JP3061064B2 - 核酸増幅の阻害における核酸類似物の使用 - Google Patents

核酸増幅の阻害における核酸類似物の使用

Info

Publication number
JP3061064B2
JP3061064B2 JP6501101A JP50110194A JP3061064B2 JP 3061064 B2 JP3061064 B2 JP 3061064B2 JP 6501101 A JP6501101 A JP 6501101A JP 50110194 A JP50110194 A JP 50110194A JP 3061064 B2 JP3061064 B2 JP 3061064B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
amplification
template
primer
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP6501101A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH08501681A (ja
Inventor
ブシャート，オーレ
エグホルム，ミカエル
ニールセン，ペーター・エイギル
ベアウ，ロルフ・ヘンリク
スタンリィ，クリストファー・ジョン
Original Assignee
ブシャート，ドアテ
エグホルム，ミカエル
ニールセン，ペーター・エイギル
ベアウ，ロルフ・ヘンリク
ペー・エヌ・アー・ディアグノスティクス・アクチエン・セルスカブ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ブシャート，ドアテ, エグホルム，ミカエル, ニールセン，ペーター・エイギル, ベアウ，ロルフ・ヘンリク, ペー・エヌ・アー・ディアグノスティクス・アクチエン・セルスカブ filed Critical ブシャート，ドアテ
Publication of JPH08501681A publication Critical patent/JPH08501681A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3061064B2 publication Critical patent/JP3061064B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、核酸増幅方法を阻害することにおける核酸
類似物の使用およびそれに基づく診断／分析技術に関す
る。
核酸増幅技術は、現在、広く使用されている。これら
の技術としては、最も広く使用されている技術であるEP
−Ａ−0200362およびEP−Ａ−0201184に開示されている
「PCR」（ポリメラーゼ連鎖反応）法が挙げられ、EP−
Ａ−0320308に開示されている「LCR」（リガーゼ連鎖反
応）およびプロシーディングズ・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA）、第87巻、第1874−1878頁、19
90年３月およびネイチャー（Nature）、第350巻、第631
3号、第91−92頁、1991年３月７日に開示されている、
いわゆる「NASBA」または「3SR」法も挙げられる。
診断におけるこれらの方法の使用における主な問題
は、前の反応からの増幅核酸配列の持ち越しによる偽陽
性物の生成である。これらの方法は、標的配列を含有す
る１つの分子さえ存在すれば、陽性の結果を生じる能力
を有するので、もちろん、かかる偽陽性物を生じるのは
非常に簡単である。現在、増幅方法が行われたかまたは
行われなかったかを決定する前に、かかる方法の反応生
成物を後処理するのが必要である。これは、反応生成物
とピペットなどのいくつかの実験器具との間、および利
用可能な増幅生成物の追跡を行うことができる人員との
接触を含み、今後の実験を汚染する。
現在、増幅生成物を手で扱わず、非開放系反応容器中
で増幅反応の成功をモニターすることができる、いわゆ
る「イントリンジック（intrinsic）」法を研究する多
くの試みが行われている。
相補的配列の慣用の核酸を選択的に結合して、加熱に
よるデハイブリダイゼーションに対して、慣用の核酸間
の同様のハイブリッドよりも安定なハイブリッドを形成
する新しい形態の核酸類似物は、1992月５月22日に出願
されたPCT出願PCT/EP92/01220に開示されている。本発
明者らは、今、このより大きなハイブリッド安定性を利
用して、核酸増幅方法を選択的に阻害することができる
ことを見いだした。この技術を使用して、かかる増幅方
法における偽陽性物を防止することもできる。該技術
は、ある診断／分析法の必須の部分として利用すること
もできる。
第１の態様では、本発明は、増幅方法における本質的
な方法に関与する核酸の配列に対して充分に相補的な核
酸類似物の有効量を供給して、増幅方法において該配列
の有効な関与を防止するのに充分に強く該配列にハイブ
リダイズさせることからなる核酸増幅の阻害方法を提供
するものである。したがって、この本発明の態様は、二
本鎖標的核酸の各鎖が１つ以上のプライマーについて鋳
型として使用される領域を有しており、該プライマーが
伸長または連結されて該鋳型に対して相補的な第２鋳型
を形成する核酸増幅方法を阻害する方法であって、該鋳
型または該プライマーの配列とハイブリダイズするのに
充分に該配列に対して相補的な核酸類似物を供給し、該
核酸類似物が、該増幅方法の条件下、プライマー鋳型ハ
イブリダイゼーションを阻害するのに充分に強く、また
は、プライマー伸長もしくはプライマー連結を阻害する
のに充分に強く個々の鋳型またはプライマーにハイブリ
ダイズすることを特徴とする核酸増幅方法を阻害する方
法を含む。
好ましくは、該方法は、PCRまたはLCRまたは3SR法で
ある。「アンカー」および「逆」PCR法が含まれる。
各鎖中に鋳型として作動する領域を有する「二本鎖標
的核酸」は、必ずしも出発物質ではなく、該方法におけ
る所望の増幅の直接的な標的である必要もない。
PCRでは、「二本鎖標的核酸」は、通常、出発物質に
取り込まれ、PCRは、一般に、所望のその少なくとも１
本の鎖の増幅であろう。しかしながら、１本のDNA鎖だ
けを用いてPCR反応を開始することができ、プライマー
伸長法の第１サイクルにおいて該相補鎖が生成される。
後のサイクルでは、「二本鎖標的核酸」は、主に前のサ
イクルからの生成物で構成される。
LCRでは、「二本鎖標的核酸」は、同様に、最初に、
通常、出発物質に取り込まれ、後のサイクルでは、主に
増幅生成物である。
必ずしも、プライマーは、増幅サイクルの同一部分に
おいて各鎖にハイブリダイズするわけではなく、実際
は、二本鎖標的核酸が形成された後にだけである。した
がって、3SR法では、リバーストランスクリプターゼに
よって相補的なDNA鎖として伸長される第１プライマー
に出発RNA鎖をハイブリダイズさせて、「二本鎖標的核
酸」を形成する。NRase HによるハイブリダイズしたRNA
鎖の分解後、第２プライマーをDNA鎖にハイブリダイズ
させ、リバーストランスクリプターゼによって伸長させ
て、二本鎖DNA分子を形成させる。したがって、この段
階により、DNA/RNAに存在する両方の鎖がプライマーに
ハイブリダイズされたであろうし、次いで、該プライマ
ーが伸長された。
第１プライマーは、DNA/DNA生成物が該DNA/DNA生成物
を鋳型として使用してRNA出発物質に対応する多くのRNA
コピーを生成するT7 RNAポリメラーゼなどのRNAポリメ
ラーゼについてのプロモーターを含み、次いで、該RNA
コピーの各々が第１プライマーおよびリバーストランス
クリプターゼが作用する出発物質となるように構成され
る。
該核酸類似物の不在下で、該増幅方法を行い、所望の
レベルの増幅生成物を構築し、次いで、該核酸類似物を
添加する。
好ましくは、該核酸類似物は、増幅生成物にハイブリ
ダイズする。このことによって、増幅が遮断されるであ
ろうし、次反応を汚染したとしても鋳型として作用する
のが不可能である安定な核酸−核酸類似物ハイブリッド
の形態で生成物を残すことができる。したがって、「イ
ントリンジック」法よりも「オープン」法の方が、持越
汚染に対して安全になる。
別にまたはさらに、かかるタイプの増幅方法で使用さ
れる装置を、核酸類似物を含有する溶液で処理して、汚
染物として存在する増幅生成物にかかる類似物をハイブ
リダイズさせることができ、その後、該装置を洗浄し、
該増幅方法で使用する、該装置中に汚染物として最初に
存在する増幅生成物の該増幅方法における増幅は、該類
似物へのハイブリダイゼーションによって防止される。
したがって、本発明は、核酸増幅生成物が後の増幅方
法において鋳型として作用することを防止するための方
法であって、該核酸増幅生成物と後の増幅方法の条件下
で安定なハイブリッドを形成する核酸類似物を該核酸増
幅生成物にハイブリダイズさせることからなる防止方法
を含む。
本発明は、また、環境中に存在する核酸増幅生成物が
後の増幅方法において核酸について汚染鋳型として作用
することを防止する方法であって、該核酸増幅生成物と
後の増幅方法の条件下で安定なハイブリッドを形成する
核酸類似物で該環境を処理することからなる防止方法を
含む。
実際には、該類似物と増幅のための標的配列を含有す
る存在するいずれの核酸との間でも安定なハイブリッド
を形成するように、例えば、ハイブリダイゼーションバ
ッファー中に核酸類似物を含有する溶液で、該方法で利
用される装置の全てまたはいくつかを洗浄してもよい。
核酸類似物で形成されたハイブリッドは、後の増幅方法
の条件に耐えるのに充分に安定であり、これによって、
汚染標的配列は、かかる方法に参加して偽陽性を生じる
のを防止する。
本発明のこの態様および他の態様において使用される
核酸類似物は、５〜20個の核酸基結合リガンド、例え
ば、10〜15個のリガンドを含有する。
特異的核酸配列の増幅を停止させるように設計された
核酸類似物を供給することができるか、あるいは、多く
の異なる増幅を停止させる核酸類似物配列の混合物を含
有する試薬を供給することができる。好ましくは、この
後者の目的のための試薬は、多様な配列または多数の配
列を含有する。究極的には、各々、リガンドのランダム
配列を含有する分子を構築するために各段階で単量体シ
ンソン（４種類のDNA塩基の各々に対して相補的な、リ
ガンドを含む）の混合物を使用して、核酸合成類似物を
合成することができる。充分量のかかる試薬は、増幅方
法を阻害することができる増幅生成物に対して相補的
な、充分に多量の分子を含有すべきである。
一般に、かかる試薬における核酸類似物の各分子は、
少なくとも10mer、より好ましくは、少なくとも12mer、
例えば、15〜20merであるのが好ましい。
増幅方法の選択的阻害は、診断プロセスの一部として
より有効に作動せしめられる。
現在、別の配列からの１つの塩基変化（例えば、遺伝
子における「正常な」配列からの１つの塩基突然変異）
などの特定の配列が存在するかを測定することに関し
て、配列を増幅させるためにPCRなどの方法を使用する
場合、増幅生成物における配列を検出するための方法は
困難である。これらは、生成物全体を配列決定して、変
化して塩基の存在を証明することを含む。それらは、遺
伝子配列の変化が制限部位に影響を及ぼす場合、１つ以
上の制限酵素によって生成された変化したパターンの消
化生成物を検出することも含む。それらは、起こり得る
配列間で区別するのに充分にストリンジェントな条件下
で、該生成物に、突然変異した配列についての標識核酸
プローブをハイブリダイズさせることを含む。
突然変異が存在する場合にだけPCR標的配列と安定な
ハイブリッドを形成する能力を有する核酸類似物を設計
し、ハイブリダイゼーション条件下で試料核酸に該類似
物を供給することによって、突然変異含有配列の指数増
幅が起こらないように、PCR反応を選択的に阻害でき
る。この原理は、他の増幅方法にまでも及ぶ。
したがって、本発明は、標的核酸配列の存在または不
在を検出する方法であって、該標的配列が存在する場合
に位置する該核酸の部分を含む鋳型として使用される領
域を有する二本鎖核酸の各鎖を、１つ以上のプライマー
を該鋳型にハイブリダイズさせ、該プライマーの伸長も
しくは連結させて、該鋳型に対して相補的な第２鋳型を
形成することによって増幅させる増幅方法を行うことか
らなり、該標的核酸配列に対して相補的な核酸類似物を
供給し、該核酸類似物が、該標的核酸配列が存在する場
合に増幅方法を阻害するのに充分に強く鋳型とハイブリ
ダイズすることを特徴とする検出方法を含む。
核酸類似物が増幅反応の全体にわたって存在する場
合、標的配列を有する他の鎖の増幅は、指数的よりもむ
しろ線形であり、その結果、有意な量の増幅生成物は生
成されない。
したがって、標的配列の存在は、有意な生成物レベル
を生成するためのPCRまたはLCRまたは3SRである増幅反
応が行われないことに基づいて導かれる。例えば、ゲル
に対して該反応生成物を走行させて、バンドが生じない
ことは、該配列の存在を示す。
何かの他の理由のために反応が行われなかったことか
ら保護するために内部対照を含むことが望ましい。した
がって、好ましくは、対照として、同一プライマーを使
用する増幅方法による増幅能力を有する第２核酸基質が
含まれ、該第２核酸基質は、増幅によって標的配列の増
幅生成物とは異なる生成物を生じる。
特異的な位置での特定の塩基の存在を検出するため、
例えば、特異的な１つの塩基突然変異の存在を示すため
に、このようにして該方法を行うことができる。一連の
かかる分析は、各分析で個々の突然変異に対して作成さ
れた核酸類似物を使用することによって、起こり得る突
然変異の範囲が遺伝子領域内に存在するかを同定するた
めに並行してまたは連続的に行われる。
より一般的な配列からの突然変異の場合、突然変異ま
たは「正常な」配列を「標的核酸配列」とみなす。した
がって、核酸類似物が突然変異配列に対して相補的であ
る場合、増幅が行なわれないことは、突然変異の存在を
示す。別法としては、「正常な」配列に対して相補的な
核酸類似物を使用することもでき、これにより、増幅が
行われないことは、「正常な」配列の存在を示し、成功
した増幅は、非特異的な突然変異の存在、すなわち、
「正常な」配列の不在を示す。
RNAがPCRプライマー結合部位または該プライマー結合
部位から実質的に離れた鋳型におけるヌクレオチド配列
のいずれにハイブリダイズさせられようとRNAなどの核
酸類似物がPCR増幅反応を妨げることができることが判
明したが、RNA/DNAハイブリダイゼーション部位の選択
が重要ではないということはない。一般に、PCR反応を
停止させるために必要なPNAとDNA鋳型との間の親和性の
レベルは、PNAがプライマー結合部位またはその近くに
ハイブリダイズする場合、わずかに少ない。親和性は、
最も強く結合するホモピリミジン領域を含む特定の塩基
配列を考慮に入れてPNA配列長さの適切な選択によって
非常によくすることができる。
したがって、一方が対照として使用され、かつ、他方
を阻害する好適なPNAの存在に鈍感である２つのPCR反応
を同時に１つの鋳型上で行うことができるような条件を
選択することができる。したがって、一方がより長い増
幅生成物を生成し、他方がより短い増幅生成物を生成す
る２つの異なるリバースプライマーと合わせて１つのフ
ォワードプライマーを使用する場合、PNAの親和性を賢
明に選択すると、短い生成物プライマーの結合部位また
はその近くにPNAを指向させ、その各PCR反応を、長い生
成物PCR反応を同時に阻害することなく防止することが
できる。PNAハイブリダイゼーション部位が検出しよう
とする１つの塩基対突然変異を含有するものである場
合、該突然変異が存在する場合、PNAは結合し、唯一のP
CR生成物が生成されるが、突然変異が存在しない場合、
該PNAは、短い生成物PCRを阻害するのに充分に強くはDN
Aを結合せず、長い生成物および短い生成物の両方を生
成する。したがって、阻害が有効ではない長い生成物PC
Rは、突然変異の存在または不在についてのアッセイに
おいて適正条件の使用を証明する内部対照として作動す
る。
本発明は、同一のプライマーを使用して一連のPCR増
幅方法を行い、増幅毎に複数の配列の各々に対して相補
的な各核酸類似物を供給し、各配列が存在する場合に該
配列とハイブリダイズさせて該増幅方法を阻害すること
によって、順次、標的核酸配列内の複数の配列の各々の
存在または不在を検出する方法を含む。
したがって、一対の間隔をおいたPCRプライマー結合
部位を有する標的配列を各鎖に１つずつ与えるとする
と、特異的配列への結合能を有する核酸類似物を供給し
て、PCR条件下で安定であり、かつ、指数的増幅を阻害
するハイブリッドを形成させることによって、これらの
部位の間で一つの鎖上に特に特異的な配列を生じるかを
測定することができる。この原理は、有用には、多くの
起こり得る配列が遺伝子または遺伝子クラスターなどの
大きな領域内の核酸の領域に連続的に存在するかを測定
するために適用される。一例として、イー・コリにおい
て、30個までの遺伝子は、抗生物質耐性を決定する短い
遺伝子領域においてクラスター化される。抗生物質耐性
遺伝子が特定の微生物中に存在するかを測定するために
は、通常、関心のある各遺伝子についてPCRプライマー
を増殖させることを含む。
選択的PCRブロックのために核酸類似物を使用する
と、領域全体をフランクする一対のプライマーを使用し
て、存在する遺伝子を測定することができる。特異的配
列核酸類似物は、同定されるべき各遺伝子配列について
のいずれかの鎖に対して相補的にされ、次いで、PCR反
応は、存在する各核酸類似物を用いて行われる。試験下
の該類似物がハイブリダイズする配列が核酸中に存在す
る場合、PCR反応は阻害される。慣用のPCRを使用する場
合、研究されるべき各配列に対して特異的な一対のプラ
イマーが必要である。各プライマー対は、多くのパラメ
ータを変化させることによって最適にされるべき増幅条
件を必要とする。前記PCR出願に開示されている種類の
核酸類似物は、所望の配列において容易に合成されるの
で、多くの異なるPCRプライマーを得ることおよび各プ
ライマー対の組合わせに対して好適な増幅方法を開発す
ることの問題が解消される。
本発明は、ハイブリダイゼーション条件下で、プライ
マー部位またはプライマー部位から下流でプライマーま
たは鋳型と安定なハイブリッドを形成する核酸類似物を
供給することからなる核酸鋳型にハイブリダイズさせた
プライマーのポリメラーゼ媒介伸長を阻害する方法を含
む。
増幅方法の生成物は、配列決定するか、または標識オ
リゴヌクレオチドでプローブすることによって検出し同
定する場合、通常、一本鎖形態で得ることが必要であ
る。相補鎖は、通常、等量で存在し、該鎖は、再結合す
る傾向がある。したがって、２つの生成鎖の一方の優勢
的に存在するような方法（非対称PCR）で、PCR反応を行
うことが望まれる。現在、これは、１つのプライマーを
他方よりも多く使用することによって試みられる。理想
的には、所望の配列の指数的生成が１つのプライマーを
使い果たすまで起こり、次いで、結果として線形増幅が
生じる。反応の初期段階に影響を及ぼす同等ではないプ
ライマー濃度のため、しばしば、PCR方法が適正に開始
されないという問題がある。
したがって、本発明は、二本鎖標的核酸の各鎖がプラ
イマーに対する鋳型として使用される領域を有してお
り、該プライマーが伸長して鋳型に対して相補的な第２
鋳型を形成し、複数回の増幅サイクルの後、該反応条件
下で該プライマーの１つがその標的にハイブリダイズす
るのを阻害するのに充分に強く該プライマーにハイブリ
ダイズする核酸類似物を添加し、次いで、該増幅をさら
に複数回続けることを特徴とする非対称核酸増幅方法を
含む。
好ましくは、増幅方法は、PCRである。
本発明は、この方法で非対称増幅を行い、次いで、増
幅生成物を検出または配列決定することを含む。
試みたPCRまたは他の増幅反応の間のPNA濃度は、好ま
しくは、0.5μＭよりも多く、好ましくは、2.0μＭより
も多く、最も好ましくは、３μＭよりも多く、例えば、
３〜15μＭである。
前記の全てにおいて使用される核酸類似物は、好まし
くは、主鎖に沿って個々の間隔をおいた位置に複数のリ
ガンドを有するポリアミド主鎖からなっているペプチド
核酸（PNA）であって、該リガンドが、各々、独立し
て、天然核塩基、非天然核塩基または核塩基結合基であ
り、各リガンドが該主鎖の窒素原子に直接または間接的
に結合しており、窒素原子を有する該リガンドが主に該
主鎖において４〜８個の介在原子によってお互いに離れ
ていることを特徴とするペプチド核酸（PNA）である。
しかしながら、それは、一般に、核酸を相補的な配列に
ハイブリダイズさせて、核酸類似物に対応する慣用のデ
オキシリボヌクレオチドと該核酸との間のハイブリッド
よりも加熱による変性に対して安定なハイブリッドを形
成する能力を有する核酸類似物である。好ましくは、１
つの鎖が核酸類似物に対して相補的な配列を有している
二本鎖核酸にハイブリダイズして、その結果、この１つ
の鎖を他の鎖に代える能力を有する核酸類似物である。
前記定義のペプチド核酸（PNA）の主鎖における窒素
原子の離間は、好ましくは、５個の原子による。式Ｉ
（下記）で示される核酸類似物において、これは、DNA
に対する最強の親和性を提供することが見いだされた。
しかしながら、あまり最適ではないスペーシングによっ
て、例えば、５個よりも多い原子のスペーシングによっ
て、例えば、14個までまたはそれ以上の原子によって、
１つ以上のリガンドの間隔をおくことによってPNAおよ
びDNA間の結合強度を低下させることが望ましい場合も
ある。
好ましくは、リガンド間スペーシングの25％以下は、
６個以上の原子である。より好ましくは、リガンド間ス
ペーシングの10〜15％以下は、６個以上の原子である。
リガンドを有する（直接またはリンカー基を介して）ア
ザ窒素原子は、前記スペーシングとみなされない。
DNA結合の強度を低下させるための別法またはさらな
る方法は、DNAの結合にあまりまたは全く寄与しない部
分、例えば、水素をリガンドの代わりに置いて、いくつ
かのリガンドを省略することである。好ましくは、リガ
ンド位置の25％以下、例えば、10〜15％以下は、非結合
部分によって占められている。
代表的なリガンドとしては、好適なリンカーを介して
ペプチド主鎖に結合した４つの主な天然DNA塩基（すな
わち、チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン）ま
たは他の天然核塩基（例えば、イノシン、ウラシル、５
−メチルシトシンまたはチオウラシル）または合成塩基
（例えば、ブロモウラシル、アザアデニンまたはアザグ
アニンなど）が挙げられる。
好ましい具体例において、本発明で使用される核酸類
似物は、一般式（Ｉ）： ［式中、 ｎは、少なくとも２であり、 L1−Lnは、各々、独立して、水素、ヒドロキシ、（C1
−C4）アルカノイル、天然核塩基、非天然核塩基、芳香
族基、DNAインターカレーター（intercalator）、核塩
基結合基およびレポーターリガンドから選択され、L1−
Lnのうち少なくとも１つは、天然核塩基、非天然核塩
基、DNAインターカレーター、または核塩基結合基であ
り； A1−Anは、各々、単結合、メチレン基または式（II
a）もしくは（II b）： （式中、 Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはＣ（CH3）２であ
り； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑは、各々、１〜５の整数であり、ｐ＋ｑ
は、10以下であり； ｒおよびｓは、各々、０または１〜５の整数であり、
ｒ＋ｓは、10以下であり； R1およびR2は、各々、独立して、水素、ヒドロキシ−
またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換されてい
てもよい（C1−C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキ
シ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群か
ら選択され； R3およびR4は、各々、独立して、水素、（C1−C4）ア
ルキル、ヒドロキシ−またはアルコキシ−またはアルキ
ルチオ−置換（C1−C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコ
キシ、アルキルチオおよびアミノからなる群から選択さ
れる） で示される基であり； B1−Bnは、各々、ＮまたはR3N+であり、ここで、R
3は、前記定義と同じであり； C1−Cnは、各々、CR6R7、CHR6CHR7またはCR6R7CH2で
あり、ここで、R6は、水素であり、R7は、天然アルファ
−アミノ酸の側鎖からなる群から選択されるか、あるい
は、R6およびR7は、独立して、水素、（C2−C6）アルキ
ル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒドロキ
シ、（C1−C6）アルコキシ、（C1−C6）アルキルチオ、
NR3R4およびSR5からなる群から選択され、ここで、R3お
よびR4は、前記定義と同じであり、R5は、水素、（C1−
C6）アルキル、ヒドロキシ−、アルコキシ−またはアル
キルチオ−置換（C1−C6）アルキルであるが、あるい
は、R6およびR7は、一緒になって、脂肪族環系または複
素環系を形成し； D1−Dnは、各々、CR6R7、CH2CR6R7またはCHR6CHR7で
あり、ここで、R6およびR7は、前記定義と同じであり； G1−Gn-1は、各々、いずれかの向きで、 （式中、R3は、前記定義と同じである） であり； Ｑは、−CO2H、−CONR′Ｒ″、−SO3Hもしくは−SO2N
R′Ｒ″または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性誘導体であ
り； Ｉは、−NHRＲ′または−NRＣ（Ｏ）Ｒ′で
あり、ここで、Ｒ′、Ｒ″、ＲおよびＲ′は、独立
して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガ
ンド、インターカレーター、キレーター、ペプチド、タ
ンパク、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレオ
チドならびに可溶性および不溶性ポリマーからなる群か
ら選択される］ で示される。別法としては、ＣおよびＤは、CHR6（C
H2）sCHR7であり、ここで、ｓは、０〜２である。
好ましいペプチド核酸は、一般式（III）： ［式中、 Ｌは、各々、独立して、水素、フェニル、複素環（例
えば、１、２または３個の環からなる）、天然核塩基、
および非天然核塩基からなる群から選択され； R7′は、各々、独立して、水素および天然アルファ−
アミノ酸の側鎖からなる群から選択され； ｎは、１〜60の整数であり； ｋ、ｌおよびｍは、各々、独立して、０または１〜５
の整数であり；好ましくは、ｋとｍとの合計は、１また
は２、最も好ましくは、１であり； Rhは、OH、NH2または−NNLysNH2であり； Riは、ＨまたはCOCH3である］ で示される。特に好ましくは、Ｌが各々独立して核塩基
チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グア
ニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）からなる群から選択さ
れ、特にチミンであり、ｎが１〜30の整数であり、特
に、４〜20である式（III）で示される化合物である。
本発明のペプチド核酸は、溶液中または固相上のいず
れかで、標準的なペプチド合成法の適用によって合成さ
れる。使用されるシンソンは、特別に設計された単量体
アミノ酸または標準的な保護基によって保護されたそれ
らの活性誘導体である。オリゴヌクレオチド類似物は、
対応する二酸およびジアミンを使用することによって合
成することもできる。
したがって、本発明は使用される化合物の製造に使用
される単量体シンソンは、一般式： ［式中、Ｌ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、アミノ基がアミノ
保護基によって保護されていてもよいことを除いて、前
記定義と同じであり;Eは、COOH、CSOH、SOOH、SO2OHま
たはその活性誘導体であり;Fは、NHR3またはNPgR3であ
り、ここで、R3は、前記定義と同じであり、Pgは、アミ
ノ保護基である］ で示されるアミノ酸、二酸およびジアミンからなる群か
ら選択される。
好ましい単量体シンソンは、式（VII）： ［式中、Ｌは、水素、フェニル、複素環、天然核塩基、
非天然核塩基およびその保護誘導体からなる群から選択
され;R7′は、独立して、水素または天然アルファ−ア
ミノ酸の側鎖からなる群から選択される］ で示されるアミノ酸またはそのアミノ保護および／また
は酸末端活性誘導体である。特に、R7′が水素であり、
Ｌが核塩基チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン
（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）ならびに
その保護誘導体からなる群から選択される式（４）で示
されるかかるシンソンが好ましい。
かかるPNAの生成は、前記PCT出願PCT/EP92/01220に詳
述されている。
本発明は、増幅のための複数のプライマーおよび該プ
ライマーのうちの１つにおける配列または該増幅反応に
おいて該プライマーを使用して増幅されるべき標識核酸
配列に対して相補的な配列を有する少なくとお１つの核
酸類似物からなる核酸増幅反応用キットを含む。
かかるキットは、さらに、増幅反応において該プライ
マーの伸長または連結を生ずるために用いられるポリメ
ラーゼまたはリガーゼ、例えば、Taqポリメラーゼなど
のDNAポリメラーゼからなる。
「3SR」タイプの方法における使用のためには、該キ
ットは、さらに、リバーストランスクリプターゼ、RNA
ポリメラーゼおよびRNase Hなどのヌクレアーゼを１つ
以上を含んでもよい。
一般に、かかるキットは、さらに、１種類以上が公知
方法または好適な方法で標識（放射性標識）されていて
もよいヌクレオチド（dTTP、dCTP、dATPおよびdGTPのい
くつかまたは全て）を含んでもよい。かかる標識を検出
するための試薬も含んでもよい。キットは、さらに、バ
ッファー、塩、安定化剤および核酸認識剤の１つ以上を
含んでもよい。これらは、特異的な配列を認識する試薬
または非配列特異的方法において核酸を認識する試薬で
ある。例えば、前者の例は、オリグヌクレオチドまたは
PNA型の核酸類似物であり、所望により、検出可能な標
識を有していてもよく、後者の例は、核酸に対する抗体
である。
本発明において使用するのに好適な標識としては、放
射性同位体標識、酵素標識、ビオチン、スピン標識、フ
ルオロフォア、化学蛍光標識、抗原標識および抗体標識
が挙げられる。
キットは、さらに、核酸増幅反応のものとは異なる増
幅生成物を生成するためにプライマーを使用する増幅の
ための鋳型を含む正の対照実験を行うための試薬を含ん
でいてもよい。
キットは、さらに、核酸増幅生成物を配列決定するの
に使用する試薬、例えば、Taqポリメラーゼなどのポリ
メラーゼおよび１つ以上のジデオキシヌクレオチドを含
んでもよい。
以下の実施例において、全てのPNAは、式VIIで示され
る単量体シンソンから誘導された主鎖を有しており、各
々の場合、各Ｌは、常法でＡ、Ｃ、ＧまたはＴによって
表される天然核塩基の１つである。使用される命名法
は、前記PCT/EP92/01220において使用されたものに従
う。
本発明は、添付した図面に言及される以下の詳細な実
施例によってさらに説明される。
第１図は、PNAによるプライマーのポリメラーゼ媒介
伸長の阻害を示すゲルのオートラジオグラフである。
第２図は、１つの塩基対によって異なる配列間で区別
するPNAによるPCR反応の選択的な阻害を示す臭化エチジ
ウムゲルである。
第３図は、PCRのPNA指向阻害のさらなる実施例を示す
臭化エチジウムゲルである。
第４図は、プライマー標的部位と重複するか、また
は、それからの変化する量によって間隔をおいたPCR鋳
型上の部位に指向されたPNAによるPCRの阻害を示す臭化
エチジウムゲルである。
第５図は、１つのプライマーに対して相補的なPNAに
よるPCR反応の完全な阻害を示す臭化エチジウムゲルで
ある。
第６図は、１つの塩基変化を同定するためにPCR阻害
をさらに説明する実施例６の結果を示す臭化エチジウム
ゲルである。
実施例１ PNAによるプライマー伸長停止 チミン残基10個の挿入配列を含有するプラスミド［Bl
uescript、ストラータジーン，インコーポレンテッド
（Strategene,Inc.）」（pT10KS）、0.5μｇを制限エン
ドヌクレアーゼPvu IIで切断し、10×濃度バッファー
（イー・コリ（E.coli）クレノウDNAポリメラーゼにつ
いて:100mMトリス−HCl、100mM、MgCl2、50mM NaCl、1m
Mジチオトレイトール（DTT）、pH7.5;Taq DNAポリメラ
ーゼについて;100mMトリス−HCl、15mM MgCl2、500mM N
aCl、1mg/mlゼラチン、pH8.3）１μおよびH2O 6μ
を添加した「リバースプライマー」（５′−AAC AGC TA
T GAC CAT G）0.1μｇおよびプラスミド中のT10挿入部
に対して相補的なA10PNA 100ngを90℃で10分間、37℃で
60分間インキュベートし、次いで、２℃に冷却した。次
いで、10mM DT 1μ、dCTP、dGTP、dTTPおよび１μCi
のα32P−dATPの10μＭ溶液１μおよび1Uの適切なDNA
ポリメラーゼを添加した。20℃で５分後、dATP、dCTP、
dGTPおよびdTTPの1mM溶液２μを添加し、イー・コリ
（E.coli）DNAポリメラーゼについては37℃で、またはT
aqポリメラーゼについては60℃で、15分間インキュベー
ションを続けた。次いで、エタノール50μ、２％（w/
v）酢酸カリウムの添加によってDNAを沈澱させ、８％
（w/v）アクリルアミド/7M尿素配列決定ゲル中での電気
泳動、次いで、オートラジオグラフィによって分析し
た。結果を第１図に示す。レーンは、以下のとおり示さ
れる： レーン1:イー・コリ（E.coli）DNAポリメラーゼクレ
ノイフラグメント、PNAは含まない。
レーン2:PNAの存在下以外は、レーン１と同様。
レーン3:Taqポリメラーゼ、PNAは含まない。
レーン4:PNAの存在下でのTaqポリメラーゼ。
レーン5:Bam HIで切断されたプラスミドを有する対
照。
このダイアグラムから、A10PNAがBam HI部位に隣接す
る鋳型DNAの一本の鎖にハイブリダイズしていることが
判明する。したがって、A10PNAがプライマーのポリメラ
ーゼ伸長を阻害する場合、ゲル上を走行する生成物は、
レーン５に示されるBamH I切断生成物で生成される。ポ
リメラーゼ伸長がPNAによってチェックされない場合、
長い伸長生成物が得られる。各PNA含有レーン（２およ
び４）において、BamH I位置において予想されるバンド
が生成される。PNAの不在下では、PNAによってTaqの完
全な阻害を示すPNA/Taqレーン（レーン４）において実
質的に全く存在しない、長い生成物が見られる。
実施例２ PCR DNA増幅のPNA指向阻害による１つの塩基突然変異の
検出 相補的オリゴヌクレオチド５′−GATCCT10Gおよび
５′−GATCCA10GをBluescriptKS＋プラスミド（ストラ
ータジーン（Stratagene））のBamH I部位で個々の鎖に
クローン化することによって、プラスミドpT10KSを構築
した。プラスミドpT9CKSは、相補的オリゴヌクレオチド
５′−TCGACT5CT4Gおよび５′−TCGACA4GA5GをpUC19のS
al I部位にクローン化することによって構築した。
バッファー（10mMトリス−HCl、3.5mM MgCl2、50mM K
Cl、0.1mg/mlゼラチン、pH8.3）50μ中にプラスミド1
25ng、プラスミド2 DNA 25ng、1.25mM dATP、1.25mM d
CTP、1.25mM dGTP、1.25mM dTTP、プライマー1 0.2μ
ｇ、プライマー2 0.2μｇおよびPNA2.5μｇを含有する
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。該試料を94℃
に５分間加熱し、次いで、65℃に冷却し、この段階で、
1UのTaq DNAポリメラーゼ［ベーリンガー・マンハイム
（Boehringer Mannheim）］を添加した。次いで、30温
度サイクル（94℃（２分間）、40℃（３分間）および65
℃（２分間））を行った。
TBEバッファー（90mM トリス−ホウ酸塩、1mM EDT
A、pH8.3）中で操作する６％（w/v）ポリアクリルアミ
ドゲル中での電気泳動によって、得られたDNAを分析
し、該DNAを臭化エチジウムで染色することによって可
視化した。
プライマー１として「M13プライマー」を、プライマ
ー２として「リバースプライマー」を使用して、実施例
１の記載に従って実験を行った。得られたゲルを第２図
に示す。以下のプラスミドおよびPNAを使用した： レーン1:pT9CKS（dA5GA4/dT4CT5PNA標的をSal I部位
にクローン化させたpBluescriptKS＋）およびpT10KS（d
A10/dT10PNA標的をBamH I部位にクローン化させたpBlue
scriptKS＋）、PNAを含まない。
レーン2:PNA H−T5CT4LysNH2を有する以外は、レーン
１と同様。
レーン3:PNA H−T10LysNH2を有する以外は、レーン１
と同様。
レーン4:pT10KSおよびpT9CKSならびにPNA H−T5CT4−
LysNH2。
レーン5:pT10KSおよびpT9CKSならびにPNA H−T10LysN
H2。
レーン１において、各プラスミドから１つずつの２つ
のPCR生成物が明らかに見られる。pT10KSの増幅によっ
て、118bpフラグメントが得られ、pT9CKSの増幅によっ
て、221bpフラグメントが得られる。
プラスミドpT9CKSは、PNA T5CT4LysNH2についての標
的配列を含有する。レーン２において、PNAによるPCRの
阻害を示すこのプラスミドについてのバンドは見られな
い。
実施例３ PCRのPNA指向阻害のさらなる実証 エグホルム，エム（Egholm,M.）、ブシャート，オー
（Buchardt,O.）、ニールセン，ピー・イー（Nielsen,
P.E.）およびベアウ，アール・エイチ（Berg,R.H.）（1
992）ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ
イエティ（J.Amer.Chem.Soc.）114、1895−1897および
エグホルム，エム、ブシャート，オー、ニールセン，ピ
ー・イーおよびベアウ，アール・エイチ（1992）ジャー
ナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ11
4、9677−9678におけると同様に、PNA T10−Lys−NH2を
合成した。プラスミドpT10KSおよびpT9CKSは、実施例２
の記載と同じであった。99bp PCRフラグメント（この実
施例で使用されるPNSaのいずれについても標的部位を有
しない）をbluescript KS＋プラスミドのSma I部位にク
ローニング化させることによって、対照プラスミドpCKS
を構築した。標準的な技術を使用して、組換えイー・コ
リJM103の選択されたクローンからプラスミドを単離
し、CsCl勾配液中で浮揚性密度遠心によって精製し、次
いで、ジデオキシ法によって配列決定した。
PCR反応で以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使
用した：リバースプライマー（５′−CACACAGGAAACAGCT
ATGAC）およびフォワードプライマー（５′−GTAAAACGA
CGGCCAGT）。各プラスミド1ng、各プライマー0.2μＭ、
200μM dNTP、10mMトリス−HCl、pH8.3（25℃）で、10m
M KCl、および3mM MgCl2を含有する50μの体積中でPC
R増幅を行った。
PCR反応は、パラフィン油２滴で覆い、90℃で２分間
インキュベートした後、3Uのストッフェル（stoffel）
ポリメラーゼ［パーキン・エルマー・セタス（Perkin E
lmer Cetus）］の添加によって、増幅プロセスを開始さ
せた。全ての実験において、LEP増幅器［IgGバイオテク
（IgG Biotech）］を使用し、PCRサイクルプロフィル
は、96℃、２分−55℃、３分−35℃、１分−65℃、２分
−35サイクルであった。
PCRプライマー結合および伸長に先立つPNA/DNA複合体
の形態を確実にするため、通常の３ステップPCRサイク
ルを、PCRプライマーのTmよりも充分に上の温度での異
なったPNAアニーリング工程で拡大させた。
第３図には、PNA T10−LysNH2の存在下でのPCR阻害の
実験機構および結果を示す。前記２つのプラスミド鋳
型、すなわち、A10標的部位を含有する246bpフラグメン
トを増幅させるpT10KSプラスミド、および、329bp非標
的フラグメントを増幅させる対照プラスミドpCKSを使用
した。PNAT T10−LysNH2が存在しない場合（レーン
２）、pT10KSプラスミドは、予想された246bp PCRフラ
グメントを合成させる。しかしながら、PNA T10−LysNH
23.2μＭの存在下では、生成物は、生成されない（レー
ン３〜５）。PNA T10〜LysNH2は、pCKS対照プラスミド
（レーン１）からの予想された329bpフラグメントの増
幅を阻害しないので、生成物の不在は、PCR反応に対す
るPNA T10−LysNH2の非特異的阻害効果に依存しない。
したがって、PNA T10−LysNH2が配列特異的方法でその
類似した標的DNAの増幅を防止することができることが
判明する。
実施例４ PNAおよびPCRプライマー標的部位の相対的な位置に阻害
に影響を及ぼさずに変化されうることの実証 この実施例は、PNA標的部位がPCR領域の中央に位置す
るか（１）、PCRプライマー部位に直接隣接する位置に
あるか、（２）、あるいは、PCRプライマー部位の１つ
と重複する（３）場合に得られる効果を示す。これら３
つの場合における阻害の基本的なメカニズム間には基本
的な差異がある。PNA標的部位がPCRプライマー部位から
少し離れて位置する場合、阻害は、ポリメラーゼによる
読み過ごしを防止することによって操作されることが予
想される。反対に、PNAおよびPCRプライマー標的部位が
重複している場合、阻害は、プライマー排除によって操
作されることが予想される。最後に、PNA標的がPCRプラ
イマー部位に隣接して位置する場合、阻害は、PCRプラ
イマーへのポリメラーゼアクセスを防止することによっ
て、および／または、プライマー伸長の開始を防止する
ことによって操作されると思われる。３つの全ての場
合、有効な阻害は、第４図に示すとおり、PNA T10−Lys
NH2を用いて得られる。この実施例では、PCRは、各操作
において、「フォワードプライマー」、「SKプライマ
ー」および「A10プライマー」と称される３種類のフォ
ワードプライマーを使用して行われる。これらは、フォ
ワードプライマー（５′−GTAAAACGACGGCCAGT）、T10プ
ライマー（５′−CATCCTTTTTTTTTTG）およびSKプライマ
ー（５′−TCTAGAACTAGTGGATC）である。この実施例で
使用されるプラスミドpT10KS（詳細は、実施例２を参
照）において、フォワードプライマー標的部位の３′−
末端は、A10標的の101bp下流に位置しており、SKプライ
マーの３′−末端は、A10標的のすぐ下流に位置してお
り、A10プライマーは、各々、５′−および３′−側に
５および1bpを含むA10標的部位をスパンする。レーン１
−2:PNA−T10−LysNH2の不在下（１）または3.2μＭの
存在下（２）でリバースおよびフォワードプライマーを
用いたpT10KSプラスミドの増幅を示す。レーン３および
4:PNA T10−LysNH2の不在下（３）または3.2μＭの存在
下（４）でリバースおよびSKプライマーを用いるpT10KS
の増幅を示す。レーン７および8:PNA T10−LysNH2の不
在下（７）または3.2μＭの存在下（８）でリバースお
よびT10プライマーを用いるpT10KSプラスミドの増幅を
示す。PCRサイクル条件は、96℃、２分−55℃、３分−3
5℃、１分−65℃、２分−35サイクルであった。PNA T10
LysNH2は、幅広く間隔があいたPNAおよびPCRプライマー
標的部位（レーン２）、隣接するPNAおよびPCRプライマ
ー標的部位（レーン２）および重複するPNAおよびPCRプ
ライマー標的部位（レーン８）を有する鋳型からのPCR
生成物の形成を防止する。
実施例５ PCR反応は、一般に、１つのプライマーに対して相補
的なPNAの不在下および存在下で、実施例２の記載と同
様に行なった。
結果を第５図に示す。レーン１では、予想されたPCR
生成物が見られる。レーン２では、PCR反応が完全に阻
害されることを示す。
実施例は、プライマー１として「M13プライマー」
を、プライマー２としてGATCC T10Gを使用して行った。
標的プラスミドは、pT10KSであった。30サイクルの各々
の第２期で使用される温度は、40℃に代えて35℃であっ
た。
実施例６ 混合配列PNAによるPCR阻害 前記実施例で使用したPNAは、単にピリミジン残基を
含有するだけであり、それらの標的配列を用いてトリプ
レックスを形成することが判明した。したがって、原理
の一般性を示すために、標的DNAを用いて標準的なワト
ソン−クリックデュプレックスを形成する混合配列PNA
を用いて、一連の実験を行った。第６図には、１つのヌ
クレオチドによって異なる２つの混合配列PNA（PNA−A:
H−TTCCGGTTGCC−NH2およびPNA−B:Gly:TTCCGGCTGCC−N
H2）を用いた１つの塩基突然変異分析の実験機構および
結果を示す。対応する点突然変異を含有する２つの鋳型
（「Ａ」および「Ｂ」）を使用する。３つのオリゴヌク
レオチドプライマーがこの実験に含まれる。750bp PCR
フラグメントを生成するフォワードおよびリバースオリ
ゴ対ならびに変性プライマーは、点突然変異を含有する
領域に対して指向した。フォワードプライマーと一緒
に、変性プライマーは、鋳型としてＡまたはＢ対立因子
（allele）を使用して150bpフラグメントを増幅させ
る。PNAは、点突然変異を含有する領域に対して指向さ
せられ、したがって、クランピングは、プライマー排除
によって操作されると思われる。
この実験では、各PCR反応（50μ）は、前記のよう
な200μM dNTP、10mMトリス−HCl、pH9.9（20℃）、50m
M KCl、1.5mM MgCl2、0.01％ゼラチン、0.1％トリトン
Ｘ−100、1Uのスーパータグ（supertag）酵素［ストラ
ータジーン（Stratagene）］、対立因子特異的プラスミ
ド1ng、突然変異を含有する領域に対して指向する変性
プライマー10pmol、フォワードプライマー10pmol、リバ
ースプライマー10pmolおよびPNAを含有する。図面にお
いて、レーンは、以下のとおりである：レーン1:A−対
立因子、PNAは存在しない。レーン2:A−対立因子および
10μM PNA−Ａ。レーン3:A−対立因子および10μM PNA
−Ｂ。レーン4:B−対立因子、PNAは存在しない。レーン
5:B−対立因子および10μM PNA−Ａ。レーン6:B−対立
因子および10μM PNA−Ｂ。PCR条件は、96℃１分−60℃
２分−40℃30秒−60℃２分−30サイクルであった。
Ａ−対立因子を鋳型として使用する場合、750bp（内
部PCR対照）および150bpフラグメント（対立因子の診断
薬）は、共に、PNA−Ａの不在下で生成される（レーン
１）。しかしながら、反応がPNA−Ａを含有する場合、7
50bp PCR対照フラグメントだけが生成される（レーン
２）。これに対して、750bpおよび150bp PCRフラグメン
トは、共に、PNA−Ｂの存在下で生成される（レーン
３）。鋳型をＢ−対立因子に変えると、結果は逆であ
る。したがって、PNA−Ｂの存在は、150bpフラグメント
の生成を阻害し（レーン６）、PNA−Ａの存在は、阻害
しない（レーン５）。したがって、本発明者らは、両方
の混合配列PNA（ＡおよびＢ）は、点突然変異精度でそ
れらの類似するPCR生成物を阻害することができると推
論する。
以下に、本発明の実施態様について記載する。
（１）二本鎖覆的核酸の各鎖が１つ以上のプライマーに
ついて鋳型として使用される領域を有しており、該プラ
イマーが伸長または連結されて該鋳型に対して相補的な
第２鋳型を形成する核酸増殖方法を阻害する方法であっ
て、該鋳型または該プライマーの配列とハイブリダイズ
するのに充分に該配列に対して相補的な核酸類似物を供
給し、該核酸類似物が、該増幅方法の条件下、プライマ
ー鋳型ハイブリダイゼーションを阻害するのに充分に強
く、または、プライマー伸長もしくはプライマー連結を
阻害するのに充分に強く個々の鋳型またはプライマーに
ハイブリダイズすることを特徴とする核酸増幅方法を阻
害する方法。
（２）増幅方法がPCRまたはLCR法である上記（１）の方
法。
（３）増幅方法を核酸類似物の不在下で行って、所望の
レベルの増幅生成物を構築し、次いで、核酸類似物を添
加する上記（１）または（２）の方法。
（４）核酸類似物を増幅生成物にハイブリダイズさせる
上記（３）の方法。
（５）該タイプの増幅方法において使用されるべき装置
を該核酸類似物を含有する溶液で処理して、汚染物とし
て存在する増幅生成物に核酸類似物をハイブリダイズさ
せ、次いで、該装置を洗浄し、増幅方法において使用
し、該増幅方法における装置鋳に汚染として最初に存在
する増幅生成物の増幅を該核酸類似物へのハイブリダイ
ゼーションによって防止する上記（１）または（２）の
方法。
（６）後の増幅方法の条件下で安定なハイブリッドを形
成する核酸類似物を核酸増幅生成物にハィブリダイズさ
せることを特徴とする、核酸増幅生成物が後の増幅方法
で鋳型として供されることを防止する方法。
（７）増幅方法の条件下で安定なハイブリッドを増幅生
成物と形成する核酸類似物で環境を処理することを特徴
とする、環境中に存在する核酸増幅生成物が後の増幅方
法で核酸に対する汚染鋳型として供されることを防止す
る方法。
（８）標的核酸配列の存在または不在を検出する方法で
あって、該標的核酸配列が存在する場合に位置する核酸
の部分を含む鋳型として使用される領域を有する二本鎖
核酸の各鎖を１つ以上のプライマーの該鋳型にハイブリ
ダイズさせ、該プライマーを伸長もしくは連結させて、
該鋳型に対して相補的な第２鋳型を形成することによっ
て増幅させる増幅方法を行うことからなり、該標的核酸
配列に対して相補的な核酸類似物を供給し、該核酸類似
物が、該標的核酸配列が存在する場合に増幅方法を阻害
するのに充分に強く鋳型とハイブリダイズすることを特
徴とする、標的核酸配列の存在または不在の検出方法。
（９）同一のプライマーを使用して一連のPCR増幅方法
を行い、増幅毎に一対のプライマー結合部位間の標的核
酸配列内の複数の配列の各々に対して相補的な各核酸類
似物を供給して、各配列が存在する場合に該配列とハイ
ブリダイズさせて該増幅方法を阻害することによって、
順次、一対のプライマー結合部位間の標的核酸配列内の
複数の配列の各々の存在または不在を検出する上記
（８）の方法。
（10）対照として、増幅によって標的配列の増幅生成物
とは異なる生成物を生じせしめる同一プライマーを使用
する増幅方法による増幅能力を有する第２核酸基質を含
む上記（８）または（９）の方法。
（11）二本鎖標的核酸の各鎖がプライマーに対する鋳型
として使用される領域を有しており、該プライマーが伸
長して鋳型に対して相補的な第２鋳型を形成し、複数回
の増幅サイクルの後、該反応条件下で該プライマーのう
ちの１つがその標的にハイブリダイズするのを阻害する
のに充分に強く該プライマーにハイブリダイズする核酸
類似物を添加し、次いで、該増幅をさらに複数回続ける
ことを特徴とする非対照核酸増幅方法。
（12）ハイブリダイゼーション条件下で、プライマー部
位またはプライマー部位から下流でプライマーまたは鋳
型と安定なハイブリッドを形成する核酸類似物を供給す
ることを特徴とする、核酸鋳型にハイブリダイズさせた
プライマーのポリメラーゼ媒体伸長を阻害する方法。
（13）増幅のための複数のプライマーおよび該プライマ
ーのうちの１つにおける発列または該増幅反応において
該プライマーを使用して増幅されるべき標識核酸配列に
対して相補的な配列を有する少なくとも１つの核酸類似
物からなることを特徴とする核酸増幅反応用キット。
（14）さらに、プライマーの伸長または連結を生ずるた
めの増幅反応で使用されるポリメラーゼまたはリガーゼ
からなる上記（13）のキット。
（15）さらに、リバーストランスクリプターゼ、RNAポ
リメラーゼおよびヌクレアーゼのうち１つ以上を含む上
記（13）のキット。
（16）さらに、ヌクレオチドを含む上記（13）〜（15）
のいずれか１つのキット。
（17）標識ヌクレオチドを含む上記（16）のキット。
（18）さらに、バッファー、塩、安定化剤および核酸認
識剤のうち１つ以上を含む上記（13）〜（17）のいずれ
か１つのキット。
（19）さらに、核酸増幅反応のものとは異なる増幅生成
物を生成するためにプライマーを使用する増幅のための
鋳型を正の対照実験を行うための試薬を含む上記（13）
〜（18）のいずれか１つのキット。
（20）さらに、核酸配列決定試薬を含む上記（13）〜
（19）のいずれか１つのキット。
（21）ハイブリダイゼーション条件下で、増幅方法で核
酸がプライマーまたは鋳型として作用するのを妨害する
のに充分に強く、存在する場合に相補的配列の対応する
核酸にハイブリダイズする能力を有する核酸類似物の混
合物からなることを特徴とする核酸増幅方法を不可能に
するための試薬。
（22）混合物が異なる様々な配列の核酸類似物分子を含
有する上記（21）の試薬。
（23）配列がランダムである上記（22）の試薬。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 999999999 ベアウ，ロルフ・ヘンリク デンマーク国デーコー―2000フレデリク スベアウ、ランゲランズヴァイ20ベー 番、トレジエ・チル・ヘイア (73)特許権者 999999999 ペー・エヌ・アー・ディアグノスティク ス・アクチエン・セルスカブ デンマーク国デーコー−2100コペンハー ゲン・エー、レアセー・パークアレー42 番 (72)発明者 ブシャート，オーレ デンマーク国デーコー―3500ヴェアレー セ、セナガーズヴァイ73番 (72)発明者 エグホルム，ミカエル デンマーク国デーコー―2000フレデリク スベアウ、シンズヴィーレヴァイ５番、 トレジエ・チル・ヴェンストレ (72)発明者 ニールセン，ペーター・エイギル デンマーク国デーコー―2980コケダー ル、ヒョアテヴェンゲット509番 (72)発明者 ベアウ，ロルフ・ヘンリク デンマーク国デーコー―2000フレデリク スベアウ、ランゲランズヴァイ20ベー 番、トレジエ・チル・ヘイア (72)発明者 スタンリィ，クリストファー・ジョン イギリス国ケンブリッジシャー・ピーイ ー17・４ジェイビー、ハンチングドン、 セイント・アイヴズ、クロムウエル・プ レイス、12アー番 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】二本鎖標的核酸の各鎖が１つ以上のプライ
    マーについて鋳型として使用される領域を有しており、
    該プライマーが伸長または連結されて該鋳型に対して相
    補的な第２鋳型を形成する核酸増幅方法を阻害する方法
    であって、該鋳型または該プライマーの配列とハイブリ
    ダイズするのに充分に該配列に対して相補的なペプチド
    核酸を供給し、該ペプチド核酸が、該増幅方法の条件
    下、プライマー鋳型ハイブリダイゼーションを阻害する
    のに充分に強く、または、プライマー伸長もしくはプラ
    イマー連結を阻害するのに充分に強く個々の鋳型または
    プライマーにハイブリダイズすることを特徴とする核酸
    増幅方法を阻害する方法。
  2. 【請求項２】ペプチド核酸が一般式（Ｉ）： ［式中、 ｎは、少なくとも２であり、 L1−Lnは、各々、独立して、水素、ヒドロキシ、（C1−
    C4）アルカノイル、天然核塩基、非天然核塩基、芳香族
    基、DNAインターカレーター、核塩基結合基およびレポ
    ーターリガンドから選択され、L1−Lnのうち少なくとも
    １つは、天然核塩基、非天然核塩基、DNAインターカレ
    ーター、または核塩基結合基であり； A1−Anは、各々、単結合、メチレン基または式（II a）
    もしくは（II b）： （式中、 Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはＣ（CH3）２であ
    り； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑは、各々、１〜５の整数であり、ｐ＋ｑは、
    10以下であり； ｒおよびｓは、各々、０または１〜５の整数であり、ｒ
    ＋ｓは、10以下であり； R1およびR2は、各々、独立して、水素、ヒドロキシ−ま
    たはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換されていて
    もよい（C1−C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、
    アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群から選
    択され； R3およびR4は、各々、独立して、水素、（C1−C4）アル
    キル、ヒドロキシ−またはアルコキシ−またはアルキル
    チオ−置換（C1−C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキ
    シ、アルキルチオおよびアミノからなる群から選択され
    る） で示される基であり； B1−Bnは、各々、ＮまたはR3N+であり、ここで、R3は、
    前記定義と同じであり； C1−Cnは、各々、CR6R7、CHR6CHR7またはCR6R7CH2であ
    り、ここで、R6は、水素であり、R7は、天然アルファ−
    アミノ酸の側鎖からなる群から選択されるか、あるい
    は、R6およびR7は、独立して、水素、（C2−C6）アルキ
    ル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒドロキ
    シ、（C1−C6）アルコキシ、（C1−C6）アルキルチオ、
    NR3R4およびSR5からなる群から選択され、ここで、R3お
    よびR4は、前記定義と同じであり、R5は、水素、（C1−
    C6）アルキル、ヒドロキシ−、アルコキシ−またはアル
    キルチオ−置換（C1−C6）アルキルであるが、あるい
    は、R6およびR7は、一緒になって、脂肪族環系または複
    素環系を形成し； D1−Dnは、各々、CR6R7、CH2CR6R7またはCHR6CHR7であ
    り、ここで、R6およびR7は、前記定義と同じであり； G1−Gn-1は、各々、いずれかの向きで、 （式中、R3は、前記定義と同じである） であり； Ｑは、−CO2H、−CONR′Ｒ″、−SO3Hもしくは−SO2N
    R′Ｒ″または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性誘導体であ
    り； Ｉは、−NHRＲ′または−NRＣ（Ｏ）Ｒ′であ
    り、ここで、Ｒ′、Ｒ″、ＲおよびＲ′は、独立し
    て、水素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガン
    ド、インターカレーター、キレーター、ペプチド、タン
    パク、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレオチ
    ドならびに可溶性および不溶性ポリマーからなる群から
    選択される］ で示されるペプチド核酸である請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】核酸増幅生成物が後の増幅方法において鋳
    型として作用することを防止するための方法であって、
    該核酸増幅生成物と後の増幅方法の条件下で安定なハイ
    ブリッドを形成するペプチド核酸を該核酸増幅生成物に
    ハイブリダイズさせることを特徴とする防止方法。
  4. 【請求項４】標的核酸配列の存在または不在を検出する
    方法であって、該標的核酸配列が存在する場合に位置す
    る核酸の部分を含む鋳型として使用される領域を有する
    二本鎖核酸の各鎖を、１つ以上のプライマーを該鋳型に
    ハイブリダイズさせ、該プライマーを伸長もしくは連結
    させて、該鋳型に対して相補的な第２鋳型を形成するこ
    とによって増幅させる増幅方法を行うことからなり、該
    標的核酸配列に対して相補的なペプチド核酸を供給し、
    該ペプチド核酸が、該標的核酸配列が存在する場合に増
    幅方法を阻害するのに充分に強く鋳型とハイブリダイズ
    することを特徴とする、標的核酸配列の存在または不在
    の検出方法。
  5. 【請求項５】ハイブリダイゼーション条件下で、プライ
    マー部位またはプライマー部位から下流でプライマーま
    たは鋳型と安定なハイブリッドを形成するペプチド核酸
    を供給することを特徴とする、核酸鋳型にハイブリダイ
    ズさせたプライマーのポリメラーゼ媒介伸長を阻害する
    方法。
  6. 【請求項６】増幅のための複数のプライマーおよび該プ
    ライマーのうちの１つにおける配列または該増幅反応に
    おいて該プライマーを使用して増幅されるべき標識核酸
    配列に対して相補的な配列を有する少なくとも１つのペ
    プチド核酸からなることを特徴とする核酸増幅反応用キ
    ット。
  7. 【請求項７】ハイブリダイゼーション条件下で、増幅方
    法で核酸がプライマーまたは鋳型として作用するのを防
    止するのに充分に強く、存在する場合に相補的配列の対
    応する核酸にハイブリダイズする能力を有するペプチド
    核酸の混合物からなることを特徴とする核酸増幅方法を
    不可能にするための試薬。
JP6501101A 1992-06-05 1993-06-07 核酸増幅の阻害における核酸類似物の使用 Expired - Fee Related JP3061064B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB929211979A GB9211979D0 (en) 1992-06-05 1992-06-05 Uses of nucleic acid analogues
GB9211979.1 1992-06-05
PCT/EP1993/001435 WO1993025706A1 (en) 1992-06-05 1993-06-07 Use of nucleic acid analogues in the inhibition of nucleic acid amplification

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH08501681A JPH08501681A (ja) 1996-02-27
JP3061064B2 true JP3061064B2 (ja) 2000-07-10

Family

ID=10716635

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6501101A Expired - Fee Related JP3061064B2 (ja) 1992-06-05 1993-06-07 核酸増幅の阻害における核酸類似物の使用

Country Status (17)

Country Link
US (2) US5891625A (ja)
EP (1) EP0646181B1 (ja)
JP (1) JP3061064B2 (ja)
KR (2) KR0140836B1 (ja)
AT (1) ATE147441T1 (ja)
AU (1) AU674520B2 (ja)
CA (1) CA2136831C (ja)
CZ (1) CZ282786B6 (ja)
DE (1) DE69307317T2 (ja)
DK (1) DK0646181T3 (ja)
ES (1) ES2098752T3 (ja)
FI (1) FI110694B (ja)
GB (1) GB9211979D0 (ja)
HU (1) HU219371B (ja)
NO (1) NO317111B1 (ja)
SK (1) SK149394A3 (ja)
WO (1) WO1993025706A1 (ja)

Families Citing this family (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6020124A (en) * 1992-04-27 2000-02-01 Trustees Of Dartmouth College Detection of soluble gene sequences in biological fluids
US7825215B1 (en) 1993-04-26 2010-11-02 Peter E. Nielsen Substituted nucleic acid mimics
GB9311386D0 (en) * 1993-06-02 1993-07-21 Pna Diagnostics As Nucleic acid analogue assay procedures
EP0726965A1 (en) * 1993-11-23 1996-08-21 Ciba Corning Diagnostics Corp. Use of antisense oligomers in a process for controlling contamination in nucleic acid amplification reactions
GB2284209A (en) * 1993-11-25 1995-05-31 Ole Buchardt Nucleic acid analogue-induced transcription of RNA from a double-stranded DNA template
US6133444A (en) * 1993-12-22 2000-10-17 Perseptive Biosystems, Inc. Synthons for the synthesis and deprotection of peptide nucleic acids under mild conditions
WO1995029921A1 (en) * 1994-04-29 1995-11-09 Perseptive Biosystems, Inc. Activated esters of 1-phenylpyrazolin-5-one for labelling amine-functionalized molecules
US5629152A (en) * 1994-08-01 1997-05-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Trisubstituted β-lactams and oligo β-lactamamides
ZA956776B (en) * 1994-08-25 1996-03-20 Akzo Nobel Nv A process for making the product of a nucleic acid amplification reaction incapable of being a target for further amplification a diagnostic assay employing said process a kit and a container suitable for carrying out said process for assay
US6033851A (en) * 1994-12-09 2000-03-07 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for suppressing nonspecific hybridization in primer extension method
EP0813610A1 (de) * 1995-03-04 1997-12-29 Roche Diagnostics GmbH Sequenzspezifischer nachweis von nukleinsäuren
CA2219891C (en) 1995-05-05 2002-01-29 The Perkin-Elmer Corporation Methods and reagents for combined pcr amplification and hybridization probing assay
US6001645A (en) * 1995-06-07 1999-12-14 Promega Corporation Thermophilic DNA polymerases from thermotoga neapolitana
EP0832280A2 (en) * 1995-06-07 1998-04-01 Abbott Laboratories Probe masking method of reducing background in an amplification reaction
US6077664A (en) * 1995-06-07 2000-06-20 Promega Corporation Thermophilic DNA polymerases from Thermotoga neapolitana
DE69632324T2 (de) * 1995-06-07 2005-06-16 PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham Pna-dna-chimäre und pna-synthone zu deren herstellung
EP0870055B1 (en) 1995-10-12 2007-05-16 LANSDORP, Peter, M. Method for detecting multiple copies of a repeat sequence in a nucleic acid molecule
WO1997014793A1 (en) * 1995-10-20 1997-04-24 Trustees Of Boston University Nucleic acid clamps
US6143496A (en) 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
US6617422B1 (en) 1997-05-23 2003-09-09 Peter Nielsen Peptide nucleic acid monomers and oligomers
US6900012B1 (en) * 1997-06-03 2005-05-31 The University Of Chicago Plant artificial chromosome compositions and methods
US7193128B2 (en) * 1997-06-03 2007-03-20 Chromatin, Inc. Methods for generating or increasing revenues from crops
US7227057B2 (en) 1997-06-03 2007-06-05 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
US7235716B2 (en) 1997-06-03 2007-06-26 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
US7119250B2 (en) 1997-06-03 2006-10-10 The University Of Chicago Plant centromere compositions
US6156953A (en) * 1997-06-03 2000-12-05 University Of Chicago Plant artificial chromosome compositions and methods
US6485901B1 (en) 1997-10-27 2002-11-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons
WO1999034014A2 (en) * 1997-12-23 1999-07-08 Roche Diagnostics Gmbh A method for the determination of a nucleic acid
AU759915B2 (en) 1998-07-31 2003-05-01 Gen-Probe Incorporated Reversible inhibiting probes
US7981599B1 (en) 1998-07-31 2011-07-19 Boston Probes, Inc. Non-nucleic acid probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection of individual human chromosomes X, Y, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18 and 20 as 13/21 as a pair
US6165337A (en) * 1998-12-23 2000-12-26 Shelton Scientific Manufacturing, Inc. Semi-dry electrophoresis apparatus and method
US7989202B1 (en) 1999-03-18 2011-08-02 The University Of Chicago Plant centromere compositions
WO2001032931A2 (en) * 1999-11-02 2001-05-10 Curagen Corporation Method and compositions for selectively inhibiting amplification of sequences in a population of nucleic acid molecules
WO2001048242A2 (en) 1999-12-29 2001-07-05 Mergen Ltd. Methods for amplifying and detecting multiple polynucleotides on a solid phase support
US20020015951A1 (en) * 2000-01-06 2002-02-07 Bader Joel S. Method of analyzing a nucleic acid
US6962906B2 (en) * 2000-03-14 2005-11-08 Active Motif Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use
US20040014644A1 (en) * 2000-03-14 2004-01-22 Vladimir Efimov Oligonucleotide analogues and methods of use for modulating gene expression
CA2402319A1 (en) 2000-03-14 2001-09-20 Active Motif Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use
US6376191B1 (en) 2000-03-22 2002-04-23 Mergen, Ltd. Microarray-based analysis of polynucleotide sequence variations
US6936443B2 (en) * 2000-04-03 2005-08-30 Cytyc Corporation Detection and typing of human papillomavirus using PNA probes
DE60141205D1 (de) 2000-04-03 2010-03-18 Cytyc Corp Nachweis und typisierung des papillomavirus mittels pna-sonden
GB0021286D0 (en) * 2000-08-30 2000-10-18 Gemini Genomics Ab Identification of drug metabolic capacity
EP1349958B1 (en) 2000-09-26 2009-06-03 Boston Probes, Inc. Probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection, identification and/or enumeration of bacteria
US6905824B2 (en) * 2000-12-15 2005-06-14 Boston Probes, Inc. Methods for determining organisms not requiring the separation of fixative or excess probe
ATE346950T1 (de) 2001-03-09 2006-12-15 Boston Probes Inc Kombinationsoligomere betreffende verfahren, kits und zusammensetzungen
JP2005524384A (ja) * 2001-09-24 2005-08-18 ボストン　プローブス，インコーポレイテッド ゲノム核酸におけるランダム分布反復配列への検出可能なプローブ結合の抑制に関する方法、キットおよび組成物
EP1487858A4 (en) * 2002-03-21 2006-01-04 Boston Probes Inc PNA OLIGOMERS, OLIGOMER SETS, PROCESSES AND KITS FOR DETECTION OF BACILLUS ANTHRACIS
US20030211509A1 (en) * 2002-03-26 2003-11-13 Wiley Steven R. TNF-delta ligand and uses thereof
US7052840B2 (en) * 2002-04-03 2006-05-30 Capitol Genomix, Inc. Reversible association of nucleic acid with a carboxylated substrate
US20030211483A1 (en) * 2002-05-09 2003-11-13 Schroeder Benjamin G. Methods for the enrichment of low-abundance polynucleotides
WO2003100076A2 (en) * 2002-05-17 2003-12-04 Applera Corporation Pna probes, probe sets, method and kits pertaining to the determination of listeria
US20030220844A1 (en) * 2002-05-24 2003-11-27 Marnellos Georgios E. Method and system for purchasing genetic data
MXPA05000190A (es) * 2002-07-01 2005-09-30 Univ State Cleveland Metodo para detectar polinucleotidos mutados dentro de una gran poblacion de polinucleotidos de tipo silvestre.
JP4588451B2 (ja) * 2002-09-08 2010-12-01 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー Ｐｎａダイマーおよびｐｎａオリゴマー合成に関する方法、組成物およびライブラリー
DE10253966B4 (de) * 2002-11-19 2005-03-24 Clondiag Chip Technologies Gmbh Microarray-basiertes Verfahren zur Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuren in einem kontinuierlichen Prozess
US20040259132A1 (en) * 2002-11-22 2004-12-23 Henrik Stender Peptide nucleic acid probes for analysis of pseudomonas (sensu stricto)
EP2112229A3 (en) 2002-11-25 2009-12-02 Sequenom, Inc. Methods for identifying risk of breast cancer and treatments thereof
US7354715B2 (en) 2003-05-22 2008-04-08 Dow Agrosciences Llc High-throughput methods of screening DNA for deletions and other mutations
US20050221310A1 (en) * 2003-06-06 2005-10-06 Gene Ogic, Inc. Methods for enhancing gene expression analysis
WO2005003370A2 (en) * 2003-06-06 2005-01-13 Gene Logic, Inc. Methods for enhancing gene expression analysis
WO2005010209A2 (de) * 2003-07-24 2005-02-03 Qiagen Gmbh Verfahren zur reversen transkription und/oder amplifikation von nukleinsäuren
WO2005052193A2 (en) * 2003-11-19 2005-06-09 Applera Corporation Methods for determining the degradation state or concentration of nucleic acids
US8729341B2 (en) * 2004-02-23 2014-05-20 University Of Chicago Plants modified with mini-chromosomes
CA2502549C (en) 2004-04-23 2016-02-16 Becton, Dickinson And Company Use of an extraction control in a method of extracting nucleic acids
WO2005111235A2 (en) * 2004-05-04 2005-11-24 Dak Denmark A/S Methods for detecting chromosome aberrations
CA2574610A1 (en) * 2004-07-22 2006-03-02 Sequenom, Inc. Methods for identifying risk of type ii diabetes and treatments thereof
EP1836317A2 (en) * 2004-12-06 2007-09-26 BioVeris Corporation Methods and compositions for detecting bacillus anthracis
US7700287B2 (en) * 2005-01-28 2010-04-20 Life Technologies Corporation Compositions and methods for terminating a sequencing reaction at a specific location in a target DNA template
US20090264635A1 (en) 2005-03-25 2009-10-22 Applera Corporation Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts
US20090246758A1 (en) 2005-06-02 2009-10-01 Advandx, Inc. Peptide nucleic acid probes for analysis of microorganisms
US8481697B2 (en) 2005-07-01 2013-07-09 Dako Denmark A/S Nucleic acid base pairs
WO2007030510A2 (en) * 2005-09-08 2007-03-15 Chromatin Inc. Plants modified with mini-chromosomes
DE102005048503B4 (de) * 2005-10-07 2012-10-18 InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH Verfahren zur Steuerung der abschnittsweisen enzymatischen Nukleinsäurevervielfältigung über inkomplette Komplementärstränge
EP2479291A1 (en) * 2005-10-27 2012-07-25 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification using non-random primers
ATE488587T1 (de) 2005-12-06 2010-12-15 Ambion Inc Rückübertragungs-primer und verfahren zu deren entwurf
ES2345954T3 (es) * 2006-05-12 2010-10-06 Cepheid Deteccion de la union de recombinacion de adn.
EP2602321B1 (en) 2006-05-31 2017-08-23 Sequenom, Inc. Methods and compositions for the extraction and amplification of nucleic acid from a sample
US8153369B2 (en) 2006-06-05 2012-04-10 Cancer Care Ontario Assessment of risk for colorectal cancer
US8119352B2 (en) * 2006-06-20 2012-02-21 Cepheld Multi-stage amplification reactions by control of sequence replication times
WO2008070525A1 (en) 2006-12-04 2008-06-12 Luminex Corporation Oxocarbonamide peptide nucleic acids and methods of using same
US7902345B2 (en) 2006-12-05 2011-03-08 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
EP2099930B1 (en) 2006-12-13 2015-02-18 Luminex Corporation Systems and methods for multiplex analysis of pcr in real time
WO2008083261A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-10 Applera Corporation Systems and methods for detecting nucleic acids
CN101978070A (zh) * 2006-12-29 2011-02-16 应用生物系统公司 检测核酸的系统和方法
WO2008098142A2 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for rhd typing, gender determination and nucleic acid quantification
GB0703996D0 (en) * 2007-03-01 2007-04-11 Oxitec Ltd Nucleic acid detection
GB0703997D0 (en) * 2007-03-01 2007-04-11 Oxitec Ltd Methods for detecting nucleic sequences
EP2079839A4 (en) 2007-03-05 2009-11-18 Cancer Care Ontario ASSESSMENT OF COLORECTAL CARCINOMA RISK
US8614089B2 (en) * 2007-03-15 2013-12-24 Chromatin, Inc. Centromere sequences and minichromosomes
CN101641452B (zh) 2007-03-26 2013-10-23 塞昆纳姆股份有限公司 限制性核酸内切酶增强的多态序列检测
EP2167537A2 (en) 2007-07-03 2010-03-31 Dako Denmark A/S Compiled methods for analysing and sorting samples
WO2009032781A2 (en) 2007-08-29 2009-03-12 Sequenom, Inc. Methods and compositions for universal size-specific polymerase chain reaction
US9605035B2 (en) 2008-01-10 2017-03-28 Research Development Foundation Vaccines and diagnostics for the ehrlichioses
AU2009223671B2 (en) 2008-03-11 2014-11-27 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
US8206926B2 (en) 2008-03-26 2012-06-26 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
CA2724638C (en) 2008-05-27 2020-02-18 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods comprising a polar aprotic solvent
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8476013B2 (en) * 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
CA2743057C (en) 2008-11-07 2019-11-26 Research Development Foundation Compositions and methods for the inhibition of cripto/grp78 complex formation and signaling
CN102301005A (zh) 2008-12-17 2011-12-28 生命技术公司 用于检测等位基因变体的方法、组合物和试剂盒
EP3301446B1 (en) 2009-02-11 2020-04-15 Caris MPI, Inc. Molecular profiling of tumors
WO2010097655A1 (en) 2009-02-26 2010-09-02 Dako Denmark A/S Compositions and methods for rna hybridization applications
EP2408936A4 (en) * 2009-03-18 2013-01-30 Sequenom Inc USE OF HEAT-STAINED ENDONUCLEASES FOR THE PREPARATION OF REPORTER MOLECULES
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
CN103911428B (zh) 2009-03-27 2016-02-24 生命技术公司 用于检测等位基因变体的方法、组合物和试剂盒
EP3211095B1 (en) 2009-04-03 2019-01-02 Sequenom, Inc. Nucleic acid preparation compositions and methods
EP2789689B1 (en) 2009-06-29 2016-04-27 Luminex Corporation Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
US9096909B2 (en) 2009-07-23 2015-08-04 Chromatin, Inc. Sorghum centromere sequences and minichromosomes
US20160186266A1 (en) 2009-10-27 2016-06-30 Carislife Sciences, Inc. Molecular profiling for personalized medicine
EP2507391B1 (en) 2009-12-02 2016-08-17 Dako Denmark A/S Compositions and methods for performing hybridizations with no denaturation
EP3660165B1 (en) 2009-12-22 2023-01-04 Sequenom, Inc. Processes and kits for identifying aneuploidy
WO2011087789A2 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Becton, Dickinson And Company Methods for the detection of microorganisms
JP4960536B2 (ja) * 2010-02-25 2012-06-27 パナソニック株式会社 二本鎖ｄｎａ中の標的配列を増幅する方法
WO2012095639A2 (en) 2011-01-14 2012-07-19 Genefirst Limited Methods, compositions, and kits for determing the presence/absence of a varian nucleic acid sequence
US8460872B2 (en) 2011-04-29 2013-06-11 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species
EP2761028A1 (en) 2011-09-30 2014-08-06 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods using formamide
US11118226B2 (en) 2011-10-21 2021-09-14 Agilent Technologies, Inc. Hybridization compositions and methods
US20140377762A1 (en) 2011-12-19 2014-12-25 360 Genomics Ltd. Method for enriching and detection of variant target nucleic acids
US9605313B2 (en) 2012-03-02 2017-03-28 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US20140093873A1 (en) 2012-07-13 2014-04-03 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
WO2014033314A1 (en) 2012-09-03 2014-03-06 Uab Bioseka Antisense oligonucleotide targeting bacterial glucosyltransferases
EP2929050A1 (en) 2012-12-10 2015-10-14 AdvanDx, Inc. Use of probes for mass spectrometric identification of microorganisms or cells and associated conditions of interest
US9896728B2 (en) 2013-01-29 2018-02-20 Arcticrx Ltd. Method for determining a therapeutic approach for the treatment of age-related macular degeneration (AMD)
EP3597774A1 (en) 2013-03-13 2020-01-22 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
KR102206573B1 (ko) 2013-03-15 2021-01-25 테출론 인코포레이티드 스타필로코커스 아우레우스 감염의 치료를 위한 안티센스 분자
WO2014144423A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Techulon Inc. Antisense molecules for treatment of staphylococcus aureus infection
LT6214B (lt) 2013-10-07 2015-08-25 Uab "Bioseka" Priešprasminiai oligonukleotidai aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijai
WO2015057998A1 (en) 2013-10-16 2015-04-23 The University Of British Columbia Device for formulating particles at small volumes
EP3065706A4 (en) 2013-11-08 2017-11-29 Baylor Research Institute Nuclear localization of glp-1 stimulates myocardial regeneration and reverses heart failure
EP3117011B1 (en) 2014-03-13 2020-05-06 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2016134293A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Baylor College Of Medicine p63 INACTIVATION FOR THE TREATMENT OF HEART FAILURE
SG10202104058XA (en) 2015-10-14 2021-05-28 Bio Path Holdings Inc P-ethoxy nucleic acids for liposomal formulation
CN108778477B (zh) 2016-01-06 2022-02-25 不列颠哥伦比亚大学 分叉混合器及其使用和制造方法
US20190177391A1 (en) 2016-03-31 2019-06-13 Baylor Research Institute Angiopoietin-like protein 8 (angptl8)
WO2017193025A1 (en) 2016-05-06 2017-11-09 William Marsh Rice University Stoichiometric nucleic acid purification using randomer capture probe libraries
KR20190053905A (ko) 2016-09-16 2019-05-20 바이오-패쓰 홀딩스 인크. 리포솜 안티센스 올리고뉴클레오타이드와의 병용 요법
EP3519578B1 (en) 2016-10-03 2021-12-22 Precision Nanosystems Inc Compositions for transfecting resistant cell types
CA3121170A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Caris Mpi, Inc. Next-generation molecular profiling
WO2021112918A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 Caris Mpi, Inc. Pan-cancer platinum response predictor

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4988617A (en) * 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
DE69131891T2 (de) * 1990-02-16 2000-06-15 Hoffmann La Roche Verbesserungen in der spezifität und zweckmässigkeit der polymerase-kettenreaktion
WO1992007957A1 (en) * 1990-10-31 1992-05-14 Cimino George D Methods and compositions for minimizing inhibition of nucleic acid amplification
DK51092D0 (da) * 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf

Also Published As

Publication number Publication date
NO944655L (no) 1995-02-03
CA2136831A1 (en) 1993-12-23
DE69307317D1 (de) 1997-02-20
ATE147441T1 (de) 1997-01-15
JPH08501681A (ja) 1996-02-27
CZ295194A3 (en) 1995-09-13
KR0140836B1 (ko) 1998-06-15
NO317111B1 (no) 2004-08-16
CZ282786B6 (cs) 1997-10-15
AU4323593A (en) 1994-01-04
HUT71931A (en) 1996-02-28
US5891625A (en) 1999-04-06
EP0646181A1 (en) 1995-04-05
CA2136831C (en) 2002-11-05
EP0646181B1 (en) 1997-01-08
AU674520B2 (en) 1997-01-02
HU9403463D0 (en) 1995-02-28
HU219371B (en) 2001-03-28
NO944655D0 (no) 1994-12-02
WO1993025706A1 (en) 1993-12-23
DE69307317T2 (de) 1997-05-22
FI110694B (fi) 2003-03-14
KR950702252A (ko) 1995-06-19
US5972610A (en) 1999-10-26
ES2098752T3 (es) 1997-05-01
FI945725A0 (fi) 1994-12-05
SK149394A3 (en) 1996-01-10
FI945725A (fi) 1994-12-05
DK0646181T3 (da) 1997-10-13
GB9211979D0 (en) 1992-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3061064B2 (ja) 核酸増幅の阻害における核酸類似物の使用
US20210388430A1 (en) Compositions of toehold primer duplexes and methods of use
JP3143475B2 (ja) 二本鎖ｄｎａの核酸類似体による誘導転写
Wu et al. Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia.
KR970003151B1 (ko) 뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법
US8889350B2 (en) Methods and compositions for isolating polynucleotides
WO2000043531A9 (en) Methods and kits for characterizing gc-rich nucleic acid sequences
Carvalho et al. Optimization of a multiplex minisequencing protocol for population studies and medical genetics
WO2008143367A1 (en) Haplotyping method by multiplex amplification
EP1117826A1 (en) Oligonucleotide primers that destabilize non-specific duplex formation and uses thereof
JP4235283B2 (ja) 小三本鎖形成ｐｎａオリゴ
JP2004194619A (ja) 競合核酸を使用した酵素反応方法
Jendraschak et al. Isolation of Human Promoter Regions byAluRepeat Consensus-Based Polymerase Chain Reaction
WO2024106289A1 (ja) 塩基配列差異の検出キット及び検出法
JP4616988B2 (ja) 三本鎖ｄｎａ形成技術を応用したｄｎａ多型検出方法
Marras 2 Artificial Hybridization Probes
JP2005323583A (ja) 遺伝子多型の検出方法
JP2004033090A (ja) ビブリオ・バルニフィカスの検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090428

Year of fee payment: 9

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees