JPWO2013132700A1 - 標的核酸の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(2)核酸調製工程で調製した核酸を鋳型として標識プローブを調製する工程
(3)対象となる細菌が属する種または属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行う工程
(4)上記ハイブリダイゼーション工程においてハイブリダイゼーションの成立の有無を判定する工程
所定の塩基配列(好ましくは、20塩基以上50塩基以下であり、より好ましくは、20塩基以上25塩基以下である。)を有する検出用プローブを備える固相体を準備する工程と、
前記標的核酸を検出するためのシグナル発生部を有するシグナル化標的核酸を準備する工程と、
前記シグナル化標的核酸と、前記検出用プローブと、前記標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位(好ましくは、15塩基以上であり、60塩基以下である。)と前記検出用プローブの前記所定の塩基配列部分と特異的にハイブリダイズする第2の部位(好ましくは、20塩基以上50塩基以下であり、より好ましくは、20塩基以上25塩基以下である。)とを備えるオリゴヌクレオチドである仲介剤と、これらのハイブリダイズ産物を形成可能に接触させる工程と、
前記固相体上において、前記シグナル化標的核酸の前記シグナル発生部に基づく情報を取得する工程と、
を備える、方法。
(2) 前記シグナル化標的核酸の準備工程は、標的核酸を含む可能性のある核酸試料に対してDNAポリメラーゼを用いたDNA断片増幅法を利用して前記シグナル化標的核酸を取得する工程である、(1)に記載の方法。
(3) 前記シグナル化標的核酸の準備工程は、シグナル発生部を有するプライマーを含むプライマーセットを用いたDNAポリメラーゼを用いたDNA断片増幅法を利用する、(2)に記載の方法。
(4) 前記シグナル発生部は、一次的又は二次的に発色可能な物質を含む、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5) 前記検出用プローブは前記標的核酸に予め関連付けられた所定の塩基配列を有している、(1)又は(2)に記載の方法。
(6) 前記検出用プローブの前記所定の塩基配列は、正規直交化配列から選択される、(5)に記載の方法。
(7) 前記検出用プローブの前記所定の塩基配列は、配列番号1〜配列番号100に記載の塩基配列又はこの塩基配列に相補的な塩基配列から選択される、(5)又は(6)に記載の方法。
(8) 前記固相体準備工程は、2以上の前記標的核酸を検出可能に、2以上の前記検出用プローブを備える前記固相体を準備する工程である、(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9) 前記仲介剤は、さらに、第1の部位と第2の部位とを連結するリンカー部位を備えている、(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10) 前記仲介剤の前記リンカー部位は、DNAポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位であり、好ましくは、リン酸ジエステル結合を介して前記プローブ中のヌクレオチドに隣接される、元素数が2以上40以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含んでり、より好ましくは、以下のいずれかの式で表される、方法。
5’−O−CmH2m−O−3’ 式(1)
(式中、5’は、5’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、3’は、3’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、mは2以上40以下の整数を表す。)、
又は、
5’−(OCnH2n)l−O−3’ 式(2)
(式中、5’は、5’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、3’は、3’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、nは2以上4以下の整数を表し、lは、2以上の整数であって、(n+1)×lは40以下となる整数を表す。)
(11) 歯周炎に関連する微生物の検出用である、(1)〜(10)のいずれかに記載の方法。
(12) 標的核酸の検出用キットであって、
所定の塩基配列を有する検出用プローブ1又は2以上を備える固相体と、
前記標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位と前記検出用プローブの前記所定の塩基配列部分と特異的にハイブリダイズする第2の部位とを備えるオリゴヌクレオチドと、
を備える、キット。
(13) 前記シグナル発生部は、一次的又は二次的に発色可能な物質を含む、(12)に記載のキット。
(14) 前記検出用プローブは前記標的核酸に予め関連付けられた所定の塩基配列を有している、(12)又は(13)に記載のキット。
(15) 前記検出用プローブの前記所定の塩基配列は、正規直交化配列から選択される、(14)に記載のキット。
(16) 前記検出用プローブの前記所定の塩基配列は、配列番号1〜配列番号100に記載の塩基配列又はこの塩基配列に相補的な塩基配列から選択される、(15)に記載のキット。
(17) 前記仲介剤は、さらに、第1の部位と第2の部位とを連結するリンカー部位を備えている、(12)〜(16)のいずれかに記載のキット。
(18) 前記仲介剤の前記リンカー部位は、DNAポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位である、(17)に記載のキット。
(19) さらに、前記標的核酸を検出するためのシグナル発生部を有するシグナル化標的核酸をDNAポリメラーゼを用いてDNA増幅方法によって取得するためプライマーセットを備える、(12)〜(18)のいずれかに記載のキット。
(20) 前記標的核酸は、歯周炎に関連する微生物を識別可能な標的核酸である、(12)〜(19)のいずれかに記載のキット。
(21) 所定の塩基配列を有する1又は複数のプローブを備える固相体であるユニバーサルアレイから1又は2以上の標的核酸に対するオーダーメイドアレイを製造する方法であって、
前記ユニバーサルアレイを準備する工程と、
前記1又は2以上の標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位と前記プローブの前記所定の配列と特異的にハイブリダイズする第2の部位とを有する1又は2以上のオリゴヌクレオチドである仲介剤を準備する工程と、
前記ユニバーサルアレイ上において前記プローブと前記仲介剤とのハイブリダイズ産物を形成する工程と、
を備える、方法。
(22) 所定の塩基配列を有する1又は複数のプローブを備える固相体であるユニバーサルアレイから1又は2以上の標的核酸に対するオーダーメイドキットを製造する方法であって、
前記ユニバーサルアレイを準備する工程と、
前記1又は2以上の標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位と前記プローブの前記所定の塩基配列と特異的にハイブリダイズする第2の部位とを有する1又は2以上のオリゴヌクレオチドである仲介剤を準備する工程と、
を備える、方法。
すなわち、
(1)シグナル発生部を有するシグナル化標的核酸を準備し、
(2)このシグナル化標的核酸と、固相体上の検出用プローブと、シグナル化標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位と検出用プローブと特異的にハイブリダイズする第2の部位とを備えるオリゴヌクレオチドである仲介剤と、これらのハイブリダイズ産物を形成可能に接触させ、
(3)固相体上において、シグナル化標的核酸のシグナル発生部に基づく情報を取得する。
本明細書に開示される標的核酸の検出方法は、所定の塩基配列を有する検出用プローブを備える固相体を準備する工程と、標的核酸を検出するためのシグナル発生部を有するシグナル化標的核酸を準備する工程と、シグナル化標的核酸と、検出用プローブと、標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位と検出用プローブの所定の塩基配列部分と特異的にハイブリダイズする第2の部位とを備えるオリゴヌクレオチドである仲介剤と、を、これらのハイブリダイズ産物を形成可能に接触させる工程と、固相体上において、前記シグナル化標的核酸の前記シグナル発生部に基づく情報を取得する工程と、を備えることができる。
固相体準備工程は、検出用プローブが固定化された固相体を準備する。2以上の標的核酸を検出可能に、2以上の検出用プローブが固相体に固定化されていてもよい。こうした固相体は、検出方法の実施に先立って予め準備していてもよいし、商業的に入手してもよいし、検出方法の実施毎に調製してもよい。
シグナル化標的核酸は、標的核酸とシグナル発生部とを備えている。標的核酸は既に記載したとおりである。
シグナル発生部は、従来公知のものを適宜選択して用いることができる。それ自体励起されると蛍光シグナルを発する蛍光物質などの各種色素であってもよいし、さらに酵素反応や抗原抗体反応により第2成分と組み合わせて各種シグナルを発する物質であってもよい。典型的には、Cy3、Alexa555、Cy5、Alexa647等の蛍光標識物質を用いることができる。また、ビオチンとストレプトアビジンHPRとを組み合わせて基質による処理等による発色による検出およびラテックス粒子を用いたクロマト手法として用いてもよい。
ハイブリダイゼーション工程は、シグナル化標的核酸と、検出用プローブと、仲介剤と、を、これらのハイブリダイズ産物を形成可能に接触させる工程である。
仲介剤は、標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位と検出用プローブの所定の塩基配列部分と特異的にハイブリダイズする第2の部位とを備えるオリゴヌクレオチドである。
第1の部位は、標的核酸と特異的にハイブリダイズする部位である。より具体的には、シグナル化標的核酸(二本鎖の場合)のうちシグナル発生部を備えているDNA一本鎖の少なくとも一部を構成する標的配列に特異的にハイブリダイズする部位である。第1の部位は、標的配列と特異的にハイブリダイズする程度の相補性を有するが、好ましくは標的配列と完全に相補的である。なお、標的配列は、融解温度のほか、同時に検出する他の標的核酸と関係から適宜決定される。第1の部位の塩基配列の長さは特に限定しない。好ましくは、15塩基以上であり、60塩基以下である。
第2の部位は、検出用プローブの所定の塩基配列部分と特異的にハイブリダイズする。検出用プローブの所定の塩基配列は、既に記載したとおりである。すなわち、予め標的核酸に関連付けられているが、標的核酸とは関係のない人工的な塩基配列、たとえば、正規直交化配列とすることができる。第2の部位は、こうした検出用プローブにおける検出用配列と特異的なハイブリダイズが可能な程度に相補的である。好ましくは、こうした検出用配列と完全に相補的である。第2の部位は、好ましくは、20塩基以上50塩基以下であり、より好ましくは、20塩基以上25塩基以下である。
仲介剤は、さらに、第1の部位と第2の部位とを連結するリンカー部位を備えていてもよい。こうしたリンカー部位を備えることで、第1の部位と第2の部位との物理的間隔を確保することができて、第1の部位の標的核酸へのハイブリダイズ性と第2の部位の検出用プローブへのハイブリダイズ性とを良好に保持できる。
5’−O−CmH2m−O−3’ 式(1)
(式中、5’は、5’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、3’は、3’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、mは2以上40以下の整数を表す。)
5’−(OCnH2n)l−O−3’ 式(2)
(式中、5’は、5’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、3’は、3’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、nは2以上4以下の整数を表し、lは、2以上の整数であって、(n+1)×lは40以下となる整数を表す。)
情報取得工程は、固相体上において、前記シグナル化標的核酸の前記シグナル発生部に基づく情報を取得する工程前記固相体上の前記増幅断片と前記検出用プローブとのハイブリダイズ産物を検出する工程である。
本明細書に開示される標的核酸の検出用キットは、所定の塩基配列を有する検出用プローブ1又は2以上を備える固相体と、標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位と検出用プローブの前記所定の塩基配列部分と特異的にハイブリダイズする第2の部位とを備えるオリゴヌクレオチドと、を備えることができる。本明細書に開示されるキットによれば、標的核酸とはハイブリダイズしない検出用プローブを標的核酸に関連付けて、固相体上でハイブリダイズによりハイブリダイズ産物を形成することができる。
本明細書に開示されるユニバーサルアレイから1又は2以上の標的核酸に対するオーダーメイドアレイを製造する方法は、所定の塩基配列を有する1又は複数のプローブを備える固相体であるユニバーサルアレイを準備する工程と、1又は2以上の標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位と1又は複数のプローブの所定の配列と特異的にハイブリダイズする第2の部位とを有する1又は2以上のオリゴヌクレオチドである仲介剤を準備する工程と、ユニバーサルアレイ上において1又は複数のプローブと仲介剤とのハイブリダイズ産物を形成する工程と、を備えることができる。このユニバーサルアレイの製造方法においては、プローブ(検出用プローブに対応する)、固相体、第1の部位及び第2の部位を備えるオリゴヌクレオチド(仲介剤)、標的核酸については、既に説明した実施態様をそのまま適用することができる。
本明細書に開示されるユニバーサルアレイから1又は2以上の標的核酸に対するオーダーメイドキットを製造する方法は、所定の塩基配列を有する1又は複数のプローブを備える固相体であるユニバーサルアレイを準備する工程と、1又は2以上の標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位と1又は複数のプローブの所定の塩基配列と特異的にハイブリダイズする第2の部位とを有する1又は2以上のオリゴヌクレオチドである仲介剤を準備する工程と、を備えることができる。このオーダーメイドキットを製造する方法においては、プローブ(検出用プローブに対応する)、固相体、第1の部位及び第2の部位を備えるオリゴヌクレオチド(仲介剤)、標的核酸については、既に説明した実施態様をそのまま適用することができる。
東洋鋼鈑社製geneslideガラス基板に、3’末端をアミノ基で修飾した合成オリゴDNA(株式会社日本遺伝子研究所製)を溶かした水溶液を検出用プローブとし、日本ガイシ株式会社にてGENESHOT(登録商標)スポッターを用いてスポットした。使用した合成オリゴDNA配列は、文献(Analytical Biochemistry 364(2007)78-85)のSupplementary Table1記載のD1_1からD1_100の100種(配列番号1〜100)のうち、D1_1からD1_32(配列番号1〜32)およびD1_100(配列番号100)とした。これらのオリゴDNAをスポットの後、80℃、1時間のベークを行った。さらに、2×SSC/0.2%SDSで15分洗浄後、95℃で2×SSC/0.2%SDSで5分間洗浄し、さらに、滅菌水を用いて10回上下振とうする洗浄を3回行った後、遠心(1000rpm×3分)を行い、液切りを行った。
口腔内の微生物種のうち、評価に用いた微生物種は、Enterococcus faecaliso(微生物A)及びPseudoramibacter alactolyticus(微生物B)とした。また、これらの微生物の標的核酸を増幅するための増幅用プライマー配列は以下の通りとした(以下において、塩基配列は、特に断りのない限り、それぞれ5’から3’方向で示す)。
R−プライマー(微生物A用):GCAGATTCATTGGTCAGAGAACATATCTCTAGAGTGGT
R−プライマー(微生物B用):CATCTAAAGCGTTCCCAGTTCCATATCTCTATTGCGCT
(2)で蛍光標識された増幅産物(シグナル化標的核酸)を用いたDNAマイクロアレイへの反応及びその検出手順は、以下のとおりとした。
ハイブリダイズ用標識サンプル溶液は、コントロール液(濃度2.5nM)1.5μl、ハイブリダイゼーション液9.0μl及び仲介剤溶液(濃度100nM)4.0μl(小計14.5μl)にシグナル化標的核酸溶液(PCR増幅産物)4.0μlを加えて合計18.5μlとした。
微生物A用
仲介剤I−A1:AGGGTAACCAACCAGCGAGCAGATTCATTGGTCAGAGAACA(プローブD1−001に対応)
仲介剤I−A2:AAAGTGCGTCTAAGTTCGCATCTAAAGCGTTCCCAGTTCCA(プローブD1−002に対応)
微生物B用
仲介剤I−B1:CAGAGGGTAGCCAAGCCGGTCCGAAATTACAACGAAGCGAA(プローブD1−003に対応)
仲介剤I−B2:ATCCACATCATCCACCGAGTAGCGATTTCTTAGGATGCCT(プローブD1−004に対応)
微生物A用
仲介剤II−A1:AGGGTAACCAACCAGCGAXGCAGATTCATTGGTCAGAGAACA(プローブD1−001に対応)
仲介剤II−A2:AAAGTGCGTCTAAGTTCGXCATCTAAAGCGTTCCCAGTTCCA(プローブD1−002に対応)
微生物B用
仲介剤II−B1:CAGAGGGTAGCCAAGCCGXGTCCGAAATTACAACGAAGCGAA(プローブD1−003に対応)
仲介剤II−B2:ATCCACATCATCCACCGXAGTAGCGATTTCTTAGGATGCCT(プローブD1−004に対応)
調製したハイブリダイズ用標識サンプル溶液を、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を使用し、90℃で1分加熱後、ヒートブロック(TAITEC社DTU-N)を使用し80℃で1分加熱した。次いで、サンプル溶液を各9μlずつ、DNAマイクロアレイのスポットエリアにかけ、乾燥防止のためコンフォート/プラス用サーモブロックSlide(Eppendorf社)を使用し、37℃で30分間静置することによりハイブリダイズ反応を行った。その後、洗浄液(MilliQ 188.0ml、20×SSC 10.0ml、10%SDS 2.0ml(合計200.0ml)をいれたガラス染色バットにハイブリダイズ反応終了後のガラス基板を浸漬し、5分間上下振とうした。その後、1×SSCを入れたガラス染色バットにガラス基板を移し、1分間上下振とうし、2000rpmで1分間遠心乾燥し、ガラス基板表面に残った水分を除去した。
MolecularDevices社GenePix4000Bを使用してLaserPowerおよびPMTを適宜調節し、蛍光画像を取得した。結果を図4、図5及び図6に示す。
検出用プローブ(微生物A用):ACCACTCTAGAGATA
検出用プローブ(微生物B用):AGCGCAATAGAGATA
F−プライマー(微生物A及びBの共用):Cy3-AGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACG
R−プライマー(微生物A及びBの共用):Cy3-ATGGTGTGACGGGCGGTGTGT
R−プライマー(微生物A及びBの共用):Cy3-ATGGTGTGACGGGCGGTGTGT
メルクミリポア製Hi-Flow Plus メンブレンシート(60mm x 600mm)にキャプチャーDNAプローブ溶液を、特開2003−75305号公報に記載されている吐出ユニット(インクジェット法)を用いた日本ガイシ株式会社GENESHOT(登録商標)スポッターを用いて、図8に示すパターンとプローブ種でスポットした。なお、使用したプローブの合成オリゴヌクレオチドのDNA配列は、文献(Analytical Biochemistry 364(2007)78-85)のSupplementary Table1記載のD1_1からD1_100の100種のうち任意の44種の配列をコモンタグとして使用し図8に示すものを使用した。なお、D1に続く番号は、配列番号に対応している。スポットに使用した合成オリゴヌクレオチド(DNA)については、5’末端をタンパク質(アルブミン、アビジン等)で修飾されたDNAの固定化を行った。
実施例1と同様の微生物種(Enterococcus faecaliso(微生物A)及びPseudoramibacter alactolyticus(微生物B))を評価に用いた。また、プライマーは、以下に示すFプライマー及びRプライマーを共通して用い、増幅条件は、実施例1と同様の条件とした。
R−プライマー(微生物A及びBの共用):biotin-ATGGTGTGACGGGCGGTGTGT
(2)にて増幅したサンプルを用いてのDNAマイクロアレイへの反応及びその検出手順は以下の通りに行った。すなわち、ハイブリダイズサンプル液は、ハイブリダイゼーション液(0.5%Tween20-1%BSA-PBS)200.0μl、仲介剤溶液(濃度100nM)4.0μl及びコントロール液(濃度2.5nM)4.0μlに各ビオチン化標的核酸溶液(PCR増幅産物)4.0μlを加えて合計212.0μlとした。なお、コントロール液は、biotin-rD1_100(100nM)10μl、TE(pH8.0)390μlを混合して合計400μlとした(Alexa555-rD1_100の最終濃度は、2.5nM)。なお、このbiotin標識オリゴDNAは、DNAマイクロアレイ用プローブのうちD1_100配列に相補な配列の5’末端をbiotinで標識したものである。
仲介剤II−A1:AGGGTAACCAACCAGCGAXGCAGATTCATTGGTCAGAGAACA(プローブD1−001に対応)
仲介剤II−A2:AAAGTGCGTCTAAGTTCGXCATCTAAAGCGTTCCCAGTTCCA(プローブD1−002に対応)
微生物B用
仲介剤II−B1:CAGAGGGTAGCCAAGCCGXGTCCGAAATTACAACGAAGCGAA(プローブD1−003に対応)
DNAマイクロアレイを0.2mlチューブに入る大きさに切断し、チューブ内にセットし、上記調製ハイブリダイズサンプル液各200μlを加えて、ヒートブロック温度90℃で1分間熱変性を行った後、37℃で30分間反応させた。反応終了後、DNAマイクロアレイを洗浄液(0.1%Tween20-1mM EDTA-TBS)入り0.2mlチューブに移し、37℃のヒートブロック内で洗浄作業(37℃×1分、37℃×10分、37℃×1分)を行った。
アレイの乾燥後の発色結果を図9に示す。図9に示すように、発色結果を目視にて確認したところ、濃い発色が見られた。以上の結果から、仲介剤を介してプローブとビオチン化標的核酸とのハイブリダイズ産物がアレイ上において検出できたことがわかった。
メルクミリポア製Hi-Flow Plus メンブレンシート(60mm x 600mm)にキャプチャーDNAプローブ溶液を、特開2003−75305号公報に記載されている吐出ユニット(インクジェット法)を用いた日本ガイシ株式会社GENESHOT(登録商標)スポッターを用いて、図10に示すパターン及びプローブ種にてスポットした。なお、図10に示すプローブのD1に続く番号は、配列番号に対応している。スポットに使用した合成オリゴヌクレオチド(DNA)については、5’末端をタンパク質(アルブミン、アビジン等)で修飾されたDNAの固定化を行った。スポットの後、60℃、1時間のベークを行うことで合成オリゴDNAの固定化を行った。
実施例1と同様の微生物種(Enterococcus faecaliso(微生物A)及びPseudoramibacter alactolyticus(微生物B))を評価に用いた。また、プライマーは、実施例2で用いたのと同じFプライマー及びRプライマーを共通して用い、増幅条件は、実施例1と同様の条件とした。増幅したサンプル遺伝子はQIAGEN社のMinElute PCR Purification Kitにて精製を行った後、狙いとする長さの断片として増幅されていることを確認した。
(2)にて増幅したDNAを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応及びその検出を行った。
微生物A用
仲介剤II−A1:AGGGTAACCAACCAGCGAXGCAGATTCATTGGTCAGAGAACA(プローブD1−001に対応)
微生物B用
仲介剤II−B1:CAGAGGGTAGCCAAGCCGXGTCCGAAATTACAACGAAGCGAA(プローブD1−003に対応)
Claims (20)
- 標的核酸を検出する方法であって、
所定の塩基配列を有する検出用プローブを備える固相体を準備する工程と、
前記標的核酸を検出するためのシグナル発生部を有するシグナル化標的核酸を準備する工程と、
前記シグナル化標的核酸と、前記検出用プローブと、前記標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位と前記検出用プローブの前記所定の塩基配列部分と特異的にハイブリダイズする第2の部位(好ましくは、20塩基以上50塩基以下であり、より好ましくは、20塩基以上25塩基以下である。)とを備えるオリゴヌクレオチドである仲介剤と、これらのハイブリダイズ産物を形成可能に接触させる工程と、
前記固相体上において、前記シグナル化標的核酸の前記シグナル発生部に基づく情報を取得する工程と、
を備える、方法。 - 前記シグナル化標的核酸の準備工程は、標的核酸を含む可能性のある核酸試料に対してDNAポリメラーゼを用いたDNA断片増幅法を利用して前記シグナル化標的核酸を取得する工程である、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナル化標的核酸の準備工程は、シグナル発生部を有するプライマーを含むプライマーセットを用いたDNAポリメラーゼを用いたDNA断片増幅法を利用する、請求項2に記載の方法。
- 前記シグナル発生部は、一次的又は二次的に発色可能な物質を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記検出用プローブは前記標的核酸に予め関連付けられた所定の塩基配列を有している、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記検出用プローブの前記所定の塩基配列は、正規直交化配列から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記検出用プローブの前記所定の塩基配列は、配列番号1〜配列番号100に記載の塩基配列又はこの塩基配列に相補的な塩基配列から選択される、請求項5又は6に記載の方法。
- 前記固相体準備工程は、2以上の前記標的核酸を検出可能に、2以上の前記検出用プローブを備える前記固相体を準備する工程である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記仲介剤は、さらに、第1の部位と第2の部位とを連結するリンカー部位を備えている、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記仲介剤の前記リンカー部位は、DNAポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位であり、好ましくは、リン酸ジエステル結合を介して前記プローブ中のヌクレオチドに隣接される、元素数が2以上40以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含んでおり、より好ましくは、以下のいずれかの式で表される、方法。
5’−O−CmH2m−O−3’ 式(1)
(式中、5’は、5’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、3’は、3’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、mは2以上40以下の整数を表す。)、
又は、
5’−(OCnH2n)l−O−3’ 式(2)
(式中、5’は、5’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、3’は、3’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、nは2以上4以下の整数を表し、lは、2以上の整数であって、(n+1)×lは40以下となる整数を表す。) - 標的核酸の検出用キットであって、
所定の塩基配列を有する検出用プローブ1又は2以上を備える固相体と、
前記標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位と前記検出用プローブの前記所定の塩基配列部分と特異的にハイブリダイズする第2の部位とを備えるオリゴヌクレオチドと、
を備える、キット。 - 前記シグナル発生部は、一次的又は二次的に発色可能な物質を含む、請求項11に記載のキット。
- 前記検出用プローブは前記標的核酸に予め関連付けられた所定の塩基配列を有している、請求項11又は12に記載の方法。
- 前記検出用プローブの前記所定の塩基配列は、正規直交化配列から選択される、請求項13に記載のキット。
- 前記検出用プローブの前記所定の塩基配列は、配列番号1〜配列番号100に記載の塩基配列又はこの塩基配列に相補的な塩基配列から選択される、請求項14に記載のキット。
- 前記仲介剤は、さらに、第1の部位と第2の部位とを連結するリンカー部位を備えている、請求項11〜15のいずれかに記載のキット。
- 前記仲介剤の前記リンカー部位は、DNAポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位である、請求項16に記載のキット。
- さらに、前記標的核酸を検出するためのシグナル発生部を有するシグナル化標的核酸をDNAポリメラーゼを用いてDNA増幅方法によって取得するためプライマーセットを備える、請求項11〜17のいずれかに記載のキット。
- 所定の塩基配列を有する1又は複数のプローブを備える固相体であるユニバーサルアレイから1又は2以上の標的核酸に対するオーダーメイドアレイを製造する方法であって、
前記ユニバーサルアレイを準備する工程と、
前記1又は2以上の標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位と前記プローブの前記所定の配列と特異的にハイブリダイズする第2の部位とを有する1又は2以上のオリゴヌクレオチドである仲介剤を準備する工程と、
前記ユニバーサルアレイ上において前記プローブと前記仲介剤とのハイブリダイズ産物を形成する工程と、
を備える、方法。 - 所定の塩基配列を有する1又は複数のプローブを備える固相体であるユニバーサルアレイから1又は2以上の標的核酸に対するオーダーメイドキットを製造する方法であって、
前記ユニバーサルアレイを準備する工程と、
前記1又は2以上の標的核酸と特異的にハイブリダイズする第1の部位と前記プローブの前記所定の塩基配列と特異的にハイブリダイズする第2の部位とを有する1又は2以上のオリゴヌクレオチドである仲介剤を準備する工程と、
を備える、方法。
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