KR101151602B1 - 클레나우 단편을 이용한 ｒｔ-ｐｃｒ 반응의 성능을 개선시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 RT-PCR의 성능을 증진 시킬 수 있는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 변성형 클레나우 단편을 RT-PCR 반응액에 첨가함으로써 RT-PCR 반응의 민감도와 증폭 효율을 증진 시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명을 따르면 역전사 효소에 의한 DNA 중합효소 활성 저해를 완화시킬 수 있으며 PCR 반응의 증폭 효율을 개선시킬 수 있어 결과적으로 RT-PCR 반응의 성능을 개선시킬 수 있게 된다.

RT-PCR, 민감도, 증폭 효율, 성능, 변성형, 클레나우 단편

Description

클레나우 단편을 이용한 ＲＴ-ＰＣＲ 반응의 성능을 개선시키는 방법{Method for improving the performance of PCR and RT-PCR using a Klenow fragment}

본 발명은 PCR(polymerase chain reaction) 또는 RT-PCR(reverse transcriptase-PCR)에서의 성능을 개선시킬 수 있는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, PCR 또는 RT-PCR 반응을 실시함에 있어 변성형(denatured) 클레나우 단편(Klenow fragment)을 반응액에 추가로 첨가함으로써 민감도(sensitivity) 및 증폭 효율(amplification efficiency)로 대표되는 성능(performance)을 개선시키는 방법에 관한 것이다.

PCR은 DNA의 원하는 부분을 대량 증폭(amplification)하는 방법으로 DNA 분자의 어느 부분이든지 그 가장자리 서열(border sequence)만 알면 이 방법을 통해서 증폭할 수 있다. 1984년 Kary Mullis가 특정 DNA 서열(sequence)을 증폭하기 위한 방법으로 고안하여 처음으로 PCR이라고 명명하였다. 유전자를 연구 및 분석하는 분자유전학을 포함한 많은 생물학 관련 연구에서 현재까지도 널리 이용되고 있는 기법이다(Science 252: 1643-1651, 1991). PCR은 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 의한 DNA 복제(DNA replication)의 특징을 이용한 기법이다.

PCR에는 여러 종류가 있는데, 그 중 하나가 RT-PCR이다. RT-PCR은 역전사 반응(reverse transcription)과 그 후에 이어서 실시되는 PCR 반응을 결합한 통합 반응을 지칭한다. 역전사 반응이란 RNA로부터 역전사 효소(reverse transcriptase; RTase)의 작용에 의해 DNA가 합성되는 반응을 지칭한다. RT-PCR은 전체적으로 보면 RNA를 주형(template)으로 하여 DNA가 1차적으로 합성되고(역전사 반응), 이 RT 반응에서 합성된 DNA를 주형으로 하여 2차적으로 대량의 DNA가 합성(PCR 반응)되게 된다. 이 RT-PCR을 구성하는 두 반응은 순차적으로 다른 튜브에서 수행될 수도 있으며(uncoupled RT-PCR; two-step RT-PCR), 처음부터 한 튜브에 관련되는 모든 성분을 첨가한 후 하나의 튜브 내에서 일어나게 할 수도 있다(coupled RT-PCR; one-step RT-PCR; continuous RT-PCR). 일반적인 PCR에서는 주형으로 DNA가 사용되는 것에 반하여 RT-PCR에서는 주형으로 RNA가 사용된다는 점이 서로 다르다.

RT-PCR에서는 역전사 반응에서 생성된 DNA를 PCR 반응의 주형으로 사용할 때, 역전사 반응에서 생성된 DNA만을 특별히 분리/정제하여 사용하지 않고 역전사 반응액을 그대로 사용한다. 즉, 역전사 반응과 PCR 반응을 분리하여 실시할 때(즉, two-step RT-PCR)는 역전사 반응액의 일부를 PCR 반응에 주형을 포함한 시료로 그대로 사용하게 되고, 한 튜브에서 두 반응을 모두 구현할 때(즉, one-step RT-PCR)는 분리/정제가 적용되지 않음이 당연하다. 그런데 RT-PCR의 주형으로 역전사 반응에서 생성된 DNA만을 특별히 분리/정제하여 사용하지 않고 역전사 반응액을 그대로 사용하는 경우 다음과 같은 문제가 초래된다. 바로 RTase에 의한 PCR 반응의 저해(inhibition) 현상이다. RTase는 PCR의 핵심 효소인 DNA 중합효소의 효소 활성(enzymatic activity)을 저해한다(Nucl. Acids Res. 20:1487-1490, 1992; BioTechniques 18:678-687, 1995). 이로 인하여 PCR 반응에 첨가되는 역전사 반응액은 양적으로 제한될 수밖에 없다. 특히 한 튜브에서 역전사 반응과 PCR 반응을 모두 실시하는 경우에 RTase에 의한 DNA 중합효소의 효소 활성 저해를 최소화하기 위해서는 반응액에 첨가되는 RTase의 양을 제한할 수밖에 없고, 따라서 일반적으로 사용하는 RTase의 양에 비하여 상대적으로 매우 적은 양이 사용되고 이는 첨가된 DNA 중합효소의 양에 비교하여서도 상대적으로 적게 된다. 이러한 점을 해결할 수 있는 방안이 강구된다면 RT-PCR의 성능은 보다 개선될 수 있다.

이러한 문제를 해결하고자 하는 시도로 미국특허 6,300,069호가 있다. 미국특허 6,300,069호에는 상기의 RTase에 의한 DNA 중합효소의 활성 저해를 완화시키기 위하여 단일중합체성 핵산(homopolymeric nucleic acids; homopolymeric oligonucleotide)을 이용하는 방법이 개시되어 있으나 그 효과가 충분하지 않다.

본 발명자들은 RTase에 의한 PCR 반응의 DNA 중합효소 활성 저해 효과를 완화 또는 방지할 수 있는 방법을 개발하고 이에 더하여 RT-PCR의 증폭 효율까지를 개선시키고자 노력한 결과, 변성형 클레나우 단편의 첨가가 상기 두 측면에서 상당한 효과가 있다는 것을 발견하고 이를 RT-PCR에 적용함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명 세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

따라서 본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 RT-PCR 반응의 성능을 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 RT-PCR 반응의 성능을 개선시키는 데 활용될 수 있는 유용물질을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 변성형 클레나우 단편을 RT-PCR 반응액에 추가로 첨가함으로써 RTase에 의한 저해를 감소시키고 민감도 및 증폭 효율 같은 성능을 증진시키는 방법을 제공한다. 상기 “변성형 클레나우 단편”이란 클레나우 단편의 고유 활성이 상실되게 준비된 변성된 클레나우 단편을 지칭한다.

본 명세서에서 “주형”이라 함은 증폭하고자 하는 유전 정보를 가진 물질을 의미하며, 통상 RNA 또는 DNA이다. 본 명세서에서의 “프라이머(primer)”는 역전사 반응이나 PCR을 실시하기 위해 반드시 필요한 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로 일종의 짧은 DNA 단편을 지칭한다. 프라이머는 단일 가닥(single strand) 형태이다. 본 명세서의 프라이머는 역전사 반응용 프라이머와 PCR 반응용 프라이머로 대별될 수 있다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 이용되는 클레나우 단편은 서열번호 1로 제시되는 아미노산 서열을 갖고 있다. 물론 당분야의 일반적인 방식으로 서열번호 1의 아미노산 서열은 일부가 변경될 수 있으며, 더 나아가 일부분이 제거되거나 또는 추가 부분이 첨가될 수도 있으며 클레나우 단편 전체를 포함하는 융합단백질(fusion protein) 형태일 수도 있다. 이는 당분야에서는 일반적인 것이므로 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.

상기 클레나우 단편을 RT-PCR 반응에 첨가해 줄 때 그 첨가 시점은 역전사 반응 시작 전으로 해도 되고 또는 PCR 반응 전으로 해도 된다. 본 발명자들에 의해 확인된 바에 따르면, 역전사 반응 시작 전에 첨가해 주는 것이 클레나우 단편의 첨가 효과를 극대화할 수 있어 바람직하다.

상기 클레나우 단편의 첨가량은 1-50 단위(unit)의 범위에서 적용하는 것이 바람직하고, 특히 10-30 단위의 범위가 가장 바람직하다. 여기서 1 단위(1 unit)란 75 ng의 단백질 양에 해당하는 클레나우 단편의 양으로 정의한다.

상기 변성형 클레나우 단편의 준비는 화학적 및 물리적 방법으로 달성할 수 있다. 화학적 방법으로는 산이나 알칼리 처리가 일반적이며 유기용매 처리도 가능하다. 물리적 방법으로는 열, 압력, 자외선, X-선, 음파, 동결을 이용하는 방식이 가능하다. 화학적으로 변성시키는 것에 비하여 물리적으로 변성시키는 것이 예기치 못한 결과를 초래할 가능성이 상대적으로 낮으므로 바람직하며, 물리적으로 변성시키는 방법 중에서는 비가역적 변성을 용이하게 달성할 수 있는 열을 이용하는 열적 변성(thermal denaturation)이 가장 바람직하다.

본 발명의 RT-PCR 반응에 적용 가능한 RTase로는 그 종류에 있어 특별한 제한은 없으며, 이에 국한되지 않지만 예로, 조류 골수아세포증 바이러스(Avian Myeblastosis Virus; AMV)로부터 발견된 역전사 효소, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney murine Leukemia Virus; MMLV)로부터 발견된 역전사 효소, 세망내피증 바이러스(Reticuloendotheliosis Virus; REV)로부터 발견된 역전사 효소를 제시할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 RTase로 REV 유래 RTase를 이용한 역전사 반응을 제시하고 있으나 어떠한 RTase가 사용된 역전사 반응도 제한 없이 본 발명이 적용될 수 있다.

본 발명의 RT-PCR 반응에 적용 가능한 DNA 중합효소로는 특별한 제한이 없으며, 이에 국한되지 않지만 예로, Thermus aquaticus 유래의 Taq DNA 중합효소, Thermus thermophilus 유래의 Tth DNA 중합효소, Thermus flavus 유래의 Tfl DNA 중합효소, Thermus ubiquitos 유래의 Hot Tub DNA 중합효소, Thermotoga maritima 유래의 Ultma DNA 중합효소, Pyrococcus furiosus 유래의 Pfu DNA 중합효소, Thermococcus litoralis 유래의 Vent DNA 중합효소 및 Tli DNA 중합효소, Pyrococcus woesei 유래의 Pwo DNA 중합효소(이상 제품명)를 제시할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 Taq DNA 중합효소를 이용한 PCR 반응을 제시하고 있으나 어떠한 DNA 중합효소가 사용된 PCR 반응도 제한 없이 본 발명이 적용될 수 있다.

본 발명은 역전사 반응과 PCR 반응이 결합된 RT-PCR 반응에 집중하여 실시예를 제시하고 있으나, PCR 증폭 효율 증진이라는 효과만을 활용할 목적으로 PCR 반응 단독에만 본 발명을 적용해도 무방하다. PCR 반응에서만 본 발명을 적용하기 위해서는 변성형 클레나우 단편을 PCR 반응 전에 첨가해 주면 된다.

본 발명의 방법에 따르면, 간단히 변성된 클레나우 단편(변성형 클레나우 단편)을 RT-PCR 반응액에 첨가해 줌으로써, RTase에 의한 DNA 중합효소의 활성 저해를 감소시키고 이에 더하여 PCR 반응 자체의 증폭 효율을 증진시켜 결과적으로 RT-PCR 반응의 성능을 높여 줄 수 있다. 또한 본 발명을 따르면, 변성형 클레나우 단편을 PCR 반응에만 첨가하여 단순히 PCR 반응의 성능을 높여 줄 수도 있다. 상기 RT-PCR 반응 또는 PCR 반응의 성능이란 증폭 효율과 민감도를 의미한다. 쉽게 설명하면, 같은 주형의 양으로도 더 많은 산물(product)이 합성되게 하고(증폭 효율 증진), 보다 적은 양의 주형에 대해서도 증폭을 가능하게(민감도 제고) 해 준다. 결론적으로 본 발명은 RT-PCR 반응 또는 PCR 반응의 증폭 효율을 개선시킬 수 있고 민감도를 높여 줄 수 있다. 특히, 이러한 민감도 개선 효과는 주형의 농도가 낮을 때 특히 유효한데, 이러한 특징은 임상 검체를 이용한 진단 분야에서 특히 효과적이다. 왜냐하면 임상 검체에는 매우 적은 양의 주형이 포함되어 있는 것이 일반적이기 때문이다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 클레나우 단편의 제조 및 변성

본 발명의 클레나우 단편은 다음과 같이 제조 되었다. 서열번호 1로 표시되는 아미노산의 서열을 암호화(coding)하고 있는 유전자 서열(nucleotide sequence)을 이용하여 통상적인 재조합 단백질 기술(recombinant protein technology)에 따라 클레나우 단편을 생산하였다. 서열번호 1의 아미노산의 서열에 해당하는 유전자 서열 중 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열을 당분야의 일반적인 방법에 따라 pBAD 벡터(vector) (인비트로젠 사)에 클로닝(cloning)하였다. 제작된 플라스미드(plasmid)를 대장균 TOP10(인비트로젠 사)에 도입시켜 클레나우 단편의 생산균주(production host)를 제작하였다.

제작된 생산균주를 이용한 클레나우 단편의 생산은 다음과 같이 실시하였다. 25 μg/ml의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 170 mM NaCl)에 제작된 생산균주를 접종하여 배양을 시작하였다. 배양을 하면서 세포 배양액(culture broth)의 600 nm에서의 흡광도가 0.4-0.5가 되었을 때 최종 농도가 0.02%가 되게 L-아라비노오스(L-arabinose)를 첨가하여 클레나우 단편의 발현(expression)을 유도(induction)하였다. 발현 유도를 4-5 시간 지속한 후 배양 세포를 원심분리(7,000 rpm, 10 분, 4℃)를 통하여 회수하였다. 회수된 세포 침전물(precipitate)은 세포 침전물 1 g 당 40 ml의 용해 완충액(lysis buffer: 50 mM potassium phosphate, 400 mM NaCl, 100 mM KCl, 10% glycerol, pH 7.8)을 가하여 충분히 풀어준 다음 일반적인 초음파 분쇄법(sonication)을 통하여 세포를 파쇄시켰다. 이렇게 얻어진 세포 파쇄액을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액(supernatant)을 회수하여 클레나우 단편이 다량 포함된 단백질 용액을 준비하였다. 얻어진 단백질 용액에 최종 농도가 0.15%가 되게 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)을 첨가한 후 잘 섞어주었다. 이를 얼음 속에 1시간 동안 방치하여 DNA가 침전되게 해 주었다. 그 다음으로 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간의 원심분리를 실시한 후 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에 최종 농도가 25%가 되게 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)를 첨가한 후 흔들어 주면서 잘 녹여 주었다. 이를 얼음 속에 1시간 동안 방치한 후 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 20분)하여 불필요한 단백질들을 침전시켰다. 원심분리 후 상층액을 회수한 다음 회수된 상층액에 최종 농도가 50%가 되게 암모늄 설페이트를 추가로 첨가하였다. 이를 얼음 속에 1시간 동안 방치한 후 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 20분)를 실시하여 클레나우 단편을 포함한 단백질들을 침전시켰다. 상층액은 제거하고 단백질 침전물은 염제거 완충액(desalting buffer: 50 mM Tris-Cl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), pH 8.0)을 초기에 얻어졌던 세포 파쇄액 부피의 1/10을 가하여 녹였다. 이렇게 얻어진 단백질 용액을 세파덱스 G-25(Sephadex G-25) 염제거 컬럼(desalting column)을 통과시켜 단백질 용액에 포함되어 있던 염이 제거된 단백질 용액을 얻었다. 이렇게 얻어진 단백질 용액을 시료로 하여 이온 교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)를 실시하여 클레나우 단편을 분리/정제하였다. 상기 이온 교환 크로마토그래피에 사용한 컬럼은 QFF 컬럼(지이헬스케어 사)이었으며, 컬럼의 초기 평형화(equilibration)는 5 컬럼 부피의 평형화 완충액(equilibration buffer: 25 mM Tris-Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)을 흘려주는 방식으로 실시하였고, 시료 적하(loading) 후의 1차 세 척(washing)은 3 컬럼 부피의 1차 세척 완충액(1^st washing buffer: 25 mM Tris-Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)을 흘려주는 방식으로 실시하였고, 그 다음 단계인 2차 세척은 4 컬럼 부피의 2차 세척 완충액(2^nd washing buffer: 25 mM Tris-Cl, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, pH 8.0)을 흘려주는 방식으로 실시하였다. 클레나우 단편의 용출(elution)은 20%(v/v) 농도 구배(gredient)의 용출 완충액(elution buffer: 25 mM Tris-Cl, 0.1 mM EDTA, 200 mM KCl, pH 8.0) 조건에서 실시하였다. 얻어진 크로마토그래피 분획(chromatographic fraction)은 센트리콘 YM30(Centricon YM30; 밀리포아 사)을 제조자의 지시에 따라 사용하여 3배 농축하였다. 이렇게 얻어진 정제 클레나우 단편의 농축액은 동부피의 1차 저장 완충액(1^st storage buffer: 50 mM potassium phosphate, 1 mM Dithiothreitol(DTT), 50% glycerol, pH 7.0)과 혼합시켰다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 잘 섞은 다음 다시 혼합용액과 동일 부피의 2차 저장 완충액(2^nd storage buffer: 50 mM potassium phosphate, 1 mM DTTithiothreitol, 75% glycerol, pH 7.0)과 추가 혼합하여 잘 섞어 주었다. 상기 과정을 통하여 정제된 클레나우 단편을 포함한 용액을 얻었다.

이렇게 제조된 클레나우 단편은 본 발명의 변성형 클레나우 단편을 제조하기 위하여 다음과 같은 절차를 수행하였다. 상기 클레나우 단편 용액을 가열 블록(heating block)을 이용하여 95℃에서 5분간 가열해 주어 열변성을 유도하였다. 이렇게 얻어진 것을 변성형 클레나우 단편으로 사용하였다. 통상 사용 시에는 20 μl 부피의 RT-PCR 또는 PCR 반응액에 24 단위의 변성형 클레나우 단편을 첨가해 주는 방식으로 사용하였다.

실시예 2: RT - PCR 반응에서 클레나우 단편의 첨가 효과 조사

RT-PCR 반응에서의 클레나우 단편의 첨가 효과는 다음과 같이 조사되었다. 본 실시예의 RT-PCR 반응은 역전사 반응과 PCR 반응이 분리되어 실시되는 구성으로 되어 있다. 본 실시예의 조사에서는 최적 클레나우 단편의 첨가 시점을 조사하기 위하여 클레나우 단편의 첨가 시점을 역전사 반응 시작 때부터와 PCR 반응 시작 때부터로 구분하여 실시하였다. 또한 첨가해 주는 클레나우 단편은 클레나우 단편의 고유 활성을 그대로 가진 활성형(active form; intact form)과 클레나우 단편의 고유 활성이 없어진 변성형(denatured) 두 종류로 그 형태를 달리 하였다.

본 실시예에서는 1 kbp의 베타-액틴(β-actin) 단편의 증폭과 1.6 kbp의 18S 리보조말 RNA(ribosomal RNA; rRNA) 단편의 증폭을 실시하였으며, 18S rRNA 유전자의 NCBI accession number는 NR_003286이고 β-actin의 NCBI accession number는 BC_008633이다. 주형은 인간세포주(human cell-line) K562로부터 추출한 RNA를 사용하였다. RNA 추출은 인트론바이오테크놀로지사의 easy BLUE RNA Extraction Kit를 사용하여 제품의 사용 설명서에 따라 실시했다.

본 실시예의 역전사 반응 조건은 일반적으로 적용하는 조건인 방법으로 실시하였으며 역전사 반응용 프라이머로는 랜덤 헥사머(random hexamer)를 사용하였다. 역전사 반응 조건을 제시하면 다음과 같다. 조성은 0.8 ng~20 ng human total RNA, 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 3 mM MgCl₂, 25 mM DTT, 75 mM KCl, 0.25 mM의 dNTPs, 10 pmole/μl random hexamer, 40 units RNase inhibitor, 100 units REV RTase이며, 역전사 반응액의 준비가 완료되면 이를 PCR 기기인 써멀 사이클러(thermal cycler)로 옮겨 역전사 반응을 실시했다. 1 kbp의 베타-액틴 단편의 역전사 반응은 50℃에서 1 시간 실시하였으며, 1.6 kbp의 18S rRNA 단편의 역전사 반응도 50℃에서 1 시간 실시하였다.

본 실시예의 PCR 반응은 Taq DNA 중합효소에 기반한 일반적인 방법으로 실시하였으며, 이를 위해 인트론바이오테크놀로지 사의 i- StarTaq ^TM 제품을 사용하였다. 각 주형의 증폭마다 적합한 프라이머를 제작하여 사용하였으며 이를 제시하면 다음 표 1과 같다.

본 실시예의 PCR 반응액의 기본 조성은 30 mM TrisHCl(pH9.0), 30 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 0.25 mM의 dNTPs, 1.5 units i- StarTaq DNA polymerase(인트론바이오테크놀로지 사)이다. 이렇게 준비된 PCR 반응액에 표 1에 제시된 프라이머를 각 증폭에 맞게 1 pmole/μl로 첨가해 주었다. 그리고 마지막으로 역전사 반응액 2 μl를 첨가해 준 후 최종 반응액 부피를 20 μl로 맞추어 주었다. PCR 반응액의 준비가 완료되면 이를 PCR 기기인 써멀 사이클러로 옮겨 PCR 반응을 다음의 조건으로 실시하였다. 1 kbp의 베타-액틴 단편의 PCR 증폭은 94℃로 2분 가열한 다음, 94℃에서 20초 가열, 66℃에서 20초 가열, 72℃에서 1분 가열하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 35회 반복한 후, 이를 72℃에서 2분 더 가열한 다음 최종적으로 4℃에서 방치하는 조건으로 실시하였으며, 1.6 kbp의 18S rRNA 단편의 PCR 증폭은 94℃로 2분 가열한 다음, 94℃에서 20초 가열, 62℃에서 20초 가열, 72℃에서 2분 가열하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 35회 반복한 후, 이를 72℃에서 2분 더 가열한 다음 최종적으로 4℃에서 방치하는 조건으로 실시하였다.

상기 조건으로 PCR을 실시한 후 1% 아가로즈 젤 전기영동을 실시하여 최종 RT-PCR 산물을 분석하였다. 그 결과는 도 1에 제시되어 있다.

도 1의 결과로부터, 활성형 클레나우 단편의 첨가보다는 변성형 클레나우 단편의 첨가가 효과적이라는 사실을 확인할 수 있었다. 또한, 클레나우 단편의 첨가 시점으로는 PCR 반응 때부터 보다는 역전사 반응 시작 시점부터가 보다 적합하다는 것도 확인할 수 있었다. 이 둘 간의 차이는 크지 않았지만, 클레나우 단편의 첨가 시점으로 역전사 반응 시작 시점이 보다 최적이라는 사실로부터 클레나우 단편의 첨가 효과는 PCR 반응 단계에서의 증진 효과 외에 정확한 기작은 불명확하지만 역전사 반응 단계에서도 일부 증진 효과가 있다고 추정할 수 있었다. 그런데, 대부분의 증진 효과가 주로 PCR 반응에 관련되는 것으로 파악되었다.

실시예 3: RT - PCR 의 증폭 효율 개선에 대한 조사

클레나우 단편의 첨가에 의한 RT-PCR 반응의 증폭 효율 개선 여부에 대하여 조사하였다. 본 실시예에서는 1 kbp의 베타-액틴 단편, 1.3 kbp 18S rRNA 단편, 1.6 kbp 18S rRNA 단편의 증폭에서 변성형 클레나우 단편을 다양한 양으로 첨가해 주면서 그 효과를 조사하였다. 전반적 방법은 실시예 2의 방법을 그대로 준용하였다. 다만, 새로 추가된 증폭인 1.3 kbp 18S rRNA 단편의 증폭을 위한 PCR 반응에서는 다음 표 2에 제시된 프라이머를 사용하였다.

새로 추가된 1.3 kbp의 18S rRNA 단편의 PCR 증폭 조건으로는 94℃로 2분 가열한 다음, 94℃에서 20초 가열, 62℃에서 20초 가열, 72℃에서 1분 30초 가열하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 35회 반복한 후, 이를 72℃에서 2분 더 가열한 다음 최종적으로 4℃에서 방치하는 조건으로 실시하였다.

대조 실험으로는 PCR 증폭 효율에 대해 입증된 물질인 소혈청알부민(Bovine serum albumin; BSA)을 여러 양으로 첨가해 주는 실험을 실시하였다(Biochem. Mol. Biol. Int. 44: 157-163, 1998). 본 실시예에서의 변성형 클레나우 단편이나 BSA는 실시예 2의 결과를 고려하여 역전사 반응 시작 때부터 첨가해 주었다. 그 결과는 도 2와 같다.

본 실시예에서는 주형으로 인간 유래의 mRNA(human mRNA), 인간 유래의 리보소말 RNA(human ribosomal RNA) 같이 다양하게 하였는데, 모든 경우에서 RT-PCR 증폭 효율 증진 효과를 확인할 수 있었다. 특히 리보소말 RNA와 같이 복잡한 2차 구조를 가지는 주형의 경우에 변성형 클레나우 단편의 첨가 효과가 두드러졌다. 대조 실험으로 실시된 BSA 첨가와 유사한 증폭 효율 증진 효과가 확인되었다. 이상의 결과로 변성형 클레나우 단편 첨가가 RT-PCR의 증폭 효율 증진에 효과적임을 확인할 수 있었으며, 이러한 효과는 일부 PCR 단계의 증폭 효율 증진에 기인한다는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 효과는 RT-PCR에 국한되지 않고 일반적인 단독 PCR 반응에서도 기대할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: RTase 에 의한 PCR 저해의 완화 효과 조사

RT-PCR 반응을 구성하는 뒷부분 단계인 PCR 반응에서의 잔여 RTase 활성에 의한 PCR 저해(정확히는 PCR 반응에 포함된 DNA 중합효소의 활성 저해)를 클레나우 단편의 첨가로 억제 또는 완화시킬 수 있는지에 대하여 다음과 같이 조사하였다. 본 실시예의 조사는 앞의 실시예와는 달리 RT-PCR 반응을 이용하지 않고 PCR 반응만으로 조사하였다. 따라서 본 실시예에 사용된 주형은 RNA가 아니라 DNA이었다. 본 실시예에서는 1.3 kbp 18S rRNA 단편 증폭을 대상으로 하였다. 사용한 주형은 인간세포주(human cell-line) K562로부터 추출한 DNA를 사용하였다. DNA 추출은 인트론바이오테크놀로지사의 G-spin^TM DNA Extraction kit(for Cell/Tissue)를 사용하여 제품의 사용 설명서에 따라 실시했다. PCR 조성 및 조건은 실시예 3의 1.3 kbp 18S rRNA 단편 증폭에 활용된 PCR 반응 조건과 동일하게 실시하였다. 차이는 역전사 반응액을 첨가하는 대신 주형 DNA로 게놈(genomic) DNA를 2 μl(50 ng, 5 ng, 0.5 ng) 첨가해 주는 것뿐이었다.

상기처럼 준비된 PCR 반응액에 활성형의 RTase를 첨가하여 인위적으로 PCR 저해 조건을 형성한 후 여기에 클레나우 단편을 첨가하여 조성된 PCR 저해가 완화되는지를 조사하였다. 그 결과는 도 3과 같다.

도 3의 활성형의 RTase가 첨가되지 않은 결과에서 알 수 있듯이, 활성형 클레나우 단편의 첨가는 PCR 반응을 저해하였고 변성형 클레나우 단편의 첨가는 이와는 반대로 PCR 반응을 증진시킴을 알 수 있었다. 이는 앞에서 이미 확인된 사실이다. 한편, 도 3의 활성형의 RTase가 첨가된 결과에서 알 수 있듯이 활성형 RTase를 첨가했을 경우에는 이미 알려진 대로 PCR 성능이 저하되었다. 이러한 저해 효과는 도 3의 결과에서와 같이 변성형 클레나우 단편을 첨가해 줌으로써 일정 부분 회복시킬 수 있었다. 이러한 RTase에 의한 PCR 반응 저해를 억제시키는 특징은 실시예 3에서 확인된 PCR 증진 효과와는 구별될 수 있는 특징이다. 이 결과로부터 변성형 클레나우 단편의 첨가에 의한 RT-PCR 반응의 성능 증진 효과는 실시예 3에서 확인된 PCR 증폭 효율의 증진에 의한 효과뿐만 아니라 본 실시예에서 확인된 RTase에 의한 PCR 저해를 완화시키는 것에 의한 효과까지가 포함되어 있음을 알 수 있었다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 클레나우 단편의 첨가 효과에 대하여 조사한 결과이다. RT-PCR 반응으로 1 kbp의 베타-액틴을 증폭한 경우와 1.6 kbp의 18S rRNA를 증폭한 경우에서 클레나우 단편의 첨가 효과를 조사하였다. "M"은 1 kb ladder DNA 마커를 나타내고, "Con"은 클레나우 단편을 넣지 않은 대조 실험의 결과를 나타내고, "nature"는 활성형 클레나우 단편을 첨가한 경우를 나타내고, "denatured"는 변성형 클레나우 단편을 첨가한 경우를 나타낸다. "+Klenow after RT"는 역전사 반응 후, 즉 PCR 반응 시작 시점에 클레나우 단편을 첨가한 경우이고, "+Klenow before RT"는 역전사 반응 전, 즉 역전사 반응 시작 시점에서부터 클레나우 단편을 첨가한 경우이다.

도 2는 증폭 효율 증진 효과를 조사한 결과이다. 변성형 클레나우 단편과 BSA는 역전사 반응 시작 시점부터 첨가하였다. "M"은 1 kb ladder DNA 마커이고, "Con"은 어떤 것도 첨가하지 않은 음성 대조 실험 결과이다. "+Klenow(units)"는 역전사 반응에 표시한 양의 클레나우 단편을 첨가한 경우의 결과이고, "+BSA(mg)"은 역전사 반응에 표시한 양의 BSA를 첨가한 경우의 결과이다.

도 3은 RTase에 의한 PCR 저해 현상의 완화에 있어서의 변성형 클레나우 단편의 첨가 효과를 보여주는 결과이다. "M"은 1 kb ladder DNA 마커이고, "Con"은 변성형 클레나우 단편을 첨가하지 않은 각 실험군에서의 음성 대조 실험 결과이다. "+Klenow"는 클레나우 단편이 첨가된 경우이고 "+Active REV RT"는 활성형 REV RTase가 첨가된 경우이고 이 표시가 없는 경우는 RTase가 첨가되지 않은 경우에 해당한다. "Nature"는 첨가된 클레나우 단편이 활성형인 경우이고 "Denatured"는 첨 가된 클레나우 단편이 변성형인 경우에 해당한다.

<110> INTRON BIOTECHNOLOGY, Co., Ltd. <120> Method for improving the performance of PCR and RT-PCR using a Klenow fragment <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 624 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Klenow fragment <400> 1 Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Leu Ala Leu Glu Phe Met 1 5 10 15 Val Ile Ser Tyr Asp Asn Tyr Val Thr Ile Leu Asp Glu Glu Thr Leu 20 25 30 Lys Ala Trp Ile Ala Lys Leu Glu Lys Ala Pro Val Phe Ala Phe Asp 35 40 45 Thr Glu Thr Asp Ser Leu Asp Asn Ile Ser Ala Asn Leu Val Gly Leu 50 55 60 Ser Phe Ala Ile Glu Pro Gly Val Ala Ala Tyr Ile Pro Val Ala His 65 70 75 80 Asp Tyr Leu Asp Ala Pro Asp Gln Ile Ser Arg Glu Arg Ala Leu Glu 85 90 95 Leu Leu Lys Pro Leu Leu Glu Asp Glu Lys Ala Leu Lys Val Gly Gln 100 105 110 Asn Leu Lys Tyr Asp Arg Gly Ile Leu Ala Asn Tyr Gly Ile Glu Leu 115 120 125 Arg Gly Ile Ala Phe Asp Thr Met Leu Glu Ser Tyr Ile Leu Asn Ser 130 135 140 Val Ala Gly Arg His Asp Met Asp Ser Leu Ala Glu Arg Trp Leu Lys 145 150 155 160 His Lys Thr Ile Thr Phe Glu Glu Ile Ala Gly Lys Gly Lys Asn Gln 165 170 175 Leu Thr Phe Asn Gln Ile Ala Leu Glu Glu Ala Gly Arg Tyr Ala Ala 180 185 190 Glu Asp Ala Asp Val Thr Leu Gln Leu His Leu Lys Met Trp Pro Asp 195 200 205 Leu Gln Lys His Lys Gly Pro Leu Asn Val Phe Glu Asn Ile Glu Met 210 215 220 Pro Leu Val Pro Val Leu Ser Arg Ile Glu Arg Asn Gly Val Lys Ile 225 230 235 240 Asp Pro Lys Val Leu His Asn His Ser Glu Glu Leu Thr Leu Arg Leu 245 250 255 Ala Glu Leu Glu Lys Lys Ala His Glu Ile Ala Gly Glu Glu Phe Asn 260 265 270 Leu Ser Ser Thr Lys Gln Leu Gln Thr Ile Leu Phe Glu Lys Gln Gly 275 280 285 Ile Lys Pro Leu Lys Lys Thr Pro Gly Gly Ala Pro Ser Thr Ser Glu 290 295 300 Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Leu Asp Tyr Pro Leu Pro Lys Val Ile 305 310 315 320 Leu Glu Tyr Arg Gly Leu Ala Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Thr Asp Lys 325 330 335 Leu Pro Leu Met Ile Asn Pro Lys Thr Gly Arg Val His Thr Ser Tyr 340 345 350 His Gln Ala Val Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Thr Asp Pro Asn 355 360 365 Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Asn Glu Glu Gly Arg Arg Ile Arg Gln 370 375 380 Ala Phe Ile Ala Pro Glu Asp Tyr Val Ile Val Ser Ala Asp Tyr Ser 385 390 395 400 Gln Ile Glu Leu Arg Ile Met Ala His Leu Ser Arg Asp Lys Gly Leu 405 410 415 Leu Thr Ala Phe Ala Glu Gly Lys Asp Ile His Arg Ala Thr Ala Ala 420 425 430 Glu Val Phe Gly Leu Pro Leu Glu Thr Val Thr Ser Glu Gln Arg Arg 435 440 445 Ser Ala Lys Ala Ile Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Gly Met Ser Ala Phe 450 455 460 Gly Leu Ala Arg Gln Leu Asn Ile Pro Arg Lys Glu Ala Gln Lys Tyr 465 470 475 480 Met Asp Leu Tyr Phe Glu Arg Tyr Pro Gly Val Leu Glu Tyr Met Glu 485 490 495 Arg Thr Arg Ala Gln Ala Lys Glu Gln Gly Tyr Val Glu Thr Leu Asp 500 505 510 Gly Arg Arg Leu Tyr Leu Pro Asp Ile Lys Ser Ser Asn Gly Ala Arg 515 520 525 Arg Ala Ala Ala Glu Arg Ala Ala Ile Asn Ala Pro Met Gln Gly Thr 530 535 540 Ala Ala Asp Ile Ile Lys Arg Ala Met Ile Ala Val Asp Ala Trp Leu 545 550 555 560 Gln Ala Glu Gln Pro Arg Val Arg Met Ile Met Gln Val His Asp Glu 565 570 575 Leu Val Phe Glu Val His Lys Asp Asp Val Asp Ala Val Ala Lys Gln 580 585 590 Ile His Gln Leu Met Glu Asn Cys Thr Arg Leu Asp Val Pro Leu Leu 595 600 605 Val Glu Val Gly Ser Gly Glu Asn Trp Asp Gln Ala His Ala Ala Leu 610 615 620 <210> 2 <211> 1878 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klenow fragment <400> 2 atgggctctg gatccggtga tgacgatgac aagctcgccc ttgaattcat ggtgatttct 60 tatgacaact acgtcaccat ccttgatgaa gaaacactga aagcgtggat tgcgaagctg 120 gaaaaagcgc cggtatttgc atttgatacc gaaaccgaca gccttgataa catctctgct 180 aacctggtcg ggctttcttt tgctatcgag ccaggcgtag cggcatatat tccggttgct 240 catgattatc ttgatgcgcc cgatcaaatc tctcgcgagc gtgcactcga gttgctaaaa 300 ccgctgctgg aagatgaaaa ggcgctgaag gtcgggcaaa acctgaaata cgatcgcggt 360 attctggcga actacggcat tgaactgcgt gggattgcgt ttgataccat gctggagtcc 420 tacattctca atagcgttgc cgggcgtcac gatatggaca gcctcgcgga acgttggttg 480 aagcacaaaa ccatcacttt tgaagagatt gctggtaaag gcaaaaatca actgaccttt 540 aaccagattg ccctcgaaga agccggacgt tacgccgccg aagatgcaga 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Claims (14)

1. 역전사 효소(reverse transcriptase)에 의한 DNA 중합효소(DNA polymerase) 활성 저해를 완화시켜 RT-PCR의 민감도(sensitivity) 및 증폭 효율(amplification efficiency)을 개선시키기 위하여 RT-PCR 반응에 열적 변성된(thermal denatured) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 클레나우 단편을 첨가하여 실시하는 RT-PCR 방법.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 RT-PCR 반응은 역전사 반응과 PCR 반응이 별도로 분리되어 실시되거나, 또는 하나의 동일 용기 내에서 역전사 반응과 PCR 반응이 함께 실시되는 것을 특징으로 하는 RT-PCR 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 열적 변성된(thermal denatured) 클레나우 단편을 첨가하는 시점이 역전사 반응 시작 시점 또는 PCR 반응 시작 시점인 것을 특징으로 하는 RT-PCR 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 열적 변성된(thermal denatured) 클레나우 단편의 첨가량은 1-50 단위인 것을 특징으로 하는 RT-PCR 방법.
6. 역전사 효소(reverse transcriptase)에 의한 DNA 중합효소(DNA polymerase) 활성 저해를 완화시켜 PCR의 민감도(sensitivity) 및 증폭 효율(amplification efficiency)을 개선시키기 위하여 PCR 반응에 열적 변성된(thermal denatured) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 클레나우 단편을 첨가하여 실시하는 PCR 방법.
7. 삭제
8. 제 6 항에 있어서, 상기 열적 변성된(thermal denatured) 클레나우 단편의 첨가량은 1-50 단위인 것을 특징으로 하는 PCR 방법.
9. 제 1 항, 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 방법에 기반한 RT-PCR용 키트.
10. 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항의 방법에 기반한 PCR용 키트.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제

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