DE202021100985U1

DE202021100985U1 - Ein diagnostisches Assay-Kit und Mittel zum Nachweis von Coronavirus-Nukleinsäure

Info

Publication number: DE202021100985U1
Application number: DE202021100985.3U
Authority: DE
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2020-06-26
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2031-02-27

Abstract

Ein diagnostisches Assay-Kit zum Nachweis einer Nukleinsäure des Schweren Akuten Respiratorischen Syndroms-Corona-Virus 2 (SARS-Cov2) in einer Probe, wobei das diagnostische Assay-Kit ein erstes Corona-LAMP-Primer-Set umfasst, wobei das erste Corona-LAMP-Primer-Set die folgenden Nukleinsäure-Primermoleküle umfasst:
a) einen Nukleinsäure-F3-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID Nr.: 47 (GGACCCCAAAATCAG) gezeigt ist, oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID Nr.: 47 (GGACCCCAAAATCAG) gezeigten Sequenz ist; und
b) einen Nukleinsäure-FL-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 94 (GTTGAATCTGAGGGTCC) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 94 (GTTGAATCTGAGGGTCC) gezeigten Sequenz ist; und
c) einen Nukleinsäure-FIP-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 95 (TCTCCATTCTGGTTACTGCCCGAAATGCACCCCGCATTAC) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 95 (TCTCCATTCTGGTTACTGCCCGAAATGCACCCCGCATTAC) gezeigten Sequenz ist; und
d) einen Nukleinsäure-B3-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 56 (CTTGCCATGTTGAGTG) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 56 (CTTGCCATGTTGAGTG) gezeigten Sequenz ist; und
e) einen Nukleinsäure-BL-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 53 (CCCCAAGGTTTACCC) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 53 (CCCCAAGGTTTACCC) gezeigten Sequenz ist; und
f) einen Nukleinsäure-BIP-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 55 (CGCGATCAAAACAACGTCGGAGCGGTGAACCAAGACGCAG) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 55 (CGCGATCAAAACAACGTCGGAGCGGTGAACCAAGACGCAG) gezeigten Sequenz ist.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Assay-Kit und Mittel für einen spezifischen und schnellen Nachweis von Coronavirus-Nukleinsäuren in biologischen Proben. Die Erfindung stellt neuartige Oligonukleotide zur Verwendung in der Reversen-Transkriptions-Schleifen-vermittelten isothermalen Amplifikation (EN: Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP)) bereit, die nachweislich eine schnelle und spezifische Amplifikation und einen Nachweis von viralen Nukleinsäuren ohne zeitaufwendige Probenvorbereitung und - aufreinigung ermöglichen.
BESCHREIBUNG
Das Schwere Akute Respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), ein neuartiges Coronavirus, breitet sich seit Anfang 2020 rasant rund um den Globus aus. Bei Menschen verursacht es die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die häufig mit einem schweren respiratorischen Syndrom einhergeht (Chen et al., 2020; Zhao et al., 2020; Zhu et al., 2020). Um die durch COVID-19 ausgelöste globale Gesundheitskrise zu bewältigen, ist eine schnelle und spezifische Diagnostik unerlässlich. Bei Verdacht auf eine Infektion mit dem pandemischen SARS-CoV-2 wird der Erreger vorzugsweise auf Nukleinsäure-Ebene mit einem standardisierten molekularbiologischen Test zum Nachweis des viralen RNA-Genoms nachgewiesen, z. B. durch Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR). Dazu wird die virale RNA aus Patientenproben (z. B. aus Abstrichen oder Sputum) zunächst im Labor durch einen arbeitsintensiven Aufreinigungsprozess (2-3 Stunden) aufbereitet, bevor der eigentliche Virusnachweis durch RT-PCR mit modernen Thermocyclern erfolgen kann. Unter idealen Bedingungen dauert ein solcher Test in einer klinischen Laborumgebung 3-5 Stunden. Im aktuellen Pandemie-Szenario ist die Testzeit ein großer Engpass für ein umfassendes bevölkerungsweites Screening.
Eine alternatives PCR-basiertes Verfahren zum Nachweis von Krankheitserregern ist die Reverse-Transkriptions-Schleifen-vermittelte isothermale Amplifikation (EN: Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP)), die den Nachweis von Nukleinsäuren jeglicher Herkunft innerhalb kurzer Zeit (ca. 60 Minuten) ermöglicht und keine komplexen Analysegeräte erfordert. Trotz ihrer vielen Vorteile haben RT-LAMPs bisher noch nicht den Weg in die klinische Standarddiagnostik von humanen Krankheitserregern wie SARS-CoV-2 gefunden. Grund dafür ist die inakzeptable Häufigkeit von falsch-positiven und falschnegativen Ergebnissen. Dies liegt vor allem an den verwendeten LAMP-Sonden (im Folgenden auch als Nachweis-Oligonukleotide oder Primer bezeichnet), deren Design im direkten Vergleich zur klassischen PCR wesentlich komplexer und anspruchsvoller ist (siehe 1). Anstelle von zwei einzelnen, an das Amplikon gebundenen Sense- und Anti-Sense-Primern werden beim LAMP 4-6 Sonden benötigt, von denen jede spezifisch an 6-8 einzelne RNA/DNA-Zielregionen bindet.
Obwohl nur hochkonservierte Genomsegmente Gegenstand des Sondendesigns sind, erhöht die hohe Anzahl der verwendeten Ziel-Oligonukleotide zwangsläufig die Wahrscheinlichkeit von Mismatches und der Bildung von künstlichen Primer-Dimeren. Die beiden gängigen inneren LAMP-Sonden, die sogenannten FIP- und BIP-Primer, sind typischerweise zwischen 35-45 Nukleotide (nt) lang und bestehen ebenfalls aus Sense- und Anti-Sense-Untereinheiten. In der Literatur wird ausführlich beschrieben, dass diese beiden Sonden, die theoretisch die Schleifen (EN: Loops) bilden, besonders anfällig für Fehlanpassungen und die damit verbundene Entstehung von Hairpin-Strukturen sind. Stabile Hairpins können dazu führen, dass FIPs und BIPs „verklumpen“ und eine inaktive Form annehmen, oder, was noch wichtiger ist, dass die Hairpin-Struktur eine sogenannte 3'-Komplementarität aufweist, die zu einer selbstverstärkenden Struktur und damit zu einem falsch positiven Ergebnis führen kann
Außerdem erhöht die Verwendung so vieler (und teilweise sehr langer) Primer-Sequenzen das Risiko einer sogenannten „sporadischen Amplifikation“ im Verhältnis zur exponentiellen Amplifikation in negativen Kontrollproben. Als Erklärung hierfür werden in der einschlägigen Literatur komplexe Interaktionen zwischen mehreren Sonden angeführt. Falsch-negative Ergebnisse werden also hauptsächlich durch ein inadäquates Design der LAMP-Primer verursacht.
Es ist daher ein Ziel der Erfindung, RT-LAMP-Oligonukleotide für den Nachweis von Coronavirus-Nukleinsäuren in einer Probe bereitzustellen, die die vielen für RT-LAMP-Sonden bekannten Nachteile überwinden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im Folgenden werden die Elemente der Erfindung beschrieben. Diese Elemente sind mit spezifischen Ausführungsformen aufgeführt; es sollte jedoch verstanden werden, dass sie in beliebiger Weise und in beliebiger Anzahl kombiniert werden können, um zusätzliche Ausführungsformen zu schaffen. Die vielfältig beschriebenen Beispiele und bevorzugten Ausführungsformen sollten nicht so ausgelegt werden, dass die vorliegende Erfindung nur auf die explizit beschriebenen Ausführungsformen beschränkt ist. Diese Beschreibung sollte so verstanden werden, dass sie Ausführungsformen unterstützt und umfasst, die zwei oder mehr der explizit beschriebenen Ausführungsformen kombinieren oder die eine oder mehrere der explizit beschriebenen Ausführungsformen mit einer beliebigen Anzahl der offenbarten und/oder bevorzugten Elemente kombinieren. Darüber hinaus sollten alle Permutationen und Kombinationen aller beschriebenen Elemente in dieser Anmeldung als durch die Beschreibung der vorliegenden Anmeldung offenbart angesehen werden, sofern der Kontext nichts anderes angibt.
Definitionen
Wenn nicht anders vermerkt, werden Fachausdrücke entsprechend dem üblichen Sprachgebrauch verwendet.
Alle hierin erwähnten Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und sonstigen Referenzen sind durch Verweis in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke einbezogen. Alle Sequenzen, die mit den hierin erwähnten GenBank-Zugangsnummern verbunden sind, sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit, wie sie am 23. Februar 2021 vorlagen, einbezogen, soweit dies nach den geltenden Richtlinien und/oder Gesetzen zulässig ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde die folgende Referenz des SARS-CoV2-Genoms verwendet: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/1798174254/. Im Falle von Konflikten ist die vorliegende Spezifikation, einschließlich Begriffserklärungen, maßgeblich.
Obwohl Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder gleichwertig sind, verwendet werden können, um die offenbarte Technologie zu praktizieren oder zu testen, werden im Folgenden geeignete Verfahren und Materialien beschrieben. Die Materialien, Verfahren und Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sind nicht als einschränkend anzusehen.
Um die Übersicht der verschiedenen Ausführungsformen dieser Offenbarung zu erleichtern, werden die folgenden Erklärungen zu bestimmten Begriffen gegeben:
Der Begriff „Amplifikation“ bezieht sich auf die Erhöhung der Anzahl der Kopien eines Nukleinsäuremoleküls, wie z.B. eines Gens oder Fragments eines Gens, z.B. mindestens eines Teils eines SARS-CoV-2-Nukleinsäuremoleküls. Die Produkte einer Amplifikationsreaktion werden als Amplifikationsprodukte oder Amplikons bezeichnet. Ein Beispiel für eine in vitro Amplifikation ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), bei der eine Probe (z.B. eine biologische Probe von einem Subjekt) mit einem Paar oder Set von Oligonukleotid-Primern unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die eine Hybridisierung der Primer an ein Nukleinsäuremolekül in der Probe ermöglichen. Die Primer werden unter geeigneten Bedingungen verlängert, von dem Template dissoziiert und dann erneut angelagert, verlängert und dissoziiert, um die Anzahl der Kopien des Nukleinsäuremoleküls zu amplifizieren. Weitere Beispiele für in vitro Amplifikationstechniken sind die Echtzeit-PCR (EN: real-time PCR), die quantitative Echtzeit-PCR (EN: quantitative real-time PCR (qPCR)), die reverse Transkriptions-PCR (EN: reverse transcription PCR (RT-PCR)), die quantitative RT-PCR (EN: quantitative RT-PCR (qRT-PCR)), die Schleifen-vermittelte isothermale Amplifikation (EN: Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP); siehe Notomi et ah, Nucl. Acids Res. 28: e63, 2000); Reverse-Transkriptions-LAMP (EN: Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP)); Strangverdrängungsamplifikation (EN: strand displacement amplification (siehe USPN 5,744,311)); transkriptionsvermittelte Amplifikation (EN: transcription- mediated amplification (USPN 5,399,491)); transkriptionsfreie isothermale Amplifikation (EN: transcription-free isothermal amplification (siehe USPN 6,033,881)); Reparaturkettenreaktionsamplifikation (EN: repair chain reaction amplification (siehe WO 90/01069 )); Ligase-Kettenreaktions-Amplifikation (EN: ligase chain reaction amplification (siehe EP-A-320 308)); lückenfüllende Ligase-Kettenreaktions-Amplifikation (EN: gap filling ligase chain reaction amplification (siehe USPN 5,427,930)); gekoppelte Ligase-Detektion und PCR (EN: coupled ligase detection and PCR (siehe USPN 6,027,889)); und NASBA™ RNA-Amplifikation ohne Transkription (EN: NASBA™ RNA transcription-free amplification (siehe USPN 6,025,134)). Eine bevorzugte Amplifikation ist eine isothermale Amplifikation.
Der Begriff „Amplifikationsprodukt oder Amplikon“ bezieht sich auf spezifische DNA-Fragmente, die aus einer beliebigen Primer-gerichteten Amplifikationsreaktion erzeugt werden, insbesondere einer Amplifikation mit Primer der Erfindung. Der Begriff „Target-Amplifikationsprodukt“ oder „amplifiziertes Target“ bezieht sich auf doppelsträngige DNA („dsDNA“), die aus einer spezifischen Target-Nukleinsäure erzeugt wird, die mittels Primergerichteter Amplifikation identifiziert und quantifiziert werden soll. Ein solches Target ist vorzugsweise eine Coronavirus-Nukleinsäure. Target-Amplifikationsprodukte können mittels LAMP hergestellt werden, insbesondere unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Primer. Ferner versteht es sich, dass alle Verfahren zur Herstellung geeigneter Target-Amplifikationsprodukte ausreichend kontrolliert sind, um störende Nicht-Target-Amplifikationsartefakte wie Primer-Dimer-Fragmente, Triple-Helices und dergleichen zu eliminieren. Bei den Ziel-Amplifikationsprodukten handelt es sich im Allgemeinen um dsDNA, die durch interkalierende Mittel gebunden werden kann.
Der Begriff „Bedingungen, die ausreichen“ bezieht sich auf jede Umgebung, die die gewünschte Aktivität erlaubt, z.B. die eine spezifische Bindung oder Hybridisierung zwischen zwei Nukleinsäuremolekülen oder die eine reverse Transkription und/oder Amplifikation einer Nukleinsäure erlaubt. Eine solche Umgebung kann bestimmte Inkubationsbedingungen (wie z.B. Zeit und/oder Temperatur) oder die Anwesenheit und/oder Konzentration bestimmter Faktoren, beispielsweise in einer Lösung (wie beispielsweise Puffer, Salz(e), Metallion(en), Detergenz(ien), Nukleotid(e), Enzym(e) usw.) umfassen, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein.
Der Begriff „Kontakt“ bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Platzierung in direkter physikalischer Assoziation; zum Beispiel in fester und/oder flüssiger Form. Beispielsweise kann die Kontaktierung in vitro mit einem oder mehreren Primern und/oder Sonden und einer biologischen Probe (z.B. einer Probe einschließlich Nukleinsäuren) in Lösung erfolgen.
Der Begriff „nachweisbare Markierung“ bezieht sich auf eine Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt mit einem anderen Molekül (z.B. einem Nukleinsäuremolekül) konjugiert ist, um den Nachweis dieses Moleküls zu erleichtern. Spezifische, nicht einschränkende Beispiele für Markierungen umfassen fluoreszierende und fluorogene Einheiten (z.B. Fluorophore), chromogene Einheiten, Haptene (wie Biotin, Digoxigenin und Fluorescein), Affinitäts-Tags und radioaktive Isotope (wie 32P, 33P, 35S und 125I). Die Markierung kann direkt nachweisbar sein (z.B. optisch nachweisbar) oder indirekt nachweisbar (z.B. über Wechselwirkung mit einem oder mehreren zusätzlichen Molekülen, die ihrerseits nachweisbar sind). Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren und Anleitungen zur Auswahl von Markierungen, die für verschiedene Zwecke nützlich sind, werden z.B. in Sambrook und Russell, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) und Ausubel et al, in Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987, und einschließlich Aktualisierungen). Fluorophor: Eine chemische Verbindung, die bei Anregung durch einen bestimmten Stimulus, z.B. eine bestimmte Wellenlänge des Lichts, Licht emittiert (fluoresziert), z.B. bei einer anderen Wellenlänge (z.B. einer längeren Wellenlänge des Lichts). Fluorophore sind Teil der größeren Klasse der lumineszierenden Verbindungen. Zu den lumineszierenden Verbindungen gehören auch chemilumineszierende Moleküle, die keine bestimmte Wellenlänge des Lichts benötigen, um zu lumineszieren, sondern eine chemische Energiequelle nutzen. Daher entfällt bei der Verwendung von chemilumineszierenden Molekülen (wie Aequorin) die Notwendigkeit einer externen Quelle für elektromagnetische Strahlung, wie z.B. einem Laser.
Beispiele für bestimmte Fluorophore, die in den hier offenbarten Sonden und Primern verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt und umfassen 4-Acetamido-4'-isothiocyanatostilben-2,2'-disulfonsäure; Acridin und Derivate wie Acridin und Acridinisothiocyanat, 5-(2'-Aminoethyl)aminonaphthalin-l-sulfonsäure (EDANS), 4-Amino-N-[3-vinylsulfonyl)phenyl]naphthalimid-3,5-disulfonat (Lucifer Yellow VS), N-(4-Anilino-1-naphthyl)maleimid, Anthranilamid; Brillantgelb; Coumarin und Derivate wie Coumarin, 7-Amino-4-methylcoumarin (AMC, Coumarin 120), 7-Amino-4-trifluormethylcoumarin (Coumarin 151); Cyanosin; 4',6-Diaminidin-2-phenylindol (DAPI); 5',5"-Dibrompyrogallol-Sulfonphthalein (Brompyrogallolrot); 7-Diethylamino-3-(4'-Isothiocyanatophenyl)-4-methylcoumarin; Diethylentriaminpentaacetat; 4,4'-Diisothiocyanatodihydro-stilben-2,2'-disulfonsäure; 4,4'-Diisothiocyanatostilben-2,2'-Disulfonsäure; 5-[Dimethylamino]naphthalin-1-sulfonylchlorid (DNS, Dansylchlorid); 4-Dimethylaminophenylazophenyl-4'-Isothiocyanat (DABITC); Eosin und Derivate wie Eosinisothiocyanat; Erythrosin und Derivate wie Erythrosin B und Erythrosinisothiocyanat; Ethidium; Fluorescein und Derivate wie 5-Carboxyfluorescein (FAM), 5-(4,6-Dichlortriazin-2-yl)aminofluorescein (DTAF), 2'7'-Dimethoxy- 4'5'-dichlor-6-carboxyfluorescein (JOE), Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), QFITC (XRITC), 6-Carboxyfluorescein (HEX) und TET (Tetramethylfluorescein); Fluorescamin; IR144; IR1446; Malachitgrün-Isothiocyanat; 4-Methylumbelliferon; ortho-Kresolphthalein; Nitrotyrosin; Pararosanilin; Phenolrot; B-Phycoerythrin; o-Phthaldialdehyd; Pyren und Derivate wie Pyren, Pyrenbutyrat und Succinimidyl-i -pyrenbutyrat; Reactive Red 4 (CIBACRON™ Brilliant Red 3B-A); Rhodamin und Derivate wie 6-Carboxy-X-Rhodamin (ROX), 6-Carboxyrhodamin (R6G), Lissamin-Rhodamin B-Sulfonylchlorid, Rhodamin (Rhod), Rhodamin B, Rhodamin 123, Rhodamin X-Isothiocyanat, N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), Tetramethylrhodamin und Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC); Sulforhodamin B; Sulforhodamin 101 und Sulfonylchlorid-Derivat von Sulforhodamin 101 (Texas Red); Riboflavin; Rosolsäure und Terbiumchelat-Derivate; LightCycler Red 640; Cy5.5; und Cy56-Carboxyfluorescein; Bor-Dipyrromethen-Difluorid (BODIPY); Acridin; Stilben; Cy3; Cy5, VIC® (Applied Biosystems); LC Red 640; LC Red 705; und Yakima-Gelb unter anderem. Weitere Beispiele für Fluorophore sind Quasar® 670, Quasar® 570, CalRed 590, CalRed 610, CalRed615, CalRed 635, CalGreen 520, CalGold 540, und CalOrange 560 (Biosearch Technologies, Novato, CA). Der Fachmann kann weitere Fluorophore auswählen, die z.B. von Molecular Probes/Life Technologies (Carlsbad, CA) erhältlich sind.
In besonderen Beispielen wird ein Fluorophor als Donor-Fluorophor oder als Akzeptor-Fluorophor verwendet. „Akzeptor-Fluorophore“ sind Fluorophore, die Energie von einem Donor-Fluorophor absorbieren, z.B. im Bereich von etwa 400 bis 900 nm (z.B. im Bereich von etwa 500 bis 800 nm). Akzeptor-Fluorophore absorbieren im Allgemeinen Licht bei einer Wellenlänge, die in der Regel mindestens 10 nm höher (z.B. mindestens 20 nm höher) als die maximale Absorptionswellenlänge des Donor-Fluorophors ist, und haben ein Fluoreszenz-Emissionsmaximum bei einer Wellenlänge im Bereich von etwa 400 bis 900 nm. Akzeptor-Fluorophore haben ein Anregungsspektrum, das sich mit der Emission des Donor-Fluorophors überschneidet, so dass die vom Donor emittierte Energie den Akzeptor anregen kann. Idealerweise ist ein Akzeptor-Fluorophor in der Lage, an ein Nukleinsäuremolekül gebunden zu werden.
In einem besonderen Beispiel ist ein Akzeptor-Fluorophor ein Dark Quencher, wie Dabcyl, QSY7 (Molecular Probes), QSY33 (Molecular Probes), BLACK HOLE QUENCHERS™ (Biosearch Technologies; wie BHQo, BHQ1, BHQ2 und BHQ3), ECLIPSE™ Dark Quencher (Epoch Biosciences) oder IOWA BLACK™ (Integrated DNA Technologies). Ein Quencher kann die Emission eines Donor-Fluorophors reduzieren bzw. quenchen.
„Donor-Fluorophore‟ sind Fluorophore oder lumineszierende Moleküle, die in der Lage sind, Energie auf ein Akzeptor-Fluorophor zu übertragen, wobei in einigen Beispielen ein nachweisbares Fluoreszenzsignal des Akzeptors erzeugt wird. Donor-Fluorophore sind im Allgemeinen Verbindungen, die im Bereich von ca. 300 bis 900 nm absorbieren, zum Beispiel bei ca. 350 bis 800 nm. Donor-Fluorophore haben einen starken molaren Absorptionskoeffizienten bei der gewünschten Anregungswellenlänge, zum Beispiel größer als etwa 103 M"1cm"1.
Der Begriff „isoliert“, z.B. im Zusammenhang mit einer „isolierten“ biologischen Komponente (wie einer Nukleinsäure oder einem isolierten Primer), wurde im Wesentlichen von anderen biologischen Komponenten, in denen die Komponente natürlicherweise vorkommt, abgetrennt oder gereinigt, z.B. von anderer chromosomaler und extrachromosomaler DNA, RNA und Proteinen. Nukleinsäuren, die „isoliert“ wurden, umfassen Nukleinsäuren, die durch Standard-Reinigungsverfahren gereinigt wurden. Der Begriff umfasst auch Nukleinsäuren, die durch rekombinante Expression in einer Wirtszelle hergestellt wurden, sowie chemisch synthetisierte Nukleinsäuremoleküle. Isoliert erfordert keine absolute Reinheit und kann Protein-, Peptid- oder Nukleinsäuremoleküle umfassen, die zu mindestens 50 % isoliert sind, wie z.B. zu mindestens 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder sogar 99,9%.
Der Begriff „Reverse-Transkriptions-Schleifen-vermittelte isothermale Amplifikation (EN: Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification)“ oder „LAMP“ oder „RT-LAMP“ betrifft ein Verfahren zur Amplifikation von DNA oder RNA. Das Verfahren ist eine einstufige Amplifikationsreaktion unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität (z.B. Notomi et al, Nucl. Acids. Res. 28:E63, 2000; Nagamine et al, Mol. Cell. Probes 16:223-229,2002; Mori et al, J. Biochem. Biophys. Methods 59: 145-157, 2004). Für LAMP werden typischerweise mindestens vier, vorzugsweise sechs Primer verwendet, die für sechs bis acht Regionen innerhalb einer Ziel-Nukleinsäuresequenz spezifisch sind. Die Primer umfassen einen äußeren Vorwärtsprimer (F3), einen äußeren Rückwärtsprimer (B3), einen inneren Vorwärtsprimer (FIP) und einen inneren Rückwärtsprimer (BIP). In einigen Ausführungsformen können auch ein Vorwärtsschleifen-Primer (EN: Forward Loop Primer; Loop F) und ein Rückwärtsschleifen-Primer (EN: Backward Loop Primer; Loop B) enthalten sein. Bei der Amplifikationsreaktion wird eine Haarnadelstruktur-DNA (EN: Stem-Loop-DNA) mit invertierten Wiederholungen der Ziel-Nukleinsäuresequenz erzeugt. Zur Amplifikation von RNA-Zielsequenzen kann der Reaktion Reverse Transkriptase zugesetzt werden. Diese Variante wird als RT-LAMP bezeichnet.
Ein „Primer-Set“ gemäß der Erfindung ist eine Sammlung von einzelnen Primern, die in Kombination zur Durchführung einer LAMP oder RT-LAMP ausreichen.
Der Begriff „Primer“ bezeichnet kurze Nukleinsäuren, im Allgemeinen DNA-Oligonukleotide mit einer Länge von 10 Nukleotiden oder mehr (z.B. 10-60, 15-50, 20-45 oder 20-40 Nukleotide in der Länge). Primer können an einen komplementären Ziel-DNA-Strang durch Nukleinsäure-Hybridisierung angelagert werden, um ein Hybrid zwischen dem Primer und dem Ziel-DNA-Strang zu bilden, und dann entlang des Ziel-DNA-Strangs durch ein DNA-Polymerase-Enzym verlängert werden. Primerpaare können zur Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz verwendet werden, z.B. durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), LAMP, RT-LAMP oder andere in der Technik bekannte Nukleinsäure-Amplifikationsmethoden.
Der Begriff „Sonde“ bezieht sich typischerweise auf eine isolierte Nukleinsäure (z.B. mit einer Länge von mindestens 10 oder mehr Nukleotiden) mit einem angehängten nachweisbaren Marker oder Reportermolekül. Typische Markierungen sind radioaktive Isotope, Liganden, Chemilumineszenzmittel, Fluorophore und Enzyme. Verfahren zur Markierung von Oligonukleotiden und Hinweise zur Auswahl der für verschiedene Zwecke geeigneten Marker werden z.B. in Sambrook et al. (2001) und Ausubel et al. (1987) diskutiert.
Der Begriff „rekombinante Nukleinsäure“ bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das in der Natur nicht vorkommt oder eine Sequenz aufweist, die durch eine künstliche Kombination von zwei ansonsten getrennten Segmenten der Nukleotidsequenz hergestellt wird. Diese künstliche Kombination wird durch chemische Synthese oder durch die künstliche Manipulation von isolierten Nukleinsäuresegmenten erreicht, z.B. durch gentechnische Verfahren, wie sie von Sambrook and Russell, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) beschrieben werden. Der Begriff „rekombinant“ umfasst Nukleinsäuren, die allein durch Addition, Substitution oder Deletion eines Teils eines natürlichen Nukleinsäuremoleküls verändert wurden. Eine rekombinante Nukleinsäure umfasst auch eine heterologe Nukleinsäure, die in einen Vektor eingefügt ist. Eine „heterologe Nukleinsäure“ bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die aus einer anderen genetischen Quelle oder Spezies stammt, z.B. eine virale Nukleinsäure, die in ein bakterielles Plasmid eingefügt wurde (hier in einigen Beispielen als rekombinanter Vektor bezeichnet).
Eine „Probe“ (oder eine „biologische Probe“) ist eine biologische Probe, die DNA (z.B. genomische DNA oder cDNA), RNA (einschließlich mRNA), Protein oder Kombinationen davon enthält. Beispiele sind u.a. isolierte Nukleinsäuren, Zellen, Zelllysate, Chromosomenpräparate, peripheres Blut, Urin, Stuhl, Speichel, Augenflüssigkeit, Gewebebiopsie (wie z.B. eine Tumorbiopsie oder Lymphknotenbiopsie), chirurgische Probe, Knochenmark, Fruchtwasserproben und Autopsiematerial. In einem Beispiel enthält eine Probe virale Nukleinsäuren, z.B. SARS-CoV-2-RNA oder DNA, die von SARS-CoV-2-RNA revers transkribiert wurde. In besonderen Beispielen werden die Proben direkt verwendet (z. B. frisch oder gefroren) oder können vor der Verwendung manipuliert werden, z.B. durch Fixierung (z.B. unter Verwendung von Formalin), Zugabe von RNA-Schutzreagenzien (https://international.neb.com/products/t2011- monarch-dna - rna - protection-reagent#Product%20Information) und/oder Einbettung in Wachs (wie FFPE-Gewebeproben). Eine bevorzugte Probe gemäß der Erfindung ist eine Probe, die aus dem Respirationstrakt eines Subjekts gewonnen wird, wie z. B. eine Gurglerprobe, eine Mundabstrichprobe, eine Nasenabstrich-Probe oder eine Rachenabstrich-Probe.
Der Begriff „Subjekt“ bezeichnet jeden mehrzelligen Wirbeltierorganismus, wie z.B. humane und nicht-humane Säugetiere (einschließlich nicht-humaner Primaten). In einem Beispiel ist bekannt, dass ein Subjekt mit SARS-CoV-2 infiziert ist oder der Verdacht besteht, dass er damit infiziert ist.
Der Begriff „Hybridisierung unter stringenten Bedingungen“ bedeutet beispielsweise Hybridisierung unter experimentellen Bedingungen, die dem Fachmann gut bekannt sind. Konkret bezieht sich der Begriff „stringente Bedingungen“ auf solche Bedingungen, so dass ein gebildetes Nukleinsäurehybrid nach Durchführung der Hybridisierung bei 60°C bis 68°C in Gegenwart von 0,7 bis 1 mol/l NaCl und anschließendem Waschen bei 65°C bis 68°C mit einer 0,1- bis 2-fachen SSC-Lösung identifiziert wird. Dabei ist zu beachten, dass 1×SSC beispielsweise aus 150 mmol/l NaCl und 15 mmol/l Natriumcitrat zusammengesetzt ist. Um die Stringenz zu wählen, können beispielsweise die Salzkonzentration und die Temperatur im Waschschritt entsprechend optimiert werden. Darüber hinaus ist es allgemeines technisches Wissen in der Technik, z.B. Formamid, SDS oder ähnliches hinzuzufügen, um die Stringenz zu verbessern. In einigen bevorzugten Ausführungsformen können die stringenten Hybridisierungsbedingungen diejenigen sein, die in einer klassischen LAMP-Amplifikationsreaktion verwendet werden, wie sie hierin im Beispielabschnitt offenbart sind.
Der Begriff „Coronavirus-Nukleinsäure“ bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die direkt von einem Coronavirus-Genom abgeleitet ist, wie coronavirale genomische RNA oder, oder DNA, die davon revers transkribiert wurde. Ein Coronavirus im Kontext der Erfindung ist ein Virus der Familie der Coronaviridae. Zu den Coronaviridae gehören z.B. Coronaviren, z.B. das humane Coronavirus 229E (HCoV- 229E), das humane Coronavirus OC43 (HCoV-OC43) sowie SARS-CoV und SARS-CoV-2 (der Erreger des schweren akuten respiratorischen Syndroms (SARS)), die Infektionen der oberen Atemwege, Infektionen der unteren Atemwege und Gastroenteritis verursachen. Am meisten bevorzugt in allen Aspekten und Ausführungsformen der hierin offenbarten Erfindung ist das Coronavirus SARS-CoV-2, das verursachende Virus der COVID-19-Pandemie.
Der Begriff „Primer-Set“ oder „RT-LAMP-Primer-Set“ oder ähnliche Begriffe, die sich auf ein bestimmtes „Set“ von Oligonukleotiden beziehen, bezeichnen eine Vielzahl von Primer-Oligonukleotiden, die zusammen in einer Amplifikationsreaktion zur Amplifikation einer Nukleinsäure verwendet werden können. Wenn also von einem „Set von RT-LAMP-Primern“ oder einem „LAMP-Set“ die Rede ist, so erfordert ein solches Set mindestens 4 RT-LAMP-Sonden für eine ausreichende Amplifikation bei isothermen Bedingungen gemäß dem allgemeinen LAMP- oder RT-LAMP-Verfahren. Ein solches Set umfasst daher mindestens die inneren Primer (innerer Vorwärtsprimer EN: Forward Inner Primer, oder FIP, und innerer Rückwärtsprimer EN: Backward Inner Primer, oder BIP) sowie die äußeren Primer F3 und B3 (siehe auch 1). In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann ein „Set von RT-LAMP-Primern“ zusätzlich Vorwärts- und Rückwärtsschleifen-Primer (EN: Loop F und Loop B oder LF und BL) umfassen.
Die Begriffe „der [vorliegenden] Erfindung“, „gemäß der Erfindung“, „nach der Erfindung“ und dergleichen, wie hier verwendet, sollen sich auf alle Aspekte und Ausführungsformen der hier beschriebenen und/oder beanspruchten Erfindung beziehen.
Wie hierin verwendet, ist der Begriff „umfassend“ so auszulegen, dass er sowohl „einschließlich“ als auch „bestehend aus“ umfasst, wobei beide Bedeutungen ausdrücklich beabsichtigt sind, und daher einzeln offenbarte Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung. Wo hierin verwendet, ist „und/oder“ als spezifische Offenbarung von jedem der beiden angegebenen Merkmale oder Komponenten mit oder ohne das andere zu verstehen. So ist z.B. „A und/oder B“ als spezifische Offenbarung von (i) A, (ii) B und (iii) A und B zu verstehen, so als ob jedes Merkmal hier einzeln aufgeführt wäre. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnen die Begriffe „etwa“ und „ungefähr“ ein Genauigkeitsintervall, das der Fachmann so versteht, dass die technische Wirkung des betreffenden Merkmals noch gewährleistet ist. Der Begriff bezeichnet typischerweise eine Abweichung von dem angegebenen Zahlenwert um ±20%, ±15%, ±10% und z.B. ±5%. Wie dem Fachmann klar sein wird, hängt die spezifische Abweichung für einen numerischen Wert für einen bestimmten technischen Effekt von der Art des technischen Effekts ab. Zum Beispiel kann ein natürlicher oder biologischer technischer Effekt im Allgemeinen eine größere Abweichung aufweisen als ein künstlicher oder technischer Effekt. Wie dem Fachmann klar sein wird, hängt die spezifische Abweichung für einen numerischen Wert für einen bestimmten technischen Effekt von der Art des technischen Effekts ab. So kann z. B. ein natürlicher oder biologischer technischer Effekt im Allgemeinen eine größere Abweichung aufweisen als ein von Menschen gemachter oder konstruierter technischer Effekt. Wenn ein unbestimmter oder bestimmter Artikel verwendet wird, wenn er sich auf ein Substantiv im Singular bezieht, z.B. „ein“, „eine“, „einer“ oder „der“, „die“, oder „das“, schließt dies einen Plural dieses Substantivs ein, sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist.
Verfahren, Mittel und Primer-Sets zum Nachweis von SARS-CoV-2-Nukleinsäuren
Hierin sind Verfahren und Mittel zum Nachweis von SARS-CoV-2-Nukleinsäuren in einer Probe (wie in einer Probe von einem Subjekt, das mit SARS-CoV-2 infiziert ist oder bei dem der Verdacht besteht, dass es mit SARS-CoV-2 infiziert ist) offenbart. Die offenbarten Verfahren können verwendet werden, um eine Infektion mit SARS-CoV-2 in einem Subjekt zu diagnostizieren, zum Beispiel durch Analysieren einer biologischen Probe von einem Subjekt, um SARS-CoV-2-Nukleinsäuren in der Probe von dem Subjekt nachzuweisen. In einigen Beispielen umfassen die Verfahren LAMP- oder RT-LAMP-Assays.
Dementsprechend betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins einer Coronavirus-Nukleinsäure in einer Probe, umfassend:

• In Kontakt bringen der Probe mit mindestens einem Set von Reversen-Transkriptions-Schleifen-vermittelten isothermalen Amplifikationsprimern (EN: reverse transcriptionloop mediated isothermal amplification (RT-LAMP)), die für eine Coronavirus-Nukleinsäure spezifisch sind, unter Bedingungen, die für die Amplifikation der Coronavirus-Nukleinsäure ausreichend sind, wodurch ein Coronavirus-Nukleinsäure-Amplifikationsprodukt erzeugt wird; und
• Nachweisen des Coronavirus-Nukleinsäure-Amplifikationsprodukts, wodurch die Anwesenheit von Coronavirus-Nukleinsäure in der Probe nachgewiesen wird.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Coronavirus, von dem eine Nukleinsäure mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und den erfindungsgemäßen Mitteln nachgewiesen wird, SARS-CoV-2. In bestimmten, besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beziehen sich die Verfahren und Mittel der verschiedenen hierin offenbarten Aspekte und Ausführungsformen auf einen spezifischen und selektiven Nachweis von SARS-CoV-2, und schließen somit andere Coronaviren, vorzugsweise das humane Coronavirus 229E (HCoV-229E) und das humane Coronavirus OC43 (HCoV-OC43), ausdrücklich aus, oder die Verfahren und Mittel der Erfindung können diese nicht nachweisen.
Die hier beschriebenen Verfahren und Mittel können für jeden Zweck verwendet werden, für den der Nachweis von SARS-CoV-2-Nukleinsäuren wünschenswert ist, einschließlich diagnostischer und prognostischer Anwendungen, wie z.B. in Labor- und klinischen Umgebungen. Geeignete Proben umfassen alle herkömmlichen biologischen Proben, einschließlich klinischer Proben, die von einem menschlichen oder tierärztlichen Subjekt gewonnen wurden. Geeignete Proben umfassen alle biologischen Proben, die für den Nachweis einer Infektion bei Subjekten nützlich sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zellen (wie Wangenzellen oder periphere mononukleäre Blutzellen), Gewebe, Autopsieproben, Knochenmarkaspirate, Körperflüssigkeiten (Blut, Serum, Plasma, Urin, Stuhl, Liquor, Mittelohrflüssigkeit, Augenflüssigkeit, Muttermilch, bronchoalveoläre Lavage, Trachealaspirate, Sputum, orale Flüssigkeiten, Nasopharyngealaspirate, Oropharyngealaspirate oder Speichel), orale Abstriche, Augenabstriche, Zervikalabstriche, Vaginalabstriche, Rektalabstriche, Stuhl und Stuhlsuspensionen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden bevorzugte Proben aus Rachenabstrich, Nasenabstrich, Mundabstrich, Abstrichen von Schleimhäuten und Gurgelwasser ausgewählt. Die Probe kann direkt verwendet werden, was ein spezifischer Vorteil der hierin offenbarten Verfahren zum Nachweis von SARS-CoV-2 ist, oder sie kann verarbeitet werden, z.B. durch Zugabe von Lösungsmitteln, Konservierungsmitteln, Puffern oder anderen Verbindungen oder Substanzen. In einigen Beispielen werden die Nukleinsäuren aus der Probe isoliert. In anderen Beispielen ist die Isolierung von Nukleinsäuren aus der Probe vor der Verwendung in den hier offenbarten Verfahren nicht notwendig und die Probe (wie Speichel oder Gurgelwasser) wird direkt oder mit minimaler Vorverarbeitung verwendet. Zum Beispiel können Körperflüssigkeiten (wie Speichel/Sputum oder Gurgelwasser) in einigen Beispielen in Wasser oder Puffer verdünnt und in den offenbarten RT-LAMP-Assays ohne zusätzliche Verarbeitung verwendet werden. In einigen Beispielen wird die Probe (z.B. eine Probe, die Zellen enthält, wie z.B. mononukleäre Zellen aus peripherem Blut) vorbehandelt, um Zellen zu lysieren (z.B. mit einem Lysepuffer) oder durch einfaches Erhitzen, aber Nukleinsäuren werden vor der Verwendung im RT-LAMP-Assay nicht isoliert. Zu den Proben gehören auch isolierte Nukleinsäuren, wie z.B. DNA oder RNA, die aus einer biologischen Probe eines Subjekts, einem SARS-CoV-2-Isolat oder einer anderen Quelle von Nukleinsäuren isoliert wurden. Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren wie RNA und/oder DNA aus einer Probe sind dem Fachmann bekannt; solche Verfahren hängen z.B. von der Art der Probe ab, in der die Nukleinsäure gefunden wird. Nukleinsäuren können mit Standardverfahren extrahiert werden. Zum Beispiel kann die schnelle Nukleinsäurepräparation mit einem kommerziell erhältlichen Kit durchgeführt werden (z. B. Kits und/oder Instrumente von Qiagen (z. B. DNEasy® oder RNEasy® Kits), Roche Applied Science (z. B. MagNA Pure Kits und Instrumente), Thermo Scientific (KingFisher mL), bioMerieux (Nuclisens® NASBA Diagnostics) oder Epicentre (Masterpure™ Kits)). In anderen Beispielen können die Nukleinsäuren unter Verwendung von Guanidiniumisothiocyanat extrahiert werden, wie z.B. die einstufige Isolierung durch saure Guanidiniumisothiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion (Chomczynski et al. Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987).
Ein zusätzlicher Vorteil der Verfahren und Mittel der vorliegenden Erfindung ist im Vergleich zu Standard-RT-PCR-basierten Verfahren die deutlich reduzierte Assay- und Nachweiszeit, vorzugsweise bis zu 45 Minuten, bei gleichzeitiger Erhöhung der Amplifikationsrate und damit Verbesserung der Nachweisgrenzen des Assays. Die Sonden-Optimierung der Erfindung bietet eine hochspezifische und dennoch schnelle und kostenreduzierte Diagnostik für SARS-CoV-2-Infektionen, die auch in virenarmen Proben wie z.B. Gurgellösungen funktioniert. Diese Effekte verbessern die Testakzeptanz und - geschwindigkeit. Diese Effekte sind für die optimierten Primer-Sequenzen der Erfindung möglich.
Hierin werden Verfahren zum Nachweis von SARS-CoV-2 in einer Probe unter Verwendung von LAMP- oder RT-LAMP-Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis beschrieben. LAMP, das erstmals von Notomi et al. (Nucl. Acids Res. 28:e63, 2000) beschrieben wurde, ist ein einstufiges isothermales Amplifikationsverfahren, das unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität in kurzer Zeit amplifizierte Nukleinsäuren produzieren kann. LAMP kann für die Amplifikation von RNA-Targets angepasst werden, indem der Reaktion Reverse Transkriptase (RT) ohne einen zusätzlichen Hitzeschritt hinzugefügt wird (als RT-LAMP bezeichnet). Die isothermale Natur von LAMP und RT-LAMP ermöglicht die Flexibilität des Assays, da er mit einfachen und kostengünstigen Heizgeräten verwendet werden kann, was den Nachweis von SARS-CoV-2 in anderen Umgebungen als in zentralen klinischen Labors, einschließlich am Point-of-Care (POC), erleichtern kann. POC-Tests sind besonders wichtig für die SARS-CoV-2-Diagnose, da sie das Potenzial haben, ein dezentrales bevölkerungsweites Screening von SARS-CoV-2-Infektionen zu ermöglichen. Darüber hinaus bieten LAMP und RT-LAMP Vielseitigkeit in Bezug auf den Probentyp und es wird angenommen, dass die Wahrscheinlichkeit des Nachweises eines amplifizierbaren Targets sogar in Gurgellösungen steigt, was die allgemeine Testakzeptanz erhöhen wird.
In bevorzugten Ausführungsformen der hierin offenbarten Erfindung umfasst das mindestens eine Set von RT-LAMP-Primern, das für die Coronavirus-Nukleinsäure spezifisch ist, einen oder mehrere von einem äußeren Vorwärtsprimer (F3), einem äußeren Rückwärtsprimer (B3), einem inneren Vorwärtsprimer (FIP), einem inneren Rückwärtsprimer (BIP) und vorzugsweise: einen Vorwärtsschleifenprimer (FL) und einen Rückwärtsschleifenprimer (BL).
In einigen Ausführungsformen der Erfindung ist es bevorzugt, dass das mindestens eine Set von RT-LAMP-Primern spezifisch für eine Region innerhalb des Coronavirus-Genoms ist, ausgewählt aus: einer Region innerhalb des Coronavirus-Gens ORF1AB oder einer Region innerhalb des Coronavirus-Gens N, wobei die Region innerhalb des Coronavirus-Gens ORF1AB vorzugsweise an einer genomischen Position von etwa 500 bis etwa 800 liegt; und wobei die Region innerhalb des Gen-N-Fragments an einer genomischen Position von etwa 28500 bis etwa 28900 liegt. Das Genom von SARS-CoV-2 ist aus dem Stand der Technik bekannt (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/1798174254/).
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Set von Nukleinsäure-Primern zur Verwendung in der Schleifen-vermittelten isothermalen Amplifikation (LAMP) von einer vom Schweren Akuten Respiratorischen Syndrom-Corona-Virus 2 (SARS-Cov2) abgeleiteten ZielNukleinsäure, umfassend mindestens ein erstes Corona-LAMP-Primer-Set, wobei das erste Corona-LAMP-Primer-Set mindestens die folgenden Nukleinsäure-Primermoleküle umfasst:

• einen Nukleinsäure-F3-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID Nr.: 47 (GGACCCCAAAATCAG) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID Nr.: 47 (GGACCCCAAAATCAG) gezeigten Sequenz ist; und
• einen Nukleinsäure-FL-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NR: 94 (GTTGAATCTGAGGGTCC) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NR: 94 (GTTGAATCTGAGGGTCC) gezeigten Sequenz ist; und
• einen Nukleinsäure-FIP-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NR: 95 (TCTCCATTCTGGTTACTGCCCGAAATGCACCCCGCATTAC) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NR: 95 (TCTCCATTCTGGTTACTGCCCGAAATGCACCCCGCATTAC) gezeigten Sequenz ist; und
• einen Nukleinsäure-B3-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NR: 56 (CTTGCCATGTTGAGTG) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NR: 56 (CTTGCCATGTTGAGTG) gezeigten Sequenz ist; und
• einen Nukleinsäure-BL-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NR: 53 (CCCCAAGGTTTACCC) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NR: 53 (CCCCAAGGTTTACCC) gezeigten Sequenz ist; und
• einen Nukleinsäure-BIP-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NR: 55 (CGCGATCAAAACAACGTCGGAGCGGTGAACCAAGACGCAG) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NR: 55 (CGCGATCAAAACAACGTCGGAGCGGTGAACCAAGACGCAG) gezeigten Sequenz ist.

Darüber hinaus betrifft der erste Aspekt auch ein Set von Nukleinsäure-Primern zur Verwendung in der Schleifen-vermittelten isothermalen Amplifikation (LAMP) von einer vom Schweren Akuten Respiratorischen Syndrom-Corona-Virus 2 (SARS-Cov2) abgeleiteten ZielNukleinsäure, umfassend mindestens ein zweites Corona-LAMP-Primer-Set, wobei das zweite Corona-LAMP-Primer-Set mindestens die folgenden Nukleinsäure-Primermoleküle umfasst:

• einen Nukleinsäure-F3-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NR: 1 (ATGACCAAATTGGCTACTAC) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NR: 1 (ATGACCAAATTGGCTACTAC) gezeigten Sequenz ist; und
• einen Nukleinsäure-FL-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NR: 12 (CCATCTTGGACTGAG) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NR: 12 (CCATCTTGGACTGAG) gezeigten Sequenz ist; und
• einen Nukleinsäure-FIP-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NR: 4 (AGCTTCTGGCCCAGTTCCTTCGTGGTGGTGACGG) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NR: 4 (AGCTTCTGGCCCAGTTCCTTCGTGGTGGTGACGG) gezeigten Sequenz ist; und
• einen Nukleinsäure-B3-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NR: 68 (AGCACGATTGCAGCAT) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NR: 68 (AGCACGATTGCAGCAT) gezeigten Sequenz ist; und
• einen Nukleinsäure-BL-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NR: 65 (ACTGAGGGAGCCTTGA) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NR: 65 (ACTGAGGGAGCCTTGA) gezeigten Sequenz ist; und
• einen Nukleinsäure-BIP-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NR: 67 (CAAAGACGGCATCATATGGGGGATTGCGGGTGCCAATGTG) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NR: 67 (CAAAGACGGCATCATATGGGGGATTGCGGGTGCCAATGTG) gezeigten Sequenz ist.

Das Set von Nukleinsäure-Primern der Erfindung kann in bestimmten Ausführungsformen eine Duplex- oder Triplex-Kombination von LAMP-Primer-Sets umfassen. In solchen Duplex- oder Triplex-Anwendungen ist jedes LAMP-Primer-Set mit einer eindeutigen nachweisbaren Markierung assoziiert, um einen spezifischen Nachweis der Amplifikation basierend auf jedem Set unabhängig zu ermöglichen. Daher umfasst in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung das Set von Nukleinsäure-Primern sowohl das oben genannte erste Corona-LAMP-Primer-Set als auch das oben genannte zweite Corona-LAMP-Primer-Set.
In einer Triplex-Anwendung umfasst das Set von Nukleinsäure-Primern der Erfindung ferner ein Kontroll-LAMP-Primer-Set, das Nukleinsäure-Primer für die LAMP einer internen Kontroll-Nukleinsäure in reverser Transkription umfasst, wie z.B. eine revers transkribierte RNA, die von einem Housekeeping-Gen abgeleitet ist, wie z.B. humanes beta-Aktin (ACTB).
In diesem Zusammenhang kann es bevorzugt sein, dass der F3-LAMP-Primer, der FL-LAMP-Primer, der B3-LAMP-Primer und/oder der BL-LAMP-Primer jeweils eine Länge von 5 bis 30 Nukleotiden (nt), vorzugsweise von 8 bis 25 nt, aufweisen oder daraus bestehen.
In diesem Zusammenhang kann es auch bevorzugt sein, dass der FIP-LAMP-Primer und/oder der BIP-LAMP-Primer jeweils eine Länge von 10 bis 50 Nukleotiden (nt), vorzugsweise von 15 bis 40 nt, aufweisen oder daraus bestehen.
Wie oben erwähnt, umfasst mindestens ein Primer in jedem LAMP-Primer-Set, vorzugsweise mehr als ein Primer in jedem solchen Set, eine nachweisbare Markierung, wie eine nachweisbare Markierung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Biotin, FAM, DIG oder einem anderen Beispiel für nachweisbare Markierungen besteht, wie hier an anderer Stelle beschrieben.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst der mindestens ein Set von RT-LAMP-Primern mindestens einen, vorzugsweise zwei, vier oder sechs Primer, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu mindestens 80%, vorzugsweise 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder ganz besonders bevorzugt 100% identisch mit einer der SEQ ID NRN: 1 bis 73, 94 oder 95, oder umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Zielnukleinsäure hybridisiert, die eine Sequenz umfasst, die komplementär zu einer beliebigen von SEQ ID NR: 1 bis 73, 94 oder 95 ist.
Wie oben erwähnt, kann LAMP oder RT-LAMP auch durch die Zugabe von mehreren LAMP-Primer-Sets mit unterschiedlichen Spezifitäten gemultiplext werden. Diese Fähigkeit ist vorteilhaft, weil sie z.B. die Einbeziehung interner Kontrolle(n), die Amplifikation von zwei oder mehr Regionen innerhalb desselben Targets oder den Nachweis von zwei oder mehr Targets oder Pathogenen in einer einzigen Reaktion ermöglicht. In einigen Beispielen umfassen die offenbarten Verfahren einen Multiplex-LAMP- oder RT-LAMP-Assay zum Nachweis mehrerer Regionen von SARS-CoV-2-Nukleinsäuren in einer einzigen Reaktion, z.B. zum Nachweis von ORF1AB und dem N-Gen.
In einigen Beispielen umfassen die Verfahren und Mittel ferner die reverse Transkription der SARS-CoV-2-RNA in der Probe, zum Beispiel durch in Kontakt bringen der Probe mit einer reversen Transkriptase. Das „in Kontakt bringen“ der Probe mit der reversen Transkriptase kann vor dem in Kontakt bringen der Probe mit dem einen oder den mehreren Sets von LAMP-Primern erfolgen oder gleichzeitig mit dem in Kontakt bringen der Probe mit dem einen oder den mehreren Sets von LAMP-Primern (z.B. in demselben Reaktionsmix mit den LAMP-Primern). Das Amplifikationsprodukt wird durch jedes geeignete Verfahren nachgewiesen, wie z.B. durch Trübungsnachweis, Fluoreszenz, immunchromatographische Lateral-Flow-Assays (im Folgenden als „Dipsticks“ bezeichnet) oder durch Gelelektrophorese.
In weiteren Ausführungsformen amplifiziert das Set von LAMP-Primern spezifisch eine weitere SARS CoV-2 N-Gen-Nukleinsäure. Ein weiteres beispielhaftes Set von LAMP-Primern zur Amplifikation einer weiteren SARS CoV-2 N-Gen-Nukleinsäure umfasst einen F3-Primer, der eine Nukleinsäure mit mindestens 90% (wie z.B. mindestens 95%, 96%, 98% oder vorzugsweise 100%) Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 47 einschließt, einen B3-Primer, der eine Nukleinsäure mit mindestens 90% (wie z.B. mindestens 95%, 96%, 98% oder vorzugsweise 100%) Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 56 einschließt, einen FIP-Primer, der eine Nukleinsäure mit mindestens 90% (wie z.B. mindestens 95%, 96%, 98% oder vorzugsweise 100%) Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 51, oder 95 einschließt und einen BIP-Primer, der eine Nukleinsäure mit mindestens 90% (wie z.B. mindestens 95%, 96%, 98% oder vorzugsweise 100%) Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 55 einschließt, und gegebenenfalls einen Loop F-Primer, der eine Nukleinsäure mit mindestens 90% (wie z.B. mindestens 95%, 96%, 98% oder vorzugsweise 100%) Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 49 oder 94 einschließt, und einen Loop B-Primer, der eine Nukleinsäure mit mindestens 90 % (wie z.B. mindestens 95%, 96%, 98% oder vorzugsweise 100%) Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 53 einschließt, oder dem reversen Komplement von einer der SEQ ID NR: 47-56, 94, oder 95. Dieses bevorzugte Primer-Set, hierin als „CLPS1“ bezeichnet, ist beispielhaft in 7 dargestellt, wo die Primer-Bindungsstellen des Primer-Sets CLPS1 in der genomischen N-Gen-Region von SARS CoV-2 gezeigt sind. CLPS1 ist in Tabelle 1 weiter unten beschrieben.
In weiteren Ausführungsformen amplifiziert das Set von LAMP-Primern spezifisch eine weitere SARS CoV-2 N-Gen-Nukleinsäure. Ein weiteres beispielhaftes Set von LAMP-Primern zur Amplifikation einer weiteren SARS CoV-2 N-Gen-Nukleinsäure umfasst einen F3-Primer, der eine Nukleinsäure mit mindestens 90% (wie z.B. mindestens 95%, 96%, 98% oder vorzugsweise 100%) Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 1 einschließt, einen B3-Primer, der eine Nukleinsäure mit mindestens 90% (wie z.B. mindestens 95%, 96%, 98% oder vorzugsweise 100%) Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 68 einschließt, einen FIP-Primer, der eine Nukleinsäure mit mindestens 90% (wie z.B. mindestens 95%, 96%, 98% oder vorzugsweise 100%) Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 4 oder 5 einschließt, und einen BIP-Primer, der eine Nukleinsäure mit mindestens 90% (wie z.B. mindestens 95%, 96%, 98% oder vorzugsweise 100%) Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 67 einschließt, und gegebenenfalls einen Loop F-Primer, der eine Nukleinsäure mit mindestens 90% (wie z.B. mindestens 95%, 96%, 98% oder vorzugsweise 100%) Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 12 oder 13 einschließt, und einen Schleifen-B-Primer, der eine Nukleinsäure mit mindestens 90% (wie z.B. mindestens 95%, 96%, 98% oder vorzugsweise 100%) Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 65 einschließt, oder dem reversen Komplement von einer der SEQ ID NRN: 1, 4, 5, 12, 13, 65, 67, 68. Dieses bevorzugte Primer-Set, hierin als „CLPS2“ bezeichnet, ist beispielhaft in 8 dargestellt, wo die Primer-Bindungsstellen des Primer-Sets CLPS2 in der genomischen N-Gen-Region von SARS CoV-2 gezeigt sind. CLPS2 ist in Tabelle 1 weiter unten beschrieben.

Tabelle 1 zeigt die beiden bevorzugten Primersätze CLPS1 und CLPS2 der vorliegenden Erfindung mit den Koordinaten der genomischen Zielregion von SARS CoV2.

Primer set	Primer Bezeichnung	Sequenz	Genomische Koordinaten	SEQ ID NR:	Passende Markierung
CLPS1	Aliyah-F3	GGACCCCAAAATCAG	28286-28300	47	-
	Aliyah- FIP		28365-28346; 28301-28320	95	Biotin (SEQ ID NR: 51)
	Aliyah-FL	GTTGAATCTGAGGGTCC	28344-28328	94	FAM (SEQ ID NR: 49)
	Aliyah- BL	CCCCAAGGTTTACCC	28397-28411	53	-
	Aliyah- BIP		28377-28396; 28438-28419	55	-
	Aliyah-B3	CTTGCCATGTTGAGTG	28457-28441	56	-
CLPS2	SARS-CoV2-1.F3	ATGACCAAATTGGCTACTAC	28515-28534	1	-
CLPS2	(Biotin-)SARS-C0V2-1.FIP		28630-28613; 28554-28569	4	Biotin (SEQ ID NR: 5)
	(FAM-)SARS-C0V2-1.FL	CCATCTTGGACTGAG	28597-28583	12	FAM (SEQ ID NR: 13)
	SARS-CoV2-3.BL	ACTGAGGGAGCCTTGA	28676-28691	65	-
	SARS-CoV2-3.BIP		28651-28670; 28725-28706	67	-
	SARS-CoV2-3.B3	AGCACGATTGCAGCAT	28749-28734	68	-

In anderen Ausführungsformen umfassen die Mittel und Verfahren das In Kontakt bringen einer Probe (wie einer Probe, die SARS CoV-2-Nukleinsäuren enthält oder bei der der Verdacht besteht, dass sie SARS CoV-2-Nukleinsäuren enthält) mit mindestens einem Set von LAMP-Primern, die für eine SARS CoV-2 N-Protein kodierende Nukleinsäure spezifisch sind (z.B. ein Set von Primern, das die Sequenzen der SEQ ID NRN: 1-18 oder 31-56 oder 64-73, 94 oder 95 enthält), unter Bedingungen, die für die Amplifikation der SARS CoV-2 N-Gen-Nukleinsäure ausreichen, wobei ein Amplifikationsprodukt erzeugt wird. In einigen Beispielen amplifizieren die LAMP-Primer eine SARS CoV-2 N-Gen-Nukleinsäure mit mindestens 80% Sequenzidentität (wie mindestens 85%, 90%, 95%, 98% oder mehr Sequenzidentität) zu den Nukleotiden 28270-29530 der SARS CoV-2-Referenzsequenz oder einem Teil davon. In einigen Beispielen umfassen die Verfahren ferner die reverse Transkription der SARS CoV-2-RNA in der Probe, beispielsweise durch in Kontakt bringen der Probe mit einer reversen Transkriptase. Das in Kontakt bringen der Probe mit der reversen Transkriptase kann vor dem in Kontakt bringen der Probe mit dem einen oder mehreren Sets von LAMP-Primern erfolgen oder gleichzeitig mit dem in Kontakt bringen der Probe mit dem einen oder mehreren Sets von LAMP-Primern (z.B. im gleichen Reaktionsgemisch mit den LAMP-Primern). Das Amplifikationsprodukt wird durch jedes geeignete Verfahren nachgewiesen, wie z. B. Lateral Flow Dipsticks oder Nachweis der Trübung, Fluoreszenz oder durch Gelelektrophorese.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst der mindestens eine Primer in dem Set von RT-LAMP-Primern eine nachweisbare Markierung. Eine nachweisbare Markierung ist vorzugsweise eine, wie sie hier an anderer Stelle definiert ist. Bestimmte bevorzugte Markierungen sind jedoch aus einer der folgenden Kategorien von Markierungen ausgewählt: Fluorophore, Isotope (z.B. 32P, 33P,35S, 3H, 14C, 1251, 1311), elektronendichte Reagenzien (z.B., Gold, Silber), Nanopartikel, Enzyme, die üblicherweise in einem ELISA verwendet werden (z.B. Meerrettichperoxidase, Beta-Galaktosidase, Luziferase, alkalische Phosphatase), chemilumineszierende Verbindungen, kolorimetrische Markierungen (z.B., kolloidales Gold), magnetische Markierungen (z.B. DynabeadsTM), Biotin, Digoxigenin, Haptene, Proteine, für die Antiseren oder monoklonale Antikörper verfügbar sind, Liganden, Hormone, Oligonukleotide, die in der Lage sind, einen Komplex mit dem entsprechenden Oligonukleotid-Komplement zu bilden, oder eine beliebige Kombination davon. Am meisten bevorzugt werden die nachweisbare Marker verwendet, die in Tabelle 1 angegeben sind.
In bestimmten Ausführungsformen kann das mindestens eine Set von LAMP-Primern außerdem mindestens ein Quencher-Oligonukleotid umfassen.
Die Probe und das/die LAMP-Primer-Set(s) werden unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die für die Amplifikation einer SARS CoV-2-Nukleinsäure (wie einer SARS CoV-2 ORF1AB- oder N-Protein-Nukleinsäure) ausreichen. Die Probe wird mit dem/den Set(s) von LAMP-Primern in einer Konzentration in Kontakt gebracht, die ausreicht, um die Amplifikation einer SARS CoV-2-Nukleinsäure zu unterstützen. In einigen Beispielen beträgt die Menge jedes Primers etwa 0,1 µM bis etwa 5 µM (wie etwa 0,2 µM bis etwa 2 µM, oder etwa 0,5 µM bis etwa 2 µM). Jeder Primer kann in einer anderen Konzentration enthalten sein, und geeignete Konzentrationen für jeden Primer können von einem Fachmann unter Verwendung von Routineverfahren ausgewählt werden.
In einigen Beispielen wird die LAMP- oder RT-LAMP-Reaktion in einem Gemisch durchgeführt, das einen geeigneten Puffer (z.B. einen Phosphatpuffer oder Tris-Puffer) enthält. Der Puffer kann auch zusätzliche Komponenten enthalten, wie z.B. Salze (wie KCl oder NaCl, Magnesiumsalze (z. B. MgCl2 oder MgSo4), Ammonium (z.B. (NH4)2So4)), Detergenzien (z.B. TRITON®-X100) oder andere Zusatzstoffe (wie z.B. Betain, Guanidinhydrochlorid oder Dimethylsulfoxid). Die Auswahl eines geeigneten Puffers und etwaiger Additive kann von einem Fachmann mit Hilfe von Routineverfahren vorgenommen werden. In einem nicht einschränkenden Beispiel enthält der Puffer 20 mM Tris- HC1, 10 mM (NH4)2So4, 50 mM KCl, 8 mM MgSo4, 0,1% TRITON®-X100 und 0,8 M Betain. Ein beispielhafter, kommerziell erhältlicher Reaktionspuffer ist IX Isothermal Amplification Buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA). Der Reaktionsmix enthält auch Nukleotide oder Nukleotidanaloga. In einigen Beispielen ist eine äquimolare Mischung aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP (als dNTPs bezeichnet) enthalten, z.B. etwa 0,5-2 mM dNTPs. Zur Verstärkung des erfindungsgemäßen Assays wird insbesondere die Zugabe von Guanidinhydrochlorid bevorzugt (siehe Zhang Y et al - https://doi.org/10.1101/2020.06.03.132894).
Eine DNA-Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität ist ebenfalls in der Reaktionsmischung enthalten. Beispielhafte DNA-Polymerasen sind Bst DNA-Polymerase, Bst 2.0 DNA-Polymerase, Bst 2.0 WarmStart™ DNA-Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA), Phi29 DNA-Polymerase, Bsu DNA-Polymerase, OmniAmp™ DNA-Polymerase (Lucigen, Middleton, MI), Taq DNA-Polymerase, VentR®- und Deep VentR®-DNA-Polymerasen (New England Biolabs), 9°Nm™-DNA-Polymerase (New England Biolabs), Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, PhiPRDl-DNA-Polymerase, Phage M2-DNA-Polymerase, T4-DNA-Polymerase und T5-DNA-Polymerase. In einigen Beispielen sind etwa 1 bis 20 U (wie etwa 1 bis 15 U, etwa 2 bis 12 U, etwa 10 bis 20 U, etwa 2 bis 10 U oder etwa 5 bis 10 U) an DNA-Polymerase in der Reaktion enthalten. In einigen Beispielen hat die Polymerase Strangverdrängungsaktivität und besitzt keine 5'-3' Exonukleaseaktivität. In einem nicht einschränkenden Beispiel ist die DNA-Polymerase Bst 2.0 WarmStart™ DNA-Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA), zum Beispiel etwal6 U Bst 2.0 WarmStart™ DNA-Polymerase pro Reaktion.
In einigen Ausführungsformen ist die Ziel-SARS-CoV-2-Nukleinsäure RNA, und eine reverse Transkriptase ist zusätzlich im LAMP-Assay enthalten (genannt RT-LAMP-Assay). Exemplarische WarmStart® RTx Reverse Transkriptase (NEB, Ipswich, MA), SuperScript IV Reverse Transkriptase (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), Reverse Transkriptasen umfassen MMLV Reverse Transkriptase, AMV Reverse Transkriptase und ThermoScript™ Reverse Transkriptase (Life Technologies, Grand Island, NY), Thermo-X™ Reverse Transkriptase (Life Technologies, Grand Island, NY). In einigen Beispielen sind etwa 0,1 bis 50 U (wie etwa 0,2 bis 40 U, etwa 0,5 bis 20 U, etwa 1 bis 10 U oder etwa 2 bis 5 U) RT in der Reaktion enthalten. In einem besonderen, nicht einschränkenden Beispiel umfasst die Reaktion 2 U/Reaktion AMV RT.
Das Reaktionsgemisch, einschließlich Probe, LAMP-Primern, Puffern, Nukleotiden, DNA-Polymerase, optional reverser Transkriptase und einer zweiten Polymerase wie der Q5® High-Fidelity DNA Polymerase und anderen Komponenten, wird für eine Zeitspanne und bei einer Temperatur inkubiert, die für die Produktion eines Amplifikationsprodukts ausreicht. In einigen Beispielen umfassen die Reaktionsbedingungen das Inkubieren der Reaktionsmischung bei etwa 37°C bis etwa 70°C (wie etwa 40°C-70°C, etwa 50°C-65°C oder etwa 45°C-60°C), zum Beispiel etwa 40°C, etwa 45°C, etwa 50°C, etwa 55°C, etwa 60°C, etwa 65°C oder etwa 70°C. Das Reaktionsgemisch wird für mindestens etwa 5 Minuten (wie etwa 10, etwa 15, etwa 20, etwa 30, etwa 40, etwa 50, etwa 60, etwa 70, etwa 80, etwa 90, etwa 100, etwa 110, etwa 120 Minuten oder mehr) inkubiert, zum Beispiel etwa 10-120 Minuten, etwa 15-90 Minuten, etwa 20-70 Minuten, etwa 45-75 Minuten oder etwa 30-60 Minuten. In einem nicht einschränkenden Beispiel umfassen die Reaktionsbedingungen die Inkubation der Reaktionsmischung bei etwa 60°C für etwa 60 Minuten. Die Reaktion kann optional durch eine kurze Inkubation bei einer höheren Temperatur beendet werden, zum Beispiel etwa 2-10 Minuten bei etwa 80°C. In einigen Beispielen, die jedoch nicht darauf beschränkt sind, wird der Assay unter Verwendung einer chemischen Heizvorrichtung durchgeführt, um die Probe für eine bestimmte Zeit auf der Reaktionstemperatur zu halten (siehe z. B. Singleton et al., Proc. SPIE 8615:8625oR, 2013; Curtis et al, PLoS ONE 7:e31432, 2012).
Nach der Inkubation des Reaktionsgemischs wird das Amplifikationsprodukt mit jedem geeigneten Verfahren nachgewiesen. Die Nachweisverfahren können quantitativ, semiquantitativ oder qualitativ sein. Die Anreicherung eines Amplifikationsprodukts (z.B. im Vergleich zu einer Negativkontrolle, wie z.B. einer Nur-Reagenz-Kontrolle) zeigt das Vorhandensein von SARS CoV-2-Nukleinsäuren in der Probe an. In einigen Beispielen wird die Akkumulation eines Amplifikationsprodukts durch immunchromatographische Lateral-Flow-Assays (z.B. unter Verwendung von Dipsticks) nachgewiesen, indem die Trübung des Reaktionsgemischs gemessen wird (z.B. visuell oder mit einem Trübungsmesser). In anderen Beispielen wird das Amplifikationsprodukt mit Hilfe von Gelelektrophorese nachgewiesen, z.B. durch Nachweis des Vorhandenseins oder der Menge des Amplifikationsprodukts mit Agarosegelelektrophorese. In einigen Beispielen wird das Amplifikationsprodukt unter Verwendung eines kolorimetrischen Assays nachgewiesen, z.B. mit einem pH-sensitiven Farbstoff (z. B. Phenolrot) oder einem interkalierenden Farbstoff (z.B. Propidiumiodid, SYBR-Grün oder Picogreen) in einer Cycler-basierten Echtzeitanalyse oder einem chromogenen Reagenz (siehe z. B. Goto et al., BioTechniques 46: 167-172, 2009).
In weiteren Beispielen wird das Amplifikationsprodukt durch einen fluoreszierenden Indikatorfarbstoff wie Calcein oder Hydroxynaphtholblau (HNB) detektiert (siehe z. B. Tomita et al., Nat. Protoc. 3:877-882,2008). In anderen Beispielen werden die Amplifikationsprodukte mit Hilfe einer nachweisbaren Markierung nachgewiesen, die in einen oder mehrere der LAMP-Primer eingebaut ist (siehe unten). Die nachweisbare Markierung kann optisch nachweisbar sein, z. B. mit dem Auge oder mit einem Spektrophotometer oder Fluorimeter. In einigen Beispielen ist die nachweisbare Markierung ein Fluorophor, wie die oben beschriebenen. In einigen Beispielen wird die Markierung in Echtzeit nachgewiesen, z. B. mit einem Fluoreszenz-Scanner (z.B. ESEQuant, Qiagen). Ein Fachmann kann eine oder mehrere nachweisbare Markierungen zur Verwendung in den hierin offenbarten Verfahren auswählen.
Ferner betrifft die Erfindung in einem dritten Aspekt ein Verfahren zur Diagnose einer Coronavirus-Infektion in einem Subjekt, wobei das Verfahren den Nachweis des Vorhandenseins einer Coronavirus-Nukleinsäure in einer biologischen Probe umfasst, die zuvor von dem Subjekt mit einem Verfahren des ersten Aspekts erhalten wurde, wobei das Vorhandensein der Coronavirus-Nukleinsäure in der biologischen Probe eine Coronavirus-Infektion in dem Subjekt anzeigt.
Die Verfahren der hierin offenbarten Erfindung sind vorzugsweise ex vivo oder in vitro Verfahren.
Die Verfahren der Erfindung werden in bevorzugten Ausführungsformen als Lateral-Flow-Test, vorzugsweise als Lateral-Flow-Dipstick-Test, durchgeführt.
Primer und Kits
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung einen isolierten Nukleinsäure-Primer, umfassend eine Nukleinsäuresequenz einer der SEQ ID NRN: 1 bis 73, 94 oder 95 oder umfassend eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens 80%, vorzugsweise 90%, Sequenzidentität zu einer der SEQ ID NRN: 1 bis 73, 94 oder 95, oder umfassend eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Zielnukleinsäure hybridisiert, die eine Sequenz umfasst, die komplementär zu einer der SEQ ID NRN: 1 bis 73, 94 oder 95 ist.
In einigen Ausführungsformen haben die offenbarten Primer eine Länge zwischen 10 und 60 Nukleotiden, wie 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 oder 60 Nukleotide in der Länge und sind in der Lage, an die offenbarten Nukleinsäuremoleküle zu hybridisieren und in einigen Beispielen zu amplifizieren. In einigen Beispielen haben die Primer und/oder Sonden eine Länge von mindestens 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 oder 60 Nukleotiden. In anderen Beispielen können die Primer und/oder Sonden nicht mehr als 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40,45, 50, 55 oder 60 Nukleotide lang sein.
In einigen Beispielen umfassen die offenbarten Primer LAMP-Primer zur Amplifikation von SARS CoV2 ORF1AB-Nukleinsäuren, einschließlich Primer, die eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität (beispielsweise mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Identität) zu SEQ ID NR: 19 oder 57 (F3), SEQ ID NRN: 26 (B3), SEQ ID NRN: 22, 23 oder 59 (FIP), SEQ ID NRN: 27 oder 62 (BIP), SEQ ID NRN: 28 oder 29 (LF) und/oder SEQ ID NRN: 30 (LB) umfassen, oder das reverse Komplement von jeder davon.
In einigen Beispielen umfassen die offenbarten Primer LAMP-Primer für die Amplifikation von SARS CoV-2 N-Gen-Nukleinsäuren, einschließlich Primer, die eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens 90% Sequenzidentität (beispielsweise mindestens 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99 % oder 100% Identität) zu SEQ ID NR: 1, 31, 32, 33, 40 oder 47 (F3), SEQ ID NRN: 9, 38, 39, 56, 68 oder 73 (B3), SEQ ID NRN: 4, 5, 6, 36, 44, 45, 51 oder 95 (FIP), SEQ ID NRN: 10, 11, 17, 55, 67 oder 72 (BIP), SEQ ID NRN: 12, 13, 37, 46, 49 oder 94 (LF), und/oder SEQ ID NRN: 14, 18 oder 53, 65 oder 70 (LB) umfassen, oder das reverse Komplement von jeder davon.
In einigen Beispielen enthält mindestens einer der Primer eine nachweisbare Markierung, wie z.B. ein Fluorophor. In besonderen Beispielen, nachweisbare Markierungen wie in Tabelle 2 unten angegeben.
Obwohl hier beispielhafte Primer-Sequenzen angegeben sind, können die Primer-Sequenzen leicht variiert werden, indem die Primer einige Nukleotide stromaufwärts oder stromabwärts von den Nukleotidpositionen, an die sie auf der Zielnukleinsäure hybridisieren, bewegt werden, vorausgesetzt, dass die Sonde und/oder der Primer immer noch spezifisch für die Zielnukleinsäuresequenz ist. Zum Beispiel können Variationen der Primer, die als SEQ ID NRN: 1-73, 94 oder 95 offenbart sind, durch „Verschieben“ der Sonden oder Primer um einige Nukleotide 5' oder 3' von ihren Positionen hergestellt werden, und solche Variationen werden immer noch spezifisch für die jeweilige Ziel-Nukleinsäuresequenz sein.
Die vorliegende Offenbarung stellt auch Primer zur Verfügung, die Variationen der in einer der SEQ ID NRN: 1-73 gezeigten Nukleotidsequenzen enthalten, solange diese Variationen den Nachweis des Ziel-Nukleinsäuremoleküls ermöglichen. Beispielsweise kann ein Primer mindestens 90% Sequenzidentität aufweisen, wie z. B. mindestens 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % Identität mit einer Nukleinsäure, die die in einer der SEQ ID NRN: 1-73, 94 oder 95 gezeigte Sequenz aufweist. In solchen Beispielen ändert sich die Anzahl der Nukleotide nicht, aber die Nukleinsäuresequenz, die in einer der SEQ ID NRN: 1-73, 94 oder 95 gezeigt ist, kann bei einigen Nukleotiden variieren, wie z.B. Änderungen bei 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Nukleotiden.
Die vorliegende Anmeldung stellt auch Primer zur Verfügung, die etwas länger oder kürzer sind als die in einer der SEQ ID NRN: 1-73, 94 oder 95 gezeigten Nukleotidsequenzen, solange solche Deletionen oder Additionen die Amplifikation und/oder den Nachweis des gewünschten Ziel-Nukleinsäuremoleküls ermöglichen. Beispielsweise kann ein Primer einige Nukleotid-Deletionen oder -Additionen am 5'- oder 3'-Ende der in einer der SEQ ID NRN: 1-73, 94 oder 95 gezeigten Primer enthalten, wie z. B. Addition oder Deletion von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Nukleotiden vom 5'- oder 3'-Ende oder Kombinationen davon (wie eine Deletion an einem Ende und eine Addition am anderen Ende). In solchen Beispielen ändert sich die Anzahl der Nukleotide.
Es sind auch Primer vorgesehen, die an einer oder mehreren Positionen (wie 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr Positionen) degeneriert sind, z.B. ein Primer, der eine Mischung von Nukleotiden (wie 2, 3 oder 4 Nukleotide) an einer bestimmten Position im Primer enthält. In anderen Beispielen enthalten die hierin offenbarten Primer eine oder mehrere synthetische Basen oder alternative Basen (z.B. Inosin). In anderen Beispielen enthalten die hierin offenbarten Primer ein oder mehrere modifizierte Nukleotide oder Nukleinsäureanaloga, wie eine oder mehrere gesperrte Nukleinsäuren (siehe z.B. U.S. Pat. No. 6,794,499 ) oder eine oder mehrere Superbasen (Nanogen, Inc., Bothell, WA). In anderen Beispielen enthalten die hierin offenbarten Primer einen Minor-Groove-Binder, der an das 5'- oder 3'-Ende des Oligonukleotids konjugiert ist (siehe z. B. U.S. Pat. Nr. 6,486,308 ).
Die hierin offenbarten Nukleinsäure-Primer können in Form eines Kits oder eines Kits zur Verwendung bei dem Nachweis oder Amplifikation einer oder mehrerer SARS CoV-2-Nukleinsäuren geliefert werden. Daher bezieht sich die Erfindung in einem vierten Aspekt auf ein Diagnose-Kit zur Verwendung beim Nachweis einer Coronavirus-Nukleinsäure, umfassend einen oder mehrere der isolierten Nukleinsäure-Primer der Erfindung.
In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung des isolierten Nukleinsäureprimers des dritten Aspekts oder des Diagnosekits des zweiten Aspekts in einem Verfahren zum Nachweis von Coronavirus-Nukleinsäuren, vorzugsweise gemäß dem ersten oder dritten Aspekt.
In einem solchen Kit wird eine geeignete Menge eines oder mehrerer der Nukleinsäureprimer (wie einer oder mehrere der SEQ ID NRN: 1-73, 94 oder 95) in einem oder mehreren Behältern oder in einem oder mehreren einzelnen Wells oder Kanälen einer Multiwell-Platte oder -Karte oder einer mikrofluidischen Vorrichtung bereitgestellt. Der/die Nukleinsäureprimer kann/können z.B. suspendiert in einer wässrigen Lösung oder als gefriergetrocknetes oder lyophilisiertes Pulver bereitgestellt werden. Der/die Behälter, in dem/denen die Nukleinsäure(n) geliefert wird/werden, kann/können jeder herkömmliche Behälter sein, der die gelieferte Form aufnehmen kann, z.B. Mikrofugenröhrchen, Multiwell-Platten, Ampullen oder Flaschen. Die Kits können entweder markierte oder unmarkierte Nukleinsäure-Primer (z. B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 oder mehr Primer) zur Verwendung bei der Amplifikation und/oder Nachweis von SARS CoV-2-Nukleinsäuren enthalten. Eine oder mehrere Positiv- und/oder Negativkontrollen und interne Kontrollprimer und/oder Nukleinsäuren können ebenfalls im Kit enthalten sein. Beispielhafte Negativkontrollen umfassen Nicht-SARS-CoV-2-Nukleinsäuren (z.B. HCoV-OC43- oder HCoV-229E-Nukleinsäuren) oder nicht virale Nukleinsäuren (z.B. humane Nukleinsäuren). Exemplarische Positivkontrollen umfassen Primer und Nukleinsäuren für die Amplifikation von humanen Zielnukleinsäuren (wie humanes β-Actin oder RNaseP) oder Primer und Nukleinsäuren für andere SARS-CoV-2-Zielnukleinsäuren. Exemplarische interne Kontrollen umfassen Primer und Nukleinsäuren für die Amplifikation von nicht humanen infizierenden viralen Nukleinsäuren (wie z.B. das pflanzenpathogene Kartoffelvirus X, PVX). Ein Fachmann kann geeignete Positiv- und Negativkontrollen für die hier offenbarten Assays auswählen.
In einigen Beispielen werden ein oder mehrere Primer (z.B. ein oder mehrere Sets von Primern) in vorgemessenen Einwegmengen in einzelnen, typischerweise wegwerfbaren Röhrchen, Vertiefungen, mikrofluidischen Geräten oder gleichwertigen Behältern bereitgestellt. In diesem Beispiel kann die Probe, die auf das Vorhandensein der Zielnukleinsäuren getestet werden soll, in die einzelnen Röhrchen oder Wells gegeben werden und die Amplifikation und/oder Nachweis kann direkt durchgeführt werden. Das Kit kann auch zusätzliche Reagenzien für den Nachweis und/oder die Amplifikation von SARS CoV-2-Nukleinsäuren enthalten, z.B. Puffer, Nukleotide (z.B. dNTPs), Enzyme (z.B. DNA-Polymerase(n) und/oder reverse Transkriptase) oder andere geeignete Reagenzien. Die zusätzlichen Reagenzien können sich in einem von dem einen oder den mehreren Primern getrennten Behälter befinden oder im selben Behälter wie der/die Primer enthalten sein.
Es versteht sich, dass die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf ein spezifisches Problem oder eine spezifische Umgebung und die Einbeziehung von Variationen der vorliegenden Erfindung oder zusätzlicher Merkmale (wie z.B. weitere Aspekte und Ausführungsformen) im Rahmen der Möglichkeiten einer Person mit gewöhnlichen Kenntnissen auf dem Gebiet der Technik im Lichte der hierin enthaltenen Lehren liegen wird.
Sofern der Kontext nichts anderes vorschreibt, sind die Beschreibungen und Definitionen der oben dargestellten Merkmale nicht auf einen bestimmten Aspekt oder eine bestimmte Ausführungsform der Erfindung beschränkt und gelten gleichermaßen für alle beschriebenen Aspekte und Ausführungsformen.
Alle hierin zitierten Referenzen, Patente und Veröffentlichungen werden hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einbezogen.
Figurenliste
Die Figuren zeigen:

1: zeigt ein Schema eines Standard-RT-LAMP-Sonden-Sets (links) im Vergleich zu einem klassischen RT-PCR-Primer-Set.
2: zeigt einen Vergleich der Genomarchitektur des Coronavirus (nach Wu et al. 2020 Nature Vol 579).
3: zeigt das Mapping der annotierten LAMP-Primer der Erfindung im genomischen Bereich von ORF1a/b von SARS CoV-2.
4: zeigt das Mapping der annotierten LAMP-Primer der Erfindung im genomischen Bereich des N-Gens von SARS CoV-2.
5: zeigt die O1a/b-LAMP-Primer-Bindungsstellen der annotierten Primer in der genomischen ORF1a/b-Region von SARS CoV-2.
6: zeigt eine Übersicht der bevorzugten LAMP-Primer-Sets CLPS1 und CLPS2 der vorliegenden Erfindung, wie annotiert, im SARS-CoV-2 N-Gen.
7: zeigt die Primer-Bindungsstellen des CLPS1-Primer-Sets in der genomischen Region des N-Gens von SARS-CoV-2.
8: zeigt die Primer-Bindungsstellen des CLPS2-Primer-Sets in der genomischen Region des N-Gens von SARS CoV-2.
9: zeigt einen Time-to-Result-Vergleich zwischen den SARS-CoV-2-LAMP-Primer-Sets der vorliegenden Erfindung und zeigt bereits erzielte Optimierungen zwischen den LAMP-Primer-Sets der vorliegenden Erfindung.
10: zeigt einen Time-to-Result-Vergleich zwischen publizierten E- und N-Primer-Sets von NEB (https://doi.org/10.1101/2020.06.03.132894) und den erfindungsgemäßen SARS-CoV-2 LAMP-Primer-Sets der vorliegenden Erfindung.
11: zeigt Ct-Werte des SARS-CoV-2-Primertests mit der SARS-CoV2-Standardprobe RV340059 unter Verwendung von sechs verschiedenen Primer-Verdünnungen von unverdünnt bis 1:1.000.
12: zeigt die Tm-Werte des SARS-CoV-2-Primertests mit der SARS-CoV2-Standardprobe RV340059 unter Verwendung von sechs verschiedenen Primer-Verdünnungen von unverdünnt bis 1:1.000.
13: zeigt Ct-Werte des SARS-CoV-2-Primermix-Vergleichs unter Verwendung von sechs verschiedenen Primern in serieller Verdünnung von klinischen Proben in GPS. Die Verdünnungen reichen von 1:4 bis 1:512.
14: zeigt den Vergleich der Tm-Werte der SARS CoV-2 Primermixe unter Verwendung von sechs verschiedenen Primern in serieller Verdünnung von klinischen Proben in GPS. Die Verdünnungen reichen von 1:4 bis 1:512.
15: zeigt Ct-Werte der SARS CoV-2-Referenzproben 1 und 2 in seriellen Verdünnungen von unverdünnt bis 1:128 unter Verwendung der drei ausgewählten Primer-Sets CLPS1, CLPS3 und CLPS2 jeweils in einer Duplex-Reaktion mit der Kontrolle (ACTB).
16: zeigt Tm-Werte der SARS CoV-2-Referenzproben 1 und 2 in seriellen Verdünnungen von unverdünnt bis 1:128 unter Verwendung der drei ausgewählten Primer-Sets CLPS1, CLPS3 und CLPS2 jeweils in einer Duplex-Reaktion mit der Kontrolle (ACTB). Gefüllte Balken sind positiv für die Kontrolle (ACTB) und SARS CoV-2, wobei die grünen Balken zusätzlich über einen Lateral Flow Dipstick verifiziert wurden. Gestreifte Balken sind positiv für SARS CoV-2, zeigen aber keine Amplifikation von Aktin an. Nicht gefüllte Balken sind negativ für SARS CoV-2.
17: zeigt den Ct-Wert von SARS CoV-2 Triplex zur Bestimmung der Primerkonzentration mit CLPS1, CLPS2 und der Kontrolle (ACTB) sowie der Referenzprobe 1 in serieller Verdünnung von 1000 Kopien/ µL bis 31,25 Kopien/µL.
18: zeigt Ct-Wert des SARS CoV-2 Triplex-Duplex-Vergleichs, Referenzprobe 1 in serieller Verdünnung von 1000 Kopien/µL bis 31,25 Kopien/µL, Negativkontrolle: 2xStabilisierungspuffer.
19: zeigt Ct-Wert von SARS CoV-2, ACTB-Konzentration in Triplex, RV340080 und RV3400077 Verdünnungen, CLPS1 und CLPS2.
20: zeigt die Schmelzkurvenanalyse von SARS CoV-2 LAMP gemäß der vorliegenden Erfindung.

Die Sequenzen zeigen:

Tabelle 2: RT-LAMP Oligonukleotide der Erfindung

Bezeichnung:	Sequenz:	SARS-CoV2 genomische Ziel-Koordinaten:	SEQ ID NR:
SARS-CoV2-1.F3		28515-28534	1
SARS-CoV2-1.F2	TTCGTGGTGGTGACGG	28554-28569	2
SARS-CoV2-1.F1c	AGCTTCTGGCCCAGTTCC	28630-28613	3
SARS-CoV2-1.FIP		28630-28613; 28554-28569	4
Biotin- SARS-CoV2-1.FIP		Biotin-28630-28613; 28554-28569	5
JOE- SARS-CoV2-1.FIP		JOE-28630-28613; 28554-28569	6
SARS-CoV2-1.B1c	ATTGGCACCCGCAATCC	28709-28725	7
SARS-CoV2-1.B2	GAGGAAGTTGTAGCAC	28760-28745	8
SARS-CoV2-1.B3	CGAGAAGAGGCTTGACT	28827-28811	9
SARS-Cov2-1.BIP		28709-28725;28760-28745	10
DIG-SARS-Cov2-1.BIP		DIG-28709-28725; 28760-28745	11
SARS-CoV2-1.FL	CCATCTTGGACTGAG	28597-28583	12
FAM- SARS-CoV2-1.FL		FAM -28597-28583	13
SARS-CoV2-1.BL	TGCTAACAATGCTGC	28726-28740	14
SARS-CoV2-2.Bie	ATTGGCACCCGCAATCC	28709-28725	15
SARS-CoV2-2.B2		28790-28771	16
SARS-Cov2-2.BIP		28709-28725,28790-28771	17
SARS-CoV2-2.BL	GTGCTACAACTTCCTC	28745-28760	18
1.ORF1ab-F3		408-429	19
1.ORF1ab-F2	CTTGAACAGCCCTATGTG	455-472	20
1.ORF1ab-F1c		564-545	21
1.ORF1ab-FIP		564-545; 455-472	22
DIG-1.ORF1ab-FIP		DIG-564-545; 455-472	23
1.ORF1ab-B1c	CCTCATGTGGGCGAAA	589-605	24
1.ORF1ab-B2		701-679	25
1.ORF1ab-B3		795-775	26
1.ORF1ab-BIP		589-605; 701-679	27
1.ORF1ab-FL	TTCTGCTACCAGCTCAAC	538-521	28
FAM-1.ORF1ab-FL	TTCTGCTACCAGCTCAAC	FAM-538-521	29
1.ORF1ab-BL		617-636	30
New-N.F3	GAGCTACCAGACGAA	28539-28553	31
LF-F3		28573-28593	32
LF-F3.2	AGATCTCAGTCCAAG	28579-28593	33
LF-F2		28596-28617	34
New-F1c_compl.		28659-28638	35
Biotin-LF-FIP	Biotin-	Biotin-28659-28638; 28596-28617	36

FAM-LF-FL		FAM -28637-28621	37
New-N.B3	GCAATGTTGTTCCTT	28775-28761	38
New-N.B3.2	CTCTGCTCCCTTCTG	28805-28791	39
AE-F3	ACTACCTAGGAACTGG	28605-28620	40
AE-F2		28621-28642	41
AE-Fic		28683-28663	42
AE-F1C2		28691-28673	43
Biotin-AE-FIP1	Biotin-	Biotin-28683-28663; 28621-28642	44
Biotin-AE-FIP2	Biotin-	Biotin-28691-28673; 28621-28642	45
FAM-AE-FL		FAM-28660-28646	46
Aliyah-F3	GGACCCCAAAATCAG	28286-28300	47
Aliyah-F2		28301-28320	48
FAM-Aliyah-FL		FAM-28344-28328	49
Aliyah-Fic		28365-28346	50
Biotin-Aliyah-FIP	Biotin-	Biotin-28365-28346; 28301-28320	51
Aliyah-Bic		28377-28396	52
Aliyah-BL	CCCCAAGGTTTACCC	28397-28411	53
Aliyah-B2		28438-28419	54
Aliyah-BIP		28377-28396; 28438-28419	55
Aliyah-B3	CTTGCCATGTTGAGTG	28457-28441	56
O1a/b-NewF3	ACGTTCGGATGCTCG	481-495	57
Oia/b-NewF2		497-516	58
DIG-O1a/b-NewFIP		DIG-564-545; 497-516	59
O1a/b-NewB1c		596-615	60
Oia/b-NewB2_1408		660-640	61
O1ab-NewBIP_1408		596-615; 660-640	62
O1ab-NewB3_1408	GCGCCGTAACTATGG	678-664	63
SARS-CoV2-3.B1C		28651-28670	64
SARS-CoV2-3.BL	ACTGAGGGAGCCTTGA	28676-28691	65
SARS-CoV2-3.B2		28725-28706	66
SARS-CoV2-3.BIP		28651-28670; 28725-28706	67
SARS-CoV2-3.B3	AGCACGATTGCAGCAT	28749-28734	68
SARS-CoV-2-4.B1c		28674-28693	69
SARS-CoV2-4.BL / LF-BL	TCACATTGGCACCCG	28705-28719	70
SARS-COV-2-4.BIP / LF-B2	TGCAGCATTGTTAGCAGG	28743-28724	71
SARS-COV-2-4.BIP / LF-BIP		28674-28693; 28743-28724	72
LF-B3	GAGGAAGTTGTAGCAC	28760-28744	73
ACTB- F3	AGTACCCCATCGAGCACG	-	74
DIG-ACTB-FIP		-	75
FAM-ACTB-FL		-	76
ACTB- BL		-	77
ACTB- BIP		-	78
ACTB- B3		-	79
Aliyah-FL	GTTGAATCTGAGGGTCC	28344-28328	94
Aliyah-FIP		28365-28346; 28301-28320	95

SEQ ID NR: 80 in 5 ist ein Fragment der genomischen ORFlab Region von SARS-CoV2 (SEQ ID NR: 80):

SEQ ID NR: 81 zeigt die komplementäre Sequenz des Fragments der genomischen ORF1ab Region von SARS-CoV2 (SEQ ID NR: 81):
SEQ ID NR: 82 in 5 ist ein Fragment des ORF1a Polyproteins von SARS-CoV2 (SEQ ID NR: 82):
SEQ ID NR: 83 in 5 ist ein Fragment des ORF1a/b Polyproteins von SARS-CoV2 (SEQ ID NR: 83):
SEQ ID NR: 84 in 7 ist ein Fragment der genomischen N-Gen Region von SARS-CoV2 (SEQ ID NR: 84):
SEQ ID NR: 85 zeigt die komplementäre Sequenz der genomischen N-Gen Region von SARS-CoV2 (SEQ ID NR: 85):
SEQ ID NR: 86 in 7 ist eine T7-Promotersequenz (SEQ ID NR: 86):

TAATACGACTCACTATAGGG

SEQ ID NR: 87 in 7 ist eine T7-Promotersequenz (SEQ ID NR: 87):

ATTATGCTGAGTGATATCCC

SEQ ID NR: 88 in 7 ist ein Fragment des N-Proteins von SARS-CoV2 (SEQ ID NR: 88):

GPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDL

SEQ ID NR: 89 in 7 ist ein Fragment des Ni-Peptids von SARS-CoV-1 (SEQ ID NR: 89):

PSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQ

SEQ ID NR: 90 in 8 ist ein Fragment der genomischen N-Gen Region von SARS-CoV2 (SEQ ID NR: 90):
SEQ ID NR: 91 in 8 ist ein Fragment der genomischen N-Gen Region von SARS-CoV2 (SEQ ID NR: 91):
SEQ ID NR: 92 in 8 ist ein Fragment des N-Proteins von SARS-CoV2 (SEQ ID NR: 92):
SEQ ID NR: 93 in 8 ist ein Fragment des N2-Peptids von SARS-CoV1 (SEQ ID NR: 93):

EPIHQKITLAPAILLTMLQSCY

BEISPIELE
Bestimmte Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung werden nun beispielhaft und unter Bezugnahme auf die hierin enthaltene Beschreibung, Figuren und Tabellen dargestellt. Solche Beispiele sind für die Verfahren, Verwendungen und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung nur repräsentativ und sollten nicht als Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung auf nur solche repräsentativen Beispiele verstanden werden.
Die Beispiele zeigen:
Beispiel 1: Entwicklung von SARS CoV-2 LAMP-Primern
In der einschlägigen Fachliteratur und von den führenden Herstellern von RT-LAMP-Kits (NEB, Optigene®, Lucigene®) wird für das Design der Sonden das kostenlose webbasierte Programm „Primer Explorer“ (EIKEN Chemical Co., Ltd.) empfohlen. Der Anwender gibt zunächst gut konservierte Zielgenabschnitte in eine Online-Maske ein, die dann algorithmisch 3-5 Vorschläge für LAMP-Primer-Sets bestehend aus F3-, B3-, FIP- und BIP-Sonden vorschlägt. Wesentlich sind jedoch die sogenannten Schleifen-Primer (EN: Loop-Primer), die in dieser Anwendung nicht generiert werden (1: FL- und BL-Oligos). Es hat sich gezeigt, dass Schleifenprimer nicht nur die Spezifität der Reaktion erhöhen, sondern auch die Reaktionszeit (time-to-result / time-to-threshold, Ct/q-Wert) deutlich (bis zu 30 %) reduzieren. Allerdings müssen diese FL- / BL-Sonden in einem zweiten Schritt mit der unausgereiften, Endanwenderunfreundlichen App (u.a. mit mehreren Bugs / Programmfehlern) separat erzeugt werden.
Die Erfahrungen des Erfinders sowie zahlreiche Veröffentlichungen belegen jedoch eindeutig, dass frei verfügbare Programme wie der „Primer Explorer“ oder vergleichbare Softwareanwendungen (z.B. LAMP Designer) sehr fehlerhaft sind. Feine Details, die eine unbedingte Voraussetzung für eine erfolgreiche LAMP-Reaktion sind, wie der effiziente Ausschluss von Fehlpaarungen (EN: Mismatches), Primer-Dimeren und suboptimalen Haarnadelstrukturen (EN: Hairpins), werden von diesen Programmen nicht ausreichend berücksichtigt.
Nach intensiver Prüfung und Bewertung verschiedener LAMP-Sonden gegen verschiedene RNA-Viren (sowie das Coronavirus SARS-CoV-2), die mit Hilfe des oben genannten webbasierten Programms „Primer Explorer“ abgeleitet wurden, stellte sich heraus, dass diese stets eine inakzeptable Häufung von falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnissen verursachten. In einigen Fällen generierte das Programm sogar Primer, die keine Spezifität für die virale Zielsequenz aufwiesen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder daher hochspezifische Sonden (siehe Tabelle 2) für den schnellen und vor allem zuverlässigen Nachweis einer SARS CoV-2-Infektion mittels RT-LAMP entwickelt und deren Präzision in klinischen Analyselaboren bestätigt. Damit wurde erstmals der Grundstein für den nachhaltigen Einsatz dieses Verfahrens in der klinischen Diagnostik gelegt.
Die Entwicklung der hochspezifischen LAMP-Sonden gegen SARS-CoV-2 basierte auf folgendem Ansatz: Zunächst wurden durch eigene umfangreiche bioinformatische Vergleichsanalysen aller publizierten Genome hochkonservierte Bereiche der viralen Zielsequenz (bis 300 bp) identifiziert und diese in jeweils acht separate Basenabschnitte unterteilt. Diese 15 bis 25 langen oligomeren Regionen haben bestmögliche Abstände zueinander [F2-F3: 0-60 nt, F1c-B1c: 0-100 nt, F2-B2: 120-160 nt; F1c-F2 (Loops): 40-60 nt] und weisen eine Schmelztemperatur (Tm) zwischen 55°C und 68°C auf, mit einer maximalen Differenz von 5°C. Die Schmelztemperatur charakterisiert den Punkt, an dem 50% der Oligonukleotide an ihre Zielsequenz gebunden sind und 50% frei in Lösung liegen. Idealerweise sollte diese im Bereich der RT-LAMP-Reaktionstemperatur liegen (63°-68°C).
Um eine robuste Hybridisierung und damit eine fehlerfreie Amplifikation der Zielsequenz zu gewährleisten, wurden nur hohe, negative ΔG°-Werte in Bezug auf das terminale 5'- und insbesondere 3'-Ende der Nachweis-Oligonukleotide berücksichtigt (mindestens -4 kcal/mol, besser jedoch ≥ -5 kcal/mol). Die Primer haben außerdem einen GC-Gehalt zwischen 40-60% und sind nicht gegen repetitive Sequenzbereiche gerichtet, um Fehlamplifikationen zu vermeiden. Regionen, die potenziell Sekundärstrukturen bilden könnten, sowie Intra-Primer-Homologien (mehr als 3 Basen komplementär zueinander innerhalb des Oligonukleotids) oder Inter-Primer-Homologien (Sense- und Antisense-Primer haben komplementäre Segmente) wurden ebenfalls identifiziert und ausgeschlossen (bzw. mit modernsten Verfahren modifiziert). Für die abschließende Überprüfung der Spezifität der LAMP-Produkte mit der Lateral-Flow-Dipstick-Methode haben die Oligonukleotide noch folgende Markierungen: FL-Sonde: FAM-Markierung am 5'-Ende; FIP-Sonde: Biotin- oder Digoxigenin-Markierung am 5'-Ende; BIP-Sonde: JOE am 5'-Ende.
In der folgenden Tabelle 3 sind beispielhaft bevorzugte Primer-Sets und deren Bezeichnungen aufgeführt, die zur Bezeichnung der RT-LAMP-Primer-Sets in den folgenden Experimenten der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Tabelle 3 ist jedoch nicht als einschränkend zu verstehen, da einzelne unten aufgeführte Primer aus einem benannten Set auch mit anderen Primern aus anderen Sets kombiniert werden können, wenn diese geeignet sind.

Tabelle 3: Übersicht über die bevorzugten Primer-Sets CLPS1 bis 7 einschließlich des ACTB-Kontroll-Primer-Sets gemäß der vorliegenden Erfindung mit den jeweiligen Primern und ihren entsprechenden SEQ ID Nrn.

Primer-Set	Primer- Bezeichnung	SEQ ID NR
Kontrolle (ACTB)	ACTB- F3	74
	DIG-ACTB-FIP	75
	FAM-ACTB-FL	76
	ACTB- BL	77
	ACTB- BIP	78
	ACTB- B3	79
CLPS1	Aliyah-F3	47
	Aliyah-FIP	51
	Aliyah-FL	49
	Aliyah-BL	53
	Aliyah-BIP	55
	Aliyah-B3	56
CLPS2	SARS-CoV2-1.F3	1
	Biotin-SARS-CoV2-1.FIP	5
	FAM-SARS-CoV2-1.FL	13
	SARS-CoV2-3.BL	65
	SARS-CoV2-3.BIP	67
	SARS-CoV2-3.B3	68
CLPS3	LF-F3	32
	FAM-LF-FL	37
	Biotin-LF-FIP	36
	SARS-CoV2-1.BL/LF-BL	70
	SARS-CoV2-1.BIP/LF-BIP	72
	SARS-CoV2-4.B3/LF-B3	73
CLPS4	AE-F3	40
	Biotin-AE-FIP2	45
	FAM-AE-FL	46
	SARS-CoV2-1.BL	14
	SARS-CoV2-1.BIP	10
	New-NB3	38
CLPS5	O1a/b-NewF3	57
CLPS5	O1a/b-NewFIP	59
	FAM-1. ORF1ab-FL	29
	1. ORF1ab-BL	30
	O1a/b-NewBIP_1408	62
	O1a/b-NewB3_1408	63
CLPS6	SARS-COV2.1.-F3	1
	Biotin-SARS-CoV2.1.-FIP	5
	FAM-SARS-CoV2.1.-FL	13
	SARS-CoV2.1.-BL	14
	SARS-CoV2.1.-BIP	10
	SARS-CoV2.1.-B3	9
CLPS7	1.ORF1ab-F3	19
	1.ORF1ab -FIP	22
	1.ORF1ab -FL	28
	1.ORF1ab-BL	30
	1.ORF1ab-BIP	27
	1.ORF1ab-B3	26

Die hier beschriebenen RT-LAMP-Experimente wurden mit dem WarmStart® LAMP Kit (DNA & RNA) durchgeführt, das von New England Biolabs (NEB) erworben wurde. Alle notwendigen Reagenzien zur Durchführung des RT-LAMPs waren in diesem kommerziell erhältlichen Kit enthalten. Des Weiteren wurden die hier beschriebenen Experimente gemäß den bekannten Standardprotokollen für LAMP-Verfahren durchgeführt.
Beispiel 2: „Ringversuch“ der entwickelten LAMP-Primer
Die Validierung der entwickelten LAMP-Primer erfolgte anhand von Ringversuchen der Firma Instand e.V. (Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in medizinischen Laboratorien e.V.) mit dem Primer-Set CLPS6. INSTAND e.V. ist eine der drei von der Bundesärztekammer benannten Referenzinstitutionen und damit zuständig für die Organisation von Ringversuchen zur Qualitätskontrolle in medizinischen Laboratorien. Die untersuchten „Ringversuch“-Proben bestanden aus insgesamt sieben Proben mit unterschiedlicher Zusammensetzung (siehe Tabelle 4) und bilden den Standard für die Bewertung der Qualität eines neuen SARS-CoV-2-Nachweisverfahrens. Die Tests wurden an den Universitätskliniken Frankfurt und Münster durchgeführt und ergaben folgende Ergebnisse:

Tabelle 4: Assay-Verifizierung

Probe	Ergebnis
SARS CoV-2 (RV340059)	positive
HCoV-OC43 (RV 340060)	negative
SARS CoV-2 (RV 340061)	positive
Negativkontrolle (RV 340062)	negative
SARS CoV-2 (RV 340063)	positive
SARS CoV-2 (RV 340064)	positive
HCoV-229E (RV 340065)	negative

INSTAND e. V. ist eine interdisziplinäre, gemeinnützige, wissenschaftliche medizinische Fachgesellschaft mit über 300 Mitgliedern. Sie organisiert seit 1968 Ringversuche im Rahmen der externen Qualitätssicherung auf dem Gebiet der Hämatologie. Im Jahr 1970 wurde dieses Angebot auf nahezu alle Bereiche der Labordiagnostik ausgeweitet. Zu den angestrebten Zielen gehören:

• Optimale Patientenversorgung durch verbesserte Diagnostik, Therapieüberwachung, Nachsorge und Rehabilitation im Bereich der Medizin
• Früherkennung von Krankheiten durch Verbesserung der Qualität von Laboranalysen und deren Bewertung
• Förderung der Forschung zur Qualitätssicherung in der Laboratoriumsmedizin
• Fortbildung in allen Bereichen der medizinischen Labordiagnostik.

Weitere Informationen: https://www.instand-ev.de/en/news/archives.html; z. B. Vorbewertung von virologischen Ringversuchen März 2016 https://www.instand-ev.de/fileadmin/uploads/Aktuelles/Pre-evaluation_Virology_March_2016_20160503b_EN.pdf und https://www.instand-ev.de/fileadmin/uploads/user upload/Dokumente/Virologie/20200214 INSTAND announce ment EQAS novel coronavirus SARS-CoV-2.pdf
Beispiel 3: Optimierung der LAMP-Primer-Sets
Um eine weitere erfolgreiche Optimierung der erfindungsgemäßen LAMP-Primer zu demonstrieren, wurde in vitro transkribierte SARS-CoV-2-RNA 10-fach seriell verdünnt und als Template in RT-LAMP-Reaktionen mit dem 2xWarmStart Colorimetric von NEB, ergänzt mit Guanidinhydrochlorid, UTP und UDG, eingesetzt. Das endgültige Reaktionsvolumen betrug 10 µL, wovon 3 µL unterschiedliche Mengen an viraler RNA enthielten. 9 zeigt die Ergebnisse für die optimierten Primer-Sets CLPS3 und CLPS4 im Vergleich zu dem alten Primer-Mix CLPS6. Die Erfinder zeigen, dass die Optimierung der Primer-Sets CLPS3 und CLPS4 den Ct-Wert im Vergleich zum alten Primer-Mix CLPS6 signifikant reduziert (9).
Zusätzlich wurde SARS-CoV-2-Zellkulturüberstand (Ct13; freundlicherweise vom Universitätsklinikum Frankfurt zur Verfügung gestellt) zur RNA-Isolierung verwendet. Die extrahierte RNA wurde 10-fach seriell verdünnt und als Template in RT-LAMP-Reaktionen unter Verwendung von NEBs 2xWarmStart Colorimetric, ergänzt mit Guanidinhydrochlorid, UTP und UDG, verwendet. Das endgültige Reaktionsvolumen betrug 10 µL, wovon 3 µL unterschiedliche Mengen an viraler RNA enthielten. 10 zeigt die Ergebnisse für die publizierten E- und N-Primer-Sets von NEB (https://doi.org/10.1101/2020.06.03.132894) im Vergleich zu den optimierten neuen Primer-Sets CLPS4 und CLPS5 der vorliegenden Erfindung. Die Erfinder zeigen, dass die optimierten Primer-Sets CLPS4 und CLPS5 geringere Virus-Kopienzahlen in den Proben stabiler amplifizierten als die E- und N-Primer-Sets von NEB.
Beispiel 4: Nachweis der Leistungsfähigkeit der optimierten Primer-Sets
Leistungsnachweis ausgewählter optimierter Primer-Sets CLPS1, CLPS2, CLPS3, CLPS4 und CLPS5: Das vorherige Experiment wurde fortgesetzt, um die Leistung der Primer-Mixe mit verschiedenen RNA-Konzentrationen zu testen. Für dieses Experiment wurde die SARS-CoV2-Standardprobe RV340059 als Template verwendet. Das Ziel dieses Experiments war es, die beiden optimalen Primer-Sets für die Verwendung in der endgültigen Version des RT-LAMP-Assays gemäß der vorliegenden Erfindung zu bestimmen und zu bestätigen.
Es wurden sechs verschiedene Simplex-Reaktions- Primer-Mixe mit jeweils einem der sechs Primer-Sets CLPS1, CLPS2, CLPS3, CLPS4 und CLPS5 sowie dem ACTB-Primer-Set als Kontrolle hergestellt. Das Reaktionsvolumen betrug insgesamt 25 µL, wobei 5 µL als Template dienten. Ein Mastermix für 10 Proben für jedes der SARS CoV-2 Primer-Sets CLPS1, CLPS2, CLPS3, CLPS4 und CLPS5 und die Kontrolle (ACTB) wurde gemäß der folgenden Tabelle 5 hergestellt.

Tabelle 5: Master-Mix-Pipettierschema für Simplex-LAMP.

Bestandteil	Volumen
2x Master Mix mit UDG	12,5 µL
SARS-CoV-2 Primer-Mix	1,25 µL
(F3/B3 Stammlösung: 2 µM
FIP/BIP Stammlösung: 16 µM
FL/BL Stammlösung: 8 µM)
LAMP-Fluoreszenzfarbstoff (50x Konzentrat)	0,25 µL
GnCl (1M)	1 µL
MilliQ H2O	5 µL
Template	5 µL
Gesamtvolumen	25 µL

Die Ergebnisse dieses Primer-Tests sind in 11 und 12 dargestellt. 11 zeigt die jeweiligen Ct-Werte und 12 die jeweiligen Tm-Werte des SARS CoV-2-Primertests mit der SARS CoV2-Standardprobe RV340059 unter Verwendung von sechs verschiedenen Primer-Verdünnungen von unverdünnt bis 1:1000.
1Es wurde beobachtet, dass die unverdünnte SARS CoV2-Standardprobe RV340059 die Reaktion inhibiert, was auf die unterschiedliche Probenmatrix zurückzuführen ist, in der die SARS CoV-2-RNA bereitgestellt wurde. Diese Inhibition ist nicht mehr relevant, sobald die Probe 1:10 verdünnt wurde. Diese Verdünnung zeigt, dass die Primer-Sets CLPS3, CLPS2 und CLPS5 die Proben schneller amplifizierten als die Primer-Sets CLPS1 und CLPS4, da ihre Ct-Werte niedriger sind. Betrachtet man die Ergebnisse für das Verdünnungsverhältnis 1:100, so ist zu erkennen, dass die beiden Primer-Mixe CLPS2 und CLPS4 am besten abschneiden. Jeder der fünf SARS-CoV-2- Primer-Mixe war nur in der Lage, die Probe in einem der beiden Replikate zu amplifizieren. Beide Primer-Sets CLPS1 und CLPS4 erreichten den gewünschten Ct-Wert von 15 Minuten oder weniger. Da die Gesamtleistung der Primer-Mixe zu ähnlich war, wurden weitere Experimente durchgeführt, um sich auf ein endgültiges Primer-Set mit der besten Leistung für den RT-LAMP-Assay gemäß der vorliegenden Erfindung festzulegen.
Bestätigung der leistungsfähigsten Primer-Sets an Verdünnungen von SARS CoV-2-Überstand: Diese Ergebnisse und die für den finalen Assay ausgewählten Primer-Sets CLPS1 und CLPS2 sollten in einem weiteren Experiment bestätigt werden.
Das folgende Material wurde zur Verfügung gestellt:

- 1,5 mL-Gefäße
- 8 Well PCR Tube Stripes mit aufgesetzten flachen Kappen
- CLPS1 Primer-Mix
- CLPS4 Primer-Mix
- ACTB Primer-Mix (Kontrolle)
- CLPS3 Primer-Mix
- CLPS2 Primer-Mix
- LAMP-Fluoreszenzfarbstoff (50x-Konzentrat) (NEB)
- WarmStart Colorimetric LAMP 2x Master Mix mit UDG (NEB)
- Guanidinhydrochlorid (40 mM)
- SB-Puffer
- milliQ H2O

Es wurden sechs verschiedene Primer-Mixe für die Simplex-Reaktion hergestellt, die jeweils einen der sechs in Frage kommenden Primer enthielten. Das Reaktionsvolumen betrug insgesamt 10 µL, wobei 2 µL als Template dienten. Für jeden SARS CoV-2 Primer-Mix wurde ein Master-Mix für 20 Proben gemäß der folgenden Tabelle 6 hergestellt.

Tabelle 6: Master-Mix-Pipettierschema für Simplex-LAMP.

Bestandteil	Volumen
2x Master-Mix with UDG	5 µL
SARS-CoV-2 Primer-Mix (F3/B3 Stammlösung: 2 µM FIP/BIP Stammlösung: 16 µM FL/BL Stammlösung: 8 µM)	0,5 µL
LAMP-Fluoreszenzfarbstoff (50x Konzentrat)	0,1 µL
GnCl (1M)	0,4 µL
MilliQ H2O	2 µL
Template	2 µL
Gesamtvolume	10 µL

Anschließend wurden die Master-Mixe in 8-Well PCR-Gefäßstreifen mit aufgesetzten Flachkappen mit einem Volumen von 8 µL Master-Mix für jede Reaktion aliquotiert.
In den Experimenten wurden acht verschiedene Verdünnungen verwendet, die jeweils in Duplikaten getestet wurden. Eine serielle Verdünnung wurde in einem 8-Well PCR-Gefäßstreifen mit aufgesetzten Flachkappen hergestellt. Dazu wurden 25 µL klinischer Proben, die vom Universitätsklinikum Frankfurt am Main (UKF) zur Verfügung gestellt wurden, in die erste Vertiefung pipettiert und mit 75 µL GPS gemischt. Zur Herstellung der Verdünnungsmatrix wurden 900 µL Gurgelprobe (G) mit 100 µL 10x Stabilisierungspuffer (GPS) gemischt. Für die im Experiment verwendeten Verdünnungen wurde GPS in einem unterschiedlichen Verhältnis mit klinischen Proben gemäß Tabelle 7 aufgestockt.
Die folgende Tabelle 7 zeigt das Pipettierschema für die Verdünnungen.

Verdünnung Klinische Proben GPS

1:5 10 µL 40 µL

1:10 5 µL 45 µL

1:20 2,5 µL 47,5 µL

Negativkontrolle (NC) - 50 µL
50 µL dieser 1:4-Verdünnung wurden dann in die zweite Vertiefung pipettiert und mit 50 µL GPS gemischt. Dies wurde für den gesamten Streifen wiederholt, so dass acht verschiedene Verdünnungen im Bereich von 1:4 bis 1:512 entstanden. Die Proben wurden dann für 10 Minuten bei 95°C inaktiviert. Nach der Inaktivierung und Abkühlung wurden die Proben in einem anderen Laborbereich direkt in den Master-Mix gegeben, vortexed und abgeschleudert. Die Proben wurden dann in den Analytik Jena qTower 2.2 gegeben und gemäß Tabelle 8 abgearbeitet.
Tabelle 8: Isothermes Amplifikationsprogramm.

Schritt Temperatur Dauer Wiederholung

Inkubation 25°C 5 min -

Inkubation 65°C 1 min 45x

Schmelzkurve 75°C-95°C - -
Die Ergebnisse des Tests der leistungsfähigsten Primer-Sets auf SARS CoV-2 Überstandverdünnungen sind in 13 und 14 dargestellt. 13 zeigt die Ct-Werte und 14 Tm-Werte des SARS CoV-2 Primer-Mix-Vergleichs unter Verwendung von sechs verschiedenen Primern in serieller Verdünnung von klinischen Proben in GPS. Die Verdünnungen reichen von 1:4 bis 1:512.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass von den fünf getesteten SARS CoV-2 Primer-Sets die Primer-Sets CLPS1, CLPS3 und CLPS2 wie oben beschrieben am besten abschnitten. Daher wurden die Primer-Sets CLPS4 und CLPS5 für das endgültige Assay-Protokoll nicht mehr berücksichtigt. Da die Primer-Mixe CLPS3 und CLPS2 in ihrer Leistung zu ähnlich sind, wurden beide Primer-Sets in den folgenden Experimenten verwendet. Da der CLPS1-Primermix der einzige Primermix ist, der die Probe bei einem Verdünnungsverhältnis von 1:512 detektierte, ist die hohe Sensitivität ein entscheidendes Argument für die Auswahl des CLPS1-Primermixes als eines der finalen Primer-Sets für den RT-LAMP-Assay gemäß der vorliegenden Erfindung. Darüber hinaus zeichnet sich das CLPS1-Primer-Set insbesondere bei klinischen Proben als zuverlässig aus.
Verifizierung der ausgewählten, am besten funktionierenden Primer-Sets an seriellen Verdünnungen von Referenzproben: Für dieses Experiment wurden die drei verschiedenen Primer-Sets CLPS1, CLPS3 und CLPS2 mit der gezeigten besten Performance verwendet. Die Experimente wurden jeweils in einer Duplexreaktion mit ATCB-Primermix durchgeführt. Das Reaktionsvolumen für jede Probe betrug insgesamt 25 µL, wobei 5 µL als Template dienten. Für jeden SARS CoV-2 Primermix wurde ein Mastermix für 38 Proben gemäß der folgenden Tabelle 9 hergestellt.

Tabelle 9: Master-Mix-Pipettierschema für Duplex-LAMP.

Bestandteil	Volumen
2x Master-Mix mit UDG	12,5 µL.
SARS-CoV-2 Primer-Mix	1,25 µL.
ACTB Primer-Mix	0,5 µL.
LAMP Fluoreszenzfarbstoff	0,25 µL.
GnCl (1M)	1 µL
MilliQ H2O	4,5 µL.
Template	5 µL.
Gesamtvolumen	25 µL.

Die Mastermixe wurden in 8-Well-PCR-Gefäßstreifen mit aufgesetzten Flachkappen mit einem Volumen von 20 µL Mastermix für jede Reaktion aliquotiert.
Serielle Verdünnungen der Referenzproben 1 und 2 wurden in je einem 8-Well-Streifen hergestellt. Von jeder Verdünnung wurden 100 µL angesetzt. Es wurde mit 100 µL der unverdünnten Probe in der ersten Vertiefung begonnen. In der zweiten Vertiefung wurden 100 uL der unverdünnten Probe zu 100 µL GPS hinzugefügt, was ein Verdünnungsverhältnis von 1:2 ergab, wobei das GPS aus einem Verhältnis von 1:10 der mit Stabilisierungspuffer versetzten Gurgellösung (G) bestand. Anschließend wurden 100 µL der 1:2 Verdünnungen zu 100 µL GPS in der dritten Vertiefung hinzugefügt, was ein Verdünnungsverhältnis von 1:4 ergab. Dieser Vorgang wurde für den gesamten Streifen wiederholt. Dadurch ergaben sich acht verschiedene Verdünnungen für jede Referenzprobe. Tabelle 10 zeigt die jeweiligen seriellen Verdünnungen. Jede Verdünnung wurde in Duplikaten getestet.
Tabelle 10: Serielle Verdünnung der Referenzprobe

unverdünnt 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
Anschließend wurden die Proben bei 95°C für 10 Minuten inaktiviert. Nach der Inaktivierung und Abkühlung wurden die Proben in einem anderen Laborbereich direkt in den Master-Mix gegeben, vortexed und geschleudert. Anschließend wurden die Proben in den Analytik Jena qTower 2.2 gegeben und gemäß Tabelle 11 abgearbeitet.
Tabelle 11: Isothermes Amplifikationsprogramm

Schritt Temperatur Dauer Wiederholung

Inkubation 25°C 5 min -

Inkubation 65°C 1 min 30x

Schmelz kurve 80°C-96°C - -
Nach Abschluss der Amplifikation wurden an einigen Proben eine Lateral Flow Dipsticks zur weiteren Analyse durchgeführt. Getestet wurde je ein 1:4-Duplikat pro Referenzprobe und Primermix sowie eine der 1:2-Verdünnungen der Referenzprobe für die Primer-Sets CLPS2 und CLPS3.
15 und 16 zeigen die Ergebnisse des Experiments. 15 zeigt die Ct-Werte und 16 die Tm-Werte der SARS CoV-2-Referenzproben 1 und 2 in seriellen Verdünnungen von unverdünnt bis 1:128 unter Verwendung der drei ausgewählten Primer-Sets CLPS1, CLPS3 und CLPS2 jeweils in einer Duplexreaktion mit Kontrolle (ACTB).
Alle Primermixe detektierten zuverlässig die Referenzprobe 1 (10.000.000 Kopien/ml), lediglich die unverdünnte Probe war zu stark, so dass Aktin nicht amplifiziert werden konnte. Dies könnte auch daran liegen, dass die Matrix der unverdünnten Probe die LAMP-Reaktion hemmt, wie man anhand der höheren Ct-Werte der unverdünnten Proben im Vergleich zu den verdünnten Proben vermuten kann.
Das gleiche Problem trat auch bei den unverdünnten Proben der Referenzprobe 2 (1.000.000 Kopien/ml) auf. Eines von zwei Replikaten für CLPS1 und CLPS2 amplifizierte überhaupt nicht, was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass die Probenmatrix die LAMP-Reaktion stört. Der CLPS1-Primermix erkannte die Referenzprobe 2 in beiden Replikaten bis zu einem Verdünnungsverhältnis von 1:16 zuverlässig. Bei Verdünnungen von 1:32 bis 1:128 konnte die SARS CoV-2 RNA in je einem der beiden Replikate nachgewiesen werden. Der CLPS3-Primermix konnte Referenzprobe 2 bis zu einem Verdünnungsverhältnis von 1:32 zuverlässig nachweisen. Von den drei SARS-CoV-2 Primermixen schnitt CLPS2 am besten ab. Der CLPS2-Primermix zeigte die gleichen Probleme wie die unverdünnte Referenzprobe 2 und konnte die Probe in allen Verdünnungen zuverlässig nachweisen, wobei beide Replikate positiv für SARS CoV-2 und Aktin waren.
Dieses Experiment ist das erste Argument für die Wahl des Primer-Sets CLPS2 gegenüber CLPS3 für den endgültigen RT-LAMP-Assay gemäß der vorliegenden Erfindung, da beide auf eine ähnliche Region desselben Gens abzielen. Der andere Primer, der für das endgültige Assay-Protokoll in Betracht gezogen wird, wäre CLPS1, da er in einer Reihe von Experimenten, wie oben beschrieben, zuverlässige Leistung gezeigt hat und seine Zielregion sich weder mit dem Primer-Set CLPS2 noch mit CLPS3 überschneidet.
Beispiel 5: Triplex-LAMP-Experimente
Bestimmung der zu verwendenden Primerkonzentration: Vier verschiedene PrimerKonzentrationen für die SARS-CoV-2-spezifischen Primer-Sets wurden in Triplex mit Kontrolle (ACTB) getestet (konstante Konzentration ACTB-Primer mit 0,5 µL). Die Ergebnisse sind in 17 und Tabelle 12 dargestellt. Tabelle 12 zeigt die Ct-Werte der verdünnten Referenzprobe 1 von 1000 Kopien/µL bis 31,25 Kopien/µL.
Tabelle 12: zeigt Ct-Werte entsprechend der Verdünnungsreihe der Referenzprobe 1
Alle Proben waren positiv für SARS-CoV-2, aber es wurden erkennbare Unterschiede und ein Trend bei den Ct-Werten festgestellt. Erfreulicherweise waren die gemessenen Ct-Werte bei niedrigeren Konzentrationen der Primer höher als gewünscht.
Vergleich von Triplex-LAMP und Duplex-LAMP: In einem weiteren Experiment wurde Triplex-LAMP mit Duplex-LAMP verglichen. Dazu wurden drei verschiedene PrimerKonzentrationen für die SARS-CoV-2 spezifischen Primer in Triplex mit Kontrolle (ACTB) (konstante Konzentration ACTB-Primer mit 0,5 µL) mit den Duplex-Reaktionen CLPS2/ Kontrolle (ACTB) und CLPS1/ Kontrolle (ACTB) verglichen. 17 und Tabelle 13 zeigen die Ergebnisse. Tabelle 13 zeigt die Ct-Werte von Triplex-LAMP und Duplex-LAMP der verdünnten Referenzprobe 1 von 1000 Kopien/µL bis 31,25 Kopien/µL.
Tabelle 13: zeigt die Ct-Werte von Triplex-LAMP und Duplex-LAMP in Abhängigkeit von der Verdünnungsreihe der Referenzprobe 1
Die Ct-Werte des Duplex-LAMPs sind vergleichbar mit den Ct-Werten des Triplex-LAMPs. SARS CoV-2 wurde in allen Proben nachgewiesen.
Bestimmung der Primerkonzentration der besten Kontrolle (ACTB): Ein weiteres Experiment wurde durchgeführt, um die beste Kontroll (ACTB)-Primerkonzentration im Triplex zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 19 dargestellt.
Es wurden drei verschiedene Primerkonzentrationen für die Kontrolle (ACTB) getestet (F3/B3 Stammlösung: 2 µM; FIP/BIP Stammlösung: 16 µL; FL/BL-Stammlösung: 8 µM/0,5 µL, 0,4 µL, 0,3 µL).
Wie in 19 gezeigt, sind die Ct-Werte für eine Kontrollkonzentration (ACTB) von 0,5 µL am niedrigsten. Sie ist daher die bevorzugte Konzentration für die Triplex-Reaktion, wobei die F3/B3-Primerlösung eine Konzentration von 100 nM, die FIP/BIP-Primerlösung eine Konzentration von 800 nM und die FL/BL-Primerlösung eine Konzentration von 400 nM für 0,5µL in 10µL (final) aufweist.
Beispiel 6: Analyse von SARS CoV-2 infizierten Patientenproben
Die Spezifität und Sensitivität der erfindungsgemäßen Primer-Sets wurde unter klinischen Bedingungen nachgewiesen. Klinische Proben von humanen SARS CoV-2 infizierten Patienten wurden vom Universitätsklinikum Münster (UKM) und dem Universitätsklinikum Frankfurt am Main (UKF) zur Verfügung gestellt.
Daher wurde SARS CoV-2 zunächst in Rachenabstrichproben bestimmt, die von mit SARS CoV-2 infizierten menschlichen Patienten stammten: Der SARS CoV-2 RT-LAMP gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde an gereinigter RNA aus Patientenproben durchgeführt. Die Proben stammten alle von Rachenabstrichen von menschlichen Patienten, die mit SARS CoV-2 infiziert waren. Anschließend wurden 3 µL gereinigte RNA jeder Probe in 7 µL Master Mix in Duplikaten zugegeben. WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA), 225 mM Betain; UTP/UDG Primer Set CLPS6.
Anschließend wurde das Reaktionsgemisch für 5 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Temperatur wurde auf 65°C erhöht und das Reaktionsgemisch für 45 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Ct-Werte bestimmt. In der folgenden Tabelle 14 sind die Ergebnisse der Analyse von SARS CoV-2 infizierten menschlichen Patientenproben dargestellt.

Tabelle 14: zeigt die Ergebnisse von RT-LAMP zur Bestimmung von SARS CoV-2 in klinischen Proben unter Verwendung der erfindungsgemäßen Primer-Sets

Sample	Mean C_t value [min]	C_t value [min]	Results LAMP
Probe 1	16	15,18	positiv
Probe 1	16	14,05	positiv
Probe 2	23,5	19,46	positiv
Probe 2	23,5	18,89	positiv
Probe 3	27	20,05	positiv
Probe 3	27	21,48	positiv
Probe 4	28	20,83	positiv
Probe 4	28	18,46	positiv
Probe 5	37	33,06	positiv
Probe 5	37	Kein C_t	negativ
Probe 6	Kein C_t	Kein C_t	negativ
Probe 6	Kein C_t	Kein C_t	negativ

In einem weiteren Experiment wurde SARS CoV-2 in Gurgelproben (G) mit Rachenabstrichproben (T) verglichen, die von menschlichen Patienten stammten, die mit SARS CoV-2 infiziert waren: Analyse von SARS CoV-2-infizierten Patientenproben: SARS CoV-2 RT-LAMP wurde an ungereinigten Patientenproben aus Gurgeln (G) und Rachenabstrichen (T) durchgeführt; zunächst wurden die Proben für 2 Minuten bei 95°C hitzeinaktiviert. Anschließend wurden 3 µL jeder Probe in 7 µL Master-Mix (WarmStart® LAMP Kit (DNA & RNA)) mit 200 mM Betain; dUTP/UDG; und Primer-Set CLPS6 pipettiert. Anschließend wurden die Reaktionsgemische für 5 Minuten bei 25°C und anschließend für 45 Minuten bei 65°C inkubiert.
Anschließend wurden die Ct-Werte bestimmt. In der folgenden Tabelle 15 sind die Ergebnisse des Vergleichs von SARS CoV-2 in Gurgelproben (G) mit Rachenabstrichproben (T) von menschlichen Patienten, die mit SARS CoV-2 infiziert waren, dargestellt.

Tabelle 15: Ct-Werte von SARS CoV-2-infizierten Patientenproben

Probe*		C_tWert [min]	Ergebnisse LAMP
Probe 7	G: C_t 38,76	Kein C_t	negativ
Probe 7	T: Ct 39,39	Kein C_t	negativ
Probe 8	G: C_t 31,80	21,47	positiv
Probe 8	T: C_t 32,15	Kein C_t	negativ
Probe 9	G: C_t 39,71	Kein C_t	negativ
Probe 9	T: C_t 39,72	Kein C_t	negativ
Probe 10	G: No C_t	Kein C_t	negativ
Probe 10	T: No C_t	Kein C_t	negativ
Probe 11	G: C_t 24,32	17,74	positiv
Probe 11	T: C_t 24,45	21,54	positiv

*Referenz Ct-Werte zu gereinigter RNA aus Gurgelwasser (G) und Rachenabstrich (T), Standard RT-PCR.

Beispiel 7: Leistungsnachweis ausgewählter Primer-Sets an Ringtestproben und Zellkulturüberstand klinischer Proben
Alle Experimente wurden mit dem aktuellen Assay an ungereinigten Proben durchgeführt, die im Verhältnis 1:4 in Gurgelprobenmatrix (G) mit Stabilisierungspuffer verdünnt wurden.
Zunächst wurde die Spezifität getestet. Tabelle 16 zeigt die Ergebnisse des LAMP-Assays unter Verwendung der ausgewählten Primer-Sets CLPS1 und CLPS2.

Tabelle 16: Ct-Werte der Ringversuchsprobe unter Verwendung der ausgewählten Primer-Sets CLPS1 und CLPS2.

Ringversuchsprobe		Konzentration Verdünnung	CLPS1	CLPS2
MRC-5 Zellen	RV340070	1:6	Kein C_t	Kein C_t
MERS CoV	RV340067	1:1.000	Kein C_t	Kein C_t
HCoV 229E	RV340068	1:1.000	Kein C_t	Kein C_t
HCoV NL63	RV340072	1:1.000	Kein C_t	Kein C_t
HCoV OC43	RV340074	1:1.000	Kein C_t	Kein C_t

Erfreulicherweise wurde keine Kreuzreaktivität mit anderen Coronaviren aus Ringtests in allen Replikaten angezeigt.
Für die Fortsetzung der Experimente zum Nachweis der Leistungsfähigkeit der ausgewählten Primer-Sets wurden weitere Ringtestproben ausgewählt.
Dazu wurden die ungereinigten Proben im Verhältnis 1:4 in Gurgellösung (G) mit SB-Puffer (GPS) verdünnt. Folgende Schritte wurden durchgeführt: Hitzeinaktivierung der Proben für 10 Minuten bei 95°C. Anschließend wurden 5 µL Probe in 20 µL Master Mix pipettiert. Es wurde das WarmStart® Colorimetric LAMP Kit mit UDG verwendet. Es wurde 40 mM Guanidinhydrochlorid zugegeben. SARS CoV-2 Primermix CLPS1 und CLPS2 wurden zusammen mit der Kontrolle (ACTB) zugegeben. Die Reaktionsgemische wurden für 5 Minuten bei 25 °C und anschließend für 25 Minuten bei 65 °C inkubiert. Tabelle 17 zeigt die Ergebnisse des LAMP-Assays unter Verwendung der ausgewählten Primer-Sets CLPS1 und CLPS2.

Tabelle 17: Ct-Werte der Ringversuchsproben unter Verwendung der ausgewählten Primer-Sets CLPS1 und CLPS2.

Verdünnungsreihe Referenzprobe 1
Kopien/ µL	CLPS1	CLPS2
1,000	8,8	8,2
1,000	9,0	8,6
100	10,4	9,6
100	9,6	9,4
10	9,4	10,3
10	10,4	9,6
1	10,6	10,5
1	9,8	9,9
0,1	10,2	kein C_t
0,1	10,6	9,7
0,01	kein C_t	kein C_t
0,01	kein C_t	kein C_t
0,001	kein C_t	kein C_t
0,001	kein C_t	kein C_t

SARS CoV-2 wurde in der jeweiligen verdünnten Referenzprobe 1 zuverlässig nachgewiesen.

Tabelle 19: zeigt die Ct-Werte von verdünnten SARS CoV-2 Zellkulturüberständen klinischer Proben unter Verwendung ausgewählter Primer-Sets CLPS1 und CLPS2.

Verdünnungsreihe SARS CoV-2 Zellkulturüberstand
Verdünnung	CLPS1	CLPS2
1:4	9,9	9,6
1:4	9,2	9,4
1:8	9,1	9,7
	9,7	8,9
1:16	9,3	10,4
1:16	10,1	9,2
1:32	9,1	10,1
1:32	10,7	9,1
1:64	9,3	9,9
1:64	10,6	9,8
1:128	13,0	13,3
1:128	Kein C_t	Kein C_t
1:256	Kein C_t	13,6
1:256	15,2	Kein C_t
1:512	15,7	Kein C_t
1:512	Kein C_t	Kein C_t

Erfreulicherweise konnten die Erfinder mit diesem Experiment zeigen, dass die bevorzugten Primer-Sets (CLPS1 und CLPS2) der vorliegenden Erfindung SARS CoV-2 in Zellkulturüberständen der Instand-Referenzprobe und der klinischen Proben zuverlässig und mit hoher Sensitivität nachweisen. Weiterhin wurde gezeigt, dass SARS CoV-2 in der Referenzprobe bis zu 1 Kopie/µL nachweisbar ist. Es ist anzumerken, dass das Primer-Set CLPS1 für Zellkulturüberstände aus klinischen Proben teilweise sensitiver ist.
Beispiel 8: Schmelzkurvenanalyse
Es wurde eine Schmelzkurvenanalyse von SARS CoV-2 LAMP durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 20 dargestellt. Dazu wurde Zellkulturüberstand aus klinischen Proben nahe der Nachweisgrenze (LOD) in stabilisierter Gurgelprobe (GPS) bereitgestellt und die folgenden Schritte durchgeführt

• Hitzeinaktivierung der Proben 10 Minuten bei 95°C
• 5 µL Probe wurden in 20 µL Master Mix pipettiert
• WarmStart® Colorimetric LAMP Kit mit UDG wurden für die Durchführung des Verfahrens verwendet
• 40 mM Guanidinhydrochlorid wurde in die Reaktionsmischung gegeben
• Ausgewählter Primermix CLPS2 wurde zusammen mit der Kontrolle (ACTB) in verschiedenen Konzentrationen gemischt: 0,6X, 0,4X und 0,2X
• Die Reaktionsmischungen wurden bei 25°C für 5 Minuten und anschließend bei 65°C für weitere 25 Minuten inkubiert

20 zeigt die Ergebnisse der Schmelzkurvenanalyse; Mit einem Prozentsatz von 40% der Kontrolle (ACTB) wurden wiederholt optimale Ergebnisse für die stabile Aktin-Amplifikation gezeigt und darüber hinaus wurde SARS CoV-2 in schwachen Proben nachgewiesen.
Beispiel 9: Nachweis der Stabilität der mit Stabilisierungspuffer stabilisierten Probe
In einem letzten Experiment wurde die Probenstabilität untersucht, wenn die Proben in Stabilisierungspuffer (SB) gelagert werden. Dazu wurden die folgenden Schritte durchgeführt:

• Instand Ringversuchsprobe (SARS CoV2 Standardprobe RV340059) Verdünnungsreihe wurde mit/ und ohne SB erstellt
• Hitzeinaktivierung der Proben für 10 Minuten bei 95°C nach 0,1h und 2 h
• 5 µL Probe wurden in 20 µL Master Mix pipettiert
• WarmStart® Colorimetric LAMP Kit mit UDG wurden für die Durchführung des Verfahren verwendet
• 40 mM Guanidinhydrochlorid wurde in jede Probe gegeben
• Ausgewähltes Primer-Set CLPS2 wurde zusammen mit der Kontrolle (ACTB) gemischt
• Die Reaktionsgemische wurden für 5 Minuten bei 25°C und anschließend für weitere 25 Minuten bei 65°C inkubiert

Tabelle 20: zeigt die Ct-Werte der Proben mit und ohne SB, gemessen zu verschiedenen Zeitpunkten.

Puffer	Verdünnung	Zeitpunkt nach Probenpräparation
Puffer	Verdünnung	0 h		1 h		2 h
Ohne SB	1:10	10,0	9,9	10,3	9,3	Kein C_t	Kein C_t
Ohne SB	1:100	Kein C_t	Kein C_t	Kein C_t	Kein C_t	Kein C_t	Kein C_t
	1:1,000	Kein C_t	Kein C_t	Kein C_t	Kein C_t	Kein C_t	Kein C_t
Mit SB	1:10	7,9	7,9	7,7	7,9	7,6	8,0
	1:100	8,7	9,0	9,6	8,4	9,5	8,8
	1:1,000	9,3	Kein C_t	Kein C_t	8,8	9,2	Kein C_t

Im Hinblick auf die Ergebnisse wurde gezeigt, dass der SB-Puffer die Proben während der Inaktivierung und nach der Inaktivierung stabilisiert. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse einer ersten Zeitverlaufsstudie zur Probenintegrität darauf hin, dass SB auch die RNA-Qualität (und damit deren Stabilität) von inaktivierten Proben bei RT und bei einer Temperatur von 4°C für mindestens 3 Tage erhöht (Referenzprobe 1.000 Kopien/µL).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Ein diagnostisches Assay-Kit zum Nachweis einer Nukleinsäure des Schweren Akuten Respiratorischen Syndroms-Corona-Virus 2 (SARS-Cov2) in einer Probe, wobei das diagnostische Assay-Kit ein erstes Corona-LAMP-Primer-Set umfasst, wobei das erste Corona-LAMP-Primer-Set die folgenden Nukleinsäure-Primermoleküle umfasst: a) einen Nukleinsäure-F3-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID Nr.: 47 (GGACCCCAAAATCAG) gezeigt ist, oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID Nr.: 47 (GGACCCCAAAATCAG) gezeigten Sequenz ist; und b) einen Nukleinsäure-FL-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 94 (GTTGAATCTGAGGGTCC) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 94 (GTTGAATCTGAGGGTCC) gezeigten Sequenz ist; und c) einen Nukleinsäure-FIP-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 95 (TCTCCATTCTGGTTACTGCCCGAAATGCACCCCGCATTAC) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 95 (TCTCCATTCTGGTTACTGCCCGAAATGCACCCCGCATTAC) gezeigten Sequenz ist; und d) einen Nukleinsäure-B3-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 56 (CTTGCCATGTTGAGTG) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 56 (CTTGCCATGTTGAGTG) gezeigten Sequenz ist; und e) einen Nukleinsäure-BL-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 53 (CCCCAAGGTTTACCC) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 53 (CCCCAAGGTTTACCC) gezeigten Sequenz ist; und f) einen Nukleinsäure-BIP-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 55 (CGCGATCAAAACAACGTCGGAGCGGTGAACCAAGACGCAG) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 55 (CGCGATCAAAACAACGTCGGAGCGGTGAACCAAGACGCAG) gezeigten Sequenz ist.
Ein diagnostisches Assay-Kit zum Nachweis einer Nukleinsäure des Schweren Akuten Respiratorischen Syndroms-Corona-Virus 2 (SARS-Cov2) in einer Probe, wobei das diagnostische Assay-Kit mindestens ein zweites Corona-LAMP-Primer-Set umfasst, wobei das zweite Corona-LAMP-Primer-Set die folgenden Nukleinsäure-Primermoleküle umfasst: a) einen Nukleinsäure-F3-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 1 (ATGACCAAATTGGCTACTAC) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 1 (ATGACCAAATTGGCTACTAC) gezeigten Sequenz ist; und b) einen Nukleinsäure-FL-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 12 (CCATCTTGGACTGAG) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 12 (CCATCTTGGACTGAG) gezeigten Sequenz ist; und c) einen Nukleinsäure-FIP-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 4 (AGCTTCTGGCCCAGTTCCTTCGTGGTGGTGACGG) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 4 (AGCTTCTGGCCCAGTTCCTTCGTGGTGGTGACGG) gezeigten Sequenz ist; und d) einen Nukleinsäure-B3-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 68 (AGCACGATTGCAGCAT) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 68 (AGCACGATTGCAGCAT) gezeigten Sequenz ist; und e) einen Nukleinsäure-BL-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 65 (ACTGAGGGAGCCTTGA) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 65 (ACTGAGGGAGCCTTGA) gezeigten Sequenz ist; und (i) einen Nukleinsäure-BIP-LAMP-Primer, der (i) eine Sequenz umfasst, oder im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 67 (CAAAGACGGCATCATATGGGGGATTGCGGGTGCCAATGTG) gezeigt ist oder einer Sequenz mit nicht mehr als 5 oder nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 1 Nukleotid-Veränderung davon, ausgewählt aus Addition(en), Deletion(en) und Substitution(en), oder (ii) unter stringenten Bedingungen an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu der in SEQ ID NO: 67 (CAAAGACGGCATCATATGGGGGATTGCGGGTGCCAATGTG) gezeigten Sequenz ist.
Das diagnostische Assay-Kit nach Anspruch 1 oder 2, umfassend sowohl das erste Corona-LAMP-Primer-Set nach Anspruch 1 als auch das zweite Corona-LAMP-Primer-Set nach Anspruch 2.
Das diagnostische Assay-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der F3-LAMP-Primer, der FL-LAMP-Primer, der B3-LAMP-Primer und/oder der BL-LAMP-Primer jeweils eine Länge von 5 bis 30 Nukleotiden (nt), vorzugsweise von 8 bis 25 nt, aufweist oder daraus besteht.
Das diagnostische Assay-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der FIP-LAMP-Primer und/oder der BIP-LAMP-Primer jeweils eine Länge von 10 bis 50 Nukleotiden (nt), vorzugsweise von 15 bis 40 nt, aufweist oder daraus besteht.
Das diagnostische Assay-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei mindestens ein Primer im Set, vorzugsweise mehr als ein Primer im Set, eine nachweisbare Markierung umfasst, wie eine nachweisbare Markierung, die aus Biotin, FAM oder DIG ausgewählt ist.
Das diagnostische Assay-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die LAMP eine Reverse-Transkriptions-LAMP (RT-LAMP) ist.
Das diagnostische Assay-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend eine oder mehrere Pufferlösungen und/oder Reagenzien zur Durchführung einer LAMP unter Verwendung des ersten und/oder zweiten LAMP-Primer-Sets.
Das diagnostische Assay-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Nukleinsäure-FIP-LAMP-Primer des ersten und/oder zweiten LAMP-Primer-Sets Biotin-markiert ist, und/oder wobei der Nukleinsäure-FL-LAMP-Primer des ersten und/oder zweiten LAMP-Primer-Sets FAM-markiert ist.
Das diagnostische Assay-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend ein Kontroll-LAMP-Primer-Set, das Nukleinsäure-Primer für die LAMP einer internen Kontroll-Nukleinsäure in reverser Transkription umfasst, wie beispielsweise eine revers transkribierte RNA, die von einem Housekeeping-Gen abgeleitet ist, wie beispielsweise humanes beta-Aktin (ACTB).
Das diagnostische Assay-Kit nach Anspruch 10, wobei das Kontroll-LAMP-Primer-Set einen Nukleinsäure-F3-LAMP-Primer, einen Nukleinsäure-FL-LAMP-Primer, einen Nukleinsäure-FIP-LAMP-Primer, einen Nukleinsäure-B3-LAMP-Primer, einen Nukleinsäure-BL-LAMP-Primer und einen Nukleinsäure-BIP-LAMP-Primer umfasst.
Das diagnostische Assay-Kit nach Anspruch 11, wobei der Nukleinsäure-FL-LAMP-Primer und der Nukleinsäure-FIP-LAMP-Primer mit einer nachweisbaren Markierung markiert sind, die sich von den Markierungen unterscheidet, die für das erste und zweite Corona-LAMP-Primer-Set verwendet werden.
Das diagnostische Assay-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 12, ferner umfassend Mittel zur reversen Transkription der Ziel-RNA von SARS-CoV2.
Eine Behälterpackung, umfassend mindestens einen ersten Behälter, wobei der erste Behälter eine Primermischung-Zusammensetzung aller Nukleinsäure-Primermoleküle des ersten Corona-LAMP-Primer-Sets nach Anspruch 1 umfasst.
Eine Behälterpackung, umfassend mindestens einen zweiten Behälter, wobei der zweite Behälter eine Primermischung-Zusammensetzung aller Nukleinsäure-Primermoleküle des zweiten Corona-LAMP-Primer-Sets nach Anspruch 2 umfasst.
Die Behälterpackung nach Anspruch 14 oder 15, umfassend sowohl den ersten Behälter nach Anspruch 14 als auch den zweiten Behälter nach Anspruch 15.
Die Behälterpackung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, umfassend einen dritten Behälter, wobei der dritte Behälter ein Kontroll-LAMP-Primer-Set umfasst, das Nukleinsäure-Primer für die LAMP einer internen Kontroll-Nukleinsäure in reverser Transkription umfasst, wie eine revers transkribierte RNA, abgeleitet von einem Housekeeping-Gen, wie humanes beta-Actin (ACTB).
Eine Verwendung eines Nukleinsäure-Primer-Sets für den chirurgischen oder diagnostischen Nachweis einer SARS CoV2-Infektion in einem Säugetier-Subjekt, wobei das Nukleinsäure-Primer-Set das erste und/oder zweite Corona-LAMP-Primer-Set nach einem der Ansprüche 1 bis 13 ist.
Die Verwendung nach Anspruch 18, umfassend das Erhalten einer biologischen Probe von dem Säugetier-Subjekt.
Die Verwendung nach Anspruch 18, wobei die biologische Probe durch chirurgische Entnahme einer Rachenabstrichprobe des Säugetier-Subjekts erhalten wird.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Säugetier-Subjekt ein Mensch ist.