JPH08508636A

JPH08508636A - 核酸配列の増幅

Info

Publication number: JPH08508636A
Application number: JP6517199A
Authority: JP
Inventors: アルバートエル．ジェイアール．ジョージ; サティシュケイ．バートネイガー
Original assignee: オンコールインコーポレーテッド
Priority date: 1993-01-27
Filing date: 1994-01-25
Publication date: 1996-09-17
Also published as: EP0686200A1; AU6092394A; EP0686200A4; WO1994017210A1

Abstract

(57)【要約】精製されていてもよいし、核酸混合物中に存在していてもよいDNAまたはRNA鋳型から核酸配列を増幅する方法。得られた核酸配列はその鋳型の正しいコピーであってもよいし、また修飾されていてもよい。本発明方法は特定の核酸配列のコピーの正確度を高めることができ、単一のアッセイによって特定の点突然変異をさらに効率的に検出することができるので、従来の増幅方法よりも優れている（第１図参照）。

Description

【発明の詳細な説明】核酸配列の増幅関連出願に対するクロスレファレンス本出願は1993年１月27日に出願された米国特許出願第08/010,433号の一部継続出願である。発明の背景１．技術分野本発明は核酸配列の増幅方法に関する。さらに詳しくは、精製されていてもよいし核酸混合物に存在していてもよい、DNAまたはRNA鋳型から核酸配列を製造する改良方法に関する。得られた核酸配列は、前記鋳型の正確なコピーであってもよいし、修飾されていてもよい。２．背景技術従来、増幅される核酸配列の鎖両方を同一の方法で合成する核酸配列の増幅方法が用いられていた。そのような方法は当該プロセスに利用される酵素の性質によって制約をうける傾向がある。米国特許第4,683,195および第4,683,202においては、DNAまたはRNAはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅されている。これらの特許はここに番号を引用してその全体を本願開示に取り入れるものとする。この方法は、オリゴヌクレオチドプライマーを二本鎖標的核酸の各相補鎖の５'末端にハイブリッド化するものである。プライマーは、遊離型ヌクレオチドを標的核酸の各鎖と相補的な核酸配列に組み込むDNAポリメラーゼによって、３'末端から５'から３'方向へと伸長される。得られた伸長生成物は、標的核酸鎖から解離された後次のサイクルの標的配列となる。充分量の増幅DNAを得るためには反復サイクルを行わなければならず、そのサイクルの間においては、相補DNA鎖を高温で変性しなければならない。この方法で使用される大腸菌DNAポリメラーゼＩのような通常のポリメラーゼは、相補鎖の変性に必要な温度で不活性化されてしまうという制約がある。従って、反応混合物にはそのようなポリメラーゼによる合成サイクルそれぞれの間や加熱変性工程の後、新たに酵素を添加しなければならない。その結果、プライマー伸長および相補鎖の合成は次のサイクルで起こることになる。この追加工程によって増幅に要する時間が長くなる一方、多工程を必要とする増幅は複雑化する。近年、熱安定性のDNAポリメラーゼがThermus aquaticusのような好気性菌から発見され分離されている。このような熱安定性ポリメラーゼのおかげで一連の合成および変性工程の初期段階で酵素を添加することができるようになり、各変性工程後に新たに酵素を添加する必要はなくなっている。 PCRに潜在的な問題は、プライマー配列と増幅を意図しないDNA分子領域とのハイブリッド化である。一般に、標的となる標品は、標的配列そのものの外に、プライマー配列と若干相補的な他の配列を含んでいるから、このような望ましくないハイブリッド化が生じるのである。プライマー分子の３'末端ヌクレオチドが標的配列以外の配列とうまくハイブリッド化してしまうと、プライマー伸長もポリメラーゼ酵素によってうまく開始し、所望の標的配列とは異なる伸長生成物となる可能性がある。ある場合には、この伸長生成物は指数的に増幅されることがあり、それが誤って所望の標的配列と考えられることがある。核酸混合物にコピーとして低量で存在する特定の核酸配列を検出するリガーゼ連鎖反応（LCR）と呼ばれる方法も併記されている。ヨーロッパ特許出願第03203 08号にはこの方法が記載されており、ここに本番号を引用することによってその全体を本願開示に入れるものとする。この方法によれば、標品中の標的核酸を近接する配列含有プローブにアニーリングする。ハイブリッド化により、前記プローブを連結して元の標的核酸に相補的であって検出可能な融合プローブを生成する。この融合プローブを核酸から解離させ、続くハイブリッド化およびプローブ融合の鋳型として使用すると、検出対象の核酸が幾何学的に増幅される。この方法ではDNAポリメラーゼは使用されていない。 LCRは、増幅用として少なくとも四つ別個のオリゴヌクレオチドプローブを必要とするため不利である。LCRではさらに、標的核酸の全配列が分かっていなければならない。その上、バックグラウンドシグナルが標的に依存しないプローブの連結によって得られる。第三プローブは第一プローブとハイブリッド化し、第四プローブは第二プローブとハイブリッド化するので、これらプローブは過剰に加えた場合、標的核酸に依存することなく連結し得る二本鎖を、プローブ同士で容易に作ることができる。ヨーロッパ特許出願第0439182はここに番号を引用して、その全体を本願開示として入れるものとするが、そこには、修飾末端が正されるまで連結をすることができないように一末端を修飾した標的核酸とハイブリッド化するプローブ/プライマーを供給することによって、LCR増幅を改良する方法が記載されている。そのような修飾の一つとして、プローブ同士の連結を防ぐために、プローブの間に小さなギャップを置く。考えられる四つのヌクレオチドとは異なる三つ以下のヌクレオチドからDNA配列が構成されるように、標的核酸のギャップ配列を選択しなければならない。第四のヌクレオチドは隣接するプローブの５'末端に相補的な最初の塩基でなければならない。次に、DNAポリメラーゼまたは逆転写酵素を用いてそのギャップを埋め、一またはそれ以上のプローブを標的依存的に５' から３'方向へ伸長してそれらプローブを連結可能にする。反応混合物は隣接プローブの５'末端でその塩基と相補的な第四のデオキシヌクレオシド三リン酸を省略する。この方法によれば、標的核酸で選択されたギャップはデオキキシヌクレオシド三リン酸のうち最大三つに相補的な塩基を含めばよいのであるから、標的核酸におけるギャップの位置が制限され、そのギャップのサイズもまた制限される。さらに、この方法は四つのプライマーを必要とする。このヨーローッパ特許出願には、プライマーがポリメラーゼ酵素によって伸長不可能となるようにそのプライマーの一末端を修飾するPCR増幅方法も開示されている。この修飾を鋳型依存的に除いた場合、そのプライマーは伸長可能となる。しかしながら、このタイプのPCRでは、伸長を起こさせる前にその修飾を除く工程を付加しなければならない。核酸配列を増幅する先行技術の方法に伴う前記不利益に鑑み、この分野では明らかに、増幅配列の正確度を高めることができ、特定の核酸鎖を検出することができ、そして増幅工程の単一系列において効率的に複対立遺伝子を調べることができる方法が望まれていた。発明の要約本発明は、ある観点からLCRおよびPCRを組み合わせて使用することにより、標的核酸配列をより高い正確度で検出および増幅することができるという発見に基づいている。従って、本発明方法の一観点によれば、本発明は、核酸または核酸混合物に含まれている標的核酸配列を酵素的に増幅する方法であって、ａ．標的核酸配列を選択する工程、ｂ．標的核酸配列第一末端の第一セグメントに実質上相補的な第一プライマー、標的核酸配列第二末端の第二セグメントに実質上相補的であってその３'末端が第一プライマーの５'末端に隣接している第二プライマー、および標的核酸配列第一末端に類似しており、前記第一プライマーの少なくとも一部と実質上相補的な第三プライマーとからなるプライマー群を供給する工程、ｃ．少なくとも四つの異なるヌクレオチド塩基を供給する工程、ｄ．前記第一および第二プライマーと標的核酸配列とを標的依存的にハイブリッド化してプライマー/標的複合体を生成する工程、ｅ．隣接する第一プライマーの５'末端と第二プライマーの３'末端とが連結する条件でライゲーションを行い、前記標的核酸配列に実質上相補的な融合増幅生成物を生成する工程、ｆ．前記融合増幅生成物を標的核酸配列から解離させる工程、ｇ．前記第三プライマーと前記融合増幅生成物をハイブリッド化する工程、ｈ．伸長された増幅生成物が前記融合増幅生成物と実質上相補的になる条件で、前記ヌクレオチド塩基の存在下、第三プライマーを伸長する工程、およびｉ．場合により、融合増幅生成物から伸長された増幅生成物を解離させる工程、からなることを特徴とする増幅方法に関する。本発明方法のさらに別の観点によれば、本発明は、前記開示の方法を用いて、核酸または核酸混合物に含まれている標的核酸配列の点突然変異または対立遺伝子を酵素的に検出する方法に関する。前記プライマーの一つは、多くの類似オリゴヌクレオチド配列から構成されており、その一つは考えられる対立遺伝子または点突然変異に対して正しく相補的であり、またオリゴヌクレオチドはそれぞれ相異なるラベルで標識されている。得られた増幅生成物にどの標識オリゴヌクレオチドが含まれているかを検出することによって、上記対立遺伝子を同定する。第三の観点によれば、本発明は、核酸または核酸混合物に含まれている標的核酸配列を酵素的に増幅する方法であって、ａ．標的核酸配列を選択する工程、ｂ．標的核酸配列第一末端の第一セグメントに実質上相補的な第一プライマー、標的核酸配列第二末端の第二セグメントに実質上相補的であってその第二セグメントが前記第一セグメントから間隔をおいて配置されている第二プライマー、および標的核酸配列第一末端に類似しており、前記第一プライマーの一部と実質上相補的な第三プライマーとからなるプライマー群を供給する工程、ｃ．少なくとも四つの異なるヌクレオチド塩基を供給する工程、ｄ．前記第一および第二プライマーと標的核酸配列とを標的依存的にハイブリッド化してプライマー/標的複合体を生成する工程、ｅ．伸長された第二プライマーの３'末端が第一プライマーの５'末端に隣接する塩基で終わる伸長された第二プライマーが生成する条件で、ヌクレオチド塩基の存在下、第二プライマーの３'末端を伸長する工程、ｆ．第一および伸長されたされた第二プライマーが前記標的核酸配列に実質上相補的な融合増幅生成物を生成する条件で、第一および伸長された第二プライマーの両末端を連結する工程、ｇ．前記融合増幅生成物を標的核酸配列から解離させる工程、ｈ．前記第三プライマーと前記融合増幅生成物をハイブリッド化する工程、ｉ．伸長された増幅生成物が前記融合増幅生成物と実質上相補的になる条件で、ヌクレオチド塩基の存在下、前記第三プライマーを伸長する工程、およびｊ．場合により、融合増幅生成物から伸長された増幅生成物を解離させる工程、からなることを特徴とする増幅方法に関する。本発明生成物からみた観点の一つによれば、本発明は、核酸または核酸混合物に含まれる標的核酸配列を増幅するキットであって、第一、第二および第三プライマー、場合により第四プライマー；連結酵素；重合酵素；および少なくとも四つのヌクレオチド；からなることを特徴とするキットに関する。図面の簡単な説明図１は、本明細書に述べたDNAの増幅/検出方法の一態様を示す。図２は、走査アクリルアミドゲルをPhosphor Imagerから出力したものである。図中の矢印は得られた高分子量の増幅生成物を示す。図３は、本明細書に述べたDNAの増幅/検出方法の他の態様を示す。図４は、多剤耐性遺伝子（MDR-1）（配列ID NO:1）の配列の一部を示す。図５から図11までは、走査アクリルアミドゲルのPhosphor Imagerからの出力であり、本発明の種々の態様で達成された増幅を表す。図12は、本明細書に述べたDNAの増幅/検出方法の他の具体化を示す。好ましい具体化に関する記載本発明を詳細に述べるに先立って、まず以下の用語を定義する。本発明において使用するのに適当な「標的核酸」または「標的核酸配列」なる用語は、原核生物または真核生物のDNAまたはRNAからのものであってよく、植物、動物、昆虫、微生物などからのものを含む。「標的核酸」または「標的核酸配列」は単離されていてもよいし、増幅される標的核酸配列のほかに他の核酸配列を含む標品中に存在していてもよい。標的核酸配列は、その標的核酸配列より長い核酸鎖に位置していてもよい。この場合には標的核酸配列の両末端が、選択されていない核酸配列と標的核酸配列との境界となる。標的核酸標品は合成的に得たものでもよいし、または当分野に周知の方法で生物から単離したものであってもよい。特に有用な核酸源としては、生物の組織または血液サンプルから誘導されたもの、自己複製ベクターに存在する核酸、およびウイルス、細菌や真菌のような病原性生物から誘導された核酸である。染色体の転位や、挿入、欠失、トランスロケーションおよびその他の変異によって生じる病態、腫瘍遺伝子によって生じる病態、および癌に関連する病態のような病態に関係する標的核酸配列もまた本発明においては特に有用な配列である。「選択された」なる用語は、所望の性質をもっている標的核酸配列があり、その標的配列の適切なセグメントの周囲にプローブが構築されていることを意味する。「プローブ」または「プライマー」なる用語は本願では同じ意味をもっている。すなわち、一本鎖のオリゴヌクレオチド断片である。「オリゴヌクレオチド」なる用語はDNAまたはRNAを意味する。プローブまたはプライマーは、標的依存的な連結または伸長ができるような再結合条件下でその配列とハイブリッド化するならば、標的核酸配列と「実質上相補的」である。再結合はA-X（式中ＸはＴまたはＵである）とG-Cとの間における二本鎖デュプレックス構造を形成する特定の塩基対に依存する。したがって、プライマー配列は標的核酸配列の正しい配列を反映する必要はない。しかしながら、標的核酸の正確なコピーが望ましい場合には、そのプライマーは正しい配列を反映していなければならない。典型的な例をあげれば、「実質上相補的な」プライマーは標的の核セグメントに相補的な塩基を少なくとも70％またはそれ以上含んでいる。さらに好ましくは、80％の塩基が相補的であり、最も好ましくは90％の塩基が相補的である。一般に、プライマーは標的核酸配列の末端とハイブリッド化し、標的に依存して連結または伸長できるように連結または伸長されなければならない。プライマーはRNAでもDNAでもよく、普通に組み込まれた塩基類縁体である修飾された窒素性塩基を含んでいてもよいし、標識することによってあるいは標識を付するのに適当なリンカーアームによって修飾されているものであってもよい。標的配列が未知であったり、変性している場合その場所にはイノシンを使用することができる。オリゴヌクレオチドはプライマーと標的核酸とをハイブリッド化し、かつ、増幅を進めるのに充分な長さでなければならない。オリゴヌクレオチドは好ましくは15ないし50個、さらに好ましくは20ないし40個、最も好ましくは 25ないし35個のヌクレオチドである。ヌクレオチド配列、内容および長さは、増幅される配列によって変わる。プライマーは、標的核酸配列と実質上相補的な配列を含む一またはそれ以上のオリゴヌクレオチドからなると考えられる。したがって、ストリンジェンシーの低い条件下では、オリゴヌクレオチドはそれぞれ標的核酸の同じセグメントとハイブリッド化する。しかしながら、ストリンジェンシーの高いハイブリッド化条件では、標的核酸配列に最も相補的なオリゴヌクレオチド配列がハイブリッド化するだけであろう。条件のストリンジェンシーは、当分野では一般に温度や溶媒およびその他のパラメーターに依存するとされている。おそらく最も簡単に調節できるパラメーターは温度であるが、この条件はPCRと同様であるから、当業者は、所望のストリンジェンシーレベルを達成するのに必要な適正条件を決めることができる。本発明で使用するのに適切なオリゴヌクレオチドブライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブは、当分野で公知の方法により誘導することができる。公知の方法には、化学合成、非特異的に核酸を切断する化学物質や酵素を用いて大きい核酸を切断する方法、部位特異的な制限エンドヌクレアーゼを使用する方法がある。プライマーはβ-シアノエチルフォスフォルアミダイト法や当業界に公知のその他の方法を用いて作ることができる。オリゴヌクレオチドプライマー合成法は、当業界公知の方法により自動DNA合成機を用いて行うのが好ましい。所望のオリゴヌクレオチドプライマーが合成されれば、これを合成に用いた固体支持体から切断し、当業界公知の方法で処理して保護基を除く。次いで、抽出およびゲル精製を含む当業界公知の方法により、オリゴヌクレオチドプライマーを精製する。オリゴヌクレオチドプライマーの濃度および純度はアクリルアミドゲルで調べてもよいし、分光光度計により260nmおよび280nmの吸光度を測定することによって調べてもよい。リガーゼがオリゴヌクレオチドプライマーと連結するためには、本発明に用いられるプライマーは５'末端でリン酸化されているのが好ましい。リン酸化は当業界公知の方法により行うことができるが、T4ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を使用して行うのが好ましい。オリゴヌクレオチドは未標識あるいは標識ATPの存在下でリン酸化することができる。増幅プロセスをモニターするため、標識ATP を使用してプライマーをリン酸化してもよい。特に好ましいのは［γ-³²Ｐ］ATP である。オリゴヌクレオチドプライマーは、当業界で公知の検出可能なマーカー、³⁵Ｓや³Ｈなどその他の放射性同位体、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ルシファーイエロー、AMCAブルーなどのような蛍光マーカーで標識してもよい。また、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビのパーオキシダーゼのように、特定の化学反応が起こると検出可能なシグナルを生成する酵素マーカーで標識してもよい。そのような酵素マーカーは、増幅プロセスの変性工程に耐えられるよう、熱安定性であることが好ましい。プライマーは、ハプテンあるいは標識アビジン分子が結合しているビオチンや、標識抗ジゴキシゲニン抗体が結合しているジゴキシゲニンのようなその他の分子に共有結合しているヌクレオチドを挟んで間接的に標識してもよい。プライマーは化学合成のプロセスで標識してもよいし、合成後に当業界公知の方法で標識を行ってもよい。どのような標識方法および標識のタイプを選ぶかは本発明にとって重大な要件ではない。プローブまたはプライマーは修飾されていてもよいものとする。例えば、ポリメラーゼと共働する5'-3'エキソヌクレアーゼによるプライマーの加水分解は、プライマーの５'末端にある最後のヌクレオチド間にリン酸チオエート基を介在させることによって防ぐことができる。ポリメラーゼによるプライマーの伸長は、３'末端にジデオキシヌクレオチドやアミノ基、コルジセピンまたはリン酸残基を入れることによって阻害することができる。あるいは、プライマーの３'末端にアラビノシルヌクレオチドを入れてプライマーの伸長を阻害してもよい。この方法によると、ポリメラーゼによる伸長は阻害されるが、前記プライマーは他のプライマーと連結することができる。「四つの異なるヌクレオチド塩基」なる用語は、文脈がDNAを指す場合、デオキシチミジン三リン酸（dTTP）；デオキシアデノシン三リン酸（dATP）；デオキシグアノシン三リン酸（dGTP）およびデオキシシチジン三リン酸（dCTP）を意味し、RNAを指す場合、ウリジン三リン酸（UTP）；アデノシン三リン酸（ATP）；グアノシン三リン酸（GTP）およびシチジン三リン酸（CTP）を意味する。あるいは、dUTP、dITP、rITPまたはその他の修飾塩基を前記四つのヌクレオチド塩基と置換してもよいし、四つのヌクレオチド塩基と一緒に反応混合物へ入れて増幅された鎖に取り込んでもよい。増幅工程は、少なくとも前記四つのデオキシヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP）若しくはプライマーとして作動するオリゴヌクレオチドの伸長によってDNA鎖を生成する修飾ヌクレオシド三リン酸の存在下、または、前記四つのリボヌクレオシド三リン酸（ATP、CTP、GTP およびUTP）若しくは同様にRNA鎖を生成する修飾ヌクレオシド三リン酸の存在下で行われる。本発明の方法によって、特定の変異または対立遺伝子の存在を検出しようとする場合、オリゴヌクレオチドプライマーの一つは、それぞれ異なる配列をもち異なる方法で標識されたオリゴヌクレオチド断片群のセットから構成されていてもよい。増幅生成物中の前記標識の存在によって、標的DNA配列と正確に相補的なオリゴヌクレオチド断片が検出されることになる。この場合、各オリゴヌクレオチド断片は上記したように標識してもよい。有用性第一の具体化第一の具体化において、標的核酸は一本鎖として記述される。しかし、標的が二本鎖ではあるが、プローブ/プライマーとのハイブリッド化の前に、その相補鎖から単に分離される場合がこれに含まれることを理解すべきである。プライマー１および２、両者は実質上は標的核酸配列に相補的であり、二つのプライマーが標的核酸の鎖にハイブリッド化する場合、第一プライマーの５'末端が第二プライマーの３'末端に隣接するように、標的核酸の鎖の隣接した領域にハイブリッド化する。第一プライマーの３'末端は、実質上は標的核酸配列の５'末端に相補的で、第二プライマーの５'末端は、実質上は標的核酸配列の3'末端に相補的である。第一プライマーの５'末端は、二本鎖の複合体中に融合増幅生成物を作製するために、リガーゼを用いて、第二プライマーの３'末端に連結される。融合プライマーは標的核酸から解離される。第三プライマーは実質上はすべてに、あるいは少なくとも第一プライマーの一部と相補的で、標的核酸の５'末端と類似している。第三プライマーは、第一プライマーと十分に相補的であるべきで、その結果、用いられた条件下で、特異的なハイブリッド化がおきる。第三プライマーは第一プライマーよりも小さく、あるいは第一プライマーよりも大きく、そしてまた、実質上は第二プライマーの一部と相補的であるべきである。第三プライマーは、融合増幅生成物にハイブリッド化し、実質上融合増幅生成物に相補的な伸長された増幅生成物を形成するために、少なくとも四種の異なるヌクレオチド塩基の存在下で、ポリメラーゼにより伸長される。これが第一サイクルの内容である。続いて二本鎖複合体は解離される。オリゴヌクレオチドプライマー（１および２）は、標的核酸配列および第一サイクルの伸長増幅生成物にハイブリッド化する。プライマー３は、融合増幅生成物にハイブリッド化する。伸長および連結はその前の通りおこなわれ、このプロセスが繰り返される。第二プライマーの３'末端の第一プライマーの５'末端への連結が可能なまま、ポリメラーゼによる第二プライマーの伸長を阻害するように、第二プライマーの３'末端を修飾することが考えられる。その様な修飾は例えば、第二プライマーの３'末端にアラビノシルヌクレオチドを置くことである。シトシンアラビノシドを含むDNAオリゴマーの化学的合成法は当技術分野で知られている（Beardsley 、Nucl．Acid．Res.(1988)16:9165-9176）。そのような修飾は第一および第二プライマーの連結前に除去される必要はない。これとは別に、ポリメラーゼがもつ５'から３'のエキソヌクレアーゼによるプライマーの加水分解を阻害するために第一プライマーの５'末端が修飾されることもまた考えられる。その様な修飾は例えば、第一プライマーの５'末端の最後のヌクレオチドの間にリン酸チオエート基を置くことである。プライマーを含むリン酸チオエートの化学的合成法は当技術分野で知られている（OttおよびEckst ein、Biochemistry、(1987)26:8237-8241）。そのような修飾は第一および第二プライマーの連結前に除去される必要はない。さらに、ジデオキシヌクレオチドまたはリン酸基をもつプライマーの３'末端を修飾することにより、このプライマーの連結に影響を及ぼすことなしに、第一プライマーの伸長が阻害されることが考えられる。この修飾を生産する方法は、当技術分野で知られている（MarkiewiczおよびWyrzykiewicz、Nucl．Acid．Res. (1989)17:7149-7158）。生成物の分離または精製、あるいは過剰試薬の除去をおこなうことなしに、このプロセスが連続的に行われることが見出された。したがって、これにより、単一の反応容器（例えば、試験管）で、全体のプロセスがおこなわれることになる。一本鎖の変異は二本鎖の変異をより特殊化した形であることは理解されるべきである。標的核酸が二本鎖であるならば、第三プライマーのいくつかは第二相補鎖にハイブリッド化し、第一および第二プライマーは第一鎖にハイブリッド化する。第一鎖からの伸長および連結は上述のように進行する。第三プライマーのいくつかはまた、第二鎖に相補的な標的特異的な様式で伸長される。伸長された第三プライマーおよび第二鎖の解離後、少なくとも第一および第二プライマーのいくつかは伸長した第三プライマーにハイブリッド化し、第三プライマーの少なくともいくつかは再び第二鎖にハイブリッド化する。第一および第二プライマーの連結および第三プライマーの伸長により増幅された標的核酸を検出しようとする場合、これらのプライマーの一つまたはすべてが、検出可能な増幅された標的核酸を示すために、上述のようなマーカーを用いて、あるいは標識された塩基、または標識のために活性化された塩基の存在下で、第三プライマーを伸長することにより標識される。これとは別に、標的核酸が二本鎖の場合、両方の増幅された鎖は異なる検出マーカーを用いて標識される:第一鎖は特定のマーカーをもつ第三プライマーを標識することにより標識され、第二鎖は第一および/または第二プライマーを標識することにより標識される。特定の点突然変異または対立遺伝子の存在を検出しようとする場合、オリゴヌクレオチドの混合物を含む一つのプライマーが核酸の試料に添加される。それぞれのオリゴヌクレオチドは、異なる、独立に検出可能なマーカーを用いて標識され、その結果、特定の突然変異または対立遺伝子の存在に関する情報が単一の段階で得られる。他のオリゴヌクレオチドは含まれず、標的配列に正確に相補的なオリゴヌクレオチドは増幅生成物に含まれ、どの標識が生成物に含まれているかを決定することにより、その存在が検出される。増幅反応は、オリゴヌクレオチドプライマー:標的の比率が約10⁷から10³:1で、さらに好ましくは、およそ10⁴:1で、過剰のプライマーを用いて最適におこなわれる。プライマーのモル濃度を調整することにより、プロセスの効率を最大にすることが考えられる。増幅に用いられる緩衝液は、好ましくはpＨ範囲がおよそ7.5から8.5であり、さらに好ましくは、およそ８から8.5であり、最も好ましくは、約8.0である。第二の具体化第二の具体化において、標的核酸は一本鎖として記述される。しかし、標的が二本鎖ではあるが、プローブ/プライマーとのハイブリッド化の前に、その相補鎖から単に分離される場合がこれに含まれることを理解すべきである。標的核酸には二つのプライマーがハイブリッド化する。第一プライマーは実質上は標的核酸配列の５'末端に相補的であり、第二プライマーは実質上は標的核酸配列の３'末端に相補的である。プライマー（プライマー１および２）は、標的核酸の鎖の領域にハイブリッド化し、その結果、二つのプライマーの標的核酸の鎖へのハイブリッド化において、第一プライマーの５'末端は第二プライマーの３'末端からスペースが空けられる。プライマー間のスペースまたはギャップの大きさは、第二プライマーを伸長するためのポリメラーゼまたは転写酵素の能力により決定され、その結果、新規に添加される第二プライマーの３'末端は直接的に第一プライマーの５'末端に隣接する。好ましくは、しかし必須ではないが、ギャップまたはスペースの大きさは十分に長く、そのため、第二プライマーを伸長するためのポリメラーゼまたは転写酵素によりギャップを「うめる」ために、少なくとも四種の異なるヌクレオチドが必要である。第二プライマーの３'末端は、四種のヌクレオチド塩基の存在下で、ポリメラーゼまたは転写酵素により伸長される。第一プライマーの５'末端は、標的核酸および伸長された融合プライマーからなる二本鎖の複合体を形成するために、新規の第二伸長されたプライマーの３'末端に連結される。二本鎖複合体は解離し、第三プライマーは伸長した融合プライマーにハイブリッド化する。第三プライマーは実質上、第一プライマーのすべてあるいは一部に相補的で、標的核酸配列の５'末端に類似している。第三プライマーの３'末端は二本鎖複合体を形成し、サイクルを完了するために、ポリメラーゼまたは転写酵素により伸長される。二本鎖複合体は解離され、標的核酸が増幅されるまで、サイクルが繰り返される。標的配列が図12に示されるように二本鎖核酸の一部である場合、存在する第三プライマーのいくつかは標的配列に相補的な第二鎖にハイブリッド化し、増幅生成物を形成するために伸長されることが理解されよう。このプロセスは生成物の分離または精製、あるいは過剰な試薬の除去をせずに、連続的におこなわれることが考えられる。したがって、単一の反応容器（例えば、試験管）で、全体のプロセスがおこなわれることになる。さらに、プライマー間のギャップは上述のようにいろいろな大きさであるので、方法は特定のDNA 配列に限定されず、第三プライマーの伸長は四種のヌクレオチドの存在下で進行する。一本鎖の変異は二本鎖の変異のより特殊化された場合であることを理解するべきである。その二本鎖には四種のプライマーが存在し、第一と第二プライマーは実質上標的核酸の第一鎖に相補的であり、第三と第四プライマーは実質上標的核酸の第二鎖に相補的である。第三プライマーは実質上第一プライマーの少なくとも一部に相補的であり、第四プライマーは実質上第二プライマーの少なくとも一部に相補的である。第三および第四プライマーの伸長および連結は、上述のように第一および第二プライマーと同様におこなわれる。第三および第四プライマーの少なくともいくつかは伸長した融合プライマー（第一および第二プライマー）にハイブリッド化することを理解せねばならない。第三プライマーはその後伸長され、第四プライマーとの連結がおきる。第一プライマーの５'末端（および第四プライマーの５'末端、そこでは核酸は二本鎖である）は、ポリメラーゼがもつ５'から３'へのエキソヌクレアーゼによるプライマーの加水分解を阻害するために修飾されることが考えられる。その様な修飾は例えば、第一または第四プライマーの５'末端の最後のヌクレオチドの間に、リン酸チオール基を付けることである。リン酸チオエート基を含むプライマーの化学的合成法は当技術分野では知られている（OttおよびEckstein、Bioch emistry、(1987)26:8237-8241）。その様な修飾は、第一および第二プライマーの連結の前に除去される必要はない。本発明の「ギャップをうめる」具体化に関して、ある種のDNAポリメラーゼが、DNAの重合に伴う鎖置換活性を有していることは認識されるべきである。伸長していないプライマーを置換するので、この活性を減少または消失させることが好ましい。例えば、図３に示されるように、この活性が減少または消失しない限り、オリゴ２またはオリゴ３を伸長しても、それぞれオリゴ１またはオリゴ４の置換は生じない。鎖置換活性はDNAポリメラーゼのプロセシビティに関連する。DNAポリメラーゼのプロセシビティは、酵素の結合という事象あたりの添加したヌクレオチド残基数として定義される。高度のプロセシビティをもつDNAポリメラーゼは、強度の鎖置換活性を示す。酵素のプロセシビティは、1）塩濃度、2）ヌクレオチド濃度、および3）二価陽イオンのような因子に影響される。我々は次のことを見出した：１）プライマーの伸長の際の塩濃度を増加すると、プロセシビティは低下し、それにより片方のオリゴの置換は減少する。これは伸長生成物の連結を促進する。２）伸長しないオリゴ（図３のオリゴ１および４）の５'末端の残基のヌクレオチド濃度を減少することにより、プライマー伸長の際の限定されたヌクレオチドの取り込みの前にDNAポリメラーゼが停止する。プライマ−１の５'末端での停止により、DNAリガーゼがギャップをうめる時間が延びる。３）伸長するオリゴの３'末端に伸長することができないヌクレオチドのアラビノシル誘導体をおくことにより、DNAポリメラーゼによるプライマー２の伸長およびプライマー１の置換の両者を阻害することができる。これはプライマー１およびプライマー２が隣接位置にある「ギャップのない」場合に役立つ。さらに、第一および第四プライマーの伸長が、ジデオキシヌクレオチドまたはリン酸基でプライマーの３'末端を修飾することにより、これらのプライマーの連結に影響することなしに阻害されることが考えられる。この修飾をつくる方法は、当技術分野で知られている（MarkiewiczおよびWyrzykiewicz、Nucl．Acid． Res.(1989)17:7149-7158）。増幅した標的核酸を検出しようとする場合、増幅した鎖が検出できるように、上述のようにこれらのプライマーの一つまたはすべてが標識される。これとは別に、標識された塩基または標識のために活性化される塩基の存在下で、第二または第三プライマーの伸長をおこなうことにより、鎖が標識される。特定の配列の存在を検出するために、一つのプライマーがオリゴヌクレオチドの混合物からなる場合、それぞれのオリゴヌクレオチドは異なる、独立に検出可能なマーカーで標識され、その結果、それぞれの変異に関する情報が単一の段階で得られる。増幅反応は最適には、オリゴヌクレオチドプライマー:標的の比率がおよそ10⁷ から10³:1、より好ましくは、およそ10⁴:1で、プライマー過剰の状態でおこなわれる。プライマーのモル数を調整することにより、プロセスの効果を最大にできることが考えられる。増幅に用いられた緩衝液は、好ましくはpＨの範囲がおよそ7.5から8.5で、より好ましくは、およそ８から8.5、最も好ましくは、およそ8.0である。標的核酸が二本鎖であるならば、鎖は分離され、その結果、それらは個々に用いられる。この分離は、それぞれは当技術分野でよく知られている、物理的、化学的あるいは酵素的手法を含むいずれかの適当な変性方法によりおこなわれる。上記具体化のいずれにおいても、増幅反応は一連の段階を含む。反応は、二段階プロセス［すなわち、1）ハイブリッド化/伸長/連結とそれに続く2）変性］または三段階プロセス［1）ハイブリッド化；2）伸長/連結および3）変性］のいずれかである。これらの段階は手動でも行われるが、好ましくは、自動thermal cy derでおこなわれる。ハイブリッド化は一般的に、およそ50から75℃の温度で、0.5から２分間、より好ましくは、60から70Ｃで、１から1.5分間、さらに最も好ましくは、およそ6 3から68℃で、およそ１分間おこなわれる。伸長/連結またはハイブリッド化/伸長/連結の段階は一般的に、およそ60から80℃の温度で、0.5から５分間、より好ましくは、68から78℃で、２から４分間おこなわれる。好ましい酵素的連結段階を可能にする条件および試薬は一般的に、当業者に知られており、用いられたリガーゼの種類に直接的に依存する。「連結酵素」は、 T4リガーゼを含む核酸配列を連結する、当技術分野で知られているどの酵素でもよいが、AMPLIGASE（Epicentre Technologies、Madison、Wisconsin）、Taqリガーゼ（New England Biolabs、Bevedy、Massachusetts）およびPfuリガーゼ（Str atagene、La Jolla、Califomia）のような、およそ０から95℃の温度で安定なリガーゼが好ましい。熱安定性リガーゼがない場合、リガーゼはサイクルが繰り返されるごとに添加されねばならない。少なくとも約５単位の連結酵素/ピコモルのオリゴヌクレオチドが用いられる。１単位は、合訃50μｌ中、45℃で、15分間に、１μｇのBstEIIで消化したバクテリオフアージλのDNAのcos部位の50％の連結を触媒するために必要な量として定義される。「ポリメラーゼ」は、大腸菌DNAポリメラーゼＩ、大腸菌DNAポリメラーゼＩの Klenow断片、AmpliTaqDNAポリメラーゼStoffel断片、T4DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼあるいは逆転写酵素を含む、RNAまたはDNA鎖を重合できるいずれかの酵素である。一般にプライマーは、標的に依存した方法で、例えば、プライマーがハイブリッド化する核酸配列に相補的に核酸鎖が形成されるような条件下で、ポリメラーゼにより伸長される。重合酵素は、TaqDNAポリメラーゼ（Perkin-Elm er、Norwalk、Connecticut）のように、およそ０から95℃の温度で安定であることが好ましい。熱安定性ポリメラーゼがない場合、ポリメラーゼはサイクルが繰り返されるごとに添加されねばならない。オリゴヌクレオチド１ピコモルあたり少なくとも約0.5単位の重合酵素（製造者の定義による）が用いられる。ポリメラーゼまたは転写酵素によるプライマーの伸長は５'から３'の方向へ進み、反応系に、適当量の少なくとも四種のヌクレオチド塩基の添加が必要である。プライマーの伸長後、核酸鎖を分離する必要がある。鎖の分離は、よく知られた物理的、化学的あるいは酵素的手法を含むいずれかの適当な変性方法によりおこなわれる。例えば、核酸の鎖を分離する一つの物理的方法には、完全に変性するまで核酸を熱処理することが含まれる。典型的な熱変性は一般に、およそ85から110℃の温度で、より好ましくは、90から100℃で、最も好ましくは、およそ92 から96℃で、少なくとも約0.5分間おこなわれる。異なるオリゴヌクレオチドプライマーで得られる結果を最適化するために、温度および時間を修正する方法を当業者は理解している。それとは別に、変性は当技術分野で知られている別の方法によりおこなわれる。そのような方法の一つは、ヘリカーゼのような核酸-巻き戻し酵素の導入によるものである。ホルムアミド、EDTAのような高パーセンテージの変性剤を含む緩衝液を用いる、または凍結によるような当技術分野で知られているいずれかの方法により反応を停止する。その後、生成物はなんらかの方法で解析されるが、ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動が好ましい。好ましくは、二次構造を解消するために、ゲルに充填する前に、試料は煮沸される。ゲルは乾燥され、オリゴヌクレオチドまたは増幅鎖が放射活性をもつヌクレオチドを含む場合、オートラジオグラム用フィルムまたはphosphorスクリーンの前におかれる。ゲルはまた、ブロットされ、増幅した領域に特異的なプローブで探索される。プライマーは当技術分野で知られているいずれかの方法で検出可能なマーカーを用いて標識される。プライマーを標識する好ましい方法は末端標識によるものである。³¹Ｐ原子を³²Ｐをもつリン酸基に置換することにより、化学合成中にプライマーが標識される。置換されたヌクレオチドは直接的に標識される、あるいは標識を付加するためのリンカーアームを含む、または標識結合分子が結合するハプテンまたは他の分子に付着している（Boehringer Mannheim、Indianapolis 、Indiana）。適当な直接的な標識には、³²Ｐ、³Ｈおよび³⁵Ｓのような放射活性標識およびフルオレセイン、テキサスレッド、AMCAブルー、ルシファーイエロー、ローダミンなどのような蛍光マーカー、可視光で検出可能なシアニン染料、酵素などのような非放射活性標識が含まれる。蛍光マーカーは別法としては、活性化されたリンカー部位をもつヌクレオチドにつけられる。プライマーは、上に開示した方法により、すなわち、ハプテンまたはビオチンあるいはジゴキシゲニンのような他の分子に共有結合したヌクレオチドを取り込み、ハプテンまたは他の分子に結合した標識抗体を用いた、あるいはビオチンの場合、検出可能な標識に結合したアビジンを用いたサンドイッチハイブリッド化をおこなうことにより、間接的に標識される。抗体およびアビジンは、これらを検出可能にするために、蛍光マーカー、またはアルカリホスファターゼあるいは西洋ワサビのパーオキシダーゼのような酵素マーカーを結合される。結合アビジンおよび抗体はVector Laboratories（Burlingame、Califomia）およびBoehringer Mannheim（Indianapolis、Indiana）のような会社から商業的に入手可能である。酵素に対する基質および/または触媒を供給することにより、酵素を比色反応により検出できる。各種の触媒存在下で、異なる色が反応により生産され、これらの色は複数のプローブを別々に検出するために可視化される。当技術分野で知られている基質および触媒が用いられる。アルカリホスファターゼの好ましい触媒には、５-ブロモ-４- クロロ-３-インドリルリン酸（BCIP）およびニトロブルーテトラゾリウム（NBT ）が含まれる。西洋ワサビのパーオキシダーゼの好ましい基質は、ジアミノベンゾエート（DAB）である。以下の例は、本発明の好ましい具体化をより十分に示すために述べられている。これらは、しかしながら、発明の幅広い範囲を限定するものとして解釈されるものではない。略語: ＡＴＰアデノシン三リン酸ｄＡＴＰデオキシアデノシン三リン酸ＣＴＰシチジン三リン酸ｄＣＴＰデオキシシチジン三リン酸ＧＴＰグアノシン三リン酸ｄＧＴＰデオキシグアノシン三リン酸ｄＴＴＰチミジン三リン酸ＵＴＰウリジン三リン酸ＮＴＰヌクレオシド三リン酸 nmole（nＭ）ナノモル pmole（pＭ）ピコモル mmole（mＭ）ミリモル（μＭ）マイクロモル ng ナノグラム μg マイクログラム bis ビスアクリルアミド（Ｎ,Ｎ'-メチレンビスアクリルアミド）５' ペントースの５'位３' ペントースの３'位例１標的DNAの調製多剤耐性遺伝子（MDR-1）の889塩基対領域（図４、配列ID NO:1）がシステムの標的DNAとして選択された。MDR-1遺伝子はAmerican Type Culture Collection 、ATCC No.65704から得られる。標的DNAは、遺伝子の既知の配列に基づくを用いた標準的なポリメラーゼ連鎖反応により調製された。PCR反応混合物は、１mM TrisHCl（pH8.4）、５mM KCl、1.2mM MｇCl₂、それぞれ0.8mMのdNTP、１μ ＭのプライマーＡ、１μＭのプライマーＢ、１ngの鋳型DNA、2.5単位のAmpliTaq ^TMDNAポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus、Norwalk、Connecticut）を含む。反応混合物は94℃で６分間熱処理され、以下のサイクルが30回おこなわれた:94℃ 、１分間、65℃、45秒間、72℃、３分間。最後の重合は72℃で、10分間おこなわれた。酵素に推薦される条件下で、40単位のRsaI制限エンドヌクレアーゼを用いて、 20μｇのDNAが37℃で２時間消化された。反応混合物は、DNAが完全に消化されたかを確認するために、その一部がアガロースゲル上で泳動された。DNAはその後連続的に、等量のフェノール、フェノール-クロロホルム（1:1）およびクロロホルムで抽出され、さらに二倍量のエタノールで沈殿された。DNAペレットは脱イオン水に懸濁され、260nmでの吸光度を測定することにより、その濃度が定量された。例２オリゴヌクレオチドの調製デオキシヌクレオチドオリゴマーは、β-シアノエチルホスフオアミダイト法を用いて、Milligen/Biosearch Cydone Plus DNA合成機（Millipore、Bedford、 Massachusetts）により合成された。オリゴヌクレオチド合成のための試薬はすべてMillipore（Bedford、Massachusetts）から入手した。以下の配列をもつオリゴヌクレオチドが合成された：特異的な配列が合成された後、支持体からオリゴヌクレオチドを切断するために、水酸化アンモニウムによる60分室温処理がおこなわれた。保護基を除去するために、オリゴヌクレオチドが水酸化アンモニウムとともに、55℃で一晩インキュベートされた。水酸化アンモニウムをSpeedvac Concentrator［Savant Instru ments,Inc.、Farmingdale、New York］により蒸発乾固させた。オリゴヌクレオチドを脱イオン水に懸濁し、等量の水飽和したＮ-ブタノールで、３回抽出をおこなった。残存する微量のＮ-ブタノールは、Speedvac Concentratorを用いた蒸発により除去された。オリゴヌクレオヂドの濃度は、分光光度計で260nmの吸光度を測定することにより定量された。例３オリゴヌクレオヂドのリン酸化それぞれのオリゴヌクレオチドの５'末端が、ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化された。反応混合物（100μｌ）には、それぞれのオリゴヌクレオチドを２ナノモル、50mM TrisHClpH7.6、10mM MgCl₂、５mM DTT、0.1 mM塩酸スペルミジン、0.1mM EDTA、１mM ATPおよび50単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（GIBCO BRL、Gaithersburg、MaTyland）が含まれる。37℃で１時間後、酵素は65℃、10分間の熱処理により不活化された。例４オリゴヌクレオチドの³²Ｐ標識オリゴヌクレオチド（20ピコモル）は、その５'末端が³²Ｐを用いて、60μｌの50mM TrisHClpH7.6、10mM MgCl₂、５mM DTT、0.1mM塩酸スペルミジン、 0.1mM EDTAおよび200μCiの［γ-³²P］ATP（3000Ci/mmole=67pmoleのATP;Dupont のNEN Research Products部門、Boston、Massachusetts）中で標識された。反応を20単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（GIBCO BRL，Gaithersburg、Maryland ）を添加することにより開始し、37℃で、１時間インキユベートした。T4ポリヌクレオチドキナーゼは、65℃で、10分間の熱処理により不活化された。例５ DNAの増幅終濃度0.2μＭのオリゴヌクレオチド１、２および３が、20μｌの25mMTrisHCl pH8.0、10mM KCl、2mM MgCl₂、10mM DTT、２mM NAD＋および50μＭのdATP、dGT P、dCTPおよびdTTP中で、標的DNAの存在または非存在下でインキュベートされた。dNTPの保存溶液は-20℃で保存された。三つの異なる実験がおこなわれた。それぞれの場合において、一つのオリゴヌクレオチドのみが標識された。15単位のTaqリガーゼ（New England Biolabs、Be verly、Massachusetts）および１単位のAmplitaq^TMDNAポリメラーゼ（PerkinElm er、Norwalk、Connecticut）が添加され、その反応液にミネラルオイルが１滴重層された。単一の反応容器で、Ericomp^TMThermal Cycler（Ericomp Incorporati on、SanDiego、California）を用いて、反応は94℃で、６分間おこなわれた。反応液は94℃で１分間、および65℃で４分間インキュベートされ、このサイクルが 30回繰り返された。生成物の形成は、それぞれの³²Ｐ標識されたオリゴヌクレオチドを用いて独立に追跡された。反応を13μｌの停止液（95％ホルムアミド、20mM EDTA、0.05％ブロモフエノールブルー、0.05％キシレンシアノールFF）を添加することにより停止させた。電気泳動により解析するまで、試料を-20℃で保存した。例６増幅生成物の分離増幅反応の生成物は、100mMトリスホウ酸pH8.3、２mM EDTAに８Ｍ尿素を含む8％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド:ビス;19:1）で分離された。BRLシーケンシングゲル装置モデルS2（BRL、Gaithersburg、Maryland）がゲルを泳動するために用いられた。試料（４μｌ）は、ゲルに充填される前に煮沸することにより変性された。電気泳動は、60ワット一定で、２時間おこなわれた。ゲルを乾燥し、Phospho Scre en^TM（Molecular Dynamics、Sunnyvale、Califomia）に露光され、Phosphor Ima ger^TM（Molecular Dynamics、Sunnyvale、Califomia）で解析された。図２は、例５に記述された方法により増幅された試料のPhosphor Imagerスキャンからの出力である。レーン１では、反応液は標識したオリゴ１および未標識のオリゴ２および３を含む。レーン２では、反応液はレーン１と同一で、そこに標的DNAを添加したものである。増幅したDNAバンドは矢印で示されている。レーン３では、反応液は標識したオリゴ２および未標識のオリゴ１および３を含む。レーン４では、反応液はレーン３と同一で、そこに標的DNAを添加したものである。レーン５では、反応液は未標識のオリゴ１と２および標識したオリゴ３を含む。レーン６では、反応液はレーン５と同一で、そこに標的DNAを添加したものである。標的DNAなしでは増幅はおきず、増幅はいずれのオリゴヌクレオチドを標識しても検出されることがわかる。例７具体化２デオキシヌクレオチドは、例２に記述されたように、β-シアノエチルホスフオアミダイト法を用いて、Milligen/Biosearch Cydone Plus^TMDNA合成機（Milli pore、Bedford、Massachusetts）により合成された。オリゴヌクレオチド１および３の合成はすでに例２に記述されている。以下の配列をもつオリゴヌクレオチドが合成された：オリゴヌクレオチドは、例３に記述されているように、ATPおよびT4ポリヌクレオヂドキナーゼを用いて、５'末端がリン酸化されるか、例４に記述されているように、５'末端が³²Ｐで標識される。標的DNAは例１に記述されているように調製された。終濃度0.2μＭのリン酸化オリゴヌクレオチドが、20μｌの25mM TrisHClpH8.0 、10mM KCl、２mM MgCl₂、10mM DTT、２mM NAD＋およびそれぞれ50μＭのdATP、 dCTP、dGTPおよびdTTP中で、標的DNA（0.5fmole=3x10⁸分子）存在下でインキュベートされる。dNTPの保存溶液は-20℃で保存される。 15単位のTaqリガーゼ（New England Biolabs、Bevedy、Massachusetts）および１単位のAmplitaq^TM DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer、Norwalk、Connecticut ）が添加され、反応液に１滴のミネラル油が重層された。反応は、単一の反応容器で、Ericomp Thermal Cyder^TM（Ericomp Incorporation、SanDiego、Califoni a）を用いて、94℃で、６分間おこなわれる。その後、反応液は94℃、１分間および65℃、４分間インキュベートされ、このサイクルが30回繰り返される。 13μｌの停止溶液（95％v/vホルムアミド、20mM EDTA、0.05％w/vブロモフエノールブルー、0.05％キシレンシアノールFF）を添加することにより反応を停止した。試料は電気泳動により解析するまで、-20℃で保存する。増幅反応の生成物は例６に記述されているように分離される。例８本例は、第一と第二プライマーの間にギャップをもつ三種のプライマーを用いた本発明の図12の具体化を示すものである。デオキシヌクレオチドは、例２に記述されたように、β-シアノエチルホスフォアミダイト法を用いて、Milligen/Biosearch Cydone Plus^TMDNA合成機（Milli pore、Bedford、Massachusetts）により合成された。以下の配列をもつオリゴヌクレオチドが合成された：Ｍ13mp18フアージの一本鎖および二本鎖DNAをNew England Biolabs（Bevedy、 Massachusetts）より入手し、本例の標的として使用した。その配列はよく知られており、ヌクレオチド6201から6340の関連する部分は次のとおりである（配列 ID NO:12）：オリゴ５はヌクレオチド6311から6334に相補的である；オリゴ６はヌクレオチド 6205から6231に相補的である。終濃度0.25μＭのオリゴ５と７、および終濃度0. 5μＭのリン酸化したオリゴ６を20μｌの50mM TrisHCl pH8.0、10mM DTT、2mM N AD、10mM KCl、4mM MgCl₂、20μＭのdATP、dGTP、dTTPおよび５μＭのdCTP中で、M13mp18二本鎖DNA（2.5x10^-13Ｍで存在）存在下でインキュベートした。三つの異なるセットのアッセイが設定された。それぞれの場合、5'-³²P標識のオリゴヌクレオチドが一種類のみ添加された。それゆえ、第一の場合、オリゴ５のみが標識された。第二の場合、オリゴ６のみが標識された。第三の場合、オリゴ７のみが標識された。さらに、それぞれのアッセイについて、標的DNAがないことを除いて、同一の試薬を用いて陰性の対照実験がおこなわれた。５単位のAmpliTaq Stoffel断片および30単位のTaqリガーゼが添加された。反応チューブをGeneAmp^TM PCR system 9600 thermal cycler（Perkin Elmer Cetus）を用いて、94℃で２分間（１サイクル）、その後94℃で１分間および55℃で2.5分間（30サイクル）インキュベートした。停止溶液（95％ホルムアミド、20mM EDTA、0.05％ブロモフェノールブルー、0 .05％キシレンシアノールFF）を添加することにより反応を停止した。増幅反応の生成物を8％ポリアクリルアミド変性ゲルで解析した。その結果が図５に示されており、これは本例で増幅された試料のPhosphor Imagerスキャンの出力である。レーン１では、反応液は³²Ｐ標識したオリゴ５および未標識のオリゴ６および７を含む。レーン２では、反応液はレーン１と同一で、そこに標的DNAを添加したものである。増幅したDNAバンドは矢印で示されている。レーン３では、反応液は³²Ｐ標識したオリゴ６および未標識のオリゴ５および７を含む。レーン４では、反応液はレーン３と同一で、そこに標的DNAを添加したものである。レーン５では、反応液は³²Ｐ標識したオリゴ７および未標識のオリゴ５および６を含む。レーン６では、反応液はレーン５と同一で、そこに標的DNAを添加したものである。標的DNAなしでは増幅はおきず、増幅生成物は三つのうちのいずれのオリゴヌクレオチドを標識しても検出されることがわかる。例９本例は、四種のプライマーを用い、そのうちの二種が伸長されるような本発明の図３の具体化を示すものである。デオキシヌクレオチドは、例２に記述されたように、β-シアノエチルホスフォアミダイト法を用いて、Milligen/Biosearch Cydone Plus^TMDNA合成機（Milli pore、Bedford、Massachusetts）により合成された。オリゴヌクレオチド５、６および７の合成はすでに例８に記述されている。以下の配列をもつオリゴヌクレオチドが合成された：終濃度0.025μＭのオリゴ５と７（それぞれ第二および第三プライマー）、および終濃度0.05μＭのリン酸化したオリゴ６および８（それぞれ第一および第四プライマー）を20μｌの50mM TrisClpH8.0、10mM DTT、２mM NAD、10mMKCl、４m M MgCl₂、20μＭのdATP、dGTP、dTTPおよび５μＭのdCTP中で、Ｍ13mp18ファージの二本鎖DNA存在下でインキュベートした。四つの異なるセットのアッセイが設定された。それぞれの場合、5'-³²P標識のオリゴヌクレオチドが一種類のみ添加された。さらに、それぞれのアッセイについて、標的DNAがないことを除いて、同一の試薬を用いて陰性の対照実験がおこなわれた。５単位のAmpliTaq Stoff el断片および30単位のTaqリガーゼが添加された。反応チューブをGeneAmp^TMPCR system 9600 thermal cycler（Perkin Elmer Cetus）を用いて、94℃で２分間（１サイクル）、その後94℃で１分間および55℃で2.5分間（30 サイクル）インキュベートした。例８のように、停止溶液を添加することにより反応を停止した。増幅反応の生成物を８％ポリアクリルアミド変性ゲルで解析した。その結果が図６に示されており、これは本例で増幅された試料のPhosphor Imagerスキャンの出力である。レーン１では、反応液は³²Ｐ標識したオリゴ５および未標識のオリゴ６、７および８を含む。レーン２では、反応液はレーン１と同一で、そこに標的DNAを添加したものである。増幅したDNAバンドは矢印で示されている。レーン３では、反応液は³²Ｐ標識したオリゴ６および未標識のオリゴ５、７および８を含む。レーン４では、反応液はレーン３と同一で、そこに標的DNAを添加したものである。レーン５では、反応液は³²Ｐ標識したオリゴ７および未標識のオリゴ５、６および８を含む。レーン６では、反応液はレーン５と同一で、そこに標的DNAを添加したものである。レーン７では、反応液は³²Ｐ標識したオリゴ８および未標識のオリゴ5、６および７を含む。レーン８では、反応液はレーン７と同一で、そこに標的DNAを添加したものである。標的DNAなしでは増幅はおきず、増幅はいずれのオリゴヌクレオチドを標識しても検出されることがわかる。例10 本例は、塩濃度を増加し、ヌクレオチド濃度を減少することが、DNAポリメラーゼによる鎖の置換活性を減少し、DNAリガーゼによる連結を促進することを示すものである。Ｍ13mp18一本鎖DNAにアニールした5'-³²P末端標識したプライマー（例８のオリゴ５）の伸長は、オリゴ５の79ヌクレオチド下流にアニールした別のプライマー（例８のオリゴ６）の存在下でモニターされた。DNAポリメラーゼによるブロッキングプライマー（オリゴ６）の伸長は、３'末端にNH₂-基を導入することにより阻害された。アッセイ条件下で、オリゴ５はオリゴ６の５'末端に達するまで、DNAポリメラーゼにより伸長された。伸長生成物はしばらくの間蓄積し、伸長はブロッキングプライマー（オリゴ６）を越えて継続する。アッセイ中にDNAリガーゼが存在すると、オリゴ６の５'末端の伸長生成物は、オリゴ５に連結するのに十分長く蓄積される。Ａ．DNAポリメラーゼによる鎖置換のアッセイ条件 5'-³²P末端標識したプライマー（オリゴ５）（15nM）およびブロッキングプライマー（オリゴ６）（300nM）が、Ｍ13mp18ファージ一本鎖DNA（26nM）に同時にアニールされた。アニーリングは10mM TrisClpH7.5、10mM MgCl₂および50mMNaCl 中で、95℃で３分間熱処理し、室温まで徐冷することによりおこなわれた。 AmpliTaq DNAポリメラーゼによる鎖置換は、OCR緩衝液（50mM TrisHClpH8.0、 10mM DTT、2mM NAD）、100mM KCl、2mM MgCl₂、25単位/mlのAmpliTaqDNAポリメラーゼおよび下述のような適当な濃度のデオキシヌクレオチド三リン酸中で、プライマー鋳型複合体を10倍に希釈することによりアッセイされた。AmpliTaqDNA ポリメラーゼStoffel断片を用いたアッセイは、10mM KClおよび50単位/mlの酵素であることを除いて、同一条件でおこなわれた。反応は55℃でインキュベートされ、その一部が30秒、１分、２分後にサンプリングされた。停止液が添加され、試料は８％ポリアクリルアミド変性ゲルで解析された。Ｂ．DNAリガーゼ存在下でのDNAポリメラーゼによる鎖置換のアッセイ条件ブロッキングプライマーの５'末端がリン酸化され、1500単位/mlのTaqリガーゼ（New England Biolabs）が添加されたことを除いて、上述のＡと同様にアッセイがおこなわれた。アッセイＡおよびＢ両者の結果は図７から10に示されている。図７は、100mM KCl存在下での、AmpliTaqDNAポリメラーゼによる鎖の置換を示す。レーンは次の通りである：レーンA1-A3： 20μＭの四種すべてのdNTP レーンB1-B3： 20μＭのdA、dG、dTおよび４μＭのdC レーンC1-C3： 20μＭのdA、dG、dTおよび２μＭのdC レーンD1-D3： 20μＭのdA、dG、dTおよび１μＭのdC レーンＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔはオリゴ５プライマーおよびＭ13mp18ファージDNAのジデオキシシーケンシングパターンを示す。矢印はブロッキングプライマー（オリゴ６）の５'末端が結合する位置を示す。レーン１、２、３はそれぞれ、30秒、１分、２分の時間点である。図８は、10mM KCl存在下での、AmpliTaq Stoffel断片DNAポリメラーゼによる鎖の置換を示す。レーンは次の通りである：レーンA1-A3： 20μＭの四種すべてのdNTP レーンB1-B3： 20μＭのdA、dG、dTおよび10μＭのdC レーンC1-C3： 20μＭのdA、dG、dTおよび５μＭのdC レーンＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔはオリゴ５プライマーおよびＭ13mp18ファージDNAのジデオキシシーケンシングパターンを示す。矢印はブロッキングプライマー（オリゴ６）の５'末端が結合する位置を示す。レーン１、２、３はそれぞれ、30秒、１分、２分の時間点である。図９は、100mM KClおよびTaqリガーゼ存在下での、AmpliTaq DNAポリメラーゼによる鎖の置換を示す。レーンは次の通りである：レーンA1-A3;B1-B3： 20μＭの四種すべてのdNTP レーンC1-C3;D1-D3： 20μＭのdA、dG、dTおよび４μＭのdC レーンE1-E3;F1-F3： 20μＭのdA、dG、dTおよび２μＭのdC レーンB1-B3、D1-D3およびF1-F3はリガーゼなし。レーンＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔはオリゴ５プライマーおよびＭ13mp18ファージDNAのジデオキシシーケンシングパターンを示す。矢印は伸長プライマー（オリゴ５）およびオリゴ６の連結により形成された生成物の位置を示す。レーン１、２、３はそれぞれ、30秒、１分、２分の時間点である。図10は、10mM KClおよびTaqリガーゼ存在下での、AmpliTaq Stoffel断片DNAポリメラーゼによる鎖の置換を示す。レーンは次の通りである：レーンA1-A3;B1-B3： 20μＭの四種すべてのdNTP レーンC1-C3;D1-D3： 20μＭのdA、dG、dTおよび10μＭのdC レーンB1-B3およびD1-D3はリガーゼなし。レーンＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔはオリゴ５プライマーおよびＭ13mp18ファージDNAのジデオキシシーケンシングパターンを示す。矢印は伸長プライマー（オリゴ５）およびオリゴ６の連結により形成された生成物の位置を示す。レーン１、２、３はそれぞれ、30秒、１分、２分の時間点である。図７から10から、高塩濃度を用い、オリゴ６の５'末端のヌクレオチド濃度（この特定の例では、dCTP）を減少することにより、オリゴ５はオリゴ６の５'末端に達するまで、DNAポリメラーゼにより伸長されることは明らかである。伸長生成物は、DNAリガーゼによりオリゴ６に連結されるのに十分の長さの時間蓄積される。AmpliTaqポリメラーゼは、Stoffel断片よりも約10倍プロセッシブである。それゆえ、Stoffel断片と比較して類似した程度のプロセッシビティを達成するためには、より高い塩濃度およびより低いdCTP濃度が必要とされる。例11 本例は三種のプライマーを用い、そこにギャップをもたない本発明の第１図の具体化を示す。デオキシヌクレオチドは例２に述べられたように、β-シアノエチルホスフォアミダイド法を用いて、Milligen/Biosearch Cydone Plus^TM DNA合成機（Millip ore、Bedford、Massachusetts）により合成される。オリゴヌクレオチド３の合成についてはすでに例２に記述された。次の配列をもつオリゴヌクレオチドが合成される：終濃度0.025μＭのオリゴヌクレオチド３および10と終濃度0.05μＭの５'末端をリン酸化したオリゴヌクレオチド９が、50mM Tris HClpH8.0、10mM DTT、2mM NA D、10mM KCI、4mM MgCl₂、20μＭのdATP、dCTP、dGTP、dTTPを含む20μｌ中で、標的DNA（5x10^-12Ｍ、RsaI消化のMDR-1 DNA）存在下でインキュベートされた。三種の異なるセットのアッセイが設定された。それぞれについて、一つの５'末端を³²Ｐで標識したオリゴヌクレオチドのみが添加された。それゆえ、第一の場合、オリゴ９のみが標識された。第二の場合には、オリゴ10のみが標識された。第三の場合には、オリゴ３のみが標識された。さらに、それぞれのアッセイについて、標的DNAがないことを除いて、同一試薬を用いて、陰性対照実験がおこなわれた。５単位のAmliTaq Stoffel断片および30単位のTaqリガーゼが添加された。反応チューブはGeneAmp^TMPCR system 9600 thermal cyder（Pe rkin Elmer Cetus）中で、94℃で２分間（１サイクル）および94℃で１分間および55℃で2.5分間（30サイクル）インキュベートされた。反応は例５のように、停止液を添加することにより停止された。増幅反応生成物は、８％ポリアクリルアミド変性ゲル上で解析された。結果は図11に示されており、これは本例において増幅された試料のPhosphor Imagerスキャンの出力である。レーン１では、反応液は³²Ｐ-標識されたオリゴ９および未標識のオリゴ３および10を含む。レーン２では、反応液はレーン１と同一で、標的DNAを添加したものである。増幅したDNAのバンドは矢印で示されている。レーン３では、反応液は³²Ｐ-標識されたオリゴ10および未標識のオリゴ３および９を含む。レーン４では、反応液はレーン３と同一で、標的DNAを添加したものである。レーン５では、反応液は³²Ｐ-標識されたオリゴ３および未標識のオリゴ９および10 を含む。レーン６では、反応液はレーン５と同一で、標的DNAを添加したものである。増幅は標的DNAなしでは起きず、増幅生成物は三種のオリゴヌクレオチドのいずれの一つを標識しても検出できることがわかる。オリゴ10の３'末端にあるaraCはオリゴ９の５'末端に連結される。本発明の好ましい具体例のみが特に示され、記述されているが、本発明の多くの修正および変形は、本発明の精神および意図から離れることなしに、上記の内容および添付される請求の範囲内で可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＲＵ，ＳＫ，ＵＡ (72)発明者バートネイガーサティシュケイ. アメリカ合衆国 20878 メリーランド州、ゲイサースバーグ、ノーウィッチコート 21 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸または核酸混合物に含まれている標的核酸配列を酵素的に増幅する方法であって、ａ）標的核酸配列を選択する工程、ｂ）標的核酸配列第一末端の第一セグメントに実質上相補的な第一プライマー、標的核酸配列第二末端の第二セグメントに実質上相補的であってその３'末端が第一プライマーの５'末端に隣接している第二プライマー、および標的核酸配列第一末端に類似しており、前記第一プライマーの少なくとも一部と実質上相補的な第三プライマーとからなるプライマー群を供給する工程、ｃ）少なくとも四つの異なるヌクレオチド塩基を供給する工程、ｄ）前記第一および第二プライマーと標的核酸配列とを標的依存的にハイブリッド化してブライマー/標的複合体を生成する工程、ｅ）隣接する第一プライマーの５'末端と第二プライマーの３'末端とが連結する条件で連結を行い、前記標的核酸配列に実質上相補的な融合増幅生成物を生成する工程、ｆ）前記融合増幅生成物を前記標的核酸配列から解離させる工程、ｇ）前記第三プライマーと融合増幅生成物をハイブリッド化する工程、ｈ）伸長された増幅生成物が前記融合増幅生成物と実質上相補的になる条件で、前記ヌクレオチド塩基の存在下、第三プライマーを伸長する工程、およびｉ）場合により、融合増幅生成物から、伸長された増幅生成物を解離させて標的配列を増幅する工程、からなる増幅方法。２．標的核酸が一本鎖である請求項１の方法。３．工程（d）ないし（i）を少なくとも一回反復する請求項１の方法。４．標的核酸がDNAである請求項１の方法。５．標的核酸がRNAである請求項１の方法。６．工程（e）が連結酵素の存在下で行われる請求項１の方法。７．連結酵素がT4DNAリガーゼである請求項６の方法。８．連結酵素が０ないし95℃で安定である請求項６の方法。９．連結酵素が、Taqリガーゼ、Pfuリガーゼおよびアンプリガーゼからなる群より選ばれる請求項８の方法。 10．工程（h）がポリメラーゼの存在下で行われる請求項１の方法。 11．工程（h）が、大腸菌DNAポリメラーゼＩ、大腸菌DNAポリメラーゼＩのKleno w断片およびT4DNAポリメラーゼからなる群より選ばれたポリメラーゼの存在下で行われる請求項11の方法。 12．工程（h）が、０ないし95℃の温度で安定なポリメラーゼの存在下行われる請求項10の方法。 13．重合剤が、TaqDNAポリメラーゼおよびAmpliTaq Stoffel断片DNAポリメラーゼからなる群より選ばれる請求項12の方法。 14．標的核酸配列が、遺伝病または癌を引き起こす少なくとも一つの欠失または変異を含む請求項１の方法。 15．標的核酸配列が病原性生物、ウィルスまたは腫瘍遺伝子に含まれる請求項１の方法。 16．プライマー群の一つが二以上の異なるオリゴヌクレオチドからなり、オリゴヌクレオチドの一つが前記標的核酸配列と正確に相補的の配列をもっている請求項１の方法。 17．標的核酸が第一鎖および第二鎖からなる二本鎖核酸であり、前記第一および第二ブライマーは実質上第一鎖に相補的であり、前記第三プライマーは実質上前記第二鎖に相補的であり、前記第一鎖および第二鎖は工程（d）より前に解離されており、第三プライマーのうち少なくともあるものは第二鎖とハイブリッド化して伸長され、伸長された増幅生成物を生成する請求項１の方法。 18．各工程が生成物を単離または精製することなく順次行われることを特徴とする特許請求項１項の方法。 19．各工程が単一反応容器中で行われる請求項18の方法。 20．第一プライマーの５'末端がリン酸チオエート基からなる請求項１の方法。 21．第二プライマーの３'末端がアラビノシルヌクレオチドからなる請求項１の方法。 22．核酸または核酸混合物に含まれている標的核酸配列の変異または対立遺伝子を酵素的に検出する方法であって、ａ）標的核酸配列を選択する工程、ｂ）標的核酸配列第一末端の第一セグメントに実質上相補的な第一プライマー、前記標的核酸配列第二末端の第二セグメントに実質上相補的であってその３'末端が第一プライマーの５'末端に隣接している第二プライマー、および前記標的核酸配列の第一末端に類似しており、前記第一プライマーの少なくとも一部と実質上相補的な第三プライマーとからなるプライマー群であって、それらプライマーの一つが二以上の異なるオリゴヌクレオチドからなり、当該オリゴヌクレオチドの一つが前記標的核酸配列と正確に相補的の配列をもっており、各オリゴヌクレオチドが異なるマーカーで標識されている、プライマー群を供給する工程、ｃ）少なくとも四つの異なるヌクレオチド塩基を供給する工程、ｄ）前記第一および第二プライマーと標的核酸配列とを標的依存的にハイブリッド化してプライマー/標的複合体を生成する工程、ｅ）隣接する第一プライマーの５'末端と第二プライマーの３'末端とが連結する条件で連結を行い、前記標的核酸配列に実質上相補的な融合増幅生成物を生成する工程、ｆ）前記融合増幅生成物を標的核酸配列から解離させる工程、ｇ）前記第三プライマーと融合増幅生成物をハイブリッド化する工程、ｈ）伸長された増幅生成物が前記融合増幅生成物と実質上相補的になる条件で、前記ヌクレオチド塩基の存在下、第三プライマーを伸長する工程、ｉ）場合により、融合増幅生成物から、伸長された増幅生成物を解離させる工程、およびｊ）前記融合増幅生成物または前記伸長された増幅生成物にどの標識プライマーが含まれているかを決定することによって、変異または対立遺伝子が存在するかどうかを検出する工程からなる検出方法。 23．核酸または核酸混合物に含まれている標的核酸配列を酵素的に増幅する方法であって、ａ）標的核酸配列を選択する工程、ｂ）標的核酸配列第一末端の第一セグメントに実質上相補的な第一プライマー、標的核酸配列第二末端の第二セグメントに実質上相補的であってその第二セグメントが多くのヌクレオチドによって前記第一セグメントから間隔をおいている第二プライマー、および標的核酸配列第一末端に類似しており、前記第一プライマーの少なくとも一部と実質上相補的な第三プライマーとからなるプライマー群を供給する工程、ｃ）少なくとも四つの異なるヌクレオチド塩基を供給する工程、ｄ）前記第一および第二プライマーと標的核酸配列とを標的依存的にハイブリッド化してプライマー/標的複合体を生成する工程、ｅ）伸長された第二プライマーの３'末端が第一プライマーの５'末端に隣接する塩基で終わる伸長された第二プライマが生成する条件で、ヌクレオチド塩基の存在下、第二プライマーの３'末端を伸長する工程、ｆ）前記第一プライマーおよび前記伸長された第二プライマーが前記標的核酸配列に実質上相補的な融合増幅生成物を生成する条件で、第一および伸長された第二プライマーの末端を連結する工程、ｇ）前記融合増幅生成物を標的核酸配列から解離させる工程、ｈ）前記第三プライマーと前記融合増幅生成物をハイブリッド化する工程、ｉ）伸長された増幅生成物が前記融合増幅生成物と実質上相補的になる条件で、ヌクレオチド塩基の存在下、第三プライマーを伸長する工程、およびｊ）場合により、融合増幅生成物から、伸長された増幅生成物を解離させて標的配列を増幅する工程、からなる増幅方法。 24．工程（d）ないし（j）を少なくとも一回反復する請求項23の方法。 25．標的核酸が第一鎖および第二鎖からなる二本鎖核酸であり、前記第一および第二プライマーは実質上第一鎖に相補的であり、前記第三プライマーは実質上前記第二鎖に相補的であり、前記第一鎖および第二鎖は工程（d）より前に解離されており、第三プライマーのうち少なくともあるものは第二鎖とハイブリッド化して伸長され、伸長された増幅生成物を生成する請求項23の方法。 26．さらに第四プライマーを含んでおり、その第四プライマーは前記第二標的核酸鎖に実質上相補的であり、また第四プライマーは前記第二プライマーに実質上相補的であり、第三プライマーが第四プライマーの３'末端まで伸びていてこれと連結されている請求項25の方法。 27．核酸が加熱により変性されている請求項26の方法。 28．核酸がDNAである請求項23の方法。 29．核酸がRNAである請求項23の方法。 30．工程（f）が連結酵素の存在下で行われる請求項23の方法。 31．連結酵素がT4DNAリガーゼである請求項30の方法。 32．連結酵素が０ないし95℃で安定である請求項30の方法。 33．連結酵素が、アンプリガーゼ、TaqリガーゼおよびPfuリガーゼからなる群より選ばれる請求項32の方法。 34．工程（e）および（i）がポリメラーゼの存在下で行われる請求項23の方法。 35．工程（e）および（i）が、大腸菌DNAポリメラーゼＩ、大腸菌DNAポリメラーゼＩのKlenow断片およびT4DNAポリメラーゼからなる群より選ばれたポリメラーゼの存在下で行われる請求項34の方法。 36．工程（e）および（i）が０ないし95℃で安定なポリメラーゼの存在下で行われるこ請求項34の方法。 37．ポリメラーゼが、TaqDNAポリメラーゼおよびAmpliTaq Stoffel断片DNAポリメラーゼからなる群より選ばれる請求項36の方法。 38．標的核酸配列が、遺伝病を引き起こす少なくとも一つの欠失または変異を含む請求項23の方法。 39．標的核酸配列が病原性生物、ウィルスまたは腫瘍遺伝子に含まれている請求項23の方法。 40．前記プライマーの一つが二以上のオリゴヌクレオチドからなり、当該オリゴヌクレオチドの一つは前記標的核酸と正確に相補的な配列をもっている請求項23 の方法。 41．生成物を単離または精製することなく、各工程が順次行われることを特徴とする特許請求項23項の方法。 42．各工程が単一の反応容器中で行われる請求項41の方法。 43．第一プライマーの５'末端がリン酸チオエート基からなる請求項23の方法。 44．第四プライマーの５'末端がリン酸チオエート基からなる請求項26の方法。 45．核酸または核酸混合物に含まれている標的核酸配列の変異または対立遺伝子を酵素的に検出する方法であって、ａ）標的核酸配列を選択する工程、ｂ）標的核酸配列第一末端の第一セグメントに実質上相補的な第一プライマー、標的核酸配列第二末端の第二セグメントに実質上相補的であってその第二セグメントが前記第一セグメントから間隔をおいて配置されている第二プライマー、および標的核酸配列第一末端に類似しており、第一プライマーの少なくとも一部と実質上相補的な第三プライマーとからなるプライマー群であって、それらプライマーの一つが二以上の異なるオリゴヌクレオチドからなり、当該オリゴヌクレオチドの一つは前記標的核酸配列と正確に相補的な配列をもっており、各オリゴヌクレオチドが異なるマーカーで標識されている、プライマー群を供給する工程、ｃ）少なくとも四つの異なるヌクレオチド塩基を供給する工程、ｄ）前記第一および第二プライマーと標的核酸配列とを標的依存的にハイブリッド化してプライマー/標的複合体を生成する工程、ｅ）伸長された第二プライマーの３'末端が第一プライマーの５'末端と隣接する伸長された第二プライマーが生成する条件で、ヌクレオチド塩基の存在下、第二プライマーの３'末端を伸長する工程、ｆ）前記第一プライマーおよび前記伸長された第二プライマーが前記標的核酸配列に相補的な融合増幅生成物を生成する条件で、第一および第二プライマーの末端を連結する工程、ｇ）前記融合増幅生成物を標的核酸配列から解離する工程、ｈ）前記第三プライマーを前記融合増幅生成物とハイブリッド化する工程、ｉ）伸長された増幅生成物が前記融合増幅生成物と相補的になる条件で、ヌクレオチド塩基の存在下、第三プライマーを伸長する工程、ｊ）場合により、融合増幅生成物から、伸長された増幅生成物を解離する工程、およびｋ）融合増幅生成物または伸長された増幅生成物にどの標識プライマーが含まれているかを決定することによって変異または対立遺伝子が存在するかどうかを検出する工程からなる検出方法。 46．核酸または核酸混合物に含まれる少なくとも一つの標的核酸配列を増幅するキットであって、ａ．第一、第二および第三プライマー、場合により第四プライマー、ｂ．連結酵素、ｃ．重合酵素、およびｄ．少なくとも四つの異なるヌクレオチドからなるキット。 47．さらにｅ．前記プライマーの一つに付された検出可能なマーカーを含む請求項46のキット。 48．さらにｅ．連結および重合反応に適した緩衝液を含む請求項46のキット。 49．DNA源が植物、動物、昆虫および微生物からなる群より選ばれる請求項４の方法。 50．RNA源が植物、動物、昆虫および微生物からなる群より選ばれる請求項５の方法。 51．DNA源が植物、動物、昆虫および微生物からなる群より選ばれる請求項28の方法。 52．RNA源が植物、動物、昆虫および微生物からなる群より選ばれる請求項29の方法。