JP2022540268A - 固体支持体上で固定化されたｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９を使用する核酸シークエンシングライブラリを調製するための組成物及び方法 - Google Patents

固体支持体上で固定化されたｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９を使用する核酸シークエンシングライブラリを調製するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

表面上にランダムに断片化された二本鎖標的核酸断片の固定化ライブラリを生成するために、固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を使用するための方法及び組成物が提示される。本方法は、超並列核酸シークエンシングを含む様々なプロセスで使用するための核酸断片を生成するために有用である。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年７月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８７３，６０９号の優先権の利益を主張し、この出願は、参照によりその全体が任意の目的のために本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本出願は、固体支持体上に固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を使用して、ランダムに断片化された二本鎖核酸断片のライブラリ、固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を含む固体支持体、及び関連する組成物を生成するための方法に関する。ランダムに断片化された二本鎖核酸断片の固定化ライブラリは、例えば、ハイスループット、超並列及び／又はマルチプレックス核酸シークエンシングを含む様々な用途のための鋳型として有用である。
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的分子などの標的二本鎖核酸標的分子からランダムに断片化された核酸分子のライブラリを生成することが望ましい、様々な方法及び用途が存在する。多くの場合、この目的は、核酸シークエンシング反応において鋳型として使用するためのより大きな二本鎖核酸分子から、より小さい核酸分子（例えば、核酸断片）を生成することである。
次世代シークエンシングに使用するための二本鎖核酸の断片化及びタグ付けに現在使用されている方法の多くは、核酸を無駄にし、断片化のために高価な機器を必要とし、また、タグ付けされた核酸断片の断片化、タグ付け及びを回収の手順は、困難であり、面倒であり、手間がかかり、時間がかかり、非効率的であり、費用がかかり、比較的大量の試料核酸を必要とする。加えて、これらの方法の多くは、それらが生成された試料の核酸に含まれる配列を完全に表すものではない核酸断片を生成する。したがって、当該技術分野において必要とされるものは、標的二本鎖核酸からランダムに断片化された二本鎖核酸断片のライブラリを生成する際に、速度及び使用の容易さを提供する方法であり、次世代シークエンシング及び増幅法などの核酸分析方法に容易に適用することができる方法である。
本明細書によれば、本出願は、ランダムに断片化された、二本鎖核酸断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、（ａ）固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を上に有する固体支持体を提供することと、（ｂ）標的二本鎖核酸を、この標的二本鎖核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素によってランダムに断片化され、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が二本鎖核酸断片の少なくとも一方の鎖に結合する条件下で、固体支持体に適用し、それにより、ランダムに断片化された二本鎖核酸断片の固定化ライブラリを生成することと、を含む、方法を記載する。
いくつかの実施形態では、標的二本鎖核酸は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを含む。いくつかの実施形態では、標的二本鎖核酸は、ｄｓＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は、非配列特異的様式でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を標的二本鎖核酸に結合するように誘導する第１のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、固体支持体に固定化されている。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、非配列特異的様式で標的核酸に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分とを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、（ＧＣ）ｎ又は（ＡＴ）ｎを含み、ｎは５～２０、１０～１５、又は１０である。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１０～４０、１５～３５、又は１７～２０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドはビオチン化され、固体支持体は、１つ以上のビオチン結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ビオチン結合タンパク質は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体、ビオチン受容体、及び／又はビオチン結合酵素を含む。いくつかの実施形態では、ビオチン結合酵素は、ビオチニダーゼ又はビオチンホロカルボキシラーゼ合成酵素を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、固体支持体を、二本鎖核酸断片がその上に固定化された状態で洗浄して、任意の非結合核酸を除去することを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、固体表面上に固定化された二本鎖核酸断片を増幅することを含む。いくつかの実施形態では、増幅することは、ポリメラーゼ及び第１のポリヌクレオチドの一部に対応する増幅プライマを提供することを含む。
いくつかの実施形態では、標的二本鎖核酸を固体支持体に適用することは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の核酸結合特異性を低下させる１つ以上の試薬で処理することを含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬は、ベタイン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、エチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、及び／又はスルファラン（sulphalane）を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の酵素の密度で固体支持体上に存在する。
いくつかの実施形態では、固定化ライブラリ中の二本鎖核酸断片の長さは、固体支持体上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の密度に比例する。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、微小粒子、パターン化表面、又はウェルを含む。いくつかの実施形態では、微小粒子は、ビーズである。
いくつかの実施形態では、本方法は、（ｃ）二本鎖核酸断片の固定化ライブラリの少なくとも一部に挿入色素を適用して、染色された固定化断片のセットを得ることと、染色された固定化断片の画像を得ることと、を含む。
いくつかの実施形態では、標的二本鎖核酸を適用することは、生体試料を固体支持体に添加することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、細胞溶解物を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、全細胞を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、血液、血漿、血清、リンパ液、粘液、痰、尿、精液、脳脊髄液、気管支吸引液、糞便、及び浸軟組織からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本方法は、二本鎖核酸断片をタグ付けすることを含む。
いくつかの実施形態では、二本鎖核酸断片は、第１のタグドメインを含む第１のタグでタグ付けされる。いくつかの実施形態では、第１のタグドメインは、クラスタ増幅のための領域を含む。いくつかの実施形態では、第１のタグドメインは、シークエンシング反応をプライミングするための領域を含む。
いくつかの態様では、本方法は、固定化された二本鎖核酸断片を、固体支持体から遊離させることを含む。いくつかの実施形態では、遊離させることは、固体支持体からのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の切断を含む。いくつかの実施形態では、遊離させることは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写増幅法（ＴＭＡ）、及び核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、又は他の増幅プロセスを実行することを含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、サプレッションＰＣＲを含む。いくつかの実施形態では、遊離させることは、光又は熱を適用することを含む。
本出願はまた、ランダムに断片化された、二本鎖核酸断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、（ａ）固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を上に有する固体支持体を提供することであって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、非配列特異的様式で標的核酸に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分と、を含む、ビオチン化された第１のポリヌクレオチドに結合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を含み、ビオチン化された第１のポリヌクレオチドが、固体支持体上のビオチン結合タンパク質に結合されている、提供することと、（ｂ）標的二本鎖核酸を、この標的二本鎖核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体によってランダムに断片化され、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が二本鎖核酸断片のうちの少なくとも一方の鎖と結合する条件下で、固体支持体に適用し、それにより、ランダムに断片化された二本鎖核酸断片の固定化ライブラリを生成することと、を含む、方法を記載する。
いくつかの実施形態では、ビオチン結合タンパク質は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体、ビオチン受容体、及び／又はビオチン結合酵素を含む。いくつかの実施形態では、ビオチン結合酵素は、ビオチニダーゼ又はビオチンホロカルボキシラーゼ合成酵素を含む。
いくつかの実施形態では、標的二本鎖核酸を固体支持体に適用することは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の核酸結合特異性を低下させる１つ以上の試薬で処理することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬は、ベタイン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、エチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、及び／又はスルファランを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、二本鎖核酸断片をタグ付けすることを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸断片は、第１のタグドメインを含む第１のタグでタグ付けされる。いくつかの実施形態では、第１のタグドメインは、クラスタ増幅のための領域を含む。いくつかの実施形態では、第１のタグドメインは、シークエンシング反応をプライミングするための領域を含む。
いくつかの態様では、本方法は、固定化された二本鎖核酸断片を、固体支持体から遊離させることを含む。いくつかの実施形態では、遊離させることは、固体支持体からのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の切断を含む。いくつかの実施形態では、遊離させることは、ＰＣＲ又は他の増幅プロセスを実行することを含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、サプレッションＰＣＲを含む。いくつかの実施形態では、遊離させることは、光又は熱を適用することを含む。
本出願はまた、本明細書に記載の方法に従って調製された固定化された二本鎖核酸断片のライブラリを上に有する固体支持体も記載する。
本出願はまた、固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を上に有する固体支持体であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が、標的二本鎖核酸をランダムに断片化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を含む、固体支持体も記載する。
いくつかの実施形態では、標的二本鎖核酸は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを含む。いくつかの実施形態では、標的二本鎖核酸は、ｄｓＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は、非配列特異的様式で標的二本鎖核酸を結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する第１のポリヌクレオチドに結合される。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、固体支持体に固定化されている。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、非配列特異的様式で標的核酸に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分とを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、（ＧＣ）ｎ又は（ＡＴ）ｎを含み、ｎは５～２０又は１０～１５である。いくつかの実施形態では、ｎは１０である。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１０～４０又は１５～３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１７又は２０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドはビオチン化され、固体支持体はビオチン結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ビオチン結合タンパク質は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体、ビオチン受容体、及び／又はビオチン結合酵素を含む。いくつかの実施形態では、ビオチン結合酵素は、ビオチニダーゼ又はビオチンホロカルボキシラーゼ合成酵素を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の酵素の密度で固体支持体上に存在する。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、微小粒子、パターン化表面、又はウェルを含む。いくつかの実施形態では、微小粒子は、ビーズである。
本出願はまた、本明細書に記載の固体支持体と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の核酸結合特異性を低下させる１つ以上の試薬と、を含む組成物も記載する。いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬は、ベタイン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、エチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、及び／又はスルファランを含む。
本出願はまた、固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を上に有する固体支持体であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、非配列特異的様式で標的二本鎖核酸に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分と、を含む、ビオチン化された第１のポリヌクレオチドに結合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を含み、ビオチン化された第１のポリヌクレオチドが、固体支持体上のビオチン結合タンパク質に結合されている、固体支持体を記載する。
いくつかの実施形態では、ビオチン結合タンパク質は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体、ビオチン受容体、及び／又はビオチン結合酵素を含む。いくつかの実施形態では、ビオチン結合酵素は、ビオチニダーゼ又はビオチンホロカルボキシラーゼ合成酵素を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６個の複合体の密度で固体支持体上に存在する。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、微小粒子、パターン化表面、又はウェルを含む。いくつかの実施形態では、微小粒子は、ビーズである。
本出願はまた、本明細書に記載の固体支持体と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の核酸結合特異性を低下させる１つ以上の試薬と、を含む組成物も記載する。いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬は、ベタイン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、エチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、及び／又はスルファランを含む。
追加の目的及び利点は、以下の説明において部分的に記載され、一部は説明から明白であるか、又は実践によって習得され得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせによって実現及び達成されるであろう。
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明はいずれも例示的かつ説明的なものであり、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、一実施形態を示し、説明と共に本明細書に記載される原理を説明する役割を果たす。
本発明の一実施形態を示す。この実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、表面上に固定化されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｃａｓ９）酵素と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分及び一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分を含むビオチン化ポリヌクレオチドと、を有する。標的二本鎖核酸は固体支持体に適用され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体によってランダムに断片化され、二本鎖核酸断片は、表面上に固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体に結合される。核酸断片のサイズは、表面上に固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素間の距離に依存する。
核酸試料を配列決定するための現在のプロトコルは、ＤＮＡ、若しくはＲＮＡなどの核酸、又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドなどの核酸を鋳型ライブラリに変換する試料調製プロセスを日常的に採用する。これらの方法は、核酸試料の損失をもたらし、多くの場合、断片化のために高価な機器を必要とする場合が多い。加えて、試料調製方法は、多くの場合、困難であり、面倒であり、非効率的である。
標準的な試料調製方法では、各鋳型は、インサートのいずれかの端部にアダプタを含み、多くの場合、核酸を修飾することにも修飾反応の目的の生成物の精製することにも多くの工程が必要とされる。これらの工程は、適合した断片をフローセルに添加する前に溶液中で実行され、それらは、表面に共有結合したプライマの末端にハイブリダイズされた断片をコピーするプライマ伸長反応によって表面に結合される。次いで、これらの「シーディング（seeding）」鋳型は、数回の増幅サイクルを経てコピーされた鋳型のモノクローナルクラスタを生じさせる。
ＤＮＡなどの標的二本鎖核酸を、クラスタ形成及びシークエンシングの準備が整った溶液中でランダムに断片化された二本鎖核酸断片に変換するために必要とされる工程の数は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を介した断片化を使用することで最小限に抑えることができる。任意の非結合核酸を除去するための精製工程に続いて、ＰＣＲによって核酸断片の末端に追加の配列が付加される。
溶液ベースの断片化には欠点があり、いくつかの手間を要する工程を必要とする。加えて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅工程中に偏り（bias）が導入される可能性がある。本明細書に提示される方法及び組成物は、これらの欠点を克服し、試料操作又は移動の必要が最小限に抑えられた、単一の固体支持体上で偏りのない試料調製、クラスタ形成及びシークエンシングを行うことを可能にする。
本開示は、フローセルなどの固体支持体の表面に予め結合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素が、固体支持体上で無傷の標的核酸を効果的にランダムに断片化し、固定化する条件下で使用できるという驚くべき発見に関する。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を含む１つ以上の鎖が、その５’末端を介して固体支持体の表面に付着している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素はまた、後続のクラスタ生成及びシークエンシングを可能にする配列を含有する複合体内に包含され得る。
本明細書に提示される方法及び組成物は、溶液ベースの断片化方法及びよりランダムでない断片化方法に勝るいくつかの利点を提供する。例えば、精製された、部分的に精製された、又は未精製の無傷の標的核酸でさえ、事前の試料調製なしに、クラスタ生成のために固体支持体又はフローセルに直接装填することができる。加えて、元の無傷の核酸における配列情報の連続性（contiguity）は、固体支持体又はフローセルの表面上の断片の並置によって物理的に保存することができる。更なる利点として、核酸断片は、固体支持体又はフローセルの表面に物理的に連結されているため、核酸断片の更なる操作後の試薬の精製は、例えば、フローセルチャネルにおけるフロースルー緩衝液交換によって達成することができる。
更に、標的二本鎖核酸の改善されたランダムな断片化により、ランダムに断片化された二本鎖核酸断片のライブラリが、元の試料をより良好に表すことを可能にする。
Ｉ．固体支持体上のランダムな断片化
上記に従って、本明細書では、ランダムに断片化された二本鎖核酸断片の固定化ライブラリを調製する方法、及びそのような方法に従って調製された、固定化された二本鎖核酸断片のライブラリを上に有する固体支持体が提示される。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を上に有する固体支持体を提供することと、（ｂ）標的二本鎖核酸を、この標的二本鎖核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素によってランダムに断片化され、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が二本鎖核酸断片の少なくとも一方の鎖に結合する条件下で、固体支持体に適用し、それにより、ランダムに断片化された二本鎖核酸断片の固定化ライブラリを生成することと、を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は、固体支持体上に直接固定化される。
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を上に有する固体支持体を提供することであって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、非配列特異的様式で標的二本鎖核酸に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分と、を含む、ビオチン化された第１のポリヌクレオチドに結合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を含み、ビオチン化された第１のポリヌクレオチドが、固体支持体上のビオチン結合タンパク質に結合されている、提供することと、（ｂ）標的二本鎖核酸を、この標的二本鎖核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体によってランダムに断片化され、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が二本鎖核酸断片のうちの少なくとも一方の鎖と結合する条件下で、固体支持体に適用し、それにより、ランダムに断片化された二本鎖核酸断片の固定化ライブラリを生成することと、を含む、方法を記載する。
本明細書で使用する場合、用語「ランダムに断片化された」は、ランダムな様式での標的核酸の断片化を指し、様々な断片（例えば、配列の観点からランダムな位置での断片化によって生成された断片）を生成することを指す。いくつかの実施形態では、標的核酸は、非配列特異的様式でランダムに断片化されて、様々な断片同一性を生成する。断片化は、ＤＮＡの投入量に関係なく、正規化された生成物量及び断片サイズの両方の観点から制御可能である（すなわち、制御可能なサイズ選択）。例えば、図１に示されるように、固体支持体上の隣接するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素間の距離は、固体支持体の表面上に固定化される断片のサイズ範囲を決定することができる。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列特異的様式で断片化される。例えば、以下で論じられるように、同じ固体支持体上の２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素複合体は、標的核酸の関心対象の領域に隣接する１対のｓｇＲＮＡを含むことができる。このような実施形態では、ｓｇＲＮＡの各対によって単一の断片が生成される。他の実施形態では、固体支持体（例えば、ビーズ）の集団が使用され、固体支持体の集団における各固体支持体は、異なる対のｓｇＲＮＡを担持することができる。このようにして、異なる固体支持体は、標的核酸中の異なる配列を標的とする。いくつかの実施形態では、異なるｓｇＲＮＡ対はゲノム中の異なる標的配列を標的とする。これらの方法は、マルチプレックス標的化を可能にする。
本明細書で使用するとき、用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素」は、概して、クラスタ化され、規則的に間隔を置いた短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質－９ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）酵素を指す。Ｃａｓ９は、Ｃｓｎ１としても既知であり、２つのヌクレアーゼドメイン、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨヌクレアーゼドメインを含有するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質であり、これは、スモールＲＮＡによってプログラムされて、核酸（例えば、ＤＮＡ）を切断する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は、当業者に周知であり、例えば、米国特許出願公開第２０１９／０２０２８５６号の開示によって例示され、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）、ストレプトコッカス・パスツリアヌス（Streptococcus pasteurianus）（ＳｐａＣａｓ９）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｃａｓ９（ＦｎＣａｓ９）、又はナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）Ｃａｓ９（ＮｃＣａｓ９）から誘導することができる。核酸を切断することが知られているＣａｓ９の更なる変異体は、当業者に既知であり、野生型又は天然に存在するＣａｓ９及び変異体又は修飾されたＣａｓ９（例えば、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ）を含む。標的核酸を断片化又は切断することができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素が標的ＤＮＡをランダムに断片化又は切断することができる条件下で、本発明で使用することができることが理解されるであろう。
本明細書で使用する場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素複合体」は、一般に、非配列特異的又は配列特異的様式で標的二本鎖核酸に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する第１のポリヌクレオチドに結合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を指す。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、固体支持体に固定化されている。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、非配列特異的又は配列特異的様式で標的核酸に結合するようにＣＲＩＳＰＲ．／Ｃａｓ９酵素を誘導する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分と、を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドはビオチン化され、固体支持体は、１つ以上のビオチン結合タンパク質を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、非配列特異的又は配列特異的様式で標的核酸に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分と、を含む、ビオチン化された第１のポリヌクレオチドに結合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を含むことができ、ビオチン化された第１のポリヌクレオチドが、固体支持体上のビオチン結合タンパク質に結合されている。
本明細書で使用する場合、用語「二本鎖核酸」は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを指す。いくつかの実施形態では、標的二本鎖核酸は、ｄｓＤＮＡである。用語「ＤＮＡ」は、標的二本鎖核酸分子と関連して本開示全体を通して使用されるが、任意の好適な核酸又は核酸類似体をランダムに断片化することができることを理解されたい。
用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素と複合体を形成するのに必要なヌクレオチド配列（「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列」）のみを示す二本鎖核酸を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素と機能的複合体を形成するのに好適な任意の核酸又は核酸類似体を含むことができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾塩基、非天然塩基、修飾骨格を含むことができ、一方又は両方の鎖にニックを含むことができる。
本明細書で使用する場合、用語「タグ」及び「タグドメイン」は、所望の意図された目的又は用途のための配列を示すポリヌクレオチドの部分又はドメインを指す。タグドメインは、任意の所望の目的のために提供される任意の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、タグは、ユニバーサル配列、プライマ配列、インデックス配列、キャプチャ配列、バーコード配列（例えば、計数又はエラー補正のために使用される）、切断配列、シークエンシング関連配列、富化のための配列、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の機能的配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、タグドメインは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、クラスタ増幅反応のためのプライマとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、シークエンシング反応のためのプライマとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。任意の他の好適な特徴がタグドメインに組み込まれ得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、タグドメインは、５～２００ｂｐの間の長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、１０～１００ｂｐの間の長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、２０～５０ｂｐの間の長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０及び２００ｂｐの間の長さを有する配列を含む。
本明細書に提示される方法及び組成物では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は、１つ以上のポリヌクレオチドを介して支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドなどの１つ以上のポリヌクレオチドは、非配列特異的様式で標的二本鎖核酸に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する（すなわち、標的二本鎖核酸をランダムに断片化又は切断するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する条件）。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、配列特異的な様式で標的二本鎖核酸に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導し、断片化は、固体支持体の集団であって、各固体支持体が、標的核酸中の関心対象の配列の３’に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する第１のポリヌクレオチドを含む第１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体と、標的核酸中の関心対象の配列の５’に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する第２のポリヌクレオチドを含む第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体と、を含む、固体支持体の集団、を使用して達成される。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、固体支持体に固定化されている。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、固体支持体に直接、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を結合するリンカー分子を介して固定化され得るようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を誘導する一本鎖ガイドＲＮＡを含む５’部分を含む。
本明細書で使用する場合、用語「一本鎖ガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」は、関心対象の標的二本鎖核酸中の標的配列にハイブリダイズすることができる一本鎖ＲＮＡを指す。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素及び標的配列（すなわち、プロトスペーサー配列）と相互作用し、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を標的配列にガイドし、その部位でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素が標的配列を切断する。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素が非配列特異的様式で誘導される場合、標的配列は、配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接することを除いて、配列制限を有さない。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列としては、５’－ＮＧＧ、５’－ＮＧＧＮＧ、５’－ＮＮＡＧＡＡＷ、及び５’－ＡＣＡＹが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素が、配列特異的様式で誘導される場合、標的配列は配列制限を有する。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素がランダムな様式で核酸を切断して様々な断片サイズを生成するように、非配列特異的様式でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を誘導するｓｇＲＮＡが選択される。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１０～４０ヌクレオチド、１５～３０ヌクレオチド、又は１７又は２０ヌクレオチドである。ｓｇＲＮＡの例としては、（ＧＣ）ｎ又は（ＡＴ）ｎの短いランダム性又は配列（式中、ｎは５～２０、８～１５、又は１０である）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、ｓｇＲＮＡ設計及び構築に精通しており、例えば、ｓｇＲＮＡ設計ツールがインターネット上又は商業的供給源から入手可能である。ｓｇＲＮＡは、化学的に合成されてもよく、酵素的に合成されてもよく、又はこれらの組み合わせであってもよい。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは「ビオチン化」され、固体支持体は、１つ以上のビオチン結合タンパク質を含む。本明細書で使用するとき、用語「ビオチン化」は、ビオチンを共有結合させるプロセスを指す。ビオチン結合タンパク質は、当業者に周知であり、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体、ビオチン受容体、及びビオチン結合酵素、例えばビオチニダーゼ、ビオチンホロカルボキシラーゼ合成酵素などが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などの核酸結合酵素の核酸結合特異性を低下させる１つ以上の試薬は、単独で、又はｓｇＲＮＡと組み合わせて使用されてもよい（すなわち、標的二本鎖核酸をランダムに断片化又は切断するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する別の条件）。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は、１つ以上の試薬で処理されてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の核酸結合特異性を低下させ、処理された固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を上に有する固体支持体に標的二本鎖核酸が適用されるときにランダムな断片を誘導する。結合特異性を低下させる試薬は、当業者に周知である。結合特異性低減剤の例としては、ベタイン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、エチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、及び／又はスルファラン（sulphalane）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、標的二本鎖核酸をランダムに断片化又は切断するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する条件は、他の条件に加えて、又はその代わりに、高グリセロール濃度（例えば、＞５％ｖ／ｖ）の使用、高濃度のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素／ＤＮＡのμｇ（例えば、１００単位／μｇ）の最適でない緩衝液（例えば、最適でないイオン強度若しくはｐＨを有する）の使用、長時間の反応時間、及び／又はＭｇ２＋以外の二価カチオンの使用（例えば、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、及び／又はＺｎ２＋）を含み得る。
分子（例えば、核酸）の固体支持体への固定化に言及する場合、用語「固定化された」、及び「付着された」は、本明細書では互換的に使用され、両方の用語は、明示的に又は文脈によって別段指示されない限り、直接的又は間接的、共有結合、又は非共有結合を包含することが意図される。本開示のある特定の実施形態では、共有結合が好ましい場合があるが、一般的に、必要とされるのは、例えば核酸増幅及び／又はシークエンシングを必要とする用途において、支持体を使用することが意図される条件下で、分子（例えば、核酸）が、支持体に固定化されたままであるか又は付着したままであるということである。
本開示の特定の実施形態は、例えば、ポリヌクレオチドなどの生体分子への共有結合を可能にする反応基を含む中間材料の層又はコーティングの適用によって「機能化」された不活性基材又はマトリックス（例えば、ガラススライド、ポリマービーズなど）から構成される固体支持体を利用することができる。このような支持体の例としては、ガラスなどの不活性基材上に支持されるポリアクリルアミドヒドロゲル、特に国際公開第２００５／０６５８１４号及び米国特許出願公開第２００８／０２８０７７３号に記載されているポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これらに限定されず、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このような実施形態では、生体分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、中間材料（例えば、ヒドロゲル）に直接共有結合できるが、中間材料は、それ自体が基材又はマトリックス（例えば、ガラス基材）に非共有結合してもよい。用語「固体支持体への共有結合」は、このタイプの配列を包含するように適宜解釈されるべきである。
用語「固体表面」、「固体支持体」、及び他の文法的均等物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体の付着に適切であるか、又は適切であるように改変され得る任意の材料を指す。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズなどの微小粒子、パターン化表面、又はウェルを含む。当該技術分野において理解されるように、可能な基材の数は非常に多い。可能な基材としては、ガラス及び変性又は機能化ガラス、プラスチック（例えば、アクリル、ポリスチレン、並びにスチレン及び他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（商標）など）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース、セラミックス、樹脂、シリカ、又はシリコン及び変性シリコンを含むシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバ束、並びに様々な他のポリマーを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、特に有用な固体支持体及び固体表面は、フローセル装置内に配置される。例示的なフローセルは、以下に更に詳細に示される。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、規則的なパターンでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体の固定に好適なパターン化された表面を含む。「パターン化された表面」は、固体支持体の露出層内又はその上の異なる領域の配置を指す。例えば、１つ以上の領域は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体が存在する特徴であり得る。この特徴は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体が存在しない間質領域によって分離され得る。いくつかの実施形態では、パターンは、行及び列にある特徴のｘ－ｙフォーマットであり得る。いくつかの実施形態では、パターンは、特徴及び／又は間質領域の反復配列であり得る。いくつかの実施態様では、パターンは、特徴及び／又は間質領域のランダム配列であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体は、固体支持体上にランダムに分布している。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体は、パターン化された表面上に分布している。本明細書に記載される方法及び組成物において使用することができる例示的なパターン化表面は、米国特許出願公開第２０１２／０３１６０８６（Ａ１）号及び同第２０１３／０１１６１５３（Ａ１）号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面にウェル又は窪みのアレイを含む。これは、フォトリソグラフィー、スタンピング技術、成形技術、及びマイクロエッチング技術を含むがこれらに限定されない様々な技術を使用して、技術分野において一般的に知られているように製造することができる。技術分野において理解されるように、使用される技術は、アレイ基板の組成及び形状に依存する。
固体支持体の組成及び幾何学的形状は、その使用によって異なり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、スライド、チップ、マイクロチップ及び／又はアレイなどの平面構造である。したがって、基材の表面は、平面層の形態であり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、フローセルの１つ以上の表面を含む。本明細書で使用するとき、用語「フローセル」は、１つ又はそれ以上の流体試薬を流通させることができる固体表面を含むチャンバを指す。本開示の方法において容易に使用することができるフローセル及び関連する流体システム及び検出プラットフォームの例は、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、国際公開第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，２１１，４１４号、米国特許第７，３１５，０１９号、米国特許第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、固体支持体又はその表面は、管又は容器の内側又は外側表面などの非平面である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ミクロスフェア又はビーズを含む。本明細書における「ミクロスフェア」又は「ビーズ」又は「粒子」又は文法的均等物は、小さな離散粒子を意味する。好適なビーズ組成物としては、プラスチック、セラミックス、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル（thoria sol）、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス、又はセファロースなどの架橋デキストラン、セルロース、ナイロン、架橋ミセル、及びテフロン（商標）が挙げられるが、これらに限定されず、並びに固体支持体について本明細書に概説される任意の他の材料を全て使用することができる。Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｄ．の「Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ」は、有用なガイドである。特定の実施形態では、ミクロスフェアは、磁気ミクロスフェア又はビーズである。
ビーズは球状である必要はない。不規則な粒子を使用してもよい。代替的に又はそれに加えて、ビーズは多孔質であってもよい。ビーズサイズは、ナノメートル、すなわち、１００ｎｍ～ミリメートル、すなわち、１ｍｍの範囲であり、ビーズは約０．２ミクロン～約２００ミクロンが好ましく、約０．５～約５ミクロンが特に好ましいが、いくつかの実施形態では、より小さい又はより大きいビーズが使用されてもよい。
図１は、概して、一実施形態による方法を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、表面上に固定化される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素（「Ｃａｓ９」）と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分とを含むビオチン化ポリヌクレオチドを有する。標的二本鎖核酸は固体支持体に適用され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体によってランダムに断片化され、二本鎖核酸断片は、表面上に固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体に結合される。核酸断片のサイズは、表面上に固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素間の距離に依存する。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５個の複合体、又は少なくとも１０６個の複合体の密度で固体支持体上に固定化される。
標的二本鎖核酸が固体支持体に適用されると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は、標的二本鎖核酸を断片化し、したがって、両末端で固体支持体の表面に結合されたランダムに断片化された二本鎖核酸断片を生成する。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸断片の長さは、表面上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又はこれらの複合体の密度を変化させることによって変化させることができる。いくつかの実施形態では、固定化ライブラリ中の二本鎖核酸断片の長さは、固体支持体上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体の密度に比例する。特定の実施形態では、得られる二本鎖核酸断片の長さは、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、２４００ｂｐ、２５００ｂｐ、２６００ｂｐ、２７００ｂｐ、２８００ｂｐ、２９００ｂｐ、３０００ｂｐ、３１００ｂｐ、３２００ｂｐ、３３００ｂｐ、３４００ｂｐ、３５００ｂｐ、３６００ｂｐ、３７００ｂｐ、３８００ｂｐ、３９００ｂｐ、４０００ｂｐ、４１００ｂｐ、４２００ｂｐ、４３００ｂｐ、４４００ｂｐ、４５００ｂｐ、４６００ｂｐ、４７００ｂｐ、４８００ｂｐ、４９００ｂｐ、５０００ｂｐ、１００００ｂｐ、３００００ｂｐ、又は１００，０００ｂｐ未満である。そのような実施形態では、次に、二本鎖核酸断片は、米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の開示によって例示されるように、標準的なクラスタ化学を使用して、クラスタ内に増幅され得、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、鋳型の長さは、標準的なクラスタ化学を使用して適切に増幅され得るものよりも長い。例えば、いくつかの実施形態では、鋳型の長さは、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、２４００ｂｐ、２５００ｂｐ、２６００ｂｐ、２７００ｂｐ、２８００ｂｐ、２９００ｂｐ、３０００ｂｐ、３１００ｂｐ、３２００ｂｐ、３３００ｂｐ、３４００ｂｐ、３５００ｂｐ、３６００ｂｐ、３７００ｂｐ、３８００ｂｐ、３９００ｂｐ、４０００ｂｐ、４１００ｂｐ、４２００ｂｐ、４３００ｂｐ、４４００ｂｐ、４５００ｂｐ、４６００ｂｐ、４７００ｂｐ、４８００ｂｐ、４９００ｂｐ、５０００ｂｐ、１００００ｂｐ、３００００ｂｐ、又は１００，０００ｂｐより長い。特定の実施形態では、鋳型の長さは、上で例示したものから選択される上限及び下限によって規定される範囲内であり得る。
特定の実施形態では、クラスタ生成の前に、固体支持体の表面上に固定化された二本鎖核酸断片を画像化することができる。例えば、二本鎖核酸断片の固定化ライブラリの少なくとも一部に挿入色素を適用して、染色された固定化断片のセットを得ることができ、これを画像化して、表面上の核酸分子の骨格の位置の記録を保存することができる。クラスタ生成及びシークエンシングに続いて、クラスタの座標は、元の骨格上のそれらの位置と関連付けることができ、したがって、分子及びゲノムアセンブリに沿ったリード（ｒｅａｄ）のアライメントを支援することができる。
いくつかの実施形態では、標的二本鎖核酸を適用することは、生体試料を固体支持体に添加することを含む。生体試料は、核酸を含み、断片化のために固体表面上に堆積させることができる任意の種類であり得る。例えば、試料は、精製核酸を含む様々な精製状態の核酸を含むことができる。しかしながら、試料は完全に精製される必要はなく、例えば、タンパク質と混合された核酸、他の核酸種、他の細胞成分、及び／又は任意の他の汚染物質を含むことができる。いくつかの実施形態では、生体試料は、ＤＮＡ、タンパク質、他の核酸種、他の細胞成分、及び／又はインビボで見られるものとほぼ同じ割合で存在する任意の他の汚染物質の混合物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、成分は、無傷細胞に見られるものと同じ割合で見出される。いくつかの実施形態では、生体試料は、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７未満又は０．６０未満の、２６０／２８０比を有する。いくつかの実施形態では、生体試料は、少なくとも２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７未満、又は少なくとも０．６０の、２６０／２８０比を有する。本明細書で提供される方法により、核酸を固体支持体に結合させることを可能にするため、任意の非結合核酸又は他の汚染物質は、表面に結合された断片化が生じた後に固体支持体を洗浄することだけで除去され得る。生体試料は、例えば、粗細胞溶解物又は全細胞を含み得る。例えば、本明細書に記載の方法において固体支持体に適用される粗細胞溶解物は、他の細胞成分から核酸を単離するために従来から使用している分離工程のうちの１つ以上が行われる必要はない。例示的な分離工程は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９、及びＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌに記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
したがって、いくつかの実施形態では、生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、粘液、痰、尿、精液、脳脊髄液、気管支吸引液、糞便、及びそれらの浸軟組織、若しくはそれらの溶解物、又は核酸を含む任意の他の生体標本を含み得る。本明細書に提示される方法及び組成物の１つの利点は、フローセルに生物学的試料を添加することができ、その後の溶解工程及び精製工程は、フローセルに必要な試薬を流すだけで、更なる移動又は取り扱い工程なしにフローセル内で全て生じ得ることである。
また、本明細書では、上記の方法に従って調製された、固定化されたタグ付き核酸断片のライブラリを上に有する固体支持体も提示される。
ＩＩ．固定化されたポリヌクレオチド分子の物理的マップ
また、本明細書では、固定化ポリヌクレオチドの物理的マップを生成する方法も提示される。本方法は、有利には、連結された配列（すなわち、同じ標的ポリヌクレオチド分子からの第１及び第２の部分）を含有する可能性が高いクラスタを同定に利用することができる。したがって、固定化されたポリヌクレオチドから得られる任意の２つのクラスタの相対的近接度は、２つのクラスタから得られる配列情報のアラインメントに有用な情報を提供する。具体的には、固体表面上の任意の２つの所与のクラスタ間の距離は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０２５２５０号により詳細に記載されるように、２つのクラスタが同じ標的ポリヌクレオチド分子に由来する確率と正に相関する。
一例として、いくつかの実施形態では、フローセルの表面上に伸張する長いｄｓＤＮＡ分子は、インサイチュで断片化され、フローセルの表面を横切って接続されたｄｓＤＮＡブリッジのラインが生じる。更に、固定化ＤＮＡの物理的マップを生成することができる。したがって、物理的マップは、固定化ＤＮＡが増幅された後のクラスタの物理的関係を相関させる。具体的には、物理的マップは、国際公開第２０１２／０２５２５０号の組み込まれた材料に記載されているように、任意の２つのクラスタから得られたシークエンスデータが連結される確率を計算する。
いくつかの実施形態では、物理的マップは、固体表面を横切る固定化された核酸分子の位置を確立するために核酸を画像化することによって生成される。いくつかの実施形態では、固定化された核酸は、イメージング剤を固体支持体に添加し、イメージング剤からシグナルを検出することによって画像化される。いくつかの実施形態では、イメージング剤は、検出可能な標識であってもよい。好適な検出可能な標識としては、プロトン、ハプテン、放射性核種、酵素、蛍光標識、化学発光標識、及び／又は発色剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、イメージング剤は、挿入色素又は非挿入核酸結合剤である。当該技術分野において既知の任意の好適な挿入色素又は非挿入核酸結合剤を使用することができ、これには、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０２８２６１７号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、固定化された二本鎖核酸断片は、クラスタ生成の前に自由末端を遊離させるように更に断片化される。ブリッジ構造の切断は、国際公開第２０１２／０２５２５０号の組み込まれた材料によって例示されるように、当該技術分野において既知の任意の好適な方法論を使用して実行することができる。例えば、切断は、国際公開第２０１２／０２５２５０号に記載されているようなウラシルなどの修飾ヌクレオチドの組み込みによって、制限エンドヌクレアーゼ部位の組み込みによって
又は、本明細書の他の場所で説明されているように、液相ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体をブリッジ核酸構造に適用することによって、起こり得る。
特定の実施形態では、複数の標的二本鎖核酸分子が、複数のナノチャネルを備えるフローセル上に流され、ナノチャネルは、それに固定化された複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体を有する。本明細書で使用するとき、用語「ナノチャネル」は、長い線状核酸分子が流入する狭いチャネルを指す。いくつかの実施形態では、標的核酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００個以下の又は１０００個以下の個々の長鎖の標的核酸が、各ナノチャネルに流入する。いくつかの実施形態では、個々のナノチャネルは、標的核酸の個々の長鎖が複数のナノチャネルと相互作用することを防止する物理的バリアによって分離される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、少なくとも１０、５０、１００、２００、５００、１０００、３０００、５０００、１００００、３００００、５００００、８００００個又は少なくとも１０００００個のナノチャネルを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネル表面に結合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体は、核酸を断片化する。次いで、連続マッピングは、例えば、これらのチャネルのうちの１つの長さに沿ってクラスタを追跡することによって実行することができる。いくつかの実施形態では、標的核酸の長鎖は、少なくとも０．１ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、４５０ｋｂ、５００ｋｂ、５５０ｋｂ、６００ｋｂ、６５０ｋｂ、７００ｋｂ、７５０ｋｂ、８００ｋｂ、８５０ｋｂ、９００ｋｂ、９５０ｋｂ、１０００ｋｂ、５０００ｋｂ、１００００ｋｂ、２００００ｋｂ、３００００ｋｂの長さ、又は少なくとも５００００ｋｂの長さであり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸の長鎖は、０．１ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、４５０ｋｂ、５００ｋｂ、５５０ｋｂ、６００ｋｂ、６５０ｋｂ、７００ｋｂ、７５０ｋｂ、８００ｋｂ、８５０ｋｂ、９００ｋｂ、９５０ｋｂ以下、又は１０００ｋｂ以下の長さである。一例として、ナノチャネル内にマッピングされた固定化された断片化生成物を含む１０００以上のナノチャネルを有するフローセルを使用して、短い「ポジショニングされた」リードで生物のゲノムを配列決定することができる。いくつかの実施形態では、ナノチャネル内にマッピングされた固定化された断片化生成物を使用して、ハプロタイプを解析することができる。いくつかの実施形態では、ナノチャネル内にマッピングされた固定化された断片化生成物を使用して、フェージング課題を解析することができる。
ＩＩＩ．固定化された核酸断片の増幅及びシークエンシング
増幅．本開示は更に、本明細書に提供される方法に従って生成される固定化された核酸断片の増幅に関する。表面に結合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を介した断片によって生成される固定化された核酸断片は、当技術分野において既知の任意の好適な増幅方法に従って増幅することができる。いくつかの実施形態では、固定化されたＤＮＡ断片は、固体支持体上で増幅される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面に結合された断片化が起こるもの同じ固体支持体である。このような実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、試料調製物が、最初の試料導入工程から、増幅まで、及び任意選択的にシークエンシング工程まで、同じ固体支持体上で進行することを可能にする。
例えば、いくつかの実施形態では、固定化された核酸断片は、米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の開示によって例示されるように、クラスタ増幅方法論を使用して増幅され、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の組み込まれている材料は、固定化された核酸分子のクラスタ又は「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅産物を固体支持体上に固定化することを可能にする固相核酸増幅の方法を記載する。そのようなアレイ上の各クラスタ又はコロニーは、複数の同一の固定化されたポリヌクレオチド鎖及び複数の同一の固定化された相補的ポリヌクレオチド鎖から形成される。そのように形成されたアレイは、本明細書では一般に「クラスタ化アレイ」と称される。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号に記載されているような固相増幅反応の生成物は、固定化されたポリポリヌクレオチド鎖と固定化された相補鎖の対をアニーリングすることによって形成されるいわゆる「ブリッジ（ｂｒｉｄｇｅｄ）」構造体であり、両方の鎖は、好ましくは共有結合を介して、５’末端で固体支持体上に固定化されている。クラスタ増幅法は、固定化された核酸鋳型を使用して固定化されたアンプリコンを生成する方法の例である。他の適切な方法論を使用して、本明細書で提供される方法に従って生成された固定化された核酸断片から固定化されたアンプリコンを生成することもできる。例えば、１つ以上のクラスタ又はコロニーは、増幅プライマの各対の一方又は両方のプライマが固定化されているかどうかに関わらず、固相ＰＣＲによって形成することができる。
他の実施形態では、固定化された核酸断片は、溶液中で増幅される。例えば、いくつかの実施形態では、固定化された核酸断片は、切断されるか、又は別の方法で固体支持体から遊離され、次いで増幅プライマは、溶液中で遊離分子にハイブリダイズされる。他の実施形態では、増幅プライマを、１つ以上の初期の増幅工程のために固定化された核酸断片にハイブリダイズさせ、その後溶液中の後続の増幅工程を行う。したがって、いくつかの実施形態では、固定化された核酸鋳型を使用して、液相アンプリコンを生成することができる。
本明細書に記載されるか、又は技術分野で一般的に公知の増幅方法論のいずれかを、ユニバーサル又は標的特異的プライマと共に利用して、核酸を増幅できることが理解されるであろう。増幅に適切な方法には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，００３，３５４号に記載されているように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写増幅法（ＴＭＡ）及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらに限定されない。上記の増幅方法を使用して、関心対象の１つ以上の核酸を増幅することができる。例えば、マルチプレックスＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどを含むＰＣＲを利用して、固定化された核酸断片を増幅することができる。いくつかの実施形態では、関心対象の核酸に特異的に向けられるプライマは、増幅反応に含まれる。
ポリヌクレオチドの増幅に好適な他の方法としては、オリゴヌクレオチド伸長及びライゲーション、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５－２３２（１９９８）、参照により本明細書に組み込まれる。）、及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（一般に米国特許第７，５８２，４２０号、同第５，１８５，２４３号、同第５，６７９，５２４号、及び同第５，５７３，９０７号、欧州特許第０ ３２０ ３０８（Ｂ１）号、欧州特許第０ ３３６ ７３１（Ｂ１）号、欧州特許第０ ４３９ １８２（Ｂ１）号、国際公開第９０／０１０６９号、国際公開第８９／１２６９６号、及び国際公開第８９／０９８３５号、その全てが参照により組み込まれる）技術、を挙げることができる。これらの増幅方法は、核酸を増幅するように設計され得ることが理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、増幅方法は、関心対象の核酸に特異的に向けられるプライマを含むライゲーションプローブ増幅又はオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応を含み得る。いくつかの実施形態では、増幅法は、関心対象の核酸に特異的に指向されるプライマを含有するプライマ伸長ライゲーション反応を含んでもよい。関心対象の核酸を増幅するように特別に設計することができるプライマ伸長及びライゲーションプライマの非限定的な例として、増幅は、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５８２，４２０号及び同第７，６１１，８６９号に例示されるようなＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に使用されるプライマを含み得る。
本開示の方法で使用され得る例示的な等温増幅法としては、例えばＤｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５２６１－６６（２００２）により例示される多置換増幅（ＭＤＡ）、又は例えば米国特許第６，２１４，５８７号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により例示される等温鎖置換核酸増幅が挙げられるが、これらに限定されない。本開示で使用され得る他の非ＰＣＲ系方法としては、例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５、米国特許第５，４５５，１６６号、及び同第５，１３０，２３８号、並びにＷａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１－９６（１９９２）に記載されている鎖置換増幅（ＳＤＡ）又は例えば、Ｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：２９４－３０７（２００３）に記載されている超分枝鎖置換増幅が挙げられ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、等温増幅法は、ゲノムＤＮＡのランダムプライマ増幅のために、鎖置換Ｐｈｉ ２９ポリメラーゼ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大型断片、５’→３’エキソ－と共に使用することができる。これらのポリメラーゼの使用は、それらの高い加工性及び鎖置換活性の利点を利用する。高い加工性により、ポリメラーゼは、１０－２０ｋｂの長さの断片を産生できる。上記のように、クレノウポリメラーゼなどの低いプロセッシビティと鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して、等温条件下でより小さな断片を生成することができる。増幅反応、条件及び成分の更なる説明は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６７０，８１０号の開示に詳細に記載されている。
本開示において有用な別の核酸増幅法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒｏｔｈｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（５）：１３２１－２（１９９３）に記載されているように、定常５’領域の後にランダム３’領域が続く２ドメインプライマの集団を使用するタグ付きＰＣＲである。増幅の最初のラウンドは、ランダムに合成された３’領域からの個々のハイブリダイゼーションに基づいて、熱変性された核酸上で多数の開始を可能にするために実施される。３’領域の性質により、開始部位はゲノム全体にランダムであると考えられる。その後、結合していないプライマを除去し、定常５’領域に相補的なプライマを使用して、更なる複製を行うことができる。
シークエンシング．本開示は更に、本明細書に提供される方法に従って生成される、固定化されたランダムに断片化された二本鎖核酸断片のシークエンシングに関する。表面に結合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を介した断片化によって生成された固定化された二本鎖核酸断片は、合成によるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、ナノポアシークエンシングなどの直接シークエンシングなどの任意の好適なシークエンシング法に従って配列決定することができる。いくつかの実施形態では、固定化された核酸断片は、固体支持体上で配列決定される。いくつかの実施形態では、シークエンシングのための固体支持体は、表面結合された断片化が起こるものと同じ固体支持体である。いくつかの実施形態では、シークエンシングのための固体支持体は、増幅が起こるのと同じ固体支持体である。いくつかの実施形態では、第１の固体支持体が断片化に使用され、第２の固体支持体が増幅及びシークエンシングに使用される。
１つのシークエンシング方法論は、合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）である。ＳＢＳでは、核酸鋳型（例えば標的核酸又はそのアンプリコン）に沿った核酸プライマの伸長を監視して、鋳型中のヌクレオチドの配列を決定する。基礎となる化学プロセスは、重合であり得る（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される場合￥）。特定のポリマーベースのＳＢＳの実施態様では、プライマに付加されるヌクレオチドの順序及び種類の検出を使用して鋳型の配列を決定することができるように、蛍光標識ヌクレオチドを鋳型依存的にプライマに付加する（それによってプライマを伸長させる）。
フローセルは、本開示の方法によって生成された、増幅された核酸断片を収容するための便利な固体支持体を提供する。そのようなフォーマットの１つ以上の増幅された核酸断片は、サイクル中に試薬を繰り返し送達することを含むＳＢＳ又は他の検出技術に供することができる。例えば、第１のＳＢＳサイクルを開始するために、１つ以上の標識されたヌクレオチド、核酸、ＤＮＡポリメラーゼなどを、１つ以上の増幅された核酸分子を収容するフローセルに流入／通過させることができる。プライマ伸長によって標識ヌクレオチドが組み込まれる部位を検出することができる。任意選択的に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマに付加されると、更なるプライマ伸長を終結する可逆的終結特性を更に含むことができる。例えば、可逆的ターミネータ部分を有するヌクレオチド類似体をプライマに付加して、デブロッキング剤が送達されてその部分を除去するまで、その後の伸長が起こらないようにすることができる。したがって、可逆的終端を使用する実施形態では、デブロッキング試薬をフローセルに送達することができる（検出発生の前又は後）。洗浄は、様々な送達工程の間に実施することができる。次に、サイクルをｎ回繰り返してプライマをｎ個のヌクレオチドで伸長し、それによって長さｎの配列を検出することができる。本開示の方法によって生成されるアンプリコンと共に使用するために容易に適合させることができる例示的なＳＢＳ手順、流体系及び検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、国際公開第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，２１１，４１４号、米国特許第７，３１５，０１９号、米国特許第７，４０５，２８１号、及び米国特許第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
パイロシークエンシングなどの、サイクル反応を使用する他の配列決定手順を使用することができる。パイロシークエンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に取り込まれる際の、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１），８４－９（１９９６）、Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１），３－１１（２００１）、Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５），３６３（１９９８）、米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許第６，２５８，５６８号、及び米国特許第６，２７４，３２０号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。パイロシークエンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に即座に変換されることで検出でき、生成されたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼ生成光子を介して検出することができる。したがって、配列決定反応は、発光検出システムを介して監視することができる。蛍光ベースの検出システムに使用される励起放射線源は、パイロシークエンシング手順には必要ない。本開示に従って生成されたアンプリコンへのパイロシークエンシングの適用に適合させることができる有用な流体システム、検出器、及び手順は、例えば国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／５７１１１号、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８（Ａ１）号、米国特許第７，５９５，８８３号、及び米国特許第７，２４４，５５９号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態は、核酸又はＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用を介して、又はゼロモード導波路（ＺＭＷ）を用いて検出することができる。ＦＲＥＴベースのシークエンシングのための技術及び試薬は、例えば、Ｌｅｖｅｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，６８２－６８６（２００３）；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６－１０２８（２００８）、Ｋｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５，１１７６－１１８１（２００８）に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかのＳＢＳ実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組み込み時に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づくシークエンシングは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ製品ラインで市販されている電気検出器及び関連技術、又は米国特許出願公開第２００９／００２６０８２（Ａ１）号、同第２００９／０１２７５８９（Ａ１）号、同第２０１０／０１３７１４３（Ａ１）号、若しくは同第２０１０／０２８２６１７号（Ａ１）に記載されているシークエンシング法及びシステムを使用でき、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。結合平衡除外を使用してターゲット核酸を増幅するための本明細書に記載の方法は、プロトンを検出するために使用される基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載の方法を使用して、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を産生することができる。
別の有用なシークエンシング技術は、ナノポアシークエンシングである（例えば、Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，１４７－１５１（２０００）、Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３５：８１７－８２５（２００２年）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２：６１１－６１５（２００３）を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかのナノポアの実施形態では、標的核酸又は標的核酸から除去された個々のヌクレオチドは、ナノポアを通過する。核酸又はヌクレオチドがナノポアを通過するとき、各ヌクレオチド種は、ポアの電気コンダクタンスの変動を測定することによって識別され得る（米国特許第７，００１，７９２号、Ｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３，１９９６－２００１（２００７）、Ｈｅａｌｙ，Ｎａｎｏｍｅｄ．２，４５９－４８１（２００７）、Ｃｏｃｋｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，８１８－８２０（２００８）、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
本開示による検出に適用することができるアレイに基づく発現及び遺伝子型解析のための例示的な方法は、米国特許第７，５８２，４２０号、同第６，８９０，７４１号、同第６，９１３，８８４号、若しくは同第６，３５５，４３１号、又は米国特許出願公開第２００５／００５３９８０（Ａ１）号、同第２００９／０１８６３４９（Ａ１）号、若しくは同第２００５／０１８１４４０（Ａ１）号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の方法の利点は、複数の標的核酸の迅速かつ効率的な検出を、並行な提供することである。したがって、本開示は、上記で例示されるものなどの当技術分野において既知の技術を使用して核酸を調製及び検出することができる統合システムを提供する。したがって、本開示の統合システムは、増幅試薬及び／又はシークエンシング試薬を１つ以上の固定化されたＤＮＡ断片に送達することができる流体成分を含むことができ、システムは、ポンプ、弁、リザーバー、流体ラインなどの構成要素を含む。フローセルは、標的核酸を検出するための統合システムで構成及び／又は使用することができる。例示的なフローセルは、例えば、米国特許第２０１０／０１１１７６８（Ａ１）号及び米国特許出願第１３／２７３，６６６号に記載され、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。フローセルについて例示されるように、統合システムの流体成分の１つ又はそれ以上を増幅方法及び検出方法に使用することができる。核酸シークエンシングの実施形態を一例として取ると、統合システムの流体構成要素の１つ又は複数を、本明細書に記載の増幅方法、及び上記に例示したようなシークエンシング方法におけるシークエンシング試薬の送達に使用することができる。あるいは、統合システムは、増幅方法を実施し、検出方法を実施するための別個の流体システムを含み得る。増幅された核酸を作成し、また核酸の配列を決定することができる統合シークエンシングシステムの例としては、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及び参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／２７３，６６６号に記載のデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。
ＩＶ．固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合物を有する固体支持体及び調製方法
本明細書に提示される他の実施形態は、固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を上に有するビーズなどの固体支持体を含む。特定の実施形態では、固体支持体は、非配列特異的様式で標的核酸に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する第１のポリヌクレオチドに結合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を上に有する。特定の他の実施形態では、固体支持体は、配列特異的な様式で標的核酸に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する第１のポリヌクレオチドに結合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を含む。固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を上に有する。いくつかの実施形態では、異なる固体支持体は、異なる配列で標的核酸に結合すようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する。いくつかの実施形態では、固体支持体上の第１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は、関心対象の配列の標的核酸の３’に結合するように第１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する、第１のポリヌクレオチドに結合し、固体支持体上の第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素は、関心対象の標的核酸の５’に結合するように第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する、第２のポリヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を非配列特異的様式で（又は、任意選択的に、各固体支持体が、関心対象の配列の周りの隣接領域を標的とする一対のｓｇＲＮＡを含む、異なる配列を標的とする固体支持体の集団では、配列特異的様式で）標的核酸に結合するように誘導する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分と、を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドはビオチン化され、固体支持体は、１つ以上のビオチン結合タンパク質を含む。これらの表面結合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体の密度は様々であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５個の、若しくは少なくとも１０６個の酵素又は複合体の密度で固体支持体上に存在する。
Ｖ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９微小粒子を使用した断片化
本明細書に提示される一実施形態は、それに固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体を有する微小粒子（例えば、ビーズ）の集団である。ビーズなどの固体支持体の使用は、溶体ベースの断片よりもいくつかの利点を提供することができる。例えば、標準的な溶体ベースの断片化では、断片化反応の最終的な断片サイズを制御することは困難である。断片のサイズは、核酸の量及びサイズに対する、並びに反応時間に対する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓの比率の関数である。これらのパラメータが制御される場合であっても、対のリードの長さの組み合わせよりも短い過剰な小さな断片を除去するための追加の工程として、サイズ選択の分画が一般的に必要とされる。本明細書で提供される方法は、これらの欠点を回避する。具体的には、ビーズ固定化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体は、断片化反応に加えられるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ビーズの量に関係なく、結合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体の空間的分離の関数としての最終的な断片サイズの選択を可能にする。溶液ベースの断片化の更なる制限は、ＰＣＲ増幅前後の両方で断片化反応の生成物の何らかの形の精製を行う必要があることである。これは、典型的には、管から管への反応のいくらかの移動を必要とする。対照的に、ビーズベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓ上の断片化生成物は、洗浄して、増幅又はその他の下流処理のために後で放出することができるため、試料移動の必要性を回避することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓ酵素又は複合体が常磁性ビーズ上に組み立てられる実施形態では、断片化反応生成物の精製は、ビーズを磁石で固定し及び洗浄することによって容易に達成することができる。したがって、いくつかの実施形態では、断片化及びＰＣＲ増幅などの他の下流処理は、全て、単一のチューブ、容器、液滴、又は他の容器内で実行することができる。いくつかの実施形態では、試料の断片化及び下流処理は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０１１６１２８号に記載されるように、微小流体液滴ベースのデバイスで行われる。例えば、微小流体液滴ベースのデバイスでは、標的核酸、洗浄緩衝液又は他の試薬を含有する液滴を、固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体を含む表面上に通過させることができる。同様に、固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓ酵素又は複合体を上に有するビーズを含む液滴を、微小流体液滴ベースのデバイス内標的二本鎖核酸、洗浄緩衝液又は他の試薬と接触させてもよい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ビーズを断片緩衝液中の標的二本鎖核酸の溶液に添加すると、ランダムな断片化が起こり、標的二本鎖核酸がビーズの表面に連結する。ランダムに断片化された二本鎖核酸断片の固定化ライブラリが生成される。
いくつかの実施形態では、ブリッジ断片の長さは、ビーズの表面上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体の密度によって決定され得る。断片化が完了すると、任意の好適な方法を使用して、二本鎖核酸断片をビーズの表面から遊離させることができる。いくつかの実施形態では、断片化生成物は、サプレッションＰＣＲ、ステップアウトＰＣＲなどの増幅法を使用してビーズから遊離される。いくつかの実施形態では、断片化産物は、切断によってビーズから遊離される。切断は、例えば、化学的、酵素的、光化学的、又はこれらの組み合わせであり得る。固体支持体から１つ以上の断片化生成物を放出するための任意の好適な方法が、本明細書で提供される方法で利用され得ることが理解されるであろう。
核酸は、接触の確率を増加させるための任意の好適な方法を使用して、表面に結合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体と効率的に接触させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、標的二本鎖核酸と、固体表面上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体との間の接触を増加させるために、固体表面上への核酸の沈殿を利用することができる。参照によりその全体が組み込まれる国際公開第２０１０／１１５１２２号の開示によって例示されるように、核酸を固体支持体と接触させるために当該技術分野において既知である多数の方法のうちのいずれか１つを利用することができる。当業者には理解されるように、核酸は、ＰＥＧ、エタノール、又は例えば固相可逆固定化（ＳＰＲＩ）技術で使用される多数のバッファーのいずれか１つを含む、核酸を表面上に沈殿させることが知られている様々な他の薬剤のうちの任意の１つを添加することによって、核酸を固体支持体上に沈殿させることができる。
いくつかの実施形態では、固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体を有するビーズの集団を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓ酵素、複合体、又はオリゴヌクレオチドを有さない過剰なビーズと混合することができ、それによって、２つ以上の異なるビーズにわたる断片化の可能性が低減される。２つ以上の異なるビーズにわたる断片化の可能性を低減するための別の方法は、ビーズ間の接触が最小限に抑えられるようにビーズを固定化することを含む。ビーズの固定化は、例えば、微小遠心管などの固体表面の側面への磁性を介したビーズの固定化、又は国際公開第２０１０／１１５１２２号の組み込まれた材料によって例示される任意の他の固定化技術を含む、当技術分野で既知の多数の技術のいずれかによって達成することができる。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ビーズを使用して、原核細胞又は真核細胞などの単一細胞から核酸を単離及び同定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ビーズなどの粒子は、同じインデックスを共有するインデックス付きＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体でコーティングされる（特定のビーズ上に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓ酵素又は複合体の全ては、別のビーズ上に存在するインデックスとは異なる同じインデックスを担持する）。次いで、ビーズを、当該技術分野において既知の様々な方法のいずれか１つを介して細胞内に配置することができる。例えば、細胞内のビーズを送達するための方法としては、遺伝子銃、光熱ナノブレード（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．（２０１１）４：１３２１－７）、及び細胞透過性物質と共に使用されるペプチド（Ｎｉｔｉｎ ｅｔ ａｌ Ａｎｎ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ．（２００９）３７：２０１８－２０２７）等が挙げられるが、これらに限定されない。単一の細胞からの核酸を、インデックス付けされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体を有する粒子と会合させるための好適な方法を、本明細書に提示される方法で使用することができることが理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体は、本明細書で先に詳述したように、ビーズに共有結合することができる。加えて、又は代替的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体は、化学的又は物理的刺激を適用するとビーズから放出され得る。固体支持体からのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体の放出を誘発することができる刺激のいくつかの例としては、光及び／又は温度変化（例えば、熱）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体は、制限エンドヌクレアーゼなどの酵素の活性を使用して、固体支持体から放出される。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体は、ビーズから分離され、細胞内で自由に移動することができる。ビーズ（又は代替的に、放出されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体）がクロマチン又は核酸と接触すると、断片化が起こり得る。真核生物及び原核生物系では、全てのゲノムＤＮＡが断片化に常にアクセス可能であるかつ／又は利用可能であるわけではないことが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、最大０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％以上の、９９％の細胞中の全核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体によって断片化される。
いくつかの実施形態では、二本鎖核酸断片は、例えば、第１のタグドメインを含む第１のタグでタグ付けされる。いくつかの実施形態では、第１のタグドメインは、クラスタ増幅のための領域及び／又はシークエンシング反応をプライミングするための領域を含み得る。断片のタグ付けは、同じタグを共有するリードをまとめてグループ化することによって、同じ細胞又は他の生体試料からのリードを識別することが可能となる。これらのリードは、同じ固体支持体又はビーズに由来するもの（したがって、同じ細胞又は生体試料由来）と見なすことができる。
いくつかの実施形態では、個々の生体試料又は標的二本鎖核酸が複数の固体支持体又はビーズによって断片化されないことを確実にするために、アプローチを使用することができる。例えば、１つのアプローチは、細胞と同様のサイズのビーズを使用することである。これは、細胞が複数のビーズを収容することができないことを確実にする。加えて、又は代替的に、別のアプローチは、単一の細胞標的化に有利な細胞対ビーズ比を使用することである。例えば、ビーズよりもはるかに多くの細胞が存在する場合、細胞内のビーズのポアソン分布は、１つのビーズを取り込んだ細胞は、２つ以上のビーズを取り込んだ細胞をはるかに上回っていることを意味する。
いくつかの実施形態では、上記の単一細胞アプローチを使用して、２つの一塩基多型（ＳＮＰ）又は構造的再配置が同じ細胞中に存在するかどうかを決定することができる。例えば、癌細胞の不均一な集団の場合、２つのＳＮＰが同じ細胞に存在するのか、異なる細胞に存在するのかを知ることは、適切な癌治療の実施に役立つ可能性がある。
いくつかの実施形態では、上記の単一細胞アプローチは、ＲＮＡを研究に使用できる。例えば、ビーズを、逆転写工程のための好適な酵素（すなわち、逆転写酵素）及びオリゴヌクレオチドでコーティングすることによって、単一細胞レベルでの遺伝子発現を分析することができる。一実施形態では、逆転写酵素、オリゴヌクレオチド、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素でコーティングされたビーズを導入した後、細胞質ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、タグ付けし、細胞内で調製することができる。
ＶＩ．固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を使用してロングリードを組み立てる方法
核酸断片のアセンブリは、核酸分子の集団内の個々の長い核酸分子の単離、及び各核酸の断片ライブラリへの変換を可能にする。核酸断片のライブラリがタグ付け及び配列決定されるとき、核酸断片は、例えば、それらが含有するタグを参照することによって、元の長い分子に組み戻すことができる。
標的二本鎖核酸は、本明細書で上述したように接触の確率を増加させるための任意の好適な方法を使用して、表面に結合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓと効率的に接触させることができる。
この方法は、例えば、ライブラリ調製のための断片化試薬とビードアレイとの組み合わせを用いて、様々な既知のフォーマットのいずれか１つを使用して実行することができ、続いてインデックス付けされたシークエンシングを実行し及び特注のデータ分析を行うことができる。互いに静的に分離したビーズを維持する任意の他の好適な方法を、試料の表面断片化及びインデックス付けに使用することができる。例えば、ミクロスフェアがウェル内に留まることができるように、ビーズを保持できる基板のウェル若しくは小さな窪みなどの物理的な構成、又は他の力（磁気若しくは圧縮）の使用、又は化学的に機能化された部位、静電的に変化した部位、疎水性及び／又は親水性に機能化された部位、又は接着剤のスポットなどの、化学的に変化した部位又は活性化した部位が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ミクロスフェアは、ウェルに非共有結合的に関連しているが、ウェルは更に化学的に機能化されてもよく、架橋剤を使用してもよく、又は物理的バリア、例えば、ビーズ上のフィルム又は膜が使用されてもよい。
特定の実施形態では、基材の表面は、共有結合又は非共有結合のいずれかで、本発明のミクロスフェアを基材上の個別の部位又は位置に付着させるために使用され得る化学修飾部位を含有するように修飾される。この文脈における「化学的に修飾された部位」としては、以下が含まれるがこれらに限定されない：ミクロスフェアを共有結合させるために使用することができ、これは、一般に、対応する反応性官能基も含有する、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基、及びチオール基を含む化学官能基のパターンの付加、ミクロスフェアを結合するために使用することができる接着剤のパターンの付加（接着剤の添加のための事前の化学的機能化又は接着剤の直接添加のいずれかによって）、ミクロスフェアの静電付着のための荷電基のパターン（化学官能性と同様）の付加、例えば、ミクロスフェアが、その部位とは反対の荷電基を含む場合、好適な実験条件下で同様に疎水性又は親水性ミクロスフェアを添加すると、水親和性に基づいてミクロスフェアを部位に会合するように、疎水性又は親水性の異なる部位にする化学官能基のパターンの付加。例えば、水性系での疎水性ビーズと疎水性部位の使用は、ビーズの部位への会合を優先的に促す。上記で概説したように、この意味における「パターン」は、個別の部位におけるビーズの付着を可能にする表面の均一な処理の使用、並びに個別の部位をもたらす表面の処理の使用を含む。当業者よって理解されるように、これは様々な方法で達成され得る。
いくつかの実施形態では、標的二本鎖核酸が固体支持体に適用されると、標的二本鎖核酸は、固体支持体上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体によって、ランダムに何度も断片化される。各断片は、固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、固体支持体はビーズであり、アレイチップ内のビーズの物理的分離が、核酸分子が２つのビーズの間に到達することを防ぐ。他の実施形態では、ビーズは、密接に接触しており、１つ以上の核酸分子は、２つ以上の固体支持体の間で伸張し得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の標的二本鎖核酸分子を、固体支持体ごとに断片化することができる。２つの対立遺伝子が同じ固体支持体又はビーズ上に断片化される確率は低く、添加される核酸の濃度と、固体支持体又はビーズの数の関数である。例えば、同じウェルに２つの対立遺伝子が生じるのを回避するために、０．１ｘハプロム相当物（５０，０００個のゲノム相当）を１００万個のビーズに装填する必要がある。
いくつかの実施形態では、二本鎖核酸断片は、タグ付けのための既知の方法のいずれかによってタグ付けされる。二本鎖核酸断片は、例えば、第１のタグドメインを含む第１のタグでタグ付けされ得る。いくつかの実施形態では、第１のタグドメインは、シークエンシング反応をプライミングするための領域を含む。断片化、及び任意選択的にタグ付けが完了すると、二本鎖核酸断片は、固体支持体の表面から溶液に移すことができ、個々の二本鎖核酸断片をプールして、シークエンシングなどの次の工程のために備えることができる。
固定化された二本鎖核酸断片の固体支持体から溶液への放出又は遊離は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法を使用して達成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、断片化された分子は、例えば、表面に結合されたオリゴヌクレオチドの５’末端に存在する切断部分を介してビーズの表面から切断することによって遊離され得る。切断部分は、固体支持体からの核酸鎖の切断に好適な任意の部分であり得る。切断部分を利用する方法の例としては、限定するものではないが、制限エンドヌクレアーゼ切断、化学的切断、ＲＮａｓｅ切断、光化学切断などが挙げられ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００６／０６４１９９号に記載されている切断方法及び切断部分が含まれる。
タグは、増幅及びシークエンシングプライマなどの追加の配列を付加できるＰＣＲステップアウトプライマをハイブリダイズするハイブリダイゼーションポイントとして使用することができる「プライマ」領域を含んでもよい。例えば、増幅プライマＰ５及びＰ７を付加することができる。付加されると、例えば、一方の末端部にＰ５アダプタを有し、他方の端部にＰ７を有する分子を富化するため、サプレッションＰＣＲを使用することができる。いくつかの実施形態では、増幅は、サプレッションＰＣＲによってＰ５及びＰ７のアダプタ配列を付加するステップアウトプライマを用いて、固体支持体（例えばビーズ）から直接実行できる。
別の実施形態では、各固体支持体は、プライマ配列がＰ５－リード１シークエンシングプライマ又はＰ７リード２シークエンシングプライマのいずれかである、２種類の表面グラフト化オリゴヌクレオチドを有することができる。これにより、混合したＰ５－Ｐ７ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素又は複合体が得られる。これらは、固体支持体から切断され、続いてサプレッションＰＣＲによって、Ｐ５／Ｐ７分子を富化するか、又は固体支持体から直接増幅することができる。
均等物
前述の明細書は、当業者が実施形態を実践することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳細に詳述し、本発明者らによって想到される最良の様式を説明する。しかしながら、前述の内容が本文にどれほど詳細にあらわれていても、実施形態は多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
用語「含む（comprising）」は、本明細書では、列挙された要素のみならず、任意の追加の要素を更に包含する、オープンエンドであることが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「約」は、明示的に示されているか否かに関わらず、例えば、整数、分数、及びパーセンテージを含む数値を指す。用語は、一般に、当業者が列挙された値（例えば、同じ機能又は結果を有する）と同等であると考えられる数値の範囲（例えば、列挙された範囲の±５～１０％）を指す。少なくとも及び約などの用語が数値又は範囲のリストの前にある場合、その用語はリスト内に提供される値又は範囲の全てを変更する。場合によっては、約という用語は、最も近い有効数字に丸められた数値を含んでもよい。
本出願全体を通して、様々な刊行物、特許、又は特許出願が参照されている。これらの刊行物の全体の開示は、本出願において参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (77)

  1. ランダムに断片化された、二本鎖核酸断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、
    （ａ）固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を上に有する固体支持体を提供することと、
    （ｂ）標的二本鎖核酸を、前記標的二本鎖核酸が前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素によってランダムに断片化され、かつ前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が前記二本鎖核酸断片のうちの少なくとも一方の鎖と結合する条件下で、前記固体支持体に適用し、それにより、ランダムに断片化された、二本鎖核酸断片の固定化ライブラリを生成することと、を含む、方法。
  2. 前記標的二本鎖核酸が、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記標的二本鎖核酸が、ｄｓＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
  4. ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素が、非配列特異的様式で前記標的二本鎖核酸に結合するように前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する第１のポリヌクレオチドに結合される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記第１のポリヌクレオチドが、前記固体支持体に固定化されている、請求項４に記載の方法。
  6. 前記第１のポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、非配列特異的様式で前記標的核酸に結合するように前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分と、を含む、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 前記ｓｇＲＮＡが、（ＧＣ）ｎ又は（ＡＴ）ｎを含み、ｎが、５～２０である、請求項６に記載の方法。
  8. ｎが、１０である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ｓｇＲＮＡが、１０～４０ヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
  10. 前記ｓｇＲＮＡが、１７又は２０ヌクレオチドである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記第１のポリヌクレオチドが、ビオチン化され、前記固体支持体が、１つ以上のビオチン結合タンパク質を含む、請求項４～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ビオチン結合タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体、ビオチン受容体、及び／又はビオチン結合酵素を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ビオチン結合酵素が、ビオチニダーゼ又はビオチンホロカルボキシラーゼ合成酵素を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記固体支持体を、前記二本鎖核酸断片がその上に固定化された状態で洗浄して、任意の非結合核酸を除去することを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記固体表面上に固定化された前記二本鎖核酸断片を増幅することを含む、請求項４～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記増幅することが、ポリメラーゼ及び前記第１のポリヌクレオチドの一部に対応する増幅プライマを提供することを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記標的二本鎖核酸を前記固体支持体に適用することが、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の核酸結合特異性を低下させる１つ以上の試薬で処理することを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記１つ以上の試薬が、ベタイン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、エチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、及び／又はスルファラン（sulphalane）を含む、請求項１８に記載の方法。
  19. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素が、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の酵素の密度で前記固体支持体上に存在する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記固定化ライブラリ中の前記二本鎖核酸断片の長さが、前記固体支持体上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の密度に比例する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記固体支持体が、微小粒子、パターン化表面、又はウェルを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記微小粒子が、ビーズである、請求項２１に記載の方法。
  23. （ｃ）前記二本鎖核酸断片の前記固定化ライブラリの少なくとも一部に挿入色素を適用して、染色された固定化断片のセットを得ることと、前記染色された固定化断片の画像を得ることと、を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 標的二本鎖核酸を適用することが、生体試料を前記固体支持体に添加することを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記生体試料が、細胞溶解物を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記生体試料が、全細胞を含む、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記生体試料が、血液、血漿、血清、リンパ液、粘液、痰、尿、精液、脳脊髄液、気管支吸引液、糞便、及び浸軟組織からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  28. 前記二本鎖核酸断片をタグ付けすることを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記二本鎖核酸断片が、第１のタグドメインを含む第１のタグでタグ付けされる、請求項２８に記載の方法。
  30. 第１のタグドメインが、クラスタ増幅のための領域を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記第１のタグドメインが、シークエンシング反応をプライミングするための領域を含む、請求項２９又は３０に記載の方法。
  32. 前記固定化された二本鎖核酸断片を、前記固体支持体から遊離させることを含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記遊離させることが、前記固体支持体からの前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の切断を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記遊離させることが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写増幅法（ＴＭＡ）、及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、又は他の増幅プロセスを実行することを含む、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記ＰＣＲが、サプレッションＰＣＲを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記遊離させることが、光又は熱を適用することを含む、請求項３２に記載の方法。
  37. ランダムに断片化された、二本鎖核酸断片の固定化ライブラリを調製する方法であって、
    （ａ）固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を上に有する固体支持体を提供することであって、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、非配列特異的様式で標的核酸に結合するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分と、を含む、ビオチン化された第１のポリヌクレオチドに結合された前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を含み、前記ビオチン化された第１のポリヌクレオチドが、前記固体支持体上のビオチン結合タンパク質に結合されている、提供することと、
    （ｂ）標的二本鎖核酸を、前記標的二本鎖核酸が前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体によってランダムに断片化され、かつ前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が前記二本鎖核酸断片のうちの少なくとも一方の鎖と結合する条件下で、前記固体支持体に適用し、
    それにより、ランダムに断片化された、二本鎖核酸断片の固定化ライブラリを生成することと、を含む、方法。
  38. 前記ビオチン結合タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体、ビオチン受容体、及び／又はビオチン結合酵素を含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ビオチン結合酵素が、ビオチニダーゼ又はビオチンホロカルボキシラーゼ合成酵素を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記標的二本鎖核酸を前記固体支持体に適用することが、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の核酸結合特異性を低下させる１つ以上の試薬で処理することを含む、請求項３８又は３９に記載の方法。
  41. 前記１つ以上の試薬が、ベタイン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、エチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、及び／又はスルファランを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記二本鎖核酸断片をタグ付けすることを含む、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記二本鎖核酸断片が、第１のタグドメインを含む第１のタグでタグ付けされる、請求項４２に記載の方法。
  44. 第１のタグドメインが、クラスタ増幅のための領域を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記第１のタグドメインが、シークエンシング反応をプライミングするための領域を含む、請求項４３又は４４に記載の方法。
  46. 前記固定化された二本鎖核酸断片を、前記固体支持体から遊離させることを含む、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記遊離させることが、前記固体支持体からの前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の切断を含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記遊離させることが、ＰＣＲ又は他の増幅プロセスを実行することを含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記ＰＣＲが、サプレッションＰＣＲを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記遊離させることが、光又は熱を適用することを含む、請求項４８に記載の方法。
  51. 請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法に従って調製された、固定化された二本鎖核酸断片のライブラリを上に有する固体支持体。
  52. 固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を上に有する固体支持体であって、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が、標的二本鎖核酸をランダムに断片化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を含む、固体支持体。
  53. 前記標的二本鎖核酸が、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを含む、請求項５２に記載の固体支持体。
  54. 前記標的二本鎖核酸が、ｄｓＤＮＡである、請求項５３に記載の固体支持体。
  55. ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素が、非配列特異的様式で前記標的二本鎖核酸を結合するように前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する第１のポリヌクレオチドに結合される、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の固体支持体。
  56. 前記第１のポリヌクレオチドが、前記固体支持体に固定化されている、請求項５５に記載の固体支持体。
  57. 前記第１のポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、非配列特異的様式で前記標的核酸に結合するように前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分と、を含む、請求項５５又は５６に記載の固体支持体。
  58. 前記ｓｇＲＮＡが、（ＧＣ）ｎ又は（ＡＴ）ｎを含み、ｎが、５～２０である、請求項５７に記載の固体支持体。
  59. ｎが、１０である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ｓｇＲＮＡが、１０～４０ヌクレオチドである、請求項５７に記載の方法。
  61. 前記ｓｇＲＮＡが、１７又は２０ヌクレオチドである、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記第１のポリヌクレオチドが、ビオチン化され、前記固体支持体が、ビオチン結合タンパク質を含む、請求項５５～５１のいずれか一項に記載の固体支持体。
  63. 前記ビオチン結合タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体、ビオチン受容体、及び／又はビオチン結合酵素を含む、請求項６２に記載の固体支持体。
  64. 前記ビオチン結合酵素が、ビオチニダーゼ又はビオチンホロカルボキシラーゼ合成酵素を含む、請求項６３に記載の固体支持体。
  65. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素が、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の酵素の密度で前記固体支持体上に存在する、請求項５２～６４のいずれか一項に記載の固体支持体。
  66. 前記固体支持体が、微小粒子、パターン化表面、又はウェルを含む、請求項５２～６５のいずれか一項に記載の固体支持体。
  67. 前記微小粒子が、ビーズである、請求項６６に記載の固体支持体。
  68. 請求項５２～６７のいずれか一項に記載の固体支持体と、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の核酸結合特異性を低下させる１つ以上の試薬と、を含む、組成物。
  69. 前記１つ以上の試薬が、ベタイン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、エチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、及び／又はスルファランを含む、請求項６８に記載の組成物。
  70. 固定化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を上に有する固体支持体であって、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９末端配列を含む３’部分と、非配列特異的様式で標的二本鎖核酸に結合するように前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を誘導する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む５’部分と、を含む、ビオチン化された第１のポリヌクレオチドに結合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を含み、前記ビオチン化された第１のポリヌクレオチドが、前記固体支持体上のビオチン結合タンパク質に結合されている、固体支持体。
  71. 前記ビオチン結合タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体、ビオチン受容体、及び／又はビオチン結合酵素を含む、請求項７０に記載の固体支持体。
  72. 前記ビオチン結合酵素が、ビオチニダーゼ又はビオチンホロカルボキシラーゼ合成酵素を含む、請求項７１に記載の固体支持体。
  73. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６個の複合体の密度で前記固体支持体上に存在する、請求項７０～７２のいずれか一項に記載の固体支持体。
  74. 前記固体支持体が、微小粒子、パターン化表面、又はウェルを含む、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の固体支持体。
  75. 前記微小粒子が、ビーズである、請求項７４に記載の固体支持体。
  76. 請求項７０～７５のいずれか一項に記載の固体支持体と、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の核酸結合特異性を低下させる１つ以上の試薬と、を含む、組成物。
  77. 前記１つ以上の試薬が、ベタイン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、エチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、及び／又はスルファランを含む、請求項７６に記載の組成物。
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