KR20220034716A - 고체 지지물 상에 고정된 crispr/cas9를 사용하여 핵산 서열분석 라이브러리를 제조하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

고체 지지물 상에 고정된 crispr/cas9를 사용하여 핵산 서열분석 라이브러리를 제조하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220034716A
KR20220034716A KR1020217020184A KR20217020184A KR20220034716A KR 20220034716 A KR20220034716 A KR 20220034716A KR 1020217020184 A KR1020217020184 A KR 1020217020184A KR 20217020184 A KR20217020184 A KR 20217020184A KR 20220034716 A KR20220034716 A KR 20220034716A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
solid support
crispr
double
stranded nucleic
Prior art date
Application number
KR1020217020184A
Other languages
English (en)
Inventor
나일 앤서니 곰리
Original Assignee
일루미나 케임브리지 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 일루미나 케임브리지 리미티드 filed Critical 일루미나 케임브리지 리미티드
Publication of KR20220034716A publication Critical patent/KR20220034716A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

표면 상에 무작위로 단편화된 이중-가닥 표적 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 생성하기 위한 고정된 CRISPR/Cas9 효소를 사용하기 위한 방법 및 조성물이 제시된다. 본 방법은 대량 병렬 핵산 서열분석을 포함하는, 다양한 공정에 사용하기 위한 핵산 단편을 생성하는데 유용하다.

Description

고체 지지물 상에 고정된 CRISPR/CAS9를 사용하여 핵산 서열분석 라이브러리를 제조하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 7월 12일자로 출원된 미국 가출원 제62/873,609호의 우선권의 이익을 주장하며, 이는 목적에 따라 전체적으로 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
설명
기술분야
본 출원은 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 라이브러리를 생성하기 위한 고체 지지물 상에 고정된 CRISPR/Cas9 효소를 사용하는 방법, 고정된 CRISPR/Cas9 효소를 포함하는 고체 지지물, 및 관련 조성물에 관한 것이다. 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리는, 예를 들어, 높은 처리량, 대량 병렬 및 또는 다중 핵산 서열분석을 포함하는 다양한 응용을 위한 주형으로서 유용하다.
다양한 방법 및 응용에서, 표적 이중-가닥 핵산 표적 분자, 예컨대 이중-가닥 DNA(dsDNA) 표적 분자로부터 무작위로 단편화된 핵산 분자의 라이브러리를 생성하는 것이 바람직하다. 종종, 목적은 핵산 서열분석 반응에서 주형으로 사용하기 위해 더 큰 이중-가닥 핵산 분자로부터 더 작은 핵산 분자(예를 들어, 핵산 단편)를 생성하는 것이다.
차세대 서열분석에 사용하기 위한 이중-가닥 핵산의 단편화 및 태깅을 위해 현재 사용되는 많은 방법은 핵산을 낭비하고, 단편화를 위한 고가의 기구를 필요로 하며, 단편화, 태깅 및 태깅된 핵산 단편 회수를 위한 절차가 어렵고, 지루하고, 힘들고, 시간 소모적이고, 비효율적이며, 비용이 많이 들고, 비교적 많은 양의 샘플 핵산을 필요로 한다. 또한, 이들 방법 중 다수는 핵산 단편을 생성하는 데 사용되는 샘플 핵산에 포함된 서열을 완전히 대표하지는 않는 핵산 단편을 생성한다. 따라서, 당업계에 필요한 것은 표적 이중-가닥 핵산으로부터 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 라이브러리를 생성할 때 속도 및 사용 용이성을 제공하고 핵산 분석 방법, 예컨대 차세대 서열분석 및 증폭 방법에 용이하게 적용할 수 있는 방법이다.
설명에 따르면, 본 출원은 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법을 기술하며, 본 방법은 (a) CRISPR/Cas9 효소가 고정된 고체 지지물을 제공하는 단계; 및 (b) 표적 이중-가닥 핵산이 CRISPR/Cas9 효소에 의해 무작위로 단편화되고, CRISPR/Cas9가 이중-가닥 핵산 단편의 적어도 하나의 가닥에 결합하는 조건 하에서 고체 지지물에 표적 이중-가닥 핵산을 적용하는 단계를 포함하고, 이에 의해, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 생성한다.
일부 실시형태에서, 표적 이중-가닥 핵산은 이중-가닥 DNA(dsDNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 또는 이중-가닥 RNA/DNA 하이브리드(hybrid)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 이중-가닥 핵산은 dsDNA이다.
일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소는 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 표적 이중-가닥 핵산에 결합하도록 유도하는 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지물에 고정된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 표적 핵산에 결합하도록 유도하는 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함한다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 (GC)n 또는 (AT)n을 포함하고, 여기서 n은 5 내지 20, 10 내지 15, 또는 10이다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 10 내지 40, 15 내지 35, 또는 17 내지 20개의 뉴클레오타이드이다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 비오티닐화되고 고체 지지물은 하나 이상의 비오틴 결합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비오틴 결합 단백질은 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 항-비오틴 항체, 비오틴 수용체, 및/또는 비오틴-결합 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비오틴-결합 효소는 비오티니다제 또는 비오틴 할로카르복실라제 합성효소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 이중-가닥 핵산 단편이 고정된 고체 지지물을 세척하여 임의의 결합되지 않은 핵산을 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 고체 표면 상에 고정된 이중-가닥 핵산 단편을 증폭하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 증폭하는 단계는 제1 폴리뉴클레오타이드의 일부에 상응하는 증폭 프라이머 및 중합효소를 제공하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 고체 지지물에 표적 이중-가닥 핵산을 적용하는 단계는 CRISPR/Cas9 효소의 핵산 결합 특이성을 감소시키는 하나 이상의 시약으로 CRISPR/Cas9 효소를 처리하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 시약은 베타인, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 에탄올, 에틸렌 글리콜, 다이메틸아세트아마이드, 다이메틸폼아마이드, 및/또는 설파란을 포함한다.
일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소는 ㎟ 당 적어도 103, 104, 105, 또는 106개의 효소의 밀도로 고체 지지물 상에 존재한다.
일부 실시형태에서, 고정된 라이브러리 내의 이중-가닥 핵산 단편의 길이는 고체 지지물 상의 CRISPR/Cas9 효소의 밀도에 비례한다.
일부 실시형태에서, 고체 지지물은 마이크로입자, 패턴화된 표면, 또는 웰을 포함한다. 일부 실시형태에서, 마이크로입자는 비드이다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 (c) 삽입 염료를 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리의 적어도 일부에 적용하여 염색된 고정된 단편의 세트를 얻는 단계; 및 염색된 고정된 단편의 이미지를 얻는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 이중-가닥 핵산을 적용하는 단계는 생물학적 샘플을 고체 지지물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 세포 용해물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 전세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 점액, 객담, 소변, 정액, 뇌척수액, 기관지 흡인물, 대변, 및 침연 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 이중-가닥 핵산 단편을 태깅하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이중-가닥 핵산 단편은 제1 태그 도메인을 포함하는 제1 태그로 태깅된다. 일부 실시형태에서, 제1 태그 도메인은 클러스터 증폭을 위한 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 태그 도메인은 서열분석 반응을 프라이밍하기 위한 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 고체 지지물로부터 고정된 이중-가닥 핵산 단편을 유리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유리시키는 단계는 고체 지지물로부터의 CRISPR/Cas9 효소의 절단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유리시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR), 가닥 변위 증폭(strand displacement amplification, SDA), 전사 매개 증폭(transcription mediated amplification, TMA) 및 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA), 또는 다른 증폭 과정을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, PCR은 억제 PCR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유리시키는 단계는 빛 또는 열을 가하는 단계를 포함한다.
본 출원은 또한 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법을 기술하며, 본 방법은 (a) CRISPR/Cas9 복합체가 고정된 고체 지지물을 제공하는 단계 - CRISPR/Cas9 복합체는 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 표적 핵산에 결합하도록 유도하는 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함하는 비오티닐화된 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합된 CRISPR/Cas9 효소를 포함하고, 비오티닐화된 제1 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지물 상의 비오틴 결합 단백질에 결합됨 -; 및 (b) 표적 이중-가닥 핵산이 CRISPR/Cas9 복합체에 의해 무작위로 단편화되고, CRISPR/Cas9 복합체가 이중-가닥 핵산 단편의 적어도 하나의 가닥에 결합하는 조건 하에서 고체 지지물에 표적 이중-가닥 핵산을 적용하는 단계를 포함하고, 이에 의해, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 생성한다.
일부 실시형태에서, 비오틴 결합 단백질은 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 항-비오틴 항체, 비오틴 수용체, 및/또는 비오틴-결합 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비오틴-결합 효소는 비오티니다제 또는 비오틴 할로카르복실라제 합성효소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 고체 지지물에 표적 이중-가닥 핵산을 적용하는 단계는 CRISPR/Cas9 효소의 핵산 결합 특이성을 감소시키는 하나 이상의 시약으로 CRISPR/Cas9 효소를 처리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 시약은 베타인, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 에탄올, 에틸렌 글리콜, 다이메틸아세트아마이드, 다이메틸폼아마이드, 및/또는 설파란을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 이중-가닥 핵산 단편을 태깅하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 핵산 단편은 제1 태그 도메인을 포함하는 제1 태그로 태깅된다. 일부 실시형태에서, 제1 태그 도메인은 클러스터 증폭을 위한 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 태그 도메인은 서열분석 반응을 프라이밍하기 위한 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 고체 지지물로부터 고정된 이중-가닥 핵산 단편을 유리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유리시키는 단계는 고체 지지물로부터의 CRISPR/Cas9 효소의 절단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유리시키는 단계는 PCR 또는 다른 증폭 과정을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, PCR은 억제 PCR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유리시키는 단계는 빛 또는 열을 가하는 단계를 포함한다.
본 출원은 또한 본 명세서에 기재된 방법에 따라 제조된 이중-가닥 핵산 단편의 라이브러리가 고정된 고체 지지물을 기술한다.
본 출원은 또한 CRISPR/Cas9 복합체가 고정된 고체 지지물을 기술하며, CRISPR/Cas9 복합체는 표적 이중-가닥 핵산을 무작위로 단편화하는 CRISPR/Cas9 효소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 이중-가닥 핵산은 이중-가닥 DNA(dsDNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 또는 이중-가닥 RNA/DNA 하이브리드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 이중-가닥 핵산은 dsDNA이다.
일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소는 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 표적 이중-가닥 핵산에 결합하도록 유도하는 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합된다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지물에 고정된다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 표적 핵산에 결합하도록 유도하는 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함한다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 (GC)n 또는 (AT)n을 포함하고, 여기서 n은 5 내지 20 또는 10 내지 15이다. 일부 실시형태에서, n은 10이다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 10 내지 40 또는 15 내지 30개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 17 또는 20개의 뉴클레오타이드이다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 비오티닐화되고 고체 지지물은 비오틴 결합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비오틴 결합 단백질은 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 항-비오틴 항체, 비오틴 수용체, 및/또는 비오틴-결합 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비오틴-결합 효소는 비오티니다제 또는 비오틴 할로카르복실라제 합성효소를 포함한다.
일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소는 ㎟ 당 적어도 103, 104, 105, 또는 106개의 효소의 밀도로 고체 지지물 상에 존재한다.
일부 실시형태에서, 고체 지지물은 마이크로입자, 패턴화된 표면, 또는 웰을 포함한다. 일부 실시형태에서, 마이크로입자는 비드이다.
본 출원은 또한 본 명세서에 기재된 고체 지지물 및 CRISPR/Cas9 효소의 핵산 결합 특이성을 감소시키는 하나 이상의 시약을 포함하는 조성물을 기술한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 시약은 베타인, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 에탄올, 에틸렌 글리콜, 다이메틸아세트아마이드, 다이메틸폼아마이드, 및/또는 설파란을 포함한다.
본 출원은 또한 CRISPR/Cas9 복합체가 고정된 고체 지지물을 기술하며, CRISPR/Cas9 복합체는 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 표적 이중-가닥 핵산에 결합하도록 유도하는 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함하는 비오티닐화된 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합된 CRISPR/Cas9 효소를 포함하고, 비오티닐화된 제1 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지물 상의 비오틴 결합 단백질에 결합된다.
일부 실시형태에서, 비오틴 결합 단백질은 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 항-비오틴 항체, 비오틴 수용체, 및/또는 비오틴-결합 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비오틴-결합 효소는 비오티니다제 또는 비오틴 할로카르복실라제 합성효소를 포함한다.
일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 복합체는 ㎟ 당 적어도 103, 104, 105, 106개의 복합체의 밀도로 고체 지지물 상에 존재한다.
일부 실시형태에서, 고체 지지물은 마이크로입자, 패턴화된 표면, 또는 웰을 포함한다. 일부 실시형태에서, 마이크로입자는 비드이다.
본 출원은 또한 본 명세서에 기재된 고체 지지물 및 CRISPR/Cas9 효소의 핵산 결합 특이성을 감소시키는 하나 이상의 시약을 포함하는 조성물을 기술한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 시약은 베타인, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 에탄올, 에틸렌 글리콜, 다이메틸아세트아마이드, 다이메틸폼아마이드, 및/또는 설파란을 포함한다.
추가적인 목적 및 이점이 부분적으로는 하기의 설명에서 제시되고 부분적으로는 설명으로부터 명백하거나, 또는 실시에 의해 학습될 수 있다. 목적 및 이점은 첨부된 청구범위에 특히 지적되는 요소 및 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다.
전술한 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명은 모두 예시적이고 설명적일 뿐이며 청구범위를 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 포함되고 그 일부를 구성하는 첨부 도면은 일 실시형태를 예시하며, 설명과 함께 본 명세서에 설명된 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태를 도시한다. 이 실시형태에서, CRISPR/Cas9 복합체는 표면 상에 고정된다. CRISPR/Cas9 복합체는 CRISPR/Cas9(Cas9) 효소, 및 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함하는 비오티닐화된 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. 표적 이중-가닥 핵산은 고체 지지물에 적용되어, CRISPR/Cas9 복합체에 의해 무작위로 단편화되고, 이중-가닥 핵산 단편은 표면 상에 고정된 CRISPR/Cas9 복합체에 결합된다. 핵산 단편의 크기는 표면 상의 고정된 CRISPR/Cas9 효소들 사이의 거리에 따라 좌우된다.
핵산 샘플을 서열분석하기 위한 현재의 프로토콜은 핵산, 예컨대 DNA, 또는 RNA, 또는 RNA/DNA 하이브리드를 주형의 라이브러리로 전환하는 샘플 제조 과정을 이용한다. 이들 방법은 핵산 샘플의 손실을 초래할 수 있으며, 종종 단편화를 위한 고가의 기구를 필요로 할 수 있다. 또한, 샘플 제조 방법은 종종 어렵고, 지루하고, 비효율적이다.
표준 샘플 제조 방법에서, 각각의 주형은 삽입물의 어느 한 말단에 어댑터를 포함하고, 종종 핵산을 변형하고 변형 반응의 원하는 생성물을 정제하기 위해 여러 단계가 필요하다. 이들 단계는, 표면에 공유적으로 부착된 프라이머의 말단에 혼성화된 단편(hybridized fragment)을 복사하는 프라이머 연장 반응에 의해 표면에 결합된 플로우 셀(flow cell)에 적응된 단편을 첨가하기 전에 용액 중에서 수행된다. 이어서, 이들 '시딩(seeding)' 주형은 여러 사이클의 증폭을 통해 복사된 주형의 단일 클론 클러스터를 생성한다.
표적 이중-가닥 핵산, 예컨대 DNA를 클러스터 형성 및 서열분석을 위해 준비된 용액 중에서 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편으로 형질전환시키는 데 필요한 단계의 수는 CRISPR/Cas9 효소 매개 단편화의 사용에 의해 최소화될 수 있다. 임의의 결합되지 않은 핵산을 제거하기 위한 정제 단계 후, PCR에 의해 핵산 단편의 말단에 추가의 서열이 추가된다.
용액-기반 단편화는 단점을 가지며 몇몇 노동-집약적 단계를 필요로 한다. 부가적으로, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 단계 동안 바이어스(bias)가 도입될 수 있다. 본 명세서에 제시된 방법 및 조성물은 이러한 단점을 극복하고 샘플 조작 또는 이동을 위한 최소한의 요건으로 단일 고체 지지물 상에서 편향되지 않은 샘플 제조, 클러스터 형성 및 서열분석이 일어나도록 한다.
본 발명은 고체 지지물, 예컨대 플로우 셀의 표면에 사전-결합된 CRISPR/Cas9 효소가 고체 지지물 상에서 온전한 표적 핵산을 효과적으로 무작위로 단편화하고 고정하는 조건 하에서 사용될 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소를 포함하는 하나 이상의 가닥은 그의 5' 말단을 통해 고체 지지물의 표면에 부착된다. CRISPR/Cas9 효소는 또한 후속 클러스터 생성 및 서열분석을 가능하게 하는 서열을 포함하는 복합체 내에 포함될 수 있다.
본 명세서에 제시된 방법 및 조성물은 용액-기반 단편화 방법 및 덜 무작위적인 단편화 방법에 비해 몇몇 이점을 제공한다. 예를 들어, 정제된, 부분적으로 정제된 또는 심지어 정제되지 않은 온전한 표적 핵산을, 사전 샘플 제조 없이, 클러스터 생성을 위한 고체 지지물 또는 플로우 셀 상에 직접 로딩할 수 있다. 또한, 원래의 온전한 핵산에서의 서열 정보의 연속성이 고체 지지물 또는 플로우 셀의 표면 상의 단편들의 병치(juxtaposition)에 의해 물리적으로 보존될 수 있다. 추가의 이점으로서, 핵산 단편이 고체 지지물 또는 플로우 셀의 표면에 물리적으로 연결되므로, 핵산 단편의 추가의 조작 후 시약의 정제가, 예를 들어, 플로우 셀 채널에서 유동-통과(flow-through) 완충액 교환에 의해 달성될 수 있다.
또한, 표적 이중-가닥 핵산의 개선된 무작위 단편화는 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 라이브러리가 원래의 샘플을 더 잘 대표할 수 있게 한다.
I. 고체 지지물 상의 무작위 단편화
상기에 따라, 본 명세서에서는 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법, 및 이러한 방법에 따라 제조된 이중-가닥 핵산 단편의 라이브러리가 고정된 고체 지지물을 제시한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 (a) CRISPR/Cas9 효소가 고정된 고체 지지물을 제공하는 단계; 및 (b) 표적 이중-가닥 핵산이 CRISPR/Cas9 효소에 의해 무작위로 단편화되고, CRISPR/Cas9가 이중-가닥 핵산 단편의 적어도 하나의 가닥에 결합하는 조건 하에서 고체 지지물에 표적 이중-가닥 핵산을 적용하는 단계를 포함하고, 이에 의해, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 생성한다.
일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소는 고체 지지물 상에 직접 고정된다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 (a) CRISPR/Cas9 복합체가 고정된 고체 지지물을 제공하는 단계 - CRISPR/Cas9 복합체는 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 표적 이중-가닥 핵산에 결합하도록 유도하는 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함하는 비오티닐화된 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합된 CRISPR/Cas9 효소를 포함하고, 비오티닐화된 제1 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지물 상의 비오틴 결합 단백질에 결합됨 -; 및 (b) 표적 이중-가닥 핵산이 CRISPR/Cas9 복합체에 의해 무작위로 단편화되고, CRISPR/Cas9 복합체가 이중-가닥 핵산 단편의 적어도 하나의 가닥에 결합하는 조건 하에서 고체 지지물에 표적 이중-가닥 핵산을 적용하는 단계를 포함하고, 이에 의해, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 생성한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "무작위로 단편화된"은 다양한 단편(예를 들어, 서열 관점에서 무작위 위치에서 단편화에 의해 생성되는 단편)을 생성하기 위해 무작위 방식으로 표적 핵산을 단편화하는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 비-서열 특이적 방식으로 무작위로 단편화되어 다양한 단편 특성(identity)을 생성한다. 단편화는 DNA의 입력량에 관계없이, 정규화된 생성물 양 및 단편 크기(즉, 제어가능한 크기 선택)의 관점에서 본 발명에 의해 제어가능하다. 예를 들어, 도 1에 나타난 바와 같이, 고체 지지물 상에서 인접한 CRISPR/Cas9 효소들 사이의 거리는 고체 지지물의 표면 상에 고정되는 단편의 크기 범위에 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산은 서열 특이적 방식으로 단편화된다. 예를 들어, 아래에서 논의되는 바와 같이, 동일한 고체 지지물 상의 2개의 CRISPR/Cas9 효소 복합체는 표적 핵산 내의 관심 영역을 플랭킹(flanking)하는 한 쌍의 sgRNA를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 단일 단편은 sgRNA의 각각의 쌍에 의해 생성된다. 다른 실시형태에서, 고체 지지물(예를 들어, 비드)의 집단이 사용되며, 고체 지지물 집단에서의 각각의 고체 지지물은 상이한 쌍의 sgRNA를 보유할 수 있다. 이러한 방식으로, 상이한 고체 지지물이 표적 핵산 내의 상이한 서열을 표적화할 것이다. 일부 실시형태에서, 상이한 sgRNA 쌍은 게놈 내의 상이한 표적 서열을 표적화한다. 이들 방법은 다중 표적화를 가능하게 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CRISPR/Cas9 효소"는 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR) 및 CRISPR-관련 단백질-9 뉴클레아제(CRISPR-associated protein-9 nuclease, Cas9) 효소를 지칭한다. Csn1로도 알려진 Cas9는, 핵산(예를 들어, DNA)을 절단하도록 소형 RNA에 의해 프로그래밍되는, 2개의 뉴클레아제 도메인, RuvC 뉴클레아제 도메인 및 HNH 뉴클레아제 도메인을 함유하는 CRISPR-관련 단백질이다. CRISPR/Cas9 효소는, 미국 특허 출원 공개 제2019/0202856호의 개시내용에 예시된 바와 같이, 일반적으로 당업자에게 공지되어 있으며, 이의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 예를 들어, 유전자 조작된 CRISPR/Cas9 효소는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) Cas9(StCas9), 스트렙토코커스 파스테우리아누스(Streptococcus pasteurianus)(SpaCas9), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) Cas9(CjCas9), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) Cas9(FnCas9), 또는 나이세리아 시네레아(Neisseria cinerea) Cas9(NcCas9)로부터 유래될 수 있다. 핵산을 절단하는 것으로 알려진 Cas9의 추가적인 변이체는 당업자에게 공지되어 있으며, 야생형 또는 자연 발생 Cas9 및 돌연변이 또는 변형 Cas9(예를 들어, Cas9D10A)를 포함한다. 표적 핵산을 단편화 또는 절단할 수 있는 임의의 CRISPR/Cas9 효소는 CRISPR/Cas9 효소가 표적 DNA를 무작위로 단편화 또는 절단할 수 있는 조건 하에서 본 발명에 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CRISPR/Cas9 효소 복합체"는 일반적으로, CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 또는 서열-특이적 방식으로 표적 이중-가닥 핵산에 결합하도록 유도하는 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합된 CRISPR/Cas9 효소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지물에 고정된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 또는 서열 특이적 방식으로 표적 핵산에 결합하도록 유도하는 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 비오티닐화되고 고체 지지물은 하나 이상의 비오틴 결합 단백질을 포함한다. 예를 들어, CRISPR/Cas9 효소 복합체는 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 또는 서열 특이적 방식으로 표적 핵산에 결합하도록 유도하는 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함하는 비오티닐화된 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합된 CRISPR/Cas9 효소를 포함할 수 있고, 비오티닐화된 제1 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지물 상의 비오틴 결합 단백질에 결합된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "이중-가닥 핵산"은 이중-가닥 DNA(dsDNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 또는 이중-가닥 RNA/DNA 하이브리드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표적 이중-가닥 핵산은 dsDNA이다. 용어 "DNA"가 표적 이중-가닥 핵산 분자와 관련하여 본 개시내용 전반에 걸쳐 사용되지만, 임의의 적합한 핵산 또는 핵산 유사체가 무작위로 단편화될 수 있음이 이해되어야 한다.
용어 "CRISPR/Cas9 말단"은 CRISPR/Cas9 효소와 복합체를 형성하는 데 필요한 뉴클레오타이드 서열("CRISPR/Cas9 말단 서열")만을 나타내는 이중-가닥 핵산을 지칭한다. CRISPR/Cas9 말단은 CRISPR/Cas9 효소와 기능적 복합체를 형성하기에 적합한 임의의 핵산 또는 핵산 유사체를 포함할 수 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas9 말단은 DNA, RNA, 변형된 염기, 비-천연 염기, 변형된 골격을 포함할 수 있고, 한 가닥 또는 두 가닥 모두에 닉(nick)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "태그" 및 "태그 도메인"은 원하는 의도된 목적 또는 응용을 위한 서열을 나타내는 폴리뉴클레오타이드의 일부 또는 도메인을 지칭한다. 태그 도메인은 임의의 원하는 목적을 위해 제공되는 임의의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 태그는 범용 서열, 프라이머 서열, 인덱스 서열, 포획 서열, 바코드 서열(예를 들어, 계수 또는 오차 보정을 위해 사용됨), 절단 서열, 서열분석-관련 서열, 풍부화를 위한 서열, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기능적 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 태그 도메인은 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그 도메인은 클러스터 증폭 반응을 위한 프라이머와의 혼성화에 적합한 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그 도메인은 서열분석 반응을 위한 프라이머와의 혼성화에 적합한 하나 이상의 영역을 포함한다. 임의의 다른 적합한 특징부가 태그 도메인 내에 혼입될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일부 실시형태에서, 태그 도메인은 길이가 5 bp 내지 200 bp인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그 도메인은 길이가 10 bp 내지 100 bp인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그 도메인은 길이가 20 bp 내지 50 bp인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그 도메인은 길이가 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 150 bp 및 200 bp인 서열을 포함한다.
본 명세서에 제시된 방법 및 조성물에서, CRISPR/Cas9 효소는 고체 지지물에 고정된다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 통해 지지물에 고정된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 제1 폴리뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 표적 이중-가닥 핵산에 결합하도록 유도한다(즉, CRISPR/Cas9 효소가 표적 이중-가닥 핵산을 무작위로 단편화하거나 절단하도록 유도하는 조건). 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas9 효소가 서열-특이적 방식으로 표적 이중-가닥 핵산에 결합하도록 유도하고, 단편화는 각각의 고체 지지물이 CRISPR/Cas9 효소가 표적 핵산 내의 관심 서열의 3'에 결합하도록 유도하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 CRISPR/Cas9 복합체 및 CRISPR/Cas9 효소가 표적 핵산 내의 관심 서열의 5'에 결합하도록 유도하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 CRISPR/Cas9 복합체를 포함하는 고체 지지물의 집단을 사용하여 달성된다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지물에 고정된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 CRISPR/Cas9 복합체가 직접적으로 또는 CRISPR/Cas9 효소를 고체 지지물에 결합하는 링커 분자를 통해 고정되도록 유도하는 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일-가닥 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"는 관심 표적 이중-가닥 핵산 내의 표적 서열에 혼성화될 수 있는 단일 가닥 RNA를 지칭한다. sgRNA는 CRISPR/Cas9 효소 및 표적 서열(즉, 프로토스페이서 서열)과 상호작용하여, CRISPR/Cas9 효소가 표적 서열을 절단하는 부위의 표적 서열로 CRISPR/Cas9 효소를 안내한다.
일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 유도되는 경우, 표적 서열은 서열이 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif(PAM))에 인접하는 것을 제외하고는 서열 제한을 갖지 않는다. 예를 들어, Cas9 단백질에 대한 PAM 서열은 5'-NGG, 5'-NGGNG, 5'-NNAGAAW, 및 5'-ACAY를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소가 서열 특이적 방식으로 유도되는 경우, 표적 서열은 서열 제한을 갖는다.
일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소가 다양한 단편 크기를 생성하는 무작위 방식으로 핵산을 절단하도록 비-서열 특이적 방식으로 CRISPR/Cas9를 유도하는 sgRNA가 선택된다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 10 내지 40개의 뉴클레오타이드, 15 내지 30개의 뉴클레오타이드, 또는 17 또는 20개의 뉴클레오타이드이다. sgRNA의 예는 (GC)n 또는 (AT)n의 짧은 무작위체 또는 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, n은 5 내지 20, 8 내지 15, 또는 10이다. 당업자는 sgRNA 설계 및 구성에 익숙하며, 예를 들어 sgRNA 설계 도구는 인터넷 상에서 또는 상업적 공급원으로부터 입수가능하다. sgRNA는 화학적으로 합성될 수 있거나, 효소적으로 합성될 수 있거나, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 "비오티닐화"되고, 고체 지지물은 하나 이상의 비오틴 결합 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "비오티닐화"는 비오틴을 공유적으로 부착하는 과정을 지칭한다. 비오틴 결합 단백질은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 항-비오틴 항체, 비오틴 수용체, 및 비오틴-결합 효소, 예컨대 비오티니다제, 비오틴 할로카르복실라제 합성효소 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 핵산 결합 효소, 예컨대 CRISPR/Cas9의 핵산 결합 특이성을 감소시키는 하나 이상의 시약은 단독으로 또는 sgRNA와 조합하여(즉, CRISPR/Cas9 효소가 표적 이중-가닥 핵산을 무작위로 단편화하거나 절단하도록 유도하는 다른 조건에서) 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 처리된 CRISPR/Cas9 효소가 고정된 고체 지지물에 표적 이중-가닥 핵산이 적용될 때 CRISPR/Cas9 효소의 핵산 결합 특이성을 감소시키고 무작위 단편화를 유도하기 위해 CRISPR/Cas9 효소는 하나 이상의 시약으로 처리된다. 결합 특이성 감소 시약은 당업자에게 잘 알려져 있다. 결합 특이성 감소 시약의 예에는 베타인, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 에탄올, 에틸렌 글리콜, 다이메틸아세트아마이드, 다이메틸폼아마이드, 및/또는 설파란이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소가 표적 이중-가닥 핵산을 무작위로 단편화하거나 절단하도록 유도하는 조건은, 다른 조건에 더하여 또는 대안적으로, 높은 글리세롤 농도(예를 들어, > 5% v/v)의 사용, 고농도의 CRISPR/Cas9 효소/㎍의 DNA(예를 들어, 100 단위/㎍), (예를 들어, 최적이 아닌 이온 강도 또는 pH를 갖는) 비-최적 완충액의 사용, 연장된 반응 시간, 및/또는 Mg2+ 이외의 2가 양이온(예를 들어, Mn2+, Cu2+, Co2+, 및/또는 Zn2+)의 사용을 포함한다.
고체 지지물에 대한 분자(예를 들어, 핵산)의 고정화를 언급할 때, 용어 "고정된" 및 "부착된"은 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용되며, 이들 용어는 모두 명시적으로 또는 문맥에 의해 달리 지시되지 않는 한 직접 또는 간접, 공유 또는 비공유 부착을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 소정의 실시형태에서, 공유 부착이 바람직할 수 있지만, 일반적으로 요구되는 바는, 분자(예를 들어, 핵산)가, 예를 들어 핵산 증폭 및/또는 서열분석을 필요로 하는 응용에서 지지물을 사용하도록 의도된 조건 하에서 지지물에 고정되거나 부착된 상태로 남아 있는 것이다.
본 발명의 소정의 실시형태는, 예를 들어 생체 분자, 예컨대 폴리뉴클레오타이드에 대한 공유 부착을 허용하는 반응성 기를 포함하는 중간 재료의 층 또는 코팅의 적용에 의해, 기능화된 불활성 기재 또는 매트릭스(예를 들어, 유리 슬라이드, 중합체 비드 등)로 구성되는 고체 지지물을 사용할 수 있다. 이러한 지지물의 예에는 유리와 같은 불활성 기재 상에 지지된 폴리아크릴아마이드 하이드로겔, 특히 국제 특허 공개 WO2005/065814호 및 미국 특허 출원 공개 제2008/0280773호(이들의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 폴리아크릴아마이드 하이드로겔을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 실시형태에서, 생체분자(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드)는 중간 물질(예를 들어, 하이드로겔)에 직접 공유적으로 부착될 수 있지만, 중간 물질은 그 자체로 기재 또는 매트릭스(예를 들어, 유리 기재)에 비공유적으로 부착될 수 있다. 용어 "고체 지지물에 대한 공유 부착"은 따라서 이러한 유형의 배열을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서에서, 용어 "고체 표면", "고체 지지물" 및 다른 문법적 등가물은, CRISPR/Cas9 효소 및 CRISPR/Cas9 복합체의 부착에 적절하거나 적절하도록 변형될 수 있는 임의의 재료를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 고체 지지물은 마이크로입자, 예컨대 비드, 패턴화된 표면 또는 웰을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 가능한 기재(substrate)의 수는 매우 많다. 가능한 기재는 유리 및 개질 또는 기능화된 유리, 플라스틱(예를 들어, 아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 재료의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 테플론(Teflon)TM 등을 포함함), 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로오스, 세라믹, 수지, 실리카, 또는 규소 및 개질된 규소를 포함하는 실리카-기반 재료, 탄소, 금속, 무기 유리, 플라스틱, 광섬유 다발, 및 다양한 다른 중합체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에 특히 유용한 고체 지지물 및 고체 표면은 플로우 셀 장치 내에 위치한다. 예시적인 플로우 셀이 하기에 더 자세하게 제시된다.
일부 실시형태에서, 고체 지지물은 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체를 정렬된 패턴으로 고정하는 데 적합한 패턴화된 표면을 포함한다. "패턴화된 표면"은 고체 지지물의 노출된 층 내의 또는 그 상에서의 상이한 영역들의 배열을 지칭한다. 예를 들어, 영역들 중 하나 이상은 하나 이상의 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체가 존재하는 특징부일 수 있다. 특징부는 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체가 존재하지 않는 사이 영역(interstitial region)에 의해 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 패턴은 행(row) 및 열(column)로 있는 특징부의 x-y 포맷일 수 있다. 일부 실시형태에서, 패턴은 특징부 및/또는 사이 영역의 반복 배열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 패턴은 특징부 및/또는 사이 영역의 무작위 배열일 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체는 고체 지지물 상에 무작위로 분포된다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체는 패턴화된 표면 상에 분포된다. 본 명세서에 제시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 예시적인 패턴화된 표면이 미국 특허 출원 공개 제2012/0316086 A1호 및 제2013/0116153 A1호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 고체 지지물은 표면에 함몰부들 또는 웰들의 어레이를 포함한다. 이는, 포토리소그래피, 스탬핑 기술, 몰딩 기술 및 마이크로에칭 기술을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 기술을 사용하여 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이 제조될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 사용되는 기술은 어레이 기재의 조성 및 형상에 의존할 것이다.
고체 지지물의 조성 및 기하학적 구조는 그의 용도에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 지지물은 슬라이드, 칩, 마이크로칩 및/또는 어레이와 같은 평면 구조이다. 이와 같이, 기재의 표면은 평면 층의 형태일 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 지지물은 플로우 셀의 하나 이상의 표면을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "플로우 셀"이라는 용어는 하나 이상의 유체 시약들이 유동될 수 있는 고체 표면을 포함하는 챔버를 지칭한다. 본 발명의 방법에서 용이하게 사용될 수 있는 플로우 셀 및 관련 유체 시스템 및 검출 플랫폼의 예는, 예를 들어 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)], 국제 특허 공개 WO 04/018497호; 미국 특허 제7,057,026호; 국제 특허 공개 WO 91/06678호; 국제 특허 공개 WO 07/123744호; 미국 특허 제7,329,492호; 미국 특허 제7,211,414호; 미국 특허 제7,315,019호; 미국 특허 제7,405,281호, 및 미국 특허 출원 공개 제2008/0108082호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 고체 지지물 또는 그의 표면은 튜브 또는 용기의 내측 또는 외측 표면과 같이 비-평면이다. 일부 실시형태에서, 고체 지지물은 미소구체(microsphere) 또는 비드를 포함한다. 본 명세서에서 "미소구체" 또는 "비드" 또는 "입자" 또는 문법적 등가물은 작은 개별 입자를 의미한다. 적합한 비드 조성물은 플라스틱, 세라믹, 유리, 폴리스티렌, 메틸스티렌, 아크릴 중합체, 상자성 재료, 토리아 졸, 탄소 흑연, 이산화티타늄, 라텍스 또는 가교결합된 덱스트란, 예컨대 세파로스(Sepharose), 셀룰로오스, 나일론, 가교결합된 미셀 및 테플론TM을 포함하지만 이에 한정되지 않을 뿐만 아니라, 고체 지지물에 대해 본 명세서에 약술된 임의의 다른 재료가 모두 사용될 수 있다. 미국 인디애나주 피셔 소재의 방스 래버러토리즈(Bangs Laboratories)로부터의 "미소구체 검출 가이드(Microsphere Detection Guide)"가 유용한 안내서이다. 소정 실시형태에서, 미소구체는 자기 미소구체 또는 비드이다.
비드는 구형일 필요는 없으며; 불규칙한 입자가 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 비드는 다공성일 수 있다. 비드 크기는 나노미터, 즉 100 nm 내지 수 밀리미터, 즉 1 mm의 범위이고, 약 0.2 마이크로미터 내지 약 200 마이크로미터의 비드가 바람직하고, 약 0.5 내지 약 5 마이크로미터가 특히 바람직하지만, 일부 실시형태에서는 더 작거나 더 큰 비드가 사용될 수 있다.
도 1은 일반적으로 일 실시형태에 따른 방법을 예시한다. CRISPR/Cas9 복합체는 표면 상에 고정된다. CRISPR/Cas9 복합체는 CRISPR/Cas9 효소(Cas9) 및 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함하는 비오티닐화된 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. 표적 이중-가닥 핵산은 고체 지지물에 적용되어, CRISPR/Cas9 복합체에 의해 무작위로 단편화되고, 이중-가닥 핵산 단편은 표면 상에 고정된 CRISPR/Cas9 복합체에 결합된다. 핵산 단편의 크기는 표면 상의 고정된 CRISPR/Cas9 효소들 사이의 거리에 따라 좌우된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체는 ㎟ 당 적어도 103개, 적어도 104개, 적어도 105개, 또는 적어도 106개의 복합체의 밀도로 고체 지지물 상에 존재한다.
표적 이중-가닥 핵산이 고체 지지물에 적용될 때, CRISPR/Cas9 효소는 표적 이중-가닥 핵산을 단편화하여, 고체 지지물의 표면에 양쪽 말단이 결합된 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편을 생성할 것이다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 핵산 단편의 길이는 표면 상의 CRISPR/Cas9 효소 또는 그의 복합체의 밀도를 변화시킴으로써 다양해질 수 있다. 일부 실시형태에서, 고정된 라이브러리 내의 이중-가닥 핵산 단편의 길이는 고체 지지물 상의 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체의 밀도에 비례한다. 소정 실시형태에서, 생성된 이중-가닥 핵산 단편의 길이는 100 bp 미만, 200 bp 미만, 300 bp 미만, 400 bp 미만, 500 bp 미만, 600 bp 미만, 700 bp 미만, 800 bp 미만, 900 bp 미만, 1000 bp 미만, 1100 bp 미만, 1200 bp 미만, 1300 bp 미만, 1400 bp 미만, 1500 bp 미만, 1600 bp 미만, 1700 bp 미만, 1800 bp 미만, 1900 bp 미만, 2000 bp 미만, 2100 bp 미만, 2200 bp 미만, 2300 bp 미만, 2400 bp 미만, 2500 bp 미만, 2600 bp 미만, 2700 bp 미만, 2800 bp 미만, 2900 bp 미만, 3000 bp 미만, 3100 bp 미만, 3200 bp 미만, 3300 bp 미만, 3400 bp 미만, 3500 bp 미만, 3600 bp 미만, 3700 bp 미만, 3800 bp 미만, 3900 bp 미만, 4000 bp 미만, 4100 bp 미만, 4200 bp 미만, 4300 bp 미만, 4400 bp 미만, 4500 bp 미만, 4600 bp 미만, 4700 bp 미만, 4800 bp 미만, 4900 bp 미만, 5000 bp 미만, 10000 bp 미만, 30000 bp 미만 또는 100,000 bp 미만이다. 이러한 실시형태에서, 이중-가닥 핵산 단편은 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호의 개시내용에 의해 예시되는 바와 같이 표준 클러스터 화학을 사용하여 클러스터로 증폭될 수 있으며, 이들 각각의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 주형의 길이는 표준 클러스터 화학을 사용하여 적합하게 증폭될 수 있는 것보다 더 길다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 주형의 길이는 100 bp 초과, 200 bp 초과, 300 bp 초과, 400 bp 초과, 500 bp 초과, 600 bp 초과, 700 bp 초과, 800 bp 초과, 900 bp 초과, 1000 bp 초과, 1100 bp 초과, 1200 bp 초과, 1300 bp 초과, 1400 bp 초과, 1500 bp 초과, 1600 bp 초과, 1700 bp 초과, 1800 bp 초과, 1900 bp 초과, 2000 bp 초과, 2100 bp 초과, 2200 bp 초과, 2300 bp 초과, 2400 bp 초과, 2500 bp 초과, 2600 bp 초과, 2700 bp 초과, 2800 bp 초과, 2900 bp 초과, 3000 bp 초과, 3100 bp 초과, 3200 bp 초과, 3300 bp 초과, 3400 bp 초과, 3500 bp 초과, 3600 bp 초과, 3700 bp 초과, 3800 bp 초과, 3900 bp 초과, 4000 bp 초과, 4100 bp 초과, 4200 bp 초과, 4300 bp 초과, 4400 bp 초과, 4500 bp 초과, 4600 bp 초과, 4700 bp 초과, 4800 bp 초과, 4900 bp 초과, 5000 bp 초과, 10000 bp 초과, 30000 bp 초과 또는 100,000 bp 초과이다. 특정 실시형태에서, 주형의 길이는 상기에 예시된 것들로부터 선택되는 상한 및 하한에 의해 한정되는 범위 내에 있을 수 있다.
소정 실시형태에서, 클러스터 생성 전에, 고체 지지물의 표면 상에 고정된 이중-가닥 핵산 단편은 이미지화될 수 있다. 예를 들어, 삽입 염료를 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리의 적어도 일부에 적용하여 염색된 고정된 단편의 세트를 얻을 수 있으며, 이를 이미지화하여 표면 상의 핵산 분자의 골격의 위치 기록을 보존할 수 있다. 클러스터 생성 및 서열분석 후, 클러스터의 좌표는 원래의 골격 상의 그들의 위치와 관련될 수 있으므로 분자 및 게놈 조립체를 따른 리드(read)의 정렬을 돕는다.
일부 실시형태에서, 표적 이중-가닥 핵산을 적용하는 단계는 생물학적 샘플을 고체 지지물에 첨가하는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플은, 핵산을 포함하고 단편화를 위해 고체 표면 상에 놓일 수 있는 임의의 유형일 수 있다. 예를 들어, 샘플은 정제된 핵산을 비롯한, 다양한 정제 상태의 핵산을 포함할 수 있다. 그러나, 샘플은 완전히 정제될 필요는 없으며, 예를 들어 단백질, 다른 핵산 종, 다른 세포 성분 및/또는 임의의 다른 오염물과 혼합된 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생체 내에서 발견되는 것과 대략 동일한 비율로 존재하는 DNA, 단백질, 다른 핵산 종, 다른 세포 성분, 및/또는 임의의 다른 오염물의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 성분들은 온전한 세포에서 발견되는 것과 동일한 비율로 발견된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 2.0 미만, 1.9 미만, 1.8 미만, 1.7 미만, 1.6 미만, 1.5 미만, 1.4 미만, 1.3 미만, 1.2 미만, 1.1 미만, 1.0 미만, 0.9 미만, 0.8 미만, 0.7 미만, 또는 0.60 미만의 260/280 비를 갖는다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 적어도 2.0, 적어도 1.9, 적어도 1.8, 적어도 1.7, 적어도 1.6, 적어도 1.5, 적어도 1.4, 적어도 1.3, 적어도 1.2, 적어도 1.1, 적어도 1.0, 적어도 0.9, 적어도 0.8, 적어도 0.7, 또는 적어도 0.60의 260/280 비를 갖는다. 본 명세서에 제공된 방법은 핵산이 고체 지지물에 결합되도록 하기 때문에, 표면 결합 단편화가 일어난 후에 고체 지지물을 세척함으로써 임의의 결합되지 않은 핵산 또는 다른 오염물이 간단히 제거될 수 있다. 생물학적 샘플은, 예를 들어 조(crude) 세포 용해물 또는 전세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 방법에서 고체 지지물에 적용되는 조 세포 용해물은 다른 세포 성분으로부터 핵산을 단리하는 데 전통적으로 사용되는 하나 이상의 분리 단계를 거칠 필요가 없다. 예시적인 분리 단계는 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989] 및 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al]에 제시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다.
따라서, 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 점액, 객담, 소변, 정액, 뇌척수액, 기관지 흡인물, 대변, 및 침연 조직, 또는 이들의 용해물, 또는 핵산을 포함하는 임의의 다른 생물학적 시료를 포함할 수 있다. 본 명세서에 제시된 방법 및 조성물의 한 가지 이점은 생물학적 샘플이 플로우 셀에 첨가될 수 있으며, 단순히 필요한 시약을 플로우 셀로 흘려 보냄으로써 추가의 이동 또는 처리 단계 없이 플로우 셀에서 후속 용해 및 정제 단계가 모두 일어날 수 있다는 것이다.
또한, 상기 방법에 따라 제조된 태깅된 핵산 단편의 라이브러리가 고정된 고체 지지물이 본 명세서에 제시된다.
II. 고정된 폴리뉴클레오타이드 분자의 물리적 맵
또한, 고정된 폴리뉴클레오타이드의 물리적 맵을 생성하는 방법이 본 명세서에 제시된다. 본 방법은 연결된 서열을 포함할 가능성이 있는 클러스터(즉, 동일한 표적 폴리뉴클레오타이드 분자로부터의 제1 및 제2 부분)를 확인하기 위해 유리하게 이용될 수 있다. 따라서, 고정된 폴리뉴클레오타이드로부터 생성되는 임의의 2개의 클러스터의 상대적인 근접성은 2개의 클러스터로부터 얻은 서열 정보의 정렬에 유용한 정보를 제공한다. 구체적으로, 고체 표면 상의 임의의 2개의 주어진 클러스터 사이의 거리는, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 국제 특허 공개 WO 2012/025250호에 더 상세히 기재된 바와 같이, 2개의 클러스터가 동일한 표적 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 유래될 확률과 양의 상관관계가 있다.
일례로서, 일부 실시형태에서, 플로우 셀의 표면에 걸쳐 뻗어 있는 긴 dsDNA 분자는 원위치에서(in situ) 단편화되어, 플로우 셀의 표면을 가로질러 연결된 dsDNA 브리지(bridge)의 선을 생성한다. 또한, 고정된 DNA의 물리적 맵이 이어서 생성될 수 있다. 따라서, 물리적 맵은 고정된 DNA가 증폭된 후 클러스터의 물리적 상관관계를 보여준다. 구체적으로, 물리적 맵은, 국제 특허 공개 WO 2012/025250호의 통합 자료에 기재된 바와 같이, 임의의 2개의 클러스터로부터 얻어진 서열 데이터가 연결될 확률을 계산하는 데 사용된다.
일부 실시형태에서, 물리적 맵은 고체 표면을 가로지르는 고정된 핵산 분자의 위치를 확립하기 위해 핵산을 이미지화함으로써 생성된다. 일부 실시형태에서, 고정된 핵산은 고체 지지물에 이미징제(imaging agent)를 첨가하고 이미징제로부터의 신호를 검출함으로써 이미지화된다. 일부 실시형태에서, 이미징제는 검출가능한 표지이다. 적합한 검출가능한 표지는 양성자, 합텐, 방사성 핵종, 효소, 형광 표지, 화학발광 표지, 및/또는 발색제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이미징제는 삽입 염료 또는 비-삽입 핵산 결합제이다. 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2012/0282617호에 제시된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 삽입 염료 또는 비-삽입 핵산 결합제가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 고정된 이중-가닥 핵산 단편은 클러스터 생성 전에 자유 말단을 유리시키기 위해 추가로 단편화된다. 브리지된 구조의 절단은 국제 특허 공개 WO 2012/025250호의 통합 자료에 의해 예시되는 바와 같이, 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 절단은, 본 명세서의 다른 부분에 기재된 바와 같이, 국제 특허 공개 WO 2012/025250호에 기재된 바와 같은 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 우라실의 혼입에 의해, 제한 엔도뉴클레아제 부위의 혼입에 의해, 또는 용액-상 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체를 브리지된 핵산 구조에 적용함으로써 일어날 수 있다.
소정 실시형태에서, 복수의 표적 이중-가닥 핵산 분자는 복수의 나노-채널을 포함하는 플로우 셀 상으로 유동되고, 나노-채널은 그에 고정된 복수의 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체를 갖는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 나노-채널은 긴 선형 핵산 분자가 유동되는 좁은 채널을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산의 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 10개 이하, 11개 이하, 12개 이하, 13개 이하, 14개 이하, 15개 이하, 16개 이하, 17개 이하, 18개 이하, 19개 이하, 20개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 100개 이하, 200개 이하, 300개 이하, 400개 이하, 500개 이하, 600개 이하, 700개 이하, 800개 이하, 900개 이하 또는 1000개 이하의 개별적인 긴 가닥이 각각의 나노-채널 내로 유동된다. 일부 실시형태에서, 개별 나노-채널은 표적 핵산의 개별적인 긴 가닥이 다수의 나노-채널과 상호작용하는 것을 방지하는 물리적 장벽에 의해 분리된다. 일부 실시형태에서, 고체 지지물은 적어도 10개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 500개, 적어도 1000개, 적어도 3000개, 적어도 5000개, 적어도 10000개, 적어도 30000개, 적어도 50000개, 적어도 80000개 또는 적어도 100000개의 나노-채널을 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노-채널의 표면에 결합된 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체가 핵산을 단편화 한다. 이어서, 예를 들어, 이들 채널들 중 하나의 길이를 따라 클러스터를 따라 감으로써 연속성 맵핑이 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산의 긴 가닥은 길이가 적어도 0.1kb, 적어도 1kb, 적어도 2kb, 적어도 3kb, 적어도 4kb, 적어도 5kb, 적어도 6kb, 적어도 7kb, 적어도 8kb, 적어도 9kb, 적어도 10kb, 적어도 15kb, 적어도 20kb, 적어도 25kb, 적어도 30kb, 적어도 35kb, 적어도 40kb, 적어도 45kb, 적어도 50kb, 적어도 55kb, 적어도 60kb, 적어도 65kb, 적어도 70kb, 적어도 75kb, 적어도 80kb, 적어도 85kb, 적어도 90kb, 적어도 95kb, 적어도 100kb, 적어도 150kb, 적어도 200kb, 적어도 250kb, 적어도 300kb, 적어도 350kb, 적어도 400kb, 적어도 450kb, 적어도 500kb, 적어도 550kb, 적어도 600kb, 적어도 650kb, 적어도 700kb, 적어도 750kb, 적어도 800kb, 적어도 850kb, 적어도 900kb, 적어도 950kb, 적어도 1000kb, 적어도 5000kb, 적어도 10000kb, 적어도 20000kb, 적어도 30000kb, 또는 적어도 50000kb일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산의 긴 가닥은 길이가 0.1kb 이하, 1kb 이하, 2kb 이하, 3kb 이하, 4kb 이하, 5kb 이하, 6kb 이하, 7kb 이하, 8kb 이하, 9kb 이하, 10kb 이하, 15kb 이하, 20kb 이하, 25kb 이하, 30kb 이하, 35kb 이하, 40kb 이하, 45kb 이하, 50kb 이하, 55kb 이하, 60kb 이하, 65kb 이하, 70kb 이하, 75kb 이하, 80kb 이하, 85kb 이하, 90kb 이하, 95kb 이하, 100kb 이하, 150kb 이하, 200kb 이하, 250kb 이하, 300kb 이하, 350kb 이하, 400kb 이하, 450kb 이하, 500kb 이하, 550kb 이하, 600kb 이하, 650kb 이하, 700kb 이하, 750kb 이하, 800kb 이하, 850kb 이하, 900kb 이하, 950kb 이하, 또는 1000kb 이하이다. 일례로서, 나노-채널 내에 맵핑된 고정된 단편화 생성물을 갖는 1000개 이상의 나노-채널을 갖는 플로우 셀이 짧은 '위치설정된' 리드를 갖는 유기체의 게놈을 서열화하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노-채널 내의 맵핑된 고정된 단편화 생성물은 일배체형(haplotype)을 해결하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노-채널 내의 맵핑된 고정된 단편화 생성물은 페이징(phasing) 문제를 해결하는 데 사용될 수 있다.
III. 고정된 핵산 단편의 증폭 및 서열분석
증폭. 본 발명은 또한 본 명세서에 제공된 방법에 따라 생성된 고정된 핵산 단편의 증폭에 관한 것이다. 표면 결합된 CRISPR/Cas9 효소 매개 단편화에 의해 생성된 고정된 핵산 단편은 당업계에 공지된 임의의 적합한 증폭 방법에 따라 증폭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고정된 DNA 단편은 고체 지지물 상에서 증폭된다. 일부 실시형태에서, 고체 지지물은 표면 결합 단편화가 일어나는 동일한 고체 지지물이다. 이러한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물은 초기 샘플 도입 단계부터 증폭을 통해 그리고 선택적으로 서열분석 단계를 통해 동일한 고체 지지물 상에서 샘플 제조가 진행되도록 한다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 고정된 핵산 단편은 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호의 개시내용에 의해 예시된 바와 같은 클러스터 증폭 방법을 사용하여 증폭되며, 상기 특허들 각각의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호의 통합 자료는, 고정된 핵산 분자의 클러스터 또는 "콜로니"로 구성된 어레이를 형성하기 위하여 증폭 생성물이 고체 지지물 상에 고정되게 하는 고체상 핵산 증폭 방법을 기재한다. 그러한 어레이 상의 각각의 클러스터 또는 콜로니는 복수의 동일한 고정된 폴리뉴클레오타이드 가닥 및 복수의 동일한 고정된 상보적 폴리뉴클레오타이드 가닥으로부터 형성된다. 이렇게 형성된 어레이는 일반적으로 본 명세서에서 "클러스터형 어레이(clustered array)"로 지칭된다. 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호에 기재된 것과 같은 고체상 증폭 반응의 생성물은 고정된 폴리뉴클레오타이드 가닥과 고정된 상보적 가닥 쌍의 어닐링에 의해 형성된 소위 "브리지된" 구조이며, 두 가닥은 모두 5' 말단에서, 바람직하게는 공유 부착을 통해 고체 지지물 상에 고정된다. 클러스터 증폭 방법은 고정된 핵산 주형을 사용하여 고정된 앰플리콘(amplicon)을 생성하는 방법의 예이다. 다른 적합한 방법이 또한 본 명세서에 제공된 방법에 따라 생성되는 고정된 핵산 단편으로부터 고정된 앰플리콘을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 각각의 증폭 프라이머 쌍의 하나의 프라이머가 고정되든 또는 둘 모두의 프라이머가 고정되든 간에 하나 이상의 클러스터 또는 콜로니가 고체상 PCR을 통해 형성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 고정된 핵산 단편은 용액 중에서 증폭된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 고정된 핵산 단편은 절단되거나 그렇지 않으면 고체 지지물로부터 유리되며, 이어서 증폭 프라이머는 용액 중에서 유리된 분자에 혼성화된다. 다른 실시형태에서, 증폭 프라이머는 하나 이상의 초기 증폭 단계를 위해 고정된 핵산 단편에 혼성화되고, 용액 중에서 후속 증폭 단계가 이어진다. 따라서, 일부 실시형태에서, 고정된 핵산 주형은 용액-상 앰플리콘을 생성하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재되거나 당업계에 일반적으로 공지된 임의의 증폭 방법은 범용 또는 표적-특이적 프라이머와 함께 이용되어 고정된 핵산 단편을 증폭할 수 있음이 이해될 것이다. 증폭에 적합한 방법은, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제8,003,354호에 기재된 바와 같이, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 가닥 변위 증폭(SDA), 전사 매개 증폭(TMA) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 증폭 방법은 하나 이상의 관심 핵산을 증폭하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 다중 PCR, SDA, TMA, NASBA 등을 포함하는 PCR을 이용하여, 고정된 핵산 단편을 증폭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심 핵산에 특이적으로 관련된 프라이머가 증폭 반응에 포함된다.
핵산의 증폭을 위한 다른 적합한 방법은 올리고뉴클레오타이드 연장 및 라이게이션, 롤링 서클 증폭(RCA)(본 명세서에 참고로 포함된, 문헌[Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)]) 및 올리고뉴클레오타이드 라이게이션 검정(oligonucleotide ligation assay, OLA)(일반적으로 미국 특허 제7,582,420호, 제5,185,243호, 제5,679,524호 및 제5,573,907호; 유럽 특허 제0 320 308 B1호; 유럽 특허 제0 336 731 B1호; 유럽 특허 제0 439 182 B1호; 국제 특허 공개 WO 90/01069호; 국제 특허 공개 WO 89/12696호; 및 국제특허 공개 WO 89/09835호 참조, 이들 모두는 참고로 포함됨) 기술을 포함할 수 있다. 이들 증폭 방법은 고정된 핵산 단편을 증폭하도록 설계될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 증폭 방법은 관심 핵산에 특이적으로 관련된 프라이머를 포함하는 라이게이션 프로브 증폭 또는 올리고뉴클레오타이드 라이게이션 검정(OLA) 반응을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭 방법은 관심 핵산에 특이적으로 관련된 프라이머를 포함하는 프라이머 연장-라이게이션 반응을 포함할 수 있다. 관심 핵산을 증폭하도록 특이적으로 설계될 수 있는 프라이머 연장 및 라이게이션 프라이머의 비제한적인 예로서, 각각 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,582,420호 및 제7,611,869호에 의해 예시되는 바와 같이, 증폭은 골든게이트(GoldenGate) 검정에 사용되는 프라이머(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 일루미나, 인크.(Illumina, Inc.))를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 등온 증폭 방법은, 예를 들어 문헌[Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 5261-66(2002)]에 의해 예시된 바와 같은 다중 변위 증폭(MDA) 또는 예를 들어, 미국 특허 제6,214,587호에 의해 예시된 등온 가닥 변위 핵산 증폭을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않으며, 이들 문헌의 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명에 사용될 수 있는 다른 비-PCR-기반 방법은, 예를 들어 문헌[Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995]; 미국 특허 제5,455,166호 및 제5,130,238호, 및 문헌[Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)]에 기재된 가닥 변위 증폭(SDA) 또는 예를 들어 문헌[Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003)]에 기재된 과분지형(hyperbranched) 가닥 변위 증폭을 포함하며, 이들 문헌의 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 예를 들어, 등온 증폭 방법은 게놈 DNA의 무작위 프라이머 증폭을 위해 가닥-변위 Phi 29 중합효소 또는 Bst DNA 중합효소 큰 단편, 5'->3' 엑소-와 함께 사용될 수 있다. 이들 중합효소의 사용은 그들의 높은 가공성 및 가닥 변위 활성을 활용한다. 높은 가공성으로 인해 중합효소는 길이가 10kb 내지 20kb인 단편을 생성한다. 상기에 제시된 바와 같이, 클레노브(Klenow) 중합효소와 같이 낮은 가공성 및 가닥-변위 활성을 갖는 중합효소를 사용하여 등온 조건 하에서 더 작은 단편을 생성할 수 있다 증폭 반응, 조건 및 구성요소에 대한 추가 설명은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,670,810호의 개시내용에 상세히 제시되어 있다.
본 발명에 유용한 다른 핵산 증폭 방법은, 예를 들어 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Grothues et al. Nucleic Acids Res. 21(5):1321-2 (1993)]에 기재된 바와 같은 불변 5' 영역 다음에 무작위 3' 영역을 갖는 2-도메인 프라이머의 집단을 사용하는 태깅된 PCR이다. 무작위로 합성된 3' 영역으로부터의 개별 혼성화에 기초하여 열 변성 핵산에 대한 다수의 개시를 허용하도록 제1 증폭 라운드가 수행된다. 3' 영역의 특성으로 인해, 개시 부위는 게놈 전체에 걸쳐 무작위인 것으로 고려된다. 그 후에, 결합되지 않은 프라이머는 제거될 수 있고 불변 5' 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 추가의 복제가 일어날 수 있다.
서열분석. 본 발명은 또한 본 명세서에 제공된 방법에 따라 생성된 고정된 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 서열분석에 관한 것이다. 표면 결합된 CRISPR/Cas9 효소 매개 단편화에 의해 생성된 고정된 이중-가닥 핵산 단편은 임의의 적합한 서열분석 방법, 예컨대 합성에 의한 서열분석, 라이게이션에 의한 서열분석, 혼성화에 의한 서열분석, 나노기공 서열분석 등을 포함하는 직접 서열분석에 따라 서열분석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고정된 핵산 단편은 고체 지지물 상에서 서열분석된다. 일부 실시형태에서, 서열분석을 위한 고체 지지물은 표면 결합 단편화가 일어나는 동일한 고체 지지물이다. 일부 실시형태에서, 서열분석을 위한 고체 지지물은 증폭이 일어나는 동일한 고체 지지물이다. 일부 실시형태에서, 제1 고체 지지물은 단편화에 사용되고 제2 고체 지지물은 증폭 및 서열분석에 사용된다.
한 가지 바람직한 서열분석 방법은 합성에 의한 서열분석(SBS)이다. SBS에서, 주형에서 뉴클레오타이드의 서열을 결정하기 위해 핵산 주형(예를 들어, 표적 핵산 또는 이의 앰플리콘)을 따른 핵산 프라이머의 연장이 모니터링된다. 근본적인 화학적 과정은 (예를 들어, 중합효소에 의해 촉매되는 바와 같은) 중합일 수 있다. 특정 중합효소-기반 SBS 실시형태에서, 형광 표지된 뉴클레오타이드를 주형 의존 방식으로 프라이머에 첨가하여(그에 의해 프라이머를 연장시켜), 프라이머에 첨가된 뉴클레오타이드의 순서 및 유형의 검출을 사용하여 주형의 서열을 결정할 수 있다.
플로우 셀은 본 발명의 방법에 의해 생성된 증폭된 핵산 단편을 수용(housing)하기 위한 편리한 고체 지지물을 제공한다. 이러한 형식의 하나 이상의 증폭된 핵산 단편은 사이클에서 시약의 반복된 전달을 수반하는 SBS 또는 다른 검출 기술을 거칠 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 SBS 사이클을 개시하기 위해, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드, 핵산 또는 DNA 중합효소 등이, 하나 이상의 증폭된 핵산 분자를 수용하는 플로우 셀 내로/플로우 셀을 통해 유동될 수 있다. 프라이머 연장으로 인해 표지된 뉴클레오타이드가 혼입되는 부위가 검출될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는, 일단 뉴클레오타이드가 프라이머에 첨가되었다면, 추가 프라이머 연장을 종결시키는 가역적 종결 속성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 탈블로킹제(deblocking agent)가 전달되어 모이어티를 제거할 때까지 후속 연장이 발생할 수 없도록, 가역적 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 유사체가 프라이머에 첨가될 수 있다. 따라서, 가역적 종결을 사용하는 실시형태의 경우, 탈블로킹 시약은 (검출이 일어나기 전에 또는 후에) 플로우 셀로 전달될 수 있다. 다양한 전달 단계들 사이에서 세척이 수행될 수 있다. 이어서, 사이클을 n번 반복하여 n개의 뉴클레오타이드만큼 프라이머를 연장하여, 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 앰플리콘과 함께 사용하기 위해 용이하게 조정될 수 있는 예시적인 SBS 절차, 유체 시스템, 및 검출 플랫폼이, 예를 들어 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)], 국제 특허 공개 WO 04/018497호; 미국 특허 제7,057,026호; 국제 특허 공개 WO 91/06678호; 국제 특허 공개 WO 07/123744호; 미국 특허 제7,329,492호; 미국 특허 제7,211,414호; 미국 특허 제7,315,019호; 미국 특허 제7,405,281호, 및 미국 특허 출원 공개 제2008/0108082호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
순환 반응을 사용하는 다른 서열분석 절차, 예를 들어, 파이로시퀀싱이 사용될 수 있다. 파이로시퀀싱은 특정 뉴클레오타이드가 초기(nascent) 핵산 가닥에 혼입될 때 무기 파이로포스페이트(PPi)의 방출을 검출한다(문헌[Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9(1996)]; 문헌[Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); 문헌[Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998)]; 미국 특허 제6,210,891호; 미국 특허 제6,258,568호, 및 미국 특허 제6,274,320호, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함됨). 파이로시퀀싱에서, 방출된 PPi는 ATP 설퍼릴라제에 의해 아데노신 트라이포스페이트(ATP)로 즉시 전환됨으로써 검출될 수 있고, 생성된 ATP의 수준은 루시페라제-생성된 광자를 통해 검출될 수 있다. 따라서, 서열분석 반응은 발광 검출 시스템을 통해 모니터링될 수 있다. 형광 기반 검출 시스템에 사용되는 여기 방사선 공급원은 파이로시퀀싱 절차에는 필요하지 않다. 본 발명에 따라 생성된 앰플리콘에 파이로시퀀싱을 적용하도록 조정될 수 있는 유용한 유체 시스템, 검출기 및 절차가, 예를 들어, 국제 특허 출원 PCT/US11/57111호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0191698 A1호, 미국 특허 제7,595,883호, 및 미국 특허 제7,244,559호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시형태는 핵산 또는 DNA 중합효소 활성의 실시간 모니터링을 포함하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 혼입은 형광단-함유 중합효소와 γ-포스페이트-표지된 뉴클레오타이드 사이의 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 상호작용을 통해, 또는 제로모드 도파관(zeromode waveguide, ZMW)을 이용하여 검출될 수 있다. FRET-기반 서열분석을 위한 기술 및 시약은, 예를 들어 문헌[Levene et al. Science 299, 682-686 (2003)]; 문헌[Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008)]; 문헌[Korlach et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)]에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 SBS 실시형태는 연장 생성물 내로의 뉴클레오타이드의 혼입 시 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출에 기초한 서열분석은 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)의 이온 토렌트(Ion Torrent) 제품 라인으로 구매가능한 전기 검출기 및 관련 기술 또는 미국 특허 출원 공개 제2009/0026082 A1호; 미국 특허 출원 공개 제2009/0127589 A1호; 미국 특허 출원 공개 제2010/0137143 A1호; 또는 미국 특허 출원 공개 제2010/0282617 A1호에 기재된 서열분석 방법 및 시스템을 사용할 수 있으며, 상기 미국 특허 출원 공개의 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 운동력학적 배제(kinetic exclusion)를 사용하여 표적 핵산을 증폭하기 위한 본 명세서에 제시된 방법은 양성자를 검출하는 데 사용되는 기재에 용이하게 적용될 수 있다. 더 구체적으로, 본 명세서에 제시된 방법은 양성자를 검출하는 데 사용되는 앰플리콘의 클론성 집단을 생성하는 데 사용될 수 있다.
다른 유용한 서열분석 기술은 나노기공 서열분석이다(예를 들어, 문헌[Deamer et al. Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000)]; 문헌[Deamer et al. Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002)]; 문헌[Li et al. Nat. Mater. 2:611-615 (2003)]을 참조하며, 이들 문헌의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다). 일부 나노기공 실시형태에서, 표적 핵산 또는 표적 핵산으로부터 제거된 개별 뉴클레오타이드는 나노기공을 통과한다. 핵산 또는 뉴클레오타이드가 나노기공을 통과할 때, 각각의 뉴클레오타이드 유형은 기공의 전기 전도도의 변동을 측정함으로써 확인될 수 있다(미국 특허 제7,001,792호; 문헌[Soni et al. Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007)]; 문헌[Healy, Nanomed. 2, 459-481 (2007)]; 문헌[Cockroft et al. J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)], 이들의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함됨).
본 발명에 따른 검출에 적용될 수 있는 어레이-기반 발현 및 유전자형 분석을 위한 예시적인 방법은 미국 특허 제7,582,420호; 제6,890,741호; 제6,913,884호 또는 제6,355,431호 또는 미국 특허 출원 공개 제2005/0053980 A1호; 제2009/0186349 A1호 또는 제2005/0181440 A1호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 제시된 방법의 이점은 이들이 병렬로 복수의 표적 핵산의 신속하고 효율적인 검출을 제공한다는 것이다. 따라서, 본 발명은 상기에 예시된 것과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 핵산을 제조 및 검출할 수 있는 통합 시스템을 제공한다. 따라서, 본 발명의 통합 시스템은 증폭 시약 및/또는 서열분석 시약을 하나 이상의 고정된 DNA 단편으로 전달할 수 있는 유체 구성요소를 포함할 수 있으며, 시스템은 펌프, 밸브, 저장소, 유체 라인 등과 같은 구성요소를 포함한다. 표적 핵산의 검출을 위한 통합 시스템에서 플로우 셀이 구성 및/또는 사용될 수 있다. 예시적인 플로우 셀은, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2010/0111768 A1호 및 미국 특허 출원 제13/273,666호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 플로우 셀에 대해 예시된 바와 같이, 통합 시스템의 유체 구성요소들 중 하나 이상이 증폭 방법 및 검출 방법에 사용될 수 있다. 핵산 서열분석 실시형태를 예로 들면, 통합된 시스템의 하나 이상의 유체 구성요소가 본 명세서에 제시된 증폭 방법 및 상기 예시된 것과 같은 서열분석 방법에서의 서열분석 시약의 전달을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 통합 시스템은 증폭 방법을 수행하기 위해 그리고 검출 방법을 수행하기 위해 별개의 유체 시스템을 포함할 수 있다. 증폭된 핵산을 생성하고 또한 핵산의 서열을 결정할 수 있는 통합 서열분석 시스템의 예는, 제한 없이, MiSeqTM 플랫폼(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 일루미나, 인크.) 및 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제13/273,666호에 개시된 장치를 포함한다.
IV. 고정된 CRISPR/Cas9 복합체를 갖는 고체 지지물 및 제조 방법
본 명세서에 제시된 다른 실시형태는 CRISPR/Cas9 효소가 고정된 고체 지지물, 예컨대 비드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 고체 지지물에는 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 표적 핵산에 결합하도록 유도하는 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합된 CRISPR/Cas9 효소를 포함하는 CRISPR/Cas9 복합체가 고정되어 있다. 소정의 다른 실시형태에서, 고체 지지물에는 CRISPR/Cas9 효소가 서열 특이적 방식으로 표적 핵산에 결합하도록 유도하는 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합된 CRISPR/Cas9 효소를 포함하는 CRISPR/Cas9 복합체가 고정되어 있다. 일부 실시형태에서, 상이한 고체 지지물은 CRISPR/Cas9 효소가 상이한 서열에서 표적 핵산에 결합하도록 유도한다. 일부 실시형태에서, 고체 지지물 상의 제1 CRISPR/Cas9 효소는 제1 CRISPR/Cas9 효소가 관심 서열의 표적 핵산 3'에 결합하도록 유도하는 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합되고, 고체 지지물 상의 제2 CRISPR/Cas9 효소는 제2 CRISPR/Cas9 효소가 관심 서열의 표적 핵산 5'에 결합하도록 유도하는 제2 폴리뉴클레오타이드에 결합된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로(또는 선택적으로 각각의 고체 지지물이 관심 서열 주위의 플랭킹 영역을 표적화하는 한 쌍의 sgRNA를 포함하는, 상이한 서열을 표적화하는 고체 지지물의 집단에서 서열 특이적 방식으로) 표적 핵산에 결합하도록 유도하는 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 비오티닐화되고 고체 지지물은 하나 이상의 비오틴 결합 단백질을 포함한다. 이러한 표면 결합된 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체의 밀도는 다양할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체는 ㎟ 당 적어도 103개, 적어도 104개, 적어도 105개, 또는 적어도 106개의 효소 또는 복합체의 밀도로 고체 지지물 상에 존재한다.
V. CRISPR/Cas9 마이크로입자를 사용한 단편화
본 명세서에 제시된 일 실시형태는 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체가 고정된 마이크로입자(예를 들어, 비드)의 집단이다. 고체 지지물, 예컨대 비드의 사용은 용액-기반 단편화에 비해 몇몇 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 표준 용액-기반 단편화에서, 단편화 반응의 최종 단편 크기를 제어하는 것은 어렵다. 단편 크기는 핵산의 양 및 크기와 반응 지속시간에 대한 CRISPR/Cas9의 비의 함수이다. 이들 파라미터가 제어되더라도, 결합 쌍을 이룬-리드 길이보다 더 짧은 과량의 작은 단편을 제거하기 위한 추가 단계로서 크기 선택 분획화가 통상적으로 필요하다. 본 명세서에 제공된 방법은 그러한 단점을 피한다. 구체적으로, 비드-고정된 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체는, 단편화 반응에 첨가되는 CRISPR/Cas9 비드의 양과 관계없이, 결합된 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체의 공간적 분리의 함수로서의 최종 단편 크기의 선택을 가능하게 한다. 용액-기반 단편화의 추가적인 한계는, 전형적으로 PCR 증폭 전 및 후에 단편화 반응의 생성물의 일부 형태의 정제를 수행하는 것이 필요하다는 것이다. 이는 전형적으로 튜브로부터 튜브로의 반응의 일부 이동을 필요로 한다. 대조적으로, 비드 기반 CRISPR/Cas9에서의 단편화 생성물은 세척되고 추후 증폭 또는 다른 하류 처리를 위해 방출될 수 있어서, 샘플 이동이 필요하지 않다. 예를 들어, CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체가 상자성 비드 상에 조립되는 실시형태에서, 단편화 반응 생성물의 정제는 비드를 자석으로 고정하고 세척함으로써 용이하게 달성될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 단편화 및 다른 하류 처리, 예컨대 PCR 증폭이 모두 단일 튜브, 용기, 액적 또는 다른 용기 내에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플의 단편화 및 하류 처리는, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2013/0116128호에 기재된 바와 같은 미세유체 액적 기반 장치에서 일어난다. 예를 들어, 미세유체 액적 기반 장치에서, 표적 핵산을 함유하는 액적, 세척 완충액 또는 다른 시약은 고정된 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체를 포함하는 표면 위를 통과할 수 있다. 마찬가지로, CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체가 고정된 비드를 포함하는 액적은 미세유체 액적 기반 장치에서 표적 이중-가닥 핵산, 세척 완충액 또는 다른 시약과 접촉될 수 있다.
CRISPR/Cas9 비드가 단편화 완충액 중에서 표적 이중-가닥 핵산의 용액에 첨가되는 경우, 무작위 단편화가 일어나서, 표적 이중-가닥 핵산을 비드의 표면에 연결한다. 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리가 생성된다.
일부 실시형태에서, 브리지된 단편의 길이는 비드의 표면 상의 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체의 밀도에 의해 좌우될 수 있다. 일단 단편화가 완료되면, 임의의 적합한 방법을 사용하여 이중-가닥 핵산 단편이 비드의 표면으로부터 유리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단편화 생성물은 증폭 방법, 예컨대 억제 PCR, 스텝-아웃(step-out) PCR 등을 사용하여 비드로부터 유리된다. 일부 실시형태에서, 단편화 생성물은 절단에 의해 비드로부터 유리된다. 절단은, 예를 들어 화학적, 효소적, 광화학적 또는 이들의 조합일 수 있다. 고체 지지물로부터 하나 이상의 단편화 생성물을 방출시키기 위한 임의의 적합한 방법이 본 명세서에 제공된 방법에 이용될 수 있음이 이해될 것이다.
핵산은 접촉 확률을 증가시키는 임의의 적합한 방법을 사용하여 표면 결합된 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체와 효율적으로 접촉될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 고체 표면 상으로의 핵산의 침전이 표적 이중-가닥 핵산과 고체 표면 상의 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체 사이의 접촉을 증가시키는 데 이용될 수 있다. 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 국제 특허 공개 WO 2010/115122호의 개시내용에 의해 예시되는 바와 같이, 핵산을 고체 지지물과 접촉시키기 위한 당업계에 공지된 다수의 방법 중 어느 하나가 이용될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 핵산은 PEG, 에탄올, 또는 핵산을 표면 상으로 침전시키는 것으로 알려진 다양한 다른 시약 중 어느 하나, 예를 들어, 고체상 가역적 고정화(solid phase reversible immobilization, SPRI) 기술에 사용되는 다수의 완충액 중 어느 하나를 첨가하여 고체 지지물 상에 침전될 수 있다.
일부 실시형태에서, 고정된 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체를 갖는 비드의 집단은 CRISPR/Cas9 효소, 복합체, 또는 올리고뉴클레오타이드를 갖지 않는 과량의 비드와 혼합되어, 2개 이상의 상이한 비드에 걸친 단편화의 가능성을 감소시킬 수 있다. 둘 이상의 상이한 비드에 걸친 단편화 가능성을 감소시키는 또 다른 방법은 비드를 고정시켜 비드들 사이의 접촉을 최소화하는 것을 포함한다. 비드의 고정화는 예를 들어, 마이크로원심분리 튜브와 같은 고체 표면의 측면에 자성을 통해 비드를 고정하는 것, 또는 국제 특허 공개 WO 2010/115122호의 통합된 자료에 의해 예시된 바와 같은 임의의 다른 고정화 기술을 포함하는 당업계에 공지된 다수의 기술 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 비드는 단일 세포, 예컨대 원핵 또는 진핵 세포로부터 핵산을 단리하고 확인하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 비드와 같은 입자는 동일한 인덱스를 공유하는 인덱싱된 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체로 코팅된다(특정 비드 상에 존재하는 모든 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체는 동일한 인덱스를 보유하며, 이는 다른 비드 상에 존재하는 인덱스와 상이하다). 이어서, 비드는 당업계에 공지된 다양한 방법들 중 어느 하나를 통해 세포 내부에 배치될 수 있다. 예를 들어, 세포 내부에 비드를 전달하기 위한 방법은 유전자 건(gene gun), 광열 나노블레이드(photothermal nanoblade)(문헌[Wu et al. Anal Chem. (2011) 4:1321-7]), 및 세포 투과화 물질과 함께 사용되는 펩타이드(문헌[Nitin et al Ann Biomed Eng. (2009) 37:2018-2027]) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 단일 세포로부터의 핵산을 인덱싱된 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체를 갖는 입자와 결합시키는 임의의 적합한 방법이 본 명세서에 제시된 방법에서 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체는 상기에 상세히 기재된 바와 같이 비드에 공유적으로 부착될 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체는 화학적 또는 물리적 자극의 적용 시에 비드로부터 방출될 수 있다. 고체 지지물로부터의 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체의 방출을 유발할 수 있는 자극의 일부 예는 빛 및/또는 온도 변화(예를 들어, 열)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체는 제한 엔도뉴클레아제와 같은 효소의 활성을 사용하여 고체 지지물로부터 방출된다. 특정 실시형태에서, CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체는 비드로부터 분리되어 세포 내부에서 자유롭게 이동할 수 있다. 일단 비드(또는 대안적으로, 방출된 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체)가 염색질 또는 핵산과 접촉하게 되면, 단편화가 일어날 수 있다. 진핵 및 원핵 시스템에서, 모든 게놈 DNA가 항상 접근가능하고/하거나 단편화에 이용가능한 것은 아니라는 것이 이해될 것이다. 일부 실시형태에서, 세포 내의 전체 핵산의 최대 0.001%, 최대 0.01%, 최대 0.1%, 최대 1%, 최대 2%, 최대 3%, 최대 4%, 최대 5%, 최대 6%, 최대 7%, 최대 8%, 최대 9%, 최대 10%, 최대 15%, 최대 20%, 최대 25%, 최대 30%, 최대 35%, 최대 40%, 최대 45%, 최대 50%, 최대 55%, 최대 60%, 최대 65%, 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 최대 95% 또는 최대 99%, 또는 99% 초과가 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체에 의해 단편화된다.
일부 실시형태에서, 이중-가닥 핵산 단편은, 예를 들어 제1 태그 도메인을 포함하는 제1 태그로 태깅된다. 일부 실시형태에서, 제1 태그 도메인은 클러스터 증폭을 위한 영역 및/또는 서열분석 반응을 프라이밍하기 위한 영역을 포함할 수 있다. 단편의 태깅은 동일한 태그를 공유하는 리드를 함께 그룹화함으로써 동일한 세포 또는 다른 생물학적 샘플로부터 리드를 식별하는 것을 가능하게 한다. 이들 리드는 동일한 고체 지지물 또는 비드로부터 (따라서 동일한 세포 또는 생물학적 샘플로부터) 유도된 것으로 간주될 수 있다.
일부 실시형태에서, 개별 생물학적 샘플 또는 표적 이중-가닥 핵산이 다수의 고체 지지물 또는 비드에 의해 단편화되지 않는 것을 보장하기 위한 접근법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 가지 접근법은 세포의 크기와 유사한 크기의 비드를 사용하는 것이다. 이는 세포가 다수의 비드를 수용할 수 없음을 보장할 것이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 다른 접근법은 단일 세포 표적화를 선호하는 세포 대 비드 비를 사용하는 것이다. 예를 들어, 비드보다 훨씬 더 많은 세포가 있는 경우, 세포 내부의 비드의 푸아송(Poisson) 분포는 단일 비드를 차지한 세포가 2개 이상의 비드를 차지한 세포보다 훨씬 많다는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 전술된 단일 세포 접근법은 2개의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 또는 구조적 재배열이 동일한 세포에 존재하는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 암 세포의 이종 집단의 경우, 두 개의 SNP가 동일 세포 내에 존재하는지 또는 상이한 세포 내에 존재하는지를 아는 것은 올바른 암 치료법을 구현하는 데 도움이 될 수 있다.
일부 실시형태에서, 전술된 단일 세포 접근법을 사용하여 RNA를 연구할 수 있다. 예를 들어, 역전사 단계를 위한 적합한 효소(즉, 역전사효소) 및 올리고뉴클레오타이드로 비드를 코팅함으로써, 단일 세포 수준에서의 유전자 발현을 분석할 수 있다. 일 실시형태에서, 역전사효소, 올리고뉴클레오타이드 및 CRISPR/Cas9 효소로 코팅된 비드를 도입한 후, 세포질 RNA는 cDNA로 전환되고, 태깅되고, 세포 내부에서 제조될 수 있다.
VI. 고정된 CRISPR/Cas9 효소를 사용하여 롱 리드(Long Read)를 조립하는 방법
핵산 단편의 조립은 핵산 분자 집단 내의 개별 긴 핵산 분자의 단리 및 각 핵산의 단편 라이브러리로의 전환을 가능하게 한다. 핵산 단편의 라이브러리가 태깅되고 서열분석될 때, 핵산 단편은 예를 들어 그들이 함유하는 태그들을 참조하여 원래의 긴 분자로 다시 조립될 수 있다.
표적 이중-가닥 핵산은 위에서 논의된 바와 같이 접촉 확률을 증가시키기 위한 임의의 적합한 방법을 사용하여 표면 결합된 CRISPR/Cas9와 효율적으로 접촉될 수 있다.
본 방법은 다양한 공지된 포맷들 중 어느 하나를 사용하여, 예를 들어, 라이브러리 제조를 위한 단편화 시약과 비드 어레이의 조합을 사용하고, 이어서 인덱싱된 서열분석 실행 및 비스포크 데이터 분석을 사용하여 수행될 수 있다. 비드들을 서로 정적 분리 상태로 유지하는 임의의 다른 적합한 방법이 샘플의 표면 단편화 및 인덱싱에 사용될 수 있다. 예를 들어, 미소구체가 웰에 안착될 수 있도록 비드를 유지할 수 있는 기재 내의 웰 또는 작은 함몰부와 같은 물리적 구성, 또는 다른 힘(자성 또는 압축)의 사용, 또는 화학적으로 변경되거나 활성인 부위, 예컨대 화학적으로 작용화된 부위, 정전기적으로 변경된 부위, 소수성으로 및/또는 친수성으로 작용화된 부위, 또는 접착제의 스폿.
일부 실시형태에서, 미소구체는 웰에서 비공유적으로 결합되지만, 웰은 추가로 하기에 일반적으로 기재되는 바와 같이 화학적으로 작용화될 수 있거나, 가교결합제가 사용될 수 있거나, 물리적 장벽, 예를 들어 필름 또는 막이 비드 위에 사용될 수 있다.
소정 실시형태에서, 기재의 표면은 본 발명의 미소구체를 기재 상의 개별 부위 또는 위치에 공유적으로 또는 비공유적으로 부착하는 데 사용될 수 있는 화학적으로 변형된 부위를 포함하도록 변형된다. 이러한 맥락에서 "화학적으로 변형된 부위"는, 일반적으로 상응하는 반응성 작용기를 또한 포함하는, 미소구체를 공유적으로 부착하는 데 사용될 수 있는 아미노 기, 카르복시 기, 옥소 기 및 티올 기를 포함하는 화학 작용기의 패턴의 첨가; (접착제의 첨가를 위한 사전 화학적 작용화 또는 접착제의 직접 첨가에 의해) 미소구체를 결합하는 데 사용될 수 있는 접착제의 패턴의 첨가; 예를 들어, 미소구체가 부위에 반대되는 하전된 기를 포함하는 경우, 미소구체의 정전기적 부착을 위한 (화학적 작용기와 유사한) 하전된 기의 패턴의 첨가; 적합한 실험 조건 하에서 유사하게 소수성인 또는 친수성인 미소구체의 첨가가 하이드로친화성(hydroaffinity)에 기초하여 미소구체가 부위에 결합하도록, 부위들을 차등적으로 소수성 또는 친수성으로 만드는 화학적 작용기의 패턴의 추가를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 수성 시스템에서 소수성 비드에 의한 소수성 부위의 사용은 부위에 우선적으로 비드의 결합을 유도한다. 상기에 약술된 바와 같이, 이러한 의미에서 "패턴"은 별개의 부위에서 비드의 부착을 허용하기 위한 표면의 균일한 처리의 사용뿐만 아니라 별개의 부위를 생성하는 표면의 처리를 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이는 다양한 방식으로 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 이중-가닥 핵산이 고체 지지물에 적용될 때, 표적 이중-가닥 핵산은 고체 지지물 상의 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체에 의해 여러 번 무작위로 단편화된다. 각 단편은 고체 지지물에 고정된다. 일부 실시형태에서, 고체 지지물은 비드이고, 어레이 칩 내의 비드의 물리적 분리는 핵산 분자가 2개의 비드 사이에 도달하는 것을 방지한다. 다른 실시형태에서, 비드들은 밀접하게 접촉하며, 하나 이상의 핵산 분자는 둘 이상의 고체 지지물 사이에 뻗어 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 지지물 당 하나 초과의 표적 이중-가닥 핵산 분자가 단편화될 수 있다. 2개의 대립유전자가 동일한 고체 지지물 또는 비드 상에서 단편화될 확률은 낮으며, 첨가되는 핵산의 농도 및 고체 지지물 또는 비드의 수의 함수이다. 예를 들어, 동일한 웰에서 2개의 대립유전자가 발생하는 것을 피하기 위해, 0.1x 하프롬(haplome) 등가물(50,000개의 게놈 등가물)이 1백만개의 비드로 로딩될 필요가 있을 것이다.
일부 실시형태에서, 이중-가닥 핵산 단편은 태깅을 위한 임의의 공지된 방법에 의해 태깅된다. 이중-가닥 핵산 단편은, 예를 들어 제1 태그 도메인을 포함하는 제1 태그로 태깅될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 태그 도메인은 서열분석 반응을 프라이밍하기 위한 영역을 포함한다. 일단 단편화, 및 선택적으로 태깅이 완료되면, 이중-가닥 핵산 단편이 고체 지지물의 표면으로부터 용액으로 이동되어, 개별 이중-가닥 핵산 단편이 풀링(pooling)되고 다음 단계, 예컨대 서열분석을 위해 준비될 수 있다.
고체 지지물로부터 용액으로의 고정된 이중-가닥 핵산 단편의 방출 또는 유리화는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 단편화된 분자는, 예를 들어, 표면 결합된 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 존재하는 절단 모이어티를 통해 비드의 표면을 절단함으로써 유리될 수 있다. 절단 모이어티는 고체 지지물로부터 핵산 가닥을 절단하는 데 적합한 임의의 모이어티일 수 있다. 절단 모이어티를 이용하는 방법의 예는 제한 엔도뉴클레아제 절단, 화학적 절단, RNase 절단, 광화학적 절단 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 이는 전체적으로 참고로 포함되는 국제 특허 공개 WO 2006/064199호에 제시된 절단 방법 및 절단 모이어티를 포함한다.
태그는 증폭 및 서열분석 프라이머와 같은 추가의 서열이 첨가되는 것을 가능하게 하는 PCR 스텝-아웃 프라이머를 혼성화하기 위한 혼성화 지점으로서 사용될 수 있는 "프라이머" 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 증폭 프라이머 P5 및 P7이 첨가될 수 있다. 일단 첨가되면, 억제 PCR은, 예를 들어, 일 말단에 P5 어댑터 및 다른 말단에 P7을 갖는 분자를 풍부화하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭은 억제 PCR에 의해 P5 및 P7 어댑터 서열을 첨가하는 스텝-아웃 프라이머로 고체 지지물(예를 들어, 비드)에서 직접 수행될 수 있다.
다른 실시형태에서, 각각의 고체 지지물은 프라이머 서열이 P5-리드1 서열분석 프라이머 또는 P7-리드 2 서열분석 프라이머인 2가지 유형의 표면 이식된 올리고뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 이는 혼합된 P5-P7 CRISPR/Cas9 효소 또는 복합체를 생성할 것이다. 이들은 고체 지지물로부터 절단된 후 억제 PCR을 통해 P5/P7 분자를 풍부하게 하거나, 전술된 바와 같이 고체 지지물에서 직접 증폭될 수 있다.
등가물
전술한 서면 명세서는 당업자가 실시형태들을 실시할 수 있게 하기에 충분한 것으로 간주된다. 전술한 설명 및 예는 소정 실시형태를 상세히 설명하며, 본 발명자들에 의해 고려되는 최상의 모드를 설명한다. 그러나, 전술한 내용이 본문에 아무리 상세하게 나타나더라도, 실시형태는 다양한 방식으로 실시될 수 있으며, 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 한다는 것을 이해할 것이다.
용어 "포함하는"은, 본 명세서에서, 언급된 요소들을 포함할 뿐만 아니라 임의의 추가적인 요소들을 추가로 포괄하는 개방형(open-ended)인 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은, 명시적으로 표시되었는지 여부에 관계없이, 예를 들어, 정수, 분수, 및 백분율을 포함하는 숫자 값을 지칭한다. 용어 약은 일반적으로 당업자가 (예를 들어, 동일한 기능 또는 결과를 갖는) 인용된 값과 동등한 것으로 간주할 수 있는 수치 값의 범위(예를 들어, 인용된 범위의+/-5 내지 10%)를 지칭한다. 적어도 및 약과 같은 용어가 수치 값 또는 범위의 목록에 앞에 있을 때, 이 용어는 목록에 제공된 모든 값 또는 범위를 수식한다. 일부 경우에, 용어 약은 가장 가까운 유효 숫자로 반올림되는 숫자 값을 포함할 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐서 다양한 간행물, 특허 및/또는 특허 출원이 참조되었다. 이들 간행물의 개시내용은 전체적으로 본 출원에 참고로 포함된다.

Claims (77)

  1. 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법으로서,
    (a) CRISPR/Cas9 효소가 고정된 고체 지지물을 제공하는 단계; 및
    (b) 표적 이중-가닥 핵산이 상기 CRISPR/Cas9 효소에 의해 무작위로 단편화되고, 상기 CRISPR/Cas9가 상기 이중-가닥 핵산 단편의 적어도 하나의 가닥에 결합하는 조건 하에서 상기 고체 지지물에 상기 표적 이중-가닥 핵산을 적용하는 단계
    를 포함하되, 이에 의해, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 생성하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적 이중-가닥 핵산은 이중-가닥 DNA(dsDNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 또는 이중-가닥 RNA/DNA 하이브리드를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적 이중-가닥 핵산은 dsDNA인, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR/Cas9 효소는 상기 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 상기 표적 이중-가닥 핵산에 결합하도록 유도하는 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합되는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 상기 고체 지지물에 고정되는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 상기 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 상기 표적 핵산에 결합하도록 유도하는 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 sgRNA는 (GC)n 또는 (AT)n을 포함하고, 여기서, n은 5 내지 20인, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  8. 제8항에 있어서, n은 10인, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 sgRNA는 10개 내지 40개의 뉴클레오타이드인, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 sgRNA는 17개 또는 20개의 뉴클레오타이드인, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  11. 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 비오티닐화되고 상기 고체 지지물은 하나 이상의 비오틴 결합 단백질을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 비오틴 결합 단백질은 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 항-비오틴 항체, 비오틴 수용체, 및/또는 비오틴-결합 효소를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 비오틴-결합 효소는 비오티니다제 또는 비오틴 할로카르복실라제 합성효소를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중-가닥 핵산 단편이 고정된 상기 고체 지지물을 세척하여 임의의 결합하지 않은 핵산을 제거하는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  15. 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 표면 상에 고정된 상기 이중-가닥 핵산 단편을 증폭하는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 증폭하는 단계는 상기 제1 폴리뉴클레오타이드의 일부에 상응하는 증폭 프라이머 및 중합효소를 제공하는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지물에 상기 표적 이중-가닥 핵산을 적용하는 단계는 상기 CRISPR/Cas9 효소의 핵산 결합 특이성을 감소시키는 하나 이상의 시약으로 상기 CRISPR/Cas9 효소를 처리하는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 하나 이상의 시약은 베타인, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 에탄올, 에틸렌 글리콜, 다이메틸아세트아마이드, 다이메틸폼아마이드, 및/또는 설파란을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRISPR/Cas9 효소는 ㎟ 당 적어도 103, 104, 105, 또는 106개의 효소의 밀도로 상기 고체 지지물 상에 존재하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정된 라이브러리 내의 상기 이중-가닥 핵산 단편의 길이는 상기 고체 지지물 상의 CRISPR/Cas9 효소의 밀도에 비례하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지물은 마이크로입자, 패턴화된 표면, 또는 웰을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 마이크로입자는 비드인, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, (c) 삽입 염료를 상기 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리의 적어도 일부에 적용하여 염색된 고정된 단편의 세트를 얻는 단계; 및 상기 염색된 고정된 단편의 이미지를 얻는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 이중-가닥 핵산을 적용하는 단계는 생물학적 샘플을 상기 고체 지지물에 첨가하는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 세포 용해물을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 생물학적 샘플들은 전세포를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 점액, 객담, 소변, 정액, 뇌척수액, 기관지 흡인물, 대변, 및 침연 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중-가닥 핵산 단편을 태깅하는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 이중-가닥 핵산 단편은 제1 태그 도메인을 포함하는 제1 태그로 태깅되는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 제1 태그 도메인은 클러스터 증폭을 위한 영역을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 제1 태그 도메인은 서열분석 반응을 프라이밍하기 위한 영역을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지물로부터 상기 고정된 이중-가닥 핵산 단편을 유리시키는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 유리시키는 단계는 상기 고체 지지물로부터의 상기 CRISPR/Cas9 효소의 절단을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 유리시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR), 가닥 변위 증폭(strand displacement amplification, SDA), 전사 매개 증폭(transcription mediated amplification, TMA) 및 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA), 또는 다른 증폭 과정을 수행하는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 PCR은 억제 PCR을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  36. 제32항에 있어서, 상기 유리시키는 단계는 빛 또는 열을 가하는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  37. 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법으로서,
    (a) CRISPR/Cas9 복합체가 고정된 고체 지지물을 제공하는 단계로서, 상기 CRISPR/Cas9 복합체는 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 표적 핵산에 결합하도록 유도하는 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함하는 비오티닐화된 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합된 CRISPR/Cas9 효소를 포함하고, 상기 비오티닐화된 제1 폴리뉴클레오타이드는 상기 고체 지지물 상의 비오틴 결합 단백질에 결합되는, 상기 고체 지지물을 제공하는 단계; 및
    (b) 표적 이중-가닥 핵산이 상기 CRISPR/Cas9 복합체에 의해 무작위로 단편화되고, 상기 CRISPR/Cas9 복합체가 상기 이중-가닥 핵산 단편의 적어도 하나의 가닥에 결합하는 조건 하에서 상기 고체 지지물에 상기 표적 이중-가닥 핵산을 적용하는 단계
    를 포함하되, 이에 의해, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 생성하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 비오틴 결합 단백질은 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 항-비오틴 항체, 비오틴 수용체, 및/또는 비오틴-결합 효소를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 비오틴-결합 효소는 비오티니다제 또는 비오틴 할로카르복실라제 합성효소를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 고체 지지물에 상기 표적 이중-가닥 핵산을 적용하는 단계는 상기 CRISPR/Cas9 효소의 핵산 결합 특이성을 감소시키는 하나 이상의 시약으로 상기 CRISPR/Cas9 효소를 처리하는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 하나 이상의 시약은 베타인, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 에탄올, 에틸렌 글리콜, 다이메틸아세트아마이드, 다이메틸폼아마이드, 및/또는 설파란을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중-가닥 핵산 단편을 태깅하는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 이중-가닥 핵산 단편은 제1 태그 도메인을 포함하는 제1 태그로 태깅되는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 제1 태그 도메인은 클러스터 증폭을 위한 영역을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 제1 태그 도메인은 서열분석 반응을 프라이밍하기 위한 영역을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  46. 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지물로부터 상기 고정된 이중-가닥 핵산 단편을 유리시키는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 유리시키는 단계는 상기 고체 지지물로부터의 상기 CRISPR/Cas9 효소의 절단을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 유리시키는 단계는 PCR 또는 다른 증폭 과정을 수행하는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 PCR은 억제 PCR을 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 유리시키는 단계는 빛 또는 열을 가하는 단계를 포함하는, 무작위로 단편화된 이중-가닥 핵산 단편의 고정된 라이브러리를 제조하는 방법.
  51. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 이중-가닥 핵산 단편의 라이브러리가 고정된, 고체 지지물.
  52. CRISPR/Cas9 복합체가 고정된 고체 지지물로서, 상기 CRISPR/Cas9 복합체는 표적 이중-가닥 핵산을 무작위로 단편화하는 CRISPR/Cas9 효소를 포함하는, 고체 지지물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 표적 이중-가닥 핵산은 이중-가닥 DNA(dsDNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 또는 이중-가닥 RNA/DNA 하이브리드를 포함하는, 고체 지지물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 표적 이중-가닥 핵산은 dsDNA인, 고체 지지물.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR/Cas9 효소는 상기 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 상기 표적 이중-가닥 핵산에 결합하도록 유도하는 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합되는, 고체 지지물.
  56. 제55항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 상기 고체 지지물에 고정되는, 고체 지지물.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 상기 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 상기 표적 핵산에 결합하도록 유도하는 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함하는, 고체 지지물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 sgRNA는 (GC)n 또는 (AT)n을 포함하되, n은 5 내지 20인, 고체 지지물.
  59. 제58항에 있어서, n은 10인, 고체 지지물.
  60. 제57항에 있어서, 상기 sgRNA는 10개 내지 40개의 뉴클레오타이드인, 고체 지지물.
  61. 제60항에 있어서, 상기 sgRNA는 17개 또는 20개의 뉴클레오타이드인, 고체 지지물.
  62. 제55항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 비오티닐화되고 상기 고체 지지물은 비오틴 결합 단백질을 포함하는, 고체 지지물.
  63. 제62항에 있어서, 상기 비오틴 결합 단백질은 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 항-비오틴 항체, 비오틴 수용체, 및/또는 비오틴-결합 효소를 포함하는, 고체 지지물.
  64. 제63항에 있어서, 상기 비오틴-결합 효소는 비오티니다제 또는 비오틴 할로카르복실라제 합성효소를 포함하는, 고체 지지물.
  65. 제52항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRISPR/Cas9 효소는 ㎟ 당 적어도 103, 104, 105, 또는 106개의 효소의 밀도로 상기 고체 지지물 상에 존재하는, 고체 지지물.
  66. 제52항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지물은 마이크로입자, 패턴화된 표면, 또는 웰을 포함하는, 고체 지지물.
  67. 제66항에 있어서, 상기 마이크로입자는 비드인, 고체 지지물.
  68. 제52항 내지 제67항 중 어느 한 항의 고체 지지물 및 상기 CRISPR/Cas9 효소의 핵산 결합 특이성을 감소시키는 하나 이상의 시약을 포함하는, 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 상기 하나 이상의 시약은 베타인, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 에탄올, 에틸렌 글리콜, 다이메틸아세트아마이드, 다이메틸폼아마이드, 및/또는 설파란을 포함하는, 조성물.
  70. CRISPR/Cas9 복합체가 고정된 고체 지지물로서,
    상기 CRISPR/Cas9 복합체는 CRISPR/Cas9 말단 서열을 포함하는 3' 부분 및 CRISPR/Cas9 효소가 비-서열 특이적 방식으로 표적 이중-가닥 핵산에 결합하도록 유도하는 단일-가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 5' 부분을 포함하는 비오티닐화된 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합된 CRISPR/Cas9 효소를 포함하고, 상기 비오티닐화된 제1 폴리뉴클레오타이드는 상기 고체 지지물 상의 비오틴 결합 단백질에 결합되는, 고체 지지물.
  71. 제70항에 있어서, 상기 비오틴 결합 단백질은 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 항-비오틴 항체, 비오틴 수용체 및/또는 비오틴-결합 효소를 포함하는, 고체 지지물.
  72. 제71항에 있어서, 상기 비오틴-결합 효소는 비오티니다제 또는 비오틴 할로카르복실라제 합성효소를 포함하는, 고체 지지물.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRISPR/Cas9 복합체는 ㎟ 당 적어도 103, 104, 105, 106개의 복합체의 밀도로 상기 고체 지지물 상에 존재하는, 고체 지지물.
  74. 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지물은 마이크로입자, 패턴화된 표면, 또는 웰을 포함하는, 고체 지지물.
  75. 제74항에 있어서, 상기 마이크로입자는 비드인, 고체 지지물.
  76. 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항의 고체 지지물 및 상기 CRISPR/Cas9 효소의 핵산 결합 특이성을 감소시키는 하나 이상의 시약을 포함하는, 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 상기 하나 이상의 시약은 베타인, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 에탄올, 에틸렌 글리콜, 다이메틸아세트아마이드, 다이메틸폼아마이드, 및/또는 설파란을 포함하는, 조성물.
KR1020217020184A 2019-07-12 2020-06-18 고체 지지물 상에 고정된 crispr/cas9를 사용하여 핵산 서열분석 라이브러리를 제조하기 위한 조성물 및 방법 KR20220034716A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962873609P 2019-07-12 2019-07-12
US62/873,609 2019-07-12
PCT/EP2020/066959 WO2021008805A1 (en) 2019-07-12 2020-06-18 Compositions and methods for preparing nucleic acid sequencing libraries using crispr/cas9 immobilized on a solid support

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220034716A true KR20220034716A (ko) 2022-03-18

Family

ID=71108632

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217020184A KR20220034716A (ko) 2019-07-12 2020-06-18 고체 지지물 상에 고정된 crispr/cas9를 사용하여 핵산 서열분석 라이브러리를 제조하기 위한 조성물 및 방법

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20220154173A1 (ko)
EP (1) EP3997223A1 (ko)
JP (1) JP2022540268A (ko)
KR (1) KR20220034716A (ko)
CN (1) CN113260711A (ko)
AU (1) AU2020314224A1 (ko)
BR (1) BR112021012755A2 (ko)
CA (1) CA3125241A1 (ko)
IL (1) IL284146A (ko)
MX (1) MX2021007803A (ko)
SG (1) SG11202105836XA (ko)
WO (1) WO2021008805A1 (ko)

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1323293C (en) 1987-12-11 1993-10-19 Keith C. Backman Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
CA1341584C (en) 1988-04-06 2008-11-18 Bruce Wallace Method of amplifying and detecting nucleic acid sequences
AU3539089A (en) 1988-04-08 1989-11-03 Salk Institute For Biological Studies, The Ligase-based amplification method
ATE144556T1 (de) 1988-06-24 1996-11-15 Amgen Inc Verfahren und mittel zum nachweis von nukleinsäuresequenzen
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
JP2955759B2 (ja) 1988-07-20 1999-10-04 セゲブ・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド 核酸配列を増幅及び検出する方法
US5185243A (en) 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
EP0450060A1 (en) 1989-10-26 1991-10-09 Sri International Dna sequencing
US5573907A (en) 1990-01-26 1996-11-12 Abbott Laboratories Detecting and amplifying target nucleic acids using exonucleolytic activity
ATE137269T1 (de) 1990-01-26 1996-05-15 Abbott Lab Verbessertes verfahren zur amplifikation von nuklein säurezielsequenz, einsetzbar für die polymerase und ligasekettenreaktion
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
WO1995021271A1 (en) 1994-02-07 1995-08-10 Molecular Tool, Inc. Ligase/polymerase-mediated genetic bit analysistm of single nucleotide polymorphisms and its use in genetic analysis
AU687535B2 (en) 1994-03-16 1998-02-26 Gen-Probe Incorporated Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
EP0972081B1 (en) 1997-04-01 2007-06-13 Solexa Ltd. Method of nucleic acid amplification
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US20050244870A1 (en) 1999-04-20 2005-11-03 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6913884B2 (en) 2001-08-16 2005-07-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA
ATE492652T1 (de) 2000-02-07 2011-01-15 Illumina Inc Nukleinsäuredetektionsverfahren mit universellem priming
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7611869B2 (en) 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7001792B2 (en) 2000-04-24 2006-02-21 Eagle Research & Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
JP2004513619A (ja) 2000-07-07 2004-05-13 ヴィジゲン　バイオテクノロジーズ　インコーポレイテッド リアルタイム配列決定
AU2002227156A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
DK3002289T3 (en) 2002-08-23 2018-04-23 Illumina Cambridge Ltd MODIFIED NUCLEOTIDES FOR POLYNUCLEOTIDE SEQUENCE
US7595883B1 (en) 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
US20050053980A1 (en) 2003-06-20 2005-03-10 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
WO2005065814A1 (en) 2004-01-07 2005-07-21 Solexa Limited Modified molecular arrays
US7302146B2 (en) 2004-09-17 2007-11-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and method for analysis of molecules
WO2006064199A1 (en) 2004-12-13 2006-06-22 Solexa Limited Improved method of nucleotide detection
GB0427236D0 (en) 2004-12-13 2005-01-12 Solexa Ltd Improved method of nucleotide detection
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
EP2018622B1 (en) 2006-03-31 2018-04-25 Illumina, Inc. Systems for sequence by synthesis analysis
AU2007309504B2 (en) 2006-10-23 2012-09-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
AU2007334393A1 (en) 2006-12-14 2008-06-26 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
WO2010115122A2 (en) 2009-04-03 2010-10-07 Illumina, Inc. Generation of uniform fragments of nucleic acids using patterned substrates
US8148515B1 (en) 2009-06-02 2012-04-03 Biotium, Inc. Detection using a dye and a dye modifier
US9029103B2 (en) 2010-08-27 2015-05-12 Illumina Cambridge Limited Methods for sequencing polynucleotides
US8778848B2 (en) 2011-06-09 2014-07-15 Illumina, Inc. Patterned flow-cells useful for nucleic acid analysis
CA2856163C (en) 2011-10-28 2019-05-07 Illumina, Inc. Microarray fabrication system and method
AU2012336040B2 (en) 2011-11-07 2015-12-10 Illumina, Inc. Integrated sequencing apparatuses and methods of use
US9683230B2 (en) * 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
SG11201703139VA (en) * 2014-10-17 2017-07-28 Illumina Cambridge Ltd Contiguity preserving transposition
EP3636757A1 (en) * 2014-10-17 2020-04-15 Illumina Cambridge Limited Contiguity preserving transposition
EP3303621A1 (en) * 2015-05-28 2018-04-11 Illumina Cambridge Limited Surface-based tagmentation
EP3303584B1 (en) * 2015-05-29 2019-10-09 Epicentre Technologies Corporation Methods of analyzing nucleic acids
EP4155397B1 (en) * 2016-02-10 2024-06-26 The Regents of The University of Michigan Detection of nucleic acids
CN109196115A (zh) * 2016-03-01 2019-01-11 通用测序技术公司 跟踪核酸靶标来源以用于核酸测序的方法和试剂盒
GB201616590D0 (en) * 2016-09-29 2016-11-16 Oxford Nanopore Technologies Limited Method
US11007281B2 (en) * 2017-03-28 2021-05-18 The Regents Of The University Of Californa Nano/micromotors for active and dynamic intracellular payload delivery
US11905552B2 (en) * 2017-08-04 2024-02-20 Keck Graduate Institute Of Applied Life Sciences Immobilized RNPs for sequence-specific nucleic acid capture and digital detection
US20190202856A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Sigma-Aldrich Co. Llc Engineered crispr proteins for covalent tagging nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
MX2021007803A (es) 2021-08-11
SG11202105836XA (en) 2021-07-29
CN113260711A (zh) 2021-08-13
WO2021008805A1 (en) 2021-01-21
EP3997223A1 (en) 2022-05-18
AU2020314224A1 (en) 2021-06-17
CA3125241A1 (en) 2021-01-21
US20220154173A1 (en) 2022-05-19
IL284146A (en) 2021-08-31
BR112021012755A2 (pt) 2022-04-26
JP2022540268A (ja) 2022-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7498254B2 (ja) 固形支持体でのサンプル調製
US20230183682A1 (en) Preparation of RNA and DNA Sequencing Libraries Using Bead-Linked Transposomes
KR20220034716A (ko) 고체 지지물 상에 고정된 crispr/cas9를 사용하여 핵산 서열분석 라이브러리를 제조하기 위한 조성물 및 방법
RU2810091C2 (ru) Композиции и способы получения библиотек нуклеотидных последовательностей с использованием crispr/cas9, иммобилизованного на твердой подложке
CN113226519B (zh) 使用电泳制备核酸文库
CN117651611A (zh) 生物分子的高通量分析