KR100787995B1

KR100787995B1 - 신규한 우라실-ｄｎａ 글리코실라제(ｕｄｇ) 및 이의 용도

Info

Publication number: KR100787995B1
Application number: KR1020060082707A
Authority: KR
Inventors: 권석형; 이정래; 김현규; 김태욱; 권석태; 이미선
Original assignee: 주식회사 렉스진바이오텍
Priority date: 2006-08-30
Filing date: 2006-08-30
Publication date: 2007-12-24

Abstract

본 발명은 신규한 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 저온성 세균인 앨트로모나스 마클레오디(Alteromonas macleodii)로부터 분리된 신규한 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)은 우라실을 포함하고 있는 DNA 기질 내에서 우라실 염기를 분해하는 활성이 있고 저온에서 쉽게 변성하는 특징이 있어 중합효소 연쇄반응(PCR) 과정 중에서 발생하는 교차오염을 제거할 수 있다. 따라서 본 발명의 신규한 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)는 PCR 반응의 정확도, 순도 및 증폭 효율을 증가시키는데 효과적으로 사용될 수 있다.

우라실-DNA 글리코실라제, 앨트로모나스 마클레오디, 교차오염

Description

신규한 우라실-ＤＮＡ 글리코실라제(ＵＤＧ) 및 이의 용도{Novel Uracil-DNA Glycosylase and Use Thereof}

도 1은 대장균(E. coli), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae ), 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans ), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis ) 및 해양성 저온균주인 BMTU3346의 아미노산 서열에서 공통적으로 보존된 부분에 해당하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 2는 저온성 균주들의 게놈 DNA를 주형으로 하고 고안된 프라이머를 이용하여 수행한 PCR 반응 산물을 아가로스 겔에 전기영동하여 나타낸 결과이다(A; 첫번째 PCR 결과, B; 두 번째 PCR 결과이며, M:100bp 간격의 마커 DNA, 1: HJ184, 2:GMD509, 3:HJ147, 4:HJ171, 5:HJ154, 6:GMD430, 7:GMD319, 8:ULD409, 9:HJ127 및 10:HJ192 균주를 주형으로 한 PCR 결과이다).

도 3은 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 전장 유전자의 아미노산 서열을 대장균의 UDG 아미노산 서열 및 BMTU3346의 UDG 아미노산 서열과 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 재조합 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 대장균에서 발현시켜 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제한 것을 전기영동으로 나타낸 것이다 (M: 마커 단백질, 1: 발현을 유도하지 않은 전체 세포질 분획, 2: 발현을 유도한 전체 세포질 분획, 3:하이트랩 해파린 HP 컬럼을 통해 정제한 분획 및 4:하이트랩 킬레이팅 HP 컬럼을 통해 정제한 분획을 나타낸 것이다).

도 5는 다양한 pH의 범위에서 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 단백질의 효소 활성을 나타낸 그래프이다.

도 6은 다양한 온도 범위에서 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 단백질의 효소 활성을 나타낸 그래프이다.

도 7은 다양한 이가양이온에 의한 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 단백질의 효소 활성을 나타낸 그래프이다.

도 8은 50℃의 온도에서 시간에 따른 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 단백질의 효소 활성을 나타낸 그래프이다.

도 9는 각각의 본 발명의 UDG, 대장균의 UDG 및 BMTU 균주의 UDG가 가지는 기질특이성 및 열안정성을 dUTP 또는 dTTP를 포함하는 기질을 이용하여 반응시킨 후, 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 결과이다(N: 열처리 하지 않은 UDG를 반응시킨 것, H: 열처리한 UDG를 반응시킨 것이며, dT는 dTTP를 나타낸 것이고 dU는 dUTP를 나타낸 것이다).

도 10a는 본 발명의 UDG 및 대장균의 UDG를 이용한 간접 PCR 반응 산물을 아가로스 겔에 전기 영동하여 증폭된 산물을 나타낸 결과이다(M: 1 kb 마커 DNA, 1: 대조군(UDG를 첨가하지 않은 것), 2:본 발명의 UDG를 첨가한 것, 3:대장균의 UDG를 첨가한 것, 4:50℃에서 5분간 열처리한 본 발명의 UDG를 첨가한 것, 5:50℃에서 5 분간 열처리한 대장균의 UDG를 첨가한 것임).

도 10b는 본 발명의 UDG 및 BMTU 균주의 UDG를 이용한 간접 PCR 반응 산물을 아가로스 겔에 전기 영동하여 증폭된 산물을 나타낸 결과이다(M: 1 kb 마커 DNA, 1: 대조군(UDG를 첨가하지 않은 것), 2:본 발명의 UDG를 첨가한 것, 3:BMTU 균주의UDG를 첨가한 것, 4:50℃에서 5분간 열처리한 본 발명의 UDG를 첨가한 것, 5:50℃에서 5분간 열처리한 BMTU 균주의 UDG를 첨가한 것임).

도 11은 본 발명의 UDG, 대장균의 UDG 및 BMTU 균주의 UDG를 이용한 직접 PCR 반응 산물을 아가로스 겔에 전기 영동하여 증폭된 산물을 나타낸 결과이다(M: 1 kb 마커 DNA를 나타낸 것이고, 1: dUTP를 포함하는 기질을 이용한 PCR 반응 산물을 나타낸 것이며, 2: dTTP를 포함하는 기질을 이용한 PCR 반응 산물을 나타낸 것임).

본 발명은 신규한 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 저온성 세균인 앨트로모나스 마클레오디(Alteromonas macleodii)로부터 분리된 신규한 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 및 이의 용도에 관한 것이다.

우라실-DNA 글리코실라제(Uracil-DNA glycosylase; 이하 “UDG”라고 함)는 손상된 DNA를 회복시키는 효소로써 DNA의 손상부위를 인식하여 DNA 내의 염기와 N-글리코시드 결합을 가수분해하여 DNA 내에서 손상된 염기를 제거하는 것으로 알려져 있다. 우라실-DNA 글리코실라제는 대장균에서 처음으로 분리되었고, 이 후 바실러스를 포함한 다수의 세균에서 분리되었으며, 분자량은 약 25 내지 35 kDa에 달하고 기질에 대한 특이성, 즉, DNA 내의 염기 중에서 우라실 염기만을 특이적으로 선택하여 제거하는 것으로 알려져 있다(Lindahl, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 71, 3649-3653, 1974; Cone, R., et al., Biochemistry 16, 3194-3201, 1977).

우라실은 RNA의 염기로서 때때로 DNA 내에서 발견되기도 하는데 이는 시토신이 자연적으로 탈아미노화 되어 생긴 우라실이 DNA 내로 삽입되어나 DNA 복제 과정 중 데옥시 티민 3인산(dTTP) 대신 데옥시 우라닌 3인산(dUTP)이 DNA 내로 삽입되어 발생한다. 따라서 DNA 내에 존재하는 우라실은 아데닌과 염기쌍을 형성하게 되고 이로 인하여 시토신:구아닌(C:G)으로 이루어져야 할 염기쌍이 아데닌:티민(A:T)의 염기쌍으로 바뀌게 되어 DNA가 돌연변이(mutation) 되거나 손상되는 현상이 발생하게 된다. 그러나 우라실-DNA 글리코실라제는 RNA 내의 우라실은 제거하지 않고 DNA 내의 우라실 염기만을 특이적으로 제거하여 염기가 제거된 AP(apyrimidinic site) 부위를 만들게 됨으로써 이 부위에 DNA를 수복하는 여러 가지 효소들, 즉, AP 엔도뉴클라제(AP endonuclease), DNA 폴리머라제(DNA polymerase) 및 DNA 리가제(DNA ligase) 등의 작용을 촉진시켜 손상된 또는 변이된 DNA를 복구하는 과정이 진행된 다.

한편, 핵산 증폭 반응 또는 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction: PCR)은 내열성 세균 유래의 DNA 합성효소를 이용하여 시험관 내에서 특정 핵산 부위를 대량으로 증폭하여 유용 유전자를 분리하거나 확인하는 기술이다. 이러한 PCR 반응 기술은 핵산의 검출에 필요한 검출한계를 크게 낮추는데 기여하였고, 따라서 현재에는 바이러스의 진단, 병원성 세균의 진단 등 질환을 확인하고 판단하는데 매우 유용하게 사용되고 있다. 그러나 여전히 핵산의 농도가 매우 낮은 경우에는 검출하기 어려운 문제점이 있으며 반응 효율이 반응기마다 다르게 나타나는 단점이 있다. 또한, 시료의 선별, 핵산의 분리과정, 시료를 옮기는 과정, 시료의 PCR 반응 과정, 시료의 보관 및 전기영동 후 시료의 회수과정 등에서 교차오염(cross-contamination)이 발생하기도 한다. 이러한 교차오염은 극히 미량 일지라도 목적의 시료와 함께 증폭된다면 기존의 PCR 방법으로는 시료의 오염여부를 구별할 수가 없는 문제점이 발생하게 된다.

따라서 최근들어 PCR 과정 중에서 발생하는 교차 오염을 방지하기 위한 방법 들이 개발되고 있는데 이러한 방법으로는 dTTP 대신 dUTP를 넣어서 PCR을 수행하는 방법이 Longo 등에 의해 개시된 바 있다(Longo, M. C., et al., Gene 93, 125-128, 1990). 또한, PCR 과정 중에 오염되는 기존의 dUTP를 포함한 DNA들을 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 처리하여 dUTP를 분해 시킨 후, PCR을 수행하는 방법들이 보 고 된 바 있다(Udaykumar., et al., Nucleic Acids Res. 21, 3917-3918, 1993; Taggart, et al., J. Virol . Methods 105, 57-65, 2002). 그러므로 최근에는 PCR 반응 과정에 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 처리하거나, 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 포함하는 PCR 제품들이 판매되고 있는 추세이다.

그러나 지금까지 PCR 반응 과정에 사용되고 있는 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)는 60℃ 이상의 고온에서도 쉽게 변성되지 않고 활성이 그대로 유지되므로 dUTP를 첨가한 PCR 반응에서 증폭된 우라실 염기를 포함하는 DNA 산물이 절단되는 문제점이 있으며, 특히 역전사 효소(reverse transcriptase)를 이용한 PCR 반응은 RNA의 2차 구조가 형성되지 못하게 하기 위하여 보통 55 내지 60℃ 부근의 온도에서 수행하기 때문에 dUTP를 첨가한 반응 산물의 양이 줄어들어 반응 효율이 감소하는 단점이 있다. 따라서 최근 들어 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)로 인해 PCR 반응산물이 절단되거나 또는 반응산물의 양이 감소되는 단점을 보안하기 위하여 저온에서도 쉽게 변성되어 활성을 잃는 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 발굴에 관심이 대두되고 있다. 그러나 현재까지 발굴된 저온에서도 쉽게 변성되어 활성을 잃는 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)는 해양성 저온균주인 BMTU3346으로부터 분리된 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 예 밖에 없다(Jaeger, S. et al., Extremophiles 4, 115-122, 2000). 따라서 여러 가지 용도로 유용하게 사용되고 있는 PCR 반응의 정확도 및 효율의 증가를 위해서는 상기의 BMTU3346 균주로부터 분리된 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 외의 새로운 저온성 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 발굴이 시 급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 새로운 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 찾으려고 연구를 거듭하던 중, 저온성 세균인 앨트로모나스 마클레오디(Alteromonas macleodii)로부터 신규한 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 발굴하였고, 상기 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)가 안정한 효소활성을 가지고 있으며 저온에서도 쉽게 불활성화 되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 신규한 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 세균을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세균을 배양하는 단계를 포함하는 본 발명 의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 포함하는 PCR 반응용 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 우라실 염기를 포함하는 DNA 기질 및 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 포함하는 PCR 반응용 조성물을 20 ~ 50℃에서 5 ~ 30분간 반응하는 단계를 포함하는 PCR 반응 산물의 교차오염을 제거하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 새로운 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 유전자를 탐색하기 위하여 저온성 세균들을 이용하였다. 이는 상기 저온성 세균이 생산하는 효소는 보통 중온성 세균들이 생산하는 효소와 동일한 기능을 가지고 있으면서 낮은 온도에서 안정하게 효소반응을 수행한다고 알려져 있기 때문이다. 따라서 본 발명자들은 먼저 종래에 알려진 UDG 유전자들의 공통적으로 보존된 부위에 결합하는 프라이머를 제조하고 한국해양연구소로부터 분양받은 저온성 세균들의 게놈 DNA를 이용하여 PCR을 수행함으로써 약 400bp에 해당하는 UDG 유전자가 공통적으로 보존하고 있는 DNA 산물을 얻었다. 이후, 상기 증폭된 DNA의 염기서열을 분석한 결과, 앨트로모나스 마클레오디(Alteromonas macleodii)로부터 증폭된 DNA의 염기서열이 기존에 보고 된 다른 종의 UDG 유전자의 염기서열과 가장 높은 서열 상동성을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 상기 앨트로모나스 마클레오디(Alteromonas macleodii)로부터 증폭된 DNA로부터 UDG의 전장 유전자를 얻기 위하여 인버스(inverse) PCR 방법을 수행하였고 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 앨트로모나스 마클레오디(Alteromonas macleodii)로부터 분리된 UDG의 전장 유전자는 총 660bp의 염기서열로 이루어져 있었고, 총 219개의 아미노산으로 이루어져 있었으며 단백질 분자량이 약 24.4 kDa임을 추정할 수 있었다. 또한, 다른 종과의 염기서열 상동성을 확인한 결과, 대장균(E. coli)의 UDG 와는 63%의 서열 상동성을 보였고, 해양성 저온세균인 BMTU3346 UDG 와는 40%의 서열 상동성을 보였으며, UDG의 활성에 관여한다고 알려진 아스파르트산(Asp), 아스파라긴산(Asn) 및 히스티딘(His)의 3가지 아미노산이 잘 보존되어 있음을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

이에 본 발명자들은 상기의 방법으로 획득한 UDG 유전자로부터 발현된 UDG 단백질의 기능을 규명하기 위하여 먼저 UDG 유전자를 발현시킬 수 있는 발현 벡터에 클로닝 한 후, 상기 벡터를 이용하여 발현용 세균을 형질전환 하였다. 이후, 상기 형질전환된 세균에서 발현된 본 발명의 UDG 단백질을 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.

한편, UDG 단백질은 DNA 내에서 우라실 염기를 제거하는 효소 활성이 있다고 알려져 있다. 따라서 본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 UDG 단백질이 상기와 같은 효소 활성을 가지고 있는지 확인하기 위하여, 우라실이 포함된 DNA 기질을 이용하여 UDG 효소 활성을 측정하였고, 그 결과 본 발명의 UDG 단백질이 DNA 기질내의 우라실 염기를 분해하는 것을 확인함으로써 UDG 효소 활성을 가지고 있음을 확인하였다(실시예 <5-2> 참조).

또한, 본 발명의 UDG 단백질의 최적 활성 pH 및 최적 온도를 확인한 결과, pH 8.0 내지 pH 9.0의 범위에서 효소 활성이 높게 나타나는 것을 확인하였고, 특히, pH 8.5 및 pH 9.0에서 효소 활성이 가장 높게 나타났으며(도 5 참조), UDG 단백질의 최적 온도는 20℃ 내지 30℃인 것을 확인하였다(도 6 참조). 반면, 50℃ 이후부터는 효소 활성이 급격히 감소하여 거의 활성을 잃는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 현재까지 가장 많이 사용되고 있는 대장균의 UDG 단백질 및 기존에 알려진 다른 UDG 단백질들이 60℃ 이상의 고온에서도 활성을 가지고 있는 것에 비해서 본 발명의 UDG 단백질은 50℃에서도 쉽게 불활성화 되는 특징이 있다.

또한, 본 발명의 UDG 단백질의 효소 활성에 있어서 2가 양이온 및 EDTA의 영향을 조사한 결과, 본 발명의 단백질의 효소 활성에 있어서 2가 양이온은 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났고(도 7 참조), 본 발명의 UDG 단백질의 열에 대한 안정성을 조사한 결과, 30℃에서는 60분간 거의 활성이 일정하게 나타나 매우 안정한 것을 확인하였고, 40℃에서도 50분까지 효소 활성이 안정하게 나타나는 것을 확인하였다. 그러나 50℃에서는 단백질의 열 안정성이 급격히 감소하여 5분 이내로 모든 활성을 잃어버리는 것으로 나타났다(도 8 참조). 이러한 결과는 상기 최적 온도를 확인한 결과와 동일한 결과를 보임으로써 본 발명의 UDG 단백질이 50℃ 에서 쉽게 불활성화 됨을 다시 한번 확인하였다.

나아가 본 발명자들은 본 발명의 UDG 단백질을 PCR 반응에 응용할 수 있는지 확인하기 위하여 기질특이성 및 열안정성을 확인하였다. 먼저, 본 발명의 UDG 단백질의 기질특이성은 dUTP 및 dTTP를 포함하는 기질을 이용하여 확인하였는데 그 결과, 본 발명의 UDG 단백질은 기존에 알려진 대장균의 UDG 및 해양성 저온균주인 BMTU의 UDG 단백질과 동일하게 dUTP를 포함하는 기질에만 작용하여 분해하는 것을 확인하였고, 반면 dTTP를 포함하는 기질은 분해되지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 UDG 단백질도 우라실을 포함하는 DNA 기질에만 특이적으로 반응하는 기질특이성을 가지고 있음을 알 수 있었다(도 9 참조). 또한, 상기 열안정성에 대한 실험은 대장균의 UDG , 기존에 저온에서 불활성화 된다고 보고 된 BMTU의 UDG 및 본 발명의 앨트로모나스 마클레오디(Alteromonas macleodii)의 UDG 단백질을 열처리 한 것 또는 열처리 하지 않은 것을 각각 사용하여 수행하였다. 그 결과 열처리한 본 발명의 UDG 단백질은 BMTU의 UDG 단백질과 같이 열처리에 의해 불활성화 되어 dUTP를 포함하는 기질을 분해하지 못하였고, 반면 열처리한 대장균의 UDG 단백질은 열처리 후에도 여전히 활성이 남아있어 dUTP를 포함하는 기질을 분해하는 것으로 나타났다(도 9 참조).

따라서 본 발명자들은 본 발명의 UDG 단백질을 PCR 반응에 응용하였다. 즉, UDG 단백질 및 dUTP를 포함하는 기질을 혼합하여 먼저 반응을 시킨 후, 이후 PCR 혼합물을 첨가하여 PCR 반응을 수행하는 간접 PCR(indirect PCR)을 수행하였다. 그 결과, 상기의 결과와 동일하게 본 발명의 UDG 단백질은 dUTP를 포함하는 기질을 모두 분해하여 PCR 반응산물이 전혀 증폭되지 않았다. 반면, 50℃에서 5분간 열처리를 하여 활성을 잃은 UDG 단백질을 사용한 것은 dUTP를 포함하는 기질이 분해되지 않아 PCR 반응산물이 증폭된 것을 확인하였다. 그러나 열처리한 대장균의 UDG 단백질은 열처리 후에도 여전히 활성이 남아있어 PCR 반응산물이 증폭되지 않았음을 알 수 있었다(도 10a 및 10b 참조).

또한, UDG 단백질, dUTP 또는 dTTP를 포함하는 기질 및 PCR 혼합물을 모두 한꺼번에 첨가하여 효소 반응 및 PCR 반응을 수행하는 직접 PCR(direct PCR)의 반응 결과, dUTP를 포함하는 기질을 사용한 것은 PCR 반응산물이 증폭되지 않았고, 반면 dTTP를 포함하는 기질을 사용한 것은 PCR 반응산물이 증폭된 것을 확인할 수 있었다(도 11 참조). 따라서 상기의 결과로 본 발명의 UDG 단백질은 DNA 기질내에서 우라실 염기만을 특이적으로 선택하여 반응하는 것을 알 수 있었고, 50℃에서 5분간 열처리 함으로써 효소 활성을 완전히 잃어버리는 특징이 있음을 알 수 있었다.

따라서 본 발명은 신규한 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 제공한다.

상기 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 기능적 동등물을 포함한다. 상기“기능 적 동등물”이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 UDG 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, “실질적으로 동질의 생리활성”이란 DNA 내에서 우라실 염기를 특이적으로 분해하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직하게 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 자연에서 분리되거나 또는 화학적 합성법에 의해 제조될 수 있다. 그러나 바람직하게는 저온성 세균으로부터 분리될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 앨트로모나스 마클레오디(Alteromonas macleodii)로부터 분리될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현 벡터내로 삽입되어 숙주세포를 형질전환 할 수 있다. "발현 벡터"라는 용어는 UDG 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. 상기 “발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 상기 플라스미드의 예로는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스가 사용될 수 있다. 당업자라면 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입시키는데 적합한 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 단백질 발현 유도 및 발현된 단백질의 분리가 용이하도록 디자인된 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 pET-22b(+) 벡터를 사용하였다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘(CaCl₂) 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포로는 세균(bacteria)이 바람직하며, 그 예로는 대장균이 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세균을 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 상기 형질전환된 숙주 세포내에서 본 발명의 UDG를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다. 상기 형질전환된 세포를 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들면, 형질전환된 세포가 성장할 수 있는 적합한 배지에 접종하여 종배양한 다음, 이를 본 배양용 배지에 접종하고 적합한 조건에서 배양함으로써 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 이후, 상기 형질전환된 세포에서 발현이 유도된 본 발명의 UDG 단백질의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있으며, 예를 들어, 상기 세포를 용해 후, 용해물을 원심분리하여, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 UDG 단백질을 생산할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).

또한 본 발명은 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 포함하는 PCR 반응용 조성물을 제공한다.

상기 PCR 반응용 조성물은 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)을 1 ~ 10 units 의 농도로 첨가할 수 있으며, 통상적으로 시험관 내에서 특정 핵산 부위를 대량으로 증폭하는 과정에 사용되는 시약, 예를 들면 각 종의 중합효소, 서로 다른 뉴클레오티드 트리포스페이드(dNTP), 특정 핵산 부위와 결합하여 이를 증폭할 수 있는 프라이머 및 적절한 버퍼 등을 포함할 수 있다. 상기 중합효소는 각 종에서 분리된 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소일 수 있고, 상기 증폭할 수 있는 프라이머란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다.

상기 PCR 반응은 당업계에 공지된 모든 PCR 반응의 종류일 수 있으며, 효소와 기질을 먼저 반응시킨 후, PCR 조성물을 나중에 첨가하여 반응하는 간접 PCR(indirect PCR), 또한, 효소와 기질 및 PCR 조성물을 한꺼번에 첨가하여 효소반 응을 시킨 후 PCR 반응을 수행하는 직접 PCR(direct PCR) 및 역전사 효소를 사용하는 역전사 효소 반응(reverse transcriptase-PCR)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 우라실 염기를 포함하는 DNA 기질 및 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 포함하는 PCR 반응용 조성물을 20 ~ 50℃에서 5 ~ 30분간 반응하는 단계를 포함하는 PCR 반응 산물의 교차오염을 제거하는 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)는 DNA 기질내의 우라실 염기만을 특이적으로 분해하는 활성이 있어 PCR 반응 과정 중에 발생하는 교차오염을 제거하는 특징이 있다. 상기 교차오염은 PCR 반응을 위한 시료의 선별, 핵산의 분리 과정, 시료를 옮기는 과정, 시료의 PCR 반응 과정, 시료의 보관 및 전기영동 후 시료의 회수과정 등에서 발생하는 오염을 말하는 것으로, 바람직하게는 DNA 기질에 외부적으로 첨가된 우라실 염기, 시토신이 자연적으로 탈아미노화 되어 DNA 내로 삽입된 우라실 염기 또는 상기 우라실 염기가 삽입되어 복제된 DNA 내에 존재하는 우라실 염기일 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 PCR 반응 산물의 교차오염을 제거하는 방법은 우라실 염기가 포함된 기질 및 본 발명의 UDG 단백질을 포함하는 PCR 반응용 조성물을 본 발명의 UDG 단백질이 효소활성을 나타내는 20 ~ 50℃ 에서 5 ~ 30분간 반응한 후, 당업계에 공지된 방법으로 PCR 반응을 수행함으로써 PCR 반응 산물내의 교차 오염을 제거할 수 있다. 또한, 본 발명의 UDG 단백질은 효소 반응 후, 보통 50℃ ~ 70℃의 온도 범위에서 반응하는 대부분의 PCR 반응 과정에서 활성을 잃기 때문에 PCR 반응 산물을 분해하거나 반응 산물의 양이 줄어드는 일을 방지할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 우라실 염기가 포함된 기질 및 본 발명의 UDG 단백질을 포함하는 PCR 반응용 조성물을 25℃에서 10분간 반응시킨 후 PCR 반응을 수행함으로써 본 발명의 UDG 단백질이 PCR 반응과정 중에 발생하는 교차오염은 줄이고 PCR 반응에는 아무런 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

우라실 -DNA 글리코실라제 ( UDG ) 유전자의 클로닝

본 발명자들은 저온에서도 활성을 가지는 새로운 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 유전자를 탐색하기 위하여 한국 해양과학연구소에서 10℃에서 생육하는 10 종류의 저온성 균주(하기 표 1 참조)를 분양받았다. 상기 분양받은 저온성 균주로부터 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 유전자를 확보하기 위하여 먼저, 상기 균주들을 10℃에서 배양하고, 배양된 균주들로부터 퀴아젠 게놈 DNA 분리 키트를 사용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 이후, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 기존에 보고된 대장균 (E. coli ), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae ), 슈도모나스 데니트리픽칸스(Pseudomonas denitrificans ), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis ) 및 해양성 저온균주인 BMTU3346의 UDG 유전자 중에서 잘 보존된 부위의 아미노산(도 1 참조)을 참조하여 하기의 서열번호 3 및 4의 프라이머를 제작하여 PCR를 수행하였다. 상기 PCR의 조건은 95℃에서 5분간 반응 후, 94℃에서 30초, 48℃에서 30초 및 72℃에서 1분간 반응 과정을 30회 반복 수행하였고, 72℃에서 5분간 연장반응 후 반응 산물을 1% 아가로스 겔에 전기 영동하여 그 결과를 확인하였다. 또한, (주)코스모진텍사(한국)의 PCR 정제 키트를 사용하여 상기 아가로스 젤에서 PCR 반응 산물들을 정제하였고, 이를 리얼 바이오테크사(Real biotech Corp., 중국)의 T&A 클로닝 벡터 키트를 이용하여 상기 제조업체의 실험방법에 따라 벡터에 클로닝 하였다. 상기 클로닝된 DNA의 염기서열은 (주)바이오닉스사에 의뢰하여 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 유전자의 보존된 염기서열과 유사성을 비교하였다.

저온성 균주들의 계통분류

균주	계통 분류 관계	유사도 (%)	그룹	장소	원천	진뱅크 번호
1. HJ184	플라보박테리움 프리지다리움 ( Flavobacterium frigidarium )	98	CFB	후진	해면	AF162266
2. GMD509	포토박테리움 속 ( Photobacterium sp.)	97	γ-프로토 박테리아	거문도	해면	AF261065
3. HJ147	피시크로박터 우라티보란스 ( Psychrobacter urativorans )	99	γ-프로토 박테리아	후진	해면	AJ609555
4. HJ171	바실러스 속 AH678 (Bacillus sp. AH678)	98	그람-양성 박테리아	후진	해면	AF290561
5. HJ154	마린 피시크로필 SW17 (Marine psychrophile SW17)	96	CFB	후진	갯지렁이	AF001368
6. GMD430	파라코커스 속 88/2-4 (Paracoccus sp. 88/2-4)	99	α-프로토 박테리아	거문도	해면	AJ313424
7. GMD319	파라코커스 속 ARCTIC-P17 (Paracoccus sp. ARCTIC-P17)	99	α-프로토 박테리아	거문도	해면	AY573045
8. ULD409	앨트로모나스 마클레오디 (Alteromonas macleodii )	96	γ-프로토 박테리아	울릉도	퇴적토	AF261044
9. HJ127	슈도앨트로모나스 속 SM9913 (Pseudoalteromonas sp. SM9913)	99	γ-프로토 박테리아	후진	해면	AY305857
10. HJ192	바실러스 백령엔시스 (Bacillus baekryungensis )	99	그람-양성 박테리아	후진	해면	AY505505

서열번호 3의 프라이머 : 5'-GTN GTN ATN YTN GGN CAR GAY CC- 3'

서열번호 4의 프라이머 : 5'- ARN GGN SWN GGR TGN GGN GMY- 3'

(상기에서 M은A 또는 C 염기일 수 있고, Y는 C 또는 T 염기일 수 있으며, W는 A 또는 T 염기, S는 G 또는 C 염기, R은 A 또는 G 염기, N은 A, T, G 또는 C 염기일 수 있다)

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 상기 균주들의 게놈 DNA로부터 PCR을 수행한 결과, 다양한 길이의 DNA 단편들이 증폭되었으나, 그 중에서 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 보존된 부분의 DNA에 해당되는 약 400bp의 DNA 단편은 상기 10개의 균주들 중에서 5개의 균주, 즉, HJ127, ULD409, HJ147, GMD430 및 GMD319 에서확인되었다. 또한, 상기 증폭된 5개의 DNA 단편의 염기서열을 확인한 결과, 2개의 균주, 즉, ULD409 및 HJ127에서 기존에 알려진 다른 종의 UDG 염기서열과 높은 상동성을 보임을 확인하였다(결과 미도시).

< 실시예 2>

우라실 -DNA 글리코실라제(UDG)의 전장 유전자의 클로닝

상기 실시예 1에서 기존에 알려진 UDG 염기서열과 높은 상동성을 보인 ULD409 균주에서 분리된 약 400bp의 DNA을 이용하여 전체 UDG 유전자를 클로닝 하였다. 전체 UDG 유전자를 클로닝하기 위한 방법으로는 당업계에 공지된 방법인 인버스(inverse) PCR 방법을 이용하였다(Ogasawara, N., et al., DNA Res., 1, 1-14, 1994 참조). 먼저, ULD409 균주의 게놈 DNA를 상기 실시예 1에 의해 클로닝된 약 400bp의 UDG 유전자 내에 절단부위가 없는 제한효소인 Sau3A I로 절단한 후, 동일한 염기서열을 인식하여 자르는 제한효소인 BamH I으로 절단된 pBlueScript SK(II) (스트라타진, 미국) 벡터를 이용하여 16℃에서 5시간 DNA 접합을 실시하였다. 이후 상기 접합된 DNA산물을 주형으로 인버스 PCR을 수행하기 위하여 상기 실시예 1의 ULD409 균주로부터 클로닝된 약 400bp에 해당되는 UDG의 보존된 유전자의 염기서열을 기본으로 4개의 인터널 프라이머를 제작하였다(표 2 참조). 그리고 상기 제조된 인터널 프라이머와 당업계에 공지된 pBlueScript SK(II)의 유니버셜 프라이머인 T3와 T7 프라이머를 이용하여 인버스 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 반응 산물은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 T&A 클로닝 벡터 키트를 이용하여 클로닝 하였고, 염기서열 분석을 의뢰하여 전장 UDG 유전자의 염기서열을 밝혔으며, 클러스터 프로그램(www.ebi.ac.uk/clustalw)을 이용하여 대장균 및 BMTU3346 균주의 UDG 유전자의 염기서열과 유사성을 비교하였다.

인터널 프라이머 서열

프라미어	염기서열	서열번호
UDG 상위 인터널 1	5'- GAA GCA TAA GCC ATG AGC -3'	5
UDG 하위 인터널 1	5'- CAG ACG CAC TAA GCA TTG -3'	6
UDG 상위 인터널 2	5'- AAC CAG CGA GGG AGG -3'	7
UDG 하위 인터널 2	5'- GTG GGG CAG TCA CGC AC -3'	8

그 결과, 상기 ULD409 균주로부터 분리된 UDG 유전자의 전장 염기서열은 총 660bp로 이루어져 있었으며, 총 아미노산은 219개로 이루어져 있었다. 따라서 본 발명에서는 상기 UDG 유전자의 전장 염기서열을 서열번호 1로 표시하였고, 아미노산 서열을 서열번호 2로 표시하였으며 상기 아미노산의 서열로 본 발명의 UDG 단백질의 분자량이 약 24.4 kDa인 것을 추정할 수 있었다.

또한, ULD409 균주로부터 분리된 본 발명의 UDG 유전자의 염기서열과 대장균 및 BMTU3346 균주의 UDG 유전자의 염기서열를 비교한 결과, 대장균과는 63%의 상동성을 보였으며, BMTU3346와는 40%의 상동성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 또한, UDG의 활성에 중요하게 관여하는 것으로 알려진 아스파르트산(D), 아스파라기닌(N) 및 히스티딘(H) 잔기가 잘 보존되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

< 실시예 3>

재조합 우라실 -DNA 글리코실라제(UDG)의 발현

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 제조된 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 전장 유전자를 이용하여 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 단백질을 생산하기 위해 당업계에 공지되어있는 히스티딘이 표지된 발현벡터인 pET-22b(+)(노바젠, 미국)를 이용하였다. 먼저, 발현벡터인 pET-22b(+)에 UDG 유전자를 클로닝하기 위하여 UDG 유전자 내에 존재하지 않고, 발현벡터내의 클로닝부위에만 존재하는 제한효소인 Nde I 및 Xho I를 사용하였다. 따라서 이를 위하여 UDG 유전자의 5' 영역과 3' 영역에 첨가할 제한효소부위가 삽입된 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머를 디자인하였다. 그런뒤, 상기 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 전장 유전자를 주형으로 하고 상기 프라이머들 및 PCR 과정에서 염기서열 변형 비율이 낮다고 알려진 PyroAce DNA polymerase (렉스진바이오텍사)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR의 조건은 50ng의 주형 DNA, 10 pmol의 프라이머, 200uM dNTP, 2,5 U PyroAce DNA polymerase, PyorAce 버퍼를 첨가하여 총 100㎕가 되게 한 후, 95℃에서 5분, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 반응을 30회 반복하고 72℃에서 10분간 반응하였다. 이후, 상기 PCR 반응 산물을 제한효소인 Nde I 및 Xho I로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리한 pET-22b(+)벡터에 결합시켜 본 발명의 UDG 유전자가 포함된 재조합 벡터를 제조하였고, 이를 발현시킬 수 있는 대장균 BL21(DE3)에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 형질전환 하였다. 이후, 형질전환된 균주를 40 mL LB 브로스 배지에 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였고 상기 배양된 형질전환 발현 균주를 2 L의 2X YT배지에 20 mL 접종한 후 37℃에서 배양하다가 OD₆₀₀ 값이 0.5이 될 때 이소프로필 티오갈락토시드(IPTG)를 최종 0.1 mM의 농도가 되도록 첨가하여 25℃에서 5시간 배양하면서 본 발명의 전장 UDG 유전자의 발현을 유도하였다.

서열번호 9의 프라이머

5'- CTA AAC ATA TGA CCA CAT GGG TAC AAG CAT TGG -3'

서열번호 10의 프라미어

5'- NNC TCG AGT ACC TGC CAA GAA ATG GGT GAA AG -3'

(상기에서 N은 A, T, G 또는 C 염기일 수 있다.)

< 실시예 4>

우라실 -DNA 글리코실라제 ( UDG ) 단백질의 정제

상기 실시예 3의 방법에 의해 발현된 본 발명의 재조합 UDG 단백질을 정제하기 위하여 상기 실시예 3에서 IPTG를 첨가하여 배양한 배양액을 원심분리 하였다. 이후 모든 과정은 발현된 재조합 단백질을 정제하기 위하여 4℃에서 실시하였다. 먼저, 상기 원심분리에 의해 수집된 균주 10g을 용해버퍼(10mM Tris-HCl pH 7.9, 5mM KCl, 0.1mM EDTA, 0.1mM PMSF) 100mL에 완전히 현탁시키고, 리소자임(Lysozyme)(시그마, 미국) 10mg를 첨가하여 균주를 용해시켰다. 상기 용해된 균주는 원심분리기에서 4℃, 20,000rpm으로 30분간 원심분리 하였고, 상층액만을 친화성 크로마토그래피인 하이트랩 해파린 HP(HiTrap Heparin HP) 컬럼(아머샴 바이오사이언스, 스웨덴)에 로딩하였다. 그리고 용출버퍼(10mM Tris-HCl pH 7.9, 1M KCl, 0.1mM EDTA, 0.1mM PMSF)의 염화칼륨(KCl) 농도를 50mM 에서 1M까지 높여가면서 UDG 단백질을 용출시켰다. 이때 재조합 UDG 단백질의 경우 약 300mM의 염화칼륨 농도에서 용출되는 것을 확인하였고(결과 미도시), 상기 용출된 UDG 단백질은 니켈 컬럼 버퍼 A(20mM 인산나트륨 pH 7.4, 0.5M 염화나트륨, 10% 글리세롤)를 사용하여 투석하였다. 이후, 투석된 단백질은 친화성 크로마토그래피인 하이트랩 킬레이팅 HP(HiTrap chelating HP) 컬럼에 로딩하였으며, 니켈 컬럼 버퍼 B(20mM 인산나트륨 pH 7.4 0.5M 염화나트륨, 0.5M 이미다졸 )를 이용하여 단백질을 용출시켰다. 이때, 약 150mM 이미다졸 농도에서 UDG 단백질이 용출되었고, 이후 상기 단백질을 투석버퍼(20mM Tris-HCl pH8.0, 100mM 염화칼륨, 0.1mM EDTA)을 이용하여 투석하였으며 이를 저장버퍼(20mM Tris-HCl pH 8.0, 100mM 염화칼륨, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% 글리세롤, 0.5% 트윈-20, 0.5% Nonidiet P 40)에 보관하여 사용 시까지 -20℃에 보관하였다.

< 실시예 5>

우라실 -DNA 글리코실라제(UDG)의 활성 측정

본 발명의 우라실-DNA 글리코시라제(UDG)의 효소활성 측정은 Lanes 등의 방법(Secades, P., et al., FEMS Microbiol . Lett . 226, 273-279, 2003 참조)을 이용하여 PCR 기술에 의한 인위적인 [³H]-UMP DNA 기질을 제조하고 이를 이용하여 측정하였다.

<5-1> PCR 에 의한 기질 제조

상기 실시예 4에서 정제된 본 발명의 재조합 UDG 단백질의 활성을 측정하기 위하여 약 1.8kb의 DNA 단편 (Staphylothermus marinus DNA ligase gene)을 주형으로 하고 PCR 방법을 이용하여 기질을 제조하였다. PCR 혼합물(100㎕)의 조성은 dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP를 최종농도가 0.15mM씩 되도록 각각 첨가하였고, dUTP 내에는 약 2.0uM의 데옥시[5-³H]유리딘-5-트리포스페이트([³H]-dUTP:TRK351,GE Healthcare)가 5-30 Ci/mmol이 되도록 포함하였으며, 700 pg 의 주형 DNA, 서열번호 11 및 12로 표시되는 PCR 프라이머 10 pmol, 5U 슈퍼 텍 DNA 폴리머라제(렉스진바이오테크사) 및 10x 텍 버퍼 II (300mM 트리신 pH 9.1, 400mM 염화칼륨, 15mM 염화마그네슘, 2% 트윈)이 포함되도록 하였다. PCR 반응은 94℃에서 50초, 60℃에서 1분, 72℃에서 3분 30초를 30회 반복 수행하였다. 이후, 상기 PCR에 의해 증폭된 [³H]-dUTP DNA 기질을 넵-5 컬럼(NAP-5 Column) (아머샴 바이오사이언스)를 이용하여 미반응된 [³H]-dUTP를 제거하여 본 발명에 사용될 기질을 제조하였다.

서열번호 11의 프라이머

SmLigN: 5'- AGG ATT ACA TAT GGC TGC ACA GCA GAG CGA A- 3’

서열번호 12의 프라이머

SmLigC: 5'- ATA ACT CGA GTT CAG ATA ATT TCT TTA GTT GTC TTT T- 3’

<5-2> 우라실 -DNA 글리코실라제(UDG)의 활성분석

본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 활성을 측정하기 위하여 50mM Tris-HCl(pH 8.5), 50mM 염화칼륨, 1mM EDNA, 2ug BSA, 1mM DTT, 상기 <5-1>에서 제조된 [³H]-dUTP DNA 기질 5㎕-6㎕(약 80 ng, 50,000cpm) 및 본 발명의 재조합 UDG 단백질 1ul를 혼합하여 반응액이 최종 20㎕가 되도록 하였다. 상기 반응 혼합액을 25℃에서 10분간 반응시킨 후, 얼음 속에서 단일 가닥의 송아지 흉선 DNA (ice-cold single-stranded calf-thymus DNA)(1mg/㎖) 20㎕ 및 25%(w/v) TCA 200㎕를 첨가하여 15분간 방치한 후 , 13000 rpm에서 10분간 원심분리하여 산-용해(acid-soluble) [³H]-우라실을 함유하는 상등액 120 ul를 회수하였고, 이를 베크만 LS 6800 액체 섬광 계수기를 이용하여 [³H]-dUTP DNA 기질에 대한 특이적 활성도를 측정하였다(Feinberg, A.P. et al., Anal. Biochem. 132: 6-13, 1983; Sorbek H, et al., FEBS Lett 388:1-4, 1996 참조).

그 결과, 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 기질에 대한 특이적 활성도는 9519 cpm/㎕인 것으로 나타났다(결과 미도시).

<5-3> 최적활성 pH의 결정

본 발명의 UDG 단백질의 최적활성 pH를 결정하기 위하여 pH 5.5-10.0의 범위에서 0.5의 간격으로 pH를 달리하면서 상기 <5-2>에서 수행한 방법과 동일한 방법으로 UDG 단백질의 활성을 측정하였다. 이때, pH 5.5-6.5의 범위에서는 50mM 매스-수산화나트륨(MES-NaOH) 완충용액을 사용하였으며, pH 6.5-7.5의 범위에서는 50mM 몹스-수산화나트륨(Mops-NaOH) 완충용액을 사용하였고, pH 7.5-9.0의 범위에서는 50mM Tris-HCl 완충용액 및 pH 9.0-10.0의 범위에서는 50mM 글라이신-수산화나트륨(Glycine-NaOH)완충용액을 사용하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 UDG 단백질의 활성도는 pH 8.0 내지 9.0에서 높게 나타나고 있음을 확인함으로써 상기 pH 8.0 내지 9.0의 범위가 본 발명에 따른 효소의 최적 pH 범위임을 알 수 있었다. 특히, Tris-HCl 완충용액을 사용한 pH 8.5 및 글라이신-수산화나트륨(Glycine-NaOH) 완충용액을 사용한 pH 9.0에서 효소의 활성이 가장 높게 나타났다. 반면 pH 6.5 이하에서는 본 발명의 UDG 단백질의 활성도가 급격히 감소하는 것으로 나타났다.

<5-4> 최적 온도의 결정

본 발명에 따른 UDG 단백질의 최적 온도를 측정하기 위해 10℃ 내지 80℃까지의 온도범위에서 10℃ 간격으로 반응 온도를 다양하게 하면서 상기 <5-2>에서 수행한 UDG 단백질의 활성측정 방법과 동일한 방법으로 효소반응의 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 UDG 효소의 최적 반응 온도는 20℃ 내지 30℃인 것으로 나타났으며, 특히, 50℃ 이후부터는 효소의 활성이 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

<5-5> 2가 양이온 최적 농도의 결정

2가 양이온은 여러 가지 효소들의 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에 따른 UDG 단백질의 활성에 2가 양이온이 영향을 미치는지를 측정하기 위하여 염화마그네슘(MgCl₂), 염화망간(MnCl₂), 염화칼슘(CaCl₂), 염화코발트( CoCl₂), 염화아연(ZnCl₂) 및 EDTA를 각각 1mM의 농도로 첨가하여 상기 <5-2>에서 수행한 방법과 동일하게 UDG 단백질의 효소 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 염화마그네슘(MgCl₂), 염화망간(MnCl₂), 염화칼슘(CaCl₂), 염화코발트(CoCl₂), 염화아연(ZnCl₂) 및 EDTA의 2가 양이온은 본 발명의 UDG 단백질의 효소 활성에 있어서 거의 차이가 보이지 않았으나, 반면 염화코발트(CoCl₂)를 첨가하였을 때에는 효소 활성이 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 효소는 염화코발트를 제외한 대부분의 2가 양이온이 효소 반응에 있어서 중요하게 필요로 하지 않는다는 것을 알 수 있었다.

<5-6> 열 안정성 측정

본 발명에 따른 UDG 단백질의 열 안정성을 측정하기 위해 상기 <5-2>의 반응 혼합액을 30℃, 40℃, 50℃ 및 60℃에서 반응시키면서 각 시간별(0, 5, 10, 20, 30, 40, 50 및 60분)로 시료를 채취하여 상기 <5-2>에서 수행한 UDG 단백질의 효소활성 측정방법과 동일한 방법으로 효소반응의 활성을 측정하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 UDG 효소를 30℃, 40℃ 및 50℃에서 5 ~ 60분간 반응시켰을때, 30℃에서는 60분간 거의 활성이 일정하게 나타났으며 상당히 안정하다는 것을 알 수 있었다. 또한 40℃에서도 50분까지 활성이 상당히 안정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 50℃에서는 효소의 열 안정성이 급격히 감소하여 5분 이내에 활성이 거의 0에 가깝게 나타나는 것을 확인하였다(도 8 참조). 따라서 본 발명의 UDG 효소는 기존에 알려진 대장균의 UDG 효소가 60℃ 이상에서도 활성을 가지고 있는 것에 비해 낮은 온도에서도 쉽게 활성을 잃어버린다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

우라실 -DNA 글리코실라제 ( UDG ) 단백질의 기질특이성 및 열안전성 확인

본 발명의 UDG 단백질을 PCR에 응용하기 위하여 기질특이성 및 열안정성 실험을 수행하였다. 먼저 기질특이성과 열안전성 실험을 위한 기질은 Lambda DNA(다카라, 일본)를 주형으로 2kb 크기의 PCR 반응산물을 dUTP와 dTTP를 각각 이용하여 제조하였다. 100㎕의 PCR 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 최종농도가 0.20 mM씩 되도록 각각 첨가하였고, 1ng의 Lambda DNA, 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 10 pmol, 2.5 U 수퍼 텍 DNA 폴리머라제(렉스진 바이오테그사) 및 10x 텍 버퍼 II를 첨가하였다. PCR 반응은 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초를 30회 반복 실시하였다. 이때, dUTP를 포함하는 기질을 제조할 때에는 dTTP를 제외하고 dUTP의 최종농도를 0.50 mM이 되도록 첨가하는 것을 제외하고는 상기와 같은 방법으로 PCR을 수행하였다. PCR 반응 후 잔여 프라이머와 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 dUTP)는PCR 정제 키트(코스모진텍, 한국)를 사용하여 PCR 반응산물을 순수 분리함으로써 제거하였다. 그런 뒤 상기 준비된 dUTP가 포함된 기질 또는 dTTP가 포함된 기질 300ng 및 10x 텍 버퍼 II를 첨가한 혼합물에 상기 실시예 4에서 정제한 본 발명의 UDG 단백질 1 unit을 혼합하여 25℃에서 10분간 효소 반응을 시킨 후 95℃에서 5분간 반응하여 효소의 활성을 불활성화 시켰다. 이때, 대조군으로는 상기 본 발명의 UDG 효소 대신 대장균(E. coli)의 UDG(퍼멘타스, 리투아니아) 및 BMTU 균주의 UDG 효소(로슈, 독일)를 사용하였다. 또한, 상기 효소들에 대한 열안전성을 비교하기 위하여 상기 효소들을 50℃에서 5분간 열처리하지 않은 것 또는 열처리 한 것을 사용하였다. 상기 반응 결과는 1% 아가로스겔에 전기영동하여 확인하였다.

서열번호 13의 프라이머

Lambda forward : 5'-cgc cac gac gat gaa cag ac-3'

서열번호 14의 프라이머

Lambda reverse : 5'-cac tgg ccc gtg ccg tgg ag-3'

그 결과, 도 9에서 보는 바와 같이, dUTP를 포함하는 기질은 본 발명의 UDG, 대장균(E.coli)의 UDG 및 BMTU의 UDG 효소에 의해 모두 분해되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 dTTP가 포함된 기질은 전혀 분해되지 않는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 UDG 효소 역시 dUTP를 포함하는 기질만을 선택적으로 분해하는 것을 알 수 있었다.

또한, 50℃에서 5분간 열처리한 UDG 효소들의 반응을 비교한 결과, 본 발명의 UDG 효소는 50℃에서 5분간 열처리 함으로써 효소의 활성을 잃어 dUTP를 포함하는 기질이 분해되지 않고 그대로 남아있는 것을 확인할 수 있었다. 이는 저온에서 쉽게 불활성화 된다고 알려진 BMTU 균주에서 분리된 UDG 효소와 거의 유사한 활성도를 보임을 알 수 있었다. 반면 대장균의 UDG 효소는 열처리 후에도 활성이 남아있어 dUTP를 포함하는 기질이 모두 분해된 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 7>

본 발명의 우라실 -DNA 글리코실라제(UDG)의 PCR 응용

<7-1> 간접 PCR 반응

본 발명자들은 본 발명의 UDG 단백질을 PCR 반응에 응용할 수 있는지 확인하기 위하여 먼저, 간접 PCR을 수행하였다. 이를 위해 dUTP와 dTTP를 포함하는 기질을 마우스 β-액틴 DNA를 이용하여 각각 제조하였다. 즉, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 최종농도가 0.20 mM씩 되도록 각각 첨가하였고, 1ng 마우스 β-액틴 DNA, 서열번호 15 및 16로 표시되는 프라이머 10 pmol, 2.5 U 수퍼 텍 DNA 폴리머라제(렉스진 바이오테크사) 및 10x 텍 버퍼 II를 첨가하여 총 100㎕의 PCR 혼합물이 되도록 하였다. PCR 반응은 94℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 1분을 35회 반복 수행하였다. 이때, dUTP를 포함하는 기질을 제조하기 위하여 상기 dTTP를 제외하고 dUTP의 최종농도를 0.50 mM으로 맞춘 후 상기 방법과 동일하게 PCR을 수행하였다. PCR 반응 후 잔여 프라이머와 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 dUTP)를 제거하기 위하여 PCR 정제 키트(코스모진텍, 한국)을 사용하여 PCR 반응산물을 순수 분리하였다.

서열번호 15의 프라이머

Mouse forward 5'-agc aag aga ggt atc gtg ac-3'

서열번호 16의 프라이머

Mouse reverse 5'-acc gat cca cac aga gta c-3'

상기와 같은 방법으로 제조된 dUTP 또는 dTTP를 포함하는 기질 1ng과 본 발명의 UDG 효소 1 unit(열처리 하지 않은 것 또는 50℃에서 5분간 열처리 한 것)을 혼합하여 각각 25℃에서 10분간 반응 후, PCR 혼합물(1U 수퍼 텍 DNA 폴리머라제, 200 uM의 dATP, dCTP, dGTP 및 500uM의 dUTP, 상기 서열번호 15 및 16로 표시되는 프라이머 5 pmol 및 10x 텍 버퍼 II)을 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다. 이때 대조군으로는 대장균 및 BMTU 균주의 UDG 효소를 열처리 하지 않은 것 또는 50℃에서 5분간 열처리 한 것을 사용하였다. 상기 PCR 반응은 94℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 1분을 35회 반복 수행하였고, 상기 PCR 반응 산물은 1% 아가로스겔에 전기영동하여 확인하였다.

그 결과, 열처리 하지 않은 본 발명의 UDG, 대장균의 UDG 및 BMTU의 UDG 효소와 반응한 기질은 간접 PCR 반응결과 반응산물이 전혀 증폭되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 반면, 50℃에서 5분간 열처리한 UDG 효소들 중에서 대장균 UDG를 제외한 본 발명의 UDG 및 BMTU의 UDG와 반응한 기질은 간접 PCR 반응결과 반응산물이 증폭된 것을 확인할 수 있었다(도 10a 및 도 10b 참조). 이는 상기 대장균의 UDG 효소는 50℃에서 5분간 열처리를 하여도 활성을 잃지 않았기 때문에 dUTP가 포함되어 있는 기질을 계속적으로 분해함으로써 PCR 반응 산물이 증폭되지 않았고, 반면, 본 발명의 UDG은 저온에서 효소 활성을 잃어버린다고 알려진 BMTU의 UDG와 같이 열처리를 통해 효소활성을 잃어버렸기 때문에 효소반응 시 기질내의 dUTP가 분해되지 않아서 간접 PCR 반응을 통해 반응산물이 증폭되었음을 알 수 있었다. 상기와 같은 결과는 앞에서 수행한 실시예 6의 실험 결과와 일치하는 것을 알 수 있었다.

<7-2> 직접 PCR 반응

본 발명자들은 상기 실시예 <7-1>과 같이 기질 및 본 발명의 UDG 단백질을 혼합하여 먼저 효소 반응을 시킨 후, PCR 반응 혼합물을 이후에 첨가하여 PCR 반응을 수행하는 간접 PCR의 결과를 토대로 본 발명의 UDG 단백질의 효소반응 및 PCR 반응을 한번에 수행하는 직접 PCR 반응을 수행하였다. 직접 PCR 반응은 상기 실시예 <7-1>에서 사용된 기질 1ng, PCR 반응을 위한 반응 혼합물(1U 수퍼 텍 DNA 폴리머라제, 200 uM의 dATP, dCTP, dGTP 및 500uM의 dUTP, 상기 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머 5 pmol 및 10x 텍 버퍼 II) 및 본 발명의 UDG, 대장균의 UDG 또는 BMTU의 UDG 1 unit을 각각 첨가하여 25℃에서 10분간 효소반응 후 상기 실시예 <7-1>과 동일한 조건으로 PCR 반응을 수행하였다. 이후, PCR 반응 산물은 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 UDG, 대장균의 UDG 및 BMTU의 UDG를 사용한 직접 PCR 반응에서 dUTP를 포함하는 기질을 사용한 반응에서는 PCR 반응 산물이 증폭되지 못했지만, dTTP를 포함한 기질을 사용한 반응에서는 PCR 반응 산물이 증폭되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 UDG 단백질은 PCR 반응에 필요한 혼합물에 함께 첨가하여 효소반응 및 PCR 반응을 한번에 수행하는 직접 PCR 반응에도 응용할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 11 참조).

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규한 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)는 저온성 세균인 앨트로모나스 마클레오디(Alteromonas macleodii)로부터 분리된 효소로써 우라실을 포함하고 있는 DNA 기질 내에서 우라실 염기를 분해하는 활성이 있고 저온에서 쉽게 변성하는 특징이 있어 PCR 반응 과정 중에서 발생하는 교차 오염을 제거함으로써 유전공학 및 분자생물학 실험, 바이러스 유전자 및 암 유전자의 조기 판단, 유전병 판단 및 법의학에 이르는 광범위한 분야에서 널리 사용되고 있는 PCR 반응에 응용함으로써 PCR 반응의 정확도, 순도 및 증폭 효율을 증가시키는데 효과적으로 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 우라실-DNA 글리코실라제(UDG).
제1항의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 폴리뉴클레오티드.
제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 앨트로모나스 마클레오디(Alteromonas macleodii)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제5항의 벡터로 형질전환된 세균.
제6항의 형질전환된 세균을 배양하는 단계를 포함하는 제1항의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 생산하는 방법.
제1항의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 포함하는 PCR 반응용 조성물.
우라실 염기를 포함하는 DNA 기질 및 제1항의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 포함하는 PCR 반응용 조성물을 20 ~ 50℃에서 5 ~ 30분간 반응하는 단계를 포함하는 PCR 반응 산물의 교차오염을 제거하는 방법.