JP6933907B2 - 核酸増幅方法 - Google Patents
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Description
また、本発明によれば、上記の方法に用いられる核酸増幅用試薬であって、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼ、dATP、dUTP、dCTPおよびdGTPを含む核酸増幅用試薬が提供される。
試料は、後述する標的核酸の濃度の調整などのために、必要に応じて水性媒体で希釈してもよい。このような水性媒体としては、例えば水、リン酸緩衝液、生理食塩水などが挙げられる。
標的核酸の形態は特に限定されず、直鎖状または環状の核酸であってもよいし、1本鎖又は2本鎖の核酸であってもよい。
ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼは、好ましくは古細菌由来のDNAポリメラーゼであり、より好ましくはピロコッカス属(Pyrococcus)由来もしくはサーモコッカス・コダカラエンシス(Thermococcus kodakaraensis)由来の耐熱性DNAポリメラーゼであり、さらに好ましくはPhusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymeraseおよび/またはKOD plus neoである。ここで、「ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅する」とは、ウラシル塩基を含まない核酸を増幅する一方で、ウラシル塩基を含まない核酸を実質的に増幅しないことをいう。「ウラシル塩基を含まない核酸を実質的に増幅しない」とは、本実施形態の方法の実施に悪影響を及ぼさない範囲で、ウラシル塩基を含まない核酸が増幅され得ることをいう。
第一の核酸増幅のための反応液中における、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼの濃度は、好ましくは0.01〜0.2ユニット/1μl、より好ましくは0.02〜0.1ユニット/100μlである。
第一及び第二プライマーは、好ましくは5〜50塩基、より好ましくは10〜40塩基の長さである。
第一の核酸増幅のための反応液中における第一及び第二プライマーの濃度は、好ましくは0.05〜2μM、より好ましくは0.1〜1μMである。
第一及び第二プライマーは、当業者に公知の核酸合成方法により製造することができる。
第一の核酸増幅は、好ましくは10〜60サイクル、より好ましくは15〜50サイクル行われる。第一核酸増幅工程の前に、核酸増幅反応(以下、「予備的増幅」という)を行い、その鋳型を用いて第一の核酸増幅工程を実施してもよい。この場合、予備的増幅で産生された増幅産物を予備的増幅の反応液から分取し、ポリメラーゼやdNTPsなどの試薬類と混合して反応液を調整し、第一の核酸増幅工程を実施することができる。予備的増幅において使用される試薬類は、第一の核酸増幅工程で使用される試薬類と同じであることが好ましい。予備的増幅を行う場合は、予備的増幅のサイクル数と、第一の核酸増幅のサイクル数の合計が、10〜60サイクル、より好ましくは15〜50サイクルであることがこのましい。
第二の核酸増幅のための反応液中における、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼの濃度は、好ましくは0.5U/μLから10U/μL、より好ましくは1U/μLから5U/μLである。
(i) 前記第一領域と前記第三領域の一部又は全部が重複し、かつ、前記第二領域と前記第四領域の一部又は全部が重複する;又は
(ii) 前記第一及び第二プライマーに付加されたタグの一部又は全部が、それぞれ第三及び第四領域と重複する。
上記の(ii)の関係は、第三及び第四プライマーがそれぞれ第一及び第二プライマーに付加されたタグにハイブリダイズするように設計される場合を意図する。
第三及び第四プライマーは、好ましくは5〜50塩基、より好ましくは10〜40塩基の長さである。
第二の核酸増幅のための反応液中における第三及び第四プライマーの濃度は、好ましくは好ましくは4.0nMから24.4μM、より好ましくは20nMから12.2μMである。
第三及び第四プライマーは、当業者に公知の核酸合成方法により製造することができる。
水性相と油との混合比(体積比)は、好ましくは、水性相1に対して油1〜10、より好ましくは水性相1に対して油2〜8である。
第二の核酸増幅は、好ましくは10〜70サイクル、より好ましくは20〜60サイクル行われる。
第一の核酸増幅工程におけるサイクル数と、第二の核酸増幅工程におけるサイクル数との合計は、好ましくは20〜120サイクル、より好ましくは35〜100サイクルである。
乳化助剤は、好ましくは10,000 g/mol未満の分子量を有する。
第二核酸増幅工程においてビーズを用いたエマルジョンPCRを実施した場合、増幅後、当業者に公知の方法により、エマルジョンを「破壊」又は崩壊してもよい。エマルジョンを破壊する方法は、例えば洗浄剤を加えることである。洗浄剤は、それらに限定されないが、Triton X100、ラウレス4及びノニデット(例えばNP-40)を含む。好ましくは、エマルジョン破壊溶液は、効果的な相分離をもたらすだけでなく、エマルジョンから放出されるビーズの凝集も妨げる。エマルジョン破壊溶液は、ピペット操作により容易に除去できない油性相の形成も妨げる。エマルジョン破壊溶液は、アルコール、例えば2-ブタノール及び/又は1-プロパノールを含んでいてもよい。アルコールの添加により、ビーズの凝集を最小限に保ち、かつピペット操作を可能にしながらエマルジョン破壊を大きく増進できる。
核酸増幅用試薬の形態は特に限定されず、固体(例えば、粉末、結晶、凍結乾燥品など)であってもよいし、液体(例えば、溶液、懸濁液、乳濁液など)であってもよい。核酸増幅用試薬の構成要素は、それぞれ別の容器に保存されているか又は個別に包装されていることが好ましい。核酸増幅用試薬は、検出のための標識オリゴヌクレオチドプローブを備えていてもよく、この場合、標識オリゴヌクレオチドプローブは固相に固定されていてもよい。なお、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼ、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼ、dATP、dTTP、dUTP、dCTPおよびdGTP、標識オリゴヌクレオチドプローブ、固相についての詳細は、上記の核酸増幅方法の説明で述べたことと同様である。
(1)PCR反応液の調製
以下の組成を有するPCR反応液を調製した:12.5μl 10×PCR buffer, 12.5μl 100mM MgCl2, 2,5μl, 1μlのプライマー1及び2(10μM)、0.5μlテンプレート(7pg/μl)、89.5μl蒸留水、2.5μl dNTP(それぞれ10mM:dUTP、dGTP、dATP、dCTP)、2.5μl Taq DNAポリメラーゼ(Peqlab: cat01-1020)。テンプレートは、500コピーの変異DNAである。テンプレートの一方の鎖の塩基配列を配列番号1で、配列番号1の鎖と共に二本鎖(dUTP含有のKRAS DNA断片)を形成するもう一方の鎖を配列番号2で表す。プライマー1及び2を配列番号3及び4で表す。
PCR反応は、以下のサイクル数で行った:94℃ 2分、94℃ 10秒→68℃ 1分→70℃ 10秒を3回、94℃ 10秒→59℃ 1分→70℃ 10秒を40回、70℃ 2分→4℃で放置。
プレPCR反応の基本的な手法はNature Methods Vol.3 No.7 July 2006の「Thermal cycle」に記載のとおりにして行った。
エマルジョンPCRは、Nature Methods Vol.3 No.7 July 2006に記載のとおりにして行った。
エマルジョン破壊、ハイブリダイゼーション工程手法は特表2011−529691号の段落[0079]及び[0080]を参照する。
フローサイトメトリー分析は特表2011−529691号の段落[0081]に記されているフローサイトメトリーシステムを用いて行った。
より具体的には、これらの実験は、以下の(4)〜(8)に記載のとおりにして行った。
変異率が0、0.1、1%の野生型KRAS DNAサンプル(配列番号5:水にKRAS DNA等を混合)と、同サンプルに対してdUTP含有のKRAS DNA断片(配列番号1の鎖及び配列番号2の鎖からなる二本鎖DNA)を1%相当で加えたDNAサンプルを調製し、実験に用いた。
プレPCRは50μlのPCR反応液(約1x106分子の鋳型核酸を含む)で実施した。各反応は5×Phusin高忠実度バッファー、0.8μlのPhusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase又はPhusion U(ともにNEB)、0.2μMのプライマー1、0.2μMのプライマー2、それぞれ0.25 mMのdNTP (dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、及び0.5mM MgCl2から構成された。
PCR産物をPcogreen dsアッセイキット(Invitrogen社)を使用して定量した。蛍光強度は蛍光プレートリーダー(Safire2 TECAN)をDNA参照標準を用いて定量した。
プレPCR工程の増幅産物をテンプレートとして、オイルとエマルジョンPCRマスターミックスを用いてエマルジョンを形成し、サーマルサイクラーにてエマルジョンPCRを実施した。プレPCR工程の増幅産物を18pg程度まで希釈し、4.0単位のPlatinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen社)、1×PCRバッファー(NEB)、それぞれ0.2mMのdNTPs(dATP、dUTP、dGTP、dCTP)、5mMのMgCl2、0.05μMのタグ1 (エマルジョンPCR用プライマー;配列番号6)、8μMのタグ2 (エマルジョンPCR用プライマー;配列番号7)及びタグ1がコーティングされた500〜800万個程度の磁性ビーズ(Myone, Invitrogen社)を含有する150μLのPCRマスターミックスを調製した。150μLのPCRマスターミックスと600μLの油/乳化剤ミックス(7%のABIL WE09、20%の鉱油、73%のTegosoft DEC(Degussa Goldschmidt Chemical社、バージニア州ホープウェル(Hopewell,VA))を96ディープウェルプレートに加えた。エマルジョンは、このプレートをTissueLyser(Qiagen社)内において15Hzで10秒間、次に17Hzで7秒間攪拌することによって調製した。エマルジョンは別の96穴ディープウェルプレートに分注され、下記の条件でサーマルサイクラーにかけられた。
150μLのエマルジョン破壊バッファー(10mMのTris-HCl(pH7.5)、1%のTriton-X 100、1%のSDS、100mMのNaCl、1mMのEDTA)を各ウエルに添加し、TissueLyserを20Hzで20秒間混合した。ビーズは、懸濁液を3,200gで2分間回転させ、油相を除去することによって回収した。エマルジョン破壊工程は、2回繰り返した。8個のウエルからの全ビーズを回収・統合し、150μLの洗浄バッファー(20mMのTris-HCl(pH8.4)、50mMのKCl)で洗浄した。ビーズ上の増幅産物は、0.1MのNaOH水溶液を用いて5分間変性させた。最終はビーズを150μLの洗浄バッファーで洗浄、150μLの洗浄バッファー中に再分散させた。
変異型及び野生型DNA配列に対して相補的な蛍光標識プローブを設計した。プローブのサイズは、標的領域のGC含有量に依存して15bp〜18bp程度である。変異プローブは5'側末端上でCy5(商標)蛍光体を用いて合成し、野生型プローブはCy3(商標)蛍光体に結合させた(Integrated DNA Technologies社)。さらに、増幅産物内の上記ブローブ認識個所とは別の場所に、陽性コントロールとして伸長した増幅産物を標識するために使用した(ユニバーサル)。この増幅産物特異的プローブは、それらの5'側末端に付着したROX(商標)蛍光体を用いて合成した。プローブ配列は下記に記載した。各領域との特異的ハイブリダイゼーション反応液は、30μLの洗浄バッファー(エマルジョン破壊を参照)中に存在するビーズ、66μLの1.5×ハイブリダイゼーションバッファー(4.5Mの塩化テトラメチルアンモニウム、75mMのTris-HCl(pH7.5)、6mMのEDTA)、および4μLのTEバッファー中で5μMに調製された変異型、野生型、およびユニバーサルプローブの混合液を含有していた。ハイブリダイゼーション混合液は70℃へ10秒間加熱し、35℃へ緩徐に(0.1℃/秒)冷却した。35℃で2分間インキュベートした後、この混合液を室温へ冷却した(0.1℃/秒)。ビーズは磁石を用いて集磁し、未結合プローブを含有する上清はピペットを使用して除去した。ビーズは100μLの1×ハイブリダイゼーションバッファー中に再懸濁させ、48℃へ5分間加熱して未結合プローブを除去した。加熱工程後、ビーズは再び磁石によって集磁し、100μLの洗浄バッファーを用いて1回洗浄した。最終工程で、上清を除去し、フローサイトメトリー分析のためにビーズを200μLのTEバッファー中に再懸濁させた。
高スループットオートサンプラーを装備したフローサイトメトリーシステム(BD Bioscience社)を変異型、野生型といったビーズ分析のために使用した。伸長産物を含まないビーズは、分析から除外した。フローサイトメトリーの解析は、FCS express 4(De Novo software)を用いた。
特表2011−529691号の図10Bの「KRAS G38A」に記載のものを使用した。
サンプルが擬似的なキャリーオーバー核酸を含んでいることを確認するためにPhusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymeraseと似た系統でdUTPを基質にできるPCR酵素(Phusion U)をプレPCRに用いたBEAMingを並行して実施した。プレPCRにPhusion Uを用いた場合は、すべての条件で変異率が1%を超える異常な変異率となった。このことから、今回性能確認に用いたサンプルは適切なキャリーオーバー核酸を含有していることが確認できた(図2A)。
実施例1と同じく変異率が0%、1%となるように調製したKRAS DNAサンプル、または同サンプルにウラシル含有DNAを添加したサンプルを用いてBEAMingを実施した。
Phusion U:5×Phusin高忠実度バッファー、0.8ulのPhusion U(ともにNEB)、0.2μMのプライマー1、0.2μMのプライマー2、0.25mMの各dNTP、及び0.5mM MgCl2;
KOD Plus neo:10×buffer、0.8ulのKOD Plus neo、0.2μMのプライマー1、0.2μMのプライマー2、0.2mM各dNTP、1.5mM MgSO4。
結果、実施例1の結果と同様に、プレPCRにPhusion Uを用いた場合は、すべての条件で変異率が1%を超える異常な変異率となり、キャリーオーバー核酸が増幅されていた(図3A)。これに対し、KOD Plus neo を用いた場合は、実施例1でPhusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymeraseを用いた場合と同様に、キャリーオーバーの有無によらず、0%の変異率のサンプルでは0.01%以下、0.1%の変異率のサンプルで0.1%前後の変異率となり、キャリーオーバー核酸の増幅が確認されなかった(図3B)。このことから、プレPCRにKOD plus neoを用いた場合にも、ウラシル含有核酸分解酵素を添加しなくても、emPCRの増幅産物由来のウラシル含有DNAの混入の影響を排除できることが確認できた。
実施例1に記載の方法に従って、種々の濃度のdUTP/dTTP混液を用いるエマルジョンPCRによって得られたPCR産物をgTE (TE(pH8)中20μg/mlのグリコーゲン)で100万分の1に希釈した。このPCR産物を擬似的なキャリーオーバーと想定し、上記の希釈物を用いて、実施例1に記載の方法に従ってプレPCRを行った。増幅産物をゲル電気泳動して泳動写真を取得し、ImageJを用いるデンシトメトリによって増幅効率を数値化した。結果を以下の表3に示す。
111、211、311:第1容器
112、212、312:第2容器
113、213、315:添付文書
114、214、316:梱包箱
313:第3容器
314:第4容器
Claims (16)
- 試料に含まれる標的核酸を鋳型として第一の核酸増幅を行う工程と、
前記第一の核酸増幅を行う工程で生成された増幅産物を鋳型として第二の核酸増幅を行う工程と、
を含み、
前記第一の核酸増幅を行う工程において、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼを用い、ウラシル塩基を含まない増幅産物を生成し、
前記第二の核酸増幅を行う工程において、ウラシル塩基を含むプライマーおよび/またはdUTPと、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼとを用い、ウラシル塩基を含む増幅産物を生成することを特徴とする、核酸増幅方法。 - 前記第一の核酸増幅を行う工程において、
前記試料と、dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPと、前記ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼとを混合して反応液を調製し、
前記反応液は、dUTPが存在する可能性があり、かつウラシル塩基を含む核酸が存在する可能性がある液状試料である、請求項1に記載の方法。 - ウラシル塩基を含む核酸を分解する工程を含まない、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記第二の核酸増幅を行う工程において、dATP、dUTP、dCTPおよびdGTPの存在下で核酸増幅を行う、請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
- 前記第二の核酸増幅を行う工程において、
鋳型核酸である前記第一の核酸増幅を行う工程の増幅産物を含む水性相と、油とを混合し、
油相中に、前記鋳型核酸、dATP、dUTP、dCTP、dGTPおよびウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼを含む水性液滴を作製し、
前記液滴中の前記鋳型核酸を増幅する、請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。 - 前記第二の核酸増幅を行う工程の後、前記第二の核酸増幅を行う工程の増幅産物を検出する工程をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。
- 前記増幅産物を検出する工程において、インターカレーターまたは前記増幅産物に特異的に結合する標識プローブを用いて前記増幅産物の検出を行う、請求項6に記載の方法。
- 前記ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼが、古細菌由来のDNAポリメラーゼである、請求項1〜7のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼが、ピロコッカス属(Pyrococcus)由来もしくはサーモコッカス・コダカラエンシス(Thermococcus kodakaraensis)由来の耐熱性DNAポリメラーゼである、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼである、請求項1〜9のいずれか1つに記載の方法。
- 前記第一の核酸増幅を行う工程において、前記標的核酸の第一領域に結合する第一プライマーと、前記標的核酸の第二領域の相補鎖に結合する第二プライマーとが用いられ、
前記第二の核酸増幅を行う工程において、前記標的核酸の第三領域に結合する第三プライマーと、前記標的核酸の第四領域の相補鎖に結合する第四プライマーとが用いられ、
前記第三プライマーおよび/または前記第四プライマーが、ウラシル塩基を含み、
(i) 前記第一領域と前記第三領域の一部又は全部が重複し、かつ、前記第二領域と前記第四領域の一部又は全部が重複するか、又は、
(ii) 前記第一及び第二プライマーに付加されたタグの一部又は全部が、それぞれ第三及び第四領域と重複する、請求項1〜10のいずれか1つに記載の方法。 - 前記第一の核酸増幅は15〜50サイクル行い、
前記第二の核酸増幅は20〜60サイクル行うことを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。 - 請求項1〜12のいずれか1つに記載の方法に用いられる核酸増幅用試薬であって、
ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼ、
dATP、dTTP、dCTPおよびdGTP
を含む核酸増幅用試薬。 - 請求項1〜12のいずれか1つに記載の方法に用いられる核酸増幅用試薬であって、
ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼ、dATP、dUTP、dCTPおよびdGTPを含む核酸増幅用試薬。 - 請求項1〜12のいずれか1つに記載の方法に用いられる核酸増幅用試薬であって、
ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼを含む第1容器、
dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPを含む第2容器、
ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼを含む第3容器、および
dATP、dUTP、dCTPおよびdGTPを含む第4容器、
を含む核酸増幅用試薬。 - 試料に含まれる標的核酸を鋳型として第一の核酸増幅を行う工程と、
前記第一の核酸増幅を行う工程で生成された増幅産物を鋳型として第二の核酸増幅を行う工程と、
前記第二の核酸増幅を行う工程の後、標識物質で標識された、所望の変異を有する前記第二の核酸増幅を行う工程の変異型増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブ及び前記第二の核酸増幅を行う工程の野生型増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて、前記変異型増幅産物を検出する工程と
を含み、
前記第一の核酸増幅を行う工程において、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼを用い、ウラシル塩基を含まない増幅産物を生成し、
前記第二の核酸増幅を行う工程において、ウラシル塩基を含むプライマーおよび/またはdUTPと、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼとを用い、ウラシル塩基を含む増幅産物を生成することを特徴とする、変異検出方法。
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