CN108504706A

CN108504706A - 核酸扩增方法

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Publication number: CN108504706A
Application number: CN201810154405.9A
Authority: CN
Inventors: 能登谷伦崇; 山下秀治; 吉村美香; 前田丰
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2017-02-24
Filing date: 2018-02-23
Publication date: 2018-09-07
Anticipated expiration: 2038-02-23
Also published as: JP6933907B2; US20180245145A1; US10947585B2; EP3366783A1; CN108504706B; JP2018138011A; EP3366783B1

Abstract

本发明旨在提供可更简便地抑制遗留导致的假阳性的核酸扩增方法。本发明由核酸扩增方法解决上述的课题，其特征在于，包括以试样中所含的目标核酸作为模板而进行第一核酸扩增工序，以在上述第一核酸扩增工序中生成的扩增产物作为模板而进行第二核酸扩增工序，在第一核酸扩增工序中，使用选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶，生成不含尿嘧啶碱基的扩增产物，在第二核酸扩增工序中，使用含尿嘧啶碱基的引物及/或dUTP和能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶，生成含尿嘧啶碱基的扩增产物。

Description

核酸扩增方法

【技术领域】

本发明涉及核酸扩增方法。

【背景技术】

核酸扩增装置由于被重复使用，通过向此后的核酸扩增的反应液混入核酸扩增后的扩增产物，有可发生假阳性的问题。这一般称为遗留，作为抑制其的技术已知在专利文献1中记载的方法。

专利文献1中记载了在核酸的扩增工序中生成含尿嘧啶碱基的扩增产物，在进行此后的核酸扩增之前，设用分解含尿嘧啶碱基的核酸的酶处理，分解之前核酸扩增的含尿嘧啶碱基的扩增产物的工序的方法。当以DNA作为模板时，由此方法分解因遗留而混入的含尿嘧啶碱基的核酸，使得模板核酸被扩增。

【现有技术文献】

【专利文献】

【专利文献1】美国专利第7687247号说明书

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

但是，要求更简便地防止因遗留混入其他试样的核酸被扩增导致的检查精度的降低的方法。从而，本发明旨在提供可更简便地抑制遗留导致的假阳性的核酸扩增方法。

【解决课题的技术方案】

本发明人发现，通过在第一核酸扩增中使用选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶，在第二核酸扩增中使用能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶的核酸扩增可解决上述的课题，从而完成本发明。

即，本发明提供核酸扩增方法，其包括：以试样中所含的目标核酸作为模板而进行第一核酸扩增工序，及以在上述第一核酸扩增工序中生成的扩增产物作为模板而进行第二核酸扩增工序，其特征在于，在第一核酸扩增工序中，使用选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶而生成不含尿嘧啶碱基的扩增产物，在第二核酸扩增工序中，使用含尿嘧啶碱基的引物及/或dUTP和能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶而生成含尿嘧啶碱基的扩增产物。

另外，由本发明提供在上述的方法中使用的核酸扩增用试剂，其为含选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶、dATP、dTTP、dCTP及dGTP的核酸扩增用试剂。

另外，由本发明提供在上述的方法中使用的核酸扩增用试剂，其为含能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶、dATP、dUTP、dCTP及dGTP的核酸扩增用试剂。

本发明还提供变异检测方法，其包括：以试样中所含的目标核酸作为模板而进行第一核酸扩增工序，以在上述第一核酸扩增工序中生成的扩增产物作为模板而进行第二核酸扩增工序，及在上述第二核酸扩增工序之后，使用经标记物质标记的与有期望的变异的上述第二核酸扩增工序的变异型扩增产物特异性地杂交的探针及与上述第二核酸扩增工序的野生型扩增产物特异性地杂交的探针来检测上述变异型扩增产物的工序，其特征在于，在第一核酸扩增工序中，使用选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶而生成不含尿嘧啶碱基的扩增产物，在第二核酸扩增工序中，使用含尿嘧啶碱基的引物及/或dUTP和能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶而生成含尿嘧啶碱基的扩增产物。

【发明效果】

由本发明可提供可简便地抑制遗留导致的假阳性的核酸扩增方法。

【附图说明】

【图1A】是显示本实施方式的试剂的外观的一例的图。

【图1B】是显示本实施方式的试剂的外观的一例的图。

【图1C】是显示本实施方式的试剂的外观的一例的图。

【图2A】是显示在第一核酸扩增中使用Phusion U时的变异率测定的结果的坐标图。

【图2B】是显示在第一核酸扩增中使用Phusion Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶时的变异率测定的结果的坐标图。

【图3A】是显示在第一核酸扩增中使用Phusion U时的变异率测定的结果的坐标图。

【图3B】是显示在第一核酸扩增中使用KOD plus neo时的变异率测定的结果的坐标图。

【实施方式】

在本实施方式中，提供取得比遗留核酸大大过量的目标核酸扩增产物(第一核酸扩增产物)，通过以其作为模板而进行第二核酸扩增，由此抑制遗留的影响的核酸扩增方法。在本实施方式中实施了“第一核酸扩增工序”及“第二核酸扩增工序”的至少2次的核酸扩增工序。在第二核酸扩增工序中，向含第1次核酸扩增工序的扩增产物的反应液的一部分或全部添加新扩增试剂(聚合酶或dNTPs)，进行核酸扩增反应。通常，第二核酸扩增工序在与在第一核酸扩增工序中使用的容器不同的容器内实施。此第一核酸扩增工序和第二核酸扩增工序的实施方式不特别限定。特别是，本实施方式的方法，如多重PCR和单重PCR的组合，在BEAMing法(Diehl,et al.Nature Methods vol.3,No.7,July 2006,551-9)中的预扩增及乳液PCR、巢式PCR等一样，在进行2阶段的PCR时适宜。

本实施方式的核酸扩增方法包括以试样中所含的目标核酸作为模板而进行第一核酸扩增工序。在此第一核酸扩增工序中，使用选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶而生成不含尿嘧啶碱基的扩增产物。

试样只要是含目标核酸，就不特别限定，例如可举出来源于含人的动物或植物、微生物等的生物体试样、实验用的含有核酸的试样、此外如病毒、食品、生物学制剂、土壤、废水一样的可含有核酸的试样等。生物体试样不特别限定，例如可举出人的血液(全血)、血浆、血清、尿、便、痰、泪、唾液、清洗液、骨髓或其他体液等。试样也可为固体组织。试样也可根据需要，在分析前用适合的药剂处理。

试样也可为了后述的目标核酸的浓度的调整等而根据需要用水性介质稀释。作为这样的水性介质，例如可举出水、磷酸缓冲液、生理盐水等。

目标核酸只要是脱氧核糖核酸(DNA)，就不特别限定，例如可举出基因组DNA、cDNA、基因组DNA的PCR生成物、cDNA的PCR生成物或合成多核苷酸等。目标核酸可为人来源，也可来源于此外的真核生物、例如动物或植物、原核生物或病毒。

目标核酸的尺寸不特别限定。以试样中所含的目标核酸作为模板时，目标核酸优选为300bp以下，更优选为200bp以下，再优选为200bp以下并且30bp以上。

目标核酸的形态不特别限定，可为直链状或环状的核酸，也可为单链或双链的核酸。

用于第一核酸扩增的反应液优选包括含作为模板的目标核酸的试样，dATP、dTTP、dCTP及dGTP，选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶和第一及第二引物。

选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶优选为古细菌来源的DNA聚合酶，更优选为火球菌属(Pyrococcus)来源或子宝热球菌(Thermococcus kodakaraensis)来源的耐热性DNA聚合酶，再优选为Phusion Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶及/或KODplus neo。其中，“选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸”是指扩增不含尿嘧啶碱基的核酸而基本上不扩增含尿嘧啶碱基的核酸。“基本上不扩增不含尿嘧啶碱基的核酸”是指可在不对本实施方式的方法的实施造成不良影响的范围内扩增不含尿嘧啶碱基的核酸。

在用于第一核酸扩增的反应液中的，选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶的浓度优选为0.01～0.2个单位/1μl、更优选为0.02～0.1个单位/100μl。

在用于第一核酸扩增的反应液中的dATP、dTTP、dCTP及dGTP的浓度各自优选为0.1～0.4μM、更优选为0.2～0.25μM。反应液优选为基本上不存在dUTP，因遗留而有存在含尿嘧啶碱基的核酸的可能性的液状试样。其中，“基本上不存在dUTP”是指也可在不给本实施方式的方法的实施带来不良影响的范围内存在dUTP。对于用于第一核酸扩增的反应液“有存在含尿嘧啶碱基的核酸的可能性”是指，例如，有来源于其他试样的含尿嘧啶碱基的第二核酸扩增产物作为遗留核酸而含在反应液中的可能性。

本实施方式的方法不必然要求分解含尿嘧啶碱基的核酸的工序。分解含尿嘧啶碱基的核酸的工序，例如，如在专利文献1中记载，是由UDG的分解工序。

在第一核酸扩增中使用的第一及第二引物只要是与目标核酸的一部分的区域在严格的条件下杂交，且可在核酸扩增中使用的寡核苷酸，就不特别限定，本领域技术人员可考虑与在以下的第二核酸扩增工序中使用的第三及第四引物的关系而适宜设计。其中，严格的条件是指在引物和模板核酸之间有至少90％、优选为至少95％的序列相同性之时，该引物与模板核酸可特异性地杂交的条件。一般而言，严格的条件设定为比在规定的离子强度及pH的指定的碱基序列的热熔点(thermal melting point：Tm)低约5℃。此Tm是指(在规定的离子强度、pH及核酸组成之下)与模板核酸的碱基序列互补的引物的50％平衡而杂交的温度。在本说明书中，将第一引物杂交的目标核酸上的区域称为第一区域，将第二引物杂交的目标核酸上的区域称为第二区域。对于与第三及第四引物的关系，在以下的第二核酸扩增工序中后述。

第一及第二引物优选为5～50个碱基、更优选为10～40个碱基的长度。

在用于第一核酸扩增的反应液中的第一及第二引物的浓度优选为0.05～2μM、更优选为0.1～1μM。

第一及第二引物可由本领域技术人员公知的核酸合成方法制造。

为了使核酸扩增反应良好地进行，也可进一步添加缓冲剂及无机盐而调整用于第一核酸扩增的反应液的pH及离子强度。作为缓冲剂，例如可举出Tris-HCl等。另外，作为无机盐，可举出NaCl、KCl等。

用于第一核酸扩增的反应液，例如，可通过将含作为模板的目标核酸的试样，dATP、dTTP、dCTP及dGTP，第一及第二引物，选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶和根据需要水性介质、缓冲剂、无机盐混合而调制。混合由移液器吸吐操作等本领域技术人员公知的方法进行。

可为了第一核酸扩增而使用的扩增反应不特别限定，可使用本领域技术人员公知的扩增反应，特别优选使用聚合酶链式反应(PCR)。

第一核酸扩增进行优选为10～60个循环、更优选为15～50个循环。在第一核酸扩增工序之前，也可进行核酸扩增反应(以下，称为“预扩增”)，使用该模板而实施第一核酸扩增工序。此时，从预扩增的反应液分取在预扩增中产生的扩增产物，与聚合酶或dNTPs等的试剂类混合而调整反应液，可实施第一核酸扩增工序。在预扩增中使用的试剂类优选与在第一核酸扩增工序中使用的试剂类相同。当进行预扩增时，预扩增的循环数和第一核酸扩增的循环数的合计优选为10～60个循环、更优选为15～50个循环。

本实施方式的核酸扩增方法包括以在第一核酸扩增工序中生成的扩增产物作为模板而进行第二核酸扩增工序。在此第二核酸扩增工序中，使用含尿嘧啶碱基的引物及/或dUTP和能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶，生成含尿嘧啶碱基的扩增产物。

用于第二核酸扩增的反应液优选含在第一核酸扩增工序中生成的扩增产物、含尿嘧啶碱基的第三及第四引物、能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶、dUTP、dATP、dCTP及dGTP。

在第一核酸扩增工序中生成的扩增产物可直接使用由第一核酸扩增工序的扩增反应后的反应液，也可根据需要用水性介质稀释而使用。作为水性介质，例如可举出水、磷酸缓冲液、生理盐水等。在第一核酸扩增工序中生成的扩增产物在用于第二核酸扩增的反应液中，调整至成为优选为5～600fg/μl、更优选为20～240fg/μl的浓度。

能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶可从不含尿嘧啶碱基而含胸腺嘧啶碱基的模板合成有含尿嘧啶碱基的碱基序列的扩增产物。能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶可使用公知的酶。例如，可举出水生热球菌(Thermococcus aquaticus)来源的耐热性DNA聚合酶等。

在用于第二核酸扩增的反应液中的能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶的浓度优选为0.5U/μL～10U/μL、更优选为1U/μL～5U/μL。

dUTP、dATP、dCTP及dGTP的各浓度优选为0.1～0.4μM、更优选为0.2～0.25μM。用于第二核酸扩增的反应液也可含dTTP。dTTP浓度可考虑模板核酸中的胸腺嘧啶碱基数等而由本领域技术人员适合地选择。在1个实施方式中，dTTP的浓度将dTTP含量和dUTP含量的总和设为100％，优选为60％以下，更优选为50％以下。

在第二核酸扩增中使用的，含尿嘧啶碱基的第三及第四引物只要是与第一核酸扩增产物的一部分的区域在严格的条件下杂交，且可在核酸扩增中使用的寡核苷酸，就不特别限定，可考虑与上述的第一及第二引物的关系而由本领域技术人员适宜设计。通过使得用于第二核酸扩增的引物含尿嘧啶碱基而可在第二核酸扩增工序中得到含尿嘧啶碱基的扩增产物。在本说明书中，将第三引物杂交的区域称为第三区域，将第四引物杂交的区域称为第四区域。

第一～第四引物优选有以下的关系：(i)上述第一区域和上述第三区域的一部分或全部重复，并且，上述第二区域和上述第四区域的一部分或全部重复；或者(ii)向上述第一及第二引物附加的标签的一部分或全部各自与第三及第四区域重复。

上述的(ii)的关系是指第三及第四引物被以各自与附加到第一及第二引物的标签杂交的方式设计的情况。

第三及第四引物各自被设计为含优选为3个碱基以上、更优选为5个碱基以上的尿嘧啶碱基。

第三及第四引物优选为5～50个碱基、更优选为10～40个碱基的长度。

在用于第二核酸扩增的反应液中的第三及第四引物的浓度优选为4.0nM～24.4μM、更优选为20nM～12.2μM。

第三及第四引物可由本领域技术人员公知的核酸合成方法制造。

也可向用于第二核酸扩增的反应液进一步添加油。这样的含油的反应液在如例如乳液PCR一样的含水相和油的反应液中的第二核酸扩增中使用，此时，在第一核酸扩增工序中生成的扩增产物、含尿嘧啶碱基的第三及第四引物、能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶、dUTP、dATP、dCTP及dGTP、根据需要而含的水性介质、缓冲剂、盐形成水相。油只要是能在本实施方式的方法中使用，就不特别限定，例如可举出矿物油及非离子乳化剂(Schick,1966)、例如山梨坦单油酸酯(Span(商标)80，ICI)、乙氧基化辛基苯酚(Triton(商标)X-100)及聚氧乙烯山梨坦单油酸酯(Tween(商标)80，ICI)等。

水相和油的混合比(体积比)优选为相对于水相1而油1～10、更优选为相对于水相1而油2～8。

用于第二核酸扩增的反应液，例如，可通过将作为模板的在第一核酸扩增工序中生成的扩增产物、含尿嘧啶碱基的第三及第四引物、能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶、dUTP、dATP、dCTP及dGTP混合而调制。混合由移液器吸吐操作等本领域技术人员公知的方法进行。

可用于第二核酸扩增的扩增反应不特别限定，可使用本领域技术人员公知的扩增反应，特别优选使用聚合酶链式反应(PCR)、例如数字PCR(dPCR)。

第二核酸扩增进行优选为10～70个循环、更优选为20～60个循环。

在第一核酸扩增工序中的循环数和在第二核酸扩增工序中的循环数的合计优选为20～120个循环、更优选为35～100个循环。

在第二核酸扩增工序中得到的含尿嘧啶碱基的扩增产物的碱基序列期望是目标核酸的碱基序列中的全部胸腺嘧啶碱基被置换为尿嘧啶碱基的碱基序列，但只要是在第一核酸扩增工序中抑制扩增，就无全部被置换的必要。例如，在第二核酸扩增工序中得到的含尿嘧啶碱基的扩增产物的碱基序列含优选为5个碱基以上、更优选为10个碱基以上的尿嘧啶碱基。

在1个实施方式中，第二核酸扩增工序利用，例如，使用微平板的数字PCR。在此实施方式中，首先，以每1孔含1分子的在第一核酸扩增工序中生成的扩增产物的方式，在微平板的各孔中，调制用于上述的第二核酸扩增的反应液。进而，通过在上述的条件下进行第二核酸扩增而取得含尿嘧啶碱基的扩增产物。

在1个实施方式中，第二核酸扩增工序利用乳液PCR。在此实施方式中，第二核酸扩增工序，例如，通过使含作为模板核酸的第一核酸扩增工序的扩增产物的水相和油混合而得到混合物，在油相中制作含模板核酸、dATP、dUTP、dCTP、dGTP及能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶的水性液滴，扩增得到的液滴中的模板核酸而进行。

在乳液PCR中，首先，在第二核酸扩增工序中，将含作为模板核酸的第一核酸扩增工序的扩增产物，第三及第四引物、dATP、dUTP、dCTP、dGTP及能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶的水相和油混合而得到混合物。

反应系统的第三引物及第四引物的全部或一部分也可固定于珠上。珠有例如约0.1～10μm的直径。珠典型地是聚合物材料、例如聚苯乙烯制，但也可使用非聚合物材料、例如氧化硅，此外，也可含苯乙烯共聚物、甲基丙烯酸甲酯、官能化聚苯乙烯、玻璃、硅及羧酸盐。粒子也可为超顺磁性。这样的超顺磁性粒子容易在反应后纯化。

为了变更整体的表面特性、例如疏水性或亲水性，或为了使赋予结合特异性的分子结合，珠可通过与其他材料的共价或非共价相互作用而进行改变。这样的分子不限定，包括抗体、配体、特异性地结合的蛋白质对的成员、受体、核酸或化学活性基(例如醛或羧基)。特异性地结合的蛋白质对含亲和素-生物素、链霉亲和素-生物素及第VII因子-组织因子。

在一实施方式中，第三或第四引物由现有技术中知道的任意的手段与珠结合。第三或第四引物可共价或非共价地与珠结合。第三或第四引物也可经中间物，经例如蛋白质-蛋白质相互作用、例如抗体-抗原相互作用或生物素-亲和素相互作用而结合。也可使用在现有技术中已知的其他特异性地结合的对。为了达成最适的扩增，与珠结合的引物有在均质液相反应中比必要的长度长的情况。与珠结合的引物的长度没必要与在液相中从珠游离的引物的长度相同。

接下来，在油相中，制作含作为模板核酸的第一核酸扩增工序的扩增产物、第三及第四引物、dATP、dUTP、dCTP、dGTP及能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶的水性液滴。其中得到的水性液滴是所谓的油包水型乳液(water-in-oil emulsion)。油相中的水性液滴的制作方法不特别限定，例如，通过由移液器吸吐等振荡或搅拌水相及油相的混合物，或者使用微流路芯片而将水相吐出到油相中等而可在油相中制作水性液滴。在油相中制作水性液滴时，也可使用多孔板。

可将含低浓度的模板核酸及/或珠的水相和油相混合，以水性液滴中所含的模板核酸分子最大成为1分子、并且水性液滴中所含的珠的数最大成为1个的方式制作水性液滴。多数液滴也可为空的。也可使与珠结合的低浓度的引物及存在于水相中、且从珠游离的高浓度的引物含在反应液中。水性液滴是将它们假定为略球形，依赖于搅拌条件而有例如不足1μm～100μm量级、优选为0.5～50μm、更优选为1～10μm的直径。

水相和油相的混合物也可含乳化剂。通过加乳化剂，可使乳液稳定化。乳化剂不特别限定，可举出硅酮基的乳化剂、例如Bis-PEG/PPG-14/14二甲硅油、环五硅氧烷(ABIL(商标)EM 90)或ABIL(注册商标)WE09等。

水相在乳液中占优选为至少10％(v/v)以上、更优选为20％(v/v)以上、再优选为40％(v/v)以上。从而，油相在乳液中占优选为不足90％(v/v)、更优选为不足80％(v/v)、再优选为至少不足60％(v/v)。其中，乳化剂构成油相。乳化剂在油相中占优选为5％(v/v)以上、更优选为8％(v/v)以上、再优选为10％(v/v)。

水相和油相的混合物也可还含乳化助剂。乳化助剂可与乳化剂一同作用而使乳液中的水性隔区的形成及稳定化变得容易。乳化助剂不特别限定，例如可举出油酸聚甘油基-3或异硬脂酸聚甘油基-4等。

乳化助剂优选有不足10,000g/mol的分子量。

而后，在上述中定义的第二核酸扩增的条件下，扩增在上述中得到的液滴中的模板核酸。引物固定于珠时，由第二核酸扩增反应形成在珠上固定的扩增产物。

当在第二核酸扩增工序中实施使用珠的乳液PCR时，也可在扩增后，由本领域技术人员公知的方法“破坏”或崩解乳液。破坏乳液的方法例如是加清洗剂。清洗剂不限定于它们，含Triton X100、Laureth4及Nonidet(例如NP-40)。优选为，乳液破坏溶液不仅带来有效的相分离，还防止从乳液释放的珠的凝集。乳液破坏溶液还防止无法由移液器吸吐操作容易地除去的油相的形成。乳液破坏溶液也可含醇、例如2-丁醇及/或1-丙醇。由醇的添加，可将珠的凝集保持于最小限度，并且一边使移液器吸吐操作变得可能、一边大大增进乳液破坏。

乳液破坏溶液也可作为用于清洗珠及/或反应容器而进一步净化反应物的净化液使用。另外，净化液也可用于珠的清洗及/或核酸变性。净化液，例如，含2-丁醇及/或1-丙醇。

本实施方式的核酸扩增方法也可在第二核酸扩增工序之后，还包括检测第二核酸扩增工序的扩增产物的工序。在检测工序中，可使用一般作为核酸的扩增产物的检测而使用的方法。例如，使用嵌入剂(例如SYBR(注册商标)Green、溴化乙锭等)、含与扩增产物杂交的寡核苷酸和标记物质的标记探针等。标记探针，例如，可使用结合了荧光物质的探针、结合了荧光物质和使荧光消光的猝灭剂的探针(例如TaqMan(注册商标)探针)等。当检测试样中的基因突变时，在第二核酸扩增工序之后，通过使用与第二核酸扩增工序的变异型扩增产物特异性地杂交的标记寡核苷酸探针及与第二核酸扩增工序的野生型扩增产物特异性地杂交的标记寡核苷酸探针而检测变异型扩增产物而进行。

本实施方式的核酸扩增方法不以含尿嘧啶碱基的核酸的酶分解处理作为必要。当在乳液的调制或破坏时将试样剧烈搅拌的情况中，核酸分子被气溶胶化，有在空中飞散。此时，容易发生遗留，本实施方式的方法特别适宜。

在本发明的范围中，也包含在上述的方法中使用的核酸扩增用试剂。

核酸扩增用试剂的形态不特别限定，可为固体(例如，粉末、结晶、冷冻干燥品等)，也可为液体(例如，溶液、悬浮液、乳浊液等)。核酸扩增用试剂的构成要素优选各自保存在不同的容器中或个别地包装。核酸扩增用试剂也可具备用于检测的标记寡核苷酸探针，此时，标记寡核苷酸探针也可固定于固相。再者，对于选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶、能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶、dATP、dTTP、dUTP、dCTP及dGTP、标记寡核苷酸探针、固相的细节与上述的核酸扩增方法的说明中所述的同样。

在第1实施方式中，也可将收容上述的各种试剂的容器用箱捆包而提供于使用者。在此箱中，也可同装核酸扩增用试剂的附带文书。在此附带文书中，优选记载了例如，核酸扩增用试剂的构成、核酸扩增流程等。在图1A中显示本实施方式的核酸扩增用试剂的外观的一例。图中，110表示核酸扩增用试剂，111表示收容选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶的第1容器，112表示收容dATP、dTTP、dCTP及dGTP的第2容器，113表示附带文书，114表示捆包箱。

在图1B中显示第2实施方式的核酸扩增用试剂的外观的一例。图中，210表示核酸扩增用试剂，211表示收容能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶的第1容器，212表示收容dATP、dUTP、dCTP及dGTP的第2容器，213表示附带文书，214表示捆包箱。

在图1C中显示第3实施方式的核酸扩增用试剂的外观的一例。图中，310表示核酸扩增用试剂，311表示收容选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶的第1容器，312表示收容dATP、dTTP、dCTP及dGTP的第2容器，313表示收容能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶的第3容器，314表示收容dATP、dUTP、dCTP及dGTP的第4容器，315表示附带文书，316表示捆包箱。

以下，将本发明由实施例详细地说明，但本发明不限于这些实施例。

【实施例】

【实施例1：含尿嘧啶碱基的DNA片段的调制】

(1)PCR反应液的调制

调制有以下的组成的PCR反应液：12.5μl 10×PCR缓冲液,12.5μl100mM MgCl₂,2,5μl,1μl的引物1及2(10μM)、0.5μl模板(7pg/μl)、89.5μl蒸馏水、2.5μl dNTP(各自10mM：dUTP、dGTP、dATP、dCTP)、2.5μl Taq DNA聚合酶(Peqlab：cat01-1020)。模板是500拷贝的变异DNA。模板的一方的链的碱基序列以SEQ ID NO:1表示，与SEQ ID NO:1的链一同形成双链(含有dUTP的KRAS DNA片段)的另一方的链以SEQ ID NO:2表示。引物1及2以SEQ ID NO:3及4表示。

(2)PCR循环

PCR反应用以下的循环数进行：将94℃2分钟、94℃10秒钟→68℃1分钟→70℃10秒钟实施3次，将94℃10秒钟→59℃1分钟→70℃10秒钟实施40次、70℃2分钟→于4℃放置。

(3)BEAMing

预PCR反应的基本的方法如在Nature Methods Vol.3 No.7 July 2006的“Thermal cycle”中记载的一样进行。

乳液PCR如在Nature Methods Vol.3 No.7 July 2006中记载的一样进行。

乳液破坏、杂交工序方法参照特表2011-529691号的段落[0079]及[0080]。

流式细胞术分析使用特表2011-529691号的段落[0081]中记载的流式细胞术系统进行。

更具体地，这些实验如以下的(4)～(8)所述进行。

(4)预PCR

调制变异率是0、0.1、1％的野生型KRAS DNA样品(SEQ ID NO:5：向水混合KRASDNA等)和对于同样品以相当于1％加含有dUTP的KRAS DNA片段(由SEQ ID NO:1的链及SEQID NO:2的链构成的双链DNA)的DNA样品，在实验中使用。

预PCR在50μl的PCR反应液(含约1×10⁶分子的模板核酸)中实施。各反应由5×Phusin高保真度缓冲液、0.8μl的Phusion Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶或Phusion U(均来自NEB)、0.2μM的引物1、0.2μM的引物2、各自0.25mM的dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、及0.5mM MgCl₂构成。

将PCR产物使用Pcogreen ds测定试剂盒(Invitrogen公司)进行定量。荧光强度用荧光板读取器(Safire2TECAN)、使用DNA参照标准进行定量。

【表1】预PCR热循环

温度、时间	循环数
		98℃1分钟	-
98℃10秒钟→70℃10秒钟→72℃10秒钟	3
		98℃10秒钟→67℃10秒钟→72℃10秒钟	3
98℃10秒钟→64℃10秒钟→72℃10秒钟	3
		98℃10秒钟→61℃10秒钟→72℃10秒钟	31
72℃15秒钟	-

(5)乳液PCR

以预PCR工序的扩增产物作为模板，使用油和乳液PCRMaster Mix而形成乳液，用热循环仪实施乳液PCR。将预PCR工序的扩增产物稀释至18pg左右，调制含有4.0单位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen公司)、1×PCR缓冲液(NEB)、各自0.2mM的dNTPs(dATP、dUTP、dGTP、dCTP)、5mM的MgCl₂、0.05μM的标签1(乳液PCR用引物，SEQ ID NO:6)、8μM的标签2(乳液PCR用引物，SEQ ID NO:7)及包被标签1的500～800万个左右的磁性珠(Myone,Invitrogen公司)的150μL的PCRMaster Mix。向96深孔板加150μL的PCRMaster Mix和600μL的油/乳化剂混合物(7％的ABIL WE09、20％的矿油、73％的Tegosoft DEC(DegussaGoldschmidt Chemical公司、Virginia州Hopewell(Hopewell,VA))。乳液通过将此板在TissueLyser(Qiagen公司)内以15Hz搅拌10秒钟、接下来以17Hz搅拌7秒钟而进行调制。将乳液分注到别的96孔深孔板上，在下述的条件下运行于热循环仪。

【表2】

温度、时间	循环数
		94℃2分钟	1
98℃15秒钟→64℃45秒钟→72℃75秒钟	3
		98℃15秒钟→61℃45秒钟→72℃75秒钟	3
98℃10秒钟→58℃45秒钟→72℃75秒钟	3
		94℃10秒钟→57℃45秒钟→72℃75秒钟	50

(6)乳液破坏

将150μL的乳液破坏缓冲液(10mM的Tris-HCl(pH7.5)、1％的Triton-X 100、1％的SDS、100mM的NaCl、1mM的EDTA)添加到各孔中，将TissueLyser以20Hz混合20秒钟。珠通过将悬浮液以3,200g旋转2分钟，除去油相而进行回收。乳液破坏工序重复2次。将来自8个孔的全珠回收－统合，用150μL的清洗缓冲液(20mM的Tris-HCl(pH8.4)、50mM的KCl)进行清洗。珠上的扩增产物使用0.1M的NaOH水溶液变性5分钟。最终将珠用150μL的清洗缓冲液进行清洗、再分散于150μL的清洗缓冲液中。

(7)杂交

设计对于变异型及野生型DNA序列互补的荧光标记探针。探针的尺寸是依赖于目标区域的GC含量而15bp～18bp左右。变异探针在5'侧末端上使用Cy5(商标)荧光体而合成，野生型探针与Cy3(商标)荧光体结合(Integrated DNA Technologies公司)。再者，在与扩增产物内的上述探针识别位置不同的场所，作为阳性对照，为了标记而使用延伸的扩增产物(通用)。此扩增产物特异性探针使用附着于它们的5'侧末端的ROX(商标)荧光体而进行合成。探针序列在下述中记载。与各区域的特异性杂交反应液含有存在于30μL的清洗缓冲液(参照乳液破坏)中的珠、在66μL的1.5×杂交缓冲液(4.5M的氯化四甲基铵、75mM的Tris-HCl(pH7.5)、6mM的EDTA)、及4μL的TE缓冲液中调制为5μM的变异型、野生型、及通用探针的混合液。杂交混合液在70℃加热10秒钟，缓慢(0.1℃/秒)冷却至35℃。于35℃温育2分钟之后，将此混合液冷却至室温(0.1℃/秒)。珠使用磁铁而进行集磁，含有未结合探针的上清使用移液器除去。珠再悬浮到100μL的1×杂交缓冲液中，在48℃加热5分钟而除去未结合探针。加热工序后，珠再由磁铁集磁，使用100μL的清洗缓冲液清洗1次。在最终工序，除去上清，为了流式细胞术分析而将珠再悬浮到200μL的TE缓冲液中。

(8)流式细胞术分析

将装备高通量AUT采样机的流式细胞术系统(BD Bioscience公司)用于称为变异型、野生型的珠分析。不含延伸产物的珠从分析除外。流式细胞术的解析使用FCS express4(De Novo software)。

(9)探针序列

使用在JP2011-529691A的图10B的“KRAS G38A”中记载的序列。

【结果】

为了确认样品含拟似的遗留核酸，在与Phusion Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶近似的系统中并行在预PCR中使用可以dUTP作为底物的PCR酶(Phusion U)的BEAMing而实施。当在预PCR中使用Phusion U时，成为在全部的条件下变异率超1％的异常的变异率。因此，可确认到在本次性能确认中使用的样品含有适合的遗留核酸(图2A)。

一方，当在预PCR中使用Phusion Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶时，不因遗留的有无，在0％的变异率的样品中成为0.01％以下，在0.1％的变异率的样品中成为0.1％前后的变异率(图2B)。因此，当在预PCR中使用Phusion Hot Start High-FidelityDNA聚合酶时，即使不添加含有尿嘧啶的核酸分解酶，也可确认到可排除乳液PCR的扩增产物来源的含有尿嘧啶的DNA的混入的影响。

【实施例2】

与实施例1相同地，使用调制为变异率成为0％、1％的KRAS DNA样品、或者向同样品添加含有尿嘧啶的DNA的样品而实施BEAMing。

含有dUTP的DNA由与实施例相同的方法调制。预PCR在50μl的PCR反应液中实施。各反应液的组成如下所述：Phusion U：5×Phusin高保真度缓冲液、0.8μl的Phusion U(均为NEB)、0.2μM的引物1、0.2μM的引物2、0.25mM的各dNTP、及0.5mM MgCl₂；KOD Plus neo：10×buffer、0.8μl的KOD Plus neo、0.2μM的引物1、0.2μM的引物2、0.2mM各dNTP、1.5mM MgSO₄。

PCR条件与实施例1同样。乳液PCR～流式细胞术解析的条件也与实施例1同样。

结果，与实施例1的结果同样，当在预PCR中使用Phusion U时，成为在全部的条件下变异率超1％的异常的变异率，遗留核酸被扩增(图3A)。与此相比，当使用KOD Plus neo时，与在实施例1中使用Phusion Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶的情况同样地，不因遗留的有无，在0％的变异率的样品中成为0.01％以下，在0.1％的变异率的样品中成为0.1％前后的变异率，确认不到遗留核酸的扩增(图3B)。因此，在预PCR中使用KOD plus neo时，即使不添加含有尿嘧啶的核酸分解酶，也可确认到可排除emPCR的扩增产物来源的含有尿嘧啶的DNA的混入的影响。

【实施例3：拟似的遗留的影响的评价】

根据实施例1中记载的方法而将由使用各种浓度的dUTP/dTTP混液的乳液PCR得到的PCR产物用gTE(TE(pH8)中20μg/ml的糖原)稀释为100万分的1。将此PCR产物推定为拟似的遗留，使用上述的稀释物，根据实施例1中记载的方法而进行预PCR。对扩增产物实施凝胶电泳而取得电泳照片，由使用ImageJ的光密度测定法将扩增效率数值化。结果示于以下的表3。

【表3】

	平均-空白
		T100％	41.9
T75％	41.6
		T50％	30.7
T25％	19.2
		T0％	9.7

在上述的表3中，例如“T75％”表示使用采用dTTP:dUTP＝75:25的dUTP/dTTP混液而进行的乳液PCR产物时的结果。表3中，“平均”表示对象区的平均辉度，“空白”表示背景的辉度。如表3所示，扩增效率从相当于dTTP:dUTP＝50:50缓慢地降低。从此数据得知，如果dUTP的浓度变得比dTTP:dUTP＝60:40高，则变得几乎100％的PCR产物含数个尿嘧啶碱基。

【符号的说明】

110、210、310：核酸扩增用试剂

111、211、311：第1容器

112、212、312：第2容器

113、213、315：附带文书

114、214、316：捆包箱

313：第3容器

314：第4容器

序列表

<110> SYSMEX CORPORATION

<120> 核酸扩增方法

<130> 16-041CN

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 134

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 含U的模版链

<400> 1

gctggagctc tgcagctatg actgaatata aacttgtggt agttggagcu ggugacguag 60

gcaagagugc cuugacgaua cagcuaauuc agaaucauuu uguggacgaa uauggucgua 120

uuaauuucgc ggga 134

<210> 2

<211> 134

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 另一含U的模版链

<400> 2

tcccgcgaaa ttaatacgac catattcgtc cacaaaatga ttcugaauua gcugutucgu 60

caaggcacuc uugccuacgu caccagcucc aacuaccaca aguuuauauu cagucauagc 120

ugcagagcuc cagc 134

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预PCR用引物

<400> 3

gctggagctc tgcagctatg actgaatata aacttgtggt agttg 45

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预PCR用引物

<400> 4

tcccgcgaaa ttaatacgac catattcgtc cacaaaatga ttc 43

<210> 5

<211> 134

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含U的模版

<400> 5

gctggagctc tgcagctatg actgaatata aacttgtggt agttggagct ggtggcgtag 60

gcaagagtgc cttgacgata cagctaattc agaatcattt tgtggacgaa tatggtcgta 120

ttaatttcgc ggga 134

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 乳液PCR用引物

<400> 6

tcccgcgaaa ttaatacgac 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 乳液PCR用引物

<400> 7

gctggagctc tgcagcta 18

Claims

1.核酸扩增方法，其包括：

以试样中所含的目标核酸作为模板而进行第一核酸扩增工序，及

以在上述第一核酸扩增工序中生成的扩增产物作为模板而进行第二核酸扩增工序，

其特征在于，

在第一核酸扩增工序中，使用选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶而生成不含尿嘧啶碱基的扩增产物，

在第二核酸扩增工序中，使用含尿嘧啶碱基的引物及/或dUTP和能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶而生成含尿嘧啶碱基的扩增产物。

2.权利要求1所述的方法，其中在上述第一核酸扩增工序中，

将上述试样，dATP、dTTP、dCTP及dGTP，选择性地扩增不含上述尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶混合而调制反应液，

上述反应液是基本上不存在dUTP、有存在含尿嘧啶碱基的核酸的可能性的液状试样。

3.权利要求1所述的方法，其中不包括分解含尿嘧啶碱基的核酸的工序。

4.权利要求1所述的方法，其中在上述第二核酸扩增工序中，在dATP、dUTP、dCTP及dGTP的存在下进行核酸扩增。

5.权利要求1所述的方法，其中在上述第二核酸扩增工序中，

使含作为模板核酸的第一核酸扩增工序的扩增产物的水相和油混合，

在油相中，制作含模板核酸、dATP、dUTP、dCTP、dGTP及能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶的水性液滴，

扩增上述液滴中的模板核酸。

6.权利要求1所述的方法，其中在上述第二核酸扩增工序之后，还包括检测上述第二核酸扩增工序的扩增产物的工序。

7.权利要求1所述的方法，其中在上述检测工序中，使用嵌入剂或与上述第二核酸扩增工序的扩增产物特异性地结合的标记探针而进行扩增产物的检测。

8.权利要求1所述的方法，其中选择性地扩增上述不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶是古细菌来源的DNA聚合酶。

9.权利要求1所述的方法，其中选择性地扩增上述不含尿嘧啶的核酸的DNA聚合酶是火球菌属(Pyrococcus)来源或子宝热球菌(Thermococcus kodakaraensis)来源的耐热性DNA聚合酶。

10.权利要求1所述的方法，其中上述能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶是水生热球菌(Thermococcus aquaticus)来源的耐热性DNA聚合酶。

11.权利要求1所述的方法，其中选择性地扩增上述不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶是Phusion Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶及/或KOD plus neo。

12.权利要求1所述的方法，其中

在上述第一核酸扩增工序中，使用

与上述目标核酸的第一区域结合的第一引物、和

与上述目标核酸的第二区域的互补链结合的第二引物，

在上述第二核酸扩增工序中，使用

与上述目标核酸的第三区域结合的第三引物、和

与上述目标核酸的第四区域的互补链结合的第四引物，

上述第三引物及/或上述第四引物含尿嘧啶碱基，

(i)上述第一区域和上述第三区域的一部分或全部重复，并且，上述第二区域和上述第四区域的一部分或全部重复，或者

(ii)向上述第一及第二引物附加的标签的一部分或全部各自与第三及第四区域重复。

13.权利要求1～12之任一项所述的方法，其特征在于，

上述第一核酸扩增进行15～50个循环，

上述第二核酸扩增进行20～60个循环。

14.在权利要求1所述的方法中使用的核酸扩增用试剂，其含：选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶、dATP、dTTP、dCTP及dGTP。

15.在权利要求1所述的方法中使用的核酸扩增用试剂，其含：能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶、dATP、dUTP、dCTP及dGTP。

16.在权利要求1所述的方法中使用的核酸扩增用试剂，其含：

第1容器，其含选择性地扩增不含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶、

第2容器，其含dATP、dTTP、dCTP及dGTP、

第3容器，其含能扩增含尿嘧啶碱基的核酸的DNA聚合酶、及

第4容器，其含dATP、dUTP、dCTP及dGTP。

17.变异检测方法，其包括：

以试样中所含的目标核酸作为模板而进行第一核酸扩增工序，

以在上述第一核酸扩增工序中生成的扩增产物作为模板而进行第二核酸扩增工序，及

在上述第二核酸扩增工序之后，使用经标记物质标记的下列探针来检测上述变异型扩增产物的工序：

与有期望的变异的上述第二核酸扩增工序的变异型扩增产物特异性地杂交的探针、及

与上述第二核酸扩增工序的野生型扩增产物特异性地杂交的探针，

其特征在于，