JP2018138011A - 核酸増幅方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】より簡便にキャリーオーバーによる擬陽性を抑制できる核酸増幅方法を提供することを課題とする。【解決手段】試料に含まれる標的核酸を鋳型として第一の核酸増幅を行う工程と、前記第一核酸増幅工程で生成された増幅産物を鋳型として第二の核酸増幅を行う工程とを含み、第一核酸増幅工程において、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼを用い、ウラシル塩基を含まない増幅産物を生成し、第二核酸増幅工程において、ウラシル塩基を含むプライマーおよび/またはdUTPと、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼとを用い、ウラシル塩基を含む増幅産物を生成することを特徴とする、核酸増幅方法によって上記の課題を解決する。【選択図】なし

Description

本発明は、核酸増幅方法に関する。
核酸増幅装置は繰り返し用いられるため、核酸増幅後の増幅産物が次の核酸増幅の反応液に混入することにより、擬陽性が生じ得るという問題がある。これは一般的にキャリーオーバーと呼ばれ、これを抑制する技術として特許文献１に記載の方法が知られている。
特許文献１には、核酸の増幅工程でウラシル塩基を含む増幅産物を生成し、次の核酸増幅を行う前に、ウラシル塩基を含む核酸を分解する酵素で処理し、前の核酸増幅のウラシル塩基を含む増幅産物を分解する工程を設ける方法が記載されている。DNAを鋳型とする場合は、この方法によると、キャリーオーバーによって混入したウラシル塩基を含む核酸が分解され、鋳型核酸が増幅されることとなる。
米国特許第７６８７２４７号明細書
しかしながら、キャリーオーバーによって他の試料に混入した核酸が増幅されることによる検査精度の低下を、より簡便に防止する方法が求められていた。そこで、本発明は、より簡便にキャリーオーバーによる擬陽性を抑制できる核酸増幅方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、第一の核酸増幅においてウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼを用い、第二の核酸増幅においてウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼを用いる核酸増幅によって、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明によれば、試料に含まれる標的核酸を鋳型として第一の核酸増幅を行う工程と、前記第一核酸増幅工程で生成された増幅産物を鋳型として第二の核酸増幅を行う工程とを含み、第一核酸増幅工程において、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼを用い、ウラシル塩基を含まない増幅産物を生成し、第二核酸増幅工程において、ウラシル塩基を含むプライマーおよび/またはdUTPと、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼとを用い、ウラシル塩基を含む増幅産物を生成することを特徴とする、核酸増幅方法が提供される。
また、本発明によれば、上記の方法に用いられる核酸増幅用試薬であって、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼ、dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPを含む核酸増幅用試薬が提供される。
また、本発明によれば、上記の方法に用いられる核酸増幅用試薬であって、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼ、dATP、dUTP、dCTPおよびdGTPを含む核酸増幅用試薬が提供される。
さらに、本発明によれば、試料に含まれる標的核酸を鋳型として第一の核酸増幅を行う工程と、前記第一核酸増幅工程で生成された増幅産物を鋳型として第二の核酸増幅を行う工程と、前記第二核酸増幅工程の後、標識物質で標識された、所望の変異を有する前記第二核酸増幅工程の変異型増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブ及び前記第二核酸増幅工程の野生型増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて、前記変異型増幅産物を検出する工程とを含み、第一核酸増幅工程において、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼを用い、ウラシル塩基を含まない増幅産物を生成し、第二核酸増幅工程において、ウラシル塩基を含むプライマーおよび/またはdUTPと、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼとを用い、ウラシル塩基を含む増幅産物を生成することを特徴とする、変異検出方法が提供される。
本発明によれば、簡便にキャリーオーバーによる擬陽性を抑制することができる核酸増幅方法を提供することができる。
本実施形態の試薬の外観の一例を表す図である。 本実施形態の試薬の外観の一例を表す図である。 本実施形態の試薬の外観の一例を表す図である。 第一核酸増幅においてPhusion Uを用いた場合の変異率測定の結果を示すグラフである。 第一核酸増幅においてPhusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymeraseを用いた場合の変異率測定の結果を示すグラフである。 第一核酸増幅においてPhusion Uを用いた場合の変異率測定の結果を示すグラフである。 第一核酸増幅においてKOD plus neoを用いた場合の変異率測定の結果を示すグラフである。
本実施形態では、キャリーオーバー核酸に比べて大過剰の標的核酸増幅産物(第一の核酸増幅産物)を取得し、これを鋳型として第二の核酸増幅を行うことによって、キャリーオーバーの影響が抑えられた核酸増幅方法が提供される。本実施形態では「第一の核酸増幅工程」および「第二の核酸増幅工程」の少なくとも2度の核酸増幅工程が実施される。第二の核酸増幅工程においては、1度目の核酸増幅工程の増幅産物を含む反応液の一部又は全部に、新たに増幅試薬（ポリメラーゼやdNTPs）を添加し、核酸増幅反応を行う。通常、第二の核酸増幅工程は第一の核酸増幅工程で使用された容器とは異なる容器内で実施される。この第一核酸増幅工程と第二核酸増幅工程の態様は特に限定されない。特に、本実施形態の方法は、マルチプレックスPCRとシングルプレックスPCRの組み合わせ、BEAMing法（Diehl, et al. Nature Methods vol.3, No.7, July 2006, 551-9）におけるpre-amplificationおよびemulsion PCR、nested PCRなどのように、2段階のPCRを行う場合に好適である。
本実施形態の核酸増幅方法は、試料に含まれる標的核酸を鋳型として第一の核酸増幅を行う工程を含む。この第一の核酸増幅工程では、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼを用いて、ウラシル塩基を含まない増幅産物を生成する。
試料は、標的核酸を含むものであれば特に限定されず、例えばヒトを含む動物や植物、微生物などに由来する生体試料、実験用の核酸含有試料、その他ウイルス、食品、生物学的製剤、土壌、排水のような核酸を含有し得る試料などが挙げられる。生体試料は特に限定されず、例えばヒトの血液(全血)、血漿、血清、尿、便、痰、涙、唾液、洗浄液、骨髄又はその他の体液などが挙げられる。試料は固形組織であってもよい。試料は、必要に応じて、分析前に適切な薬剤で処理されていてもよい。
試料は、後述する標的核酸の濃度の調整などのために、必要に応じて水性媒体で希釈してもよい。このような水性媒体としては、例えば水、リン酸緩衝液、生理食塩水などが挙げられる。
標的核酸は、デオキシリボ核酸(DNA)であれば特に限定されず、例えばゲノムDNA、cDNA、ゲノムDNAのPCR生成物、cDNAのPCR生成物又は合成ポリヌクレオチドなどが挙げられる。標的核酸は、ヒト由来であってもよいし、その他の真核生物、例えば動物又は植物、原核生物又はウイルスに由来していてもよい。
標的核酸のサイズは特に限定されない。試料に含まれる標的核酸を鋳型とする場合、標的核酸は、好ましくは300bp以下、より好ましくは200bp以下、さらに好ましくは200bp以下かつ30bp以上である。
標的核酸の形態は特に限定されず、直鎖状または環状の核酸であってもよいし、１本鎖又は２本鎖の核酸であってもよい。
第一の核酸増幅のための反応液は、好ましくは、鋳型としての標的核酸を含む試料と、dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPと、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼと、第一及び第二プライマーとを含む。
ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼは、好ましくは古細菌由来のDNAポリメラーゼであり、より好ましくはピロコッカス属(Pyrococcus)由来もしくはサーモコッカス・コダカラエンシス(Thermococcus kodakaraensis)由来の耐熱性DNAポリメラーゼであり、さらに好ましくはPhusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymeraseおよび／またはKOD plus neoである。ここで、「ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅する」とは、ウラシル塩基を含まない核酸を増幅する一方で、ウラシル塩基を含まない核酸を実質的に増幅しないことをいう。「ウラシル塩基を含まない核酸を実質的に増幅しない」とは、本実施形態の方法の実施に悪影響を及ぼさない範囲で、ウラシル塩基を含まない核酸が増幅され得ることをいう。
第一の核酸増幅のための反応液中における、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼの濃度は、好ましくは0.01〜0.2ユニット/1μl、より好ましくは0.02〜0.1ユニット/100μlである。
第一の核酸増幅のための反応液中におけるdATP、dTTP、dCTPおよびdGTPの濃度は、それぞれ、好ましくは0.1〜0.4μM、より好ましくは0.2〜0.25μMである。反応液は、好ましくはdUTPが実質的に存在せず、キャリーオーバーによってウラシル塩基を含む核酸が存在する可能性がある液状試料である。ここで、「dUTPが実質的に存在しない」とは、本実施形態の方法の実施に悪影響を及ぼさない範囲で、dUTPが存在していてもよいことを意味する。第一の核酸増幅のための反応液について「ウラシル塩基を含む核酸が存在する可能性がある」とは、例えば、他の試料に由来するウラシル塩基を含む第二核酸増幅産物がキャリーオーバー核酸として反応液中に含まれる可能性があることを意味する。
本実施形態の方法は、ウラシル塩基を含む核酸を分解する工程を必ずしも要しない。ウラシル塩基を含む核酸を分解する工程は、例えば、特許文献１に記載されるような、UDGによる分解工程である。
第一の核酸増幅において用いられる第一及び第二プライマーは、標的核酸の一部の領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、核酸増幅において用い得るオリゴヌクレオチドであれば特に限定されず、以下の第二核酸増幅工程において用いる第三及び第四プライマーとの関係を考慮して、当業者が適宜設計することができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、プライマーと鋳型核酸との間に少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性があるときに、該プライマーが鋳型核酸に特異的にハイブリダイズできる条件である。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びpHでの所定の塩基配列の熱的融点(thermal melting point：Tm)より約５℃低くなるように設定される。このTmとは、（規定されたイオン強度、pH及び核酸組成の下で）鋳型核酸の塩基配列に相補的なプライマーの５０％が平衡してハイブリダイズする温度である。本明細書では、第一プライマーがハイブリダイズする標的核酸上の領域を第一領域といい、第二プライマーがハイブリダイズする標的核酸上の領域を第二領域という。第三及び第四プライマーとの関係については、以下の第二核酸増幅工程において後述する。
第一及び第二プライマーは、好ましくは５〜５０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基の長さである。
第一の核酸増幅のための反応液中における第一及び第二プライマーの濃度は、好ましくは0.05〜2μM、より好ましくは0.1〜1μMである。
第一及び第二プライマーは、当業者に公知の核酸合成方法により製造することができる。
核酸増幅反応を良好に進行させるために、緩衝剤及び無機塩をさらに添加して、第一の核酸増幅のための反応液のpH及びイオン強度を調整してもよい。緩衝剤としては、例えばTris-HClなどが挙げられる。また、無機塩としては、NaCl、KClなどが挙げられる。
第一の核酸増幅のための反応液は、例えば、鋳型としての標的核酸を含む試料と、dATP、dTTP、dCTP及びdGTPと、第一及び第二プライマーと、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼと、必要に応じて水性媒体、緩衝剤、無機塩とを混合することによって調製することができる。混合は、ピペット操作など当業者に公知の方法により行われる。
第一の核酸増幅のために用い得る増幅反応は特に限定されず、当業者に公知の増幅反応を用いることができるが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いることが特に好ましい。
第一の核酸増幅は、好ましくは１０〜６０サイクル、より好ましくは１５〜５０サイクル行われる。第一核酸増幅工程の前に、核酸増幅反応（以下、「予備的増幅」という）を行い、その鋳型を用いて第一の核酸増幅工程を実施してもよい。この場合、予備的増幅で産生された増幅産物を予備的増幅の反応液から分取し、ポリメラーゼやdNTPsなどの試薬類と混合して反応液を調整し、第一の核酸増幅工程を実施することができる。予備的増幅において使用される試薬類は、第一の核酸増幅工程で使用される試薬類と同じであることが好ましい。予備的増幅を行う場合は、予備的増幅のサイクル数と、第一の核酸増幅のサイクル数の合計が、１０〜６０サイクル、より好ましくは１５〜５０サイクルであることがこのましい。
本実施形態の核酸増幅方法は、第一核酸増幅工程で生成された増幅産物を鋳型として第二の核酸増幅を行う工程を含む。この第二の核酸増幅工程では、ウラシル塩基を含むプライマーおよび/またはdUTPと、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼとを用い、ウラシル塩基を含む増幅産物を生成する。
第二の核酸増幅のための反応液は、好ましくは、第一核酸増幅工程で生成された増幅産物、ウラシル塩基を含む第三及び第四プライマー、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼ、dUTP、dATP、dCTPおよびdGTPを含む。
第一核酸増幅工程で生成された増幅産物は、第一核酸増幅工程による増幅反応後の反応液をそのまま用いてもよいし、必要に応じて水性媒体で希釈して用いてもよい。水性媒体としては、例えば水、リン酸緩衝液、生理食塩水などが挙げられる。第一核酸増幅工程で生成された増幅産物は、第二の核酸増幅のための反応液中において、好ましくは5〜600fg/μl、より好ましくは20〜240fg/μlの濃度となるように調整する。
ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼは、ウラシル塩基を含まずチミン塩基を含む鋳型から、ウラシル塩基を含む塩基配列を有する増幅産物を合成することができる。ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼは、公知の酵素を用いることができる。たとえば、サーモコッカス・アクアティクス(Thermococcus aquaticus)由来の耐熱性DNAポリメラーゼなどが挙げられる。
第二の核酸増幅のための反応液中における、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼの濃度は、好ましくは0.5U/μLから10U/μL、より好ましくは1U/μLから5U/μLである。
dUTP、dATP、dCTPおよびdGTPの各濃度は、好ましくは0.1〜0.4μM、より好ましくは0.2〜0.25μMである。第二の核酸増幅のための反応液は、dTTPを含んでいてもよい。dTTP濃度は、鋳型核酸中のチミン塩基数などを考慮して、当業者が適切に選択できる。１つの実施形態では、dTTPの濃度は、dTTP含有量とdUTP含有量との総和を１００％として、好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下である。
第二の核酸増幅において用いる、ウラシル塩基を含む第三及び第四プライマーは、第一核酸増幅産物の一部の領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、核酸増幅において用い得るオリゴヌクレオチドであれば特に限定されず、上記の第一及び第二プライマーとの関係を考慮して、当業者が適宜設計することができる。第二の核酸増幅のためのプライマーにウラシル塩基を含ませることによって、第二核酸増幅工程においてウラシル塩基を含む増幅産物を得ることができる。本明細書では、第三プライマーがハイブリダイズする領域を第三領域といい、第四プライマーがハイブリダイズする領域を第四領域という。
第一から第四プライマーは、以下の関係を有することが好ましい：
(i) 前記第一領域と前記第三領域の一部又は全部が重複し、かつ、前記第二領域と前記第四領域の一部又は全部が重複する；又は
(ii) 前記第一及び第二プライマーに付加されたタグの一部又は全部が、それぞれ第三及び第四領域と重複する。
上記の(ii)の関係は、第三及び第四プライマーがそれぞれ第一及び第二プライマーに付加されたタグにハイブリダイズするように設計される場合を意図する。
第三及び第四プライマーは、それぞれ、好ましくは3塩基以上、より好ましくは5塩基以上のウラシル塩基を含むように設計される。
第三及び第四プライマーは、好ましくは５〜５０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基の長さである。
第二の核酸増幅のための反応液中における第三及び第四プライマーの濃度は、好ましくは好ましくは4.0nMから24.4μM、より好ましくは20nMから12.2μMである。
第三及び第四プライマーは、当業者に公知の核酸合成方法により製造することができる。
核酸増幅反応を良好に進行させるために、緩衝剤及び無機塩をさらに添加して、第一の核酸増幅のための反応液のpH及びイオン強度を調整してもよい。緩衝剤としては、例えばTris-HClなどが挙げられる。また、無機塩としては、NaCl、KClなどが挙げられる。
第二の核酸増幅のための反応液にさらに油を添加してもよい。このような油を含む反応液は、例えばエマルジョンPCRのような水性相と油とを含む反応液中での第二の核酸増幅において用いられ、この場合、第一核酸増幅工程で生成された増幅産物、ウラシル塩基を含む第三及び第四プライマー、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼ、dUTP、dATP、dCTPおよびdGTP、必要に応じて含まれる水性媒体、緩衝剤、塩は、水性相を形成する。油は、本実施形態の方法に使用可能なものであれば特に限定されず、例えばミネラルオイル及び非イオン乳化剤(Schick, 1966)、例えばソルビタンモノオレエート(Span(商標)80; ICI)、オクチルフェノールエトキシレート(Triton(商標) X-100)及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween(商標)80; ICI)などが挙げられる。
水性相と油との混合比(体積比)は、好ましくは、水性相１に対して油１〜１０、より好ましくは水性相１に対して油２〜８である。
第二の核酸増幅のための反応液は、例えば、鋳型としての第一核酸増幅工程で生成された増幅産物、ウラシル塩基を含む第三及び第四プライマー、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼ、dUTP、dATP、dCTPおよびdGTPを混合することによって調製することができる。混合は、ピペット操作など当業者に公知の方法により行われる。
第二の核酸増幅のために用い得る増幅反応は特に限定されず、当業者に公知の増幅反応を用いることができるが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、例えばデジタルPCR(dPCR)を用いることが特に好ましい。
第二の核酸増幅は、好ましくは１０〜７０サイクル、より好ましくは２０〜６０サイクル行われる。
第一の核酸増幅工程におけるサイクル数と、第二の核酸増幅工程におけるサイクル数との合計は、好ましくは２０〜１２０サイクル、より好ましくは３５〜１００サイクルである。
第二の核酸増幅工程で得られるウラシル塩基を含む増幅産物の塩基配列は、標的核酸の塩基配列中の全てのチミン塩基がウラシル塩基に置き換わった塩基配列であることが望ましいが、第一核酸増幅工程において増幅が抑制されるのであれば全てが置き換わっている必要はない。例えば、第二の核酸増幅工程で得られるウラシル塩基を含む増幅産物の塩基配列は、好ましくは５塩基以上、より好ましくは１０塩基以上のウラシル塩基を含む。
１つの実施形態では、第二核酸増幅工程は、例えば、マイクロプレートを用いたデジタルPCRを利用するものである。この実施形態では、まず、１ウェルあたり１分子の第一核酸増幅工程で生成された増幅産物が含まれるように、マイクロプレートの各ウェル中に、上記の第二の核酸増幅のための反応液を調製する。そして、上記した条件で第二の核酸増幅を行うことによって、ウラシル塩基を含む増幅産物を取得する。
1つの実施形態では、第二核酸増幅工程は、エマルジョンPCRを利用するものである。この実施形態では、第二核酸増幅工程が、例えば、鋳型核酸である第一核酸増幅工程の増幅産物を含む水性相と、油と混合して混合物を得ること、油相中に鋳型核酸、dATP、dUTP、dCTP、dGTPおよびウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼを含む水性液滴を作製すること、得られた液滴中の鋳型核酸を増幅することによって行われる。
エマルジョンPCRでは、まず、第二核酸増幅工程において、鋳型核酸としての第一核酸増幅工程の増幅産物と、第三及び第四プライマー、dATP、dUTP、dCTP、dGTPおよびウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼを含む水性相と、油とを混合して混合物を得る。
反応系の第三プライマーおよび第四プライマーの全部または一部はビーズ上に固定されていてもよい。ビーズは、たとえば約0.1〜10μmの直径を有する。ビーズは、典型的には重合体材料、例えばポリスチレン製であるが、非重合体材料、例えばシリカも用いることができ、その他スチレン共重合体、メタクリル酸メチル、官能化ポリスチレン、ガラス、ケイ素及びカルボキシレートを含んでいてもよい。粒子は、超常磁性であってもよい。このような超常磁性粒子は、反応後の精製が容易である。
ビーズは、全体の表面特性、例えば疎水性若しくは親水性を変更するため、又は結合特異性を付与する分子を結合させるために、その他の材料との共有的又は非共有的相互作用により改変できる。このような分子は、限定することなく、抗体、リガンド、特異的に結合するタンパク質対のメンバー、受容体、核酸又は化学活性基(例えばアルデヒド又はカルボキシ基)を含む。特異的に結合するタンパク質対は、アビジン-ビオチン、ストレプトアビジン-ビオチン及び第VII因子-組織因子を含む。
一実施形態において、第三又は第四プライマーは、当該技術において知られる任意の手段により、ビーズと結合している。第三又は第四プライマーは、共有的又は非共有的にビーズと結合できる。第三又は第四プライマーは、中間物を介して、例えばタンパク質-タンパク質相互作用、例えば抗体-抗原相互作用又はビオチン-アビジン相互作用を介して結合させてもよい。当該技術において知られるその他の特異的に結合する対も用いることができる。最適な増幅を達成するために、ビーズに結合するプライマーは、均質液相反応において必要な長さよりも長いことがある。ビーズと結合するプライマーの長さは、液相中でビーズから遊離しているプライマーの長さと同じである必要はない。
次いで、油相中に、鋳型核酸としての第一の核酸増幅工程の増幅産物、第三及び第四プライマー、dATP、dUTP、dCTP、dGTPおよびウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼを含む水性液滴を作製する。ここで得られる水性液滴は、いわゆる油中水型エマルジョン(water-in-oil emulsion)である。油相中の水性液滴の作製方法は特に限定されず、たとえば、ピペッティング等によって水性相及び油性相の混合物を振とうまたは攪拌すること、またはマイクロ流路チップを用いて水性相を油性相中に吐出することなどにより油相中水性液滴を作製することができる。油相中の水性液滴の作製に際しては、マルチウェルプレートを用いてもよい。
低濃度の鋳型核酸及び/又はビーズを含む水性相と油相とを混合し、水性液滴中に含まれる鋳型核酸分子が最大で1分子、且つ水性液滴中に含まれるビーズの数が最大で１個となるように水性液滴が作製され得る。液滴の多くは空であってもよい。ビーズに結合した低濃度のプライマー及び水性相中に存在し、ビーズから遊離している高濃度のプライマーを反応液に含めてもよい。水性液滴は、それらを略球形と仮定して、撹拌条件に依存して、例えば1μm未満〜100μmオーダー、好ましくは0.5〜50μm、より好ましくは1〜10μmの直径を有する。
水性相と油性相との混合物は、乳化剤を含んでいてもよい。乳化剤を加えることにより、エマルジョンを安定化させることができる。乳化剤は特に限定されず、シリコーンベースの乳化剤、例えばBis-PEG/PPG-14/14ジメチコン、シクロペンタシロキサン(ABIL(商標) EM 90)又はABIL(登録商標) WE09などが挙げられる。
水性相は、エマルジョン中、好ましくは少なくとも10％(v/v)以上、より好ましくは20％(v/v)以上、さらに好ましくは40％(v/v)以上を占める。したがって、油性相は、エマルジョン中、好ましくは90％(v/v)未満、より好ましくは80％(v/v)未満、さらに好ましくは少なくとも60％(v/v)未満を占める。ここで、乳化剤は、油性相を構成するものとする。乳化剤は、油性相中で、好ましくは５％(v/v)以上、より好ましくは８％(v/v)以上、さらに好ましくは10％(v/v)を占める。
水性相と油性相との混合物は、乳化助剤をさらに含んでいてもよい。乳化助剤は、乳化剤と一緒に作用して、エマルジョン中の水性区画の形成及び安定化を容易にすることができる。乳化助剤は特に限定されず、例えばオレイン酸ポリグリセリル-３又はイソステアリン酸ポリグリセリル-４などが挙げられる。
乳化助剤は、好ましくは10,000 g/mol未満の分子量を有する。
そして、上記で定義した第二の核酸増幅の条件下で、上記で得られた液滴中の鋳型核酸を増幅する。プライマーがビーズに固定されている場合、第二核酸増幅反応によってビーズ上に固定された増幅産物が形成される。
第二核酸増幅工程においてビーズを用いたエマルジョンPCRを実施した場合、増幅後、当業者に公知の方法により、エマルジョンを「破壊」又は崩壊してもよい。エマルジョンを破壊する方法は、例えば洗浄剤を加えることである。洗浄剤は、それらに限定されないが、Triton X100、ラウレス４及びノニデット(例えばNP-40)を含む。好ましくは、エマルジョン破壊溶液は、効果的な相分離をもたらすだけでなく、エマルジョンから放出されるビーズの凝集も妨げる。エマルジョン破壊溶液は、ピペット操作により容易に除去できない油性相の形成も妨げる。エマルジョン破壊溶液は、アルコール、例えば２-ブタノール及び/又は１-プロパノールを含んでいてもよい。アルコールの添加により、ビーズの凝集を最小限に保ち、かつピペット操作を可能にしながらエマルジョン破壊を大きく増進できる。
エマルジョン破壊溶液は、ビーズ及び/又は反応容器を洗浄して反応物をさらに浄化するための浄化液として用いてもよい。また、浄化液は、ビーズの洗浄及び/又は核酸変性のために用いることもできる。浄化液は、例えば、２-ブタノール及び/又は１-プロパノールを含む。
本実施形態の核酸増幅方法は、第二核酸増幅工程の後、第二核酸増幅工程の増幅産物を検出する工程をさらに含んでいてもよい。検出工程においては、核酸の増幅産物の検出として一般的に用いられる方法を用いることができる。たとえば、インターカレーター(例えばSYBR(登録商標)Green、エチジウムブロマイドなど)、増幅産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと標識物質とを含む標識プローブなどが用いられる。標識プローブは、たとえば、蛍光物質が結合したプローブ、蛍光物質と蛍光を消光するクエンチャーが結合したプローブ(例えばTaqMan(登録商標)プローブ)などを用いることができる。試料中の遺伝子の突然変異を検出する場合、第二核酸増幅工程の後、第二核酸増幅工程の変異型増幅産物に特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドプローブ及び第二核酸増幅工程の野生型増幅産物に特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、変異型増幅産物を検出することによって行われる。
本実施形態の核酸増幅方法は、ウラシル塩基を含む核酸の酵素分解処理を必要としない。エマルジョンの調製や破壊時に試料を激しく攪拌する場合、核酸分子がエアロゾル化し、空中に飛散することがある。このような場合、キャリーオーバーが生じやすく、本実施形態の方法が特に好適である。
本発明の範囲には、上記の方法に用いられる核酸増幅用試薬も包含される。
核酸増幅用試薬の形態は特に限定されず、固体(例えば、粉末、結晶、凍結乾燥品など)であってもよいし、液体(例えば、溶液、懸濁液、乳濁液など)であってもよい。核酸増幅用試薬の構成要素は、それぞれ別の容器に保存されているか又は個別に包装されていることが好ましい。核酸増幅用試薬は、検出のための標識オリゴヌクレオチドプローブを備えていてもよく、この場合、標識オリゴヌクレオチドプローブは固相に固定されていてもよい。なお、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼ、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼ、dATP、dTTP、dUTP、dCTPおよびdGTP、標識オリゴヌクレオチドプローブ、固相についての詳細は、上記の核酸増幅方法の説明で述べたことと同様である。
第１の実施形態では、上記の各種試薬を収容した容器を箱に梱包して、ユーザに提供してもよい。この箱には、核酸増幅用試薬の添付文書を同梱していてもよい。この添付文書には、たとえば、核酸増幅用試薬の構成、核酸増幅プロトコールなどが記載されることが好ましい。図１Ａに、本実施形態の核酸増幅用試薬の外観の一例を示す。図中、１１０は、核酸増幅用試薬を示し、１１１は、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼを収容した第１容器を示し、１１２は、dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPを収容した第２容器を示し、１１３は、添付文書を示し、１１４は、梱包箱を示す。
図１Ｂに、第２の実施形態の核酸増幅用試薬の外観の一例を示す。図中、２１０は、核酸増幅用試薬を示し、２１１は、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼを収容した第１容器を示し、２１２は、dATP、dUTP、dCTPおよびdGTPを収容した第２容器を示し、２１３は、添付文書を示し、２１４は、梱包箱を示す。
図１Ｃに、第３の実施形態の核酸増幅用試薬の外観の一例を示す。図中、３１０は、核酸増幅用試薬を示し、３１１は、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼを収容した第１容器を示し、３１２は、dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPを収容した第２容器を示し、３１３は、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼを収容した第３容器を示し、３１４は、dATP、dUTP、dCTPおよびdGTPを収容した第４容器を示し、３１５は、添付文書を示し、３１６は、梱包箱を示す。
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１：ウラシル塩基を含むDNA断片の調製
（１）PCR反応液の調製
以下の組成を有するPCR反応液を調製した：12.5μl 10×PCR buffer, 12.5μl 100mM MgCl2, 2,5μl, 1μlのプライマー1及び2(10μM)、0.5μlテンプレート(7pg/μl)、89.5μl蒸留水、2.5μl dNTP(それぞれ10mM：dUTP、dGTP、dATP、dCTP)、2.5μl Taq DNAポリメラーゼ(Peqlab: cat01-1020)。テンプレートは、500コピーの変異DNAである。テンプレートの一方の鎖の塩基配列を配列番号１で、配列番号１の鎖と共に二本鎖(dUTP含有のKRAS DNA断片)を形成するもう一方の鎖を配列番号２で表す。プライマー１及び２を配列番号３及び４で表す。
（２）PCRサイクル
PCR反応は、以下のサイクル数で行った：94℃ 2分、94℃ 10秒→68℃ 1分→70℃ 10秒を３回、94℃ 10秒→59℃ 1分→70℃ 10秒を40回、70℃ 2分→4℃で放置。
（３）BEAMing
プレPCR反応の基本的な手法はNature Methods Vol.3 No.7 July 2006の「Thermal cycle」に記載のとおりにして行った。
エマルジョンPCRは、Nature Methods Vol.3 No.7 July 2006に記載のとおりにして行った。
エマルジョン破壊、ハイブリダイゼーション工程手法は特表２０１１−５２９６９１号の段落[００７９]及び[００８０]を参照する。
フローサイトメトリー分析は特表２０１１−５２９６９１号の段落[００８１]に記されているフローサイトメトリーシステムを用いて行った。
より具体的には、これらの実験は、以下の（４）〜（８）に記載のとおりにして行った。
（４）プレPCR
変異率が0、0.1、1%の野生型KRAS DNAサンプル（配列番号５：水にKRAS DNA等を混合）と、同サンプルに対してdUTP含有のKRAS DNA断片(配列番号１の鎖及び配列番号２の鎖からなる二本鎖DNA)を1%相当で加えたDNAサンプルを調製し、実験に用いた。
プレPCRは50μlのPCR反応液(約1x106分子の鋳型核酸を含む)で実施した。各反応は5×Phusin高忠実度バッファー、0.8μlのPhusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase又はPhusion U(ともにNEB)、0.2μMのプライマー1、0.2μMのプライマー2、それぞれ0.25 mMのdNTP (dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、及び0.5mM MgCl2から構成された。
PCR産物をPcogreen dsアッセイキット（Invitrogen社）を使用して定量した。蛍光強度は蛍光プレートリーダー(Safire2 TECAN)をDNA参照標準を用いて定量した。
（５）エマルジョンPCR
プレPCR工程の増幅産物をテンプレートとして、オイルとエマルジョンPCRマスターミックスを用いてエマルジョンを形成し、サーマルサイクラーにてエマルジョンPCRを実施した。プレPCR工程の増幅産物を18pg程度まで希釈し、4.0単位のPlatinum Taq DNAポリメラーゼ（Invitrogen社）、1×PCRバッファー（NEB）、それぞれ0.2mMのdNTPs(dATP、dUTP、dGTP、dCTP)、5mMのMgCl2、0.05μMのタグ1 (エマルジョンPCR用プライマー；配列番号６)、8μMのタグ2 (エマルジョンPCR用プライマー；配列番号７)及びタグ1がコーティングされた500〜800万個程度の磁性ビーズ（Myone, Invitrogen社）を含有する150μLのPCRマスターミックスを調製した。150μLのPCRマスターミックスと600μLの油/乳化剤ミックス（7％のABIL WE09、20％の鉱油、73％のTegosoft DEC（Degussa Goldschmidt Chemical社、バージニア州ホープウェル(Hopewell,VA)）を96ディープウェルプレートに加えた。エマルジョンは、このプレートをTissueLyser（Qiagen社）内において15Hzで10秒間、次に17Hzで7秒間攪拌することによって調製した。エマルジョンは別の96穴ディープウェルプレートに分注され、下記の条件でサーマルサイクラーにかけられた。
（６）エマルジョン破壊
150μLのエマルジョン破壊バッファー（10mMのTris-HCl（pH7.5）、1％のTriton-X 100、1％のSDS、100mMのNaCl、1mMのEDTA）を各ウエルに添加し、TissueLyserを20Hzで20秒間混合した。ビーズは、懸濁液を3,200gで2分間回転させ、油相を除去することによって回収した。エマルジョン破壊工程は、2回繰り返した。8個のウエルからの全ビーズを回収・統合し、150μLの洗浄バッファー（20mMのTris-HCl（pH8.4）、50mMのKCl）で洗浄した。ビーズ上の増幅産物は、0.1MのNaOH水溶液を用いて5分間変性させた。最終はビーズを150μLの洗浄バッファーで洗浄、150μLの洗浄バッファー中に再分散させた。
（７）ハイブリダイゼーション
変異型及び野生型DNA配列に対して相補的な蛍光標識プローブを設計した。プローブのサイズは、標的領域のGC含有量に依存して15bp〜18bp程度である。変異プローブは5'側末端上でCy5（商標）蛍光体を用いて合成し、野生型プローブはCy3（商標）蛍光体に結合させた（Integrated DNA Technologies社）。さらに、増幅産物内の上記ブローブ認識個所とは別の場所に、陽性コントロールとして伸長した増幅産物を標識するために使用した（ユニバーサル）。この増幅産物特異的プローブは、それらの5'側末端に付着したROX（商標）蛍光体を用いて合成した。プローブ配列は下記に記載した。各領域との特異的ハイブリダイゼーション反応液は、30μLの洗浄バッファー（エマルジョン破壊を参照）中に存在するビーズ、66μLの1.5×ハイブリダイゼーションバッファー（4.5Mの塩化テトラメチルアンモニウム、75mMのTris-HCl（pH7.5）、6mMのEDTA）、および4μLのTEバッファー中で5μMに調製された変異型、野生型、およびユニバーサルプローブの混合液を含有していた。ハイブリダイゼーション混合液は70℃へ10秒間加熱し、35℃へ緩徐に（0.1℃/秒）冷却した。35℃で2分間インキュベートした後、この混合液を室温へ冷却した（0.1℃/秒）。ビーズは磁石を用いて集磁し、未結合プローブを含有する上清はピペットを使用して除去した。ビーズは100μLの1×ハイブリダイゼーションバッファー中に再懸濁させ、48℃へ5分間加熱して未結合プローブを除去した。加熱工程後、ビーズは再び磁石によって集磁し、100μLの洗浄バッファーを用いて1回洗浄した。最終工程で、上清を除去し、フローサイトメトリー分析のためにビーズを200μLのTEバッファー中に再懸濁させた。
（８）フローサイトメトリー分析
高スループットオートサンプラーを装備したフローサイトメトリーシステム（BD Bioscience社）を変異型、野生型といったビーズ分析のために使用した。伸長産物を含まないビーズは、分析から除外した。フローサイトメトリーの解析は、FCS express 4（De Novo software）を用いた。
（９）プローブ配列
特表２０１１−５２９６９１号の図１０Ｂの「KRAS G38A」に記載のものを使用した。
結果
サンプルが擬似的なキャリーオーバー核酸を含んでいることを確認するためにPhusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymeraseと似た系統でdUTPを基質にできるPCR酵素(Phusion U)をプレPCRに用いたBEAMingを並行して実施した。プレPCRにPhusion Uを用いた場合は、すべての条件で変異率が1%を超える異常な変異率となった。このことから、今回性能確認に用いたサンプルは適切なキャリーオーバー核酸を含有していることが確認できた(図２Ａ)。
一方、プレPCRにPhusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymeraseを用いた場合は、キャリーオーバーの有無によらず、0%の変異率のサンプルでは0.01%以下、0.1%の変異率のサンプルで0.1%前後の変異率となった(図２Ｂ)。このことからプレPCRにPhusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymeraseを用いた場合は、ウラシル含有核酸分解酵素を添加しなくても、エマルジョンPCRの増幅産物由来のウラシル含有DNAの混入の影響を排除できることが確認できた。
実施例２
実施例1と同じく変異率が0%、1%となるように調製したKRAS DNAサンプル、または同サンプルにウラシル含有DNAを添加したサンプルを用いてBEAMingを実施した。
dUTP含有DNAは実施例と同じ手法で調製した。プレPCRは50μlのPCR反応液で実施した。各反応液の組成は、以下のとおりである：
Phusion U：5×Phusin高忠実度バッファー、0.8ulのPhusion U(ともにNEB)、0.2μMのプライマー１、0.2μMのプライマー２、0.25mMの各dNTP、及び0.5mM MgCl2；
KOD Plus neo：10×buffer、0.8ulのKOD Plus neo、0.2μMのプライマー１、0.2μMのプライマー２、0.2mM各dNTP、1.5mM MgSO4。
PCR条件は、実施例１と同様である。エマルジョンPCR〜フローサイトメトリー解析の条件も実施例１と同様である。
結果、実施例１の結果と同様に、プレPCRにPhusion Uを用いた場合は、すべての条件で変異率が1%を超える異常な変異率となり、キャリーオーバー核酸が増幅されていた(図３Ａ)。これに対し、KOD Plus neo を用いた場合は、実施例１でPhusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymeraseを用いた場合と同様に、キャリーオーバーの有無によらず、0%の変異率のサンプルでは0.01%以下、0.1%の変異率のサンプルで0.1%前後の変異率となり、キャリーオーバー核酸の増幅が確認されなかった(図３Ｂ)。このことから、プレPCRにKOD plus neoを用いた場合にも、ウラシル含有核酸分解酵素を添加しなくても、emPCRの増幅産物由来のウラシル含有DNAの混入の影響を排除できることが確認できた。
実施例３：擬似的キャリーオーバーの影響の評価
実施例１に記載の方法に従って、種々の濃度のdUTP/dTTP混液を用いるエマルジョンPCRによって得られたPCR産物をgTE (TE(pH8)中20μg/mlのグリコーゲン)で100万分の1に希釈した。このPCR産物を擬似的なキャリーオーバーと想定し、上記の希釈物を用いて、実施例１に記載の方法に従ってプレPCRを行った。増幅産物をゲル電気泳動して泳動写真を取得し、ImageJを用いるデンシトメトリによって増幅効率を数値化した。結果を以下の表３に示す。
上記の表３において、例えば「T75%」は、dTTP:dUTP＝75:25のdUTP/dTTP混液を用いて行ったエマルジョンPCR産物を用いた場合の結果を示す。表３中、「平均」は、対象エリアの平均輝度を表し、「ブランク」は、バックグラウンドの輝度を表す。表３に示されるように、dTTP:dUTP＝50:50あたりから徐々に増幅効率が低下する。このデータから、dTTP:dUTP＝60:40よりもdUTPの濃度が高くなると、ほぼ100％のPCR産物がウラシル塩基を数個含むようになると考えられる。
１１０、２１０、３１０：核酸増幅用試薬
１１１、２１１、３１１：第１容器
１１２、２１２、３１２：第２容器
１１３、２１３、３１５：添付文書
１１４、２１４、３１６：梱包箱
３１３：第３容器
３１４：第４容器

Claims (17)

  1. 試料に含まれる標的核酸を鋳型として第一の核酸増幅を行う工程と、
    前記第一核酸増幅工程で生成された増幅産物を鋳型として第二の核酸増幅を行う工程と、
    を含み、
    第一核酸増幅工程において、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼを用い、ウラシル塩基を含まない増幅産物を生成し、
    第二核酸増幅工程において、ウラシル塩基を含むプライマーおよび/またはdUTPと、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼとを用い、ウラシル塩基を含む増幅産物を生成することを特徴とする、核酸増幅方法。
  2. 前記第一核酸増幅工程において、
    前記試料と、dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPと、前記ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼとを混合して反応液を調製し、
    前記反応液は、dUTPが実質的に存在せず、ウラシル塩基を含む核酸が存在する可能性がある液状試料である、請求項１に記載の方法。
  3. ウラシル塩基を含む核酸を分解する工程を含まない、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記第二核酸増幅工程において、dATP、dUTP、dCTPおよびdGTPの存在下で核酸増幅を行う、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
  5. 前記第二核酸増幅工程において、
    鋳型核酸である第一核酸増幅工程の増幅産物を含む水性相と、油と混合し、
    油相中に、鋳型核酸、dATP、dUTP、dCTP、dGTPおよびウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼを含む水性液滴を作製し、
    前記液滴中の鋳型核酸を増幅する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
  6. 前記第二核酸増幅工程の後、前記第二核酸増幅工程の増幅産物を検出する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
  7. 前記検出工程において、インターカレーターまたは前記第二核酸増幅工程の増幅産物に特異的に結合する標識プローブを用いて増幅産物の検出を行う、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
  8. 前記ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼが、古細菌由来のDNAポリメラーゼである、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  9. 前記ウラシルを含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼが、ピロコッカス属(Pyrococcus)由来もしくはサーモコッカス・コダカラエンシス(Thermococcus kodakaraensis)由来の耐熱性DNAポリメラーゼである、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
  10. 前記ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼが、サーモコッカス・アクアティクス(Thermococcus aquaticus)由来の耐熱性DNAポリメラーゼである、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
  11. 前記ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼが、Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymeraseおよび／またはKOD plus neoである、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
  12. 前記第一核酸増幅工程において、前記標的核酸の第一領域に結合する第一プライマーと、前記標的核酸の第二領域の相補鎖に結合する第二プライマーとが用いられ、
    前記第二核酸増幅工程において、前記標的核酸の第三領域に結合する第三プライマーと、前記標的核酸の第四領域の相補鎖に結合する第四プライマーとが用いられ、
    前記第三プライマーおよび／または前記第四プライマーが、ウラシル塩基を含み、
    (i) 前記第一領域と前記第三領域の一部又は全部が重複し、かつ、前記第二領域と前記第四領域の一部又は全部が重複するか、又は、
    (ii) 前記第一及び第二プライマーに付加されたタグの一部又は全部が、それぞれ第三及び第四領域と重複する、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
  13. 前記第一の核酸増幅は１５〜５０サイクル行い、
    前記第二の核酸増幅は２０〜６０サイクル行うことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
  14. 請求項１〜１３のいずれか１つに記載の方法に用いられる核酸増幅用試薬であって、
    ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼ、
    dATP、dTTP、dCTPおよびdGTP
    を含む核酸増幅用試薬。
  15. 請求項１〜１３のいずれか１つに記載の方法に用いられる核酸増幅用試薬であって、
    ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼ、dATP、dUTP、dCTPおよびdGTP
    を含む核酸増幅用試薬。
  16. 請求項１〜１３のいずれか１つに記載の方法に用いられる核酸増幅用試薬であって、
    ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼを含む第1容器、
    dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPを含む第2容器、
    ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼを含む第3容器、および
    dATP、dUTP、dCTPおよびdGTPを含む第4容器、
    を含む核酸増幅用試薬。
  17. 試料に含まれる標的核酸を鋳型として第一の核酸増幅を行う工程と、
    前記第一核酸増幅工程で生成された増幅産物を鋳型として第二の核酸増幅を行う工程と、
    前記第二核酸増幅工程の後、標識物質で標識された、所望の変異を有する前記第二核酸増幅工程の変異型増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブ及び前記第二核酸増幅工程の野生型増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて、前記変異型増幅産物を検出する工程と
    を含み、
    第一核酸増幅工程において、ウラシル塩基を含まない核酸を選択的に増幅するDNAポリメラーゼを用い、ウラシル塩基を含まない増幅産物を生成し、
    第二核酸増幅工程において、ウラシル塩基を含むプライマーおよび/またはdUTPと、ウラシル塩基を含む核酸を増幅可能なDNAポリメラーゼとを用い、ウラシル塩基を含む増幅産物を生成することを特徴とする、変異検出方法。
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