JPS63102677A - 熱安定性ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents

熱安定性ｄｎａポリメラーゼ

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JPS63102677A
JPS63102677A JP62207421A JP20742187A JPS63102677A JP S63102677 A JPS63102677 A JP S63102677A JP 62207421 A JP62207421 A JP 62207421A JP 20742187 A JP20742187 A JP 20742187A JP S63102677 A JPS63102677 A JP S63102677A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、精製した熱安定酵素に関する。一つの態様で
は、この酵素はテルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ　ａ　ｕａｔｉｃｕｓ）から精製されたＤＮＡポリメ
ラーゼであり、その分子量は約８６．０００〜９０．０
００である。
本発明は、既存の核酸配列が試験試料中に存在するなら
ばそれらを増幅し、且つもし存在するならばそれらをプ
ローブを用いることによって検出する方法に関する。更
に具体的には、本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡの所定の
配列から特定の核酸配列を最初に存在している量に比較
して大量に産生じてこれらの配列の検出を容易にし、反
応を触媒する熱安定酵素を用いる方法に関する。ＤＮＡ
またはＲＮＡは、−末鎖または二本鎖であってもよく、
比較的純粋な種類または核酸の混合物の一成分であって
もよい。本発明の方法は、所望な核酸配列の増幅を達成
するため、反復反応を利用する。
〔従来の技術〕
Ｅ、コリ　（Ｅ、　　ｃｏ旦）のような中温微生物がら
のＤＮＡポリメラーゼの単離について、広範な研究が行
われてきた。例えば、ベスマン（Ｂｅｓｓ糟ａｎ）ら、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、０μシ（ｉ９５７年）、２３３巻、　１
７１〜１７７頁およびブチン（Ｂｕｔｔｉｎ）とコルン
ベルグ（にｏｒｎ−ｂｅｒｇ）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ
＋、　（ｉ９６６年）、２４１巻、５４１９〜５４２７
頁を参照されたい。
対照的に、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ…
胚旦ｃｕｓ）のような好熱菌からのＤＮＡポリメラーゼ
の単離と精製については、余り研究が行なわれていない
。カレジン（Ｋａｌｅｄｉｎ）ら、７゜（ｉ９８０年）
４５巻、６４４〜６５１頁は、テルムス・ア’；ｌ　７
　ｆ　’）　ス（７，７Ｙ　Ｔ　１株の細胞からのＤＮ
Ａポリメラーゼの６段階単離および精製法を開示してい
る。これらの工程は、粗製抽出物の単離、ＤＥＡＥ−セ
ルロース・クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト上
での分別、ＤＥＡＥ−セルロース上での分別および単一
鎖ＤＮＡ−セルロース上でのクロマトグラフィから成っ
ている。それぞれの段階からのプールは、エンド−およ
びエクソヌクレアーゼの混入についてはスクリーニング
されていない。精製された酵素の分子量は、モノマ一単
位当たり６２．０００ドルトンと報告されている。
テルムス・アクアチクス（Ｔ　、　　ｕ胆且印註カラ（
７）ポリメラーゼについての第二の精製法は、エイ・チ
ェノ（Ａ、Ｃｈｉｅｎ）ら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、（ｉ９７６年）、１２７巻、１５５０〜１５５７頁に
よって記載されている。
この方法では、粗製の抽出物をＤＥＡＥ−セファデック
スカラムにかける。透析下プール分画を次に、ホスホセ
ルロースカラム上での処理に付す。このプールした分画
を透析して、ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）を加え
てポリメラーゼの活性の損失を防止する。生成する混合
物をＤＮＡ−セルロースカラムにかける。カラムがらの
プールした物Ｉｔｓ析し、ゲル濾過によって分析すると
分子量は約６３．０００ドルトンであり、スクロース遠
心分離によれば約６８，０００ドルトンである。
熱安定酵素を用いて、既存の核酸配列を初めに存在する
量に比べて大量に増幅する方法は、１９８６年１２月１
０日発行の欧州特許公開第２００．３６２号明細書に示
唆されている。この方法では、プライマー、ヌクレオチ
ドトリホスフェートおよびポリメラーゼが用いられ、変
性、鋳型類の合成およびハイブリダイゼーションからな
っている。それぞれのプライマーの伸長生成物は、所望
の核酸配列を製造するための鋳型になる。この明細占で
は、用いられるポリメラーゼが熱安定酵素である場合に
は、熱によってその活性が破壊されないので、各変性工
程の後にそれを添加する必要はない。精製された熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼの使用については、他の利益およ
び詳細な点についてはなにも提供されていない。増幅お
よび検出工程も、サイキ（Ｓａｉｋｉ）らの５ｃｉｅｎ
ｃｅ　−、２３０巻、１３５０〜１３５４頁（ｉ９８５
年）およびサイキ（Ｓａｉｋｉ）らのＢｉｏ　　Ｔｅｃ
ｈ−匹旦■、３巻、１００８〜１０１２頁（ｉ９８５年
）に記載されている。
〔発明が解決しようとする問題点〕
したがって、当業界では、上記の診断用増幅工程を改良
するために使用することができる精製された安定な熱安
定酵素を製造することが望まれている。
〔問題点を解決するための手段〕
したがって、本発明はヌクレオチドトリホスフェートの
結合を触媒して核酸鋳型類に相補的な核酸鎖を形成する
精製された熱安定酵素を提供する。
好ましくは、精製された酵素はテルムス・アクアチクス
（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　皿旦旦匹蛙由来のＤＮＡポリメラ
ーゼであり、分子量は約８６．０００〜９０，０００ド
ルトンである。この精製された材料を温度サイクル増幅
反応に用いて、所定の核酸配列から核酸配列を初めに存
在する量に比較して大量に産生させて、それらを容易に
検出することができるようにすることができる。
テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　７由来の
ＤＮＡポリメラーゼからの酵素をコードする遺伝子も同
定され、本発明の熱安定酵素を回収するもう一つの手段
を提供する。約８６．０００〜９０、０００ドルトンの
酵素をコードする遺伝子に加えて、ＤＮＡポリメラーゼ
活性をコードする遺伝子誘導体も提供される。
最後に、本発明は、１種以上の非イオン性のポリマー性
洗剤を含む緩衝液に上記のような精製された熱安定酵素
を含有する安定な酵素組成物をも包含する。
精製された酵素および組替えＤＮＡ技術によって産生さ
れる酵素は、熱安定性ではないフレノウ（にｌｅｎｏｗ
）フラグメントよりも這かに高い特異性を提供する。更
に、精製された酵素及び組換え技術によって産生された
酵素は、ｄＴＴＰまたは他のヌクレオチドトリホスフェ
ートがＤＮＡ鋳型と共にインキュベーション混合物中に
存在しないときに予想される適当な活性を示す。また、
これらの酵素は、文献に記載されているテルムス・アク
アチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　赳旦旦匹Ｕ由来の熱安定
酵素のｐ）ｌよりも広いｐＨ範囲を有し、ｐＨ７ではｐ
Ｈ８における場合の５０％より大きな活性を示す。更に
、これらの熱安定酵素は、非イオン性洗剤を有する緩衝
液中に保存して、長時間に亙って活性を失わずに安定で
あるようにすることができる。
本発明は、プライマーおよび熱安定酵素を用いて、核酸
またはそれらの混合物中に存在する１種又は複数種の特
定の核酸配列を増幅する方法にある。一つのプライマー
の伸長生成物が他のものにハイブリダイズすると、所望
の特定の核酸配列を産生ずるための鋳型になり、その逆
も同じであり、この方法は所望の量の配列を産生ずるの
に必要な回数だけ反復される。この方法は、増幅反応の
特異性を向上させて、増幅された核酸の極めて明瞭なシ
グナルを生じる。更に、本発明の方法は、それぞれの増
幅サイクルの後に一つの容器から別の容器に試薬を移す
必要をなくする。熱安定酵素は、核酸鎖を変性するのに
要する高温に対して耐性を有し、それ故取り替える必要
がないので、上記のような移し替えは必−要でない。更
に、温度サイクル変化を自動化して、増幅反応を行うの
に必要な人員と工程数を更に削減することができる。
更に具体的には、本発明は、核酸または核酸の混合物に
含まれる少なくとも１種の特定の核酸配列を増幅する方
法であって、核酸が二本鎖である時には、この核酸が同
じまたは異なる長さの２本の別々の相補的鎖からなり、 （ａ）それぞれの核酸鎖を、４個の異なるヌクレオチド
トリホスフェートと増幅されるべきそれぞれの異なる特
定の配列について１個のオリゴヌクレオチドプライマー
とに接触させ、但しそれぞれのプライマーはそれぞれの
特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選
択され、１個のプライマーから合成された伸長生成物が
、その相補体から分離したとき、他のプライマーの伸長
生成物の合成の鋳型として働くことができるようにし、
上記接触を、それぞれのプライマーのその相補的核酸鎖
へのハイブリダイゼーションを促進する温度で行い； （ｂ）それぞれの核酸鎖を、工程（ａ）と同時にまたは
この工程の後に、ヌクレオチドトリホスフェートの結合
を触媒する熱安定酵素と接触させて、それぞれの核酸の
それぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形成し
； （ｃ）酵素の活性化し、そして増幅されるべきそれぞれ
の異なる配列について、それぞれの核酸鎮鋳型に相補的
なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成するために
は有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成物をそ
の相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温度にお
いて、有効な時間にわたり、工程（ｂ）からの混合物を
保持し；（ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成さ
れた鋳型から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖
分子を生成せしめるためには有効な温度ではあるがしか
し酵素を不可逆的に変性させる程の高温ではない温度に
おいて、有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混合物
を加熱し； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、それぞれのプライマ
ーの工程（ｄ）で産生される一本鎖分子のそれぞれへの
ハイブリダイゼーションを促進するために有効な温度に
有効な時間にわたり冷却し：（ｆ）酵素の活性を促進さ
せ、そして増幅されるべきそれぞれの異なる配列につい
て、工程（ｄ）で産生されるそれぞれの核酸鎮鋳型に相
補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成するた
めには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成物
をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温度
において、有効な時間にわたり、工程（ｂ）からの混合
物を保持し、工程（ｅ）および（ｆ）を同時にまたは順
次に行うことをコード化する、方法を提供する。
工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は、所望な水準の配列
の増幅が得られるまで繰り返すことができる。本明細書
記載の好ましい熱安定酵素は、テルムス・アクアチクス
（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　凹且Ｉ士烈ｓ）−カラ抽出された
ポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）である。最も好ま
しくは、酵素がＴａｑポリメラーゼである時には、工程
（ａ）では核酸鎖を、約１．５〜２ｉＭのマグネシウム
塩、１５０〜２００−〇それぞれのヌクレオチドおよび
１声のそれぞれのプライマーを含んで成る！１　ｉｉｊ
液と接触させ、工程（ａ）、（ｅ）および（ｆ）を約４
５〜５８℃で行い、工程（ｄ）を約９０〜１００℃で行
う。
好ましい態様では、１種又は複数種の核酸は二本鎖であ
り、工程（ａ）は、（ｉ）それぞれの核酸を、４個の異
なるヌクレオチドトリホスフェート及び増幅されるべき
それぞれの異なる特定の配列について１個のオリゴヌク
レオチドプライマーの存在下で、それぞれの核酸を変性
するのに有効な時間、有効な温度に・加熱して、但しそ
れぞれのプライマーはそれぞれの特定の配列の異なる鎖
に実質的に相補的であるように選択され、１個のプライ
マーから合成された伸長生成物が、その相補体から分離
したとき、他のプライ′マーの伸長生成物の合成の鋳型
として働くことができるようにし、（ｉｉ）変性した核
酸を、それぞれのプライマーのその相補的な核酸鎖への
ハイブリダイゼーションを促進する温度に冷却すること
によって行なわれる。
他の態様では、本発明は、核酸または核酸の混合物を含
む試料において少なくとも１種の特定の核酸配列の存在
または不存在を検出し、または上記試料における２種の
異なる配列を識別する方法であって、試料は上記１また
は複数の配列を含むものと予想され、且つ１又は複数の
核酸が二本鎖である時には、それらはそれぞれ、等しい
または等しくない長さの２本の分離された相補的鎖から
なり、工程（ａ）〜（ｆ）は上記と同じであり、特定の
１つの核酸配列または、存在するならば、複数の配列の
量を増幅させ、工程（ｅ）および（ｆ）を同時にまたは
順次に行い、 （ｇ）工程（ｆ）の生成物に、上記配列へのまたはその
変異体へハイブリダイズすることができる、検出される
べきそれぞれの配列のための、標識したオリゴヌクレオ
チドプローブを加え；そして ＜ｈ＞上記ハイブリダイゼーションが起こったかどうか
を決定することをコード化する、方法に関する。
更にもう一つの態様では、本発明は、試料中に含まれる
１種又は複数種の核酸中の少なくとも１つのヌクレオチ
ド配列の変化の存在または不存在を検出する方法であっ
て、核酸が二本鎖である時には、それはそれぞれ、等し
いまたは等しくない長さの２本の分離された相補的鎖か
らなり、上記工程（ａ）〜（ｆ）を含み、ｌ又は複数の
配列変化が存在するときには、これらを含む核酸の検出
可能な増幅を得るのに十分な回数だけ、工程（ｄ）。
（ｅ）および（ｆ）を繰り返し、且つ工程（ｅ）と（ｆ
）は同時にまたは順次に行い、 （ｇ）工程（ｆ）の生成物を膜に固定し、（ｈ）プロー
ブの配列が増幅された配列の領域に相補的であるときに
のみ増幅された核酸配列とハイブリダイズすることがで
きる、標識された配列特異的オリゴヌクレオチドプロー
ブで、上記膜をハイブリダイゼーション条件下で処理し
；そして　（ｉ）プローブが核酸試料中の増幅された配
列にハイブリダイズしたか否かを検出することをコード
化する、方法に関する。
試料が細胞を含有するときには、好ましくは、それらの
細胞を工程（ａ）の前に加熱してその中の核酸を試薬に
暴露させる。この工程は、試薬の添加前の核酸の抽出を
回避する。
この方法の変法においては１種又は複数のプライマーお
よび／またはヌクレオチドホスフェートを標識して、生
成する増幅された配列を標識するようにする。標識され
た１種又は複数のプライマーおよび／またはヌクレオチ
ドホスフェートは、最初から反応混合物中に存在しても
よくまたは後のサイクルで添加することもできる。（非
標識）配列特異的オリゴヌクレオチドトリホスフェート
を膜に固定し、標識された増幅生成物によりハイブリダ
イゼーション条件下で処理して、膜に結合した配列が増
幅生成物に存在するときにのみハイブリダイゼーション
が起こるようにする。
更にもう一つの態様では、本発明は、核酸または核酸の
混合物に含まれる１種又は複数種の特異的核酸配列をク
ローニングベクターにクローン化する方法であって、１
種又は複数の核酸が二本鎖である時には２本の分離され
た相補的鎖からなり、該１種又は複数種核酸がクローニ
ングの前に量的に増幅され、この方法は上記工程（ａ）
〜（ｆ）を含み、工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は１
種又は複数種の配列を含む１種又は複数種の核酸の検出
可能な増幅を生じるのに十分な回数だけ繰り返し； （ｇ）工程（ｆ）の生成物に上記制限部位のそれぞれに
対する制限酵素を加えて、制限消化物中に開裂生成物を
得： （ｈ）クローン化されるべき特定の配列を含む工程（ｇ
）の開裂生成物を１個以上のクローニングベクターに連
結することからなる方法に関する。
最後の態様では、本発明は、核酸または核酸の混合物に
含まれる１種又は複数種の特定の核酸配列をクローニン
グベクターにクローン化する方法であって、１種又は複
数種の核酸が二本鎖である時には、長さが等しいまたは
等しくない２本の分離された相補的鎖からなり、該１種
又は複数種の核酸がクローニングの前に量的に増幅され
、この方法は上記工程（ａ）〜（ｆ）を含み、工程（ｄ
）。
（ｅ）および（ｆ）を、１種以上のクローニングベクタ
ーに平滑末端連結するために、１種又は複数の配列を含
む１種又は複数の核酸の検出可能な増幅を生じるのに十
分な回数だけ繰り返し、（ｇ）工程（ｆ）から得られた
クローン化されるべき１種又は複数種の増幅された特定
の列をリガーゼの存在下で１種又は複数種の上記クロー
ニングベクターへ連結し、ここで、１種又は複数種の上
記増幅された配列及び１種又は複数種のベクターが連結
を行うのに十分な量で存在することをコード化する、方
法に関する。
生成物の態様では、本発明は、核酸または核酸の混合物
に含まれる少（とも１種の特定の核酸配列を増幅するの
に有用な組成物であって、増幅されるべきそれぞれの異
なる特定の配列について、４個の異なるヌクレオチドト
リホスフェートと１個のオリゴヌクレオチドプライマー
を含有し、それぞれのプライマーはそれぞれの特定の配
列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選択され、
一つのプライマーから合成された伸長生成物は、その相
補体から分離されたと、他のプライマーの伸長生成物の
合成の鋳型として働くことができるようになる。
もう一つの生成物の態様では、本発明は、核酸に含まれ
る特定の核酸配列の複数積を含んで成る１種又は複数種
の核酸の試料を提供する。この試料は、約１０〜１００
の鎖、約１００〜１０００の鎖、または約１０００を超
える鎖を有することができる。
最後の生成物の態様では、本発明は、本発明の増幅法に
よって産生される配列の複数のコピーを含有する核酸ま
たは核酸の混合物からの増幅された核酸配列を提供する
。
本明細書に用いられる「細胞」　「細胞系（セルライン
）」および「細胞培養物」は相互交換可能に用いること
ができ、これらの名称は総て子孫を包含する。したがっ
て、「形質転換体」または「形質転換された細胞」とは
、−次細胞およびトランスファーの回数とは関係なしに
その細胞に由来する培養物を包含する。また、総ての子
孫は、故意のまたは偶然の突然変異によりＤＮＡ含量が
正確には同一ではないことがあることも理解される。最
初に形質転換された細胞に置いてスクリーニングしたの
と同じ機能を有する変異体子孫も包含される。
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における作
用可能に連結されたコード配列の発現に必要なりＮＡ配
列を指す。原核生物に好適な制御配列は、例えばプロモ
ーター、任意にはオペレーター配列、リボゾーム結合部
位があるが、さらにその他の余り理解されていない配列
も包含することが可能である。真核細胞は、プロモータ
ー、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサ−を利用
することが知られている。
「発現系」という用語は、作用可能に連結された所望の
コード配列および制御配列を含むＤＮＡ配列を指し、こ
れらの配列で形質転換される宿主はコードされた蛋白質
を産生ずることができる。
形質転換を行うために、発現系をベクターに包含させて
もよいが、次に、関連のＤＮＡが宿主染色体に組み込ま
れてもよい。
本明細書で用いられる「遺伝子」という用語は、回収可
能な生物活性を有するポリペプチドまたは前駆体をコー
ド化するＤＮＡ配列を指す。このポリペプチドは、完全
な長さの遺伝子配列によりまたは酵素活性が保持されて
いるかぎりコード配列のいずれかの部分によってコード
されていてもよい。
「作用可能に連結した」という用語は、成分の正常な機
能を行うことができる併置を指す。例えば、ｔｌＪ？１
１配列に「作用可能に連結した」コード配列は、このコ
ード配列が制御配列のＩＩ　ｉｌｌ下で発現することが
できる配置を指す。
「非イオン性のポリマー性洗剤」とは、イオン性電荷を
持たず、本発明の目的には、約３．５〜約９．５のｐＨ
範囲、好ましくは４〜８．５のｐＨ範囲で酵素を安定化
することができることをコード化する、界面活性剤を指
す。
本明細書に用いられる「オリゴヌクレオチド」という用
語は、２個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはりボ
ヌクレオチド、好ましくは３個以上のものからなる分子
として定義される。その正確な大きさは多くのファクタ
ーによって異り、これらのファクターはオリゴヌクレオ
チドの最終的な機能または用途によって異る。オリゴヌ
クレオチドは、合成的にまたはクローニングによって誘
導することができる。
本明細書に用いられる「プライマー」という用語は、生
成された制限消化物中におけるように天然存在し、また
は合成的に製造されるオリゴヌクレオチドであって、核
酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成を誘発する
条件、すなわち、適当な緩衝液（「ｉｌｌ液液とはｐＨ
、イオン強度、コファクター等を包含する）中で、好適
な温度で４種の異なるヌクレオチドトリホスフェートと
熱安定酵素の存在の条件下に置くとき、合成の開始点と
して作用することができるものを指す。Ｔａｑポリメラ
ーゼについては、本明細書の緩衝液は、好ましくは１．
５〜２１１１Ｍのマグネシウム塩、好ましくはＭａＣＩ
ｌｇ　１１５０〜２００戸のそれぞれのヌクレオチドお
よび１州のそれぞれのプライマーを含有し、好ましくは
、５０＋ｎＭのＫＣｆｆと１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐ
Ｈ８〜８．４）および１００．ｈｇ／ｍ７のゼラチンを
含む。
このプライマーは、増幅において最大効率を得るには好
ましくは単一鎖であるが、二本鎖でもよい。二本鎖の場
合には、プライマーは最初に処理されて、伸長生成物を
調製するのに用いる前にそれらの鎖ごとに分離される。
好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレ
オチドである。
プライマーは十分に長く、熱安定酵素の存在で伸長生成
物の合成をプライムできるものでなければならない。プ
ライマーの正確な長さは、温度、プライマー由来および
方法用途のような多くのファクターによって変わる。例
えば、′目標とする配列の複雑さによっては、オリゴヌ
クレオチドプライマーは典型的には、１５〜２５ヌクレ
オチドを含むが、それより多くのまたはそれより少ない
ヌクレオチドを含むこともある。短いプライマー分子は
一般的には、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を
形成するには、低温が必要である。
これらのプライマーは、増幅されるそれぞれの特定の列
の異なる鎖に「実質的に」相補的になるように選択され
る。これは、それらのそれぞれの鎖とハイブリッド形成
するには十分に相補的でなければならないことを意味す
る。それ故、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映
する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグ
メントをプライマーの５′末端に結合させ、残りのプラ
イマー配列が鎖に対して相補的であるようにすることが
できる。また、プライマー配列が増幅される鎖の配列に
対して十分に相補的で、この鎖とハイブリッド形成する
ことによって、他のプライマーの伸長生成物の合成用の
鋳型となる場合には、非相補的塩基またはより長い配列
をプライマー中に含むことができる。しかしながら、検
出の目的には、詳細には標識した配列特異的プローブを
用いて検出するには、プライマーは典型的には正確な相
補性を有する場合に最高の結果が得られる。
本明細書に用いられる「制限エンドヌクレアーゼ」およ
び「制限酵素」という用語は、細菌酵素であって、それ
ぞれが特異的ヌクレオチド配列のまたはその付近の二重
ＩＮ　Ｄ　Ｎ　Ａを切断するものを指す。
本明細書に用いられるｒＤＮＡ多形」という用語は、２
種以上の異なるヌクレオチド配列がＤＮＡの特定の部位
に存在することができる状態を指す。
本明細書に用いられる「ヌクレオチド配列の変化」とい
う用語は、ある種の単一または複数のヌクレオチド置換
、欠失または挿入を指す。これらのヌクレオチド変化は
、突然変異または多形性対立遺伝子変異であることもあ
る。それ故、本明細書に用いられる方法は、単一塩基の
変異、付加または欠失によって起こされるβ−グロブリ
ン遺伝症（ある種のβ−サラセミア、鐘状赤血球貧血、
ヘモグロビンＣ症なと）において起こるような核酸での
単一ヌクレオチド変化を検出することもでき、またα−
サラセミアまたはある種のβ−サラセミアに包含される
ような多数塩基変異を検出することもできる。更に、本
発明の方法は病気に必然的には関連せず、集団中の核酸
の特定の部位、例えばヒトゲノム及びランダム多形例え
ばミトコンドリアＤＮＡのＨＬ　Ａ　ａ域に単に（置換
された、欠失されたまたは挿入されたヌクレオチド塩基
対のような）２種以上の異なるヌクレオチド配列が存在
するような状態である多形を検出することができる。以
下に詳細に記載する多形配列に特異的なオリゴヌクレオ
チドプローブは、インシュリン依存性の糖尿病メリトゥ
ス（ｍｅｌｌｉｔｕｓ）のような病気に関連した遺伝的
マーカーを検出するのに使用され、または法医学の応用
に用いることもできる。核酸が二本鎖である時には、配
列中のヌクレオチド変化は配列の塩基対変化になる。
「配列特異的オリゴヌクレオチド」という用語は、対立
遺伝子に含まれるまたは含まれない特定の配列にハイブ
リッド形成するオリゴヌクレオチドを指し、これらの配
列は検出される塩基対変化を含み、そして検出される配
列変異に特異的である。分析される配列によっては、１
種以上の配列特異的ヌクレオチドをそれぞれの配列に対
して、以下に更に記載のように用いることもできる。
本明細書に用いられる［制限フラグメント長さ多形Ｊ　
（ＲＦＬＰ）という用語は、特定の制限エンドヌクレア
ーゼで消化することによって形成される制限フラグメン
トの長さの個体間の差を指す。
本明細書に用いられる「熱安定酵素」という用語は、熱
に安定であり、耐熱性を有し、それぞれの核酸鎖に相補
的であるプライマー伸長生成物を形成する適当な方法で
ヌクレオチドの結合を触媒（促進）する酵素を意味する
。一般的には、合成はそれぞれのプライマーの３′末端
で開始され、合成が終結するまで鋳型鎖に沿って５′方
向に進行し、異なる長さの分子を産生ずる。しかしなが
ら、５′末端で合成を開始し、上記と同様な工程を用い
て、他の方向に進む熱安定酵素もある。
本明細書に用いられる熱安定酵素は、増幅反応に効果的
であるという唯一の規準を満たすものでなければならず
、すなわち、酵素は、二本鎖核酸の変性を行うのに必要
な時間高温に付す時に、不可逆的に変性（不活性化）す
るものであってはならない。この場合の不可逆的変性と
は、酵素活性を永久に且つ完全に喪失することを意味す
る。変性に必要な加熱条件は、例えば緩衝液の塩濃度、
変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成によって
変わるが、典型的には、約９０〜約１０５℃の範囲であ
り、時間については主として温度および核酸の長さによ
って変わり、典型的には約０．５〜４分間である。緩衝
液の塩濃度および／または核酸のＧＣ組成が増加すると
、更に高温を用いることもできる。好ましくは、酵素は
約９０〜１００℃で不可逆的に変性しない。
本明細書に用いられる熱安定酵素は、好ましくはその酵
素が機能する最適温度は約４０℃よりも高く、鋳型への
プライマーのハイブリダイゼーションが促進される温度
よりも低い温度であるが、（ｉ）マグネシウムおよび塩
濃度および（２）プライマーの組成および長さによって
は、ハイブリダイゼーションは更に高い温度（例えば４
５〜７０℃）で起こることができる。酵素にとっての最
適温度が高くなれば、プライマー関連の伸長法の特異性
および／または選択性は大きくなる。しかしながら、４
０℃未満（例えば３７℃）で活性な酵素も、熱に安定で
あるかぎり、本発明の範囲内に含まれる。好ましくは、
最適温度は約５０〜９０’Ｃであり、更に好ましくは６
０〜８０℃である。
本明細書に用いられる熱安定酵素は、如何なる由来から
得ることもでき、天然または組換え蛋白質であってもよ
い。耐熱性を有するものとして文献に報告されている酵
素の例は、熱に安定なポリメラーゼ、例えば好熱菌のテ
ルムス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ｆｌａｖｕｓ）
　、テルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　…
肛敗餅ｕ旦）　、バシルス・ステアロテルモフィＪＬス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｔ匹匹■肛匹戸旦■）（他の
文献に報告されているものよりも皇分低い最適温度を有
する）、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　
姐坦旦匹旦、テルムス・ラフテラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　
　１ａｃｔｅｕｓ）テルムス・ルーベンス（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓｒｕｂｅｎｓ）　、およびメタノテルムス・フエル
ビドゥス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｗｕｓ　　ｆｅｒｖ
ｉｄｕｓ）から抽出されたポリメラーゼがある。
本明細書に用いられる好ましい熱安定酵素は、テルムス
・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　７カら単離された
ＤＮＡポリメラーゼである。その各種の株も、アメリカ
ン・タイプ・カルチャ・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
）ロックビル、メリーランド、から入手することができ
、ティ・ディ’ブロック　（Ｔ、Ｄ、Ｂｒｏｃｋ）、Ｊ
、Ｂａｃｔ。
（ｉ９６９年）、９８巻、２８９〜２９７頁、およびテ
ィ・オシマ（Ｔ、Ｏｓｈｉｍａ）、八ｒｃｈ、　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、、（ｉ９７８年）、１１７巻、１８９〜
１９６頁に記載されている。これらの好ましい菌株の一
つは、ＹＴ−１株である。
天然タンパク質を回収するためには、細胞を適当な技術
を用いて増殖させる。この様な技術は、カルジン（にａ
ｌｅｄｉｎ）ら、＄、（ｉ９８０年）同上、に記載され
ている。簡単に言えば、ｌリットルに、ニトリロトリ酢
酸（ｉ００■）、トリプトン（３ｇ）酵母抽出液（３ｇ
）、コハク酸（５ｇ）、亜硫酸ナトリウム（５０■）、
リボフラビン（ｉｍｇ）　、ＫｚＨＰＯａ（５２２ｍｇ
）　、ＭｇＳＯ４（４８０ｍｇ）　、ＣａＣｊ！　ｚ（
２２２ｍｇ）、Ｎａ（Ｊ！　　（２０ｍｇ）　、および
痕跡量の元素を含む培地上で細胞を増殖させる。培地の
ｐＨは、Ｋｏｌｌで８．０±０．２に調整している。７
０℃の温度で激しく通気しながら、細胞１リツトルに対
して２０ｇまで培養すると、収量は増加する。後期対数
増殖期における細胞（５５０ｎｍでの吸収により測定）
を遠心分離によって集めて、緩衝液で洗浄し、−２０℃
に凍結保存した。
チェノ（ｃｈ　１ｅｎ）ら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、　、１９７６年、同上、による細胞を生育させるもう
一つの方法では、０．１■／１のビオチンを補填した０
、　３％のグルタミン酸、０．１■／ｌチアミンおよび
０．０５■／ｌのニコチン酸を含む定義された無機塩培
地が用いられる。これらの塩にはニトリロトリ酢酸、Ｃ
ａＳＯａｌＭｇＳＯａ、ＮａＣ！！、　ＫＮＯｓ　、　
ＮａＮ０ｉ、ＺｎＳＯ４，ＨＪＯａ。
ＣｕＳＯ４，Ｎａ１ｌｏＯｎ、　ＣｏＣｌ！　！＋　Ｆ
ｅＣＩ！、、　ＭｎＳＯ４、およびＮａ１ｌｏＯｎがあ
る。培地のｐＨはＮａＯＨで８．０に調整している。
チェノ（ｃｈｉｅｎ）らの方法では、細胞は最初は７５
℃で水浴シェーカー中で増殖させる。一定の濃度に達し
たなら、これらの細胞１リツトルを、熱風インキュベー
ターに入れである１６リツトルのカーボーイ　（ｃａｒ
ｂｏｙｓ）に移す。無菌空気を培養液中に通して、温度
を７５℃に維持する。細胞を２０時間増殖させた後、遠
心分離によって回収する。
細胞の増殖の後、酵素の単離および生成を６段階で行い
、それぞれの段階は室温より低い温度、好ましくは約４
℃で行う。
第一の段階または工程では、細胞が、凍結している場合
には、解凍し、超音波で破砕し、ｐＨが約７．５の緩衝
液に懸濁する。
第二の段階では上澄液を集めて、次いで乾燥硫酸アンモ
ニウムのような塩を加えることによって分別する。適当
な画分く典型的には、４５〜７５％飽和）を集めて、０
．２リン酸カリウム緩衝液、好ましくはｐＨ６，５の緩
１１液に溶解して、同じ緩衝液に対して透析する。
第三の段階では、核酸及びある種の蛋白質を取り除く。
第二の段階からの両分を、上記と同じ緩衝液で平衡化し
たＤＥＡＥ−セルロースカラムにかける。次いで、この
カラムを同じ緩衝液で洗浄し、蛋白質含有画分を溶出し
、２８０ｎｍでの吸収によって測定し、集めて、１０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液に対して、好ましくは第一の緩
衝液でｐｔｔを７．５にしたものと同じ成分を有するも
ので透析する。
第四の段階では、上記のようにして集めた分画を、第三
の段階で透析に用いた緩衝液で平衡にしたヒドロキシア
パタイトカラムにかける。次いで、このカラムを洗浄し
、１０ｍＭの２−メルカプトエタノールと５％のグリセ
リンを含むｐＨ７，５の０．０１Ｍ−０，５Ｍリン酸カ
リウム緩衝液の直線グラジェントで酵素を溶出する。プ
ールした熱安定酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）活性
を含む両分を、第三の段階で透析に使用したのと同じ緩
衝液で透析する。
第五の段階では、透析した画分を、第三の段階で透析に
使用した緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラ
ムにかける。このカラムを次に洗浄し、第三の段階で透
析に使用した緩衝液中で０．０１〜０．６ＭのＫＣＡの
ような緩衝液の直線グラジェントで、酵素を溶出する。
熱安定酵素の活性を有する両分を、適当な方法を用いて
デオキシリボヌクレアーゼ（エンド−およびエキソヌク
レアーゼ）の混入について試験した。例えば、エンドヌ
クレアーゼ活性は、過剰のＤＮＡポリメラーゼと共にイ
ンキュベートした後ファージλＤＮＡまたはスーパーコ
イルプラスミドＤ　Ｎ　Ａの分子量の変化から、電気泳
動によって測定することができる。同様に、エキソヌク
レアーゼ活性は、数個の部位で開裂する制限酵素を用い
て処理した後、ＤＮＡの分子量の変化から電気泳動によ
って測定することができる。
デオキシリボヌクレアーゼ活性を持たないと決定された
両分をプールして、第三の段階で用いたのと同じ緩衝液
で透析する。
第六の段階では、プールした両分を、一定のペッドポリ
ウムを有するホスホセルロースカラムに入れる。このカ
ラムを洗浄して、ｐＨ７，５でリン酸カリウム緩衝液中
０．０１〜０．４ＭのＫＣｌのような緩衝液の直線グラ
ジェントで酵素を溶出する。熱安定なポリメラーゼ活性
を有し、デオキシリボヌクレアーゼ活性を有しないプー
ルした両分を、ｐＨ８，０の緩衝液で透析する。
透析した生成物の分子量は、蛋白質分子量マーカーを用
いてＳＤＳ　ＰＡＧＥによる方法等によって決定するこ
とができる。好ましい酵素の一つであるテルムス・アク
アチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　７カラ精製されたＤＮＡ
ポリメラーゼの分子量は、上記方法によって、約８６．
０００〜９０．０００ドルトンと決定される。
本発明の熱安定酵素は、この酵素をコードする遺伝子が
テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　姐Ｌａｔ
ｉｃｕｓ）ゲノムＤＮＡからクローン化されたとき、組
換えＤＮＡ技術によって産生させることもできる。テル
ムス・アクアチクス（Ｔａｑ）ポリメラーゼについての
完全なコード配列は、約１８ｋｂ（キロベース）のゲノ
ムＤＮＡインサートフラグメント内に含まれる約３．５
ｋｂのＢ　ｇｌ　ＩＩ　−Ａｓｐ７１８（部分）制限フ
ラグメント上バタテリオファージＣＨ３５：Ｔａｑ＃　
４−２から誘導することができる。このバタテリオファ
ージは、１９８７年５月２９日にアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、寄
託番号筒４０，３３６号を有する。また、この遺伝子は
、プラスミドｐＦＣ８３（ＡＴＣＣ第６７　、４２２号
、１９８７年５月２９日寄託）から単離された約７５０
塩基対（ｂｐ）のＢｇｌ　ＩＩ　−Ｈｉｎｄ　ｍ制限フ
ラグメントを、プラスミドｐＦＣ８５（ＡＴＣＣ第６７
．４２１号、１９８７年５月２９日寄託）から単離され
た約２．８　ｋｂＨｉｎｄ　ｍ　−Ａｓｐ７１８制限フ
ラグメントに連結することによって造成することができ
る。　ｐＦＣ８３制限フラグメントはＴａｑポリメラー
ゼ遺伝子のアミノ末端を有するが、ｐＦＣ８５からの制
限フラグメントはカルボキシ−末端を有する。したがっ
て、これらの２個のフラグメントを、適当な制御配列を
有する対応して消化されたベクターと連結すると、全長
Ｔａｑポリメラーゼの翻訳が得られる。
Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子の全コード配列は、所望の酵
素活性を有する生物学的に活性な遺伝子生成物を回収す
ることを必要としないことも見出された。アミノ末端の
欠失であって、コード配列の約３分の１が不在であるも
のが、ポリメラーゼ分析において完全に活性な遺伝子生
成物を産生じた。
Ｎ−末端の欠失に加えて、Ｔａｑポリメラーゼを構成す
るペプチド鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、
またはその他の誘導体化によって改変することができ、
そしてこの蛋白質を開裂して、活性を保持するフラグメ
ントを得ることができる。
活性を破壊しないかかる変更は、遺伝子の定義から上記
蛋白質をコードするＤＮＡ配列を除外しない。
したがって、翻訳の間に配列に組み込まれるアミノ酸の
欠失、付加または変更による一次構造自体の改変は、蛋
白質の活性を破壊、することなく行うことができる。か
かる置換またはその他の変更は、本発明の予想された範
囲内にあるＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列を
有する蛋白質をもたらす。
本発明の精製された８６　、０００〜９０．０００ドル
トンのポリメラーゼで免疫したウサギからのポリクロー
ナル抗血清を用いて、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅ
ｒｍｕｓ　　Ｂ互Ｉ担四搬−の部分ゲノム発現ライブラ
リーをプローブして、下記のようにして適当なコード配
列を得た。クローン化されたゲノム配列は融合ポリペプ
チドとして発現させたり、それ自体の制御配列を用いて
直接に発現させたり、または酵素の発現に用いられる特
定の宿主に好適な制御配列を用いる構成によって発現さ
せることができる。
勿論、これらの配列をコードするＤＮＡ入手可能性は、
コドン配列を改変してＤＮＡポリメラーゼ活性をも有す
るムティン（ｍｕｔｅｉｎ）形を生じるようにする機会
を提供する。
例えば、これらの手段は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの
ための完全なコード配列を提供して、これから、各種の
宿主系に通用できるものを発現ベクター構成し、そして
コード配列を発現することができる。
以上のことから、Ｔａｑポリメラーゼコード配列の部分
はプローブとして有用であり、色々な種のその他の熱安
定ポリメラーゼコード配列を回収するためのプローブと
して有用であることも明らかである。したがって、少な
くとも６個のアミノ酸をコードするゲノムＤＮＡの部分
をＥ、コリ　（Ｌ延）において複製することができ、そ
して少なくとも６個のアミノ酸をコード化し且つ熱安定
ポリメラーゼをコード化するその他のＤＮＡを回収する
ために使用されるプローブまたはオリゴデオキシリボヌ
クレオチドプローブとして用いられる変形した形態のも
のを合成することができる。テルムス・アクアチクス（
Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ｕ川り几亜）におけるヌクレアーゼ
配列とその他の種類の対応する部分の配列は正確には一
致しないことがあるので、（６個のアミノ酸ストレッチ
をコードする）約１８個のヌクレオチドを有するオリゴ
マーは、恐ら（、間違った陽性を排除するのに十分なス
トリンジエンシー条件下でハイブリダイゼーションを行
うのに必要であろう。６個のアミノをコードする配列は
、かかるプローブに十分な情報を供給するであろう。
゛な　　、−′二および　゛ 一般的な言い方では、組換え形のＴａｑポリメラーゼの
製造は、以下のような工程を含む。
第一に、成熟酵素（この場合、総てのムティンを含むよ
うに用いられる）、あるいはＴａｑポリメラーゼとその
活性を破壊しない追加の配列との融合体または制御され
た条件下で（例えば、ペプチドでの処理によるような）
の開裂して他の蛋白質をもたらすことができる追加の配
列との融合体をコード化するＤＮＡを得る。配列がイン
トロンによって中断されていないときには、それは如何
なる宿主における発現にも好適である。この配列は、切
り出し可能で且つ回収可能な形であるべきである。
次に、好ましくは、切り出されたまたは回収されたコー
ド配列を、複製可能な発現ベクター中の好適な制御配列
と作用可能に連結する。このベクターを用いて、好適な
宿主を形質転換し、形質転換された宿主を好ましい条件
下で培養して、組替えＴａｑポリメラーゼを産生させる
。任意には、Ｔａｑポリメラーゼを培養液または細胞か
ら単離するが、ある種の不純物が許容される場合には、
蛋白質の回収および精製は必要でないこともある。
上記の段階のそれぞれは、各種の方法で行うことができ
る。例えば、所望のコード配列をゲノムフラグメントか
ら得て、適当な宿主に直接用いることもできる。各１の
宿主で作用可能な発現ベクターの造成は、以下のような
適当なレプリコンを用いて行なわれる。好適な制確部位
は、通常は利用可能でない場合には、コード配列の末端
に加えて切り出し可能な遺伝子を得、これらのベクター
に抽入することができる。
制御配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子を
発現するのに用いられる宿主細胞の型によって異る。一
般的には、原核細胞、酵母、昆虫または咄乳類細胞が、
宿主として現在有用である。
原核宿主は、一般的には組換え蛋白質の産生にとって最
も有効で好都合であり、それ故Ｔａｑポリメラーゼの発
現にとって好ましい。
Ｔ　ａ　ｑポリメラーゼの特定の場合には、組換え条件
下および自然条件下のいずれにおいても、蛋白質のＮ−
末端でかなり欠失が起こり、そして蛋白質の活性はなお
保持されたままであることを示す証拠が存在する。単離
された天然蛋白質は、蛋白質分解によ゛る減成の結果で
あり、不完全な遺伝子の翻訳の結果ではない。プラスミ
ドｐＦＣ８５の不完全な遺伝子から産生されたムティン
は、しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼの分析で完全な
長さを有する配列をコード化するＤＮＡから産生された
ムティンと同様に、完全に活性である。ある種のＮ末端
が短縮された形は活性であることが明らかであるので、
用いられる遺伝子構成またはポリメラーゼの発現も、対
応する短縮された形状のコード配列を有することがある
。
、ド装置および、応する　′ 原核生物は、最も一般的には、Ｅ、コリ　（Ｅ。
ｃｏｌｉ）の各種株によって代表される。しかしながら
、バシルス属、例えばバシルス・ズブチリス１：Ｂａｃ
ｉｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、各種のシュドモナス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）またはその他の菌株のような
他の微生物株を用いることもできる。かかる原核系では
、宿主と適合性の種に由来する複製部位と制御配列を有
するプラスミドベクターが用いられる。
例えば、Ｅ、コリ　（旦エ　匹旦）は、典型的には、ポ
リバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら、Ｇｅｎｅ、１９７７年、
２巻、９５頁によるＥ、コリ　（Ｌｃｏｌｔ）種に由来
するプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形
質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテト
ラサイクリン耐性の遺伝子を有し、所望のベクターを造
成する際に保持されまたは破壊される付加的マーカーを
提供する。転写開始を促進し、任意にはオペレーターを
有し且つリボゾーム結合部位配列を有する本明細書記載
の一般的に用いられる原核制御配列には、β−ラクタマ
ーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｉａ　ｃ）
プロモーター系〔チャン（ｃｈａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒ
ｅ　（ｉ９７７年）１９８巻、１０５６頁〕、トリプト
ファン（ｔｒｐ）プロモーター系〔ゲーデル（Ｇｏｅｄ
ｄｅｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
（ｉ９８０年）８巻、４０５７頁〕、およびλ由来のＰ
Ｌプロモーター〔シマタケ（Ｓｈ　ｉ＋ｗａ　ｔａｋｅ
）ら、Ｎａｔｕｒｅ　（ｉ９８１年）２９２巻、１２８
頁〕および輸送可能な制御カセ−／　）として有用なＮ
−遺伝子リボゾーム結合部位があり、これはポータプル
制御力セントとして有用にされており、このものは、Ｎ
、ｌ、、配列の６ｂｐ３’内での開裂を可能にする少な
くとも１個の制限部位を有する第三のＤＮＡ配列のＮＲ
ＢＳ上流に対応する第二のＤＮＡ配列に操作可能に連結
したＰ、プロモーターである第−ＤＮＡ配列を含んで成
る。
チャン（ｃｈａｎｇ）らの欧州特許出願公開第１９６，
８６４号明細書（ｉ９８６年１０月８日発行）に記載さ
れ、同じ承継人に承継されたホスファターゼＡ　（ｐｈ
ｏＡ）系も有用である。しかしながら、原核生物に適合
性の如何なる利用可能なプロモーターも用いることがで
きる。
細菌に加えて、酵母のような真核微生物も宿主として用
いることができる。サツカロミセス・セレヒシアエ□部
立匹人肛旦ν旦螢−房猛艶１護旦ｅ）ｃＤ実９室菌株で
あるパン酵母が最も多く用いられるが、その他の多くの
菌株も−ｆＱ的に利用可能である。
２ミクロン複製開始点用いるベクターが示されているが
（ブローチ、ジェイ、アール（Ｂｒｏａｃｈ。
Ｊ、Ｒ，）　、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、（ｉ９８３年）１０
１巻、３０７頁〕、酵母の発現に好適な他のプラスミド
ベクターも知られている〔例えば、スチンクコンブ（Ｓ
　ｔ　ｉ　ｎｃｈｃｏｍｂ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　（ｉ９
７９年）２８２巻、３９頁、チェンペ（Ｔｓｃｈｅｍｐ
ｅ）ら、Ｇｅｎｅ　（ｉ９８０年）１０巻、１５７頁お
よびクラーク（ｃ１ａｒｋｅ）　　ら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎ
ｚ、　（ｉ９８３年）１０１巻、３００頁を参照された
い〕。酵母ベクターに対する制御配列は、解糖酵素の合
成のプロモーターを有するＬヘス（Ｈｅｓｓ）　ら、２
Ｌ人む−シＶ刃駐−均」。
（ｉ９６８年）７巻、１４９頁、ホランド（ｌｌｏｌｌ
ａｎｄ）ら、ｌし１四１ル１」ひ−（ｉ９７８年）１７
巻、４９００頁〕。
その他の当業界に知られているプロモーターには、３−
ホスフィングリセレート・キナーゼ（ヒフツエ７ン（Ｈ
ｉ　ｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　（
ｉ９８０年）２５５巻、２０７３頁）およびその他の解
Ｉｌ！酵素、例えばグリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート
・デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コース−６−ホスフェート・イソメラーゼ、３−ホスホ
グリセレート・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、トリ
オセホスフエート・イソメラーゼ、ホスホグルコースイ
ソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターがある
。増殖条件により制御される追加の利点を有するその他
のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イ
ソチトクロームＣ１酸性ホスフプターゼ、窒素代謝に関
係する分解酵素およびマルトースおよびガラクトース利
用に関する酵素のプロモーターである（ホランド（Ｈｏ
ｌＬａｎｄ）同上〕。
ターミネータ−配列は、コード配列の３′末端において
望ましいと思われる。かかるターミネータ−は、酵母由
来の遺伝子におけるコード配列に続く３′非翻訳領域に
見出される。示されたベクターの多くはプラスミドｐｅ
ｎｏ４６を有するエノラーゼ遺伝子〔ホランド（Ｈｏｌ
ｌａｎｄ、Ｍ、Ｊ、）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、　　（ｉ９８１年）２５６巻、１３８５頁〕
またはＹＥｐ１３から得られるしＥＵ２遺伝子〔ブロー
チ（Ｂｒｏａｃｈ　、　Ｊ　、　）ら、むｎｅ　（ｉ９
７８年）８巻、１２１頁）から誘導される制御配列を有
するが、酵母適合性プロモーター、複製開始点およびた
の制御配列を有する如何なるベクターも好適である。
勿論、多細胞生物に由来する真核宿主細胞培養液におい
てポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることも
可能である。例えば、Ｔｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　％
アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
）、グルコ（ｃｒｕｚ）とパターリン（Ｐａ　ｔ　ｔｅ
ｒｓｏｎ）監修（ｉ９７３年）を参照されたい。有用な
宿主細胞系には、ネズミミエローマＮ５Ｌ　ＶＥＲＯお
よび）ｌｅｌａ細胞、およびテンジクネズミ卯巣（ｃＨ
Ｏ）＆Ｉ胞がある。
これらの細胞の発現ベクターは、通常は、シミアンウィ
ルス４０　（ＳＶ４０）からの一般的に用いられる早期
および後期プロモーター（フィールス（Ｆｉｅｒｓ）ら
、Ｎａｔｕｒｅ　（ｉ９７８年）２７３巻、１１３頁）
、またはポリオーマ、アデノウィルス２、つ゛シパピロ
ーマウイルスまたはトリザルコーマウィルスに由来する
ようなプロモーター、または免疫グロブリンプロモータ
ーおよび熱シヨツクプロモーターのような哺乳類細胞に
適合性のプロモーターおよび制御配列を有する。ＢＰＶ
をベクターとして用いる哺乳類系におけるＤＮＡ発現系
は、米国特許第４．４１９，４４６号明細書に開示され
ている。この系の変形は、米国特許第４，６０１，９７
８号明細書に記載されている。哺乳類細胞系の形質転換
の一般的態様は、米国特許第４．３９９，２１６号明細
書に記載されている。「エンハンサ−」領域が、最適な
発現において重要であると思われるが、これらの領域は
一般的にはプロモーター領域の上流に見出される配列で
ある。−所望であるならば、複製開始点をウィルス源か
ら得ることができる。しかしながら、染色体への組み込
みは、真核生物でのＤＮＡ複製では一般的な機構である
。
植物細胞も宿主として利用可能であり、植物細胞に適合
する制御配列、例えばツバリン・シンターゼ・プロモー
ターおよびポリアデニル化シグナル配列（デビソカー（
Ｄｅｐｉｃｋｅｒ、　Ａ、）ら、Ｊ、Ｍｏｌ。
担」上、αじ−（ｉ９８２年）１巻、５６１頁）が利用
できる。
更に、最近では、バクロウィルス・ベクターによって提
供される制御系を利用する昆虫細胞を用いた発現系も報
告されている〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ。
Ｄ、Ｗ、）　ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉ
ｎ　　（ｉ９８６年）　、（！ドロウ（Ｓｅｔｌｏｈ、
　Ｊ、に、）ら監修、プレナム・パブリッシング（Ｐｌ
ｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、８巻、２７７〜２
９７頁〕。これらの系はＴａｑポリメラーゼの産生にも
成功している。
彫１転換 用いる宿主細胞に依存して、形質転換はその細胞に適当
な標準的な技術を用いて行なわれる。塩化カルシウムを
用いるカルシウム処理（コーヘン（ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、
　Ｎ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　
（ＵＳＡ）　（ｉ９７２年）６９巻、２１１０頁）は、
原核生物またはその他の実質的な細胞障壁を有する細胞
に用いられる。アグロバクテリウム・チュメファシエン
ス（八ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）での感染〔シアウ（Ｓｈａｗ、Ｃ，Ｈ，）　　ら、
Ｇｅｎｅ　（ｉ９８３年）２３巻、３１５頁〕は、ある
種の植物細胞で用いられる。上記のような細胞壁を持た
ない哺乳類細胞では、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）とヴア
ン・デル・ニブ（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）のリン酸カル
シウム沈澱法が好ましいＣＶｉｒｏｌｏ■（ｉ９７８年
）５２巻、５４６頁〕。酵母への形質転換は、ヴアン・
ゾリンゲン（ＶａｎＳｏｌｉｎｇｅｎ、　Ｐ、）ら（Ｊ
、Ｂａｃｔ、、１９７７年、１３０巻、９４６頁）およ
びシアオ（ｌｌｓｉａｏ。
Ｃ，Ｌ、）　ら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、（［ｌ５Ａ）、１９７９年、７６巻、３８２９頁
）の方法によって行なわれる。
λ　ｔｌｌ　　　−イフ゛ラリ−の゛告所望の蛋白質を
コードするＤＮＡ、例えばＴａｑポリメラーゼをコード
するＤＮＡをバクテリオファージλｇｔｌｌを用いて単
離する方法は、次の通りである。ライブラリーは、テル
ムス・アクアチクス（田肛肌し赳旦Ｕ匹１ＤＮＡの完全
な消化によって生じ、λｇｔｌｌファージのＥｃｏＲ１
部位に挿入されたＥｃｏＲ１部位を両端に有するＡｌｕ
ｌフラグメントから構成され得る〔ヤング（Ｙｏｕｎｇ
）とデービス（Ｄａｖ　ｉｓ）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
口、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　１９８３年、８
０巻、１１９４〜１１９８頁〕。このバクテリオファー
ジ中のユニークＥｃｏＲ１部位がβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子のカルボキシ末端に配置しているので、（適当な
フレームおよび方向で）挿入されたＤＮＡは、ラクトー
スオペロンプロモーター／オペレーターの制御下でβ−
ガラクトシダーゼと融合した蛋白質として発現される。
ゲノム発現ライブラリーを次に抗体プラークハイブリダ
イゼーション法を用いてスクリーニングする。この方法
は「エピトープ選択」と呼ばれ、このファージによって
コードされた融合蛋白質配列に対する抗血清を用いてハ
イブリッド形成したプラークを同定するものである。例
えば、この組換えファージのライブラリーは、８６．０
００〜９０．０００ドルトンのＴａｑポリメラーゼを認
識する抗体を用いてスクリーニングして、この蛋白質の
抗原決定基をコードするＤＮＡセグメントを有するファ
ージを同定することができる。
約２Ｘ１０’個の組換えファージを、全ウサギＴａｑポ
リメラーゼ抗血清を用いてスクリーニングする。この−
次スクリーニングでは、陽性シグナルが検出され、これ
らのプラークの１種以上が、免疫前血清と反応せず且つ
免疫血清と反応する候補プラークから精製され、幾分詳
細に分析される。
組換えファージによって産生される融合蛋白質を検査す
るため、宿主Ｙ　１０８９におけるファージの溶原株を
得る。溶原株を誘発し、生成する蛋白質をゲル電気泳動
した後、それぞれの溶原株が他の溶原株には見られない
新たな蛋白質を産生ずるのを観察することができ、また
は重複配列が生じることもある。陽性シグナルを有する
ファクターを取り出す。ここに記載する例においては陽
性プラークを取り出して更に同定を行ない、低密度で再
プレートして組換体を純化し、純化したクローンをＥｃ
ｏＲＩ制限酵素での消化によるサイズクラスによって分
析した。次に、プローブを単離されたＤＮＡ挿入配列か
ら作り、適当に標識を行い、そしてこれらのプローブを
マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ
ａｎｕａｌ。
１９８２年に記載されている通常のプラークハイブリダ
イゼーション又はコロニーハイブリダイゼーション分析
法に用いることができる。
標識したプローブを用いて、シャロン（ｃｈａｒｏｎ）
３５バクテリオフアージ中に構成された第二のゲノムラ
イブラリーをプローブした（ウイルヘルマイン（Ｗｉ　
ｌｈｅｌｍｉｎｅ、　Ａ、Ｍ、）ら、Ｇｅｎｅ、１９８
３年、２６巻、１７１〜１７９頁）、このライブラリー
は、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　靭閃
旦匹１ゲノムＤＮＡのＳ　ａｕ３＾部分消化によって作
られ、そしてサイズ分別したフラグメント（ｉ５〜２０
ｋｂ）をシャロン３５フアージのＢａｇ旧部位にクロー
ン化した。
このプローブを用いて、Ｔａｑポリ゛メラーゼをコード
するＤＮＡを含むファージを単離した。ＣＨ３５：Ｔａ
ｑ＃４２と命名した生成するファージの一つは、全遺伝
子配列を有することが判明した。この遺伝子の部分をコ
ードする部分配列も単離された。
丘久叉二度遣威 所望のコード配列および制御配列を含有する好適なベク
ターの造成は、当業界で周知の標準的な連結および制限
技術を用いる。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列または
合成されたオリゴヌクレオチドを開裂し、ととのえ、そ
して再連結して所望の形状にする。
部位特異的ＤＮＡ開裂は、当業界で周知の条件下で好適
な（ｉ種以上の）制限酵素を用いて処理することによっ
て行ない、その詳細はこれらの市販の制限酵素の製造業
者によって記載されている。
例えば、ニュー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、製品カタログを
参照されたい。一般的には、約１ｎのプラスミドまたは
ＤＮＡ配列を、約２０ｄの緩衝溶液中で１単位の酵素で
開裂し、本明細書の実施例では、典型的には、過剰量の
制限酵素を用いてＤＮＡ基質を完全に消化するようにし
ている。約３７℃で約１〜２時間のインキュベーション
時間が有効であるが、変更を行なうこともできる。それ
ぞれのインキュベーションの後に、蛋白質をフェノール
／クロロホルムで抽出して、次いでエーテル抽出を行な
うことによって除去して、核酸を水性分画からエタノー
ル沈澱によって回収することができる。所望ならば、開
裂フラグメントのサイズ分離を、標準的技術を用いるポ
リアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動に
よって行なうことができる。サイズ分離の一般的説明に
ついては、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
、　１９８０年、６５巻、４９９〜５６０頁に記載され
ている。
制限開裂したフラグメントを、５０ｍＭのトリス、ｐＨ
７，６，５０ｎ＋ＭのＮａＣｌ！、１０ｍＭのＭｇＣｌ
　ｚ　、１０ｍＭのＤＴＴおよび５０〜１００禮のｄＮ
ＴＰｓ中で、２０〜２５℃で約１５〜２５分間のインキ
ュベーション時間を用いて、４種類のデオキシヌクレオ
チドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在でＥ、コリ（
Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　（フレノ
ウ　（にＩｅｎｏｗ））の大フラグメントで処理するこ
とによって平滑末端にすることができる。フレノウフラ
グメントは５′接着末端をフィルインするが、４種のｄ
ＮＴＰｓが存在していても、突出する３′単一鎖をチュ
ーバック（ｃｈｅｗｓｂａｃｋ）する。所望ならば、接
着末端の性状によって指定される制限内で唯１種のまた
は選択された複数のｄＮＴＰｓを供給することによって
選択的修復を行なうことができる。フレノウで処理した
後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出シ、エタ
ノールで沈澱させた。適当な条件下で８１ヌクレアーゼ
を用いて処理すると、単一鎖部分の加水分解が起こる。
合成オリゴヌクレオチドは、マテウチ（Ｍａｔｔｅ−ｕ
ｃｃｉ）ら（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９８１
年、１０３巻、３１８５〜３１９１頁）のトリエステル
法を用いて、または自動合成法を用いて調製することが
できる。アニーリングの前のまたは標識のための単一鎖
のキナーゼ処理は、５０ＩＩＩＭノドリス、ｐＨ７，６
，１０ｍＭのＭｇＣｌ２．５ＩＩＩＭノシチオスレイト
ール、１〜２ｍＭのＡＴＰの存在下で、１ｎＭの基質に
対して過剰量の、例えば約１０単位のポリヌクレオチド
キナーゼを用いて行なう。このキナーゼ処理がプローブ
の標識するためのものであるときには、ＡＴＰは高比活
性のγ−ｆｆ！ｐを有する。
連結は、下記の標準的条件及び温度で１５〜３０Ｉの容
積で行なう。２０　ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ、　（ｐＨ
７，５、）１０ｍＭ　ＭｇＣ１！Ｚ　、１０ｍＭ　ＤＴ
Ｔ、　３３ｎ／　ｌｌｌ７ＢＳＡ、　１０ｍＭ〜５０ｍ
ＭのＮａＣ１％および（「接着末端」の連結には）４０
−のＡＴＰ　、　０．０１〜０．０２　（ワイス（Ｗｅ
ｉｓｓ）　）単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ、０℃；または
（「平滑末端」の連結ニハ）　　１ｍＭ（７）ＡＴＰ　
、　０．３〜０．６　　（ワイス（Ｗｅｉｓｓ））単位
のＴ４ＤＮ＾リガーゼ、１４℃。分子内「粘着末端」連
結は、通常は３３〜１００鱈／−の総Ｄ　Ｎ　Ａ　ｉ３
度（５〜１１００ｎの総末端濃度）で行なう。分子間平
滑末端連結（通常は１０〜３０倍の過剰モルのリンカ−
を用いる）は、１オの総末端濃度で行なう。
「ベクターフラグメント」を用いるベクターの造成では
、ベクターフラグメントを通常は細菌性アルカリホスフ
ァターゼ（Ｂ　Ａ　Ｐ）で処理して５′ホスフエートを
除去して、ベクターの再連結を防止する。ＢＡＰ消化は
、ｐＨ８で、約１５０ｍＭのトリス中で、Ｎａ”および
Ｍｇ＋２の存在で、ベクター１■当たり約１単位のＢＡ
Ｐを用いて、６０℃で約１時間行なう。核酸フラグメン
トを回収するため、調製物をフェノール／クロロホルム
で抽出シ、エタノール沈澱せしめる。また、好ましくな
いフラグメントを追加的制限電素消化によって二重消化
されたベクターでは、連結は防止することができる。
ユ下」ｊυ痕（社）欠変 配列の改変を必要とするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに
由来するヘクターの部分については、部位特異的なプラ
イマー指令変異誘発を用いる。この技術は現在では当業
界で標準的であり、所望の変異を表わす限定されたミス
マツチを除いて変異誘発されるべき単一鎖ファージＤＮ
Ａに相補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用い
て行なわれる。要約すれば、ファージに相補的な鎖の合
成を指令するプライマーとして合成オリゴヌクレオチド
を用い、生成する二本ＩＵ　Ｄ　Ｎ　Ａをファージ支持
性の宿主細菌に形質転換する。形質転換された細菌の培
養液を上層寒天に塗布しファージを有する単一細胞から
プラークを形成させる。
理論的には、新たなプラークの５０％は変異形を単一鎖
として有するファージを含み、５０％はもとの配列を有
する。プラークをニトロセルロースフィルターに１多し
て、正も育にマツチするハイブリダイゼーション可能に
し且つもとの鎖とのミスマツチがハイブリダイゼーショ
ンを防止するのに十分であるような温度で、キナーゼ処
理した合成プライマーで「リフト（ｌｉｆｔｓ）Ｊハイ
ブリダイゼーションを行なう。次に、このプローブとハ
イブリッド形成するプラークを採取して、培養し、ＤＮ
Ａを回収する。
遺戒夏肛所 以下の造成では、プラスミド造成物の正確な連結を、最
初に連結混合物を用いてＥ、コリ　（月−Ωｌｉ）ＭＭ
２９４株または他の適当な宿主を形質転換することによ
って確かめる。当業界で理解されているように、好結果
の形質転換体を、プラスミド造成の方式に依存してアン
ピシリン耐性、テトラサイクリン耐性またはその他の抗
生物質耐性によって選択する。次に、形質転換体からの
プラスミドを、フレウェル（ｃｌｅｗｅ１１．Ｄ、Ｂ、
）ら、（Ｐｒｏｃ　、　Ｎａ　ｔ　ｌ　。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　１９６９年、６２巻、１
１５９頁）の方法により、場合によってはクロラムフェ
ニコール増幅法（フレウェル（ｃｌｅｗｅ１１．Ｄ、Ｂ
、）＋Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．．１９７２年、１１０
巻、６６７頁）によって調製する。単離したＤＮＡを、
制限処理により分析しそして／又はサンガー（Ｓａｎｇ
ｅｒ＋　Ｆ、）ら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＬＩＳ＾、１９７７年、７４巻、５４６３頁）
のジデオキシ法であって更にメソシング（Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ）ら旦匹に江Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、１９８１年、
９巻、３０９頁）によって記載されている方法またはマ
クサム（Ｍａｙａｍ）ら（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚ
　ｍｏ１ｏ■、１９８０年、６５巻、４９９頁）の方法
によって配列決定する。
透性９Ｊ［ この発明においてクローニング及び発現に用いられる宿
主菌株は、次の通りである。
クローニング及び配列決定、並びにほとんどの細菌性プ
ロモーターの制御下での造成物の発現には、Ｅ、コリ　
（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）ゲネチック・ストック・センター
ＧＣ３Ｇ＃６１３５から得たＥ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ
）株ＭＭ２９４を宿主として用いた。ＰＬＮＩＩ１１３
プロモーターの制御下での発現には、Ｅ、コリ　（Ｐ工
匹旦）Ｋ１２株ＭＣ１０００λ溶原株、ＮＪｓｉｃ１８
５７ＳｕｓＰ１＠、ＡＴＣＣ３９５３１を用いることが
できる。本明細書では、１９８７年４月７日にＡＴＣＣ
（ＡＴＣＣ５３６０６）で寄託したＥ。
コリ　（Ｌ　図旦）ＤＧ１１６を用いる。
Ｍ１３ファージ組換体のためには、ファージ怒染を受け
やすいＥ、コリ　（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）　、例えばＥ。
コリに１２株ＤＧ９８を用いる。ＤＧ９８株は１９８４
年７月１３日にＡＴＣＣ寄託され、寄託番号３９７６８
を有する。
哺乳類テノ発現はＣＯ３−７、ＣＯＳ　−Ａ２、ＣＶ−
１およびネズミ細菌で行うことができ、そして昆虫細胞
ではスポドプテラ・フルジペイダ（ＳＯｄＯｔｅｒａ葺
■旦１血）での発現を基礎とする。
■素孟血圓支定化 酵素は、長期間安定にするためには、１種又は篠数１種
の非イオン性ポリマー性洗剤を含む緩衝液中に貯蔵しな
ければならない。この様な洗剤は一般的には分子量が約
１００〜２５０．０００の範囲であり、好ましくは約４
　、０００〜２００　、０００ドルトンであり、ｐＨが
約３．５〜約９．５、好ましくは約４〜８．５で酵素を
安定化するものである。この様な洗剤の例としては、マ
ッグ・クチェオン（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ）のＥｍｕｌ
ｓｉｆｉｅｒｓ　＆　Ｄｅｔｅｒ　ｅｎｔｓ、北アメリ
カ版（ｉ９８３年）エムシー・パブリッシング・カンパ
ニー（ＭＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、）のマソク・
クチェオン部門発行、１７５、ロックロード、グレンロ
ック、ニュージャージ（米国）、の２９５〜２９８真に
記載されているものがあり、その詳細については上記文
献を参照されたい。好ましくは、洗剤はエトキシル化し
た脂肪族アルコールエーテルおよびラウリルエーテル、
エトキシル化したアルキルフェノール、オクチルフェノ
キシポリエトキシエタノール化合物、改質オキシエチル
化したおよび／またはオキシプロピル化した直鎖状アル
コール、ポリエチレングリコールモノオレエート化合物
、ポリソルベート化合物およびフェノール性脂肪族アル
コールエーテルからなる群から選択される。更に詳細に
は、好ましくは、ポリオキシエチル化（２０）ソルビタ
ンモノラウレートであるツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０
（ＩＣＩ　・アメリカス・インコーボレーテド（ＩＣＩ
Ａｍｅｒｉｃａｓ　Ｉｎｃ、）、ウイルミントン、ＤＥ
）およびエトキシル化アルキルフェノール（ノニル）で
あるイコノール（Ｉｃｏｎｏｌ）　（登録商標）　ＮＰ
−４０（バスフ（ＢＡＳＦ）イアンドット・コーポレー
ション、パーシバニー、ニューシャーシー）である。
本発明の熱安定酵素は、この酵素が必要であるかまたは
望ましいような目的に用いられる。特定の好ましい態様
では、この酵素は下記のような増幅プロトコールに用い
られる。
１且１ユ上ユニ灰 本発明の酵素を用いる増幅プロトコールは、欧州特許出
願公開第２００．３６２号明細占に開示され且つ特許請
求されている既存の核酸配列を増幅する方法である。し
かしながら、この酵素は以下のような増幅工程で用いる
のが好ましい。
一般的には、増幅工程は、連鎖反応であって、開耳する
反応段階の数に関して対数的な量で少なくとも１種の特
異的核酸配列を産生ずる連鎖反応からなる。但し、（ａ
）所望な配列の末端が十分詳細に知られており、それら
にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを合成する
ことができ、（ｂ）少量の配列を連鎖反応を開始するの
に利用することができることを条件とする。連鎖反応の
生成物は、用いられる特定のプライマーの末端に対応す
る末端を有する別個の核酸デュプレックスであろう。
精製されたまたは未精製の形の如何なる核酸配列も、そ
れが所望の特定の核酸配列を含むかまたは含むと考えら
れる場合には°、出発核酸として用いることができる。
したがってこの工程は、例えばＤＮＡまたはメツセンジ
ャーＲＮＡを包含するＲＮＡを用いることができ、これ
らのＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二本鎖であって
もよい。
更に、ＤＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドであってそれぞれ
の１つづつの鎖を有するものを利用することもできる。
これらの核酸のいずれかの混合物を用いることもでき、
または同じまたは異るプライマーを用いて先行する増幅
反応から産生された核酸も同様に用いることができる。
増幅されるべき特定の核酸配列は大きな分子の単なる部
分であってもよく、または最初から別個な分子として存
在し、該特定の配列が全核酸を構成していてもよい。
増幅される配列は純粋な形で存在することは必要ではな
く、複雑な混合物の少量分画、例えば全ヒトＤＮＡに含
まれるβ−グロビンの一部分（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら
、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０巻、１５３０〜１５３４頁、
１９８５年、に例示されているようなもの〕または、特
定の生物学的試料の極少量部分のみを構成する特定の微
生物の核酸配列の一部分であることもできる。出発核酸
配列は１種又は複数の所望の特定の核酸配列を有し、こ
の配列は同じでも異なるものであってもよい。それ故、
この増幅工程は、ある種の特定の核酸配列を多量に産生
ずるのに有用であるだけでなく、同じまたは異る核酸分
子に配置された１種以上の異る特定の核酸配列を同時に
増幅するのにも有用である。
１種又は複数種の核酸は、如何なる由来からも得ること
ができ、例えばｐＢＲ３２２のようなプラスミド、クロ
ーン化されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、または細菌、酵母
、ウィルス、オルガネラおよび植物または動物のような
高等生物のあらゆる由来の天然ＤＮＡまたはＲＮＡから
得ることもできる。
ＤＮＡまたはＲＮＡは血液、組織材料例えば絨毛膜また
は羊膜細胞から、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、
同上、２８０〜２８１頁によって記載されている方法の
ような各種技法によって抽出することができる。
増幅され、その後検出される配列に特異的なプローブを
用いるときには、細胞は核酸の抽出を行なわずに直ちに
用いることができ、この場合にはそれらを低張緩衝液に
懸濁して、細胞の溶解及び分子内成分の分散が起こるま
で、一般的には１〜１５分間約９０〜１００℃に加熱す
る。加熱工程の後、増幅試薬を、溶解した細胞に直接に
加えることができる。
如何なる特定の核酸配列も、増幅工程によって産生ずる
ことができる。必要なことは、配列の両端の十分な数の
塩基が十分詳細に知られており、所望の配列の異なる鎖
と共に配列に沿った相対的な位置でハイブリッド形成す
る２個のオリゴヌクレオチドプライマーを調製すること
ができ、一つのプライマーから合成された伸長生成物が
、その鋳型（相補体）から分離した時に、画定された長
さの核酸配列へのもう一方の伸長のための鋳型として働
くことができるようにすることである。配列の両端の塩
基についての知識が多くなるに従って、標的核酸配列の
ためのプライマーの特異性を高くすることができ、工程
の効率も高くなる。
これ以後に用いられる「プライマー」という用語は、増
幅される１又は複数のフラグメントの末端配列に関する
情報が幾分不明確である場合には特に、１種より多くの
プライマーを意味することができる。例えば、核酸配列
が蛋白質配列情報から推定される場合には、遺伝子コー
ドの縮重による総ての可能なコドンの多様性を代表する
配列が有するプライマーの集合をそれぞれの鎖について
用いられるであろう。この集合からのある１つのプライ
マーは、増幅されるべき所望の配列の末端と相同であろ
う。
オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば上記のホスホ
トリエステルおよびホスホジエステル法又はそれらの自
動化した態様のような如何なる好適な方法を用いても調
製することができる。この様な自動化した態様ではジエ
チルホスホルアミダイトを出発物質として用い、ビュー
ケージ（Ｂｅａ−ｕｃａｇｅ）らの方法（Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８１年・２２巻、
１８５９〜１８６２頁）によって合成してもよい。
修飾された固形支持体上でオリゴヌクレオチドを合成す
る方法は、米国特許第４．４５８．０６６号明細書に記
載されている。生物学的起源（例えば制限エンドヌクレ
アーゼ消化物）から単離したプライマーを用いることも
可能である。
特定の核酸配列は、この配列を含有する核酸を鋳型とし
て用いて産生される。第一の段階は、それぞれの核酸鎖
を、増幅されまたは検出されるべきそれぞれの異なる核
酸配列について、４種の異なるヌクレオチドトリホスフ
ェートと１種のオリゴヌクレオチドプライマーと接触さ
せることを含む。増幅されまたは検出されるべき核酸が
Ｄ　Ｎ　Ａである時には、ヌクレオチドトリホスフェー
トはｄＡＴＰ　、　ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰおよびＴＴ
Ｐである。
核酸鎖は、追加の核酸鎖の合成用の鋳型として用いられ
る。この合成は、如何なる好適な方法を用いて行なうこ
ともできる。一般的には、それは、好ましくはｐＨは７
〜９であり、最も好ましくは約８である水性緩衝溶液中
で起こる。好ましくは、分離された鋳型鎖を含む緩衝液
に２種のオリゴヌクレオチドプライマーを、過剰モル量
で（クローン化された核酸については、通常は約１００
０：１のプライマー：鋳型比であり、ゲノム性核酸につ
いては、通常は約１０’：１のプライマー：鋳型比であ
る）加える。しかしながら、この方法を診断的用途に用
いるときには、相補的鎖の量が知られていないことがあ
り、したがって相補的鎖の最に対するプライマーの量は
確定することができないことがあることが理解される。
しかしながら、実際的には、加えられるプライマーの量
は、一般的には、増幅される配列が複雑な長鎖核酸鎖の
混合物中に含まれるときには、相補的鎖（鋳型）の量に
対して過剰モル量となるであろう。工程の効率を向上す
るには、大過剰量が好ましい。
ヌクレオチドトリホスフェートの濃度は、増幅用の緩衝
液中ではそれぞれ１５０〜２００岸であり、ＭｇＣｌ　
、は緩衝液中に１．５〜２ｍＭの量で存在することによ
り反応の効率及び特異性を増加させる。
次に、生成する溶液を、増幅または検出されるべき核酸
が二本鎖か一本鎖かに依存して処理する。
核酸が一本鎖であるときには、変性段階を用いる必要は
なく、反応混合物は、プライマーのその相補的標的（鋳
型）配列へのハイブリダイゼーションを促進する温度に
保持される。このような温度は一般的には約３５℃〜６
５℃又はそれ以上であり、好ましくは約３７〜６０°Ｃ
であり、効果的な時間は一般的には０．５〜５分間であ
り、好ましくは１〜３分間である。好ましくは、Ｔａｑ
ポリメラーゼ及び１５−マー以上のプライマーについて
は４５〜５８℃を用いてプライマーのハイブリダイゼー
ションの特異性を増加させる。プライマーが短い場合に
は、より低温が必要である。
もとの−末鎖の核酸に対する相補体は、それに１または
２個のオリゴヌクレオチドプライマーを加えることによ
って合成することができる。適当な単一プライマーを加
えた場合、プライマー伸長生成物が、該プライマー、熱
安定酵素およびヌクレオチドトリホスフェートの存在で
合成される。
この生成物は該−末鎖の核酸に部分的に相補的であり、
そして該核酸鎖とハイブリダイズして等しくない長さの
鎖のデュプレックスを形成し、次いでこれが上記のよう
に一本鎖に分離されて、２本の単一の分離された相補的
鎖を生成する。また、２種の適当なプライマーを一本鎖
核酸に加えて、反応を行なってもよい。
核酸が二本の鎖を有するときには、これを鋳型として用
いる前に核酸の鎖を分離する必要がある。
この鎖分離は、物理的、化学的または酵素的手段のよう
な好適な変性法によって行なうことができる。核酸の鎖
を分離する好ましい物理的方法は、核酸が完全（９９％
以上）に変性するまで加熱することを含む、典型的な熱
変性の温度は約９０〜１０５℃であり、時間は一般的に
は約０．５〜５分間である。好ましくは、効果的な変性
温度は、９０〜１００℃であり、０．５〜３分間であ′
る。鎖の分離は、ヘリカーゼとして知られている酵素の
クラスからの酵素、またはヘリカーゼ活性を有しそして
リボＡＴＰの存在下でＤＮＡを変性することが知られて
いる酵素ＲｅｃＡによって誘発することもできる。
ヘリカーゼを用いて核酸の鎖を分離するのに好適な反応
条件は、ターン・ホフマンーベーリング（Ｋｕｈｎ　Ｈ
ｏｆｆＩｌａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ）　、　Ｃ３ｔｌ−
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌ■↓」ぼ−４３巻、６３頁
、１９７８年に記載されており、ＲｅｃＡを用いる技法
はシー・ラッシング（ｃ，Ｒａｄｄｉｎｇ）　＋Ａｎｎ
、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓｓ　１６巻、４０５〜３７
頁、１９８２年に記載されている。これらの変性法によ
り、等しいかまたは等しくない長さの２本の分離された
相補的鎖が生じる。
二本鎖核酸が熱によって変性された場合には、反応混合
物を、存在するそれぞれのプライマー〇相補的標的（鋳
型）配列へのハイブリダイゼーションを促進する温度に
放冷する。この温度は、試薬によって異り、通常は約３
５℃〜６５℃又はこれ以上であり、好ましくは３７〜６
０℃であり、効果的な時間、一般的には０．５〜５分間
、好ましくは１〜３分間維持される。実際には、Ｔａｑ
ポリメラーゼについては、温度は単に約９５℃から３７
℃程度へ、好ましくは約４５〜５８℃へ低下させるだけ
であり、ハイブリダイゼーションはこの範囲内の温度で
起きる。
核酸が一本鎖または二本鎖のいずれであっても、熱安定
酵素を変性段階で加えることができ、あるいはハイブリ
ダイゼーションを促進する範囲まで温度が下がった時又
はこの範囲の温度にあるときに加えることができる。次
いで、反応混合物を、酵素の活性が促進されまたは最適
化される温度、すなわちハイブリダイズしたプライマー
及び鋳型からのプライマー伸長生成物の合成を促進する
のに酵素の活性を増加させるのに十分な温度まで加熱す
る。この温度は、実際にそれぞれの核酸鋳型に相補的な
それぞれのプライマーの伸長生成物を合成するのに十分
なものでなければならないが、その相補的鋳型からのそ
れぞれの伸長生成物を変性してしまうほど高温であって
はならない（すなわち、この温度は一般的には約８０℃
〜９０°Ｃ以下である）。
この合成反応に効果的な典型的な温度は、主として用い
られる酵素および１種又は複数種の核酸のタイプによっ
て異り、一般的には約４０〜８０℃、好ましくは５０〜
７５°Ｃである。この温度は更に好ましくは、テルムス
・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ７からのＤ　Ｎ　Ａポ
リメラーゼを用いる場合には、約６５〜７５℃である。
この合成に要する時間は、主として温度、核酸の長さ、
酵素および核酸混合物の複雑さによって変わり、約０．
５〜４０分間又はこれ以上、好ましくは１〜３分間の範
囲にある。核酸が長いものであれば、−１％＞的にはよ
り長時間を必要とする。ジメチルスルホキシド（Ｄに３
０）はＴａｑポリメラーゼ酵素の活性を阻害することが
見出だされているので、ＤＭＳＯは存在する必要はなく
または推奨されない。
新たに合成された鎖とその相補的核酸鎖は二本鎖の分子
を形成し、この分子はこの工程の引き続く段階において
用いられる。次の段階では、二本鎖分子を変性するのに
効果的ではあるがしかし熱安定酵素が完全且つ不可逆的
に変性しまたは不活性化するほど高くはない温度で熱変
性することによって二本鎖分子の鎖を分離する。この温
度は、主として酵素のタイプおよび核酸の長さによって
異り、一般的には約９０〜１０５℃、更に好ましくは９
０〜１００℃であり、変性に要する時間は、主として温
度と核酸の長さによって変わり、典型的には０．５〜４
分間である。この処理時間の後、プライマーに相補的な
前の段階から生成した一本鎖分子（鋳型）へのプライマ
ーのハイブリダイゼーションを促進する水準まで温度を
下げる。この温度は、上記したような温度である。
このハイブリダイゼーション段階の後に、またはハイブ
リダイゼーション段階の代わりに（またはそれと同時に
）、熱安定酵素の活性を促進しそして前の段階からの新
たに合成された鎖を鋳型として用いてプライマー伸長生
成物を合成することができる温度に調整する。この温度
も、上記したように、その鋳型から伸長生成物を分ＦＡ
（変性）するほど高いものであってはならない（通常は
、４０〜８０℃で０．５〜４分間、好ましくは５０〜７
０°Ｃで１〜３分間である）。ハイブリダイゼーション
がこの段階中に起こるので、前の段階の変性後冷却は必
要でない。このような２つ以上の段階を同時に行なう場
合には、好ましい温度範囲は５０〜７０℃である。
鎖の分離、ハイブリダイゼーションおよび伸長生成物の
合成の加熱および冷却段階は、所望量の特定の核酸配列
を産生ずるのに必要な回数だけ繰り返すことができ、こ
の回数は最終的用途によって変わる。この回数は、存在
するプライマー、熱安定酵素およびヌクレオチドトリホ
スフェートの尼によって制限されるだけである。これら
の段階は、少なくとも２回繰り返すのが好ましい。検出
に使用するためには、サイクルの数は、例えば試料の性
状によって変わる。例えば、増幅されるべき試料が純粋
なときにはサイクル数は少なくて済ｔｒ。試料が核酸の
複雑な混合物であるときには、シグナルを十分に増幅し
て検出するには、より多くのサイクル数が必要となる。
一般的な増幅および検出には、工程を少なくとも２０回
繰り返すのが好ましい。
下記のように、標識した配列特異的プローブを用いると
きには、これらの段階を少なくとも５回繰り返すのが好
ましい。ヒトゲノムＤＮＡを上記のようなプローブと共
に用いるときには、この工程を好ましくは１５〜３０回
繰り返して配列を十分に増幅して、明確に検出可能なシ
グナルが生成するようにする。すなわちバンクグラウン
ドノイズが検出を妨げないようにする。
以下に更に詳細に説明するように、生成した特異的核酸
配列の量は、指数的に蓄積する。
酵素が不可逆的に変性または不活性化しない限り、ヌク
レオチド、プライマーまたは熱安定酵素を最初に加えた
後に更に添加する必要はない。酵素が不可逆的変性又は
不活性化を受ける場合には、それぞれの変性段階の後に
酵素を補充する必要がある。しかしながら、それぞれの
段階でこれらの物質を添加しても反応には悪影響を及ぼ
さない。
第一の核酸または核酸の混合物から１種より多くの特定
の核酸配列を産生させることが所望な時には、適当な数
の異なる種類のオリゴヌクレオチドプライマーを利用す
る。例えば、２種類の異なる特定の核酸配列を産生させ
るときには、４種類のプライマーを用いる。これらのプ
ライマー〇２つは特定の核酸配列の一つに特異的であり
、残りの２種のプライマーは第二の特定の核酸配列に特
異的である。この場合には、２種類の異なる特定の配列
のそれぞれが、本発明によって指数的に産生される。
適当な長さの時間が経過して所望量の特定の核酸配列が
産生された後、既知の方法（例えば、ＥＤＴＡ、フェノ
ール、ＳＤＳまたはＣｌＩＣｌ　、の添加）で酵素を不
活性化することによって、または反応の成分を分離する
ことによって、反応を停止させる。
増幅工程は連続的に行なってもよい。自動化法の一態様
では、温度を所定の水準に所定の時間制御するように設
定する温度サイクルを反応混合物に行なってもよい。
この目的のための一つの装置は、本発明の増幅反応を制
御するための自動化された装置である。
この装置はコンピューターによって制御される液体取扱
系を利用しており、第一の容器で成る制御された温度で
保管された酵素を、温度がコンピューターで制御されて
所定のインキュベーション方式に一致するようになって
いる第二の容器に液体移動させるものである。この第二
の容器は１種又は複数の増幅される核酸配列とヌクレオ
チドトリホスフェートとプライマーを貯蔵している。コ
ンピューターはユーザー・インターフェースを備えてお
り、それによって使用者がインキュベーションの時間お
よび温度、移動させる酵素の量などの、増幅工程におけ
る各種段階の特徴を制御する工程パラメーターを入力す
ることができるようになっている。
酵素はサイクル毎に移動させる必要はないので、用いる
ことができる好ましい装置は液体制御系のない温度循環
を利用している。この様な装置は、下記のような系から
なっている。
１、所定数の試験管、好ましくは５００μ！試験管であ
って、ヌクレオチドトリホスフェート、プライマー、核
酸配列および酵素の反応混合物が入っている試験管を固
定する熱伝導性容器。
２、熱伝導性容器を加熱、冷却し且つ室温より高いおよ
び低い温度に保持する装置であり、この装置は容器を加
熱、冷却しまたは保持する温度を制御する制御シグナル
を受けとる入力部を有する〔この様な装置はマテリアル
ス・エレクトロニクス・プロダクツ・コーポレーション
（ＭａｔｅｒｉａｌｓＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　、トレントン
、ニューシャーシーから発売されているペルティーア（
Ｐｅｌｔｉｅｒ）熱ポンプまたは水熱交換器でもよい〕
。
３、上記の装置の入力部に接続したコンピューター装置
（例えば、マイクロプロセッサ−・コントローラー）で
あって、増幅工程、温度水準および温度勾配とタイミン
グを自動的に制御するシグナルを発生する装置。
もう一つの態様では、プライマー伸長生成物の合成に用
いられる酵素は、カラム中に固定することができる。他
の反応成分をポンプによってこのカラムと加熱コイル中
を連続的に循環させることができる。したがって、生成
した核酸を、酵素を不活性化することなく繰り返し変性
させることができる。
次に、増幅プロトコールを模式的に示す。ここでは、相
補的な鎖〔Ｓ゛〕及び〔Ｓ−〕を含んで成る所望の配列
（Ｓ）を含有する２本積Ｄ　Ｎ　Ａが核酸として使用さ
れる。第１の及びこれに続く各反応サイクルの間、もと
の鋳型上での各オリゴヌクレオチドプライマーの延長が
、プライマーの１つのみにより停止する無限長の新しい
、、ＤＮＡ分子生成物を生成する。今後“長生酸物”と
称するこれらの生成物は直線的に蓄積するであろう。す
なわち、ある数のサイクルの後に存在する量がサイクル
数に比例するであろう。
こうして生成された長生酸物は、その後のサイクルの間
一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型と
して機能し、そして所望の配列〔Ｓ゛〕又は（Ｓ−）の
分子を生成するであろう。
これらの分子もまた、一方又は他方のオリゴヌクレオチ
ドプライマーの鋳型として機能してさらに〔Ｓ゛〕及び
〔Ｓ−〕を生成し、そしてそれ故に、サイクル数に対し
て指数的速度での（Ｓ）の蓄積をもたらすであろう連鎖
反応が継続され得る。
意図されるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
以外のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによ
り生成される副産物は自己触媒的ではなく、そしてそれ
故に直線的速度で蓄積する。
以下余白 上記４種類のデュプレックスが分離されれば次１λ。
以下金白 の鎖が生ずる。
ｒＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ　５’ＩＹ
ＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ　５’１ＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
、、、、　３’’ＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、、、　５’戊されｆこ長王
奴）万Ｚ １つのプライマーのオリゴヌクレオチド配列で停止する
各類及び他方の相補鎖は生成することが所望される特定
の核酸鎖（Ｓ）であることがわかる。
この工程の段階は無限に反復することができ、プライマ
ー１及び２、誘導剤及び存在するヌクレオチドによって
のみ限定される。もとのヌクレオチドは複製されないの
で、その量は全工程を通じて一定に維持される。長生酸
物はもとの核酸からのみ生成されるのでその量は直線的
に増加する。
特定の配列の量は指数的に増加する。すなわち、特定の
配列は支配的な種となる。これは次の表に示される。こ
の表は、各サイクルの効率を１００％として、ｎサイク
ル後に存在する種の相対量を示す。
以下余白 ０〜ｎサイクル″への２ｔ゛′の １５　　　　　１　　　　１５　　　　３２．７５２２
０　　　　　１　　　　２０　　　１．０４８．５５５
ｎ　　　　　　１　　　　　　ｎ　　　（２″−ｎ−１
）鋳型として一本鎖ヌクレオチドが使用される場合、サ
イクル当り１個のみの長生酸物が生成する。
少なくともｌサイクルの増幅の後に、増幅される配列の
（末端にない）内部配列に相補的な一組のプライマーを
加えることによって、所定回数の増幅の後、所定の配列
内の配列を増幅して反応の特異性を大きくすることがで
きる。この様なプライマーは如何なる段階で加えてもよ
く、そしてこのものはより短い増幅されたプライマーを
供するであろう。また、非相補的末端を有するが、増幅
において前に用いてプライマーと幾分オーバーラツプす
るプライマーを用いることによってより長いフラグメン
トを調製することができる。
この発明方法を用いて、特定の核酸配列をクローン化し
て、適当な発現ベクターに挿入することができる。次に
、このベクターを用いて適当な宿主生物を形質転換して
、組換えＤＮＡ技法の標準的方法によって配列の遺伝子
生成物を産生させることができる。
この増幅工程は、元の鋳型核酸、予偲される標的増幅生
成物および各種のハックグラウンドの非標的生成物から
の核酸の混合物を生じさせることができる。元の鋳型Ｄ
ＮＡがへテロ接合性二倍体ゲノムにおけるような複数の
標的配列を有するとき、または関連遺伝子のファミリー
があるときには、増幅された生成物は混合物であること
もある。
これらのプライマーを改変して、増幅反応によって生成
されるＤＮＡの混合物の速やかで且つ特異的なりローン
化を補助することができる。この様な改変では、プライ
マーのそれぞれに、または増幅され且つクローン化され
る配列中に制限部位が含まれる。好ましくは、同じまた
は異なる制限部位をプライマーの５′末端に導入し、増
幅された生成物の二個の末端に制限部位を生じるように
するのが好ましい。適当な酵素で切断すると、増幅され
た生成物は容易にプラスミドまたはバイアルベクター中
に挿入されて、クローン化される。
このクローニングによって、混合物ではなく個々の増幅
された生成物の分析または発現が可能になる。
プライマーがその中に導入された制限部位を有するとき
には、同じ制限部位を両方のプライマーに用いることが
できる。しかしながら、異なる制限部位を用いると、生
成物を特異的な方向でベクター中に挿入することができ
、複数の挿入、及び２個のプライマーの一方のみに基づ
いた増幅から生じる挿入は抑制する。特異的方向性は、
−末鎖配列ベクターへのクローニング時、一本鎖ハイブ
リダイゼーションプローブを用いる時またはクローン化
された生成物が発現されるべき場合に有用である。
プライマーを調製する一つの方法は、標的配列から極僅
に異なるプライマー配列を選択することである。プライ
マーのそれぞれが配置されるべき領域は、所望のベクタ
ーに適当な制限部位に対する相同性についてスクリーニ
ングされる。例えば、標的配列ｒｃＡＧＴＡＴｃｃＧＡ
、、、　Ｊは、Ｂａｒｎ旧部位を有するものと一個の塩
基しか違わない。プライマー配列はその３′末端で正確
にマツチし、その５′末端付近に変更された配列および
制限部位を有するように選択される（例えば、ｒＣＡＧ
ｇＡＴＣＣＧＡ、、、　Ｊであり、小文字は標的配列と
マツチしないものを表わしている）。この最少限に変更
した配列は、プライマーが元の標的配列とハイブリッド
形成し、重合を開始する能力を妨げない。第一の増幅サ
イクルの後、プライマーはコピーされて、標的となり、
新たなプライマーと正確にマツチする。
増幅工程の後、生成物を適当な制限酵素で開裂せしめ、
例えば、脱塩カラムまたｔよ分子量クロマトグラフィカ
ラムを通過させあるいは膜を通過させることによって、
制限消化物を場合によってはヌクレオチドトリホスフェ
ートおよび塩のような連結の阻害剤から分離させ、クロ
ーン化されるべき増幅配列を含有する（ｉ種以上の）消
化生成物は、連結反応によって、バタテリオファージＭ
１３のようなりローニングベクターに挿入される。クロ
ーニングベクターは、一般に選択マーカーを有し、そし
て場合によってはさらにプロモーターを有することもあ
る。次に、遺伝子が蛋白質をコードするときには、これ
を公知の技法によって配列決定し、そして／または発現
させることができる。
遺伝子はまた、配列決定されるべき所望の部分に相補的
な適当なプライマーを増幅工程中に加えることによって
配列決定することもできる。このプライマーは伸長生成
物を形成して、この伸長生成物を有する増幅の程度が配
列情報を提供することになる。
プライマーを調製するためのもう一つの方法は、標的配
列からプライマーの３′末端を取り出して、プライマー
の５′末端へ所望のｆｆｔｌＪＩ１１１部位を加えるこ
とからなっている。例えば、ＨｉｎｄＩ［［部位を加え
て、配列ｒｃｇａａｇｃｔｔＣＡＧＴＡＴＣＣＧＡ、、
Ｊ　　（但し、小文字は上記定義の通りである）を作る
ことができる。加えられた塩基は増幅の第一のサイクル
でハイブリダイゼーションには寄与しないが、これ以後
のサイクルでマツチする。次に、最終的に増幅された生
成物を１種又は複数種の制限酵素で切断して、上記のよ
うにクローン化し、発現させる。
増幅される遺伝子は、例えばヒトβ−ヘモグロビンまた
はヒト１（ＬＡＤ口、ＤＲまたはＤＰ−αおよび一β遺
伝子であってもよい。
もう一つの、余り好ましくはなく且つあまり効率的なも
のとはいえないクローニング法であって（制限酵素を用
いる）接着末端連結よりはむしろ平滑末端連結を用いる
方法においては、クローン化されるべき１種又は複数種
の配列あるいはプライマー中の制限酵素とは無関係に基
本的増幅方法が用いられる。しかしながら、これらの段
階は、連結を行なうのに十分なだけ増幅された１種又は
複数種の配列を産生ずるのに十分な回数にわたり繰り返
さなければならない。平滑末端連結では、接着末端連結
の場合よりも高濃度の１種又は複数種の配列と１種又は
複数種のクローニングベクターを必要とする。更に、こ
の連結反応はＴ４リガーゼ、Ｅ、コリ　（Ｅ、　　ｃｏ
ｌｉ）リガーゼのようなりガーゼの存在で行なわなけれ
ばならない。増幅された生成物が得られたならば、連結
処理法は当業者に周知の条件を用いる標準的処理法によ
り行われる・ 平滑末端連結反応を用いないクローニング法は、増幅さ
れた生成物のクローニングベクターへの挿入の方向性ま
たは多重性を制御する。
更に、この工程は、試験管内での変異誘発に用いること
ができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅され
るべき核酸配列に正確に相補的である必要はない。それ
らは、熱安定酵素によって伸長されるべき配列十分にハ
イブリダイズすることだけが必要である。用いられるプ
ライマーが元の鋳型に正確には相補的ではない場合の増
幅反応の生成物は、鋳型配列ではなくプライマーの配列
を有するので、試験管内突然変異が導入される。
引き続くサイクルでは、この突然変異は、それ以上不対
合プライミングを必要としないので、限定されない効率
で増幅される。このようにして産生された変異体を標準
的な生物学的技法によちて適当なヘクターへ挿入するこ
とができ、このヘクターに変更された蛋白質の産生前の
ような変異体特性を付与することができる。
上記のような変更されたＤＮＡ配列を作る工程は、他の
配列の変化を誘発するための異なるプライマーを用いて
、変更されたＤＮＡに対して繰り返すことができる。こ
のようにして、一連の変異配列が徐々に産生され、この
シリーズに新たに加えられたそれぞれのものは前のもの
から僅かしか粉となっていないが元のＤＮＡ源配列から
はかなりの点で異なっているようにすることができる。
このようにして、非常に不適正なプライマーを機能させ
ることはできないために単一段階では得られないような
変化を、最終的に行なうことができる。
更に、十分な量のプライマーが、増幅されるべき鎖に相
補的な配列を含有する場合には、プライマーはその配列
の一部に非相補的配列を有することができる。例えば、
（プロモーター、リンカ−、コード配列などの）鋳型配
列に相補的でないヌクレオチド配列をプライマーの一方
または両方の５′末端に結合させ、これによって増幅工
程の生成物に付加することができる。伸長プライマーが
添加された後、工程を十分な回数だけ繰り返し、非相補
的ヌクレオチド挿入部を含有する新たな鋳型を所望な量
で得る。これによって、単純な技法を用いて、比較的短
時間（例えば２時間以下）で結合したフラグメントを多
量に産生ずることができる。
この方法を用いて、感染度、遺伝学的疾患または細胞性
疾働、例えば癌に関する特異的核酸配列、例えば腫瘍遺
伝子の検出および／または特徴化を行なうことができる
。分析に利用できる核酸の量が極めて少ないとき、例え
ば胎児細胞から得られるＤＮＡを用いる鐘状赤血球貧血
の出生前診断で有用である。この増幅法は、非放射性検
出法を用いる本来鋭敏でない分析法を用いて少量試料の
分析を行なう場合、または放射分析法を用いる場合であ
って速やかな検出が望まれる場合に、特に有用である。
本発明の目的に関して、遺伝学的疾患は、例えば鐘状赤
血球貧血、α−サラセミア、β−サラセミア等のような
生体からのゲノムＤＮＡの特異的欠失および／または変
異誘発を包含する。鐘状赤血球貧血は、本方法により適
当なりＮＡ配列の増幅を行なった後の１９８５年１２月
１１日発行の欧州特許出願公開筒１６４．０５４号明細
書に記載のオリゴマー制限分析によりまたはＲＦＬＰ様
分析により、容易に検出することができ、α−サラセミ
アは、この疾患を起こす変異部に緊密に関連した多形制
限部位の不在によって検出することができ、またβ−サ
ラセミアはその制限部位の存在によって検出することが
できる。
これらの遺伝的疾患の総ては、適当な配列を増幅し、そ
れをサチン法によって放射性プローブを用いることなく
分析することによって検出することができる。この様な
方法では、例えば極めて低水準の所望な配列を含む羊水
からのＤＮＡの少量の試料を増幅し、制限酵素で切断し
、サチン法によって分析する。増幅された高水準のシグ
ナルによって非放射性プローブの使用が容易になる。
もう一つの態様では、ＤＮＡの少量試料を通常の水準に
まで増幅した後、伸長反応のサイクルを続けて行ない、
この場合、（３２Ｐ−標識またはビオチン−標識したヌ
クレオチドトリホスフェートのような）容易に検出され
るヌクレオチド誘導体を最終のＤＮＡ生成物中に直接に
４人し、これを制限酵素処理および電気泳動法による分
離またはその他の適当な方法で分析することが可能であ
る。
もう一つの態様では、核酸を、増幅前に特定の制限エン
ドヌクレアーゼに暴露することができる。
切断された配列は増幅することは出来ないので、あらか
じめＤＮＡ試料を制限酵素処理したにもかかわらず増幅
されたフラグメントが出現することは、増幅された配列
内のエンドヌクレアーゼの部位の不在を示唆する。増幅
された配列の存在または不在は、適当な方法によって検
出することができる。
本発明の方法の実際的応用は、本明細書、および欧州特
許第１６４，０５４号明細書（同上）およびサイキ（Ｓ
ａｉｋｉ）らのＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３巻
、１００８〜１０１２頁に記載されているオリゴマー制
限法によって鎌状赤血球貧血の検出を容易にするための
その使用によって例示することができる。鎌状赤血球貧
血は、β−グロブリン遺伝子の６番目のコドンにおける
唯一つの塩基対の変化によって起こるヘモグロビン疾患
である。
本発明の方法は、配列特異的オリゴヌクレオチドを用い
て（ゲノムＤＮＡのような）核酸配列の一塩基対の変化
を直接に検出するのにも用いることができる。この方法
では、癌、感染症または遺伝的疾患例えば遺伝的欠失か
ら生じるような配列変化を直接に検出することができ、
本来なら必要な制限酵素消化、電気泳動およびゲル操作
の必要がな（なる。本明細書に記載する増幅の後のドツ
ト・プロット方式において配列特異的オリゴヌクレオチ
ドを用いると、プローブの特異性およびｊ５受性が向上
し、解釈可能なシグナルを、０．０４ｔｔｇの試料を用
いて６時間以内に得ることができる。また、膜にスポッ
トする試料の量を０．１〜０．５　ｕｇに増加すると、
従来の方法で用いられる放射性プローブの代わりに、非
放射性標識されたオリゴヌクレオチドを用いることがで
きる。更に、以下に記載の方法は、大きさが１９−マー
未満の配列特異的オリゴヌクレオチドの使用に適用する
ことができ、したがって更に識別力のある配列特異的オ
リゴヌクレオチドを使用することができる。
遺伝的疾患に関しては、ＲＦＬＰはこの疾患に関する多
形制限部位を必要とするが、配列特異的オリゴヌクレオ
チドは直接に遺伝的欠失を検出し、単一の塩基の突然変
異によって生じるヘモグロビンＣ症、α−１−アンチト
リプシンおよびβ−サラセミアのような病気の解析に極
めて有用である。
また、オリゴヌクレオチドを用いて、異なる対立遺伝子
（例えばＨＬ　Ａ型）を表わす遺伝的変異体を識別する
ことができるので、熱安定酵素を含む配列特異的オリゴ
ヌクレオチドを基礎としたキ・ノドの可能性が示唆され
る。
本発明の１態様では、ヌクレオチドの配列変化を検出し
ようとするときには、上記の様に、ヌクレオチド変化を
含むと推定されるそれぞれの核酸のそれぞれの鎖につい
て１個のプライマーを用いて増幅した試料を一連の膜に
直接にスポ・ノドし、そしてそれぞれの膜を異る標識さ
れた配列特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリ
ダイズをせしめる。膜への試料のスポット法については
、カホトス（にａｆｏｔｏｓ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ７巻、１５４１〜１５５２
頁、１９７９年に記載されている。
要約していえば、膜に固定されたＤＮＡ試料を、ドデシ
ル硫酸ナトリウム、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、血清
アルブミンおよび各種の塩を含むプレ）％４ブリダイゼ
ーシヲン？容液を用いて、プローブを加える前に、前処
理することができる。次いで、標識されたヌクレオチド
プローブであって検出しようとするそれぞれの配列変化
に特異的なものをブレハイブリダイゼーション溶液と同
様のノλイブリダイゼーション溶液に加える。この／’
％イブリダイゼーション溶液を膜に適用して、この膜を
、プローブの型および長さ、成分の型および濃度等によ
って異るハイブリダイゼーション条件に付す。一般的に
は、ハイブリダイゼーションは約２５〜７５℃、好まし
くは３５〜６５℃、０．２５〜５０時間、好ましくは３
時間未満行なう。条件のストリンジエンシーが大きくな
ればなるほど、プローブと試料とのノ＼イブリダイゼー
ションに必要な相補性は大きくなる。
バンクグラウンド水準が高ければ、それだけストリンジ
エンシーは高くなる。ストリンジエンシー条件は、洗浄
にも取り込むことができる。
ハイブリダイゼーションの後、好適な手段を用いてハイ
ブリダイゼーションされないプローブを試料から洗浄除
去する０例えば各種）濃度の標準的塩リン酸ＢＤＴＡ　
（ＳＳＰＦ、）　（ｉ８０ｍｌ’ｌのＮａＣ４、１０ｍ
ＭのＮａ１ｌＰＯ。
およびＩＭのＥＤＴＡ　、　ｐＨ７，４）溶液で２５〜
７５℃で約１０分間〜時間、１回以上洗浄するが、この
時間は温度によって変化する。次いで、この標識を適当
な検出法を用いて検出する。
ここで用いられる配列特異的オリゴヌクレオチドは、一
般的には、プライマーを調製するために上記の方法で調
製され選択されるオリゴヌクレオチドである。上記のよ
うに、配列特異的オリゴヌクレオチドは、検出されるべ
きヌクレオチド変化にわたる配列の領域を包含し、検出
されるべきヌクレオチド変化に特異的なものでなければ
ならない。例えば、試料が鎌状赤血球貧血の変異を含む
かどうかを検出することが所望ならば、正常なβ−グロ
ブリン遺伝子に特徴的なヌクレオチド配列部位を含むオ
リゴヌクレオチドを調製し、さらに譲状赤血球対立遺伝
子に特徴的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチ
ドを調製する。それぞれのオリゴヌクレオチドを同じ試
料の複製物とハイブリダイズせしめ、試料が変異を含む
かどうかを決定する。
ＨＬＡクラス■遺伝子の多形性領域は第一エクソンの特
定の領域に局在しており、保存された配列によって挟ま
れているので、第一エクソンの保存された５′および３
′末端の対向する鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプラ
イマーを調製することができる。
ＨＬＡクラス■遺伝子の多形性領域の検出に用いられる
オリゴヌクレオチドの数は、クラスター構造を有するま
たはばらばらに分散している塩基対変異の領域を有する
遺伝子の型によって異る。
）ＩＬＡ　−ＤＱ−αの場合のように、この領域がクラ
スター構造を有するときには、それぞれの対立遺伝子に
ついて一つのオリゴヌクレオチドを用いる。
この領域が、ＩＩＬＡ−ＤＱ−βおよびＨＬＡ　−ＤＲ
−βの場合のように、分散しているときには、それぞれ
の対立遺伝子について１種より多くのプローブであって
それぞれ対立遺伝子変異体を包含するものが用いられる
。ＨＬＡ　−ＤＱ−βおよびＩＩＬＡ　−ＤＲ−βの場
合には、３種のプローブを、対立遺伝子変異が起きる遺
伝子座の３個の領域について用いる。
インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）の検出には
、）ＩＬＡ−ＤＲβ第二第二エキソウいて４個のプロー
ブを用いる。
ハブロタイブは、家族における分離（ｓｅｇｒｅｇａ　
ｔ　１ｏｎ）から、または場合によって個体のＤＮＡ試
料の直接分析によって推定することができる。配列特異
的オリゴヌクレオチド反応性の特異的対立遺伝子の組合
せ（ハロタイプ）は、増幅前にゲノムＤＮＡの制限酵素
消化を用いることによってペテロ接合細胞において同定
することができる。
例えば、ＤＱβで、高度に変異可能な副領域Ａ、Ｂおよ
びＣが単一の増幅領域内に・見出される場合、およびそ
れぞれの領域で６個の異なる配列（ＡＩ−６，８１−６
，Ｃ１−６）がある場合には、可能なハブロタイブの組
合わせＡＩ　、　Ｂ２　、　Ｃ１；　Ａｌ　、　Ｂ２゜
Ｃ４；　Ａ２　、　Ｂ２　、　Ｃ１；　Ａ２　、　Ｂ２
　、　Ｃ４；　Ａｌ　、　Ｂ３　、　Ｃ１；　Ａｌ　。
Ｂ３　、　Ｃ４；　Ａｔ　、　Ｂ２　、　ＣＩ　？およ
びＡＩ　、　Ｂ２　、　Ｃ４を伴って、配列特異的オリ
ゴヌクレオチドプローブ分析によっ””Ｃ個体をＤＱβ
座においてＡＩ　、　Ａ２　；　Ｂ２　、　Ｂ３　；　
Ｃ１゜Ｃ４を含むものとしてタイプ分けすることができ
る。
ゲノムＤＮＡが多形性限酵素によって増幅前に消化され
る場合、及びこの酵素がプライマーの間の対立遺伝子を
両方とも切断する場合、増幅の欠如のため配列特異的プ
ローブとの反応性はなく、何等情報を提供しない。この
酵素が対立遺伝子を切断しないときには、消化されたお
よび消化されないゲノムＤ　Ｎ　Ａでの結果は同じにな
り、その結果は何等情報を提供しないものとなる。この
酵素が一方の対立遺伝子のみを切断するときには、消化
されたおよび消化されないＤＮＡのプローブ反応性パタ
ーンを比較することによって両方のハブロタイブを推定
することができる。
これらのハブロタイブは、未切断ゲノムＤＮＡおよび多
形であり且つプライマーの間の部位を認識する事が知ら
れて、いる１〜数個の酵素で切断したゲノムＤＮＡと配
列特異的オリゴヌクレオチドとの反応性を比較すること
によって推定することができる。
配列特異的オリゴヌクレオチドの長さは、検出されるべ
き特定の標的分子、オリゴヌクレオチド源およびヌクレ
オチド組成のような多くのフックターによって異る。本
発明の場合には、配列特異的オリゴヌクレオチドは、典
型的には、１５〜２５ヌクレオチドを有するが、より多
くのまたは少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。長
さが少なくとも１９マーであるオリゴヌクレオチドは、
特異性および／または感受性を高めるが、１９マ一未満
の、例えば１６−マーであるプローブは、おそらく単一
ミスマソチがより不安定化するので、更に高い配列特異
的識別力を示すことができる。増幅によって特異性が増
加するので、より長い長さは必須ではなく、ハイブリダ
イゼーションおよび洗浄温度は同じ塩濃度について低い
ものでもよく、長さが１９７−未満のオリゴヌクレオチ
ドを用いることが好ましい。
試料を最初に膜に置いて、次い゛でオリゴヌクレオチド
で検出するときには、このオリゴヌクレオチドは、分光
的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段
によって検出することができる好適な標識残基で標識し
なければならない。免疫化学的手段には、適当な条件下
でオリゴヌクレオチドと複合体を形成することができる
抗体があり、生化学的手段には適当な条件下でオリゴヌ
クレオチドと複合体を形成することができるポリペプチ
ドまたはレクチンがある。例えば、螢光線量、エレクト
ロン・デンス（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｅｎｓｅ）試薬、
不溶性反応生成物を沈澱させまたは発色によって検出す
ることができる酵素、例えば西洋ワサビ・ペルオキシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼのようなもの、３２ｐの
ような放射性標識またはビオチンがある。ビオチンを用
いるときには、スペーサーアームを用いてそれをオリゴ
ヌクレオチドに結合せしめる。標識残基として西洋ワサ
ビ・ペルオキシダーゼが好ましい。
また、「逆」ドツト・プロット方式では、プライマーの
少なくとも１個および／または４種のヌクレオチドトリ
ホスフェートの少なくとも１つを検出可能な標識で標識
して、生成する増幅された配列を標識記する。これらの
標識残基は最初から反応混合物中に存在してもよくまた
は増幅の後期サイクルで加えて増幅生成物に標識を導入
することができる。次に、配列変異（正常または突然変
異体のいずれでも）が存在するときには、増幅された核
酸配列でハイブリッド形成できる未標識の配列特異的オ
リゴヌクレオチドを上記のようなプレハイブリダイゼー
ション条件下で膜にスポット（または固定）する。次に
、増幅された試料を、上記のようにハイブリダイゼーシ
ョン条件下で前処理した膜に加える。最後に、検出手段
を用いて、核酸試料の増幅された配列が膜に固定された
オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションする場合
に検出を行なう。ハイブリダイゼーションは変異を含む
膜に結合した配列が増幅生成物に存在するときにのみ、
すなわちプローブの配列が増幅された配列の領域に相補
的である場合にのみ起こる。
「逆」ドツト・プロット方式のもう一つの態様では、上
記の「順」ドツト・ブロック方式でのように標識を用い
ることはなく増幅を行ない、変異が存在するときにはそ
れを含む増幅された核酸配列とハイブリダイズすること
ができる標識された配列特異的オリゴヌクレオチドプロ
ーブを、上記のようなプレハイブリダイゼーション条件
下で膜にスポット（または固定）する。次に、増幅され
た試料を、上記のようなハイブリダイゼーション条件下
で前処理した膜に加える。次いで、標識したオリゴヌク
レオチドまたはそのフラグメントを膜から遊離せしめ、
試料中の増幅された配列が標識されたオリゴヌクレオチ
ドにハイブリダイゼーションする場合に、検出手段を用
いて検出することができるようにする。遊離は、例えば
プローブの制限部位を認識する膜に制限酵素を加えるこ
とによって起こすことができる。オリゴマー制限として
知られているこの方法は、１９８５年１２月１１日発行
の欧州特許出願公開第１６４，０５４号明細書に更に詳
細に記載されている。
順および逆ト′ット・プロット方式のいずれでも、いず
れかの生物からの検出される遺伝的疾患は、特異的欠失
、挿入および／またはゲノムＤＮＡのような核酸のいず
れかの塩基対の突然変異または多形における置換を含む
、塩基対の変異が知られている疾患の例としては、譲状
赤血球貧血、ヘモグロビンＣ症、α−サラセミア、β−
サラセミア等がある。検出することができる他の病気に
はＲＡＡＩＩ！瘍遺伝子、例えばｎ　−ＲＡ　Ｓ　Ｉｔ
−！癌遺伝子を含む癌性疾Φおよび感染性がある。
ドツト・プロット法は、ｍ織の移植、病気に罹り易さお
よび父性の決定の分野でのＨＬＡタイピングに用いるこ
ともできる。ＨＬ　Ａクラス■遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲ
，ＨＬＡ　−ＤｌｌｌおよびＩＩＬＡ−ＤＰ領領域らの
αおよびβ遺伝子からなり、極めて多形性が高く、それ
らのＤＮＡ水準での遺伝学的複雑性は血清学的タイピン
グにようて一般的に定義されている多形よりも著しく大
きい。更に、本発明の方法は、インシュリン依存性真性
糖尿病（ＩＤＤＭ）に関するＨ　Ｌ　Ａクラス■βタン
パク質（例えば、ＤＲβ）をコードする４個のＤＮＡ配
列を検出するのに用いることができる。
簡単にいえば、ＩＤＤＭに関する４種のＤＮＡ配列は、 （ｉ）　　　５　’　−ＧＡＧＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＣ
ＴＧＡＧ−３’（２＞　　　５　’−ＧＡＧＧＡＧＴＴ
ＣＣＴＧＣＧＣＴＴＣ−・３′（３）　　５　’　−Ｃ
ＣＴＧＴＣＧＣＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧ−３’および（４
”）　　　５　　’　−ＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡ
ＣＧＡＧＡＧＡ−３’またはそれらに相補的なりＮＡ鎖
からなる群から選択される。これらの配列の１種又は複
数種にハイブリッド形成する配列特異的プローブを調製
することができる。
各種感染生疾患は、臨床試料中に起因微生物に特徴的な
特定のＤＮＡ配列が存在することによって診断すること
ができる。これら起因微生物には、サルモネラ、クラミ
ジア、ネイセリアのような細菌、肝炎ウィルスのような
ウィルスおよびマラリアの原因となるプラスモジウムの
ような寄生虫がある。ファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ）らに
発行された１９８６年５月１３日付は米国特許再審査証
明書箱Ｂ　１４，３５８，５３５号は、感染性疾患の診
断への特異的ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブの
使用を記載している。
比較的少数の病原生物が、感染した患者からの臨床試料
中に存在するので、これらから抽出されるＤＮＡは試料
中の総ＤＮＡの極めて小さな分画だけを構成することが
ある。ＤＮＡ試料の固定の前に、推定される配列を特異
的に増幅し、ハイブリダイゼーション検出することによ
って、従来の方法の感度および特異性を著しく向上する
ことができる。
ワード（Ｗａｒｄ）の欧州特許第６３．８７９号明細書
に記載されているように、非放射性標識されたプローブ
を用いることができれば、感染性疾患の診断のためのＤ
ＮＡプローブの日常的臨床使用はかなり筒略化されるで
あろう。この方法では、ビオチン含有ＤＮＡプローブを
、アビジンまたはビオチン特異的抗体に結合した発色性
酵素によって検出する。この型の検出法は好都合である
が、感受性が比較的低い。本発明の方法による特異的Ｄ
ＮＡ増幅と安定に標識されたプローブの使用の組み合わ
せによって、ファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ）とワード（Ｗ
ａｒｄ）の方法を日常の臨床検査に有用にするのに要す
る便宜と感度が得られる。
ＡＩＤＳウィルスの検出と監視に対するこの増幅技術の
具体的な使用を以下に説明する。プライマーとプローブ
であって、それぞれＡＩＤＳウィルスの核酸中に実質的
に保存されておりＡＩＤＳウィルス中の核酸に特異的な
核酸配列を増幅し検出するように設計されているものを
、増幅および検出法に用いる。したがって、検出される
配列はＡＩＤＳウィルス中の核酸に十分に相補的であり
、酵素およびヌクレオチドトリホスフェートの存在で、
好ましくは室温で重合を開始するものでなければならな
い。
また、このプローブは、ビオチンが、式％式％ （式中、ＹはＯ、Ｎ　ＨまたはＮ−Ｃｌｌ０であり、Ｘ
は１〜４の数であり、ｙは２〜４の数である）を有する
スペーサー・アームに結合しているビオチン化したプロ
ーブである。このスペーサー・アームはまた、式 のプソラレン残基に結合している。このプソラレン残基
は、コーラジーテベ（ｃｏｕｒａｇｅ−Ｔｅｂｂｅ）ら
、影−四上ｉｍ、Ｂｉｏ叫墜り通且ｔａ、　、６９７巻
、１９８２年、１〜５頁に記載のように、「ギャップド
・サークル（ｇａｐｐｅｄ　ｃｉｒｃｌｅ）　Ｊプロー
ブ中にインターカレーションして、架橋しており、ギャ
ソプド・サークルの一木鎖ハイプリダイゼーション領域
はプライマー中に含まれる領域に及んでいる。ビオチン
化とドツト・プロット法の詳細については、１９８６年
４月１５日発行の米国特許第４，５８２，７８９号明細
書および１９８６年１０月１４日発行の米国特許第４．
６１７．２６１号明細書に更に完全に記載されている。
この増幅法を利用して、単一コピーヒト遺伝子からＤＮ
Ａを十分な量で産生させ、単純な非特異的ＤＮＡ染色剤
例えば臭化エチジウムをＤＮＡの検出に直接に用いられ
る様にできる。
生物のゲノムにおける感染性疾患及び病理学的異常の検
出に加えて、病的状態を伴わないＤＮＡ多形を検出する
のに用いることもできる。
要約すれば、増幅法は連鎖反応と熱安定酵素を用いる１
種以上の特定の核酸配列を増幅する方法を提供するもの
であり、上記反応においてプライマー伸長生成物を産生
させ、これを次にその後のプライマー伸長反応の鋳型と
して働くことができるようにする。この方法は、最初は
極めて少量でのみ存在する核酸配列を検出するのに特に
有用である。
以下の実施例は、単に例示のために提供するものであり
、発明の範囲および特許請求の範囲を限定することを意
図するものではない。これらの実施例において、総ての
パーセンテージは、特に断らないかぎり、固体の場合に
は重量％、液体の場合には容積％であり、総ての温度は
摂氏で表わしている。
朶Ｌ １、プライマーの合成 次の２種類のプライマーを下記の方法により調製した。
これらのプライマーはいずれも２０−マーであり、ゲノ
ムＤＮＡの相対する鎖に、１１０塩基対の間隔をおいて
それらの５′端にアニールする。
Ａ、自動化された合成法 Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ　　（Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　（ｉ９８１）２２　
：　１８５９−１８６２）の方法に従って合成されたジ
エチルホスホラミダイトを、ヌクレオチドで誘導体化さ
れた制御された孔サイズのガラス支持体上に逐次縮合さ
せた。この方法は、ジクロロメタン中トリクロロ酢酸に
よる脱トリチル化、活性化プロトン供与体としてベンゾ
トリアゾールを使用する縮合、並びにテトラヒドロフラ
ン及びピリジン中無水酢酸及びジメチルアミノピリジン
によるキャンピングを含む。サイクル時間は約３０分間
であった。各段階での収率は本質的に定量的であり、そ
して脱トリチル化中に放出されるジメトキシトリチルア
ルコールの回収及び分光分析により決定した。
Ｂ、オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱保護及びネｎ
製 固体支持体をカラムから取り出し、そして密閉チューブ
中で室温にて４時間、１−の濡水酸化アンモニウムに暴
露した０次に、支持体を濾過によって除去し、そして部
分的に保護されたオリゴデオキシヌクレオチドを含有す
る溶液を５時間５５℃とした。アンモニアを除去し、そ
して残渣を分取用ポリアクリルアミドゲルに適用した。
３０Ｖ／ｃｓにて９０分間電子泳動を行い、次に生成物
を含有するバンドを、蛍光プレートのＵＶシャドーによ
り同定した。バンドを切り出し、そして１−の蒸留水に
より４℃にて一夜溶出した。この溶液をＲＰ　−）ＩＰ
ＬＣカラムに適用し、そして１％酢酸アンモニウム緩衝
’６　（ｐＨ６，０）中ア七ト二トリル７〜１３％のグ
ラジェントにより溶出した。この溶出を２６０ｎｍでの
ＵＶ吸収によりモニターし、そして適当な両分を集め、
一定容量中でのＵＶ吸収により定量し、そして真空遠心
機中で室温にて蒸発乾固した。
Ｃ，オリゴデオキシヌクレオチドの特徴付は精製された
オリゴヌクレオチドの試験アリコートをポリヌクレオチ
ドキナーゼ及びｒ　−”Ｐ−ＡＴＰにより３ｔｐ−ラベ
ルした。ラベルされた化合物を、５　（ｌ　ｖ　／　ｃ
ｍにて４５分間の電気泳動の後、１４−２０％ポリアク
リルアミドゲルのオートラジオグラフィーにより試験し
た。この方法により分子量が確認される。塩基組成を、
ヘビ毒ジェステラーゼ及び細菌アルカリ性ホスファター
ゼによるオリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオシドへ
の消化、並びにこれに続く、逆相ＨＰＬＣカラム及び１
０％アセトニトリル＋１％酢酸アンモニウム移動和を用
いる該ヌクレオシドの分離・定量により決定した。
■、ナセルインからのヒトゲノムＤＮＡ０単離高分子量
ゲノムＤＡＮを、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、前掲、Ｐ２Ｓ５
−２８１に本質的に従って、ヒユーマン・ゼネティノク
・ミュータント・セル・デポジトリ−、カムデン、ＮＪ
からＧＭ２２１９Ｃとして入手可能な、正常β−グロビ
ンについてホモ接合性のＴ細胞系から単ｓｔシた。
■、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　７か
らのポリメラーゼの精製 アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション、１
２３０１パークラウンドライブ、ロックビル、ＭＤから
ＡＴＣＣ隘２５．１０４としてなんら制御なく入手でき
るテルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ…ｕａｔｉ
ｃｕｓ）　ＹＴＩ株をフラスコ中で、下記の培地で増殖
せしめた。
クエン酸ナトリウム　　　　　　　１ｍＭリン酸カリウ
ムｐＨ７，９５ｍＭ 塩化アンモニウム　　　　　　１０ｍＭ硫酸マグネシウ
ム　　　　　　　０．２ｍＭ塩化カルシウム　　　　　
　　０．１ｍＭ塩化ナトリウム　　　　　　　　　１ｇ
／ｌ酵母エキス　　　　　　　　　　１　ｇ／ｌトリプ
トン　　　　　　　　　　　Ｉｇ／ｌグルコース　　　
　　　　　　　２ｇ／ｌ硫酸第一鉄　　　　　　　　　
０．０１ｍＭ（オートクレーブ前にｐＨを８．０に調整
）上記培地中で７０℃にて一夜培養したフラスコ種母を
１０ｉ！発酵槽に接種した。種母フラスコがらの合計６
００１１ｔｌの種母を１０１１の同じ培地に接種した。
ｐｌｌを水酸化アンモニウムにより８．０に調節し、溶
存酸素を４０％に調節し、温度を７０’Ｃに調節し、そ
して撹拌速度を４０Ｏｒｐｍとした。
細胞の増殖の後、最初の５段階についてはＫａｌｅｄｉ
ｎ等、前掲、の方法（わずかに変更を加えて）を用い、
そして第６段階では異る方法を用いて精製を行った。６
段階すべてを４℃にて行った。
カラムでの分画速度は０．５力ラム／時とし、溶出中の
グラジェントの容量は１０カラム容量とした。
これに代る好ましい方法を例６に後記する。
要約すれば、上記培養のＴ、アクアチフス（Ｔ、　　ｕ
憩旦匹１　細胞を、９時間の培養の後、後期対数期１．
４ｇ乾燥重量／２の細胞濃度において、遠心分離により
集菌した。２０ｇの゛細胞を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｆ
ｌ（Ｊ’　　（ｐＨ７，５）及び０．１　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａを含む緩衝液８〇−中の懸濁した。細胞を溶解し、そ
して溶解物を４℃のローター中で３５．　ＯＯＯｒｐｍ
にて２時間遠心した。上清を集め（画分Ａ）、そして硫
酸アンモニウムの４５〜７５飽和の間で沈澱する蛋白質
画分を集め、０．２Ｍリン酸カリウム（ｐｌｌ　６．５
　＞、１０１１０１１Ｉメルカプトエタノール及び５％
グリセリンを含有する緩衝液中に溶解し、そして最後に
同じ緩衝液に対して透析して画分Ｂを得た。
画分Ｂを、上記の緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥ　−セ
ルロースの２，２Ｘ３０ｃｍカラムに適用した。次に、
このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、そして蛋白質を含有
する両分（２８０ｎｍにおける吸収により決定する）を
集めた。−緒にした蛋白質画分を、０．０１Ｍリン酸カ
リウム（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール及び５％グリセリンを含有する第二緩衝液に対し
て透析して画分Ｃを得た。
画分Ｃを、第二緩衝液で平衡化されたヒドロキシアパタ
イトの２．６　Ｘ　２１　ｃｍカラムに適用した。
次に、このカラムを洗浄し、そして１０ｍＭ２−メルカ
プトエタノール及び５％グリセリンを含有する０、０１
〜０．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７，５）　Ｉｋ街液の
直線グラジェントにより酵素を溶出した。ＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を含有する両分（９０〜１８０ｄリン酸カリ
ウム）を集め、アミコン攪拌セル及びＹＭＩＯ膜を用い
て４倍に濃縮し、そして第二緩衝液に対して透析して画
分りを得た。
画分りを、第二緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロー
スの１．６Ｘ２ａｃｍカラムに適用した。このカラムを
洗浄し、そして第二緩衝液中０．’０１〜０．５Ｍリン
酸カリウムの直線グラジェントによりＤＮＡポリメラー
ゼを？８出した。両分をエンドヌクレアーゼ及びエキソ
ヌクレアーゼの汚染について測定した。これは、過剰の
ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした後のファ
ージλＤＮＡ又はスーパーコイルプラスミドＤＮＡの分
子量の変化を電気泳動により検出することにより（エン
ドヌクレアーゼについて）、そしてＤＮＡを幾つかのフ
ラグメントに開裂せしめる制限酵素による処理の後に（
エキソヌクレアーゼについて）行った。最少のヌクレア
ーゼ汚染を有するＤＮＡポリメラーゼ画分（６５〜９５
＋ａＭリン酸カリウム）のみをプールした。このプール
にオートクレーブしたゼラチンを２５０ｎ／−の量で添
加し、そして第二緩衝液に対して透析を行って画分Ｅを
得た。
画分Ｅをホスホグルコースカラムに適用し、そＬテ２０
＋＋＋Ｍ’Ｊ　７酸カリウム（ｐＨ７，５）中ｏ、０１
〜０、４　Ｍ　ＫＣｌのグラジェント１００−により溶
出した。
両分を上記のようにしてエンドヌクレアーゼ／エキソヌ
クレアーゼの汚染について、そしてさらにポリメラーゼ
活性について（にａｌｅｄｉｎ等の方法により）測定し
た。プールした両分を第二緩衝液に対して透析し、次に
５０％グリセリン及び第二緩衝液に対する透析により濃
縮した。
ポリメラーゼの分子量を５Ｏ３−ＰＡＧＥにより決定し
た。マーカー蛋白質はホスフェ−トＢ　（９２，０００
）、ウシ血清アルブミン（６６，２００）、オバルブミ
ン（４５，０００）、カーボニックアンヒドラーゼ（３
１，０００）、大豆トリプシンインヒビター（２１，５
００）、及びリゾチーム（ｉ４，４００）であった。
予備的データは、文献（例えばＫａｌｅｄｉｎ等）に報
告されている６２．０００〜６３　、０００ドルトンで
はなく、約８６，０００〜９０，０００ドルトンであっ
た。
このポリメラーゼを、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｉ！
　　（ｐＨ６，４及びｐＨ８，０＞　　、Ｏ９Ｉ　Ｍ　
ＭＣＩ！、１０ｍＭ　Ｍｇ（ｌ　ｚ　、１　ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール、１ＱｎｓｏｌｅずつのｄＧＴＰ。
ｄＡＴＰ及びＴＴＰ　、及び０．５μＣｉ　ＣＩＩ）ｄ
ＣＴＰ、　８μｇの“活性化されたウシ”胸腺ＤＮＡ並
びに０．５−５ユニツトのポリメラーゼを含有する混合
物５０μ！中でインキュベートした。“活性化された”
ＤＮＡは、ＤＮＡの５％が酸−溶解性画分に移るまでＤ
Ｎａｓｅ　Ｉにより消化して部分加水分解した後のＤＮ
Ａの天然調製物である。この反応は７０℃にて３０分間
行い、そして０．１２５Ｍ　ＥＤＴＡ−Ｎａｚを含有す
るリン酸ナトリウムの飽和水溶液約５０ｕｌの添加によ
り停止せしめた。サンプルをＫａｌｅｄｉｎ等、前掲に
記載されているようにして処理しそして活性を測定した
。
この結果は、ポリメラーゼはｐＨ６，４においてｐＨ８
，０における活性の半分より活性であることを示した。
これに対して、Ｋａｌｅｄｉｎ等は、酸素はｐＨ約７．
０において、ｐＨ，３における活性の８％を有すること
を見出した。従って、本発明の熱安定酵素のｐｎプロフ
ィールはＫａｌｅｄｉｎ等の酵素のそれよりも広い。
最後に、ＤＮＡポリメラーゼ測定反応混合物から１種類
のみ又は複数種類のヌクレオチドトリホスフェートを除
去した場合、本発明の酵素を用いて活性がほとんど観察
されず、活性は予想値と一致しており、そして酵素は高
い忠実性を示した。
これに対して、Ｋａｌｅｄｉｎ等、前掲、を用いて観察
さた活性は予想値と一致しておらず、そしてヌクレオチ
ドトリホスフェートの間違った導入が示唆される。
■、増幅反応 上記の１鱈のゲノムＤＮＡを、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１
１（Ｊ（ｐｌ＋　８．０　）、５０ｍＭ　Ｋ（Ｊ　、１
１０ｆｆ１　ｎｇｃｌ　ｔ　＜　　５ｍＭジチオスレイ
トール、２００ｑ／ＩＲ１ゼラチン、１オのプライマー
ＰＣＯ２，１囲のプライマーＰＣＯ４，１，５ｍＭｄＡ
ＴＰ、　１．５ｍＭ　ｄｃＴＰ　、　１．５ｍＭ　ｄＧ
ＴＰ及び１．５ｍＭＴＴＰを含有する１００Ｊの初期水
性反応容量中に稀釈した。サンプルを９８℃にて１０分
間加熱してゲノムＤＮＡを変性せしめ、次に室温に冷却
した。
テルムス・アクアチクスからのポリメラーゼ４Ｉ！ｔを
反応混合物に加え、そして１００ｕｌの鉱油を重層した
。次にサンプルを、溶体を供給するためにプログラムさ
れたピペット及び変温のための温度調節装置を用いる上
記の液体取扱い及び加熱装置のアルミニウム加熱ブロッ
クに入れた。
ＤＮＡサンプルを、次のプログラムサイクルを反復して
２０サイクルの増幅にかけた。
１）加熱ブロック中で２．５分間にわたり３７℃から９
８℃に加熱し；そして ２）３分間にわたって９８℃から３７℃に冷却してプラ
イマーとＤＮＡとのアニールを可能にする。
最終ナイクルの後、サンプルをさらに１ｏ分間５５℃で
インキュベートして最終伸長反応を完了する。
■、オリゴデオキシリボヌクレオチドプロープの合成及
びリン酸化 次の配列： を有しｔ？ｓ２４と称するラベルされたＤＮＡプローブ
を調製した。配列中、＊はラベルを示す。このプローブ
は４０塩基の長さを有し、遺伝子の第４コドンから第７
コドンまでを含み、そして正常β−グロビン対立遺伝子
（βＡ）を相補的である。プライマーとプローブとの関
係を次に模式的に示す。
このプローブを例１．１．に記載した方法に従って合成
した。２０　ｐｍｏｌｅのプローブを４ユニツトのＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼおよび約４０ｐｍｏｌｅの７
−”Ｐ−ＡＴＰ　（約７０００Ｃｉ／＋＋＋ｍｏｌｅ）
と、７０＠ＩＭＴｒｉｓ　（ｐＨ７，６）　、１０ｍＭ
　ＭｇＣ１！ｚ　、１．５．ｍＭスペルミン及び１０ｍ
Ｍジチオスレイトールを含有する４０Ｉの反応容量中で
３７℃にて６０分間接触せしめた。次に２５ｍＭ　ＥＤ
ＴＡにより全容量を１００ｐ／に調製し、そしてＴｒ　
ｉｓ　−ＥＤＴＡ　（ＴＥ）　緩衝液（ｉ０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ、０、１　ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ８，０）に
より平衡化したｌ　ｒｎｌスピン透析カラム上で、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ等、前掲、ｐ４６６−４６７の方法に従っ
て精製した。反応生成物のＴＣＡ沈澱は、Ｒ３２４につ
いて比活性が４．３　μＣｉ／ｐｍｏｌｅであり、そし
て最終濃度が０．１１８ｐｍｏｌｅ／μｌであることを
示した。
■、ドツトプロットハイブリダイゼーション前記■、か
らの増幅されたサンプル４μ！、並びニア０　、７５　
、８０　、８５　、９０　、’９５及び１００％の増幅
効率を代表するように計算されたβ−グロビンプラスミ
ＦＤＮＡ（７）適当な稀釈物５．６　ｔｌＩを２００μ
ｆ（７）０．４ＮＮａ叶及び２５ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡで稀
釈し、そしてナイロンフィルター上にスポットした。こ
れは、フィルターを水で湿し、これを、フィルターを定
位置に保持するドツトブロック調製用装置中に入れ、サ
ンプルを適用し、そしてＲｅｅｄ及びＭａｎｎ、　Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　１３．７
２０２−７２２１（ｉ９８５）により開示されているよ
うにして、０．１　Ｒ１（７）２０ＸＳＳＰＥ　（３，
６ＭＮａＣｌ　％　　２００ｍＭ　ＮａＨｚＰＯ４，２
０ｍＭ　ＥＤＴＡ）により各ウェルをすすいだ。次に、
フィルターを取り出し、２０　Ｘ　５ＳＰＥ中で洗浄し
、そして真空オーブン中で８０℃にて３０分間加熱した
。
加熱の後、各フィルターを、３　ｘＳＳＰＥ、　５　Ｘ
デンハート溶液（Ｉ　Ｘ　＝０．０２％ポリビニルピロ
リドン、０．０２％フィコール、０．０２％ウシ血清ア
ルブミン、０．２ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　０．２ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ　ＸｐＨ８，０）、０．５％ＳＯＳ及び３０％ホ
ルムアミドから成るハイブリダイゼーション溶液１６−
と接触せしめ、そして４２℃にて２時間インキュベート
した。次に、２ｐｍｏｌｅのプローブＲ３２４をハイブ
リダイゼーション溶液に加え、そしてフィルターを４２
℃にて２分間インキュベートシタ。
最後に、ハイブリダイズした各フィルターを１００１Ｒ
１の２ＸＳＳＰＥ及び０．１％ＳＯＳで２回室温にて１
０分間洗浄した。次に、フィルターを１００−の２　ｘ
ＳＳＰＥ、　０．１％ＳＤＳで、６０℃にて１０分間処
理した。
次に、各フィルターをオートラジオグラフ処理した。シ
グナルは２時間後に容易に出現した。
■、オートラジオグラムの検討 ２時間後にドツトプロットのオートラジオグラムを分析
して、そしてＨａｅＩＩｌ／Ｍａｅｌ−消化ｐＢＲ：β
１により調製された標準逐次稀釈β−グロビン調製物と
、強度について比較した。β１は、５ａｉｋｉ等５ｃｉ
ｅｎｃｅ　、前掲、において記載されている野性型対立
遺伝子である。反応生成物の分析により、全体の増幅効
率は約９５％であることが示され、これはβ−グロビン
標的配列の６３０．０００倍の増加に相当する。
拠朱 １、増幅反応 例１に記載したようにしてＭｏ１ｔ４セルラインから抽
出されたゲノムＤＮＡのＩ　Ｉｌｇのサンプル２個をそ
れぞれ、５０ｎ＋Ｍ　　ＫＣ６，２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆｆ　（ｐＨ８，０）、１０ｍＭ　ＭｇＣ６２、Ｉ
　ＡのプライマーＰＣＯ３，１−のプライマーＰＣＯ４
，２００ｎ　／　ｍｌのゼラチン、１０％ジメチルスル
ホキシド、並びにｌ、　５　ｍＭずつのｄＡＴＰ　。
ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰ及びＴＴＰを含有する１００Ｊ
の反応容量中に稀釈した。この混合物を９８℃で１０分
間加熱してゲノムＤＮＡを変性した後、サンプルを室温
に冷却し、そして例１に記載したテルムス・アクアチク
スからのポリメラーゼ４Ｉを各サンプルに加えた。サン
プルに鉱油を重層して凝縮及び蒸発ロスを防止した。
サンプルの１つを例１に記載した機械の加熱ブロックに
入れ、そして次のプログラムサイクルを反復して２５サ
イクルの増刷にかけた。
（ｉ）２．５分間にわたり３７℃から９３℃に加熱し； （２）３分間にわたって９３℃から３７℃に冷却するこ
とによりプライマー及びＤＮＡをアニールせしめ；そし
て （３）３７℃に２分間保持した。
最終サイクルの後、サンプルを６０℃にてさらに１０分
間インキュベートして最終伸長反応を完結した。
第二サンプルを温度サイクル（加熱及び冷却）機の熱伝
導コンテナーに入れた。この機械においては、熱伝導コ
ンテナーに温度を上方又は下方に調節するベルティール
ヒートポンプ並びに増幅サイクル、温度レベル、温度勾
配及び温度のタイミングを自動的にコントロールするマ
イクロプロセッサ−に取り付けられる。
第二サンプルを、次のプログラムサイクルを反復する２
５サイクルの増幅に付した。
（ｉ）３分間にわたり３７℃から９５℃に加熱し； （２）９５℃に０．５分間保持して変性を生じさせ； （３）１分間にわたり９５℃から３７℃に冷却し；そし
て （４）３７℃にて１分間保持する。
■、アフセイ 分析、すなわちドツトプロット分析及びアガロース分析
のために２つの試験を行った。
ドツトプロット分析のためには、次の配列：５′−“Ｃ
ＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣ−３’　（Ｒ３
１８）のラベルされたＤＮＡプローブを調製した。この
配列中＊はラベルを示す。このプローブは１９塩基の長
さを有し、遺伝子の第４〜第７コドンを含み、そして正
常β−グロビン対立遺伝子（βＡ）に相補的である。プ
ライマー及びプローブの概略の関係を次に示す。
以ｇ：：：ｉ＋−丁一 このプローブを、例１．■、に記載した方法により合成
した。１０ｐｍｏｌｅのプローブを４ユニツトＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ及び約４Ｑｐｍｏｌｅのｒ−”Ｐ
−ＡＴＰ　（約７０００Ｃｉ　／　ｍｍｏ　ｌｅ）と、
７０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ７，６）　、
１０ｍＭ　ＭｇＣｆｚ　、１．５ｍＭスペルミン及び１
０ｍＭジチオスレイトールを含む４０μ！の反応容量中
で３７℃にて６０分間接触せしめた。
次に２５ｍＭ　ＥＤＴＡにより全容量を１００４に調整
し、そしてＴｒｉｓ　−ＥＤＴＡ　（ＴＥ）緩衝液（ｉ
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　
、　ｐＨ８，Ｏ）で平衡化された１−スピン透析カラム
上でＭａｎｉａｔｉｓ等、前掲、ｐ４６６−４６７の方
法に従って情調した。反応生成物のＴＣＡ沈澱は、Ｒ３
１Ｂについては比活性が４．６　ｐ　Ｃｉ／　ｐ＋５ｏ
ｌｅでありそして最終濃度が０．１１４ｐｍｏｌｅ／μ
！であることを示した。
前記１．からの増幅されたサンプル５　ｐｌ、及び熱安
定酵素の代りにＥ、コリＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅ
ｎｏ−断片を用いたほか前記の方法と同様にして増幅し
たサンプル５μノを、１９５μｌの０．４ＮＮａＯＨ１
２５ｍＭ　ＥＤＴＡにより稀釈し、そして２枚のナイロ
ンフィルターにスポットした。この場合、まずフィルタ
ーを水で湿し、フィルターを適切な場所に保持するドツ
トプロットｓＪ製用装置に入れ、サンプルを適用し、そ
してＲｅｅｄ及びＭａｎｎ、、前掲、により開示されて
いる様にして０．４ｄの２０　Ｘ　５ＳＰＥ（３，６Ｍ
　　ＮａＣ１、２００ｍＭ　Ｎａ１ｌｚＰＯ４，２０ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ）で各ウェルをすすいだ。次に、フィルタ
ーを取り出し、そして真空オーブン中で８０℃にて３０
分間加熱した。
加熱の後、各フィルターを、５ｘＳＳＰＥ、５×デンハ
ート？容？夜（Ｉ　Ｘ　＝０．０２％ポリビニルピロリ
ドン、０．０２％フィコール、０．０２％ウシ血清アル
ブミン、０．２　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　０．２　ｍＭ　
ＥＤＴ＾、ｐＨ８，０）及び０．５％ＳＯ３から成るハ
イブリダイゼーション溶液６−と接触せしめ、そして５
５℃にて６０分間インキユヘートした。次に、５ｕｌの
プローブＲ５１８をハイフ゛リダイゼーションを容ン夜
にカロえ、そしてフィルターを５５℃にて６０分間イン
キユヘートした。
最後に、ハイブリダイズした各フィルターを１００ｍ１
の２ＸＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳで２回室温にて１０
分間洗浄した。次に、フィルターをさらに２回（ｉ回は
１分間、２回目は３分間）１００艷の５×５ＳＰＥ、０
．１％ＳＯＳにより処理した。
次に、各フィルターをオートラジオグラフ処理し、シグ
ナルは９０分間後に容易に現われた。
アガロースゲル分析において、５μ！ずつの増幅反応混
合物を、Ｉ　ＸＴＢＥ　緩衝液（０，０８９Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ、０．０８９Ｍ硼酸及び２ｍＭ　ＥＤＴＡ）中４％）
ｉｕＳｉｅｖｅｌｏ、５％アガロースゲルに負荷し、そ
して１００　Ｖにて６０分間電気泳動した。臭化エチジ
ウムで染色した後、ＤＮＡをＵ■蛍光により可視化した
。
この結果は、例１において使用した機械及びこの例がＤ
ＮＡの増幅において同様に効果的であることを示し、目
的の配列に対応する同様の強度の別個の高強度１１０塩
基対、並びに非常に低強度の少数の他の別個のバンドを
示した。これに対して、Ｅ、コリーポリメラーゼＩのフ
レノウフラグメントを用いて各サイクルの後に試薬を移
送する増幅方法は、多くの無関係のＤＮＡ配列の非特異
的増幅から住するＤＮＡのよごろ（ｓｍｅｒ）をもたら
した。
ｔｌＬＡ−ＤＱ　、　ＯＲ及びＤＰ病変の評価において
、増幅及び検出の同様の改良が達成されることが期待さ
れる。
上記の実験において、増幅反応緩衝液が１０ａ＋ＭＭｇ
ＣＪ　２ではな（２１１１Ｍ　ＭｇＣ１ｚ　、及び１．
５ｍＭずつではなく１５０〜２００声ずつの各ヌクレオ
チドを含有する場合、並びに増幅の間３７℃の低温を４
５℃〜５８℃に上げた場合、増幅の一層良好な特異性及
び効率が得られる。さらに、ＤＭＳＯは増幅のために必
要でないか、又は好ましくないことが見出された。
■１ ヒトβ−グロビン遺伝子上の１１９塩基対断片の増幅の
ため、Ｍｏ１ｔ４セルラインがら又はＧＭ２０６４Ｍｏ
１ｔ４セルラインδ−ヒモグロビン領域のホモ接合性欠
失を代表し、そしてヒト・ケノミフク・ミュータント・
セル・デポンジトリー、カムデン、ＮＪから得られる）
を、５０ｍＭ　ＫＣｌ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（ｃＪ
！　　（ｐＨ８）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ！ｚ、２００
ｆｇ／＠ｌゼラチン、５ｍＭ２−メルカプトエタノール
、１．５ｄ門ずつのｄＡＴＰ　、　ｄＣＴＰ　、　ＴＴ
Ｐ及びｄＧＴＰ、並びに１岸ずつの次のプライマー： を含有する１００Ｉｌｌの反応容量中で増幅した。上記
プローブの配列中、小文字は制限酵素部位を形成するた
めの野性型配列からのミスマツチを示す。
ＧＨ１８は負鎖に対して相補的な２６−塩基のオリゴヌ
クレオチドであり、そして内部Ｐｓｔ１部位を含有する
。ＧＨ１９は、玉鎖に対して相補的な２９−塩基オリゴ
ヌクレオチドであり、そして内部Ｈｉｎｄ■認識部位を
含有する。これらのプライマーは、Ｐｓｔｌ及びＨｉｑ
ｄＩ［［制限部位に相同な遺伝子の領域をまずスクリー
ニングすることにより選択された。次に、例１に記載し
たようにしてプライマーを調製した。
上記の反応混合物を９５℃にて１０分間加熱しそして次
に室温に冷却した。例１に記載したポリメラーゼ合計４
μｌを各反応混合物に加え、そして次に各混合物に鉱油
を重層した。この反応混合物を次のプログラムによる３
０サイクルの増幅に付した。
２分間にわたり３７℃から９８℃に加熱し；３０分間に
わたり９８℃から３７℃に冷−却し；そして ３７℃に２分間浸漬する。
最終サイクルの後、反応混合物を６５℃にて２０分間イ
ンキュベートして最終伸長を完結した。
クロロホルムにより鉱油を抽出し、そして混合物を一２
０℃に貯蔵した。
合計１０４の増幅生成物を、一般に入手可能なＭ１３ｍ
ｐｌＯクローニングベクター０．５ｎと共に、５０ｍＭ
　ＮａＣｊ！　、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　　（
ｐｉ（７，８）　、１０ｍＭＭｇＣβ２．２０ユニソ）
（７）Ｐｓｔｌ及び２６ユニツトのＨｉｎｄＩ［［を含
有する５０μ！の容量中で３７℃にて９０分間消化した
。−２０℃に凍結することにより反応を停止した。Ｔ［
１衝液により容量を１１０μｌに調整し、そして１００
μ！を１ｍ！のビオゲルＰ−４スピン透析カラムに負荷
した。１個の０．１−画分を集め、そしてエタノール沈
澱せしめた。
（この時点において、６Ｍ２０６４サンプル中にβ−グ
ロビン増幅生成物が存在することが見出された。
次の実験は、プライマーＧＨ１８又はＧ　Ｉ＋　１９へ
の汚！０源を追跡した。他のプライマー源が得られなか
ったので、若干のクローン化配列がプライマー中の汚染
ＤＮＡに由来するであろうと理解して実験を続けた。） エタノールペレットを１５μｌの水に再Ｈ？、％　Ｑし
、次に５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ７，８
）　、１０ｎ＋Ｍ　Ｍｇ１Ｊ　ｚ、０、５　ｍＭ　ＡＴ
Ｐ、１０鱈ジチオスレイトール及び４００ユニツトのり
ガーゼを含有する２０μ！容量に調整した。〔１ユニツ
トは、５′末端濃度０．１２ｍＭ　（約３００！ｊ！／
ａＺ）　）において２０ｕ１中で、１６℃にて３０分間
に、ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたλＤＮＡの５０％の連
結をもたらすのに必要な酵素の量である。この混合物を
１６℃にて３時間インキュベートした。
Ｍｏ１ｔ　４　ＤＮＡを含有する１０μｌの連結反応混
合物を、−ｉに入手可能なＥ、コリＪＭ１０３のコンピ
テント細胞に形質転換した。形質転換された株を調製す
るための方法はＭｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、（ｉ９８１）Ｔｈ
ｉｒｄＣｌｅｖｅｌａｎｄ　　Ｓ　ｒｎ　　ｏｓｉｕｍ
　　ｏｎ　　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｒｅｃｏ
ｍ−ｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　、　Ａ、Ｗａｌｔｏｎｌｉ
、エルゼビール、アムステルダム、　１４３−１６３に
記載されている。合計６５１個の無色のプラーク（及び
０個の青色プラーク）が得られた。これらの内、１１９
個（ｉ８％）はく＋）鎖挿入部を有し、１９個（３％）
は（−）鎖挿入部を有していた。これば、Ｅ、コリーポ
リメラーゼ■のＫｌｅｎｏ−フラグメントを用いる増幅
技法からのプライマー−陽性プラーク中のβ−グロビン
鴎性プラークのパーセントのほとんど２０倍である。Ｋ
　１　ｃｎｏ−フラグメントを用いる方法においては、
反応を２５℃にて２分間行い、次に１００℃への加熱段
階を２分間行い、冷却し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを
添加し、そして反応を９回反復した。
これらの結果は、この発明の熱安定酵素を用いる増幅反
応の改良された特異性を確認している。
ＧＭ２０６４及び汚染されたプライマーを用いる後のク
ローニング実験においては、５１０個の無色プラーク中
４３個（８％）が（＋）鎖挿入部を有していた。これは
、Ｍｏ１ｔ４からの１１９クローンの約半分が汚染配列
を含有することを示唆する。
Ｍｏ１ｔ４からの（＋）鎖クローンの１０個を配列決定
した。５個は正常な野性型配列であり、そして１個のＣ
からＴへの変異を遺伝子の第二コドンの第三位置に有し
ていた（ｃＡＣ−ＣＡＴ）。ＧＭ２０６４からの汚染ク
ローンの４個を配列決定し、４個すべてが正常であった
。
上記の技法を用いながら、制限部位変形プライマーを用
いてヒ）　Ｎ　−ｒａｓ発癌遺伝子を増幅し、クローン
化し、そして部分的に配列決定し、及び）ＩＬＡＤＱ−
α、ＤＱ−β及びＤＲ−β遺伝子の塩基対セグメントを
クローン化するために使用することができる。
以下余白 Ｍ［（ 止血ｊ震榎支索 Ａ、、Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子のためのＤＮＡ配列プ
ローブの同定 Ｔａｑ　Ｂｇｐ遺伝子のための特異的ＤＮＡ配列プロー
ブを、λｇｔｌ１発現ライブラリーの免疫的スクリーニ
ングにより得た。Ｔ、アクアチフスのＤＮＡを人１ｕｌ
により完全消化し、ＥｃｏＲｌ　１２−マーリンカ−（
ｃＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ、ニューイングランドバイオ
ラプス）に連結し、ＥｃｏＲＩで消化し、そして旦ｃｏ
ＲＩ−消化され脱リン酸化されたλｇｔｌｌ　ＤＮＡ（
プロゲマ・バイオチク）と連結した。連結されたＤＮＡ
をパッケージしくジガパノクプラス、ストラテジーン）
、そしてＥ、コリに一１２株Ｙ１０９０（Ｒ，Ｙｏｕｎ
ｇより入手）にトランスフェクトした。
２Ｘ１０５プラークの最初のライブラリーを、精製され
たＴａｑポリメラーゼ（例１及び例６を参照のこと）に
対するラビットポリクローナル抗血清の１：２０００稀
釈物を用いてスクリーニングした（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，
Ａ、及びＲ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ（ｉ９８３）　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　。
２２２　ニア７８−７８２）。候補プラークを限界稀釈
で再プレートし、そして均一になるまで（約３サイクル
）再スクリーニングした。免疫前血清と反応せずそして
免疫血清と反応する候補プラークからファージを精製し
た。
候補ファージを用いてＥ、コリに一１２株Ｙ１０８９（
Ｒ，Ｙｏｕｎｇ）を溶原化した。溶源菌を、’ｌ”　ａ
　ｑポリメラーゼ抗血清と反応するＩＰＴＧ誘導性融合
蛋白質（β−ガラクトシダーゼより大）の産生について
スクリーニングした。固相のサイズ分画された融合蛋白
質を用いて、全ポリクローナル抗体からエピトープ特異
的抗体をアフィニティー精製した（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ
、　Ｌ、Ｓ、Ｂ、等（ｉ９８６）Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏ
ｌ、　　１０２　：２０７６−２０８７）　　。
１つり上げられた”エピトープ−選択された抗体をウェ
スタン分析において用いて、Ｔａｑポリメラーゼに特異
的なり　Ｎ　Ａ配列をコードしているλｇｔｌｌファー
ジ候補を同定した。λｇｔ：１と称する１つのλｇｔｌ
ｌファージ候補が、精製されたＴａｑポリメラーゼ及び
Ｔａｑポリメラーゼを含有する粗抽出画分の両者と特異
的に反応する抗体を、全ラビットポリクローナルＴａｑ
ポリメラーゼ抗血清から特異的に選択した。このファー
ジλｇｔ：１を使用してさらに検討した。
テルムス・アクアチクスＤＮＡの約１１５ｂｐのＥｃｏ
ＲＩ−適合人１ｕＩ断片をラベルしくＭａｎｉａｔｉｓ
等、前掲）で、Ｔａｑポリメラーゼ特異的プローブを形
成した。このプローブをサザン分析において、及び１゛
、アクアチフスＤ　Ｎ　Ａランダムゲノムライブラリー
をスクリーニングするために用いた。
Ｂ、テルムス・アクアチクス−ランダムゲノムライブラ
リーの造成及びスクリーニング λフアージシャロン３５　（Ｗｉｌｈｅｌｍｉｎｅ、Ａ
、Ｍ、等、前掲）をその接着末端を介してアニールしそ
して連結し、Ｂａｎ旧により完全消化し、そしてアニー
ルされたアームをスタファー（ｓ　ｔｕ　ｆ　ｆ　ｅｒ
）フラグメントから、酢酸カルシウム密度勾配超遠心（
Ｍａｎｉ−ａｔｉｓ等、前掲）により精製した。Ｔ、ア
クアチフスのＤＮＡをＳ　ａｕ３Ａで部分分解し、そし
て１５〜２０ｋｂサイズの両分をシュークロース密度勾
配超遠心により精製した。標的ＤＮＡフラグメント及び
ベクターＤＮＡフラグメントを１：１のモル比で連結す
ることによりランダムゲノムライブラリーを造成した。
ＤＮＡをパッケージし、そしてＥ、コリに一１２株ＬＥ
３９２又はに８０２にトランスフェクトした。９９％以
上の組換体を含有する２０．０００以上の最初のファー
ジのライブラリーをＥ、コリに一１２株ＬＥ３９２上で
増幅した。
λｇｔｌｌ：１の放射性ラベルされたＥｃｏＲＩ挿入部
によりＣＨ３５Ｔａｑゲノムファージライブラリーをス
クリーニングした（マニアチス等、前掲）。特異的にハ
イブリダイズする候補ファージプラークを精製し、そし
てさらに分析した。ＣＨ３５：：４−２と称する１つの
ファージが、ＨｉｎｄＩＩＩによる消化の後に４個以上
のＴ、アクアチフスＤＮＡフラグメントを放出した（約
８．０　、４．５　、０．８　、０．５８ｋｂ）。
４種類のＨｉｎｄｌｌｌＴ、アクアチフスＤＮＡフラグ
メントを、ＨｉｎｄＩ［Ｉで消化したプラスミドＢＳＭ
１３″″　（３，２ｋｂ、ベクタークローニングシステ
ムス、サンジエゴ）に連結し、そしてそれぞれＥ。
コリに一１２株ＤＧ９８の形質転換にクローン化した。
Ｃ１１３５：：４−２からの約８．０ｋｂ（７）基１ｎ
ｄＩｎＤＮＡ７ラグメントをプラスミドｐＦＣ８２（ｉ
１，２ｋｂ）中に華離し、他方ＣＨ３５：：４−２から
の４．５ｋｂ且１ｎｄＩ［ｌＤＮＡフラグメントをプラ
スミドｐＦＣ８３（７，１ｋｂ）中に単離した。
ｐＦＣ８２を含有するＥ、コリＤＧ９８株は熱安定性高
温Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ活性を含有することが示され
た（第１表）。さらに、この細胞は、免疫的にＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼと関連する新たな約６０ｋｄの分子量
のポリペプチドを合成する。
８．０ｋｂ且１ｎｄＩ［［ＤＮＡフラグメントのＴａｑ
ポリメラーゼコード領域をさらに、８．０ｋｄＨｉｎｄ
　ｍフラグメントのｊ−プロモーター近位２．８ｋｂＨ
ｉｎｄＩｎ−人且７１８部分に位置付・げた。この領域
をサブクローニングしてプラスミドｐＦＣ８５（６，０
ｋｂ）を得た。Ｉ　ＰＴＧと共にインキュベートした後
、プラスミドｐＦＣ８５を含有するＥ、コリＤＧ９８細
胞は、もとの親クローン（ｐＦＣ８２／　ＤＧ９Ｂ）に
比べて１００倍までの熱安定性Ｔａｑポリメラーゼ関連
活性を合成する（第１表）。ｐＦｃ８５を含有する細胞
は有意量の熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性を合成するが
、Ｔａｑ匹Ｉ　　Ｄ？ＩＡ配列の一部分のみが翻訳され
、約６０ｋｄのＴａｑポリメラーゼ関連ポリペプチドの
蓄積が起こる。
玉−上一表 Ｅ、コリ（ｉ）における熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性
の発現 ＢＳＭ１３／ＤＧ９８−　　　　　　　　　０．０２ｐ
ＦＣ８２／ＤＧ９８　　　　　２．２　　　２．７ｐＦ
Ｃ８５／ＤＣ９８１１，９６４３，８（Ｉｔ）細胞は後
期対数期まで増殖せしめ（十／−ＩＰＴＧ　、　１０ｍ
Ｍ）　、集菌し、音波処理し、７５℃にて２０分間加熱
し、遠心し、そして透明な上清を７０℃にてＤＮＡポリ
メラーゼ活性について測定した。
（本）１ユニット−３０分間に１　ｎＭ　ｄＣＴＰの導
入。
この発明の熱安定酵素の遺伝子は種々の細面発現ベクタ
ー、例えばＤＧ１４１（ＡＴＣＣ３９５８Ｂ）及び１）
ＰＬ　Ｎ　ａｓｓ　ＡＴＧ中で発現せしめることができ
る。
これらの宿主ベクターの両者はｐＢＲ３２２の誘導体で
あって、トリプトファン・プロモーターオペレーター及
びＡＴＧ開始コドンと作用可能に連結されたりボゾーム
結合部位（ＤＧ１４１）　、又はＡＰＬプロモーターを
含む配列及びＡＴＧ開始コドンに作用可能に連結された
遺伝子Ｎ結合部位（ｉ）ＰＬ　Ｎ　＊５ｓＡＴＧ）を有
する。これらの宿主ベクターのいずれか一方を盈ａｃｌ
により制限酵素処理し、そしてＫｌｅｎｏ−又はＳ１ヌ
クレアーゼにより平滑末端化して、。Ｔａｑポリメラー
ゼ遺伝子を後で挿入するための便利な部位を作ることが
できる。
次の様にして、プラスミドｐＦＣ８３及びｐＦＣ８５に
サブクローニングされたＤＮＡ挿入フラグメントから完
全な長さのＴａｑポリメラーゼ遺伝子を造成した。ベク
ターＢＳＭ１３°　（ベクタークローニングシステムス
、サンジエゴ、ＣＡから市販されている）をユニークＨ
ｉｎｄＩ［［部位において消化し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄ
ＮＴＰにより修復し、そしてＴ４　ＤＮＡリガーゼを用
いて鉦■オクタヌクレオチドチドリン力−５’　−ＣＡ
ＧＡＴＣＴＧ−３’に連結し、そしてＥ、コ１ＪＤＧ９
８株に形質転換した。Ａｍｐ”土匹Ｚ＆°形質転換体か
らプラスミドを単離した。クローンの１つを旦ＪＬＬＩ
［及び人且７１８により消化し、そして大ベクターフラ
グメントをゲル電気泳動により精製した。
次に、プラスミドｐＦＣ８３を鉦■及びＨｉｎｄｌ［［
で消化し、そして約７５０ｂｐのフラグメントを単離し
た。プラスミドｐＦＣ８５をＨｉｎｄｌＩＩ及び人■７
１８で消化し、そして約２．８ｋｂのフラグメントを単
離し、そして３片連結によりｐＦＣ８３からの約７５０
ｂｐの旦ＬＬＩＩ−且ｉｎｄ　ＩＩＩフラグメント及び
ＢＳＭ１３”のｌ旺■−人並７１８ベクターフラグメン
トと連結した。この連結混合物を用いてＥ、コリＤＧ９
８株（ｉ９８４年７月１３日に寄託のＡＴＣＣ！１ｋＬ
３９．７６８）を形質転換し、これからＡ醜ｐＨコロニ
ーを選択し、そして約６．７５ｋｂのプラスミド（ｐＬ
ｓＧｌ）を単離した。ｐＬＳＧ　１を含有するイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）−誘導Ｄ
Ｇ９Ｂ細胞は、Ｔ、アクアチフスから単離された天然酵
素とはサイズを異にするＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを
合成した。次に、プラスミドｐＬｓＧｌを用いて、ベク
タークローニングシステムスにより推奨される方法に従
って単鎖ＤＮＡ鋳型を形成することができる。
次に、オリゴヌクレオチド−指令変異誘発（Ｚｏｌｌｅ
ｒ及びＳｍ１ｔｈ、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（ｉ
９８２）１０：６４８７−６５００〕を用いてＡＴＧ開
始コドンの部分としてｋｌ制限部位を導入することがで
きる（Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子のコード配列中の内部
Ｈｉｎｄ■部位のヒ流に）。同様にして、遺伝子のカル
ボキシ末端の後（Ａ社７１８部位から約０．７ｋｂ上流
）にＨ■部位を導入して発現ベクターへのＴａｑポリメ
ラーゼ遺伝子のサブクローニングを容易にすることがで
きる。部位特定変異誘導を終った後、遺伝子をＢＳＭ１
３”から約３．２ｋｂの旦吐Ｉ一旦５ｔＥＩＩ制限フラ
グメント上に単離し、Ｋｌｅｎｏ−フラグメント及び４
種類すべてのｄＮＴＰにより処理し、そしてＴ４ＯＮＡ
リガーゼを用いて（平滑末端条件）、あらかじめ５ａｃ
ｌで消化し、Ｋｌｅｎｏ−及びｄＮＴＰにより修復しそ
してウシ腸ホスファターゼで処理して脱リン酸化平滑末
端を形成しておいた前記の発現ベクターに挿入すること
ができる。この連結混合物を用いてＥ、コリＤＧ１１６
を形質転換し、そして得られる形質転換体をＴａｑポリ
メラーゼの産生についてスクリーニングする。酵素の発
現は、ウェスタンイムノプロット分析及び活性分析によ
り確認することができる。
プラスミドｐＦＣ８５の約２．８ｋｂの■ユｎｄ　ｍ−
へ杼７１８フラグメント中に含有されるＴａｑポリメラ
ーゼ遺伝子のより大きな部分を、例えばプラスミドｐＰ
ｔ　Ｎ　＊ｍｓ　ＡＴＧを用いて、Ｔａｑ　匹り遺伝子
をコードするアミノ−末端ＨｉｎｄＩ［Ｉ制限部位をＡ
ＴＧ開始コドンに連結することにより、発現せしめるこ
とができる。この融合体の発現生成物は約６６、０００
〜６８，０００ドルトンの端が切り取られたポリメラー
ゼをもたらす。
この特定の造成は、プラスミドｐＦＣ８５を且ｉｎｄ■
で消化し、そしてｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ
（７）存在下でＫｌｅｎｏ＠フラグメントで処理するこ
とにより行うことができる。生じたフラグメントを８１
ヌクレアーゼでさらに処理することにより単鎖延長部を
除去し、そして生じたＤＮＡをＡ１１１８で消化し、そ
して４種類すべてのｄＮＴＰの存在下でＫｌｅｎｏｗフ
ラグメントにより処理する。回収された断片を、Ｔ４Ｄ
ＮＡ　リガーゼを用いて、あらかじめ５ａｃｌにより消
化しそしてｄＧＴＰの存在下でＫｌｅｎｏ−フラグメン
トで処理してＡ、ＴＧ平滑末端を形成しておいた脱リン
酸化プラスミドＩ）Ｐｔ　Ｎ□３　ＡＴＧに連結するこ
とができる。次に、この連結混合物を用いてＥ。
コリＤＧ１１６を形質転換し、そして形質転換体をＴａ
ｑポリメラーゼの産生についてスクリーニングする。や
はり、ウェスタンイムノプロット分析及び活性分析によ
り発現を確認することができる。
班ｉ Ｉ盟 熱安定性ポリメラーゼは、後に記載する例に従って、テ
ルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ■翌ｕ匹蛙の培
養物から直接精製することができ、あるいは粗抽出物の
調製において必要なわずかな変更を伴って、組換生産さ
れた酵素を含有する細菌培養物から精製することができ
る。
遠心分離により集菌した後、６０ｇの細胞を５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　　（ｐＨ８，１）及び１　ｍ）’Ｉ
　ＥＤＴ＾を含有する緩衝液７５−中に懸濁した。細胞
をフレンチプレス中で１４，０００〜１６．０００Ｐｓ
■にて溶菌し、この後４容積（３００ｍｆｆｉ）の追加
のＴｒｉｓ　−ＥＤＴＡを加えた。緩衝液Ａ（β−゛メ
ルカプトエタノールを５ｓＭに、そしてＮＰ　−４０及
びトウィーン２０をそれぞれ０．５ｖ／Ｖ％に）を添加
し、そしてこの溶液を冷却しながら十分に音波処理した
。得られる均質懸濁液を緩衝液Ａによりさらに稀釈して
最終容量が出発細胞重量の７．５〜８倍となるようにし
た。これを画分ｌと称する。
画分Ｉ及び上清画分中のポリメラーゼ活性を、０．０２
５Ｍ　ＴＡＰＳ−ＨＣｊ！　　（ｐｔ１９．２　、２０
℃）　、０．００２ＭＭｇＣｌ　ｚ　、０．０５ＭにＣ
ｊ！、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２　ｍＭ
ずつのｄＧＴＰ　、　ｄＡＴＰ　、　ＴＴＰ　　、　０
．１　ｄｄＣＴＰ−（α−”Ｐ　、　０．０５Ｃｉ／ｍ
Ｍ］　、１２．５Ｒ″活性化されたゝサケ精子ＤＮＡ及
び０．０１〜０．２ユニツトのポリメラーゼ（ｉ０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　、　ｐＨ８，５０ｍＭＭＣ６，
１■／−のオートクレーブされたゼラチン、０．５％Ｎ
Ｐ　−４０，０，５％トウィーン２０及び１１１Ｍ　２
−メルカプトエタノール中に稀釈）を含んで成る５０μ
ｌの混合物中で測定した。ｌユニットは３０分間中１０
ｎＨの生成物に相当する。“活性化されたＤＮＡは、Ｄ
ＮＡの５％が酸可溶性画分に変るまでＤＮａｓｅ　Ｉに
より部分加水分解された後のＤＮＡの天然調製物である
。反応を７４℃にて１０分間行い、そして次に４０１１
！を２１１ＭＥＤＴＡ中５０ｎ／−のキりリヤーＤＮＡ
溶液１．０ａｆｆｉ（０℃）中に移した。同容１（ｉ，
０ｄ）の２０％ＴＣＡ及び２％ピロリン酸ナトリウムを
加えた。０℃にて１５〜２０分間の後、サンプルをワッ
トマンＧＦ／Ｃディスクを通して濾過し、そして冷５％
ＴＣＡ−１％ビロリン酸塩により十分に洗浄し、次に冷
９５％エタノールで洗浄し、そして乾燥し、計数した。
画分■を、ベックマンＴｌ４５０−ター中で３５．００
０ｒｐ＋ｍにて２時間、２℃にて遠心し、そして集めた
上清を画分■とした。
活性の９０〜９５％を沈澱せしめるのに必要なポリミン
（Ｐｏｌｎ＋ｉｎ）　Ｐの最少量（この量は一般に最終
容量の０．２５〜０．３％であることが見出された）を
決定した後、ポリミンＰ　（ＢＲＬ、ガイセルブルグ、
ＭＤ）（ＩＯＶ／Ｖ％、ｐＨ７，５に調整しそしてオー
トクレーブしたもの）によりＴａｑポリメラーゼ活性を
沈澱せしめた。
０℃にて１５分間にわたり攪拌しながら、適当なレベル
のボリミンＰを画分■に徐々に添加した。
この溶液を０℃にてベックマンＪＡ１４０−ター中で２
０分間にわたり１３．００Ｏｒｐｍにて遠心した。上清
の活性を測定し、そしてペレットを１１５容量の０．５
×緩衝液Ａ（水で１：２に稀釈したもの）に再懸濁した
。この懸濁液を再遠心分離し、そしてペレットを１／４
容量の緩衝液Ａ　（０，４Ｍ　ＭＣｌ１を含有）に再懸
濁した。この懸濁液を十分にホモジナイズし、そして４
℃に一装置いた。このホモジネートを前記のように遠心
し、そして集めた上清を画分■と命名した。
蛋白質画分を硫酸アンモニウムの７５％飽和での１沈澱
”により集め、遠心分離しく２７．００Ｏｒｐｍ、Ｓ−
２７０−ター、３０分間）そして浮上した薄膜を５０Ｔ
ＩＩＭ　Ｔｒｉｓ−１１（Ｊ　　（ｐ）１８）　、Ｉｎ
＋Ｍ　ＥＤＴＡ中に再懸濁した。これらの段階を反復し
、そして蛋白質懸濁液を８０１１！ＭＫＣ１を含有する
Ｐ−ｃｅｌｌ緩衝液（２０ｍＭにＰｏ４゜ｐｌ＋　７．
５．０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５ｍＭβ−メルカプト
エタノール、５　ｗ　／　ｖ％グリセロール、０．５ｖ
／ｖ％ＮＰ−４０及びトウィーン２０〕により十分に透
析した。
透析物を遠心ビンに移し、これに、８０ｍＭにＣ１を含
有するＰ−ｃｅｌｌｉ衝液ですすがれたサックから回収
された蛋白質を加えた。遠心を２０．０００Ｘ　ｇにて
行い、そして時間は１５分間に・短縮した。上清を貯蔵
し、そして残ったペレットをＰ−ｃｅｌｌｌｌ衝液及び
８０ｍＭ　Ｋ（Ｊ！により洗浄・抽出し、そして再遠心
した。次に上清を一緒にして画分■と命名した。
画分■を、８０ｎ＋Ｍ　ＫＣＩ！を含有するＰ−ｃｅｌ
ｌ緩衝液で平衡化したホスホセルロースの２．２　Ｘ　
２２　Ｃ１１ｌのカラムに適用した。このカラムを同じ
緩衝液で洗浄しくカラムの２．５〜３倍容量）、そして
Ｐ−ｃｅｌｌ緩衝液中８０〜４００ｍＭ　ＫＣｌ１の直
線グラジェントを用いて蛋白質を溶出した。ＤＮＡポリ
メラーゼ活性を含有する両分（約０．１８〜０．２０Ｍ
　ＫＣｌ）をプールし、そしてアミコン攪拌セル及びＹ
Ｍ３０膜上で３〜４倍濃縮した。このセルを、ＫＣｌを
含有しないＰ−ｃｅｌｌ緩衝液ですすぎ、そして両分濃
縮物（０，１５ＭＫＣｆ最終容量調整）に加えて画分■
とした。
画分■を、Ｐ−ｃｅｌｌｌｌ衝液及び０．１５Ｍ　Ｋ（
Ｊで平衡化したうバリン・セファロースＣＬ　−６Ｂカ
ラム（ファルマシア）５１ｄに適用した。カラムを０．
１５Ｍ　ＫＣ１緩衝液（３〜４カラム容量）により洗浄
し、そしてＰ−ｃｅｌｌ緩衝液中０．１５〜０．６５Ｍ
　ＫＣ４’の直線グラジェントにより蛋白質を溶出した
。５ＯＳ−ＰＡＥＧ分析のためにゼラチンを含まない稀
釈剤への１：１０稀釈を行い、そして酵素の測定に使用
するため１■／−のゼラチンを含有する稀釈剤への引続
いての１：２０稀釈を行った。活性画分（約０．３Ｍ　
ＫＣｌで溶出）を、スーパーコイルＤＮＡ鋳型上で特異
的及び非特異的エンドヌクレアーゼ／トポイソメラーゼ
について、過剰のＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベ
ートした後のスーパーコイルプラスミドＤＮＡの分子量
の変化を電気泳動により検出することによって測定した
。少量の線状ＤＮＡフラグメントとのインキュベーショ
ンの後エキソヌクレアーゼの汚染が検出された。ピーク
画分中、約８８ｋｄ蛋白質が主たるバンドであることが
見出された。画分■と称する主要画分は、このプールを
約３〜５ポリメラーゼユニツト／６００ｎｇ　ＯＮ八で
５５℃にて３０分間測定した場合、最少の検出可能なエ
ンドヌクレアーゼ活性を伴って最高のポリメラーゼ活性
を有していた。
画分■を、１０ｍＭ　ＫＰＯ４（＋）Ｈ７，５）　、５
ｏ＋Ｍβ−メルカプトエタノール、５％グリセロール、
０．２％ＮＰ　−４０及び０．２％トウィーン２０（Ｈ
Ａ緩衝液）に対して透析した。この透析されたサンプル
を、ヒドロキシアパタイトの３　ｍｌＯカラムに通用し
、そしてＨＡ緩衝液中１０〜２５０＋＋Ｍ　ＫＰＯａ　
（ｐｔｌ　７．５　）の直線グラジェントにより酵素を
溶出した。ポリメラーゼ活性は７５ｍＭ　ＫＰＯ４にお
いて溶出し始め、１００ｍＭ　ＰＯ４においてピークを
示した。活性ピーク画分を１　：１００−１　：３００
稀釈で測定した。前のクロマトグラフィ一段階における
ように、５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析のため、ゼラチンを含ま
ない稀釈剤中１：１０の稀釈物を調製した。５ポリメラ
ーゼユニツトで５５℃において有意なエンドヌクレアー
ゼ又は二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有しない両分を
プールし、そして百分■と命名した。
画分■を、２５１酢酸ナトリウム（ｐｔｌ　５．２　）
、５％グリセロール、５ｍＭβ−メルカプトエタノール
、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ＮＰ　−４０及び
０．１％トウィーン２０の溶液に対して透析し、室温に
おいてｐＨ５に調整した。透析されたサンプルを、あら
かじめ平衡化した２−のＤＥＡＥ−Ｔｒｉｓ−Ａｃｒｙ
ｌ−Ｍ（ＬＫＢ）カラムに適用し、そして次に同じ緩衝
液で洗浄した。
カラムに付着しなかったポリメラーゼ活性を含有する両
分をプールし、そして同じ緩衝液中５０ｍＭＮａ（４に
調整し、画分■を得た。
画分■を、同じ緩衝液（２５ｍＭ酢酸ナトリウム、５０
ｍＭ　ＮａＣ１，５％グリセロール、０．１　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ　。
０．１％ＮＰ　−４０及び０．１％トウィーン２０）で
平衡化された２−のＣＭ−Ｔｒｉｓ−Ａｃｒｙｌ−Ｍ（
ＬＫＢ）カラムに適用した。このカラムを、４〜５カラ
ム容量の同じ緩衝液で洗浄し、そして酵素を酢酸ナトリ
ウム緩衝液中５０〜４００ｍＭ　ＮａＣβの直線グラジ
ェントにより溶出した。ポリメラーゼ活性のピークは約
０．１５〜０．２０Ｍ　　ＮａＣ１においてン容出され
た。ポリメラーゼ活性を、５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析のため
ゼラチンを含有しない稀釈剤中にまず１：１０で稀釈し
、１：３００〜１’　：　５００稀釈において測定した
。７４℃にてＤＮＡポリメラーゼア・ノセイ塩（２５ｍ
Ｍ　ＴＡＰＳ−ＨＣＩ。
ｐＨ９，４，２，０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ及び５０ｍＭ　Ｋ
Ｃｌ）を用いて特異的及び非特異的エンドヌクレアーゼ
／トポイソメラーゼについてスーパーコイルＤＮＡ鋳型
に対する活性ピークにわたる測定を行い、さらにＭ１３
ｓｓＤＮＡ及びｐＢＲ３２２フラグメントに対するヌク
レアーゼの測定も行った。検出可能なヌクレアーゼを含
有しない活性画分をプールし、そして銀染色５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥミニゲル上を泳動せしめた。この結果は、約２５
０．０００ユニツト／■の比活性を有する約８８ｋｄの
単一バンドを示す。
氾 例６に記載したようにして精製されたＴａｑポリメラー
ゼは、Ｔａｑエンドヌクレアーゼ活性及びＴａｑエキソ
ヌクレアーゼ活性により汚染されていないことが見出さ
れた。さらに、Ｔａｑポリメラーゼは好ましくは、使用
される各非イオン性洗剤約０．１〜約０．５Ｖ／Ｖ％を
含有する貯蔵緩衝液中に貯蔵される。さらに好ましくは
、貯蔵緩衝液は５０　ｖ／ｖ％グリセロール、１００＋
＋Ｍ　ＫＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　　（ｐＨ
８，０）　、０．１　ｍＭエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）　、１　ｍＭジチオスレイトール、０．５Ｖ／
Ｖ％ＮＰ−４０，０，５ｖ／ｖ％トウィーン２０及び２
０ｎ／ｄゼラチンからなり、そして好ましくは一２０℃
で貯蔵される。
この貯蔵されたＴａｑポリメラーゼを、２５ｍＭＴｒｉ
ｓ　−ＨＣＩ　　（ｐＨｓ、　０　）、２０ｍＭ　ＭＣ
Ｉ！、Ｉｎ＋Ｍβ−メルカプトエタノール、０．５％Ｎ
Ｐ　−４０，０，５％トウィーン２０及び５００ｎ／−
ゼラチンから成る緩衝液に稀釈した。次に、５０ｍＭ　
ＫＩＪ　％　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　　（ａｌ１
８．３）　　、１．５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　　、０．０１
ｗ／　ｖ％ゼラチン、２００声ずつのｄＮＴＰ、　１ｍ
ずつのプライマー（バクテリオファージλからの対照鋳
型上の５００塩基対の標的配列を定義する）、及び２．
０〜２．５ユニツトのＴａｑポリメラーゼ／１測定を１
００μｌの最終容量中に含有する反応緩衝液を調製した
。この反応緩衝液に鋳型を添加し、サンプルを０．５　
ｄのポリプロピレンチューブに入れ、そしてサンプルを
１００ｍの重白色鉱油で覆って蒸発を防止した。
ｌｎｇの対照鋳型（バクテリオファージλＤＮＡ）を使
用し、標的配列がＤＮＡの出発量の約１％を占め、次の
条件を用いた場合、少なくとも１０’倍の増幅が達成さ
れた。
チューブを熱浴中に置くことにより９４℃にて３０秒間
、１分間にわたり鋳型混合物をまず変性した。次に、チ
ューブを３７℃の熱浴に２分間入れた。次に、チューブ
を７２℃の熱浴に３分間入れ、そして次に９４℃の熱浴
に１分間入れた。このサンプルを合計２５サイクル反復
した。２５回目のサイクルの終りにおいて、９４℃にお
ける熱変性段階を省略し、そしてその代りに、７２℃の
インキュベーション段階をさらに３分間延長した。
測定を停止した後、サンプルを室温に放冷し、そして先
行例において記載したようにして分析した。
異る濃度のｄＮＴＰ及び異る濃度のＴａｑポリメラーゼ
を用いて、鋳型を最適に増幅することができよう。さら
に、ＤＮＡサンプル中の標的配列のサイズは、適切な伸
長く７２℃でのインキュベーション段階）のために必要
な最短時間に影響を与えるであろう。最大の効率を得る
ため、増幅されるべき個々の鋳型について温度サイクル
プロフィールの最適化を行うべきである。
貫主 例１に記載したようにして精製したＴａｑポリメラーゼ
を先行する例において記載したようにして貯蔵のために
製剤化した。但し、非イオン性ポリマー洗剤を使用しな
かった。その例において記載したようにして活性を測定
した場合、この酵素貯蔵混合物は不活性であることが見
出された。貯蔵緩衝液にＮＰ　−２０及びトウィーン２
ｏを添加した場合、十分な酵素活性が保存されており、
酵素製剤の安定のために非イオン性洗剤が必要であるこ
とが示された。
劃」ユ ヒトゲノムＤＮＡの１ｎのサンプル数個を、同等のユニ
ット数のＫｌｅｎｏｗフラグメント又はＴａｑポリメラ
ーゼを用いて、例５に記載したようにして２０〜３５サ
イクルの増幅に付し、そしてアガロースゲル電気泳動及
びサザンプロットにより分析した。これらの反応におい
て使用されたプライマーＰＣＯ３及びＰＣＯ４はヒトβ
−グロビン遺伝子の１１０ｂｐセグメントの合成を指令
する。Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ増幅は、この酵素を用
いる場合に典型的に観察されるＤＮＡの汚れ（ｓｍｅａ
ｒ）を示し、その予想される原因は非特異的アニーリン
グ、及び本質的に非−ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件（Ｉ　ＸＫ１ｅｎｏｗ塩、３７℃）下で
の無関係のゲノム配列へのプライマーの伸長である。そ
れにもかかわらず、サザンプロットにおいて、すべての
レーンで特異的１１０ｂｐβ−グロービン標的フラグメ
ントが観察された。Ｔａｑポリメラーゼを用いて行われ
た増幅において実質的に異る電気泳動パターンが見られ
、この場合、単一の主要バンドは１１０ｂｐ標的配列で
ある。この顕著な特異性は疑いなくプライマーが伸長さ
れた時の温度によるものであった。
Ｋｌｅｎｏｗフラグメント増幅の場合のように、アニー
リング段階は３７℃で行われたが、Ｔａｑ−触媒反応の
温度を約７０℃に上昇せしめた後に酵素は有意な活性を
示した。３７℃から７０℃へのこの変温の間、貧弱にマ
ツチしたプライマー−鋳型バイブリド（３７℃で形成さ
れる）が解離し、反応混合物が酵素活性化温度に達する
時点までに、高度に相補的な基質のみが伸長のために利
用可能であった。この特異性はまた、Ｋｌｅｎｏ−フラ
グメントを用いて行われる同様の増幅に比べて高収量の
標的配列をもたらす。なぜなら、非特異的伸長生成物が
ポリメラーゼに関して効果的に競争し、これによりＫｌ
ｅｎｏ−フラグメントにより作られ得る１１０−マーの
量が減少するからである。
貫上見 １　ｎ　Ｍｏ１ｔ４ＤＮＡ　、　　５０１ｎＭ　ＫＣｊ
！　、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８、３）　、１０ｍＭ
　ＭｇＣＩ！ｚ　、０．０１％ゼラチン、１犀ずつの次
のプライマー（ｉ５０ｂｐｅ！域を増幅するためのもの
）： ５　’　−ＣＡＴＧＣＣＴＣＴＴＴＧＣＡＣＣＡＴＴＣ
−３’　（ＲＳ７９）及び ５　’　−ＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＴＴＧＴＡＧＣＴＧ
−３’　（Ｒ３８０）１、５　ｍＭずつのｄＮＴＰ及び
５．０ニー１−７トのＴａｑポリメラーゼを１００μｌ
の反応容量当りに含有するサンプルの増幅を行った。２
．５．１．３、又は０．６ユニー／　トのＴａｑポリメ
ラーゼを含有する３個の追加のサンプルをＡｍ　Ｎした
。次のサイ・クルを用いて前記の温度サイクル機中で３
０サイクルの増幅を行った。
１分間にわたり７０℃から９８℃に加熱し；９８℃にて
１分間保持し； １分間にわたり９８℃から３５℃、４５℃又は５５℃に
冷却し； ３５℃、４５℃又は５５℃に１分間保持し；１分間にわ
たり３５℃、４５℃又は５５℃から７０℃に加熱し；そ
して ７０℃に３０秒間保持する。
３５℃のアニーリング温度において、２．５ユニツト／
１００Ｊ１１のＴａｑ酵素稀釈物が、アガロースゲル電
気泳動において、他のすべてのＴａｑポリメラーゼ濃度
に比べて最良のシグナル：ノイズ比を与える。４５℃に
おいては、５ユニツト／１００μｌのＴａｑ酵素が、他
の濃度に比べて最良のシグナル：ノイズ比を与える。５
５℃においては、５ユニツト／１００ｕ１のＴａｑ酵素
が、他の濃度及び４５℃でのアニーリングに比べて最良
のシグナル：ノイズ比、及び改良された収量を与える。
Ｔａｑポリメラーゼは５５℃において一層特異性が高く
、そして一層好収量を与える。
別の実験において、Ｍｏｌ　ｔ　４　ＯＮＡを、ヒユー
マン・ゼネティフク・ミュータント・セル・デポジトリ
−（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅ
１ｌ　Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）　％カムデン、ニューシ
ャーシーから得られるβ−又はＴ−グロビン配列を含有
するセルラインＧＭ２０６４ＤＮＡに１０倍ごとに、細
胞当りのコピーの相違を代表する種々の濃度で稀釈し、
そしてこれらのサンプルについて、３５℃及び５５℃の
アニーリング温度においてこの例において記載したよう
にして増幅を行った。３５℃において、アガロースゲル
電気泳動により見ることができる最良のものは５０細胞
中１コピーであった。５５℃においては、見られる最良
のものは１　／　５．０００細胞（低温に比べて１００
倍の改良）であり、これらの条件下でのＴａｑポリメラ
ーゼの特異性のためには上昇したアニーリング温度が重
要であることが示された。
第三の実験において、ニューヨーク、シラクスのＢ、Ｐ
ｏ１ｅｓｚ州立大学から得られるＨＩＶ−陽性ＤＮＡを
含有するセルライン３６８ＨからのＤＮＡを同様にして
、ＳＣＩセルライン（ｉ９Ｂ５年３月１９日にＡＴＣＣ
に寄託されている；鎌形赤血球対立遺伝子についてホモ
接合性でありそしてＨＩＶ配列をすべて欠いているＥＢ
Ｖ−形質転換されたβ−セルライン）からのＤＮＡに、
細胞当りのコピーの相違を代表する種々の濃度で稀釈し
、そしてＨ１■配列の１１５ｂｐ領域を増幅するプライ
マー５Ｋ３８及び５Ｋ３９　： ５′〜ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧ
ＡＧＡＡＡＴ−３’　（ＳＫ３８）及び ５　’　−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣ
ＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’　（ＳＫ３９）を用いて、３５
℃及び５５℃のアニーリング温度において、この例に記
載したようにして増幅を行アガロースゲル電気泳動によ
る結果が示すところによれば、３５℃のアニーリング温
度においては未稀釈の３６８Ｈサンプルのみが検出され
たが、５５℃のアニーリング温度によれば少なくとも１
０−２稀釈を検出することができ、検出における１００
倍の改良が与えられた。
劃」」よ １１のラビット網状赤血球ｍＲＮＡ　（ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラドリース）から、ｃＤＮＡを、１５０＋＋
＋ＭＫｔＪ　　、　　５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　
　　（ｐＨ８，３）　　、　１０ｍＭ　　ＭｇＣｆ　２
　　、５ｍＭ　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　ｄＡＴＰ　　、０
．５ｍＭ　ｄＣＴＰ　　、０．５ｍＭＴＴＰ　、　０．
５　ｍＭ　ｄＧＴＰ　、　０．２　ｕｇオリゴ（ｄＴ）
　１２−１８（ファルコシア）、４０ユニツトＲＮａｓ
ｉｎ　（プロメガ・バイオチック）及び５ユニツトのＡ
ＭＶ逆転写酵素を含有する１００　ＩＪｌの反応容量中
で作り、そして４２℃にて３０分間インキュベートした
。
９５℃にて１０分間加熱することにより反応を停止した
。２ｎのＲＮａｓｅ　（水中２■／−の溶液２μりをサ
ンプルに加え、そして３７℃にてｌＯ分間インキュベー
［・シた。
異る対のプライマーを用いて、Ｋｌｅｎｏ−フラグメン
トにより３回の増幅反応を行った。プライマーＰＣＯ３
／ＰＣＯ４は１１０ｂｐの生成物を定義する。プライマ
一対Ｒ５４５／オリゴ（ｄＴ）２５−３０は約３７０ｂ
ｐの生成物を定義し、そしてブライマ一対ＰＣＯ３／オ
リゴ（ｄＴ）　２５−３０は約６００ｂｐの生成物を定
義する。ＰＣＯ３゜ＰＣＯ４、及びＲ５４５はヒトβ−
グロビン遺伝子に対して相補的であり、そしてラビット
遺伝子との間に２個のミスマツチを有する。ＰＣＯ３及
びＰＣＯ４は例１に記載されている。Ｒ５４５は配列：
５　’　−Ｃ＾・ＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴ八ＧＧＴＧＣＣ
−へ　’を有する。
増幅反応は、５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ！　、１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−１１（Ｊ　　（ｐｉｔ７、６　）　、１０ｍＭ　
ＭｇＣ１、，２００ｇ／−ゼラチン、１０％ＤＭＳＯ１
１囲ＰＣＯ３又はＲ３４５，１ｄ　ＰＣＯ４又はオリゴ
（ｄＴ）　２５−３０．１．５　ｍＭ　ｄＡＴＰ　、１
．５　ｍａｌ　ｄｃＴＰ。
１、５　ｎ＋Ｍ　ＴＴＰ及び１．５　ｍＭ　ｄＧＴＰを
含有する１００ｍの反応容量中で、前記のｃＤＮＡの１
／２０（５μりを用いて行った。サンプルを９８℃にて
５分間加熱し、次に室温に冷却し、そして１００βの鉱
油を重層した。
このサンプルを、例１に記載した機械を用いてそして次
のプログラムを用いて、１０サイクルの増幅に付した。
１）加熱ブロック中で２．５分間にわたり３７℃から９
８℃に加熱しく変性）； ２）３．０分間にわたって９８℃から３７℃に冷却しく
アニール）： ３）１ユニツトのＫｌｅｎｏ賀断片を添加し；そして４
）３７℃にて２０分間保持した（伸長）。
各サンプルの１／２０（７μりを２％アガロースゲル上
での電気泳動により分析した。臭化エチジウムにより染
色した後、ＰＣＯ３／ＰＣＯ４サンプル及び１’１ｓ４
５／オリゴ（ｄＴ）サンプル中に異るバンドが見られた
。バンドのサイズは予想した長さと一致した。
すなわち、前者については１１０ｂｐであり、後者につ
いては約３７０ｂｐであった。ＰＣＯ３／オリゴ（ｄＴ
）プライマ一対による約６００ｂｐフラグメントの増幅
の証拠はなかった。
ゲルの内容物をゲナントラン（Ｇｅｎａｎｔｒａｎ）ナ
イロン膜にサザンブロッティングし、そして標準的方法
により５ａｉｋｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ　、前掲、に記載
されているニックトランスレーションされたヒトβ−グ
ロビンプローブｐＢＲ３２８：βＡとハイブリダイズせ
しめた。得られたオートラジオグラムは前に達した結論
を拡張した。すなわち、ｔｔｏｂｐ及び約３７０ｂｐの
フラグメントはβ−グロビン特異的増幅生成物であり、
そして約ｅｏｏｂｐバンドの有意な増幅は検出されなか
った。
３個の追加のサンプルを、上記の様にして得られたＴａ
ｑポリメラーゼにより、前記と同じプライマ一対を用い
て増幅した。ｃＤＮＡの５回１部分を、５０１Ｍ　ＫＣ
ｊ！　、　２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ４（ｐＨ８，０）
　、ＩＯ＋ＭＭｇＣｊ！ｚ、２０Ｏｎ／−ゼラチン、１
０％ＤＭＳＯ１１囲ＰＣ０３又はＲ５４５，１オＰＣＯ
４又はオリゴ（ｄＴ）２５−３０゜１、５ｍＭ　ｄＡＴ
Ｐ　、　１．５ｍＭ　ｄＣＴＰ　、　１．５ｍＭ　ＴＴ
Ｐ及び１、５　ｍＭ　ｄＧＴＰを含有する１００ｍの反
応容量中で増幅した。サンプルを９８℃にて５分間加熱
し、そして室温に冷却した。１ｄのＴａｑポリメラーゼ
（ロット２の１／８稀釈物）をそれぞれに加え、そして
約１００Ｉの鉱油を重層した。
このサンプルを、次のプログラムを用いて前に記載した
ベリティール（Ｐｅｌｔｉｅｒ）の装置中で９サイクル
の増幅に付した。
１）１分間にわたり３５℃から６０℃に加熱し：２）１
２分間にわたり６０℃から７５℃に加熱しく伸長）； ３）１分間にわたり７０℃から９５℃に加熱しく変性）
； ４）９５℃に３０秒間浸漬し； ５）１分間にわたり９５℃から３５℃に冷却し（アニー
ル）：そして ６）３５℃にて３０秒間浸漬した。
最後のサイクルの後、サンプルをさらに１０分間７０℃
にてインキュベートすることにより最終＜１０サイクル
目）伸長を完結した。それぞれの最終容量は約１００μ
！であった。
前記のごとく、各サンプルの１／２０（ｉ０ｕりを２％
アガロースゲル上で分析した。このゲル中で、増幅生成
物は３個のサンプルすべてに存在した。すなわち、ＰＣ
Ｏ３／ＰＣＯ４については１１０ｂｐ、Ｒ５４５／オリ
ゴ（ｄＴ）については約３７０ｂｐ、そしてＰＣＯ３／
オリゴ（ｄＴ）については約６００ｂｐであった。
これらの結果は、サザン移行及びｐＢＲ３２８：βＡプ
ローブとのハイブリダイゼーションにより確認された。
Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによってではな（Ｔａｑポリ
メラーゼによる６００ｂｐ生成物の生成は有意であり、
そしてＴａｑポリメラーゼがＫｌｅｎｏｗフラグメント
より一層長いＤＮＡを生成せしめることができることを
示唆する。
下記のバタテリオファージ及び細菌株がシタス・マスタ
ー・カルチエア・コレクション（ｃｅｔｕｓＭａｓｔｅ
ｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ＣｏｌｌＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）
（ｃ、米国カリホルニア、エメリービル、　１４００．
５３ストリート、及びアメリカン・タイプ・カルチエア
・コレクション（ＡＴＣＣ）、米国マリ−ランド、ロッ
クビル、　１２３０１パークラウンドライブ、に寄託さ
れた。これらの寄託は、特許手続のための微生物の寄託
の国際的承認についてのブタペスト条約及びそれに基く
規則（ブタペスト条約）の規定のもとに行われた。
これは、寄託の日から３０年間にわたる生存培養物の維
持を保証する。これらの微生物はブタペスト条約の規定
のもとにＡＴＣＣにより入手可能にされ、そして関連す
る米国特許の発行の後の無限定の入手可能性を保証する
本件出願人とＡＴＣＣとの契約に従って入手可能にされ
るであろう。寄託された微生物の入手可能性は、いずれ
かの政府の権威のもとにその特許法に従って認められた
権利に反してこの発明を実施することの許諾であると解
してはならない。
微生物　　　　ＣＭＣＣ尚　ＡＴＣＣ阻　　　寄託日Ｃ
ｌｌ３５：Ｔａｑ＃４−２　　　３１２５　４０．３３
６　１９８７年５月２９日Ｅ、コリＤＧ９８／ｐＦＣ８
３３１２８６７，４２１１９８７年５月２９日Ｅ、コリ
ＤＧ９８／ｐＦＣ８５３１２７６７，４２２１９８７年
５月２９日要約すれば、この発明は、温度サイクル連鎖
反応及び熱安定酵素を用いる、１又は複数の特定の核酸
配列を増幅するための方法を提供し、この方法において
は次のプライマー伸長反応のための鋳型として機能し得
る反応プライマー伸長生成物が生成される。この方法は
、最初に非常に少量のみ存在する核酸配列を検出する場
合、及び配列特異的オリゴヌクレオチドを用いてヌクレ
オチド変化を検出する場合に特に有用である。
この発明の方法は、増幅された・生成物の収量の増加、
より高い特異性、及び増幅方法を行うのに必要な、従来
開示されていたのよりも少ない段階を提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドＢＳＭ１３”中にサブクローニン
グされた約４．５ｋｂのＨｉｎｄ　ｍ　１．アクアチク
スＤＮＡ挿入部を含有するプラスミドｐＦＣ８３の制限
地図である。 第２図は、プラスミドＢＳＭ１３”中にサブクローニン
グされた約２．８ｋｂの且ｉｎｄ　ｍ　−Ａｓｐ７１８
　Ｔ、アクアチクスＤＮＡ挿入部を含有するプラスミド
ｐＦＣ８５の制限地図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するためヌク
    レオチドトリホスフェートの結合を触媒する、精製され
    た熱的に安定な酵素。 ２、ＤＮＡポリメラーゼである、特許請求の範囲第１項
    記載の酵素。 ３、約８６，０００〜９０，０００ダルトンの分子量を
    有する、特許請求の範囲第１項または第２項記載の酵素
    。 ４、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕ
    ａ−ｔｉｃｕｓ）に由来する、特許請求の範囲第３項記
    載の酵素。 ５、ｐＨ６．４では、ｐＨ８．０の活性の少なくとも５
    ０％の活性を有する、特許請求の範囲第１項〜第４項の
    いずれか１項記載の酵素。 ６、天然の形体である特許請求の範囲第１項〜第５項の
    いずれか１項記載の酵素。 ７、特許請求の範囲第２項記載の酵素をコード化する遺
    伝子。 ８、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕ
    ａ−ｔｉｃｕｓ）のゲノムからクローン化された、特許
    請求の範囲第７項記載の遺伝子。 ９、分子量が約８６，０００〜９０，０００ダルトンで
    ある酵素をコード化する、特許請求の範囲第８項記載の
    遺伝子。 １０、分子量が約６０，０００〜６５，０００ダルトン
    である酵素をコード化する、特許請求の範囲第８項記載
    の遺伝子。 １１、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑ
    ｕａ−ｔｉｃｕｓ）またはバクテリオファージＣＨ３５
    ：Ｔａｑ＃４−２のいずれかの約３．５ｋｂのＢｇｌI
    I−Ａｓｐ７１８（部分）制限フラグメント内に含まれ
    る、特許請求の範囲第９項記載の遺伝子。 １２、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑ
    ｕａ−ｔｉｃｕｓ）のゲノムまたはプラスミドｐＦＣ８
    ５のいずれかの約２．８ｋｂのＨｉｎｄ　III−Ａｓｐ
    ７１８制限フラグメント内に含まれる、特許請求の範囲
    第１０項記載の遺伝子。 １３、ｐＦＣ８５またはｐＦＣ８３から選択されるプラ
    スミド。 １４、バクテリオファージＣＨ３５；Ｔａｑ＃４−２。 １５、１種以上の非イオン性のポリマー性洗剤を含んで
    成る緩衝液中に特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれ
    か１項記載の酵素を含有する安定な酵素組成物。 １６、洗剤がそれぞれ全組成物の約０．１％〜約０．５
    ％（容積／容積）の濃度で存在する、特許請求の範囲第
    １５項記載の組成物。 １７、洗剤がポリオキシエチル化ソルビタンモノラウレ
    ートおよびエトキシル化ノニルフェノールである、特許
    請求の範囲第１５項または第１６項記載の組成物。 １８、緩衝液がグリセロール、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐ
    Ｈ８．０）エチレンジアミン四酢酸、ジチオスレイトー
    ル、ポリオキシエチル化ソルビタンモノラウレート、エ
    トキシル化ノニルフェノールおよびゼラチンを含んで成
    る、特許請求の範囲第１５項〜第１７項のいずれか１項
    記載の組成物。 １９、核酸または核酸の混合物に含まれる少なくとも１
    種の特定の核酸配列を増幅する方法であって、核酸が二
    本鎖である時には、この核酸が同じまたは異なる長さの
    ２本の別々の相補的鎖からなり、 （ａ）それぞれの核酸鎖を、４個の異なるヌクレオチド
    トリホスフェートと、増幅されるべきそれぞれの異なる
    特定の配列について１個のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーとに接触させ、但しそれぞれのプライマーはそれぞれ
    の特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的になるように
    選択され、こうして１個のプライマーから合成された伸
    長生成物がその相補体から分離したとき、他のプライマ
    ーの伸長生成物の合成の鋳型として働くことができるよ
    うにし、上記接触を、それぞれのプライマーのその相補
    的核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する温度で
    行い； （ｂ）それぞれの核酸鎖を、工程（ａ）と同時にまたは
    この工程の後にヌクレオチドトリホスフェートの結合を
    触媒する熱安定酵素と接触させて、それぞれの核酸のそ
    れぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形成し； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｂ）からの混
    合物を保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混合物を加熱し
    ； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、工程（ｄ）で産生さ
    れた一本鎖分子のそれぞれへのそれぞれのプライマーの
    ハイブリダイゼーションを促進するために有効な温度に
    まで冷却し；そして （ｆ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、工程（ｄ）で産生された
    それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマー
    の伸長生成物を合成するためには有効な温度であるがし
    かしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分離
    する程の高温ではない温度において、有効な時間にわた
    り、工程（ｂ）からの混合物を保持し、工程（ｅ）およ
    び（ｆ）を同時にまたは順次に行うことを特徴とする方
    法。 ２０、核酸または核酸の混合物に含まれる少なくとも１
    種の特定の核酸配列を増幅する方法であって、この核酸
    が同じまたは異なる長さの２本の別々の相補的鎖からな
    り、 （ａ）それぞれの核酸を、４個の異なるヌクレオチドト
    リホスフェート及び増幅されるべきそれぞれの異なる特
    定の配列についての１個のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーの存在下で、それぞれの核酸を変性するのに有効な時
    間にわたり有効な温度において加熱し、但しそれぞれの
    プライマーはそれぞれの特定の配列の異なる鎖に実質的
    に相補的になるように選択され、こうして１個のプライ
    マーから合成された伸長生成物がその相補体から分離し
    たとき、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型とし
    て働くことができるようにし； （ｂ）変性した核酸を、それぞれのプライマーのその相
    補的な核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する温
    度に冷却し； （ｃ）工程（ａ）または（ｂ）と同時にまたはその後に
    、変性した核酸を、ヌクレオチドトリホスフェートの結
    合が可能であって、それぞれの核酸のそれぞれの鎖に相
    補的なプライマー伸長生成物を形成させることができる
    熱安定酵素と接触させ； （ｄ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混
    合物を保持し； （ｅ）プライマー伸長生成物がその上に合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｄ）からの混合物を加熱し
    ； （ｆ）工程（ｅ）からの混合物を、工程（ｅ）で産生さ
    れた一本鎖分子へのプライマーのハイブリダイゼーショ
    ンを促進するために有効な時間にわたり有効な温度に冷
    却し；そして （ｇ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、工程（ｆ）で産生された
    それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマー
    の伸長生成物を合成するためには有効な温度であるがし
    かしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分離
    する程の高温ではない温度において、有効な時間にわた
    り、工程（ｆ）からの混合物を保持し、工程（ｆ）およ
    び（ｇ）を同時にまたは順次に行うことを特徴とする方
    法。 ２１、核酸または核酸の混合物を含む試料中の少なくと
    も１種の特定の核酸配列の存在または不在を検出し、ま
    たは上記試料中の２種の異なる配列を識別する方法であ
    って、該試料は上記１または複数の配列を含むものと予
    想されるものであり、且つ該１または複数の核酸が二本
    鎖である時には、それらはそれぞれ、等しいまたは等し
    くない長さの２本の分離された相補的鎖からなり、 （ａ）上記試料を、検出されるべきそれぞれの異なる特
    定の配列について、４個の異なるヌクレオチドトリホス
    フェートと、１個のオリゴヌクレオチドプライマーとに
    接触させ、但しそれぞれのプライマーはそれぞれの特定
    の配列の異なる鎖に実質的に相補的になるように選択さ
    れ、こうして１個のプライマーから合成された伸長生成
    物が、その相補体から分離したとき、他のプライマーの
    伸長生成物の合成の鋳型として働くことができるように
    し、上記接触を、それぞれのプライマーのその相補的核
    酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する温度で行い
    ； （ｂ）それぞれの核酸鎖を、工程（ａ）と同時にまたは
    この工程の後に、ヌクレオチドトリホスフェートの結合
    を触媒する熱安定酵素と接触させて、それぞれの核酸の
    それぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形成し
    ； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして検出されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｂ）からの混
    合物を保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるが熱安定酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混合物を加熱し
    ； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、工程（ｄ）で産生さ
    れた一本鎖分子へのそれぞれのプライマーのハイブリダ
    イゼーションを促進するために有効な時間にわたり、有
    効な温度に冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進させ、そして検出されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎮鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｅ）からの混
    合物を保持し、こうして特定の１つの核酸配列または、
    存在するならば、複数の核酸配列の量を増幅させ、工程
    （ｅ）および（ｆ）を同時にまたは順次に行い； （ｇ）工程（ｆ）の生成物に、上記配列へのまたはその
    変異体へのハイブリダイゼーションが可能な検出される
    べきそれぞれの配列のための標識したオリゴヌクレオチ
    ドプローブを加え；そして （ｈ）上記ハイブリダイゼーションが起こったか否かを
    決定することを特徴とする方法。 ２２、核酸または核酸の混合物を含む試料中の少なくと
    も１種の特定の核酸配列の存在または不在を検出し、ま
    たは上記試料中の２種の異なる配列を識別する方法であ
    って、該試料は上記１または複数の配列を含むものと予
    想されるものであり、そして該１又は複数の核酸が二本
    鎖であり、 （ａ）試料を、検出されるべきそれぞれの異なる特定の
    配列について、４個の異なるヌクレオチドトリホスフェ
    ート及び１個のオリゴヌクレオチドプライマーの存在下
    で、試料中のそれぞれの核酸を変性するのに有効な時間
    にわたり、有効な温度で加熱し、但しそれぞれのプライ
    マーはそれぞれの特定の配列の異なる鎖に実質的に相補
    的になるように選択され、こうして１個のプライマーか
    ら合成された伸長生成物がその相補体から分離したとき
    、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型として働く
    ことができるようにし； （ｂ）変性した核酸を、それぞれのプライマーのその相
    補的な核酸配列へのハイブリダイゼーションを促進する
    温度に冷却し； （ｃ）工程（ａ）または（ｂ）と同時にまたはその後に
    、変性した核酸を、ヌクレオチドトリホスフェートの結
    合を触媒してそれぞれの核酸のそれぞれの鎖に相補的な
    プライマー伸長生成物を形成させることができる熱安定
    酵素と接触させ； （ｄ）酵素の活性を促進させ、そして検出されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混
    合物を保持し； （ｅ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    からプライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生成
    せしめるためには有効な温度ではあるが酵素を不可逆的
    に変性させる程の高温ではない温度において、有効な時
    間にわたり、工程（ｄ）からの混合物を加熱し； （ｆ）工程（ｅ）からの混合物を、工程（ｅ）で産生さ
    れる一本鎖分子へそれぞれのプライマーのハイブリダイ
    ゼーションを促進するために有効な時間にわたり有効な
    温度に冷却し； （ｇ）酵素の活性を促進させ、そして検出されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｆ）からの混
    合物を保持し、こうして特定の１つの核酸配列または、
    存在するならば、複数の核酸配列の量を増幅させ、工程
    （ｆ）および（ｇ）を同時にまたは順次に行い； （ｈ）工程（ｇ）の生成物に、上記配列へのまたはその
    変異体へのハイブリダイゼーションが可能な検出される
    べきそれぞれの配列のための標識したオリゴヌクレオチ
    ドプローブを加え；そして （ｉ）上記ハイブリダイゼーションが起こったか否かを
    決定することを特徴とする方法。 ２３、試料中に含まれる１種又は複数種の核酸中の、少
    なくとも１つのヌクレオチド配列の変化の存在または不
    存在を検出する方法であって、該核酸が二重鎖である時
    には、それはそれぞれ、等しいまたは等しくない長さの
    ２本の分離された相補的鎖からなり、 （ａ）上記試料を、上記変化を含むものと予想されるそ
    れぞれの核酸のそれぞれの鎖について、４個の異なるヌ
    クレオチドトリホスフェートと１個のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーとに接触させ、但しそれぞれのプライマー
    はそれぞれの特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的に
    なるように選択され、１個のプライマーから合成された
    伸長生成物が、その相補体から分離したとき、他のプラ
    イマーの伸長生成物の合成の鋳型として働くことができ
    るようにし、上記接触を、それぞれのプライマーのその
    相補的核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する温
    度で行い； （ｂ）試料を、工程（ａ）と同時にまたはこの工程の後
    に、ヌクレオチドトリホスフェートの結合を触媒する熱
    安定酵素と接触させて、それぞれの核酸のそれぞれの鎖
    に相補的なプライマー伸長生成物を形成し； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むものと予想されるそれぞれの異なる核酸につ
    いて、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプラ
    イマーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であ
    るがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型か
    ら分離する程の高温ではない温度において、有効な時間
    にわたり、工程（ｂ）からの混合物を保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    からプライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生成
    せしめるためには有効な温度ではあるがしかし熱安定酵
    素を不可逆的に変性させる程の高温ではない温度におい
    て、有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混合物を加
    熱し； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、工程（ｄ）で産生さ
    れた一本鎖分子へのそれぞれのプライマーのハイブリダ
    イゼーションを促進するために有効な時間にわたり有効
    な温度に冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むものと予想されるそれぞれの異なる核酸につ
    いて、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプラ
    イマーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であ
    るがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型か
    ら分離する程の高温ではない温度において、有効な時間
    にわたり、工程（ｅ）からの混合物を保持し、１又は複
    数の配列変化が存在するときには、これらを含む核酸の
    検出可能な増幅を得るのに十分な回数だけ、工程（ｄ）
    、（ｅ）および（ｆ）を繰り返し、そして工程（ｅ）と
    （ｆ）は同時にまたは順次に行い； （ｇ）工程（ｆ）の生成物を膜に固定し、 （ｈ）プローブの配列が増幅された配列の領域に相補的
    であるときにのみ増幅された核酸配列とハイブリダイズ
    することができる、標識された配列特異的オリゴヌクレ
    オチドプローブで、上記膜をハイブリダイゼーション条
    件下で処理し；そして （ｉ）プローブが核酸試料中の増幅された配列にハイブ
    リダイズしたか否かを検出することを特徴とする方法。 ２４、試料中に含まれる１種又は複数種の核酸中の少な
    くとも１つのヌクレオチド配列の変化の存在または不存
    在を検出する方法であって、該１種又は複数種の核酸は
    それぞれ、等しいまたは等しくない長さの２本の相補的
    鎖からなり、 （ａ）試料を、上記変化を含むものと予想されるそれぞ
    れの核酸のそれぞれの鎖について、４個の異なるヌクレ
    オチドトリホスフェート及び１個のオリゴヌクレオチド
    プライマーの存在下で、試料中のそれぞれの核酸を変性
    するのに有効な時間にわたり有効な時間で加熱し、但し
    それぞれのプライマーはそれぞれの特定の配列の異なる
    鎖に実質的に相補的になるように選択され、１個のプラ
    イマーから合成された伸長生成物がその相補体から分離
    したとき、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型と
    して働くことができるようにし； （ｂ）変性した核酸を、それぞれのプライマーのその相
    補的な核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する温
    度に冷却し； （ｃ）工程（ａ）または（ｂ）と同時にまたはその後に
    、変性した核酸を、ヌクレオチドトリホスフェートの結
    合を触媒する熱安定酵素と接触させて、それぞれの核酸
    のそれぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形成
    し； （ｄ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数種
    の変化を含むと予想されるそれぞれの異なる核酸につい
    て、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライ
    マーの伸長生成物を合成するためには有効な温度である
    がしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から
    分離する程の高温ではない温度において、有効な時間に
    わたり、工程（ｃ）からの混合物を保持し； （ｅ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｄ）からの混合物を加熱し
    ； （ｆ）工程（ｅ）からの混合物を、工程（ｅ）で産生さ
    れた相補的な一本鎖分子への各プライマーのハイブリダ
    イゼーションを促進するために有効な時間にわたり有効
    な温度に冷却し； （ｇ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むと予想されるそれぞれの異なる核酸について
    、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマ
    ーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であるが
    しかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分
    離する程の高温ではない温度において、有効な時間にわ
    たり、工程（ｆ）からの混合物を保持し、１又は複数の
    配列の変化が存在するときには、これらを含む核酸の検
    出可能な増幅を得るのに十分な回数だけ、工程（ｅ）〜
    （ｇ）を繰り返し、そして工程（ｆ）と（ｇ）は同時に
    または順次に行い； （ｈ）工程（ｇ）の生成物を膜に固定し、 （ｉ）プローブの配列が増幅された配列の領域に相補的
    であるときにのみ増幅された核酸配列とハイブリダイズ
    することができる、標識された配列特異的オリゴヌクレ
    オチドプローブで、上記膜をハイブリダイゼーション条
    件下で処理し；そして （ｊ）プローブが核酸試料中の増幅された配列にハイブ
    リダイズしたか否かを検出することを特徴とする方法。 ２５、試料中に含まれる１種又は複数種の核酸中の少な
    くとも１つのヌクレオチド配列の変化の存在または不存
    在を検出する方法であって、核酸が二本鎖である時には
    、それはそれぞれ、等しいまたは等しくない長さの２本
    の分離された相補的鎖からなり、 （ａ）上記試料を、上記１又は複数の変化を含むものと
    予想されるそれぞれの核酸のそれぞれの鎖について、４
    個の異なるヌクレオチドトリホスフェートと１個のオリ
    ゴヌクレオチドプライマーとに接触させ、但しそれぞれ
    のプライマーはそれぞれの特定の配列の異なる鎖に実質
    的に相補的になるように選択され、１個のプライマーか
    ら合成された伸長生成物が、その相補体から分離したと
    き、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型として働
    くことができるようにし、上記接触を、それぞれのプラ
    イマーのその相補的核酸鎖へのハイブリダイゼーション
    を促進する温度で行い； （ｂ）試料を、工程（ａ）と同時にまたはこの工程の後
    に、ヌクレオチドトリホスフェートの結合を触媒する熱
    安定酵素と接触させて、それぞれの核酸のそれぞれの鎖
    に相補的なプライマー伸長生成物を形成し； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むものと予想されるそれぞれの異なる核酸につ
    いて、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプラ
    イマーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であ
    るがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型か
    ら分離する程の高温ではない温度において、有効な時間
    にわたり、工程（ｂ）からの反応混合物を保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし熱安定
    酵素を不可逆的に変性させる程の高温ではない温度にお
    いて、有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの反応混合
    物を加熱し； （ｅ）工程（ｄ）からの反応混合物を、工程（ｄ）で産
    生された一本鎖分子へのそれぞれのプライマーのハイブ
    リダイゼーションを促進するために有効な時間にわたり
    有効な温度に冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変異体を含むものと予想されるそれぞれの異なる核酸に
    ついて、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプ
    ライマーの伸長生成物を合成するためには有効な温度で
    あるがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型
    から分離する程の高温ではない温度において、有効な時
    間にわたり、工程（ｅ）からの反応混合物を保持し、１
    又は複数の配列変化が存在するときには、これらを含む
    核酸の検出可能な増幅を得るのに十分な回数だけ、工程
    （ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返し、そして工程（
    ｅ）と（ｆ）は同時にまたは順次に行い； （ｇ）オリゴヌクレオチドの配列が増幅された配列の領
    域に相補的であるときのみ増幅された核酸配列とハイブ
    リダイズすることができる配列特異的オリゴヌクレオチ
    ドを膜に固定し； （ｈ）この膜をハイブリダイゼーション条件下で工程（
    ｆ）の生成物で処理し；そして （ｉ）核酸試料の増幅された配列が、膜に固定されたオ
    リゴヌクレオチドにハイブリダイズしたか否かを検出す
    ることを特徴とする方法。 ２６、試料中に含まれた１種又は複数種の核酸中の少な
    くとも１つのヌクレオチド配列の変化の存在または不存
    在を検出する方法であって、該１種又は複数種の核酸は
    それぞれ、等しいまたは等しくない長さの２本の相補的
    鎖からなり、 （ａ）試料を、上記変化を含むと思われるそれぞれの核
    酸のそれぞれの鎖について、４個の異なるヌクレオチド
    トリホスフェート及び１個のオリゴヌクレオチドプライ
    マーとの存在下で、試料中のそれぞれの核酸を変性する
    のに有効な時間にわたり有効な温度に加熱して、但しそ
    れぞれのプライマーはそれぞれの特定の配列の異なる鎖
    に実質的に相補的になるように選択され、１個のプライ
    マーから合成された伸長生成物が、その相補体から分離
    したとき、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型と
    して働くことができるようにし、 （ｂ）前記変性した核酸を、それぞれのプライマーのそ
    の相補的な核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進す
    る温度に冷却し； （ｃ）工程（ａ）または（ｂ）と同時にまたはその後に
    、変性した核酸を、ヌクレオチドトリホスフェートの結
    合を触媒する熱安定酵素と接触させて、それぞれの核酸
    のそれぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形成
    し； （ｄ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むと予想されるそれぞれの異なる核酸について
    、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマ
    ーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であるが
    しかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分
    離する程の高温ではない温度において、有効な時間にわ
    たり、工程（ｃ）からの反応混合物を保持し； （ｅ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｄ）からの反応混合物を加
    熱し； （ｆ）工程（ｅ）からの反応混合物を、工程（ｅ）で産
    生される相補的な一重鎖分子へのそれぞれのプライマー
    のハイブリダイゼーションを促進するために有効な時間
    にわたり有効な温度に冷却し； （ｇ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むと予想されるそれぞれの異なる核酸について
    、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマ
    ーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であるが
    しかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分
    離する程の高温ではない温度において、有効な時間にわ
    たり工程（ｆ）からの反応混合物を保持し、１又は複数
    の配列変化が存在するときには、これらを含む核酸の検
    出可能な増幅を得るのに十分な回数だけ、工程（ｅ）〜
    （ｇ）を繰り返し、少なくとも１個のプライマーおよび
    ／または４個のヌクレオチドトリホスフェートの少なく
    とも１個を検出可能な残基で標識しておき、そして工程
    （ｆ）と（ｇ）は同時にまたは順次に行い； （ｈ）オリゴヌクレオチドの配列が増幅された配列の領
    域に相補的であるときのみ増幅された核酸配列とハイブ
    リダイズすることができる配列特異的オリゴヌクレオチ
    ドを膜に固定し、 （ｉ）この膜をハイブリダイゼーション条件下で工程（
    ｇ）の生成物で処理し；そして （ｊ）核酸試料の増幅された配列が、膜に固定されたオ
    リゴヌクレオチドにハイブリダイズしたか否かを検出す
    ることを特徴とする方法。 ２７、試料中に含まれた１種又は複数種の核酸中の少な
    くとも１つのヌクレオチド配列の変化の存在または不存
    在を検出する方法であって、該核酸が二本鎖である時に
    は、それはそれぞれ、等しいまたは等しくない長さの２
    本の分離された相補的鎖からなり、 （ａ）上記試料を、上記変化を含むものと予想されるそ
    れぞれの核酸のそれぞれの鎖について、４個の異なるヌ
    クレオチドトリホスフェートと１個のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーとに接触させ、但しそれぞれのプライマー
    はそれぞれの特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的に
    なるように選択され、１個のプライマーから合成された
    伸長生成物が、その相補体から分離したとき、他のプラ
    イマーの伸長生成物の合成の鋳型として働くことができ
    るようにし、上記接触を、それぞれのプライマーのその
    相補的核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する温
    度で行い； （ｂ）試料を、工程（ａ）と同時にまたはこの工程の後
    に、ヌクレオチドトリホスフェートの結合を触媒する熱
    安定酵素と接触させて、それぞれの核酸のそれぞれの鎖
    に相補的なプライマー伸長生成物を形成し； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むものと予想されるそれぞれの異なる核酸につ
    いて、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプラ
    イマーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であ
    るがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型か
    ら分離する程の高温ではない温度において、有効な時間
    にわたり、工程（ｂ）からの混合物を保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし熱安定
    酵素を不可逆的に変性させる程の高温ではない温度にお
    いて、工程（ｃ）からの混合物を加熱し； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、工程（ｄ）で産生さ
    れた一本鎖分子へのそれぞれのプライマーのハイブリダ
    イゼーションを促進するために有効な時間にわたり有効
    な温度に冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むものと予想されるそれぞれの異なる核酸につ
    いて、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプラ
    イマーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であ
    るがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型か
    ら分離する程の高温ではない温度において、有効な時間
    にわたり、工程（ｅ）からの混合物を保持し、１種以上
    の配列変化が存在するときには、これらを含む核酸の検
    出可能な増幅を可能にするのに十分な回数だけ、工程（
    ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返し、そして工程（ｅ
    ）と（ｆ）は同時にまたは順次に行い； （ｇ）オリゴヌクレオチドプローブの配列が増幅された
    配列の領域に相補的であるときのみ増幅された核酸配列
    とハイブリダイズすることができる標識された配列特異
    的オリゴヌクレオチドプローブを膜に固定し、 （ｈ）この膜をハイブリダイゼーション条件下で工程（
    ｆ）の生成物で処理し； （ｉ）プローブと検出される変化の両方が酵素によって
    認識される制限部位を有するときに形成される如何なる
    ハイブリッドをも開裂するであろう制限酵素で、工程（
    ｈ）の生成物を処理し； （ｊ）ハイブリダイゼーションが起こったことを示す必
    要な長さの標識された制限フラグメントが制限消化物中
    に存在するか否かを検出することを特徴とする方法。 ２８、核酸または核酸の混合物に含まれる１種又は複数
    種の特定の核酸配列をクローニングベクターにクローン
    化する方法であって、１種又は複数種の核酸が二本鎖で
    ある時には２本の分離された相補的鎖からなり、該１種
    又は複数種の核酸がクローニングの前に量的に増幅され
    、 （ａ）それぞれの核酸鎖を、４個の異なるヌクレオチド
    トリホスフェートと、増幅されるべきそれぞれの異なる
    特定の配列について１個のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーとに接触させ、但しそれぞれのプライマーはそれぞれ
    の特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的になるように
    選択され、１個のプライマーから合成された伸長生成物
    が、その相補体から分離したとき、他のプライマーの伸
    長生成物の合成の鋳型として働くことができるようにし
    、それぞれの配列が増幅され、またはそれぞれのプライ
    マーが制限部位を含み、上記接触を、それぞれのプライ
    マーのその相補的核酸鎖へのハイブリダイゼーションを
    促進する温度で行い； （ｂ）それぞれの核酸鎖を、工程（ａ）または（ｂ）と
    同時にまたはこの工程の後に、ヌクレオチドトリホスフ
    ェートの結合を触媒する熱安定酵素と接触させることに
    よりそれぞれの核酸のそれぞれの鎖に相補的なプライマ
    ー伸長生成物を形成し； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｂ）からの混
    合物を保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成される鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混合物を加熱し
    ； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、それぞれのプライマ
    ーの工程（ｄ）で産生された一本鎖分子のそれぞれへの
    ハイブリダイゼーションを促進するために有効な時間に
    わたり有効な温度に冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進し、そして増幅されるべきそれ
    ぞれの異なる配列について、工程（ｄ）で産生されるそ
    れぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマーの
    伸長生成物を合成するためには有効な温度であるがしか
    しそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分離す
    る程の高温ではない温度において、有効な時間にわたり
    、工程（ｅ）からの混合物を保持し、工程（ｄ）、（ｅ
    ）および（ｆ）を１種又は複数種の配列を含む１種又は
    複数種の核酸の検出可能な増幅を生じるのに十分な回数
    だけ繰り返し、工程（ｅ）および（ｆ）を同時にまたは
    順次に行い； （ｇ）工程（ｆ）の生成物に上記制限部位のそれぞれに
    対する制限酵素を加えて、制限消化物中に開裂生成物を
    得； （ｈ）クローン化されるべき特定の配列を含む工程（ｇ
    ）の開裂生成物を１又は複数のクローニングベクターに
    連結することを特徴とする方法。 ２９、核酸または核酸の混合物に含まれる少なくとも１
    種の特定の核酸配列をクローニングベクターにクローン
    化する方法であって、１種又は複数種の核酸は等しいま
    たは等しくない長さの２本の分離された相補的鎖からな
    り、該１種又は複数種の核酸がクローニングの前に量的
    に増幅され、 （ａ）それぞれの核酸を、増幅されるべきそれぞれの異
    なる特定の配列について、４個の異なるヌクレオチドト
    リホスフェート及び１個のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーの存在下で、それぞれの核酸を変性するのに有効な時
    間、有効な温度に加熱し、但しそれぞれのプライマーは
    それぞれの特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的であ
    るように選択され、１個のプライマーから合成された伸
    長生成物が、その相補体から分離したとき、他のプライ
    マーの伸長生成物の合成の鋳型として働くことができる
    ようにし、それぞれの配列が増幅されまたはそれぞれの
    プライマーが制限部位を含み； （ｂ）変性した核酸を、それぞれのプライマーとその相
    補的な鎖との間でハイブリダイゼーションを促進する温
    度に冷却し； （ｃ）工程（ａ）または（ｂ）と同時にまたはその後に
    、変性した核酸を、ヌクレオチドトリホスフェートの結
    合を触媒する熱安定酵素と接触させることにより、それ
    ぞれの核酸のそれぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生
    成物を形成させ； （ｄ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混
    合物を保持し； （ｅ）プライマー伸長生成物がその上で合成される鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｄ）からの混合物を加熱し
    ； （ｆ）工程（ｅ）からの混合物を、それぞれのプライマ
    ーの工程（ｅ）で産生される相補的な一本鎖分子へのハ
    イブリダイゼーションを促進するために有効な時間にわ
    たり有効な温度に冷却し； （ｇ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、工程（ｆ）で産生される
    それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマー
    の伸長生成物を合成するためには有効な温度であるがし
    かしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分離
    する程の高温ではない温度において、有効な時間にわた
    り、工程（ｆ）からの混合物を保持し、工程（ｅ）、（
    ｆ）および（ｇ）を１種又は複数種の配列を含む１種又
    は複数種の核酸の増幅を検出可能にするのに十分な回数
    だけ繰り返し、工程（ｆ）および（ｇ）を同時にまたは
    順次に行い； （ｈ）工程（ｇ）の生成物に、上記制限部位のそれぞれ
    に対する制限酵素を加えて、制限消化物中に開裂生成物
    を得； （ｉ）クローン化されるべき特定の列を有する工程（ｈ
    ）の１種又は複数種の開裂生成物を選択可能なマーカー
    を有する１種又は複数種のクローニングベクターに連結
    することを特徴とする方法。 ３０、核酸または核酸の混合物に含まれる１種又は複数
    種の特定の核酸配列をクローニングベクターにクローン
    化する方法であって、１種又は複数種の核酸が二本鎖で
    ある時には等しいまたは等しくない長さの２本の分離さ
    れた相補的鎖からなり、該１種又は複数種の核酸がクロ
    ーニングの前に量的に増幅され、 （ａ）それぞれの核酸鎖を、増幅されるべきそれぞれの
    異なる特定の配列について、４個の異なるヌクレオチド
    トリホスフェートと１個のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーとに接触させ、但しそれぞれのプライマーはそれぞれ
    の特定の列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選
    択され、１個のプライマーから合成された伸長生成物が
    、その相補体から分離したとき、他のプライマーの伸長
    生成物の合成の鋳型として働くことができるようにし、
    上記接触を、それぞれのプライマーのその相補的核酸鎖
    へのハイブリダイゼーションを促進する温度で行い； （ｂ）それぞれの核酸鎖を、工程（ａ）または（ｂ）と
    同時にまたはこの工程の後に、ヌクレオチドトリホスフ
    ェートの結合を触媒する熱安定酵素と接触させることに
    よりそれぞれの核酸のそれぞれの鎖に相補的なプライマ
    ー伸長生成物を形成し； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｂ）からの混
    合物を保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混合物を加熱し
    ； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、それぞれのプライマ
    ーの工程（ｄ）で産生される一本鎖分子のそれぞれへの
    ハイブリダイゼーションを促進するために有効な時間に
    わたり有効な温度に冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進し、そして増幅されるべきそれ
    ぞれの異なる配列について、工程（ｄ）で産生されたそ
    れぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマーの
    伸長生成物を合成するためには有効な温度であるがしか
    しそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分離す
    る程の高温ではない温度において、有効な時間にわたり
    、工程（ｅ）からの混合物を保持し、工程（ｄ）、（ｅ
    ）および（ｆ）を、１種又は複数種のクローニングベク
    ターに平滑末端連結するために効果的な、１種又は複数
    種の配列を含む１種又は複数種の核酸の増幅を生じるの
    に十分な回数だけ繰り返し、工程（ｅ）および（ｆ）を
    同時にまたは順次に行い； （ｇ）工程（ｆ）から得られたクローン化されるべき１
    種又は複数種の増幅された特異配列をリガーゼの存在下
    で１種又は複数種のクローニングベクターへ連結し、こ
    こで１種又は複数種の上記増幅された配列及び１種又は
    複数種のベクターは連結を行うのに十分な量で存在する
    、ことを特徴とする方法。 ３１、核酸または核酸の混合物に含まれる少なくとも１
    種の特定の核酸配列をクローニングベクターにクローン
    化する方法であって、１種又は複数種の核酸は等しいま
    たは等しくない長さの２本の分離された相補的鎖からな
    り、該１種又は複数種の核酸がクローニングの前に量的
    に増幅され、 （ａ）それぞれの核酸を、増幅されるべきそれぞれの異
    なる特異的配列について、４個の異なるヌクレオチドト
    リホスフェート及び１個のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーの存在下で、それぞれの核酸を変性するのに有効な時
    間、有効な温度に加熱し、但しそれぞれのプライマーは
    それぞれの特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的であ
    るように選択され、１個のプライマーから合成された伸
    長生成物が、その相補体から分離したとき、他のプライ
    マーの伸長生成物の合成の鋳型として働くことができる
    ようにし； （ｂ）変性した核酸を、それぞれのプライマーとその相
    補的な鎖との間でハイブリダイゼーションを促進する温
    度に冷却し； （ｃ）工程（ａ）もしくは（ｂ）と同時にまたはその後
    に、変性した核酸を、ヌクレオチドトリホスフェートの
    結合を触媒する熱安定酵素と接触させることによりそれ
    ぞれの核酸のそれぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生
    成物を形成させ； （ｄ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混
    合物を保持し； （ｅ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるが酵素を不可逆
    的に変性させる程の高温ではない温度において、有効な
    時間にわたり、工程（ｄ）からの混合物を加熱し； （ｆ）工程（ｅ）からの混合物を、それぞれのプライマ
    ーの工程（ｅ）で産生される相補的な一本鎖分子へのハ
    イブリダイゼーションを促進するために有効な時間にわ
    たり有効な温度に冷却し； （ｇ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、工程（ｆ）で産生された
    それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマー
    の伸長生成物を合成するためには有効な温度であるがそ
    してそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分離
    する程の高温ではない温度において、有効な時間にわた
    り、工程（ｆ）からの混合物を保持し、工程（ｅ）、（
    ｆ）および（ｇ）を１種又は複数種のクローニングベク
    ターに平滑末端連結するために効果的な、それぞれの配
    列を含む１種又は複数種の核酸増幅を生じるのに十分な
    回数だけ繰り返し、工程（ｅ）および（ｆ）を同時にま
    たは順次に行い； （ｈ）工程（ｇ）から得られるクローン化されるべき１
    種又は複数種の増幅された特異配列をリガーゼの存在下
    で１種又は複数種の上記クローニングベクターへ連結し
    、ここで１種又は複数種の上記増幅された配列及び１種
    又は複数種のベクターは連結を行うのに十分な量で存在
    する、ことを特徴とする方法。 ３２、特許請求の範囲第１９項または第２０項の増幅工
    程によって産生される上記配列の複数のコピーを有する
    核酸または核酸の混合物からの増幅された核酸配列。
JP62207421A 1986-08-22 1987-08-22 熱安定性ｄｎａポリメラーゼ Granted JPS63102677A (ja)

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JPH04267895A (ja) * 1991-02-20 1992-09-24 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｃｒ）で増幅したｄｎａ産物の簡便な検出方法
JPH04505708A (ja) * 1989-05-22 1992-10-08 エフ・ホフマンーラ　ロシュ　アーゲー 核酸による物質の標識及び追跡方法
JPH0568596A (ja) * 1991-07-16 1993-03-23 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd ポリメラーゼ連鎖反応により増幅したｄｎａの検出法
JPH06504196A (ja) * 1990-09-28 1994-05-19 エフ．ホフマン−ラ　ロシュ　アクチェンゲゼルシャフト モルモシポ・アフリカヌスからの純化された熱安定性核酸ポリメラーゼ
US5413926A (en) * 1988-08-26 1995-05-09 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Thermostable DNA polymerase from Thermus thermophilus HB-8
WO2008013010A1 (fr) 2006-07-26 2008-01-31 Nishikawa Rubber Co., Ltd. Procédé d'amplification d'une séquence nucléotidique

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