JPH0824570B2 - 熱安定性ｄｎａポリメラーゼをコードする遺伝子 - Google Patents

熱安定性ｄｎａポリメラーゼをコードする遺伝子

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JPH0824570B2
JPH0824570B2 JP1003887A JP388789A JPH0824570B2 JP H0824570 B2 JPH0824570 B2 JP H0824570B2 JP 1003887 A JP1003887 A JP 1003887A JP 388789 A JP388789 A JP 388789A JP H0824570 B2 JPH0824570 B2 JP H0824570B2
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、テルムス・アクアチクス（Thermus aquat
icus）由来の熱安定性DNAポリメラーゼをコードする遺
伝子に関する。
〔従来の技術〕
E.コリ（E. coli）のような中温微生物からのDNAポ
リメラーゼの単離について、広範な研究が行われてき
た。例えば、ベスマン（Bessman）ら、J.Biol.Chem.（1
957年）、233巻、171〜177頁およびブチン（Buttin）と
コルンベルグ（Korn−berg）J.Biol.Chem.（1966年）、
241巻、5419〜5427頁を参照されたい。
対照的に、テルムス・アクアチクス（Thermus aquati
cus）のような好熱菌からのDNAポリメラーゼの単離と精
製については、余り研究が行なわれていない。カレジン
（Kaledin）ら、Biokhymiya、（1980年）45巻、644〜65
1頁は、テルムス・アクアチクス（T.aquaticus）YT1株
の細胞からのDNAポリメラーゼの６段階単離および精製
法を開示している。これらの工程は、粗製抽出物の単
離、DEAE−セルロース・クロマトグラフィ、ヒドロキシ
アパタイト上での分別、DEAE−セルロース上での分別お
よび単一鎖DNA−セルロース上でのクロマトグラフィか
ら成っている。それぞれの段階からのプールは、エンド
−およびエクソヌクレアーゼの混入についてはスクリー
ニングされていない。精製された酵素の分子量は、モノ
マー単位当たり62,000ドルトンと報告されている。テル
ムス・アクアチクス（T.aquaticus）からのポリメラー
ゼについての第二の精製法は、エイ・チエン（A.Chie
n）ら、J.Bacteriol.（1976年）、127巻、1550〜1557頁
によって記載されている。この方法では、粗製の抽出物
をDEAE−セファデックスカラムにかける。透析下プール
分画を次に、ホスホセルロースカラム上での処理に付
す。このプールした分画を透析して、ウシ血清アルブミ
ン（BSA）を加えてポリメラーゼの活性の損失を防止す
る。生成する混合物をDNA−セルロースカラムにかけ
る。カラムからのプールした物質透析し、ゲル濾過によ
って分析すると分子量は約63,000ドルトンであり、スク
ロース遠心分離によれば約68,000ドルトンである。
熱安定酵素を用いて、既存の核酸配列を初めに存在す
る量に比べて大量に増幅する方法は、1986年12月10日発
行の欧州特許公開第200,362号明細書に示唆されてい
る。この方法では、プライマー、ヌクレオチドトリホス
フェートおよびポリメラーゼが用いられ、変性、鋳型鎖
の合成およびハイブリダイゼーションからなっている。
それぞれのプライマーの伸長生成物は、所望の核酸配列
を製造するための鋳型になる。この明細書では、用いら
れるポリメラーゼが熱安定酵素である場合には、熱によ
ってその活性が破壊されないので、各変性工程の後にそ
れを添加する必要はない。精製された熱安定性DNAポリ
メラーゼの使用については、他の利益および詳細な点に
ついてはなにも提供されていない。増幅および検出工程
も、サイキ（Saiki）らのScience、230巻、1350〜1354
頁（1985年）およびサイキ（Saiki）らのBio/Technolog
y、３巻、1008〜1012頁（1985年）に記載されている。
〔発明が解決しようとする問題点〕
したがって、当業界では、上記の診断用増幅工程を改
良するために使用することができる精製された安定な熱
安定酵素を製造することが望まれている。
〔問題点を解決するための手段〕
従って本発明は、熱安定性酵素を製造する手段として
有用な、DNAポリメラーゼをコードするDNA、及びDNAポ
リメラーゼ活性を有する蛋白質をコードしているDNA断
片を提供するものである。
精製された酵素および組替えDNA技術によって産生さ
れる酵素は、熱安定性ではないクレノウ（Klenow）フラ
グメントよりも遥かに高い特異性を提供する。更に、精
製された酵素及び組換え技術によって産生された酵素
は、dTTPまたは他のヌクレオチドトリホスフェートがDN
A鋳型と共にインキュベーション混合物中に存在しない
ときに予想される適当な活性を示す。また、これらの酵
素は、文献に記載されているテルムス・アクアチクス
（Thermus aquaticus）由来の熱安定酵素のpHよりも広
いpH範囲を有し、pH7ではpH8における場合の50％より大
きな活性を示す。更に、これらの熱安定酵素は、非イオ
ン性洗剤を有する緩衝液中に保存して、長時間に亙って
活性を失わずに安定であるようにすることができる。
本発明は、プライマーおよび熱安定酵素を用いて、核
酸またはそれらの混合物中に存在する１種又は複数種の
特定の核酸配列を増幅する方法にある。一つのプライマ
ーの伸長生成物が他のものにハイブリダイズすると、所
望の特定の核酸配列を産生するための鋳型になり、その
逆も同じであり、この方法は所望の量の配列を産生する
のに必要な回数だけ反復される。この方法は、増幅反応
の特異性を向上させて、増幅された核酸の極めて明瞭な
シグナルを生じる。更に、本発明の方法は、それぞれの
増幅サイクルの後に一つの容器から別の容器に試薬を移
す必要をなくする。熱安定酵素は、核酸鎖を変性するの
に要する高温に対して耐性を有し、それ故取り替える必
要がないので、上記のような移し替えは必要でない。更
に、温度サイクル変化を自動化して、増幅反応を行うの
に必要な人員と工程数を更に削減することができる。
更に具体的には、本発明は、核酸または核酸の混合物
に含まれる少なくとも１種の特定の核酸配列を増幅する
方法であって、核酸が二本鎖である時には、この核酸が
同じまたは異なる長さの２本の別々の相補的鎖からな
り、 （ａ）それぞれの核酸鎖を、４個の異なるヌクレオチド
トリホスフェートと増幅されるべきそれぞれの異なる特
定の配列について１個のオリゴヌクレオチドプライマー
とに接触させ、但しそれぞれのプライマーはそれぞれの
特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選
択され、１個のプライマーから合成された伸長生成物
が、その相補体から分離したとき、他のプライマーの伸
長生成物の合成の鋳型として働くことができるように
し、上記接触を、それぞれのプライマーのその相補的核
酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する温度で行
い； （ｂ）それぞれの核酸鎖を、工程（ａ）と同時にまたは
その工程の後に、ヌクレオチドトリホスフェートの結合
を触媒する熱安定酵素と接触させて、それぞれの核酸の
それぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形成
し； （ｃ）酵素の活性化し、そして増幅されるべきそれぞれ
の異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的
なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成するために
は有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成物をそ
の相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温度にお
いて、有効な時間にわたり、工程（ｂ）からの混合物を
保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混合物を加熱
し； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、それぞれのプライマ
ーの工程（ｄ）で産生される一本鎖分子のそれぞれへの
ハイブリダイゼーションを促進するために有効な温度に
有効な時間にわたり冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
れぞれの異なる配列について、工程（ｄ）で産生される
それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマー
の伸長生成物を合成するためには有効な温度であるがし
かしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分離
する程の高温ではない温度において、有効な時間にわた
り、工程（ｂ）からの混合物を保持し、工程（ｅ）およ
び（ｆ）を同時にまたは順次に行うことを特徴とする方
法を提供する。
工程（ｄ），（ｅ）および（ｆ）は、所望な水準の配
列の増幅が得られるまで繰り返すことができる。本明細
書記載の好ましい熱安定酵素は、テルムス・アクアチク
ス（Thermus aquaticus）から抽出されたポリメラーゼ
（Taqポリメラーゼ）である。最も好ましくは、酵素がT
aqポリメラーゼである時には、工程（ａ）では核酸鎖
を、約1.5〜2mMのマグネシウム塩、150〜200mMのそれぞ
れのヌクレオチドおよび１μＭのそれぞれのプライマー
を含んで成る緩衝液と接触させ、工程（ａ），（ｅ）お
よび（ｆ）を約45〜58℃で行い、工程（ｄ）を約90〜10
0℃で行う。
好ましい態様では、１種又は複数種の核酸は二本鎖で
あり、工程（ａ）は、（ｉ）それぞれの核酸を、４個の
異なるヌクレオチドトリホスフェート及び増幅されるべ
きそれぞれの異なる特定の配列について１個のオリゴヌ
クレオチドプライマーの存在下で、それぞれの核酸を変
性するのに有効な時間、有効な温度に加熱して、但しそ
れぞれのプライマーはそれぞれの特定の配列の異なる鎖
に実質的に相補的であるように選択され、１個のプライ
マーから合成された伸長生成物が、その相補体から分離
したとき、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型と
して働くことができるようにし、（ii）変性した核酸
を、それぞれのプライマーのその相補的な核酸鎖へのハ
イブリダイゼーションを促進する温度に冷却することに
よって行なわれる。
他の態様では、本発明は、核酸または核酸の混合物を
含む試料において少なくとも１種の特定の核酸配列の存
在または不存在を検出し、または上記試料における２種
の異なる配列を識別する方法であって、試料は上記１ま
たは複数の配列を含むものと予想され、且つ１又は複数
の核酸が二本鎖である時には、それらはそれぞれ、等し
いまたは等しくない長さの２本の分離された相補的鎖か
らなり、工程（ａ）〜（ｆ）は上記と同じであり、特定
の１つの核酸配列または、存在するならば、複数の配列
の量を増幅させ、工程（ｅ）および（ｆ）を同時にまた
は順次に行い、 （ｇ）工程（ｆ）の生成物に、上記配列へのまたはその
変異体へハイブリダイズすることができる、検出される
べきそれぞれの配列のための、標識したオリゴヌクレオ
チドプローブを加え；そして （ｈ）上記ハイブリダイゼーションが起こったかどうか
を決定することを特徴とする方法に関する。
更にもう一つの態様では、本発明は、試料中に含まれ
る１種又は複数種の核酸中の少なくとも１つのヌクレオ
チド配列の変化の存在または不存在を検出する方法であ
って、核酸が二本鎖である時には、それはそれぞれ、等
しいまたは等しくない長さの２本の分離された相補的鎖
からなり、上記工程（ａ）〜（ｆ）を含み、１又は複数
の配列変化が存在するときには、それらを含む核酸の検
出可能な増幅を得るのに十分な回数だけ、工程（ｄ），
（ｅ）および（ｆ）を繰り返し、且つ工程（ｅ）と
（ｆ）は同時にまたは順次に行い、 （ｇ）工程（ｆ）の生成物を膜に固定し、 （ｈ）プローブの配列が増幅された配列の領域に相補的
であるときにのみ増幅された核酸配列とハイブリダイズ
することができる。標識された配列特異的オリゴヌクレ
オチドプローブで、上記膜をハイブリダイゼーション条
件下で処理し；そして（ｉ）プローブが核酸試料中の増
幅された配列にハイブリダイズしたか否かを検出するこ
とを特徴とする方法に関する。
試料が細胞を含有するときには、好ましくは、それら
の細胞を工程（ａ）の前に加熱してその中の核酸を試薬
に暴露させる。この工程は、試薬の添加前の核酸の抽出
を回避する。
この方法の変法においては１種又は複数のプライマー
および／またはヌクレオチドホスフェートを標識して、
生成する増幅された配列を標識するようにする。標識さ
れた１種又は複数のプライマーおよび／またはヌクレオ
チドホスフェートは、最初から反応混合物中に存在して
もよくまたは後のサイクルで添加することもできる。
（非標識）反応特異的オリゴヌクレオチドトリホスフェ
ートを膜に固定し、標識された増幅生成物によりハイブ
リダイゼーション条件下で処理して、膜に結合した配列
が増幅生成物に存在するときにのみハイブリダイゼーシ
ョンが起こるようにする。
更にもう一つの態様では、本発明は、核酸または核酸
の混合物に含まれる１種又は複数種の特異的核酸配列を
クローニングベクターにクローン化する方法であって、
１種又は複数の核酸が二本鎖である時には２本の分離さ
れた相補的鎖からなり、該１種又は複数種核酸がクロー
ニングの前に量的に増幅され、この方法は上記工程
（ａ）〜（ｆ）を含み、工程（ｄ），（ｅ）および
（ｆ）は１種又は複数種の配列を含む１種又は複数種の
核酸の検出可能な増幅を生じるのに十分な回数だけ繰り
返し； （ｇ）工程（ｆ）の生成物に上記制限部位のそれぞれに
対する制限酵素を加えて、制限消化物中に開裂生成物を
得； （ｈ）クローン化されるべき特定の配列を含む工程
（ｇ）の開裂生成物を１個以上のクローニングベクター
に連結することからなる方法に関する。
最後の態様では、本発明は、核酸または核酸の混合物
に含まれる１種又は複数種の特定の核酸配列をクローニ
ングベクターにクローン化する方法であって、１種又は
複数種の核酸が二本鎖である時には、長さが等しいまた
は等しくない２本の分離された相補的鎖からなり、該１
種又は複数種の核酸がクローニングの前に量的に増幅さ
れ、この方法は上記工程（ａ）〜（ｆ）を含み、工程
（ｄ），（ｅ）および（ｆ）を、１種以上のクローニン
グベクターに平滑末端連結するために、１種又は複数種
の配列を含む１種又は複数の核酸の検出可能な増幅を生
じるのに十分な回数だけ繰り返し、 （ｇ）工程（ｆ）から得られたクローン化されるべき１
種又は複数種の増幅された特定の列をリガーゼの存在下
で１種又は複数種の上記クローニングベクターへ連結
し、ここで、１種又は複数種の上記増幅された配列及び
１種又は複数種のベクターが連結を行うのに十分な量で
存在することを特徴とする方法に関する。
生成物の態様では、本発明は、核酸または核酸の混合
物に含まれる少くとも１種の特定の核酸配列を増幅する
のに有用な組成物であって、増幅されるべきそれぞれの
異なる特定の配列について、４個の異なるヌクレオチド
トリホスフェートと１個のオリゴヌクレオチドプライマ
ーを含有し、それぞれのプライマーはそれぞれの特定の
配列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選択さ
れ、一つのプライマーから合成された伸長生成物は、そ
の相補体から分離されたと、他のプライマーの伸長生成
物の合成の鋳型として働くことができるようになる。
もう一つの生成物の態様では、本発明は、核酸に含ま
れる特定の核酸配列の複数鎖を含んで成る１種又は複数
種の核酸の試料を提供する。この試料は、約10〜100の
鎖、約100〜1000の鎖、または約1000を超える鎖を有す
ることができる。
最後の生成物の態様では、本発明は、本発明の増幅法
によって産生される配列の複数のコピーを含有する核酸
または核酸の混合物からの増幅された核酸配列を提供す
る。
本明細書に用いられる「細胞」「細胞系（セルライ
ン）」および「細胞培養物」は相互交換可能に用いるこ
とができ、これらの名称は総て子孫を包含する。したが
って、「形質転換体」または「形質転換された細胞」と
は、一次細胞およびトランスファーの回数とは関係なし
にその細胞に由来する培養物を包含する。また、総ての
子孫は、故意のまたは偶然の突然変異によりDNA含量が
正確には同一ではないことがあることも理解される。最
初に形質転換された細胞に置いてスクリーニングしたの
と同じ機能を有する変異体子孫も包含される。
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における
作用可能に連結されたコード配列の発現に必要なDNA配
列を指す。原核生物に好適な制御配列は、例えばプロモ
ーター、任意にはオペレーター配列、リボゾーム結合部
位があるが、さらにその他の余り理解されていない配列
も包含することが可能である。真核細胞は、プロモータ
ー、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用
することが知られている。
「発現系」という用語は、作用可能に連結された所望
のコード配列および制御配列を含むDNA配列を指し、こ
れらの配列で形質転換される宿主はコードされた蛋白質
を産生することができる。形質転換を行うために、発現
系をベクターに包含させてもよいが、次に、関連のDNA
が宿主染色体に組み込まれてもよい。
本明細書で用いられる「遺伝子」という用語は、回収
可能な生物活性を有するポリペプチドまたは前駆体をコ
ード化するDNA配列を指す。このポリペプチドは、完全
な長さの遺伝子配列によりまたは酵素活性が保持されて
いるかぎりコード配列のいずれかの部分によってコード
されていてもよい。
「作用可能に連結した」という用語は、成分の正常な
機能を行うことができる併置を指す。例えば、制御配列
に「作用可能に連結した」コード配列は、このコード配
列が制御配列の制御下で発現することができる配置を指
す。
「非イオン性のポリマー性洗剤」とは、イオン性電荷
を持たず、本発明の目的には、約3.5〜約9.5のpH範囲、
好ましくは４〜8.5のpH範囲で酵素を安定化することが
できることを特徴とする界面活性剤を指す。
本明細書に用いられる「オリゴヌクレオチド」という
用語は、２個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリ
ボヌクレオチド、好ましくは３個以上のものからなる分
子として定義される。その正確な大きさは多くのファク
ターによって異り、これらのファクターはオリゴヌクレ
オチドの最終的な機能または用途によって異る。オリゴ
ヌクレオチドは、合成的にまたはクローニングによって
誘導することができる。
本明細書に用いられる「プライマー」という用語は、
生成された制限消化物中におけるように天然存在し、ま
たは合成的に製造されるオリゴヌクレオチドであって、
核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成を誘発す
る条件、すなわち、適当な緩衝液（「緩衝液」とはpH、
イオン強度、コファクター等を包含する）中で、好適な
温度で４種の異なるヌクレオチドトリホスフェートと熱
安定酵素の存在の条件下に置くとき、合成の開始点とし
て作用することができるものを指す。Taqポリメラーゼ
については、本明細書の緩衝液は、好ましくは1.5〜2mM
のマグネシウム塩、好ましくはMaCl2、150〜200μＭの
それぞれのヌクレオチドおよび１μＭのそれぞれのプラ
イマーを含有し、好ましくは、50mMのKClと10mMのトリ
ス緩衝液（pH8〜8.4）および100μg/mlのゼラチンを含
む。
このプライマーは、増幅において最大効率を得るには
好ましくは単一鎖であるが、二本鎖でもよい。二本鎖の
場合には、プライマーは最初に処理されて、伸長生成物
を調製するのに用いる前にそれらの鎖ごとに分離され
る。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌ
クレオチドである。プライマーは十分に長く、熱安定酵
素の存在で伸長生成物の合成をプライムできるものでな
ければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プ
ライマー由来および方法用途のような多くのファクター
によって変わる。例えば、目標とする配列の複雑さによ
っては、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には、
15〜25ヌクレオチドを含むが、それより多くのまたはそ
れより少ないヌクレオチドを含むこともある。短いプラ
イマー分子は一般的には、鋳型と十分に安定なハイブリ
ッド複合体を形成するには、低温が必要である。
これらのプライマーは、増幅されるそれぞれの特定の
列の異なる鎖に「実質的に」相補的になるように選択さ
れる。これは、それらのそれぞれの鎖とハイブリッド形
成するには十分に相補的でなければならないことを意味
する。それ故、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反
映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラ
グメントをプライマーの５′末端に結合させ、残りのプ
ライマー配列が鎖に対して相補的であるようにすること
ができる。また、プライマー配列が増幅される鎖の配列
に対して十分に相補的で、この鎖とハイブリッド形成す
ることによって、他のプライマーの伸長生成物の合成用
の鋳型となる場合には、非相補的塩基またはより長い配
列をプライマー中に含むことができる。しかしながら、
検出の目的には、詳細には標識した配列特異的プローブ
を用いて検出するには、プライマーは典型的には正確な
相補性を有する場合に最高の結果が得られる。
本明細書に用いられる「制限エンドヌクレアーゼ」お
よび「制限酵素」という用語は、細菌酵素であって、そ
れぞれが特異的ヌクレオチド配列のまたはその付近の二
重鎖DNAを切断するものを指す。
本明細書に用いられる「DNA多形」という用語は、２
種以上の異なるヌクレオチド配列がDNAの特定の部位に
存在することができる状態を指す。
本明細書に用いられる「ヌクレオチド配列の変化」と
いう用語は、ある種の単一または複数のヌクレオチド置
換、欠失または挿入を指す。これらのヌクレオチド変化
は、突然変異または多形性対立遺伝子変異であることも
ある。それ故、本明細書に用いられる方法は、単一塩基
の変異、付加または欠失によって起こされるβ−グロブ
リン遺伝症（ある種のβ−サラセミア、鎌状赤血球貧
血、ヘモグロビンＣ症など）において起こるような核酸
での単一ヌクレオチド変化を検出することもでき、また
α−サラセミアまたはある種のβ−サラセミアに包含さ
れるような多数塩基変異を検出することもできる。更
に、本発明の方法は病気に必然的には関連せず、集団中
の核酸の特定の部位、例えばヒトゲノム及びランダム多
形例えばミトコンドリアDNAのHLA領域に単に（置換され
た、欠失されたまたは挿入されたヌクレオチド塩基対の
ような）２種以上の異なるヌクレオチド配列が存在する
ような状態である多形を検出することができる。以下に
詳細に記載する多形配列に特異的なオリゴヌクレオチド
プローブは、インシュリン依存性の糖尿病メリトゥス
（mellitus）のような病気に関連した遺伝的マーカーを
検出するのに使用され、または法医学の応用に用いるこ
ともできる。核酸が二本鎖である時には、配列中のヌク
レオチド変化は配列の塩基対変化になる。
「配列特異的オリゴヌクレオチド」という用語は、対
立遺伝子に含まれるまたは含まれない特定の配列にハイ
ブリッド形成するオリゴヌクレオチドを指し、これらの
配列は検出される塩基対変化を含み、そして検出される
配列変異に特異的である。分析される配列によっては、
１種以上の配列特異的ヌクレオチドをそれぞれの配列に
対して、以下に更に記載のように用いることもできる。
本明細書に用いられる「制限フラグメント長さ多形」
（RFLP）という用語は、特定の制限エンドヌクレアーゼ
で消化することによって形成される制限フラグメントの
長さの個体間の差を指す。
本明細書に用いられる「熱安定酵素」という用語は、
熱に安定であり、耐熱性を有し、それぞれの核酸鎖に相
補的であるプライマー伸長生成物を形成する適当な方法
でヌクレオチドの結合を触媒（促進）する酵素を意味す
る。一般的には、合成はそれぞれのプライマーの３′末
端で開始され、合成が終結するまで鋳型鎖に沿って５′
方向に進行し、異なる長さの分子を産生する。しかしな
がら、５′末端で合成を開始し、上記と同様な工程を用
いて、他の方向に進む熱安定酵素もある。
本明細書に用いられる熱安定酵素は、増幅反応に効果
的であるという唯一の規準を満たすものでなければなら
ず、すなわち、酵素は、二本鎖核酸の変性を行うのに必
要な時間高温に付す時に、不可逆的に変性（不活性化）
するものであってはならない。この場合の不可逆的変性
とは、酵素活性を永久に且つ完全に喪失することを意味
する。変性に必要な加熱条件は、例えば緩衝液の塩濃
度、変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成によ
って変わるが、典型的には、約90〜約105℃の範囲であ
り、時間については主として温度および核酸の長さによ
って変わり、典型的には約0.5〜４分間である。緩衝液
の塩濃度および／または核酸のGC組成が増加すると、更
に高温を用いることもできる。好ましくは、酵素は約90
〜100℃で不可逆的に変性しない。
本明細書に用いられる熱安定酵素は、好ましくはその
酵素が機能する最適温度は約40℃よりも高く、鋳型への
プライマーのハイブリダイゼーションが促進される温度
よりも低い温度であるが、（１）マグネシウムおよび塩
濃度および（２）プライマーの組成および長さによって
は、ハイブリダイゼーションは更に高い温度（例えば45
〜70℃）で起こることができる。酵素にとっての最適温
度が高くなれば、プライマー関連の伸長法の特異性およ
び／または選択性は大きくなる。しかしながら、40℃未
満（例えば37℃）で活性な酵素も、熱に安定であるかぎ
り、本発明の範囲内に含まれる。好ましくは、最適温度
は約50〜90℃であり、更に好ましくは60〜80℃である。
本明細書に用いられる熱安定酵素は、如何なる由来か
ら得ることもでき、天然または組換え蛋白質であっても
よい。耐熱性を有するものとして文献に報告されている
酵素の例は、熱に安定なポリメラーゼ、例えば好熱菌の
テルムス・フラブス（Thermus flavus）、テルムス・
テルモフイルス（Thermus Thermophilus）、バシルス
・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermoph
ilus）（他の文献に報告されているものよりも幾分低い
最適温度を有する）、テルムス・アクアチクス（Thermu
s aquaticus）、テルムス・ラクテウス（Thermus lac
teus）テルムス・ルーベンス（Thermus rubens）、お
よびメタノテルムス・フェルビドウス（Methanothermus
fervidus）から抽出されたポリメラーゼがある。
本明細書に用いられる好ましい熱安定酵素は、テルム
ス・アクアチクス（Thermus aquaticus）から単離され
たDNAポリメラーゼである。この各種の株も、アメリカ
ン・タイプ・カルチャ・コレクション（American Type
Culture Collection）ロックビル，メリーランド、から
入手することができ、ティ・ディ・ブロック（T.D.Broc
k）、J.Bact.（1969年）、98巻、289〜297頁、およびテ
ィ・オシマ（T.Oshima）、Arch.Microbiol.、（1978
年）、117巻、189〜196頁に記載されている。これらの
好ましい菌株の一つは、YT−１株である。
天然タンパク質を回収するためには、細胞を適当な技
術を用いて増殖させる。この様な技術は、カレジン（Ka
ledin）ら、Biokhimiya、（1980年）同上、に記載され
ている。簡単に言えば、１リットルに、ニトリロトリ酢
酸（100mg）、トリプトン（3g）酵母抽出液（3g）、コ
ハク酸（5g）、亜硫酸ナトリウム（50mg）、リボフラビ
ン（1mg）、K2HPO4（522mg）、MgSO4（480mg）、CaCl2
（222mg）、NaCl（20mg）、および痕跡量の元素を含む
倍地上で細胞を増殖させる。倍地のpHは、KOHで8.0±0.
2に調整している。70℃の温度で激しく通気しながら、
細胞１リットルに対して20gまで培養すると、収量は増
加する。後期対数増殖期における細胞（550nmでの吸収
により測定）を遠心分離によって集めて、緩衝液で洗浄
し、−20℃に凍結保存した。
チエン（Chien）ら、J.Bacteriol.、1976年、同上、
による細胞を生育させるもう一つの方法では、0.1mg/l
のビオチンを補填した0.3％のグルタミン酸、0.1mg/lチ
アミンおよび0.05mg/lのニコチン酸を含む定義された無
機塩倍地が用いられる。これらの塩にはニトリロトリ酢
酸、CaSO4，MgSO4,NaCl,KNO3，NaNO3，ZnSO4，H3BO3，C
uSO4，NaMoO4，CoCl2，FeCl3，MnSO4、およびNa2HPO4が
ある。倍地のpHはNaOHで8.0に調整している。
チエン（Chien）らの方法では、細胞は最初は75℃で
水溶シェーカー中で増殖させる。一定の温度に達したな
ら、これらの細胞１リットルを、熱風インキュベーター
に入れてある16リットルのカーボーイ（carboys）に移
す。無菌空気を培養液中に通して、温度を75℃に維持す
る。細胞を20時間増殖させた後、遠心分離によって回収
する。
細胞の増殖の後、酵素の単離および生成を６段階で行
い、それぞれの段階は室温より低い温度、好ましくは約
４℃で行う。
第一の段階または工程では、細胞が、凍結している場
合には、解凍し、超音波で破砕し、pHが約7.5の緩衝液
に懸濁する。
第二の段階では上澄液を集めて、次いで乾燥硫酸アン
モニウムのような塩を加えることによって分別する。適
当な画分（典型的には、45〜75％飽和）を集めて、0.2
リン酸カリウム緩衝液、好ましくはpH6.5の緩衝液に溶
解して、同じ緩衝液に対して透析する。
第三の段階では、核酸及びある種の蛋白質を取り除
く。第二の段階からの画分を、上記と同じ緩衝液で平衡
化したDEAE−セルロースカラムにかける。次いで、この
カラムを同じ緩衝液で洗浄し、蛋白質含有画分を溶出
し、280nmでの吸収によって測定し、集めて、10mMリン
酸カリウム緩衝液に対して、好ましくは第一の緩衝液で
pHを7.5にしたものと同じ成分を有するもので透析す
る。
第四の段階では、上記のようにして集めた分画を、第
三の段階で透析に用いた緩衝液で平衡にしたヒドロキシ
アパタイトカラムにかける。次いで、このカラムを洗浄
し、10mMの２−メルカプトエタノールと５％のグリセリ
ンを含むpH7.5の0.01M〜0.5Mリン酸カリウム緩衝液の直
線グラジエントで酵素を溶出する。プールした熱安定酵
素（例えばDNAポリメラーゼ）活性を含む画分を、第三
の段階で透析に使用したのと同じ緩衝液で透析する。
第五の段階では、透析した画分を、第三の段階で透析
に使用した緩衝液で平衡化したDEAE−セルロースカラム
にかける。このカラムを次に洗浄し、第三の段階で透析
に使用した緩衝液中で0.01〜0.6MのKClのような緩衝液
の直線グラジエントで、酵素を溶出する。熱安定酵素の
活性を有する画分を、適当な方法を用いてデオキシリボ
ヌクレアーゼ（エンド−およびエキソヌクレアーゼ）の
混入について試験した。例えば、エンドヌクレアーゼ活
性は、過剰のDNAポリメラーゼと共にインキュベートし
た後ファージλDNAまたはスーパーコイルプラスミドDNA
の分子量の変化から、電気泳動によって測定することが
できる。同様に、エキソヌクレアーゼ活性は、数個の部
位で開裂する制限酵素を用いて処理した後、DNAの分子
量の変化から電気泳動によって測定することができる。
デオキシリボヌクレアーゼ活性を持たないと決定され
た画分をプールして、第三の段階で用いたのと同じ緩衝
液で透析する。
第六の段階では、プールした画分を、一定のベッドボ
リウムを有するホスホセルロースカラムに入れる。この
カラムを洗浄して、pH7.5でリン酸カリウム緩衝液中0.0
1〜0.4MのKClのような緩衝液の直線グラジエントで酵素
を溶出する。熱安定なポリメラーゼ活性を有し、デオキ
シリボヌクレアーゼ活性を有しないプールした画分を、
pH8.0の緩衝液で透析する。
透析した生成物の分子量は、蛋白質分子量マーカーを
用いてSDS PAGEによる方法等によって決定することがで
きる。好ましい酵素の一つであるテルムス・アクアチク
ス（Thermus aquaticus）から精製されたDNAポリメラ
ーゼの分子量は、上記方法によって、約86,000〜90,000
ドルトンと決定される。
本発明の熱安定酵素は、この酵素をコードする遺伝子
がテルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）ゲノ
ムDNAからクローン化されたとき、組換えDNA技術によっ
て産生させることもできる。テルムス・アクアチクス
（Taq）ポリメラーゼについての完全なコード配列は、
約18kb（キロベース）のゲノムDNAインサートフラグメ
ント内に含まれる約3.5kbのBalII−Asp718（部分）制限
フラグメント上バクテリオファージCH35:Taq＃４−２か
ら誘導することができる。このバクテリオファージは、
1987年５月29日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ATCC）に寄託され、寄託番号第40,336号を
有する。また、この遺伝子は、プラスミドpFC83（ATCC
第67,422号、1987年５月29日寄託）から単離された約75
0塩基対（bp）のBglII−HindIII制限フラグメントを、
プラスミドpFC85（ATCC第67,421号、1987年５月29日寄
託）から単離された約2.8kbHind III−Asp718制限フラ
グメントに連結することによって造成することができ
る。pFC83制限フラグメントはTaqポリメラーゼ遺伝子の
アミノ末端を有するが、pFC85からの制限フラグメント
はカルボキシ−末端を有する。したがって、これらの２
個のフラグメントを、適当な制御配列を有する対応して
消化されたベクターと連結すると、全長Taqポリメラー
ゼの翻訳が得られる。
Taqポリメラーゼ遺伝子の全コード配列は、所望の酵
素活性を有する生物学的に活性な遺伝子生成物を回収す
ることを必要としないことも見出された。アミノ末端の
欠失であって、コード配列の約３分の１が不在であるも
のが、ポリメラーゼ分析において完全に活性な遺伝子生
成物を産生した。
Ｎ−末端の欠失に加えて、Taqポリメラーゼを構成す
るペプチド鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、
またはその他の誘導体化によって改変することができ、
そしてこの蛋白質を開裂して、活性を保持するフラグメ
ントを得ることができる。活性を破壊しないかかる変更
は、遺伝子の定義から上記蛋白質をコードするDNA配列
を除外しない。
したがって、翻訳の間に配列に組み込まれるアミノ酸
の欠失、付加または変更による一次構造自体の改変は、
蛋白質の活性を破壊することなく行うことができる。か
かる置換またはその他の変更は、本発明の予想された範
囲内にあるDNAによってコードされたアミノ酸配列を有
する蛋白質をもたらす。
本発明の精製された86,000〜90,000ドルトンのポリメ
ラーゼで免疫したウサギからのポリクローナル抗血清を
用いて、テルムス・アクアチクス（Thermus aquaticu
s）の部分ゲノム発現ライブラリーをプローブして、下
記のようにして適当なコード配列を得た。クローン化さ
れたゲノム配列は融合ポリペプチドとして発現させた
り、それ自体の制御配列を用いて直接に発現させたり、
または酵素の発現に用いられる特定の宿主に好適な制御
配列を用いる構成によって発現させることができる。
勿論、これらの配列をコードするDNA入手可能性は、
コドン配列を改変してDNAポリメラーゼ活性をも有する
ムテイン（mutein）形を生じるようにする機会を提供す
る。
例えば、これらの手段は、TaqDNAポリメラーゼのため
の完全なコード配列を提供して、これから、各種の宿主
系に適用できるものを発現ベクター構成し、そしてコー
ド配列を発現することができる。以上のことから、Taq
ポリメラーゼコード配列の部分はプローブとして有用で
あり、色々な種のその他の熱安定ポリメラーゼコード配
列を回収するためのプローブとして有用であることも明
らかである。したがって、少なくとも６個のアミノ酸を
コードするゲノムDNAの部分をE.コリ（E.coli）におい
て複製することができ、そして少なくとも６個のアミノ
酸をコード化し且つ熱安定ポリメラーゼをコード化する
その他のDNAを回収するための使用されるプローブまた
はオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブとして用い
られる変形した形態のものを合成することができる。テ
ルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）における
ヌクレアーゼ配列とその他の種類の対応する部分の配列
は正確には一致しないことがあるので、（６個のアミノ
酸ストレッチをコードする）約18個のヌクレオチドを有
するオリゴマーは、恐らく、間違った陽性を排除するの
に十分なストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼー
ションを行うのに必要であろう。６個のアミノをコード
する配列は、かかるプローブに十分な情報を供給するで
あろう。
好適な宿主、制御系および方法 一般的な言い方では、組換え形のTaqポリメラーゼの
製造は、以下のような工程を含む。
第一に、成熟酵素（この場合、総てのムテインを含む
ように用いられる）、あるいはTaqポリメラーゼとその
活性を破壊しない追加の配列との融合体または制御され
た条件下で（例えば、ペプチドでの処理によるような）
の開裂して他の蛋白質をもたらすことができる追加の配
列との融合体をコード化するDNAを得る。配列がイント
ロンによって中断されていないときには、それは如何な
る宿主における発現にも好適である。この配列は、切り
出し可能で且つ回収可能な形であるべきである。
次に、好ましくは、切り出されたまたは回収されたコ
ード配列を、複製可能な発現ベクター中の好適な制御配
列と作用可能に連結する。このベクターを用いて、好適
な宿主を形質転換し、形質転換された宿主を好ましい条
件下で培養して、組替えTaqポリメラーゼを産生させ
る。任意には、Taqポリメラーゼを培養液または細胞か
ら単離するが、ある種の不純物が許容される場合には、
蛋白質の回収および精製は必要でないこともある。
上記の段階のそれぞれは、各種の方法で行うことがで
きる。例えば、所望のコード配列をゲノムフラグメント
から得て、適当な宿主に直接用いることもできる。各種
の宿主で作用可能な発現ベクターの造成は、以下のよう
な適当なレプリコンを用いて行なわれる。好適な制限部
位は、通常は利用可能でない場合には、コード配列の末
端に加えて切り出し可能な遺伝子を得、これらのベクタ
ーに抽入することができる。
制御配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子
を発現するのに用いられる宿主細胞の型によって異る。
一般的には、原核細胞、酵母、昆虫または哺乳類細胞
が、宿主として現在有用である。原核宿主は、一般的に
は組換え蛋白質の産生にとって最も有効で好都合であ
り、それ故Taqポリメラーゼの発現にとって好ましい。
Taqポリメラーゼの特定の場合には、組換え条件下お
よび自然条件下のいずれにおいても、蛋白質のＮ−末端
でかなり欠失が起こり、そして蛋白質の活性はなお保持
されたままであることを示す証拠が存在する。単離され
た天然蛋白質は、蛋白質分解による減成の結果であり、
不完全な遺伝子の翻訳の結果ではない。プラスミドpFC8
5の不完全な遺伝子から産生されたムテインは、しかし
ながら、DNAポリメラーゼの分析で完全な長さを有する
配列をコード化するDNAから産生されたムテインと同様
に、完全に活性である。ある種のＮ末端が短縮された形
は活性であることが明らかであるので、用いられる遺伝
子構成またはポリメラーゼの発現も、対応する短縮され
た形状のコード配列を有することがある。
制御配列および対応する宿主 原核生物は、最も一般的には、E.コリ（E.coli）の各
種株によって代表される。しかしながら、バシルス属、
例えばバシルス・ズブチリス（Bacilus subtilis）、各
種のシュドモナス（Pseudomonas）またはその他の菌株
のような他の微生物株を用いることもできる。かかる原
核系では、宿主と適合性の種に由来する複製部位と制御
配列を有するプラスミドベクターが用いられる。例え
ば、E.コリ（E.coli）は、典型的には、ボリバー（Boli
var）ら、Gene、1977年、２巻、95頁によるE.コリ（E.c
oli）種に由来するプラスミドであるpBR322の誘導体を
用いて形質転換される。pBR322はアンピシリンおよびテ
トラサイクリン耐性の遺伝子を有し、所望のベクターを
造成する際に保持されまたは破壊される付加的マーカー
を提供する。転写開始を促進し、任意にはオペレーター
を有し且つリボゾーム結合部位配列を有する本明細書記
載の一般的に用いられる原核制御配列には、β−ラクタ
マーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac）プ
ロモーター系〔チャン（Chang）ら、Nature（1977年）1
98巻、1056頁〕、トリプトファン（trp）プロモーター
系〔ゲーデル（Goeddel）ら、Nucleic Acids Res.（198
0年）８巻、4057頁〕、およびλ由来のPLプロモーター
〔シマタケ（Shimatake）ら、Nature（1981年）292巻、
128頁〕および輸送可能な制御カセットとして有用なＮ
−遺伝子リボゾーム結合部位があり、これはポータブル
制御カセットとして有用にされており、このものは、N
RBS配列の6bp3′内での開裂を可能にする少なくとも１
個の制限部位を有する第三のDNA配列のNRBS上流に対応
する第二のDNA配列に操作可能に連結したPLプロモータ
ーである第一DNA配列を含んで成る。チャン（Chang）ら
の欧州特許出願公開第196,864号明細書（1986年10月８
日発行）に記載され、同じ承継人に承継されたホスファ
ターゼＡ（phoA）系も有用である。しかしながら、原核
生物に適合性の如何なる利用可能なプロモーターも用い
ることができる。
細菌に加えて、酵母のような真核微生物も宿主として
用いることができる。サッカロミセス・セレビシアエ
（Saccharomyces cerevisiae）の実験室菌株であるパン
酵母が最も多く用いられるが、その他の多くの菌株も一
般的に利用可能である。２ミクロン複製開始点用いるベ
クターが示されているが〔ブローチ，ジェイ，アール
（Broach,J.R.）、Meth.Enz.（1983年）101巻、307
頁〕、酵母の発現に好適な他のプラスミドベクターも知
られている〔例えば、スチンクコンブ（Stinchcomb）
ら、Nature（1979年）282巻、39頁、チェンペ（Tschemp
e）ら、Gene（1980年）10巻、157頁およびクラーク（Cl
arke）ら、Meth.Enz.（1983年）101巻、300頁を参照さ
れたい〕。酵母ベクターに対する制御配列は、解糖酵素
の合成のプロモーターを有する〔ヘス（Hess）ら、J.Ad
v.Enzyme Reg.（1968年）７巻、149頁、ホランド（Holl
and）ら、Biotechnology（1978年）17巻、4900頁〕。
その他の当業界に知られているプロモーターには、３
−ホスフィングリセレート・キナーゼ（ヒッツェマン
（Hitzeman）ら、J.Biol.Chem.（1980年）255巻、2073
頁）およびその他の解糖酵素、例えばグリセルアルデヒ
ド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナ
ーゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフルク
トキナーゼ、グルコース−６−ホスフェート・イソメラ
ーゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベート
・キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメラーゼ、ホ
スホグルコースイソメラーゼおよびグリコキナーゼのプ
ロモーターがある。増殖条件により制御される追加の利
点を有するその他のプロモーターは、アルコールデヒド
ロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファター
ゼ、窒素代謝に関係する分解酵素およびマルトースおよ
びガラクトース利用に関する酵素のプロモーターである
（ホランド（Holland）同上〕。
ターミネーター配列は、コード配列の３′末端におい
て望ましいと思われる。かかるターミネーターは、酵母
由来の遺伝子におけるコード配列に続く３′非翻訳領域
に見出される。示されたベクターの多くはプラスミドpe
no46を有するエノラーゼ遺伝子〔ホランド（Holland,M.
J.）ら、J.Biol.Chem.（1981年）256巻、1385頁〕また
はYEp13から得られるLEU2遺伝子〔ブローチ（Broach,
J.）ら、Gene（1978年）８巻、121頁〕から誘導される
制御配列を有するが、酵母適合性プロモーター、複製開
始点およびたの制御配列を有する如何なるベクターも好
適である。
勿論、多細胞生物に由来する真核宿主細胞培養液にお
いてポリペプチドをコードする遺伝子を発現させること
も可能である。例えば、Tissue Culture、アカデミック
・プレス（Academic Press）、クルツ（Cruz）とパター
ソン（Patterson）監修（1973年）を参照されたい。有
用な宿主細胞系には、ネズミミエローマN51、VEROおよ
びHela細胞、およびテンジクネズミ卵巣（CHO）細胞が
ある。これらの細胞の発現ベクターは、通常は、シミア
ンウイルス40（SV40）からの一般的に用いられる早期お
よび後期プロモーター（フィールス（Fiers）ら、Natur
e（1978年）273巻、113頁）、またはポリオーマ、アデ
ノウイルス２、ウシパピローマウイルスまたはトリザル
コーマウイルスに由来するようなプロモーター、または
免疫グロブリンプロモーターおよび熱ショックプロモー
ターのような哺乳類細胞に適合性のプロモーターおよび
制御配列を有する。BPVをベクターとして用いる哺乳類
系におけるDNA発現系は、米国特許第4,419,446号明細書
に開示されている。この系の変形は、米国特許第4,601,
978号明細書に記載されている。哺乳類細胞系の形質転
換の一般的態様は、米国特許第4,399,216号明細書に記
載されている。「エンハンサー」領域が、最適な発現に
おいて重要であると思われるが、これらの領域は一般的
にはプロモーター領域の上流に見出される配列である。
所望であるならば、複製開始点をウイルス源から得るこ
とができる。しかしながら、染色体への組み込みは、真
核生物でのDNA複製では一般的な機構である。
植物細胞も宿主として利用可能であり、植物細胞に適
合する制御配列、例えばノパリン・シンターゼ・プロモ
ーターおよびポリアデニル化シグナル配列（デピッカー
（Depicker,A.）ら、J.Mol.Appl.Gen.（1982年）１巻、
561頁）が利用できる。
更に、最近では、バクロウイルス・ベクターによって
提供される制御系を利用する昆虫細胞を用いた発現系も
報告されている〔ミラー（Miller,D.W.）ら、Genetic E
ngineering（1986年）、セトロウ（Setlow,J.K.）ら監
修、プレナム・パブリッシング（Plenum Publishin
g）、８巻、277〜297頁〕。これらの系はTaqポリメラー
ゼの産生にも成功している。
形質転換 用いる宿主細胞に依存して、形質転換はその細胞に適
当な標準的な技術を用いて行なわれる。塩化カルシウム
を用いるカルシウム処理（コーヘン（Cohen,S.N.）、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.(USA)（1972年）69巻、2110頁）は、
原核生物またはその他の実質的な細胞障壁を有する細胞
に用いられる。アグロバクテリウム・チュメファシエン
ス（Agrobacterium tumefaciens）での感染〔シァウ（S
haw,C.H.）ら、Gene（1983年）23巻、315頁〕は、ある
種の植物細胞で用いられる。上記のような細胞壁を持た
ない哺乳類細胞では、グラハム（Graham）とヴァン・デ
ル・エブ（van der Eb）のリン酸カルシウム沈澱法が好
ましい〔Virology（1978年）52巻、546頁〕。酵母への
形質転換は、ヴァン・ゾリンゲン（VanSolingen,P.）ら
（J.Bact.、1977年、130巻、946頁）およびシアオ（Hsi
ao,C.L.）ら（Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）、1979年、7
6巻、3829頁）の方法によって行なわれる。
λgtll発現ライブラリーの造成 所望の蛋白質をコードするDNA、例えばTaqポリメラー
ゼをコードするDNAをバクテリオファージλgtllを用い
て単離する方法は、次の通りである。ライブラリーは、
テルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）DNAの完
全な消化によって生じ、λgtllファージのEcoRI部位に
挿入されたEcoRI部位を両端に有するAluIフラグメント
から構成され得る〔ヤング（Young）とデービス（Davi
s），Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1983年、80巻、1194〜1
198頁〕。このバクテリオファージ中のユニークEcoRI部
位がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のカルボキシ末端に配
置しているので、（適当なフレームおよび方向で）挿入
されたDNAは、ラクトースオペロンプロモーター／オペ
レーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼと融合した蛋
白質として発現される。
ゲノム発現ライブラリーを次に抗体プラークハイブリ
ダイゼーション法を用いてスクリーニングする。この方
法は「エピトープ選択」と呼ばれ、このファージによっ
てコードされた融合蛋白質配列に対する抗血清を用いて
ハイブリッド形成したプラークを同定するものである。
例えば、この組換えファージのライブラリーは、86,000
〜90,000ドルトンのTaqポリメラーゼを認識する抗体を
用いてスクリーニングして、この蛋白質の抗原決定基を
コードするDNAセグメントを有するファージを同定する
ことができる。
約２×105個の組換えファージを、全ウサギTaqポリメ
ラーゼ抗血清を用いてスクリーニングする。この一次ス
クリーニングでは、陽性シグナルが検出され、これらの
プラークの１種以上が、免疫前血清と反応せず且つ免疫
血清と反応する候補プラークから精製され、幾分詳細に
分析される。組換えファージによって産生される融合蛋
白質を検査するため、宿主Y1089におけるファージの溶
原株を得る。溶原株を誘発し、生成する蛋白質をゲル電
気泳動した後、それぞれの溶原株が他の溶原株には見ら
れない新たな蛋白質を産生するのを観察することがで
き、または重複配列が生じることもある。陽性シグナル
を有するファクターを取り出す。ここに記載する例にお
いては陽性プラークを取り出して更に同定を行ない、低
密度で再プレートして組換体を純化し、純化したクロー
ンをEcoRI制御酵素での消化によるサイズクラスによっ
て分析した。次に、プローブを単離されたDNA挿入配列
から作り、適当に標識を行い、そしてこれらのプローブ
をマニアチス（Maniatis）ら、Molecular Cloning:A La
boratory Manual、1982年に記載されている通常のプラ
ークハイブリダイゼーション又はコロニーハイブリダイ
ゼーション分析法に用いることができる。
標識したプローブを用いて、シャロン（Charon）35バ
クテリオファージ中に構成された第二のゲノムライブラ
リーをプローブした（ウイルヘルマイン（Wilhelmine,
A.M.）ら、Gene、1983年、26巻、171〜179頁）。このラ
イブラリーは、テルムス・アクアチクス（Thermus aqua
ticus）ゲノムDNAのSau3A部分消化によって作られ、そ
してサイズ分別したフラグメント（15〜20kb）をシャロ
ン35ファージのBamHI部位にクローン化した。このプロ
ーブを用いて、TaqポリメラーゼをコードするDNAを含む
ファージを単離した。CH35:Taq＃４−２と命名した生成
するファージの一つは、全遺伝子配列を有することが判
明した。この遺伝子の部分をコードする部分配列も単離
された。
ベクターの造成 所望のコード配列および制御配列を含有する好適なベ
クターの造成は、当業界で周知の標準的な連結および制
限技術を用いる。単離したプラスミド、DNA配列または
合成されたオリゴヌクレオチドを開裂し、ととのえ、そ
して再凍結して所望の形状にする。
部位特異的DNA開裂は、当業界で周知の条件下で好適
な（１種以上の）制限酵素を用いて処理することによっ
て行ない、その詳細はこれらの市販の制限酵素の製造業
者によって記載されている。例えば、ニュー・イングラ
ンド・バイオラブス（New England Biolabs）、製品カ
タログを参照されたい。一般的には、約１μｇのプラス
ミドまたはDNA配列を、約20μｌの緩衝溶液中で１単位
の酵素で開裂し、本明細書の実施例では、典型的には、
過剰量の制限酵素を用いてDNA基質を完全に消化するよ
うにしている。約37℃で約１〜２時間のインキュベーシ
ョン時間が有効であるが、変更を行なうこともできる。
それぞれのインキュベーションの後に、蛋白質をフェノ
ール／クロロホルムで抽出して、次いでエーテル抽出を
行なうことによって除去して、核酸を水性分画からエタ
ノール沈澱によって回収することができる。所望なら
ば、開裂フラグメントのサイズ分離を、標準的技術を用
いるポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気
泳動によって行なうことができる。サイズ分離の一般的
説明については、Methods inEnzymology、1980年、65
巻、499〜560頁に記載されている。
制限開裂したフラグメントを、50mMのトリス、pH7.
6、50mMのNaCl、10mMのMgCl2、10mMのDTTおよび50〜100
μＭのdNTPs中で、20〜25℃で約15〜25分間のインキュ
ベーション時間を用いて、４種類のデオキシヌクレオチ
ドトリホスフェート（dNTP）の存在でE.コリ（E.coli）
DNAポリメラーゼＩ（クレノウ（Klenow））の大フラグ
メントで処理することによって平滑末端にすることがで
きる。クレノウフラグメントは５′接着末端をフィルイ
ンするが、４種のdNTPsが存在していても、突出する
３′単一鎖をチューバック（chewsback）する。所望な
らば、接着末端の性状によって指定される制限内で唯１
種のまたは選択された複数のdNTPsを供給することによ
って選択的修復を行なうことができる。クレノウで処理
した後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、
エタノールで沈澱させた。適当な条件下でS1ヌクレアー
ゼを用いて処理すると、単一鎖部分の加水分解が起こ
る。
合成オリゴヌクレオチドは、マテウチ（Matteucci）
ら（J.Am.Chem.Soc.、1981年、103巻、3185〜3191頁）
のトリエステル法を用いて、または自動合成法を用いて
調製することができる。アニーリングの前のまたは標識
のための単一鎖のキナージングは、50mMのトリス、pH7.
6、10mMのMgCl2、5mMのジチオスレイトール、１〜2mMの
ATPの存在下で、1nMの基質に対して過剰量の、例えば約
10単位のポリヌクレオチドキナーゼを用いて行なう。こ
のキナーゼ処理がプローブの標識するためのものである
ときには、ATPは高比活性のγ−32Pを有する。
連結は、下記の標準的条件及び温度で15〜30μｌの容
積で行なう。20mMTris−HCl、（pH7.5）10mM MgCl2、10
mM DTT、33μg/μl BSA、10mM〜50mMのNaCl、および
（「接着末端」の連結には）40μＭのATP、0.01〜0.02
〔ワイス（Weiss）〕単位のT4DNAリガーゼ、０℃；また
は（「平滑末端」の連結には）1mMのATP、0.3〜0.6〔ワ
イス（weiss）〕単位のT4DNAリガーゼ、14℃。分子内
「粘着末端」連結は、通常は33〜100μg/mlの総DNA濃度
（５〜100nMの総末端濃度）で行なう。分子間平滑末端
連結（通常は10〜30倍の過剰モルのリンカーを用いる）
は、１μＭの総末端濃度で行なう。
「ベクターフラグメント」を用いるベクターの造成で
は、ベクターフラグメントを通常は細菌性アルカリホス
ファターゼ（BAP）で処理して５′ホスフェートを除去
して、ベクターの再連結を防止する。BAP消化は、pH8
で、約150mMのトリス中で、Na+およびMg+2の存在で、ベ
クター1mg当たり約１単位のBAPを用いて、60℃で約１時
間行なう。核酸フラグメントを回収するため、調製物を
フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱せ
しめる。また、好ましくないフラグメントを追加的制限
酵素消化によって二重消化されたベクターでは、連結は
防止することができる。
DNA配列の改変 配列の改変を必要とするcDNAまたはゲノムDNAに由来
するベクターの部分については、部位特異的なプライマ
ー指令変異誘発を用いる。この技術は現在では当業界で
標準的であり、所望の変異を表わす限定されたミスマッ
チを除いて変異誘発されるべき単一鎖ファージDNAに相
補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行な
われる。要約すれば、ファージに相補的な鎖の合成を指
令するプライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用
い、生成する二本鎖DNAをファージ支持性の宿主細菌に
形質転換する。形質転換された細菌の培養液を上層寒天
に塗布しファージを有する単一細胞からプラークを形成
させる。
理論的には、新たなプラークの50％は変異形を単一鎖
として有するファージを含み、50％はもとの配列を有す
る。プラークをニトロセルロースフィルターに移して、
正確にマッチするハイブリダイゼーション可能にし且つ
もとの鎖とのミスマッチがハイブリダイゼーションを防
止するのに十分であるような温度で、キナーゼ処理した
合成プライマーで「リフト（lifts）」ハイブリダイゼ
ーションを行なう。次に、このプローブとハイブリッド
形成するプラークを採取して、培養し、DNAを回収す
る。
造成の証明 以下の造成では、プラスミド造成物の正確な連結を、
最初に連結混合物を用いてE.コリ（E.coli）MM294株ま
たは他の適当な宿主を形質転換することによって確かめ
る。当業界で理解されているように、好結果の形質転換
体を、プラスミド造成の方式に依存してアンピシリン耐
性、テトラサイクリン耐性またはその他の抗生物質耐性
によって選択する。次に、形質転換体からのプラスミド
を、クレウエル（Clewell,D.B.）ら、（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA、1969年、62巻、1159頁）の方法により、場
合によってはクロラムフェニコール増幅法（クレウエル
（Clewell,D.B.）,J.Bacteriol.、1972年、110巻、667
頁）によって調製する。単離したDNAを、制限処理によ
り分析しそして／又はサンガー（Sanger,F.）ら（Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、1977年、74巻、5463頁）のジデオ
キシ法であって更にメッシング（Messing）ら（Nucleic
Acids Res.、1981年、９巻、309頁）によって記載され
ている方法またはマクサム（Maxam）ら（Methodsin Enz
ymology、1980年、65巻、499頁）の方法によって配列決
定する。
宿主の例 この発明においてクローニング及び発現に用いられる
宿主菌株は、次の通りである。
クローニング及び配列決定、並びにほとんどの細菌性
プロモーターの制御下での造成物の発現には、E.コリ
（E.coli）ゲネチック・ストック・センターGCSG＃6135
から得たE.コリ（E.coli）株MM294を宿主として用い
た。PL NRBSプロモーターの制御下での発現には、E.コ
リ（E.coli）K12株MC1000λ溶原株、N7N53c1857Sus
P80、ATCC39531を用いることができる。本明細書では、
1987年４月７日にATCC（ATCC 53606）で寄託したE.コリ
（E.coli）DG116を用いる。
M13ファージ組換体のためには、ファージ感染を受け
やすいE.コリ（E.coli）、例えばE.コリK12株DG98を用
いる。DG98株は1984年７月13日にATCC寄託され、寄託番
号39768を有する。
哺乳類での発現はCOS−７、COS−A2、CV−１およびネ
ズミ細菌で行うことができ、そして昆虫細胞ではスポド
プテラ・フルジペイダ（Spodoptera frugipeida）での
発現を基礎とする。
酵素活性の安定化 酵素は、長期間安定にするためには、１種又は複数種
の非イオン性ポリマー性洗剤を含む緩衝液中に貯蔵しな
ければならない。この様な洗剤は一般的には分子量が約
100〜250,000の範囲であり、好ましくは約4,000〜200,0
00ドルトンであり、pHが約3.5〜約9.5、好ましくは約４
〜8.5で酵素を安定化するものである。この様な洗剤の
例としては、マツク・クチェオン（McCutcheon）のEmul
sfiers & Detergents、北アメリカ版（1983年）エムシ
ー・パブリッシング・カンパニー（McPublishing Co.）
のマック・クチェオン部門発行、175、ロックロード、
グレンロック、ニュージャージ（米国）、の295〜298頁
に記載されているものがあり、その詳細については上記
文献を参照されたい。好ましくは、洗剤はエトキシル化
した脂肪族アルコールエーテルおよびラウリルエーテ
ル、エトキシル化したアルキルフェノール、オクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール化合物、改質オキシエ
チル化したおよび／またはオキシプロピル化した直鎖状
アルコール、ポリエチレングリコールモノオレエート化
合物、ポリソルベート化合物およびフェノール性脂肪族
アルコールエーテルからなる群から選択される。更に詳
細には、好ましくは、ポリオキシエチル化（20）ソルビ
タンモノラウレートであるツイーン（Tween）20〔ICI・
アメリカス・インコーポレーテド（ICI Americas In
c.）、ウイルミントン、DE〕およびエトキシル化アルキ
ルフェノール（ノニル）であるイコノール（Iconol）
（登録商標）NP−40（バスフ（BASF）イアンドット・コ
ーポレーション、パーシパニー、ニューシャージー）で
ある。
本発明の熱安定酵素は、この酵素が必要であるかまた
は望ましいような目的に用いられる。特定の好ましい態
様では、この酵素は下記のような増幅プロトコールに用
いられる。
増幅プロトコール 本発明の酵素を用いる増幅プロトコールは、欧州特許
出願公開第200,362号明細書に開示され且つ特許請求さ
れている既存の核酸配列を増幅する方法である。しかし
ながら、この酵素は以下のような増幅工程で用いるのが
好ましい。
一般的には、増幅工程は、連鎖反応であって、関与す
る反応段階の数に関して対数的な量で少なくとも１種の
特異的核酸配列を産生する連鎖反応からなる。但し、
（ａ）所望な配列の末端が十分詳細に知られており、そ
れらにハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを合成
することができ、（ｂ）少量の配列を連鎖反応を開始す
るのに利用することができることを条件とする。連鎖反
応の生成物は、用いられる特定のプライマーの末端に対
応する末端を有する別個の核酸デュプレックスであろ
う。
精製されたまたは末精製の形の如何なる核酸配列も、
それが所望の特定の核酸配列を含むかまたは含むと考え
られる場合には、出発核酸として用いることができる。
したがってこの工程は、例えばDNAまたはメッセンジャ
ーRNAを包含するRNAを用いることができ、これらのDNA
またはRNAは一本鎖または二本鎖であってもよい。更
に、DNA−RNAハイブリッドであってそれぞれの１つづつ
の鎖を有するものを利用することもできる。これらの核
酸のいずれかの混合物を用いることもでき、または同じ
または異るプライマーを用いて先行する増幅反応から産
生された核酸も同様に用いることができる。増幅される
べき特定の核酸配列は大きな分子の単なる部分であって
もよく、または最初から別個な分子として存在し、該特
定の配列が全核酸を構成していてもよい。
増幅される配列は純粋な形で存在することは必要では
なく、複雑な混合物の少量分画、例えば全ヒトDNAに含
まれるβ−グロビンの一部分（サイキ（Saiki）らScien
ce、230巻、1530〜1534頁、1985年、に例示されている
ようなもの〕または、特定の生物学的試料の極少量部分
のみを構成する特定の微生物の核酸配列の一部分である
こともできる。出発核酸配列は１種又は複数の所望の特
定の核酸配列を有し、この配列は同じでも異なるもので
あってもよい。それ故、この増幅工程は、ある種の特定
の核酸配列を多量に産生するのに有用であるだけでな
く、同じまたは異る核酸分子に配置された１種以上の異
る特定の核酸配列を同時に増幅するのにも有用である。
１種又は複数種の核酸は、如何なる由来からも得るこ
とができ、例えばpBR322のようなプラスミド、クローン
化されたDNAもしくはRNA、または細菌、酵母、ウイル
ス、オルガネラおよび植物または動物のような高等生物
のあらゆる由来の天然DNAまたはRNAから得ることもでき
る。DNAまたはRNAは血液、組織材料例えば絨毛膜または
羊膜細胞から、マニアチス（Maniatis）ら、同上、280
〜281頁によって記載されている方法のような各種技法
によって抽出することができる。
増幅され、その後検出される配列に特異的なプローブ
を用いるときには、細胞は核酸の抽出を行なわずに直ち
に用いることができ、この場合にはそれらを低張緩衝液
に懸濁して、細胞の溶解及び分子内成分の分散が起こる
まで、一般的には１〜15分間約90〜100℃に加熱する。
加熱工程の後、増幅試薬を、溶解した細胞に直接に加え
ることができる。
如何なる特定の核酸配列も、増幅工程によって産生す
ることができる。必要なことは、配列の両端の十分な数
の塩基が十分詳細に知られており、所望の配列の異なる
鎖と共に配列に沿った相対的に位置でハイブリッド形成
する２個のオリゴヌクレオチドプライマーを調製するこ
とができ、一つのプライマーから合成された伸長生成物
が、その鋳型（相補体）から分離した時に、画定された
長さの核酸配列へのもう一方の伸長のための鋳型として
働くことができるようにすることである。配列の両端の
塩基についての知識が多くなるに従って、標的核酸配列
のためのプライマーの特異性を高くすることができ、工
程の効率も高くなる。
これ以後に用いられる「プライマー」という用語は、
増幅される１又は複数のフラグメントの末端配列に関す
る情報が幾分不明確である場合には特に、１種より多く
のプライマーを意味することができる。例えば、核酸配
列が蛋白質配列情報から推定される場合には、遺伝子コ
ードの縮重による総ての可能なコドンの多様性を代表す
る配列が有するプライマーの集合をそれぞれの鎖につい
て用いられるであろう。この集合からのある１つのプラ
イマーは、増幅されるべき所望の配列の末端と相同であ
ろう。
オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば上記のホス
ホトリエステルおよびホスホジエステル法又はそれらの
自動化した態様のような如何なる好適な方法を用いても
調製することができる。この様な自動化した態様ではジ
エチルホスホルアミダイトを出発物質として用い、ビュ
ーケージ（Beaucage）らの方法（Tetrahedron Letter
s、1981年、22巻、1859〜1862頁）によって合成しても
よい。修飾された固形支持体上でオリゴヌクレオチドを
合成する方法は、米国特許第4,458,066号明細書に記載
されている。生物学的起源（例えば制限エンドヌクレア
ーゼ消化物）から単離したプライマーを用いることも可
能である。
特定の核酸配列は、この配列を含有する核酸を鋳型と
して用いて産生される。第一の段階は、それぞれの核酸
鎖を、増幅されまたは検出されるべきそれぞれの異なる
核酸配列について、４種の異なるヌクレオチドトリホス
フェートと１種のオリゴヌクレオチドプライマーと接触
させることを含む。増幅されまたは検出されるべき核酸
がDNAである時には、ヌクレオチドトリホスフェートはd
ATP,dCTP,dGTPおよびTTPである。
核酸鎖は、追加の核酸鎖の合成用の鋳型として用いら
れる。この合成は、如何なる好適な方法を用いて行なう
こともできる。一般的には、それは、好ましくはpHは７
〜９であり、最も好ましくは約８である水性緩衝溶液中
で起こる。好ましくは、分離された鋳型鎖を含む緩衝液
に２種のオリゴヌクレオチドプライマーを、過剰モル量
で（クローン化された核酸については、通常は約1000:1
のプライマー：鋳型比であり、ゲノム性核酸について
は、通常は約106:1のプライマー：鋳型比である）加え
る。しかしながら、この方法を診断的用途に用いるとき
には、相補的鎖の量が知られていないことがあり、した
がって相補的鎖の量に対するプライマーの量は確定する
ことができないことがあることが理解される。しかしな
がら、実際的には、加えられるプライマーの量は、一般
的には、増幅される配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物中
に含まれるときには、相補的鎖（鋳型）の量に対して過
剰モル量となるであろう。工程の効率を向上するには、
大過剰量が好ましい。
ヌクレオチドトリホスフェートの濃度は、増幅用の緩
衝液中ではそれぞれ150〜200μＭであり、MgCl2は緩衝
液中に1.5〜2mMの量で存在することにより反応の効率及
び特異性を増加させる。
次に、生成する溶液を、増幅または検出されるべき核
酸が二本鎖か一本鎖かに依存して処理する。核酸が一本
鎖であるときには、変性段階を用いる必要はなく、反応
混合物は、プライマーのその相補的標的（鋳型）配列へ
のハイブリダイゼーションを促進する温度に保持され
る。このような温度は一般的には約35℃〜65℃又はそれ
以上であり、好ましくは約37〜60℃であり、効果的な時
間は一般的には0.5〜５分間であり、好ましくは１〜３
分間である。好ましくは、Taqポリメラーゼ及び15−マ
ー以上のプライマーについては45〜58℃を用いてプライ
マーのハイブリダイゼーションの特異性を増加させる。
プライマーが短い場合には、より低温が必要である。
もとの一本鎖の核酸に対する相補体は、それに１また
は２個のオリゴヌクレオチドプライマーを加えることに
よって合成することができる。適当な単一プライマーを
加えた場合、プライマー伸長生成物が、該プライマー、
熱安定酵素およびヌクレオチドトリホスフェートの存在
で合成される。この生成物は該一本鎖の核酸に部分的に
相補的であり、そして該核酸鎖とハイブリダイズして等
しくない長さの鎖のデュプレックスを形成し、次いでこ
れが上記のように一本鎖に分離されて、２本の単一の分
離された相補的鎖を生成する。また、２種の適当なプラ
イマーを一本鎖核酸に加えて、反応を行なってもよい。
核酸が二本の鎖を有するときには、これを鋳型として
用いる前に核酸の鎖を分離する必要がある。この鎖分離
は、物理的、化学的または酵素的手段のような好適な変
性法によって行なうことができる。核酸の鎖を分離する
好ましい物理的方法は、核酸が完全（99％以上）に変性
するまで加熱することを含む。典型的な熱変性の温度は
約90〜105℃であり、時間は一般的には約0.5〜５分間で
ある。好ましくは、効果的な変性温度は、90〜100℃で
あり、0.5〜３分間である。鎖の分離は、ヘリカーゼと
して知られている酵素のクラスからの酵素、またはヘリ
カーゼ活性を有しそしてリボATPの存在下でDNAを変性す
ることが知られている酵素RecAによって誘発することも
できる。ヘリカーゼを用いて核酸の鎖を分離するのに好
適な反応条件は、クーン・ホフマン−ベーリング（Kuhn
Hoffmann−Berling），CSH-Quantitative Biology43
巻、63頁、1978年に記載されており、RecAを用いる技法
はシー・ラッジング（C.Radding），Ann.Rev.Genetic
s、16巻、405〜37頁、1982年に記載されている。これら
の変性法により、等しいかまたは等しくない長さの２本
の分離された相補的鎖が生じる。
二本鎖核酸が熱によって変性された場合には、反応混
合物を、存在するそれぞれのプライマーの相補的標的
（鋳型）配列へのハイブリダイゼーションを促進する温
度に放冷する。この温度は、試薬によって異り、通常は
約35℃〜65℃又はこれ以上であり、好ましくは37〜60℃
であり、効果的な時間、一般的には約0.5〜５分間、好
ましくは１〜３分間維持される。実際には、Taqポリメ
ラーゼについては、温度は単に約95℃から37℃程度へ、
好ましくは約45〜58℃へ低下させるだけであり、ハイブ
リダイゼーションはこの範囲内の温度で起きる。
核酸が一本鎖または二本鎖のいずれであっても、熱安
定酵素を変性段階で加えることができ、あるいはハイブ
リダイゼーションを促進する範囲まで温度が下がった時
又はこの範囲の温度にあるときに加えることができる。
次いで、反応混合物を、酵素の活性が促進されまたは最
適化される温度、すなわちハイブリダイズしたプライマ
ー及び鋳型からのプライマー伸長生成物の合成を促進す
るのに酵素の活性を増加させるのに十分な温度まで加熱
する。この温度は、実際にそれぞれの核酸鋳型に相補的
なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成するのに十
分なものでなければならないが、その相補的鋳型からの
それぞれの伸長生成物を変性してしまうほど高温であっ
てはならない（すなわち、この温度は一般的には約80℃
〜90℃以下である）。
この合成反応に効果的な典型的な温度は、主として用
いられる酵素および１種又は複数種の核酸のタイプによ
って異り、一般的には約40〜80℃、好ましくは50〜75℃
である。この温度は更に好ましくは、テルムス・アクア
チクス（Thermus aquaticus）からのDNAポリメラーゼを
用いる場合には、約65〜75℃である。この合成に要する
時間は、主として温度、核酸の長さ、酵素および核酸混
合物の複雑さによって変わり、約0.5〜40分間又はこれ
以上、好ましくは１〜３分間の範囲にある。核酸が長い
ものであれば、一般的にはより長時間を必要とする。ジ
メチルスルホキシド（DMSO）はTaqポリメラーゼ酵素の
活性を阻害することが見出だされているので、DMSOは存
在する必要はなくまたは推奨されない。
新たに合成された鎖とその相補的核酸鎖は二本鎖の分
子を形成し、この分子はこの工程の引き続く段階におい
て用いられる。次の段階では、二本鎖分子を変性するの
に効果的ではあるがしかし熱安定酵素が完全且つ不可逆
的に変性しまたは不活性化するほど高くはない温度で熱
変性することによって二本鎖分子の鎖を分離する。この
温度は、主として酵素のタイプおよび核酸の長さによっ
て異り、一般的には約90〜105℃、更に好ましくは90〜1
00℃であり、変性に要する時間は、主として温度と核酸
の長さによって変わり、典型的には0.5〜４分間であ
る。この処理時間の後、プライマーに相補的な前の段階
から生成した一本鎖分子（鋳型）へのプライマーのハイ
ブリダイゼーションを促進する水準まで温度を下げる。
この温度は、上記したような温度である。
このハイブリダイゼーション段階の後に、またはハイ
ブリダイゼーション段階の代わりに（またはそれと同時
に）、熱安定酵素の活性を促進しそして前の段階からの
新たに合成された鎖を鋳型として用いてプライマー伸長
生成物を合成することができる温度に調整する。この温
度も、上記したように、その鋳型から伸長生成物を分離
（変性）するほど高いものであってはならない（通常
は、40〜80℃で0.5〜４分間、好ましくは50〜70℃で１
〜３分間である）。ハイブリダイゼーションがこの段階
中に起こるので、前の段階の変性後冷却は必要でない。
このような２つ以上の段階を同時に行なう場合には、好
ましい温度範囲は50〜70℃である。
鎖の分離、ハイブリダイゼーションおよび伸長生成物
の合成の加熱および冷却段階は、所望量の特定の核酸配
列を産生するのに必要な回数だけ繰り返すことができ、
この回数は最終的用途によって変わる。この回数は、存
在するプライマー、熱安定酵素およびヌクレオチドトリ
ホスフェートの量によって制限されるだけである。これ
らの段階は、少なくとも２回繰り返すのが好ましい。検
出に使用するためには、サイクルの数は、例えば試料の
性状によって変わる。例えば、増幅されるべき試料が純
粋なときにはサイクル数は少なくて済む。試料が核酸の
複雑な混合物であるときには、シグナルを十分に増幅し
て検出するには、より多くのサイクル数が必要となる。
一般的な増幅および検出には、工程を少なくとも20回繰
り返すのが好ましい。
下記のように、標識した配列特異的プローブを用いる
ときには、これらの段階を少なくとも５回繰り返すのが
好ましい。ヒトゲノムDNAを上記のようなプローブと共
に用いるときには、この工程を好ましくは15〜30回繰り
返して配列を十分に増幅して、明確に検出可能なシグナ
ルが生成するようにする。すなわちバックグラウンドノ
イズが検出を妨げないようにする。
以下に更に詳細に説明するように、生成した特異的核
酸配列の量は、指数的に蓄積する。
酵素が不可逆的に変性または不活性化しない限り、ヌ
クレオチド、プライマーまたは熱安定酵素を最初に加え
た後に更に添加する必要はない。酵素が不可逆的変性又
は不活性化を受ける場合には、それぞれの変性段階の後
に酵素を補充する必要がある。しかしながら、それぞれ
の段階でこれらの物質を添加しても反応には悪影響を及
ぼさない。
第一の核酸または核酸の混合物から１種より多くの特
定の核酸配列を産生させることが所望な時には、適当な
数の異なる種類のオリゴヌクレオチドプライマーを利用
する。例えば、２種類の異なる特定の核酸配列を産生さ
せるときには、４種類のプライマーを用いる。これらの
プライマーの２つは特定の核酸配列の一つに特異的であ
り、残りの２種のプライマーは第二の特定の核酸配列に
特異的である。この場合には、２種類の異なる特定の配
列のそれぞれが、本発明によって指数的に産生される。
適当な長さの時間が経過して所望量の特定の核酸配列
が産生された後、既知の方法（例えば、EDTA、フェノー
ル、SDSまたはCHCl3の添加）で酵素を不活性化すること
によって、または反応の成分を分離することによって、
反応を停止させる。
増幅工程は連続的に行なってもよい。自動化法の一態
様では、温度を所定の水準に所定の時間制御するように
設定する温度サイクルを反応混合物に行なってもよい。
この目的のための一つの装置は、本発明の増幅反応を
制御するための自動化された装置である。この装置はコ
ンピューターによって制御される液体取扱系を利用して
おり、第一の容器で或る制御された温度で保管された酵
素を、温度がコンピューターで制御されて所定のインキ
ュベーション方式に一致するようになっている第二の容
器に液体移動させるものである。この第二の容器は１種
又は複数の増幅される核酸配列とヌクレオチドトリホス
フェートとプライマーを貯蔵している。コンピューター
はユーザー・インターフェースを備えており、それによ
って使用者がインキュベーションの時間および温度、移
動させる酵素の量などの、増幅工程における各種段階の
特徴を制御する工程パラメーターを入力することができ
るようになっている。
酵素はサイクル毎に移動させる必要はないので、用い
ることができる好ましい装置は液体制御系のない温度循
環を利用している。この様な装置は、下記のような系か
らなっている。
1.所定数の試験管、好ましくは500μｌ試験管であっ
て、ヌクレオチドトリホスフェート、プライマー、核酸
配列および酵素の反応混合物が入っている試験管を固定
する熱伝導性容器。
2.熱伝導性容器を加熱、冷却し且つ室温より高いおよび
低い温度に保持する装置であり、この装置は容器を加
熱、冷却しまたは保管する温度を制御する制御シグナル
を受けとる入力部を有する〔この様な装置はマテリアル
ス・エレクトロニクス・プロダクツ・コーポレーション
（Materials Electronics Products Corporation）、ト
レントン、ニュージャージーから発売されているペルテ
ィーア（Peltier）熱ポンプまたは水熱交換器でもよ
い〕。
3.上記の装置の入力部に接続したコンピューター装置
（例えば、マイクロプロセッサー・コントローラー）で
あって、増幅工程、温度水準および温度勾配とタイミン
グを自動的に制御するシグナルを発生する装置。
もう一つの態様では、プライマー伸長生成物の合成に
用いられる酵素は、カラム中に固定することができる。
他の反応成分をポンプによってこのカラムと加熱コイル
中を連続的に循環させることができる。したがって、生
成した核酸を、酵素を不活性化することなく繰り返し変
性させることができる。
次に、増幅プロトコールを模式的に示す。ここでは、
相補的な鎖〔S+〕および〔S-〕を含んで成る所望の配列
〔Ｓ〕を含有する２本鎖DNAが核酸として使用される。
第１の及びこれに続く各反応サイクルの間、もとの鋳型
上での各オリゴヌクレオチドプライマーの延長が、プラ
イマーの１つのみにより停止する無限長の新しいssDNA
分子生成物を生成する。今後“長生成物”と称するこれ
らの生成物は直線的に蓄積するであろう。すなわち、あ
る数のサイクルの後に存在する量がサイクル数に比例す
るであろう。
こうして生成された長生成物は、その後のサイクルの
間一方又は他方のオルゴヌクレオチドプライマーの鋳型
として機能し、そして所望の配列〔S+〕又は〔S-〕の分
子を生成するであろう。これらの分子もまた、一方又は
他方のオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型として機能
してさらに〔S+〕及び〔S-〕を生成し、そしてそれ故
に、サイクル数に対して指数的速度での〔Ｓ〕の蓄積を
もたらすであろう連鎖反応が継続され得る。
意図されるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ン以外のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに
より生成される副産物は自己触媒的ではなく、そしてそ
れ故に直線的速度で蓄積する。
増幅されるべき特定の配列〔Ｓ〕を次の様に模式的に
表すことができる。
〔S+〕 ５′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC3′ 〔S-〕 ３′TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG5′ 対応するオリゴヌクレオチドプライマーは次の通りであ
ろう。
プライマー1: ３′GGGGGGGGGG5′ プライマー2: ５′AAAAAAAAAA3′ 従って、〔Ｓ〕を含有するDNA: が一本鎖に分離され、そしてその一本鎖がプライマー１
及び２とハイブリダイズし、４種類のデオキシリボヌク
レオチドトリホスフェートの存在下、DNAポリメラーゼ
の存在下で次の伸長反応が触媒され得る。
生成した２つのデュプレックスの変性の後、次の生成物
が生ずる。
次のサイクルにおいて、これら４つの鎖をプライマー１
及び２とハイブリダイズせしめれば、重合用試薬は次の
反応を触媒するであろう。
上記４種類のデュプレックスが分離されれば次の鎖が生
ずる。
１つのプライマーのオリゴヌクレオチド配列で制止す
る各鎖及び他方の相補鎖は生成することが所望される特
定の核酸鎖〔Ｓ〕であることがわかる。
この工程の段階は無限に反復することができ、プライ
マー１及び２、誘導剤及び存在するヌクレオチドによっ
てのみ限定される。もとのヌクレオチドは複製されない
ので、その量は全工程を通じて一定に維持される。長生
成物はもとの核酸からのみ生成されるのでその量は直線
的に増加する。特定の配列の量は指数的に増加する。す
なわち、特定の配列は支配的な種となる。これは次の表
に示される。この表は、各サイクルの効率を100％とし
て、ｎサイクル後に存在する種の相対量を示す。
鋳型として一本鎖ヌクレオチドが使用される場合、サイ
クル当り１個のみの長生成物が生成する。
少なくとも１サイクルの増幅の後に、増幅される配列
の（末端にない）内部配列に相補的な一組のプライマー
を加えることによって、所定回数の増幅の後、所定の配
列内の配列を増幅して反応の特異性を大きくすることが
できる。この様なプライマーは如何なる段階で加えても
よく、そしてこのものはより短い増幅されたプライマー
を供するであろう。また、非相補的末端を有するが、増
幅において前に用いてプライマーと幾分オーバーラップ
するプライマーを用いることによってより長いフラグメ
ントを調製することができる。
この発明方法を用いて、特定の核酸配列をクローン化
して、適当な発現ベクターに挿入することができる。次
に、このベクターを用いて適当な宿主生物を形質転換し
て、組換えDNA技法の標準的方法によって配列の遺伝子
生成物を産生させることができる。
この増幅工程は、元の鋳型核酸、予想される標的増幅
生成物および各種のバックグラウンドの非標的生成物か
らの核酸の混合物を生じさせることができる。元の鋳型
DNAがヘテロ接合性二倍体ゲノムにおけるような複数の
標的配列を有するとき、または関連遺伝子のファミリー
があるときには、増幅された生成物は混合物であること
もある。
これらのプライマーを改変して、増幅反応によって生
成されるDNAの混合物の速やかで且つ特異的なクローン
化を補助することができる。この様な改変では、プライ
マーのそれぞれに、または増幅され且つクローン化され
る配列中に制限部位が含まれる。好ましくは、同じまた
は異なる制限部位をプライマーの５′末端に導入し、増
幅された生成物の二個の末端に制限部位を生じるように
するのが好ましい。適当な酵素で切断すると、増幅され
た生成物は容易にプラスミドまたはバイアルベクター中
に挿入されて、クローン化される。このクローニングに
よって、混合物ではなく個々の増幅された生成物の分析
または発現が可能になる。
プライマーがその中に導入された制限部位を有すると
きには、同じ制限部位を両方のプライマーに用いること
ができる。しかしながら、異なる制限部位を用いると、
生成物を特異的な方向でベクター中に挿入することがで
き、複数の挿入、及び２個のプライマーの一方のみに基
づいた増幅から生じる挿入は抑制する。特異的方向性
は、一本鎖配列ベクターへのクローニング時、一本鎖ハ
イブリダイゼーションプローブを用いる時またはクロー
ン化された生成物が発現されるべき場合に有用である。
プライマーを調製する一つの方法は、標的配列から極
僅に異なるプライマー配列を選択することである。プラ
イマーのそれぞれが配置されるべき領域は、所望のベク
ターに適当な制限部位に対する相同性についてスクリー
ニングされる。例えば、標的配列「CAGTATCCGA...」
は、BamHI部位を有するものと一個の塩基しか違わな
い。プライマー配列はその３′末端で正確にマッチし、
その５′末端付近に変更された配列および制限部位を有
するように選択される（例えば、「CAGgATCCGA...」で
あり、小文字は標的配列とマッチしないものを表わして
いる）。この最少限に変更した配列は、プライマーが元
の標的配列とハイブリッド形成し、重合を開始する能力
を妨げない。第一の増幅サイクルの後、プライマーはコ
ピーされて、標的となり、新たなプライマーと正確にマ
ッチする。
増幅工程の後、生成物を適当な制限酵素で開裂せし
め、例えば、脱塩カラムまたは分子量クロマトグラフィ
カラムを通過させあるいは膜を通過させることによっ
て、制限消化物を場合によってはヌクレオチドトリホス
フェートおよび塩のような連結の阻害剤から分離させ、
クローン化されるべき増幅配列を含有する（１種以上
の）消化生成物は、連結反応によって、バクテリオファ
ージM13のようなクローニングベクターに挿入される。
クローニングベクターは、一般に選択マーカーを有し、
そして場合によってはさらにプロモーターを有すること
もある。次に、遺伝子が蛋白質をコードするときには、
これを公知の技法によって配列決定し、そして／または
発現させることができる。遺伝子はまた、配列決定され
るべき所望の部分に相補的な適当なプライマーを増幅工
程中に加えることによって配列決定することもできる。
このプライマーは伸長生成物を形成して、この伸長生成
物を有する増幅の程度が配列情報を提供することにな
る。
プライマーを調製するためのもう一つの方法は、標的
配列からプライマーの３′末端を取り出して、プライマ
ーの５′末端へ所望の制限部位を加えることからなって
いる。例えば、HindIII部位を加えて、配列「cgaagcttC
AGTATCCGA..」（但し、小文字は上記定義の通りであ
る）を作ることができる。加えられた塩基は増幅の第一
のサイクルでハイブリダイゼーションには寄与しない
が、これ以後のサイクルでマッチする。次に、最終的に
増幅された生成物を１種又は複数種の制限酵素で切断し
て、上記のようにクローン化し、発現させる。増幅され
る遺伝子は、例えばヒトβ−ヘモグロビンまたはヒトHL
ADQ、DRまたはDP−αおよび−β遺伝子であってもよ
い。
もう一つの、余り好ましくはなく且つあまり効率的な
ものとはいえないクローニング法であって（制限酵素を
用いる）接着末端連結よりはむしろ平滑末端連結を用い
る方法においては、クローン化されるべき１種又は複数
種の配列あるいはプライマー中の制限酵素とは無関係に
基本的増幅方法が用いられる。しかしながら、これらの
段階は、連結を行なうのに十分なだけ増幅された１種又
は複数種の配列を産生するのに十分な回数にわたり繰り
返さなければならない。平滑末端連結では、接着末端連
結の場合よりも高濃度の１種又は複数種の配列と１種又
は複数種のクローニングベクターを必要とする。更に、
この連結反応はT4リガーゼ、E.コリ（E. coli）リガー
ゼのようなリガーゼの存在で行なわなければならない。
増幅された生成物が得られたならば、連結処理法は当業
者に周知の条件を用いる標準的処理法により行われる。
平滑末端連結反応を用いないクローニング法は、増幅
された生成物のクローニングベクターへの挿入の方向性
または多重性を制御する。
更に、この工程は、試験管内での変異誘発に用いるこ
とができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅さ
れるべき核酸配列に正確に相補的である必要はない。そ
れらは、熱安定酵素によって伸長されるべき配列十分に
ハイブリダイズすることだけが必要である。用いられる
プライマーが元の鋳型に正確には相補的ではない場合の
増幅反応の生成物は、鋳型配列ではなくプライマーの配
列を有するので、試験管内突然変異が導入される。引き
続くサイクルでは、この突然変異は、それ以上不対合プ
ライミングを必要としないので、限定されない効率で増
幅される。このようにして産生された変異体を標準的な
生物学的技法によって適当なベクターへ挿入することが
でき、このベクターに変更された蛋白質の産生態のよう
な変異体特性を付与することができる。
上記のような変更されたDNA配列を作る工程は、他の
配列の変化を誘発するための異なるプライマーを用い
て、変更されたDNAに対して繰り返すことができる。こ
のようにして、一連の変異配列が徐々に産生され、この
シリーズに新たに加えられたそれぞれのものは前のもの
から僅かしか粉となっていないが元のDNA源配列からは
かなりの点で異なっているようにすることができる。こ
のようにして、非常に不適正なプライマーを機能させる
ことはできないために単一段階では得られないような変
化を、最終的に行なうことができる。
更に、十分な量のプライマーが、増幅されるべき鎖に
相補的な配列を含有する場合には、プライマーはその配
列の一部に非相補的配列を有することができる。例え
ば、（プロモーター、リンカー、コード配列などの）鋳
型配列に相補的でないヌクレオチド配列をプライマーの
一方または両方の５′末端に結合させ、これによって増
幅工程の生成物に付加することができる。伸長プライマ
ーが添加された後、工程を十分な回数だけ繰り返し、非
相補的ヌクレオチド挿入部を含有する新たな鋳型を所望
な量で得る。これによって、単純な技法を用いて、比較
的短時間（例えば２時間以下）で結合したフラグメント
を多量に産生することができる。
この方法を用いて、感染症、遺伝学的疾患または細胞
性疾患、例えば癌に関する特異的核酸配列、例えば腫瘍
遺伝子の検出および／または特徴化を行なうことができ
る。分析に利用できる核酸の量が極めて少ないとき、例
えば胎児細胞から得られるDNAを用いる鎌状赤血球貧血
の出生前診断で有用である。この増幅法は、非放射性検
出法を用いる本来鋭敏でない分析法を用いて少量試料の
分析を行なう場合、または放射分析法を用いる場合であ
って速やかな検出が望まれる場合に、特に有用である。
本発明の目的に関して、遺伝学的疾患は、例えば鎌状
赤血球貧血、α−サラセミア、β−サラセミア等のよう
な生体からのゲノムDNAの特異的欠失および／または変
異誘発を包含する。鎌状赤血球貧血は、本方法により適
当なDNA配列の増幅を行なった後の1985年12月11日発行
の欧州特許出願公開第164,054号明細書に記載のオリゴ
マー制限分析によりまたはRFLP様分析により、容易に検
出することができ、α−サラセミアは、この疾患を起こ
す変異部に緊密に関速した多形制限部位の不在によって
検出することができ、またβ−サラセミアはその制限部
位の存在によって検出することができる。
これらの遺伝的疾患の総ては、適当な配列を増幅し、
それをサザン法によって放射性プローブを用いることな
く分析することによって検出することができる。この様
な方法では、例えば極めて低水準の所望な配列を含む羊
水からのDNAの少量の試料を増幅し、制限酵素で切断
し、サザン法によって分析する。増幅された高水準のシ
グナルによって非放射性プローブの使用が容易になる。
もう一つの態様では、DNAの少量試料を通常の水準に
まで増幅した後、伸長反応のサイクルを続けて行ない、
この場合、（32P−標識またはビオチン−標識したヌク
レオチドトリホスフェートのような）容易に検出される
ヌクレオチド誘導体を最終のDNA生成物中に直接に導入
し、これを制限酵素処理および電気泳動法による分離ま
たはその他の適当な方法で分析することが可能である。
もう一つの態様では、核酸を、増幅前に特定の制限エ
ンドヌクレアーゼに暴露することができる。切断された
配列は増幅することは出来ないので、あらかじめDNA試
料を制限酵素処理したにもかかわらず増幅されたフラグ
メントが出現することは、増幅された配列内のエンドヌ
クレアーゼの部位の不在を示唆する。増幅された配列の
存在または不在は、適当な方法によって検出することが
できる。
本発明の方法の実際的応用は、本明細書、および欧州
特許第164,054号明細書（同上）およびサイキ（Saiki）
らのBio/Technology、３巻、1008〜1012頁に記載されて
いるオリゴマー制限法によって鎌状赤血球貧血の検出を
容易にするためのその使用によって例示することができ
る。鎌状赤血球貧血は、β−グロブリン遺伝子の６番目
のコドンにおける唯一つの塩基対の変化によって起こる
ヘモグロビン疾患である。
本発明の方法は、配列特異的オリゴヌクレオチドを用
いて（ゲノムDNAのような）核酸配列の一塩基対の変化
を直接に検出するのにも用いることができる。この方法
では、癌、感染症または遺伝的疾患例例えば遺伝的欠失
から生じるような配列変化を直接に検出することがで
き、本来なら必要な制限酵素消化、電気泳動およびゲル
操作の必要がなくなる。本明細書に記載する増幅の後の
ドット・ブロット方式において配列特異的オリゴヌクレ
オチドを用いると、プローブの特異性および感受性が向
上し、解釈可能なシグナルを、0.04μｇの試料を用いて
６時間以内に得ることができる。また、膜にスポットす
る試料の量を0.1〜0.5μｇに増加すると、従来の方法で
用いられる放射性プローブの代わりに、非放射性標識さ
れたオリゴヌクレオチドを用いることができる。更に、
以下に記載の方法は、大きさが19−マー未満の配列特異
的オリゴヌクレオチドの使用に適用することができ、し
たがって更に識別力のある配列特異的オリゴヌクレオチ
ドを使用することができる。
遺伝的疾患に関しては、RFLPはこの疾患に関する多形
制限部位を必要とするが、配列特異的オリゴヌクレオチ
ドは直接に遺伝的欠失を検出し、単一の塩基の突然変異
によって生じるヘモグロビンＣ症、α−１−アンチトリ
プシンおよびβ−サラセミアのような病気の解析に極め
て有用である。また、オリゴヌクレオチドを用いて、異
なる対立遺伝子（例えばHLA型）を表わす遺伝的変異体
を識別することができるので、熱安定酵素を含む配列特
異的オリゴヌクレオチドを基礎としたキットの可能性が
示唆される。
本発明の１態様では、ヌクレオチドの配列変化を検出
しようとするときには、上記の様に、ヌクレオチド変化
を含むと推定されるそれぞれの核酸のそれぞれの鎖につ
いて１個のプライマーを用いて増幅した試料を一連の膜
に直接にスポットし、そしてそれぞれの膜を異る標識さ
れた配列特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリ
ダイズをせしめる。膜への試料のスポット法について
は、カホトス（Kafotos）ら、Nucleic Acids Researc
h、７巻、1541〜1552頁、1979年に記載されている。
要約していえば、膜に固定されたDNA試料を、ドデシ
ル硫酸ナトリウム、フイコール（Ficoll）、血清アルブ
ミンおよび各種の塩を含むプレハイブリダイゼーション
溶液を用いて、プローブを加える前に、前処理すること
ができる。次いで、標識されたヌクレオチドプローブで
あって検出しようとするそれぞれの配列変化に特異的な
ものをプレハイブリダイゼーション溶液と同様のハイブ
リダイゼーション溶液に加える。このハイブリダイゼー
ション溶液を膜に適用して、この膜を、プローブの型お
よび長さ、成分の型および濃度等によって異るハイブリ
ダイゼーション条件に付す。一般的には、ハイブリダイ
ゼーションは約25〜75℃、好ましくは35〜65℃、0.25〜
50時間、好ましくは３時間未満行なう。条件のストリン
ジエンシーが大きくなればなるほど、プローブと試料と
のハイブリダイゼーションに必要な相補性は大きくな
る。バックグラウンド水準が高ければ、それだけストリ
ンジエンシーは高くなる。ストリンジエンシー条件は、
洗浄にも取り込むことができる。
ハイブリダイゼーションの後、好適な手段を用いてハ
イブリダイゼーションされないプローブを試料から洗浄
除去する。例えば各種濃度の標準的塩リン酸EDTA（SSP
E）（180mMのNaCl,10mMのNaHPO4および1MのEDTA,pH7.
4）溶液で25〜75℃で約10分間〜時間、１回以上洗浄す
るが、この時間は温度によって変化する。次いで、この
標識を適当な検出法を用いて検出する。
ここで用いられる配列特異的オリゴヌクレオチドは、
一般的には、プライマーを調製するために上記の方法で
調製され選択するオリゴヌクレオチドである。上記のよ
うに、配列特異的オリゴヌクレオチドは、検出されるべ
きヌクレオチド変化にわたる配列の領域を包含し、検出
されるべきヌクレオチド変化に特異的なものでなければ
ならない。例えば、試料が鎌状赤血球貧血の変異を含む
かどうかを検出することが所望ならば、正常なβ−グロ
ブリン遺伝子に特徴的なヌクレオチド配列部位を含むオ
リゴヌクレオチドを調製し、さらに鎌状赤血球対立遺伝
子に特徴的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチ
ドを調製する。それぞれのオリゴヌクレオチドを同じ試
料の複製物とハイブリダイズせしめ、試料が変異を含む
かどうかを決定する。
HLAクラスII遺伝子の多形性領域は第一エクソンの特
定の領域に局在しており、保存された配列によって挟ま
れているので、第一エクソンの保存された５′および
３′末端の対向する鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプ
ライマーを調製することができる。
HLAクラスII遺伝子の多形性領域の検出に用いられる
オリゴヌクレオチドの数は、クラスター構造を有するま
たはばらばらに分散している塩基対変異の領域を有する
遺伝子の型によって異る。HLA−DQ−αの場合のよう
に、この領域がクラスター構造を有するときには、それ
ぞれの対立遺伝子について一つのオリゴヌクレオチドを
用いる。この領域が、HLA−DQ−βおよびHLA−DR−βの
場合のように、分散しているときには、それぞれの対立
遺伝子について１種より多くのプローブであってそれぞ
れ対立遺伝子変異体を包含するものが用いられる。HLA
−DQ−βおよびHLA−DR−βの場合には、３種のプロー
ブを、対立遺伝子変異が起きる遺伝子座の３個の領域に
ついて用いる。インシュリン依存性真性糖尿病（IDDM）
の検出には、HLA−DRβ第二エキソンについて４個のプ
ローブを用いる。
ハプロタイプは、家族における分離（segregation）
から、または場合によって個体のDNA試料の直接分析に
よって推定することができる。配列特異的オリゴヌクレ
オチド反応性の特異的対立遺伝子の組合せ（ハロタイ
プ）は、増幅前にゲノムDNAの制限酵素消化を用いるこ
とによってヘテロ接合細胞において同定することができ
る。
例えば、DQβで、高度に変異可能な副領域Ａ、Ｂおよ
びＣが単一の増幅領域内に見出される場合、およびそれ
ぞれの領域で６個の異なる配列（A1−6,B1−6,C1−６）
がある場合には、可能なハプロタイプの組合わせA1,B2,
C1;A1,B2,C4;A2,B2,C1;A2,B2,C4;A1,B3,C1;A1,B3,C4;A
1,B2,C1;およびA1,B2,C4を伴って、配列特異的オリゴヌ
クレオチドプローブ分析によって個体をDQβ座において
A1,A2;B2,B3;C1,C4を含むものとしてタイプ分けするこ
とができる。
ゲノムDNAが多形性限酵素によって増幅前に消化され
る場合、及びこの酵素がプライマーの間の対立遺伝子を
両方とも切断する場合、増幅の欠如のため配列特異的プ
ローブとの反応性はなく、何等情報を提供しない。この
酵素が対立遺伝子を切断しないときには、消化されたお
よび消化されないゲノムDNAでの結果は同じになり、そ
の結果は何等情報を提供しないものとなる。この酵素が
一方の対立遺伝子のみを切断するときには、消化された
および消化されないDNAのプローブ反応性パターンを比
較することによって両方のハプロタイプを推定するこが
できる。
これらのハプロタイプは、未切断ゲノムDNAおよび多
形であり且つプライマーの間の部位を認識する事が知ら
れている１〜数個の酵素で切断したゲノムDNAと配列特
異的オリゴヌクレオチドとの反応性を比較することによ
って推定することができる。
反応特異的オリゴヌクレオチドの長さは、検出される
べき特定の標的分子、オリゴヌクレオチド源およびヌク
レオチド組成のような多くのファクターによって異る。
本発明の場合には、配列特異的オリゴヌクレオチドは、
典型的には、15〜25ヌクレオチドを有するが、より多く
のまたは少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。長さ
が少なくとも19マーであるオリゴヌクレオチドは、特異
性および／または感受性を高めるが、19マー未満の、例
えば16−マーであるプローブは、おそらく単一ミスマッ
チがより不安定化するので、更に高い配列特異的識別力
を示すことができる。増幅によって特異性が増加するの
で、より長い長さは必須ではなく、ハイブリダイゼーシ
ョンおよび洗浄温度は同じ塩濃度について低いものでも
よく、長さが19マー未満のオリゴヌクレオチドを用いる
ことが好ましい。
試料を最初に膜に置いて、次いでオリゴヌクレオチド
で検出するときには、このオリゴヌクレオチドは、分光
的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段
によって検出することができる好適な標識残基で標識し
なければならない。免疫化学的手段には、適当な条件下
でオリゴヌクレオチドと複合体を形成することができる
抗体があり、生化学的手段には適当な条件下でオリゴヌ
クレオチドと複合体を形成することができるポリペプチ
ドまたはレクチンがある。例えば、螢光線量、エレクト
ロン・デンス（electron−dense）試薬、不溶性反応生
成物を沈澱させまたは発色によって検出することができ
る酵素、例えば西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼのようなもの、32Pのような放射性標
識またはビオチンがある。ビオチンを用いるときには、
スペーサーアームを用いてそれをオリゴヌクレオチドに
結合せしめる。標識残基として西洋ワサビ・ペルオキシ
ダーゼが好ましい。
また、「逆」ドット・ブロット方式では、プライマー
の少なくとも１個および／または４種のヌクレオチドト
リホスフェートの少なくとも１つを検出可能な標識で標
識して、生成する増幅された配列を標識記する。これら
の標識残基は最初から反応混合物中に存在してもよくま
たは増幅の後期サイクルで加えて増幅生成物に標識を導
入することができる。次に、配列変異（正常または突然
変異体のいずれでも）が存在するときには、増幅された
核酸配列でハイブリッド形成できる未標識の配列特異的
オリゴヌクレオチドを上記のようなプレハイブリダイゼ
ーション条件下で膜にスポット（または固定）する。次
に、増幅された試料を、上記のようにハイブリダイゼー
ション条件下で前処理した膜に加える。最後に、検出手
段を用いて、核酸試料の増幅された配列が膜に固定され
たオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションする場
合に検出を行なう。ハイブリダイゼーションは変異を含
む膜に結合した配列が増幅生成物に存在するときにの
み、すなわちプローブの配列が増幅された配列の領域に
相補的である場合にのみ起こる。
「逆」ドット・ブロット方式のもう一つの態様では、
上記の「順」ドット・ブロット方式でのように標識を用
いることはなく増幅を行ない、変異が存在するときには
それを含む増幅された核酸配列とハイブリダイズするこ
とができる標識された配列特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブを、上記のようなプレハイブリダイゼーション条
件下で膜にスポット（または固定）する。次に、増幅さ
れた試料を、上記のようなハイブリダイゼーション条件
下で前処理した膜に加える。次いで、標識したオリゴヌ
クレオチドまたはそのフラグメントを膜から遊離せし
め、試料中の増幅された配列が標識されたオリゴヌクレ
オチドにハイブリダイゼーションする場合に、検出手段
を用いて検出することができるようにする。遊離は、例
えばプローブの制限部位を認識する膜に制限酵素を加え
ることによって起こすことができる。オリゴマー制限と
して知られているこの方法は、1985年12月11日発行の欧
州特許出願公開第164,054号明細書に更に詳細に記載さ
れている。
順および逆ドット・ブロット方式のいずれでも、いず
れかの生物からの検出される遺伝的疾患は、特異的欠
失、挿入および／またはゲノムDNAのような核酸のいず
れかの塩基対の突然変異または多形における置換を含
む。塩基対の変異が知られている疾患の例としては、鎌
状赤血球貧血、ヘモグロビンＣ症、α−サラセミア、β
−サラセミア等がある。検出することができる他の病気
にはRAA腫瘍遺伝子、例えばｎ−RAS腫瘍遺伝子を含む癌
性疾患および感染症がある。
ドット・ブロット法は、組織の移植、病気に罹り易さ
および父性の決定の分野でのHLAタイピングに用いるこ
ともできる。HLAクラスII遺伝子は、HLA−DR,HLA−DQお
よびHLA−DP領域からのαおよびβ遺伝子からなり、極
めて多形性が高く、それらのDNA水準での遺伝学的複雑
性は血清学的タイピングによって一般的に定義されてい
る多形よりも著しく大きい。更に、本発明の方法は、イ
ンシュリン依存性真性糖尿病（IDDM）に関するHLAクラ
スIIβタンパク質（例えば、DRβ）をコードする４個の
DNA配列を検出するのに用いることができる。
簡単にいえば、IDDMに関する４種のDNA配列は、 （１）５′−GAGCTGCGTAAGTCTGAG−３′ （２）５′−GAGGAGTTCCTGCGCTTC−３′ （３）５′−CCTGTCGCCGAGTCCTGG−３′および （４）５′−GACATCCTGGAAGACGAGAGA−３′ またはそれらに相補的なDNA鎖からなる群から選択され
る。これらの配列の１種または複数種にハイブリッド形
成する配列特異的プローブを調製することができる。
各種感染生疾患は、臨床試料中に起因微生物に特徴的
な特定のDNA配列が存在することによって診断すること
ができる。これら起因微生物には、サルモネラ、クラミ
ジア、ネイセリアのような細菌、肝炎ウイルスのような
ウイルスおよびマラリアの原因となるプラスモジウムの
ような寄生虫がある。ファルコウ（Falkow）らに発行さ
れた1986年５月13日付け米国特許再審査証明書第B14,35
8,535号は、感染性疾患の診断への特異的DNAハイブリダ
イゼーションプローブの使用を記載している。比較的少
数の病原生物が、感染した患者からの臨床試料中に存在
するので、これらから抽出されるDNAは試料中の総DNAの
極めて小さな分画だけを構成することがある。DNA試料
の固定の前に、推定される配列を特異的に増幅し、ハイ
ブリダイゼーション検出することによって、従来の方法
の感度および特異性を著しく向上することができる。
ワード（Ward）の欧州特許第63,879号明細書に記載さ
れているように、非放射性標識されたプローブを用いる
ことができれば、感染症疾患の診断のためのDNAプロー
ブの日常的臨床使用はかなり簡略化されるであろう。こ
の方法では、ビオチン含有DNAプローブを、アビジンま
たはビオチン特異的抗体に結合した発色性酵素によって
検出する。この型の検出法は好都合であるが、感受性が
比較的低い。本発明の方法による特異的DNA増幅と安定
に標識されたプローブの使用の組み合わせによって、フ
ァルコウ（Falkow）とワード（Ward）の方法を日常の臨
床検査に有用にするのに要する便宜と感度が得られる。
AIDSウイルスの検出と監視に対するこの増幅技術の具
体的な使用を以下に説明する。プライマーとプローブで
あって、それぞれAIDSウイルスの核酸中に実質的に保存
されておりAIDSウイルス中の核酸に特異的な核酸配列を
増幅し検出するように設計されているものを、増幅およ
び検出法に用いる。したがって、検出される配列はAIDS
ウイルス中の核酸に十分に相補的であり、酵素およびヌ
クレオチドトリホスフェートの存在で、好ましくは室温
で重合を開始するものでなければならない。
また、このプローブは、ビオチンが、式 （式中、ＹはO,NHまたはＮ−CHOであり、ｘは１〜４
の数であり、ｙは２〜４の数である）を有するスペーサ
ー・アームに結合しているビオチン化したプローブであ
る。このスペーサー・アームはまた、式 のプソラレン残基に結合している。このプソラレン残基
は、コーラジ−テベ（Courage−Tebbe）ら、Biochim.Bi
ophys.Acta.、697巻、1982年、１〜５頁に記載のよう
に、「ギャップド・サークル（gapped circle）」プロ
ーブ中にインターカレーションして、架橋しており、ギ
ャップド・サークルの一本鎖ハイブリダイゼーション領
域はプライマー中に含まれる領域に及んでいる。ビオチ
ン化とドット・ブロット法の詳細については、1986年４
月15日発行の米国特許第4,582,789号明細書および1986
年10月14日発行の米国特許第4,617,261号明細書に更に
完全に記載されている。
この増幅法を利用して、単一コピーヒト遺伝子からDN
Aを十分な量で産生させ、単純な非特異的DNA染色剤例え
ば臭化エチジウムをDNAの検出に直接に用いられる様に
できる。
生物のゲノムにおける感染性疾患及び病理学的異常の
検出に加えて、病的状態を伴わないDNA多形を検出する
のに用いることもできる。
要約すれば、増幅法は連鎖反応と熱安定酵素を用いる
１種以上の特定の核酸配列を増幅する方法を提供するも
のであり、上記反応においてプライマー伸長生成物を産
生させ、それを次にその後のプライマー伸長反応の鋳型
として働くことができるようにする。この方法は、最初
は極めて少量でのみ存在する核酸配列を検出するのに特
に有用である。
以下の実施例は、単に例示のために提供するものであ
り、発明の範囲および特許請求の範囲を限定することを
意図するものではない。これらの実施例において、総て
のパーセンテージは、特に断らないかぎり、固体の場合
には重量％、液体の場合には容積％であり、総ての温度
は摂氏で表わしている。
例1.（参考例） I.プライマーの合成 次の２種類のプライマーを下記の方法により調製し
た。
５′−ACACAACTGTGTTCACTAGC−３′（PCO3） ５′−CAACTTCATCCACGTTCACC−３′（PCO4） これらのプライマーはいずれも20−マーであり、ゲノム
DNAの相対する鎖に、110塩基対の間隔をおいてそれらの
５′端にアニールする。
A.自動化された合成法 Beaucage及びCaruthers〔Tetrahedron Letters（198
1）22:1859−1862〕の方法に従って合成されたジエチル
ホスホラミダイトを、ヌクレオチドで誘導体化された制
御された孔サイズのガラス支持体上に逐次縮合させた。
この方法は、ジクロロメタン中トリクロロ酢酸による脱
トリチル化、活性化プロトン供与体としてベンゾトリア
ゾールを使用する縮合、並びにテトラヒドロフラン及び
ピリジン中無水酢酸及びジメチルアミノピリジンによる
キャッピングを含む。サイクル時間は約30分間であっ
た。各段階での収率は本質的に定量的であり、そして脱
トリチル化中に放出されるジメトキシトリチルアルコー
ルの回収及び分光分析により決定した。
B.オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱保護及び精製 固体支持体をカラムから取り出し、そして密閉チュー
ブ中で室温にて４時間、1mlの濃水酸化アンモニウムに
暴露した。次に、支持体を濾過によって除去し、そして
部分的に保護されたオリゴデオキシヌクレオチドを含有
する溶液を５時間55℃とした。アンモニアを除去し、そ
して残渣を分取用ポリアクリルアミドゲルに適用した。
30V/cmにて90分間電子泳動を行い、次に生成物を含有す
るバンドを、蛍光プレートのUVシャドーにより同定し
た。バンドを切り出し、そして1mlの蒸留水により４℃
にて一夜溶出した。この溶液をRP−HPLCカラムに適用
し、そして１％酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.0）中ア
セトニトリル７〜13％のグラジエントにより溶出した。
この溶出を260nmでのUV吸収によりモニターし、そして
適当な画分を集め、一定容量中でのUV吸収により定量
し、そして真空遠心機中で室温にて蒸発乾固した。
C.オリゴデオキシヌクレオチドの特徴付け 精製されたオリゴヌクレオチドの試験アリコートをポ
リヌクレオチドキナーゼ及びγ−32P−ATPにより32P−
ラベルした。ラベルされた化合物を、50v/cmにて45分間
の電気泳動の後、14−20％ポリアクリルアミドゲルのオ
ートラジオグラフィーにより試験した。この方法により
分子量が確認される。塩基組成を、ヘビ毒ジエステラー
ゼ及び細菌アルカリ性ホスファターゼによるオリゴデオ
キシヌクレオチドのヌクレオチドへの消化、並びにこれ
に続く、逆相HPLCカラム及び10％アセトニトリル＋１％
酢酸アンモニウム移動相を用いる該ヌクレオシドの分離
・定量により決定した。
II.セルラインからのヒトゲノムDNAの単離 高分子量ゲノムDANを、Maniatis等、前掲、P280−281
に本質的に従って、ヒューマン・ゼネティック・ミュー
タント・セル・デポジトリー、カムデン、NJからGM2219
Cとして入手可能な、正常β−グロビンについてホモ接
合性のＴ細胞系から単離した。
III.テルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）か
らのポリメラーゼの精製 アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション、
12301パークラウンドライブ、ロックビル、MDからATCC
No.25,104としてなんら制御なく入手できるテルムス・
アクアチクス（Thermus aquaticus）YT1株をフラスコ中
で、下記の倍地で増殖せしめた。
クエン酸ナトリウム 1mM リン酸カリウムpH7.9 5mM 塩化アンモニウム 10mM 硫酸マグネシウム 0.2mM 塩化カルシウム 0.1mM 塩化ナトリウム 1g/l 酵母エキス 1g/l トリプトン 1g/l グルコース 2g/l 硫酸第一鉄 0.01mM （オートクレープ前にpHを8.0に調整） 上記倍地中で70℃にて一夜培養したフラスコ種母を10
l発酵槽に接種した。種母フラスコからの合計600mlの種
母を10lの同じ倍地に接種した。pHを水酸化アンモニウ
ムにより8.0に調節し、溶存酸素を40％を調節し、温度
を70℃に調節し、そして攪拌速度を400rpmとした。
細胞の増殖の後、最初の５段階についてはKaledin
等、前掲、の方法（わずかに変更を加えて）を用い、そ
して第６段階では異る方法を用いて精製を行った。６段
階すべてを４℃にて行った。カラムでの分画速度は0.5
カラム／時とし、溶出中のグラジエントの容量は10カラ
ム容量とした。これに代る好ましい方法を例６に後記す
る。
要約すれば、上記培養のT.アクアチクス（T.aquaticu
s）細胞を、９時間の培養の後、後期対数期1.4g乾燥重
量/lの細胞濃度において、遠心分離により集菌した。20
gの細胞を、50mM Tris−HCl（pH7.5）及び0.1mM EDTAを
含む緩衝液80ml中の懸濁した。細胞を溶解し、そして溶
解物を４℃のローター中で35,000rpmにて２時間遠心し
た。上清を集め（画分Ａ）、そして硫酸アンモニウムの
45〜75飽和の間で沈澱する蛋白質画分を集め、0.2Mリン
酸カリウム（pH6.5）、10mM2−メルカプトエタノール及
び５％グリセリンを含有する緩衝液中に溶解し、そして
最後に同じ緩衝液に対して透析して画分Ｂを得た。
画分Ｂを、上記の緩衝液で平衡化されたDEAE−セルロ
ースの2.2×30cmカラムに適用した。次に、このカラム
を同じ緩衝液で洗浄し、そして蛋白質を含有する画分
（280nmにおける吸収により決定する）を集めた。一緒
にした蛋白質画分を、0.01Mリン酸カリウム（pH7.5）、
10mM2−メルカプトエタノール及び５％グリセリンを含
有する第二緩衝液に対して透析して画分Ｃを得た。
画分Ｃを、第二緩衝液で平衡化されたヒドロキシアパ
タイトの2.6×21cmカラムに適用した。次に、このカラ
ムを洗浄し、そして10mM2−メルカプトエタノール及び
５％グリセリンを含有する0.01〜0.5Mリン酸カリウム
（pH7.5）緩衝液の直線グラジエントにより酵素を溶出
した。DNAポリメラーゼ活性を含有する画分（90〜180mM
リン酸カリウム）を集め、アミコン攪拌セル及びYM10膜
を用いて４倍に濃縮し、そして第二緩衝液に対して透析
して画分Ｄを得た。
画分Ｄを、第二緩衝液で平衡化したDEAE−セルロース
の1.6×28cmカラムに適用した。このカラムを洗浄し、
そして第二緩衝液中0.01〜0.5Mリン酸カリウムの直線グ
ラジエントによりDNAポリメラーゼを溶出した。画分を
エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼの汚染につ
いて測定した。これは、過剰のDNAポリメラーゼと共に
インキュベートした後のファージλDNA又はスーパーコ
イルプラスミドDNAの分子量の変化を電気泳動により検
出することにより（エンドヌクレアーゼについて）、そ
してDNAを幾つかのフラグメントに開裂せしめる制限酵
素による処理の後に（エキソヌクレアーゼについて）行
った。最少のヌクレアーゼ汚染を有するDNAポリメラー
ゼ画分（65〜95mMリン酸カリウム）のみをプールした。
このプールにオートクレーブしたゼラチンを250μg/ml
の量で添加し、そして第二緩衝液に対して透析を行って
画分Ｅを得た。
画分Ｅをホスホグルコースカラムに適用し、そして20
mMリン酸カリウム（pH7.5）中0.01〜0.4M KClのグラジ
エント100mlにより溶出した。画分を上記のようにして
エンドヌクレアーゼ／エキソヌクレアーゼの汚染につい
て、そしてさらにポリメラーゼ活性について（Kaledin
等の方法により）測定した。プールした画分を第二緩衝
液に対して透析し、次に50％グリセリン及び第二緩衝液
に対する透析により濃縮した。
ポリメラーゼの分子量をSDS−PAGEにより決定した。
マーカー蛋白質はホスホリダーゼＢ（92,000）、ウシ血
清アルブミン（66,200）、オバルブミン（45,000）、カ
ーボニックアンヒドラーゼ（31,000）、大豆トリプシン
インヒビター（21,500）、及びリゾチーム（14,400）で
あった。
予備的データは、文献（例えばKaledin等）に報告さ
れている62,000〜63,000ドルトンではなく、約86,000〜
90,000ドルトンであった。
このポリメラーゼを、25mM Tris−HCl（pH6.4及びpH
8.0）、0.1M KCl、10mM MgCl2、1mM2−メルカプトエタ
ノール、10nmoleずつのdGTP,dATP及びTTP、及び0.5μCi
(3H)dCTP、８μｇの“活性化されたウシ”胸腺DNA並び
に0.5−５ユニットのポリメラーゼを含有する混合物50
μｌ中でインキュベートした。“活性化された"DNAは、
DNAの５％が酸−溶解性画分に移るまでDNase Iにより消
化して部分加水分解した後のDNAの天然調製物である。
この反応は70℃にて30分間行い、そして0.125M EDTA−N
a2を含有するリン酸ナトリウムの飽和水溶液約50μｌの
添加により停止せしめた。サンプルをKaledin等、前掲
に記載されているようにして処理しそして活性を測定し
た。
この結果は、ポリメラーゼはpH6.4においてpH8.0にお
ける活性の半分より活性であることを示した。これに対
して、Kaledin等は、酸素はpH約7.0において、pH8.3に
おける活性の８％を有することを見出した。従って、本
発明の熱安定酵素のpHプロフィールはKaledin等の酵素
のそれよりも広い。
最後に、DNAポリメラーゼ測定反応混合物から１種類
のみ又は複数種類のヌクレオチドトリホスフェートを除
去した場合、本発明の酵素を用いて活性がほとんど観察
されず、活性は予想値と一致しており、そして酵素は高
い忠実性を示した。これに対して、Kaledin等、前掲、
を用いて観察さた活性は予想値と一致しておらず、そし
てヌクレオチドトリホスフェートの間違った導入が示唆
される。
IV.増幅反応 上記の１μｇのゲノムDNAを、25mM Tris−HCl（pH8.
0）、50mM KCl、10mM MgCl2、5mMジチオスレイトール、
200μg/mlゼラチン、１μＭのプライマーPC02、１μＭ
のプライマーPC04、1.5mMdATP、1.5mM dcTP、1.5mM dGT
P及び1.5mM TTPを含有する100μｌの初期水性反応容量
中に希釈した。サンプルを98℃にて10分間加熱してゲノ
ムDNAを変性せしめ、次に室温にて冷却した。テルムス
・アクアチクスからのポリメラーゼ４μｌを反応混合物
に加え、そして100μｌの鉱油を重層した。次にサンプ
ルを、溶体を供給するためにプログラムされたピペット
及び変温のための温度調節装置を用いる上記の液体取扱
い及び加熱装置のアルミニウム加熱ブロックに入れた。
DNAサンプルを、次のプログラムサイクルを反復して2
0サイクルの増幅にかけた。
１）加熱ブロック中で2.5分間にわたり37℃から98℃に
加熱し；そして ２）３分間にわたって98℃から37℃に冷却してプライマ
ーとDNAとのアニールを可能にする。
最終サイクルの後、サンプルをさらに10分間55℃でイ
ンキュベートして最終伸長反応を完了する。
V.オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの合成及び
リン酸化 次の配列： ５′−*CCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAG−
３′（RS24） を有しRS24と称するラベルされたDNAプローブを調製し
た。配列中、＊はラベルを示す。このプローブは40塩基
の長さを有し、遺伝子の第４コドンから第７コドンまで
を含み、そして正常β−グロビン対立遺伝子（βA）を
相補的である。プライマーとプローブとの関係を次に模
式的に示す。
このプローブを例1.I.に記載した方法に従って合成し
た。20pmoleのプローブを４ユニットのT4ポリヌクレオ
チドキナーゼおよび約40pmoleのγ−32P−ATP（約7000C
i/mmole）と、70mM Tris（pH7.6）、10mM MgCl2、1.5mM
スペルミン及び10mMジチオスレイトールを含有する40μ
ｌの反応容量中で37℃にて60分間接触せしめた。次に25
mM EDTAにより全容量を100μｌに調製し、そしてTris−
EDTA（TE）緩衝液（10mM Tris、0.1mM EDTA、pH8.0）に
より平衡化した1mlスピン透析カラム上で、Maniatis
等、前掲、p466−467の方法に従って精製した。反応生
成物のTCA沈澱は、RS24について比活性が4.3μCi/pmole
であり、そして最終濃度が0.118pmole/μｌであること
を示した。
VI.ドットブロットハイブリダイゼーション 前記IV.からの増幅されたサンプル４μｌ、並びに70,
75,80,85,90,95及び100％の増幅効率を代表するように
計算されたβ−グロビンプラスミドDNAの適当な希釈物
5.6μｌを200μｌの0.4NNaOH及び25mM EDTAで希釈し、
そしてナイロンフィルター上にスポットした。これは、
フィルターを水で湿し、これを、フィルターを定位置に
保持するドットブロック調製用装置中に入れ、サンプル
を適用し、そしてReed及びMann,Nucleic Acids Researc
h,13,7202−7221（1985）により開示されているように
して、0.1mlの20×SSPE（3.6MNaCl、200mM NaH2PO4、20
mM EDTA）により各ウエルをすすいだ。次に、フィルタ
ーを取り出し、20×SSPE中で洗浄し、そして真空オーブ
ン中で80℃にて30分間加熱した。
加熱の後、各フィルターを、３×SSPE、５×デンハー
ト溶液（１×＝0.02％ポリビニルピロリドン、0.02％フ
ィコール、0.02％ウシ血清アルブミン、0.2mM Tris、0.
2mM EDTA、pH8.0）、0.5％SDS及び30％ホルムアミドか
ら成るハイブリダイゼーション溶液16mlと接触せしめ、
そして42℃にて２時間インキュベートした。次に、2pmo
leのプローブRS24をハイブリダイゼーション溶液に加
え、そしてフィルターを42℃にて２分間インキュベート
した。
最後に、ハイブリダイズした各フィルターを100mlの
２×SSPE及び0.1％SDSで２回室温にて10分間洗浄した。
次に、フィルターを100mlの２×SSPE、0.1％SDSで、60
℃にて10分間処理した。
次に、各フィルターをオートラジオグラフ処理した。
ジグナルは２時間後に容易に出現した。
VII.オートラジオグラムの検討 ２時間後にドットブロットのオートラジオグラムを分
析して、そしてHaeIII/MaeＩ−消化pBR:βAにより調製
された標準逐次稀釈β−グロビン調製物と、強度につい
て比較した。βAは、Saiki等Scince、前掲、において記
載されている野性型対立遺伝子である。反応生成物の分
析により、全体の増幅効率は約95％であることが示さ
れ、これはβ−グロビン標的配列の630,000倍の増加に
相当する。
例2.（参考例） I.増幅反応 例１に記載したようにしてMolt4セルラインから抽出
されたゲノムDNAの１μｇのサンプル２個をそれぞれ、5
0mM KCl、25mM Tris−HCl（pH8.0）、10mM MgCl2、１μ
ＭのプライマーPC03、１μＭのプライマーPC04、200μg
/mlのゼラチン、10％ジメチルスルホキシド、並びに1.5
mMずつのdATP,dCTP,dGTP及びTTPを含有する100μｌの反
応容量中に稀釈した。この混合物を98℃で10分間加熱し
てゲノムDNAを変性した後、サンプルを室温に冷却し、
そして例１に記載したテルムス・アクアチクスからのポ
リメラーゼ４μｌを各サンプルに加えた。サンプルに鉱
油を重層して凝縮及び蒸発ロスを防止した。
サンプルの１つを例１に記載した機械の加熱ブロック
に入れ、そして次のプログラムサイクルを反復して25サ
イクルの増副にかけた。
（１）2.5分間にわたり37℃から93℃に加熱し； （２）３分間にわたって93℃から37℃に冷却することに
よりプライマー及びDNAをアニールせしめ；そして （３）37℃に２分間保持した。
最終サイクルの後、サンプルを60℃にてさらに10分間イ
ンキュベートして最終伸長反応を完結した。
第二サンプルを温度サイクル（加熱及び冷却）機の熱
伝導コンテナーに入れた。この機械においては、熱伝導
コンテナーに温度を上方又は下方に調節するペルティー
ルヒートポンプ並びに増幅サイクル、温度レベル、温度
勾配及び温度のタイミングを自動的にコントロールする
マイクロプロセッサーに取り付けられる。
第二サンプルを、次のプログラムサイクルを反復する
25サイクルの増幅に付した。
（１）３分間にわたり37℃から95℃に加熱し； （２）95℃に0.5分間保持して変性を生じさせ； （３）１分間にわたり95℃から37℃に冷却し；そして （４）37℃にて１分間保持する。
II.アッセイ 分析、すなわちドットブロット分析及びアガロース分
析のために２つの試験を行った。
ドットブロット分析のためには、次の配列： ５′−*CTCCTGAGGAGAAGTCTGC−３′（RS18） のラベルされたDNAプローブを調製した。この配列中＊
はラベルを示す。このプローブは19塩基の長さを有し、
遺伝子の第４〜第７コドンを含み、そして正常β−グロ
ビン対立遺伝子（βA）に相補的である。プライマー及
びプローブの概略の関係を次に示す。
このプローブを、例1.I.に記載した方法により合成し
た。10pmoleのプローブを４ユニットT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ及び約40pmoleのγ−32P−ATP（約7000Ci/mm
ole）と、70mM Tris−HCl（pH7.6）、10mM MgCl2、1.5m
Mスペルミン及び10mMジチオスレイトールを含む40μｌ
の反応容量中で37℃にて60分間接触せしめた。次に25mM
EDTAにより全容量を100μｌに調整し、そしてTris−ED
TA（TE）緩衝液（10mM Tris−HCl、0.1mM EDTA、pH8.
0）で平衡化された1mlスピン透析カラム上でManiatis
等、前掲、p466−467の方法に従って精製した。反応生
成物のTCA沈澱は、RS18については比活性が4.6μCi/pmo
leでありそして最終濃度が0.114pmole/μｌであること
を示した。
前記I.からの増幅されたサンプル５μｌ、及び熱安定
酵素の代りにE.コリDNAポリメラーゼＩのKlenow断片を
用いたほか前記の方法と同様にして増幅したサンプル５
μｌを、195μｌの0.4NNaOH、25mM EDTAにより稀釈し、
そして２枚のナイロンフィルターにスポットした。この
場合、まずフィルターを水で湿し、フィルターを適切な
場所に保持するドットブロット調製用装置に入れ、サン
プルを適用し、そしてReed及びMann,前掲、により開示
されている様にして0.4mlの20×SSPE（3.6M NaCl、200m
M NaH2PO4、20mM EDTA）で各ウエルをすすいだ。次に、
フィルターを取り出し、そして真空オーブン中で80℃に
て30分間加熱した。
加熱の後、各フィルターを、５×SSPE、５×デンハー
ト溶液（１×＝0.02％ポリビニルピロリドン、0.02％フ
ィコール、0.02％ウシ血清アルブミン、0.2mM Tris、0.
2mM EDTA、pH8.0）及び0.5％SDSから成るハイブリダイ
ゼーション溶液6mlと接触せしめ、そして55℃にて60分
間インキュベートした。次に、５μｌのプローブRS18を
ハイブリダイゼーション溶液に加え、そしてフィルター
を55℃にて60分間インキュベートした。最後に、ハイブ
リダイズした各フィルターを100mlの２×SSPE及び0.1％
SDSで２回室温にて10分間洗浄した。次に、フィルター
をさらに２回（１回は１分間、２回目は３分間）100ml
の５×SSPE、0.1％SDSにより処理した。
次に、各フィルターをオートラジオグラフ処理し、シ
グナルは90分間後に容易に現われた。
アガロースゲル分析において、５μｌずつの増幅反応
混合物を、１×TBE緩衝液（0.089M Tris、0.089M硼酸及
び2mM EDTA）中４％NuSieve/0.5％アガロースゲルに負
荷し、そして100Vにて60分間電気泳動した。臭化エチジ
ウムで染色した後、DNAをUV蛍光により可視化した。
この結果は、例１において使用した機械及びこの例が
DNAの増幅において同様に効果的であることを示し、目
的の配列に対応する同様の強度の別個の高強度110塩基
対、並びに非常に低強度の少数の他の別個のバンドを示
した。これに対して、E.コリ−ポリメラーゼＩのクレノ
ウフラグメントを用いて各サイクルの後に試薬を移送す
る増幅方法は、多くの無関係のDNA配列の非特異的増幅
から生ずるDNAのよごろ（smer）をもたらした。
HLA−DQ、DR及びDP病変の評価において、増幅及び検
出の同様の改良が達成されることが期待される。
上記の実験において、増幅反応緩衝液が10mM MgCl2で
はなく2mM MgCl2、及び1.5mMずつではなく150〜200μＭ
ずつの各ヌクレオチドを含有する場合、並びに増幅の間
37℃の低温を45℃〜58℃に上げた場合、増幅の一層良好
な特異性及び効率が得られる。さらに、DMSOは増幅のた
めに必要でないか、又は好ましくないことが見出され
た。
例3.（参考例） ヒトβ−グロビン遺伝子上の119塩基対断片の増幅のた
め、Molt4セルラインから又はGM2064セルライン（β−
及びδ−ヒモグロビン領域のホモ接合性欠失を代表し、
そしてヒト・ケノミック・ミュータント・セル・デポン
ジトリー、カムデン、NJから得られる）を、50mM KCl、
25mM Tris−HCl（pH8）、10mM MgCl2、200μg/mlゼラチ
ン、5mM2−メルカプトエタノール、1.5mMずつのdATP,dC
TP,TTP及びdGTP、並びに１μＭずつの次のプライマー： ５′−CTTCTGcagCAACTGTGTTCACTAGC−３′（GH18） ５′−CACaAgCTTCATCCACGTTCACC−３′ （GH19） を含有する100μｌの反応容量中で増幅した。上記のプ
ローブの配列中、小文字は制限酵素部位を形成するため
の野性型配列からのミスマッチを示す。GH18は負鎖に対
して相補的な26−塩基のオリゴヌクレオチドであり、そ
して内部PstI部位を含有する。GH19は、正鎖に対して相
補的な29−塩基オリゴヌクレオチドであり、そして内部
HindIII認識部位を含有する。これらのプライマーは、P
stI及びHindIII制限部位に相同な遺伝子の領域をまずス
クリーニングすることにより選択された。次に、例１に
記載したようにしてプライマーを調製した。
上記の反応混合物を95℃にて10分間加熱しそして次に
室温に冷却した。例１に記載したポリメラーゼ合計４μ
ｌを各反応混合物に加え、そして次に各混合物に鉱油を
重層した。この反応混合物を次のプログラムによる30サ
イクルの増幅に付した。
２分間にわたり37℃から98℃に加熱し； 30分間にわたり98℃から37℃に冷却し； そして 37℃に２分間浸漬する。
最終サイクルの後、反応混合物を65℃にて20分間イン
キュベートして最終伸長を完結した。クロロホルムによ
り鉱油を抽出し、そして混合物を−20℃に貯蔵した。
合計10μｌの増幅生成物を、一般に入手可能なM13mp1
0クローニングベクター0.5μｇと共に、50mM NaCl、10m
M Tris−HCl（pH7.8）、10mM MgCl2、20ユニットのPst
Ｉ及び26ユニットのHindIIIを含有する50μｌの容量中
で37℃にて90分間消化した。−20℃に凍結することによ
り反応を停止した。TE緩衝液により容量を110μｌに調
整し、そして、100μｌを1mlのビオゲルＰ−４スピン透
析カラムに負荷した。１個の0.1ml画分を集め、そして
エタノール沈澱せしめた。
（この時点において、GM2064サンプル中にβ−グロビ
ン増幅生成物が存在することが見出された。次の実験
は、プライマーGH18又はGH19への汚染源を追跡した。他
のプライマー源が得られなかったので、若干のクローン
化配列がプライマー中の汚染DNAに由来するであろうと
理解して実験を続けた。） エタノールペレットを15μｌの水に再懸濁し、次に50
mM Tris−HCl（pH7.8）、10mM MgCl2、0.5mM ATP、10mM
ジチオスレイトール及び400ユニットのリガーゼを含有
する20μｌ容量に調整した。〔１ユニットは、５′末端
濃度0.12mM（約300μl/ml）〕において20μｌ中で、16
℃にて30分間に、HindIIIで消化されたλDNAの50％の連
結をもたらすのに必要な酵素の量である。この混合物を
16℃にて３時間インキュベートした。
Molt4DNAを含有する10μｌの連結反応混合物を、一般
に入手可能なE.コリJM103のコンピテント細胞に形質転
換した。形質転換された株を調製するための方法はMess
ing J.（1981）Third Cleveland Symposium on Macromo
lecules:Recombinant DNA,A.Walton編、エルゼビール，
アムステルダム,143−163に記載されている。合計651個
の無色のプラーク（及び０個の青色プラーク）が得られ
た。これらの内、119個（18％）は（＋）鎖挿入部を有
し、19個（３％）は（−）鎖挿入部を有していた。これ
ば、E.コリ−ポリメラーゼＩのKlenowフラグメントを用
いる増幅技法からのプライマー−陽性プラーク中のβ−
グロビン陽性プラークのパーセントのほとんど20倍であ
る。Klenowフラグメントを用いる方法においては、反応
を25℃にて２分間行い、次に100℃への加熱段階を２分
間行い、冷却し、Klenowフラグメントを添加し、そして
反応を９回反復した。これらの結果は、この発明の熱安
定酵素を用いる増幅反応の改良された特異性を確認して
いる。
GM2064及び汚染されたプライマーを用いる後のクロー
ニング実験においては、510個の無色プラーク中43個
（８％）が（＋）鎖挿入部を有していた。これは、Molt
4からの119クローンの約半分が汚染配列を含有すること
を示唆する。
Molt4からの（＋）鎖クローンの10個を配列決定し
た。５個は正常な野性型配列であり、そして１個のＣか
らＴへの変異を遺伝子の第二コドンの第三位置に有して
いた（CAC→CAT）。GM2064からの汚染クローンの４個を
配列決定し、４個すべてが正常であった。
上記の技法を用いながら、制限部位変形プライマーを
用いてヒトＮ−ras発癌遺伝子を増幅し、クローン化
し、そして部分的に配列決定し、及びHLADQ−α,DQ−β
及びDR−β遺伝子の塩基対セグメントをクローン化する
ために使用することができる。
例4.（実施例） 遺伝子の検索 A.Taqポリメラーゼ遺伝子のためのDNA配列プローブの同
定 Taqpol遺伝子のための特異的DNA配列プローブを、λg
tll発現ライブラリーの免疫的スクリーニングにより得
た。T.アクアチクスのDNAをAluＩにより完全消化し、Ec
oRI12−マーリンカー（CCGAATTCCGG、ニューイングラン
ドバイオラブス）に連結し、EcoRIで消化し、そしてEco
RI−消化され脱リン酸化されたλgtllDNA（プロゲマ・
バイオテク）と連結した。連結されたDNAをパッケージ
し（ジガパックプラス、ストラテジーン）、そしてE.コ
リＫ−12株Y1090（R.Youngより入手）にトランスフェク
トした。
２×105プラークの最初のライブラリーを、精製され
たTaqポリメラーゼ（例１及び例６を参照のこと）に対
するラビットポリクローナル抗血清の1:2000希釈物を用
いてスクリーニングした〔Young,R.A.及びR.W.Davis（1
983）Science，222:778−782〕。候補プラークを限界稀
釈で再プレートし、そして均一になるまで（約３サイク
ル）再スクリーニングした。免疫前血清と反応せずそし
て免疫血清と反応する候補プラークからファージを精製
した。
候補ファージを用いてE.コリＫ−12株Y1089（R.Youn
g）を溶原化した。溶原菌を、Taqポリメラーゼ抗血清と
反応するIPTG誘導性融合蛋白質（β−ガラクトシダーゼ
より大）の産生についてスクリーニングした。固相のサ
イズ分画された融合蛋白質を用いて、全ポリクローナル
抗体からエピトープ特異的抗体をアフィニティー精製し
た〔Goldstein,L.S.B.等（1986）J.Cell.Biol. 102:2076
−2087〕。
“つり上げられた”エピトープ−選択された抗体をウ
ェスタン分析において用いて、Taqポリメラーゼに特異
的なDNA配列をコードしているλgtllファージ候補を同
定した。λgt:1と称する１つのλgtllファージ候補が、
精製されたTaqポリメラーゼ及びTaqポリメラーゼを含有
する粗抽出画分の両者と特異的に反応する抗体を、全ラ
ビットポリクローナルTaqポリメラーゼ抗血清から特異
的に選択した。このファージλgt:1を使用してさらに検
討した。
テルムス・アクアチクスDNAの約115bpのEcoRI−適合A
luＩ断片をラベルし（Maniatis等、前掲）て、Taqポリ
メラーゼ特異的プローブを形成した。このプローブをサ
ザン分析において、及びT.アクアチクスDNAランダムゲ
ノムライブラリーをスクリーニングするために用いた。
B.テルムス・アクアチクス−ランダムゲノムライブラリ
ーの造成及びスクリーニング λファージシャロン35（Wilhelmine,A.M.等、前掲）
をその接着末端を介してアニール化しそして連結し、Ba
mHIにより完全消化し、そしてアニールされたアームを
スタファー（stuffer）フラグメントから、酢酸カルシ
ウム密度勾配超遠心（Maniatis等、前掲）により精製し
た。T.アクアチクスのDNAをSau3Aで部分分解し、そして
15〜20kbサイズの画分をシュークロース密度勾配超遠心
により精製した。標的DNAフラグメント及びベクターDNA
フラグメントを1:1のモル比で連結することによりラン
ダムゲノムライブラリーを造成した。DNAをパッケージ
し、そしてE.コリＫ−12株LE392又はK802にトランスフ
ェクトした。99％以上の組換体を含有する20,000以上の
最初のファージのライブラリーをE.コリＫ−12株LE392
上で増幅した。
λgtll:1の放射性ラベルされたEcoRI挿入部によりCH3
5Taqゲノムファージライブラリーをスクリーニングした
（マニアチス等、前掲）。特異的にハイブリダイズする
候補ファージプラークを精製し、そしてさらに分析し
た。CH35::4−２と称する１つのファージが、Hind III
による消化の後に４個以上のT.アクアチクスDNAフラグ
メントを放出した（約8.0,4.5,0.8,0.58kb）。
４種類のHind IIIT.アクアチクスDNAフラグメント
を、Hind IIIで消化したプラスミドBSM13+（3.2kb、ベ
クタークローニングシステムス、サンジェゴ）に連結
し、そしてそれぞれE.コリＫ−12株DG98の形質転換にク
ローン化した。
CH35::4−２からの約8.0kbのHind IIIDNAフラグメン
トをプラスミドpFC82（11.2kb）中に単離し、他方CH3
5::4−２からの4.5kbHind IIIDNAフラグメントをプラス
ミドpFC83（7.7kb）中に単離した。
pFC82を含有するE.コリDG98株は熱安定性高温DNAポリ
メラーゼ活性を含有することが示された（第１表）。さ
らに、この細胞は、免疫的にTaqDNAポリメラーゼと関連
する新たな約60kdの分子量のポリペプチドを合成する。
8.0kb Hind III DNAフラグメントのTaqポリメラーゼ
コード領域をさらに処理し、8.0kb Hind IIIフラグメン
トの2.8kbのHind III−Asp718部分をlas−プロモーター
の近位に位置付けた。この領域をサブクローニングして
プラスミドpFC85（6.0kb）を得た。IPTGと共にインキュ
ベートした後、プラスミドpFC85を含有するE.コリDG98
細胞は、もとの親クローン（pFC82/DG98）に比べて100
倍までの熱安定性Taqポリメラーゼ関連活性を合成する
（第１表）。pFC85を含有する細胞は有意量の熱安定DNA
ポリメラーゼ活性を合成するが、Taq pol DNA配列の一
部分のみが翻訳され、約60kdのTaqポリメラーゼ関連ポ
リペプチドの蓄積が起こる。
（＃）細胞は後期対数期まで増殖せしめ（＋／−IPTG,1
0mM）、集菌し、音波処理し、75℃にて20分間加熱し、
遠心し、そして透明な上清を70℃にてDNAポリメラーゼ
活性について測定した。
（＊）１ユニット＝30分間に1nM dCTPの導入。
例5.（実施例） この発明の熱安定酵素の遺伝子は種々の細菌発現ベク
ター、例えばDG141（ATCC39588）及びpPLNRBSATG中で発
現せしめることができる。これらの宿主ベクターの両者
はpBR322の誘導体であって、トリプトファン・プロモー
ターオペレーター及びATG開始コドンと作用可能に連結
されたリボゾーム結合部位（DG141）、又はλPLプロモ
ーターを含む配列及びATG開始コドンに作用可能に連結
された遺伝子Ｎ結合部位（pPLNRBSATG）を有する。これ
らの宿主ベクターのいずれか一方をSacＩにより制限酵
素処理し、そしてKlenow又はSIヌクレアーゼにより平滑
末端化して、Taqポリメラーゼ遺伝子を後で挿入するた
めの便利な部位を作ることができる。
次の様にして、プラスミドpFC83及びpFC85にサブクロ
ーニングされたDAN挿入フラグメントから完全な長さのT
aqポリメラーゼ遺伝子を造成した。ベクターBSM13+（ベ
クタークローニングシステムス、サンジエゴ、CAから市
販されている）をユニークHind III部位において消化
し、Klenow及びdNTPにより修復し、そしてT4DNAリガー
ゼを用いてBgl IIオクタヌクレオチドチドリンカー５′
−CAGATCTG−３′に連結し、そしてE.コリDG98株に形質
転換した。AmpR 1acＺα+形質転換体からプラスミドを単
離した。クローンの１つをBgl II及びAsp718により消化
し、そして大ベクターフラグメントをゲル電気泳動によ
り精製した。
次に、プラスミドpFC83をBgl II及びHind IIIで消化
し、そして約750bpのフラグメントを単離した。プラス
ミドpFC85をHind III及びAsp718で消化し、そして約2.8
kbのフラグメントを単離し、そして３片連結によりpFC8
3からの約750bpのBgl II−Hind IIIフラグメント及びBS
M13+のBgl II−Asp718ベクターフラグメントと連結し
た。この連結混合物を用いてE.コリDG98株（1984年７月
13日に寄託のATCC No.39,768）を形質転換し、これから
AmpRコロニーを選択し、そして約6.75kbのプラスミド
（pLSGl）を単離した。pLSGlを含有するイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）−誘導DG98細胞は、
T.アクアチクスから単離された天然酵素とはサイズを異
にするTaq DNAポリメラーゼを合成した。次に、プラス
ミドpLSGlを用いて、ベクタークローニングシステムに
より推奨される方法に従って単鎖DNA鋳型を形成するこ
とができる。
次に、オリゴヌクレオチド−指令変異誘発〔Zoller及
びSmith,Nuc.Acids Res.（1982）10:6487−6500〕を用
いてATG開始コドンの部分としてSph I制御部位を導入す
ることができる（Taqポリメラーゼ遺伝子のコード配列
中の内部Hind III部位の上流に）。同様にして、遺伝子
のカルボキシ末端の後（Asp718部位から約0.7kb上流）
にBgl II部位を導入して発現ベクターへのTaqポリメラ
ーゼ遺伝子のサブクローニングを容易にすることができ
る。部位特定変異誘導を終った後、遺伝子をBSM13+から
約3.2kbのSph I−BstE II制限フラグメント上に単離
し、Klenowフラグメント及び４種類すべてのdNTPにより
処理し、そしてT4DNAリガーゼを用いて（平滑末端条
件）、あらかじめSac Iで消化し、Klenow及びdNTPによ
り修復しそしてウシ腸ホスファターゼで処理して脱リン
酸化平滑末端を形成しておいた前記の発現ベクターに挿
入することができる。この連結混合物を用いてE.コリDG
116を形質転換し、そして得られる形質転換体をTaqポリ
メラーゼの産生についてスクリーニングする。酵素の発
現は、ウェスタンイムノブロット分析及び活性分析によ
り確認することができる。
プラスミドpFC85の約2.8kbのHind III−Asp718フラグ
メント中に含有されるTaqポリメラーゼ遺伝子のより大
きな部分を、例えばプラスミドpPLNRBSATGを用いて、Ta
q pol遺伝子をコードするアミノ−末端Hind III制限部
位をATG開始コドンに連結することにより、発現せしめ
ることができる。この融合体の発現生成物は約66,000〜
68,000ドルトンの端が切り取られたポリメラーゼをもた
らす。
この特定の造成は、プラスミドpFC85をHind IIIで消
化し、そしてdATP,dGTP及びdCTPの存在下でKlenowフラ
グメントで処理することにより行うことができる。生じ
たフラグメントをS1ヌクレアーゼでさらに処理すること
により単鎖延長部を除去し、そして生じたDNAをAsp718
で消化し、そして４種類すべてのdNTPの存在下でKlenow
フラグメントにより処理する。回収された断片を、T4DN
Aリガーゼを用いて、あらかじめSac Iにより消化しそし
てdGTPの存在下でKlenowフラグメントで処理してATG平
滑末端を形成しておいた脱リン酸プラスミドpPLNRBSATG
に連結することができる。次に、この連結混合物を用い
てE.コリDG116を形質転換し、そして形質転換体をTaqポ
リメラーゼの産生についてスクリーニングする。やは
り、ウェスタンイムノブロット分析及び活性分析により
発現を確認することができる。
例6.（実施例） 精製 熱安定性ポリメラーゼは、後に記載する例に従って、
テルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）の培養
物から直接精製することができ、あるいは粗抽出物の調
製において必要なわずかな変更を伴って、組換生産され
た酵素を含有する細菌培養物から精製することができ
る。
遠心分離により集菌した後、60gの細胞を50mM Tris−
HCl（pH8.1）及び1mM EDTAを含有する緩衝液75ml中に懸
濁した。細胞をフレンチプレス中で14,000〜16,000PSI
にて溶菌し、この後４容積（300ml）の追加のTris−EDT
Aを加えた。緩衝液Ａ（β−メルカプトエタノールを5mM
に、そしてNP−40及びトウィーン20をそれぞれ0.5v/v％
に）を添加し、そしてこの溶液を冷却しながら十分に音
波処理した。得られる均質懸濁液を緩衝液Ａによりさら
に稀釈して最終容量が出発細胞重量の7.5〜８倍となる
ようにした。これを画分Ｉと称する。
画分Ｉ及び上清画分中のポリメラーゼ活性を、0.025M
TAPS−HCl（pH9.2,20℃）、0.002M MgCl2、0.05M KC
l、1mM2−メルカプトエタノール、0.2mMずつのdGTP,dAT
P,TTP,0.1mM dCTP〔α−32P,0.05Ci/mM〕、12.5μｇ
“活性化された”サケ精子DNA及び0.01〜0.2ユニットの
ポリメラーゼ（10mM Tris−HCl,pH8、50mM KCl、1mg/ml
のオートクレーブされたゼラチン、0.5％NP−40、0.5％
トウィーン20及び1mM2−メルカプトエタノール中に稀
釈）を含んで成る50μｌの混合物中で測定した。１ユニ
ットは30分間中10nMの生成物に相当する。“活性化され
た"DNAは、DNAの５％が酸可溶性画分に変るまでDNaseI
により部分加水分解された後のDNAの天然調製物であ
る。反応を74℃にて10分間行い、そして次に40μｌを2m
M EDTA中50μg/mlのキャリャーDNA溶液1.0ml（０℃）中
に移した。同容量（1.0ml）の20％TCA及び２％ピロリン
酸ナトリウムを加えた。０℃にて15〜20分間の後、サン
プルをワットマンGF/Cディスクを通して濾過し、そして
冷５％TCA−１％ピロリン酸塩により十分に洗浄し、次
に冷95％エタノールで洗浄し、そして乾燥し、計数し
た。
画分Ｉを、ベックマンTI45ローター中で35,000rpmに
て２時間、２℃にて遠心し、そして集めた上清を画分II
とした。
活性の90〜95％を沈澱せしめるのに必要なポリミン
（Polmin）Ｐの最少量（この量は一般に最終容量の0.25
〜0.3％であることが見出された）を決定した後、ポリ
ミンＰ（BRL、ガイセルブルグ、MD）（10v/v％,pH7.5に
調整しそしてオートクレーブしたもの）によりTaqポリ
メラーゼ活性を沈澱せしめた。
０℃にて15分間にわたり攪拌しながら、適当なレベル
のポリミンＰを画分IIに徐々に添加した。この溶液を０
℃にてベックマンJA14ローター中で20分間にわたり13,0
00rpmにて遠心した。上清の活性を測定し、そしてペレ
ットを1/5容量の0.5×緩衝液Ａ（水で1:2に稀釈したも
の）に再懸濁した。この懸濁液を再遠心分離し、そして
ペレットを1/4容量の緩衝液Ａ（0.4M KClを含有）に再
懸濁した。この懸濁液を十分にホモジナイズし、そして
４℃に一夜置いた。このホモジネートを前記のように遠
心し、そして集めた上清を画分IIIと命名した。
蛋白質画分を硫酸アンモニウムの75％飽和で“沈澱”
により集め、遠心分離し（27,000rpm、SW27ローター、3
0分間）そして浮上した薄膜を50mM Tris−HCl（pH8）、
1mM EDTA中に再懸濁した。これらの段階を反復し、そし
て蛋白質懸濁液を80mM KClを含有するＰ−cell緩衝液
〔20mMKPO4,pH7.5、0.5mM EDTA、5mMβ−メルカプトエ
タノール、5w/v％グリセロール、0.5v/v％NP−40及びト
ウィーン20〕により十分に透析した。
透析物を遠心ビンに移し、これに、80mM KClを含有す
るＰ−cell緩衝液ですすがれたサックから回収された蛋
白質を加えた。遠心を20,000×ｇにて行い、そして時間
は15分間に短縮した。上清を貯蔵し、そして残ったペレ
ットをＰ−cell緩衝液及び80mM KClにより洗浄・抽出
し、そして再遠心した。次に上清を一緒にして画分IVと
命名した。
画分IVを、80mM KClを含有するＰ−cell緩衝液で平衡
化したホスホセルロースの2.2×22cmのカラムに適用し
た。このカラムを同じ緩衝液で洗浄し（カラムの2.5〜
３倍容量）、そしてＰ−cell緩衝液中80〜400mM KClの
直線グラジエントを用いて蛋白質を溶出した。DNAポリ
メラーゼ活性を含有する画分（約0.18〜0.20M KCl）を
プールし、そしてアミコン攪拌セル及びYM30膜上で３〜
４倍濃縮した。このセルを、KClを含有しないＰ−cell
緩衝液ですすぎ、そして含有濃縮物（0.15M KCl最終容
量調整）に加えて画分Ｖとした。
画分Ｖを、Ｐ−cell緩衝液及び0.15M KClで平衡化し
たヘパリン・セファロースCL−6Bカラム（ファルマシ
ア）5mlに適用した。カラムを0.15M KCl緩衝液（３〜４
カラム容量）により洗浄し、そしてＰ−cell緩衝液中0.
15〜0.65M KClの直線グラジエントにより蛋白質を溶出
した。SDS−PAEG分析のためにゼラチンを含まない稀釈
剤への1:10稀釈を行い、そして酵素の測定に使用するた
め1mg/mlのゼラチンを含有する稀釈剤への引続いての1:
20稀釈を行った。活性画分（約0.3M KClで溶出）を、ス
ーパーコイルDNA鋳型上で特異的及び非特異的エンドヌ
クレアーゼ／トポイソメラーゼについて、過剰のDNAポ
リメラーゼと共にインキュベートした後のスーパーコイ
ルプラスミドDNAの分子量の変化を電気泳動により検出
することによって測定した。少量の線状DNAフラグメン
トとのインキュベーションの後エキソヌクレアーゼの汚
染が検出された。ピーク画分中、約88kd蛋白質が主たる
バンドであることが見出された。画分VIと称する主要画
分は、このプールを約３〜５ポリメラーゼユニット/600
ng DNAで55℃にて30分間測定した場合、最少の検出可能
なエンドヌクレアーゼ活性を伴って最高のポリメラーゼ
活性を有していた。
画分VIを、10mM KPO4（pH7.5）、5mMβ−メルカプト
エタノール、５％グリセロール、0.2％NP−40及び0.2％
トウィーン20（HA緩衝液）に対して透析した。この透析
されたサンプルを、ヒドロキシアパタイトの3mlのカラ
ムに適用し、そしてHA緩衝液中10〜250mM KPO4（pH7.
5）の直線グラジエントにより酵素を溶出した。ポリメ
ラーゼ活性は75mM KPO4において溶出し始め、100mM PO4
においてピークを示した。活性ピーク画分を1:100〜1:3
00稀釈で測定した。前のクロマトグラフィー段階におけ
るように、SDS−PAGE分析のため、ゼラチンを含まない
稀釈剤中1:10の稀釈物を調製した。５ポリメラーゼユニ
ットで55℃において有意なエンドヌクレアーゼ又は二本
鎖エキソヌクレアーゼ活性を有しない画分をプールし、
そして画分VIIと命名した。
画分VIIを、25mM酢酸ナトリウム（pH5.2）、５％グリ
セロール、5mMβ−メルカプトエタノール、0.1mM EDT
A、0.1％NP−40及び0.1％トウィーン20の溶液に対して
透析し、室温においてpH5に調整した。透析されたサン
プルを、あらかじめ平衡化した2mlのDEAE−Tris−Acryl
−Ｍ（LKB）カラムに適用し、そして次に同じ緩衝液で
洗浄した。カラムに付着しなかったポリメラーゼ活性を
含有する画分をプールし、そして同じ緩衝液中50mM NaC
lに調整し、画分VIIIを得た。
画分VIIIを、同じ緩衝液（25mM酢酸ナトリウム、50mM
NaCl、５％グリセロール、0.1mM EDTA、0.1％NP−40及
び0.1％トウィーン20）で平衡化された2mlのCM−Tris−
Acryl−Ｍ（LKB）カラムに適用した。このカラムを、４
〜５カラム容量の同じ緩衝液で洗浄し、そして酵素を酢
酸ナトリウム緩衝液中50〜400mM NaClの直線グラジエン
トにより溶出した。ポリメラーゼ活性のピークは約0.15
〜0.20M NaClにおいて溶出された。ポリメラーゼ活性
を、SDS−PAGE分析のためゼラチンを含有しない稀釈剤
中にまず1:10で稀釈し、1:300〜1:500稀釈において測定
した。74℃にてDNAポリメラーゼアッセイ塩（25mM TAPS
−HCl,pH9.4、2.0mM MgCl2及び50mM KCl）を用いて特異
的及び非特異的エンドヌクレアーゼ／トポイソメラーゼ
についてスーパーコイルDNA鋳型に対する活性ピークに
わたる測定を行い、さらにM13ssDNA及びpBR322フラグメ
ントに対するヌクレアーゼの測定も行った。検出可能な
ヌクレアーゼを含有しない活性画分をプールし、そして
銀染色SDS−PAGEミニゲル上を泳動せしめた。この結果
は、約250,000ユニット/mgの比活性を有する約88kdの単
一バンドを示す。
例7.（参考例） 例６に記載したようにして精製されたTaqポリメラー
ゼは、Taqエンドヌクレアーゼ活性及びTaqエキソヌクレ
アーゼ活性により汚染されていないことが見出された。
さらに、Taqポリメラーゼは好ましくは、使用される各
非イオン性洗剤約0.1〜約0.5v/v％を含有する貯蔵緩衝
液中に貯蔵される。さらに好ましくは、貯蔵緩衝液は50
v/v％グリセロール、100mM KCl、20mM Tris−HCl（pH8.
0）、0.1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1mMジチ
オスレイトール、0.5v/v％NP−40、0.5v/v％トウィーン
20及び20μg/mlゼラチンからなり、そして好ましくは−
20℃で貯蔵される。
この貯蔵されたTaqポリメラーゼを、25mM Tris−HCl
（pH8.0）、20mM KCl、1mMβ−メルカプトエタノール、
0.5％NP−40、0.5％トウィーン20及び500μg/mlゼラチ
ンから成る緩衝液に稀釈した。次に、50mM KCl、10mM T
ris−HCl（pH8.3）、1.5mM MgCl2、0.01w/v％ゼラチ
ン、200μＭずつのdNTP、１μＭずつのプライマー（バ
クテリオファージλからの対照鋳型上の500塩基対の標
的配列を定義する）、及び2.0〜2.5ユニットのTaqポリ
メラーゼ/1測定を100μｌの最終容量中に含有する反応
緩衝液を調製した。この反応緩衝液に鋳型を添加し、サ
ンプルを0.5mlのポリプロピレンチューブに入れ、そし
てサンプルを100μｌの重白色鉱油で覆って蒸発を防止
した。
1ngの対照鋳型（バクテリオファージλDNA）を使用
し、標的配列がDNAの出発量の約１％を占め、次の条件
を用いた場合、少なくとも105倍の増幅が達成された。
チューブを熱浴中に置くことにより94℃にて30秒間、
１分間にわたり鋳型混合物をまず変性した。次に、チュ
ーブを37℃の熱浴に２分間入れた。次に、チューブを72
℃の熱浴に３分間入れ、そして次に94℃の熱浴に１分間
入れた。このサンプルを合計25サイクル反復した。25回
目のサイクルの終りにおいて、94℃における熱変性段階
を省略し、そしてその代りに、72℃のインキュベーショ
ン段階をさらに３分間延長した。測定を停止した後、サ
ンプルを室温に放冷し、そして先行例において記載した
ようにして分析した。
異る濃度のdNTP及び異る濃度のTaqポリメラーゼを用
いて、鋳型を最適に増幅することができよう。さらに、
DNAサンプル中の標的配列のサイズは、適切な伸長（72
℃でのインキュベーション段階）のために必要な最短時
間に影響を与えるであろう。最大の効率を得るため、増
幅されるべき個々の鋳型について温度サイクルプロフィ
ールの最適化を行うべきである。
例8.（参考例） 例１に記載したようにして精製したTaqポリメラーゼ
を先行する例において記載したようにして貯蔵のために
製剤化した。但し、非イオン性ポリマー洗剤を使用しな
かった。その例において記載したようにして活性を測定
した場合、この酵素貯蔵混合物は不活性であることが見
出された。貯蔵緩衝液にNP−20及びトウィーン20を添加
した場合、十分な酵素活性が保存されており、酵素製剤
の安定のために非イオン性洗剤が必要であることが示さ
れた。
例9.（参考例） コトゲノムDNAの１μｇのサンプル数個を、同等のユ
ニット数のKlenowフラグメント又はTaqポリメラーゼを
用いて、例５に記載したようにして20〜35サイクルの増
幅に付し、そしてアガロースゲル電気泳動及びサザンブ
ロットにより分析した。これらの反応において使用され
たプライマーPC03及びPC04はヒトβ−グロビン遺伝子の
110bpセグメントの合成を指令する。Klenowポリメラー
ゼ増幅は、この酵素を用いる場合に典型的に観察される
DNAの汚れ（smear）を示し、その予想される原因は非特
異的アニーリング、及び本質的に非−ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件（１×Klenow塩、37℃）
下での無関係のゲノム配列へのプライマーの伸長であ
る。それにもかかわらず、サザンブロットにおいて、す
べてのレーンで特異的110bpβ−グロビン標的フラグメ
ントが観察された。Taqポリメラーゼを用いて行われた
増幅において実質的に異る電気泳動パターンが見られ、
この場合、単一の主要バンドは110bp標的配列である。
この顕著な特異性は疑いなくプライマーが伸長された時
の温度によるものであった。
Klenowフラグメント増幅の場合のように、アニーリン
グ段階は37℃で行われたが、Taq−触媒反応の温度を約7
0℃に上昇せしめた後に酵素は有意な活性を示した。37
℃から70℃へのこの変温の間、貧弱にマッチしたプライ
マー−鋳型ハイブリド（37℃で形成される）が解離し、
反応混合物が酵素活性化温度に達する時点までに、高度
に相補的な基質のみが伸長のために利用可能であった。
この特異性はまた、Klenowフラグメントを用いて行われ
る同様の増幅に比べて高収量の標的配列をもたらす。な
ぜなら、非特異的伸長生成物がポリメラーゼに関して効
果的に競争し、これによりKlenowフラグメントにより作
られ得る110−マーの量が減少するからである。
例10.（参考例） １μg Molt4DNA、50mM KCl、10mM Tris（pH8.3）、10
mM MgCl2、0.01％ゼラチン、１μｍずつの次のプライマ
ー（150bp領域を増幅するためのもの）： ５′−CATGCCTCTTTGCACCATTC−３′（RS79） 及び ５′−TGGTAGCTGGATTGTAGCTG−３′（RS80） 1.5mMずつのdNTP及び5.0ユニットのTaqポリメラーゼを1
00μｌの反応容量当りに含有するサンプルの増幅を行っ
た。2.5,1.3、又は0.6ユニットのTaqポリメラーゼを含
有する３個の追加のサンプルを調製した。次のサイクル
を用いて前記の温度サイクル機中で30サイクルの増幅を
行った。
１分間にわたり70℃から98℃に加熱し； 98℃にて１分間保持し； １分間にわたり98℃から35℃,45℃又は55℃に冷却
し； 35℃,45℃又は55℃に１分間保持し； １分間にわたり35℃,45℃又は55℃から70℃に加熱
し；そして 70℃に30秒間保持する。
35℃のアニーリング温度において、2.5ユニット/100
μｌのTaq酵素稀釈物が、アガロースゲル電気泳動にお
いて、他のすべてのTaqポリメラーゼ濃度に比べて最良
のシグナル：ノイズ比を与える。45℃においては、５ユ
ニット/100μｌのTaq酵素が、他の濃度に比べて最良の
シグナル：ノイズ比を与える。55℃においては、５ユニ
ット/100μｌのTaq酵素が、他の濃度及び45℃でのアニ
ーリングに比べて最良のシグナル：ノイズ比、及び改良
された収量を与える。Taqポリメラーゼは55℃において
一層特異性が高く、そして一層好収量を与える。
別の実験において、Molt4DNAを、ヒューマン・ゼネテ
ィック・ミュータント・セル・デポジトリー（Human Ge
netic Mutant Cell Depository）、カムデン、ニュージ
ャージーから得られるβ−又はγ−グロビン配列を含有
するセルラインGM2064DNAに10倍ごとに、細胞当りのコ
ピーの相違を代表する種々の濃度で稀釈し、そしてこれ
らのサンプルについて、35℃及び55℃のアニーリング温
度においてこの例において記載したようにして増幅を行
った。35℃において、アガロースゲル電気泳動により見
ることができる最良のものは50細胞中１コピーであっ
た。55℃においては、見られる最良のものは1/5,000細
胞（低温に比べて100倍の改良）であり、これらの条件
下でのTaqポリメラーゼの特異性のためには上昇したア
ニーリング温度が重要であることが示された。
第三の実験において、ニューヨーク、シラクスのB.Po
iesz州立大学から得られるHIV−陽性DNAを含有するセル
ライン368HからのDNAを同様にして、SC1セルライン（19
85年３月19日にATCCに寄託されている；鎌形赤血球対立
遺伝子についてホモ接合性でありそしてHIV配列をすべ
て欠いているEBV−形質転換されたβ−セルライン）か
らのDNAに、細胞当りのコピーの相違を代表する種々の
濃度で稀釈し、そしてHIV配列の115bp領域を増幅するプ
ライマーSK38及びSK39: ５′−ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT−３′（SK38） 及び ５′−TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC−３′（SK39） を用いて、35℃及び55℃のアニーリング温度において、
この例に記載したようにして増幅を行った。
アガロースゲル電気泳動による結果が示すところによ
れば、35℃のアニーリング温度においては未稀釈の368H
サンプルのみが検出されたが、55℃のアニーリング温度
によれば少なくとも10-2稀釈を検出することができ、検
出における100倍の改良が与えられた。
例11.（参考例） １μｇのラビット網状赤血球mRNA（ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリース）から、cDNAを、150mM KCl、50mM
Tris−HCl（pH8.3）、10mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM dAT
P、0.5mM dCTP、0.5mM TTP、0.5mM dGTP、0.2μｇオリ
ゴ（dT）12−18（ファルコシア）、40ユニットRNasin
（プロメガ・バイオテック）及び５ユニットのAMV逆転
写酵素を含有する100μｌの反応容量中で作り、そして4
2℃にて30分間インキュベートした。95℃にて10分間加
熱することにより反応を停止した。２μｇのRNase（水
中2mg/mlの溶液２μｌ）をサンプルに加え、そして37℃
にて10分間インキュベートした。
異る対のプライマーを用いて、Klenowフラグメントに
より３回の増幅反応を行った。プライマーPC03/PC04は1
10bpの生成物を定義する。プライマー対RS45/オリゴ（d
T）25−30は約370bpの生成物を定義し、そしてプライマ
ー対PC03/オリゴ（dT）25−30は約600bpの生成物を定義
する。PC03,PC04、及びRS45はヒトβ−グロビン遺伝子
に対して相補的であり、そしてラビット遺伝子との間に
２個のミスマッチを有する。PC03及びPC04は例１に記載
されている。RS45は配列:5′−CAAGAAGGTGCTAGGTGCC−
３′を有する。
増幅反応は、50mM NaCl、10mM Tris−HCl（pH7.6）、
10mM MgCl2、200μg/mlゼラチン、10％DMSO、１μMPC03
又はRS45、１μMPC04又はオリゴ（dT）25−30、1.5mM d
ATP、1.5mM dCTP、1.5mM TTP及び1.5mM dGTPを含有する
100μｌの反応容量中で、前記のcDNAの1/2（５μｌ）を
用いて行った。サンプルを98℃にて５分間加熱し、次に
室温に冷却し、そして100μｌの鉱油を重層した。
このサンプルを、例１に記載した機械を用いてそして
次のプログラムを用いて、10サイクルの増幅に付した。
１）加熱ブロック中で2.5分間にわたり37℃から98℃に
加熱し（変性）； ２）3.0分間にわたって98℃から37℃に冷却し（アニー
ル）； ３）１ユニットのKlenow断片を添加し；そして ４）37℃にて20分間保持した（伸長）。
各サンプルの1/20（７μｌ）を２％アガロースゲル上
での電気泳動により分析した。臭化エチジウムにより染
色した後、PC03/PC04サンプル及びRS45/オリゴ（dT）サ
ンプル中に異るバンドが見られた。バンドのサイズは予
想した長さと一致した。すなわち、前者については110b
pであり、後者については約370bpであった。PC03/オリ
ゴ（dT）プライマー対による約600bpフラグメントの増
幅の証拠はなかった。
ゲルの内容物をゲナントラン（Genantran）ナイロン
膜にサザンブロッティングし、そして標準的方法により
Saiki等、Scirnce、前掲、に記載されているニックトラ
ンスレーションされたヒトβ−グロビンプローブpBR32
8:βＡとハイブリダイズせしめた。得られたオートラジ
オグラムは前に達した結論を拡張した。すなわち、110b
p及び約370bpのフラグメントはβ−グロビン特異的増幅
生成物であり、そして約600bpバンドの有意な増幅は検
出されなかった。
３個の追加のサンプルを、上記の様にして得られたTa
qポリメラーゼにより、前記と同じプライマー対を用い
て増幅した。cDNAの５μｌ部分を、50mM KCl、25mM Tri
s−HCl（pH8.0）、10mM MgCl2、200μg/mlゼラチン、10
％DMSO、１μMPC03又はRS45、１μMPC04又はオリゴ（d
T）25−30、1.5mM dATP、1.5mM dCTP、1.5mM TTP及び1.
5mM dGTPを含有する100μｌの反応容量中で増幅した。
サンプルを98℃にて５分間加熱し、そして室温に冷却し
た。１μｌのTaqポリメラーゼ（ロット２の1/8稀釈物）
をそれぞれに加え、そして約100μｌの鉱油を重層し
た。
このサンプルを、次のプログラムを用いて前に記載し
たペリティール（Peltier）の装置中で９サイクルの増
幅に付した。
１）１分間にわたり35℃から60℃に加熱し； ２）12分間にわたり60℃から75℃に加熱し（伸長）； ３）１分間にわたり70℃から95℃に加熱し（変性）； ４）95℃に30秒間浸漬し； ５）１分間にわたり95℃から35℃に冷却し（アニー
ル）；そして ６）35℃にて30秒間浸漬した。
最後のサイクルの後、サンプルをさらに10分間70℃に
てインキュベートすることにより最終（10サイクル目）
伸長を完結した。それぞれの最終容量は約100μｌであ
った。
前記のごとく、各サンプルの1/20（10μｌ）を２％ア
ガロースゲル上で分析した。このゲル中で、増幅生成物
は３個のサンプルすべてに存在した。すなわち、PC03/P
C04については110bp、RS45/オリゴ（dT）については約3
70bp、そしてPC03/オリゴ（dT）については約600bpであ
た。これらの結果は、サザン移行及びpBR328:βＡプロ
ーブとのハイブリダイゼーションにより確認された。
KlenowフラグメントによってではなくTaqポリメラー
ゼによる600bp生成物の生成は有意であり、そしてTaqポ
リメラーゼがKlenowフラグメントより一層長いDNAを生
成せしめることができることを示唆する。
下記のバクテリオファージ及び細菌株がシタス・マス
ター・カルチュア・コレクション（Cetus Master Cultu
re Collection）（CMCC）、米国カリホルニア，エメリ
ービル,1400,53ストリート、及びアメリカン・タイプ・
カルチュア・コレクション（ATCC）、米国マリーラン
ド，ロックビル,12301パークラウンドライブ、に寄託さ
れた。これらの寄託は、特許手続のための微生物の寄託
の国際的承認についてのブタペスト条約及びそれに基く
規則（ブタペスト条約）の規定のもとに行われた。これ
は、寄託の日から30年間にわたる生存培養物の維持を保
証する。これらの微生物はブタペスト条約の規定のもと
にATCCにより入手可能にされ、そして関連する米国特許
の発行の後の無限定の入手可能性を保証する本件出願人
とATCCとの契約に従って入手可能にされるであろう。寄
託された微生物の入手可能性は、いずれかの政府の権威
のもとにその特許法に従って認められた権利に反してこ
の発明を実施することの許諾であると解してはならな
い。
要約すれば、この発明は、温度サイクル連鎖反応及び
熱安定酵素を用いる、１又は複数の特定の核酸配列を増
幅するための方法を提供し、この方法においては次のプ
ライマー伸長反応のための鋳型として機能し得る反応プ
ライマー伸長生成物が生成される。この方法は、最初に
非常に少量のみ存在する核酸配列を検出する場合、及び
配列特異的オリゴヌクレオチドを用いてヌクレオチド変
化を検出する場合に特に有用である。
この発明の方法は、増幅された生成物の収量の増加、
より高い特異性、及び増幅方法を行うのに必要な、従来
開示されていたのよりも少ない段階を提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドBSM13+中にサブクローニングされ
た約4.5kbのHind III I.アクアチクスDNA挿入部を含有
するプラスミドpFC83の制限地図である。 第２図は、プラスミドBSM13+中にサブクローニングされ
た約2.8kbのHind III−Asp718 T.アクアチクスDNA挿入
部を含有するプラスミドpFC85の制限地図である。 第３図は、テルムス・アクアチクス（Thermus aquaticu
s）由来の熱安定性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子
の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す。この図
中、第620位の塩基を含むHind III部位から第2500位の
塩基の近傍の翻訳終止コドン（End）の前までが第２図
に示すプラスミドpFC85に含まれるDNAポリメラーゼ（Ｃ
−末端側）コード領域に相当し、該Hind III部位から上
流のコード領域が第１図に示すプラスミドpFC83中のDNA
ポリメラーゼ（Ｎ−末端側）のコード領域に相当し、そ
して第３図の全コード領域がファージCH35:Taq＃４−２
のcDNA領域に含まれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３３６ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７４２１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７４２２ 審査前置に係属中 (72)発明者 グレン ホーン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94608, エミリービル，コモドアー ドライブ ７ (72)発明者 デビッド ハロー ゲルファント アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611, オークランド，ケルトン ドライブ 6208 (72)発明者 ランダル ケイヒ サイキ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94805, リッチモンド，サーティナインス ストリ ート 320 (72)発明者 フランシス クック ローヤー アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611, オークランド，サロニ ドライブ 6641 (72)発明者 スザンネ ストフェル アメリカ合衆国，カリフォルニア 94530, エル セリット，エルム コート 1008

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ファージCH35:Taq＃４−２（ATCC No.40,3
    36）中の挿入DNA領域中に存在し熱安定性DNAポリメラー
    ゼをコードしているDNA、及び該DNAの断片であってプラ
    スミドpFC85（ATCC No.67,422）中の約2.8kbのHindIII
    −Asp718挿入部内に存在し、全長熱安定性DNAポリメラ
    ーゼのＣ−末端側に相当する約60kDaの分子量を有する
    熱安定性DNAポリメラーゼ又は約66〜68kDaの分子量を有
    する熱安定性DNAポリメラーゼをコードしているDNA断
    片。
  2. 【請求項２】前記DNA断片がプラスミドpFC82又はpFC85
    中に存在する挿入部DNAであることを特徴とする、特許
    請求の範囲第１項に記載のDNA断片。
  3. 【請求項３】前記DNA断片が宿主生物におけるコード配
    列の発現に必要なDNA配列に作用可能に連結されてお
    り、該DNA配列が翻訳開始メチオニンをコードしている
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のDNA断
    片。
  4. 【請求項４】ファージCH35:Taq＃４−２（ATCC No.40,3
    36）中の挿入DNA領域中に存在し熱安定性DNAポリメラー
    ゼをコードしているDNA、又は該DNAの断片であってプラ
    スミドpFC85（ATCC No.67,422）中の約2.8kbのHindIII
    −Asp718挿入部内に存在し、全長熱安定性DNAポリメラ
    ーゼのＣ−末端側に相当する約60kDaの分子量を有する
    熱安定性DNAポリメラーゼもしくは約66〜68kDaの分子量
    を有する熱安定性DNAポリメラーゼをコードしているDNA
    断片を含んで成るベクター。
  5. 【請求項５】前記DNA断片がプラスミドpFC82又はpFC85
    中に存在する挿入部DNAであることを特徴とする、特許
    請求の範囲第４項に記載のベクター。
  6. 【請求項６】前記DNA断片が宿主生物におけるコード配
    列の発現に必要なDNA配列に作用可能に連結されてお
    り、該DNA配列が翻訳開始メチオニンをコードしている
    ことを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載のベクタ
    ー。
  7. 【請求項７】ファージCH35:Taq＃４−２（ATCC No.40,3
    36）中の挿入DNA領域中に存在し熱安定性DNAポリメラー
    ゼをコードしているDNA、又は該DNAの断片であってプラ
    スミドpFC85（ATCC No.67,422）中の約2.8kbのHindIII
    −Asp718挿入部内に存在し、全長熱安定性DNAポリメラ
    ーゼのＣ−末端側に相当する約60kDaの分子量を有する
    熱安定性DNAポリメラーゼもしくは約66〜68kDaの分子量
    を有する熱安定性DNAポリメラーゼをコードしているDNA
    断片を含んで成るベクターにより形質転換されている微
    生物。
  8. 【請求項８】前記DNA断片がプラスミドpFC82又はpFC85
    中に存在する挿入部DNAであることを特徴とする、特許
    請求の範囲第７項に記載の微生物。
  9. 【請求項９】前記DNA断片が宿主生物におけるコード配
    列の発現に必要なDNA配列に作用可能に連結されてお
    り、該DNA配列が翻訳開始メチオニンをコードしている
    ことを特徴とする特許請求の範囲第７項に記載の微生
    物。
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