JP5616905B2 - オーロラキナーゼb阻害剤治療に対する応答性を予見およびモニターするためのマーカー - Google Patents
オーロラキナーゼb阻害剤治療に対する応答性を予見およびモニターするためのマーカー Download PDFInfo
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Description
本願は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、2009年1月31日に出願された米国特許出願第61/148,957号明細書の利益を主張するものである。
本願は、これによってその全体が参照により本明細書に組み込まれている、EFS−Webを経由して提出された配列表を含む。前記ASCIIコピーは9700.txtと命名され、そのサイズは79キロバイトである。
第1の態様において、本発明は、オーロラキナーゼB阻害剤による治療に対する適格性に関して患者を分類する方法に関する。方法は、
a)患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
b)染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、および
c)染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子のコピー数増加の有無に基づき、患者をオーロラキナーゼB阻害剤による治療を受けるのに適格であると分類するステップ
を含む。
a)患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
b)染色体座7q21.1におけるABCB4遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、および
c)染色体座7q21.1におけるABCB4遺伝子のコピー数増加の有無に基づき、患者をオーロラキナーゼB阻害剤による治療を受けるのに適格であると分類するステップ
を含む。
a)現在少なくとも1種類のオーロラキナーゼB阻害剤により治療されている癌患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
b)染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
c)試験サンプルにおけるABCB1遺伝子のコピー数をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップおよび
d)ステップc)における比較に基づき、患者がオーロラキナーゼB阻害剤による治療を継続するべきかどうかを決定するステップ
を含む。
a)現在少なくとも1種類のオーロラキナーゼB阻害剤により治療されている癌患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
b)染色体座7q21.1におけるABCB4遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
c)試験サンプルにおけるABCB4遺伝子のコピー数増加の有無をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップおよび
d)ステップc)における比較に基づき、患者がオーロラキナーゼB阻害剤による治療を継続するべきかどうかを決定するステップ
を含む。
a)患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
b)染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
c)試験サンプルにおけるABCB1遺伝子のコピー数増加の有無をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップおよび
d)(i)染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子のコピー数増加の存在および(ii)試験サンプルにおけるコピー数増加がベースラインレベルまたは所定のレベルよりも高いかどうかに基づき、患者をオーロラキナーゼB阻害剤治療に耐性を有する癌であると分類するステップ
を含む。
a)患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
b)染色体座7q21.1におけるABCB4遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
c)試験サンプルにおけるABCB4遺伝子のコピー数増加の有無をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップおよび
d)(i)染色体座7q21.1におけるABCB4遺伝子のコピー数増加の存在および(ii)試験サンプルにおけるコピー数増加がベースラインレベルまたは所定のレベルよりも高いかに基づき、患者をオーロラキナーゼB阻害剤治療に耐性を有する癌であると分類するステップ
を含む。
(a)ABCB1遺伝子のコピー数増加の有無を決定するための試薬、
(b)試験を行うための取扱説明書
を含むキットに関する。
(a)ABCB4遺伝子のコピー数増加の有無を決定するための試薬、
(b)試験を行うための取扱説明書
を含むキットに関する。
本発明は、癌および腫瘍細胞のオーロラキナーゼB阻害剤治療耐性をモニターするための方法および組成物を提供する。本発明者らは、(i)染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子、(ii)染色体座7q21.1におけるABCB4遺伝子または(iii)染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子とABCB4遺伝子それぞれのコピー数増加の存在が、オーロラキナーゼB阻害剤による治療に対する耐性を伴うことを発見した。
(a)患者から得られた組織サンプルを準備するステップ、
(b)(i)ABCB1遺伝子、(ii)ABCB4遺伝子または(iii)ABCB1遺伝子とABCB4遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、および
(c)(i)ABCB1遺伝子、(ii)ABCB4遺伝子または(iii)ABCB1遺伝子とABCB4遺伝子のコピー数増加の欠如に基づいて、患者をオーロラキナーゼB阻害剤による治療に適格であると分類するステップ
を含む、患者をオーロラキナーゼB阻害剤による治療(単独療法か、併用療法の一部のいずれかとして)に適格であると同定または分類するための方法を含む。上の方法において、患者は、(i)ABCB1遺伝子、(ii)ABCB4遺伝子または(iii)ABCB1遺伝子とABCB4遺伝子のコピー数増加の存在に基づき、オーロラキナーゼB阻害剤による治療に(少なくとも単独療法としては)適格ではない可能性がある。試験サンプルを採取する患者は、癌と疑われるまたは癌と診断された患者とすることができる。さらに、本発明者らは、ABCB1遺伝子のコピー数増加が、MDR1ポリペプチドの発現増加と相関し、ABCB4遺伝子のコピー数増加がMDR3ポリペプチドの発現増加と相関することを見出した。
(a)患者から得られた試験サンプル(例えば、組織サンプル等)を準備するステップ、
(b)(i)ABCB1遺伝子、(ii)ABCB4遺伝子または(iii)ABCB1遺伝子とABCB4遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、および
(c)(i)ABCB1遺伝子、(ii)ABCB4遺伝子または(iii)ABCB1遺伝子とABCB4遺伝子のコピー数増加の存在に基づき、患者をオーロラキナーゼB阻害剤に耐性を有する癌であると分類するステップ
を含む、オーロラキナーゼB阻害剤による治療に耐性である癌を有する患者を同定または分類するための方法を含む。
(a)少なくとも1種類のオーロラキナーゼ阻害剤により治療されている癌患者から得られた試験サンプル(任意に、組織サンプルから得られた腫瘍または癌細胞が同定または抽出されてよい)を準備するステップ、
(b)試験サンプル(例えば、腫瘍または癌細胞における)における(i)ABCB1遺伝子、(ii)ABCB4遺伝子または(iii)ABCB1遺伝子とABCB4遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
(c)試験サンプル(腫瘍または癌細胞における等)から得られた(i)ABCB1遺伝子、(ii)ABCB4遺伝子または(iii)ABCB1遺伝子とABCB4遺伝子のコピー数増加をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップ、および
(d)ステップ(c)における比較に基づき、患者がオーロラキナーゼB阻害剤による治療を継続するべきかどうかを決定するステップ
を含む、オーロラキナーゼB阻害剤により治療されている患者をモニターするための方法を対象とする。具体的には、(i)ABCB1遺伝子、(ii)ABCB4遺伝子または(iii)ABCB1遺伝子とABCB4遺伝子のコピー数が増加した試験サンプル(例えば、腫瘍または癌細胞)がベースラインレベルまたは所定のレベルと同一またはより高い場合、その後オーロラキナーゼB阻害剤による治療は、(単独療法として単一で用いられていれば)中断、中止または終了されてよい。あるいは、治療医は、オーロラキナーゼB阻害剤を併用療法として、少なくとも第2の治療(例えば、第2の小分子による治療)と組み合わせることを決定できる。しかし、試験サンプル(例えば、腫瘍または癌細胞)から得られた(i)ABCB1遺伝子、(ii)ABCB4遺伝子もしくは(iii)ABCB1遺伝子とABCB4遺伝子のコピー数増加がベースラインレベルもしくは所定のレベルより少ない場合、または(i)ABCB1遺伝子、(ii)ABCB4遺伝子もしくは(iii)ABCB1遺伝子とABCB4遺伝子のコピー数増加が検出されない場合、その後オーロラキナーゼB阻害剤による治療は継続されてよい。また一方、前記治療により得られた結果次第で、治療医は、オーロラキナーゼB阻害剤を併用療法として少なくとも第2の治療(例えば、第2の小分子による治療)と組み合わせることを決定できる。
本節に用いられているような節の表題および本明細書における開示全体は、限定を目的としない。
「オーロラキナーゼB阻害剤」は、オーロラキナーゼBまたはオーロラBの少なくとも1種と結合し、オーロラキナーゼBまたはオーロラBに関連する核酸またはタンパク質の活性と拮抗する、小分子、抗体、アンチセンス、低分子干渉RNAまたはマイクロRNAに基づく化合物を含む、あらゆる種類(例えば、非選択的または選択的)の治療用化合物を意味する。例えば、多くのオーロラキナーゼB阻害剤は、ヒストンH3リン酸化または細胞分裂の少なくとも一方を阻害することが知られている。さらに、多くのオーロラキナーゼB阻害剤は、少なくとも1種類の細胞系(急性骨髄性白血病細胞系、原発性急性骨髄性白血病培養物等)におけるアポトーシスを誘導することが知られている。本発明の方法は、どの公知のまたは将来的に開発されるオーロラキナーゼB阻害剤にも有用である。オーロラキナーゼB阻害剤の例として、AZD1152、ZM447439、VX−680/MK0457およびヘスペラジンが挙げられる。
「%配列同一性を有するポリヌクレオチドから実質的になる」は、ポリヌクレオチドの長さは実質的に変わらないが、配列が実質的に異なり得ることを意味する。したがって、100ヌクレオチドの公知の配列「B」と少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチドから実質的になるポリヌクレオチド「A」は、ポリヌクレオチド「A」が約100ヌクレオチド(nt)長であるが、最大20ntが「B」配列と異なり得ることを意味する。問題のポリヌクレオチド配列は、目的の二次構造を形成するように実質的な非同一配列が付加される場合等、例えば特定の種類のプローブ、プライマーおよびその他の分子ツール等を作製するための1−15ヌクレオチドの付加等、末端の修飾のために長くなることも短くなることもできる。このような非同一ヌクレオチドは、配列が「から実質的になる」によって修飾される場合、配列同一性の計算に考慮されない。
「発現」は、機能的最終産物の生成を意味する。遺伝子の発現は、遺伝子の転写と、mRNAの前駆または成熟タンパク質への翻訳を含む。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質発現を抑制することのできるアンチセンスRNA転写産物の生成を意味する。「コサプレッション」は、同一または実質的に同様の外来または内因性遺伝子の発現を抑制することのできるセンスRNA転写産物の生成を意味する(米国特許第5,231,020号明細書)。
本明細書において、核酸分子またはポリヌクレオチドの文脈における用語「単離された」は、天然の核酸分子源またはポリヌクレオチド源に存在する他の核酸分子またはポリヌクレオチドから分離された核酸分子またはポリヌクレオチドを意味する。さらに、cDNA分子等、「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドは、組換え技法によって生成された場合は他の細胞性物質または培地を実質的に含まなくてよく、また化学的に合成された場合は前駆的化学物質または他の化学物質を実質的に含まなくてよい。一態様において、核酸分子またはポリヌクレオチドが単離される。
「遺伝子」は、コード配列の前(5’非コード配列)および後(3’非コード配列)に存在する調節配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。
「天然の遺伝子」は、それ自身の調節配列を備えた天然に存在する遺伝子を意味する。対照的に、「キメラコンストラクト」は、通常天然では一緒に存在しない核酸断片の組み合わせを意味する。したがって、キメラコンストラクトは、異なるソースに由来する調節配列およびコード配列を含むことも、同一ソースに由来する調節配列およびコード配列を含むこともできるが、通常天然に存在する配置とは異なる仕方で配置されている。
核酸配列に関する「パーセント(%)核酸配列同一性」は、候補配列における、目的配列におけるヌクレオチドと同一のヌクレオチドの比率として定義され、配列を整列し必要に応じてギャップを導入した後に最大のパーセント配列同一性を得る。%核酸配列同一性を決定するためのアライメントは、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウエア等、一般に利用できるコンピューターソフトウエアを用いた、当業者の技能範囲内の様々な方法により達成できる。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたって最大限のアライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズム等、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
%核酸配列同一性=W/Z*100
ここで、
Wは、配列アライメントプログラムまたはアルゴリズムによるCとDのアライメントによって同一マッチとして計数されたヌクレオチド数であり、
Zは、Dにおけるヌクレオチドの総数である。
「ポリメラーゼ連鎖反応」すなわち「PCR」は、一連の反復サイクルからなる、大量の特定DNAセグメントの合成のための技法である(Perkin Elmer Cetus Instruments、ノーウォーク、コネチカット州)。通常、二本鎖DNAが熱変性され、標的セグメントの3’境界に相補的な2種のプライマーが低い温度でアニーリングし、続いて中間の温度で伸長する。これら連続した3ステップの1セットをサイクルと言う。
「ポリヌクレオチド」は、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、修飾RNAもしくはDNAまたはRNAもしくはDNA模倣体(PNA等)ならびにそれらの誘導体およびホモログの核酸ポリマーである。したがって、ポリヌクレオチドは、天然の核酸塩基、糖およびヌクレオシド間共有結合(骨格)からなるポリマーと共に、同様に機能する非天然部分を有するポリマーを含む。このような修飾または置換された核酸ポリマーは本技術分野においてよく知られており、「アナログ」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは一般に、約10から最大約160または200ヌクレオチド由来の短いポリヌクレオチドである。
本明細書において、用語「ポリヌクレオチドアナログ」は、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を有するポリマーを意味する。修飾された骨格は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート等、リン原子を骨格に保持する骨格ならびに短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルの混合ヌクレオシド間結合または1もしくは複数種の短鎖へテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって生成された骨格等、リン原子を持たない骨格を含む。修飾核酸ポリマー(アナログ)は、1種以上の修飾糖成分を含むことができる。
本明細書において、用語「所定のレベル」は、アッセイ結果を所定のレベルに対して比較することによる診断結果の評価に用いられるアッセイのカットオフ値を一般に言い、所定のレベルは既に様々な臨床的パラメーター(例えば、リスク評価、疾病の重症度、進行/非進行/改善、試験サンプルの年齢決定、試験サンプル(例えば、血清または血漿)が溶血されたかの決定等)とリンクまたは関連している。本発明は、例示的な所定のレベルを提供し、本明細書に記載されている例示的なアッセイに関してこのようなレベルと臨床的パラメーターとの初期リンクまたは関連を説明する。しかし、カットオフ値がアッセイの性質に依存して変化し得ることはよく知られている。さらに、他のアッセイに本明細書における発明を適用して本明細書に基づきこれら他のアッセイに関するアッセイ特異的カットオフ値を得ることは、十分に当業者の通常の技能範囲内にある。
本明細書における「プローブ」または「プライマー」は、少なくとも8ヌクレオチドの長さであり、標的領域内の配列とプローブまたはプライマーにおける少なくとも一配列の相補性のため、標的配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドである。プローブのポリヌクレオチド領域は、DNAおよび/またはRNAおよび/または合成ヌクレオチドアナログからなることができる。好ましくは、プローブは、ポリメラーゼ連鎖反応において標的配列の準備に用いられる配列(単数または複数)と相補的な配列を含まない。
「組換え」は、例えば、化学合成による、または遺伝子工学的技法による核酸の単離セグメントの操作による、本来は別個である2種の配列セグメントの人工的な組み合わせを意味する。
「特異的にハイブリダイズする」は、核酸が第2の核酸と検出可能および特異的に結合する能力を意味する。ポリヌクレオチドは、非特異的核酸による相当量の検出可能な結合を最低限に抑えるハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で、標的核酸鎖と特異的にハイブリダイズする。
一本鎖DNAが相補断片とハイブリダイズする特異性は、反応条件のストリンジェンシーによって決定される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、DNA二本鎖が形成される傾向が減少するに従って増加する。核酸ハイブリダイゼーション反応において、特異的ハイブリダイゼーション(高ストリンジェンシー)に有利なストリンジェンシーが選択され得る。関連するが厳密に同じではないDNA分子(相同であるが同一ではない)またはセグメントを同定するために、特異性の低いハイブリダイゼーション(低ストリンジェンシー)が用いられてよい。
本明細書において、用語「対象」および「患者」は、対象が何らかの形の処置を受けたか現在受けているかに関わらず、互換的に用いられる。本明細書において、用語「単数の対象」および「複数の対象」は、哺乳動物(例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス、非ヒト霊長目(例えば、カニクイザル、チンパンジー等、サル)ならびにヒト)を含むがこれらに限定されない任意の脊椎動物を意味する。好ましくは、対象はヒトである。対象または患者は、生きていても死んでいてもよい。
「標的配列」または「標的核酸配列」は、例えば、ポリヌクレオチドプライマーまたはプローブを用いて増幅、検出またはその両方がなされる、遺伝子もしくは相補体またはそれらの断片を包含する核酸配列を意味する。さらに、標的配列という用語は二本鎖核酸配列を意味する場合もあるが、標的配列は一本鎖であってもよい。標的が二本鎖である場合、ポリヌクレオチドプライマー配列は、好ましくは標的配列の両方の鎖を増幅する。特定の生物に多かれ少なかれ特異的な標的配列が選択され得る。例えば、標的配列は、属全体、2以上の属、種もしくは亜種、血清群、栄養要求型、血清型、株、分離株または他の生物サブセットに特異的とすることができる。
「試験サンプル」は、対象または体液から採取された、標的配列を含み得るサンプルを意味する。試験サンプルは、例えば、組織、血液、唾液、痰、粘液、汗、尿、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、泌尿生殖器または肛門スワブ、結膜スワブ、眼球レンズ液、大脳脊髄液等、どのソースから採取されてもよい。試験サンプルは、(i)ソースから得られたものとして直接的に、または(ii)サンプル特性を改変するための前処理の後に用いられてよい。したがって、試験サンプルは、例えば、血液から血漿または血清を調製し、細胞またはウイルス粒子を破壊し、固形材料から液体を調製し、粘性のある液体を希釈し、液体をろ過し、試薬を添加し、核酸を精製すること等によって、使用前に前処理されてよい。
本明細書に用いられている用語「処理」、「処置」または「治療」は、(i)病態が発生するのを予防する(例えば、予防法)、(ii)病態を抑制またはその発症を妨げる、(iii)病態を緩和させるおよび/またはこのような病態を伴う1つ以上の症状を予防もしくは重症度を低減させる試みにおいて、項目(i)から(iii)の内いずれが対象で成功するかに関係なく、1種以上の活性薬剤または化合物を対象に投与することを意味する。
「変異型ポリヌクレオチド」または「変異型核酸配列」は、所定の核酸配列と少なくとも約60%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有するポリヌクレオチドを意味する。変異型は、天然のヌクレオチド配列を包含しない。
本発明において有用な核酸アッセイ法は、(i)無傷組織または細胞サンプルのin situハイブリダイゼーションアッセイ、(ii)組織サンプルから抽出された染色体DNAのマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイおよび(iii)組織サンプルから抽出された染色体DNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または他の増幅アッセイによる、コピー数増加の有無の検出を含む。これらの様式の内いずれかにおいて、ペプチド核酸等、核酸の合成アナログを用いたアッセイが用いられてもよい。
(i)ABCB1遺伝子、(ii)ABCB4遺伝子または(iii)ABCB1遺伝子とABCB4遺伝子の遺伝子発現レベルは、試験サンプル中の1種以上のmRNAの量を評価することによって決定され得る。サンプル中のmRNAを測定する方法は、本技術分野で公知のものである。mRNAレベルを測定するため、試験サンプル中の細胞が溶解され、本技術分野でよく知られている多様な方法によって、ライセートにおけるまたはライセートから精製もしくは粗精製されたRNAにおけるmRNAレベルが測定され得る。このような方法は、検出可能に標識したDNAまたはRNAプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ(すなわち、ノーザンブロッティング)または適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いた定量的または半定量的RT−PCRの手法を含む。あるいは、定量的または半定量的in situハイブリダイゼーションアッセイは、例えば組織切片または溶解されていない細胞懸濁液および検出可能な標識(例えば、蛍光または酵素標識)DNAまたはRNAプローブを用いて行われてよい。mRNAを定量するための追加的な方法は、RNAプロテクションアッセイ(RPA)、cDNAおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、representation difference解析(RDA)、ディファレンシャルディスプレイ、EST配列解析ならびに遺伝子発現連続解析(SAGE)を含む。
本明細書において前述した通り、本発明の試験サンプルは組織サンプルとすることができる。本発明の方法によってアッセイされるべき組織サンプルは、末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル、または末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルの内いずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプル等、どの種類を含むこともできる。例えば、患者の末梢血サンプルは、最初に上皮細胞集団を抽出するよう処理されて、続いてこの抽出物がアッセイされてよい。疑わしい腫瘍細胞が濃縮された細胞サンプルを得るための組織サンプルのマイクロダイセクションが用いられてもよい。本明細書における使用に好ましい組織サンプルは、末梢血や、細針生検サンプル、新鮮凍結組織およびパラフィン包埋組織等、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織ならびに骨髄である。
本発明は、試験サンプルにおける(i)ABCB1遺伝子、(ii)ABCB4遺伝子または(iii)ABCB1遺伝子とABCB4遺伝子のコピー数増加の有無を検出するためのキットも企図する。このようなキットは、上述のコピー数増加の有無を決定するための1種以上の試薬を含むことができる。例えば、前記キットは、1種以上の核酸プローブを含むことができる。あるいは、またはプローブに加えて、キットは1種以上の核酸プライマーを含むことができる。
例えば、米国特許第5,089,424号および第5,006,309号明細書に記載されているように、また例えば、Abbott Laboratories(アボットパーク、イリノイ州)からARCHITECT(登録商標)として市販されているように、構成要素および本明細書に記載されている方法を用いて(i)ABCB1遺伝子、(ii)ABCB4遺伝子または(iii)ABCB1遺伝子とABCB4遺伝子のコピー数増加の有無を決定する方法ならびにキット(またはその構成要素)は、様々な自動および半自動システム(固相が微粒子を含むシステム等)における使用に適応させることができる。
次の通り、提示のサプライヤーから抗体を購入した。Calbiochem(サンディエゴ,カリフォルニア州)からMDR1/P−糖タンパク質(カタログ番号517310)、Santa Cruz Biotechnology、Inc.(サンタクルーズ、カリフォルニア州)から抗BRCP抗体(カタログ番号sc−58222)、Cell Signaling Technology(ダンバース、マサチューセッツ州)から抗リン酸化ヒストンH3(Ser10)(カタログ番号9701)および抗ヒストンH3(カタログ番号9715)、BD Biosciences(フランクリン・レイクス、ニュージャージー州)からフィコエリトリン(PE)結合ヤギ抗マウスIgG(カタログ番号550589)およびPE結合抗ヒトCD44(カタログ番号555479)、Sigma Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)からβ−アクチン、Invitrogen(カールズバッド、カリフォルニア州)からAlexa Fluor680結合ヤギ抗ウサギIgG(カタログ番号A21109)ならびにRockland Immunochemicals、Inc.(ギルバーツビル、ペンシルベニア州)からIRDye800結合ロバ抗マウス(カタログ番号610−732−124)。Sigma Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)からパクリタキセルを購入し、Wenger Chemtech(リーエン、スイス)からPSC−833を購入し、Alexis Biochemicals Corporation(サンディエゴ、カリフォルニア州)からフミトレモルギンCを購入した。
American Type Culture Collection(ATCC;マナサス、バージニア州)からSW620、HCT−15およびAsPC1細胞系を入手し、ATCCの推奨に従って増殖させた。
Cytofix/Cytopermキット(カタログ番号554714、BD Biosciences(フランクリン・レイクス、ニュージャージー州)を用いたフローサイトメトリーにより、BCRPまたはヒトCD44の細胞表面発現の決定を行った。サンプルをBD LSR IIフローサイトメーターにかけ、BD FACSDivaソフトウエア(BD Biosciences、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州)を用いて解析した。
SW620ABCB1/3およびそれぞれの親細胞系を洗浄し、6ウェルプレート中の薬剤を含まない培地に500個/ウェルの細胞を播種した。次いで、24時間後、化合物をDMEMまたはRPMIで希釈し、細胞に添加し、これを37℃で7−10日間培養した。次いで、細胞を固定し、0.2%クリスタルバイオレットで染色して可視化し、コロニーを計数した。
全RNAを単離し、その5μgをAffymetrix、Inc.(サンタクララ、カリフォルニア州)による標準的なプロトコールを用いたマイクロアレイ解析に用いた。IVT標識化キットを用いて断片化した標識cRNAを合成し、高密度Affymetrixマイクロアレイ(AffymetrixヒトゲノムU133Aバージョン2.0)と45℃で一晩ハイブリダイズさせた。スキャンした画像および強度ファイルをRosetta Resolver遺伝子発現解析ソフトウエア、バージョン6.0(Rosetta Inpharmatics、カークランド、ワシントン州)に取り込んだ。ResolverのAffymetrixエラーモデルを適用し、反復を組み合わせた。発現プロファイルは、各細胞系の3種の独立したサンプルから得られたmRNAに由来する。
SW620およびSW620ABCB1/3細胞を洗浄し、薬剤を含まない培地で一晩増殖させた。ヒストンH3のリン酸化をモニターするため、細胞をAZD1152HQPAで90分間処理し、次に、ホスファターゼ阻害剤カクテル1および2ならびにプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma Aldrich(セントルイス、ミズーリ州))を添加したBiosource(カマリロ、カリフォルニア州)製の細胞抽出バッファー(カタログ番号FNN0011)中で速やかに抽出した。続いて、ライセートを10秒間探触子(probe)で超音波処理し、次に15,000g、15分間、4℃の遠心分離により清澄化した。SDSサンプルバッファーで処理した後、タンパク質抽出物をNuPAGE Bis−Tris4−12%ゲル(Invitrogen(カールズバッド、カリフォルニア州))で分離した。サンプルをPVDF膜(Invitrogen(カールズバッド、カリフォルニア州))へ電気的に転写させ、一次抗体と一晩インキュベートし、Pierce Dura−Signal化学発光試薬(Pierce、ロックフォード、イリノイ州)またはLI−COR Biosciences(リンカーン、ネブラスカ州)製のOdyssey赤外線イメージングシステムを用いて撮像した。
SW620およびSW620ABCB1/3細胞を洗浄し、薬剤を含まない培地で一晩増殖させた。次に、細胞を1μM AZD1152HQPAで4時間処理した。サイトゾルにおける薬剤蓄積をLC−MS分析により決定した。すなわち、細胞をPBSで1回リンスし、細胞溶解バッファー中で抽出した。培地、PBS洗浄液および細胞ライセートを2容の酸性化MeOHで処理した。次に、15000g、15分間、4℃で遠心分離することによって、粗全細胞ライセートを清澄化し、不溶性細胞ペレットとサイトゾルを得た。不溶性細胞ペレットを50%アセトニトリルで1:10希釈し、11,000gで5分間遠心分離した。純粋化合物から作成した検量線と比較して、各画分におけるAZD1152HQPA濃度を決定した。
4種それぞれのsiRNA(ABCB1;カタログ番号LQ−003868、ABCB4;カタログ番号LQ−007302−00)およびルシフェラーゼsiRNA陰性対照(5’−AACGUACGCGGAAUACUUCGA−3’(配列番号3)の解析されたON−TARGETplus SMARTpoolをDharmacon、Inc.(ラファイエット、コロラド州)から購入した。SW620およびSW620ABCB1/3細胞を洗浄し、1ウェル当たり30,000細胞で24ウェルプレートに播種し、一晩付着させた。翌日、Lipofectamine2000(Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州)を用いて、メーカーの取扱説明書に従って細胞を1オリゴ当たり最終濃度25nMのsiRNAオリゴでトランスフェクトした。トランスフェクション48時間後に細胞を回収した。
RNeasy Mini Kit(Qiagen、バレンシア、カリフォルニア州)を用いて細胞系から全細胞RNAを単離し、UV吸光度分光法により定量した。Qiagen製の(OneStep RT−PCRキット)を用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を行った。オーロラBプライマー(フォワードプライマー:5’−GGAGAGTAGCAGTGCCTTGGACC−3’(配列番号4)およびリバースプライマー:5’−AGGAGGAGGTAGAAAACAGATAAGGGAAC−3’(配列番号5))をPCR増幅に用いた。オーロラBネステッドプライマー(フォワードプライマー:5’−AGTGCCTTGGACCCCAGCTCTC−3’(配列番号6)およびリバースプライマー:5’−GAAAACAGATAAGGGAACAGTTAGGGATC−3’(配列番号7))をBigDye Terminator v3.1サイクル配列解析キット(Applied Biosystems、フォスターシティー、カリフォルニア州)による直接配列解析に用いた。Abbott LaboratoriesのDNA配列解析実験室がDNA配列解析を行った。すなわち、Applied Biosystems Big Dye(商標)Terminatorバージョン3.1サイクル配列解析試薬を用いて、メーカー推奨のプロトコール(P/N4337035)に従ってRT−PCR産物の直接配列解析を行った。配列解析用プライマーは、5プライムおよび3’プライム増幅プライマーとそれぞれ10および11塩基が内部で入れ子形成している。3130xl Genetic Analyzerにおいて50cmアレイおよびPOP−7(商標)ポリマーを用いて、蛍光標識配列解析産物の電気泳動を行った。KBベースコーラーを用いたSequence Analysisバージョン5.2により、ベースコーリングを行った。
DNAeasyキット(Qiagen、バレンシア、カリフォルニア州)を用いてゲノムDNAを単離し、100K SNP遺伝子型決定アレイセット(Affymetrix、サンタクララ、カリフォルニア州)にかけた。メーカーのプロトコールに従ってアレイを行った。マイクロアレイ生データファイルをGene Expression Omnibus(受託番号GSE7068)(Gene Expression Omnibusは、MIAME対応データ寄託を支持する遺伝子発現/分子存在量のレポジトリおよび遺伝子発現データの走査、問い合わせおよび検索の監督されたオンライン提供のことである)およびArray Express(受託番号E−MEXP−1008)(ArrayExpressは、MGED推奨に従ってMIAMEおよびMINSEQE対応データ保存を目的とする、トランスクリプトミクスデータの公共のレポジトリである。ArrayExpress Warehouseは、レポジトリにおける実験の監督されたサブセット由来の遺伝子指標の発現プロファイルを保存する。)にロードした。GTYPEソフトウエア(Affymetrix、サンタクララ、カリフォルニア州)を用いてデータ処理し、各プローブセット(SNP)の推定コピー数の情報を含むコピー数(.cnt)ファイルを作成した。この.cntファイルは、セット内の両方のアレイから組み合わせた情報を含んでいた。社内開発されたUNIX(登録商標)ベースのソフトウエアパッケージ(Olejniczakら、Mol.Can.Res.、5(4):331−339(2007)を参照)であるGeneWalkerを用いてファイルを解析した。
Charles River Laboratories(ウィルミントン、マサチューセッツ州、米国)から5−6週齢のC.B.−17scid−bg(scid−bg)またはC.B.−17scid(scid)マウスを入手し、8週齢を超えたおよび/またはサイズが約20グラムを超えたときに実験に用いた。全動物実験は、American Association of Laboratory Animal Care認定のInternal Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)に従って、米国農務省動物保護法による基準、動物実験の人道的管理と使用に関する公衆衛生局規範および実験動物の福祉に関するNIH指針を満たすまたはそれに勝る条件下で、特定の無病原体環境で行った。明らかな脱水の兆候、毛づくろいの不足、嗜眠、15%を超える体重減少および体重の20%を超える腫瘍体積は、腫瘍エンドポイントの決定に用いた。
オーロラキナーゼ阻害剤の活性を無効にするために癌細胞が細胞自律的に利用できる潜在的なメカニズムを明らかにするため、AZD1152、AZD1152HQPAの活性アルコールに生来耐性を有する細胞系を作製する試みがなされた。1μM AZD1152HQPA(約50倍のIC50)の存在下、3ヶ月の期間SW620結腸癌細胞を増殖させた。5代継代後、0.01%未満の細胞がこの処理で生存していた(データなし)。初期選別期に生存していた細胞は、1μM AZD1152HQPAの存在下さらに3ヶ月間維持するか、または薬剤なしで同じ期間増殖させた。次に、親細胞および薬剤耐性細胞の全ゲノムマイクロアレイ解析を行って、AZD1152HQPA耐性と相関する可能性のある遺伝子発現の変化を同定した。薬剤耐性SW620派生体(以後、SW620ABCB1/3と呼ぶ)において、MDR1をコードするABCB1はアレイにおいて最も高度に過剰発現した遺伝子であり、これは2種類の異なるプローブセットによって同定された(図1A、挿入図)。SW620ABCB1/3において、ABCB1ほどではないが、第2の遺伝子であるMDR3をコードするABCB4もまた上方制御されることも観察された。公知の小分子トランスポーターをコードする遺伝子セットの中で、高度にディファレンシャルな発現を示すのはABCB1およびABCB4の2種だけであった(図1A)。7番染色体長腕の共通ゲノム遺伝子座(7q21.1)内にこれらの遺伝子が並んで存在することを考慮すると、ABCB1とABCB4の明らかな同時上方制御は興味深い。このことは、ABCB1およびABCB4を含むゲノム領域が、AZD1152HQPA選択の間に増幅され、これらトランスポーター遺伝子のタンデムな過剰発現をもたらした可能性があることを示唆する。比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)解析により、親系統SW620と比べてSW620ABCB1/3においてABCB1(5コピー)とABCB4(3コピー)両方のDNAコピー数の増加が観察された(図1B)。SW620ABCB1/3において、両方の遺伝子のコピー数変化は、培地からAZD1152HQPAを退薬した後3ヶ月間維持され(図1B)、これは耐性の表現型が遺伝子増幅と一致する持続的な遺伝的事象を伴うことを示した。MDR1は、AZD1152HQPAの存在下で増殖した細胞においてタンパク質レベルで高度に上方制御され、選択圧がなくなった後であっても持続した(図1C)。
Claims (12)
- オーロラキナーゼB阻害剤治療に対する適格性に関して患者を分類するためのデータを提供する方法であって、
a)患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
b)染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、および
c)染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子のコピー数増加の有無に基づき、患者をオーロラキナーゼB阻害剤による治療を受けるのに適格であると分類するためにb)で得られたデータを提供するステップであって、染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子のコピー数増加が存在するときは、癌治療のためのオーロラキナーゼB阻害剤による治療に適格ではないと分類するステップ
を含む、方法。 - オーロラキナーゼB阻害剤により治療されている癌患者をモニターするためのデータを提供する方法であって、
a)現在少なくとも1種類のオーロラキナーゼB阻害剤により治療されている癌患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
b)染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
c)試験サンプルにおけるABCB1遺伝子のコピー数をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップであって、前記ベースラインレベルはオーロラキナーゼB阻害剤治療の開始時に患者から採取したサンプル中のABCB1遺伝子のコピー数を参照し、前記所定のレベルは癌の進行に関連するアッセイのカットオフ値を参照するステップ、および
d)ステップc)における比較に基づき、患者がオーロラキナーゼB阻害剤による治療を継続すべきかどうかを決定するためにステップc)で得られたデータを提供するステップであって、前記試験サンプルが前記ベースラインレベルもしくは前記所定のレベルより低い染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子のコピー数の増加を有するときまたはコピー数が検出されないときは、オーロラキナーゼB阻害剤による患者の治療を継続し、前記試験サンプルが前記ベースラインレベルもしくは前記所定のレベルと同等または前記ベースラインレベルもしくは前記所定のレベルより高い染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子のコピー数の増加を有するときは、オーロラキナーゼB阻害剤による患者の治療を中止するか、または併用療法として少なくとも一つの第2の治療を組合せるステップ
を含む、方法。 - オーロラキナーゼB阻害剤による治療に耐性である癌を有する患者を分類するためのデータを提供する方法であって、
a)患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
b)染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
c)試験サンプルにおけるABCB1遺伝子のコピー数増加の有無をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップであって、前記ベースラインレベルはオーロラキナーゼB阻害剤治療の開始時に患者から採取したサンプル中においてABCB1遺伝子のコピー数を参照し、前記所定のレベルは癌の進行に関連するアッセイのカットオフ値を参照するステップ、および
d)(i)染色体座7q21.1におけるABCB1遺伝子のコピー数増加の存在および(ii)試験サンプルにおけるコピー数増加がベースラインレベルまたは所定のレベルよりも高いかどうかに基づき、患者をオーロラキナーゼB阻害剤治療に耐性である癌を有すると分類するためにステップc)において得られたデータを提供するステップ
を含む、方法。 - オーロラキナーゼB阻害剤がAZD1152、ZM447439、VX−680/MK0457またはヘスペラジンである、請求項1、2または3の方法。
- 試験サンプルが組織サンプルを含む、請求項1、2または3の方法。
- 組織サンプルが、末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル、または末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルの内のいずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプルを含む、請求項5の方法。
- 決定ステップ(b)がin situハイブリダイゼーションにより行われる、請求項1、2または3の方法。
- in situハイブリダイゼーションが、(a)蛍光標識した核酸プローブ、(b)少なくとも2種の核酸プローブまたは(c)ペプチド核酸プローブを用いて行われる、請求項7の方法。
- 決定ステップ(b)が、ポリメラーゼ連鎖反応または核酸マイクロアレイアッセイにより行われる、請求項1、2または3の方法。
- 癌が結腸直腸癌または膵癌である、請求項1、2または3の方法。
- ABCB1遺伝子におけるコピー数増加の存在がMDR1ポリペプチドの発現増加と相関する、請求項1、2または3の方法。
- 患者が、化学療法、放射線照射またはそれらの組み合わせによっても治療されている、請求項1、2または3の方法。
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