KR960016559B1 - 써머스 아쿠아티쿠스로부터의 정제된 열안정성 dna 폴리머라제효소, 이를 암호화하는 dna 서열 및 이를 사용한 핵산 서열의 증폭, 검출 및 클로닝 방법 - Google Patents

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요약없음

Description

써머스 아쿠아티쿠스로부터의 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제효소, 이를 암호화하는 DNA 서열 및 이를 사용한 핵산 서열의 증폭, 검출 및 클로닝 방법
제1도는 플라스미드 BSM 13+내로 아클로닝된 ~4.5kb Hind Ⅲ 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) DNA 삽입부를 함유하는 플라스미드 pFC 83의 제한부위 지도이다.
제2도는 플라스미드 BSM 13+내로 아클로닝된 ~2.8kb Hind Ⅲ : Asp 718 써머스 아쿠아티쿠스 DNA 삽입부를 함유하는 플라스미드 pFC 85의 제한부위지도이다.
본 발명은 정제된 열안정성 효소에 관한 것이다. 한가지 양태로 본 효소는 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터 정제된 DNA 폴리머라제로서 이의 분자량은 약 86,000 내지 90,000이다.
본 발명은 시험 샘플중에 존재하는 경우 현 핵산 서열을 증폭하고 이들을 탐침을 사용하여 검출하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 본 반응을 촉매하는 열안정성 효소를 사용하여 DNA 또는 RNA의 주어진 서열중 어떠한 특정 핵산 서열도 용이하게 검출될 수 있도록 특정 핵산 서열을 처음 존재량에 비해 많은 양으로 생성하는 방법에 관한 것이다. DNA 또는 RNA는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있으며 비교적 순수한 종(species) 또는 핵산 혼합물중의 한 성분으로 존재할 수 있다. 본 발명의 방법은 반복 반응을 사용하여 목적하는 핵산 서열의 증폭을 달성한다.
이. 콜라이(E. coli)와 같은 증온균으로부터의 DNA 폴리머라제의 분리 방법에 관한 광범위한 연구가 수행되어 왔다[참조 : 예를들면, Bessman et al., J. Biol. Chem.(1957) 233 : 171-177 및 Buttin and Kornberg(1966) J. Biol. Chem 241 : 5419-5427].
대조적으로, 써머스 아쿠아티쿠스와 같은 고온균으로부터의 DNA 폴리머라제의 분리 및 정제에 관한 연구는 거의 수행되지 않았다. 문헌[Kaledin et al., Biokhymiya(1988) 45 : 644-651]에는 티. 아쿠아티쿠스(T. aquaticus) YT1 균주의 세로로부터의 DNA 폴라머라제의 6-단계분리 및 정제 과정이 기술되어 있다. 이 여섯단계로는 조 추출물의 분리단계, DEAE-셀룰로즈 크로마토그래피 단계, 하이드록시 아파타이트상에서의 분획화 단계, DEAE-셀룰로즈상에서의 분획화단계, 및 일본쇄 DNA-셀룰로즈상에서의 크로마토그래피 단계가 포함된다. 각 단계로부터 생성된 풀(pool)에서 오염물인 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제를 스크리닝 하지 않았다. 정제된 효소의 분자량은 단량체 단위당 62,000 달톤으로서 보고되어 있다.
티. 아쿠아티쿠스로부터의 폴리머라제의 제2정제 방법이 문헌[A. Chien et al., J. Bacteriol.(1976) 127 : 1550-1557]에 기술되어 있다. 이 방법에서는 조 추출물을 DEAE-세파덱스 컬럼에 적용시킨다. 그런 다음 투석하여 모든 분획을 포스포셀룰로즈 컬럼상에서 처리한다. 모은 분획을 투석하고 소 혈청 알부민(BSA)을 가하여 폴리머라제의 활성이 상실되지 않도록 한다. 생성된 혼합물은 DNA-셀룰로즈 컬럼상에 부하한다. 칼럼으로부터 모은 물질을 투석하고 겔 여과로 분석한 결과 분자량은 약 63,000 달톤이며 자당 구배 원심분리한 결과 분자량은 약 68,000 달톤으로 나타났다.
현 핵산 서열을 초기 존재량에 비해 많은 양으로 증폭시키기 위해 열안정성 효소를 사용하는 것은 1986년 12월 10일자로 공고된 유럽 특허 공보 제 200,362호에 제시되어 있다. 변성 단계, 주형 본쇄의 합성 단계 및 하이브리드화 단게를 포함하는 이 방법에서는 프라이머, 뉴클레오티드 트리포스페이스, 및 폴리머라제가 사용되고 있다. 각 프라이머의 연장 산물이 목적하는 핵산 서열을 생성하기 위한 주형이 된다. 상기 특허 공보에는 사용된 폴리머라제가 열안정성 효소일 경우엔 열의 작용으로 이 효소의 활성이 파괴되지 않기 때문에 각각의 변성 단계 후마다 폴리머라제를 가할 필요가 없다고 기술되어 있다. 정제된 열 안정성 DNA 폴라이머제를 사용할 경우 달리 유리한 점은 제시되어 있지 않다. 증폭 및 검출방법은 또한 문헌[Saiki et al., Science, 230 : 1350-1354(1985), 및 Saiki et al., Bio/Technology, 3 : 1008-1012(1985)]에 기술되어 있다.
따라서, 상술한 진단적 증폭방법을 개선시키기 위해 사용할 수 있는 정제되고 안정된 열안정성 효소를 생성하는 것이 당해 분야의 바람이다.
따라서, 본 발명은 핵산 주형 본체에 상보적인 핵산 본쇄를 형성하도록 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하는 정제된 열안정성 효소를 제공한다. 바람직하게는 정제된 효소는 써머스 아쿠아티쿠스로부터의 DNA 폴리머라제이며 분자량은 약 86,000 내지 90,000 달톤이다. 이와같이 정제된 물질은 주어진 핵산서열로부터 핵산 서열을 초기 존재량에 비해 많은 양으로 생성하여 핵산 서열을 쉽게 검출할 수 있는 온도-주기 증폭 반응에 사용할 수 있다.
써머스 아쿠아티쿠스로부터의 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 암호화하는 유전자도 또한 동정되었으며 본 발명의 열안정성 효소를 분리할 수 있는 또다른 방법을 제공한다. 약 86,000 내지 90,000 달톤의 효소를 암호화하는 유전자 이외의 DNA 폴리머라제 활성을 암호화한 유전자 유도체가 또한 제시되어 있다.
마지막으로, 본 발명은 또한 하나 이상의 비이온성 중합체 세정제를 함유하는 완충용액중에 상술한 정제된 열안정성 효소를 포함하는 안정한 효소 조성물을 제공한다.
정제된 효소 뿐만 아니라 DNA 재조합 기술에 의해 생성된 효소는 열안정성이 없는 클레노우(Klenow) 단편보다 훨씬 더 특이성을 제공한다. 이외에도, 정제된 효소 및 재조합 기술에 의해 생성된 효소는 dTTP 또는 다른 뉴클레오티드 트리포스페이트가 DNA 주형과의 배향 혼합물중에 존재하지 않을 경우 기대되는 적당한 활성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 효소는 선행 문헌에 기술된 써머스 아쿠아티쿠스로부터의 열안정성 효소의 pH 프로필에 비해 보다 더 광범위한 pH 프로필을 나타내며, pH 7 내지 pH 8에서 50% 이상의 활성도를 나타낸다. 또한, 본 발명의 열안정성 효소는 비-이온성 세정제를 함유한 완충용액중에 저장할 수 있을만큼 안정하며 저장기간동안 활성을 상실하지 않는다.
본 발명은 프라이머 및 열안정성 효소를 사용하여 핵산 및 이의 혼합물중에 존재하는 하나 이상의 특정 핵산 서열을 증폭하는 방법을 제공한다. 한 프라이머를 다른 프라이머에 하이브리드화 시킬 때, 이의 연장산물은 목적하는 특정 핵산 서열을 생성하기 위한 주형이 되며, 역으로도 가능하며 이 공정을 필요한 만큼 반복하여 목적량의 서열을 생성한다. 본 발명의 방법은 특이성을 개선시켜 증폭된 핵산의 아주 독특한 시그널을 생성한다. 또한, 본 발명의 방법으로 각각의 증폭주기후에 한 용기로부터 다른 용기로 시약을 옮길 필요가 없다. 이러한 전달 작업이 필요치 않은 이유는 당해 열안정성 효소가 핵산 본쇄를 변성시키는데 요구되는 고온에 견딜 수 있기 때문에 열안정성 효소를 대체할 필요가 없기 때문이다. 또한 온도주기를 자동화하여 증폭반응을 수행하는데 필요한 인력 및 반응 단계를 줄일 수 있다.
더욱 특히, 본 발명은 (a) 각각의 핵산 분쇄를, 각각의 프라이머가 그의 상보적인 핵산 본쇄와 하이브리드화 되도록 촉진시키는 온도에서, 증폭될 상이한 특정서열 각각에 대한 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트 및 1개의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각각의 특정 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것으로 선택하여, 하나의 프라이머로부터 합성된 연장 산물이 그의 상보물로부터 분리되는 경우에 다른 프라이머의 연장 산물의 합성을 위한 주형으로서 작용할 수 있도록 한다) ; (b) 각각의 핵산 본쇄를 단계(a)와 동시에 또는 단계(a) 이후에, 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 각 핵산의 본쇄 각각에 대해 상보적인 연장 산물을 생성하도록 하는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계 ; (c) 단계(b)에서 얻은 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 증폭될 상이한 서열 각각에 대한 핵산 본쇄 주형 각각에 상보적인 프라이머 각각의 연장 산물을 합성하기에 효과적이지만 각 연장산물이 그의 상보적인 본쇄 주형으로부터 분리될 만큼 높지않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계 ; (d) 단계(c)의 혼합물을, 프라이머 연장 산물을 이들이 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성시키기에 효과적이나, 효소를 비가역적으로 변성시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 가열시키는 단계 ; (e) 단계(d)의 혼합물을, 각 프라이머가 단계(d)에서 생성된 일본쇄 분자 각각과 하이브리드화되도록 하기에 효과적인 온도로 냉각시키는 단계 ; (f) 단계(e)의 혼합물을 , 효소의 활성을 증진시키고 증폭될 상이한 서열 각각에 대한 단계(d)에서 생성된 핵산 본쇄 주형 각각에 상보적인 각 프라이머의 연장 산물을 합성하기에 효과적이나, 각 연장 산물이 그의 상보적인 본쇄 주형으로부터 분리될 만큼 높이지는 않은 온도에서 효과적인 시간 동안 유지시키는 단계[이때, 단계(e) 및 (f)는 동시에 수행하거나 연속적으로 수행한다]를 포함하는, 핵산 또는 핵산의 혼합물(여기서, 핵산이 이본쇄일 경우에 길이가 같거나 다른 별도의 상보적인 본쇄 2개로 이루어진다)에 함유된 하나 이상의 특정 핵산 서열을 증폭시키는 방법을 제공한다.
단계(d),(e) 및 (f)는 목적하는 수준의 서열 증폭이 수즉될때까지 반복할 수 있다. 본 발명에서의 바람직한 열안정성 효소는 써머스 아쿠아티쿠스로부터 추출된 폴리어마제(Taq 폴리머라제)이다. 가장 바람직하게는, 당해 효소가 Taq 폴리머라제일 경우, 단계(a)에서, 핵산 본쇄를 마그네슘염 약 1.5 내지 2mM, 각각의 뉴클레오티드 150 내지 200μM, 및 각각의 프라미어 1μM를 함유한 완충용액과 접촉시키고, 단계(a),(e) 및 (f)는 약 45 내지 58℃에서 수행하며, 단계(d)는 약 90 내지 100℃에서 수행한다.
바람직한 국면에서, 핵산은 이본쇄이며, 단계(a)는 (ⅰ) 각각의 핵산을 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트 및 증폭될 각각의 상이한 특정 서열에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 존재하에, 각각의 핵산을 변성시키기에 유효한 온도에서 이에 유효한 시간동안 가열하고(여기에서, 각각의 프라이머는 각 특성 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것을 선택하여야 하나의 프라이머로부터 합성된 연장 산물이 이의 상보 서열로부터 분리된 경우, 다른 프라이머의 연장 산물을 합성하기 위한 주형으로서 작용할 수 있다), (ⅱ) 변성된 핵산을, 각 프라이머를 이의 상보적인 핵상 본쇄에 하이브리드화 시키는 것을 촉진시키는 온도로 냉각시킴으로써 수행한다.
다른 국면에서, 본 발명은 상기 언급된 단계(a) 내지 (f)를 수행하여 존재할 수 있는 특정 핵산 서열을 양적으로 증폭시킨 다음(g) 검출될 각각의 서열에 대해 언급된 서열 또는 이의 변이 서열에 하이브리드화할 수 있는 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 단계(f)의 생성물에 가하는 단계 ; 및 (h) 언급한 하이브리드화가 일어났는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 핵산 또는 핵산의 혼합물을 함유하는 샘플(여기에서, 상기 샘플은 하나 이상의 특정 핵산 서열(들)을 함유하는 것으로 추정되며, 핵산(들)이 이본쇄일 경우 이들은 각각 길이가 동일하거나 상이한 두 개의 분리된 상보적 본쇄로 이루어진다)내에서 하나 이상의 특정 핵산 서열의 존재 여부를 탐지하거나, 언급된 샘플중에서 두 개의 상이한 서열을 구별하는 방법을 제공한다.
또다른 국면에서, 본 발명은 상기 언급된 단계(a) 내지 (f)를 수행하고 여기에서, 단계(d),(e) 및 (f)는 존재할 수 있는 서열을 함유하는 핵산을 검출할 수 있을만큼 증폭시키기에 충분한 회수만큼 반복하고, (g) 단계(f)의 생성물을 세포막에 부착시키는 단계 ; (h) 이러한 막을 하이브리드화 조건하에서, 탐침의 서열이 증폭된 서열 영역에 상보적인 경우에만 증폭된 핵산 서열과 하이브리드화 할 수 있는 표지된 서열-특이적 올리고뉴클레이티드 탐침으로 처리하는 단계 ; 및 (ⅰ) 탐침이 핵산 샘플중의 증폭된 서열에 하이브리드화 되었는지를 탐지하는 단계를 추가로 포함하는, 샘플내에 함유된 하나 이상의 핵산 서열(여기에서, 핵산이 이본쇄일 경우, 이는 길이가 동일하거나, 동일하지 않은 두개의 분리된 상보 본쇄로 이루어진다)중에 하나 이상의 뉴클레오티드 서열이 변형되었는지의 여부를 탐지하는 방법을 제공한다.
샘플이 세포를 포함하는 경우, 바람직하게는 세포를 단계(a) 전에 가열하여 세포내 핵산의 시약에 노출되도록 한다. 이 단계로 인해 시약을 가하기 전에 핵산을 추출할 필요가 없다.
본 발명의 변형된 방법으로, 프라이머(들) 및/또는 뉴클레오티드 트리포스페이트를 표지하여 생성된 증폭 서열이 표지되도록 한다. 표지된 프라이머(들) 및/또는 뉴클레오티드 트리포스페이트(들)는 초기에 반응혼합물중에 존재할 수 있거나 나중의 주기동안 반응 혼합물중에 가할 수 있다. 서열-특이적 올리고뉴클레오티드(비표지된)를 세포막에 부착시키고 하이브리드화 조건하에 표지된 증폭 생성물로 처리하여 단지막-결합된 서열이 증폭 생성물중에 존재할 경우에만 하이브리드화가 일어나게 한다.
또다른 국면에서, 본 발명은 상기 언급된 단계(a) 내지 (f)를 수행하고 여기에서, 단계(d),(e) 및 (f)는 당해 서열(들을 함유하는 핵산을 검출할 수 있도록 증폭시키기에 충분한 회수로 반복하고, (g) 단계(f)의 생성물에 각각의 제한부위에 대한 제한효소를 가하여 제한부위에서의 절단된 생성물을 수득하는 단계 ; 및 (h) 특정 서열을 함유하는 단계(g)의 절단된 생성물(들)을 프로모터 및 선별용 마이커(mwrker)를 함유하는 하나 이상의 클로닝 벡터내로 클로닝 되도록 연결하는 단계를 추가로 포함하여, 핵산 또는 핵산의 혼합물(여기에서, 핵산(들)이 이본쇄일 경우, 핵산은 두 개의 분리된 상보 본쇄로 이루어지며, 핵산(들)은 클로닝 전에 양적으로 증폭된다)중에 함유된 하나 이상의 특정 핵산 서열을 클로닝 벡터내에 클로닝 시키는 방법을 제공한다.
마지막 국면에서, 본 발명은 상기 언급된 단계(a) 내지 (f)를 수행하고 여기서, 단계(d),(e) 및 (f)는 하나 이상의 클로닝 벡터내로의 평활말단 연결을 위해 특정 서열을 함유하는 핵산(들)을 효과적으로 증폭시키기에 충분한 회수만큼 반복하고, (g) 단계(f)로부터 수득되어 클로닝될 증폭될 특정 서열(들)을 리가제의 존재하에 언급된 하나 이상의 클로닝 벡터내로 연결하는 단계(여기서, 언급된 증폭된 서열(들) 및 벡터(들)는 연결시키기에 충분한 양으로 존재한다)를 추가로 포함하여, 핵산 또는 핵산의 혼합물(여기에서, 핵산(들)은 이본쇄일 경우 길이가 동일하거나 동일하지 않은 두개의 분리된 상보 본쇄로 이루어지며, 핵산(들)은 클로닝 전에 양적으로 증폭된다)중에 함유된 하나 이상의 특정 핵산 서열을 클로닝 벡터내로 클로닝시키는 방법을 제공한다.
생성물 국면에서, 본 발명은 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트 및 증폭된 각각의 상이한 특정 서열에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유하는(여기에서, 각각의 프라이머는 각각의 특정 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것으로 선택하여 하나의 프라이머로부터 합성된 연장 생성물이 이의 상보 서열로부터 분리되었을 경우 다른 프라이머의 연장생성물의 합성에 대한 주형으로서 작용할 수 있다), 핵산 또는 핵산의 혼합물내에 함유된 하나 이상의 특정 핵산 가열을 증폭시키는데 유용한 조성물을 제공한다.
또다른 생성물 국면에서, 본 발명은 핵산(들)내에 함유된 특정핵산 서열의 다중 본쇄를 포함하는, 하나 이상의 핵산의 샘플을 제공한다. 이 샘플은 양 10 내지 100개의 본쇄, 약 100 내지 1000개의 본쇄, 또는 약 1000개 이상의 본쇄를 함유할 수 있다.
마지막 생성물 국면에서, 본 발명의 증폭방법에 의해 생성된 서열의 많은 복제물을 포함하는, 핵산 또는 핵산의 혼합물로부터 증폭된 핵산 서열을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상용할 수 있으며 이러한 모든 명칭은 후손을 내포한다. 그러므로 용어 "형질전환체" 또는 "형질전환된 세포"는 일차 대상 세포 및 전달수와는 상관없이 이들 세포로부터 파생된 배양물을 포함한다. 또한 모든 후손은, 인위적이거나 자연적인 돌연변이 인하여 DNA 내용물이 정확히 동일하지는 않을수도 있을 인지해야 한다. 최초의 형질전환된 세포를 스크리닝하였을 때 이들과 동일한 기능을 갖는 돌연변이체 후손이 포함되어 있다.
용어 "조절 서열"은 특정 숙주 유기체내의 자동적으로 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵 세포에 적합한 조절 서열은 예를들면, 프로모터, 임의의 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위, 및 현재까지 빈약하게 밝혀진 가능한 다른 서열을 함유한다. 진핵세포는 프로모토, 폴리아데닐화 시그날, 및 인핸서(enhancer)를 사용하는 것으로 알려져 있다.
용어 "발현 시스템"은 목적하는 함호화 서열, 및 이에 작동적 가능하게 연결된 조절 서열을 함유하는 DNA 서열을 의미하므로 이들 서열로 형질전환된 숙주는 암호화된 단백질을 생성할 수 있다. 형질 전환시키기 위해서는, 발현 시스템이 벡터상에 포함될 수 있지만, 이때 관련된 DNA는 또한 숙주 염색체내에 이입시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 회수가능한 생 활성 폴리펩타이드 또는 전구체를 암호화하는 DNA 서열을 의미한다. 폴리펩타이드는 완전한 길이의 유전자 서열에 암호화되거나, 효소 활성이 유지되는 한 어떠한 암호 서열의 일부에 의해 암호화될 수 있다.
"작동적으로 연결된"이란 성분들이 정상 기능이 수행될 수 있는 인접위치를 의미한다. 그러므로, 조절 서열에 "작동적으로 연결된" 암호화 서열은 암호화 서열이 조절 서열의 조절하에 발현될 수 있는 형태를 의미한다.
"비-이온성 중합체 세정제"는 이온전하가 없으며 본 발명의 목적을 위해 약 3.5 내지 약 9.5 바람직하게는 4 내지 8.5의 pH 범위에서 본 발명의 효소를 안정화시켜 줄 수 있는 것으로 특징지워지는 계면활성제를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 이루어진 분자로서 정의된다.
올리고뉴클레오티드의 정확한 크기는 많은 요소에 의해 결정하며 이들 요소는 올리고뉴클레오티드의 궁극적인 기능 또는 용도에 의해 결정된다. 올리고뉴클레오티드는 합성적으로 또는 클로닝에 의해 유도될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프라이머"는 핵산 본쇄에 상보적인 프라이머 연장생성물의 합성을 유도하는 조건, 즉, 적당한 완충용액("완충용액"은 pH, 이온강도, 조인자 등을 포함한다)중의 개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트 및 열안정성 효소의 존재하에 적합한 온도에 놓여질 경우, 합성 시발점으로서 작용할 수 있는 정제된 제한 분해물중에 자연적으로 존재하거나, 인위적으로 합성되는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. Taq 폴리머라제에 대한 본 발명에서의 완충용액은 바람직하게는 KCl 50mM, pH 8 내지 8.4인 트리스 완충용액 10mM, 및 젤라틴 100μml과 더불어, 마그네슘염(바람직하게는 MgCl2) 1.5 내지 2mM, 각 뉴클레오티드 150 내지 200μM, 및 각 프라이머 1μM를 함유한다.
상기 프라이머는 최대 증폭효율을 위해 일본쇄가 바람직하지만 또한 이본쇄일 수 있다. 프라이머가 이본쇄일 경우, 이를 먼저, 연장 생성물의 제조에 사용하기 전에 프라이머의 본쇄를 분리시키도록 처리한다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 열안정성 효소의 존재하에 연장생성물의 합성을 촉진할 만큼 충분히 길어야만 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 공급원 및 사용 방법과 같은 많은 요소에 의해 결정된다. 예를 들면, 표적 서열의 복잡성에 따라 올리고뉴클레오티드 프라이머는 전형적으로 15 내지 25개의 뉴클레오티드를 함유하지만 이보다 더 많거나 더 적은 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 보다 짧은 프라이머분자는 일반적으로 주형과의 충분히 안정한 하이브리드 복합체를 형성하기 위해 좀 더 낮은 온도를 필요로 한다.
본 발명의 프라이머는 증폭될 각 특정 서열의 상이한 본쇄에 "실질적으로" 상보적인 것을 선택한다. 이것은 프라이머가 각각의 본쇄와 하이브리드화 하기에 충분히 상보적이어야 한다는 것을 의미한다. 그러므로, 프라이머 서열을 주형의 서열과 정확하게 반영할 필요가 없다. 예를 들면, 비-상보적인 뉴클레오티드 단펴은 프라이머의 5' 말단에 부착될 수 있으며, 이때 프라이머의 나머지 서열을 본쇄에 상보적이다. 또다른 방법으로, 프라이머 서열이 증폭될 분쇄의 서열과 하이브리드화하여 다른 프라이머의 연장 생성물을 합성하기 위한 주형을 형성할 만큼 충분한 상보성을 갖고 있다면 비-상보적인 염기 또는 좀더 긴 염기가 삽입될 수 있다. 그러나, 특히 표지된 서열-특이적 탐침을 사용하여 검출하기 위해서는, 프라이머는 전형적으로 최상의 결과를 얻을 수 있는 정확한 상보성을 갖는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"는 이들 각각이 특정 뉴클레오티드 서열에서 또는 근처에서 이본쇄 DNA를 절단하는 박테리아 효소를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "DNA 다형성(ploymorphism)"은 두개 이상의 상이한 뉴클레오티드 서열이 DNA의 특정부위에 존재할 수 있는 상태를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "서열내의 뉴클레오티드 변이"는 한개 또는 여러개의 어떠한 뉴클레오티드가 치환, 결실, 또는 삽입되었음을 의미한다. 이들 뉴클레오티드 변이 서열을 돌연변이체 또는 다형성 대립변이체일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법으로 단일-염기 돌연변이, 부가 또는 결실에 의해 유발된 β-글로빈 유전병(몇몇 β-지중해빈혈, 겸상적혈구빈혈, 헤모글로빈 C 질병, 등)에서 일어날 수 있는 것과 같은 핵산내의 단일 뉴클레오티드 변이, 뿐만 아니라 α-지중해빈혈 또는 몇몇 β-지중해빈혈과 연관된 것과 같은 다중-염기 변이를 탐지할 수 있다. 또한 본 발명의 방법으로 반드시 질병과 연관되어 있지는 않지만 단순히 두 개 이상의 뉴클레오티드 서열(치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드 염기쌍을 가졌든지간에)이 사람 게놈의 HLA 영역에서와 같이 집단내 핵산의 특정부위에 존재할 수 있는 다변성 및 미토콘드리아 DNA와 같은 랜덤 다변성을 탐지할 수 있다. 하기에 상세히 기술된 다변성 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하여 인슐린-의존 당뇨병 또는 법정상 지정된 질병과 연관된 유전적 마아커를 탐지할 수 있다. 하기에 상세히 기술된 다변성 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하여 인슐린-의존 당뇨병 또는 법정상 지정된 질병과 연관된 유전적 마아커를 탐지할 수 있다. 이러한 핵산이 이본쇄일 경우, 서열내의 뉴클레오티드 변이는 서열내 염기쌍의 변이가 된다.
용어 "서열-특이적 올리고뉴클레오티드"는 대립인자상에 함유되지 않은 특정 서열에 하이브리드화될 올리고뉴클레오티드를 의미하며 여기서, 특정 서열에는 검출될 염기쌍 변이체가 연결되어 있으며 탐지될 서열 변이에 대해 특이적이다. 분석될 서열에 따라, 하나 이상의 서열-특이적 뉴클레오티드는 다음에 추가로 기술되는 바와 같이 각 서열에 대해 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "제한 단편 길이 다변성"("RFLP")은 특정 제한 엔도뉴클레아제에 의해 분해되어 형성된 제한 단편 개개의 길이상 차이를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "열안정성 효소"는 열에 안정하고 내열성이 있으며 각각의 핵산 본쇄에 상보적인 프라이머 연장 생성물을 형성하도록 적당한 방법으로 뉴클레오티드의 결합을 촉매하는 효소를 의미한다. 일반적으로 합성은 각 프라이머의 5' 말단에서 시작되어 합성이 완결될때가지 주형본쇄를 따라 5' 방향으로 진행하여 길이가 상이한 분자를 생성한다. 그러나, 5' 말단에서 합성이 시작되고 상술한 바와 동일한 방법을 사용하여 3' 방향으로 진행하는 열안정성 효소가 있을 수 있다.
본 발명의 열안정성 효소는 효율적인 증폭반응을 위한 단일 기준을 만족시켜야 하는데 다시 말해서, 이본쇄 핵산을 변형시키는데 필요한 시간동안 승온처리할 경우, 당해 효소는 비가역적으로 변성(불활성)되어서는 안된다. 본 발명의 목적을 위해 비가역적 변성을 효소적 활성의 영구적이고 완전한 상실을 의미한다. 변성시키는데 필요한 가열 조건은, 예를 들면, 완충용액의 염농도 및 변성될 핵산의 길이 및 뉴크레오티드 조성에 따라 결정되지만 전형적으로 주로 온도 및 핵산 길이에 의해 결정된 시간, 전형적으로는 약 0.5 내지 4분 동안 약 90 내지 105℃의 범위에서 가열한다. 완충용액의 염농도 및/또는 핵산의 GC 조성비가 증가됨에 따라 효소는 좀더 높은 온도에서 견딜 수 있다. 바람직하게는, 효소는 약 90 내지 100℃에서도 비가역적으로 변성되지 않을 것이다.
본 발명에 따른 열안정성 효소가 작용하는 최적온도는 약 40℃보다 더 높으며 이 최적온도 이하의 온도에서는 주형에 대한 프라이머의 하이브리드화가 촉진되긴 하지만, (1) 마그네슘 및 염농도 및 (2) 프라이머의 조성 및 길이에 따라 하이브리드화는 좀더 고온(예, 45 내지 70℃)에서 일어날 수 있다. 효소에 대한 최적온도가 높으면 높을수록 프라이머-지시된 연장과정의 특이성 및/또는 선택성이 더욱 더 증가한다. 그러나, 40℃ 이하, 예를들면, 37℃에서 활성일 효소는 또한 열안정성이 있다면 본 발명의 범주에 속한다. 바람직하게는, 최적 온도 범위는 약 50 내지 90℃, 더욱 바람직하게는 60 내지 80℃이다.
본 발명에서의 열안정성 효소는 어떠한 공급원으로부터 수득할 수 있으며, 천연 단백질이거나 재조합 단백질일 수 있다. 내열성이 있는 것으로 문헌에 보고된 효소이 예로는 열안정성 폴리머라제, 예를들면, 고온균인 써머스 플라버스(Thermus flavus), 써머스 러버(Thermus ruber), 써머스 써머필라스(Therums thermophilus), 바이러스 스테아로써머플러스(Bacillus stearothermophilus)(이균은 수록된 다른 균보다 약간 낮은 최적온도를 갖는다), 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, 써머스 락테우스(Thermus lacteus), 써머스 루벤스(Thermus rubens) 및 메타노써머스 페르비더스(Methanothermus fervidus)로부터 추출된 폴라머라제가 있다.
본 발명에서의 바람직한 열안정성 효소는 써머스 아쿠아티쿠스로부터 분리된 DNA 폴리머라제이다. 써머스 아쿠아티쿠스의 여러 균주는 미합중국 매릴랜드주 소재의 아메리칸 타잎 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수가능하며 문헌[T.D.Brock, J.Bact(1969) 98 : 289-297, 및 T.Oshima, Arch. Microbiol.(1978) 117 : 189-196]에 기술되어 있다. 이들 바람직한 균주중 하나는 균주 YT-1이다.
천연 단백질을 회수하기 위해, 적합한 기술을 사용하여 세포를 배양한다. 이러한 한가지 기술이 문헌[Kaledin et al., Biokhimiya(1980), Supra]에 기술되어 있다. 간략하게 설명하면, 세포를 니트릴로트리아세트산(100mg), 트립톤(3g), 효모 추출물(3g), 석신산(5g), 아황산나트륨(50mg), 리보플라빈(1mg), K2HPO4(522mg), MgSO4(480mg), CaCl2(222mg), MaCl(20mg), 및 미량원소로 조성된 11의 배지상에 배향한다. KOH를 사용하여 배지의 pH를 8.0＋0.2로 조성한다. 70℃의 온도에서 20g/l 이하의 세포를 격렬하게 통기 교반시켜 배양하면 수율이 증가된다. 후기 로그 단계의 세포(550nm에서 흡광도로 결정됨)를 원심분리로 수거하여 완충용액으로 세척한 다음 －20℃에서 냉동보관한다.
문헌[Chien et al., J. Bacteriol(1976), Supra]에 기술된 세포의 또다른 배양방법으로, 바이오틴 01mgl, 티아민 0.1mgl, 및 니코틴산 0.05mg/l의 보충된 0.3% 글루탐산을 함유하는 소정의 무기염 배지를 사용한다. 이 염은 니트로트리아세트산, CaSO4, MgSO4, NaCl, KNO3, NaNO3, ZnSO4, H3BO3, CuSO4, NaMoO4, CoCl2, FeCl3, MnSO4, 및 Na2HPO3를 함유한다. NaOH를 사용하여 배지의 pH를 8.0으로 조정한다.
치엔(Chien)등의 기술에서, 세포를 처음에 수욕탕진기내 75℃에서 배양한다. 특정 밀도에 도달했을 때 이들 세포중 11를 16-1유기병에 옮겨 이를 온풍 배양기에 넣는다. 멸균 에어를 배양물내에 버블링시키고 온도를 75℃로 유지시킨다. 세포를 20시간 동안 생육시킨다음 원심분리하여 수거한다.
세포육성후, 효소를 6단계로 분리 및 정제하여 이들 각 단계는 실온이하의 온도, 바람직하게는 약 4℃에서 수행한다.
1단계에서는, 냉동된 세포를 해동시키고 초음파로 분쇄시켜 양 pH 7.5의 완충용액중에 현탁시키고 원심분리한다.
2단계에서는, 상등액을 수거한 다음 무수 황산암모늄과 같은 염을 가하여 분획화 한다. 적당한 분획(전형적으로 45 내지 75%의 포화도)을 수거하고 바람직하게는 pH 6.5의 0.2 인산칼륨 완충용액중에 용해시킨다음 동일한 완충용액에 대해 투석한다.
3단계에서는, 핵산 및 몇몇 단백질을 제거한다. 2단계로부터의 분획을 상술한 바와 동일한 완충용액으로 평형된 DEAE-셀룰로즈 칼럼에 적용시킨다. 이어서 칼럼을 동일한 완충용액으로 세척하고 280nm하의 흡광도에 의해 결정된 단백질-함류 분획 유출물을 수거하고 바람직하게는 처음 완충용액과 성분은 동일하지만 pH는 7.5인 10mM인산칼륨 완충용액에 대해 투석한다.
4단계에서는, 상기와 같이 수거된 분획을, 3단계에서 투석시 사용된 완충용액으로 평형된 하이드록시아파타이트 칼럼에 적용시킨다. 이어서 칼럼을 세척하고 10mM 2-머캅토 에탄올 및 5% 글리세린을 함유하는 pH 7.5인 0.01M 내지 0.5M 인산칼륨 완충용액과 같은 완충용액의 직선구배로 효소를 용출시킨다. 열안정성 효소(예, DNA 폴리머라제) 활성을 함유하는 모아진 분획을 3단계에서 투석시 사용된 것과 동일한 완충용액에 대해 투석한다.
5단계에서는, 투석된 분획을 3단계에서 투석시 완충용액으로 평형된 DEAE-셀룰로즈 칼럼에 적용시킨다. 그런 다음 칼럼을 세척하고 3단계에서 투석시 사용된 완충용액중의 0.01 내지 0.6M KCl과 같은 완충용액의 직선구배로 효소를 용출시킨다. 열안정성 효소 활성을 나타내는 분획을 대상으로 하여, 데옥시리보뉴클레아제(엔도-및 엑소뉴클레아제)에 의해 오염되었는지의 여부를 적합한 방법을 사용하여 시험한다. 예를들면 엔도뉴클레아제 활성은 과량의 DNA 폴리머라제와 함께 배양한 후 파지 λDNA 또는 슈퍼코일링된 플라스미드 DNA의 분자량 변화를 전기영동으로 측정하여 결정한다. 유사하게, 엑소뉴클레아제 활성은 몇몇 부위를 절단하는 제한효소로 처리한 후 DNA의 분자량 변화를 전기영동으로 측정하여 결정한다.
데옥시리보뉴클레아제 활성이 없는 것으로 결정된 분획을 모아 3단계에서 사용된 것과 동일한 완충용액에 대해 투석한다
6단계에서는, 모은 분획은 고정상 용액을 갖는 포스포 셀룰로즈칼럼상에 놓아둔다. 칼럼을 세척하고 pH 7.5인 인산칼륨 완충용액중의 0.01 내지 0.4M KCl과 같은 완충용액의 직선구배로 효소를 용출시킨다. 열안정성 폴리머라제 활성을 나타내며 데옥시리보뉴클레아제 활성을 나타내지 않은 모은 분획을 pH 8.0인 완충용액에 대해 투석한다.
투석된 생성물의 분자량은 특정 기술, 예를들면 단백질 분자량 마아커를 사용한 SDS PAGE 기술로서 결정할 수 있다. 본 발명에서의 바람직한 효소중 한 효소인 써머스 아쿠아티쿠스로부터 정제된 DNA 폴리머라제의 분자량은 상기 방법에 의해 약 86,000 내지 90,000 달톤으로 결정되었다.
본 발명의 열안정성 효소는 또한 써머스 아쿠아티쿠스 게놈 DNA로부터 본 효소를 암호화한 유전자를 클로닝시키는 것과 같은 DNA 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 써머스 아쿠아티쿠스(Taq) 폴리머라제에 대해 완전한 암호화 서열은 ~18kd 게놈 DNA 삽입 단편내에 함유된 약 3.5kb Bgl Ⅱ-Asp 718(부분) 제한단편상의 박테리오파지 CH35 : Taq #4-2로부터 유도될 수 있다. 이 박테리오파지는 1987년 5월 29일에 아메리칸 타잎 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 기탁되었으며 기탁번호는 제40,336호이다. 또다른 방법으로는, 플라스미드 pFC 83(1987년 5월 29일에 기탁된 ATCC 제67,422호)으로부터 분리된 ~750 염기쌍(bp) Bgl Ⅱ-Hind Ⅲ 제한단편을 플라스미드 pFC85(1987년 5월 29일에 기탁된 ATCC 제67,421호)로부터 분리된 ~2.8kb Hind Ⅲ-Asp 718 제한단편에 연결시켜 유전자를 제조할 수 있다. pFC 83 제한단편은 Taq 폴리머라제 유전자의 아미노-말단을 함유하는 반면에 pFC 85의 제한단편은 카복실-말단을 함유한다. 그러므로 이들 두개의 단편을 적당한 조절 서열을 사용하여 상용하게 분해된 벡터내로 연결하면 완전한 길이의 Taq 폴리머라제가 해독될 것이다.
또한, 목적하는 효소활성을 나타내는 생물학적 활성 유전자 생성물을 회수하는데 Taq 폴리머라제 유전자의 전제 암호화 서열이 필요치 않는다 것이 밝혀졌다. 아미노 말단에서 암호화 서열의 약 1/3을 제거해도 폴리머라제 검정에서 다소 활성을 나타내는 유전자 생성물이 생성되었다.
N-말단의 제거 이외에, Taq 폴리머라제를 포함하는 펩타이드쇄내의 개개의 아미노산 잔기는 산호, 환원 또는 기타 유도화 반응으로 변형시킬 수 있으며 상기 단백질을 절단하여 활성을 보유하는 단편을 수득할 수 있다. 활성을 파괴하지 않는 이러한 변형 방법은 그러한 단백질을 암호화 하는 DNA 서열을 유전자로부터 제거하지는 않는다.
그러므로, 해독시에 서열내에 도입된 아미노산의 결실, 부가 또는 변형에 의한 일차 구조 자체의 변형이 단백질 활성의 파괴없이 이루어질 수 있다. 이러한 치환 또는 기타 변형으로 본 발명의 범위내에 속하는 DNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 단백질이 생성된다.
본 발명의 정제된 86,000 내지 90,000 달톤 폴리머라제로 면역화시킨 토끼로부터의 폴리클로날 항혈청을 사용하여 써머스 아쿠아티쿠스부분 게놈 발현 라이브러리를 탐지하여 하기한 바와 같이 적합한 암호화 서열을 수득한다. 클로닝된 게놈 서열은 융합 폴리펩타이드로서 발현 될 수 있거나, 자체의 조절 서열을 사용하여 직접 발현될 수 있거나, 또는 효소의 발현을 위해 사용된 특정 숙주에 적당한 조절 서열을 사용한 작제물에 의해 발현될 수 있다.
물론, 이들 서열을 암호화하는 DNA를 이용할 경우는 코돈 서열을 변형시켜 DNA 폴리머라제 활성을 나타내는 변형 단백질 형태를 생성한다.
그러므로, 이들 연장물로 Taq DNA 폴리머라제에 대한 완전한 암호화 서열을 제공할 수 있으며 이로부터 여러가지 숙주 시스템에 적용가능한 발현벡터를 작제하여 암호화 서열을 발현할 수 있다. 또한, Taq 폴리머라제-암호화 서열중 일부는 여러 종에서 다른 열안정성 폴리머라제-암호화 서열을 회수할 수 있는 탐침으로 유용하다는 것을 본 발명 이전부터 확실하다. 따라서, 6개 이상의 아미노산을 암호화하는 게놈 DNA중 일부는 이. 콜라이내에서 복제될 수 있으며 6개 이상의 아미노산을 암호화하고 열안정성 폴리머라제를 암호화하는 부가적인 DNA를 회수하기 위해 사용되는 탐침 또는 올리고 뉴클레오티드 탐침으로서 사용한 변성된 형태를 합성할 수 있다. 써머스 아쿠아티쿠스의 뉴클레오티드 서열과 다른 세균의 상응하는 부분의 뉴클레오티드 서열간의 정확한 매치가 이루어질 수 없기 때문에 오류된 하이브리드를 제거하기에 충분한 반응조건하에서 하이브리드화를 얻기 위해서는 아마도 약 18개의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고머(6개의 연결된 아미노산을 암호화함)가 필요하다. 6개의 아미노산을 암호화하는 서열은 이러한 탐침에 충분한 정보를 제공해줄 것이다.
적합한 숙주, 조절 시스템 및 방법
일반적인 관점에서, Taq 폴리머라제의 재조합 형태를 생성하는 방법은 전형적으로 다음과 같다 : 일차로, 성숙한(모든 변이단백질을 포함시키기 위해 사용된 용어)효소, 또는 Taq 폴리머라제의 활성을 파괴하지 않은 부가 서열 또는 조절된 조건(예, 펩티다제로 처리)하에서 절단가능하고 활성 단백질을 부여하는 부가 서열에 대한 Taq 폴리머라제의 융합체를 암호화하는 DNA를 수득한다. 서열이 인트론에 의해 분열되지 않는다면 이는 어떠한 숙주내에서도 발현시키기에 적합하다. 이 서열은 절단가능하고 회수가능한 형태여야 한다.
그런다음 절단되거나 회수된 암호화 서열을 바람직하게는 복제 가능한 발현벡터내의 적합한 조절 서열과 작동가능하게 연결시킨다. 이 벡터를 사용하여 적합한 숙주를 형질전환시키고 형질전환된 숙주를 재조합 Taq 폴리머라제를 생성하기에 유리한 조건하에서 배양한다. 임의로, Taq 폴리머라제를 배지 또는 세포로부터 분리한다 : 단백질의 회수 및 정제과정은 몇몇 불순물이 허용될 수 있는 수준으로 존재하는 경우에서는 필요치 않을 수 있다.
상기한 각 단계는 여러가지 방법으로 수행할 수 있다. 예를들면, 목적하는 암호화 서열을 게놈 단편으로부터 수득하여 적당한 숙주에 직접 사용할 수 있다. 여러 숙주내에서 작동가능한 발현벡터는 아래에서 설명한 바와 같이 적당한 복제인자 및 조절 서열을 사용하여 제조한다. 적합한 제한부위를 정상적으로 이용할 수 없을 경우 암호화 서열의 말단에 가하여 절단용 유전자를 제공함으로써 이드 벡터내로 삽입시킬 수 있다.
조절 서열, 발현벡터, 및 형질전환방법은 유전자를 발현시키기 위해 사용되는 숙주 세포의 종류에 의해 결정된다. 일반적으로 원핵성물, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포가 현재 숙주로서 유용한다. 일반적으로 원핵세포 숙주가 제조합 단백질을 생성하는데 가장 효과적이면서 편리하므로 Taq 폴리머라제의 발현을 위해 바람직하다.
Taq 폴리머라제의 특별한 경우에 재조합 조건 및 천연 조건하에서 단백질의 N-말단부에서 상당부분이 결실될 수 있으면서 단백질의 활성은 여전히 유지되는 증거가 나타난다. 이러한 사실은 끝이 절단된-유전자가 해독되었기 때문이 이니라 단백분해효소에 의해, 분리된 천연 단백질이 분해되었기 때문이다. 그러나, 플라스미드 pFC 85의 끝이 절단된-유전자로부터 생성된 돌연변이 단백질은 완전한 길이의 서열을 암호화하는 DNA로부터 생성된 단백질과 마찬가지로 DNA 폴리머라제의 검정에서 완전히 활성을 나타낸다. 특정 N-말단부 축소된 형태는 확실히 활성을 나타내기 때문에 사용된 유전자 작제물 또는 폴리머라제의 발현물은 또한 암호하 서열의 상응하는 축소된 형태도 포함할 수 있다.
조절 서열 및 상응하는 숙주
가장 흔히 사용되는 대표적인 원핵생물은 이. 콜라이(E. coli)의 여러 균주를 들 수 있다. 그러나, 다른 미생물 균주도 또한 사용할 수 있으며 예를들면, 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis)와 같은 바실러스, 슈도모나스(Pseudomonas)의 여러 종, 또는 기타 세균 균주가 있다. 이러한 원핵 생물계에서는 복제 부위 및 숙주와 공존가능한 종으로부터 유래된 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터를 사용한다. 예를들면, 문헌[Bolivar, et al., Gene (1977) 2 : 95]에 기술된 바와 같은, 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR 322의 유도체를 사용하여 이. 콜라이를 전형적으로 형질전환시킨다. pBR 322는 앰피실린 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 함유하고 있으므로 목적하는 벡터를 제조하는데 있어서 보존되거나 파괴될 수 있는 부가의 마아커를 제공한다. 본 명세서에서, 라이보좀 결합부위 서열 및 임의로 오퍼레이터와 더불어, 전사개시용 프로모터를 함유하는 것으로 정의되어 통상 사용되는 원핵 생물 조절 서열은 β-락타마제(페니실리나제) 및 락토즈(lac) 프로모터 시스템[참조 : Chang, et al., Nature (1977) 198 : 1056], 트립토판(trp) 프로모터 시스템[참조 : Goeddel, et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8 : 4057] 및 λ-유도된 PL프로모터[참조 : Shimatake, et al., Nature (1981) 292 : 128]과 같은 통상 사용되는 프로모터, 및 NRBS서열의 3' 6개 bp내에서 절단을 허용하는 하나 이상의 제한부위를 갖는 제3DNA 서열의 NRBS상부에 상응하는 제2DNA 서열에 작동적으로 연결된 PL프로모터인 제1DNA 서열을 함유하는, 운반가능한 조절 카세트로서 유용하게 제조된 N-유전자 리보좀 결합부위를 포함한다. 창(chang)에 의해 1986년 10월 8일에 공고된 유럽 특허공보 제 196,864호에 기술된 포스파타제 A(pho A) 시스템도 또한 유용하다. 그러나, 원핵생물과 양립 가능한 어떠한 프로모터 시스템도 사용할 수 있다.
세균 이외에도 효모와 같은 진핵 미생물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 수 많은 기타 균주가 통상 이용할 수 있지만, 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 실험용 균주, 베이커스(Baker's) 효모를 가장 많이 사용한다. 2μ 복제원을 사용하는 벡터가 예시되어 있으며[참조 : Broach, J, R., Meth. Enz. (1983) 101 : 307), 효모발현에 적합한 다른 플라스미드 벡터도 공지되어 있다[참조 : Stinchcomb, et al., Nature (1979) 282 : 39. Tschempe, et al., Gene (1980) 10 : 157 및 Clarke L., et al., Meth. Enz (1983) 101 : 300]. 효모 벡터에 대한 조절 서열은 당분해 효소의 합성을 위한 프로모터를 포함한다[참조 : Hess, et al., J. Adv. Enzyme Reg. (1968) 7 : 149 : Hollanmd, et al., Biotechnology (1978) 17 : 4900].
당계에 알려진 부가적인 프로모터로는 3-포스포글리세레이트키나제의 프로모터[참조 : Hitzeman, et al., J. Biol. Chem (1980) 255 : 2073], 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프락토키나제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제 및 글루코키나제와 같은 기타 당분해 효소에 대한 프로모터가 있다. 성장조건에 의해 조절되는 전사의 부가적인 이점을 지닌 기타 프로모터는 알콜 데하이드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스퍼타제, 질소대사와 관련된 분해효소, 및 말토즈 및 갈락토즈 이용에 필요한 효소에 대한 프로모터 영역이다(Holland, Supra).
또한, 터미네이터 서열은 암호화 서열의 3' 말단에 위치함이 바람직한 것으로 믿어진다. 이러한 터미네이터는 효모-유래된 유전자내의 암호화 서열에 뒤이어 3' 비해독 영역에서 발견된다. 예시된 많은 벡터는 플라스미드 peno 46을 함유하는 에놀라제 유전자[참조 : Holland, M. J., et al., J. Biol. Chem. (1981) 256 : 1385) 또는 YEP13으로부터 수득된 LEU 2 유전자[참조 : Broach, J., et al., Gene (1978) 8 : 121]로부터 유래된 조절 서열을 함유하지만, 효모-양립가능한 프로모터, 복원제, 및 기타 조절 서열을 함유하는 어떠한 벡터도 적합하다.
물론, 다세포 유기체로부터 유래된 진핵 숙주 세포 배양물내에서 폴리펩타이드-암호화 유전자를 발현시키는 것 또한 가능하다[참조 : Tissue Culture, Academic Press, Cruz and Patterson, editors (1973)]. 유용한 숙주 세포주로는 쥐의 골수종 N 51, VERO 및 헬라 세포, 및 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포가 있다. 이러한 세포에 대한 발현 벡터는 통상, 예를들면, 시미한 바이러스 40(SV 40)로부터의 통상 사용되는 초기 및 후기 프로모터[참조 : Fiers, et al., Nature (1978) 273 : 113]과 같은 포유동물 세포와 양립가능한 프로모터 및 조절 서열, 또는 포리오마, 아네노바이러스(Adenovirus) 2, 소유두종 바이러스, 또는 조류육종 바이러스로부터 유래된 기타 바이러스성 프로모터, 또는 면역 글로불린 프로모터 및 열 쇼크 프로모터를 포함한다. 포유동물계에서 벡터로서 BPV를 사용한 DNA 발현 시스템이 미합중국 특허 제4,419,446호에 기술되어 있다. 이 시스템의 변형 시스템이 미합중국 특허 제4,601,978호에 기술되어 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질 전환에 대한 일반적인 관점이 액셀(Axel)의 미합중국 특허 제4,399,216호에 기술되어 있다. 또한, 본 발명에 이르러 "인헨서" 영역이 발현을 최적화 하는데 중요한 것으로 나타나며 ; 이들 영역은 일반적으로 프로모터 영역의 상부에서 발견되는 서열이다. 복제원은 필요한 경우, 바이러스로부터 수득할 수 있다. 그러나, 염색체내로의 이입은 진핵생물에서 DNA 복제시 흔한 기작이다.
현재 식물 세포도 또한 숙주로서 이용할 수 있으며, 노팔린 신타제(nopaline synthase) 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날 서열과 같은 식물세포와 양립 가능한 조절서열[참조 : Depicker, A., et al., J. Mol. Appl Gen. (1982) 1 : 561]이 이용 가능하다.
최근에, 또한, 바큘로바이러스 벡터에 의해 제공된 조절 시스템을 이용하는 곤충세포를 사용한 발현 시스템이 문헌[Miller, D. W., et al., in Genetic Engineering (1986) Setlow, J.K. et al., eds., Plenum Pudlishing, Vol. Ⅰ, pp, 277 내지 297]에 기술되어 있다. 이들 시스템은 또한 Taq 폴리머라제를 성공적으로 생성한다.
형질전환
사용된 숙주 세포에 따라, 세포에 적당한 표준 기술을 사용하여 형질전환을 수행한다. 문헌[Cohen, S. N., Proc. Natl. Acad, Sci(USA) (1972) 69 : 2110]에 기술된 바와 같이 염화칼슘을 사용한 처리법을 원핵생물 또는 실질적인 세포벽을 함유하는 기타 세포에 사용한다. 아그로박테리윰 튜메패엔스(Agrobacterium tumefaciens로의 감염법[참조 : Shaw, C. H., et al., Gene (1983) 23 : 315]은 특정 식물 세포에 사용한다. 세포벽이 없는 포유동물 세포에 대해서는, 문헌[Graham and van der Eb, Virology (1978) 52 : 546]에 기술된 인산칼슘 침전법이 바람직하다. 효모의 형질전환은 문헌[Van Solingen, P., et al., J. Bact. (1977) 130 : 946 및 Hsiao. C. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) (1979) 76 : 3829]에 기술된 방법에 따라 수행한다.
λgt 11 발현 라이브러리의 제조
박테리오파지 벡터 λgt 11을 사용하여 Taq 폴리머라제 암호화 DNA와 같은 목적하는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리하는 방법은 다음과 같다 : 라이브러리는 λgt 11 파지[참조 : Young 및 Pavis, Proc, Natl. Acad. Sci USA (1983) 80 : 1194 내지 1198]내의 Eco RI 부위에 삽입된 써머스 아쿠아티쿠스 DNA를 완전히 분해시켜 생성한 Eco RL-플랭킹된 Alu I 단편으로 제조할 수 있다. 이 박테리오파지내의 독특한 Eco RI 부위가 β-갈락토시다제 유전자의 카복실-말단에 위치하고 있기 때문에, (적합한 프레임 및 방향으로) 삽입된 DNA는 락토즈오페론 프로모터/오퍼레이터의 조절하에 β-갈락토시다제와 융합된 단백질로서 발현된다.
그런다음 항체 플라그 하이브리드화 방법을 사용하여 게놈 발현 라이브러리를 스크리닝한다. "에피토프 선별법"으로 언급된 상기 방법의 변형방법은 파지에 의해 암호화된 융합 단백질 서열에 대한 항혈청을 사용하여 하이브리드화된 플라그를 확인한다. 그러므로, 재조합 파지의 라이브러리는 본 단백질의 항원 결정기를 암호화하는 DNA 단편을 수반하는 파지를 동정하기 위해 86,000 내지 90,000 달톤 Taq 폴리머라제를 인지하는 항체를 사용하여 스크리닝 할 수 있다.
총 토끼 Taq 폴리머라제 항혈청을 사용하여 약 2×105재조합파지를 스크리닝한다. 이러한 일차 스크리닝에서, 양성 시그날을 검출하고 이들 플라그중 하나 이상을 예비 면역 혈청과 반응하지 않으며 면역 혈청과는 반응하는 후보 플라그로부터 정제하여 좀더 세밀히 분석한다. 재조합 파지에 의해 생성된 융합 단백질을 검사하기 위해, 숙주 Y 1089내의 파지의 용원을 생성한다. 용원을 유도하고 생성된 단백질을 겔 전기영동하면, 각각의 용원이 다른 용원에서는 발견되지 않는 새로운 단백질을 생성하는 것을 관찰할 수 있거나, 복제 서열이 생성될 수 있다. 양성 시그날을 함유하는 파지를 선정한다 : 이 경우에, 한 개의 양성 플라그를 선정하여 좀더 동정한 다음 보다 더 낮은 밀도로 재도말하여 재조합체를 정제하고 Eco RI 제한효소 분해시켜 정제된 클론을 크기별로 분석한다. 그런다음 분리된 삽입 서열로 탐침을 만들고 적당히 표지된 이들 탐침을 문헌[Maniatis et al., Melecular Cloning, A Laboratory Manual (1982)]에 기술된 통상적인 콜로니 또는 플라그 하이브리드화 검정에 사용할 수 있다.
표지된 탐참을 사용하여 차론(Charon) 35 박테리오파지에서 작제된 제2게놈 라이브러리를 탐지한다[참조 : Wilhemine, A. M. et al., Gene(1983) 26 : 171 내지 179]. 이 라이브러리는 게놈 써머스 아쿠아티쿠스 DNA를 Sau 3A-부분 분해시켜 제조하고 크기-분획된 단편(15-20kb)을 차론 35 파지의 Bam HI 부위내로 클로닝시킨다. 탐침을 사용하여 Taq 폴리머라제를 암호화하는 DNA를 함유한 파지를 분리한다. 생성된 파지중 하나인 CH 35 : Taq #4-2는 전체 유전자 서열을 함유한 것으로 밝혀졌다. 유전자의 일부를 암호화하는 부분 서열도 또한 분리되었다.
벡터 제조
목적하는 암호화 서열 및 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터의 작제 공정은 당계에 널리 알려진 표준 연결 및 제한기술을 사용한다. 분리된 플라스미드, DNA 서열, 또는 합성된 올리고뉴클레오티드를 절단하고 재조합하여 목적하는 형태로 재연결한다.
부위-특이적 DNA 전달은 당계에 일반적으로 알려진 조건하에서, 적합한 제한효소(또는 효소들)로 처리하여 수행하며 이 작업의 세부 사항은 시판되는 제한효소의 제조업자가 구체적으로 지시하고 있다[참조 : New England Biolabs, Product Catalog]. 일반적으로, 약 20μl의 완충용액중에서 효소 1 유니트에 의해 양 1μg의 플라시미드 또는 DNA 서열이 절단된다.
본 명세서의 실시예에서, 전형적으로 과량의 제한 효소를 사용하여 DNA 기질을 완전히 분해시킨다. 배양시간은 양 37℃에서 약 1 내지 2시간 수행하지만 변동될 수 있다. 각각의 배양 후, 페놀/클로로포름 및 에테르로 차례로 추출하여 단백질을 제거하고 핵산을 에탄올로 수성 분획으로부터 회수한다. 필요한 경우, 표준 기술을 사용한 폴리아크릴아미드 겔 또는 아가로수 겔 전기영동을 하여 절단된 단편을 크기별로 분리할 수 있다. 크기별 분리 방법은 문헌[Methods IN Enymology (1980) 65 : 499-560]에 기술되어 있다.
제한-절단된 단편을 pH 7.6인 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 100mM DTT 및 50 내지 100μM dNTPS중에 4개의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTPS)의 존재하 20 내지 25℃에서 약 15 내지 25분 동안 배양하면서 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 Ⅰ의 거대 단편(클레노누)으로 처리하여 평활-말단시킬 수 있다. 클레노우 단편은 5' 점성 말단에 dNTP를 채우지만, 4개의 dNTP가 존재하더라도 클레노우 단편은 돌출한 3' 일본쇄를 후위부부터 분해시킨다. 필요한 경우, 점성 말단의 한정된 성질내에서 단 한개의 선택된 dNTP를 공급함으로써 선택적으로 수선할 수 있다. 클레노우로 처리한 후, 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 적당한 조건하에서 S1 뉴클레아제로 처리하여 모든 일본쇄 부분을 가수분해시킨다.
마테우스(Matteucci)등의 트리에스테르 방법[참조 : J. Am. Chem. Soc. (1981) 103: 3185-3191]을 사용하거나 자동화 합성방법을 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 일본쇄의 키나싱은 아닐링전 또는 라벨링 동안에, pH 7.6인 50mM 트리스, 10mM MgCl2, 5mM 디티오트레이톨 및 1-2mM ATP의 존재하에 1nM 기질에 대해 과량의 폴리뉴클레오티드 키나제, 예를들면 약 10유니트를 사용하여 수행할 수 있다. 키나싱을 탐침의 표시화시에 수행할 경우, ATP는 고 특이성 활성 δ-32P를 함유할 것이다.
연결공정은 다음의 표준조건 및 온도하에서 15 내지 30μl 용량으로 수행한다 : pH 7.5의 20mM 트리스-Cl, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 30μg/ml BSA, 10mM-50mM NaCl, 0℃에서 ("점성 말단" 연결시) 40μM ATP, 0.1 내지 0.02(weiss) 유니트 T 4DNA 리가제이거나, 14℃에서 ("평활 말단" 연결시) 1mM ATP, 0.3 내지 0.6(weiss) 유니트 T 4DNA 리가제. 분자간의 "점성 말단" 연결은 통상 33 내지 100μg/ml 총 DNA 농도(5 내지 10mM 총 말단농도)에서 수행한다. 분자간 평활 말단 연결(통상 링커의 10 내지 30배 몰량을 사용함)은 1μM 총 말단농도에서 수행한다.
“벡터 단편”을 사용한 벡터제조시, 벡터 단편을 통상 세균성 알칼리 포스파타제(BAP)로 처리하여 5' 포스페이트를 제거하고 벡터가 재연결되는 것을 방지한다. BAP 분해작업은 Na+및 Mg2+의 존재하에 벡터 1mg 당 BAP 약 1유니트를 사용하면서 pH 8의 양 150mM 트리스중 60℃에서 약 1시간 동안 수행한다. 그런다음 페놀/크로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켜 핵산 단편을 회수한다. 또다른 방법으로, 불필요한 단편의 추가적인 제한효소 분해 과정에 의해 이중으로 분해된 벡터가 재연결되는 것을 방지할 수 있다.
DNA 서열의 변형
서열 변형을 필요로 하는 cDNA 또는 게놈 DNA로부터 유래된 벡터의 일부분에 대해, 부위-특이적 프라이머-지시된 돌연변이 유도반응을 사용한다. 이 기술은 현재 당업계에서는 표준방법으로서, 한정된 오류 결합부분을 제외하고 돌연변이될 일본쇄 파지 DNA에 상보적인 프라이머 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 목적하는 돌연변이를 일으킨다. 간단하게, 프라이머로서 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 파지에 상보적인 본쇄의 합성을 지시하고 생성된 이본쇄 DNA를 파지-지지 숙주 세균내로 형질전환시킨다. 형질전환된 세균의 배양물을 탑 한천에 도말하여 파지가 기생하는 단일 세포로부터 플라그를 형성한다.
이론상, 새로운 플라그의 50%는 돌연변이형을 일본쇄로서 지닌 파지를 함유하고 나머지 50%는 본래의 서열을 함유할 것이다. 플라그를 니트로셀룰로즈 필터에 옮기고 "여과물"을 정확한 결합의 하이브리드화를 허용하는 온도이지만 최초 서열과의 오류 결합은 하이브리드화를 방지하기에 충분한 온도에서 키나싱된 합성 프라이머와 하이브리드화시킨다. 그런다음 탐침과 하이브리드화되는 플라그를 선정하고 배양한 다음 DNA를 회수한다.
작제의 입증
하기 설명한 작제공정에서, 플라스미드 제조에 대한 정확한 연결은 먼저, 연결 혼합물로 이. 콜라이 균주 MM 294, 또는 기타 적합한 숙주를 형질정환시켜 확인한다. 성공적인 형질전환체를 당계에 알려진 바와같이 플라스미드 작제방법에 따라, 앰피실린, 테트라사이클린 또는 기타 항생물질을 이용하거나, 다른 마아커를 사용하여 선별한다. 그런다음, 임의로 클로람페니콜 증폭[참조 Clewell, D.B., J. Bacteriol, (1972) 110 : 667]에 이어서, 문헌[Clewell, D.B., et al., Proc, Natl, Acad, Sci,(USA) (1969) 62 : 1159]의 방법에 따라 형질전환체의 플라스미드를 제조한다. 분리된 DNA를 제한효소로 분석하고/하거나 문헌[Sanger. F., et al., Proc, Natl. Acad. Sci.(USA) (1977) 74 : 5463 및 좀더 상세히 기술된 Messing, et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9 : 309]의 디데옥시 방법 또는 문헌(Maxam, et al., Methods in Enzymology (1980) 65 : 499]의 방법에 따라 염기 서열을 파악한다.
예시된 숙주
본 발명의 클로닝 및 발현에 사용되는 숙주 균주는 다음과 같다 :
클로닝 및 서열분석, 및 대부분의 세균성 프로모터의 조절하에 작제물의 발현을 위해, 이. 콜라이 제네틱스톡 센터 GCSC #6135로부터의 이. 콜라이 균주 MM 294를 숙주로서 사용한다. PLNRBS프로모터의 조절하의 발현을 위해, 이. 콜라이 균주 K12 MC1000 λ용원, N7N53cI857SusP80, ATCC 39531을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용된 숙주는 이. 콜라이 DG 116으로 이 균주는 1987년 4월 7일 ATCC(ATCC 53606)에 기탁되었다.
M13파지 재조합 인자를 위해서는, 이.콜라이 K12 균주 DG 98과 같은 파지 감염에 민감한 이. 콜라이 균주를 사용한다. DG 98균주는 1984년 7월 13일에 ATCC에 기탁되었고 기탁번호는 39768이다.
포유동물 발현은 COS-7, COS-A2, CV-1 및 쥐세포, 및 스포돕테라 프러지페이다(Spodoptera frugipeida)에 곤충세포계 발현을 수행할 수 있다.
효소활성의 안정화
장기간의 안정성을 위해, 본 발명의 효소는 하나 이상의 비이온성 중합체 세정제를 함유하는 완충용액중에 저장해야만 한다. 이러한 세정제는 일반적으로 분자량의 범위가 약 100 내지 250,000, 바람직하게는 약 4000 내지 200,000 달톤이며 pH 약 3.5 내지 9.5, 바람직하게는 pH 약 4 내지 8.5에서 효소를 안정하게 한다. 이러한 세정제의 예로는 본 명세서 참고문헌으로 제시된 문헌[McCutcheon's Emulsifiers ＆ Detergents, North Americal edition(1983), published by the McCutcheon Division of Mc Publishing Co., 175 Rock Road, Glen Rock, NJ(USA), pages 295-298]에 기술된 것들이다. 바람직하게는, 세정제는 에톡실화 지방 알코올 에테르 및 라우릴에태르, 에톡실화 알킬페놀, 옥틸페녹시 폴라에톡시 에탄올 화합물, 개질된 옥시에틸화 되고/되거나 옥시프로필화 직쇄 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 모노올레이트 화합물, 폴리솔베이트 화합물, 및 페놀성 지방 알코올 에테르로 이루어진 그룹중에서 선택한다. 더욱 특히 바람직한 세정제는 폴리옥시에틸화(20) 솔비탈 모노라우레이트인 "ICI Americas Inc., Wilmington DE"의 트윈(Tween) 및 에톡실화 알킬페놀(노닐)인 "BASF Wyandotte Corp. Parsippany, NJ"의 이코놀TM(IconolTM)NP-40이다.
본 발명의 열안정성 효소는 이러한 효소를 필요로 하거나 원하는 어떠한 목적을 위해서라도 사용할 수 있다. 특히 바람직한 국면에서, 본 발명의 효소는 아래에서 설명되는 증폭 프로토콜에서 사용한다.
증폭 프로토콜
본 발명의 효소를 사용한 증폭 프로토콜은 유럽 특허 공보 제 200,306호에 기술되고 청구된 현 서열의 증폭 방법이 될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 하기의 증폭방법에 본 발명의 효소를 사용한다.
일반적으로, 증폭방법은 (a) 목적 서열의 말단은 이들에게 하이브리드화될 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있는 만큼 충분히 상세하게 알려져 있으며 (b) 소량의 서열을 연쇄반응을 개시하는데 이용할 수 있는 특정 핵산 서열 하나 이상의 수많은 관련 반응 단계에 비해 지수량으로 생성하기 위한 연쇄반응으로 이루어진다. 연쇄반응의 생성물은 사용된 특정 프라이머의 말단에 상응하는 말단 서열을 갖는 별개의 핵산 복제물일 것이다.
출발 핵산으로서, 정제되거나 정제되지 않은 형태의 어떠한 핵산 서열도 목적하는 특정 핵산 서열을 함유하거나 함유하는 것으로 기대된다면 사용할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 예를들면, 일본쇄이거나 이본쇄일 수 있는 DNA 또는 mRNA를 포함한 RNA를 사용할 수 있다. 또한 각각이 한개의 본쇄를 함유하는 DNA-RNA 하이브리드를 사용할 수도 있다. 이들 핵산의 어떠한 혼합물도 또한 사용할 수 있거나, 동일하거나 상이한 프라이머를 사용하는 본명세서에서의 앞서의 증폭 반응으로부터 생성된 핵산을 사용할 수 있다. 증폭된 특정 핵산 서열은 단지 좀더 큰 분자의 분획일 수 있거나 초기에 불연속 분자로서 존재할 수 있으므로 특정 핵산 서열은 전체 핵산을 구성한다.
증폭될 서열이 초기에 순수형태로 존재해야할 필요는 없다 : 증폭된 서열은 완전한 사람 DNA에 함유된 β-글로빈 유전자의 일부 [참조 : Saiki et al., Science, 230, 1530 내지 1534(1985)]와 같은 복합 혼합물의 소분획이거나 특정 생물학적 샘플의 극소분획만을 구성할 수 있는 특정 미생물로 인하여 핵산 서열의 일부일 수 있다. 출발 핵산 서열은 동일하거나 상이할 수 있는 목적하는 특정 핵산 서열을 한개 이상 함유할 수 있다. 그러므로, 증폭 방법은 많은 양의 한가지 특정 핵산 서열을 생성하는데 유용할 뿐만 아니라 동시에 동일하거나 상이한 핵산 분자상에 위치한 한가지 이상의 상이한 특정 핵산 서열을 증폭시키는데 유용하다.
핵산은 예를들면 pBR 322와 같은 플라스미드, 클로닝된 DNA 또는 RNA, 또는 RNA, 또는 세균, 효모, 바이러스, 소기관, 및 고등 유기체(식물 또는 동물)를 포함한 모든 공급원으로부터의 천연 DNA 또는 RNA과 같은 어떠한 공급원으로부터의 수득할 수 있다. DNA 또는 RNA는 문헌 [Maniatis et al., supra, P. 280-281]에 기술된 것과 같은 여러 기술을 사용하여 혈액, 장악 융모와 같은 조직재료, 또는 양막세포로부터 추출할 수 있다.
증폭된 서열에 특이한 탐침을 사용하여 탐지할 경우, 세포를 저장 완충용액중에 현탁시키고 약 90 내지 100℃오 세포 융해 및 세포내 성분의 분산이 유발될때가지 일반적으로 1 내지 15분 동안 가열하면 핵산을 추출하지 않고서 세포를 직접 사용할 수 있다. 가열단계후, 증폭시약을 응해된 세포에 직접 가할 수 있다.
어떠한 특정 핵산 서열도 증폭방법에 의해 생성될 수 있다. 단지 필요로 하는 것은 한 개의 프라이머로부터 합성된 연장 생성물이 이의 주형(상보서열)으로부터 분리되었을 때 다른 프라이머를 예정된 길이의 핵산 서열로 연장시키기 위한 주형으로 작용하도록 서열을 따라 상대적 위치에서 목적하는 서열의 상이한 본쇄에 하이브리드화할 두개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조할 수 있을만큼 충분히 상세하게 서열의 양 말단에서의 염기의 충분한 수를 밝혀야만 한다.
서열의 양 말단에 존재하는 염기의 수를 좀더 상세히 파악하고 있을수록 표적 핵산 서열에 대한 프라이머의 특이성을 더욱 더 증가시킬 수 있으므로 본 발명의 효율성이 좀더 증가하게 된다.
본 명세서의 이하에서 사용된 용어 “프라이머”는 특히, 증폭될 단편의 말단 서열에 관한 정보가 미흡할 경우에 한개 이상의 프라이머를 의미할 수 있다. 예를들면, 핵산 서열을 단백질 서열 정보로부터 유추한 경우에, 유전적 양호의 변성에 근거한 모든 코돈 변형을 나타내는 서열을 함유하는 프라이머 집합을 각각의 본쇄에 대해 사용될 것이다. 이러한 집합체로부터의 한 개의 프라이머는 증폭될 목적 서열의 말단과 상동성일 것이다.
올리고뉴클레티드 프라이머는 예를들면, 상술한 포스포트리에스테르 및 포스포디에스테르 방법 또는 이의 자동화 방법과 같은 적합한 어떠한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 한가지 자동화 방법으로, 출발물질로서 디에틸포스포르아미다이트를 사용하여 문헌 [Beaucage et al., Tetrahedron Letters (1981), 22 : 1859-1862]에 기술된 바에 따라 합성할 수 있다. 변형된 고체 지지체상에 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 방법이 미합중국 특허 제4,458,066호에 기술되어 있다. 또한 생물학적 공급원(예, 제한 엔도뉴클레아제 분해물)으로부터 분리시킨 프라이머를 사용할 수도 있다.
특정 핵산 서열은 주형으로서 그 서열을 함유하는 핵산을 사용하여 제조한다. 1단계로서 각각의 핵산 본쇄를 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트 및 증폭되거나 검출될 각각의 상이한 핵산 서열에 대한 한개의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시킨다. 증폭되거나 검출될 핵산이 DNA일 경우, 이때의 뉴클레오티드 트리포스페이트는 dATP, dCTP, dGTP 및 TTP이다.
핵산 본쇄는 부가의 핵산 본쇄의 합성을 위한 주형으로서 사용한다. 이 합성작업은 적합한 어떠한 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 일반적으로한, 합성과정은 바람직하게는 pH 7 내지 9, 가장 바람직하게는 약 8의 수성 완충용액에서 진행시킨다. 바람직하게는, 두개의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 물과량(클로닝된 핵산을 기준으로 보통 약 1000 : 1의 프라이머 : 주형, 및 게놈 핵산을 기준으로 보통 약 106: 1의 프라이머 : 주형)을 분리된 주형 본쇄를 함유하는 완충용액에 가한다. 그러나, 본 발명의 방법을 진단용으로 사용한다면 상보 본쇄의 양을 알 수 없으므로 상보 본쇄의 양에 대한 프라이머의 양을 확실하게 결정할 수 없는 것은 확실하다. 그러나, 실제로, 증폭될 서열이 복잡한 장쇄 핵산본쇄의 혼합물중에 함유되어 있는 경우 일반적으로 프라이머의 첨가몰량은 상보 본쇄(주형)의 몰량에 비해 과다할 것이다. 본 발명의 효율성을 증가시키기 위해서는 과다한 몰량이 바람직하다.
바람직하게는 뉴클레오티드 트리포스페이트의 농도는 각각이 증폭용 완충용액중에서 150 내지 20μM이며, 완충용액중에는 MgCl2가 1.5 내지 2mM량으로 존재하여 반응의 효율성 및 특이성을 증가시켜 준다.
그런 다음, 증폭되거나 검출된 핵산이 일본쇄거나 이본쇄인가의 여부에 따라 생성된 혼합물을 처리한다. 핵산이 일본쇄 일 경우, 변성 단계를 사용한 필요가 없으며 반응혼합물을 프라이머의 상보 표적(주형) 서열에 프라이머의 하이브리드화를 촉진하는 온도에서 유지시킨다. 이렇나 온도는 일반적으로 약 35℃ 내지 65℃ 이상, 바람직하게는 약 37 내지 60℃이며 유효 시간은 일반적으로 0.5 내지 5분, 바람직하게는 1 내지 3분이다. 바람직하게는 Taq 폴리머라제 및 15량체 이상의 프라이머에 대해 45 내지 58℃를 사용하여 프라이머 하이브리드화의 특이성을 증가시킨다. 보다 짧은 프라이머는 좀더 낮은 온도를 필요로 한다.
최초 일본쇄 핵산의 상보 서열은 하나 또는 두개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 가하여 합성할 수 있다. 적당한 단일 폴라이머를 가하면, 프라이머, 열안정성 효소 및 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에 프랑머 연장 생성물이 합성된다. 이러한 생성물은 일본쇄 핵산에 부분적으로 상보적일 것이고 핵산 본쇄와 하이브리드화하여 상이한 길이의 본쇄 복제물을 형성하면서 이때 복제물은 상술한 바와 같이 일보쇄로 분리되어 두 개의 별개의 단일 상보 본쇄가 생성된다. 또다른 방법으로, 두개의 적당한 프라이머를 일본쇄 핵산에 가하여 반응을 수행할 수 있다.
핵산이 두 개의 본쇄를 함유하는 경우, 핵산의 본쇄를 분리한 다음 주형으로서 사용할 수 있다. 본쇄 분리 작업은 물리적, 화학적 또는 효소적 방법을 포함하는 적합한 어떠한 변성 방법에 의해 수행할 수 있다. 핵산의 본쇄를 분리하는 한가지 바람직한 물리적 방법은 핵산이 완전히 (>99%) 변성될때까지 핵산을 가열시키는 것이다.
전형적인 열변성 방법은 약 90 내지 105℃의 온도로 일반적으로 양 0.5 내지 5분 동안 가열한다. 바람직한 유효 변성온도는 0.5 내지 3분 동안의 90 내지 100℃이다. 또한 본쇄 분리는 헬리카제 계통의 효소, 또는 헬라카제 활성을 나타내며 리보 ATP의 존재하 DNA를 변성시키는 것으로 알려진 효소 RecA에 의해 유도될 수 있다. 헬리카제를 사용하여 핵산의 본쇄를 분리시키는데 적합한 반응조건은 문헌[Kuhn Hoffmann- Berling, CSH-Quantitative Biology, 43 : 63(1978)]에 기술되어 있으며 RecA를 사용한 기술이 문헌[C. Radding, Ann. Rev. Genetics, 16 : 405-37(1982)]에 기술되어 있다. 변성작업으로 길이가 동일하거나 상이한 두 개의 분리된 상보 본쇄가 생성된다.
이본쇄 핵산을 열로 변성시킬 경우, 존재하는 각 프라이머의 상보 표적(주형) 서열에 하이브리드화를 촉진하는 온도로 반응 혼합물을 냉각시킨다. 이 온도는 시약에 따라 보통 약 35℃ 내지 65℃, 바람직하게는 37 내지 60℃이며 이 온도에서 유효시간동안, 일반적으로 0.5 내지 5분, 바람직하게는 1 내지 3분 동안 유지한다. 실제로, Taq 폴리머라제의 경우에는 온도를 약 95℃에서 37℃ 정도, 바람직하게는 약 45℃ 내지 58℃로 낮추며, 하이브리드화는 이 범위내의 온도에서 일어난다.
핵산이 일본쇄거나 일본쇄인지에 따라, 열안정성 효소를 변성 단계시, 또는 온도 저하시키거나 온도가 하이브리드화 촉진시의 온도범위일 경우에 가할 수 있다. 그런다음, 반응 혼합물을 효소활성의 촉진 또는 최적온도 즉, 하이브리드화된 프라이머 및 주형으로부터 프라이머 연장 생성물의 합성을 촉진하는데 효소의 활성을 증가시키기에 충분한 온도로 가열한다. 이 온도는 실제로 각 핵산 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장 생성물을 합성하기에 충분해햐 하지만, 상보 주형으로부터 각 연장 생성물을 변성시킬만큼 높아서는 안된다(즉, 온도는 일반적으로 약 80℃ 내지 90℃ 미만이다).
주로 사용된 핵산(들) 및 효소의 형태에 따라, 이 합성반응에 유효한 전형적인 온도범위는 일반적으로 약 40 내지 80℃, 바람직하게는 50 내지 75℃이다. 써머스 아쿠아티쿠스로부터의 DNA 폴리머라제를 사용한 경우, 더욱 바람직한 온도 범위는 약 65 내지 75℃이다. 합성에 필요한 시간은 주로 온도, 핵산의 길이, 효소 및 핵산 혼합물의 복잡성에 따라 0.5 내지 40분 이상, 바람직하게는 1 내지 3분일 수 있다. 핵산이 길어질수록 일반적으로 필요한 시간은 더욱 더 길어진다. 디메틸설폭사이드(DMSO)는 Taq 폴리머라제 효소 활성을 억제시키는 것으로 밝혀졌기 때문에 반드시 필요하지는 않다.
새로 합성된 균주 및 이의 상보 핵산 본쇄로 이본쇄 분자를 형성하여 본 방법에 후속단계에 사용한다. 다음 단계에서, 일본쇄 분자의 본쇄를 변성시키기에 유효한 온도에서 그러나 당해 열안정성 효소가 완전하고도 비가역적으로 변성되거나 불활성될만큼 높지 않은 온도에서 열변성시켜 분리시킨다. 이 온도범위는 주로 효소종류 및 핵산 길이에 따라 일반적으로 약 90 내지 105℃, 더욱 바람직하게는 90 내지 100℃이며 변성에 필요한 시간범위는 주로 온도 및 핵산 길이에 따라 전형적으로 0.5 내지 4분이다.
이 시간 후에, 전 단계로부터 생성된 프라이머의 상보 일본쇄 분자(주형)에 대한 프라이머의 하이브리드화를 촉진하는 수준으로 온도를 낮춘다. 이러한 온도는 상술한 바와 같다.
이 하이브리드화 단계후, 또는 하이브리드화 단계 대신에(또는 동시에), 열안정 효소의 활성을 촉진시켜 주형으로서 전 단계로부터 새로이 합성된 본쇄를 사용하여 프라이머 연장 생성물을 합성시키기에 유효한 온도로 조정한다. 다시말해서, 전술한 바와 같이 연장 생성물을 이의 주형으로부터 분리(변선)시킬만큼 높은 온도에서는 안된다(보통 40 내지 80℃로 0.5 내지 40분 동안, 바람직하게는 50 내지 70℃로 20초 동안). 이 단계동안에 하이브리드화가 일어날 수 있으므로 변성 후 냉각의 전 단계가 필요치 않다. 동시 단계를 사용한 경우에, 바람지한 온도범위는 50 내지70℃이다.
본쇄 분자의 가열 및 냉각 단계, 하이브리드화, 및 연장 생성물 합성은 서열의 궁극적인 용도에 따라 필요한 만큼 반복하여 목적하는 양의 특정 핵산 서열을 생성한다. 유일한 제약조건은 프라이머, 열안정성 효소 및 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재량이다. 바람직하게는 상기 단계는 2회 이상 반복한다. 검출에 사용하기 위해, 반복 회수는 샘플의 성질에 의해 결정될 것이다. 예를들면, 증폭될 샘플이 순수하면 필요한 반복회수는 적어질 것이다. 만일 샘플이 핵산의 복합 혼합물일 경우, 시그날 서열을 검출하기 위해 신호 서열을 충분히 증폭시키기 위해서는 더 많은 반복회수가 필요하다. 일반적인 증폭 및 검출을 위해서는, 본 발명을 20회 이상 반복하는 것이 바람직하다.
표지된 서열-특이적 탐침을 하기한 바와 같이 사용한 경우, 바람직하게는 각 단계를 5회 이상 반복한다. 이러한 탐침으로서 사람 게놈 DNA를 사용한 경우, 확실히 탐지가능한 시그날이 생성될만큼 충분히 즉, 배경 소음이 검출에 아무런 장애를 주지않을 정도로 서열을 증폭시키기 위해서는 바람직하게는 본 방법을 15 내지 30회 반복한다.
하기에서 보다 상세히 기술되는 바와 같이, 특정 핵산 서열의 생성량은 지수적 양상으로 축적될 것이다.
각각의 변성 단계후 효소를 공급할 수 필요가 있을 경우에, 효소가 비가역적으로 변성되거나 불화성되지 않는다면 처음 첨가 이후에, 뉴클레오티드, 프라이머, 또는 열안정성 효소를 부가족으로 가할 필요가 없다. 그러나, 각 단계에서 이러한 물질을 가해도 반응에 불리한 영향을 미치지는 않을 것이다.
최초 핵산 또는 핵산의 혼합물로부터 한 개 이상의 특정 핵산 서열을 생성해야 할 경우, 적당한 수만큼의 상이한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한다. 예를들면, 두 개의 상이한 특정 핵산 서열을 생성시켜야 하는 경우, 4개의 프라이머를 사용한다. 두개의 프라이머는 특정 핵산 서열중 하나에 대해 특이적이고 다른 두 개의 프라이머는 제2특정 핵산 서열에 대해 특이적이다. 이러한 방식으로, 두 개의 상이한 특정 서열 각각을 본 발명의 방법에 따라 지수적으로 생성할 수 있다.
특정 핵산 서열이 목적하는 양만큼 생성되도록 적당한 시간이 경과된 후, 공지의 방법(예 : EDTA, 페놀, SDS 또는 CHCl3를 가함)으로 효소를 불활성화시키거나 반응성분을 분리시킴으로서 반응을 중단시킨다.
증폭과정은 연속적으로 수행될 수 있다. 자동 공정의 한 양태로서는 반응혼합물이 일정수준에서 일정기간동안 조절되도록 계획되는 온도로 순환될 수 있다.
이러한 목적을 위한 기계로서는 본 발명의 증폭 반응을 조절하는 자동기기가 있다. 이 기기는 제1저장소내에서 조절된 온도로 저장된 효소 액체를 컴퓨터에 의해 온도가 조절된 제2저장소로 이전시켜 특정한 배양계획을 수행하도록 하는 컴퓨터하에서의 액체조절시스템을 이용한다. 제2저장소는 뉴클레오티드 트리포스페이트 및 프라이머에 덧붙여져 증폭될 핵산 서열(들)을 저장한다. 상기 컴퓨터에는 사용자가 공정변수를 입력시켜 배양시간 및 온도, 전이될 효소의 양 등과 같은 증폭 서열에서의 여러단계의 특성을 조절하는 이용자 점유 영역이 포함된다.
사용될 수 있는 바람직한 기계는 효소가 매번 회로에서 전이될 필요가 없기 때문에 액체 조절 시스템을 갖지 않는 온도 순환을 이용한다.
1. 일정한 수의 시험관, 바람직하게는 500μl 시험관이 고정될 수 있고 뉴클레오티드 트리포스페이트, 프라이머, 핵산 서열 및 효소의 반응 혼합물을 함유하는 열전도성 용기.
2. 가열, 냉각 및 실온 이상 및 이하의 열전도 용기로 유지시키는 기관, 여기에서 이러한 용기가 가열, 냉각 또는 유지되는 온도에서 또는 온도로 조절하는 조절 신호를 수용하기 위한 입력기를 갖는다(이것은 뉴저지, 트랜톤 소재의 Materials Products Corporation에서 시판되는 펠티어(Peltier) 가열 펌프이거나 물-열교환기일 수 있다).
3. 상기 기관의 압력기와 연합되어 서열의 증폭, 온도수준, 및 온도구배 및 타이밍을 자동으로 조절하는 신호를 발생하는 컴퓨터 기관(예를들어 마이트로프로세서 조절기).
다른 양태로서, 프라이머 연장 생성물의 합성에 사용되는 효소는 칼럼내에서 고정화시킬 수 있다. 다른 반응 성분은 펌프를 이용하여 칼럼 및 시리즈내의 가열 코일을 통해 연속적으로 순환될 수 있다. 이렇게 함으로써 생성된 핵산은 효소를 불활성화 시키지 않고도 반복적으로 변성시킬 수 있다.
증폭 프로토콜은 하기에서 도식적으로 설명하며, 여기에서 상보본쇄[S+] 및 [S-]로 구성된 목적 서열[S]를 함유하는 이본쇄 DNA는 핵산으로 이용된다. 제일 처음 및 각각의 연속된 반응주기 동안, 원래의 주형상의 각 올리고뉴클레오티드 프라이머의 연장에 의해 단지 프라이머 한 개만으로 종료되는 무한정 길이의 새로운 ss DNA 분자 생성물 하나가 생성된다. 이후에서 “긴 생성물”로 언급되는 이들 생성물은 산술증가식으로 축적되는 것으로서, 즉, 수회의 주기를 거친 후의 양은 주기의 횟수에 비례된다.
이렇게 생성된 긴 생성물은 이후 주기동안에 올리고뉴클레오티드프라이머 하나 또는 다른 하나에 대한 주형으로서 작용하게 되고 목적하는 서열[S+] 또는 [S]의 분자가 생성된다. 이들 분자는 [S+] 및 [S-]를 생성하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 하나 또는 다른 하나의 주형으로서 작용하게 되고 이러한 연쇄 반응은 계속 유지될 수 있으므로, 주기의 횟수에 비하여 자수증가율표[S]가 축적된다.
의도된 것 이외의 올리고뉴클레오티드 하이브리드화에 의해 생성된 부산물은 자기-촉매적인 것이 아니므로(드물게 예외가 있다) 이것도 역시 산술증가율로 축적된다.
증폭될 특정 서열[S]는 하기와 같이 도식적으로 묘사될 수 있다 :
[S+] 5'AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3'
[S-] 3'TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5'
적합한 올리고누클레오타이드 프라이머는
프라이머 1 : 3' GGGGGGGGGG 5'
프라이머 2 : 5' AAAAAAAAAA 3'이므로 [S]를 함유하는 DNA
…zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz…
…zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz…
가 일본쇄로 분리되고 이의 일본쇄가 프라이머 1 및 2와 하이브리드되는 경우, 하기의 연장화 반응은 4가지 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서 열안정성 폴리머라제에 의해 촉매될 수 있다 :
3' 5'
연장←------GGGGGGGGGG 프라이머 1
…zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz…
최초 주형본쇄＋
최초 주형본쇄－
…zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzzz
프라이머 2 AAAAAAAAAA -------→ 연장
5' 3'
형성된 2개의 중복체를 변성시켰을때, 그 생성물은
3'5'
…zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG
새로이 합성된 긴 생성물 1
5'3'
…zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz…
최초의 주형본쇄
3'5'
…zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz…
최초의 주형본쇄
5'3'
AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz…
새로이 합성된 긴 생성물 2 이다.
이들 4개의 본쇄가 다음 주기에서 프라이머 1 및 2와 재하이브리드화 되도록 한다면, 열안정성이 폴리머라제는 하기 반응을 촉매하게 된다 :
프라이머 2 5'AAAAAAAAAA -------→ 여기까지 연장
3'…zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5'
새로이 합성된 긴 생성물 1
연장 ←-------GGGGGGGGGG 5' 프라이머 1
5'…zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz…3'
최초의 주형 본쇄+
프라이머 2 5' AAAAAAAAAA------------→ 연장
3'…zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz…5'
촤초의 주형본쇄－
여기까지 연장←--------GGGGGGGGGG 5' 프라이머 1
5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz…3'
새로이 합성된 긴 생성물 2
상기 중복체 4개의 본쇄를 분리하면 하기와 같은 본쇄가 생성된다 :
5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3'
새로이 합성된 [S']
3'…zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5'
제1주기시 합성된 긴 생성물 1
3'…zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5'
새로이 합성된 긴 생성물 1
5'…zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz…3'
최초의 주형 본쇄＋
5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz…3'
새로이 합성된 긴 생성물 2
3'…zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz…5'
최초의 주형 본쇄－
3' TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5'
새로이 합성된 [S-]
5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz…3'
제1주기에서 합성된 긴 생성물 2
하나의 프라이머의 올리고뉴클레오티드 서열 및 다른 프라이머의 상보적 서열과 종료되는 각각의 본쇄는 생성될 목적하는 특정 핵산서열[S]이다.
핵산은 복제되지 않으므로 전과정에서 최초의 핵산의 양이 일정하게 유지된다. 긴 생성물의 양은 이들의 최초 핵산으로부터만 생성되므로 산술적으로 증가한다. 특정 서열의 양은 지수적으로 증가한다.
그러므로 상기의 특정 서열이 우세한 종류가 된다. 이것은 하기 표에 설명되어 있으며, 각 주기에 100% 효율로 가정하여 n번 주기후에 이론적으로 존재할 수 있는 종류의 상대적인 양을 나타낸다.
0 내지 n회 주기를 거친 후의 이본쇄의 수
Figure kpo00001
일본쇄 핵산을 주형으로 사용할때는 긴 생성물 하나만 매회 주기에 형성한다.
일정 서열내의 서열은 증폭될 서열의 내부 서열(말단이 아닌 서열)에 상보적인 프라이머 한 세트를 증폭반응이 1회 이상의 주기를 거친 후 가함으로써 반응의 특이성을 더욱 증대시키기 위한 증폭반응 일정한 횟수 후에 증폭될 수 있다. 이러한 프라이머는 어떠한 단계에도 가할 수 있으며 더 짧은 증폭 단편을 제공하게 된다. 또한 더 긴 단편은 비-상보적 말단을 갖고 증폭반응에 이미 사용된 프라이머로 중복 부위를 갖는 프라이머를 사용하여 제조될 수 있다.
본 명세서의 방법은 특수한 핵산 서열을 적합한 발현 벡터에 삽입하기 위해 클로닝하는데 이용될 수 있다. 상기 벡터는 적합한 숙주 생물체를 재조합 DNA 기술의 표준 방법에 의한 서열의 유전자 생성물을 생성하도록 형질전환시키는데 이용될 수 있다.
본 명세서의 증폭 과정은 원래의 주형 핵산, 예상되는 목적 증폭산물, 및 다양한 목적하지 않은 배경산물의 결과로서 핵산 혼합물을 생성할 수 있다. 증폭된 생성물은 최초 주형 DNA가 이형이배체 게놈에서와 같이 다수의 목적 서열을 함유하거나 여기에 관련된 유전자 계(family)가 있는 경우 혼합물로 존재할 수도 있다.
본 명세서에서의 프라이머는 증폭 반응에 의해 생성된 DNA 혼합물의 클로닝을 신속하고 특정하게 보조하도록 변형될 수 있다. 이러한 변형중 한가지는 제한부위가 프라이머 각각에 또는 증폭되고 클로닝될 서열중에 함유되도록 하는 것이다. 이렇게 하면 동일하거나 상이한 제한부위가 프라이머의 5' 말단에 삽입되어 증폭된 생성물의 양말단에 제한부위를 갖는 결과를 가져온다. 적합한 효소로 절단하면 증폭된 생성물은 쉽게 플라스미드 또는 바이알 벡터내에 삽입되고 클로닝될 수 있다. 이러한 클로닝에 의해 혼합물이 아닌 각각의 증폭된 생성물을 분석하거나 발현시킬 수 있다.
프라이머가 여기에 삽입될 제한부위를 갖는 경우, 동일한 제한 부위를 양쪽의 프라이머에 사용할 수 있다. 그러나 상이한 부위를 사용하면, 생성물이 특정한 방향성을 갖고 삽입되고 다수의 삽입 뿐만 아니라 두개의 프라이머중 하나만을 기초로 하는 증폭반응으로부터 유도된 삽입 또한 억제된다. 여기에서 특정한 방향성은 일본쇄 서열화 벡터로 클로닝할때, 일본쇄 하이브리드화 탐침을 사용할때, 또는 클론된 생성물이 발현될때 유용하다.
프라이머를 제조하는 한가지 방법은 표적 서열과의 차이가 최소화된 프라이머 서열을 선택하는 것이다. 프라이머 각각이 위치하게 되는 부위는 목적하는 벡터에 적합한 제한부위의 상동성으로 선별한다. 예를들어, 표적서열 "CAGTATCCGA…"는 Bam HⅠ 부위를 함유하는 서열과 한 개의 염기만이 다르다. 프라이머 서열은 이의 3' 말단이 표적서열과 정확히 매치하고 이의 5' 말단 가까이에 변형된 서열 및 제한부위를 갖는 것(예를들어, "CAGgATCCGA…", 여기에서 소문자는 표적 서열과 잘못 짝지원진 것을 의미한다)으로 선택된다.
이렇게 최소한으로 변형된 서열은 프라이머가 최초의 표적 서열에 히이브리드되고 중합반응을 개시하는 능력에는 영향을 끼치지 못한다. 제1증폭 주기후에, 복제된 프라이머는 표적이 되고 새로운 프라이머와 정확히 짝을 짓게 된다.
증폭과정후, 생성물을 적합한 제한효소로 절단하고, 제한 분해물은 예를들어 탈염화 칼럼, 또는 분자량 크로마토그라피 칼럼을 통과시키거나 막을 통과시킴로써 뉴클레오티드 트리포스페이트와 같은 연결 억제제 및 염으로부터 임의로 분리시키고 클로닝될 증폭 서열을 함유하는 분해 생성물(들)은 연결시켜 박테리오파아지 M13과 같은 클로닝 벡터에 연결시킴으로써 삽입시킨다. 클로닝 벡터는 일반적으로 선택성 마아커를 가지며 프로모터 또한 임의로 가질 수 있다. 상기 유전자가 단백질을 암호화 하는 경우 공지의 기술을 이용하여 이 유전자를 서열화 하고/하거나 발현시킬 수 있다. 이 유전자는 증폭과정중에 적합한 프라이머를 가하여 서열화 될 수 있으며 상기 프라이머는 서열화될 목적 부위애 상보적인 것이다. 이 프라이머는 연장 생성물을 형성할 것이며 이러한 연장 생성물의 증폭 정도는 서열 정보를 제공한다.
프라이머를 제조하는 또하나의 방법은 표적 서열로부터 프라이머의 3' 말단을 취하고 목적하는 제한부위(들)를 프라이머의 5' 말단에 첨가하는 것이다. 상기의 예로서, Hind Ⅲ 부위를 서열 “cgaagcttCAGTATCCGA…”(여기에서 소문자는 상기에서 설명한 바와 같다)를 만들기 위해 첨가할 수 있다. 첨가된 염기는 증폭반응의 제1주기에서는 하이브리드화 과정에 참여하지 않지만 그 다음 주기에서는 짝을 이룬다. 최종 증폭 생성물을 제하효소(들)로 절단하고 상기에 서술된 바와 같이 클로닝시키고 발현시킨다. 증폭될 유전자는 예를들어 사람의 베타-헤모글로빈 또는 사람의 HLA DQ, DR 또는 DP-α 및 -β유전자일 수 있다.
이외에, 덜 바람직하고 덜 효과적이긴 하지만, 오히려 점성 말단 연결(제한효소 사용) 보다 평활 말단 연결을 이용하는 클로닝 방법을 이용하고, 클로닝될 프라이머 또는 서열(들)중에 제한효소에 관여되지 않은 기본적인 증폭 과정을 이용하는 방법이 있다. 그러나 연결반응을 수행할 수 있을 정도로 충분히 증폭된 서열(들)을 생성시키기 위하여 각 단계를 충분히 반복하여야 한다. 평활 말단 연결 반응은 점성말단 연결 반응보다 서열(들) 및 클로닝 벡터(들)이 더 높은 농도로 존재해야 한다. 또한, 연결반응은 T4 리가제, 이. 콜라이 리가제 및 리가제와 같은 리가제의 존재하에서 수행되어야 한다. 증폭 생성물을 수득한 후, 연결과정은 본 분야의 숙련가에게 공지된 조건을 이용하는 표준과정에 의한다.
평활 말단 연결 과정을 포함하지 않는 클로닝 방법은 증폭된 생성물을 클로닝 벡터에 삽입하는데 있어서 방향성 또는 복합성을 조절한다.
또한, 본 명세서의 과정은 시험관내 돌연변이를 유발시키는데 이용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 증폭될 헥산 서열과 정확히 상보적일 필요는 없다. 단지, 이들은 열안정성 효소에 의해 연장되는 서열과 충분히 하이브리드화할 수 있기만 하면 된다. 최초 주형과 정확히 상보적이지 않은 프라이머를 이용한 증폭 반응의 생성물은 시험관내 돌연변이에 도입시킴으로써 주형보다는 프라이머 서열을 함유하게 된다. 더이상의 주기중에서도 잘못 짝지워진 프라이밍이 필요하지 않기 때문에 돌연변이는 효율이 감소되지 않은 채로 증폭된다. 이렇게 생성된 돌연변이는 표준 분자 생물학적 기술로 적합한 벡터에 삽입될 수 있으며, 변형된 단백질을 생성하는 능력과 같은 돌연변이 특성을 이 벡터에 부여할 수 있다.
상기에 서술된 바와 같이 DNA 서열을 변경시키는 과정은 상이한 프라이머를 사용하여 변형된 DNA를 반복시킬 수 있으므로 서열의 변화를 더 크게 유도할 수 있다. 이러한 방법으로 돌연변이된 서열의 시리이즈가 점진적으로 생성될 수 있으며, 여기에서 이 시리이즈에 대한 각각의 새로운 첨가는 최종의 것과 최소한으로 다를 수 있으나 최초 DNA 유래성 서열과는 최대한 다를 수 있다. 이러한 방법으로 궁극적으로는 프라이머로서 기능하기에는 너무 많이 잘못 짝지워진 무력성 때문에 단일과정으로는 실행할 수 없는 그러한 변화가 생성될 수 있다.
또한 플라이머는 증폭될 본쇄에 상보적인 서열을 함유하는 프라이머의 양이 충분한 경우 이의 서열의 일부로서 비-상보적인 서열을 함유할 수 있다. 예를들어, 주형서열(예를들어, 프로모터, 링커, 암호화 서열등)에 상보적이지 않은 뉴클레오티드 서열은 프라이머 하나 또는 양쪽 모두의 5' 말단에 연결될 수 있으며, 이렇게 함으로써 증폭 과정의 생성물에 부착된다. 연장 프라이머가 첨가된 후, 비-상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 새로운 주형을 목적하는 양만큼 삽입시키기 위해 주기가 충분히 순환하도록 한다. 이렇게 함으로써 간단한 기술을 사용하여 비교적 짧은 시간(예를들어, 2시간 이하)내에 결합된 단편을 다량 생산할 수 있다.
본 명세서의 방법은 또한 전염병, 암과 같은 유전적 기능장애 또는 세포성 기능장애와 관련된 특정 핵산서열 예를들어, 발암 유전자(oncogenes)를 감별 및/또는 특징화하는데 이용될 수 있다. 증폭 반응는 분석에 이용할 핵산의 양이 매우 소량인 경우, 예를들어 태반 세포로부터 수득된 DNA를 이용하여 겸상 적혈구 빈혈증을 출생전 진단할때 유용하다. 특히 선천적으로 감응성이 없을 수 있는 소량의 시료를 비-방사선 동위원소 검출 분석으로 분석하고자 할때, 또는 방사선 동위원소 기술을 사용하더라도 신속한 감별을 원할때는 증폭과정이 유용하다.
본 발명의 목적에서 유전적 질환으로는 예를들어 겸상 적혈구 빈혈증, α-지중해 빈혈증, β-지중해 빈혈증 등과 같은 모든 생물체의 게놈성 DNA에 유발되는 특수한 결실 및/또는 돌연변이가 포함될 수 있다. 겸상 적혈구 빈혈증은 1985년 12월 11일자로 공고된 유럽 특허 공보 제164,054호에 기술된 바와 같이 올리고머 제한 분석을 통하여, 또는 본 발명의 방법에 의해 적합한 DNA 서열을 증폭시키는 RFLP와 유사한 분석을 통하여 용이하게 검진될 수 있다. α-지중해 빈혈증은 서열의 부재를 기준으로 감별할 수 있고, β-지중해 빈혈증은 질병을 유발시킨 돌연변이와 인접하게 연결된 다형성 제한부위의 존재를 근거로 하여 감별할 수 있다.
이러한 유전절 질환 모두는 적합한 서열을 증폭시키고, 방사성 동위원소 탐침을 사용하지 않고도 써던(Southern) 블럿법에 의해 이를 분석함으로써 검진될 수 있다. 이러한 과정에 있어서, 예를들어 목적하는 서열을 매우 낮은 농도로 함유하는 양막액으로부터 수득한 DNA 시료 소량을 증폭시키고, 제한효소로 절단한 후 써던 블럿팅 기술로 분석한다. 비-방사성 동위원소 탐침을 이용할 경우 증폭된 시그날을 높은 농도로 하면 효과적이다.
다른 양태에 있어서, DNA 시료 소량을 유용한 농도로 증폭시킬 수 있으며, 연장 반응 주기를 더 수행하고 여기에서 쉽게 검출될 수 있는 뉴클레오티드 유도체(예를들어32P-표지되거나 바이오틴 표지된 뉴클레오티드 트리포스페이트)를 최종 DNA 생성물에 직접 도입시킨 후 제한방법 및 전기영동적 분리 또는 다른 적합한 방법으로 분석할 수 있다.
또다른 양태로서, 핵산은 증폭반응전에 특정 제한 엔도뉴클레아제에 노출시킬 수 있다. 절단되는 서열은 증폭될 수 없으므로, DNA 시료의 앞서의 제한에도 불구하고 증폭된 단편의 출현은 증폭된 서열내에 엔도뉴클레아제에 대한 부위가 존재하지 않음을 암시한다. 증폭된 서열의 존재 또는 부재는 적합한 방법으로 감별될 수 있다.
이러한 기술의 실제적인 적용은 본 명세서 및 EP 제164,054호(상기 참조), 및 문헌[참조 : Saiki et al., Bio/Technology, 3, 1008-1012(1985)]에 기술된 올리고머 제한 기술을 통해 겸상적혈구 빈혈증에 검진을 촉진하는데 이용함으로써 증명될 수 있다. 겸상적혈구 빈혈증은 β-글로빈 유전자의 여섯번째 코돈의 염기쌍 하나의 변화에 의해 유발되는 헤모글로빈 질병이다.
본 발명의 방법은 또한 서열-특이적 올리고뉴클레오티드를 이용하여 핵산 서열(예를들어 게놈성 DNA)중의 단일 염기쌍 변이를 직접 판별하는데 이용될 수 있다. 이러한 방법에 있어서 서열변이가 암, 전염병에 의하거나 또는 유전병, 예를들어 유전적 장해에서 기인되더라도, 제한분해, 전기영동 및 겔 조작 등을 필요로 하지 않고도 직접 판별할 수 있다. 탐침의 특이성 및 감응성이 개선된 경우, 증폭 반응후의 점선 블럿 형상내의 서열-특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하면 인식할 시그날을 6시간 내에 0.04μg 시료로 수득할 수 있다. 또한 막에 점적시킨 시료의 양이 0.1 내지 0.5μg 으로 증가될 경우 이전에 사용한 방사성 동위원소 탐침보다는 비-방사성 동위원소적으로 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 또한 하기에 기술된 과정은 크기가 19-머 미만인 서열-특이적 올리고뉴클레오티드의 이용에 적용되며 이렇게 함으로써 더욱 구별되는 서열-특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하도록 한다.
유전학적 질병에 있어서 RFLP는 이 질병과 관련된 다형성 제한 부위를 필요로 하는 반면, 서열 특이적 올리고뉴클레오티드는 유전적 장해를 직접 검진할 수 있으므로 단일-염기 돌연변이에 의해 유발되는 헤모글로빈 C 질병, α-1-항트립신증 및 β-지중해 빈혈증과 같은 질병을 분석하는데 일반적으로 더욱 유용하다. 또한 올리고뉴클레오티드는 열안정성 효소를 포함하는 서열-특이적 올리고뉴클레오티드를 기초로 하는 HLA 타이핑 킷트(kit)의 실현성을 지시함으로써 상이한 대립인자(예를들어, HLA 타이핑)을 나타내는 유전적 변이체와 구분하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 한 양태에 있어서, 서열중의 뉴클레오티드 변이를 검진 하려는 경우 뉴클레오티드 변이를 함유하는 것으로 추정되는 각 핵산의 각각의 쇄에 대한 프라이머 하나를 이용하여 상기에 기술한 바와 같이 증폭한 시료를 막 시리즈에 직접 점적시키고 각각의 막을 서로 다르게 표지된 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 탐침과 하이브리드화시킨다. 막에 시료를 점적하는 과정은 문헌[참조 : Kafotos et al., Nucleic Acids Research, 7 : 1541-1552(1979)]에 기술되어 있다.
막에 결합된 DNA 시료는 탐침을 가하기 전에, 니트륨 도데실 설페이트, 피콜(Ficoll), 혈청 알부민 및 각종 염을 함유하는 예비하이브리드화 용액으로 전처리할 수 있다. 그후 검출하고자 하는 각 서열 변이에 특이적인 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 예비융합화 용액과 유사한 하이브리드화 용액에 가한다. 하이브리드화 용액을 막에 가하고 막을 탐침 유혈 및 길이, 성분의 유형 및 농도 등에 의존하는 하이브리드화 조건에 적용시킨다. 일반적으로 하이브리드화를 약 25 내지 75℃, 바람직하게는 35 내지 65℃에서 0.25 내지 50시간, 바람직하게는 3시간 이하 동안에 수행한다. 조건의 한정도가 클수록 탐침과 시료 사이의 하이브리드화에 필요한 상보성이 커진다. 기본 농도가 높으면 이에 따라서 한정도가 증가될 수 있다. 한정 조건은 세척과정중에도 적용될 수 있다.
하이브리드화 후, 시료를 25 내지 75℃에서 약 10분 내지 1시간 동안 온도에 따라 표준 식염 인산염 EDTA(SSPE)(NaCl 180mM, NaHPO410mM 및 EDTA 1M, pH 7.4)용액의 여러가지 농도로 1회 또는 2이상 세척하는 것과 같은 적절한 방법을 이용하여 하이브리드화 되지 않은 탐침을 세척해낸다. 표지는 적합한 검출 기술을 이용하여 검진한다.
본 발명에서 사용된 서열-특이적 올리고뉴클레오티드는 상기에 기술된 바와 같이 프라이머를 제조하고 선별하기 위해 일반적으로 제조되고 선택되는 올리고뉴클레오티드이다. 상기에서와 같이 서열-특이적 검출하고자 하는 뉴클레오티드 변이부위까지 정에 이르는 서열 영역을 함유해야 하며 검출하려는 뉴클레오티드변이 부위에 특이적인 것이어야 한다. 예를들어, 시료가 겸상 적혈구 빈혈증에 대한 돌연변이를 함유하는지의 여부를 검진하려면, 정상적인 β-글로빈 유전자의 특성을 지닌 뉴클레오티드 서열 부위를 함유하도록 제조된 올리고뉴클레오티드 및 겸상적혈구 대립인자의 특성을 지닌 뉴클레오티드 서열을 함유하도록 제조된 올리고뉴클레오티드가 있어야 한다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 시료가 돌연변이를 함유하는지의 여부를 측정하기 위해 동일한 시료의 중복체에 하이브리드화시킨다.
HLA 클래스 Ⅱ유전자의 다형성 부위를 제1엑손의 특정부위에 고정시키고 보존 서열을 양쪽에 나열시켜서 제1엑손의 보존된 5' 및 3' 말단의 상대쇄에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조할 수 있다.
HLA 클래스 Ⅱ유전자의 다형성 부위를 측정하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드의 수는 유전자의 종류에 따라 다양하며, 여기에서 유전자는 뭉치거나 각기 확산될 수 있는 염기쌍 변이영역을 갖는다. HLA-DQ-α의 경우와 같이 영역이 뭉쳐진 경우, 각각의 대립 인자에 대해 하나의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. HLA-DQ-β 및 HLA-DR-β의 경우와 같이 영역이 각기 확산된 경우, 대립인자성 변이 부위를 각기 내포하는 하나 이상의 탐침을 각각의 대립인자에 대하여 사용한다. HLA-DQ-β 및 HLA-DR-β의 경우 대립인자성 변이가 유발될 수 있는 부위의 3영역에 대하여 3가지 탐침을 사용한다. 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)의 검진에는 HLA-DR-β 제2엑손에 대한 4가지 탐침을 사용한다.
반수체형(Haplotype)은 집단내의 분리분석을 통하여 경우에 따라 각각의 DNA 시료를 직접 분석함으로써 추정될 수 있다. 서열-특이적 올리고 뉴클레오티드 반응도의 특이적 대립인자성 조합(반수체형)은 이형접합체성 세포내에서 증폭반응 전에 게놈성 DNA를 제한효소를 분해시킴으로써 측정될 수 있다.
예를들어, DQβ에서, 단일의 증폭 영역내에 변이성이 높은 3개의 소영역 A,B,C가 발견되었고, 각 영역(A1-6, B1-6, C1-6)에 6개의 상이한 서열이 존재한다면, 이들 각각은 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 탐침 분석에 의해 DQβ 부위내에 가능한 반수체형 조합으로서 A1, B2, C1 : A1, B2, C4 : A2, B2, C1 : A2, B2, C4 : A1, B3, C1 : A1, B3, C4 : A1, B2, C1 : 및 A1, B2, C4를 가질 수 있는 A1, A2 : B2, B3 : C1, C4를 함유하는 것으로 유형을 나눌 수 있다.
증폭반응전에 다형성 제한 효소로 게놈성 DNA를 분해시키고 이 효소가 프라이머 사이의 양쪽 대립인자 모두를 절단해낸다면, 증폭 반응이 결여되었기 때문에, 서열-특이적 탐침과 전혀 반응하지 않으므로 이 결과는 무의미한 것이다. 효소가 대립인자 양쪽 모두를 절단하지 않는 경우에도, 탐침은 분해된 게놈성 DNA와 분해되지 않은 게놈성 DNA에 대하여 동일한 결과를 나타내므로 이 결과도 무의미한 것이다. 그러나 효소가 대립인자 하나만 절단하는 경우는 분해된 DNA와 분해되지 않은 DNA에 대한 탐침의 반응 양식을 비교함으로써 양쪽의 반수체형을 추정할 수 있다.
반수체형은 절단되지 않은 게놈성 DNA로 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 반응성을 비교하여 추정할 수 있고 하나 또는 여러 효소로 절단된 게놈성 DNA는 다형성이 있으며 프라이머 사이에 인식 부위가 있는 것으로 인지된다.
서열-특이적 올리고뉴클레오티드의 길이는 측정하고자 하는 특정 표적 분자, 올리고뉴클레오티드의 공급천, 및 뉴틀레오티드 조성을 포함하는 여러 요인에 따른다. 본 발명의 목적을 위해 서열-특이적 올리고뉴클레오티드가 뉴클레오티드를 더 많거나 더 적게 함유할 수 있더라도 전형적으로 15 내지 25개의 뉴클레오티드를 함유한다.
길이가 적어도 19-머인 올리고뉴클레오티드는 특이성 및/또는 감응성을 증진시킬 수 있는 반면, 19-머이하, 예를들어 16-머인 탐침은 하나만 잘못 짝지워진 경우에도 더욱 탈안정화되므로 서열-특이적 차이는 더욱 증가될 수 있다. 증폭반응이 특이성을 증가시키므로 길이가 길수록 결정도가 낮아지며 하이브리드화 및 세척 온도는 동일한 염 농도에 대해 더욱 낮을 수 있으므로 길이가 19량체 보다 작은 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직하다.
막위에 처음 시료가 고정된 부분을 올리고뉴클레오티드로 검진하며 올리고뉴클레오티드는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적인 방법으로 측정할 수 있는 표지 잔기를 표지되어야 한다. 면역화학적 방법은 적절한 조건하에서 올리고뉴클레오티드와 복합체를 형성할 수 있는 항체를 포함하며, 생화학적 방법에는 적절한 조건하에서 올리고뉴클레오티드와 복합제를 형성할 수 있는 폴리펩티드 또는 렉틴을 포함한다. 예로서 형광염료, 전자조밀 시약, 양고추냉이 퍼옥시다제, 일칼린 포스파타제와 같이 불용성 반응생성물을 침전시키거나 색소학적으로 검출될 수 있는 효소,32P, 또는 바이오틴과 같은 방사성 동위원소 표지물질이 포함된다. 바이오틴을 사용하는 경우 스페이서 암(spacer arm)을 올리고뉴클레오티드에 결합시켜 사용할 수 있다. 표지 잔기로서는 양고추냉이 퍼옥시다제가 바람직하다.
또한 "역"점 블럿 형태에 있어서 프라이머 하나 이상 및/또는 4가지 뉴클레오티드 트리포스페이트중 하나 이상이 검출가능한 표지로 표지하므로서, 생성된 증폭 서열을 표지시킨다. 이들 표지된 잔기는 처음부터 반응홉합물중에 존재할 수 있거나 증폭반응 주기말에 가하여 증폭 생성물을 표지시킬 수 있다. 서열 변이(들)(정상 또는 돌연변이에 관계없이)이 존재하는 경우, 증폭된 핵산 서열과 하이브리드화 될 수 있는 표지되지 않은 서열-특이적 올리고뉴클레오티드를 상기에 기술된 예비 하이브리드화 조건하에서 막에 점적(고정)시킨다. 증폭된 시료를 상기에서 기술한 바와 같이 하이브리드화 조건하에서 예비 처리된 막에 가한다. 최종적으로 핵산 시료중의 증폭된 서열이 막에 고정된 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화되었는지의 여부를 판단하기 위해 검출 수단을 이용한다. 변이가 함유된 막-결합 서열이 증폭 생성물에 존재하는 경우, 즉 탐침 서열이 증폭 서열 부위와 상보적인 경우에만 하이브리드화가 일어난다.
"역"점 블럿 형태의 다른 변형에서는, 상기에 기술된 "정(forward)"점 블럿 형태에서와 같이 표지를 사용하지 않고 증폭반응을 수행할 수 있으며 변이가 함유된 증폭된 핵산 서열로 하이브리드화 할 수 있는 표지된 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 탐침을, 존재하다면, 상기에 기술한 바와 같은 예비하이브리드화 조건하에서 막에 점적(고정)시킨다. 증폭된 시료를 상기에 기술한 바와 같이 융합화 조건하에서 예비처리된 막에 가한다. 시료중의 증폭된 서열이 표지된 올리고뉴클레오티드와 하이브리드되었는지를 판단하는 검출수단을 이용하여 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 단편을 막에서 분리시킨다. 예를들어 탐침내의 제한부위를 인식하는 막에 제한효소를 가하여 방출시킬 수 있다. 올리고머 제한법으로 공지된 상기 과정은 1985년 12월 11일자로 공고된 유럽특허 공보 제164,054호에 더욱 상세히 기술되어 있다.
정 및 역 점 블럭법 모두에 있어서, 검출될 수 있는 유전적 질병은 염기쌍 돌연변이중 특정 결실, 삽입 및/또는 치환 또는 모든 개체로부터 핵산, 예를들어, 게놈성 DNA의 다형현상을 내포한다. 염기쌍 변이가 공지된 질병의 예로는 겸상적혈구 빈혈중, 헤모글로빈 C증, α-지중해 빈혈증, β-지중해 빈혈증 등이 포함된다. 검출될 수 있는 이외의 질병에는 RAs 발암 유전자, 예를들어, n-RAS 발암 유전자 등의 종양성 질병과 전염병이 포함된다.
점 블럿 과정은 또한 조직이식, 질병감수성, 및 부계검정분야에서 HLA 타이핑을 하는데 이용될 수 있다. HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP 영역으로부터 α 및 β유전자로 구성된 HLA 클래스 Ⅱ유전자는 높은 다형성을 가지며 DNA 수준에서 이들의 유전적 복합성은 근래에 혈청학적 타이핑에 의해 규정된 다형현상보다 현저하게 큰 것이다.
또한 이 과정은 인슐린-의존성 당뇨병(IDDM)과 관련된 HLA 클래스 Ⅱ β단백질(예 : DRβ)을 암호화하는 4가지 DNA 서열을 검색하는데 이용될 수 있다. IDDM과 관련된 4가지 DNA 서열은 1) 5'-GAGCTGCGTAAGTCTGAG -3', 2) 5' -GAGGAGTTCCTGCGCTTC -3', 3) 5' -CCTGTCGCCGAGTCCTGG-3' 및 4) 5'-GACATCCTGGAAGACGAGAGA-3' 또는 이와 상보적인 DNA 쇄로 구성된 그룹에서 선택된다.
서열-특이적 탐침은 이것이 이들 서열 하나 이상과 하이브리드되도록 제조할 수 있다.
여러가지 전염병은 임상적 시료내에 전염성 미생물에 특징적인 특정 DNA 서열이 존재하는지의 여부로 진단할 수 있다. 여기에는 살모넬라(Salmonella), 클라미디아(Chlmydia), 네이세리아(Neisseria)와 같은 세균 : 간염 바이러스와 같은 바이러스, 및 말라리아를 전염시키는 플라즈모디움(Plasmodium)과 같은 기생충이 포함된다. 1986년 5월 13일자로 팔코우(Falkow)등에 허여된 미합중국 특허 재심사(reexamination certificate) 제 B14,358,545호에는 전염병의 진단을 위한 특이적 DNA 하이브리드화 탐침의 용도가 기술되어 있다.
병원성 생물체의 비교적 적은 수가 감염된 환자로부터 취한 임상적 시료내에 존재할 수 있으며 이들로부터 추출된 DNA는 시료 전체 DNA중에 매우 작은 부분으로만 구성될 수 있다. DNA 시료를 고정화하고 하이브리드화 측정을 하기 전에 의심되는 서열을 특정하게 증폭화시키면 통상의 과정에 있어서 감수성과 특이성을 현저히 증진시킬 수 있다.
전염병을 진단하기 위한 DNA 탐침의 통상적인 임상용법은 비방사적으로 표지된 탐침을 위드(Ward)의 유럽 특허 제63,879호에 기술된 바와 같이 사용할 경우 상당히 간소화할 수 있다. 이 방법에서, 바이오틴-함유 DNA 탐침은 아비딘 또는 바이오틴-특이성 항체에 연결된 염색성 효소에 의해 탐지된다. 이러한 유형의 탐지방법은 편리하지만 비교적 정확치가 않다. 본 발명의 방법에 따른 특정 DNA 증폭 작업 및 안정하게 표지된 탐침을 팔코우 및 워드 방법에 도용함으로써 통상적인 임상용법에서의 이들 방법이 필요로 하는 편이성과 정확도가 제공될 수 있다.
AIDS 바이러스를 검출하거나 모니터하기 위한 증폭기술의 특정 기술은 하기와 같다 ; 증폭 및 검출 방법에서 증폭하고 검출하기 위해 각각이 고안된 프라이머 및 탐침으로서 AIDS 바이러스내의 핵산 가운데 실질적으로 보존되어 있으며 AIDS 바이러스내의 핵산에 특이한 핵산서열을 사용한다. 그러므로 검출될 핵산은 효소 및 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에 바람직하게는 실온에서, 중합화를 개시하기 위해서 AIDS 바이러스내의 핵산에 충분히 상보적이어야 한다.
또한, 탐침은 하기 일반식의 스페이서 암에 바이오틴이 부착된 바이오티닐화된 탐침을 사용할 수 있다 :
Figure kpo00002
상기 식에서, Y는 O, NH, 또는 N-CHO이고, x는 1 내지 4의 수이며, y는 2 내지 4의 수이다.
차례로 스페이서 암은 하기 구조식의 프로살렌에 연결된다.
Figure kpo00003
프소랄렌 잔기는 문헌[Courage-Tebble et al., Biochim, Biophys, Acta, 697(1982) 1-5]에 기술된 바와 같이 "벌어진 원형(gapped circle)" 탐침내에 삽입시키고 가교결합시키는데 여기에서, 벌어진 원형의 일본쇄 하이브리드 영역은 프라이머내에 함유된 영역을 차지한다.
상기 바이오티닐화 및 점 블럿 방법에 대해서는 1986년 4월 15일에 허여된 미합중국 특허 제4,582,789호 및 1986년 10월 14일에 허여된 미합중국 특허 제4,617,261호에 더욱 자세히 기술되어 있다.
증폭방법은 또한 단일 복제 사람 유전자로부터 충분한 양의 DNA를 생성하여 에티디움 브로마이드와 같은 간단한 비특이성 DNA 염색 시약에 의한 탐지 방법으로도 DNA를 직립 식별할 수 있도록 하기 위해 사용할 수 있다.
증폭방법은 전염병 및 유기체 게놈의 병리학적 기형체를 탐지하기 위해 사용하는 것 이외에도 또한, 어떠한 병리상태와도 연관지울 수 없는 DNA 다변성을 탐지하는데 사용할 수 있다.
요약하면, 당해 증폭방법은 연쇄반응 및 열안정성 효소를 사용하여 하나 이상의 특정 핵산 서열을 증폭하는 방법으로서 이러한 반응으로 프라이머 연장 반응물에 대한 주형으로서 실제적으로 작용할 수 있는 반응 프라이머 연장 생성물이 생성된다. 이 방법은 특히 처음에 단지 극소량으로 존재하는 핵산 서열을 탐지하는데 특히 유용하다.
다음 실시예는 본원 발명을 예시하기 위해 제공된 것이며 이로써 본원의 청구사항을 제한하려는 것은 아니다.
이들 실시예에서 모든 중량부는 달리 언급되지 않는한, 고체인 경우에는 중량을 기준으로 하고, 액체인 경우에는 용량을 기준으로 하며, 모든 온도는 섭씨 온도로 주어졌다.
실시예 Ⅰ
Ⅰ. 프라이머의 합성
하기 기술한 방법으로 다음 두개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조한다.
5'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3'(PCO3)
5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3'(PCO4)
이들 프라이머, 20-mer를 110개의 염기쌍의 거리로 떨어진 5'-말단을 갖는 게놈성 DNA의 반대편 본쇄에 어닐링시킨다.
A. 자동화 합성 공정 : 베아우케이지(Beaucage) 및 카루터스(Caruthers)(Tetrahedron Letters(1981) 22 : 1859-1862)에 따라 합성된 디에틸포스포르아미디트를 뉴클레오사이드 유도체화 공극 조절된 유리 지지체에 연속적으로 축합시킨다. 이 공정에는 디클로로메탄중에서 트리클로로아세트산을 사용하는 탈트리틸화반응, 활성화 양성자 공여체로서 벤조트리아졸을 사용하는 축합반응, 및 테트라하이드로푸란 및 피리딘중에서 아세트산 무수물 및 디메틸아미노피리딘을 사용하는 캡핑 반응이 포함된다. 순환시간은 대략 30분 정도이다. 각각의 단계에서의 수득량은 반드시 정량적이며, 탈트리틸화 반응중에 방출된 디메톡시트리틸 알코올을 수집하여 분광광도 측정법에 의해 측정한다.
B. 올리고데옥시리보뉴클레오티드 탈보호 및 정제 공정 : 고체 지지체를 칼럼으로부터 꺼내어 밀폐 튜브중, 실온에서 진한 수산화 암모늄 1ml에 4시간 동안 노출시킨다. 그 다음, 지지체를 여과하여 제거하고, 부분적으로 보호된 올리고데옥시뉴클레오티드를 함유하는 용액을 5시간에 걸쳐 55℃로 상승시킨다. 암모니아를 제거하고 잔사를 예비 폴리아크릴아미드겔에 적용시킨다. 30볼트/cm에서 90분 동안 전기영동한 후, 생성물을 함유하는 밴드가 형광 플레이트의 UV 조사에 의해 확인된다. 이 밴드를 절단하여 4℃에서, 증류수 1ml로 밤새 용출시킨다. 이 용액을 RP-HPLC 칼럼에 적용시켜 pH 6.0에서, 1% 암모늄 아세테이트 완충액중의 아세토니트릴 7 내지 13% 구배를 사용하여 용출시킨다. 260nm에서의 UV 흡광도에 의해 용출을 모니터링한 다음, 적당한 분획을 수거하고, UV 흡광도에 의해 고정된 용량으로 정량화환 다음 진공 원심분리기중, 실온에서 증발건고시킨다.
C. 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 특징화 : 정제한 올리고뉴클레오티드의 시험할 분취량을 폴리뉴클레오티드 키나제 및 γ-32P-ATP로32P 표지화한다. 표지된 화합물을 50볼트/cm에서 45분간 전기영동한 후 14 내지 20% 폴리아크릴아미드 겔의 방사자동사진법에 의해 시험한다. 이 공정으로 분자량을 입증한다.
베놈(venom) 디에스터라제 및 박테리아 알칼린 포스파타제를 사용하여 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 뉴클레오사이드로 분해한 다음, 계속해서 역상 HPLC 칼럼 및 10% 아세토니트릴, 1% 암모늄 아세테이트 이동상을 사용하여, 유도된 뉴클레오사이드를 분리하여 정량화함으로써 염기 조성을 결정한다.
Ⅱ. 세포주로부터의 사람 게놈성 DNA의 분리
문헌[Maniatis et al., 상기 인용 p280-281]의 방법을 사용하여, 기타 기관[Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, NJ]으로부터 GM 2219C로서 입수용이한 정상의 β-글로빈 동종성인 T 세포주 몰트(Molt) 4로부터 고분자량의 게놈성 DNA를 분리한다.
Ⅲ. 써머스 아쿠아티쿠스로부터의 폴리머라제의 정제
기탁 기관[American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive Rockville, MD]로부터 제한없이 입수용이한, 기탁번호 ATCC 제25,104로서 이용할 수 있는 써머스 아쿠아티쿠스 균주 YT1을 다음과 같은 조성을 갖는 배지를 함유하는 플라스크에서 생육시킨다 :
나트륨 시트레이트1mM
인산 칼륨(pH 7.9)5mM
염화 암모늄10mM
황산 마그네슘0.2mM
염화 칼슘0.1mM
염화 나트륨1g/ℓ
효모 추출물1g/ℓ
트립톤1g/ℓ
글루코즈2g/ℓ
황산철0.01mM
(pH는 가압멸균하기전에 8.0으로 조정한다)
10ℓ들이 발효조를 상기 배지중, 70℃에서 밤새 배양시킨 종균 배양용 플라스크로부터 접종한다. 종균 배양물 플라스크로부터 총 600ml를 사용하여 동일한 배지 10ℓ를 접종시킨다. 40%의 용해된 산소 및 70℃의 온도에서 400rpm으로 교반하면서, 수산화암모늄으로 pH를 8.0으로 조절한다.
세포를 생육시킨 후, 칼레딘(kaledin) 등(상기 인용)의 프로토콜(약간 변형하여)의 처음 5단계를 사용하고 6단계는 다른 프로토콜을 사용하여 정제한다. 6단계 전부4℃에서 수행한다. 컬럼상에서 분획화 속도는 0.5칼럼/시간이며 옹출시키는 동안 구배물의 용적은 10칼럼 용적이다. 다른 바람직한 정제 프로토콜은 하기 실시예 Ⅵ에 기술되어 있다.
간략하게 언급하면, 상기 9시간의 배양 후, 티. 아쿠아티쿠스 세포의 배양물을 말기 로그 단계, 1.4 건조중량 g/ℓ의 세포 밀도에서 원심분리하여 수거한다. 세포 20g을 pH 7.5의 50mM 트리스 HCl, 0.1mM EDTA로 이루어지는 완충액 80ml에 재현탁시킨다. 세포를 융해시켜 융해물을 회전기중, 4℃ 및 35,000rpm에서 2시간 동안 원심분리한다. 상등액을 모으고 (분획 A), 황산암모늄 45 내지 75% 포화 농도에서 침전되는 단백질 분획을 모아 pH 6.5의 0.2M 인산칼류 완충액, 10mM 2-머캅토에탄올 및 5% 글리세린으로 이루어지는 완충용액에 용해시킨 다음 최종적으로 상기 완충 용액에 대해 투석시켜 분획 B를 수득한다.
분획 B를 상기 기술된 완충 용액으로 평형화시킨 DEAE-셀룰로즈의 2.2×30cm 칼럼에 적용시킨다. 그 다음, 칼럼을 상기 완충용액으로 세척하고, 단백질(280nm에서의 흡광도 측정)을 함유하는 분획을 모은다. 단백질 분획을 합하여 pH 7.5의 0.01M 인산 칼륨 완충용액, 10mM 2-머캅에탄올 및 5% 글리세린을 함유하는 제2완충액에 대해 투석시켜 분획 C를 수득한다.
분획 C를 제2완충 용액으로 평형화시킨 하이드록시 아파타이트의 2.6×21cm 칼럼에 적용시킨다. 그 다음, 칼럼을 세척하고, 10mM 2-머캅토에탄올 및 5% 글리세린을 함유하는 pH 7.5의 0.01 내지 0.5M 인산칼륨 완충액의 직선 구배를 사용하여 효소를 용출시킨다.
DNA 폴리머라제 활성을 갖는 분획(90 내지 180mM 인산 칼륨)을 합하여 아미콘 교반된 세포(Amicon Stirred Cell) 및 YM 10막을 사용하여 4배 농축시킨 다음 제2완충액에 대해 투석시켜 분획 D를 수득한다.
분획 D를 제2완충 용액으로 평형화된 DEAE-셀룰로즈의 1.6×28cm 칼럼에 적용시킨다. 컬럼을 세척하고 제2완충 용액중에서 0.01 내지 0.5M 인산칼륨의 직선 구배를 사용하여 폴리머라제를 용출시킨다. 분획을 과량의 DNA 폴리머라제와 함께 배양한 후(엔도뉴클레아제에 대해) 및 DNA를 다수의 분획으로 절단하는 제한 효소로 처리한 후(엑소뉴클레아제에 대해), 파지 λ DNA 또는 슈퍼코일된 플라스미드 DNA의 분자량의 변화를 전기영동하여 탐지함으로써 엔도뉴클레아지(들) 및 엑소뉴클레아제(들)의 오염도를 검정한다. 뉴클레아제 최소 오염도를 갖는 DNA 폴리머라제 분획(65 내지 95mM 인산칼륨)만을 모은다. 여기에 가압멸균한 젤라틴을 250μg/ml의 양으로 가하고 제2완충 용액에 대해 투석시켜 분획 E를 수득한다.
분획 E를 포스포셀룰로즈 칼럼에 적용시켜 100ml의 구배물(pH 7.5의 20mM 인산칼륨 완충 용액중의 0.01 내지 0.4M KCl 구배)로 용출시킨다. 분획을 상기 기술한 바와 같이 엔도/엑소뉴클레아제(들)의 오염도에 대해 분석하고 또한 폴리머라제 활성도(칼레딘 등의 방법에 의해)에 대해 분석한 다음 모은다. 모은 분획을 제2완충 용액에 대해 투석한 다음, 50% 글리세린 및 제2완충 용액에 대해 투석하여 농축시킨다.
SDS PAGE에 의해 폴리머라제의 분자량을 측정한다. 마아커 단백질은 포스포릴라제 B(92,500), 소의 혈청 알부민(66,200), 오브알부민(45,000), 탄산 탈수효소(31,000), 대두 트립신 억제제(21,000) 및 라이소라임(14,400)이다.
예비시험 데이터는 폴리머라제의 분자량이 문헌(예를들어, 칼레딘 등의 문헌)에 기술된 바와 같은 62,000 내지 63,000달톤이 아니라 약 86,000 내지 90,000달톤임을 제시하고 있다.
pH 6.4 및 pH 8.0의 25mM 트리스-HCl, 0.1M KCl, 10mM MgCl2, 1mM 2-머캅토 에탄올, 각각 10nmole의 dGTP, dATP 및 TTP, 및 0.5μ Ci(3H) dCTP, 송아지 흉선 "활성화" DNA 8μg, 및 폴리머라제 0.5 내지 5단위를 함유하는 혼합물 50μl중에서 폴리머라제를 배양한다. "활성화" DNA는 DNA의 5%가산-가용성 분획으로 이동될때까지 DNasel으로 부분 가수분해한 후의 DNA의 천연제제이다. 70℃에서 30분 동안 반응을 수행하고, 0.125M EDTA-Na2를 함유하는 나트륨 피로포스페이트의 포화 수용액 50μl를 가함으로써 중단시킨다. 샘플을 가공 처리하여 칼레딘 등에 의해 기술된 바와 같이 활성도를 측정한다.
그 결과, pH 6.4에서 폴리머라제의 활성도는 pH8.0에서의 활성도는 1/2 이상이었다. 이와는 반대로, 칼레딘 등은 pH 약 7.0에서 효소는 pH8.3에서의 활성도의 8%를 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이 시험에서의 열안정성 효소에 대한 pH 범위는 칼레딘 등의 효소에 대한 것보다 광범위하다.
최종적으로, DNA 폴리머라제 검정용 반응 혼합물로부터 하나 이상의 뉴클레오티드 트리포스페이트만을 제거하고, 경우에 따라 다른 것을 제거한다 하더라도 아주 소량 제거한 다음, 본 효소를 이용하여 활성도를 측정하며 이 활성도는 거대치와 일치하며 효소는 높은 적합도를 나타낸다. 이와는 반대로, 칼레딘 등의 효소를 사용하여 측정한 활성도는 기대치와 일치하지 않으며, 뉴클레오티드 트리포스페이트(들)의 잘못된 도입을 제시한다.
Ⅳ. 증폭 반응
상기 기술한 게놈성 DNA 1μg을 25mM 트리스 HCl 완충액 (pH 8.0), 50mM KCl, 10mM MgCl2, 5mM 디티오트레이톨, 200μg/ml 젤라틴, 프라이머 PCO3 1μM, 1.5mM dATP, 1.5mM dCTP, 1.5mM dGTP 및 1.5mM TTP를 함유하는 초기 수성 반응 용액 용적 100μl중에서서 희석한다. 샘플을 98℃에서 10분 동안 가열하여 게놈성 DNA를 변성시킨 다음, 실온으로 냉각시킨다. 반응 혼합물에 써미스 아쿠아티쿠스로부터의 폴리머라제 4μl를 가하고 광유 캡 10μl로 중층화한다. 그 다음, 예정된 피펫을 사용하여 상기 기술된 액체 조작 및 가열 장치의 알루미늄 가열 블록에 샘플을 놓아 액체를 운반하고 온도 조절 장치로 온도를 변화시킨다.
DNA 샘플을 기계에서 다음과 같은 프로그램 주기를 반복하여 20회 증폭 반응시킨다 :
1) 가열 블록에서 2.5분에 걸쳐 37℃에서 98℃로 가열.
2) 3분에 걸쳐 98℃에서 37℃로 냉각시켜 프라이머와 DNA를 어닐링시킴.
마지막 주기 후, 샘플을 55℃에서 10분 동안 더 배양하여 최종 증폭반응을 완결시킨다.
Ⅴ. 올리고데옥시리보뉴클레오티드 탐침의 합성 및 인산화 반응
다음 서열을 갖는 표지된 DNA 탐침 RS24를 제조한다 :
5'-*CCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTTCTCAGGAGTCAG-3'(RS24)
(주 : *는 표지를 나타냄)
이 탐침은 40개의 염기로 이루어지며, 유전자의 4번째에서 17번째 코돈을 따라 뻗어 있으며, 정상의 β-글로빈 대립 유전자(βA)에 대해 상보적이다. 프라이머와 탐침의 대략적인 도식은 다음과 같다 :
Figure kpo00004
실시예 Ⅰ의 섹션(Ⅰ)에 기술된 공정에 따라 상기 탐침을 합성한다.
탐침 20pmole을, 70mM 트리스 완충용액(pH 7.6), 10mM MgCl2, 1.5mM 스퍼민 및 10mM 디티오트레이톨을 함유하는 반응액 40μl의 용적중, 37℃에서 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 4단위 및 γ-32P-ATP 약 40pmole(약 7000Ci/mmole)과 60분 동안 접촉시켜 상기 탐침을 표지시킨다. 그 다음, 25mM EDTA 를 가하여 총 용적을 100μl로 조정하고, 트리스-EDTA(TE) 완충 용액(10mM 트리스 완충 용액, 0.1mM EDTA, pH8.0)으로 평형화된 1ml 스핀 투석용 칼럼상에서 마니아티스등(상기 인용)의 문헌 466에서 467페이지에 기술된 공정에 따라 정제한다. 반응 생성물의 TCA 침전은 RS24에 대한 특이활성이 4.3μCi/pmole이며 최종 농도가 0.118pmole/μl임을 나타낸다.
Ⅵ. 점 블럿(Dot Blot) 하이브리드화
섹션(Ⅳ)로부터의 증폭된 샘플 4μl 및 70, 75, 80, 85, 90, 95 및 100%의 증폭 효능을 나타내도록 계산된 적절한 희석 농도의 β-글로빈 플라스미드 DNA 5.6μl를 0.4N NaOH 200μl, 25mM EDTA로 희석하고, 문헌[Reed and Mann Nucleic Acids Research 13, 7202-7221(1985)]에 기술된 바와 같이, 우선 물로 필터를 적신 다음, 점 블럿 제조용 장치상에 필터를 놓고 제 위치에 고정시켜 샘플을 적용시킨 다음, 각각의 웰을 20x SSPE(3.6M NaCl, 200mM NaH2PO4, 20mM EDTA) 0.1ml로 세척함으로써 나일론 필터상에 스폿팅(spotting)한다.
그 다음, 필터를 치우고, 20x SSPE중에서 세척한 다음 진동오븐중, 80℃에서 30분 동안 베이킹한다.
베이킹 후, 각각의 필터를 3x SSPE, 5x 덴하르트(Denhardt's) 용액(1x=0.02% 폴리비닐피롤리딘, 0.02% 피콜(Ficoll), 0.02% 소의 혈청아부민, 0.2mM 트리스, 0.2mM EDTA, pH 8.0) 0.5% SDS 및 30% 포름아미드로 이루어지는 하이브리드화 용액 16ml와 접촉시켜 42℃에서 2분 동안 배양한다. 탐침 RS24 2pmole를 하이브리드화 용액에 가하고 필터를 42℃에서 2분 동안 배양한다.
최종적으로, 각각의 하이브리드화 필터를 실온에서, 2x SSPE 100ml 및 0.1% SDS로 10분 동안 2회 세척한다. 그 다음, 필터를 60℃에서 2x SSPE 100ml, 0.1% SDS로 10분 동안 1회 처리한다.
그 다음, 각각의 필터를 방사자동사진 찍어 두시간 후 시그날을 쉽게 볼 수 있다.
Ⅶ. 방사자동사진의 도해
점 블럿의 방사자동사진을 2시간 후 분석하고, 문헌[Saiki et al., Science, 상기 인용]에 기술된 바와 같이 Hea Ⅲ/Mae Ⅰ-분해된pBR : βA(여기에서, βA는 야생형 대립 유전자이다)로 제조된 일련의 희석 농도의 표준 β-글로빈 제조합물과 강도를 비교한다.
반응 생성물의 분석 결과, 전반적인 증폭 효능은 약 95%이며, 이는 β-글로빈 표적 서열상에서의 630,000배 증가에 상응한다.
실시예 Ⅱ
Ⅰ. 증폭반응
실시예 Ⅰ에 기술한 바와 같은 몰트 4 세포주로부터 추출한 게놈성 DNA 1μg의 샘플 두 개를 각각 50mM KCl, 25mM 트리스 HCl 완충 용액(pH 8.0), 10mM MgCl2, 프라이머 PC03 1μM, 프라이머 PC04 1μM, 젤라틴 200μg/ml, 10% 디메틸설폭사이드(용량기준) 및 각각 1.5mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 TTP를 함유하는 반응 용적 100μl에서 희석한다. 이 혼합물을 98℃에서 10분 동안 가열하여 게놈성 DNA를 변성시킨 후, 샘플을 실온으로 냉각시키고, 각각의 샘플에 실시예 I에 기술된 써머스 아쿠아티쿠스로부터의 폴리머라제 4μl를 가한다. 샘플을 광유로 중층화시켜 축합 및 증발에 의한 손실을 방지한다.
샘플 하나를 실시예 1에 기술된 기계의 가열 블록에 놓고 다음과 같은 프로그램 주기를 반복하여 25회 증폭 반응시킨다 :
(1) 2.5분에 걸쳐 37℃에서 93℃로 가열 :
(2) 3분에 걸쳐 93℃에서 37℃로 냉각시켜 프라이머와 DNA를 어닐링시킴 :
(3) 37℃에서 2분 동안 유지.
마지막 주기 후, 샘플을 60℃에서 10분 동안 더 배양하여 증폭 반응을 최종적으로 완결시킨다.
다른 하나의 샘플을 온도 순환(가열 및 냉각) 기계의 열-전도성 용기에 놓아둔다. 이 기계에서, 열-전도성 용기를 온도를 상하로 조절하는 펠티어(peltier) 가열 펌프 마이크로프로세서 조절기에 부착시켜 증폭 순서, 온도 수준, 온도 변화 및 온도의 시간적 조절을 자동적으로 조절한다.
이 샘플을 다음과 같은 프로그램 주기를 반복하여 25회 증폭 반응시킨다 :
(1) 3분에 걸쳐 37℃에서 95℃로 가열 :
(2) 0.5분 동안 95℃로 유지시켜 변성시킴 :
(3) 1분에 걸쳐 95℃에서 37℃로 냉각 : 및
(4) 37℃에서 1분 동안 유지.
Ⅱ. 분석
두가지 시험, 즉 점 블럿 및 아가로즈 겔 분석하여 샘플을 시험한다.
점 블럿 분석의 경우에는, 다음과 같은 서열의 표지된 DNA 탐침 RS18을 제조한다 :
5' *CTCCTGAGGAGAAGTCTGC 3'(RS18)
(주 : *는 표지를 나타냄)
이 탐침은 19개의 염기로 이루어지며, 유전자의 4번째에서 17번째 코돈을 따라 뻗어 있으며 정상의 β-글로빈 대립유전자(βA)에 대해 상보적이다. 프라이머 및 탐침의 대략적인 도식은 다음과 같다 :
Figure kpo00005
실시예 I의 섹션(I)에 기술된 방법에 따라 상기 탐침을 합성한다.
탐침 10pmole을, 70mM 트리스·HCI 완충 용액(pH 7.6), 10mM MgCl2, 1.5mM 스퍼민 및 10mM 디티오트레이톨을 함유하는 반응 용적 40μl중, 37℃에서 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 4단위 및 γ-32P-ATP 약 40pmole(dir 7000Ci/mmole)과 60분 동안 접촉시켜 상기 탐침을 표지시킨다. 그 다음, 25mM EDTA를 가하여 총 용적을 100μl로 조정하고, 트리스-EDTA(TE) 완충용액(10mM 트리스·HCl 완충용액, 0.1mM EDTA, pH 8.0)으로 평형화시킨 1ml 스핀 투석 칼럼상에서 문헌[Maniatis et al., 상기 인용, p466-467]의 공정에 따라 정제한다.
반응 생성물의 TCA 침전은 RS18에 대한 특이활성이 4.6μCi/pmole이며 최종 농도가 0.114pmole/μl임을 나타낸다.
열안정성 효소 대신 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편을 사용하는 것을 제외하고는 상기와 같이 증폭시킨 샘플 및 섹션(I)로부터의 증폭시킨 샘플 5μl을 0.4N NaOH 195μl, 25mM EDTA로 희석하고, 문헌[Reed and Mann 상기 인용]에 기술된 바와 같이 우선 필터를 물로 적신 다음 이를 점 블럿 제조용 장치에 놓고 제위치에 고정시켜 샘플을 적용시킨 다음, 각각의 웰을 20x SSPE 0.4ml(3.6M NaCl, 200mM NaH2PO4, 20mM EDTA)로 세척함으로써 두개의 복제용 나일론 필터상에 스폿팅한다. 그 다음, 필터를 치우고, 20x SSPE에서 세척하여 진공오븐중 80℃에서 30분 동안 베이킹한다.
베이킹한 후, 각각의 필터를 5x SSPE, 5x 덴하르트 용액(1x=0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 피콜, 0.02% 소의 혈청 알부민, 0.2mM 트리스, 0.02mM EDTA : pH 8.0) 및 0.5% SDS로 이루어지는 하이브리드화 용액 6ml와 접촉시켜 55℃에서 60분 동안 배양한다. 그 다음, 탐침 RS18 5μl를 하이브리화 용액에 가하여 필터를 55℃에서 60분 동안 배양한다.
최종적으로, 각각의 하이브리드화 필터를 실온에서, 2x SSPE 100ml 및 0.1% SDS로 10분 동안 2회 세척한다. 그 다음, 필터를 60℃에서 5x SSPE 100ml, 0.1% SDS로 1분 동안 그리고 2분 동안 2회 더 처리한다.
각각의 필터를 자동 방사 사진찍어 90분 후 시그날을 쉽게 볼 수 있다.
아가로즈 겔 분석에 있어서, 각각의 증폭 반응물 5μl를 1x TBE 완충용액(0.089M 트리스, 0.089M 붕산 및 2mM EDTA)중의 4% 누시브(Nusieve)/0.5% 아가로즈 겔상에 부하하여 100V에서 60분 동안 전기영동 한다. 에티늄 브로마이드로 염색한 후, DNA를 UV 형광에 의해 가시화한다.
그 결과, 실시예 I 및 본 실시예예서 사용된 기계는 DNA를 증폭시키는데 동등하게 효과적이며, 목적하는 서열에 상응하는 유사한 강도의 고강도 110-염기쌍의 불연속 밴드 및 보다 낮은 강도의 다른 몇개의 불연속 밴드를 나타낸다. 이와는 달리, 이. 콜라이 폴리머라제 I의 클레나우 단편을 사용하는 각각의 주기 후, 시약의 운반을 수반하는 증폭 방법은 다수의 관련되지 않은 DNA 서열의 비특이적 증폭으로 부터 야기되는 DNA 반점을 생성한다.
HLA-DQ, DR 및 DP 영역을 평가하는데 있어서 증폭 및 탐지 방법을 유사하게 개선시킬 수 있는 것으로 기대된다.
상기 실험에서 증폭 반응 완충 용액이 10mM, MgCl2대신 2mM MgCl2및 각각 1.5mM 이라기 보다는 150 내지 200㎛의 뉴클레오티드를 함유하며, 37℃의 저온을 증폭반응 동안 45 내지 58℃로 상승시키는 경우에는, 보다 우수한 증폭의 특이성 및 효능을 나타낸다. 또한 DMSO는 증폭반응을 위해 반드시 필요하지 않거나 바람직하지 않은 것으로 밝혀졌다.
실시예 Ⅲ
증폭 및 클로닝
사람 β-글로빈 유전자상에서 119-염기쌍 단편을 증폭시키기 위해, 상기 기술한 바와 같이 몰트 4세포주 또는 GM 2064 세포주(β 및 헤모글로빈 영역의 동종성 결실을 나타내며, 기관[Human Genetic Mutant Cell Depository Camden, NJ]으로부터 입수용이함)으로부터 분리된 각각의 사람 게놈성 DNA 총 1㎍을 50mM KCl,25mM 트리스. HCl(pH 8), 10mM MgCl2, 200㎍/ml 젤라틴, 5mM 2-머캅토 에탄올, 각각 1.5mM의 dATP, dCTP, TTP 및 dGTP, 및 각각 1μM의 다음 프라이머, 즉 5'-CTTCTGcagCAACTGTGTTCACTAGC-3'(G18) 및 5'-CACaAgCTTCATCCACGTTCACC-3'(GH19)(여기에서, 소문자는 제한효소 부위를 생성시키기 위해 야생형 서열과 다르게 결합시키는 것을 나타냄)를 함유하는 반응 용적 100μl에서 증폭시킨다.
GH18은 음성 본쇄에 대해 상보적인 26-염기 올리고뉴클레오티드이며 내부 Pst I 부위를 갖는다. GH19는 양성 본쇄에 대해 상보적인 29-염기 올리고뉴클레오티드이며 내부 Hind Ⅱ 인지서열을 갖는다. 이들 프라이머를 Pst I 및 Hind Ⅲ 제한 부위에 대해 동종성인 유전자 영역을 스크리닝하여 선별한다. 그 다음, 실시예 I에서 기술한 바와 같이 프라이머를 제조한다.
상기 반응 혼합물을 95℃에서 10분 동안 가열한 다음 실온으로 냉각시킨다. 각각의 반응 혼합물에 실시예 I에 기술된 폴리머라제 총 4μl를 가한 다음, 각각의 혼합물을 광유로 중층화시킨다. 반응 혼합물을 다음과 같은 프로그램으로 30회 증폭 반응시킨다 :
1. 2.5분에 걸쳐 37℃에서 98℃로 가열
2. 3분에 걸쳐 98℃에서 37℃로 냉각
3. 37℃에서 2분 동안 유지
마지막 주기 후, 반응 혼합물을 65℃에서 20분 동안 배양하여 증폭 반응을 최종적으로 완결시킨다. 광유는 클로로포름으로 추출하고 혼합물은 -20℃에 둔다.
증폭된 생성물 총 10μl를 50mM NaCl, 10mM 트리스. HCl(ph7.8), 10mM MgCl2, Pst I 20단위 및 Hind Ⅲ 26단위를 함유하는 50μl 용적중, 37℃에서 공지의 M13mP 10 클로닝 벡터 0.5㎍으로 분해시킨다. -20℃에서 동결시켜 반응을 중단시킨다. TE 완충용액으로 용적을 110μl로 조정하여 BioGel P-4 스핀 투석 칼럼 1ml상에 부하한다(100μl). 0.1ml 분획 하나를 모아 에탄올 침전시킨다(이 시점에서, GM 2064 샘플중에 β-글로빈 증폭 반응 생성물이 있음이 발견된다. 연속적으로 실험을 반복하여 프라이머, GH 18 또는 GH 19의 오염원을 추적한다. 프라이머의 다른 공급원을 이용할 수 없으므로, 프라이머중의 오염 DNA로부터 유도된 몇몇 클로닝된 서열을 사용하여 실험을 계속한다).
에탄올 펠릿을 물 15μl에 재현탁시킨 다음, 50mM 트리스 HCl(pH 7.8), 10mM MgCl2, 0.5mM ATP, 10mM 디티오트레이톨 및 리가제 400단위를 함유하는 20μl 용적으로 조정한다[1단위는 0.12mM(약 330μl/ml)의 5'-말단 농도에서, 20μl중 16℃에서 Hind Ⅲ 분해된 λ DNA를 30분 동안에 50% 연결시키기 위해 필요한 효소의 양이다]. 이 혼합물을 16℃에서 3시간 동안 배양한다.
몰트 4DNA를 함유하는 연결용 반응 혼합물 10μl를 공지의 입수용이한 이. 콜라이 균주 JM 103 적격한 세포에 형질전환시킨다.
형질전환된 균주를 제조하기 위한 공정은 문헌[Messing. J.(1981) Third leveland Symposium on Macromolecules : Recombinant DNA. ed. A. Walton Elsevier Amsterdam, 143, 163]에 기술되어 있다.
무색의 플라그(및 청색 플라그 0개)를 총 651개 수득한다. 이들중 119개는 (+)-본쇄 삽입물(18%)를 가지며 19개는 (-)-본쇄 삽입물(3%)를 갖는다. 이 사실은 25℃에서 2분 동안 반응시키고, 2분 동안 100℃로 가열한 후 냉각시키고, 클레나우 단편을 가하여 반응을 9회 반복하는, 이. 콜라이 폴리머라제 I의 클레나우 단편을 사용하는 증폭 기술로부터 얻은 프라이머-양성 플라그중의 β-글로반 양성 플라그의 비율에 대해 약 20배 정도의 증가를 나타낸다. 이들 결과로부터 본 발명의 열안정성 효소를 사용하는 증폭 반응의 특이성이 개선되었음을 확인할 수 있다.
나중의 GM 2064 및 오염된 프라이머를 사용한 클로닝 실험에서, 510개의 무색 플라그중 43개(8%)가 (+)-본쇄 삽입물을 갖는다. 이 사실은 몰트 4로부터의 119개 클론의 1/2 오염 서열을 함유함을 제시한다.
몰트 4로부터의 (+)-본쇄 클론 10개에 대해 서열을 분석한다.
5개는 정상의 야생형 서열이며 5개는 유전자의 2번째 코돈의 3번째 위치에서 하나의 C가 T로(CAC가 CAT로) 돌연변이 되었다. GM 2064로부터의 오염 클론 4개에 대해 서열 분석한 결과 4개 모두가 정상이다.
또한, 제한 부위-변형 프라이머를 사용하여 사람 N-ras 발암성 유전자를 증폭시키고 클로닝하여 부분적으로 서열화 할 수 있으며, 상기 기술을 사용하여 HLA DQ-α, DQ-β 및 DR-β 유전자의 염기쌍 절편을 클로닝할 수 있다.
MgCl2및 뉴클레오티드의 농도를 각각 2mM 및 150 내지 200μM로 감소시키고 순환 최저온도를 37℃에서 45 내지 58℃로 상승시키면, 증폭반응의 특이성 및 효능이 개선될 수 있다.
실시예 Ⅳ
유전자 복구
A. TAQ 폴리머라제 유전자에 대한 DNA 서열 탐침의 동정
λgt 11 발현 라이브러리의 면역학적 스크리닝에 따라 Taq pol 유전자에 대한 특정 DNA 서열 탐침을 얻는다. 티. 아쿠아티쿠스 DNA를 Alu I으로 완전하게 분해하여 Eco RI 12-mer 링커(CCGGAATTCCGG, New England Biolabs)와 연결시키고, Eco RI으로 분해하여 탈인산화된 Eco RI-분해된 λgt 11DNA(Promega Biotech)와 연결시킨다. 연결된 DNA를 패키징하여(Gigapack Plus, Strategene) 이. 콜라이 K-12 균주 Y1090(R. Young에 의해 제공됨)에 형질감염시킨다.
2×105플라그의 초기 라이브러리를, 정제된 Taq 폴리머라제에 대해 유발된 토끼의 폴리클로날 항혈청의 1 : 2000 희석농도를 사용하여(참조 : 실시예 I 및 Ⅳ) 스크리닝한다(Young R. A. and R. W. Davis(1983) Science 222 : 778-782). 후보 플라그를 제한 희석 농도로 재도말하고 동종성이 될 때까지 재스크리닝한다(3회). 예비 면역 혈청과 반응하지 않고 면역 혈청과 반응하는 후보 플라그로부터 파지를 정제한다.
후보 파지를 사용하여 이. 콜라이 K-12 균주 Y 1089(R. Young)를 용원시킨다. 폴리머라제 항혈청과 반응하는 IPTG 유도 가능한 융합 단백질(β-갈락토시다제보다 큼)의 생산을 알아보기 위해 용원균을 스크리닝 한다. 고체상의 크기-분획화된 융합 단백질을 사용하여 전체 폴리클로날 항혈청으로부터 에피토프-특이 항체의 정제를 돕는다(Goldstein, L.S.B., et al.(1986) J. Cell Biol. 102 : 2076-2087).
Taq 폴리머라제에 대해 독특하게 특이한 DNA 서열을 암호화하는 후보 λgt 11 파지를 동정하기 위한 웨스턴(Western) 분석에 "피쉬드(fished)" 에피토프-선별 항체를 사용한다. 후보 λgt 11 파지 하나(λgt : 1)는 정제된 Taq 폴리머라제, 및 Taq 폴리머라제를 함유하는 조 추출물 분획 둘다와 독특하게 반응하는 토끼의 폴리클로날 Taq 폴리머라제 항혈청 전체로부터 항체를 특이적으로 선별한다. 이 파지 λgt : 1은 추가의 연구에 사용된다.
써머스 아쿠아티쿠스 DNA의 ~115bp Eco RI-적응된 Alu I 단편을 표지화하여(Maniatis et al 상기 인용) Taq 폴리머라제-특이적 탐침을 생성시킨다. 이 탐침을 써던(Southern)분석에 사용하여 티. 아쿠아티쿠스 DNA 랜덤 게놈 라이브러리를 스크리닝 한다.
B. 써머스 아쿠아티쿠스 랜덤 게놈 라이브러리의 작제 및 스크리닝
λ 파지 채론(Charon) 35(Wilhelmine, A. M. et al., 상기 인용)을 어닐링시키고 접착 말단을 통해 연결한 다음, Bam H I 으로 완전하게 분해시켜 어닐링된 암(arm)을 칼륨 아세테이트 밀도 구배 초원심분리에 의해 "스터퍼(stuffer)" 단편으로부터 정제한다(Maniatis, et al., 상기 인용). 티. 아쿠아티쿠스 DNA를 Sau 3A로 부분적으로 분해하고 15 내지 20kb 크기의 분획을 슈크로즈 밀도 구배 초원심분리에 의해 정제한다. 표적물과 벡터 DNA 단편을 1 : 1 몰비율로 연결시켜 랜덤한 게놈 라이브러리를 작제한다. DNA를 패키징하여 이. 콜라이 K-12 균주 LE 392 또는 K802에 형질감염 시킨다. 재조합물＞99%를 함유하는 초기 파지＞20,000의 라이브러리를 이. 콜라이 K-12 균주 LE 392상에서 증폭시킨다.
CH 35 Taq 게놈 파지 라이브러리를 λgt 11: 1의 방사성 표지된 Eco RI 삽입물로 스크리닝한다(Maniatis et al 상기 인용). 특이적으로 하이브리드화하는 후보 파지 플라그를 정제하여 추가로 분석한다.
하나의 파지 Ch 35 : 4-2를 Hind Ⅲ로 분해하면 티. 아쿠아티쿠스의 4개의 DNA 단편(~8.0, 4.5, 0.8, 0.58kb) 이상이 생성된다.
4개의 Hind Ⅲ 티. 아쿠아티쿠스 DNA 단편을 Hind Ⅲ-분해된 플라스미드 BSM B+(3.2kb, vector Cloning System, San Diego)과 연결시키고, 각각 클로닝시킨 다음 이. 콜라이 K-12 균주 DG 98을 형질 전환시킨다.
CH 35 : : 4-2로부터의 ~8.0kb Hind Ⅲ DNA 단편을 플라스미드PFC 82(11.2kb)에서 분리하고, CH 35 : : 4-2로부터의 4.5kb Hind Ⅲ DNA 단편은 플라스미드 pFC 83(7.7kb)에서 분리한다.
pFC 82를 함유하는 이. 콜라이 균주 DG 98은 열에 대해 안정한 고온성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 것으로 나타났다(표 1). 또한, 이들 세포는 Taq DNA 폴리머라제와 면역학적으로 관계있는 분자량 ~60kd의 신류한 폴리펩티드를 합성한다.
8.0kb Hind Ⅲ DNA 단편의 Taq 폴리머라제 암호화 영역을 8.0kb Hind Ⅲ 단편중의 lac-프로모터에 인접한 2.8kb의 Hind Ⅲ-Asp 718영역에 추가로 위치시킨다. 이 영역을 서브클로닝시켜 플라스미드 pFC 85(6.0kb)를 얻는다. IPTG로 유도하면, pFC 85를 함유하는 이. 콜라이 DG 98 세포는 원래의 모 클론(pFC 82/DG 98)보다 100배까지 열에 대해 더 안정한 Taq 폴리머라제-관련 활성을 합성한다(표 1). pFC 85를 함유하는 세포는 상당량의 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 합성하는 반면, Taq pol DNA 서열의 일정 부분만이 해독되어 ~60kb Taq 폴리머라제-관련 폴리펩티드가 축적된다.
[표 1]
이. 콜라이#에서 열안정성 DNA 폴리머라제 활성의 발현
Figure kpo00006
#후기 로그 단계로 생육시킨 세포(+/- IPTG, 10mm)를 수거하여 초음파 처리하고 75℃에서 20분 동안 가열한 다음 원심분리하여 등명한 상등액을 70℃에서, DNA 폴리머라제 활성에 대해 분석한다.
*1단위=30분동안 혼입된 1nM dCTP
실시예 Ⅴ
Taq 폴리머라제의 발현
본 발명의 열안정성 유전자를 DG 141(ATCC 39588) 및PPLNRBSATG를 포함하는 다양한 박테리아 발현 백터중 어느 하나에서 발현시킬 수 있다. 이들 숙주 벡터 둘다는 작동적으로 연결된 ATG 개시 코돈을 함유하는 트리톱판 프로모터-오퍼레이터 및 리보좀 결합부위를 갖는 서열을 지니거나(DG 141), 또는 ATG개시 코돈에 작동적으로 연결된 λ PL프로모터 및 유전자 N 리보좀 결합부위를 갖는 서열을 지니는 (pPLRBSATG) pBR 322 유도체이다. 이들 숙주 벡터중 하나를 Sac I으로 제한시키고 클레나우 또는 S1 뉴클레아제로 평활말단화하여 Taq 폴리머라제 유전자의 연속삽입을 위한 편리한 제한 부위를 작제할 수 있다.
다음과 같이 플라스미드 pFC 83 및 pFC 85내로 서브클로닝된 DNA 삽입단편으로부터 완전한 길이의 Taq 폴리머라제 유전자를 작제한다. 벡터 BSM 13+(Vector Cloning Systems, San Diego, CA로부터 시판중임)을 독특한 Hind Ⅲ 부위에서 분해시키고 클레나우 및 dNTPS로 처리한 다음 T4 DNA 리가제로 Bgl Ⅱ 옥타뉴클레오티드 링커 5'-CAGATCTG-3'에 연결시켜, 이. 콜라이 균주 DG 98내로 형질전환시킨다. AmpRlac Zα+형질 전환체로부터 플라스미드를 분리한다. 클론중 하나를 BglⅡ 및 Asp 718제한효소로 분해하여 콘 벡터단편을 겔 전기영동에 의해 정제한다.
그다음, 플라스미드 pFC 83을 BglⅡ 및 Hind Ⅲ로 분해하고 ~750 염기쌍의 단편을 분리한다. 플라스미드 pFC 85를 Hind Ⅲ 및 Asp 718로 분해하고 ~2.8kb 단편을 분리하여 pFC 83으로부터의 ~750 염기쌍의 BglⅡ-Hind Ⅲ 단편 및 BSM 13+의 BglⅡ-Asp 718 벡터 단편에 3부분으로 연결시킨다. 이 연결용 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 균주 DG 98(ATCC 39, 768, 1984, 7, 13 기탁)을 형질전환시켜, 이로부터 AmpR콜로니를 선별하고 ~6.75킬로베이스의 플라스미드(pLSG 1)를 분리한다. pLSG 1을 함유하는 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(IPTG)-유도된 DG 98 세포는 티. 아쿠아티쿠스로부터 분리된 고유 효소와 구분되는 크기의 Taq DNA 폴리머라제를 합성한다. 그 다음, 플라스미드 pLSG 1을 사용하여 벡터클로닝 시스템에 의해 추천된 방법에 따라 일본쇄 DNA 주형을 생성시킬 수 있다.
올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이 유발(참조 : Zoller and Smith, Nuc. Acids Res. (1982) 10 : 6487-6500)을 사용하여 ATG 개시 코돈 부분(Taq 폴리머라제 유전자의 암호화 서열중 내부 Hind Ⅲ부위의 상부)으로서 Sph I 제한부위를 도입시킬 수 있다. 유사하게, 유전자의 카복실-말단 다음에(Asp 718 부위로부터 ~0.7kb 상부) BglⅡ 부위를 도입시켜 Taq 폴리머라제 유전자의 발현벡터로의 서브크로닝을 용이하게 할 수 있다. 부위-지시된 돌연변이를 수행한 후, 유전자를 ~3.2kb Sph I-BstEⅡ 제한단편상에서 BSM 13+벡터로부터 분리하고, 클레나우 단편 및 4개의 dNTPS로 처리하고 T4 DNA 리가제를 사용하여, Sac I으로 분해하고 클레나우 및 dNTPS로 보충되고, 송아지 장의 포스파타제로 처리하여 탈인산화된 평활 말단을 갖는 상기 언급한 발현벡터중의 하나에 삽입할 수 있다. 이 연결용 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 DG 116을 형질전환시킨 다음, 이로써 생성된 형질전환체 Taq 폴리머라제의 제조를 위해 스크리닝한다. 웨스턴 면역블럿 분석(Western immunoblot analysis) 및 활성 분석을 수행하여 효소의 발현을 확인한다.
예를 들어 플라스미드 pRLNRBSATG 를 사용하여, Taq pol 유전자를 암호화하는 아미노-말단 Hind Ⅲ 제한부위를 ATG 개시 코돈에 작동적으로 연결시킴으로써 플라스미드 pFC 85의 ~2.8kb Hind Ⅲ-ASP 718 단편내에 함유된 보다 많은 양의 Taq 폴리머라제 유전자를 발현시킬 수 있다. 발현시의 융합 생성물은 ~66,000 내지 68,000 달톤의 절두된 폴리머라제를 생성한다.
상기와 같은 특정한 작제공정은 플라스미드 pFC 85를 Hind Ⅲ로 분해하고 dATP, dGTP 및 dCTP의 존재하에 클레나우 단편으로 처리함으로써 수행할 수 있다. 생성된 단편을 또한 S1 뉴클레아제로 처리하여 일본쇄 연장부분을 제거하고, 생성된 DNA를 Asp 718로 분해한 다음 4개의 dNTPS의 존재하에 클레나우 단편으로 처리한다. Sac I으로 분해하고 ATG 평활 말단을 작제하기 위해 dGTP의 의 존재하에 클레나우 단편으로 처리시킨 탈인산화된 플라스미드 pPLNRBSATG 에 회수한 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결할 수 있다.
그후, 이 연결용 혼합물을 사용하여, 이. 콜라이 DG 116을 형질전환시킬 수 있으며 Taq 플라머라제의 생성을 알아보기 위해 상기 형질전환체를 스크리닝한다. 다시, 웨스턴 면역 블럿 분석 및 활성 분석을 수행하여 발현을 확인한다.
실시예 Ⅵ
정제
열안전성 폴리머라제를 하기에 기술된 실시예에 따른 써머스 아쿠아티쿠스의 배양물로부터 직접 정제하거나, 또는 다른 방법으로는 조 추출물의 제조에 필요한 단지 최소의 변형을 갖는 재조합적으로 수득된 효소를 함유하는 박테리아 배양물로부터 정제할 수 있다.
원심분리하여 세포를 수거한 후, 세포 60g을 pH 8의 50mM 트리스-Cl, 1mM EDTA로 이루어지는 완충용액 75 ml에 재현탁시킨다. 세포를 프첸치 프레스(French Press)중, 14,000 내지 16,000 PSI에서 용해시킨 후, 트리스-EDTA 4용적(300ml)을 추가로 가한다. 완충용액 A[5mM에 β-머캅토에탄올 및 각각 0.5%(v/v)에 NP-40 및 트윈(Tween) 20]를 가하여 용액을 냉각시키면서 철저히 초음파 처리한다. 생성된 균질한 현탁액을 최종 용적이 초기 세포중량이 7.5 내지 8배가 되도록 완충용액 A로 더 희석한다(분획 I).
pH 9.4(20℃)의 0.025M TAPS-HCL, 0.002M MgCl2, 0.05M KCl, 1mM 2-머캅토에탄올, 각각 0.2mM의 dGTP, dATP, TTP, 0.1mM dCTP[α-32P, 0.05 Ci/mM], 12.5㎍ "활성화된" 연어정자 DNA 및 폴리머라제(pH 8의 10mM 트리스-HCl, 50mM KCl, 1mg/ml의 가압 멸균된 젤라틴, 0.5% NP-40, 0.5% 트윈 20 및 1mM 2-머캅토 에탄올중에서 희석된) 0.01 내지 0.2 단위를 함유하는 혼합물 50μl중에서 분획( I ) 및 연속되는 그외의 분획의 폴리머라제 활성을 측정한다. 1단위는 30분 동안의 10mM 생성물에 상응한다. "활성화" DNA는 DNA의 5%가 산-가용성 분획에 이동될때까지 DNase I로 부분 가수분해한 후의 DNA의 천연 제조물이다. 74℃에서 10분동안 반응을 수행한 다음 40μl를 2mM EDTA중 0℃에서 5㎍/ml운반 DNA 1.0ml에 옮긴다. 등용적(1.0ml)의 20% TCA, 2% 나트륨 피로포스페이트를 가한다. 0℃에서 15 내지 20분 후, 샘플을 와트만(Whatman) GF/C 디스크를 통해 여과하고 냉 5% TCA-1% 피로포스페이트, 그리고 냉 95% 에탄올로 세척하여 건조시킨 다음 계수한다.
분획( I )을 벡크만(Beckman) TI 45 회전기중, 2℃ 및 35,000rpm 에서 2시간 동안 원심분리하여 상등액을 모은다(분획 Ⅱ).
90 내지 95%의 활성을 촉진시키에 필요한 폴리민(Polymin) P의 최소양을 정한 후 폴리민 P(BRL, Gaithersburg, MD)(10%, w/v, pH 7.5로 조정하고 가압멸균함)로 Taq 폴리머라제 활성을 촉진시키는데, 이때 폴리민의 양은 통상적으로 0.25% 내지 0.3% 최종 용적인 것으로 밝혀졌다.
0℃에서 15분동안 교반하면서 적절한 양의 폴리민 P를 분획(Ⅱ)에 서서히 가한다. 이 용액을 벡크만 JA14 회전기중, 2℃ 및 13,000rpm에서 20분 동안 원심분리한다. 상등액을 대상으로 활성도를 검점하고 펠릿을 0.5x 완충용액 A(H2O로 1 : 2로 희석)의 1/5용적 재현탁시킨다. 이 상등액을 제원심 분리하고 펠릿을 0.4M KCl을 함유하는 완충용액 A의 1/4 용적에 재현탁시킨다. 이 현탁액을 철저히 균질화하여 4℃에서 밤새 방치한다. 균질물을 상기와같이 원심분리하여 상등액을 모은다(분획 Ⅲ).
단백질 분획을 75% 포화 황산암모늄에서 침전시켜 모아 원심분리(27,000rpm에서, SW 27 회전기, 30분)하고 부유하고 박막을 pH 8의 5mM 트리스-Cl, 1mM EDTA에 재현탁시킨다. 이들 단계를 반복하고 단백질 현탁액을 80mM KCl을 함유하는 P-세포완충용액(pH 7.5의 20mM KPO4, 0.5mM EDTA, 5mM β-머캅토에탄올, 5%(w/v) 글리세롤, 0.5%(v/v) NP-40 및 트윈 20)으로 집중적으로 투석시킨다.
투석물을 원신분리병에 옮기고, 여기에 80mM KCl을 함유하는 p-세포 완충용액으로 헹군 색(Sack)으로 부터 회수된 단백질을 가한다. 20,000xg에서 15분 동안 원심분리한다. 상등액을 모으고 남은 펠릿을 세척하고, p-세포 완충용액 및 80mM KCl로 출한 다음 재원리분리한다. 그다음, 상등액을 모은다(분획 Ⅳ).
분획(Ⅳ)를 80mM KCl을 함유하는 p-세포 완충용액으로 평형화시킨 포스포셀루로즈의 2.2×22cm 칼럼에 적용시킨다. 칼럼을 상기와 동일한 완충용액으로 세척하고(2.5 내지 3칼럼용적), p-세포 완충용액중의 80 내지 400mM KCl의 직선 구배를 사용하여 단백질을 용출시킨다. DNA 폴리머라제 활성을 갖는 분획(~0.18 내지 0.20M KCl)을 모아 아미콘(Amicon) 교반된 세포 및 YM 30 막상에서 3 내지 4배 농축시킨다. 세포를 KCl을 함유하지 않는 p-세포 완충용액으로 헹구어 분획 농축물에 가하여(0.5M KCl로 최종 용적을 조정) 분획(Ⅴ)을 수득한다.
분획(Ⅴ)을 p-세포 완충용액 및 0.15M KCl로 평형화시킨 헤파린 세파로즈(Heparin Sepharose) CL-6B 칼럼(Pharmacia) 5ml에 적용시킨다. 이 칼럼을 0.15M KCl 완충용액(3 내지 4칼럼 용적)으로 세척하고 p-세포 완충용액중의 0.15 내지 0.65M KCl의 직선 구배를 사용하여 단백질을 용출시킨다. SDS-PAGE 분석을 위해, 젤라틴 없이 희석제로 1 : 10 희석액을 제조하고 계속해서 효소검정에 사용하기 위해 젤라틴 1㎎/ml를 함유하는 희석제로 1 : 20 희석액을 제조한다. 분획을 과량의 DNA 폴리머라제와 함께 배양한 후 슈퍼코일된 플라스미드 DNA의 분자량의 변화를 전기영동에 의해 감지함으로써 특이적 및 비-특이적 엔도 뉴클레아제/토포이성질화 효소에 대한 슈퍼코일된 DNA 주형상에서 분획(~0.3M KCl에서 용출시킴)의 활성도를 검정한다. 작은 직선 DNA 단편과 함께 배양하면서 엑소뉴클레아제 오염도를 확인한다. 피크 분획중 ~88kd 단백질이 주요밴드인 것으로 밝혀졌다. 주요 푸울(분획 Ⅵ)을 55℃에서 폴리머라제 ~3 내지 5단지/DNA 600ng으로 30분 동안 검정한 결과, 이는 검출가능한 엔도뉴클레아제 최소활성을 지니면서도 최고의 폴리머라제 활성을 갖는 것으로 나타났다.
분획(Ⅵ)을 pH 7.5의 10mM KPO4, 5mM β-머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 0.2% NP-40 및 0.2% 트윈20(HA 완충용액)에 대해 투석한다. 투석한 샘플을 하이드록시아타이트 칼럼 3ml에 적용시켜 pH 7.5의 10 내지 250mM KPO4, HA 완충용액의 직선 구배를 사용하여 효소를 용출시킨다. 100mM KPO4에서 피크와 함게 75mM KPO4에서 DNA 폴리머라제 활성을 용출되기 시작한다. 활성 피크 분획을 1 : 100 내지 1 : 300 희석액에서 검정한다. 앞서 크로마토그라피 단계에서와 같이, SDS-PAGE 분석을 위해 희석제중의 1 : 10 희석액을 젤라틴없이 제조한다. 55℃에서 폴리머라제 5단위로 검정했을때 엔도뉴클레아제 또는 이본쇄 엑소뉴클레아제를 상당량 함유하지 않는 분획을 모은다(분획 Ⅶ).
분획(Ⅶ)을 실온에서 pH 5로 조정한, pH 5.2의 25mM 나트륨 아세테이트, 5% 글리세롤 5mM β-머캅토에탄올, 0.1mM EDTA, 0.1% NP-40 및 0.1% 트윈 20의 용액에 대해 투석한다. 투석한 샘플을 예비-평형화된 DEAE-트리스-아크릴-M(LKB) 칼럼 2ml에 적용시키고 계속해서 상기 완충용액으로 세척한다. 칼럼에 점착되지 않은, 폴리머라제 활성을 지닌 분획을 모아 동일한 완충요액중에서 50mM NaCl로 조정하여 분획(Ⅷ)을 수득한다.
분획(Ⅷ)을 상기와 동일한 완충용액(25mM 나트륨 아세테이트, 50mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.1mM EDTA, 0.1% NP-40 및 0.1% 트윈 20)으로 평형화된 CM-트리스-아크릴 M(LKB) 2ml에 적용시킨다. 칼럼을 동일한 완충용약의 4 내지 5 칼럼 용적으로 세척하고, 나트륨 아세테이트중에서 50 내지 400mM NaCl 직선 구배를 사용하여 효소를 용출시킨다. ~0.15 내지 0.20M NaCl에서 폴리머라제 활성피크가 용출된다. SDS-PAGE 분석을 위해, 처음에 젤라틴없이 희석제중의 1 : 10 희석도를 갖는 1 : 300 내지 1 : 500 희석제에서 폴리머라제 활성을 검정한다. 74℃에서 DNA 폴리머라제 검정용염(25mM TAPS-HCl(pH 9.4), 2.0mM MgCl2및 50mM KCl)을 사용하여, 특이적 및 비-특이적 엔도뉴클레아제/토포이성질화 효소에 대한 슈퍼코일된 DNA 주형상에서 활성피크를 검정하고, 또한 M 13ss DNA 및 pBR 322 단편상에서 뉴클레아제에 대한 활성피크를 검정한다. 뉴클레아제가 검출되지 않은 활성분획을 모아 은염색된 SDS-PAGE 미니겔상에 통과시킨 결과, ~250,000 단위/mg의 특이활성을 갖는 ~88kd의 단일밴드가 나타났다.
이 특이활성도는 이미 분리한 Taq 폴리머라제에 대한 활성도보다 크며, 적어도 이. 콜라이 폴리머라제 I에 대한 활성도보다 크다.
실시예 Ⅶ
실시예 Ⅵ에 기술한 바와 같이 정제한 Taq 폴리머라제는 어떠한 오염성 Taq 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 또한, Taq 폴리머라제는 사용된 비이온성 중합성 세정제 약 0.1 내지 약 0.5%(v/v)를 함유하는 저장 완충용액중에 보관하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 50%(v/v) 글리세롤, 100mM KCl, pH 8.0의 20mM 트리스-Cl, 0.1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1Mm 디티오트레이톨, 0.5%(v/v) NP-40, 0.5%(v/v) 트윈 20 및 20㎍/ml 젤라틴으로 이루어지는 저장완충용액중, -20℃에서 보관한다.
보관한 Taq 폴리머라제를 pH 8.0의 25mM 트리스 Cl , 20mM KCL, 1mM β-머캅토에탄올, 0.5% NP-40 , 0.5% 트윈-20 및 500㎍/ml 젤라틴으로 이루어지는 완충용액을 희석시킨다. 그다음, 50mM KCl , pH 8.3의 10mM 트리스-Cl, .15mM MgCl2, 0.01%(w/v) 젤라틴, 각각 20μM의 dNTP , 박테리오파아지 λ로부터의 조절주형상의 500 염기쌍 표적 서열을 규정하는 각각 1μM의 프라이머, 및 검정당 Taq 폴리머라제 2.0 내지 2.5 단위를 함유하는 반응완충용액을 최종용적 100μl가 되게 제조한다. 반응 완충용액에 주형을 가하고, 시료를 0.5ml 폴리프로필렌 튜브에 넣어 짙은 백색 광유 100μl로 표면을 덮어 증발을 방지한다.
표적 서열이 DNA 출발중량의 약 1%를 나타내는 조절 주형(박테리오파아지 λDNA) 1mg을 사용하는 다음 조건을 사용하면 105배 이상을 증폭시킬 수 있다.
우선 주형 혼합물 튜브를 열욕중에 옮겨 94℃에서 1분 30초 동안 변성시킨다. 그다음, 튜브를 열욕중, 37℃에서 2분동안, 72℃에서 3분동안 그리고 94℃에서 1분동안 둔다. 이 순환을 총 25회 반복한다. 25회째에는 94℃에서 열변성단계를 생략하고 대신 72℃에서의 배양단계를 추가로 3분 더 연장한다. 분석을 종결시킨 다음, 샘플을 실온으로 냉각시켜 상기 실시예에서 기술한 바와 같이 분석한다.
각각 다른 농도의 dNTPS및 각각 다른 양의 Taq 폴리머라제를 사용하여 주형을 최적으로 증폭시킨다. 또한, DNA 시료중의 표적 서열의 크기는 (72℃에서의 배양단계를) 적당하게 연장시키기 위해 필요한 최소 시간에 직접 영향을 미칠 것이다. 증폭시키고자 하는 주형에 대해 적당한 온도변화를 주어 최대 증폭율을 얻는다.
실시예 Ⅷ
실시예 I에 기술한 바와 같이 정제한 Taq 폴리머라제를 저장하기 위해 상기 실시예에서 기술한 바와 같이, 단 비-이온성 중합체 세정제를 사용하지 않으면서 제형화한다. 상기 실시예에 기술한 바와 같이 활성도를 분석한 결과, 저장한 효소 혼합물은 불활성인 것으로 밝혀졌다. 저장완충용액에 NP-40 및 트윈 20을 가한 경우 효소의 활성이 완전히 유지되는데, 이 사실은 효소제제의 안정성을 위해서는 비이온성 세정제의 존재가 필요하다는 것을 지시해준다.
실시예 Ⅸ
동일한 단위의 클레노우 단편 또는 Taq 폴리머라제를 사용하여 사람 게놈성 DNA 시료 1㎍ 여러개를 실시예 Ⅴ에서 기술한 바와 같이 20 내지 35회 증폭반응시킨 다음, 아가로즈 겔 전기영동 및 써던블럿에 의해 분석한다. 이들 반응에 사용된 프라이머 PC03 및 PC04는 사람 β-글리빈 유전자의 110-bp 절편의 합성을 유도한다. 클레나우 폴리머라제 증폭반응은 이 효소와 함께 전형적으로 관찰되는 DNA의 반점을 나타내는데, 그 이유는 반드시 엄격치 않은 하이브리드화 조건(37℃에서 1×클레나우염)하에서 프라이머가 관련되지 않은 게놈 서열에 특이하지 않게 어닐링되며 연장되기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 써던 블럿에 의해 모든 레인(lane)에서 특히 β-글리빈 100bp 표적 단편이 검출되었다. Taq 폴리머라제를 이용하여 수행한 증폭반응에서는 상당히 상이한 전기영동 패턴이 나타났는데, 여기서는 단일 주 밴드가 110bp 표적 서열이다. 주목할만한 이러한 특이성은 프라이머가 연장되는 때의 온도에 기인함을 의심할 여지가 없다.
클레나우 단편 증폭반응에서와 같이 어닐링 단계는 37℃에서 수행하지만, Taq-촉매된 반응 온도는 효소가 상당한 활성을 나타내기 전에 약 70℃로 상승시켜야만 한다. 온도를 37℃에서 70℃로 상승시키는 동안 잘 매치되지 않은 프라이머-주형 하이브리드(37℃에서 형성됨)가 분해되어 반응이 효소-활성화 온도에 도달했을때 매우 상보적인 기질만이 증폭에 이용될 수 있다. 또한, 이 특이성은 클레나우 단편을 사용하여 수행한 유사한 증폭반응에 비해 보다 많은 수율의 표적 서열을 생성하는데, 그 이유는 비-특이성 증폭 생성물이 폴리머라제에 대해 효과적으로 경쟁함으로써 클레나우 단편에 의해 제조될 수 있는 110-mer의 양을 감소시키기 때문이다.
실시예 Ⅹ
반응용적 100μl당 몰트 4DNA 1㎍, 50mM KCl, 10mM 트리스(pH 8.3), 10mM MgCl20.01% 젤라틴, (150bp 영역을 증폭시키기 위한) 각각 1μM의 프라이머
5'-CATGCCTCTTTGCACCATTC-3'(RS 79) 및
5'-TGGTAGCTGGATTGTAGCTG-3'(RS 80)
각각 1.5mM의 dNTP 및 Taq 폴리머라제 5.0 단위를 함유하는 시료를 증폭 반응시킨다. Taq 폴리머라제 2.5, 1.3 또는 0.6 단위를 함유하는 3개의 샘플을 더 제조한다. 다음과 같은 주기를 사용하여 상기 기술한 온도순환기계에서 30회 증폭반응시킨다 :
1분에 걸쳐 70℃에서 98℃로 상승
98℃에서 1분동안 유지
1분에 걸쳐 98℃에서 35, 45 또는 55℃로 냉각
35, 45 또는 55℃에서 1분동안 유지
1분에 걸쳐 35, 45 또는 55℃에서 70℃로 상승
70℃에서 30초동안 유지.
어닐링 온도 35℃에서 아가로즈 겔 전기영동함으로써, 2.5단위/Taq 효소 희석액 100μl가 다른 모든 Taq 폴리머라제 농축물에 비해 가장 우수한 시그날 대 노이즈(Signal-to-noise)비를 나타낸다. 45℃에서는 5단위/Taq 효소 100μl가 다른 농축물에 비해 가장 우수한 시그날 대 노이즈 비를 나타낸다. 55℃에서 5단위/Taq 효소 100μl가 다른 농축물 및 45℃에서의 어닐링에 비해 가장 우수한 시그날 대 노이즈 비를 나타내며 수율을 개선시킨다. 폴리머라제는 55℃에서 보다 특이적으로 보다 우수한 수율을 갖는다.
각각의 실험에 있어서, 몰트 4DNA를 β- 또는 δ-글로빈을 함유하지 않는 세포주 GM 2064 DNA(Human Genetic Mutant Cell Depository Cander, New jersey로부터 입수용이)에 세포당 다양한 복제를 나타내는 다양한 농도로 연속적으로 10-배 희석하여 이들 샘플상, 35℃ 및 55℃의 어닐링 온도에서 본 실시예에서 언급한 바와 같이 증폭반응시킨다. 35℃에서 아가로즈 겔 전기영동에 의해 볼수 있는 가장 우수한 복제는 50개 세포에서 1복제이다. 55℃에서 볼수 있는 가장 우수한 복제율은 1/5000개 세포(저온에 비해 100배 증진)이며, 이 사실은 이들 조건하에서 Taq 폴리머라제 특이성에 대해 상승된 어닐링 온도가 중요함을 암시한다.
세번째 실험에서, HIV-양성 DNA를 함유하는 세포주 368H(B. Poiesz, State, University of NewYork, Syracuse, NY로부터 구입가능)로부터의 DNA를 SC 1 세포주(1985년 3월 19일자로 ATCC에 기탁 ; 낫형 세포 대립 유전자에대해 동종성이며 어떤 HIV 서열이 결실된 EBV-형질절환된 β 세포주)으로부터의 DNA에 세포당 다양한 복제물을 나타내는 다양한 농도로 희석한 다음, 하기와 같은 서열의 프라이머 SK 38 및 K 39을 35℃ 및 55℃의 어닐링 온도에서 상기 기술한 바와 같이 증폭반응시켜 HIV 서열의 115bp 영역을 증폭시킨다.
5'-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3'(SK38)
5'-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3'(SK39)
아가로즈 겔 전기영동한 결과, 35℃의 어닐링 온도에서는 단지 희석하지 않은 368H 시료만이 검출된 반면에, 55℃의 어닐링 온도에서는 10-2이상의 희석액이 검출될 수 있는데, 이사실은 검출에 있어서의 100배 증진을 나타낸다.
실시예 XI
150mM KCl, 50mM 트리스·HCl(pH 8.3), 10mM MgCl2, 5mM DTT, 0.5mM dATP, 0.5mM dCTP, 0.5mM TTP, 0.5mM dGTP, 올리고(dT) 12-18(Pharmacia) 0.2㎍, RNasin(Promega Biotec) 40단위 및 AMV 역전사효소(BRL) 5단위를 함유하는 반응용액 100μl중에서 토끼의 망상 적혈구 mRNA(Bethesda Research Laboratoris) 1㎍으로부터 cDNA를 제조하여 42℃에서 30분동안 배양한다. 95℃에서 10분동안 가열하여 반응을 중단시킨다. 시료(수중의 2mg/ml 용액 2μl)에 RNase 2㎍을 가하여 37℃에서 10분동안 배양한다.
서로 상이한 쌍의 프라이머를 사용하는 클레나우 단편으로 3종류의 증폭반응을 수행한다. 프라이머 쌍 PC03/PC04는 110-bp 생성물을 한정한다. 프라이머 쌍 RS45/올리고(dT) 20-30은 약 370-bp 생성물을 한정하며, 프라이머 쌍 PC03/올리고(dT) 25-30은 약 600-bp 생성물을 한정한다. PC03, PC04 및 RS45는 사람 β-글로빈유전자에 대해 상보적이며 각각은 토끼 유전자와 잘못 조합된 결합 2개를 갖는다. PC03 및 PC04는 실시예 I에 기술되어 있다. RS45는 서열 5'-CAAGAAGGTGCTAGGTGCC-3'을 갖는다.
50mM NaCl, 10mM 트리스·HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 200㎍/ml 젤라틴, 10% DMSO, 1μM PC03 또는 RS45, 1μM PC04 또는 올리고(dT) 25-30μM, 1.5mM dATP, 1.5mM dCTP, 1.5mM TTP 및 1.5mM dGTP을 함유하는 반응 용액 100μl중에서 상기 기술한 cDNA 1/20(5μl)로 증폭반응을 수행한다. 시료를 98℃에서 5분동안 가열한 다음, 실온으로 냉각시키고 광유 100μl로 중층화시킨다.
당해 시료를 대상으로 하여 다음과 같은 프로그램 및 실시예 I에 기술된 기계를 사용하여 자동화 증폭반응을 10회 수행한다 :
1) 가열블럭에서 2.5분에 걸쳐 37℃에서 98℃로 가열(변성) ;
2) 3.0분에 걸쳐 98℃에서 37℃로 냉각(어닐링) ;
3) 클레나우 단편 1단위 첨가 ; 및
4) 37℃에서 20분 동안 유지(증폭)
생플의 최종 용적은 약 140μl이다.
각각의 시료의 1/20(7μl)을 2% 아가로즈 겔상에서 전기영동한다. 에티듐 브로마이드로 염색한 후, PC03/PC04 및 RS45/올리고(dT) 샘플에서 분리된 밴드가 나타난다. 밴드의 크기는 기대한 길이와 일치하는데, 전자는 110bp이고 후자는 약 370bp이다. PC03/올리고(dT) 프라이머 쌍을 사용한 증폭반응시 약 600bp 단편의 증폭반응이 일어난 증거는 없다.
겔을 게나트란(Genatran) 나일론 막에 써던 블럿 시킨 다음, 문헌[Saiki et al., Science, 상기 인용]에 기술된 표준 기술을 사용하여 닉크-해독된 인체 β-글로빈 프로브 탐침 pBR328 : βA와 하이브리드화시킨다. 자동방사사진 결과, 이미 알고 있는 바와 같이 110 미 약 370bp 단편은 β-글로빈 특이적 증폭 생성물이며 약 600bp 증폭반응의 밴드는 검출되지 않았다.
세개의 추가의 시료를 상기 기술한 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 상기 기술한 바와 같이 수득한 Taq 폴리머라제로 증폭시킨다. 50mM KCl, 25mM 트리스 ·HCl(pH 8.0), 10mM MgCl2, 200㎍/ml 젤라틴, 10% DMSO, 1μM PC03 또는 RS45, 1μM PC04 또는 올리고-(dT) 25-30μM, 1.5mM dATP, 1.5mM dCTP, 1.5mM TTP 및 1.5mM dGTP를 함유하는 반응용액 10μl중에서 cDNA 5μl를 증폭시킨다. 시료를 98℃에서 5분동안 가열한 다음 실온으로 냉각시킨다. 각각에 Taq 폴리머라제 1μl(로트 2의 1/8 희석)를 가하여 광유약 100μl로 중층화한다.
다음과같은 프로그램을 사용하여 상기 실시예에 기술된 펠티어(Peltier) 장치에서 샘플을 9회 증폭 반응 시킨다 :
1) 1분에 걸쳐 35℃에서 60℃로 상승 :
2) 12분에 걸쳐서 60℃에서 70℃로 상승(연장) :
3) 1분 걸쳐 70℃에서 95℃로 상승(변성) :
4) 95℃에서 30초 동안 유지 :
5) 1분에 걸쳐 95℃에서 35℃로 냉각(어닐링) ; 및
6) 35℃에서 3초동안 유지
마지막 주기 후 시료를 70℃에서 추가로 10분동안 배양하여 최종(10회 주기) 연장을 완결시킨다. 각각의 최종 용적은 약 100μl이다.
상기와 같이 각각의 샘플의 1/20(10μl)을 2% 아가로즈 겔상에서 분석한다. 이 겔에서 3개의 샘플 전부에 증폭 생성물이 존재하는데 PC03/PC04에 대해서는 100bp, RS45/올리고(dT)에 대해서는 약 370bp 및 PC03/올리고(dT)에 대해서는 약 600bp가 생성된다. 이 결과는 pBR328 : βA 탐침을 써던 전이 및 하이브리드화 시킴으로써 확인된다.
클레나우 단편이 아니라 Taq 폴리머라제를 사용한 600bp 생성물의 생성은 매우 중요하며, 이는 Taq 폴리머라제가 클레나우 단편에 비해 보다 긴 DNA를 생성할 수 있음을 제시한다.
다음 박테리오파아지 및 박테리아 균주는 기탁 기관[Cetus Master Culture Collection, 1400 Fifty-Third Street, Emeryville, California, USA(CMCC) 및 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA(ATCC)]에 기탁되어 있다. 이들 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁에 관한 국제승인하, 부다페스트 조약의 규정 및 규약에 따라 기탁되었다. 이는 기탁일로부터 30년간 생존 배양물의 유지가 인정된다. 이 균주는 부다페스트 조약의 규약하에 및 미합중국 특허권상의 제한되지 않은 권리를 인정하는 ATCC와 출원인 사이의 협약에 따라 ATCC로부터 입수용이할 수 있다. 기탁된 균주의 입수용이성은 특허법에 따라 특정정부의 권한하에 인정된 권리를 위반하면서 발명을 실시하는 허가로서 해석되는 것은 아니다.
Figure kpo00007
총괄적으로, 본 발명은 온도-순환 연쇄반응 및 열안정성 효소를 사용하여 하나 이상의 특성 핵산 서열을 증폭시키기 위한 방법을 제공하며, 이 반응에서 생성된 반응 프라이머 증폭생성물을 연속적으로 추가의 프라이머 연장 반응용 주형으로서 작용할 수 있다. 이 방법은 특히, 초기에 단지 매우 소량 존재하는 핵산을 검출하고, 서열-특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하여 뉴클레오티드 변이를 검출하는데 유용하다. 또는, 본 발명의 증폭방법은 분자 클로닝에도 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 증폭 생성물의 증가된 수율, 보다 큰 특이성을 제공하며 선행기술의 증폭방법에 비해 수행해야할 단계가 더 적다.

Claims (27)

  1. 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 핵산 주형 본쇄에 상보적인 핵산 본쇄를 형성하도록 하고, 폴리아크릴아미드 겔 변성시 분자량이 92,500달톤인 포스포릴라제 B표준물 보다 신속하게 이동하고 소의 혈청 알부민보다는 느리게 이동하는 것을 근거로 하여 측정한 분자량이 약 86,000 내지 90,000 달톤인, 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터 유도된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소.
  2. 제1항에 있어서, pH 6.4에서의 활성도가 pH 8.0에서의 활성도의 50% 이상인 효소.
  3. (a) 써머스 아쿠아티쿠스(Taq) 열안정성 효소에 대한 항체를 사용하여 발현 라이브러리를 면역학적 스크리닝하여 상기 열안정성 효소에 대한 DNA 서열 탐침을 동정하는 단계 ;
    (b) 표적 DNA의 게놈 라이브러리를 작제하는 단계 ;
    (c) 단계(a)에 의해 수득된 방사선 표지된 탐침을 사용하여 상기 게놈 라이브러리를 스크리닝하는 단계 ; 및
    (d) 상기 열안정성 핵산 폴리머라제 효소를 암호화하는 DNA, 또는 효소적으로 활성인 절단된 열안정성 핵산 폴리머라제 효소를 암호화하는 상기 DNA 서열의 단편을 함유하는 파지(phage)를 분리시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 써머스 아쿠아티쿠스 DNA로부터 수득가능한 핵산 주형 본쇄에 상보적인 핵산 분쇄를 형성하도록 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 결합을 촉매하는 써머스 아쿠아티쿠스로부터의 열안정성 핵산 폴리머라제 효소를 암호화하는 DNA 서열, 또는 써머스 아쿠아티쿠스로부터 유도되고 효소적으로 활성인 절단인 열안정성 핵산 폴리머라제 효소를 암호화하는 상기 DNA 서열의 단편.
  4. 제3항에 있어서, 써머스 아쿠아트쿠스의 게놈 또는 박테리오파지 CH35 : Taq#4-2의 DNA의 약 3.5kb의 Bg Ⅲ-Asp 718(부분) 제한 단편내에 함유되어 있는 DNA 서열.
  5. 제3항에 있어서, 써머스 아쿠아트쿠스의 게놈 또는 플라스미드 pFC85의 약 2.8kb의 Hind Ⅲ-Asp718 제한 단편내에 함유되어 있는 DNA 서열.
  6. 하나 이상의 비-이온성 중합체 세정제를 함유하는 완충액중에 제1항 또는 제2항에 따르는 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 포함하는 안정한 효소 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 세정제가 조성물의 총 용량을 기준으로 하여, 각각 약 0.1% 내기 약 0.5% 용량의 농도로 존재하는 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 세정제가 폴리옥시에틸화 솔비탄 모노라우레이트 및 에톡시화 노닐 페놀인 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 완충액이 글리세롤, pH 8.0인 트리스-Cl, 에틸렌디아민 테트라아세트산, 디티오트레이톨, 폴리옥시에틸화 솔비탄 모노라우레이트, 에톡시화 노닐 페놀, 및 젤라틴을 함유하는 조성물.
  10. (a) 각각의 핵산 본쇄를, 각각의 플라이머가 그의 상보적인 핵산 본쇄와 하이브리드화 되도록 촉진시키는 온도에서, 증폭될 상이한 특정 서열 각각에 대한 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트 및 1개의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각각의 특정 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것으로 선택하여, 하나의 프라이머로부터 합성된 연장 산물이 그의 상보물로부터 분리되는 경우에 다른 프라이머의 연장산물의 합성을 위한 주형으로서 작용할 수 있도록 한다) ;
    (b) 각각의 핵산 본쇄를 단계(a)와 동시에 또는 단계(a) 이후에, 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 각 핵산의 본쇄 각각에 대해 상보적인 프라이머 연장 생성물을 생성하도록 하는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계 ;
    (c) 단계(b)에서 얻은 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 증폭될 상이한 서열 각각에 대한 핵산 본쇄 주형 각각에 상보적인 프라이머 각각의 연장 생성물을 합성 하기에 효과적이지만 각 연장산물이 그의 상보적인 본쇄 주형으로부터 분리될 만큼 높지않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계 ;
    (d) 단계(c)의 혼합물을, 프라이머 연장 산물을 이들이 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성시키기에 효과적이나, 효소를 비가역적으로 변성시킬 만큼 높지 않은 온도에서 효과적인 시간동안 가열 시키는 단계 ;
    (e) 단계(d)의 혼합물을, 각 프라이머가 단계(d)에서 생성된 일본쇄 분자 각각과 하이브리화도록 하기에 효과적인 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (f) 단계(e)의 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 증폭될 상이한 서열 각각에 대한 단계(d)에 생성된 핵산 본쇄 주형 각각에 상보적인 각 프라이머의 연장 산물을 합성하기에 효과적이나, 각 연장 산물이 그의 상보적인 본쇄 주형으로부터 분리될 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계[이때, 단계(e) 및 (f)는 동시에 수행하거나 연속적으로 수행한다]를 포함하는, 헥산 또는 핵산의 혼합물(여기서, 핵산이 이본쇄일 경우에 길이가 같거나 다른 별도의 상보적인 본쇄 2개로 이루어진다)에 함유된 하나 이상의 특정 핵산 서열을 증폭시키는 방법.
  11. (a) 각각의 핵산을, 증폭될 각각의 상이한 특정 서열에 대한 1개의 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서, 각각의 핵산을 변성시키기에 효과적인 온도에서 효과적인 시간동안 가열하는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각각의 특정 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것으로 선택하여 하나의 프라이머로부터 합성된 연장 생성물이 이의 상보물로부터 분리될 경우에 다른 프라이머의 연장산물을 합성하기 위한 주형으로서 제공될 수 있도록 한다) ;
    (b) 변성된 핵산을 각각의 프라이머가 이의 상보적이 핵산본쇄와 하이브리드화되도록 하는 온도로 냉각 시키는 단계 ;
    (c) 변성된 핵산을 단계(a) 또는 (b)와 동시에 또는 단계(a) 또는 (b) 이후에, 뉴클레오티드 트리포스페이트를 결합시켜 각 핵산의 각 본쇄에 상보적인 프라이머 연장 산물을 형성시켜 주는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계 ;
    (d) 단계(c)의 혼합물을, 열안정성 효소의 활성을 증진시키고 증폭될 각각의 상이한 서열에 대한 각각의 핵산 본쇄 주행에 상보적인 각 프라이머의 연장 생성물을 합성시키기에 효과적이나, 각각의 연장산물을 이의 상보적인 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계 ;
    (e) 단계(d)의 혼합물을, 프라이머 연장 산물을 이들이 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성하기에 효과적이나, 효소를 비가역적으로 변성시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 가열하는 단계 ;
    (f) 단계(e)의 혼합물을, 프라이머가 단계(e)에서 생성된 그의 상보적인 일본쇄 분자와 하이브리드화되도록 하기에 효과적인 시간동안, 효과적인 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (g) 단계(f)의 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 증폭될 각각의 상이한 서열에 대한 단계(f)에서 생성된 각 핵산 본체 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장 산물을 합성하기에 효과적이나, 각 연장산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서, 효과적인 시간동안 유지시키는 단계[이때, 단계(f) 및 (g)는 동시에 수행하거나 연속적으로 수행한다]를 포함하는, 핵산 또는 핵산의 혼합물(여기에서, 핵산은 길이가 동일하거나 상이한 두개의 상보적 본쇄로 이루어진다)내에 함유된 하나 이상의 특정 핵산 서열을 증폭시키는 방법.
  12. (a) 핵산 또는 핵산의 혼합물(여기에서, 핵산이 이본쇄일 경우에 각각 길이가 같거나 다른 별도의 상보적 본쇄 2개로 이루어진다)을 함유하는 샘플을, 각 프라이머가 그의 상보적인 핵산 본쇄와 하이브리드화 되도록 하는 온도에서, 검출할 각각의 상이한 특정 서열에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트와 접촉시키는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각 특정 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것을 선택하여, 하나의 프라이머로부터 합성된 연장 산물이 이의 상보물로부터 분리될 경우 다른 프라이머의 연장산물을 합성하기 위한 주형으로서 제공될 수 있도록 한다) ;
    (b) 상기 샘플은, 단계(a)와 동시에 또는 단계(a) 이후에, 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 각 핵산의 각 본쇄에 상보적인 프라이머 연장 산물을 형성하도록 하는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계 ;
    (c) 단계(b)의 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 검출할 각각의 상이한 서열에 대한 각 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장 생성물을 합성하기에 효과적이나, 각각의 연장 산물을 이의 상보 본쇄 주행으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간 동안 유지시키는 단계 ;
    (d) 단계(c)의 혼합물을, 프라이머 연장 산물을 이들이 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성시키기에 효과적이나, 열안정성 효소를 비가역적으로 변성사킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간 동안 가열시키는 단계 ;
    (e) 단계(d)의 혼합물을, 각 프라이머가 단계(d)에서 생성된 그의 상보적인 일본쇄 분자와 하이브리드화 되도록 하기에 효과적인 시간 동안 효과적 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (f) 단계(e)의 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 검출될 각각의 상이한 서열에 대한 각 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장산물을 합성하기에 효과적이나, 각각의 연장 산물을 이의 상보 본쇄주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간 동안유지시켜, 존재하는 경우, 특정 핵산 서열(들)을 정량적으로 증폭시키는 단계[이때, 단계(e) 및 (f)는 연속적으로 수행하거나 동시에 수행한다] ;
    (g) 단계(f)의 생성물에, 언급한 서열 또는 이의 변형서열과 하이브리드화할 수 있는 검출될 각 서열에 대한 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 가하는 단계 ; 및
    (h) 언급한 하이브리드화의 발생 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 언급한 서열(들)을 함유하는 것으로 추정되는 언급한 샘플중에서 하나 이상의 특정 핵산 서열을 구별하는 방법.
  13. (a) 핵산 또는 핵산의 혼합물(여기에서, 핵산은 이본쇄이다)을 함유하는 샘플을, 검출한 각각의 상이한 특정 서열에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페트의 존재하에 샘플중의 각 핵산을 변성시키기에 효과적인 온도에서 효과적인 시간동안 가열하는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각각의 특정 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것으로 선택하여, 하나의 프라이머로부터 합성된 연장 생성물이 이의 상보물로부터 분리될 경우에 다른 프라이머의 연장산물을 합성하기 위한 주형으로서 제공될 수 있도록 한다) ;
    (b) 변성된 핵산을 각각의 프라이머가 이의 상보적인 핵산 본쇄와 하이브리드화되도록 하는 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (c) 변성된 핵산을 단계(a) 또는 (b)와 동시에 또는 단계(a) 또는 (b) 이후에, 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 각 핵산의 각 본쇄에 상보적인 프라이머 연장 생성물을 형성시키는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계 ;
    (d) 단계(c)의 혼합물을, 열안정성 효소의 활성을 증진시키고 검출할 각각의 상이한 서열에 대한 각각의 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장 산물을 합성시키기에 효과적이나, 각각의 연장산물을 이의 상보적인 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계 ;
    (e) 단계(d)의 혼합물을, 프라이머 연장 산물을 이들이 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성하기에 효과적이나, 효소를 비가역적으로 변성시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 가열하는 단계 :
    (f) 단계(e)의 혼합물을, 각 프라이머가 단계(e)에서 생성된 그의 상보적인 일본쇄 분자와 하이브리드화 되도록 하기에 효과적인 시간동안, 효과적인 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (g) 단계(f)의 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 검출할 각각의 상이한 서열에 대한 각 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장 산물을 합성하기에 효과적이나, 각 연장 산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서, 효과적인 시가동안 유지시켜, 존재하는 경우, 특정 핵산 서열(들)을 정량적으로 증폭시키는 단계[이때, 단계(f) 및 (g)는 동시에 수행하거나 연속적으로 수행한다] ;
    (h) 단계(g)의 생성물에 언급한 서열 또는 이의 변형 서열과 하이브리드화할 수 있는 검출할 각 서열에 대한 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 가하는 단계 ; 및
    (i) 언급한 하이브리드화의 발생여부를 결정하는 단계를 포함하는, 언급한 서열(들)을 함유하는 것으로 추정되는 언급함 샘플중에서 하나 이상의 특정 핵산 서열의 존재여부를 탐지하거나, 언급한 샘플중에서 두개의 상이한 서열을 구별하는 방법.
  14. (a) 하나 이상의 핵산(여기에서 핵산은 이본쇄일 경우에 길이가 같거나 다른 별도의 상보적 본쇄 2개로 이루어진다)을 함유하는 샘플을, 각 프라이머가 그의 상보적인 핵산 본쇄와 하이브리드화되도록 하는 온도에서, 핵선 서열의 변이체를 함유하는 것으로 여겨지는 각 핵산의 각 본쇄에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트와 접촉시키는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각 특정 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것을 선택하여, 하나의 프라이머로부터 합성된 연장 생성물이 이의 상보물로부터 분리될 경우 다른 프라이머의 연장 생성물을 합성하기 위한 주형으로서 제공될 수 있도록 한다) ;
    (b) 상기 샘플을, 단계(a)와 동시에 또는 단계(a) 이후에, 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 각 핵산의 각 본쇄에 상보적인 프라이머 연장 산물을 형성하도록 하는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계 ;
    (c) 단계(b)의 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 언급한 변이체(들)을 함유하는 것으로 여겨지는 각각의 상이한 핵산에 대한 각 핵산 본체 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장 산물을 합성하기에 효과적이나, 각각의 연장 산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시켜 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계 ;
    (d) 단계(c)의 혼합물을, 프라이머 연장 산물을 이들이 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성시키기에 효과적이나, 열안정성 효소를 비가역적으로 변성시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 가열시키는 단계 ;
    (e) 단계(d)의 혼합물을 각 프라이머가 단계(d)에서 생성된 그의 상보적인 일본쇄 분자와 하이브리드화 되도록 하기에 효과적인 시간동안 효과적인 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (f) 단계(e)의 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 언급한 변이체(들)을 함유하는 것으로 여겨지는 각각의 상이한 핵산에 대한 각 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장 산물을 합성하기에 효과적이나, 각각의 연장 산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계(이때, 단계(d),(e) 및 (f)는, 존재하는 경우, 서열 변이체(들)을 함유하는 핵산이 검출가능하게 증폭되도록 충분한 회수로 반복하며, 단계(e) 및 (f)는 연속적으로 수행하거나 동시에 수행한다] ;
    (g) 단계(f)의 생성물을 막에 부착시키는 단계 ;
    (h) 이 막을 하이브리드화 조건하에서 탐침의 서열이 증폭된 서열의 영역에 상보적인 경우에만 증폭된 핵산 서열과 하이브리드화할 수 있는 표지된 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 탐침으로 처리하는 단계 ; 및
    (i) 탐침이 핵산 샘플중의 증폭된 서열에 하이브리드화 되었는지의 여부를 탐지하는 단계를 포함하는, 샘플중에 함유된 하나 이상의 핵산의 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 변이되었는지의 여부를 탐지하는 방법.
  15. (a) 하나 이상의 핵산(여기에서, 핵산은 각각 길이가 같거나 상이한 상보적 본쇄 2개로 이루어진다)을 함유하는 샘플을, 핵산서열의 변이체(들)을 함유하는 것으로 추정되는 각 핵산의 각 본쇄에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서, 각각의 핵산을 변성시키기에 효과적인 온도에서 효과적인 시간동안 가열하는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각각의 특정 핵산의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것으로 선택하여 하나의 프라이머로부터 합성된 연장 산물이 이의 상보물로부터 분리될 경우에 다른 프라이머의 연장산물을 합성하기 위한 주형으로서 제공될 수 있도록 한다) ;
    (b) 변성된 핵산을 각각의 프라이머가 이의 상보적인 핵산본쇄와 하이브리드화되도록 하는 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (c) 변성된 핵산을 단계(a) 또는 (b)와 동시에 또는 단계(a) 또는 (b) 이후에, 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 각 핵산의 각 본쇄에 상보적인 프라이머 연장 산물을 형성시키는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계 ;
    (d) 단계(c)의 혼합물을, 열안정성 효소의 활성을 증진시키고 언급한 변이체(들)을 함유하는 것으로 기대되는 각각의 상이한 핵산에 대한 각각의 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장 산물을 합성시키기에 효과적이나, 각각의 연장 산물을 이의 상보적인 본쇄주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계 ;
    (e) 단계(d)의 혼합물을, 프라이머 연장 산물을 이들이 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성하기에 효과적이나, 효소를 비가역적으로 변성시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 가열하는 단계 ;
    (f) 단계(e)의 혼합물을, 각 프라이머가 단계(e)에서 생성된 그의 상보적인 일본쇄 분자와 하이브리드화 되도록 하기에 효과적인 시간동안, 효과적인 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (g) 단계(f)의 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 언급한 변이체(들)을 함유하는 것으로 기대되는 각각의 상이한 핵산에 대한 각 핵산 본쇄 주형에 상보적인 가 프라이머의 연장 산물을 합성하기에 효과적이나, 각각의 연장 산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계[이때, 단계(e),(f) 및 (g)는, 존재하는 경우, 서열 변이체(들)을 함유하는 핵산이 검출가능하게 증폭되도록 충분한 회수로 반복하고, 단계(f) 및 (g)는 연속적으로 수행하거나 동시에 수행한다] ;
    (h) 단계(g)의 생성물을 막에 부착시키는 단계 ;
    (i) 이 막을 하이브리드화 조건하에서 탐침의 서열이 증폭된 서열의 영역에 상보적인 경우에만 증폭된 핵산 서열과 하이브리드화할 수 있는 표지된 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 탐심으로 처리하는 단계: 및
    (j) 탐침이 핵산 샘플중의 증폭된 서열에 하이브리드화되었는지의 여부를 탐지하는 단계를 포함하는, 샘플중에 함유된 하나 이상의 핵산 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 변히되었는지의 여부를 탐지하는 방법.
  16. (a) 하나 이상의 핵산(여기에서, 핵산이 이본쇄일 경우에 길이가 같거나 다른 별도의 상보적 본쇄 2개로 이루어진다)을 함유하는 샘플을, 각 프라이머가 그의 상보적인 핵산 본쇄와 하이브리드화되도록 하는 온도에서, 핵산 서열의 변이체(들)을 함유하는 것으로 기대되는 각 핵산의 각 본쇄에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트와 접촉시키는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각 특정 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것을 선택하여, 하나의 프라이머로부터 합성된 연장 산물이 이의 상보물로부터 분리될 경우 다른 프라이머의 연장산물을 합성하기 위한 주형으로서 제공될 수 있도록 한다) ;
    (b) 상기 샘플을, 단계(a)와 동시에 또는 단계(a) 이후에, 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 각 핵산의 각 본쇄에 상보적인 프라이머 연장 산물을 형성하도록 하는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계 ;
    (c) 단계(b)의 반응 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 언급한 변이제(들)을 함유하는 것으로 기대되는 각각의 상이한 핵산에 대한 각 핵산 본체 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장 산물을 합성하기에 효과적이나, 각각의 연장 산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계 ;
    (d) 단계(c)의 반응 혼합물을, 프라이머 연장 산물을 이들이 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성시키기에 효과적이나, 열안정성 효소를 비가역적으로 변성시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 가열시키는 단계 ;
    (e) 단계(d)의 혼합물을, 각 프라이머가 단계(d)에서 생성된 그의 상보적인 일본쇄 분자와 하이브리드화 되도록 하기에 효과적인 시간동안 효과적인 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (f) 단계(e)의 반응 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 언급한 변이체(들)을 함유하는 것으로 기대되는 각각의 상이한 핵산에 대한 각 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장 산물을 합성하기에 효과적이나, 각각의 연장 산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간 동안 유지시키는 단계[이때, 단계(d),(e) 및 (f)는, 존재하는 경우, 서열 변이체(들)을 함유하는 핵산이 검출 가능하게 증폭되도록 충분한 회수로 반복하고, 하나 이상의 프라이머 및/또는 4개의 뉴클레오티드 트리포스페이트중 하나 이상은 검출가능한 잔기로 표지시키며, 단계(e)및 (f)는 연속적으로 수행하거나 동시에 수행한다] ;
    (g) 막에, 올리고뉴클레오티드의 서열이 증폭된 서열의 영역에 상보적인 경우에만 증폭된 핵산 서열과 하이브리드화할 수 있는 서열-특이적 올리고뉴클레오티드를 부착시키는 단계 ;
    (h) 막을 하이브리드화 조건하에서 단계(f)의 생성물로 처리하는 단계 ; 및
    (i) 핵산 샘플중의 증폭된 서열이 상기 막에 부착된 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화되었는지의 여부를 탐지하는 단계를 포함하는, 샘플중에 함유된 하나 이상의 핵산의 서열에서 하나이상의 뉴클레오티드가 변히되었는지의 여부를 탐지하는 방법.
  17. (a) 하나 이상의 핵산(여기에서, 핵산은 길이가 같거나 상이한 상보적 본쇄 2개로 이루어진다)을 함유하는 샘플을, 핵산 서열의 변이체(들)을 함유하는 것으로기대되는 각 핵산의 각 본쇄에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서 각각의 핵산을 변성시키기에 효과적인 온도에서 효과적인 시간동안 가열하는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각각의 특정 핵산 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것으로 선택하여 하나의 프라이머로부터 합성된 연장 산물이 이의 상보물로부터 분리될 경우에 다른 프라이머의 연장 산물을 합성하기 위한 주형으로서 제공될 수 있도록 한다) ;
    (b) 변성된 핵산을 각각의 프라이머가 이의 상보적인 핵산 본쇄와 하이브리드화되도록 하는 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (c) 변성된 핵산을 단계(a) 또는 (b)와 동시에 또는 단계(a) 또는 (b) 이후에 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 각 핵산의 각 본쇄에 상보적인 프라이머 연장 산물을 형성시키는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계 ;
    (d) 단계(c)의 반응 혼합물을, 열안정성 효소의 활성을 증진시키고 언급한 변이체(들)을 함유하는 것으로 기대되는 각각의 상이한 핵산에 대한 각각의 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장 산물을 합성시키기에 효과적이나, 각각의 연장 산물을 이의 상보적인 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계 ;
    (e) 단계(d)의 반응 혼합물을, 프라이머 연장 산물을 이들이 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성하기에 효과적이나, 효소를 비가역적으로 변성시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 가열하는 단계 ;
    (f) 단계(e)의 반응 혼합물을, 각 프라이머가 단계(e)에서 생성된 그의 상보적인 일본쇄 분자와 하이브리드화되도록 하기에 효과적인 시간동안, 효과적인 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (g) 단계(f)의 반응 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 언급한 변이체(들)을 함유하는 것으로 기대되는 각각의 상이한 핵산에 대한 각 핵산 본쇄 주형에 상보적인 가 프라이머의 연장 산물을 합성하기에 효과적이나, 각각의 연장 산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 기간동안 유지시키는 단계[이때, 단계(e),(f) 및 (g)는, 존재하는 경우, 서열 변이체(들)을 함유하는 핵산이 검출 가능하게 증폭되도록 충분한 회수로 반복하고, 하나 이상의 프라이머 및/또는 4개의 뉴클레오티드 트리포스페이트중 하나 이상은 탐지 가능한 잔기로 표지하며, 단계(f) 및 (g)는 연속적으로 수행하거나 동시에 수행한다] ;
    (h) 막에, 올리고뉴클레오티드의 서열이 증폭된 서열의 영역에 상보적인 경우에만 증폭된 핵산 서열과 하이브리드화할 수 있는 서열-특이적 올리고뉴클레오티드를 부착시키는 단계 ;
    (i) 상기 막을 하이브리드화 조건하에서 단계(g)의 생성물로 처리하는 단계 ; 및
    (j) 핵산 샘플중의 증폭된 서열이 상기 막에 부착된 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화되었는지의 여부를 탐지하는 단계를 포함하는, 샘플중에 함유된 하나 이상의 핵산의 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 변이되었는지의 여부를 탐지하는 방법.
  18. (a) 하나 이상의 핵산(여기에서, 핵산이 이본쇄일 경우에 길이가 같거나 다른 별도의 상보적 본쇄 2개로 이루어진다)을 함유하는 샘플을, 각 프라이머가 그의 상보적인 핵산 본쇄와 하이브리드화 되도록 하는 온도에서, 핵산서열의 변이체(들)을 함유하는 것으로 기대되는 각 핵산의 각 본쇄에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트와 접촉시키는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각 특정 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것을 선택하여, 하나의 프라이머로부터 합성된 연장산물이 이의 상보물로부터 분리될 경우 다른 프라이머의 연장산물을 합성하기 위한 주형으로서 제공될 수 있도록 한다) ;
    (b) 상기 샘플을, 단계(a)와 동시에 또는 단계(a) 이후에, 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 각 핵산의 각 본쇄에 상보적인 프라이머 연장 산물을 형성하도록 하는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계 ;
    (c) 단계(b)의 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 언급한 변이체(들)을 함유하는 것으로 기대되는 각각의 상이한 핵산에 대한 각 핵산 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장산물을 합성하기에 효과적이나, 각각의 연장산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간 동안 유지시키는 단계 ;
    (d) 단계(c)의 혼합물을, 프라이머 연장 산물을 이들이 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성시키기에 효과적이나, 열안정성 효소를 비가역적으로 변성시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 가열시키는 단계 ;
    (e) 단계(d)의 혼합물을, 각 프라이머가 단계(d)에서 생성된 그의 상보적 본쇄 분자와 하이브리드화되도록 하기에 효과적인 시간 동안 효과적인 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (f) 단계(e)의 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 언급한 변이체(들)을 함유하는 것으로 기대되는 각각의 상이한 핵산에 대한 각 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장산물을 합성하기에 효과적이나, 각각의 연장산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계[이때, 단계(d),(e) 및 (f)는, 존제하는 경우, 서열 변이체(들)을 함유하는 핵산이 검출 가능하게 증폭되도록 충분한 회수로 반복하고, 단계(e) 및 (f)는 연속적으로 수행하거나 동시에 수행한다] ;
    (g) 막에, 올리고뉴클레오티드 탐침의 서열이 증폭된 서열의 영역에 상보적인 경우에만 증폭딘 핵산 서열과 하이브리드화할 수 있는 표지된 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 탐침을 부착시키는 단계 ;
    (h) 상기 막을 하이브리드화 조건허에서 단계(f)의 생성물로 처리하는 단계 ;
    (i) 탐지될 탐침 및 변이체(들) 둘다가 제한효소에 의해 인지된 제한부위를 함유하는 경우 형성된 어떠한 하이브리드도 절단시킬 수 있는 제한효소로 단계(h)의 생성물을 처리하는 단계 ; 및
    (j) 필요한 길이의 표지된 제한 단편이 하이브리드화가 일어났는지를 나타내는 제한 분해물중에 존재하는지의 여부를 탐지하는 단계를 포함하는, 샘플중에 함유된 하나 이상의 핵산의 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 변이되었는지의 여부를 탐지하는 방법.
  19. (a) 각 핵산(여기에서, 핵산은 이본쇄일 경우에 길이가 같거나 다른 별도의 상보적 본쇄 2개로 이루어지며 클로닝 전에 정량적으로 증폭된다)을, 각 프라이머가 그의 상보적인 핵산 본쇄와 하이브리드화되도록 하는 온도에서, 증폭될 각각의 상이한 특정 서열에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트와 접촉시키는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각 특정 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것을 선택하여, 하나의 프라이머로부터 합성된 연장산물이 이의 상보물로부터 분리될 경우 다른 프라이머의 연장산물을 합성하기 위한 주형으로서 제공될 수 있도록 한다) ;
    (b) 각 핵산 본쇄를, 단계(a)와 동시에 또는 단계(a) 이후에, 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 각 핵산의 각 본쇄에 상보적인 프라이머 연장 산물을 형성하도록 하는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계 ;
    (c) 단계(b)의 혼합물을 효소의 활성을 증진시키고 증폭될 각각의 상이한 서열에 대한 각 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장산물을 합성하기에 효과적이나, 각각의 연장산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간 동안 유지시키는 단계 ;
    (d) 단계(c)의 혼합물을, 프라이머 연장 산물을 이들 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성시키기에 효과적이나, 열안정성 효소를 비가역적으로 변성시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 가열시키는 단계 ;
    (e) 단계(d)의 혼합물을, 각 프라이머가 단계(d)에서 생성된 그의 상보적인 일본쇄 분자와 하이브리드화 되도록 하기에 효과적인 시간동안 효좌적인 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (f) 단계(e)의 혼합물을 효소의 활성을 증진시키고 증폭될 각각의 상이한 서열에 대한 단계(d)에서 생성된 각 핵산 본체 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장 산물을 합성하기에 효과적이나, 각각의 연장산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간 동안 유지시키는 단계[이때, 단계(d),(e) 및 (f)는 상기 서열(들)을 함유하는 핵산(들)이 검출 가능하게 증폭되도록 충분한 회수로 반복하고, 단계(e) 및 (f)는 연속적으로 수행하거나 동시에 수행한다] ;
    (g) 단계(f)의 생성물에 언급한 각각의 제한부위에 대한 제한효소를 가하여 제한분물중의 절단된 생성물을 수득하는 단계 ; 및
    (h) 특정 서열(들)을 함유하는 단계(g)의 절단된 생성물(들)을 하나 이상의 클로닝 벡터 내로 클로닝되도록 연결시키는 단계를 포함하는, 핵산 또는 핵산의 혼합물내에 함유된 하나 이상의 특정 핵산 서열을 클로닝 벡터내로 클로닝시키는 방법.
  20. (a) 각각의 핵산(여기에서, 핵산(들)은 길이가 같거나 다른 상보적 본쇄 2개로 이루어진다)을 증폭될 각각의 상이한 서열에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서, 각각의 핵산을 변성시키기에 효과적인 온도에서 효과적인 시간 동안 가열하는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각각의 특정 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것으로 선택하여 하나의 프라이머로부터 합성된 연장산물이 이의 상보물로부터 분리될 경우에 다른 프라이머의 연장산물을 합성하기 위한 주형으로서 제공될 수 있도록 하며, 증폭될 각 서열 또는 각 프라이머는 제한부위를 함유한다) ;
    (b) 변성된 핵산을 각각의 프라이머가 이의 상보적 핵산본쇄와 하이브리드화되도록 하는 효과적인 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (c) 변성된 핵산을 단계(a) 또는 (b)와 동시에 또는 단계(a) 또는 (b) 이후에 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 각 핵산의 각 본쇄에 상보적인 프라이머 연장산물을 형성시키는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계 ;
    (d) 단계(c)의 혼합물을, 열안정성 효소의 활성을 증진시키고 증폭될 각각의 상이한 서열에 대한 각각의 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장산물을 합성시키기에 효과적이나, 각각의 연장산물을 이의 상보적인 본쇄주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간 동안 유지시키는 단계 ;
    (e) 단계(d)의 혼합물을, 프라이머 연장산물을 이들이 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성하기에 효과적이나, 효소를 비가역적으로 변성시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 가열하는 단계 ;
    (f) 단계(e)의 혼합물을, 각 프라이머가 단계(e)에서 생성된 그의 상보적인 일본쇄 분자와 하이브리드화 되도록 하기에 효과적인 시간동안, 효과적인 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (g) 단계(f)의 혼합물을 ,효소의 활성을 증진시키고 증폭될 각각의 상이한 서열에 대한 단계(e)에서 생성된 각 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장산물을 합성하기에 효과적이나, 각 연장산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서, 효과적인 시간 동안 유지시키는 단계[이때, 단계(e),(f) 및 (g)는 상기 서열(들)을 함유하는 핵산(들)이 검출 가능하게 증폭되도록 충분한 회수로 반복하며, 단계(f) 및 (g)는 연속적으로 수행하거나 동시에 수행한다] ;
    (h) 단계(g)의 생성물에, 언급한 제한 부위에 대한 각각의 제한 효소를 가하여 제한 분해물중의 절단된 생성물을 수득하는 단계 ; 및
    (i) 특정 서열(들)을 함유하는 단계( h)의 절단될 생성물(들)을 선별 가능한 마아커(marker)를 함유하는 하나 이상의 클로닝 벡터내로 클로닝되도록 연결시키는 단계를 포함하는, 핵산 또는 핵산의 혼합물내의 함유된 하나 이상의 특정 핵산 서열을 클로닝 벡터내로 클로닝시키는 방법.
  21. (a) 각각의 핵산(여기에서, 핵산(들)이 이본쇄일 경우에 길이가 같거나 다른 별도의 상보적인 본쇄 2개로 이루어지며 클로닝전에 정량적으로 증폭된다)을, 각 프라이머가 그의 상보적인 핵산 본쇄와 하이브리드화되도록 하는 온도에서, 증폭될 각각의 상이한 특정 서열에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트와 접촉시키는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각 특정 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것을 선택하여, 하나의 프라이머로부터 합성된 연장산물이 이의 상보물로부터 분리될 경우 다른 프라이머의 연장산물을 합성하기 위한 주형으로서 제공될 수 있도록 한다) ;
    (b) 각 핵산 본쇄를, 단계(a)와 동시에 또는 단계(a) 이후에, 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 각 핵산의 각 본체에 상보적인 프라이머 연장 산물을 형성하도록 하는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계 ;
    (c) 단계(b)의 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 증폭될 각각의 상이한 서열에 대한 각 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장산물을 합성하기에 효과적이나, 각각의 연장 산물을 이의 상보 분쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계 ;
    (d) 단계(c)의 혼합물을, 프라이머 연장 산물을 이들이 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성시키기에 효과적이나, 열안정성 효소를 비가역적으로 변성시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간 동안 가열시키는 단계 ;
    (e) 단계(d)의 혼합물을 각 프라이머가 단계(d)에서 생성된 그의 상보적인 일본쇄 분자와 하이브리드화 되도록 하기에 효과적인 시간동안 효과적인 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (f) 단계(e)의 혼합물을 효소의 활성을 증진시키고 증폭될 각각의 상이한 서열에 대한 단계(d)에서 생성된 각 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장산물을 합성 하기에 효과적이나, 각각의 연장산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간 동안 유지시키는 단계[이때, 단계(d),(e) 및 (f)는 하나 이상의 클로닝 벡터내로 평활말단 연결시키기 위한 서열(들)을 함유하는 핵산(들)이 효과적으로 증폭되도록 충분한 회수로 반복하고, 단계(e) 및 (f)는 연속적으로 수행하거나 동시에 수행한다 ] ;
    (g) 단계(f)로부터 수득된 클로닝될 증폭된 특정 서열(들)을 리가제의 존재하에 하나 이상의 언급된 클로닝 벡터내로(여기에서, 언급한 증폭될 서열(들) 및 벡터(들)는 연결되기에 충분항 양으로 존재한다)연결시키는 단계를 포함하는, 핵산 또는 핵산의 혼합물내에 함유된 하나 이상의 특정 핵선 서열을 클로닝 벡터내로 클로닝시키는 방법.
  22. (a) 각각의 핵산(여기에서, 핵산(들)은 길이가 같거나 다른 2개의 상보적 본쇄로 이루어지며, 클로닝전에 정량적으로 증폭된다)을, 증폭될 각각의 상이한 서열에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서 각각의 핵산을 변성시키기에 효과적인 온도에서 효과적인 시간 동안 가열하는 단계(여기에서, 각각의 프라이머는 각각의 특정 서열의 상이한 본쇄에 실질적으로 상보적인 것으로 선택하여 하나의 프라이머로부터 합성된 연장산물이 이의 상보물로부터 분리될 경우에 다른 프라이머의 연장산물을 합성하기 위한 주형으로서 제공될 수 있도록 한다) ;
    (b) 변성된 핵산을 각각의 프라이머가 이의 상보적인 핵산 본쇄와 하이브리드화되도록 하는 온도로 냉각 시키는 단계 ;
    (c) 변성된 핵산을 단계(a) 또는 (b)와 동시에 또는 단계(a) 또는 (b) 이후에 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉매하여 각 핵산의 각 본쇄에 상보적인 프라이머 연장 산물을 형성시키는 열안정성 효소와 접촉시키는 단계,
    (d) 단계(c)의 혼합물을 열안정성 효소의 활성을 증진시키고 증폭될 각각의 상이한 서열에 대한 각각의 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장산물을 합성시키기에 효과적이나, 각각의 연장산물을 이의 상보적인 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 유지시키는 단계 ;
    (e) 단계(d)의 혼합물을, 프라이머 연장산물을 이들이 합성되는 주형으로부터 분리시켜 일본쇄 분자를 생성하기에 효과적이나, 효소를 비가역적으로 변성시킬 만큼 높지는 않은 온도에서 효과적인 시간동안 가열하는 단계 ;
    (f) 단계(e)의 혼합물을 프라이머가 단계(e)에서 생성된 그의 상보적인 일본쇄 분자와 하이브리드화되도록 하기에 효과적인 시간동안 효과적인 온도로 냉각시키는 단계 ;
    (g) 단계(f)의 혼합물을, 효소의 활성을 증진시키고 증폭될 각각의 상이한 서열에 대한 단계(e)에서 생성된 각 핵산 본쇄 주형에 상보적인 각 프라이머의 연장 산물을 합성하기에 효과적이나, 각 연장산물을 이의 상보 본쇄 주형으로부터 분리시킬 만큼 높지는 않은 온도에서, 효과적인 시간동안 유지시키는 단계[이때, 단계(e),(f) 및 (g)는 하나 이상의 클로닝 벡터내로 평활 말단 연결시키기 위한 각 서열을 함유하는 핵산(들)이 효과적으로 증폭되도록 충분한 회수로 반복하여 단계(f) 및 (g)는 동시적으로 수행하거나 연속적으로 수행한다] ;
    (h) 단계(g)로부터 수득된 클로닝될 증폭된 특정 서열(들)을 리가제의 존재하에, 하나 이상의 언급된 클로닝 벡터내로(여기에서, 언급한 증폭된 서열(들) 및 벡터(들)는 연결되기에 충분한 양으로 존재한다) 연결시키는 단계를 포함하는, 핵산 또는 핵산의 혼합물내에 함유된 하나 이상의 특정 서열을 클로닝 벡터내로 클로닝시키는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 써머스 아쿠아티쿠스 YT1(ATCC 25, 104)로부터 유도된 효소.
  24. 제1항에 있어서, 열안정성 데옥시리보뉴클레아제 오염물이 최고한도로 존재하는 효소.
  25. 제1항에 있어서, 마그네슘 염 약 1.5 내지 2mM, 각각의 뉴클레오티드 150 내지 200μM 및 각각의 프라이머 1μM을 포함하는 증폭 완충액 중에서 0.5분 동안 약 95℃의 온도에서도 비가역적으로 변성되지 않는 폴리머라제 효소.
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 매질로부터 세포를 회수하고 이 세포를 융해시키는 단계 ;
    (b) 암모늄 설페이트로 침전시켜 단백질 분획을 수거하는 단계 ;
    (c) 이와 같이 회수된 분획을, DEAE-셀룰로즈 칼럼을 사용하여 크로마토그래피하여 단백질 함유 분획을 수거하는 단계 ;
    (d) 수거된 분획을 하이드록시아파타이트 칼럼에 적용시키고 DNA 폴리머라제 활성을 지닌 용출된 분획을 합하는 단계 ;
    (e) 이로써 합한 분획을, 제2의 완충액으로 평형시킨 제2의 DEAE-셀룰로즈 칼럼을 사용하여 크로마토그래피한 다음, 뉴클레아제 오염물이 최소로 존재하는 DNA 폴리머라제 분획을 모으는 단계 ; 및
    (f) 이와 같이 모은 분획을, 포스포셀룰로즈 칼럼을 사용하여 크로마토그래피시키고 KCI 구배로 용출시킨 다음,
    엔도/엑소-뉴클레아제 오염 여부 및 폴리머라제 활성 여부에 대해 알아보기 위해 상기 분획을 분석하여 폴리머라제 활성을 지닌 분획을 모으는 단계들을 포함하는 방법에 의해, 써머스 아쿠아티쿠스로부터 수득될 수 있는 효소.
  27. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 매질로부터 세포를 회수하고 이 세포를 융해시키는 단계 ;
    (b) DNA 폴리머라제 활성을 폴리민 P(Polymin P)로 침전시킨 다음, 상기 침전물로부터 DNA 폴리머라제 활성을 용출시키고 후속 원심분리의 상층액을 수거하는 단계 ;
    (c) 암모늄 설페이트로 침전시켜 단백질 분획을 수거하는 단계 ;
    (d) 이와같이 회수된 단백질 분획을, 포스포셀룰로즈 칼럼을 사용하여 크로마토그래피하고 KCI 구배로 용출시킨 다음, DNA 폴리머라제 활성을 갖는 분획을 모으는 단계 ;
    (e) 이로써 모은 분획을 헤파린 세파로즈 CL-6B 칼럼에 적용하고 KCl 구배로 용출시킨 다음, 가장 높은 폴리머라제 활성을 지니고 최소의 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 분획을 모으는 단계 ;
    (f) 이와 같이 모은 분획을 하이드록시아파타이트 칼럼에 적용한 다음, DNA 폴리머라제 활성을 지니지만, 상당한 양의 엔도뉴클레아제 또는 이본쇄 엑소뉴클레아제 오염물을 갖지 않는 분획을 합하는 단계 ;
    (g) 이러한 합산 분획을, DEAE-트리스-아크릴-M 칼럼을 사용하여 크로마토그래피시킨 다음, DNA 폴리머라제 함유 분획을 모으는 단계 ; 및
    (h) 이로써 모은 분획을 CM-트리스-아크릴 M 칼럼을 사용하여 크로마토그래피하고 NaCl 구배로 용출시킨 다음, 탐지할만한 어떠한 뉴클레아제도 갖지 않는 DNA 폴리머라제 분획을 모으는 단계들을 포함하는 방법에 의해, 써머스 아쿠아티쿠스로부터 재조합적으로 제조된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 함유하는 배양물로부터 수득될 수 있는 효소.
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