JPH03180181A - 熱安定性核酸ポリメラーゼ組成物 - Google Patents

熱安定性核酸ポリメラーゼ組成物

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JPH03180181A JP2326114A JP32611490A JPH03180181A JP H03180181 A JPH03180181 A JP H03180181A JP 2326114 A JP2326114 A JP 2326114A JP 32611490 A JP32611490 A JP 32611490A JP H03180181 A JPH03180181 A JP H03180181A
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、熱安定性核酸ポリメラーゼを含有する安定性
酵素組成物に関する。
本発明の核酸ポリメラーゼ組成物は、温度循環ＤＮＡポ
リメラーゼ連鎖反応によって既存の特定の核酸配列から
多量の核酸配列を複製するために特に有用である。
〔従来の技術〕
Ｅ、コ’Ｊ　　（Ｂ、ｃｏｌｉ）のような中温微生物か
らのＩ）ＮＡポリメラーゼの単離について、広範な研究
が行われてきた。例えば、ベスマン（Ｂｅｓｓｍａｎ）
ら、Ｊ、Ｒｉｏｔ、Ｃｈｅｍ、　　（１９５７年）　、
２３３巻、１７１〜１７７頁およびブチン（Ｂｕｔｔｉ
ｎ）とコルンベルグ（ＫＯｒｎ−ｂｅｒｇ）　Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　（１９６６年）、２４１巻、５４
１９〜５４２７頁を参照されたい。
これとは対照的に、テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ　　凹懸旦ｃｕｓ）のような好熱菌からのＤＮＡ
ポリメラーゼの単離と精製については、余り研究が行な
われていない。カレジン（Ｋａｌｅｄｉｎ）　　ら、影
匹泣虹ｙａ、　　（１９８０年〉４５巻、６４４〜６５
１頁は、テルムス・アクアチフス（Ｔ、ａｑｕａｔｉｃ
ｕｓ）　　ＹＴＩ株の細胞からのＤＮＡポリメラーゼの
６段階単離および精製法を開示している。これらの工程
は、粗製抽出物の単離、ＤＢＡＢ−セルロース・クロマ
トグラフィー、ヒドロキシアパタイト上での分別、Ｄ８
ＡＥ−セルロース上での分別および単一Ｉｌｌ　Ｄ　Ｎ
　Ａ−セルロース上でのクロマトグラフィーから戊って
いる。それぞれの段階からのプールは、エンド−および
エクソヌクレアーゼの混入についてはスクリーニングさ
れていない。精製された酵素の分子量は、モノマー単位
当たり６２．０００ダルトンと報告されている。
テルムス・アクアチフス（Ｔ、　　ａｑｕａｔｉｃｕｓ
）からのポリメラーゼについての第二の精製法は、エイ
・チェノ（Ａ、　Ｃｈ　１ｅｎ）　　ら、Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、　　（１９７６年）、１２７巻、１５５０
〜１５５７頁によって記載されている。
この方法では、粗製の抽出物をＤＢＡＢ−セファデック
スカラムにかける。透析下プール分画を次に、ホスホセ
ルロースカラム上での処理に付す。このプールした分画
を透析して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えてポ
リメラーゼの活性の損失を防止ゲル濾過によって分析す
ると分子量は約６３．０００ダルトンであり、スクロー
ス遠心分離によれば約６８、０００ダルトンである。
しかしながら、これらの酵素は作用ｐＨ範囲、貯蔵安定
性等に問題があり、温度循環連鎖反応による核酸の多量
複製・増幅のために用いることはできなかった。
〔発明が解決しようとする課題〕
メラーゼを含んで成る安定性の高い新規な酵素組成物を
提供するものである。
〔課題を解決するための手段〕
前記の課題は、核酸の鋳型鎮に相補的な核酸鎖を形成す
るためヌクレオチドトリホスフェートの結合を触媒する
熱安定性核酸ポリメラーゼ、及び一種又は複数種類の非
イオン性界面活性剤を含有−ゼは非イオン性洗剤を含有
する緩衝液中に保存した場合長時間に亙って活性を失わ
ずに安定である。
〔具体的な説明〕
本明細書において用いる用語は次の意味を有する。
「細胞」、「細胞系（セルライン）」および「細胞培養
物」は相互交換可能に用いることができ、これらの名称
は総て子孫を包含する。したがって、「形質転換体」ま
たは「形質転換された細胞」とは、−次細胞およびトラ
ンスファーの回数とは関係なしにその細胞に由来する培
養物を包含する。また、総ての子孫は、人為的または偶
然的突然変異によりＤＮＡ含量が正確には同一ではない
ことがあることも理解される。最初に形質転換された細
胞においてスクリーニングしたのと同じ機能を有する変
異体子孫も包含される。
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における作
用可能に連結されたコード配列の発現に必要なりＮＡ配
列を指す。原核生物に好適な制御配列は、例えばプロモ
ーター、任意にはオペレーター配列、リボゾーム結合部
位であるが、さらにその他の余り理解されていない配列
も包含することが可能である。真核細胞は、プロモータ
ー、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサ−を利用
することが知られている。
「発現系」という用語は、作用可能に連結された所望の
コード配列および制御配列を含むＤＮＡ配列を指し、こ
れらの配列で形質転換された宿主はコードされた蛋白質
を産生ずることができる。
形質転換を行うために、発現系をベクターに含有させて
もよいが、これに続き関連のＤＮＡが宿主染色体に組み
込まれてもよい。
本明細書で用いられる「遺伝子」という用語は、生物活
性を有するポリペプチドまたはその前駆体をコード化す
るＤＮＡ配列を指す。このポリペプチドは、完全な長さ
の遺伝子配列によりまたは酵素活性が保持されているか
ぎりコード配列のいずれかの部分によってコードされて
いてもよい。
「作用可能に連結した」という用語は、成分の正常な機
能を行うことができる併置を指す。例えば、制御配列に
「作用可能に連結した」コード配列は、このコード配列
が制御配列の制御下で発現スことができる配置を指す。
「非イオン性のポリマー性洗剤」とは、イオン性電荷を
持たず、本発明の目的には、約３．５〜約９．５のｐＨ
範囲、好ましくは４〜８．５のｐＨ範囲で酵素を安定化
することができることを特徴とする界面活性剤を指す。
本明細書に用いられる「オリゴヌクレオチド」という用
語は、２個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはりボ
ヌクレオチド、好ましくは３個以上のものからなる分子
として定義される。その正確な大きさは多くのファクタ
ーによって異り、これらのファクターはオリゴヌクレオ
チドの最終的な機能または用途によって異る。オリゴヌ
クレオチドは、合成的にまたはクローニングによって調
製することができる。
本明細書に用いられる「制限エンドヌクレアーゼ」およ
び「制限酵素」という用語は、細菌酵素であって、それ
ぞれが特異的ヌクレオチド配列のまたはその付近の二重
鎖ＤＮＡを切断するものを指す。
本明細書に−用いられる「ヌクレオチド配列の変化」と
いう用語は、ある種の単一または複数のヌクレオチド置
換、欠失または挿入を指す。
本明細書に用いられる熱安定酵素は、如何なる由来から
得ることもでき、天然または組換え蛋白質であってもよ
い。耐熱性を有するものとして文献に報告されている酵
素の例は、熱に安定なポリテルモフィルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）（
他の文献に報告されているものよりも幾分低い最適温度
を有する）、テルムス・アクアチフス抽出されたポリメ
ラーゼである。
本明細書に用いられる好ましい熱安定酵素は、由来する
ＤＮＡポリメラーゼである。その各種の株も、アメリカ
ン・タイプ・カルチャ・コレクシＢ　ン（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ）　ｏ　ｔクビル、メリーランド、から入手すること
ができ、ティ・デイ・ブＯ−）り（Ｔ、　Ｄ、　Ｂｒｏ
ｃｋ）　、Ｊ、　Ｂａｃｔ。
（１９６９年〉、９８巻、２８９〜２９７頁、およびテ
ィ・オシ？　（Ｔ、Ｏｓｈｉｍａ）、Ａｒｃｈ、Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、、　　（１９７８年）、１１７巻、１８
９〜１９６頁に記載されている。これらの好ましい菌株
の一つは、ＹＴ−１株である。
本発明において使用する好ましいＤＮＡポリメラーゼは
次の性質を有する。
（１）作用 本酵素は、鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオ
チド又はポリヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基にデ
オキシリボヌクレオシド５′−トリホスフェートのα−
ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシ
リボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５′−モノホスフ
ェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する。
〈２〉基質特異性 本酵素はその十分な活性のために部分的に二本鎖を形成
したＤＮＡ鋳型及び４種類のデオキシリボヌクレオシド
５′−トリホスフェートを必要とする。ここで部分的に
二本鎖を形成したＤＮＡ鋳型とは、例えば単鎖鋳型ＤＮ
Ａ分子に遊離の３′−ヒドロキシル基を有するオリゴヌ
クレオチドプライマーがアニールしている状態を意味す
る。単＃、ＩＩ　Ｄ　Ｎ　Ａに対しても低い活性を示す
可能性がある。
（３〉最適Ｈ及び安定ｐＨ範囲 最適ｐＨ範囲は、７０℃〜７５℃の温度においてｐＨ８
，０〜８．５である。但し、ｐＨ７，０においても有意
な活性を有する。本酵素は少なくともｐＨ５，０〜ｐＨ
９，４の範囲で比較的安定である。
（４〉作用温度範囲 室温〜８５℃の範囲で活性であり、最適温度は約７５℃
である。３５℃における活性は７５℃における活性の約
１％である。
（５）不活性化 本酵素は ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ＢＤＴ
Ａ、ホルムアミド、ＳＤＳ、高濃度の尿素、等により阻
害される。
（７〉分子量 本発明の分子量を、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により、分子量標準としてホスホリラーゼＢ（分
子量９２．０００）　、ウシ血清アルブミン（分子量６
６．２００）　、オバルブミン（分子量４５．０００）
　、カーボニックアンヒドラーゼ（分子量３１．０００
）　、大豆トリプシンインヒビター（分子量２１、５０
０）及びリゾチーム（分子量１４．０００）を用いて決
定した場合、約８６．０００〜９０．０００ダルトンで
あった。しかし最近の報告によればホスホリラーゼＢの
分子量は約９７．３００ダルトンであるとされており、
この分子量に基けば本発明の酵素の分子量は約９４．０
００ダルトンとされる。
なお、酵素の活性測定法及び力価の定義は参考例４に記
載し、本酵素の精製方法の具体例を参考例１及び４に記
載する。また、本発明の組成物の製造方法を実施例１及
び２に記載する。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、該酵素を生産する能力
を有するテルムス・アクアチフスを、例えば７０℃にお
いて培養し、この培養物から採取することができる。例
えば、細胞を２０時間増殖させた後、遠心分離によって
回収する。
細胞の増殖の後、酵素の単離および生成を６段階で行い
、それぞれの段階は室温より低い温度、好ましくは約４
℃で行う。
第一の段階または工程では、細胞が、凍結している場合
には、解凍し、超音波で破砕し、ｐＨが約７．５の緩衝
液に懸濁する。
第二の段階では上澄液を集めて、次いで乾燥硫酸アンモ
ニウムのような塩を加えることによって分別する。適当
な両分（典型的には、４５〜７５％飽和）を集めて、０
．２リン酸カリウム緩衝液、好ましくはｐＨ６，５の緩
衝液に溶解して、同じ緩衝液に対して透析する。
′第三の段階では、核酸及びある種の蛋白質を取り除く
。第二の段階からの両分を、上記と同じ緩衝液で平衡化
したＤＥＡＲ−セルロースカラムにかける。次いで、こ
のカラムを同じ緩衝液で洗浄し、蛋白質含有画分を溶出
し、２８０ｎｆｆｌでの吸収によって測定し、集めて、
１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液に対して、好ましくは
第一の緩衝液でｐＨを７，５にしたものと同じ成分を有
するもので透析する。
第四の段階では、上記のようにして集めた分画を、第三
の段階で透析に用いた緩衝液で平衡にしたヒドロキシア
パタイトカラムにかける。次いで、このカラムを洗浄し
、１０ｍＭの２−メルカプトエタノールと５％のグリセ
リンを含むｐＨ７，５の０．０１Ｍ〜０．５Ｍリン酸カ
リウム緩衝液の直線グラジェントで酵素を溶出する。プ
ールした熱安定酵素ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む画分
を、第三の段階で透析に使用したのと同じ緩衝液で透析
する。
第五の段階では、透析した両分を、第三の段階で透析に
使用した緩衝液で平衡化したＤＥＡＲ−セルロースカラ
ムにかける。このカラムを次に洗浄し、第三の段階で透
析に使用した緩衝液中で０．Ｏ１〜０．６ＭのＫＣｌの
ような緩衝液の直線グラジェントで、酵素を溶出する。
熱安定酵素の活性を有する両分を、適当を方法を用いて
デオキシリボヌクレアーゼ（エンド−およびエキソヌク
レアーゼ）の混入について試験する。例えば、エンドヌ
クレアーゼ活性は、過剰のＤＮＡポリメラーゼと共にイ
ンキュベートした後ファージλＤＮＡまたはスーパーコ
イルプラスミドＤＮＡの分子量の変化から、電気泳動に
よって測定することができる。同様に、エキソヌクレア
ーゼ活性は、数個の部位で開裂する制限酵素を用いて処
理した後、ＤＮＡの分子量の変化から電気泳動によって
測定することができる。
デオキシリボヌクレアーゼ活性を持たないと決定された
両分をプールして、第三の段階で用いたのと同じ緩衝液
で透析する。
第六の段階では、プールした両分を、一定のベツドボリ
ウムを有するホスホセルロースカラムに入れる。このカ
ラムを洗浄して、ｐＨ７，５でリン酸カリウム緩衝液中
０．０１〜０．４ＭのＫＣｌ１のような緩衝液の直線グ
ラジェントで酵素を溶出する。熱安定なポリメラーゼ活
性を有し、デオキシリボヌクレアーゼ活性を有しないプ
ールした両分を、ｐＨ８，０の緩衝液で透析する。
透析した生成物の分子量は、蛋白質分子量マーカーを用
いてＳＯＳ　ＰＡＧＨによる方法等によって決定するこ
とができる。好ましい酵素の一つであるテルムス・アク
アチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）か
ら精製されたＤＮＡポリメラーゼの分子量は、前記方法
によって、分子量標準ホスホリラーゼＢの分子量を９２
．０００ダルトンとした場合、約８６．０００〜９０、
０００ダルトンと決定される。
本発明の熱安定酵素は、この酵素をコードする遺伝子を
テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ａｑｕ−
ａｔｉｃｕｓ）ゲノムＤＮＡからクローン化し、組換え
ＤＮＡ技術によって製造することもできる。テルムス・
アクアチフス（Ｔａｑ）　　ポリメラーゼの完全なコー
ド配列は、約１８ｋｂ　（キロベース°）のゲノムＤＮ
Ａインサートフラグメント内に含まれる約３．５ｋｂの
Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ａｓｐ７１８　（部分）制限フラグメ
ントを含むバクテリオファージＣＨ３５：Ｔａｑ　＃　
４−２から誘導することができる。このバクチリオファ
。
−ジは、１９８７年５月２９日にアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、寄
託番号第４０．３３６号を有する。また、この遺伝子は
、プラスミドｐｐｃｇａ　（ＡＴＣＣ第６７、４２２号
、１９８７年５月２９日寄託〉から単離された約７５０
塩基対（ｂｐ）のＢｇｌ　ｌｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩ制限フ
ラグメントを、プラスミドｐＦＣ８５（ＡＴＣＣ第６７
、４２１号、１９８７年５月２９日寄託）から単離され
た約２．８ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−Ａｓｐ７１８制限
フラグメントに連結することによって造成することがで
きる。
ｐＦｃ８５制限フラグメントはＴａｑポリメラーゼ遺伝
子のアミノ末端をコードする部分を有するが、ｐＦＣ８
５からの制限フラグメントはカルボキシ−末端をコード
する部分を有する。したがって、これらの２個のフラグ
メントを、適当な制御配列を有する対応して消化された
ベクターと連結すると、全長Ｔａｑポリメラーゼの翻訳
が得られる。
所望の酵素活性を有する生物学的に活性な遺伝子生成物
を得るためにはＴａｑポリメラーゼ遺伝子の全コード配
列は必要でないことも見出された。
アミノ末端コード部分が欠失しており、コード配列の約
３分の１が不在であるＤＮＡが、ポリメラーゼ分析にお
いて完全に活性な遺伝子生成物を産生じた。
Ｎ−末端の欠失に加えて、Ｔａｑポリメラーゼを構成す
るペプチド鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、
またはその他の誘導体化によって改変されていてもよく
、また蛋白質を開裂して活性を保持するフラグメントを
得ることもできる。活性を破壊しないかかる変更は、遺
伝子の定義からこのような蛋白質をコードするＤＮＡ配
列を除外しない。
したがって、翻訳の間に配列に組み込まれるアミノ酸の
欠失、付加または変更による一次構造自体の改変は、蛋
白質の活性を破壊することなく行うことができる。かか
る置換またはその他の変更は、本発明の範囲に属するＤ
ＮＡによってコードされたアミノ酸配列を有する蛋白質
をもたらす。
本発明の精製されたポリメラーゼで免疫したウサギから
のポリクローナル抗血清を用いて、テルムス・アクアチ
フス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ヨ匹旦思紅の部分ゲノム発現
ライブラリーをプローブして、下記のようにして適当な
コード配列を得た。クローン化されたゲノム配列は融合
ポリペプチドとして発現させたり、それ自体の制御配列
を用いて直接に発現させたり、または酵素の発現に用い
られる特定の宿主に好適な制御配列を用いる構成によっ
て発現させることができる。
勿論、これらの配列をコードするＤＮＡの入手可能性は
、コドン配列を改変してＤＮＡポリメラーゼ活性をも有
するムティン（ｍｕｔｅｉｎ）形を得る機会を提供する
。
例えば、これらの手段は、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ
のための完全なコード軛列を提供して、このコード配列
から、各種の宿主系に適用できる発現ベクターを構成し
、そしてコード配列を発現せしめることができる。さら
に、以上のことから、Ｔａｑポリメラーゼコード配列の
部分はプローブとして有用であり、色々な種のその他の
熱安定ポリメラーゼコード配列を回収するためのプロー
ブとして有用であることも明らかである。したがって、
少なくとも６個のアミノ酸をコードするゲノムＤＮＡの
部分をＥ、　コリ　（Ｂ、ｃｏｌｉ）において複製しそ
してこれを変性してプローブとして使用し、あるいは少
なくとも６個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチ
ドを合或し、これらを用いて熱安定性ポリメラーゼをコ
ードする他のＤＮＡを検索することができる。テルムス
・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ）におけるヌクレアーゼ配列とその他の種類の対応す
る部分の配列は正確には一致しないことがあるので、間
違った陽性を排除するのに十分なストリンジエンシー条
件下でハイブリダイゼーションを行うために６個のアミ
ノ酸ストレットをコードする約１８個のヌクレオチドを
有するオリゴマーが必要であろう。６個のアミノをコー
ドする配列は、かかるプローブのために十分な情報を供
給するであろう。
好適な宿主、制御系および方法 一般的に、組換え形のＴａｑポリメラーゼの製造は、以
下のような工程を含む。
第一に、成熟酵素（この場合、総てのムティンを含む意
味に用いられる〉、あるいはＴａｑポリメラーゼとその
活性を破壊しない追加の配列との融合体、または制御さ
れた条件下で（例えば、ペプチダーゼによる処理による
〉開裂して活性蛋白質をもたらすことができる追加の配
列との融合体、をコード化するＤＮＡを得る。配列がイ
ントロンによって中断されていないときには、それは如
何なる宿主における発現にも好適である。この配列は、
切り出し可能で且つ回収可能な形であるべきである。
次に、好ましくは、切り出されたまたは回収されたコー
ド配列を、複製可能な発現ベクター中の好適な制御配列
と作用可能に連結する。このベクターを用いて、好適な
宿主を形質転換し、形質転換された宿主を好ましい条件
下で培養して、組換えＴａｑポリメラーゼを産生させる
。場合によっては、Ｔａｑポリメラーゼを培養液または
細胞から単離するが、ある種の不純物が許容される場合
には、蛋白質の回収および精製は必要でないこともある
。
上記の段階のそれぞれは、各種の方法で行うことができ
る。例えば、所望のコード配列をゲノムフラグメントか
ら得て、適当な宿主に直接用いることもできる。各種の
宿主で作用可能な発現ベクターの造成は、以下のような
適当なレプリコンを用いて行なわれる。好適な制限部位
が通常は利用可能でない場合には、これをコード配列の
末端に加えて切り出し可能な遺伝子を得、これらのベク
ターに挿入することができる。
制御配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子を
発現するのに用いられる宿主細胞の型によって異る。一
般的には、原核細胞、酵母、昆虫または哺乳類細胞が宿
主として現在有用である。
原核宿主は、一般的には組換え蛋白質の産生にとって最
も有効で好都合であり、それ故Ｔａｑポリメラーゼの発
現にとって好ましい。
Ｔａｑポリメラーゼの特定の場合には、組換え条件下お
よび自然条件下のいずれにおいても、蛋白質のＮ−末端
でかなり欠失が起こり、そして蛋白質の活性はなお保持
されたままであることを示す証拠が存在する。単離され
た天然蛋白質は、蛋白質分解による分解の結果であり、
不完全な遺伝子の翻訳の結果ではない。しかしながら、
プラスミドｐＦＣ８５の不完全な遺伝子から産生された
ムティンは、ＤＮＡポリメラーゼの分析で完全な長さを
有する配列をコードするＤＮＡから産生されたムティン
と同様に、完全に活性である。ある種のＮ末端が短縮さ
れた形は活性であることが明らかであるので、用いられ
る遺伝子構成物またはポリメラーゼの発現も、対応する
短縮された形状のコード配列を含むことができる。
制御配列および対応する宿主 原核生物は、最も一般的には、Ｅ、コリ（Ｂ。
ｃｏｌｉ）の各種株によって代表される。しかしながう
、ハシルス属、例えばバシルス・ズブチリスｄｏｍｏｎ
ａｓ）またはその他の菌株のような他の微生物株を用い
ることもできる。かかる原核系では、宿主と適合性の種
に由来する複製部位と制御配列を有するプラスミドベク
タ、−が用いられる。例えば、Ｅ、：ＩＩＪ　（Ｅ、　
　ｃｏｌｉ）は、典型的には、ポリバー（Ｂｏｌｉｖａ
ｒ）　　ら、Ｇｅｎｅ、　１９７７年、２巻、９５頁に
よるＥ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）種に由来するプラスミ
ドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される
。
ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐
性の遺伝子を有し、所望のベクターを造成する際に保持
されまたは破壊される付加的マーカーを提供する。転写
開始を促進し、任意にはオペレーターを有し且つリボゾ
ーム結合部位配列を有する本明細書記載の一般的に用い
られる原核制御配列には、β−ラクタマーゼ（ペプチダ
−ゼ）およびラクトース（ｌａｃ）　プロモーター系〔
チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７７年
〉１９８巻、１０５６頁〕、トリプト７　ｙ　：／　（
ｔｒｐ）プロモーター系〔ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８０
年）８巻、４０５７頁〕、およびλ由来のＰ、プロモー
ター〔シマタケ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ）　　ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ　（１９８１年〉２９２巻、１２８頁〕およびポ
ータプル制御カセットとして有用なＮ−遺伝子リボゾー
ム結合部位があり、このポータプル制御カセットは、Ｎ
ＩＩＩＩｓ配列の６　ｂｐ　３　’内での開裂を可能に
する少なくとも１個の制限部位を有する第三のＤＮＡ配
列のＮＲＢＳ上流に対応する第二のＤＮＡ配列に操作可
能に連結したＰＬプロモーターである第−ＤＮＡ配列を
含んで成る。チャン（Ｃｈａｎｇ）　　らの欧州特許出
願公開第１９６．８６４号明細書（１９８６年１０月８
日発行）に記載され、同じ承継穴に承継されたホスファ
ターゼＡ　（ｐｈｏＡ）系も有用である。しかしながら
、原核生物に適合性の如何なる利用可能なプロモーター
も用いることができる。
細菌に加えて、酵母のような真核微生物も宿主として用
いることができる。サツカロミセス・セレビシアｚ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍ　ＣｅＳ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
実験室菌株であるパン酵母が最も多く用いられるが、そ
の他の多くの菌株も一般的に利用可能である。２ミクロ
ン複製開始メ蝙いるベクターが示されているが〔ブロー
チ、ジェイ、アール（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ１）。
Ｍｅｔｈ、　Ｂｎｚ、　（１９８３年）１０１巻、３０
７頁〕、酵母の発現に好適な他のプラスミドベクターも
知られている〔例えば、スチンクコンブ（Ｓｔｉｎｃｈ
ｃｏｍｂ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９年〉２８２巻
、３９頁、チェンバ（Ｔｓｃｈｅｍｐｅ）ら、Ｇｅｎｅ
　（１９８０年）１０巻、１５７頁およびクラーク（Ｃ
１ａｒｋｅ）ら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　（１９８３年
）１０１巻、３００頁を参照されたい〕。酵母ベクター
のための制御配列には解糖系酵素の台底のプロモーター
、も含まれる〔ヘス（ルｅＳＳ）ら、Ｊ、　Ａｄｖ、Ｅ
ｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、　（１９６８年）７巻、１４９頁
、ホランド（、Ｈｏ１ｌａｎｄ）　　ら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏ−封釘（１９７８年）１７巻、４９００頁〕。
その他の当業界に知られているプロモーターには、３−
ホスフォグリセレート・キナーゼ（ヒラ’７　ｇ　？ン
（）１ｉｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
（１９８０年）２５５巻、２０７３頁〉およびその他の
解糖系酵素、例えばグリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート
・デカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グル
コース−６−ホスフェート・イソメラーゼ、３−ホスホ
グリセレート・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、トリ
オースホスフェート・イソメラーゼ、ホスホグルコース
イソメラーゼおよびグルコキナーゼの遺伝子のプロモー
ターがある。増殖条件により制御される追加の利点を有
するその他のプロモーターは、アルコールデヒドロケナ
ーゼ２、イソチトクロームＣ１酸性ホスフアターゼ、窒
素代謝に関係する分解酵素およびマルトースおよびガラ
クトース利用に関する酵素のプロモーターである〔ホラ
ンド（Ｈｏｌｌａｎｄ）同上〕。
ターミネータ−配列は、コード配列の３′末端において
望ましいであろう。かかるターミネータ−は、酵母由来
の遺伝子におけるコード配列に続く３′非翻訳領域に見
出される。例示されるベクターの多くは、エノラーゼ遺
伝子を含有するプラスミドｐｅｎｏ４６　（ホランド（
Ｈｏｌｌａｎｄ、　　Ｍ、Ｊ、）　　ら、Ｊ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　（１９８１年）２５６巻、１
３８５頁〕から、またはＹＢｐ１３から得られるＬＢｔ
１２遺伝子〔ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、）ら、Ｇ
ｅｎｅ　（１９７８年）８巻、１２１頁〕から誘導され
る制御配列を有するが、酵母適合性プロモーター、複製
開始点および他の制御配列を有する如何なるベクターも
好適である。
勿論、多細胞生物に由来する真核宿主細胞培養物におい
てポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることも
可能である。例えば、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１−ｔｕｒｅ
、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ）、タル”７　（Ｃｒｕｚ）とパターソン（Ｐａｔｔ
ｅｒｓｏｎ）監修（１９７３年）を参照されたい。有用
な宿主細胞系には、ネズミミエロー７Ｎ５１．　ＶＢＲ
ＯおよびＨｅ１ａ細胞、並びにチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞がある。
これらの細胞のための発現ベクターは、通常は、シミア
ンウィルス４０（ＳＶ４０）からの−船釣に用いられる
前期および後期プロモーター（フィールス（Ｆｉｅｒｓ
）　　ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８年）２７３巻、１
１３頁〉　、またはポリオーマ、アデノウィルス２、ウ
シパピローマウィルスモジ＜はトリザルコーマウィルス
に由来するようなプロモーター、または免疫グロブリン
プロモーターおよびヒートショックプロモーターのよう
な哺乳類細胞に適合性のプロモーターおよび制御配列を
有する。ＢＰＶをベクターとして用いる哺乳類系におけ
るＤＮＡ発現系は、米国特許第４．４１９．４４６号明
細書に開示されている。
この系の変形は、米国特許第４．６０１．９７８号明細
書に記載されている。哺乳類細胞系の形質転換の一般的
態様は、米国特許第４．３９９．２１６号明細書に記載
されている。「エンハンサ−」領域が、最適な発現にお
いて重要であると思われるが、これらの領域は一般的に
はプロモーター領域の上流に見出される配列である。所
望であるならば、複製開始点をウィルス源から得ること
ができる。しかしながら、真核生物でのＤＮＡ複製では
染色体への組み込みが一般的な機構である。
植物細胞も宿主として利用可能であり、植物細胞に適合
する制御配列、例えばツバリン・シンターゼ・プロモー
ターおよびポリアデニル化シグナル配列〔デビッカ−（
Ｄｅｐｉｃｋｅｒ、＾、）ら、Ｊ、　Ｍｏｌ。
９旦」□、　（１９８２年）１巻、５６１頁〕が利用で
きる。
更に、最近では、バクロウィルス・ベクターによって提
供される制御系を利用する昆虫細胞を用いた発現系も報
告されている〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｄ。
Ｗ、）　　ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｂｎ　ｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ　（１９８６年）、セトロウ（Ｓｅｔｌｏｗ、　Ｊ、
に、）ら監修、プレナム・パブリッシング（Ｐｌｅｎｕ
ｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、８巻、２７７〜２９７頁
〕。
これらの系はＴ、ａ　ｑポリメラーゼの産生にも有用で
ある。
形質転換 用いる宿主細胞に依存して、形質転換はその細胞に適当
な標準的な技術を用いて行なわれる。塩化カルシウムを
用いるカルシウム処理〔コーヘン（Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、
Ｎ、　）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　（ＵＳＡ）　（１９７２年〉６９巻、２１１０
頁〕が、原核生物またはその他の実質的な細胞障壁を有
する細胞に用いられる。アグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンス（Ｍ二垣ｚｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ）での感染〔シア９（Ｓｈａｗ、　Ｃ８Ｈ，）　
　ら、Ｇｅｎｅ　（１９８３年）２３巻、３１５頁〕が
、ある種の植物細胞で用いられる。前記のような細胞壁
を持たない哺乳類細胞では、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）
とヴアン・７’）し・ニブ（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｂ）の
リン酸カルシウム沈澱法が好ましい（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
　（１９７８年）５２巻、５４６頁〕。酵母への形質転
換は、ヴアン・プリンゲン（Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇｅｎ
、　Ｐ、）ら（Ｊ、Ｂａｃｔ、、　　１９７７年、１３
０巻、９４６頁）およびシアオ（）ｌｓｉａｏ、　Ｃ，
Ｌ、）　　ら（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　　１９７
９年、７６巻、３８２９頁〉の方法によって行なわれる
。
λｇｔｌ１発現ライブラリーの造成 所望の蛋白質をコードするＤＮＡ、例えばＴａｑポリメ
ラーゼをコードするＤＮＡをバクテリオファージλｇｔ
ｌｌを用いて単離する方法は、次の通りである。ライブ
ラリーは、テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　
ａ　ｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡを完全消化しこれをλｇｔ
ｌｌファージのＢｃｏＲＩ部位に挿入することによって
得られるＢｃｏＲＩ部位を両端に有する＾１ｕＩフラグ
メントから槽底され得る〔ヤング（Ｙｏｕｎｇ）とデー
ビｘ　（Ｄａｖｉｓ）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
１９８３年、８０巻、１１９４〜１１９８頁〕。このバ
クテリオファージ中のユニークＥｃｏＲ１部位がβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子のカルボキシ末端に位置している
ので、適当なフレームおよび方向で挿入されたＤＮＡは
、ラクトースオペロンプロモーター／オペレーターの制
御下でβ−ガラクトシダーゼと融合した蛋白質として発
現される。
次に、抗体プラークハイブリダイゼーション法を用いて
ゲノム発現ライブラリーをスクリーニングする。この方
法は「エピトープ選択」と呼ばれ、このファージによっ
てコードされた融合蛋白質配列に対する抗血清を用いて
ハイブリッド形式するプラークを同定するものである。
例えば、この組換えファージのライブラリーを、８６．
０００〜９０．０００ダルトンのＴａｑポリメラーゼを
認識する抗体を用いてスクリーニングして、この蛋白質
の抗原決定基をコードするＤＮＡセグメントを有するフ
ァージを同定することができる。
約２Ｘ１０’個の組換えファージを、全ウサギＴａｑポ
リメラーゼ抗血清を用いてスクリーニングする。この−
次スクリーニングでは、陽性シグナルが検出され、これ
らのプラークの１種以上が、免疫前血清と反応せず且つ
免疫血清と反応する候補プラークから精製され、幾分詳
細に分析される。
組換えファージによって産生される融合蛋白質を検査す
るため、宿主Ｙ１０８９におけるファージの溶原株を得
る。溶原株を誘発し、生成する蛋白質をゲル電気泳動し
た後、それぞれの溶原株が他の溶原株には見られない新
−たな蛋白質を産生ずるのを観察することができ、また
は重複配列が生じることもある。陽性シグナルを有する
ファージを取り出す。ここに記載する例においては１個
の陽性プラークを取り出して更に同定を行ない、低密度
で再プレートして組換体を純化し、純化したクローンを
ＢｃｏＲＩ制限酵素での消化によるサイズクラスによっ
て分析する。次に、単離されたＤＮＡ挿入配列からプロ
ーブを作り、適当に標識を行い、そしてこれらのプロー
ブをマニアチュ（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｍａｎｕａｌ、　１９８２年に記載されている通常の
プラークハイブリダイゼーション又はコロニーハイブリ
ダイゼーション分析法に用いることができる。
標識したプローブを用いて、シャロン（Ｃｈａｒｏｎ）
３５バクテリオフアージ中に構成された第二のゲノムラ
イブラリーをプローブした〔ウイルヘルマイン（Ｗｉｌ
ｈｅｌｍｉｎｅ、＾」、）ら、Ｇｅｎｅ、　　１９８３
年、２６巻、１７１〜１７９頁〕。このライブラリーは
、テルムス・アクアチフス（’ｒｈｅｒｍｕｓ　　皿四
只皿鮭ゲノムＤＮＡを５ａｕ３Ａ部分消化しそしてサイ
ズ分別したフラグメント（１５〜２０ｋｂ）　をシャロ
ン３５フアージの８ａｍＨＩ部位にクローン化すること
により作製された。このプローブを用いて、Ｔａｑポリ
メラーゼをコードするＤＮＡを含むファージを単離した
。Ｃｌ１３５　：Ｔａｑ＃４−２と命名した生成するフ
ァージの一つは、全遺伝子配列を有することが判明した
。この遺伝子の部分をコードする部分配列も単離された
。
ベクターの造成 所望のコード配列および制御配列を含有する好適なベク
ターの造成は、当業界で周知の標準的な連結および制限
酵素技術を用いる。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列ま
たは台底されたオリゴヌクレオチドを開裂し、ととのえ
、そして再連結して所望の形状にする。
部位特異的ＤＮＡ開裂は、当業界で周知の条件下で好適
な（１種以上の）制限酵素を用いて処理することによっ
て行ない、その詳細はこれらの市販の制限酵素の製造業
者によって記載されている。
例えば、二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　、製品カタログ
を参照されたい。−船釣には、約ＩＲのプラスミドまた
はＤＮＡ配列を、約２０Ｊｌｌの緩衝溶液中でｌ単位の
酵素で開裂し、本明細書の実施例では、典型的にはく過
剰量の制限酵素を用いてＤＮＡ基質を完全に消化するよ
うにしている。約３７℃で約１〜２時間のインキュベー
ション時間が有効であるが、変更を行なうこともできる
。それぞれのインキュベーションの後に、蛋白質をフェ
ノール／クロロホルムで抽出して、次いでエーテル抽出
を行なうことによって除去して、核酸を水性分画からエ
タノール沈澱によって回収することができる。所望なら
ば、開裂フラグメントのサイズ分離を、標準的技術を用
いるポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気
泳動によって行なうことができる。サイズ分離の一般的
説明については、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＢｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、　１９８０年、６５巻、４９９〜５６０頁に記
載されている。
制限開裂したフラグメントを、５０ｍＭのトリス、ｐＨ
７，６、５０ｍＭのＮａＣ１、１０ｍＭのＭｇＣＥ　２
．　１ｈ＋ＭのＤＴＴおよび５０〜１００廁のｄＮＴＰ
ｓ中で、２０〜２５℃で約１５〜２５分間のインキュベ
ーション時間を用いて、４種類のデオキシヌクレオチド
トリホスフェ−）　（ｄＮＴＰ）の存在でＥ、コリ（Ｂ
、ｃｏｌｉ）　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウ（Ｋ
ｌｅｎｏｗ））　の大フラグメントで処理することによ
って平滑末端にすることができる。フレノウフラグメン
トは５′接着末端をフィルインするが、４種のｄＮＴＰ
ｓが存在していても、突出する３′単一鎖をチューバッ
ク（ｃｈｅｗｓ　ｂａｃｋ）する。所望ならば、接着末
端の性状によって指定される制限内で唯１種のまたは選
択された複数のｄＮＴＰｓを供給することによって選択
的修復を行なうことができる。フレノウで処理した後、
混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノー
ルで沈澱させた。適当な条件下で８１ヌクレアーゼを用
いて処理すると、単一鎖部分の加水分解が起こる。
台底オリゴヌクレオチドは、マテウチ（Ｍａｔｔｅｕ−
ｃｃｉ）ら（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、、　１９８
１年、１０３巻、３１８５〜３１９１頁）のトリエステ
ル法を用いて、または自動合成法を用いて調製すること
ができる。アニーリングの前のまたは標識のための単一
鎖のキナーゼ処理は、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７，６，
１０ｍＭのＭｇＣ１２゜５ｍＭのジチオスレイトール、
１〜２ｍＭのＡＴＰの存在下で、１ｎＭの基質に対して
過剰量の、例えば約１０単位のポリヌクレオチドキナー
ゼを用いて行なう。このキナーゼ処理がプローブの標識
するためのものであるときには、ＡＴＰは高比活性のγ
３２ｐを有する。
連結は、下記の標準的条件及び温度で１５〜３０ＪＪ１
の容積で行なう。２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２．　　
（ｐＨ７，５）　１０ｍＭ　Ｍｇｌ！！２．１０ｍＭ　
ＤＴＴ、　　３３Ｉ！ｆｌ／ｍ１ＢＳＡ、　１０ｍＭ　
〜５０ｍＭのＮａＣｆ　ｓおよび（「接着末端」の連結
には）４０渕のＡＴＰ、　　０．０１〜０．０２［’ワ
イス（Ｗｅｉｓｓ）　）単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ、
０℃：またはく「平滑末端」の連結には）１ｍＭの＾Ｔ
Ｐ、　　０．３〜０．６　Ｃワイス（Ｗｅｉｓｓ）　１
単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ、１４℃。分子内「粘着末
端」連結は、通常は３３〜１００　ｎ／ｒｎｌの総ＤＮ
Ａ濃度（５〜１１００ｎの総末端濃度）で行なう。
分子間平滑末端連結（通常は１０〜３０倍の過剰モルの
リンカ−を用いる）は、１廁の総末端濃度で行なう。
「ベクターフラグメント」を用いるベクターの造成では
、ベクターフラグメントを通常は細菌性アルカリホスフ
ァターゼ（ＢＡＰ）で処理して５′ホスフエートを除去
して、ベクターの再連結を防止する。ＢＡＰ消化は、ｐ
Ｈ８で、約１５０ｍＭのトリス中で、Ｎａ“およびＭｇ
”の存在で、ベクター１　ｍｇ当たり約１単位のＢＡＰ
を用いて、６０℃で約１時間行なう。核酸フラグメント
を回収するため、調製物をフェノール／クロロホルムで
抽出し、エタノール沈澱せしめる。また、好ましくない
フラグメントを追加的制限酵素消化によって二重消化さ
れたベクターでは、連結は防止することができる。
ＤＮＡ配列の改変 配列の改変を必要とするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに
由来するベクターの部分については、部位特異的なブラ
イマー指令変異誘発を用いる。この技術は現在では当業
界で標準的であり、所望の変異を表わす限定されたミス
マツチを除いて変異誘発されるべき単一鎮ファージＤＮ
Ａに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い
て行なわれる。要約すれば、ファージに相補的な鎖の合
成を指令するプライマーとして合成オリゴヌクレオチド
を用い、生成する二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａをファージ支持性の
宿主細菌に形質転換する。形質転換された細菌の培養液
を上層寒天に塗布しファージを有する単一細胞からプラ
ークを形成させる。
理論的には、新たなプラークの５０％は変異形を単一鎖
として有するファージを含み、５０％はもとの配列を有
する。プラークをニトロセルロースフィルターに移して
、正確にマツチするハイブリダイゼーションを可能にし
且つもとの鎮とのミスマツチがハイブリダイゼーション
を防止するのに十分であるような温度で、キナーゼ処理
した台底ブライマーで「リフト（ｌｉｆｔｓ）　Ｊハイ
ブリダイゼーションを行なう。次に、このプローブとハ
イブリッド形成するプラークを採取して、培養し、ＤＮ
Ａを回収する。
造成の証明 以下の造成では、プラスミド造成物の正確な連結を、最
初に連結混合物を用いてＥ、コ！Ｊ　（Ｅ！。
ｃｏｌｉ）ＭＭ２９４株または他の適当な宿主を形質転
換することによって確かめる。当業界で理解されている
ように、好結果の形質転換体を、プラスミド造成の方式
に依存してアンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性ま
たはその他の抗生物質耐性によって選択する。次に、形
質転換体からのプラスミドを、フレウェル（Ｃｌｅｗｅ
ｌｌ、　Ｄ、Ｂ、）　　ら、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　１９６９年、６２巻、１
１５９頁）の方法により、場合によってはクロラムフェ
ニコール増幅法〔フレウェル（Ｃｌｅｗｅｌｌ、　Ｄ、
Ｂ、）、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
１９７２年、１１０巻、６６７頁〕によって調製する。
単離したＤＮＡを、制限処理により分析し、そして／又
はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、）ら（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、［ＩＳＡ、　　１９７７年、７４巻、５４６３
頁）のジデオキシ法であって更にメッシング（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ）ら（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　
１９８１年、９巻、３０９頁）によって記載されている
方法、またはマクサム（Ｍａｘａｍ）　　ら（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１９８０年、
６５巻、４９９頁）の方法によって配列決定する。
宿主の例 この発明においてクローニング及び発現に用いられる宿
主菌株は、次の通りである。
クローニング及び配列決定、並びにほとんどの細菌性プ
ロモーターの制御下での造成物の発現には、Ｅ、コリ　
（ｔｉ、　　ｃｏｌｉ）ゲネチック・ストック・センタ
ーＧＣ３Ｇ＃６１３５から得たＥ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）株ＭＭ２９４を宿主として用いた。ＰＬ　Ｎ■ｓプ
ロモーターの制御下での発現には、Ｅ、コ！ｊ　（Ｂ、
ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＭＣ１００Ｏλ溶原株、ＮＪｓｓＣ
１８５７ＳｕＳＰｓｏ、　ＡＴＣＣ３９５３１を用いる
ことができる。本明細書では、１９８７年４月７日にＡ
ＴＣＣ（ＡＴＣＣ５３６０６）として寄託されているＥ
、コリ　（Ｂ、ｃｏｌｉ）口Ｇ１１６を用いる。
Ｍ１３ファージ組検体のためには、ファージ感染を受け
やすいＥ、コリ（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）　、例えばＥ。
コリに１２株０Ｇ９８を用いる。０６９８株は１９８４
年７月１３日にＡＴＣＣ寄託され、寄託番号３９７６８
を有する。
哺乳類での発現はＣＯ５−７，Ｃ０５−Ａ２．　ＣＶ−
１およびネズミ細菌で行うことができ、そして昆虫細胞
ではスポドプテラ・フルジペイダ（動列□ｔｅｒａ旦」
■坦卦）での発現を基礎とする。
酵素活性の安定化 酵素は、長期間安定にするためには、１種又は複数種の
非イオン性ポリマー性界面活性剤を含む緩衝液中に貯蔵
するのが好ましい。この様な界面活性剤は一般的には分
子量が約１００〜２５０．０００の範囲であり、好まし
くは約４，０００〜２００．０００ダルトンであり、ｐ
Ｈが約３．５〜約９．５、好ましくは約４〜８．５で酵
素を安定化するものである。この様な界面活性剤の例と
しては、マツグ・クチェオン（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ）
のＢｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　＆　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ
、北アメリカ版（１９８３年〉　エムシー・パブリッシ
ング・カンパ＝　−（ＭＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ
、）のマツグ・クチェオン部門発行、１７５．　　ロッ
クロード、グレンロック、ニューシャーシー（米国）、
の２９５〜２９８頁に記載されているものがあり、その
詳細については上記文献を参照されたい。好ましくは、
界面活性剤はエトキシル化した脂肪族アルコールエーテ
ルおよびラウリルエーテル、エトキシル化したアルキル
フェノール、オクチルフエノキシポリエトキシエ・タノ
ール化合物、改質オキシエチル化したおよび／またはオ
キシプロピル化した直鎮状アルコール、ポリエチレング
リコールモノオレエート化合物、ポリソルベート化合物
およびフェノール性脂肪族アルコールエーテルからなる
群から選択される。更に詳細には、好ましくは、ポリオ
キシエチル化（２０）　　ソルビタンモノラウレートで
あるツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０　　ＣＩＣＩ　・アメ
リカス・インコーポレーテド（ＩＣＩ　Ａｍｅｒｉｃａ
ｓ　Ｉｎｃ、）、　　ウイルミントン、ＯＢ〕およびエ
トキシル化アルキルフェノール（ノニル〉であるイコノ
ール（Ｉｃｏｎｏｌ）　（登録商標）　ＮＰ−４０（バ
スフ（ＢＡＳＦ）イアンドット・コーポレーション、パ
ーシバニー、ニューシャーシー）である。
以下の実施例は、単に例示のために提供するものであり
、発明の範囲および特許請求の範囲を限定することを意
図するものではない。これらの実施例において、総ての
パーセンテージは、特に断らないかぎり、固体の場合に
は重量％、液体の場合には容積％であり、総ての温度は
摂氏で表わしている。
アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション、　
１２３０１パークラウンドライブ、ロックビル。
ＭＤからＡＴＣＣＮα２５．１０４としてなんら制御な
く入手できるテルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＹＴＩ株をフラスコ中で、下記
の培地中で増殖せしめた。
クエン酸ナトリウム リン酸カリウムｐＨ７，９ 塩化アンモニウム 硫酸マグネシウム 塩化カルシウム 塩化ナトリウム 酵母エキス トリプトン １ｍＭ ５ｏ＋Ｍ ０ｍＭ ０．２ｍＭ ０，１ｍＭ Ｉｇ／ｆ １ｇ／１ １ｇ／ｌ グルコース　　　　　　　　　　　２ｇ／ｌ硫酸第一鉄
　　　　　　　　　０．０１ｍＭ（オートクレーブ前に
ｐＨを８．０に調整）上記培地中で７０℃にて一夜培養
したフラスコ種母を１０ｆ１発酵槽に接種した。種母フ
ラスコからの合計６００−〇種母を１０１の同じ培地に
接種した。
ｐＨを水酸化アンモニウムにより８，０に調節し、溶存
酸素を４０％に調節し、温度を７０℃に調節し、そして
攪拌速度を４０Ｏｒｐｍとした。
細胞の増殖の後、最初の５段階についてはＫａｌｅ−ｄ
ｉｎ等、前掲、の方法（わずかに変更を加えて）を用い
、そして第６段階では異る方法を用いて精製を行った。
６段階すべてを４℃にて行った。カラムでの分画速度は
０．５力ラム／時とし、溶出中のグラジェントの容量は
１０カラム容量とした。これに代る好ましい方法を例６
に後記する。
要約すれば、上記培養のＴ、アクアチフス（Ｌヨｕａｔ
ｉｃｕｓ）細胞を、９時間の培養の後、後期対数期１．
４ｇ乾燥重量／１の細胞濃度において、遠心分離により
集菌した。２０ｇの細胞を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ　＜ｐＨ７，５）及び０．１ｍＭ　Ｂ［ｌＴＡを含む
緩衝液８Ｍ中に懸濁した。細胞を溶解し、そして溶解物
を４℃のローター中で３５．００Ｏｒｐｍにて２時間遠
心した。
上滑を集め（画分Ａ）、そして硫酸アンモニウムの４５
〜７５％飽和の間で沈澱する蛋白質画分を集め、０．２
Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６，５）、１０ｍＭ　　２−メ
ルカプトエタノール及び５％グリセリンを含有する緩衝
液中に溶解し、そして最後に同じ緩衝液に対して透析し
て画分Ｂを得た。
画分Ｂを、上記の緩衝液で平衡化されたＤＥＡＢ　−セ
ルロースの２．２　Ｘ３０ｃｍカラムに適用した。次に
、このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、そして蛋白質を含
有する画分（２８０ｎｍにおける吸収により決定する）
を集めた。−緒にした蛋白質画分を、０．０１Ｍリン酸
カリウム（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　　２−メルカプト
エタノール及び５％グリセリンを含有する第二緩衝液に
対して透析して画分Ｃを得た。
画分Ｃを、第二緩衝液で平衡化されたヒドロキシアパタ
イトの２．６　Ｘ２１ｃｍカラムに適用した。次に、こ
のカラムを洗浄し、そして１０ｍＭ　２−メルカプトエ
タノール及び５％グリセリンを含有する０、０１〜０．
５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７，５）緩衝液の直線グラジ
ェントにより酵素を溶出した。ＤＮＡポリメラーゼ活性
を含有する両分（９０〜１８０ｍＭ　！Ｊン酸カリウム
）を集め、アミコン攪拌セル及びＹＭＩＯ膜を用いて４
倍に濃縮し、そして第二緩衝液に対して透析して画分り
を得た。
画分りを、第二緩衝液で平衡化したＤＢＡＢ−セルロー
スの１．６　Ｘ２８ｃｍカラムに適用した。このカラム
を洗浄し、そして第二緩衝液中０．０１〜０．５　Ｍ　
’Ｊン酸カリウムの直線グラジェントによりＤＮＡポリ
メラーゼを溶出した。画分をエンドヌクレアーゼ及びエ
キソヌクレアーゼの汚染について測定した。これは、過
剰のＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした後の
ファージλＯＮＡ又はスーパーコイルプラスミドＤＮＡ
の分子量の変化を電気泳動により検出することにより（
エンドヌクレアーゼについて）、そしてＤＮＡを幾つか
のフラグメントに開裂せしめる制限酵素による処理の後
に（エキソヌクレアーゼについて）行った。最少のヌク
レアーゼ汚染を有するＤＮＡポリメラーゼ画分く６５〜
９５ｏ＋Ｍ　リン酸カリウム〉のみをプールした。
このプールにオートクレーブしたゼラチンを２５０に／
−の量で添加し、そして第二緩衝液に対して透析を行っ
て画分Ｅを得た。
画分Ｅをホスホグルコースカラムに適用し、そして２０
ｍＭリン酸カリウム（１１１）１７．５）中０．０１〜
０．４ＭＫＣｊ！！のグラジェント１００ｒｎｌにより
溶出した。両分を上記のようにしてエンドヌクレアーゼ
／エキソヌクレアーゼの汚染について、そしてさらにポ
リメラーゼ活性について（Ｋａｌｅｄｉｎ等の方法によ
り〉測定した。プールした画分を第二緩衝液に対して透
析し、次に５０％グリセリン及び第二緩衝液に対する透
析により濃縮した。
ポリメラーゼの分子量を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより決定し
た。マーカー蛋白質はホスホリダーゼＢ　（９２，００
０）、ウシ血清アルブミン（６６、２００）　、オバル
ブミン（４５，０００）、カーボニックアンヒドラーゼ
（３１，０００）、大豆トリプシンインヒビター（２１
，５００）、及びリゾチーム（１４，４００）であった
。
予備的データは、文献（例えばＫａｌｅｄｉｎ等）に報
告されている６２．　Ｃ１００〜６３．０００ダルトン
ではなく、約８６．０００〜９０．０００ダルトンであ
った。
コノポリメラーゼを、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ！　
（ｐＨ６，４及びｐＨ８，０）、　　０．１Ｍ　ＫＣｊ
！、　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　１ｍＭ　　２−メル
カプトエタノール、ｌＱｎｍｏｌｅずつのｄＧＴＰ　。
ｄＡＴＰ及びＴＴＰ　、及び０．５μＣ１（３Ｈ）ｄＣ
ＴＰ、　　８．ｇの“活性化されたウシ”胸腺ＤＮＡ並
びに０．５−５ユニツトのポリメラーゼを含有する混合
物５０ｕ！中でインキュベートした。“活性化された”
　ＤＮＡは、ＤＮＡの５％が酸−溶解性画分に移るまで
ＤＮａｓｅ　■により消化して部分加水分解した後のＤ
ＮＡの天然調製物である。この反応は７０℃にて３０分
間行い、そして０．１２５Ｍ　ＥＤＴＡ　　Ｎａｚを含
有するリン酸す）　ＩＪウムの飽和水溶液的５０Ｉｌｌ
の添加により停止せしめた。サンプルをＫａｌｅｄｉｎ
等、前掲に記載されているようにして処理しそして活性
を測定した。
この結果は、ポリメラーゼはｐＨ６，４においてｐＨ８
，０における活性の半分より活性であることを示した。
これに対して、Ｋａｌｅｄｉｎ等は、酸素はｐＨ約７．
０において、ｐＨ８，３における活性の８％を有するこ
とを見出した。従って、本発明の熱安定酵素のｐＨプロ
フィールはＫａｌｅｄｉｎ等の酵素のそれよりも広い。
最後に、ＤＮＡポリメラーゼ測定反応混合物から１種類
のみ又は複数種類のヌクレオチドトリホスフェートを除
去した場合、本発明の酵素を用いて活性がほとんど観察
されず、活性は予想値と一致しており、そして酵素は高
い忠実性を示した。
これに対して、Ｋａｌｅｄｉｎ等、前掲、を用いて観察
された活性は予想値と一致しておらず、そしてヌクレオ
チドトリホスフェートの間違った導入が示唆される。
Ｔａｑ　ｐｏｔ遺伝子のための特異的ＤＮＡ配列プロー
ブを、λｇｔｌ１発現ライブラリーの免疫的スクリーニ
ングにより得た。Ｔ、アクアチフスのＤＮＡをＡｌｕ　
Ｉにより完全消化し、ＢｃｏＲＩ　１２−マーリンカ−
（ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ　、ニューイングランドバ
イオラプス）と連結し、ＢｃｏＲＩで消化し、そしてＢ
ｃｏＲＩ−消化され脱リン酸化されたλｇｔｌｌ　ＤＮ
Ａ　（ブロゲマ・バイオチク〉　と連結した。連結され
たＤＮＡをパッケージしくジガパックプラス、ストラテ
ジーン）、モしてＥ、コリに一１２株Ｙ１０９０　（Ｒ
ｌＹｏｕｎｇより入手）にトランスフェクトした。
例４を参照のこと）に対するラビットポリクローナル抗
血清の１：２０００稀釈物を用いてスクリーニングした
（　Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ、及びＲ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ　
（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２２２　ニア７８−７
８２）　、候補プラークを限界稀釈で再プレートし、そ
して均一になるまで（約３サイクル）再スクリーニング
した。免疫前血清と反応せずそして免疫血清と反応する
候補プラークからファージを精製した。
候補ファージを用いてＥ、コリＹ−１２株Ｙ１０８９（
Ｒ，Ｙｏｕｎｇ）を溶原化した。溶原菌を、Ｔａｑポリ
メラーゼ抗血清と反応するＩＰＴＧ誘導性融合蛋白質（
β−ガラクトシダーゼより大）の産生についてスクリー
ニングした。面相のサイズ分画された融合蛋白質を用い
て、全ポリクローナル抗体からエピトープ特異的抗体を
アフィニティー精製した［：　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、　
Ｌ、　Ｓ、Ｂ、等（１９８６）　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｒｉａ
ｌ。
１０２　：　２０７６−２０８７”ｌ。
今度は、“つり上げられた”エピトープ−選択された抗
体をウェスタン分析において用いて、Ｔａｑポリメラー
ゼに特異的なりＮＡ配列をコードしているλｇｔｌｌフ
ァージ候補を同定した。λｇｔ：１と称する１つのλｇ
ｔｌｌファージ候補が、全ラビットポリクローナルＴａ
ｑポリメラーゼ抗血清からの精製されたＴａｑポリメラ
ーゼ及びＴａｑポリメラーゼを含有する粗抽出画分の両
者と特異的に反応する抗体を、特異的に選択した。この
ファージλｇｔ：１を使用してさらに検討した。
テルムス・アクアチフスＤＮＡの約１１５ｂｐのＢｃｏ
ＲＩ−適合Ａｌｕ　Ｉ断片をラベルしくＭａｎｉａｔｉ
ｓ等、前掲〉で、Ｔａｑポリメラーゼ特異的プローブを
形成した。このプローブをサザン分析において、及びＴ
、アクアチフスＤＮＡランダムゲノムライブラリーをス
クリーニングするために用いた。
λ７７−ジ’ｙヤＣ１：／３５　（Ｗｉｌｈｅｌｍｉｎ
ｅ、　Ａ、Ｍ、等、前掲）をその接着末端を介してアニ
ールしそして連結し、ＢａｍＨＩにより完全消化し、モ
してアニールされたアームをスタツプ−（ｓｔｕｆｆｅ
ｒ）　　フラグメントから、酢酸カルシウム密度勾配超
遠心（Ｍａｎｉ−ａｔｉｓ等、前掲）により精製した。
Ｔ、アクアチフスのＤＮＡを５ａｕ３Ａで部分分解し、
そして１５〜２０ｋｂサイズの両分をシュークロース密
度勾配超遠心により精製した。標的ＤＮＡフラグメント
及びベクターＤＮＡフラグメントを１＝１のモル比で連
結することによりランダムゲノムライブラリーを遺戒し
た。ＤＮＡをパッケージし、そしてＥ、コリに一１２株
ＬＢ３９２又はに８０２にトランスフェクトした。９９
％以上の組換体を含有する２０．０００以上の最初のフ
ァージのライブラリーをＥ、コリに一１２株Ｌｌｌｉ３
９２上で増幅した。
λｇｔｌｌ　：　ｌの放射性ラベルされたＥｃｏＲＩ挿
入部によりＣＨ３５Ｔａｑゲノムファージライブラリー
をスクリーニングした（マニアチス等、前掲）。特異的
にハイブリダイズする候補ファージプラークを精製し、
そしてさらに分析した。ＣＨ３５：：　４−２と称する
１つのファージが、旧ｎｄＩＩＩによる消化の後に４個
以上のＴ、アクアチフスＤＮＡフラグメントを放出した
く約８．０　、４．５　、０．８　、０．５８ｋｂ）。
４種類のＨｉｎｄＩ［Ｉ　Ｔ、　　アクアチフスＤＮＡ
フラグメントを、旧ｎｄＩＩＩで消化したプラスミドＢ
ＳＭ１３′″（３，２ｋｂ、ベクタークローニングシス
テムス、すＣＨ３５：：　４−２からの約８．Ｏｋｂの
旧ｎｄＩ［［ＤＮＡ７ラグメントをプラスミドｐＦｃ８
２　（１１，２ｋｂ）中に単離し、他方ＣＨ３５：：　
４−２からの４．５ｋｂＨ罰ｄＩＩ［ＤＮＡフラグメン
トをプラスミドｐＦＣ８３（７，７ｋｂ）中に単離した
。
ｐＦＣ８２を含有するＥ、コ１ＪＤＧ９８株は熱安定性
高温ＤＮＡポリメラーゼ活性を含有することが示された
（第１表）。さらに、この細胞は、免疫的にＴａｑ　Ｄ
ＮＡポリメラーゼと関連する新たな約５Ｑｋｄの分子量
のポリペプチドを合成した。
８、Ｏｋｂ　）ｌｉｎｄＩＩＩ　ＤＮＡフラグメントの
Ｔａｑポリメラーゼコード領域をさらに処理し、８．Ｏ
ｋｂ　）ｌｉｎｄＩ［フラグメントの２．３ｋｂのＨｉ
ｎｄ　ＩＩＩ　−Ａ！Ｅ７１８部分を１ａｓ−プロモー
ターの近位に位置付けた。この領域をサブクローニング
してプラスミドｐＦｃ８５　（６，０ｋｂ）を得た。Ｉ
ＰＴＧと共にインキュベートした後、プラスミドｐＦＣ
８５を含有するＥ、コリＤＧ９８細胞は、もとの親クロ
ーン（ｐＦＣ８２／ＤＧ９８）　に比べて１００倍まで
の熱安定性Ｔａｑポリメラーゼ関連活性を合成する（第
１表）。ｐＰｃ８５を含有する細胞は有意量の熱安定Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性を合成するが、Ｔａｑ　ｐｏｔ　
ＤＮＡ配列の一部分のみが翻訳され、約６０ｋｄのＴａ
ｑポリメラーゼ関連ポリペプチドの蓄積が起こる。
第１表 Ｅ、コリ（＃）における熱安定ＤＮＡ ポリメラーゼ活性の発現 ８３Ｍ１３／ＤＧ９８−　　　　　　　　　　　　０．
０２ｐＦｃ８２／ＤＧ９８　　　　　２．２　　　　　
２．７（＃）細胞は後期対数期まで増殖せしめ（＋／−
ＩＰＴＧ　、　１０ｍＭ）　、集菌し、音波処理し、７
５℃にて２０分間加熱し、遠心し、そして透明な上滑を
７０℃にてＤＮＡポリメラーゼ活性について測定した。
（本）１ユニット−３０分間に１　ｎＭ　ｄＣＴＰの取
り込み。
参考例３゜ この発明の熱安定酵素の遺伝子は種々の細菌発現ベクタ
ー、例えばＤＧ１４１（ＡＴＣＣ３９５８８）及びｐＰ
ｃＮｕｎｓ　ＡＴＧ中で発現せしめることができる。こ
れらの宿主ベクターの両者はｐＢＲ３２２の誘導体であ
って、トリプトファン・プロモーターオペレーター及び
ＡＴＧ開始コドンと作用可能に連結されたりボゾ−ム結
合部位（ＤＧ１４１）　、又はλＰＬプロモーターを含
む配列及びＡＴＧ開始コドンに作用可能に連結された遺
伝子Ｎ結合部位（１）ＰＬ　Ｎｌｌｌ５　ＡＴＧ）を有
する。これらの宿主ベクターのいずれか一方をＳａｃ　
Ｉにより制限酵素処理し、そしてＫｌｅｎｏｗ又はＳｌ
ヌクレアーゼにより平滑末端化して、Ｔａｑポリメラー
ゼ遺伝子を後で挿入するための便利な部位を作ることが
できる。
次の様にして、プラスミドｐＦＣ８３及びｐＦＣ８５に
サブクローニングされたＤＮＡ挿入フラグメントから完
全な長さのＴａｑポリメラーゼ遺伝子を造成した。ベク
ターＢＳＭ１３”　　（ベクタークローニングシステム
ス、サンジエゴ、　ＣＡから市販されている）をユニー
ク旧ｎｄＩＩＩ部位において消化し、にｌｅｎｏｗ及び
（ＩＮＴＰにより修復し、そしてＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ
を用いてシ０ＩＩオクタヌクレオチドナ＋リンカ−５′
−ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３’に連結し、モしてＥ、３９０
６９８株に形質転換した。Ａｍｐ”　１ａｃＺ、”形質
転換体からプラスミドを単離した。クローンの１つをＢ
ｇｌ　ＩＩ及び八５ｐ７１８により消化し、そして大ベ
クターフラグメントをゲル電気泳動により精製した。
次に、プラスミドｐＦＣ’８３を坦ＩＩ及びＨｉｎｄＩ
Ｉ［で消化し、そして約７５０ｂｐのフラグメントを単
離した。プラスミドｐＦＣ８５を１辻ｄｌｌｉ及びＡｓ
ｐ７１８で消化し、そして約２，８ｋｂのフラグメント
を単離し、そして３片連結によりｐＦＣ８３からの約７
５０ｂｐのＢｇｌＩ［−１堕ｄＩＩＩフラグメント及び
８３Ｍ１３“のＪ匹■−か江７１８ベクターフラグメン
トと連結した。この連結混合物を用いてＥ、３９０６９
８株（１９８４年７月１３日に寄託〕ＡＴｃｃＮα３９
．７６８）を形質転換し、これからＡｍｐ”コロニーを
選択し、そして約６．７５ｋｂのプラスミド（ｐＬｓＧ
ｌ）を単離した。ｐＬｓＧｌを含有するイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘導され
たＤＧ９８細胞は、Ｔ、アクアチフスから単離された天
然酵素と区別できないサイズのＴａｑ　ＤＮＡポリメラ
ーゼを合成した。次に、プラスミドｐＬｓＧ１を用いて
、ベクタークローニングシステムスにより推奨される方
法に従って単鎖ＤＮＡ鋳型を形成することができる。
次に、オリゴヌクレオチド−指令変異誘発［：Ｚｏｌｌ
ｅｒ及びＳｍ１ｔｈ、　　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、　　（１９８２）　１０：６４８７−６５００〕を用
いてＡＴＧ開始コドンの部分としてｓｐｈ　Ｉ制限部位
を導入することができる（Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子の
コード配列中の内部旧ｎｄＩＩＩ部位の上流に）。同様
にして、遺伝子のカルボキシ末端の後（Ａｓｐ７１８部
位から約Ｑ、７ｋｂ上流）にＢｇｌＩＩ部位を導入して
発現ベクターへのＴａｑポリメラーゼ遺伝子のサブクロ
ーニングを容易にすることができる。部位特定変異誘導
を終った後、遺伝子を８３Ｍ１３＋ベクターから約３．
２ｋｔｌのｓｐｈ　Ｉ−ＢｓｔＢ　ＩＩ制限フラグメン
ト上に単離し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント及び４種類す
べてのｄＮＴＰにより処理し、そしてＴ４ＤＮＡＩＪガ
ーゼを用いて（平滑末端条件）、あらかじめＳａｃ　Ｉ
で消化し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰにより修復しそし
てウシ腸ホスファターゼで処理して脱リン酸化平滑末端
を形成しておいた前記の発現ベクターに挿入することが
できる。この連結混合物を用いてＥ９　コＩＪ　ＤＧ１
１６を形質転換し、そして得られる形質転換体をＴａｑ
ポリメラーゼの産生についてスクリーニングする。酵素
の発現は、ウェスタンイムノプロット分析及び活性分析
により確認することができる。
プラスミドｐＦＣ８５の約２．８ｋｋｌの長ｉｎｄ　ｆ
ｆ１−人」７１８フラグメント中に含有されるＴａｑポ
リメラーゼ遺伝子のさらに大きな部分を、例えばプラス
ミド！］Ｐｔ、　Ｎｕｎｓ　ＡＴＧを用いて、Ｔａｑ　
ｐｏｌ遺伝子をコードするアミノ−末端旧ｎｄＩＩＩ制
限部位をＡＴＧ開始コドンに連結することにより、発現
せしめることができる。この融合体の発現生成物は約６
６、０００〜６８、０００ダルトンの端が切り取られた
ポリメラーゼをもたらす。
この特定の造成は、プラスミドｐＦＣ８５を旧ｎｄｌｌ
ｉで消化し、そしてｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ及びｄＣＴ
Ｐの存在下でにｌｅｎｏｗフラグメントで処理すること
により行うことができる。生じたフラグメントを３１ヌ
クレアーゼでさらに処理することにより単鎖延長部を除
去し、そして生じたＤＮＡをＡｓｐ７１８で消化し、そ
して４種類すべてのｄＮＴＰの存在下でＫｌｅｎｏｗフ
ラグメントにより処理する。回収された断片を、Ｔ４Ｏ
Ｎ＾　リガーゼを用いて、あらかじめＳａｃ　Ｉにより
消化しそしてｄＧＴＰの存在下でＫｌｅｎｏｗフラグメ
ントで処理してＡＴＧ平滑末端を形成しておいた脱リン
酸化プラスミドｐＰｔ　Ｎｕｎｓ　ＡＴＧに連結するこ
とができる。次に、この連結混合物を用いてＥ、コリＤ
Ｇ１１６を形質転換し、そして形質転換体をＴａｑポリ
メラーゼの産生についてスクリーニングする。
やはり、ウェスタンイムノプロット分析及び活性分析に
より発現を確認することができる。
参考例４．精製 熱安定性ポリメラーゼは、前に記載した例に従って、テ
ルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ａｑｕａ−
ｔｉｃｕｓ）の培養物から直接精製する方法に粗抽出物
の調製において必要なわずかな変更を加えて、組換生産
された酵素を含有する細菌培養物から精製することがで
きる。
遠心分離により集菌した後、６０ｇの細胞を５０ｍＭＴ
ｒｉｓ　−ＨＣ１（ｐＨ８，１）及び１ｍＭＢＤＴＡを
含有する緩衝液７５社中に懸濁した。細胞をフレンチプ
レス中で１４．０００〜１６．０ＯＯＰＳＩにて溶菌し
、この後４容積（３００ｒｎ１）の追加のＴｒｉｓ−［
ＥＤＴＡを加えた。緩衝液Ａ（β−メルカプトエタノー
ルを５ｍＭに、そしてＮＰ−４０及びトウィーン２０を
それぞれ０．５Ｖ／Ｖ％に）を添加し、そしてこの溶液
を冷却しながら十分に音波処理した。得られる均質懸濁
液を緩衝液入によりさらに稀釈して最終容量が出発細胞
重量の７．５〜８倍となるようにした。これを画分Ｉと
称する。
画分Ｉ及び上清画分中のポリメラーゼ活性を、０、０２
５Ｍ　ＴＡＰＳ　−）ＩＣ’　１　（ｐＨ９，２、２０
℃）、　０．００２Ｍ　Ｍｇ１ｌ！□。
０．０５Ｍ　ＫＣｌ、　１ｍＭ　２−ｙ’　ルカ７’　
）　エタ／　−ル、０．２ｍＭずつのｄＧＴＰ　、　ｄ
ＡＴＰ　、　ＴＴＰ　、　０．１ｍＭ　ｄＣＴＰ　（ａ
−”Ｐ、　０．０５Ｃｉ／ｍＭ］　、　１２．５ｘ“活
性化された”サケ精子ＤＮＡ及び０．０１〜０゜２ユニ
ツトのポリメラーゼ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　
ｐＨ８，５ＱｍＭ　ＫＣｆｌ、　　１ｍｇ／−のオート
クレーブされたゼラチン、０．５％ＮＰ−４０、０，５
％トウィーン２０及び１ｍＭ　　２−メルカプトエタノ
ール中に稀釈）を含んで成る５０Ｉ１１の混合物中で測
定した。１ユニツトは３０分間中１０ｎＭの生成物に相
当する。“活性化された”ＤＮＡは、ＤＮＡの５％が酸
可溶性画分に変るまでＤＮａｓｅ　Ｉにより部分加水分
解された後のＤＮＡの天然調製物である。反応を７４℃
にて１０分間行い、そして次に４０〃を２ｍＭ　ＢＤＴ
Ａ中５０ｚ／ｒｒｄｌのキャリヤーＤＮＡ溶液１．０ｍ
ｇ（０℃）中に移した。同容量（１，〇−〉の２０％Ｔ
ＣＡ及び２％ピロリン酸ナトリウムを加えた。０℃にて
１５〜２０分間の後、サンプルをワットマンＧＦ／Ｃデ
ィスクを通して濾過し、そして冷５％ＴＣＡ−１％ビロ
リン酸塩により十分に洗浄し、次に冷９５％エタノール
で洗浄し、そして乾燥し、計数した。
画分Ｉを、ベックマンＴｌ４５０−ター中で３５．００
Ｏｒｐｍにて２時間、２℃にて遠心し、そして集めた上
滑を画分■とした。
活性の９０〜９５％を沈澱せしめるのに必要なポリミン
（Ｐｏｌｙｍｉｎ）　　Ｐの最少量（この量は一級に最
終容量の０．２５〜０．３％であることが見出された）
を決定した後、ポリミンＰ　（ＢＰ［、、ガイセルブル
グ。
ＭＥ））　（ＩＯＶ／Ｖ％、ｐ）１７．５に調整しそし
てオートクレーブしたもの〉によりＴａｑポリメラーゼ
活性を沈澱せしめた。
０℃にて１５分間にわたり攪拌しながら、適当なレベル
のポリミンＰを画分■に徐々に添加した。
この溶液を０℃にてベックマンＪＡ１４０−ター中で２
０分間にわたり１３．　ＯＯＯｒｐｍにて遠心した。上
清の活性を測定し、そしてペレットを１７５容量の０．
５×緩衝液Ａ（水で１：２に稀釈したもの）に再懸濁し
た。この懸濁液を再遠心分離し、そしてペレットを１７
４容量の緩衝液Ａ　（０，４Ｍ　ＫＣＪを含有）に再懸
濁した。この懸濁液を十分にホモジナイズし、そして４
℃に一装置いた。このホモジネートを前記のように遠心
し、そして集めた上滑を画分■と命名した。
蛋白質画分を硫酸アンモニウムの７５％飽和での“沈澱
°により集め、遠心分離しく２７．　ＯＯＱｒｐｍ　。
５Ｗ２７０−ター、３０分間）そして浮上した薄膜を５
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８）、　１ｍＭ　ＢＤ
ＴＡ中に再懸濁した。
これらの段階を反復し、そして蛋白質懸濁液を８０ｍＭ
ＫｃＪ！を含有するＰ−ｃｅｌｌ緩衡液Ｃ２０ｍＭに２
口、。
ｐＨ７，５，０，５ｍＭ　ＢＤＴＡ、　　５ｍＭ　β−
メルカプトエタノール、５　ｗ／ｖ％グリセロール、０
．５ｖ／ｖ％ＮＰ−４０及びトウィーン２０〕により十
分に透析した。
透析物を遠心ビンに移し、これに、３ＱｍＭＫＣｊ！を
含有するＰ−ｃｅｌｌ緩衡液ですすがれたサックから回
収されたすべての蛋白質を加えた。遠心を２０、０００
　Ｘ　ｇにて行い、そして時間は１５分間に短縮した。
上清を貯蔵し、そして残ったペレットをＰ−ｃｅｌｌ緩
衡液及び８０ｍＭＫＣｊ！により洗浄・抽出し、そして
再遠心した。次に上滑を一緒にして画分■と命名した。
画分■を、８０ｍＭＫＣｌを含有するｐ−ｃｅｌｌ緩衝
液で平衡化したホスホセルロースの２．２　Ｘ２２ｃｍ
ツカラムに適用した。このカラムを同じ緩衝液で洗浄し
くカラムの２．５〜３倍容量）、そしてＰ−ｃｅｌｌ緩
衝液中８０〜４００ｍＭ　ＫＣｆの直線グラジェントを
用いて蛋白質を溶出した。ＤＮＡポリメラーゼ活性を含
有する両分（約０．１８〜０．２０Ｍにｌ）をプールし
、そしてアミコン攪拌セル及びＹＭ３０膜上で３〜４倍
濃縮した。このセルを、ＫＣＩを含有しないｐ−ｃｅｌ
ｌ緩衝液ですすぎ、そして両分濃縮物（０，１５Ｍ　Ｋ
Ｃｌ最終容＃調整）に加えて画分Ｖとした。
画分Ｖを、Ｐ　−ｃｅｌｌ緩衝液及び０．１５Ｍ　ＫＣ
Ａで平衡化シタヘパリン・セファロースＣＬ−６８カラ
ム（ファルマシア’）５ｍｌに適用した。カラムを０．
１５ＭＫＣＡ緩衝液（３〜４カラム容量）により洗浄し
、そしてＰ　−ｃｅｌｌ緩衝液中０．１５〜０．６５Ｍ
　ＫＣｆの直線グラジェントにより蛋白質を溶出した。
ＳＯＳ　−ＰＡＧＥ分析のためにゼラチンを含まない稀
釈剤への１；１０稀釈を行い、そして酵素の測定に使用
するため１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含有する稀釈剤への
引続いての１＝２０稀釈を行った。活性画分（約０．３
ＭＫＣｌで溶出）を、スーパーコイルＤＮＡ鋳型上で特
異的及び非特異的エンドヌクレアーゼ／トポイソメラー
ゼについて、過剰のＤＮＡポリメラーゼと共にインキュ
ベートした後のスーパーコイルプラスミドＤＮＡの分子
量の変化を電気泳動により検出することによって測定し
た。少量の線状ＤＮＡフラグメントとのインキュベーシ
ョンの後エキソヌクレアーゼの汚染が検出された。ピー
ク画分中、約８８ｋｄ蛋白質が主たるバンドであること
が見出された。画分■と称する主要画分は、このプール
を約３〜５ポリメラーゼユニツ）／　６００ｎｇ　ＯＮ
八で５５℃にて３０分間測定した場合、最少の検出可能
なエンドヌクレアーゼ活性を伴って最高のポリメラーゼ
活性を有していた。
画分■を、１０ｍＭ　ＫＰＯ４（ｐＨ７，５）、　５ｍ
Ｍβ−メルカプトエタノール、５％グリセロール、０．
２％ＮＦ−４０及び０．２％トウィーン２０（ＨＡ緩衝
液）に対して透析した。この透析されたサンプルを、ヒ
ドロキシアパタイトの３ｒｎｌのカラムに適用し、そし
てＨＡ緩衝液中１０〜２５０ｍＭ　ＫＰＯａ（ｐＨ７，
５）の直線グラジェントにより酵素を溶出した。−ポリ
メラーゼ活性は７５ｍＭ　ＫＰＯ４において溶出し始め
、１００ｍＭ　ＫＰＯ４においてピークを示した。活性
ピーク画分を１：１００〜１：３００稀釈で測定した。
前のクロマトグラフィー段階におけるように、５Ｏ３−
ＰＡＧＢ分析のため、ゼラチンを含まない稀釈剤中１＝
１０の稀釈物を調製した。５ポリメラーゼユニツトで５
５℃において有意なエンドヌクレアーゼ又は二本鎖エキ
ソヌクレアーゼ活性を有しない画分をプールし、そして
画分■と命名した。
画分■を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）、５
％グリセロール、５ｍＭ　β−メルカプトエタノール、
０、１ｍＭ　ＢＤＴＡ　、　０．１％ＮＰ−４０及び０
．１％トウィーン２０の溶液に対して透析し、室温にお
いてｐＨ５に調整した。透析されたサンプルを、あらか
じめ平衡化した２−のＤＥＡＲ−Ｔｒｉｓ−Ａｃｒｙｌ
　−Ｍ（１，ＫＢ）カラムに適用し、そして次に同じ緩
衝液で洗浄した。カラムに付着しなかったポリメラーゼ
活性を含有する画分をプールし、そして同じ緩衝液中５
０ｍＭ　ＮａＣＩ！に調整し、画分■を得た。
画分■を、同じ緩衝液（２５ｍＭ酢酸ナトリウム、５０
ｍＭ　ＮａＣｌ２．５％グリセロール、０．１ｍＭ　Ｂ
ＤＴＡ　。
０．１％ＮＰ−４０及び０．１％トウィーン２０）で平
衡化された２−のＣＭ−Ｔｒｉｓ−Ａｃｒｙｌ　−Ｍ（
ＬＫＢ）カラムに適用した。このカラムを、４〜５カラ
ム容量の同じ緩衝液で洗浄し、そして酵素を酢酸ナトリ
ウム緩衝液中５０〜４００ｍＭ　　ＮａＣ１２の直線グ
ラジェントにより溶出した。ポリメラーゼ活性のピーク
は約０．１５〜０．２０Ｍ　　ＮａＣｌにおいて溶出さ
れた。ポリメラーゼ活性を、５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析のた
めにゼラチンを含有しない稀釈剤中にまず１：１０で稀
釈し、１：３００〜１：５００稀釈において測定した。
７４℃にてＤＮＡポリメラーゼアッセイ塩（２５ｍＭ　
ＴＡＰＳ−ＨＣ１。
ｐｌ（９，４，２，０ｍＭ　ＭｇＣｆｌ　２及び５０ｍ
ＭＫＣ１）を用イテ特異的及び非特異的エンドヌクレア
ーゼ／トポイソメラーゼについてスーパーコイルＤＮＡ
鋳型に対する活性ピークにわたる測定を行い、さらにＭ
１３ｓｓＯＮＡ及びｐＢＲ３２２フラグメントに対する
ヌクレアーゼの測定も行った。検出可能なヌクレアーゼ
を含有しない活性画分をプールし、そして銀染色５Ｏ３
−ＰＡＧＥ　ミニゲル上を泳動せしめた。この結果は、
約２５０．０００ユニツト／■の比活性を有する約８８
ｋｄの単一バンドを示す。
リメラーゼは、Ｔａｑエンドヌクレアーゼ活性及びＴａ
ｑエキソヌクレアーゼ活性により汚染されていないこと
が見出された。さらに、Ｔａｑポリメラーゼは好ましく
は、使用される各非イオン性洗剤約０．１〜約ｏ、　５
ｖ／ｖ％を含有する貯蔵緩衝液中に貯蔵される。さらに
好ましくは、貯蔵緩衝液は５０Ｖ／Ｖ％グリセロール、
１００ｍＭ　ＫＣｆ　、　　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｆｌ　（Ｉ）Ｈ８，０）、　０．１ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸（ＢＤＴＡ）、１ｍＭジチオスレイトール、０
．５ｖ／ｖ％ＮＰ−４０、０，５Ｖ／Ｖ％トウイー：／
２０及び２０Ｒ／−ゼラチンからなり、そして好ましく
は一２０℃で貯蔵される。
メラーゼを先行する例において記載したようにして貯蔵
のために製剤化した。但し、非イオン性ポリマー洗剤を
使用しなかった。その例において記載したようにして活
性を測定した場合、この酵素貯蔵混合物は不活性である
ことが見出された。貯蔵緩衝液にＮＰ−２０及びトウィ
ーン２０を添加した場合、十分な酵素活性が保存されて
おり、酵素製剤の安定のために非イオン性洗剤が必要で
あることが示された。
下記のバタテリオファージ及び細菌株がシタス・マスタ
ー・カルチュア・コレクション（Ｃｅｔｕｓ　Ｍａｓ−
ｔｅｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ＣｏｌｌＣｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ）（Ｃ、米国カリホルニア、エメリーピル、　　１４
００．　５３ストリート、及びアメリカン・タイプ・カ
ルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）、　　米国マリ−
ランド、ロックビル、　１２３０１パークラウンドライ
ブ、に寄託された。・これらの寄託は、特許手続のため
の微生物の寄託の国際的承認についてのブタペスト条約
及びそれに基く規則（ブタペスト条約〉の規定のもとに
行われた。
微生物　　ＣＭＣＣＮ住ＡＴＣＣＮα　寄託日ＣＨ３５
：　Ｔａｑ　＃　４−２　　３１２５　４０．３３６　
１９８７年５月２９日Ｅ、コリＤコリ８／ｐＦＣ８３３
１２８６７、４２２１９８７年５月２９日ヨ
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドＢＳＭ１３“中にサブクローニン
グされた約４．５ｋｂの旧ｎｄＩ［Ｔ、　　アクアチフ
スＤＮＡ挿入部を含有するプラスミドｐＦＣ８３の制限
地図である。 第２図は、グラスミ１８３Ｍ１３＋中にサブクローニン
グされた約２．８ｋｂの旧ｎｄ　ＩＩＩ　−Ａｓｐ７１
８　Ｔ、アクアチフスＤＮＡ挿入部を含有するプラスミ
ドｐＦＣ８５の制限地図である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １．１種又は複数種の非イオン性界面活性剤を含有する
    緩衝液中に熱安定性核酸ポリメラーゼを含んで成る安定
    な酵素組成物。 ２、前記非イオン性界面活性剤が１００〜２５０，００
    ０ダルトンの範囲の分子量を有するものである、請求項
    １に記載の組成物。 ３、前記非イオン性界面活性剤が４，０００〜２００，
    ０００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項２に記
    載の組成物。 ４、各界面活性剤が全組成物に対して０．１％〜０．５
    ％（体積／体積）の濃度で存在する、請求項１に記載の
    組成物。 ５、前記界面活性剤がポリオキシエチル化ソルビタンモ
    ノラウレート、エトキシル化ノニルフェノールエトキシ
    ル化脂肪アルコールエーテル及びラウリルエーテル、エ
    トキシル化アルキルフェノール、オクチルフェノキシポ
    リエトキシエタノール化合物、修飾オキシエチル化及び
    ／又はオキシプロピル化直鎖アルコール、ポリエチレン
    グリコールモノオレエート化合物、ポリソルベート化合
    物並びにフェノール性脂肪アルコールエーテル、並びに
    これらの組合せ、から成る群から選択されたものである
    、請求項１に記載の組成物。 ６、前記界面活性剤がポリオキシエチル化ソルビタンモ
    ノラウレート、エトキシル化ノニルフェノール、又はこ
    れらの組合せである、請求項５に記載の組成物。 ７、前記緩衝液が、グリセロール、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（
    ｐＨ８．０）、エチレンジアミン四酢酸、ジチオスレイ
    トール、ポリオキシエチル化ソルビタンモノラウレート
    、エトキシル化ノニルフェノール、及びゼラチンを含ん
    で成る、請求項１に記載の組成物。 ８、前記緩衝液が５０％（体積／体積）グリセロール、
    ２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍエ
    チレンジアミン四酢酸、１ｍＭジチオスレイトール、０
    ．５％（体積／体積）ポリオキシエチル化ソルビタンモ
    ノラウレート、０．５％（体積／体積）エトキシル化ノ
    ニルフェノール、及び２００μｇ／ｍｌゼラチンを含ん
    で成る、請求項７に記載の組成物。 ９、前記ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼで
    ある、請求項１に記載の組成物。 １０、前記緩衝液がｐＨ３．７〜９．５である、請求項
    １に記載の組成物。 １１、前記緩衝液がｐＨ４．０〜８．５である、請求項
    １０に記載の組成物。 １２、界面活性剤が０．１〜１．０％の濃度で存在する
    、請求項１１に記載の組成物。 １３、前記ＤＮＡポリメラーゼが、テルムス（Ｔｈｅｒ
    ｍｕｓ）属の種から由来するものである、請求項９に記
    載の組成物。 １４、前記の種が、テルムス・フラブス（￥Ｔｈｅｒｍ
    ｕｓ￥￥ｆｌａｖｕｓ￥）、テルムス・レベール（￥Ｔ
    ｈｅｒｍｕｓ￥￥ｒｕｂｅｒ￥）、テルムス・サーモフ
    ィルス（￥Ｔｈｅｒｍｕｓ￥￥ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ−￥
    ￥ｌｕｓ￥）、テルムス・アクアチクス（￥Ｔｈｅｒｍ
    ｕｓ￥￥ａｑｕａｔｉ￥−￥ｃｕｓ￥）、テルムス・ラ
    クテウス（￥Ｔｈｅｒｍｕｓ￥￥ｌａｃｔｅｕｓ￥）及
    びテルムス・ルペンス（￥Ｔｈｅｒｍｕｓ￥￥ｒｕｂｅ
    ｎｓ￥）から成る群から選択されたものである、請求項
    １３に記載の組成物。 １５、前記の種がテルムス・アクアチクス（￥Ｔｈｅｒ
    ｍｕｓ￥￥ａｑｕａｔｉｃｕｓ￥）である、請求項１４
    に記載の組成物。 １６、前記の種がテルムス・フラブス（￥Ｔｈｅｒｍｕ
    ｓ￥￥ｆｌａｖｕｓ￥）である請求項１４に記載の組成
    物。 １７、前記の種がテルムス・サーモフィルス（￥Ｔｈｅ
    ｒｍｕｓ￥￥ｔｈｅｒｍｏｈｉｌｕｓ￥）である、請求
    項１４に記載の組成物。
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