CN101151377B - 纳米-pcr:进行核酸扩增和检测的方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种不依赖于温度循环的核酸序列扩增的方法、装置及组合物，该方法不依赖于传统的台式温度循环装置。并且，通过在核酸上施加应力来可实现双链核酸的变性、引物退火及对聚合酶的引物延伸的精密控制。这些方法较之于传统PCR方法可以提供一个或多个优点，包括：对于PCR过程的精密控制；总体上得到改善的精确度；对问题序列的改善的精确性，例如GC-高含量区域或者串联重复区域；增加的序列长度；增加的反应产率；降低的实验时间；更高的效率；较为低的费用；更高的轻便性；对于温度、pH及离子强度等的多种环境参数的适应性。

Description

纳米-PCR:进行核酸扩增和检测的方法及装置

技术领域

本发明涉及一种核酸扩增及检测方法。本发明在特定的实施方案中公开一种用于聚合酶链式反应的改良方法、装置及材料。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)已成为扩增特定DNA序列或RNA序列的常用方法。1987年7月28日授予Mullis的美国专利第4683202号和1987年7月28日授予Mullis等人的美国专利第4683195号都公开了基本的PCR方法。PCR方法自问世以来，对生物技术及生物医学的发展赋予了深远的影响。之后授予的一千多件美国专利中都援引了选自上述专利中的一件或两件中所公开的内容。

通常，DNA序列扩增过程需要首先选择并获得与靶DNA序列末端相互补的两个寡核苷酸引物。将引物、聚合酶、四种常见脱氧核苷三磷酸的混合物、多种盐类及缓冲溶液与靶DNA混合。此后为了进行DNA变性，将其加热至大于大约90℃，由此将双链靶DNA分解为单链DNA模板。此后，通过将反应混合物的温度慢慢地冷却而降低至60℃以下，来使引物和DNA模板末端退火(即序列特异性杂交或结合)。之后，将温度提升至70℃以上进行复制，也称为引物延伸。此时，聚合酶将各自单链DNA作模板从3′至5′的方向解译码，且从引物的末端将互补序列合成于从5′至3′的方向。这完成了DNA扩增的一个循环，且产生了用于新的循环的起始材料。在由变性、引物退火及引物延伸构成的每一完整循环后，该方法产生了初始靶DNA序列的指数级增长(2ⁿ)的拷贝数。为开始新的循环，反应混合物再被加热至90℃以上，使双链产物分解为单链DNA模板。之后，重复引物退火及延伸步骤。

这一基本的PCR扩增方案以及各种扩展和改进方法使得许多不同的方法可以用于核酸的操作及检测，包括例如诊断分析及法医学分析的方法，而这些方法需要从小量的起始样品来产生阈值量的DNA。PCR的技术用于例如传染性疾病及遗传性疾病的监控、DNA及RNA测序、基因表达研究、药物开发和法医学上的指纹识别等区域。该技术已成为对病毒性病原体及细菌性病原体的检测、鉴定及定量分析的标准技术。几种基于PCR技术的诊断测验方法可用于如下多种病原体检测和/或定量分析。例如：引发AIDS的HIV-1；可引发肝癌的B型及C型肝炎病毒；可能引宫颈癌的人类乳头瘤病毒；小儿肺炎及支气管炎的主要发病原因的RSV；女性中可以引发骨盆炎疾病及不育症的沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)及淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoea)；引发移植患者及其它免疫受损患者生命受威胁的细胞巨化病毒；活性状态下引发咳嗽及疲倦，并使感染的器官不可逆转地受损伤的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。然后尽管满足了很多区域的需要，但现有的PCR及基于PCR的技术仍具有一些显著缺陷。

传统PCR及基于PCR的技术的缺陷

保真度：通常序列的准确度限制了传统的PCR。例如，通常用于DNA扩增的热稳定性聚合酶Taq，在进行PCR期间，将会产生1×10^-4个错误/碱基对的误差率。这意味着由400个碱基对构成的DNA序列的PCR扩增，在进行20个循环后，将会在PCR产物的所有分子中随机产生大概40000个误差。

对于困难的靶序列(例如，GC含量高的序列或重复序列)的精确性的要求更限制传统PCR及基于PCR的技术。Taq等通常聚合酶的误差率大多依赖于靶核苷酸序列。例如，当序列的G+C含量高时(例如，鸡的抗生物素蛋白基因5′调节区域中的序列)，使用Taq的PCR通常不是可行的方法。同样，简单重复序列例如三核苷酸的重复序列(AGC)_n或其它串联重复序列(A)_n将Taq的误差率可增加至每重复序列有1.5×10^-2个误差。请参照Shinde et al.，Nucleic AcidsResearch，31：974。因此，为具有更高的保真度(即更低的误差率)而对基因工程改造的聚合酶授予了种种专利。这些包括Hi-Fidelity及Phusion聚合酶。

长度的限制：扩增的靶序列长度也限制了现有PCR技术。一些报告报道了长度为10至20千碱基的序列的扩增，但这在通常的实践中很罕见而且很难进行。还有，长的靶模板的PCR扩增只在有限量的性能良好的DNA序列上可进行。在性能良好的序列上所进行的非常普遍且成本有效的DNA扩增的上限为大约300至400个碱基对的长度，对于G-C含量高的序列来说，其上限通常更低。

受限的扩增：现有的PCR技术还受限于反应混合物中可进行的扩增循环数。反复的加热及冷却循环逐渐导致酶的分解，这些将限制初始物质能够扩增的扩增系数。传统的PCR扩增极少超过30-35次循环。

适应性(robustness)：传统的PCR一般需要相当量的试剂、大体积的装置(例如，热循环仪)、相当高的劳动量(例如，繁琐的优化)及最小量的初始物质，这些中的每一个都使得传统的PCR成为费钱、费时间的过程。现有的PCR技术对通常的正常序列需要数小时、对复杂的序列或长的模板需要数日至数周。传统的PCR技术需要大量的时间进行循环和使反应混合物的温度平衡。另外，为可靠地扩增较不理想的靶序列，还需要进行耗时的优化过程。

为进行传统常PCR技术需要严格控制的条件(例如，温度、pH及缓冲溶液的成分)。另外，多种污染物对用于复制靶DNA或RNA的聚合酶，会直接抑制或妨碍，由此妨碍PCR的扩增。这些因素进一步限制用来扩增的初始物质的质量，对于进行扩增阶段之前通过DNA或RNA提取技术获得的纯度赋予了额外的要求。进行常规PCR的环境一般是实验室，在远距离场所、大夫诊疗室、患者的病床或在野外是几乎不可能进行。

诊断的灵敏度和特异性：基于PCR的诊断、法医学试剂盒及分析法的灵敏度取决于在PCR反应中能够达成的总体收率、精确度、适应性及靶序列长度。现有PCR性能参数里上述的限制因数限制了为正确地进行PCR扩增所需要的初始DNA或RNA的最小量。而这些又限制依赖于传统PCR或基于PCR的病原体检测系统、诊断或法医学试剂盒或分析法的灵敏度。基于PCR的诊断、法医学或病原体检测系统的特异性主要取决于DNA扩增及读取的准确度以及被准确扩增及确认的靶DNA或RNA的长度。

因为这些及其他因素，现有的基于PCR的技术及检测系统在总体速度、效率、费用-效果及用途范围中受到限制。因此，也有过对传统PCR及装置进行逐渐改进的提案，它涉及到所述性能参数中的部分内容。例如，Tso在2003年9月2日授予的美国专利第6613560号中公开了利用微量样品流体进行DNA扩增的PCR微反应器。也提到了高温DNA变性的替代方法。例如，Purvis在2001年9月18日授予的美国专利第6291185号中公开了一种双链核酸的电化学变性方法。Stanley在2001年3月6日授予的美国专利第6197508号中公开了另一种核酸的电化学变性方法。Dattagupta在2001年4月10日授予的美国专利第6214587号中公开了利用引物来从模板中置换出DNA链的方法。另外，Mullis(同上)曾经提出过使用解旋酶来分开DNA链的方法。

鉴于常规PCR所具备的这些限制，尽管有上述所提到的逐渐性改进方案，但在本发明的技术领域中仍存在对于核酸的扩增、操作、测序及检测的改进方法、装置及组合物的需求。

发明概述

本发明中记载的方法及装置提供进行PCR的突破性技术。本发明所述的技术也允许PCR不依赖于热循环而能够进行。本技术可适合于广泛的环境温度或使用受控的温度。根据需要，进行复制及扩增时可精确地进行控制，以此能够在许多性能参数上进行实质性的改进。点击“Nano-PCR^TM”，该技术在基于PCR的核酸检测及扩增中引入了典范。

附图说明

图1A及图1B表示不依赖于温度循环的PCR方法的代表性流程图。

图2A-图2C是表示固定于相对表面之间的DNA链上施加张力的代表性方法及反应盒元件的排列。

图3A及图3B是表示利用光阱或磁阱，在DNA链上施加张力的方法及反应盒元件的排列。

图4是表示在结合于固定在流体流中的基质上的聚合酶的DNA链上，施加张力的代表性方法及反应盒元件的排列。

图5A及图5B是表示在流体流中，被固定在一个末端的DNA链上施加张力的代表性方法及反应盒元件的排列。

图6A-图6C是表示在悬浮于流体速度梯度的DNA链上施加张力的代表性方法及反应盒元件的排列。

图7A及图7B是表示用于进行不依赖于温度循环或热变性的PCR方法的代表性装置概略图。

本发明实施方案详述

定义

术语“核酸”“多核苷酸”及“寡核苷酸”在本发明说明书中指任意长度的核苷酸的聚合体形式，包括但不限于核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语无意于区分长度的差别，且只用来指分子的一级结构。因此在某些实施方案中，这些用语可包含三链、双链、单链的DNA及三链、双链、单链的RNA。另外，还包括甲基化或帽化的多核苷酸修饰，或未修饰形式。具体来说，术语“核酸”“多核苷酸”及“寡核苷酸”包括，聚脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)；聚核糖核苷酸(包含D-核糖)；含有嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷的其他种类的多核苷酸及其它含有非核苷酸主链的聚合物，例如包含聚酰胺的其它聚合体(例如，肽核酸(PNA))及聚吗啉聚合体(例如，从Anti-Virals，Inc.Corvallis，Oreg.以Neugene购得)；以及其它得合成的序列特异性的核酸聚合物，前提是该聚合物含有的核碱基的构型允许碱基配对和碱基堆叠，如同在DNA和RNA中存在的。

本发明所述的“引物”指的是在适当的温度及适当缓冲溶液中于适当的条件(即4种不同的核苷三磷酸、用于聚合的试剂如DNA聚合酶或RNA聚合酶或逆转录酶存在下)下，可作为模板-引导的DNA合成的起始点的单链多核苷酸。引物的适当长度依赖于引物的应用目的，但一般由至少7个核苷酸构成的长度，通常由10个至30个核苷酸构成的长度。一些引物可以更长，例如可以由30至50个核苷酸构成。PCR引物通常为由20至30个碱基对构成的长度，并互补于位于靶序列的一条单链的上游部位(即5’—3’方向)及互补于与其相对的另一条链的下游部位(即3’—5’方向)。引物5’末端限定了扩增的PCR产物的末端。引物可包含与AT含量同样的GC含量，但不包含由一个碱基构成的长片段。另外，引物不可包含相互间实质性地互补的结构。由此将不会形成引物二聚体或另外的二级结构。短的引物分子通常为了与模板形成足够稳定的杂合复合物而需要更低的温度。引物没有必要反映模板的正确序列，但为与模板杂交而必须具有充分的互补性。所谓“引物位点”或“引物结合位点”是指引物所与之杂交的靶DNA的片段。所谓“引物对”是指包括与待扩增的DNA序列5’末端的互补链相杂交的5’“上游引物”以及与待扩增的序列3’末端相杂交的3’“下游引物”的一组引物。

本发明所述的“互补”是指一种核酸与另一种核酸分子相同或选择性杂交。当杂交比完全缺少特异性时更具有选择性时，将会存在选择性杂交。当在至少14-25个核苷酸的片段上存在至少大约55％的同一性，或至少65％、至少75％或至少90％的同一性时，通常会产生选择性杂交。在替代性的实施方案中，一种核酸特异地杂交于另一种核酸。请参照M.Kanehisa，Nucleic Acids Res.12：203(1984)。

“完全互补的”引物是指在引物的全长上完全互补并且没有错配。引物通常与靶序列的一部分(子序列)完全互补。所谓“错配”是指引物的核苷酸与比对的靶核酸的核苷酸之间不互补的位点。“显著互补”当用于指引物时，意味着该引物与其靶序列不是完全互补的，相反该引物只是在所需的引物结合位点与其相应链具有足够的互补性而能进行选择性的杂交。

本发明所述的“探针”是指能通过一种或多种化学结合，通常是通过互补碱基配对，尤其是通过氢键形成与互补序列的靶核酸结合形成双链结构的核酸。探针结合或杂交于“探针结合位点”。探针可以被可检测标记所标记，以容易地检测探针，特别是当探针与其互补靶标杂交后。可附着于探针的标记包括本领域已知可以被化学或物理手段检测的一系列不同探针中的任一种。例如，可附着于探针上的标记包括但不限于放射性同位元素、荧光团、发色团、金颗粒、量子点、质量标记、电子密集颗粒、磁性颗粒、自旋标记、可发射化学发光的分子、电化学活性分子、酶、辅因子、及酶底物。探针的大小可以显著不同。一些探针相对较短。通常探针长度至少为7至15个核苷酸。另一些探针的长度至少为20个、30个或40个核苷酸。还有另一些探针甚至更长，至少为50个、60个、70个、80个、90个核苷酸。有的甚至比这些还长，至少为100个、150个、200个或更多的核苷酸。探针可以具有上述长度范围内的任何特定长度。

“嗜热DNA聚合酶”为最佳工作温度超过40℃的热稳定性DNA聚合酶。通常对于“嗜热DNA聚合酶”的最佳工作温度范围为约50℃至80℃，或者是60℃至80℃。这种热稳定性酶在进行常规PCR期间，对加热及冷却酶的反复循环具有更好的适应性。

“困难序列”是指聚合酶具有在其上跳过、出错或停止作用的倾向的序列。困难序列包括，包含G和C比碱基对高于大约50％的几个残基的片(例如，6个、9个、12个、15个或30个碱基对或更多的片段)(称为富含GC的序列)；包含串联重复片段的序列；多聚重复序列例如poly-A序列；与亨廷顿病等特定疾病相关的序列中发现的三核苷酸重复区域及其它问题序列。

传统聚合酶链式反应(PCR)的综述

利用嗜热(即，热稳定性)DNA聚合酶进行标准热循环聚合酶链式反应时，通常经过如下几个步骤：1)在管里制备PCR缓冲液、dNTP混合物、引物对、DNA聚合酶及双蒸水的混合物；2)在上述管里添加待扩增的DNA；3)将上述管放置在热循环仪(例如，Perkin-Elmer^TM9600或9700PCR Thermal Cycler)的温度模块中；4)用要进行大约25次-30次循环的特定反应条件(例如，加热至90℃以上大约1-2分钟，进行双链DNA的热变性，慢慢冷却至50℃-65℃2分钟进行退火，加热至约70℃-75℃数分钟，进行所谓的引物延伸的聚合作用)设定热循环仪的条件。实施上述方法可以产生大约初始物质的2n倍扩增，其中n是进行扩增的总循环数。尽管常规PCR的一些缺陷来自于常规技术通常是怎样进行的，但是性能参数中的一些缺陷直接或间接地由于依赖温度循环而引发。例如，总体反应收率、扩增效率、灵敏度、适应性及轻便性均受温度循环的限制。Nano-PCR^TM方法不仅可以克服由于温度循环造成的缺陷，还可以克服传统PCR的典型实施中所固有的缺陷。

Nano-PCR^TM

Nano-PCR^TM方法及装置通过打破传统方法造成的种种缺陷，能够飞速扩大聚合酶链式反应的检测及扩增能力。表1比较了现有PCR和Nano-PCR^TM的典型性能参数。

表1：现有PCR和Nano-PCR^TM的性能参数

 

性能参数	现有PCR	Nano-PCRTM方法及装置
			精确度-正常序列	大约1×10-4个误差/碱基对的典型误差率。	大约1×10-7个误差/碱基对的误差率或更小。
复制问题序列(富含GC的序列或重复序列)时的精确度	大约1.5×10-2个误差/重复序列的典型误差率	通过精确控制复制过程，达到小于大约1.0×10-3个误差/重复序列的误差率
			扩增的序列的长度	通常限定在大约300-400个碱基对	可扩增多至20000个碱基对的序列
总体反应收率	试剂及聚合酶的降解通常将扩增限制在大约30-35个循环	试剂可承受多于100次个循环的DNA扩增
			费用	热循环仪一般为$4000以上	为进行Nano-PCRTM而可制造小型及比较廉价的装置
总体PCR反应时间	需要数小时至数日	可在1小时内完成
			轻便性	限定于实验室环境的试验台上的装置进行	可以在可携带的手提装置上进行
适应性	需要严格受控的运行条件，即温度、pH值。需要高纯度起始物质	可以改变温度及pH值、可以用广泛的起始物质来进行，对可能的污染物具有较好的耐受性，且为制备起始物质的提取方法不复杂
			灵敏度	通常需要1000个以上的多核苷酸/ml的分析物	需要10个以下的多核苷酸/ml的分析物
特异性	在诊断用试剂盒中，假阳性率可超过15％	在诊断用试剂盒中，假阳性率可低于12.5％。改良的特异性将会减少用于确认靶DNA或RNA序列的高费用事后处理及生物信息学步骤的必要性

迄今为止所进行的PCR及基于PCR的技术的共同点在于，用热循环仪依次进行DNA变性、引物退火、通过聚合酶的作用延伸引物。本发明中所述的点击(dubbed)Nano-PCR^TM方法和实施这些方法的装置对核酸分子施加受控量的压力或应力，从而为热循环仪提供一种替代手段，以进行DNA或RNA扩增。如本发明所示，对核酸施加应力包括，直接或间接对核酸施加具有使该核酸拉伸倾向的压力。例如，可以通过直接施用机械张力而将应力施加于核酸上，例如通过流体流中的流体动力学应力，或电磁场，直接作用在核酸分子上或作用于结合核酸的表面、基质、或颗粒等。在多种应用中，Nano-PCR^TM可以克服传统地限制常规PCR性能及范围的一个或多个缺陷。

机械张力的循环(Cycling of Mechanical Tension)

对核酸施加受控的张力不仅可以提供双链DNA(dsDNA)热变性的替代手段，也可提供精确控制PCR过程各个步骤的独特能力。通过对DNA/RNA分子或聚合酶施加精确受控的压力，例如机械应力、流体动力学应力或电磁场应力，Nano-PCR^TM提供了扩增DNA或RNA的新方法。

增加含有DNA分子的溶液的温度和增加对DNA分子的应力，均产生类似的结果。因此，聚合酶的反应循环可通过将施加于DNA模板上的张力增加至大于约65pN以进行DNA变性而得到实行。通过将作用于DNA模板的张力慢慢减少至低于约50pN以允许引物和模板退火，从而实现相应于引物退火的步骤。之后，在借助酶促聚合作用的引物延伸阶段，将施加于DNA模板上的张力在大约0至30pN内进行调整，以控制复制的进程、速度和/或准确度。如同常规PCR的热循环一样，Nano-PCR^TM方法中的应力循环也以以事前设计好的程序来循环。

在下面的实施例中，将阐述能够实施这些方法的多种形式。如同机械张力，施加于核酸分子上的流体动力学应力和/或电场也可进行循环以实施Nano-PCR^TM，而不依赖于热循环。当然，Nano-PCR^TM虽然不依赖于温度循环也照常进行，但这并不意味着温度循环对一些具体实施方案没有好处，如将在下面详细讨论的。图1A及图1B是Nano-PCR^TM的代表性流程图。可以适当地根据特定任务，例如测序、克隆、诱变、突变筛选及病原体检测等，对基本方案进行修饰和变化。

在室温及标准缓冲液的条件下，对双链DNA施加大于大约65pN的张力，则可以引发变性(即解链)为单链DNA(ssDNA)。本发明所述的“室温”是指正常范围的舒适实验室温度，一般为20℃-22℃。在室温下对DNA的力诱导的解链的理论模型已被Ioulia Rouzina及Victor A.Bloomfield描述(“Force-Induced Melting of the DNADouble Helix1.Thermodynamic Analysis”Biophys J.，80：882-93，2001；及，“Force-Induced Melting of the DNA Double Helix.2.Effect of Solution Conditions”Biophys J.，80：894-900，2001)。本发明所属领域的技术人员，通过此处所述的Rouzina及Bloomfielding的公式，可以确定使引物解链所需的张力的精确水平，这类似于传统解链点温度计算法。

在引物寡核苷酸存在下将所用的张力慢慢减少至大约65pN以下，则可以使引物选择性地结合于模板DNA，其类似于在热循环仪中将变性的DNA缓慢降温至低于引物的解链温度。因此，在引物退火步骤期间，能够将作用于核酸模板的张力从引发dsDNA解链所需量减少至引物退火所需量。另外，也希望使作用于DNA链的张力维持在能显著地抑制聚合酶作用的水平，例如在大约30pN或更大，但低于大约50pN，直到未结合的引物从反应室中冲走，以使非特异性结合及非特异性引物延伸最小化。

通过将介于大约0至大约30或35pN的张力利用于核酸模板，可以减少聚合酶的活性速度。酶的确切速度依赖于多种因素，包括聚合酶或核苷三磷酸底物的环境温度或环境浓度。在室温中大于大约35-45pN的张力促使对聚合酶的核酸外切酶的活性进行校对。

Nano-PCR^TM的实施性实施方案包括：(a)提供包含靶序列的双链DNA(dsDNA)的样品、一个或多个寡核苷酸引物(例如：与靶序列及其互补链的的3’末端互补的引物对)、至少4种不同的核苷三磷酸(即ATP、CTP、GPT、TTP)及DNA聚合酶；(b)使用非热驱动的方法，例如对dsDNA施加足以使dsDNA解链的张力(例如大于大约65pN的张力)，将dsDNA变性成单链DNA(ssDNA)模板链；(c)控制上述非热驱动的退火方法，促进引物与互补的模板链的杂交，例如，当用张力使dsDNA变性时，减少作用于ssDNA的张力。(d)允许DNAp延伸引物以形成dsDNA；(e)反复进行步骤(b-d)直至获得所需量的DNA扩增。

本说明书所记载的方法中，“非热驱动的方法”是指，dsDNA的变性不单单是通过将温度增加到dsDNA的解链温度以上来实现，而是通过将不依赖于温度的物理或机械力作用于核酸来实现。非热驱动的方法可包括对DNA链施加张力，例如，通过直接施加机械力量、通过流体流动、通过施加电场，和/或通过一种或多种变性剂的作用。如本说明书所述，这种力量的效果可能会受到温度的影响，从而需要在给定的情况下在上述方法的一个或多个阶段中控制并可选地调节温度。

需要扩增的靶序列可包含在分离的DNA或核酸混合物中，也可以包含在长度相同或不相同的互补链中。方法还可以包含：以包含RNA的组合物开始，及利用逆转录酶或类似的方法生成DNA模板。或者靶序列可以以单链核酸的形式提供，从而在第一个循环中不需要步骤(b)。步骤(a)的反应成分可在方法开始时进行组合，或根据需要分开导入。可选地，在某些步骤中可将反应组分从反应室中除去。例如，三磷酸核苷(NTPs)可在步骤(d)之中或之前导入，引物可在步骤(c)之中或之前导入，而没有结合的引物可在引物延伸(复制)步骤之前从室中冲走。而且，在本方法的多种实施方案中，约0-45pN、约0-35pN，或约0-20pN范围的张力可在步骤(d)施加于模板DNA链。在这种实施方案中，步骤(d)中施加于模板链的张力量可根据时间发生变化。步骤(d)中，施加于模板链的张力量，可根据聚合酶的已知或推测的进行状况以及困难子序列或易错子序列例如G-C高含量片段(例如，包含约50％以上的G-C碱基对或70％以上的G-C碱基对的片段)的位置或包含重复序列的片段的位置，而发生变化。

对正常序列及“困难”序列的Nano-PCR^TM的精确度

引物延伸步骤中，对模板DNA施加张力的情况下，可以诱导聚合酶成“相反方向”，且聚合酶的外切核酸酶活性占优势。在原子水平及单一聚合酶/外切核酸酶步骤级别的时间中，可理解该方法是随机的。但是从多个步骤的时间规模的平均角度考虑，施加的张力在所处的温度及溶液条件下大于理论上可预测的阈值时，聚合酶会持续显示外切核酸酶活性。

通过在引物延伸步骤中给模板DNA施加受控量的张力(所述量低于聚合酶的外切核酸酶活性占优势所需阈值，例如，在室温及正常的PCR溶液条件下，低于约35至45pN，最好在约10至30pN范围)，从而Nano-PCR^TM可提供与传统的PCR相比，显著增加的DNA复制准确度。而且，这种效果也可在难以使用传统PCR方法的子序列上取得。对于包含或多或少问题片段的混合物的模板，其引物延伸过程中，施加于模板DNA链的张力量可在约0至45pN、约0至35pN，或约0至20pN的范围内进行调整。例如，根据序列图，如有必要，可以将张力增加至约35pN以下水平以促进对困难区域的准确度，之后，小心地降低张力以允许更快地通过问题较少的区域。模板链的长度在引物延伸过程内产生变化。本方法的一些变更中，作为对模板链长度变化的直接响应，可以调整对模板的张力，从而使可根据聚合反应的进程及“困难”子序列的特定位置，准确校正所施加的张力。在无法直接监测聚合酶反应进程的实施方案中，聚合酶的位置可根据施加的张力量下聚合酶的已知复制速度乘以经过的时间来进行推测。

因此，Nano-PCR^TM与传统的PCR相比，以显著提高的准确度，可以对正常的靶模板及困难序列(例如，GC-高含量DNA、串联重复序列、微卫星或三核苷酸重复DNA)进行准确的复制和扩增。例如，当目前可得的保真度最高的聚合酶之一(例如，Phusion Enzyme)用于传统的热驱动PCR中时，在较好的情况中观察到了大约4.0x10^-7个误差/碱基对的误差率。与此相反，本说明书所述的Nano-PCR^TM方法显示出小于约1.0x10^-7个误差/碱基对的误差率、小于5.0x10^-8个误差/碱基对的误差率、1.0x10^-8个误差/碱基对的误差率、5.0x10^-9个误差/碱基对的误差率、1.0x10^-9个误差/碱基对的误差率、5.0x10^-10个误差/碱基对的误差率，甚至可能产生1.0x10^-10个误差/碱基对的误差率。而且，本说明书所述的方法可以实现高于50％、60％、70％、75％、80％，或甚至85％的GC含量的寡核苷酸片段的有效扩增。

特定情况下，寡核苷酸片段包含长度至少8个碱基的重复碱基对单位的片段(例如，AAAAAAAA，GCGCGCGC)。传统的PCR的误差率在这种情况下会增加，通常接近1.0x10^-2个误差/碱基对的误差率。本发明所提出的Nano-PCR^TM方法，以小于约1.0x10^-3个误差/碱基对的误差率，提供重复碱基对单位的扩增。特定条件下，可能产生小于1.0x10^-4个误差/碱基对，1.0x10^-5个误差/碱基对，1.0x10^-6个误差/碱基对，或1.0x10^-7个误差/碱基对的误差率。在重复碱基对单位长度至少为10个碱基对，至少15个碱基对，或至少20个碱基对的情况下，也可获得这种低误差率。本说明书所述的方法中，这种结果也可在微卫星区域、聚合酶滑动区域及其它串联重复区域上获得，在进行传统PCR时，这些区域是困难区域。

扩增效率

当扩增效率定义公式为N₁＝N₂(1+Y)ⁿ，N₁是产物拷贝数量，N₂是模板寡核苷酸拷贝数量，n是循环次数，Y是效率时，可实现80％以上的效率。特定条件下，还能实现高于85％、90％、95％、96％、97％、98％或甚至高于99％的扩增效率。在寡核苷酸片段的GC含量高于55％、60％、65％、70％，或甚至高于75％的情况下，也能取得这种扩增效率。寡核苷酸片段的GC含量高于50％、55％、60％、65％，或高于70％的情况下，可实现高于50％的扩增效率。也可取得高于60％、70％、80％、90％、95％、97％，或甚至高于99％的效率。传统的PCR中，这些GC高含量区域在添加各种变性剂的情况下才得以扩增和测序，这些变性剂包括但不限于氢氧化钠、TMA氯化物、TMA草酸盐、TMA醋酸盐、TMA硫酸氢盐、氯化铵、苄基二甲基十六烷基氯化铵、HTA溴化物、HTA草酸盐、甜菜碱一水合物、DMSO、甲酰胺等。在Nano-PCR^TM的某些特定实施方案中，在缺少这样的聚合酶链式反应添加剂的情况下，利用本说明书所述的方法也可观察到有效的扩增。

适应性和适用性

传统的PCR通常依赖于对于温度的准确控制及循环。而且，传统的PCR方法还可需要其它因数，例如多种变性剂及繁琐的优化。但是如本说明书所述，使用张力循环以驱动扩增，获得了比单纯热循环所能允许的对PCR方法的更高程度的精确控制。而且，本说明书所述的方法可在较宽的温度条件范围内进行，仅受某些因数的限制，例如所选的聚合酶起作用的温度范围及在给定张力下引物/模板的解链温度。

当然，温度可对张力条件下聚合酶的反应速度及准确度及DNA的解链产生影响。通常，解链dsDNA所需的张力量随着温度的提高而减少。粗略地计算，解链dsDNA需要约0至20℃的温度、至多约75pN的张力。约在60℃温度条件下，使dsDNA变性所需的张力量可能为约45pN。在温度刚低于自由DNA解链点时，解链张力减少至约7pN。

虽然通常并不需要，但是根据个别应用地需要，在本方法的一个或多个步骤中，控制温度将会是有利的。例如，维持反应混合物的温度在某一温度，所述温度能优化所选DNA聚合酶的准确度、聚合速度和/或张力响应，增加或减少实现DNA解链所需的张力量，或因个别装置及工作环境而有利。如果没有特别要求，温度通常都会保持恒定，全部过程可在正常的室温或其附近进行。如果没有特别注明，本说明书所涉及的实施例都利用适合室温的张力量进行。所属领域的技术人员根据较高或较低的温度，能够容易地控制施加于DNA模板的张力。

通过施加少量的张力，热循环温度将不再限制进行PCR反应所需的温度。例如，通过施加约7至45pN的张力，可将双链DNA变性的温度降低最多约30℃。通过调整施加于DNA的张力量，可在远远低于传统的PCR中为了变性而所需的温度下进行PCR。这种效果可以允许使用低幅度的热循环仪进行PCR。例如，该方法可包含变性步骤，其中施加低于约65pN的力量，溶液温度上升至大约90℃以下，或者上升至大约80℃以下。

本说明书所述的方法及装置可在90℃以下的温度实施或操作。例如，寡核苷酸变性步骤可在低于80℃、70℃、60℃、50℃、40℃、30℃或甚至25℃下进行。退火步骤可在低于50℃、45℃、40℃、35℃、30℃或甚至25℃进行。而且，聚合步骤可在低于70℃、60℃、50℃、40℃、30℃或甚至25℃下进行。

同样，浸有DNA的溶液的pH值及离子强度可能会影响DNA的张力诱导的解链曲线。因此，本方法通过调整施加于DNA的力量的强度，使Nano-PCR^TM与传统的PCR相比，可利用更广泛的溶液的pH值及离子强度条件进行PCR。同样，所有这些和其它参数都会对引物延伸的张力控制产生影响。本说明书所述的方法可以为实现这些效果而进行调整，甚至可利用这些效果。因此，Nano-PCR^TM通常对较广泛的温度、离子强度、pH值及缓冲溶液的条件比较适应，这意味着，Nano-PCR^TM可在广泛的条件下进行，而且对DNA或RNA的提取及纯化要求不严格，而且对通常限制传统的PCR范围的多种污染物及酶抑制剂具有较大的抗性。在优选实施方案中，污染物质的存在可通过冲洗试剂的方式除去，这是Nano-PCR^TM方法的一部分。例如，包含污染物的未净化的DNA试剂可能会引入Nano-PCR^TM装置内，其DNA会留在反应室内，例如通过此处描述的用于保留DNA进行应力的受控施加的任何手段。污染物从反应室内以冲洗方式除去，而试剂以冲洗方式供应至反应室内。这对Nano-PCR^TM过程提供显著的适应性，而且在不利于传统的PCR的环境下，也可以实现迅速而准确的扩增。

直接施加机械力量的Nano-PCR^TM

Nano-PCR^TM可以用多种方法进行，以直接将机械张力施加于DNA链，该方法作为非热驱动的方法，能使DNA变性和/或精确控制DNA聚合酶的活性。对双链寡核苷酸施加张力，有多种不同的方法。例如，DNA链可以阵列方式锚定于可移动的元件、单独可控制的元件、或可操纵的颗粒之上。

利用相对且包被的表面

例如，如图2A-图2C所示，利用相对且包被的表面上锚定的核酸来进行所述方法。通过将第一复合分子(例如，链霉抗生物素)201、207(其对于每个表面可以相同也可以不同)附着于两个基质表面(203、209)来制备包被的表面。被包被的基质表面以适当的距离互相相对排列。双链核酸205固定于包被的表面上，所述双链核酸205的一条链的两端包含与第一复合分子互补的复合分子(例如生物素)，该复合分子能识别和结合所述第一复合分子。通过增加被包被的表面之间的距离，或将包被的表面之一或两者横向平移，对固定的核酸的末端施加力量。例如，基质之一或两者都是可移动的元件或包含可移动的元件，例如压电元件。可以将足以导致双链DNA解链的张力(例如，室温下超过大约65pN)施加于核酸，可产生锚定链和自由链。锚定链和自由链都可以利用适当的引物及聚合酶进行复制。优选地，可冲洗除去自由链并收集之，使得只复制锚定链。可以在复制期间控制相对表面的位置，以调节施加于锚定模板链的张力量。根据需要，可重复所述循环。

利用相对且包被的表面(215、217)的方法的装置的变更中，一个表面或两个表面也可排列形成单个可移动元件(219)的阵列，如图2C所示，各元件都可以通过可编程的处理器驱动的控制电路进行个别控制。所述的控制电路可包括向处理器报告力量和/或位移参数的反馈通道。可利用印刷或平版印刷技术设计位点以将分子锚定于表面。执行上述方法的装置还可包含：向室内输入试剂的通道，或包含上述被包被的表面的通道，及单独或组合递送试剂并传达(可选地存储)的仪器，及回收反应产物的仪器。将核酸固定于表面的大量合适的方法是已知的，包括但不限于共价键合、抗原-抗体，及链霉抗生物素-生物素。

可以排列流体流以在相对的表面之间定向和延伸DNA链。例如，如图2B所示，DNA可锚定表面213的一端，该表面213具有流体流的通道分布于锚定位置之间。流体通过这些通道流动，可以将DNA链或多或少均匀定向和延伸于所需的方向，例如，朝向相对的表面211或可移动元件的阵列，其可在锚定表面之间具有通道以接受流体流。因此，本方法可包含：DNA链锚定于第一表面、使流体通过第一表面的开口部流向并通过相对于上述第一表面的第二表面的开口部，及锚定DNA在流体流中定向于第二表面。

为了使每个循环增加锚定链的数量，可使用可活化引物来复制附着的链。“可活化引物”包含可以被化学或物理方法活化的化学部分。这些“可活性基团”是惰性的，直至被活化，例如，利用适当波长的激光进行光活化。本发明所属的技术领域已知许多不同的可活化化学基团，它们可以转化或解封闭而成为功能性复合基团。本方法的变体中，可活化引物可退火至锚定的单链核酸。进行引物延伸及片段复制。通过施加压力于模板链，使所得的双链核酸变性。自由拷贝链将会包含引物的可活化基团。活化能使拷贝链固定于相对的包被表面上。这一循环可重复直至取得所需水准的扩增为止。如果需要，可释放锚定的核酸，例如通过使用识别核酸的锚定末端附近的序列的限制酶，或者识别用引物引入至拷贝的核酸末端的序列的限制酶。

利用光阱或磁阱

对DNA直接施加张力的其它方法可利用光学镊子或磁力镊子或其他阱以操纵DNA所锚定的颗粒。光学镊子利用光强梯度产生的力量捕获颗粒。因光电场而极化的介电颗粒通过梯度引向最亮的点。与此相反，反射性、吸收性低介电颗粒因辐射压被推向最暗的点。还可通过将具有合适形状的波前的激光束带至数值孔径透镜的密集焦点(tightfocus)，而获得足以形成三维阱的光产生的力。图3A表示通过激光束303焦点处的珠301之间延伸的DNA链。如图3B所示，可利用光学镊子的陈列307操作大量颗粒。可购买得到的光学镊子陈列包括Arryx，Inc.生产的陈列。光学镊子陈列的其它例子参见E.R.Dufresne和D.G.Grier，Rev.Sci.Instr.69：1974(1998)；及美国专利第6055106号(2000)。光学镊子陈列可包含大约10³、10⁴、10⁵、10⁶，或更多的成双的光学镊子或磁力镊子。

利用光学镊子或磁力镊子进行的扩增通常可以如下方式进行：核酸在流体介质中固定于适当颗粒的各末端。颗粒可改造成利用光阱或磁阱进行操作。通过将压力(例如，光学力量或磁力)施加于颗粒，而将足以使dsDNA变性的张力，例如大于约65pN的张力施加于寡核苷酸，从而产生核酸变性。张力可在引物存在的情况下减少，以使引物和核酸退火。通过DNA聚合酶进行的聚合作用可通过进一步缓和张力而起始。为重复循环，可增加张力使产生的双链核酸变性。本发明的变体中，以核酸的一端锚定于流体流中捕获(例如通过磁场)的珠上。流体的流速可用于控制对核酸的张力。

可以从单个靶分子开始，并依次用拷贝链组装成阵列。拷贝链可利用可活化引物锚定于新珠上。新珠可邻近于拷贝链。或者，具有预固定的引物的珠可以在变性步骤中邻近于拷贝的链。通过这种方式对珠的操作可选择性地可通过可编程的处理器进行自动控制。

利用流体动力学应力的Nano-PCR^TM

Nano-PCR^TM可利用在受控制的流体流中，通过流体动力学应力将张力施加于DNA的方式进行。利用这种方式的方法可以在微流体装置上进行，该装置为试验台装置，或者其尺寸可以减少至手提大小，例如可以整合到手提装置中。以受控的流体流，通过流体动力学应力将张力施加于DNA的Nano-PCR^TM方法，可利用受控制的流体流动速度的任意排列完成。

利用锚定的DNA聚合酶：利用固定于装置表面的聚合酶的Nano-PCR^TM方法包含如下步骤。聚合酶固定于表面上，所述表面使得流体以受控制的速度流过。例如，包被第一复合部分的通道或室的表面可用于固定DNA聚合酶，所述DNA聚合酶已经过修饰以包含第二复合部分。实例性的复合部分包括抗原-抗体、组氨酸-Ni-NTA或生物素-链霉抗生物素对。靶dsDNA在引物存在的情况下变性，例如，dsDNA和引物可以接受一定的流体流速，从而使得足以导致dsDNA解链的力量(例如，大于约65pN的力量)施加于dsDNA。可通过降低流速的方式形成聚合酶/核苷酸/引物的复合体。引物延伸及片段复制可通过进一步减少流速的方式促进。包含模板及拷贝链的双链核酸产物可通过施加增加的流速来变性，而且可重复循环至取得所需水平的扩增为止。这种方法中，聚合酶可固定于微通道上，例如，微流体“芯片实验室”型装置的微通道。

在用于实施利用一个或多个被包被的表面上锚定的聚合酶的方法的装置变体中，这种装置也可包含：将试剂引入反应室或通道中，所述反应室或通道包含包被的表面，及单独或组合递送试剂，并选择性地储存试剂及回收反应产物的仪器。

在本发明所属的技术领域已知的印刷或平版印刷技术可用于在锚定分子上设计位点。这种装置包含在反应室或通道中产生和控制流体流的仪器。可利用产生和控制流体流的任意合适的方法，包括电动方法、泵及注射仪器。试剂溶液可选择性地可通过反应室进行再循环。

图4示例了一种方法，其中聚合酶401锚固定于基质407，例如，通过链霉抗生物素结合等方式。DNA链403可结合于锚定的聚合酶上。流过基质407上的受控制的流体流409以流体动力学应力的形式将伸展力施加于DNA链。如上所述，可利用图1所示的一般方案，通过施加压力进行Nano-PCR。

利用受控制的流体流中的锚定DNA链：对核酸施加张力的另一个方法涉及固定于受控制的流体流中的核酸。本方法通常以如下方式进行：将核酸固定在包被的表面上，所述核酸在一个末端包含可识别并结合包被于表面上的第二复合部分第一复合部分。流体流过表面，从而使得足以导致dsDNA解链的力量(例如，大于约65pN的力量)施加于锚定的双链核酸，产生链分离。DNA聚合酶及引物(可选择的是包含可活化基团的引物)以降低的流速冲洗表面。降低或中断的流速可以形成聚合酶/核苷酸/引物复合体。引物延伸及片段复制通过流速的进一步降低或中断而在NTP存在的情况下得以促进。复制后，流速可增加，使dsDNA接受压力，从而使得dsDNA变性。利用可活化引物的情况下，延伸的引物可以活化。这些活化的延伸引物可结合于包被的表面，而且重复循环直至获得所需水准的扩增为止。在此类方法中，聚合酶可固定于微通道的表面，例如，微流体“实验室芯片”型装置的微通道上。

图5表明流体动力学应力对流体流中的DNA的拉伸，其中DNA链503通过锚定分子501锚定于基质507。以方向509流动的流体以受控的方式使DNA延伸，其是流体流速的函数。图5B显示一种变体方法，其中DNA链503通过结合分子501锚定于多个基质结构505上，从而使得流体在结构之间以受控的速度流动。应理解，还有许多其它方法可以用于获得类似的结果。

实施利用一个或多个被包被的表面上的锚定核酸的方法的装置的变更中，这种装置也可包含：用于将试剂引入反应室或通道内的通道，所述反应室或通道包含包被的表面及单独或组合递送试剂并选择性地存储试剂及回收反应产物的仪器。本发明所属的技术领域已知的印刷或平版印刷技术可用为在锚定分子设计位点。这种装置可包含在反应室或通道内用于产生并控制流体流的仪器。可利用产生和控制流体流的任意的合适方法。例如，通过泵可以产生流动，或通过静电驱动。试剂溶液可选择性地通过反应室进行再循环。

速度梯度中，利用流体动力学应力聚焦使DNA延伸：利用流体流施加张力的其它方式可与上述方法组合使用，或可形成不同方法的基础。DNA可在具有速度梯度的流体中延伸。图6A-图6C显示流体动力学应力聚焦及对传播延伸流的多种示例性实施方案。

例如，Wong等人分析了多种此类技术的基础，并说明了一种流体动力学应力聚焦的方法(Wong et al.，“Deformation of DNA moleculesby hydrodynamic focusing.”J.Fluid Mech.497：55-65，2003)。如图6A所示，流体动力学应力聚焦中，以相对较高速度流动的缓冲溶液607的两股分流在微通道605中与低速引入的中央流汇聚。汇聚的流体加速了中央流，而没有进行实质性混合。其结果是产生了在流动方向具有强速度梯度的流动区域。该梯度内的DNA601被拉长形成伸展的状态。通过进一步增加汇聚的流体的流速，就可以使dsDNA变性，从而使ssDNA从微通道中释放。这还能使ssDNA递送至反应室，例如，已锚定了聚合酶的反应室。

可利用滞止流以捕获核酸并对核酸提供张力，而无需任何锚定。Perkins等人记述了在平面拉伸流仪器中拉伸DNA的方法(“SinglePolymer Dynamics in an Elongation Flow”Science，276：2016-21，1997)。Perkins所述的仪器中，如图6C所示，流体623从反方向流入T形接合部625。上述接合部的中央，设立有滞止点629。此点的外部，建立有流体速度梯度。DNA601捕获于所述滞止点，被速度梯度在相对方向同等拉伸。其它安排例如图6B所示的通道615包括进入通道615的流体偏移射流(offset jets)617，或者以相反方向流过含有核酸的槽的流动的缓冲液。

利用所施加电场的循环的Nano-PCR^TM方法

Nano-PCR^TM方法中，可通过利用电场及磁场对DNA链施加力量。可通过多种方式实现这种目标。例如，电场可用于在微流体装置中驱动流体流动，而间接对DNA施加力量。如上所述，流体流可用于对DNA施加流体动力学应力，例如，锚定于表面和/或颗粒的DNA，或与锚定于表面的DNA聚合酶相结合的DNA。电泳力可直接对DNA链施加力量。

电场也可用于操作结合于传导性颗粒的DNA链。因此，可进行Nano-PCR^TM方法，其中变性、退火和/或引物延伸步骤受到非热驱动方法的控制，其中DNA链的一端或两端结合于传导性颗粒，例如金纳米颗粒等，这些颗粒能够被电场操作以向所述DNA链提供张力。DNA分子的一端附着于传导性颗粒的情况下，另一末端可锚定于装置内的反应室表面。如本说明书所述，这种方法可利用可活化引物以锚定各循环所生成的DNA链。

Nano-PCR^TM方法的示例性应用

Nano-PCR^TM方法可用在病原体及生物武器检测所用的试剂盒及系统。这种病原体包括但不限于：腺伴随病毒(AAV)、腺病毒、细胞巨化病毒(CMV)、EB病毒、肠道病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类疱疹病毒6型(HHV-6)、人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人类免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、单纯疱疹病毒1型及2型(HSV-1和HSV-2)、人类T细胞嗜淋巴性病毒I型与II型(HTLV-I和HTLV-II)、结核分枝杆菌、支原体、细小病毒B-19、呼吸道合胞病毒(RSV)、猪内源性逆转录病毒(PERV)。Nano-PCR^TM方法可在任何环境下用于检测任何病原体，因为这些方法可提供增加的灵敏度、准确度及适应性。

基于常规PCR诊断法对特定病原体的检测及鉴定，一般要求病原生物或其多核苷酸应该以特定阈值浓度存在于生物流体之中(例如，血液，唾液等)。例如，据报道结核分枝杆菌的检测下限为7.5x10³个生物/ml。HCV RNA可在100至1000个分子/ml范围内进行检测。Shim报道了，聚合酶链式反应可以检测出已证明的含有结核分枝杆菌的节结(nodule)的约87.5％。该数据相当于12.5％的检测假阴性。在优选的实施方案中，Nano-PCR^TM方法可用于检测病原体，例如上面所述的，其假阴性率一般小于12.5％、10％、5％、2.5％、1％、0.5％、0.25％，或者0.1％。

而且，可以进行Nano-PCR^TM，使得其不象传统PCR一样受限于约30-35次循环。这是因为DNA重复加热超过DNA解链温度后造成聚合酶降解。与此相反，Nano-PCR^TM方法可以可选择性的包括40次，50次，60次，70次，100次，或者更多的循环。因为Nano-PCR^TM可以在等温方式或低幅温度变化下进行，所以Nano-PCR^TM可以重复许多个循环，仅受酶寿命的限制(例如在室温)。

因此，Nano-PCR^TM可以扩增的起始材料(生物或其DNA或RNA)的量显著低于传统PCR所要求的量。Nano-PCR^TM方法可检测并可靠地扩增少至一个分子的DNA或RNA，并且大大减少假阴性率，且提供增加至100％的灵敏度。对于如前所述的病原体，生物或者多核苷酸可在不足1000个生物或多核苷酸/ml、100个生物或多核苷酸/ml、50个生物或多核苷酸/ml、25个生物或多核苷酸/ml、10个生物或多核苷酸/ml、5个生物或多核苷酸/ml，甚至1个生物或多核苷酸/ml的浓度中被检测出。

本方法的代表性的变体可用于检测样品中至少一个特定DNA序列的存在与否或区分两个不同的DNA序列。该变体中，靶DNA可如上所述进行扩增。本方法还可包括：将扩增的DNA与探针(例如，与待检测序列有互补性，并包含可检测部分例如荧光标记的寡核苷酸)接触；以及，通过观察与扩增的DNA结合的探针存在与否来检测样品内特定DNA序列的存在与否，或通过检测多个探针当中哪个探针与扩增的DNA结合来区分两个不同的序列。

本方法的又一种变体可用于扩增和/或检测RNA编码的序列。靶序列可编码于分离的RNA或核酸混合物中的RNA。本方法可包括：从样品(例如，组织或流体)中分离RNA；进行逆转录获得相应的cDNA；以及，如上所述扩增靶序列。这些方法可进一步包括如上所述检测样品中特定序列是否存在。

本发明方法的另一变体可利用于对DNA进行测序。这样的方法可选择性的包括，如前所述的DNA扩增步骤及上述DNA的测序步骤。DNA的测序包括：(a)提供包含靶序列的dsDNA样品，该样品分成四个平行反应物，向各个平行反应物提供与靶序列的3’末端互补的引物；提供4种不同的核苷三磷酸(即，ATP，CTP，GTP，TTP)；以可检测的化学部分例如荧光部分可选择地标记选自ddATP、ddCTP、ddGTP及ddTTP的不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)及DNA聚合酶；(b)使用非热驱动的方法，例如，向dsDNA施加足以使dsDNA解链的张力(例如，大于约65pN的力)，从而将dsDNA变性成ssDNA模板链；(c)控制非热驱动的方法以促进引物与互补性模板链的杂交，例如：当为了变性dsDNA使用张力时，通过减少施加于ssDNA的张力；(d)允许DNAp延伸引物以形成dsDNA；(e)可选地重复上述(b-d)的步骤，直至获得所需量的DNA序列扩增，以及通过确定上述反应中产生的各核苷涮的长度，或通过检测碱基特异性荧光部分或一些其它的碱基特异性信号(如同在各种单分子测序方案中的一样)来确定序列。

Nano-PCR^TM装置

为实行本说明书中所述的非热驱动的聚合酶链式反应，可以使用许多不同的装置种类及构造。一种这样的装置是微流体装置，其中所述装置的微流体通道中的流体流速是可控制和可变的。在优选的实施方案中，装置具有反应室，该反应室可以是通道、排列的通道、或密封的空间。反应室一般包括保留核酸的手段及对保留在其中的核酸施加应力或张力的手段。因此，用于实施此处所述任一方法的部件可以包括通道和封闭的空间的组合，其中具有能结合核酸或复合分子(能结合其互补的复合分子)的颗粒；带有复合分子的表面；可移动元件；指导流体流向和形成速度梯度的通道；泵；阀门；膜等。室可包括光学透明的窗口，例如，如果使利用光学显微操纵器(opticalmicromanipulator)。装置可以作为能整合入在手提式单位的微流体装置而制造。根据需要，Nano-PCR^TM可在不足1uL，例如约50-1000nL，优选约100-500nL的溶液体积下进行。

作为一个例子，图7A表示了一种可能的装置构造，其中试剂可通过入口701、707及715导入。可提供一个或多个储存室705、711以容纳制备的缓冲溶液、双脱氧核苷三磷酸、聚合酶等。阀门703、709、717及718可包括一个或多个流体门，以在通道间的连接部位控制流体流速。如图2-6所表示，反应室715可设计成允许对其内部的核酸分子施加受控的张力。可选择性的提供通道721及泵723，以允许试剂再循环及通过盒715的流速得到控制。泵723可根据本发明技术领域所已知的任意适合的机制进行操作，例如，蠕动泵；使用一个或多个风箱(bellow)或活塞的泵；使用电动压力，以及这些装置的组合及变体等。当不需要再循环时，流体可在室715之内或之外收到控制，例如，通过安装在入口和/或出口701及719的注射器来控制。在图7B中表示了使用环型或大略环型的通道结构的微流体装置示例。入口751将试剂直接引入给反应室763供料的室，或引入一个或多个储藏室753、754用于以后使用。阀门755、757及759控制往反应通道中的流入及流出。泵761可通过蠕动作用控制通道763中的流体流速，例如以顺次的受控方式，将一个或多个阀门偏转至通道763，或者通过电动力或微流体学领域公认的任意其他手段。例如，可以用阀门和蠕动泵构建装置，其包含由弹性聚合物构建的结构，可以以受控的顺序偏转入装置的通道中以控制流速，如国际公开的PCT申请WO/02081729中所记载。

图7B所示装置的操作，可通过在非热驱动的聚合酶链式反应期间的操作来得以理解。在核酸扩增反应的特定情况中，含有或可能含有靶核酸的样品通过入口751导流入环763。在一些实例中，如图4-图5所示，环763的一个或多个壁可以锚定聚合酶或核苷酸。或者，如图6所示，通过使用额外的入口和旋转表面，可以使环产生流体速度梯度、对传流体流动等。完成扩增反应所需的其它试剂类似的通过入口导入。典型的试剂包括，特异性与靶核酸杂交的引物(例如，正向引物及反向引物)；4种脱氧核苷三磷酸(即dATP，dTTP，dGTP及dCTP)；聚合酶；缓冲溶液及聚合酶所需的多种辅因子(例如金属离子)。

将样品及必要的扩增试剂导入环763后，所得的溶液在泵761的作用下循环。通过改变泵的作用速度来控制溶液的循环/流动速度。建立能对靶核酸施加约65pN力的流速，该流速能使靶核酸变性。降低流体流速使对靶核酸所施加的力减少到约30pN至60pN的范围内。这允许形成聚合酶/核酸/引物复合物。通过将流速进一步减少为施加的不足30pN来起始引物延伸。引物延伸结束时，再次增加流速以使获得的双链核酸变性。重复上述步骤直至获得所需量的靶核酸为止。通过开启阀门759并通过出口765流出溶液，可以获得扩增的靶核酸。

执行Nano-PCR^TM方法的装置可以包括，可单独操作并控制反应装置的元件的可编程的控制装置，而且也可包括传感器及反馈线路，从而控制装置可以监控、分析以及(如有需要)调节反应参数，例如施加的应力和模板延伸。

实施例

实施例1：利用相对的包被表面的方法及装置

根据标准方法制作了一对链霉抗生物素包被的表面(Sabanayagam，Smith，和Cantor.″Oligonucleotideimmobilization onmicropatterned streptavidin surfaces.″Nucleic Acids Res.2000，Vol.28，No.8pp.i-iv)。将生物素化的dsDNA(在一条链的两端进行生物素化)添加在上述表面，在这些表面之间固定了dsDNA(JeffreyM.Rothenberg和Meir Wilchek.p-Diazobenzoyl-biocyt in：a new biotinylating reagent for DNANucleic Acids Research Volume16Number 14 1988)。调整施用于表面的模板浓度，可控制DNA分子的表面密度。在室温，通过增加包被的表面间的距离，在dsDNA上施加大于约65pN的张力。这使dsDNA变性，只留下靶ssDNA进行扩增。将已结合的DNA与含有生物素基团的引物接触，减少表面之间的距离，使30pN至60pN的力施加在固定的ssDNA。使引物与靶DNA退火，并向所得聚合物中添加DNA聚合酶及核苷酸。使施加的张力进一步减少至不足30pN来开始引物延伸。完成引物延伸后，增加表面间的距离，以在所得的双链上施加大于65pN的力。此力的施加使复制的核苷酸链从模板变性出来。光活化包含生物素部分的复制链，并使其结合至链霉抗生物素包被的相对表面。重复上述步骤直至对靶核苷酸获得所需程度的复制。

所含的生物素试剂可从商业供应企业购买，例如MolecularProbes或Pierce。例如，具有可光活化的硝基苄基的生物素衍生物(MeNPOC-biotin)以适合生物分子与表面的较容易的连接的形式存在(Pirrung MC，Huang CY.A general method for the spatiallydefined immobilization of biomolecules on glasss urfaces using″caged″biotin.Bioconjug Chem.1996May-Jun；7(3)：317-21)。

实施例2：利用固定的聚合酶的方法及装置

根据标准方法制作了链霉抗生物素包被的微通道表面(Sabanayagam，Smith，和Cantor.″Oligonucleotideimmobilization on micropatterned streptavidin surfaces.″NucleicAcids Res.2000，Vol.28，No.8pp.i-iv)。将生物素化的DNA聚合酶流入微通道，并孵育以使表面饱和。可以获得用于酶生物素化的商业试剂盒，例如可从Pierce Labs获得。将未结合的酶从微通道流出，并将靶核苷酸(例如ssDNA，RNA)及引物流入，其室流速使得对核苷酸施加用大于60pN的力。减少流速，使30pN至60pN的力施加于上述核苷酸，使之形成聚合酶/核苷酸/引物复合物。使室流速进一步减少至不足30pN来进行引物的延伸。完成引物的延伸后，增加流速将大于65pN的力施加于所得的双链。此力的施加使复制的核苷酸链从模板变性出来。变性的链通过微流体室进行循环直至结合聚合酶为止，重复上述步骤，直至对靶核苷酸获得所需程度的扩增。

实施例3：利用DNA固定化的方法及装置

根据标准方法制作了链霉抗生物素包被的微通道表面。(Sabanayagam，Smith，和Cantor.″Oligonucleotide immobilizationon micropatterned streptavidin surfaces.″Nucleic Acids Res.2000，Vol.28，No.8pp.i-iv)。将生物素化的dsDNA(在一条链的一个末端进行生物素化)流入微通道，并孵育以允许表面结合(Jeffrey M.Rothenberg和MeirWilchek.p-Diazobenzoyl-biocytin：a new biotinylating reagent for DNA Nucleic Acids ResearchVolume16Number141988)。建立了对结合的dsDNA施加大于65pN的力的室流体流速。这使dsDNA变性，只留下靶ssDNA进行扩增。将DNA聚合酶，核苷酸及生物素化的引物流入微通道。所用的生物素试剂可从商业供应企业购买例如Molecular Probes或Pierce。例如，具有可光活化的硝基苄基的生物素衍生物(MeNPOC-biotin)以适合生物分子与表面之间较容易的连接的形式存在(Pirrung MC，Huang CY.Ageneral method for the spatially defined immobilization ofbiomolecules on glass surfacesusing″caged″biotin.BioconjugChem.1996May-Jun；7(3)：317-21)。减少流速，使30pN至60pN的力施加于结合的ssDNA。将引物与靶DNA退火，使所得的化合物与DNA聚合酶复合。使室流速进一步减少至不足30pN来完成引物的延伸。完成引物的延伸后，增加流速，在所得的双链上施加大于65pN的力。这种力的施加，将复制的核苷酸链从模板变性出来。将含有生物素部分的复制链进行光活化，并结合在链霉抗生物素包被的微通道表面。重复上述步骤，直至对靶核苷酸获得所需程度的扩增。

实施例4：利用光学镊子的方法及装置

于环境温度下，将双链DNA复合物锚定在合适介质中的聚苯乙烯珠之间。(″Overstretching B-DNA：the Elastic Response ofIndividual Double Stranded and Single Stranded DNA Molecules″by Steven B.Smith，Yujia Cui，和Carlos Bustamante Science(1996)vol.271，pp.795-799)。将大约65pN的拉伸力通过利用光学镊子施加于DNA。(Rouzina，L，和V.A.Bloomfield.2001b.Force-induced melting of the DNA double helix 2.Effect ofsolution conditions.Biophys.J.80：894-900)。该力导致了DNA的变性。将引物添加至介质，并将拉伸力减少至不足60pN。这使引物与变性的单链DNA退火。把DNA聚合酶及核苷酸添加在介质，并使张力减少到0至30pN，开始高度准确的复制。在复制完成后，将约65pN的拉伸力施加于每个双链DNA分子之上，导致释放出单链DNA分子。这可以借助于操纵器阵列来进行规模放大。例如可以使用Arryx，Inc.制作的光阱阵列之类的阵列。

本发明虽参照其特定的实施方案来进行详细记载，但本领域普通技术人员应该明白，可以进行多种改变，并采用等价方式，而不脱离本发明的范围。

Claims (73)

1.一种核酸的扩增方法，该方法包括：

(a)使一种或多种单链核酸模板链与互补于所述一种或多种模板链的一部分的一种或多种寡核苷酸引物接触；

(b)将一个或多个引物中的至少一个引物与所述一种或多种模板链的所述引物与其互补的部分退火；

(c)使所述一种或多种模板链与DNA聚合酶或RNA聚合酶及至少四种不同的核苷三磷酸接触；

(d)通过DNA聚合酶或RNA聚合酶延伸至少一个退火的引物，从而形成一个或多个与所述一种或多种模板链结合的延伸产物；

(e)将所述一个或多个延伸产物与所述一种或多种模板链分离；

(f)重复步骤(a)、(b)、(c)、(d)和(e)以扩增所述核酸，

其中，将步骤(e)中的至少一个延伸产物用作随后步骤(a)-(e)循环中的模板链，并且其中步骤(b)或(d)中至少一个包括对所述一种和多种模板链的施加张力。

2.根据权利要求1所述的方法，其中对于最后一个循环，不进行步骤(e)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(e)进一步包括对所述一种或多种模板链施加张力。

4.根据权利要求1所述的方法，其中对所述一种或多种模板链施加受控量的张力包括：对所述一种或多种模板链施加机械张力、流体动力学应力或电场能量。

5.根据权利要求4所述的方法，其中对所述一种或多种模板链直接施加受控量的机械张力包括：移动附着了所述一种或多种模板链的表面。

6.根据权利要求1所述的方法，其中对所述一种或多种模板链直接施加张力包括：控制对所述一种或多种模板链的由流体流引起的流体动力学张力。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或多种模板链锚定在暴露于流体流的表面；所述一种或多种模板链结合于DNA聚合酶，所述DNA聚合酶锚定在暴露于流体流的表面；或者所述一种或多种模板链通过对传流体流而维持并延伸。

8.根据权利要求1所述的方法，其中对所述一种或多种模板链的张力施加包括：

对连接于所述一种或多种模板链中的至少一种链的一个或两个末端的一个或多个颗粒施加力。

9.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(e)中施加张力包括：施加增加量的与步骤(d)中施加的相同类型的张力。

10.根据权利要求1所述的方法，其中对所述一种或多种模板链施加的张力选自下列的范围：对于变性，大于65pN；对于退火，小于65pN；对于退火，30pN至50pN；和对于延伸，0pN至45pN。

11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)包括：对所述一种或多种模板链的张力施加，以及在核酸上的难于复制的序列被复制期间增加所施加的张力。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸包含一个或多个具有数个残基的片段，所述片段的GC含量超过50％，并且所述核酸以高于90％的效率扩增。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸包含一个或多个片段，所述片段包含具有8个或更多碱基对的重复单元，并且所述核酸以高于90％的效率扩增。

14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)、(b)、(c)、(d)及(e)在低于65℃下进行。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(a)、(b)、(c)、(d)及(e)重复至少50次。

16.根据权利要求15所述的方法，其中多于1000个碱基的模板链被扩增。

17.根据权利要求16所述的方法，其中该方法在1小时或更短时间内完成。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸在pH4-7或者pH8-10的溶液中扩增。

19.根据权利要求1所述的方法，其在体积小于1μL的反应室内进行。

20.根据权利要求1所述的方法，其在步骤(a)的第一种情况之前还包括：

获得RNA样品；

在足以产生互补DNA链的组合物的存在下，将RNA与逆转录酶接触；和

从RNA分离DNA以形成所述单链核酸。

21.根据权利要求1所述的方法，其在步骤(a)的第一种情况之前还包括：

获得DNA样品；

使上述DNA变性；

使上述变性的DNA结合于反应室内的基质；和

通过冲洗上述反应室，从上述样品中除去污染物。

22.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)的第一种情况下，所述一种或多种模板链是从单个DNA分子中获得的。

23.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)的至少第一种情况下，所述一个或多个模板链包含于未纯化的样品材料中。

24.扩增核酸的方法，包括：

(a)使一种或多种单链核酸的模板链与互补于所述一种或多种模板链的部分的一种或多种寡核苷酸引物接触，其中所述一个或多个引物的至少一个引物包括能与结合至基质上的一种或多种分子结合的一种或多种复合基团；

(b)将具有所述一种或多种复合基团的至少一个引物与所述引物与其互补的所述一种或多种模板链的部分退火，从而将所述一种或多种模板链接合至所述基质上；

(c)使所述一种或多种模板链与DNA聚合酶或RNA聚合酶及至少四种不同的核苷三磷酸接触；

(d)通过DNA聚合酶或RNA聚合酶延伸一个或多个引物，从而形成一个或多个与所述一种或多种模板链结合的延伸产物；

(e)将所述一个或多个延伸产物与所述一种或多种模板链分离；和

(f)重复步骤(a)、(b)、(c)、(d)和(e)以扩增所述核酸，

其中，将步骤(e)中的至少一个延伸产物用作随后步骤(a)-(e)循环中的模板链，并且

其中步骤(b)、(d)和(e)中至少一个包括对所述一种和多种模板链的施加张力。

25.根据权利要求24所述的方法，其中对于最后一个循环，不进行步骤(e)。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述一种或多种复合基团是可活化的。

27.根据权利要求24所述的方法，其中所述一种或多种复合基团和结合于基质的一种或多种分子分别是生物素和链霉抗生物素。

28.根据权利要求24所述的方法，其中所述一种或多种复合基团包含可光活化的、被约束的生物素。

29.一种扩增核酸的方法，其中该方法包括：

(a)通过将足以导致将所述双链核酸分子分离形成两条单链核酸分子的张力施加于所述一个或两个双链使双链核酸分子变性，其中被施加张力的所述一个或两个单链核酸分子将成为模板DNA链；

(b)使所述一个或两个模板链与互补于所述模板链的一部分的一个或多个寡核苷酸引物、DNA聚合酶或RNA聚合酶及至少4种不同的核苷三磷酸接触；

(c)降低施加至步骤(a)中的一个或两个模板链的张力，使所述一个或多个引物与所述一个或多个引物与其互补的相应的模板链的部分退火；

(d)控制对于所述一种或两种模板链施加的张力，使得DNA聚合酶或RNA聚合酶对所述一个或多个引物进行延伸，从而形成一个或多个双链核酸分子，其中一个或多个延伸产物结合至所述一个或多个模板链；和

(e)重复步骤(a)、(b)、(c)和(d)以扩增所述核酸，

其中，将在步骤(d)中形成的一个和多个双链核酸分子中的至少一个用作下一个步骤(a)-(d)循环中步骤(a)的双链核酸分子。

30.根据权利要求29所述的方法，其中施加、降低和控制所述张力中的至少一种包括：将被施加所述张力的核酸分子结合于基质或者一个或多个颗粒或者两者，以及控制所述基质或者所述一个或多个颗粒的运动或者控制两者。

31.根据权利要求29所述的方法，其中施加、降低和控制所述张力中的至少一种包括：将被施加所述张力的核酸分子结合于一个或多个颗粒，以及通过光学或磁学操作控制所述一个或多个颗粒的运动。

32.根据权利要求29所述的方法，其中施加、降低和控制所述张力中的至少一种包括：调整对被施加所述张力的核酸分子的流体流。

33.根据权利要求29所述的方法，其中所述核酸分子中的至少一个结合于聚合酶，所述聚合酶结合于所述基质，并且其中流体流经所述基质。

34.根据权利要求29所述的方法，其中所述核酸分子中的至少一个结合于基质。

35.根据权利要求29所述的方法，其中所述核酸分子中的至少一个在流体流速度梯度中或在对传流体流中被拉伸。

36.根据权利要求29所述的方法，其中步骤(d)包括：在一个或多个模板链上的难于复制序列被复制期间增加所述张力。

37.根据权利要求29所述的方法，其中整个过程在环境温度下进行。

38.根据权利要求29所述的方法，其中该过程在高于20℃但低于60℃的温度下进行。

39.根据权利要求29所述的方法，其中该过程在室温下进行，且步骤(a)中的张力大于65pN，步骤(c)中的张力减少至小于65pN，步骤(d)中的张力调整至0pN至45pN之间。

40.一种用于对核酸分子施加张力的装置，包含：

一个或多个流体通道，

将核酸分子保留在所述一个或多个流体通道中的手段，

用于在引物延伸、复制或至少一个扩增循环期间将可变和受控量的张力施加于保留在其中的核酸分子的机构，和

一个或多个用于核酸引物延伸、复制或扩增的室，其用于试剂的反应、储存或引入，可选地其中所述试剂包括核酸引物、核苷三磷酸和聚合酶。

41.根据权利要求40所述的装置，其中用于对保留在所述装置中的核酸分子施加张力的机构包含第一和第二表面，所述第一和第二表面具有用于将核酸分子锚定于其上的手段，而且其中所述第一和第二表面能够进行相对移动。

42.根据权利要求40所述的装置，其中用于对所述核酸分子施加张力的机构包含至少一个表面，所述表面具有用于将核酸分子锚定于其上的手段，所述装置还包含能对所述核酸分子提供受控和可变的流体流的机构。

43.根据权利要求42所述的装置，其中具有用于将核酸分子锚定于其上的手段的至少一个表面还含有用于分布于锚定所述核酸分子的手段之间的流体流的通道。

44.根据权利要求40所述的装置，其中对所述核酸分子提供受控和可变的流体流的机构能够产生层状流体流中的速度梯度。

45.根据权利要求40所述的装置，其中用于对保留在所述装置中的核酸分子施加张力的机构包含：能够在层状流体流中提供速度梯度的流体流通道、流体流中的滞止点、对传流体流或者这些的组合。

46.根据权利要求40所述的装置，其中用于对保留在所述装置中的核酸分子施加张力的机构包含：能够操作与所述核酸分子结合的颗粒的光学、电学或磁学操作器的阵列。

47.一种对核酸分子施加张力的微流体装置，包含：

(a)基质；

(b)位于所述基质中的流体通道；

(c)与所述流体通道流体相通的入口，核酸分子的样品可以通过所述入口导入所述流体通道，

(d)用于在引物延伸、复制或至少一个扩增循环期间对核酸分子施加张力的机构，

(e)用于在所述装置中保留核酸分子的手段，以及

(f)一个或多个用于核酸引物延伸、复制或扩增的室，其用于试剂的反应、储存或引入，可选地其中所述试剂包括核酸引物、核苷三磷酸和聚合酶，

其中所述装置能够进行等温操作。

48.根据权利要求47所述的微流体装置，其中所述基质含有弹性体型材料。

49.根据权利要求47所述的微流体装置，其中流体通道的构型使得导入流体通道的样品能绕流体通道循环。

50.根据权利要求47所述的微流体装置，其中所述微流体装置还包含可操作地放置的泵以通过通道运输流体。

51.根据权利要求47所述的微流体装置，其中用于保留核酸分子的手段允许在流体通道内保留核酸。

52.根据权利要求47所述的微流体装置，其包含至少一个固定于流体通道内的聚合酶分子。

53.通过聚合酶链式反应进行核酸扩增的方法，其包括：

(a)变性双链核酸以产生单链模板链；

(b)将引物与模板链退火；和

(c)通过模板-链-驱动的聚合酶的引物延伸以产生延伸产物，从而形成双链核酸分子；和

(d)重复步骤(a)-(c)以扩增该双链核酸，

其中，将在步骤(c)中产生的双链核酸分子中的至少一个用作下一个步骤(a)-(c)循环中的模板链，并且

其中，步骤(b)和(c)中至少一个包括对所述核酸施加张力。

54.根据权利要求53的方法，其中施加张力包括施加机械张力、流体动力学张力或电磁力。

55.根据权利要求53的方法，其中所述方法在选自下列的温度下进行：i)整个过程在环境温度下进行；或者ii)变性步骤在低于80℃的温度下进行；或者iii)退火步骤在低于50℃的温度下进行；或者iv)延伸步骤在低于70℃的温度下进行。

56.根据权利要求53的方法，其中

在步骤(a)中施加的张力等于或大于65pN，

或步骤(b)中施加的张力选自(i)等于或小于50pN，(ii)30pN-50pN，包括端值，和(iii)35pN-45pN，包括端值；

或步骤(c)中施加的张力等于或小于45pN。

57.进行核酸扩增的方法，其包括：

(a)变性双链核酸以产生单链模板链；

(b)将引物与模板链退火；

(c)通过模板-链-驱动的聚合酶的引物延伸以产生延伸产物，从而形成双链核酸分子；和

(d)重复步骤(a)-(c)以扩增该双链核酸，

其中，步骤(a)是等温的并且包括对所述核酸施加机械或流体动力学张力；

并且其中，将在步骤(c)中产生的双链核酸分子中的至少一个用作下一个步骤(a)-(c)循环中步骤(a)中的模板链。

58.进行核酸扩增的方法，其包括：

(a)变性双链核酸以产生单链模板链；

(b)将引物与模板链退火；

(c)通过模板-链-驱动的聚合酶的引物延伸以产生延伸产物，从而形成双链核酸分子；和

(d)重复步骤(a)-(c)以扩增该双链核酸，

其中将在步骤(c)中产生的双链核酸分子中的至少一个用作下一个步骤(a)-(c)循环中的模板链，和

其中，步骤(c)包括对所述核酸施加可变的张力，所述可变的张力调整所述核酸聚合酶的具有校正功能的核酸外切酶活性。

59.进行核酸扩增的方法，其包括：

(a)变性双链核酸以产生单链模板链；

(b)将引物与模板链退火；

(c)通过模板-链-驱动的聚合酶的引物延伸以产生延伸产物，从而形成双链核酸分子；和

(d)重复步骤(a)-(c)以扩增该双链核酸，

其中将在步骤(c)中产生的双链核酸分子中的至少一个用作下一个步骤(a)-(c)循环中的模板链，和

其中在步骤(b)中使用的引物是可激活的引物，其包括用于固定步骤(c)中得到的延伸产物的复合基团。

60.进行核酸扩增的方法，其包括：

(a)变性双链核酸以产生单链模板链；

(b)将引物与模板链退火；和

(c)通过模板-链-驱动的聚合酶的引物延伸以产生延伸产物，从而形成双链核酸分子；和

(d)重复步骤(a)-(c)以扩增该双链核酸，

其中，将在步骤(c)中产生的双链核酸分子中的至少一个用作下一个步骤(a)-(c)循环中的模板链，和

其中，步骤(b)和(c)中至少一个包括对所述核酸施加张力，和

其中，在重复步骤(a)至(c)n次后，所述模板链的拷贝数量以n次幂增加，其中n是大于1的整数。

61.根据权利要求53所述的方法，其中步骤(a)包括对所述核酸施加张力。

62.用于降低核酸聚合酶对引物延伸中的误差率的方法，其包括：

通过核酸聚合酶延伸与核酸模板退火的引物以产生双链核酸分子，其中将张力可调节地施加至所述核酸模板或所述引物以降低核酸聚合酶对所述引物延伸的误差率。

63.用于降低核酸聚合酶在富含GC的模板上对引物延伸的误差率的方法，其包括：

通过核酸聚合酶延伸与富含GC的核酸模板退火的引物以产生双链核酸分子，其中将张力可调节地施加至所述核酸模板或所述引物以降低在富含GC的模板上对所述引物延伸的误差率。

64.根据权利要求40所述的装置，其中用于保留所述核酸分子的手段包括锚定手段，并且用于施加可变和受控的张力的机构包括可操作的可移动的单独可控制元件或颗粒的阵列。

65.根据权利要求64所述的装置，其中所述可移动的单独受控元件是压电元件。

66.根据权利要求47所述的装置，其中用于对保留在所述装置中的核酸分子施加张力的机构包含：能够操作与所述核酸分子结合的颗粒的光学镊子或磁学镊子。

67.根据权利要求66所述的装置，其能够在流体流中捕获与所述核酸分子结合的颗粒。

68.根据权利要求40所述的装置，其进一步包括：

具有其上的多个支持结构的至少一个表面，所述支持结构具有用于锚定核酸分子的手段；和

用于对所述核酸分子提供受控和可变的流体流的机构，

其中，所述支持结构允许流体以受控制的速度流过所述结构之间。

69.根据权利要求40所述的装置，其中用于对保留在所述装置中的核酸分子施加张力的机构包括以下中的一种或多种：

能够产生速度梯度的流体通道；

能够提供流体动力学应力聚焦的流体通道；

能够提供对传流体流的流体通道；和

能够提供T形结合部的流体通道。

70.根据权利要求40所述的装置，其中用于对保留在所述装置中的核酸分子施加张力的机构包括用于施加电场以驱动所述装置中的流体流的手段或用于对保留在所述装置中的核酸分子施加电场的手段。

71.用于处理核酸分子的试剂盒，其包括

根据权利要求40所述的装置，和

具有结合在其上的核酸聚合引物的颗粒。

72.用于处理核酸分子的试剂盒，其包括

根据权利要求40所述的装置，和

用于扩增、测序或鉴定核酸分子的试剂。

73.根据权利要求40所述的装置，其中所述装置是手提的。