ES2104550T5 - Enzima purificado termoestable y proceso para ampliar, detectar y/o clonar secuencias de acido nucleico empleando dicho enzima. - Google Patents

Enzima purificado termoestable y proceso para ampliar, detectar y/o clonar secuencias de acido nucleico empleando dicho enzima.

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Abstract

SE OBTIENE UNA ENZIMA TERMOESTABLE PURIFICADA QUE TIENE UNAS CARACTERISTICAS UNICAS. PREFERENTEMENTE LA ENZIMA SE SEPARA DE LA ESPECIE THERMUS AQUATICUS Y TIENE UN PESO MOLECULAR DE 86.000 A 90.000 DALTONS APROXIMADAMENTE. LA ENZIMA TERMOESTABLE PUEDE SER NATIVA O RECOMBINANTE Y SE PUEDE UTILIZAR EN UNA REACCION EN CADENA DE CICLADO DE TEMPERATURA EN DONDE SE AMPLIFICA LA CANTIDAD DE POR LO MENOS UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO A PARTIR DE UNA SECUENCIA YA EXISTENTE CON LA AYUDA DE CEBADORES SELECCIONADOS Y DE TRIFOSFATOS NUCLEOTIDOS. EL PROCESO DE AMPLIFICACION CONSISTE EN TRATAR CEPAS COMPLEMENTARIAS INDEPENDIENTES DEL ACIDO NUCLEICO CON UN EXCESO MOLAR DE DOS CEBADORES OLIGONUCLEOTIDOS, EXTENDER LOS CEBADORES CON UNA ENZIMA TERMOESTABLE PARA FORMAR PRODUCTOS DE EXTENSION CEBADORES COMPLEMENTARIOS QUE ACTUAN COMO MODELOS PARA SINTETIZAR LA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO DESEADA Y DETECTAR LA SECUENCIA ASI AMPLIFICADA. LOS PASOS DE LA REACCION SE PUEDEN REPETIR CUANTAS VECES SE DESEE Y EN ELLOS INTERVIENE EL CICLADO DE TEMPERATURA PARA EFECTUAR LA HIBRIDACION, PROMOCION DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA Y DESNATURALIZACION DE LOS HIBRIDOS FORMADOS. LA ENCIMA SE ALMACENA PREFERENTEMENTE EN UN TAMPON DE DETERGENTES NO IONICOS QUE LE CONFIEREN ESTABILIDAD A LA ENZIMA.

Description

Enzima purificado termoestable y proceso para ampliar, detectar y/o clonar secuencias de ácido nucleico empleando dicho enzima.
La presente invención se refiere a una DNA polimerasa de Thermus aquaticus purificada termoestable que tiene un peso molecular de 86.000-90.000 determinado de acuerdo con su migración en DSD-PAGE cuando el marcado de las proteínas es la fosforilasa B (92.500), albúmina de suero bovino (66.200), ovoalbúmina (45.000), anhidrasa carbónica (31.000), inhibidor de tripsina de haba de soja (21.500) y lipozima (14.400). Además, la invención se refiere a las versiones caracterizadas en las reivindicaciones.
La DNA polimerasa de la presente invención es de utilidad en su proceso para amplificar secuencias de ácido nucleico existentes si están presentes en una muestra de ensayo y para detectarlas si están presentes empleando una sonda. Más específicamente es de utilidad en un proceso para producir cualquier secuencia de ácido nucleico particular a partir de una secuencia dada de DNA o RNA en cantidades que son grandes en comparación con la cantidad presente inicialmente, de modo que se facilita así la detección de las secuencias, en donde cataliza la reacción. El DNA o el RNA puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, y puede ser una especie relativamente pura o un componente de una, mezcla de ácidos nucleicos. El proceso de la invención emplea una reacción repetitiva para llevara, cabo la amplificación de la secuencia de ácido nucleico deseada.
Se ha llevado a cabo una investigación extensiva en relación con el aislamiento de DNA polimerasas de microorganismos mesofílicos tales como E. coli. Véase por ejemplo Bessman y col., J. Biol. Chem. (1957) 233: 171-177 y Buttin y Kornberg (1966) J. Biol. Chem. 241: 5419-5427.
Por el contrario, se ha investigado relativamente poco el aislamiento y purificación de DNA polimerasas de termófilos, como por ejemplo Thermus aquaticus. Kaledin y col., Biokhymiya (1980) 45: 644-651, descubren un procedimiento de aislamiento y purificación en seis etapas de una DNA polimerasa a partir de células de Thermus aquaticus, cepa YT1. Estas etapas implican el aislamiento del extracto crudo, la cromatografía en DEAE-celulosa, el fraccionamiento en hidroxiapatito, el fraccionamiento en DEAE-celulosa, y la cromatografía en celulosa-DNA de cadena sencilla. Las fracciones recuperadas de cada etapa no se ensayaron para endo y exonucleasa(s) contaminantes. El peso molecular del enzima purificado se describe como de 62.000 daltons por unidad monomérica.
Un segundo esquema de purificación para una polimerasa de Thermus aquaticus es el descrito por A. Chien y col., J. Bacteriol. (1976) 127: 1550-1557. En este proceso, el extracto crudo se aplica a una columna de DEAE-Sephadex. Las fracciones dializadas reunidas se someten a continuación a un tratamiento en una columna de fosfocelulosa. Las fracciones reunidas se dializan y se añade albúmina sérica bovina (BSA) para evitar la pérdida de actividad polimerasa. La mezcla resultante se carga en una columna de celulosa-DNA. El material recuperado de la columna se dializa y se analiza por filtración en gel para comprobar que posee un peso molecular de aproximadamente 63.000 daltons, y mediante centrifugación en gradiente de sacarosa, de aproximadamente 68.000 daltons.
El uso de una enzima termoestable para amplificar secuencias de ácido nucleico existentes en cantidades que son grandes en comparación con la cantidad presente inicialmente ha sido sugerido en la Publicación de Patente Europea Nº 200.362, publicada el 10 de diciembre de 1986. Se emplean en el proceso cebadores, trifosfatos de nucleótido, y una polimerasa, implicando dicho proceso la desnaturalización, la síntesis de cadenas molde y la hibridación. El producto de extensión de cada cebador pasa a ser molde para la producción de la secuencia de ácido nucleico deseada. La aplicación descubre que si la polimerasa empleada es un enzima termoestable, no es necesario añadirlo tras cada etapa de desnaturalización, puesto que el calor no destruirá su actividad. No se proporcionan otras ventajas o detalles sobre el uso de una DNA polimerasa termoestable. El proceso de amplificación y de detección está descrito asimismo por Saiki y col., Science, 230: 1350-1354 (1985), y por Saiki y col., Bio/Technology, 3: 1008-1012
(1985).
En este sentido, existe la voluntad en este campo de producir un enzima termoestable estable y purificado que pueda ser utilizado para mejorar el proceso de amplificación diagnóstico descrito anteriormente.
En este sentido, la presente invención proporciona dicha enzima termoestable que posee actividad DNA, polimerasa, cataliza la combinación de trifosfatos de nucleósidos para formar una cadena de ácido nucleico complementaria a una cadena molde de ácido nucleico, y que posee un peso molecular de 86.000 a 90.000 determinado en función de su migración en SDS-PAGE, cuando las proteínas marcadoras son fosforilasa B (92.500), albúmina sérica bovina (66.200), ovoalbúmina (45.000), anhidrasa carbónica (31.000), inhibidor de tripsina de haba de soja (21.500) y lisozima (14.400). En otro aspecto, dicho enzima termoestable es un enzima recombinante o una modificación del mismo. Este material purificado puede emplearse en una reacción de amplificación por ciclos de temperatura en la que las secuencias de ácido nucleico se producen a partir de una secuencia dada de ácido nucleico en cantidades que son grandes en comparación con la cantidad presente inicialmente, de modo que pueden ser detectadas fácilmente.
El gen que codifica el enzima DNA polimerasa de Thermus aquaticus ha sido asimismo identificado y proporciona todavía otro medio para obtener el enzima termoestable de la presente invención. Adicionalmente al gen que codifica el enzima de 86.000-90.000 daltons, se presentan asimismo derivados génicos que codifican actividad DNA polimerasa.
La invención comprende asimismo una composición de enzima estable que comprende un enzima termoestable purificado como se ha descrito anteriormente en un tampón que contiene uno o más detergentes poliméricos no iónicos.
El enzima purificado, así como los enzimas producidos mediante técnicas de DNA recombinante, proporcionan mucha más especificidad que el fragmento Klenow, que no es termoestable. Adicionalmente, el enzima purificado y los enzimas producidos de forma recombinante exhiben la actividad apropiada esperada cuando no están presentes dTTP u otros trifosfatos de nucleótidos en la mezcla de incubación con el molde de DNA. Además, los enzimas aquí descritos poseen un perfil de pH más amplio que el del enzima termoestable de Thermus aquaticus descrito en la literatura, con más del 50% de la actividad a pH 7 como a pH 8. Adicionalmente, el enzima termoestable descrito aquí puede ser conservado en un tampón con detergentes no iónicos de modo que es estable, y no pierde su actividad a lo largo de un período de tiempo.
La presente invención, reside en un proceso para amplificar una o más secuencias específicas de ácido nucleico presente en un ácido nucleico o en una mezcla de los mismos empleando cebadores y el enzima termoestable de la presente invención. El producto de extensión de un cebador cuando hibrida con el otro cebador pasa a ser un molde para la producción de la secuencia de ácido nucleico específica deseada, y viceversa, repitiéndose el proceso tantas veces como sea necesario para producir la cantidad deseada de la secuencia. El método aquí descrito mejora la especificidad de la reacción de amplificación, lo que resulta en una señal muy evidente de ácido nucleico amplificado. Adicionalmente, el método descrito aquí elimina la necesidad de transferir los reactivos de un recipiente a otro tras cada ciclo de amplificación. Esta transferencia no es necesaria puesto que el enzima termoestable soportará las elevadas temperaturas requeridas para desnaturalizar las cadenas de ácido nucleico, por lo que no necesita ser reemplazado. Adicionalmente, la sucesión de ciclos de temperatura puede ser automatizada para una reducción adicional en la fuerza de trabajo y en las etapas requeridas para llevar a cabo la reacción de amplificación.
Más específicamente, la presente invención proporciona un proceso para amplificar al menos una secuencia de ácido nucleico específica contenida en un ácido nucleico o en una mezcla de ácidos nucleicos, en el que si el ácido es de doble cadena, consiste en dos cadenas complementarias separadas de longitud igual o diferente, consistiendo dicho proceso en las etapas de:
(a) poner en contacto cada cadena de ácido nucleico con cuatro trifosfatos de nucleótidos diferentes y un cebador oligonucleótido para cada secuencia específica diferente a amplificar, en el que cada cebador se selecciona para ser sustancialmente complementario a cadenas diferentes de cada secuencia específica, de modo que el producto de extensión sintetizado a partir de un cebador, cuando se separa de su cadena complementaria, puede servir como molde para la síntesis de un producto de extensión del otro cebador, realizándose este contacto a una temperatura que promueve la hibridación de cada cebador con su cadena de ácido nucleico complementaria;
(b) poner en contacto cada cadena de ácido nucleico, al mismo tiempo o tras la etapa (a), con un enzima termoestable de la presente invención que permite la combinación de los trifosfatos de nucleótidos para formar productos de extensión de cebador complementarios a cada cadena de cada ácido nucleico.
(c) mantener la mezcla de la etapa (b) a una temperatura efectiva durante un tiempo efectivo para activar el enzima, y para sintetizar, para cada secuencia diferente a amplificar, un producto de extensión de cada cebador que es complementario a cada cadena molde de ácido nucleico, pero a una temperatura no tan alta como para separar cada producto de extensión de su cadena molde complementaria;
(d) calentar la mezcla de la etapa (c) durante un tiempo efectivo y a una temperatura efectiva para separar los productos de extensión del cebador de los moldes a partir de los cuales se han sintetizado para producir moléculas de cadena sencilla, pero a una temperatura no tan alta como para desnaturalizar irreversiblemente el enzima;
(e) enfriar la mezcla de la etapa (d) a una temperatura efectiva durante un tiempo efectivo para promover la hibridación de cada cebador con cada una de las moléculas de cadena sencilla producidas en la etapa (d); y
(f) mantener la mezcla de la etapa (e) a una temperatura efectiva durante un tiempo efectivo para promover la actividad del enzima y para sintetizar, para cada secuencia diferente a amplificar, un producto de extensión de cada cebador que es complementario a cada cadena molde de ácido nucleico producida en la etapa (d), pero a una temperatura no tan alta como para separar cada producto de extensión de su cadena molde complementaria, en los casos en los que las etapas (e) y (f) sean realizadas de forma simultánea o secuencial.
Las etapas (d), (e) y (f) pueden repetirse hasta obtener el nivel deseado de amplificación de secuencia. El enzima termoestable preferido aquí es una polimerasa extraída de Thermus aquaticus (polimerasa Taq). Más preferentemente, si el enzima es polimerasa Taq, en la etapa (a) las hebras de ácido nucleico se ponen en contacto con un tampón que incluye una sal de magnesio a aproximadamente 1,5-2 mM, 150-200 \muM de cada uno de los nucleótidos, y 1 \muM de cada uno de los nucleótidos, y 1 \muM de cada cebador, realizándose las etapas (a), (e) y (f) a aproximadamente 45-58ºC, y realizándose la etapa (d) a aproximadamente 90-100ºC.
En un aspecto preferido, el ácido o los ácidos nucleicos son de doble cadena y la etapa (a) se lleva a cabo (i) calentando cada ácido nucleico en presencia de cuatro trifosfatos de nucleótidos diferentes y un cebador oligonucleótido para cada secuencia específica diferente a amplificar, durante un tiempo efectivo y a una temperatura efectiva para desnaturalizar cada ácido nucleico, en la que cada cebador se ha seleccionado para ser sustancialmente complementario a cadenas diferentes de cada secuencia específica, de modo que el producto de extensión sintetizado a partir de un cebador, cuando se separa de su cadena complementaria, puede servir como molde para la síntesis del producto de extensión del otro cebador; y (ii) enfriar los ácidos nucleicos desnaturalizados hasta una temperatura que promueva la hibridación de cada cebador con su cadena de ácido nucleico complementaria.
En otros aspectos la invención se refiere a un proceso para detectar la presencia o la ausencia de al menos una secuencia de ácido nucleico específica en una muestra que contiene un ácido nucleico o una mezcla de ácidos nucleicos, o para distinguir entre dos secuencias diferentes en dicha muestra, cuando dicha muestra es sospechosa de contener dicha secuencia o secuencias, y cuando si el ácido o los ácidos nucleicos son de doble cadena, consisten cada uno en dos cadenas y complementarias separadas de longitud igual o diferente, comprendiendo dicho proceso las etapas de (a) a (f) mencionada anteriormente, lo que tiene como resultado la amplificación en cantidad de la secuencia o las consecuencias de ácido nucleico específica, si están presentes;
g) añadir al producto de la etapa (f) una sonda de oligonucleótido marcada, para cada secuencia a detectar, capaz de hibridar con dicha secuencia o con una mutación de la misma; y
(h) determinar si dicha hibridación ha tenido lugar.
Todavía en otro aspecto, la invención se refiere a un proceso para detectar la presencia o ausencia de al menos una variación de nucleótido en la secuencia en uno o más de los ácidos nucleicos contenidos en una muestra, en la que si el ácido nucleico es de doble cadena consiste en dos cadenas separadas complementarias de longitud igual o diferente, incluyendo dicho proceso las etapas (a) a (f) mencionadas anteriormente, en el que las etapas (d), (e) y (f) se repiten un número suficiente de veces, lo que resulta en una amplificación detectable del ácido nucleico que contiene la secuencia, si está presente;
(g) fijar el producto de la etapa (f) a una membrana;
(h) tratar la membrana bajo condiciones de hibridación con una sonda de oligonucleótido marcada específica de secuencia capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico amplificada únicamente si una secuencia de la sonda es complementaria a una región de la secuencia amplificada; y
(i) detectar si la sonda ha hibridado con una secuencia amplificada en la muestra de ácido nucleico.
Si la muestra incluye células, preferentemente se calientan antes de la etapa (a) para exponer los ácidos nucleicos en ellas contenidos a los reactivos. Esta etapa evita la extracción de los ácidos nucleicos antes de la adición de los reactivos.
En una variación de este proceso, el cebador o los cebadores y/o los trifosfatos de nucleótidos están marcados de modo que la secuencia amplificada resultante está marcada. El cebador o los cebadores y/o los trifosfatos de nucleótidos marcados pueden estar presentes en la mezcla de reacción desde el inicio o ser añadidos durante un ciclo posterior. El oligonucleótido específico de secuencia (no marcado) se fija a una membrana y se trata bajo condiciones de hibridación con el producto de amplificación marcado de modo que la hibridación tendrá lugar únicamente si la secuencia unida a la membrana está presente en el producto de amplificación.
Todavía en otro aspecto, esta invención se refiere a un proceso para la clonación en un vector de clonación de una o más secuencias de ácido nucleico específicas contenidas en un ácido nucleico o en una mezcla de ácidos nucleicos, los cuales ácidos nucleicos, cuando son de doble cadena, consisten en dos cadenas complementarias separadas, y los cuales ácidos son amplificados en cantidad antes de ser clonados, incluyendo dicho proceso las etapas de (a) a (f) mencionadas anteriormente, repitiéndose las etapas (d), (e) y (f) un número suficiente de veces para tener como resultado una amplificación detectable del ácido o los ácidos nucleicos que contienen la o las secuen-
cias;
(g) añadir al producto de la etapa (f) un enzima de restricción para cada uno de dichos sitios de restricción para obtener productos escindidos en una digestión de restricción; y
(h) ligar el producto o productos escindidos de la etapa (g) que contienen la secuencia o secuencias específicas a clonar en uno o más vectores de clonación que contienen un promotor y un marcador seleccionable.
En un aspecto adicional, esta invención se refiere a un proceso para clonar en un vector de clonación una o más secuencias de ácido nucleico específicas contenidas en un ácido nucleico o en una mezcla de ácidos nucleicos, los cuales ácidos nucleidos, cuando son de doble cadena, consisten en dos cadenas complementarias separadas de longitud igual o diferente, y los cuales ácidos son amplificados en cantidad antes de ser clonados, incluyendo dicho proceso las etapas de (a) a (f) mencionadas anteriormente, repitiéndose las etapas (d), (e) y (f) un número suficiente de veces para tener como resultado una amplificación efectiva del ácido o los ácidos nucleicos que contienen la o las secuencias para su ligación en extremos romos en uno o más vectores de clonación; y
(g) ligar la secuencia o secuencias específicas amplificadas que se desea clonar obtenidas a partir de la etapa (f) en uno o más de dichos vectores de clonación en presencia de una ligasa, estando presentes dicha secuencia o secuencias amplificadas y dicho vector o vectores en cantidades suficientes para llevar a cabo la ligación.
En una forma del producto, la invención proporciona una composición de materiales útil en la amplificación de al menos una secuencia de ácido nucleico específica contenida en un ácido nucleico o en una mezcla de ácidos nucleicos, que incluye cuatro trifosfatos de nucleótidos diferentes y un cebador oligonucleótido para cada secuencia específica a amplificar, en la que cada cebador se selecciona para ser sustancialmente complementario a cadenas diferentes de cada secuencia específica, de modo que el producto de extensión sintetizado a partir de un cebador, cuando se separa de su cadena complementaria, puede servir como molde para la síntesis del producto de extensión del otro cebador.
En otra forma del producto, la invención proporciona una muestra de uno o más ácidos nucleicos que incluye múltiples cadenas de una secuencia de ácido nucleico específica contenida en el ácido o ácidos nucleicos. La muestra puede incluir aproximadamente 10-100 cadenas, aproximadamente 100-100 cadenas, o más de aproximadamente 1000 cadenas.
En una forma del producto adicional, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico amplificada a partir de un ácido nucleico o mezcla de ácidos nucleicos que incluye múltiples copias de la secuencia producida mediante los procesos de amplificación aquí descritos.
La Figura 1 es un mapa de sitios de restricción del plásmido pFC83 que contiene el inserto de DNA de Thermus aquaticus HindIII de aproximadamente 4,5 kb subclonado en el plásmido BSM13+.
La Figura 2 es un mapa de sitios de restricción del plásmido pFC85 que contiene el inserto de DNA de Thermus aquaticus Hindi a Asp718 de aproximadamente 2,8 kb subclonado en el plásmido BSM13+.
Tal y como aquí se utilizan, "célula", "línea celular" y "cultivo celular" pueden ser utilizados de forma intercambiable, y todas estas designaciones incluyen la progenie. De este modo, las palabras "transformantes" o "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y cultivos derivados de la misma, sin tener en cuenta el número de transferencias. Se entiende asimismo que toda la progenie puede no ser idéntica con precisión en cuanto al contenido en DNA, a causa de mutaciones deliberadas o inadvertidas. Queda incluida la progenie mutante que posee la misma funcionalidad que se ha escrutado en la célula transformada original.
El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida de forma operativa en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión a ribosoma, y, posiblemente, otras secuencias todavía no bien comprendidas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y estimuladores.
El término "sistema de expresión" se refiere a secuencias de DNA que contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de control en unión operativa, de modo que los hospedadores transformados con tales secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas. Con el objetivo de realizar la transformación, el sistema de expresión puede ser incluido en un vector; sin embargo, el DNA relevante puede ser también integrado en el cromosoma del hospedador.
El término "gen" tal y como aquí se utiliza se refiere a una secuencia de DNA que codifica un precursor o polipéptido bioactivo recuperable. El polipéptido puede ser codificado por una secuencia del gen de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante siempre que la actividad enzimática quede retenida.
"Conectada de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición tal que la función normal de los componentes pueda ser realizada. De este modo, una secuencia codificante "conectada de forma operativa" a secuencias de control se refiere a una configuración en la que las secuencias codificantes pueden ser expresadas bajo el control de las secuencias.
"Detergentes poliméricos no iónicos" se refiere a agentes con actividad superficial que no poseen carga iónica y que se caracterizan, por lo que respecta a esta invención, por su capacidad para estabilizar el enzima aquí descrito en un intervalo de pH de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 9,5, preferentemente de 4 a 8,5.
El término "oligonucleótido" tal y como aquí se utiliza se define como una molécula formada por dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferentemente más de tres. Su longitud exacta dependerá de numerosos factores, y dependerá a su vez de la función o uso último del oligonucleótido. El oligonucleótido puede ser obtenido sintéticamente o por clonación.
El término "cebador" tal y como aquí se utiliza se refiere a un oligonucleótido, bien sea de origen natural, como en una digestión de restricción purificado, o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las que la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico resulta inducida, es decir, en presencia de los cuatro trifosfatos de nucleótidos diferentes y de enzima termoestable en un tampón adecuado ("tampón" incluye pH, fuerza iónica, cofactores, etc.), y a una temperatura adecuada. Para la polimerasa Taq el tampón que aquí se describe contiene preferentemente de 1,5 a 2 mM de una sal de magnesio, preferentemente MgCl_{2}, 150-200 \muM de cada nucleótido, y 1 \muM de cada cebador, junto con preferentemente KCl 50 mM, tampón Tris 10 mM, pH 8-8,4, y gelatina a 100 \mug/ml.
El cebador es preferentemente de cadena sencilla para una eficacia máxima en la amplificación, pero puede ser alternativamente de doble cadena. Si es de doble cadena, el cebador se trata en primer lugar para separar sus cadenas antes de ser utilizado para preparar productos de extensión. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser lo suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia de un enzima termoestable. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de numerosos factores, incluyendo la temperatura, el origen del cebador y el uso del método. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleótido contendrá típicamente de 15 a 25 nucleótidos, aunque puede contener un número mayor o menor de nucleótidos. Las moléculas cebadoras cortas requieren en general temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde.
En esta invención, los cebadores se seleccionan para ser "substancialmente complementarios" con las diferentes hebras de cada secuencia específica a amplificar. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridar con sus respectivas cadenas. Por consiguiente, la secuencia del cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento nucleotídico no complementario puede ser unido al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador complementaria a la hebra. Alternativamente, pueden insertarse bases no complementarias o secuencias más largas en el cebador, siempre que la secuencia del cebador posea suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena a amplificar como para hibridar con ella y de este modo formar un molde para la síntesis del producto de extensión del otro cebador. Sin embargo, con la finalidad de la detección, en particular empleando sondas marcadas específicas de secuencia, los cebadores poseen típicamente una complementariedad exacta para la obtención de los mejores resultados.
Tal y como aquí se utilizan, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas bacterianos, cada uno de los cuales cortará DNA de doble cadena en, o cerca de, una secuencia de nucleótidos especifica.
Tal y como aquí se utiliza, el término "polimorfismo de DNA" se refiere a la situación en la que dos o más secuencias de nucleótidos diferentes pueden existir en un sitio particular en el DNA.
Tal y como aquí se utiliza, el término "variación de nucleótidos en la secuencia" se refiere a cualquier sustitución, deleción o inserción de nucleótidos única o múltiple. Estas variaciones en los nucleótidos pueden ser variaciones alélicas mutantes o polimórficas. Por consiguiente, este proceso puede detectar cambios en nucleótidos únicos en ácidos nucleicos como ocurre en el caso de las enfermedades genéticas de la \beta-globina causadas por mutaciones, adiciones o deleciones de una sola base (algunas \beta-talasemias, anemia de células falciformes, enfermedad de la hemoglobina C, etc.) así como variaciones de múltiples bases como las implicadas en la \alpha-talasemia o en algunas \beta-talasemias. Adicionalmente, el proceso aquí descrito puede detectar polimorfismos no necesariamente asociados con una enfermedad, sino que constituyen puramente una situación en la que dos o más secuencias de nucleótidos diferentes (bien sea por sustitución, deleción o inserción de pares de bases de nucleótidos) pueden existir en un sitio particular en el ácido nucleico de la población, como es el caso de las regiones HLA del genoma humano y polimorfismos al azar como en el DNA mitocondrial. Las sondas de oligonucleótido polimórficas específicas de secuencia descritas en detalle a partir de aquí en esta invención pueden ser empleadas para detectar marcadores genéticos ligados a una enfermedad como es el caso de la diabetes mellitus dependiente de insulina o en aplicaciones de medicina forense. Si el ácido nucleico es de doble cadena, la variación de nucleótidos en la secuencia significa una variación de un par de bases en la secuencia.
El término "oligonucleótidos específicos de secuencia" se refiere a oligonucleótidos que hibridarán con secuencias específicas contenidas o no en los alelos, comprendiendo estas secuencias la variación en el o los pares de bases a detectar, y siendo estas secuencias específicas para la variación de secuencia a detectar. Dependiendo de las secuencias a analizar, pueden emplearse uno o más oligonucleótidos específicos de secuencia para cada secuencia, como se describe con mayor detalle más adelante en esta invención.
Tal y como aquí se utiliza, el término "polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción" ("RFLP") se refiere a las diferencias entre individuos en las longitudes de los fragmentos de restricción obtenidos por digestión con una endonucleasa de restricción en particular.
Tal y como aquí se utiliza, el término "enzima termoestable" se refiere a un enzima que es estable al calor y que es resistente al calor y que cataliza (facilita) la combinación de los nucleótidos de la forma adecuada para formar los productos de extensión del cebador que son complementarios a cada cadena del ácido nucleico. En general, la síntesis se iniciará en el extremo 3' de cada cebador y procederá en el sentido 5' a lo largo de la cadena de molde, hasta que la síntesis finalice, produciendo moléculas de diferentes longitudes. Sin embargo, puede existir un enzima termoestable que inicie la síntesis en el extremo 5' y que proceda en la otra dirección, empleando el mismo proceso descrito arriba.
El enzima termoestable de esta invención debe satisfacer un único criterio para ser efectivo para la reacción de amplificación, esto es, el enzima no debe desnaturalizarse (inactivarse) irreversiblemente cuando se somete a las elevadas temperaturas durante el tiempo necesario para llevar a cabo la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble cadena. La desnaturalización irreversible para los propósitos de esta invención se refiere a una pérdida permanente y completa de actividad enzimática. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización dependerán, por ejemplo, de la concentración de sal tamponadora y de la longitud y composición de nucleótidos de los ácidos nucleicos a desnaturalizar, pero se encontrará típicamente en el intervalo de aproximadamente 90ºC a aproximadamente 105ºC durante un tiempo que dependerá principalmente de la temperatura y de la longitud del ácido nucleico, típicamente de aproximadamente 0,5 a cuatro minutos. Pueden tolerarse temperaturas superiores a medida que la concentración de sal del tampón y/o el contenido en G/C del ácido nucleico aumenta. Preferentemente el enzima no resultará desnaturalizado irreversiblemente a aproximadamente 90-100ºC.
El enzima termoestable de esta invención preferentemente posee una temperatura óptima a la cual funciona que es superior a aproximadamente 40ºC, la cual es la temperatura por debajo de la cual se promueve la hibridación del cebador con el molde, aunque si bien, dependiendo de (1) las concentraciones de sal y de magnesio y (2) la composición y longitud del cebador, la hibridación puede tener lugar a una temperatura superior (por ejemplo 45-70ºC). Cuanto más elevada sea la temperatura óptima para el enzima, mayor será la especificidad y/o selectividad del proceso de extensión dirigido por cebador. Sin embargo, enzimas que son activos por debajo de 40ºC, por ejemplo a 37ºC, se encuentran asimismo dentro del ámbito de esta invención, siempre y cuando sean termoestables. Preferentemente la temperatura óptima se encuentra en el intervalo de aproximadamente 50ºC a 90ºC, más preferentemente 60-80ºC.
El enzima termoestable aquí descrito puede ser obtenido a partir de cualquier fuente y puede ser una proteína nativa o recombinante.
El enzima termoestable aquí es una DNA polimerasa aislada de Thermus aquaticus. Se encuentran disponibles diversas cepas de la misma a partir de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, y está descrita por T.D. Brock, J. Bacteriol (1969) 98: 289-297, y por T. Oshima, Arch. Microbiol (1978) 117: 189-196. Una de estas cepas preferidas es la cepa YT-1.
Para recuperar la proteína nativa, las células se hacen crecer empleando cualquier técnica adecuada. Una de tales técnicas es descrita por Kaledin y col., Biokhimiya (1980), supra. Brevemente, las células se hacen crecer en un litro de medio que contiene ácido nitrilotriacético (100 mg), triptona (3 g), extracto de levadura (3 g), ácido succínico (5 g), sulfito de sodio (50 mg), riboflavina (1 mg), K_{2}HPO_{4} (522 mg), MgSO_{4} (480 mg), CaCl_{2} (222 mg), NaCl (20 mg), y elementos traza. El pH del medio se ajusta a 8,0 \pm 0,2 con KOH. El rendimiento aumenta si se cultiva con aireación vigorosa hasta 20 g/litro de células a una temperatura de 70ºC. Las células en la última fase logarítmica (determinada por absorbancia a 550 nm) se recogen por centrifugación, se lavan con un tampón y se conservan congeladas a -20ºC.
En otro método para hacer crecer las células, descrito en Chien y col., J. Bacteriol (1976), supra, se emplea un medio definido con sales minerales que contiene un 0,3% de ácido glutámico suplementado con biotina 0,1 mg/l, tiamina 0,1 mg/l y ácido nicotínico 0,05 mg/l. Las sales incluyen ácido nitrilotriacético, CaSO_{4}, MgSO_{4}, NaCl, KNO_{3}, NaNO_{3}, ZnSO_{4}, H_{3}BO_{3}, CuSO_{4}, NaMoO_{4}, CoCl_{2}, FeCl_{3}, MnSO_{4}, y Na_{2}HPO_{4}. El pH del medio se ajusta a 8,0 con NaOH.
En la técnica de Chien y col., las células se hacen crecer inicialmente a 75ºC en un agitador de agua caliente. Una vez alcanzada una cierta densidad, se transfiere un l de estas células a recipientes de 16 litros que se colocan en incubadores de aire caliente. Se hace burbujear aire estéril a través de los cultivos y la temperatura se mantiene a 75ºC. Las células se dejan crecer durante 20 horas antes de recogerlas por centrifugación.
Una vez han crecido las células, el aislamiento y purificación del enzima se realiza en seis etapas, cada una de las cuales se realiza a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente, preferentemente a aproximadamente 4ºC.
En la primera etapa o paso, las células, si están congeladas, se descongelan, se desintegran por ultrasonicación, se suspenden en un tampón a pH de aproximadamente 7,5 y se centrifugan.
En la segunda etapa, el sobrenadante se recoge y se fracciona a continuación añadiendo una sal tal como sulfato amónico seco. La fracción apropiada (típicamente al 45-75% de saturación) se recoge, se disuelve en tampón de fosfato de potasio a 0,2 M preferentemente a pH de 6,5, y se dializa contra el mismo tampón.
En la tercera etapa se eliminan los ácidos nucleicos y algunas proteínas. La fracción de la segunda etapa se aplica a una columna de DEAE-celulosa equilibrada con el mismo tampón que el utilizado anteriormente. A continuación la columna se lava con el mismo tampón y las fracciones de eluido que contienen proteína, determinadas por absorbancia a 280 nm, se recogen y se dializan contra tampón de fosfato de potasio 10 mM, preferentemente con los mismos ingredientes que en el primer tampón, pero a un pH de 7,5.
En la cuarta etapa, la fracción recogida de este modo se aplica a una columna de hidroxiapatito equilibrada con el tampón empleado para la diálisis en la tercera etapa. La columna se lava a continuación y el enzima se eluye con un gradiente lineal de un tampón como por ejemplo tampón de fosfato de potasio de 0,01 M a 0,5 M a pH 7,5 conteniendo 2-mercaptoetanol 10 mM y glicerina al 5%. Las fracciones recogidas que contienen actividad del enzima termoestable (por ejemplo, DNA polimerasa) se dializan contra el mismo tampón empleado para la diálisis en la tercera
etapa.
En la quinta etapa, la fracción dializada se aplica a una columna de DEAE-celulosa, equilibrada con el tampón empleado para la diálisis en la tercera etapa. La columna se lava a continuación y el enzima se eluye con un gradiente lineal de un tampón tal como KCl de 0,01 M en el tampón empleado para la diálisis en la tercera etapa. Las fracciones con actividad de enzima termoestable se ensayan a continuación para desoxirribonucleasas contaminantes (endo- y exonucleasas) empleando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, la actividad endonucleásica puede determinarse electroforéticamente a partir del cambio en el peso molecular de DNA de fago \lambda o de DNA plasmídico superenrollado tras la incubación con un exceso de DNA polimerasa. Análogamente, la actividad exonucleásica puede determinarse electoforéticamente a partir del cambio en el peso molecular del DNA tras el tratamiento con un enzima de restricción que corta en diversos puntos.
Las fracciones que se determina que no poseen ninguna actividad desoxirribonucleásica se combinan y se dializan contra el mismo tampón empleado en la tercera etapa.
En la sexta etapa, las fracciones combinadas se colocan en una columna de fosfocelulosa con un volumen de lecho establecido. La columna se lava y el enzima se eluye con un gradiente lineal de un tampón tal como KCl de 0,01 a 0,4 M en un tampón de fosfato de potasio a pH 7,5. Las fracciones combinadas con actividad polimerasa termoestable y sin actividad desoxirribonucleasa se dializan contra un tampón a pH 8,0.
El peso molecular del producto dializado puede ser determinado por cualquier técnica, por ejemplo por SDS-PAGE empleando proteínas marcadoras del peso molecular. El peso molecular de la DNA polimerasa purificada de Thermus aquaticus, se determina que es mediante el método anterior de aproximadamente 86.000-90.000 daltons determinado como se indica en la reivindicación 1.
El enzima termoestable de esta invención puede ser producido asimismo mediante técnicas de DNA recombinante, puesto que el gen que codifica este enzima ha sido clonado a partir del DNA genómico de Thermus aquaticus. La secuencia codificante completa de la polimerasa (Taq) de Thermus aquaticus puede derivarse del bacteriófago CH35:Taq#4-2 en un fragmento de restricción (parcial) BgIII-Asp718 de aproximadamente 3,5 kilobases (kb), contenido en un fragmento de inserto de DNA genómico de aproximadamente 18 kb. Este bacteriófago ha sido depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) el 29 de mayo de 1987, y tiene el número de acceso 40.336. Alternativamente, el gen puede constituirse ligando un fragmento de restricción BgIII-HindIII de aproximadamente 750 pares de bases (pb) aislado a partir del plásmido pFC83 (ATCC 67.422, depositado el 29 de mayo de 1987) con un fragmento de restricción Hindi-Asp718 de aproximadamente 2,8 kb aislado a partir del plásmido pFC85 (ATCC 67.421, depositado el 29 de mayo de 1987). El fragmento de restricción pFC83 incluye el extremo amino terminal del gen de la polimerasa Taq, mientras que el fragmento de restricción de pFC85 contiene el extremo carboxilo terminal. De este modo, la ligación de estos dos fragmentos en el vector digerido adecuadamente con secuencias de control apropiadas tendrá como resultado la traducción de una polimerasa Taq de longitud completa.
Se ha hallado asimismo que la secuencia codificante complete del gen de la polimerasa Taq no es requerida para recuperar un producto génico activo biológicamente con la actividad enzimática deseada. Deleciones amino-terminales en las que aproximadamente un tercio de la secuencia codificante está ausente han tenido como resultado la producción de un producto génico que es muy activo en ensayos de polimerasa.
Además de las deleciones N-terminales, residuos amino-acídicos individuales en la cadena peptídica que comprende la polimerasa Taq pueden ser modificados por oxidación, reducción u otra derivatización, y la proteína puede escindirse para obtener fragmentos que retienen la actividad. Tales alteraciones que no destruyen la actividad no apartan a la secuencia de DNA que codifica tal proteína de la definición de gen.
De este modo, modificaciones de la estructura primaria en sí misma mediante deleción, adición o alteración de los aminoácidos incorporados en la secuencia durante la traducción pueden realizarse sin destruir la actividad de la proteína. Tales sustituciones u otras alteraciones tienen como resultado proteínas que poseen una secuencia amino-acídica codificada por DNA que queda dentro del ámbito contemplado en la presente invención.
Se empleó antisuero policlonal de conejos inmunizados con la polimerasa purificada de 86.000-90.000 daltons de esta invención para sondear una biblioteca de expresión genómica parcial de Thermus aquaticus para obtener la secuencia codificante adecuada como se describe más abajo. La secuencia genómica clonada puede expresarse en forma de polipéptido de fusión, expresarse directamente empleando sus propias secuencias de control o expresarse mediante construcciones que emplean secuencias de control adecuadas para el hospedador particular empleado para la expresión de la enzima.
Por supuesto, la disponibilidad de DNA que codifica estas secuencias proporciona la oportunidad de modificar la secuencia de codones, de modo que se generan formas muteínas (proteínas mutantes) que poseen asimismo actividad DNA polimerasa.
De este modo, estas herramientas pueden proporcionar la secuencia codificante completa de la DNA polimerasa Taq a partir de la cual pueden construirse vectores de expresión aplicables a diversos sistemas de hospedadores, expresándose la secuencia codificante. Resulta asimismo evidente a partir de lo descrito que porciones de la secuencia que codifica la polimerasa Taq son útiles como sondas para recuperar otras secuencias que codifican polimerasas termoestables a partir de diversas especies. En este sentido, porciones del DNA genómico que codifican al menos seis aminoácidos pueden replicarse en coli y las formas desnaturalizadas pueden utilizarse como sondas o pueden sintetizarse sondas de oligodesoxirribonucleótidos que codifican al menos seis aminoácidos y pueden emplearse para recuperar DNAs adicionales que codifican una polimerasa termoestable. Puesto que puede no haber una coincidencia precisa y exacta entre la secuencia de nucleótidos en la forma de Thermus aquaticus y en la porción correspondiente de otras especies, son necesarios probablemente oligómeros que contienen aproximadamente 18 nucleótidos (que codifican el fragmento de seis aminoácidos) para obtener hibridación bajo condiciones de suficiente restrictividad para eliminar falsos positivos. Las secuencias que codifican seis aminoácidos suministrarán información suficiente para tales sondas.
Hospedadores adecuados, sistemas de control y métodos
En general, la producción de una forma recombinante de la polimerasa Taq implica típicamente las siguientes etapas:
En primer lugar, se obtiene un DNA que codifica el enzima maduro (en el sentido que se utiliza aquí incluye todas las muteínas) o una fusión de la polimerasa Taq con una secuencia adicional que no destruye su actividad o con una secuencia adicional escindible en condiciones controladas (por ejemplo con tratamiento con peptidasas) para rendir una proteína activa. Si la secuencia no está interrumpida con intrones, es adecuada para la expresión en cualquier hospedador. Esta secuencia debe estar en una forma escindible y recuperable.
La secuencia codificante escindida o recuperada se coloca a continuación preferentemente unida de forma operativa con secuencias de control adecuadas en un vector de expresión replicable. El vector se utiliza para transformar un hospedador adecuado y el hospedador transformado se cultiva en condiciones favorables para que tenga lugar la producción de la polimerasa Taq recombinante. Opcionalmente, la polimerasa Taq se aísla a partir del medio o a partir de las células; la recuperación y la purificación de la proteína puede no ser necesaria en algunos casos, en los que pueden tolerarse algunas impurezas.
Cada una de las etapas mencionadas anteriormente puede llevarse a cabo de diversas formas diferentes. Por ejemplo, las secuencias codificantes deseadas pueden obtenerse a partir de fragmentos genómicos y pueden emplearse directamente en hospedadores adecuados. Las construcciones para los vectores de expresión operativos en diversos hospedadores se fabrican empleando replicones y secuencias de control adecuadas, tal y como se describe más adelante. Pueden añadirse sitios de restricción adecuados, si no están disponibles normalmente, a los extremos de la secuencia codificante de modo que proporcionan un gen escindible para ser insertado en estos vectores.
Las secuencias de control, los vectores de expresión y los métodos de transformación dependen del tipo de célula hospedadora empleada para expresar el gen. En general, son actualmente útiles como células hospedadoras células procariotas, de levaduras, de insecto o de mamífero. Los hospedadores procariotas son en general los más eficientes y convenientes para la producción de proteínas recombinantes, por lo que son los preferidos para la expresión de la polimerasa Taq.
En el caso particular de la polimerasa Taq, los datos acumulados indican que una deleción considerable en el extremo N-terminal de la proteína puede tener lugar en condiciones tanto nativas como recombinantes, y que la actividad de la proteína queda todavía retenida. Parece que las proteínas nativas aisladas pueden ser el resultado de degradación proteolítica y no de la traducción de un gen truncado. La muteína producida a partir del gen truncado del plásmido pFC85 es, sin embargo, totalmente activa en ensayos de DNA polimerasa, como lo es la producida a partir del DNA que codifica la secuencia codificante completa. Puesto que resulta evidente que ciertas formas acortadas en su extremo N-terminal son activas, las construcciones génicas empleadas para la expresión de la polimerasa pueden incluir asimismo las correspondientes formas acortadas de la secuencia codificante.
Secuencias de control y hospedadores correspondientes
Los procariotas están representados casi siempre por diversas cepas de E. coli. Sin embargo, otras cepas microbianas pueden ser utilizadas, como bacilos, por ejemplo Bacillus subtilis, diversas especies de Pseudomonas, u otras cepas bacterianas. En estos sistemas procarióticos se utilizan vectores plasmídicos que contienen sitios de replicación y secuencias de control derivadas de especies compatibles con el hospedador. Por ejemplo, E. coli se transforma típicamente empleando derivados de pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli por Bolivar y col., Gene (1977) 2:95. El pBR322 contiene genes para la resistencia a amplicilina y tetraciclina, por lo que proporciona marcadores adicionales que pueden ser retenidos o destruidos en la construcción del vector deseado. Las secuencias de control procariotas utilizadas normalmente, que tal y como se definen aquí incluyen promotores para el inicio de la trascripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias de sitio de unión a ribosoma, incluyen promotores utilizados normalmente como el sistema promotor de la \beta-lactamasa (penicilinasa) y de la lactosa (lac) (Chang y col., Nature (1977) 198: 1056), el sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057) y el promotor derivado de lambda P_{L} (Shimatake y col., Nature (1981) 292: 128) y un sitio de unión al ribosoma del gen N, que se ha facilitado para su utilización en forma de casete de control portátil, que comprende una primera secuencia de DNA que es el promotor P_{L} unido de forma operativa con una segunda secuencia de DNA que corresponde al N_{RBS} corriente arriba de una tercera secuencia de DNA que posee al menos un sitio de restricción que permite la escisión dentro de las seis bases en 3' de la secuencia N_{RBS}. Es asimismo útil el sistema de la fosfatasa A (phoA) descrito por Chang y col., en la Publicación de Patente Europea Nº 196.864, publicada el 8 de octubre de 1986, asignada al mismo beneficiario. No obstante, puede utilizarse cualquier sistema promotor adecuado compatible con procariotas.
Además de bacterias, puede utilizarse asimismo como hospedadores microbios eucariotas, como por ejemplo levaduras. Las cepas de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae, levaduras de Baker, son las más utilizadas, aunque otras cepas también están normalmente disponibles. Si bien se ilustran vectores que emplean el origen de replicación de 2 micras (Broach, J.R., Meth. Enz. (1983) 101: 307), se conocen otros vectores plasmídicos adecuados para la expresión en levaduras (véase, por ejemplo, Stinchcomb, y col., Nature (1979) 282: 39, Tschempe y col., Gene (1980) 10: 157, y Clarke, L., y col., Meth Enz. (1983) 101: 300). Las secuencias de control para vectores de levaduras incluyen promotores para la síntesis de enzimas de la glucólisis (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. (1968) 7: 149; Holland y col., Biotechnology (1978) 17: 4900).
Los promotores adicionales conocidos en el campo incluyen el promotor para la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. (1980) 255: 2073), y aquellos para otros enzimas glicolíticos, tales como por ejemplo la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Otros promotores que presentan la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de cultivo son las regiones promotoras del alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, ácido fosfatasa, enzimas de degradación asociados con el metabolismo del nitrógeno y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa (Holland, supra).
Se cree asimismo que son deseables secuencias terminadoras en el extremo 3' de las secuencias codificantes. Tales terminaciones se encuentran en la región 3' no traducida que sigue a las secuencias codificantes en genes derivados de levaduras. Muchos de los vectores ilustrados contienen secuencias de control derivadas del gen de la enolasa contenido en el plásmido peno46 (Holland, M.J., y col., J. Biol.. Chem. (1981) 256: 1385) o del gen LEU2 obtenido a partir de YEp13, (Broach, J., y col., Gene (1978) 8: 121); sin embargo, es adecuado cualquier vector que contenga un promotor, origen de replicación y otras secuencias de control compatibles con levaduras.
Es también posible, por supuesto, expresar genes que codifican polipéptidos en cultivos de células hospedadoras eucariotas derivadas de organismos multicelulares. Véase, por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Cruz and Patterson, editors (1973). Las líneas celulares útiles incluyen mielomas murinos, células N51, VERO y HeLa, y células de ovario de hámster chino (CHO). Los vectores de expresión para tales células incluyen normalmente promotores y secuencias de control compatibles con las células de mamífero como, por ejemplo, los promotores temprano y tardío del Virus de Simio (SV 40) utilizados con frecuencia (Fiers y col., Nature (1978) 273: 113), u otros promotores virales como los derivados de polioma, Adenovirus 2, virus del papiloma bovino, o virus del sarcoma aviar, o promotores de inmunoglobulinas y promotores de choque térmico. En la Patente Estadounidense 4.419.446 se descubre un sistema para expresar DNA en sistemas de mamíferos empleando el BPV como vector. Se describe en la Patente Estadounidense 4.601.978 una modificación de este sistema. Aspectos generales de las transformaciones de sistemas de hospedadores de células de mamífero han sido descritos por Axel, Patente Estadounidense Nº 4.399.216. Actualmente parece ser también que son importantes regiones "estimuladoras" ("enhancer" para la optimización de la expresión; son éstas en general secuencias que se encuentran corriente arriba respecto a la región promotora. Pueden obtenerse orígenes de replicación de fuentes virales, en caso de que sean necesarios. Sin embargo, la integración en el cromosoma es un mecanismo común para la replicación del DNA en eucariotas.
Las células de plantas están asimismo disponibles como hospedadores, y están disponibles también secuencias de control compatibles con células de plantas como por ejemplo el promotor y las secuencias de señal de poliadenilación de la nopalina sintetasa (Depicker, A., y col., J. Mol. Appl. Gen. (1982) 1: 561).
Recientemente, además de lo descrito, han sido descritos sistemas de expresión que emplean células de insecto que utilizan sistemas de control proporcionados por vectores de baculovirus (Miller, D.W. y col., en Genetic Engineering (1986) Setlow, J.K., y col., eds. Plenum Publishing, Vol. 8, págs. 277-297). Estos sistemas son también exitosos en la producción de polimerasa Taq.
Transformaciones
Dependiendo de la célula hospedadora utilizada, la transformación se lleva a cabo empleando técnicas estándar adecuadas para estas células. El tratamiento con calcio empleando cloruro cálcico, como se describe en Cohen, S.N., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1972) 69: 2110, se emplea para procariotas o para otras células que contienen importantes barreras de pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens (Shaw, C.H., y col., Gene (1983) 23: 315) se emplea para ciertos tipos e células de plantas. Para células de mamífero sin tales paredes celulares, se prefiere el método de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology (1978) 52: 546. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo según el método de Van Solingen, P., y col., J. Bact. (1977) 130: 946 y Hsiao, C.L., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 3829.
Construcción de una biblioteca de expresión en \lambdagt11
La estrategia para aislar DNA que codifica las proteínas deseadas, como por ejemplo el DNA que codifica la polimerasa Taq, empleando el vector bacteriófago lambda gt11 es como sigue. Puede construirse una biblioteca de fragmentos AluI flanqueados por EcoRI, generada por digestión completa de DNA de Thermus aquaticus, insertada en el sitio EcoRI en el fago lambda gt11 (Young y Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 1194-1198). Puesto que el único sitio EcoRI en este bacteriófago se localiza en el extremo carboxilo del gen de la \beta-galactosidasa, en DNA insertado (en el marco y orientación adecuados) se expresa como proteína fusionada con la \beta-galactosidasa bajo el control del promotor/operador del operón lactosa.
Las bibliotecas de expresión genómica se escrutan empleando el procedimiento de hibridación en calva con anticuerpos. Una modificación de este procedimiento, descrita como "selección de epítopos", emplea antisuero contra la secuencia de la proteína de fusión codificada por el fago, al objeto de confirmar la identificación de las calvas hibridadas. De este modo, esta biblioteca de fagos recombinantes puede ser escrutada con anticuerpos que reconocen la polimerasa Taq de 86.000-90.000 daltons, con el objetivo de identificar los fagos que llevan segmentos de DNA que codifican los determinantes antigénicos de esta proteína.
Se escrutan aproximadamente 2 x 10^{5} fagos recombinantes empleando antisuero de conejo total contra la polimerasa Taq. En este escrutinio primario, se detectan las señales positivas y una o más de estas valvas son purificadas a partir de calvas candidato que no reaccionan con el suero preinmune y que reaccionan con el suero inmune, siendo analizadas en más detalle. Para examinar las proteínas de fusión producidas por los fagos recombinantes, se producen lisógenos del fago en el hospedador Y1089. Tras la inducción de los lisógenos y la electroforesis en gel de las proteínas resultantes, cada lisógeno puede ser observado para producir una nueva proteína, no hallada en los otros lisógenos, pudiéndose obtener también secuencias duplicadas. Se pican los fagos conteniendo señales positivas; en este caso, una calva positiva se picó para su posterior identificación, replaqueándose a menor densidad para purificar los recombinantes, analizándose los clones purificados por clasificación de tamaño mediante digestión con el enzima de restricción EcoRI. Pueden obtenerse y marcarse adecuadamente de este modo sondas de las secuencias del inserto de DNA aisladas, utilizándose dichas sondas en ensayos convencionales de hibridación de colonias o de calvas, descritos en Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982). La sonda marcada se utilizó para sondear una segunda biblioteca genómica construida en un bacteriófago Charon 35 (Wilhelmine, A.M., y col., Gene (1983) 26: 171-179). Esta biblioteca se realizó a partir de digestiones parciales con Sau3A de DNA genómico de Thermus aquaticus, y los fragmentos fraccionados por tamaño (15-20 kb) se clonaron en el sitio BamHI del fago Charon 35. La sonda se utilizó para aislar fagos que contuvieran el DNA que codifica para la polimerasa Taq. Uno de los fagos resultantes, denominado CH35:Taq#4-2, se halló que contenía la secuencia génica completa. Se aislaron asimismo secuencias parciales que codificaban porciones de la proteína.
Construcción del vector
La construcción de vectores adecuados que contienen las secuencias codificantes y de control deseadas se realiza empleando las técnicas estándar de restricción y ligación bien comprendidas en el campo. Los plásmidos aislados, secuencias de DNA, u oligonucleótidos se escinden, recortan y religan en la forma deseada.
La escisión del DNA específica de sitio se lleva a cabo tratando con el enzima (o enzimas) de restricción adecuado en condiciones que son en general bien comprendidas en el campo, y las características particulares de las cuales vienen especificadas por el fabricante de estos enzimas de restricción disponibles comercialmente. Véase por ejemplo, New England Biolabs, Product Catalog. En general, se escinde aproximadamente 1 \mug de plásmido o de secuencia de DNA con aproximadamente 1 unidad de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón; en los ejemplos aquí descritos, se emplea típicamente un exceso de enzima de restricción para asegurar una completa digestión del DNA sustrato. Se utilizan normalmente tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 2 horas a aproximadamente 37ºC, si bien pueden tolerarse variaciones. Tras casa incubación, la proteína se elimina por extracción con fenil/cloroformo, pudiendo ser seguida de una extracción con éter, recuperándose el ácido nucleico de las fracciones acuosas por precipitación con etanol. Si se desea, puede realizarse una separación por tamaño de los fragmentos escindidos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o en gel de agarosa empleando técnicas estándar. Una descripción general de las separaciones por tamaño puede encontrarse en Methods in Enzymology (1980) 65: 499-560.
Los fragmentos resultantes de la escisión con enzimas de restricción pueden ser romados mediante tratamiento con el fragmento mayor de la DNA polimerasa I de E. coli (fragmento Klenow) en presencia de los cuatro trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs) empleando tiempos de incubación de aproximadamente 15 a 25 minutos a de 20 a 25ºC en Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM y dNTPs 50-100 \muM. El fragmento Klenow rellena los extremos 5' cohesivos, pero recorta las cadenas sencillas sobresalientes en 3', incluso cuando están presentes los cuatro dNTPs. Si se desea, puede realizarse una reparación selectiva suministrando únicamente un dNTP, o bien dNTPs seleccionados, dentro de las limitaciones impuestas por la naturaleza de los extremos cohesivos. Tras el tratamiento con Klenow, la mezcla se extrae con fenol/cloroformo y se precipita con etanol. El tratamiento en condiciones apropiadas con nucleasa S1 tiene como resultado la hidrólisis de cualquier porción de cadena sencilla.
Pueden prepararse oligonucleótidos sintéticos empleando el método de triéster de Matteucci y col., (J. Am. Chem. Soc. (1981) 103: 3185-3191) o empleando métodos de síntesis automatizada. Se logra la fosforilación de las cadenas sencillas antes de la hibridación o para el marcaje empleando un exceso de polinucleótido quinasa, por ejemplo 10 unidades de polinucleótido quinasa para 1 nM de sustrato en presencia de Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 5 mM, ATP 1-2 mM. Si la fosforilación se realiza para el marcaje de una sonda, el ATP contendrá una alta actividad específica de \gamma-^{32}P.
Las ligaciones se realizan en volúmenes de 15 a 30 \mul bajo las siguientes condiciones y temperaturas estándar: Tris-HCl 20m mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, BSA 33 \mug/ml, NaCl 10 mM - 50 mM, y o bien 40 \muM ATP y 0,01-0,02 unidades (Weiss) de DNA ligasa de T4 a 0ºC (para la ligación de "extremos cohesivos", o bien 1 mM ATP y 0,3-0,6 unidades (Weiss) de DNA ligasa de T4 a 14ºC (para la ligación de "extremos romos"). Las ligaciones intermoleculares de "extremos cohesivos" se llevan a cabo normalmente a concentraciones totales de DNA de 33 a 100 \mug/ml (concentración total de extremos 5-100 nM). Las ligaciones intermoleculares de "extremos romos" (empleando normalmente un exceso molar de engarces de 10 a 30 veces) se realiza a una concentración total de extremos de 1 \muM.
En la construcción de vectores empleando "fragmentos de vectores", el fragmento de vector se trata normalmente con fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) para eliminar el fosfato en 5' y evitar la religación del vector. Las digestiones con BAP se llevan a cabo a pH 8 en Tris-HCl aproximadamente 150 mM, en presencia de Na^{+} y Mg^{2+}, empleando aproximadamente 1 unidad de BAP por mg de vector a 60ºC durante aproximadamente una hora. Con el objetivo de recuperar los fragmentos de ácidos nucleicos, la preparación se extrae con fenol/cloroformo y se precipita con etanol. Alternativamente, la religación puede ser evitada en vectores que han sido digeridos doblemente mediante digestión adicional con enzima de restricción de los fragmentos no deseados.
Modificación de las secuencias de DNA
Se emplea la mutagénesis específica de sitio dirigida por cebador para las porciones de vectores derivadas de cDNA o de DNA genómico que requieren modificaciones de secuencia. Esta técnica es actualmente un estándar en el campo, y se realiza empleando un oligonucleótido sintético, cebador complementario, excepto por un desapareamiento limitado que representa la mutación deseada, a un DNA de fago de cadena sencilla que se va a mutagenizar. De forma resumida, el oligonucleótido sintético se utiliza como cebador para dirigir la síntesis de una cadena complementaria a la del fago, y el DNA de doble cadena resultante se transforma en una bacteria hospedadora que puede soportar el fago. Se plaquean cultivos de las bacterias transformadas en capa de agar, lo que permite la formación de calvas a partir de células individuales portadoras del fago.
En teoría, el 50% de las nuevas calvas contendrán el fago, que poseerá, en forma de cadena sencilla, la forma mutada, mientras que el otro 50%, poseerá la secuencia original. Las calvas se transfieren a filtros de nitrocelulosa y las réplicas en el filtro se hibridan con un cebador sintético fosforilado a una temperatura que permite la hibridación de un apareamiento exacto, pero a la cual los desapareamientos con la cadena original son suficientes para impedir la hibridación. A continuación, las calvas que hibridan con la sonda se pican y se cultivan, y se recupera el
DNA.
Verificación de la construcción
En las construcciones que se describirán más adelante, se confirman las ligaciones correctas para las construcciones plasmídicas transformando en primer lugar la cepa de E. coli MM294, u otro hospedador adecuado, con la mezcla de ligación. Se seleccionan los transformantes con ampicilina, tetraciclina u otra resistencia a antibióticos, o utilizando otros marcadores, dependiendo del modo de construcción del plásmido, tal y como es conocido en el campo. Se preparan los plásmidos a partir de los transformantes según el método de Clewell, D.B., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1969) 62: 1159, opcionalmente tras la amplificación con cloramfenicol (Clewell, D.B., J. Bacteriol. (1972) 110: 667). El DNA aislado se analiza por restricción o mediante secuenciación según el método de los dideoxis de Sanger, F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 5463, como se describe adicionalmente en Messing y col., Nucleic Acids Res. (1981) 9: 309, o mediante el método de Maxam y col., Methods in Enzymology (1980) 65: 499.
Ejemplificación de los hospedadores
Las cepas de hospedadores empleadas aquí para la clonación y expresión son las siguientes:
Para la clonación y secuenciación, y para la expresión de las construcciones bajo el control de la mayoría de promotores bacterianos, se empleó como hospedador la cepa de E. coli MM294 obtenida a partir del E. coli Genetic Stock Center GCSC#6135. Para la expresión bajo el control del promotor P_{L}N_{RBS}, puede utilizarse la cepa K12 MC1000 lisógeno lambda de coli, N_{7}N_{53}cI857 SusP_{80}, ATCC 39531. Aquí se utiliza coli DG116, la cual se depositó en la ATCC el 7 de abril de 1987 (ATCC 53606).
Para los recombinantes del fago M13, se emplean cepas de E. coli susceptibles a la infección de los fagos, como por ejemplo la cepa DG98 de E. coli K12. La cepa DG98 ha sido depositada en la ATCC el 13 de julio de 1984 y posee el número de acceso 39768.
La expresión en mamíferos puede llevarse a cabo en células COS-7, COS-A2, CV-1 y murinas, y la expresión basada en células de insecto en Spodoptera frugiperda.
Estabilización de la actividad enzimática
Para la estabilidad a largo plazo, el enzima aquí descrito debe conservarse en un tampón que contenga uno o más detergentes no iónicos poliméricos. Tales detergentes son generalmente aquellos que poseen un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 100 a 250.000 preferentemente aproximadamente de 4.000 a 200.000 daltons, y que estabilizan el enzima a un pH de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 9,5, preferentemente aproximadamente de 4 a 8,5. Ejemplos de tales detergentes incluyen aquellos especificados en las páginas 295-298 de Emulsifiers & Detergents, de McCutcheon, edición norteamericana (1983), publicada por la McCutcheon Deivision de MC Publishing Co., 175 Rock Road, Glen Rock, NJ (EE.UU.), el descubrimiento completo de los cuales se incorpora aquí por referencia. Preferentemente los detergentes se seleccionan del grupo que incluye éteres de alcoholes grasos y lauril éteres etoxilados, aquilfenoles etoxilados, compuestos de octilfenoxi polietoxi etanol, alcoholes de cadena lineal modificados oxietilados y/o oxipropilados, compuestos de monooleato de polietilén glicol, compuestos de polisorbato, y éteres fenólicos de alcoholes grasos. Los más particularmente preferidos son Tween 20, de ICI Americas Inc., Wilmington, DE, que es un monolaurato de sorbitano polioxietilado (20), e Iconol^{TM} NP-40, de BASF Wyandotte Corp., Pawrsippany, NJ, que es un alquil fenol etoxilado (nonilo).
El enzima termoestable de esta invención puede ser utilizado para cualquier propósito en el que tal enzima sea necesario o deseable. En un aspecto particularmente preferido, el enzima de la presente invención se emplea en el protocolo de amplificación establecido a continuación.
Protocolo de amplificación
El protocolo de amplificación que utiliza el enzima de la presente invención puede ser el proceso para la amplificación de secuencias de ácido nucleico existentes que se descubre y reivindica en la Publicación de Patente Europea Nº 200.362, supra. Preferentemente, sin embargo, el enzima de la presente invención se utiliza en el proceso de amplificación descrito a continuación.
En general, el proceso de amplificación implica una reacción en cadena para la producción, en cantidades exponenciales relativas al número de etapas de reacción implicadas, de al menos una secuencia de ácido nucleico específica, siempre que (a) los extremos de la secuencia requerida sean conocidos en detalle suficiente para que puedan ser sintetizados oligonucleótidos que hibriden con ellos, y (b) que una pequeña cantidad de la secuencia esté disponible para iniciar la reacción en cadena. El producto de la reacción en cadena será un dúplex de ácido nucleico discreto con extremos que corresponderán a los extremos de los cebadores específicos empleados.
Cualquier secuencia de ácido nucleico, en forma purificada o no purificada, puede ser utilizado como ácido nucleico, o ácidos nucleicos, de partida, siempre que contenga, o que se sospeche que contenga, la secuencia de ácido nucleico específica deseada. De este modo, el proceso puede emplear, por ejemplo, DNA o RNA, incluyendo RNA mensajero, pudiendo ser este DNA o RNA de cadena sencilla o de cadena doble. Adicionalmente, puede utilizarse un híbrido de DNA-RNA que contenga una cadena de cada. Puede emplearse asimismo una mezcla de cualquiera de estos ácidos nucleicos, o bien los ácidos nucleicos producidos en una reacción de amplificación previa como se describe aquí empleando los mismos o diferentes cebadores. La secuencia específica de ácido nucleico a amplificar puede ser sólo una fracción de una molécula mayor o puede estar presente inicialmente como una molécula discreta, de forma que la secuencia especifica constituye el ácido nucleico completo.
No es necesario que la secuencia a amplificar esté presente inicialmente en forma pura; puede ser una fracción menor de una mezcla compleja, como por ejemplo una porción del gen de la \beta-globina contenida en DNA humano completo (como se ejemplifica en Saiki y col., Science, 230: 1530-1534 (1985) o una porción de una secuencia de ácido nucleico debida a un microorganismo en particular, el cual microorganismo puede constituir solamente una fracción muy pequeña de una muestras biológica en particular. La secuencia de ácido nucleico de partida puede contener más de una secuencia de ácido nucleico específica deseada, que puede ser la misma o diferente. Por consiguiente, el proceso de amplificación es útil no sólo para la producción de grandes cantidades de una secuencia de ácido nucleico específica, sino también para amplificar simultáneamente más de una secuencia de ácido nucleico específica diferente localizada en la misma molécula o en moléculas diferentes de ácido nucleico.
El ácido nucleico, o ácidos nucleicos, pueden ser obtenidos de cualquier fuente, como por ejemplo de plásmidos tales como el pBR322, de DNA o RNA clonados, o de DNA o RNA naturales de cualquier origen, incluyendo bacterias, levaduras, virus, orgánulos, y de organismos superiores como plantas o animales. El DNA o RNA puede ser extraído de la sangre, de material tisular como por ejemplo vello coriónico, o de células amnióticas mediante diversas técnicas como por ejemplo las descritas en Maniatis y col., supra, p. 280-281.
Si se emplean sondas que son especificas de una secuencia que se va a amplificar y a detectar posteriormente, pueden utilizarse directamente las células sin extracción del ácido nucleico si se suspenden un tampón hipotónico y se calientan a aproximadamente 90-100ºC hasta que tenga lugar la lisis celular y la dispersión de los componentes intracelulares, generalmente de 1 a 15 minutos. Tras la etapa de calentamiento, los reactivos de amplificación pueden ser añadidos directamente a las células lisadas.
Cualquier secuencia de ácido nucleico especifica puede ser producida mediante el proceso de amplificación. Es únicamente necesario que sean conocidos un número suficiente de bases en ambos extremos de la secuencia con suficiente detalle, de modo que puedan prepararse dos cebadores oligonucleótidos que hibridarán con diferentes cadenas de la secuencia deseada, y con posiciones relativas a lo largo de la secuencia de modo que un producto de extensión sintetizado a partir de un cebador, cuando se separa de su molde (cadena complementaria), puede servir como molde para la extensión a partir de otro cebador de una secuencia de ácido nucleico de longitud definida. Cuanto mayor sea el conocimiento de las bases en ambos extremos de la secuencia, mayor será la especificidad de los cebadores para la secuencia diana de ácido nucleico, y por consiguiente mayor será la eficiencia del proceso.
Se comprenderá que la palabra "cebador" tal y como se utiliza a partir de aquí, puede referirse a más de un cebador, en particular en el caso en el que exista alguna ambigüedad en la información relativa a la secuencia, o secuencias, terminales del fragmento a amplificar. Por ejemplo, en el caso que se infiera una secuencia de ácido nucleico a partir de información de secuencia de proteína, se emplearán para cada cadena una colección de cebadores que contengan secuencias que representen todas las variaciones posibles de codones basadas en la degeneración del código genético. Un cebador de esta colección será homólogo con el extremo de la secuencia deseada a amplificar.
Los cebadores oligonucleótidos puede prepararse empleando cualquier método adecuado, tal como, por ejemplo, los métodos de fosfotriéster y fosfodiéster descritos anteriormente, o formas automatizadas de los mismos. En una de tales formas automatizadas, se emplean dietilfosforamiditos como materiales de partida, y pueden fabricarse tal como se describe por Beaucage y col., Tetrahedron Letters (1981), 22: 1859-1862. Un método para sintetizar oligonucleótidos en un soporte sólido modificado se describe en la Patente Estadounidense Nº 4.458.066. Es posible asimismo utilizar un cebador que ha sido aislado de una fuente biológica (como por ejemplo una digestión por endonucleasas de restricción).
La secuencia específica de ácido nucleico se produce empleando el ácido nucleico que contiene dicha secuencia como molde. La primera etapa implica poner en contacto cada cadena de ácido nucleico con cuatro trifosfatos de nucleótidos diferentes y un cebador oligonucleótido para cada secuencia de ácido nucleico diferente a amplificar o detectar. Si los ácidos nucleicos a amplificar o detectar son DNA, entonces los trifosfatos de nucleótidos son dATP, dCTP, dGTP y TTP.
Las cadenas de ácido nucleico se emplean como molde para la síntesis de cadenas de ácido nucleico adicionales. Esta síntesis puede ser realizada empleando cualquier método adecuado. En general se lleva a cabo una solución acuosa tamponada, preferentemente a pH 7-9, más preferentemente de aproximadamente 8. Preferentemente, se añade un exceso molar (para un ácido nucleico clonado, generalmente aproximadamente 1000:1 cebador: molde, y para ácido nucleico genómico, normalmente aproximadamente 10^{6}:1 cebador: molde) de los dos cebadores oligonucleótidos al tampón que contiene las cadenas de molde separadas. Queda entendido, sin embargo, que la cantidad de cadena complementaria puede no ser conocida si el proceso aquí descrito se emplea para aplicaciones diagnósticas, de modo que la cantidad de cebador en relación con la cantidad de cadena complementaria no puede ser determinada con certeza. Sin embargo, a efectos prácticos, la cantidad de cebador añadido estará generalmente en exceso molar sobre la cantidad de cadena complementaria (molde) cuando la secuencia a amplificar está contenida en una mezcla de cadenas de ácido nucleico de cadena larga complejas. Se prefiere un gran exceso molar para mejorar la eficiencia del proceso.
Preferentemente, la concentración de trifosfatos de nucleótidos es de 150-200 \muM de cada uno en el tampón de amplificación, y está presente MgCl_{2} en el tampón en una cantidad de 1,5-2 mM para mejorar la eficiencia y la especificidad de la reacción.
La solución resultante se trata seguidamente de un modo u otro en función de si los ácidos nucleicos a amplificar o detectar son de cadena doble o de cadena sencilla. Si los ácidos nucleicos son de cadena sencilla, entonces no es necesario emplear ninguna etapa de desnaturalización, y la mezcla de reacción se mantiene a una temperatura que facilita la hibridación del cebador con su secuencia diana complementaria (molde). Esta temperatura es generalmente de aproximadamente 35ºC a 65ºC o más, preferentemente de aproximadamente 37-60ºC durante un tiempo efectivo, generalmente de medio minuto a cinco minutos, preferentemente de uno a tres minutos. Preferentemente, se emplean 45-58ºC para la polimerasa Taq y cebadores de más de 15 mer para aumentar la especificidad de la hibridación del cebador. Cebadores más cortos necesitan temperaturas inferiores.
La cadena complementaria del ácido nucleico de cadena sencilla original puede sintetizarse añadiendo uno o más cebadores oligonucleótidos a la reacción. Si se añade un cebador único adecuado, se sintetiza un producto de extensión de cebador en presencia del cebador, el enzima termoestable y los trifosfatos de nucleótidos. El producto será parcialmente complementario al ácido nucleico de cadena sencilla se hibridará con la cadena de ácido nucleico para formar un dúplex de cadenas de longitud desigual que pueden ser separadas a continuación en cadenas sencillas como se ha descrito anteriormente para producir dos cadenas separadas sencillas complementarias. Alternativamente, pueden añadirse dos cebadores apropiados al ácido nucleico de cadena sencilla y puede llevarse a cabo la reacción.
Si el ácido nucleico contiene dos cadenas, es necesario separar las cadenas del ácido nucleico antes de que pueda ser utilizado como molde. Esta separación de las cadenas puede llevarse a cabo mediante cualquier método de desnaturalización adecuado, incluyendo medios físicos, químicos o enzimáticos. Un método físico preferido de separar las cadenas del ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que esté desnaturalizado completamente (*299%). La desnaturalización por calor típica implica temperaturas en el intervalo de aproximadamente 90 a 105ºC durante tiempos generalmente en el intervalo de aproximadamente 0,5 a 5 minutos. Preferentemente, la temperatura efectiva de desnaturalización es de 90 a 100ºC durante de 0,5 a 3 minutos. La separación de las cadenas puede inducirse asimismo mediante un enzima de la clase de enzimas conocida como helicasas o por el enzima RecA, que posee una actividad helicasa y en la presencia de riboATP se sabe que desnaturaliza el DNA. Las condiciones de reacción adecuadas para separar las cadenas de los ácidos nucleicos con helicasas han sido descritas por Jun, B., Abdel-Monem, M., y Hoffmann-Berling, J., CSH-Quantitative Biology, 43: 63-67 (1978), y las técnicas para el empleo de RecA están revisadas en C. Radding, Am. Rev. Genetics, 16: 405-37 (1982). La desnaturalización produce dos cadenas separadas complementarias de longitud igual o desigual.
Si el ácido nucleico de doble cadena se desnaturaliza por calor, la mezcla de reacción se deja enfriar a una temperatura que promueva la hibridación de cada cebador presente con su secuencia diana complementaria (molde). Esta temperatura es de aproximadamente 35ºC a 65ºC o más, dependiendo de los reactivos, preferentemente de 37-60ºC, mantenida durante un tiempo eficaz, generalmente de 0,5 a 5 minutos, y preferentemente de 1 a 3 minutos. A efectos prácticos, la temperatura se reduce simplemente de aproximadamente 95ºC a una temperatura tan baja como 37ºC, preferentemente hasta aproximadamente 45-58ºC para la polimerasa Taq, y la hibridación tiene lugar a una temperatura en este intervalo.
Dependiendo de si el ácido nucleico es de cadena doble o de cadena sencilla, el enzima termoestable podrá ser añadido en la etapa de desnaturalización o cuando la temperatura se haya reducido hasta, o esté en el intervalo de, la temperatura que promueve la hibridación. La mezcla de reacción se calienta seguidamente hasta una temperatura a la cual la actividad del enzima está promovida u optimizada, es decir, una temperatura suficiente para aumentar la actividad del enzima en la facilitación de la síntesis de los productos de extensión de cebador a partir de la hibridación del cebador y el molde. La temperatura debe ser realmente suficiente para sintetizar un producto de extensión a partir de cada cebador que es complementario a cada molde de ácido nucleico, pero no debe ser tan alta como para desnaturalizar cada producto de extensión de su molde complementario (es decir, la temperatura es generalmente menor de aproximadamente 80-90ºC).
Dependiendo principalmente de los tipos de enzimas y de ácido nucleico, o ácidos nucleicos, a emplear, la temperatura efectiva típica para esta reacción de síntesis se encuentra generalmente en el intervalo de aproximadamente 40 a 80ºC, preferentemente de 50 a 75ºC. La temperatura está más preferentemente en el intervalo de aproximadamente 65-75ºC cuando se emplean una DNA polimerasa de Thermus aquaticus. El período de tiempo requerido para esta síntesis puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,5 a 40 minutos o más, dependiendo principalmente de la temperatura, de la longitud del ácido nucleico, del enzima y de la complejidad de la mezcla de ácido nucleico, preferentemente de uno a tres minutos. Si el ácido nucleico es más largo, se requiere generalmente un período de tiempo más largo. La presencia de dimetilsulfóxido (DMSO) no es necesaria o recomendada puesto que se ha encontrado que el DMSO inhibía la actividad enzimática de la polimerasa Taq.
La cadena sintetizada de novo y su cadena de ácido nucleico complementaria forman una molécula de doble cadena que se emplea en las subsiguientes etapas del proceso. En la siguiente etapa, las cadenas de la molécula de doble cadena se separan por desnaturalización por calor a una temperatura efectiva para desnaturalizar la molécula, pero a una temperatura no tan alta como para que el enzima termoestable sea completamente e irreversiblemente desnaturalizado o inactivado. Dependiendo principalmente del tipo de enzima y de la longitud del ácido nucleico, esta temperatura está generalmente en el intervalo de aproximadamente 90 a 105ºC, más preferentemente de 90 a 100ºC, y el tiempo para la desnaturalización se encuentra típicamente en el intervalo de 0,5 a cuatro minutos, dependiendo principalmente de la temperatura y de la longitud del ácido nucleico.
Tras este tiempo, la temperatura se reduce a una temperatura que promueve la hibridación del cebador con su molécula de cadena sencilla complementaria (molde) producida en la etapa anterior. Tal temperatura está descrita anteriormente.
Tras esta etapa de hibridación, o en lugar de (o concurrentemente con), la etapa de hibridación, la temperatura se ajusta a una temperatura que es efectiva para promover la actividad del enzima termoestable para permitir la síntesis de un producto de extensión de cebador empleando como molde la cadena sintetizada de novo a partir de la etapa anterior. De nuevo, la temperatura no debe ser tan alta como para separar (desnaturalizar) el producto de extensión de su molde, como se ha descrito previamente (normalmente de 40 a 80ºC durante de 0,5 a 40 minutos, preferentemente de 50 a 70ºC durante uno-tres minutos). La hibridación puede tener lugar durante esta etapa, de modo que la etapa previa de enfriamiento tras la desnaturalización no es requerida. En tal caso, empleando etapas simultáneas, el intervalo de temperatura preferido es de 50-70ºC.
Las etapas de calentamiento y enfriamiento para la separación e hibridación de cadenas y síntesis de producto de extensión pueden ser repetidas con tanta frecuencia como se desee para producir la cantidad deseada de la secuencia de ácido nucleico específica, dependiendo de cual sea el uso último. La única limitación es la cantidad de cebadores, enzima termoestable y trifosfatos de nucleótidos presente. Preferentemente, las etapas se repiten al menos dos veces. Para el uso en la detección, el número de ciclos dependerá, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Por ejemplo, se requerirán menos ciclos si la muestra a amplificar es pura. Si la muestra es una mezcla compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más ciclos para amplificar la señal suficientemente para su detección. Para la detección y amplificación general, el proceso se repite preferentemente al menos 20 ve-
ces.
Cuando se emplean sondas marcadas específicas de secuencia como se describe más adelante, preferentemente las etapas se repiten al menos cinco veces. Cuando se emplea DNA genómico humano con tales sondas, el proceso se repite preferentemente 15-30 veces para amplificar la secuencia lo suficiente como para producir una señal claramente detectable, es decir, de modo que el ruido de fondo no interfiera con la detección.
Como se describirá con mayor detalle más adelante, la cantidad de secuencia de ácido nucleico específica producida se acumulará de forma exponencial.
No es necesario añadir nucleótidos, cebadores o enzima termoestable adicionales tras la adición inicial, siempre que el enzima no se haya desnaturalizado o inactivado irreversiblemente, en cuyo caso es necesario volver a añadir enzima tras cada etapa de desnaturalización. La adición de tales materiales en cada etapa, de cualquier modo, no afectará a la reacción de forma adversa.
Cuando se desea producir más de una secuencia de ácido nucleico específica a partir del primer ácido nucleico o mezcla de ácidos nucleicos, se utiliza el número adecuado de cebadores oligonucleótidos diferentes. Por ejemplo, si se desea producir dos secuencias de ácido nucleico específicas diferentes, se utilizan cuatro cebadores. Dos de los cebadores son específicos para una de las secuencias de ácido nucleico específicas y los otros dos cebadores son específicos para la segunda secuencia de ácido nucleico específica. De este modo, cada una de las dos secuencias específicas diferentes pueden ser producidas de forma exponencial con el presente proceso.
Una vez ha pasado el tiempo suficiente para producir la cantidad deseada de la secuencia de ácido nucleico específica, la reacción puede pararse inactivando el enzima mediante cualquier método conocido (por ejemplo, añadiendo EDTA, fenol, SDS o CHCl_{3}), o separando los componentes de la reacción.
El proceso de amplificación puede ser realizado de forma continua. En un aspecto de un proceso automatizado, la mezcla de reacción puede someterse a ciclos de temperatura de modo que la temperatura está programada para ser controlada a un cierto nivel durante un cierto tiempo.
Un instrumento adecuado para este propósito es una máquina automática para manipular la reacción de amplificación de esta invención. Este instrumento utiliza un sistema de manipulación de líquidos controlado por computador para realizar las transferencias en líquido del enzima conservado a una temperatura controlada en un primer receptáculo a un segundo receptáculo cuya temperatura esta controlada por la computadora para adecuarse a un cierto perfil de incubación. El segundo receptáculo conserva la secuencia o secuencias de ácido nucleico o amplificar más los trifosfatos de nucleótidos y los cebadores. El computador incluye un interfaz de usuario a través del cual el usuario puede incorporar los parámetros del proceso que controlan las características de las diversas etapas en la secuencia de amplificación, como por ejemplo los tiempos y temperaturas de incubación, la cantidad de enzima a transferir,
etc.
Un aparato preferido que puede ser empleado utiliza un sistema de ciclos de temperatura sin sistema de manipulación de líquidos puesto que el enzima no necesita ser transferido en cada ciclo. Tal aparato consiste en los siguientes sistemas:
1.
Un recipiente conductor del calor para sostener un cierto número de tubos, preferentemente tubos de 500 \mul, que contienen la mezcla de reacción de trifosfatos de nucleótidos, cebadores, secuencias de ácido nucleico y enzima.
2.
Un sistema para calentar, enfriar y mantener el recipiente conductor del calor por encima y por debajo de la temperatura ambiente, el cual sistema posee una vía de entrada para recibir una señal de control para controlar a cuál de las temperaturas el recipiente debe ser calentado, enfriado o mantenido. (Este sistema puede consistir en bombas de calor Peltier disponibles de Materials Electronics Products Corporation, en Trenton, NJ, o un intercambiador de calor de agua).
3.
Un sistema computerizado (por ejemplo un controlador por microprocesador), acoplado a la vía de entrada de dicho sistema, para generar las señales que controlan automáticamente la secuencia de amplificación, los niveles de temperaturas, y la pendiente y temporización de las temperaturas.
En otro aspecto, el enzima empleado para la síntesis de los productos de extensión de cebador puede ser inmovilizado en una columna. Los otros componentes de la reacción pueden hacerse circular de forma continua mediante una bomba a través de la columna y una espiral de calentamiento dispuestas en serie. De este modo, los ácidos nucleicos producidos pueden ser desnaturalizados repetidamente sin inactivar el enzima.
El protocolo de amplificación se muestra de forma esquemática a continuación, en donde el DNA de doble cadena conteniendo la secuencia deseada [S] formado por cadenas complementarias [S^{+}] y [S^{-}] se utiliza como ácido nucleico. Durante el primero y cada ciclo de reacción subsiguiente, la extensión de cada cebador oligonucleótido sobre el molde original producirá una nueva molécula de ssDNA (DNA de cadena sencilla) producto de longitud indefinida que finaliza con uno solo de los cebadores. Estos productos, a los que nos referiremos a partir de ahora como "productos largos", se acumularán de forma lineal; esto es, la cantidad presente tras cualquier número de ciclos será proporcional a este número de ciclos.
Los productos largos producidos de este modo actuarán como moldes para uno u otro de los cebadores oligonucleótidos durante los ciclos subsiguientes, y producirán moléculas de la secuencia deseada [S^{+}] o [S^{-}]. Estas moléculas funcionarán asimismo como moldes para uno u otro de los cebadores oligonucleótidos, produciendo [S^{+}] y [S^{-}] adicionales, y de este modo puede mantenerse una reacción en cadena que tendrá como resultado la acumulación de [S] a una velocidad exponencial en relación con el número de ciclos.
\newpage
Los productos secundarios formados por las híbridaciones de oligonucleótidos diferentes de las deseadas no son autocatalíticas (excepto en casos raros), por lo que se acumulan a una velocidad lineal.
La secuencia específica a amplificar, [S], puede ser representada esquemáticamente como:
101
Los cebadores oligonucleótidos adecuados serían:
100
de modo que si el DNA que contiene [S]
1
se separa en cadenas sencillas y estas cadenas sencillas se hacen hibridar con los Cebadores 1 y 2, pueden catalizarse las siguientes reacciones de extensión con una polimerasa termoestable en presencia de los cuatro trifosfatos de nucleótidos:
2
Tras la desnaturalización de los dos dúplex formados, los productos son:
3
Si estas cuatro cadenas se dejan rehibridar con los Cebadores 1 y 2 en el siguiente ciclo, la polimerasa termoestable catalizará las siguientes reacciones:
4
5
Si se separan las cadenas de los cuatro dúplex anteriores, encontraremos las siguientes cadenas:
6
7
Se observará que cada cadena que termina con la secuencia de oligonucleótido de un cebador y con la secuencia complementaria del otro cebador es la secuencia de ácido nucleico específica [S] que se desea producir.
La cantidad de ácido nucleico original permanece constante en la totalidad del proceso, puesto que no se replica. La cantidad de los productos largos aumenta linealmente porque se producen únicamente a partir del ácido uncleico original. La cantidad de la secuencia específica aumenta exponencialmente. De este modo, la secuencia específica pasará a ser la especie predominante. Esto queda ilustrado en la siguiente tabla, en la que se indican las cantidades relativas de las especies teóricamente presentes tras n ciclos, asumiendo un 100% de eficiencia en cada ciclo.
Número de cadenas dobles después de 0 a n ciclos
8
Cuando se utiliza como molde un ácido nucleico de cadena sencilla, únicamente se forma un producto largo por ciclo.
Puede amplificarse una secuencia dentro de una secuencia dada tras un número dado de amplificaciones para obtener mayor especificidad de la reacción añadiendo tras al menos un ciclo de amplificación un conjunto de cebadores que son complementarios a secuencias internas (que no están en los extremos) de la secuencia a amplificar. Tales cebadores pueden ser añadidos en cualquier etapa y proporcionarán un fragmento amplificado más corto. Alternativamente, un fragmento más largo puede ser preparado empleando cebadores con extremos no complementarios, pero que poseen algún tipo de solapamiento con los cebadores utilizados previamente en la amplificación.
El método aquí descrito puede ser utilizado para clonar una secuencia de ácido nucleico en particular para su inserción en un vector de expresión adecuado. El vector puede ser utilizado a continuación para transformar un organismo hospedador adecuado para producir un producto génico de la secuencia mediante métodos estándar de tecnología de DNA recombinante.
El proceso de amplificación aquí descrito puede rendir una mezcla de ácidos nucleicos, resultantes de el ácido nucleico molde original, los productos objetivo amplificados esperados, y varios productos no objetivo como ruido de fondo. El producto amplificado puede ser asimismo una mezcla si el DNA molde original contuviera múltiples secuencias diana, como en el caso de un genoma diploide heterocigoto, o cuando existe una familia de genes relacionados.
Los cebadores aquí descritos pueden ser modificados para facilitar la clonación rápida y específica de la mezcla de DNAs producida por la reacción de amplificación. En una de estas modificaciones, un sitio de restricción está contenido en cada uno de los cebadores o en la secuencia a amplificar y clonar. Preferentemente, se incorporan los mismos sitios de restricción o diferentes en los extremos 5' de los cebadores, para obtener sitios de restricción en los dos extremos del producto amplificado. Cuando se corta con los enzimas apropiados, el producto amplificado puede ser insertado fácilmente en un vector plasmídico o viral y clonado. Esta clonación permite el análisis o la expresión de productos amplificados individuales, no de una mezcla.
Si los cebadores poseen sitios de restricción incorporados en ellos, puede utilizarse el mismo sitio de restricción para ambos cebadores. Sin embargo, el uso de sitios diferentes permite la inserción del producto en el vector con una orientación específica y suprime las inserciones múltiples, así como inserciones derivadas de amplificaciones basadas en uno solo de los dos cebadores. La orientación específica es útil cuando se clona en vectores de secuenciación de cadena sencilla, cuando se emplean sondas de hibridación de cadena sencilla, o cuando el producto clonado va a ser expresado.
Un método para preparar los cebadores consiste en elegir una secuencia de cebador que difiera mínimamente de la secuencia diana. Se investigan para su homología con los sitios de restricción adecuados para el vector deseado las regiones en las que cada uno de los cebadores debe situarse. Por ejemplo, la secuencia diana "CAGTATTCCGA..." difiere e únicamente una base de una que contenga un sitio BamHI. Se elige una secuencia de cebador complementaria exactamente con la secuencia diana en su extremo 3', y que contenga la secuencia alterada y el sitio de restricción cerca del extremo 5' (por ejemplo, "CAGgATCCGA...", donde la letra en minúscula simboliza un desapareamiento con la secuencia diana). La secuencia alterada mínimamente no interferirá con la capacidad del cebador para hibridar con la secuencia diana original e iniciar la polimerización. Tras el primer ciclo de amplificación, el cebador es copiado, se convierte en diana, y es exactamente complementario a los nuevos cebadores.
Después del proceso de amplificación, los productos se cortan con los enzimas de restricción adecuados, se separa opcionalmente la digestión de restricción de los inhibidores de la ligación, como por ejemplo los trifosfatos de nucleótidos y las sales, por ejemplo haciendo pasar la digestión por una columna de desalado, o una columna de cromatografía de peso molecular, o a través de una membrana, y el producto o productos de digestión que contienen la secuencia amplificada a clonar es/son insertados por ligación en un vector de clonación como por ejemplo el bacteriófago M13. El vector de clonación posee generalmente un marcador seleccionable y puede poseer asimismo opcionalmente un promotor. A continuación, el gen puede ser secuenciado y/o expresado, si codifica una proteína, mediante técnicas bien conocidas. El gen puede ser asimismo secuenciado añadiendo un cebador adecuado durante el proceso de amplificación, siendo este cebador complementario a la porción deseada que se va a secuenciar. El cebador formará un producto de extensión, y la extensión de la amplificación con tal producto de extensión proporcionará información sobre la secuencia.
Otro método para preparar los cebadores implica tomar el extremo 3' de los cebadores de la secuencia diana y añadir el sitio o sitios de restricción adecuados al extremo 5' del cebador. Para el ejemplo anterior, puede añadirse un sitio Hindi para obtener la secuencia "cgaagcttCAGTATCCGA...", donde las letras en minúscula son como se ha descrito arriba. Las bases añadidas no contribuirán a la hibridación en el primer ciclo de amplificación, pero serán complementarias en ciclos subsiguientes. Los productos de amplificación finales se cortan a continuación con un enzima o enzimas de restricción y se clonan y expresan como se ha descrito anteriormente. El gen a amplificar puede ser, por ejemplo, la beta-hemoglobina humana o los genes HLA, DQ, DR o DP-\alpha y -\beta humanos.
Como alternativa, a pesar de que es menos preferido y menos eficiente, se emplea un método de clonación mediante ligación de extremos romos en lugar de ligación de extremos cohesivos (empleando enzimas de restricción), en el que se aplica el procedimiento de amplificación básico sin tener en cuenta los sitios de restricción en los cebadores o secuencia(s) a clonar. Sin embargo, las etapas deben repetirse un número suficiente de veces para producir suficiente(s)
secuencia(s) amplificada(s) para que tenga lugar la ligación. La ligación en extremos romos requiere que estén presentes mayores concentraciones de secuencia(s) y vector(es) de clonación que en la ligación en extremos cohesivos. Adicionalmente, la ligación debe tener lugar en presencia de una ligasa, como por ejemplo la ligasa de T4, ligasa de E. coli y ligasa. Una vez se ha obtenido e producto amplificado, el procedimiento de ligación es un procedimiento estándar empleando condiciones bien conocidas para aquellos expertos en el campo.
El método de clonación que no implica la ligación de extremos romos controla la orientación o multiplicidad de inserción del producto amplificado en el vector de clonación.
Adicionalmente, el proceso aquí descrito puede utilizarse para la mutagénesis in vitro. Los cebadores oligonucleótidos no necesitan ser exactamente complementarios con la secuencia de ácido nucleico a amplificar. Es únicamente necesario que sean capaces de hibridar con la secuencia lo suficientemente bien como para ser extendidos por el enzima termoestable. El producto de una reacción de amplificación en el que los cebadores empleados son no exactamente complementarios con el molde original contendrá la secuencia del cebador en lugar de la del molde, introduciéndose de este modo una mutación in vitro. En ciclos adicionales, esta mutación será amplificada con una eficiencia no disminuida puesto que no se requieren hibridaciones con desapareamiento adicionales. El mutante producido de este modo puede ser insertado en un vector apropiado mediante técnicas estándar de biología molecular, y puede conferir propiedades de mutante a este vector, como el potencial para la producción de una proteína alterada.
El proceso para producir una secuencia de DNA alterada como se ha descrito anteriormente podría ser repetido en el DNA alterado empleando diferentes cebadores para inducir cambios adicionales en la secuencia. En este sentido, podrían producirse gradualmente una serie de secuencias mutantes en las que cada nueva adición a la serie podría diferir sólo ligeramente de la anterior, pero podría diferir de la fuente de secuencia de DNA original de una forma cada vez mayor. De este modo, pueden producirse en último término cambios que no es posible realizar en una sola etapa debido a la incapacidad de funcionar de un cebador con importantes desapareamientos.
Adicionalmente, el cebador puede contener como parte de su secuencia una secuencia no complementaria, siempre que una cantidad suficiente del cebador contenga una secuencia que sea complementaria a la cadena a amplificar. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que no es complementaria a la secuencia del molde (como por ejemplo un promotor, engarce, secuencia codificante, etc.) puede ser unida al extremo 5' de uno o de ambos cebadores, y de este modo ser añadida al producto del proceso de amplificación. Tras la adición del cebador de extensión, se realizan un número suficiente de ciclos para obtener la cantidad deseada de nuevo molde que contiene el inserto de nucleótido no complementario. Esto permite la producción de grandes cantidades de los fragmentos combinados en un período de tiempo relativamente corto (por ejemplo, dos horas o menos) empleando una técnica simple.
El método aquí descrito puede ser utilizado asimismo para permitir la detección y/o caracterización de secuencias de ácido nucleico específicas asociadas con enfermedades infecciosas, alteraciones genéticas o alteraciones celulares como por ejemplo el cáncer, por ejemplo oncogenes. La amplificación es útil cuando la cantidad de ácido nucleico disponible para el análisis es muy pequeña, como es el caso, por ejemplo, del diagnóstico prenatal de la anemia de células falciformes, empleando DNA obtenido de células fetales. La amplificación es particularmente útil si tal análisis debe ser realizado sobre una muestra pequeña empleando técnicas de detección no radiactivas, que pueden ser inherentemente poco sensibles, o en el caso de que se empleen técnicas radiactivas, pero que sea deseable una detección rápida.
Para los propósitos de esta invención, las enfermedades genéticas pueden incluir deleciones y/o mutaciones específicas en el DNA genómico de cualquier organismo, como por ejemplo, anemia de células falciformes, \alpha-talasemia, \beta-talasemia, y similares. La anemia de células falciformes puede ser detectada rápidamente a través de un análisis de restricción de oligómeros como se describe en la Publicación de Patente Europea PE 164.054, publicada el 11 de diciembre de 1985, o vía un análisis del tipo RFLP tras la amplificación de la secuencia de DNA adecuada mediante el presente método. La \alpha-talasemia puede detectarse por la ausencia de una secuencia, y la \beta-talasemia puede detectarse por la presencia de un sitio de restricción polimórfico conectado estrechamente a una mutación que causa la enfermedad.
Todas estas enfermedades genéticas pueden ser detectadas mediante la amplificación de la secuencia adecuada y mediante su análisis por transferencia Southern sin emplear sondas radiactivas. En tal proceso, por ejemplo, una pequeña muestra de DNA de, por ejemplo, líquido amniótico que contiene una concentración muy baja de la secuencia deseada, es amplificada, cortada con un enzima de restricción, y analizada mediante una técnica de transferencia Southern. El uso de sondas no radiactivas está facilitado por la elevada concentración de la señal amplificada.
En otro aspecto, una pequeña muestra de DNA puede ser amplificada hasta un nivel conveniente y seguidamente puede realizarse un ciclo adicional de reacciones de extensión en las que derivados de nucleótido que son fácilmente detectables (como por ejemplo, trifosfatos de nucleótidos marcados con ^{32}-P o con biotina) son incorporados directamente en el producto final de DNA, que puede ser analizado mediante restricción y separación electroforética o mediante cualquier otro método adecuado.
En un aspecto adicional, el ácido nucleico puede ser expuesto a una endonucleasa de restricción particular antes de la amplificación. Puesto que una secuencia que ha sido cortada no puede ser amplificada, la aparición de un fragmento amplificado, a pesar de la restricción previa de la muestra de DNA, implica la ausencia de un sitio para la endonucleasa dentro de la secuencia amplificada. La presencia o ausencia de una secuencia amplificada puede ser detectada mediante un método adecuado.
Una aplicación práctica de esta técnica puede ser ilustrada por su uso en la facilitación de la detección de la anemia de células falciformes mediante la técnica de restricción de oligómeros descrita aquí y en la PE 164.054, supra, y en Saiki y col., Bio/Technology, 3, pp. 1008-1012 (1985). La anemia de células falciformes es una enfermedad de la hemoglobina causada por un cambio en un solo par de bases en el sexto codón del gen de la \beta-globina.
El método de esta invención puede utilizarse también para detectar directamente variaciones de un solo par de bases en una secuencia de ácido nucleico (como por ejemplo DNA genómico) empleando oligonucleótidos específicos de secuencia. En este método, la variación de secuencia, bien sea resultante de cáncer, una enfermedad infecciosa o una enfermedad genética, por ejemplo una lesión genética, es detectada directamente, eliminando la necesidad de una digestión de restricción, electroforesis y manipulaciones del gel, de otro modo requeridas. El uso de oligonucleótidos específicos de secuencia en un formato de transferencia en punto tras la amplificación, como se describe aquí, proporciona una especificidad y sensibilidad mejoradas de la sonda; una señal interpretable puede ser obtenida con 0,04 \mug de muestra en seis horas. Asimismo, si la cantidad de muestra aplicada sobre la membrana aumenta hasta 0,1-0,5 \mug, pueden ser utilizados oligonucleótidos marcados no isotópicamente en lugar de las sondas radiactivas empleadas en métodos anteriores. Además, el proceso descrito aquí a continuación es aplicable para el uso de oligonucleótidos específicos de secuencia de menos de 19 mer de longitud, lo que permite el uso de oligonucleótidos específicos de secuencia más discriminatorios.
Por lo que respecte a las enfermedades genéticas, mientras que la RELP requiere la asociación de un sitio de restricción polimórfico con la enfermedad, los oligonucleótidos específicos de secuencia detectan directamente la lesión genética, y son en general más útiles para el análisis de enfermedades tales como la enfermedad de la hemoglobina C, \alpha-1-antitripsina y \beta-talasemia, que se originan en mutaciones de una sola base. Adicionalmente, los oligonucleótidos pueden ser utilizados para distinguir entre variantes genéticas que representan alelos diferentes (por ejemplo, para el tipado HLA), indicando la posibilidad de realización de un kit de tipado HLA basado en oligonucleótidos específicos de secuencia que incluye un enzima termoestable.
En un aspecto de la invención aquí descrita en el que es necesario detectar una variación de un nucleótido en la secuencia, la muestra, amplificada como se ha descrito anteriormente empleando un cebador para cada cadena de cada ácido nucleico que se sospecha que contiene la variación en el nucleótido, se aplica directamente sobre una serie de membranas, y cada membrana se hibrida con una sonda de oligonucleótido específico de secuencia marcado diferente. Un procedimiento para aplicar la muestra sobre una membrana se describe en Kafotos y col., Nucleic Acids Research, 7: 1541-1552 (1979).
De forma resumida, la muestra de DNA fijada a la membrana puede ser pretratada con una solución de prehibridación que contiene dodecil sulfato sódico, Ficoll, albúmina sérica y diversas sales antes de la adición de la sonda. A continuación, una sonda de oligonucleótido marcada que es específica para cada variación de secuencia a detectar es añadida a una solución de hibridación similar a la solución de prehibridación. La solución de hibridación se aplica a la membrana y la membrana se somete a condiciones de hibridación que dependerán del tipo de sonda y de su longitud, del tipo y concentración de los ingredientes, etc. En general, la hibridación se lleva a cabo a aproximadamente de 25ºC a 75ºC, preferentemente de 35ºC a 65ºC, durante de 0,25 a 50 horas, preferentemente menos de tres horas. Cuanto mayores sean las condiciones de restrictividad, mayor complementariedad se requerirá para la hibridación entre la sonda y la muestra. Si el nivel de ruido de fondo es elevado, la restrictividad puede aumentarse de forma proporcional. Las condiciones de restrictividad pueden incorporarse también en el lavado.
Tras la hibridación, la muestra se lava de la sonda no hibridada empleando cualquier medio adecuado, como por ejemplo lavando una o más veces con concentraciones variables de soluciones de EDTA fosfato salino estándar (SSPE) (NaCl 180 mM, NaHPO_{4} 10 mM y EDTA 1 mM, pH 7,4) a 25ºC-75ºC durante aproximadamente de 10 minutos a 1 hora, dependiendo de la temperatura. El marcaje se detecta seguidamente empleando cualquier técnica de detección adecuada.
El oligonucleótido específico de secuencia empleado aquí es un oligonucleótido que se prepara y selecciona en general tal y como se describe anteriormente para preparar y seleccionar los cebadores. Tal y como se describe anteriormente, el oligonucleótido específico de secuencia debe comprender la región de la secuencia que comprende la variación nucleotídica a detectar y debe ser específico para la variación nucleótica a detectar. Por ejemplo, si se desea detectar si una muestra contiene la mutación para la anemia de células falciformes, se preparará un oligonucleótido que contendrá el sitio de secuencia nucleotídica característico del gen de la \beta-globina normal, y se preparará un oligonucleótido que contendrá la secuencia nucleotídica característica del alelo para las células falciformes. Cada oligonucleótido se hibridará con duplicado de la misma muestra para determinar si la muestra contiene la
mutación.
Las áreas polimórficas de los genes HLA de clase II están localizadas en regiones específicas del primer exón y están flanqueadas por secuencias conservadas, de modo que pueden prepararse cebadores oligonucleótidos complementarios a cadenas opuestas de los extremos 5' y 3' conservados del primer exón.
El número de oligonucleótidos empleados para la detección de las áreas polimórficas de los genes HLA de clase II variará dependiendo del tipo de gen, el cual posee regiones de variación en los pares de bases que pueden estar agrupadas o separadas. Si las regiones están agrupadas, como en el caso de HLA-DQ-\alpha, entonces se emplea un oligonucleótido para cada alelo. Si las regiones están separadas, como en el caso de HLA-DQ-\beta y HLA-DR-\beta, entonces se empleará para cada alelo más de una sonda, cada una comprendiendo una variante alélica. En el caso de HLA-DQ-\beta y HLA-DR-\beta, se emplean tres sondas para las tres regiones del locus en las que pueden producirse variantes alélicas. Para la detección de la diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) se emplean cuatro sondas para el segundo exón de HLA-DR-\beta.
Pueden inferirse haplotipos a partir de análisis de segregación en familias o, en algunos casos, mediante análisis directo de la muestra de DNA individual. Pueden identificarse combinaciones alélicas específicas (haplotipos) de reactividades de oligonucleótidos específicos de secuencia en células heterozigotas empleando digestión por enzimas de restricción del DNA genómico antes de la amplificación.
Por ejemplo, si en DQ\beta se encuentran tres subregiones altamente variables, A, B y C, dentro de una región amplificada única, y si existen seis secuencias diferentes en cada región (A1-6, B1-6, C1-6), entonces un individuo puede ser tipado en el locus DQ\beta mediante análisis con sondas de oligonucleótidos específicos de secuencia para contener A1, A2; B2, B3; C1, C4; con las combinaciones de haplotipos posibles de A1, B2, C1; A1, B2, C4; A2, B2, C1; A2, B2, C4; A1, B3, C1; A1, B3, C4; A1, B2, C1; y A1, B2, C4.
Si el DNA genómico se digiere con un enzima de restricción polimórfico antes de la amplificación, y si el enzima corta ambos alelos entre los cebadores, no se produce reactividad con las sondas específicas de secuencia debido a una falta de amplificación, y el resultado no es informativo. Si el enzima no corta ningún alelo, los resultados de la sonda con DNA genómico digerido y no digerido son los mismos y el resultado no es informativo. Sin embargo, si el enzima corta solamente un alelo, entonces pueden inferirse ambos haplotipos comparando los patrones de reactividad de la sonda sobre DNA digerido y no digerido.
Los haplotipos pueden deducirse comparando las reactividades de oligonucleótidos específicos de secuencia con DNA genómico no cortado y con DNA genómico cortado con uno o varios enzimas que se conoce que son polimórficos y que reconocen sitios entre los cebadores.
La longitud del oligonucleótido específico de secuencia dependerá de numerosos factores, incluyendo la molécula diana en particular que se va a detectar, la fuente de oligonucleótido y la composición en nucleótidos. Para los propósitos de esta invención, el oligonucleótido específico de secuencia contiene típicamente de 15 a 25 nucleótidos, aunque puede contener más o menos nucleótidos. Mientras que los oligonucleótidos que tienen una longitud de al menos 19 mer pueden estimular la especificidad y/o la sensibilidad, las sondas de menos de 19 mer, por ejemplo 16 mer, pueden mostrar una mayor discriminación específica de secuencia, presumiblemente porque un solo desapareamiento es más desestabilizante. Debido a que la amplificación aumenta la especificidad de modo que una longitud mayor es menos crucial, y las temperaturas de hibridación y lavados pueden ser menores para la misma concentración de sal, se prefiere utilizar oligonucleótidos que tienen menos de 19 mer de longitud.
En el caso en que la muestra se coloca en primer lugar en la membrana y posteriormente se detecta con el oligonucleótido, el oligonucleótido debe estar marcado con una porción de marcaje adecuada, la cual puede ser detectada mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Los medios inmunoquímicos incluyen anticuerpos que son capaces de formar un complejo con el oligonucleótido en condiciones adecuadas, y los medios bioquímicos incluyen polipéptidos o lectinas capaces de formar un complejo con el oligonucleótido en condiciones adecuadas. Los ejemplos incluyen los colorantes fluorescentes, los reactivos densos a los electrones, los enzimas capaces de depositar productos de reacción insolubles o que pueden ser detectados cromogénicamente, como por ejemplo la peroxidasa de rábano, la fosfatasa alcalina, un marcaje radiactivo tal como ^{32}P o biotina. Si se emplea biotina, puede utilizarse un brazo espaciador para unirla al oligonucleótido. Preferentemente, la porción de marcaje es peroxidasa de rábano.
Alternativamente, en un formato de transferencia en punto "reverso", al menos uno de los cebadores y/o al menos uno de los cuatro trifosfatos de nucleótidos se marca con un marcaje detectable, de modo que la secuencia amplificada resultante está marcada. Estas porciones marcadas pueden estar presentes inicialmente en la mezcla de reacción, o ser añadidas durante un ciclo posterior de la amplificación para introducir el marcaje en el producto de amplificación. A continuación, un oligonucleótido específico de secuencia no marcado capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico amplificada, si la variación o variaciones de secuencia (bien sean normales o mutantes) están presentes, se deposita en (se fija a) la membrana en condiciones de prehibridación como se ha descrito anteriormente. La muestra amplificada se añade a continuación a la membrana pretratada bajo condiciones de hibridación tal como se ha descrito anteriormente. Finalmente, se emplean medios de detección para determinar si una secuencia amplificada en la muestra de ácido nucleico ha hibridado con el oligonucleótido fijado a la membrana. La hibridación tendrá lugar únicamente si la secuencia unida a la membrana que contiene la variación está presente en el producto de amplificación, esto es, únicamente si una secuencia de la sonda es complementaria a una región de la secuencia amplificada.
En otra versión del formato de transferencia en punto "reverso", la amplificación se lleva a cabo sin emplear un marcaje, como en el caso del formato de transferencia en punto "directo" como se ha descrito anteriormente, y una sonda de oligonucleótido específico de secuencia marcado capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico que contiene la variación, si está presente, se deposita en (se fija a) la membrana en condiciones de prehibridación como se ha descrito anteriormente. La muestra amplificada se añade a continuación a la membrana pretratada bajo condiciones de hibridación tal como se ha descrito anteriormente. A continuación el oligonucleótido marcado o un fragmento del mismo se libera de la membrana de un modo tal que puede emplearse un medio de detección para determinar si una secuencia amplificada en la muestra ha hibridado con el oligonucleótido marcado. La liberación puede tener lugar, por ejemplo, añadiendo un enzima de restricción a la membrana que reconoce un sitio de restricción en la sonda. Este procedimiento, conocido como restricción de oligómero, está descrito con mayor detalle en la Publicación de Patente Europea PE 164.054 publicada el 11 de diciembre de 1985.
En ambos métodos de transferencia en punto directa y reserva, las enfermedades genéticas que pueden detectarse incluyen deleciones, inserciones y/o sustituciones específicas en cualquier par de bases, mutaciones o polimorfismos en ácidos nucleicos, por ejemplo DNA genómico, de cualquier organismo. Ejemplos de enfermedades en las que se conoce una variación de pares de bases incluyen la anemia de células falciformes, la enfermedad de la hemoglobina C, la \alpha-talasemia, la \beta-talasemia y similares. Otras enfermedades que pueden detectarse incluyen enfermedades cancerosas como las que implican los oncogenes RAS, por ejemplo el oncogén n-RAS, y enfermedades infecciosas.
Puede emplearse asimismo un proceso de transferencia en punto para el tipado de HLA en los campos de transplante de tejidos, susceptibilidad a enfermedades y determinación de la paternidad. Los genes HLA de clase II, que consisten en los genes \beta de las regiones HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP, son altamente polimórficos; su complejidad genética a nivel de DNA es significativamente mayor que el polimorfismo definido actualmente por el tipado serológico. Adicionalmente, el proceso aquí descrito puede ser empleado para detectar cuatro secuencias de DNA que codifican para proteínas de HLA de clase II \beta (por ejemplo, DR\beta), asociadas con la diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM). De forma resumida, las cuatro secuencias de DNA asociadas con la IDDM se seleccionan del grupo que consiste en:
1) 5'-GAGCTGCGTAAGTCTGAG-3'
2) 5'-GAGGAGTTCCTGCGCTTC-3'
3) 5'-CCTGTCGCCGAGTCCTGG-3' Y
4) 5'-GACATCCTGGAAGACGAGAGA-3',
o las cadenas de DNA que son complementarias a las mismas. Pueden prepararse sondas específicas de secuencia que hibridarán con una o más de estas secuencias.
Pueden diagnosticarse varias enfermedades genéticas por la presencia en muestras clínicas de secuencias de DNA específicas características del microorganismo causante. Estos incluyen bacterias, tales como Salmonella, Chlamydia, Neisseria; virus tales como el virus de la hepatitis; y parásitos como el Plasmodium responsable de la malaria. El Certificado de Reexamen de Patente Estadounidense B14.358.535, publicado el 13 de mayo de 1986 para Falkow y col., describe el uso de sondas de hibridación e DNA específicas para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Puede estar presente un número relativamente pequeño de organismos patógenos en una muestra clínica de un paciente infectado, y el DNA extraído de los mismos puede constituir únicamente una fracción muy pequeña del DNA total en la muestra. La amplificación específica de secuencias sospechosas antes de la inmovilización y detección de la hibridación de las muestras de DNA podría mejorar en gran medida la sensibilidad y especificidad de procedimientos tradicionales.
El uso clínico rutinario de las sondas de DNA para el diagnóstico de enfermedades infecciosas se simplificaría considerablemente si pudieran emplearse sondas marcadas no radiactivamente como se describe en la PE 63.879 para Ward. En este procedimiento, sondas de DNA conteniendo biotina se detectan con enzimas cromogénicos unidos a avidina o a anticuerpos específicos para biotina. Este tipo de detección es conveniente, pero relativamente poco sensible. La combinación de la amplificación de DNA específica mediante el presente método y el uso de sondas marcadas de forma estable podría proporcionar la conveniencia y la sensibilidad requeridas para hacer útiles los procedimientos de Falkow y Ward en un sistema clínico de rutina.
Un uso específico de la tecnología de amplificación para la detección o monitorización del virus del SIDA se describe del modo siguiente. El proceso de amplificación y detección se emplea con cebadores y sondas que están diseñadas para amplificar y detectar, respectivamente, secuencias de ácidos nucleicos que están sustancialmente conservados en los ácidos nucleicos de los virus del SIDA y que son específicas de los ácidos nucleicos de los virus del SIDA. De este modo, la secuencia a detectar debe ser suficientemente complementaria a los ácidos nucleicos en los virus del SIDA como para iniciar la polimerización, preferentemente a temperatura ambiente, en presencia del enzima y de trifosfatos de nucleótidos.
Adicionalmente, la sonda puede ser una sonda biotinilada en la que la biotina está unida a un brazo espaciador de fórmula:
-Y-(CH_{2})_{2}-O-[(CH_{2})_{x}O]_{y}-CH_{2}CH_{2}-NH
en el que Y es O, NH o N-CHO, x es un número de 1 a 4, e y es un número de 2 a 4. El brazo espaciador está unido a su vez a una porción psoraleno de fórmula:
9
La porción psoraleno se intercala en una sonda de "círculo incompleto" ("gapped circle") entrecruzándola, como lo describen Courage-Tebbe y col., Biochim. Biophys. Acta, 697 (1982), 1-5, en la que la región de hibridación de cadena sencilla del círculo incompleto comprende la región contenida en los cebadores. Los detalles de este procedimiento de biotinilación y de transferencia en punto se describen con mayor detalle en la Patente Estadounidense asignada normalmente nº 4.582.789, publicada el 15 de abril de 1986, y la Patente Estadounidense nº 4.617.261, publicada el 14 de octubre de 1986.
El proceso de amplificación puede utilizarse asimismo para producir cantidades suficientes de DNA a partir de una sola copia de un gen humano, de modo que pueda emplearse una tinción de DNA sencilla y no específica como por ejemplo la tinción con bromuro de etidio para diagnosticar el DNA directamente.
Además de para detectar enfermedades infecciosas y anormalidades patológicas en el genoma de organismos, el proceso de amplificación puede ser empleado asimismo para detectar polimorfismos de DNA que pueden no estar asociados con ningún estado patológico.
En resumen, el proceso de amplificación se comprueba que proporciona un proceso para amplificar una o más secuencias de ácido nucleico específicas empleando una reacción en cadena y un enzima termoestable, en la cual reacción se producen productos de extensión que pueden actuar subsiguientemente como moldes para reacciones de extensión de cebador posteriores. El proceso es especialmente útil en la detección de secuencias de ácido nucleico que están presentes inicialmente sólo en cantidades muy pequeñas.
Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración únicamente, sin que sea su propósito en ningún modo limitar el alcance de la invención reivindicada. En estos ejemplos, todos los porcentajes son en peso para sólidos, y en volumen para los líquidos, a menos que se indique lo contrario, y todas las temperaturas se dan en grados Celsius.
Ejemplo I I. Síntesis de los cebadores
Se prepararon los siguientes cebadores oligonucleótidos mediante el método descrito a continuación:
5'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3' (PCO3)
5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3' (PCO4)
Estos cebadores, ambos de 20 mer, hibridan con cadenas opuestas del DNA genómico, estando sus extremos 5' separados por una distancia de 110 pares de bases.
A.
Procedimientos de síntesis automática: Los dietilfosfaramiditos, sintetizados de acuerdo con Beaucage y Caruthers (Tegrahedron Letters (1981) 22: 1859-1862) se condensaron secuencialmente en un soporte de vidrio de poro controlado derivatizado con nucleótidos. El procedimiento incluyó la destritilación con ácido tricloroacético en dicloro-metano, la condensación empleando benzotriazol como donador de protones activante, y la protección con anhídrido acético y dimetilaminopiridina en tetrahidrofurano y piridina. La duración del ciclo fue de aproximadamente 30 minutos. Los rendimientos de cada etapa fueron esencialmente cuantitativos y se determinaron por recolección y examen espectroscópico del dimetoxitritil alcohol liberado durante la destritilación.
B.
Procedimientos de desprotección y purificación de oligodesoxirribonucleótidos: Se eliminó el soporte sólido de la columna y se expuso a 1 ml de hidróxido amónico concentrado a temperatura ambiente durante cuatro horas en un tubo cerrado. El soporte se eliminó seguidamente por filtración y la solución conteniendo el oligodesoxinucleótido parcialmente protegido se mantuvo a 55ºC durante cinco horas. Se eliminó el amoníaco y el residuo se aplicó a un gel de poliacrilamida preparativo. Se realizó la electroforesis a 30 volts/cm durante 90 minutos, tras los cuales se identificó la banda que contenía el producto por transiluminación UV sobre una placa fluorescente. La banda se cortó y se eluyó con 1 ml de agua destilada durante toda la noche a 4ºC. Esta solución se aplicó a una columna de HPLC-RP y se eluyó con un gradiente 7-13% de acetonitrilo en tampón de acetato de amonio 1% a pH 6,0. La elusión se controló mediante absorbancia al UV a 260 nm, se recogió la fracción adecuada, se cuantificó por absorbancia al UV en un volumen fijo y se evaporó a sequedad a temperatura ambiente en una centrífuga de vacío.
C.
Caracterización de los oligodesoxirribonucleótidos: Alícuotas de ensayo de los oligonucleótidos purificados se marcaron con ^{32}P con polinucleótido quinasa y \lambda-^{32}P-ATP. Los compuestos marcados se examinaron por autorradiografía de geles de poliacrilamida al 14-20% tras la electroforesis durante 45 minutos a 50 volts/cm. Este procedimiento verifica el peso molecular. Se verificó la composición en bases por digestión del oligodesoxirribonucleótido hasta nucleósidos empleando una diesterasa de veneno y fosfatasa alcalina bacteriana, separándose y cuantificándose a continuación los nucleósidos derivados empleando una columna de HPLC de fase reversa y una fase móvil de acetonitrilo al 10%, acetato amónico al 1%.
II. Aislamiento del DNA genómico humano de una línea celular
Se aisló DNA genómico humano de elevado peso molecular de una línea de células T, Molt 4, homozigota para \beta-globina normal, disponible a partir del Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, NJ, como GB2219C, empleando esencialmente el método de Maniatis y col., supra, p. 280-281.
III. Purificación de una polimerasa de Thermus aquaticus
Se hizo crecer la cepa YT1 de Thermus aquaticus, disponible sin restricción de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, como ATCC nº 25.104, en frascos con el siguiente medio:
\newpage
Citrato sódico 1 mM
Fosfato potásico, pH 7,9 5 mM
Cloruro amónico 10 mM
Sulfato magnésico 0,2 mM
Cloruro cálcico 0,1 mM
Cloruro sódico 1 g/l
Extracto de levadura 1 g/l
Triptona 1 g/l
Glucosa 2 g/l
Sulfato ferroso 0,01 mM
(El pH se ajustó a 8,0 antes de autoclavar)
Se inoculó un fermentador de 10 litros con un frasco de cultivo de inóculo cultivado en el medio anterior durante toda la noche a 70ºC. Se emplearon un total de 600 ml del frasco de inóculo para inocular 10 litros del mismo medio. El pH se controló a 8,0 con hidróxido amónico, se mantuvo el oxígeno disuelto al 40%, a una temperatura de 70ºC y con una velocidad de agitación de 400 rpm.
Tras el crecimiento de las células, se purificaron empleando el protocolo (con ligeras modificaciones) de Kaledin y col., supra, durante las cinco primeras etapas, y utilizando un protocolo diferente en la sexta etapa. La totalidad de las seis etapas se realizaron a 4ºC. La velocidad de fraccionamiento en columnas fue de 0,5 columnas/hora, y los volúmenes de gradientes durante la elusión fueron de 10 volúmenes de columna. Un protocolo de purificación alternativo y preferido se proporciona en el Ejemplo VI a continuación.
De forma resumida, el cultivo anterior de células de T. Aquaticus se recogió por centrifugación tras nueve horas de cultivo, en fase logarítmica tardía, a una densidad celular de 1,4 g de peso seco por litro. Se resuspendieron 20 gramos de células en 80 ml de un tampón que consistía en Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, EDTA 0,1 mM. Las células se lisaron y el lisado se centrífugo durante dos horas a 35.000 rpm en un rotor de 4ºC. Se recogió el sobrenadante (fracción A), y se recogió la fracción de proteína que precipitaba entre el 45 y el 75% de saturación de sulfato amónico, se disolvió en un tampón consistente en tampón de fosfato de potasio 0,2 M, pH 6,5, 2-mercaptoetanol 10 mM, y glicerina al 5%, dializándose finalmente contra el mismo tampón para rendir la fracción B.
Se aplicó la fracción B a una columna de DEAE-celulosa de 2,2 x 30 cm, equilibrada con el tampón descrito más arriba. Se lavó a continuación la columna con el mismo tampón y las fracciones conteniendo proteína (determinadas por absorbancia a 280 nm) se recogieron. Las fracciones de proteína combinadas se dializaron contra un segundo tampón, conteniendo tampón de fosfato de potasio 0,01 M, pH 7,5, 2-mercaptoetanol 10 mM, y glicerina al 5%, para rendir la fracción C.
Se aplicó la fracción C a una columna de 2,6 x 21 cm de hidroxiapatito, equilibrada con un segundo tampón. La columna se lavó a continuación y el enzima se eluyó con un gradiente lineal de tampón de fosfato de potasio de 0,01 a 0,5, pH 7,5, conteniendo 2-mercaptoetanol 10 mM, y glicerina al 5%. Las fracciones conteniendo actividad DNA polimerasa (90-180 mM fosfato potásico) fueron combinadas, se concentraron cuatro veces empleando una celda agitada Amicon y membrana YM10, y se dializaron contra el segundo tampón para rendir la fracción D.
Se aplicó la fracción D a una columna de DEAE-celulosa de 1,6 x 28 cm, equilibrada con el segundo tampón. Se lavó la columna y se eluyó la polimerasa con un gradiente lineal de fosfato potásico de 0,01 a 0,5 M en el segundo tampón. Las fracciones se ensayaron para endonucleasas y exonucleasas contaminantes detectando electoforéticamente el cambio en el peso molecular de DNA del fago \lambda o de DNA plasmídico superenrollado tras la incubación con un exceso de DNA polimerasa (para endonucleasa) y tras el tratamiento con un enzima de restricción que corta el DNA en diversos fragmentos (para exonucleasas).Únicamente se reunieron aquellas fracciones de DNA polimerasa (fosfato potásico 65-95 mM) que presentaban una contaminación mínima por nucleasas. Se añadió al combinado gelatina autoclavada en una cantidad de 250 \mug/ml, y se realizó una diálisis contra el segundo tampón para rendir la fracción E.
Se aplicó la fracción E a una columna de fosfocelulosa y se eluyó con 100 ml de un gradiente (gradiente de 0,01 a 0,4 M KCl en tampón de fosfato de potasio 20 mM, pH 7,5). Las fracciones se ensayaron para endo/exonucleasas contaminantes como se ha descrito anteriormente, así como para actividad polimerasa (mediante el método de Kaledin y col.), y seguidamente se reunieron. Las fracciones reunidas se dializaron contra el segundo tampón, y seguidamente se concentraron por diálisis contra glicerina al 50% y el segundo tampón.
El peso molecular de la polimerasa se determinó por SDS-PAGE. Las proteínas marcadoras fueron fosforilasa B (92.500), albúmina sérica bovina (66.200), ovoalbúmina (45.000), anhidrasa carbónica (31.000), inhibidor de tripsina de haba de soja (21.500) y lisozima (14.400).
Los datos preliminares sugieren que la polimerasa presenta un peso molecular de aproximadamente 86.000-90.000 daltons, no de 62.000-63.000 daltons como se describe en la literatura (por ejemplo en Kaledin y col.).
Se incubó la polimerasa en 50 \mul de una mezcla conteniendo Tris-HCl 25 mM, pH 6,4 y pH 8,0, KCl 0,1 M, MgCl_{2} 10 mM, 2-mercaptoetanol 1 mM, 10 mmoles de cada uno de los trifosfatos de nucleótidos dGTP, dATP, y TTP, y 0,5 \muCi de (^{3}H) dCTP, 8 \mug de DNA de timo de ternera "activado" y 0,5-5 unidades de la polimerasa. El DNA activado es una preparación nativa de DNA tras hidrólisis parcial con DNasa I hasta que el 5% del DNA se ha transferido a la fracción ácido soluble. La reacción se realizó a 70ºC durante 30 minutos, y se paró añadiendo 50 \mul de una solución acuosa saturada de pirofosfato sódico conteniendo 0,125 M de EDTA-Na_{2}. Se procesaron las muestras y la actividad se determinó como se describe en Kaledin y col., supra.
Los resultados mostraron que a pH 6,4 la polimerasa era más de la mitad de activa que a pH 8,0. Por lo contrario, Kaledin y col., hallaron que a un pH de aproximadamente 7,0, el enzima descrito allí poseía un 8% de la actividad a pH 8,3. Por consiguiente, el perfil de pH para el enzima termoestable aquí descrito es más amplio que el del enzima de Kaledin y col.
Finalmente, cuando se eliminaban únicamente uno o más trifosfatos de nucleótidos de una mezcla de reacción de ensayo de DNA polimerasa, se observaba muy poca actividad, casi inapreciable, empleando el enzima aquí descrito, y la actividad era consistente con el valor esperado, y mostrando el enzima una elevada fidelidad. Por el contrario, la actividad observada utilizando el enzima de Kaledin y col. (supra) no es consistente con el valor esperado, y sugiere una incorporación errónea de trifosfato(s) de nucleótido(s).
IV. Reacción de amplificación
Se diluyó un microgramo del DNA genómico descrito anteriormente en un volumen de reacción acuoso inicial de 100 \mul, conteniendo tampón Tris-HCl 25 mM (pH 8,0), KCl 50 mM, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 5 mM, gelatina 200 \mug/ml, cebador PCO3 1 \muM, cebador PCO4 1 \muM, dATP 1,5 mM, dCTP 1,5 mM, TTP 1,5 mM y dGTP 1,5 mM. Se calentó la muestra durante 10 minutos a 98ºC para desnaturalizar el DNA genómico, y seguidamente se enfrió a temperatura ambiente. Se añadieron 4 \mul de la polimerasa de Thermus aquaticus a la mezcla de reacción, y ésta se cubrió con 100 \mul de una capa superior de aceite mineral. Seguidamente se colocó la muestra en el bloque calefactor de aluminio del instrumento de manipulación de líquidos y de calefacción descrito anteriormente, empleando pipetas programadas para desplazar líquidos, y un dispositivo de control de temperatura para llevar a cabo los cambios de temperatura.
La muestra de DNA se sometió a 20 ciclos de amplificación en el aparato, repitiendo el siguiente ciclo de programas:
1)
calentamiento de 37ºC a 98ºC en el bloque calefactor durante un período de 2,5 minutos; y
2)
enfriamiento de 98ºC a 37ºC durante un período de tres minutos, para permitir la hibridación de los cebadores y el DNA.
Tras el último ciclo, la muestra se incubó durante 10 minutos adicionales a 55ºC para completar la reacción de extensión final.
V. Síntesis y fosforilación de sondas de oligodesoxirribonucleótido
Se preparó una sonda de DNA marcada, designada RS24, de la secuencia siguiente:
5'-*CCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAG-3' (RS24)
donde * indica la marca. Esta sonda tiene 40 bases de longitud, comprende los codones del cuarto al decimoséptimo del gen, y es complementaria al alelo normal de la \beta-globina (\beta^{A}). Se presenta seguidamente el diagrama esquemático de cebadores y sondas:
10
Esta sonda se sintetizó según los procedimientos descritos en la Sección I del Ejemplo I. La sombra se marcó poniendo en contacto 20 pmoles de la misma con 4 unidades de polinucleótido quinasa de T4 y aproximadamente 40 pmoles de \gamma-^{32}P-ATP (aproximadamente 7000 Ci/mmol) en un volumen de reacción de 40 \mul conteniendo tampón Tris-HCl 70 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 10 mM, espermina 1,5 mM y ditiotreitol 10 mM durante 60 minutos a 37ºC. El volumen total se ajustó seguidamente a 100 \mul con EDTA 25 mM y se purificó según el procedimiento de Maniatis y col., supra, p. 466-467, sobre una columna de diálisis por centrifugación de 1 ml equilibrada con tampón Tris-EDTA (TE) (tampón Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0). La precipitación con TCA del producto de reacción indicó que para RS24 la actividad específica era de 4,3 \muCi(pmol, y la concentración final era de 0,118 pmol/\mul.
VI. Hibridaciones por transferencia en punto
Se diluyeron cuatro microlitros de la muestra amplificada de la Sección IV y 5,6 \mul de las diluciones adecuadas de DNA plasmídico de \beta-globina calculadas para representar eficiencias de amplificación del 70, 75, 80, 85, 90, 95 y 100% con 200 \mul de NaOH 0,4 N, EDTA 25 mM, y se aplicaron sobre un filtro de nylon humedeciendo en primer lugar el filtro con agua, colocándolo en un aparato para preparar transferencias en punto que mantiene los filtros fijos, aplicando seguidamente las muestras, y lavando cada pocillo con 0,1 ml de 20 x SSPE (NaCl 3,6 M, NaH_{2}PO_{4} 200 mM, EDTA 20 mM), tal y como lo descubren Reed y Mann, Nucleic Acids Research, 13 7202-7221 (1985). A continuación se retiraron los filtros, se lavaron en 20 x SSPE, y se cocieron durante 30 minutos a 80ºC en un horno vacío.
Tras la cocción, se puso en contacto cada filtro con 16 ml de una solución de hibridación consistente en SSPE 3 x, solución de Denhardt 5 x (1 x = polivinilpirrolidona 0,02%, Ficoll 0,02%, albúmina sérica bovina 0,02%, Tris-HCl 0,2 mM, EDTA 0,2 mM, pH 8,0), SDS 0,5% y formamida 30%, y se incubaron durante 2 horas a 42ºC. A continuación se añadieron 2 pmoles de sonda RS24 a la solución de hibridación y el filtro se incubó durante 2 minutos a 42ºC.
Finalmente, cada filtro hibridado, se lavó dos veces con 100 ml de SSPE 2 x y SDS 0,1% durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación los filtros se trataron una vez con 100 ml de SSPE 2 x, SDS 0,1% a 60ºC durante 10 minutos.
A continuación, se autorradiografió cada filtro, haciéndose aparente la señal a las dos horas.
VII. Discusión del autorradiograma
Se analizó el autorradiograma de las transferencias en punto tras dos horas y se comparó en su intensidad con diluciones seriadas estándar de reconstrucciones de \beta-globina preparadas con pBR:\beta^{A} digerido con HaeIII/MaeI donde \beta^{A} es el alelo de tipo salvaje, como se describe en Saiki y col., Science, supra.
El análisis del producto de reacción indicó que la eficiencia global de amplificación era de aproximadamente el 95%, correspondiente a un aumento de 630.000 veces de la secuencia diana de \beta-globina.
Ejemplo II I. Reacción de amplificación
Dos muestras de 1 \mug de DNA genómico extraído de la línea celular Molt 4 como se describe en el Ejemplo I se diluyeron cada una en un volumen de reacción conteniendo KCl 50 mM, tampón Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 10 mM, 1 \muM del cebador PCO3, 1 \muM del cebador PCO4, gelatina 200 \mug/ml, dimetilsulfónico 10% (en volumen) y 1,5 mM de cada uno de los trifosfatos de nucleótidos dATP, dCTP, TTP, dGTP. Una vez esta muestra se calentó durante 10 minutos a 98ºC para desnaturalizar el DNA genómico, las muestras se enfriaron a temperatura ambiente y se añadieron a cada muestra 4 \mul de la polimerasa de Thermus aquaticus descrita en el Ejemplo I. Se depositó una capa de aceite mineral sobre las muestras para evitar la condensación y las pérdidas por evaporación.
Se colocó una de las muestras en el bloque calefactor del aparato descrito en el Ejemplo I y se sometió a 25 ciclos de amplificación, repitiendo el siguiente ciclo de programación:
(1)
calentamiento de 37 a 93ºC durante un período de 2,5 minutos;
(2)
enfriamiento de 93ºC a 37ºC durante un período de 3 minutos para permitir la hibridación de los cebadores y el DNA; y
(3)
mantener a 37ºC durante 2 minutos.
Después del último ciclo, la muestra se incubó durante 10 minutos adicionales a 60ºC para completar la reacción de extensión final.
Se colocó la segunda muestra en el bloque conductor del calor de un aparato ciclador de temperatura (enfriamiento y calentamiento). En este aparato, el bloque conductor del calor está unido a bombas de calor Peltier que ajustan la temperatura hacia arriba o hacia abajo y a un controlador microprocesador para controlar automáticamente la secuencia de amplificación, las temperaturas, y la pendiente y temporización de las temperaturas.
La segunda muestra se sometió a 25 ciclos de amplificación, repitiendo el siguiente ciclo de programación:
(1)
calentamiento de 37 a 95ºC durante un período de 3 minutos;
(2)
mantener a 95ºC durante 0,5 minutos para permitir que se produzca la desnaturalización;
(3)
enfriar de 95 a 37ºC durante un período de 1 minuto; y
(4)
mantener a 37ºC durante 1 minuto.
II. Análisis
Se realizaron dos pruebas para el análisis: una transferencia en punto y un gel de agarosa.
Para el análisis por transferencia en punto, una sonda de DNA marcada, designada como RS18, fue preparada con la siguiente secuencia:
5'-*CTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3' (RS18)
donde * indica el marcaje. Esta sonda tiene 19 bases de longitud, comprende los codones del cuarto al decimoséptimo del gen, y es complementaria al alelo normal de la \beta-globina (\beta^{A}). Se presenta seguidamente el diagrama esquemático de cebadores y sondas:
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Esta sonda se sintetizó según los procedimientos descritos en la Sección I del Ejemplo I. La sonda se marcó poniendo en contacto 10 pmoles de la misma con 4 unidades de polinucleótido quinasa de T4 y aproximadamente 40 pmoles de \gamma^{-32}P-ATP (aproximadamente 7000 Ci/mmol) en un volumen de reacción de 40 \mul conteniendo tampón Tris-HCl 70 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 10 mM, espermina 1,5 mM y ditiotreitol 10 mM durante 60 minutos a 37ºC. El volumen total se ajustó seguidamente a 100 \mul con EDTA 25 mM y se purificó según el procedimiento de Maniatis y col., supra, p. 466-467, sobre una columna de diálisis por centrifugación de 1 ml equilibrada con tampón Tris-EDTA (TE) (tampón Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0). La precipitación con TCA del producto de reacción indicó que para RS18 la actividad específica era de 4,6 \muCi/pmol, y la concentración final era de 0,114 pmol/\mul.
Cinco microlitos de la muestra amplificada de la Sección I y de una muestra amplificada como se ha descrito anteriormente excepto que se utilizó el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli en lugar del enzima termoestable se diluyeron con 195 \mul de NaOH 0,4 N, EDTA 25 mM, y se aplicaron sobre dos filtros de nylon replicados humedeciendo en primer lugar los filtros con agua, colocándolos en un aparato para preparar transferencias en punto que mantiene los filtros fijos, aplicando seguidamente las muestras, y lavando cada pocillo con 0,4 ml de SSPE 20 x (NaCl 3,6 M, NaH_{2}PO_{4} 200 mM, EDTA 20 mM), tal y como lo descubren Reed y Mann, Nucleic Acids Research, 13, 7202-7221 (195). A continuación se retiraron los filtros, se lavaron en SSPE 20 x, y se cocieron durante 30 minutos a 80ºC en un horno de vacío.
Tras la cocción, se puso en contacto cada filtro con 6 ml de una solución de hibridación consistente en SSPE 5 x, solución de Denhardt 5 x (1 x = polivinilpirrolidona 0,02%, Ficoll 0,02%, albúmina sérica bovina 0,02%, Tris-HCl 0,2 mM, EDTA 0,2 mM, pH 8,0) y SDS 0,5%, y se incubaron durante 60 minutos a 55ºC. A continuación se añadieron 5 \mul de sonda RS18 a la solución de hibridación y el filtro se incubó durante 60 minutos a 55ºC.
Finalmente, se lavó cada filtro hibridado dos veces con 100 ml de SSPE x 2 y SDS 0,1% durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación se trataron los filtros dos veces con 100 ml de SSPE 5 x SDS 0,1% a 60ºC durante 1) un minuto, y 2) tres minutos, respectivamente.
Seguidamente se autorradiografió cada filtro, haciéndose aparente la señal después de 90 minutos.
En el análisis en gel de agarosa, 5 \mul de cada reacción de amplificación se cargaron en un gel 4% NuSieve/0,5% agarosa en tampón TBE x 1 (Tris-HCl 0,089 M, ácido bórico 0,089 M, EDTA 2 mM) y se sometieron a electroforesis durante 60 minutos a 100 V. Tras teñir con bromuro de etidio, se visualizó el DNA por fluorescencia UV.
Los resultados demuestran que ambos aparatos utilizados en el Ejemplo I y en este ejemplo fueron igualmente efectivos en la amplificación del DNA, mostrando bandas de 110 pares de bases de alta intensidad discretas de intensidad similar, correspondientes a la secuencia deseada, junto con algunas bandas discretas más de mucha menor intensidad. Por el contrario, el método de amplificación de DNA que implica una transferencia de reactivo tras cada ciclo empleando el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli rindió una mancha difusa de DNA resultante de una amplificación no específica de muchas secuencias de DNA no relacionadas.
Es de esperar que mejoras similares en la amplificación y detección se podrán conseguir en la evaluación de las regiones HLA-DQ, DR y DP.
Si en los experimentos anteriores el tampón de reacción de amplificación contiene MgCl_{2} 2 mM en lugar de MgCl_{2} 10 mM y 150-200 \muM de cada nucleótido en lugar de 1,5 mM de cada, y si la temperatura inferior de 37ºC se aumenta a 45-58ºC durante la amplificación, se obtiene una mejor especificidad y eficiencia de amplificación. Asimismo, se halló que el DMSO no era necesario o preferido para la amplificación.
Ejemplo III
Amplificación y clonación
Para la amplificación de un fragmento de 119 pares de bases en el gen de la \beta-globina humana, un total de 1 microgramo de cada de DNA genómico humano aislado de la línea celular Molt 4 o de la línea celular GM2064 (que representa una deleción homozigota de la región de \beta- y \delta-globina, y que está disponible comercialmente de Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, NJ) como se ha descrito anteriormente, se amplificó en un volumen de reacción de 100 \mul conteniendo KCl 50 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8, MgCl_{2} 10 mM, gelatina 200 \mug/ml, 2-mercaptoetanol 5 mM, 1,5 mM de cada uno de los trifosfatos de nucleótidos dATP, dCTP, TTP y dGTP y 1 \muM de cada uno de los siguientes cebadores:
5'-CTTCTGcagCAACTGTGTTCACTAGC-3' (GH18)
5'-CACaAgCTTCATCCACGTTCACC-3' (GH19)
en los que las minúsculas representan desapareamientos respecto a la secuencia de tipo salvaje para crear sitios de enzimas de restricción GH18 en un oligonucleótido de 26 bases complementario a la cadena negativa, y contiene un sitio de restricción interno PstI. GH19 es un oligonucleótido de 29 bases complementario a la cadena positiva y contiene una secuencia de reconocimiento interna para HindIII. Estos cebadores se seleccionaron escrutando en primer lugar las regiones del gen para homología con los sitios de restricción PstI y HindIII. A continuación se prepararon los cebadores como se describe en el Ejemplo I.
Las mezclas de reacción anteriores se calentaron durante 10 minutos a 95ºC y seguidamente se enfriaron a temperatura ambiente. Se añadieron un total de 4 \mul de la polimerasa descrita en el Ejemplo I a cada mezcla de reacción, y seguidamente cada mezcla se cubrió con aceite mineral. Las mezclas de reacción se sometieron a 30 ciclos de amplificación con el siguiente programa:
2,5 min, rampa, de 37 a 98ºC
3 min, rampa, de 98 a 37ºC
2 min, mantener, 37ºC
Tras el último ciclo, las mezclas de reacción se incubaron durante 20 minutos a 65ºC para completar la extensión final. El aceite mineral se extrajo con cloroformo y las mezclas se conservaron a -20ºC.
Se digirieron un total de 10 \mul del producto amplificado con 0,5 \mug de vector de clonación M 13mp10, que está disponible públicamente en un volumen de 50 \mul que contenía NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,8 MgCl_{2} 10 mM, 20 unidades de PstI y 26 unidades de HindIII durante 90 minutos a 37ºC. La reacción se paró congelando a -20ºC. El volumen se ajustó a 110 \mul con tampón TE y se cargó (100 \mul) con una columna de diálisis por centrifugación de 1 ml BioGel P-4. Se recogió una fracción de 0,1 ml y se precipitó con etanol.
(En este punto se descubrió que existía un producto de amplificación de \beta-globina en la muestra de GM2064. Los subsiguientes experimentos indicaron que la fuente de contaminación podría ser los cebadores, bien GH18 o GH19. Puesto que no había otra fuente de cebadores disponible, el experimento se continuó en el bien entendido que algunas secuencias clonadas derivarían del DNA contaminante en los cebadores).
El sedimento de etanol se resuspendió en 15 \mul de agua, y a continuación se ajustó a un volumen de 20 \mul conteniendo Tris-HCl 50 mM, 7,8, MgCl_{2} 10 mM, ATP 0,5 mM, ditiotreitol 10 mM, y 400 unidades de ligasa. [Una unidad es la cantidad de enzima requerida para rendir una ligación del 50% de DNA \lambda digerido con HindIII en 30 minutos a 16ºC en 20 \mul a una concentración de extremos 5' de 0,12 mM (aproximadamente 330 \mug/ml). Esta mezcla se incubó durante tres horas a 16ºC.
Diez microlitros de la mezcla de reacción de ligación conteniendo DNA de Molt 4 se transformaron en células competentes de la cepa de E. coli JM103, que están disponibles públicamente. El procedimiento seguido para preparar la cepa transformada está descrito en Messing, J. (1981) Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA, ed. A. Walton, Elsevier, Amsterdam, 143-163. Se obtuvieron un total de 651 calvas incoloras (y 0 calvas azules). De estas, 119 poseían un inserto de cadena (+) (18%) y 19 un inserto de cadena (-) (3%). Esto significa un aumento de casi 20 veces sobre el porcentaje de calvas positivas para \beta-globina de entre las calvas positivas para cebador a partir de la técnica de amplificación empleando el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli, en la que la reacción se lleva a cabo durante 2 minutos a 25ºC, y después se repiten nueve veces las etapas de calentamiento a 100ºC durante 2 minutos, enfriamiento, adición de fragmento Klenow y reacción. Estos resultados confirman la especificidad mejorada de la reacción de amplificación empleando enzima termoestable de esta invención.
En un posterior experimento de clonación con GM2064 y los cebadores contaminados, 43 de las 510 calvas incoloras (8%) poseían el inserto de cadena (+). Esto sugiere que aproximadamente la mitad de los 119 clones de Molt 4 contienen la secuencia contaminante.
Diez de los clones de cadena (+) de Molt 4 fueron secuenciados. Cinco fueron secuencias salvajes normales y cinco poseían una única mutación de C a T en la tercera posición del segundo codón del gen (de CAC a CAT). Cuatro de los clones contaminantes de GM2064 fueron secuenciados, y los cuatro fueron normales.
Los cebadores modificados para sitio de restricción pueden ser utilizados asimismo para amplificar y clonar y secuenciar parcialmente en oncogén humano N-ras, y para clonar segmentos de pares de bases de los genes HLA DQ-\alpha, DQ-\beta y DR-\beta empleando las técnicas anteriores.
De nuevo, si la concentración de MgCl_{2} y de nucleótidos se reduce a 2 mM y 150-200 \muM, respectivamente, y la temperatura mínima de ciclación aumenta de 37ºC a 45-58ºC, puede incrementarse la especificidad y eficiencia de la reacción de amplificación.
Ejemplo IV Recuperación del gen A. Identificación de una sonda de secuencia de DNA para el gen de la polimerasa TAQ
Se obtuvo una sonda de secuencia de DNA específica para el gen Taq pol tras el escrutinio inmunológico de una biblioteca de expresión en \lambdagt11. Se dirigió el DNA de Thermus aquaticus completamente con AluI, se ligó con engarces EcoRI de 12 mer (CCGGAATTCCGG, New England Biolabs), se dirigió con EcoRI y se ligó con DNA de \lambdagt11 digerido con EcoRI y desfosforilado (Promega Biotech). El DNA ligado se empaquetó (Gigapack Plus, Stratagene) y se transfectó en la cepa Y1090 de E. coli K-12 (proporcionada por R. Young).
La biblioteca inicial de 2 x 10^{5} calvas fue escrutada (Young, R.A., y R.W. Davis (1983) Science, 222: 778-782) con una dilución 1:2000 de un anticuerpo policlonal de conejo obtenido contra polimerasa Taq purificada (véanse los Ejemplos I y VI). Las calvas candidato se replaquearon a una dilución límite y se reescrutaron hasta ser homogéneas (aproximadamente 3 ciclos). Se purificaron los fagos a partir de las calvas candidatas que no reaccionaron con el suero preinmune y sí reaccionaron con el suero inmune.
Se emplearon los fagos candidatos para lisogenizar la cepa Y1090 de E. coli K-12 (R. Young). Se escrutaron los lisógenos para la producción de una proteína de fusión inducible por IPTG (mayor que la \beta-galactosidasa) que reaccionara con el antisuero contra la polimerasa Taq. Se emplearon proteínas de fusión fraccionadas por tamaño en fase sólida para purificar por afinidad anticuerpos específicos de epítopos a partir del antisuero policlonal total (Goldstein, L.S.B., y col. (1986), J. Cell. Biol., 102: 2076-2087).
A su vez, se emplearon los anticuerpos seleccionados para epítopo "pescados" de este modo, en un análisis Western para identificar qué fagos \lambdagt11 candidatos codificaban secuencias de DNA específicas únicamente para la polimerasa Taq. Un fago \lambdagt11 candidato, denominado \lambdagt:1, seleccionaba específicamente anticuerpos a partir del antisuero policlonal total de conejo contra la polimerasa Taq que reaccionaban únicamente tanto con la polimerasa Taq purificada como con fracciones de extracto crudo que incluían la polimerasa Taq. Este fago, \lambdagt:1, se empleó para su estudio posterior.
Se marcó el fragmento AluI adaptado a EcoRI de aproximadamente 115 pb de DNA de Thermus aquaticus (Maniatis y col., supra), para generar una sonsa específica de polimerasa Taq. La sonda se empleó en análisis Southern y para escrutar una biblioteca genómica al azar de DNA de Thermus aquaticus.
B. Construcción y escrutinio de una biblioteca genómica al azar de Thermus aquaticus
Se hibridó y ligó el fago lambda Charon 35 (Wilhelmine, A.M., y col., supra) mediante sus extremos cohesivos, se dirigió completamente con BamHI, y los brazos hibridados se purificaron de los fragmentos suplementarios ("stuffer") mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad de acetato de potasio (Maniatis y col., supra). Se dirigió parcialmente el DNA de Thermus aquaticus con Sau3A, y la fracción de 15 a 20 kb de longitud se purificó por ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. La biblioteca genómica al azar se construyó ligando los fragmentos de DNA diana y de vector con una relación molar 1:1. El DNA se empaquetó y se transfectó en las cepas de E. coli K-12 LE392 y K802. Se amplificó una biblioteca de más de 20.000 fagos iniciales conteniendo más del 99% de recombinantes en la cepa LE39 de E. coli K-12.
La biblioteca fágica genómica CH35 Taq se escrutó (Maniatis y col., supra) con el inserto EcoRI marcado radiactivamente de \lambdagt11:1. Las calvas de fagos candidatas hibridadas específicamente fueron purificadas y analizadas posteriormente. Un fago, denominado Ch35::4-2, liberó \geq cuatro fragmentos de DNA de Thermus aquaticus tras digestión con HindIII (aproximadamente 8,0, 4,5, 0,8 y 0,58 kb).
Se ligaron los cuatro fragmentos de DNA de Thermus aquaticus por digestión con HindIII en el plásmido BSM13^{+} digerido con HindIII (3,2 kb, Vector Cloning Systems, San Diego), y se clonaron individualmente tras la transformación en la cepa DG98 de E. coli K-12.
El fragmento de DNA HindIII de aproximadamente 8,0 kb de CH35::4-2 fue aislado en el plásmido pFC82 (11,2 kb), mientras que el fragmento de DNA HindIII de 4,5 kb de CH35::4-2 fue aislado en el plásmido pFC83 (7,7 kb).
Se demostró que la cepa DG98 de E. coli portadora de pFC82 contenía una actividad DNA polimerasa a elevada temperatura y termoestable (Tabla 1). Adicionalmente, estas células sintetizaban un nuevo polipéptido de aproximadamente 60 kd de peso molecular, relacionado inmunológicamente con la polimerasa de DNA Taq.
La región codificante de polimerasa Taq del fragmento de DNA de 8,8 kb HindIII se localizó posteriormente en la porción de 2,8 kb HindIII a Asp718 proximal al promotor lac del fragmento HindIII de 8,0 kb. Esta región se subclonó para rendir el plásmido pFC85 (6,0 kb). Tras la inducción con IPTG, las células DG98 de E. coli portadoras del plásmido pFC85 sintetizan hasta 100 veces más actividad relacionada con polimerasa Taq termoestable (Tabla 1) que el clon parental original (pFC82/DG98). A pesar de que las células portadoras de pFC85 sintetizan una cantidad significativa de una actividad DNA polimerasa termoestable, únicamente se traduce una porción de la secuencia de DNA Taq pol, lo que resulta en la acumulación de un polipéptido de aproximadamente 60 kd relacionado con polimerasa Taq.
TABLA 1 Expresión de una actividad DNA polimerasa termoestable en E. coli#
12
#Se hicieron crecer las células hasta fase logarítmica tardía (+/-IPTG, 10 mM), se recogieron, sonicaron, calentaron a 75ºC durante 20 minutos, centrifugaron y el sobrenadante clarificado se ensayó a 70ºC para actividad DNA polimerasa.
* 1 unidad = 1 nM de dCTP incorporado en 30 minutos.
Ejemplo V Expresión de la polimerasa Taq
El gen que codifica la polimerasa termoestable de la presente invención puede ser expresado en cualquiera de los diversos vectores de expresión bacterianos, incluyendo DG141 (ATCC 39588) y pP_{L}N_{RBS}ATG. Ambos vectores son derivados del pBR322 que poseen o bien una secuencia que contiene un operador-promotor y un sitio de unión a ribosoma de triptófago con un codón ATG de inicio operativamente unido (DG141), o bien poseen una secuencia que contiene el promotor P_{L} de labda y un sitio de unión a ribosoma de gen N unido operativamente a un codón ATG de inicio (pP_{L}N_{RBS}ATG). Cualquiera de estos dos vectores puede digerirse con el enzima de restricción SacI, y sus extremos pueden romarse con Klenow o con nucleasa S1 para construir un sitio de restricción conveniente para la inserción subsiguiente del gen de la polimerasa Taq.
Se construyó el gen de longitud completa de la polimerasa Taq a partir de los fragmentos de insertos de DNA subclonados en los plásmidos pFC83 y pFC85 del modo siguiente. El vector BSM13^{+} (disponible comercialmente a partir de Vector Cloning Systems, San Diego, CA), se dirigió en el único sitio de restricción HindIII, se reparó con Klenow y dNTPs, y se ligó con la DNA ligasa de T4 a un engarce octanucleótido BgIII, 5'-CAGATCTG-3', y se transformó en la cepa DG98 de E, coli. Se aislaron los plásmidos de los transformantes Amp^{R} lacZ\alpha^{+}. Uno de los clones se dirigió con los enzimas de restricción BglII y Asp718, y el fragmento mayor del vector se purificó por electroforesis en gel.
A continuación, el plásmido pFC83 se dirigió con BgIII y HindIII y se aisló el fragmento de aproximadamente 750 pb. Se dirigió el plásmido pFC85 con HindIII y Asp718 y el fragmento de aproximadamente 2,8 kb se aisló y se unió en una ligación de tres puntos con el fragmento de 750 pares de bases BgIII-HindIII de pFC83 y el fragmento de vector BgIII-Asp718 de BSM13^{+}. Esta mezcla de ligación se empleó para transformar la cepa de E. coli DG98 (ATCC 39.768, depositada el 13 de Julio de 1984), a partir de la cual se seleccionaron colonias Amp^{R} y se aisló un plásmido de 6,75 kilobases aproximadamente (pLSG1). Las células DG98 inducidas con isopropil-\beta-D-tiogalactósido (IPTG) portadoras del plásmido pLSG1 sintetizaron polimerasa Taq indistinguible en tamaño del enzima nativo aislado de Thermus aquaticus. El plásmido pLSG1 puede ser utilizado seguidamente para generar un molde de DNA de cadena sencilla según el procedimiento recomendado por Vector Cloning Systems.
Puede utilizarse a continuación mutagénesis dirigida por oligonucleótido (véase Zoller y Smith, Nuc. Acids Res. (1982) 10: 6487-6500) para introducir un sitio de restricción SphI como parte del codón ATG de inicio (corriente arriba del sitio HindIII interno en la secuencia codificante del gen de la polimerasa Taq). De forma similar, puede introducirse un sitio BgIII tras el extremo carboxilo terminal del gen (aproximadamente 0,7 kb corriente arriba del sitio Asp718) para facilitar el subclonaje del gen de la polimerasa Taq en un vector de expresión. Una vez realizada la mutagénesis específica de sitio, el gen puede ser aislado del vector BSM13^{+} en forma de un fragmento de restricción de aproximadamente 3,2 kb SphI-BstEII, puede tratarse con el fragmento de Klenow y los cuatro dNTPs, e insertarse mediante la DNA ligasa de T4 (en condiciones de ligación de extremos romos) en cualquiera de los vectores de expresión mencionados anteriormente, que han ido digeridos con SacI, reparados con Klenow y dNTPs, y tratados con fosfatasa alcalina de intestino de ternera para generar extremos romos desfosforilados. Esta mezcla de ligación se emplea para transformar E. coli DG116, y los transformantes resultantes se escrutan para la producción de polimerasa Taq. La expresión del enzima puede confirmarse por análisis mediante inmunotransferencia Western y análisis de actividad.
Puede ser expresada una proporción mayor del gen de la polimerasa Taq contenido en el fragmento de aproximadamente 2,8 kb HindIII-Asp718 del plásmido pFC85 empleando, por ejemplo, el plásmido pP_{L}N_{RBS}ATG, mediante la unión operativa del sitio de restricción HindIII amino terminal presente en el gen Taq pol a un codón ATG de iniciación. El producto de esta fusión, una vez expresado, rendirá una polimerasa truncada de aproximadamente 66.000-68.000 daltons.
Esta construcción específica puede realizarse dirigiendo el plásmido pFC85 con HindIII y tratando con el fragmento Klenow en presencia de dATP, dGTP y dCTP. El fragmento resultante se trata adicionalmente con nucleasa S1 para eliminar cualquier extensión de cadena sencilla, y el DNA resultante se digiere con Asp718 y se trata con el fragmento Klenow en presencia de los cuatro dNTPs. El fragmento recuperado puede ligarse empleando DNA ligasa de T4 al plásmido pP_{L}N_{RBS}ATG desfosforilado, el cual ha sido digerido con SacI, y tratado con fragmento Klenow en presencia de dGTP para construir un extremo romo ATG. Esta mezcla de ligación puede ser utilizada a continuación para transformar E. coli DG116, y los transformantes se escrutarán para la producción de polimerasa Taq. De nuevo, la expresión puede confirmarse por análisis de inmuno-transferencia Western y por análisis de actividad.
Ejemplo VI Purificación
La polimerasa termoestable puede ser purificada directamente a partir de un cultivo de Thermus aquaticus siguiendo el ejemplo descubierto a continuación o, alternativamente, a partir de un cultivo bacteriano que contiene el enzima producido de forma recombinante únicamente con modificaciones mínimas necesarias en la preparación del extracto crudo.
Tras ser recogidos por centrifugación, 60 gramos de células fueron resuspendidos en 75 ml de un tampón que consiste en Tris-HCl 50 mM, pH 8, EDTA 1 mM. Las células se lisaron con una prensa francesa a 14.000-16.000 psi, y seguidamente se añadieron 4 volúmenes (300 ml) de Tris-EDTA adicionales. Se añadió tampón A (\beta-mercaptoetanol a 5 mM y NP-40 y Tween 20 al 0,5% (v/v) cada uno) y la solución se sonicó completamente mientras se mantenía en frío. La suspensión homogénea resultante se diluyó adicionalmente con tampón A de modo que el volumen final fue de 7,5 a 8 veces el peso celular de partida. Esta fracción se denominó Fracción I.
Se determinó la actividad polimerasa en la Fracción I y en las fracciones subsiguientes en una mezcla de 50 \mul conteniendo TAPS-HC1 0,025 M, pH 9,4 (20ºC), MgCl_{2} 0,002 M, KCl 0,05 M, 2-mercaptoetanol 1 mM, 0,2 mM de cada uno de dGTP, dATP, TTP, 0,1 mM dCTP [\alpha-^{32}P, 0,05 Ci/mM], 12,5 \mug de esperma de salmón "activado" y 0,01-0,02 unidades de la polimerasa (diluidas en Tris-HCl 10 mM, pH 8, KCl 50 mM, 1 mg/ml de gelatina autoclavada, NP-40 0,5%, Tween 20 0,5%, y 2-mercaptoetanol 1 mM). Una unidad corresponde a 10 nM de producto en 30 minutos. DNA "activado" es una preparación nativa de DNA tras hidrólisis parcial con DNasa I hasta que el 5% del DNA se transfiere a la fracción ácido-soluble. La reacción se realizó a 74ºC durante 10 minutos, y seguidamente se transfirieron 40 \mul a 1,0 ml de DNA de carga a 50 \mug/ml en EDTA 2 mM a 0ºC. Se añadió un volumen igual (1,0 ml) de TCA al 20%, pirofosfato sódico 2%. Transcurridos 15-20 minutos a 0ºC, las muestras se filtraron a través de discos Whatman GF/C y se lavaron extensivamente con TCA 5% - pirofosfato 1% frío, seguido de etanol 95% frío, se secaron y se contaron.
La Fracción I se centrifugó durante 2 horas a 35.000 rpm en un rotor Beckman TI 45 a 2ºC y el sobrenadante recogido se denominó Fracción II.
Se precipitó la actividad polimerasa Taq con Polymin P (BRL, Gaithersburg, MD) (10% p/v, ajustada a pH 7,5 y autoclavada), una vez se había determinado la cantidad mínima de Polymin P necesaria para precipitar el 90-95% de la actividad, siendo cantidad en general entre el 0,25% y el 0,3% del volumen final.
Se añadió lentamente una cantidad adecuada de Polymin P a la Fracción II mientras se agitaba durante 15 minutos a 0ºC. Se centrifugó esta solución a 13.000 rpm durante 20 minutos en un rotor Beckman JA 14 a 2ºC. El sobrenadante se ensayó para la actividad y el sedimento se resuspendió en un 1/5 del volumen de tapón A 0,5x (diluido 1:2 con H_{2}O). Se volvió a centrifugar esta suspensión y el sedimento se resuspendió en 1/4 del volumen de tapón A conteniendo KCl 0,4 M. Esta suspensión se homogeneizó completamente y se dejó durante toda la noche a 4ºC. El homogenado se centrifugó como se ha descrito y el sobrenadante recogido se denominó Fracción III.
La fracción de proteína se recogió por "precipitación" con sulfato de amonio a una saturación del 75%, se centrifugó (a 27.000 rpm, rotor SW27, 30 minutos) y la película flotante se resuspendió en Tris-HCl 50 mM, pH 8, EDTA 1 mM. Estas etapas se repitieron y la suspensión de proteína se dializó extensivamente con tampón P-cell (KPO_{4} 20 Mm, pH 7,5 EDTA 0,5 mM, \beta-mercaptoetanol 5 mM, glicerol 5% (p/v), NP-40 y Tween 200,5% (v/v) conteniendo KCl 80 mM.
Se transfirió el dializado a una botella de centrifugación a la que se añadió toda la proteína recuperada de los sacos lavados con el tampón P-cell conteniendo KCl 80 mM. Se llevó a cabo la centrifugación a 20.000 x g y el tiempo se redujo a 15 minutos. El sobrenadante se conservó y el sedimento remanente se lavó, se extrajo con tampón P-cell y KCl 80 mM, y se volvió a centrifugar. El sobrenadante se reunió a continuación para formar la Fracción IV.
La Fracción IV se aplicó a una columna de 2,2 x 22 cm de fosfocelulosa, equilibrada con el tampón P-cell conteniendo KCl 80 mM. Se lavó la columna (2,5-3 volúmenes de columna) con el mismo tampón y la proteína se eluyó empleando un gradiente lineal de 80 a 400 mM de KCl en tampón P-cell. Se reunieron las fracciones conteniendo actividad DNA polimerasa (aproximadamente 0,18-0,20 M de KCl) y se concentraron de 3 a 4 veces en una celda agitada Amicon con membrana YM30. La celda se lavó con el tampón P-cell sin KCl y se añadió al concentrado de fracciones para formar la Fracción V (volumen final ajustado a 0,15 M KCl).
Se aplicó la Fracción V a una columna de 5 ml de Heparin Sepharose CL-6B (Pharmacia) equilibrada con tampón de P-cell y KCl 0,15 M. La columna se lavó con tampón 0,15 M KCl (de 3 a 4 volúmenes de columna) y la proteína se eluyó con un gradiente lineal de 0,15 a 0,65 M de KCl en tampón P-cell. Se realizó una dilución 1:10 en diluyente sin gelatina para el análisis por SDS-PAGE, y se realizó seguidamente una dilución 1:20 con diluyente con gelatina 1 mg/ml para su uso en ensayos enzimáticos. Las fracciones con actividad (eluyendo a aproximadamente 0,3 M KCl) se ensayaron en DNA molde superenrollado para endonucleasas y/o topoisomerasas específicas y no específicas mediante detección elecroforética del cambio en el peso molecular de DNA plasmídico superenrollado tras incubación con un exceso de DNA polimerasa. Se detectó la contaminación con exonucleasas tras la incubación con fragmentos de DNA pequeños lineales. En las fracciones pico, se halló una proteína de aproximadamente 88 kd como la banda principal. La fracción principal, denominada Fracción VI, poseía la actividad polimerasa más elevada con una actividad endonucleasa detectable mínima cuando se ensayaba esta fracción durante 30 minutos a 55ºC con de 3 a 5 unidades de polimerasa por 600 ng de DNA.
Se dializó la Fracción VI contra KPO_{4} 10 mM, pH 7,5, \beta-mercaptoetanol 5 mM, glicerol 5%, NP-40 0,2%, y Tween 20 0,2% (tampón HA). La muestra dializada se aplicó a una columna de 3 ml de hidroxiapatito, y el enzima se eluyó con una gradiente lineal de 10 a 250 nM de KPO_{4} a pH 7,5, tampón HA. La actividad DNA polimerasa empezó a eluir a 75 mM de KPO_{4} encontrándose el pico a 100 mM de KPO_{4}. Se ensayaron las fracciones de pico activas a una dilución de 1:100 a 1:300. Al igual que en la etapa de cromatografía previa, se preparó una dilución 1:10 en diluyente sin gelatina para el análisis por SDS-PAGE. Se reunieron las fracciones sin endonucleasas o exonucleasas de doble cadena significativas por ensayo a 55ºC con 5 unidades de polimerasa, y se denominaron Fracción VII.
Se dializó la Fracción VII contra una solución de 25 mM de acetato sódico pH 5,2, glicerol 5%, \beta-mercaptoetanol 5 mM, EDTA 0,1 mM, NP-40 0,1%, y Tween 20 0,1%, ajustada a pH 5 a temperatura ambiente. La muestra dializada se aplicó a una columna de DEAE-Tris-Acril-M (LKB) de 2 ml preequilibrada y lavada subsiguientemente con el mismo tampón. La fracción conteniendo actividad polimerasa que no se adhería a la columna se reunió y se ajustó a NaCl 50 mM en el mismo tampón para rendir la Fracción VIII.
La Fracción VIII se aplicó a una columna de CM-Tris-Acril M (LKB) de 2 ml equilibrada con el mismo tampón (25 mM de acetato sódico NaCl 50 mM, glicerol 5%, EDTA 0,1 mM, NP-40 0,1%, y Tween 20 0,1%). La columna se lavó con de 4 a 5 volúmenes de columna del mismo tampón y el enzima se eluyó con un gradiente lineal de 50 a 400 mM de NaCl en tampón de acetato sódico. El pico de actividad polimerasa eluyó aproximadamente 0,15 a 0,20 M de NaCl. Se ensayó la actividad polimerasa a una dilución 1:300 a 1:500, con la primera dilución 1:10 en diluyente sin gelatina para el análisis por SDS-PAGE. Se realizó un ensayo a lo largo del pico de actividad sobre moldes de DNA superenrollado para endonucleasas y/o topoisomerasas específicas y no específicas empleando sales de ensayo de DNA polimerasa (25 mM TAPS-HCl, pH 9,4, MgCl_{2} 2,0 mM, y KCl 50 mM) a 74ºC, así como ensayos para nucleasas sobre fragmentos de DNA ss de M13 y DNA de pBR322. Las fracciones activas sin nucleasa(s) detectables se reunieron y se corrieron en un mini gel SDS-PAGE que se tiñó con plata. Los resultados mostraron una única banda de 88 kd con una actividad específica de aproximadamente 250.000 unidades/mg.
Esta actividad específica es más de un orden de magnitud superior a la reivindicada para la polimerasa Taq aislada previamente, y al menos un orden de magnitud superior a la de la polimerasa I de E. coli.
Ejemplo VII
La polimerasa Taq purificada como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo VI se halló que estaba exenta de cualquier actividad Taq endonucleasa y exonucleasa contaminante. Adicionalmente, la polimerasa Taq se conserva preferentemente en tampón de conservación conteniendo de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,5% volumen/volumen de cada detergente polimérico no iónico empleado. Con mayor preferencia el tampón de conservación consiste en glicerol 50% (v/v), KCl 100 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 ácido etilendiaminotetraacético 0,1 mM (EDTA), ditiotreitol 1 mM, NP-40 0,5% v/v, Tween 20 0,5% v/v, y gelatina 200 \mug/ml, y se conserva preferentemente a -20ºC.
La polimerasa Taq conservada se diluyó en un tampón que consistía en Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, KCl 20 mM, \beta-mercaptoetanol 1 mM, NP-40 0,5%, Tween 20 0,5% y gelatina 500 \mug/ml. Se preparó a continuación un tampón de reacción conteniendo KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina 0,01% (p/v), 200 \muM de cada dNTP, 1 \muM de cada uno de los cebadores que definen una secuencia diana de 500 pares de bases en un molde de control de bacteriófago \lambda, y 2,0-2,5 unidades de polimerasa Taq por ensayo en un volumen final de 100 \mul. Se añadió el molde al tampón de reacción, la muestra se colocó en un tubo de polipropileno de 0,5 ml, y la muestra se cubrió con 100 \mul de aceite mineral pesado para evitar la evaporación.
Se consiguió una amplificación de al menos 10^{5} veces cuando se empleaban las siguientes condiciones, empleando 1 ng de molde control (DNA del bacteriófago \lambda), en el que la secuencia diana representaba aproximadamente un 1% de la masa de DNA de partida.
En primer lugar, la mezcla con el molde se desnaturalizó durante 1 minuto, 30 segundos a 94ºC colocando el tubo en un baño caliente. A continuación el tubo se colocó n un baño caliente a 37ºC durante dos minutos. A continuación el tubo se colocó en un baño caliente a 72ºC durante tres minutos, y seguidamente en el baño caliente a 94ºC durante un minuto. Este ciclo se repitió durante un total de 25 ciclos. Al final del 25º ciclo, la etapa de desnaturalización a 94ºC se omitió y se reemplazó extendiendo la etapa de incubación a 72ºC en tres minutos adicionales. Tras la finalización del ensayo, se dejaron enfriar las muestras a temperatura ambiente y se analizaron como se describe en los ejemplos previos.
El molde puede ser amplificado de forma óptica con una concentración diferente de dNTPs y una cantidad diferente de polimerasa Taq. Asimismo, el tamaño de la secuencia diana en la muestra de DNA tendrá un impacto directo sobre el tiempo mínimo requerido para una extensión correcta (etapa de incubación a 72ºC). Debería realizarse una optimización del perfil de ciclos de temperatura para cada molde individual a amplificar, al objeto de obtener la máxima eficiencia.
Ejemplo VIII
La polimerasa Taq purificada como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo I se formuló para su conservación como se ha descrito en el ejemplo previo, pero sin los detergentes poliméricos no iónicos. Cuando se ensayó para su actividad tal y como se describe en aquel ejemplo, la mezcla de conservación del enzima demostró ser inactiva. Cuando se añadieron NP-40 y Tween 20 al tampón de conservación, se restauró la actividad enzimática completa, lo que indica que la presencia de los detergentes no iónicos es necesaria para la estabilidad de la formulación de enzima.
Ejemplo IX
Se sometieron varias muestras de 1 \mug de DNA genómico humano a 20-35 ciclos de amplificación como se describe en el Ejemplo V, con unidades equivalentes de bien el fragmento Klenow o la polimerasa Taq, analizándose los resultados por electroforesis en gel de agarosa y transferencia Southern. Los cebadores empleados en estas reacciones, PCO3 y PCO4, dirigen la síntesis de un segmento de 110 pb del gen de la beta-globina humana. Las amplificaciones por la polimerasa Klenow mostraron la mancha de DNA difuminada típicamente observada con este enzima, la causa aparente de la cual es la hibridación y extensión no específica de los cebadores con secuencias genómicas no relacionadas en las que son condiciones de hibridación necesariamente no restrictivas (sales de Klenow 1x a 37ºC). De cualquier modo, por transferencia Southern se detectó un fragmento diana de 110 pb de beta-globina específico en todos los carriles. Se observó un patrón electroforético substancialmente diferente en la amplificación realizada con la polimerasa Taq en el que la banda única principal es la secuencia diana de 110 pb. Esta destacable especificidad es sin duda debida a la temperatura a la cual se extienden los cebadores.
Sin embargo, aunque al igual que con las amplificaciones con el fragmento Klenow, la etapa de hibridación se realizara a 37ºC, la temperatura para las reacciones catalizadas por Taq debe elevarse hasta aproximadamente 70ºC antes de que el enzima exhiba una actividad significativa. Durante esta transición de 37 a 70ºC, los híbridos molde-cebador poco complementarios (que se forman a 37ºC) se desasocian de modo que en el momento en que la reacción alcanza la temperatura de activación del enzima, únicamente está disponible para la extensión el substrato altamente complementario. Esta especificidad resulta asimismo en un mayor rendimiento de secuencia diana que las amplificaciones similares realizadas con el fragmento Klenow, puesto que los productos de extensión no específicos compiten efectivamente por la polimerasa, reduciendo de este modo la cantidad de secuencia de 110 pb que puede ser sintetizada por el fragmento Klenow.
Ejemplo X
Se realizó la amplificación de una muestra conteniendo 1 \mug de DNA de Molt 4, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 10 mM, gelatina 0,01%, y 1 \muM de cada uno de los siguientes cebadores (para amplificar una región de 150 pb):
5'-CATGCCTCTTTGCACCATTC-3' (RS79) y
5'-TGGTAGCTGGATTGTAGCTG-3' (RS80)
1,5 mM de cada dNTP, y 5,0 unidades de polimerasa Taq por 100 \mul de volumen de reacción. Se prepararon tres muestras adicionales conteniendo 2,5, 1,3 ó 0,6 unidades de polimerasa Taq. La amplificación se realizó en el aparato de ciclado de temperatura descrito anteriormente empleando el siguiente ciclo, durante 30 ciclos:
de 70 a 98ºC, durante 1 minuto
mantener a 98ºC durante 1 minuto
de 98ºC a 35, 45 ó 55ºC durante 1 minuto
mantener a 35, 45 ó 55ºC durante 1 minuto
de 35, 45 o 55ºC a 70ºC durante 1 minuto
mantener a 70ºC durante 30 segundos
A una temperatura de hibridación de 35ºC, la dilución de enzima Taq de 2,5 unidades por 100 \mul rindió la mejor relación señal-ruido en una electroforesis en gel de agarosa sobre el resto de concentraciones de polimerasa Taq. A 45ºC, las unidades de 100 \mul de enzima Taq rindieron la mejor relación señal-ruido respecto a las otras concentraciones. A 55ºC, las 5 unidades por 100 \mul de enzima Taq rindieron la mejor proporción señal ruido sobre el resto de concentraciones y sobre la hibridación a 45ºC, y un rendimiento mejorado. La polimerasa Taq presenta un mayor rendimiento y especificidad a 55ºC.
En un experimento por separado, el DNA Molt 4 se diluyó 10 veces de forma seriada en DNA de la línea celular GM2064, que no contiene secuencias \beta- o \delta-globina, disponible a partir de Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, New Jersey, a diferentes concentraciones que representan diferentes copias por célula, y la amplificación se llevó a cabo en estas muestras como se describe en este ejemplo a temperatura de hibridación de 35ºC y 55ºC. A 35ºC, la cantidad más baja que puede detectarse por electroforesis en gel de agarosa es 1 copia por 50 células. A 55ºC, lo más bajo que puede detectarse es una copia por 5.000 células (una mejora de 100 veces respecto a la temperatura inferior), lo que ilustra la importancia de una temperatura de hibridación aumentada para la especificidad de la polimerasa Taq en estas condiciones.
En un tercer experimento, el DNA de una línea celular 368H que contiene DNA positivo de HIV, disponible a partir de B. Poiesz, State University of New York, Syracuse, NY, fue diluido de forma similar en el DNA de la línea celular SC1 (depositada en la ATCC el 19 de Marzo de 1985; una línea celular \beta transformada con EBV homozigota para el alelo de células falciformes y que carece de cualquier secuencia HIV), a diferentes concentraciones que representan varias copias por célula, y la amplificación se llevó a cabo como se describe en este Ejemplo, a temperaturas de hibridación de 35ºC y 55ºC, empleando los cebadores SK38 y SK39, que amplifican una región de 115 pb de la secuencia de HIV:
5'-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3' (SK38) y
5'-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3' (SK39)
Los resultados por electroforesis en gel de agarosa muestran que únicamente la muestra 368H no diluida pudo ser detectada con la temperatura de hibridación a 35ºC, mientras que puede detectarse una dilución de al menos 10^{-2} con la temperatura de hibridación a 55ºC, lo que supone una mejora de 100 veces en la detección.
Ejemplo XI
Se preparó cDNA a partir de 1 \mug de mRNA de reticulocito de conejo (Bethesda Research Laboratories) en un volumen de reacción de 100 \mul conteniendo KCl 150 mM, tris-HC1 50 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 10 mM, DTT 5 mM, dATP 0,5 mM, dCTP 0,5 mM, TTP 0,5 mM, dGTP 0,5 mM, 0,2 \mug de oligo (dT) 12-18 (Pharmacia), 40 unidades de Rnasin (Promega Biotech), y 5 unidades de transcriptasa reserva de AMV (BRL), incubándose durante 30 minutos a 42ºC. La reacción se detuvo calentando durante 10 minutos a 95ºC. Se añadieron a la muestra 2 \mug de Rnasa A (2 \mul de una solución 2 mg/ml en agua), y se incubó la muestra durante 10 minutos a 37ºC.
Se llevaron a cabo tres reacciones de amplificación con el fragmento Klenow empleando diferentes parejas de cebadores. La pareja de cebadores PCO3/PCO4 definen un producto de 110 pb. La pareja de cebadores RS45/oligo (dT)25-30 definen un producto de aproximadamente 370 pb, y la pareja de cebadores PCO3/oligo(dT)25-30 definen un producto de aproximadamente 600 pb. PCO3, PCO4 y RS45 son complementarios al gen de la \beta-globina humana, y cada uno presenta dos desapareamientos con el gen del conejo. Los cebadores PCO3 y PCO4 se describen en el Ejemplo I. RS45 posee la secuencia:
5'-CAAGAAGGTGCTAGGTGCC-3'.
Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo con 1/20ª parte (5 \mul) del cDNA descrito anteriormente en un volumen de reacción de 100 \mul que contiene NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 10 mM, gelatina 200 \mug/ml, DMSO 10%, PCO3 ó RS45 1 \muM, PCO4 ó oligo(dT)25-30 1 \muM, dATP 1,5 mM, dCTP 1,5 mM, TTP 1,5 mM y dGTP 1,5 mM. Las muestras se calentaron durante cinco minutos a 98ºC, y seguidamente se enfriaron a temperatura ambiente y se cubrieron con una capa de aceite mineral de 100 \mul.
Las muestras se sometieron a 10 ciclos de amplificación automática empleando el aparato descrito en el Ejemplo I y utilizando el siguiente programa:
1) calentamiento de 37ºC a 98ºC en un bloque térmico durante 2,5 minutos (desnaturalización);
2) enfriamiento de 98ºC a 37ºC durante 3,0 minutos (hibridación);
3) adición de 1 unidad de fragmento Klenow; y
4) mantenimiento a 37ºC durante 20 minutos (extensión).
El volumen final de cada muestra fue de aproximadamente 140 \mul.
Una veinteava parte (7 \mul) de cada muestra fue analizada por electroforesis en un gel de agarosa al 2%. Tras tinción con bromuro de etidio, se observaron bandas discretas en las muestras PCO3 / PCO4 y RS45 / oligo (dT). Los tamaños de las bandas fueron consistentes con las longitudes esperadas: 110 pb para el primero, aproximadamente 370 pb para el segundo. No se observaron indicios de amplificación de un fragmento de aproximadamente 600 pb con el par de cebadores PCO3/ oligo(dT).
El contenido del gel fue sometido a una transferencia Southern sobre una membrana Genatran de nylon y se hibridó con una sonda de \beta-globina humana, pBR328:betaA, marcada por traslación de mella como se describe en Saiki y col., Science, supra, empleando técnicas estándar. El autorradiograma resultante extendió las conclusiones alcanzadas previamente: los fragmentos de 110 pb y de aproximadamente 370 pb fueron productos de amplificación específicos de \beta-globina, y no se detectó amplificación significativa de la banda de aproximadamente 600 pb.
Se amplificaron tres muestras adicionales con la polimerasa Taq obtenida como se describe anteriormente empleando las mismas parejas de cebadores descritas previamente. Se amplificaron porciones de 5 \mul de cDNA en volúmenes de 100 \mul conteniendo KCl 50 mM, Tris-HCl 25 mM (pH 8,0), MgCl_{2} 10 mM, gelatina 200 \mug/ml, DMSO 10%, PCO3 ó RS45 1 \muM, PCO4 ó oligo(dT)25-30 1 \muM, dATP 1,5 mM, dCTP 1,5 mM, TTP 1,5 mM y dGTP 1,5 mM y dGTP 1,5 mM. Las muestras se calentaron durante cinco minutos a 85ºC, y seguidamente se enfriaron a temperatura ambiente. Se añadió 1 \mul de polimerasa Taq (dilución 1/8 del lote 2) a cada muestra, y se cubrieron con aproximadamente 100 \mul de aceite mineral.
Las muestras se sometieron a 9 ciclos de amplificación en el dispositivo Peltier descrito en el ejemplo previo empleando el siguiente programa:
1) 1 min, rampa de 35ºC a 60ºC;
2) 12 min, rampa de 60ºC a 70ºC (extensión);
3) 1 min, rampa de 70ºC a 95ºC (desnaturalización);
4) 30 seg, mantener a 95ºC;
5) 1 min, rampa de 95ºC a 35ºC (hibridación); y
6) 30 seg, mantener a 35ºC.
Una vez finalizado el último ciclo, las muestras se incubaron 10 minutos adicionales a 70ºC para completar la extensión final (décimo ciclo). El volumen final de cada muestra fue de aproximadamente 100 \mul.
Al igual que en el caso anterior, 1/20ª parte (10 \mul) de cada muestra se analizó en un gel de agarosa al 2%. En este gel, los productos de amplificación estuvieron presentes en todas las tres muestras: 110 pb para PCO3/PCO4, aproximadamente 370 pb para RS45/oligo(dT), y aproximadamente 600 pb para PCO3/oligo(dT). Estos resultados fueron confirmados por trasferencia Southern e hibridación con la sonsa pBR328:betaA.
La producción del producto de 600 pb con la polimerasa Taq pero no con el fragmento Klenow es significativa, y sugiere que la polimerasa Taq es capaz de producir DNA más largo que el fragmento Klenow.
Se depositaron los siguientes bacteriófagos y cepas bacterianas en la Cetus Master Culture Collection, 1400 Fifty-Third Street, Emeryville, California, EE.UU. (CMCC), y en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, EE.UU. (ATCC). Estos depósitos se llevaron a cabo al amparo del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los propósitos del Procedimiento de Patentes y de las Regulaciones incluidas (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable durante al menos 30 años a partir de la fecha de depósito. El organismo está disponible a partir de la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sometido a un acuerdo sobre los solicitantes y la ATCC que asegura una disponibilidad sin restricciones tras la publicación de la patente estadounidense pertinente. La disponibilidad de las cepas depositadas no debe interpretarse como una licencia para poner en práctica la invención contraviniendo los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno de conformidad con sus leyes sobre patentes.
13
En resumen, la presente invención ha demostrado proporcionar un proceso para amplificar una o más secuencias de ácido nucleico específicas empleando una reacción en cadena por ciclos de temperatura y un enzima termoestable, en la cual reacción se producen productos de extensión de cebador que pueden actuar subsiguientemente como moldes para reacciones adicionales de extensión de cebador. El proceso es especialmente útil en la detección de secuencias de ácido nucleico que están presentes inicialmente únicamente en cantidades muy pequeñas, así como en la detección de variaciones de nucleótidos empleando oligonucleótidos específicos de secuencia. Asimismo, el proceso de amplificación descrito puede ser utilizado para la clonación molecular.
El proceso aquí descrito tiene como resultado rendimientos aumentados de producto amplificado, una mayor especificidad, y menos etapas necesarias para la realización del procedimiento de amplificación, respecto a lo que ha sido descubierto previamente.

Claims (51)

1. Un método para la preparación de un enzima DNA polimerasa de Thermus aquaticus termoestable, que cataliza la combinación de los trifosfatos de nucleósidos para formar una cadena de ácido nucleico complementaria de una cadena molde de un ácido nucleico, que tiene un peso molecular de 86.000 a 90.000, determinado de acuerdo con su migración en un análisis SDS-PAGE, cuando las proteínas marcadoras son la fosforilasa B (92.500), la albúmina de suero bovino (66.200), la ovoalbúmina (45.000), la anhidrasa carbónica (31.000), el inhibidor de la tripsina de haba de soja (21.500), y la lisozima (14.400), comprendiendo dicho método el cultivo de una cepa de Thermus aquaticus o una célula anfitriona recombinante, hospedando una secuencia de DNA que codifica dicha DNA polimerasa en condiciones adecuadas y aislando dicha DNA polimerasa del cultivo.
2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho enzima termoestable no se desnaturaliza irreversiblemente cuando se le somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble cadena.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho enzima termoestable es un enzima derivado del Thermus aquaticus YT1 (ATCC 25.104).
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho enzima termoestable tiene por lo menos el 50% de actividad a pH 6,4 de la que tiene a pH 8,0.
5. Un método para la preparación de una secuencia de DNA que codifica una DNA polimerasa de Thermus aquaticus termoestable, que cataliza la combinación de nucleósido trifosfatos para formar una cadena de ácido nucleico complementaria de una cadena molde de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó un fragmento de dicha secuencia de DNA que codifica un enzima termoestable truncada enzimáticamente activa, la cual tiene una actividad DNA polimerasa, comprendiendo dicho método los siguientes pasos:
(a) identificación de una sonda de secuencias de DNA para el enzima termoestable mediante la exploración inmunológica de una librería de expresión que contiene el genoma del Thermus aquaticus, con anticuerpos para la Taq polimerasa termoestable;
(b) construcción de una librería genómica del DNA diana;
(c) exploración de la librería genómica con la sonda marcada radiactivamente obtenida en el paso (a); y
(d) aislamiento de los fagos que contienen el DNA que codifica dicho enzima termoestable.
6. El método de la reivindicación 5, en donde dicho enzima o fragmento del mismo no se desnaturaliza irreversiblemente cuando se somete a elevadas temperaturas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble cadena.
7. El método de la reivindicación 6, en donde como sonda se emplea una porción del DNA genómico del Thermus aquaticus que codifica por lo menos seis aminoácidos de la Taq polimerasa.
8. El método de la reivindicación 7, en donde dicha sonda se selecciona entre las sondas siguientes:
(a) el fragmento de DNA de Thermus aquaticus de aproximadamente 115 bp Eco-RI-AluI adaptado, de pFC85 (ATCC 67.421);
(b) el fragmento de DNA de Thermus aquaticus de aproximadamente 750 bp BaIII-HindIII, de pFC83 (ATCC 67.422);
(c) el fragmento de DNA de Thermus aquaticus HindIII-BamHI, del inserto de pFC85 (ATCC 67.421);
(d) el fragmento de DNA de Thermus aquaticus de aproximadamente 2,8 kb HindIII-Asp718, de pFC85 (ATCC 67.421); y
(e) el fragmento de DNA de Thermus aquaticus BamHI-NheI, del inserto de pFC85 (ATCC 67.421);
9. El método de la reivindicación 5, en donde la secuencia de DNA de Thermus aquaticus está contenida dentro de un fragmento de restricción de aproximadamente 3,5 kb BaIII-Asp718 (parcial) de, o bien el genoma del Thermus aquaticus o bien el DNA del bacteriófago CH35:Taq#4-2(ATCC 40.336).
10. El método de la reivindicación 5, en donde la secuencia de DNA de Thermus aquaticus está contenida dentro de un fragmento de restricción HindIII-Asp718 de aproximadamente 2,8 kb de, o bien el genoma del Thermus aquaticus o bien el plásmido pFC85(ATCC 67.421).
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en donde la secuencia de DNA tiene adicionalmente un codon AGT de partida.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en donde la secuencia de DNA codifica una proteína de fusión que contiene dicho enzima termoestable.
13. Un método para la preparación de un vector recombinante que comprende la inserción de la secuencia o fragmento de DNA, de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en un vector apropiado.
14. El método de la reivindicación 13, en donde el vector recombinante es el CH35:Taq#4-2(ATCC 40.336), pFC83 (ATCC 67.422), pFC85 (ATCC 67.421) ó un vector, el inserto del cual se compone del fragmento BgIII/HindIII de aproximadamente 750 bp, de pFC83, y el fragmento HindIII/Asp718 de aproximadamente 2,8 kbp, de pFC85.
15. El método de la reivindicación 13, en donde dicha secuencia o fragmento de DNA está engarzado operablemente a una secuencia control de la expresión.
16. Una célula anfitriona recombinante que contiene un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.
17. La célula anfitriona recombinante de la reivindicación 16, la cual es la E. coli.
18. Un método para la producción de un enzima termoestable recombinante que tiene actividad DNA polimerasa, fragmento o modificación del mismo que tiene actividad DNA polimerasa, el cual cataliza la combinación de los trifosfatos de nucleósidos para formar una cadena de ácido nucleico complementaria de una cadena molde de ácido nucleico, el cual método comprende el cultivo de una célula anfitriona de la reivindicación 16 ó 17.
19. El método de la reivindicación 18, en donde dicho enzima o modificación del mismo tiene un peso molecular de 86.000 a 90.000 determinado de acuerdo con su migración en un análisis SDS-PAGE, cuando las proteínas marcadoras son la fosforilasa B (92.500), albúmina de suero bovino (66.200), ovoalbúmina (45.000), anhidrasa carbónica (31.000), inhibidor de tripsina de haba de soja (21.500) y lisozima (14.400).
20. El método de la reivindicación 18 ó 19, en donde el enzima recombinante, fragmento o modificación del mismo, están exentos de actividad desoxirribonucleasa termoestable contaminante.
21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde dicho enzima recombinante, fragmento o modificación del mismo, no se desnaturaliza irreversiblemente cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble cadena.
22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en donde el enzima recombinante, fragmento o modificación del mismo tienen por lo menos el 50% de la actividad a pH 6,4 de la que tiene a pH 8,0.
23. Un método para la preparación de una composición de enzima estable que comprende la combinación de una DNA polimerasa de Thermus aquaticus termoestable, preparada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, ó un enzima recombinante termoestable, fragmento o modificación del mismo, que tiene actividad DNA polimerasa obtenido por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, con un tampón que comprende uno o más detergentes poliméricos no iónicos.
24. El método de la reivindicación 23, en donde los detergentes están presentes cada uno de ellos, en una concentración de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,5% volumen/volumen de la composición total.
25. El método de la reivindicación 23 ó 24, en donde los detergentes son un monolaurato de sorbitano polioxietilado y un nonil fenol etoxilado.
26. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en donde el tampón comprende glicerina, Tris-Cl, pH 8,0, ácido etilendiamina tetracético, ditiotreitol, un monolaurato de sorbitano polioxietilado, un nonil fenol etoxilado, y gelatina.
27. Una DNA polimerasa de Thermus aquaticus termoestable, que cataliza la combinación de los trifosfatos de nucleósidos para formar una cadena de ácido nucleico complementaria de una cadena molde de ácido nucleico, que tiene un peso molecular de 86.000 a 90.000 determinado por su migración en un análisis SDS-PAGE, cuando las proteínas marcadoras son la fosforilasa B (92.500), albúmina de suero bovino (66.200), ovoalbúmina (45.000), anhidrasa carbónica (31.000), inhibidor de tripsina de haba de soja (21.500) y lisozima (14.400).
28. El enzima termoestable de la reivindicación 27, que no se desnaturaliza irreversiblemente cuando se somete a elevadas temperaturas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble cadena.
29. El enzima termoestable de la reivindicación 27 ó 28, el cual es un enzima derivado del Thermus aquaticus YT1 (ATCC 25.104).
30. El enzima termoestable de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, el cual tiene por lo menos el 50% de la actividad a pH 6,4 de la que tiene a pH 8,0.
31. El enzima termoestable de las reivindicaciones 27 a 30, que puede obtenerse mediante un método reivindicado en la reivindicación 1.
32. Una secuencia de DNA que codifica una DNA polimerasa de Thermus aquaticus termoestable, que cataliza la combinación de los trifosfatos de nucleósidos para formar una cadena de ácido nucleico complementario de una cadena molde de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31, o un fragmento de dicha secuencia de DNA que codifica un enzima truncada termoestable enzimáticamente activa, que tiene una actividad DNA polimerasa.
33. La secuencia de DNA de la reivindicación 32, en donde dicho enzima o fragmento del mismo no se desnaturaliza irreversiblemente cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble cadena.
34. La secuencia de DNA del Thermus aquaticus de la reivindicación 32, que está contenida dentro de un fragmento de restricción BaIII-Asp718 (parcial) de aproximadamente 3,5 kb de, o bien el genoma del Thermus aquaticus o bien el DNA del bacteriófago CH35:Taq#4-2 (ATCC 40.336).
35. La secuencia de DNA del Thermus aquaticus de la reivindicación 32, que está contenida dentro de un fragmento de restricción HindIII-Asp718 de aproximadamente 2,8 kb de, ó bien el genoma del Thermus aquaticus o el plásmido pFC85 (ATCC 67.421).
36. La secuencia de DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, la cual adicionalmente tiene un codon ATG de partida.
37. La secuencia de DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36, la cual codifica una proteína de fusión que contiene dicho enzima termoestable.
38. Un vector recombinante que contiene la secuencia o fragmento de DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 37.
39. El vector recombinante de la reivindicación 38, el cual es el CH35:Taq#4-2 (ATCC 40.336), pFC83 (ATCC 67.422), pFC85 (ATCC 67.421) ó un vector, cuyo inserto esta compuesto del fragmento BgIII/HindIII de aproximadamente 750 bp, de pFC83 y el fragmento HindIII/Asp718 de aproximadamente 2,8 kbp, de pFC85.
40. El vector recombinante de la reivindicación 38, en donde dicha secuencia o fragmento de DNA está operablemente engarzado a una secuencia de control de la expresión.
41. Un enzima recombinante termoestable que tiene actividad DNA polimerasa o una modificación del mismo que tiene actividad DNA polimerasa, que cataliza la combinación de los trifosfatos de nucleósidos para formar una cadena de ácido nucleico complementaria a la cadena molde del ácido nucleico, teniendo dicho enzima o modificación del mismo un peso molecular de 86.000 a 90.000 determinado de acuerdo con su migración en un análisis SDS-PAGE, cuando las proteínas marcadoras son la fosforilasa B (92.500), albúmina de suero bovino (66.200), ovoalbúmina (45.000), anhidrasa carbónica (31.000), inhibidor de tripsina de haba de soja (21.500) y lisozima (14.400), pudiéndose obtener dicho enzima por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en donde dicha célula anfitriona es la célula anfitriona recombinante de la reivindicación 17.
42. Una composición de enzima estable que contiene una DNA polimerasa de Thermus aquaticus termoestable, que cataliza la combinación de los trifosfatos de nucleósidos para formar una cadena de ácido nucleico complementaria a la cadena molde del ácido nucleico, que tiene un peso molecular de 86.000 a 90.000 determinado de acuerdo con su migración en un análisis SDS-PAGE, cuando las proteínas marcadoras son la fosforilasa B (92.500), albúmina de suero bovino (66.200), ovoalbúmina (45.000), anhidrasa carbónica (31.000), inhibidor de tripsina de haba de soja (21.500) y lisozima (14.400), en un tampón que contiene uno o más detergentes poliméricos no iónicos.
43. Una composición de enzima estable, que comprende una Thermus aquaticus DNA polimerasa recombinante termoestable o un fragmento del mismo que tiene actividad DNA polimerasa, obtenido por:
(a)
el método de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, ó
(b)
de acuerdo con la reivindicación 41,
en un tampón que contiene uno o más detergentes poliméricos no iónicos.
44. Una composición de enzima estable que contiene una DNA polimerasa de Thermus aquaticus recombinante termoestable o una modificación de la misma que tiene actividad DNA polimerasa que cataliza la combinación de los trifosfatos de nucleósidos para formar una cadena de ácido nucleico complementaria a la cadena molde del ácido nucleico, que tiene un peso molecular de 86.000 a 90.000 determinado de acuerdo con su migración en un análisis SDS-PAGE, cuando las proteínas marcadoras son la fosforilasa B (92.500), albúmina de suero bovino (66.200), ovoalbúmina (45.000), anhidrasa carbónica (31.000), inhibidor de tripsina de haba de soja (21.500) y lisozima (14.400), en un tampón que contiene uno o más detergentes poliméricos no iónicos.
45. La composición de enzima estable de la reivindicación 44, en donde el enzima recombinante o modificación del mismo no se desnaturaliza irreversiblemente cuando se somete a elevadas temperaturas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble cadena.
46. La composición de enzima estable de una cualquiera de las reivindicaciones 44 ó 45, en donde el enzima recombinante o modificación del mismo tiene por lo menos el 50% de la actividad a pH 6,4 de la que tiene a pH 8,0.
47. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 42, 43 ó 44, en donde los detergentes están presentes cada uno en una concentración de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,5% volumen/volumen de la composición total.
48. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 42, 43, 44 ó 47, en donde los detergentes son un monolaurato de sorbitano polioxietilado y un nonil fenol etoxilado.
49. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 42, 43, 44, 47 ó 48, en donde el tampón contiene glicerina, Tris-Cl, pH 8,0, ácido etilendiamina tetracético, ditiotreitol, un monolaurato de sorbitano polioxietilado, un nonil fenol etoxilado, y gelatina.
50. El empleo de un enzima termoestable que tiene una actividad DNA polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31, del enzima recombinante termoestable de la reivindicación 41, ó de una composición de enzima estable de una cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44 ó 47 a 49 para las reacciones en cadena de la polimerasa.
51. Un método para la amplificación de las secuencias de ácido nucleico que comprende el empleo de un enzima termoestable que tiene actividad DNA polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31, del enzima recombinante termoestable de la reivindicación 41, ó de una composición de enzima estable de una cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44 ó 47 a 49.
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