JP2719529B2

JP2719529B2 - 熱安定性核酸ポリメラーゼ組成物

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Publication number: JP2719529B2
Application number: JP2326114A
Authority: JP
Inventors: アンソニーエルリッヒヘンリー; バンクスマリスカリー; ホーングレン; ハローゲルファントデビッド; ケイヒサイキランダル; クックローヤーフランシス; ネトフェルスザンネ
Original assignee: エフ．ホフマンーラロシュアーゲー
Priority date: 1986-08-22
Filing date: 1990-11-29
Publication date: 1998-02-25
Anticipated expiration: 2013-02-25
Also published as: JP2502042B2; EP0776970B1; EP0776970A1; DK438487D0; JPH0824570B2; JPH06292579A; EP0776970B2; DE3752073D1; BR8704332A; NO305488B1; DE3752073T2; KR880003007A; SG46644A1; DE3752392T3; DE3752392T2; JP2502041B2; DE258017T1; AU7729887A; CN87105787A; JPH02434A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、熱安定性DNAポリメラーゼを含有する安定
性酵素組成物に関する。

本発明のDNAポリメラーゼ組成物は、温度循環DNAポリ
メラーゼ連鎖反応によって既存の特定の核酸配列から多
量の核酸配列を複製するために特に有用である。

〔従来の技術〕

E.コリ（E. coli）のような中温微生物からのDNAポ
リメラーゼの単離について、広範な研究が行われてき
た。例えば、ベスマン（Bessman）ら、J.Biol.Chem.（1
957年）、233巻、171〜177頁およびブチン（Buttin）と
コルンベルグ（Kornberg）J.Biol.Chem.（1966年）、24
1巻、5419〜5427頁を参照されたい。

これとは対照的に、テルムス・アクアチクス（Thermu
s aquaticus）のような好熱菌からのDNAポリメラーゼ
の単離と精製については、余り研究が行なわれていな
い。カレジン（Kaledin）ら、Biokhymiya，（1980年）4
5巻、644〜651頁は、テルムス・アクアチクス（T. aqu
aticus）YT1株の細胞からのDNAポリメラーゼの６段階単
離および精製法を開示している。これらの工程は、粗製
抽出物の単離、DEAE−セルロース・クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシアパタイト上での分別、DEAE−セルロー
ス上での分別および単一鎖DNA−セルロース上でのクロ
マトグラフィーから成っている。それぞれの段階からの
プールは、エンド−およびエクソヌクレアーゼの混入に
ついてはスクリーニングされていない。精製された酵素
の分子量は、モノマー単位当たり62,000ダルトンと報告
されている。

テルムス・アクアチクス（T. aquaticus）からのポ
リメラーゼについての第二の精製法は、エイ・チエン
（A.Chien）ら、J.Bacteriol.（1976年）、127巻、1550
〜1557頁によって記載されている。この方法では、粗製
の抽出物をDEAE−セファデックスカラムにかける。透析
下プール分画を次に、ホスホセルロースカラム上での処
理に付す。このプールした分画を透析して、ウシ血清ア
ルブミン（BSA）を加えてポリメラーゼの活性の損失を
防止する。生成する混合物をDNA−セルロースカラムに
かける。カラムからのプールした物質を透析し、ゲル濾
過によって分析すると分子量は約63,000ダルトンであ
り、スクロース遠心分離によれば約68,000ダルトンであ
る。

しかしながら、これらの酵素は作用pH範囲、貯蔵安定
性等に問題があり、温度循環連鎖反応による核酸の多量
複製・増幅のために用いることはできなかった。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明は、温度循環連鎖反応による核酸の多量
複製のために使用することができる核酸ポリメラーゼを
含んで成る安定性の高い新規な酵素組成物を提供するも
のである。

〔課題を解決するための手段〕

前記の課題は、核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成
するためヌクレオチドトリホスフェートの結合を触媒す
る熱安定性核酸ポリメラーゼ、及び一種又は複数種類の
非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液中に該酵素を含
んで成る酵素組成物を提供することにより解決される。
熱安定性核酸ポリメラーゼは非イオン性洗剤を含有する
緩衝液中に保存した場合長時間に亙って活性を失わずに
安定である。

〔具体的な説明〕

本明細書において用いる用語は次の意味を有する。

「細胞」、「細胞系（セルライン）」および「細胞培
養物」は相互交換可能に用いることができ、これらの名
称は総て子孫を包含する。したがって、「形質転換体」
または「形質転換された細胞」とは、一次細胞およびト
ランスファーの回数とは関係なしにその細胞に由来する
培養物を包含する。また、総ての子孫は、人為的または
偶然的突然変異によりDNA含量が正確には同一ではない
ことがあることも理解される。最初に形質転換された細
胞においてスクリーニングしたのと同じ機能を有する変
異体子孫も包含される。

「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における
作用可能に連結されたコード配列の発現に必要なDNA配
列を指す。原核生物に好適な制御配列は、例えばプロモ
ーター、任意にはオペレーター配列、リボゾーム結合部
位であるが、さらにその他の余り理解されていない配列
も包含することが可能である。真核細胞は、プロモータ
ー、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用
することが知られている。

「発現系」という用語は、作用可能に連結された所望
のコード配列および制御配列を含むDNA配列を指し、こ
れらの配列で形質転換された宿主はコードされた蛋白質
を産生することができる。形質転換を行うために、発現
系をベクターに含有させてもよいが、これに続き関連の
DNAが宿主染色体に組み込まれてもよい。

本明細書で用いられる「遺伝子」という用語は、生物
活性を有するポリペブチドまたはその前駆体をコード化
するDNA配列を指す。このポリペプチドは、完全な長さ
の遺伝子配列によりまたは酵素活性が保持されているか
ぎりコード配列のいずれかの部分によってコードされて
いてもよい。

「作用可能に連結した」という用語は、成分の正常な
機能を行うことができる併置を指す。例えば、制御配列
に「作用可能に連結した」コード配列は、このコード配
列が制御配列の制御下で発現スことができる配置を指
す。

「非イオン性のポリマー性洗剤」とは、イオン性電荷
を持たず、本発明の目的には、約3.5〜約9.5のpH範囲、
好ましくは４〜8.5のpH範囲で酵素を安定化することが
できることを特徴とする界面活性剤を指す。

本明細書に用いられる「オリゴヌクレオチド」という
用語は、２個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリ
ボヌクレオチド、好ましくは３個以上のものからなる分
子として定義される。その正確な大きさは多くのファク
ターによって異り、これらのファクターはオリゴヌクレ
オチドの最終的な機能または用途によって異る。オリゴ
ヌクレオチドは、合成的にまたはクローニングによって
調製することができる。

本明細書に用いられる「制限エンドヌクレアーゼ」お
よび「制限酵素」という用語は、細菌酵素であって、そ
れぞれが特異的ヌクレオチド配列のまたはその付近の二
重鎖DNAを切断するものを指す。

本明細書に用いられる「ヌクレオチド配列の変化」と
いう用語は、ある種の単一または複数のヌクレオチド置
換、欠失または挿入を指す。

本明細書に用いられる熱安定酵素は、如何なる由来か
ら得ることもでき、天然または組換え蛋白質であっても
よい。耐熱性を有するものとして文献に報告されている
酵素の例は、熱に安定なポリメラーゼ、例えば好熱菌の
テルムス・フラブス（Thermus flavus）、テルムス・
サーモフィルス（Thermus thermophilus）、バシルス
・ステアロテルモフイルス（Bacillus stearothermoph
ilus）（他の文献に報告されているものよりも幾分低い
最適温度を有する）、テルムス・アクアチクス（Thermu
s aquaticus）、テルムス・ラクテウス（Thermus lac
teus）、テルムス・ルーベンス（Thermus rubens）、
およびメタノテルムス・フェルビドウス（Methanotherm
us fervidus）から抽出されたポリメラーゼである。

本明細書に用いられる好ましい熱安定酵素は、テルム
ス・アクアチクス（Thermus aquaticus）に由来するDN
Aポリメラーゼである。その各種の株も、アメリカン・
タイプ・カルチャ・コレクション（American Type Cult
ure Collection）ロックビル，メリーランド、から入手
することができ、ティ・ディ・ブロック（T.D.Broc
k）、J.Bact.（1969年）、98巻、289〜297頁、およびテ
ィ・オシマ（T.Oshima）、Arch.Microbiol.，（1978
年）、117巻、189〜196頁に記載されている。これらの
好ましい菌株の一つは、YT-1株である。

本発明において使用する好ましいDNAポリメラーゼは
次の性質を有する。

（１）作用本酵素は、鋳型DNAにアニールされたオリゴヌクレオ
チド又はポリヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基にデ
オキシリボヌクレオシド５′−トリホスフェートのα−
ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシ
リボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５′−モノホスフ
ェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する。

（２）基質特異性本酵素はその十分な活性のために部分的に二本鎖を形
成したDNA鋳型及び４種類のデオキシリボヌクレオシド
５′−トリホスフェートを必要とする。ここで部分的に
二本鎖を形成したDNA鋳型とは、例えば単鎖鋳型DNA分子
に遊離の３′−ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオ
チドプライマーがアニールしている状態を意味する。単
鎖DNAに対しても低い活性を示す可能性がある。

（３）最適pH及び安定pH範囲最適pH範囲は、70℃〜75℃の温度においてpH8.0〜8.5
である。但し、pH7.0においても有意な活性を有する。
本酵素は少なくともpH5.0〜pH9.4の範囲で比較的安定で
ある。

（４）作用温度範囲室温〜85℃の範囲で活性であり、最適温度は約75℃で
ある。35℃における活性は75℃における活性の約１％で
ある。

（５）不活性化本酵素は97.5℃において少なくとも５分間の半減期を
有する。

（６）阻害、活性化及び安定化ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、EDT
A、ホルムアミド、SDS、高濃度の尿素、等により阻害さ
れる。

（７）分子量本発明の分子量を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により、分子量標準としてホスホリダーゼＢ（分
子量92,000）、ウシ血清アルブミン（分子量66,200）、
オバルブミン（分子量45,000）、カーボニックアンヒド
ラーゼ（分子量31,000）、大豆トリプシンインヒビター
（分子量21,500）及びリゾチーム（分子量14,000）を用
いて決定した場合、約86,000〜90,000ダルトンであっ
た。しかし最近の報告によればホスホリラーゼＢの分子
量は約97,300ダルトンであるとされており、この分子量
に基けば本発明の酵素の分子量は約94,000ダルトンとさ
れる。

なお、酵素の活性測定法及び力価の定義は参考例４に
記載し、本酵素の精製方法の具体例を参考例１及び４に
記載する。また、本発明の組成物の製造方法を実施例１
及び２に記載する。

本発明のDNAポリメラーゼは、該酵素を生産する能力
を有するテルムス・アクアチクスを、例えば70℃におい
て培養し、この培養物から採取することができる。例え
ば、細胞を20時間増殖させた後、遠心分離によって回収
する。

細胞の増殖の後、酵素の単離および生成を６段階で行
い、それぞれの段階は室温より低い温度、好ましくは約
４℃で行う。

第一の段階または工程では、細胞が、凍結している場
合には、解凍し、超音波で破砕し、pHが約7.5の緩衝液
に懸濁する。

第二の段階では上澄液を集めて、次いで乾燥硫酸アン
モニウムのような塩を加えることによって分別する。適
当な画分（典型的には、45〜75％飽和）を集めて、0.2
リン酸カリウム緩衝液、好ましくはpH6.5の緩衝液に溶
解して、同じ緩衝液に対して透析する。

第三の段階では、核酸及びある種の蛋白質を取り除
く。第二の段階からの画分を、上記と同じ緩衝液で平衡
化したDEAE−セルロースカラムにかける。次いで、この
カラムを同じ緩衝液で洗浄し、蛋白質含有画分を溶出
し、280nmでの吸収によって測定し、集めて、10mMリン
酸カリウム緩衝液に対して、好ましくは第一の緩衝液で
pHを7.5にしたものと同じ成分を有するもので透析す
る。

第四の段階では、上記のようにして集めた分画を、第
三の段階で透析に用いた緩衝液で平衡にしたヒドロキシ
アパタイトカラムにかける。次いで、このカラムを洗浄
し、10mMの２−メルカプトエタノールと５％のグリセリ
ンを含むpH7.5の0.01M〜0.5Mリン酸カリウム緩衝液の直
線グラジエントで酵素を溶出する。プールした熱安定酵
素DNAポリメラーゼ活性を含む画分を、第三の段階で透
析に使用したのと同じ緩衝液で透析する。

第五の段階では、透析した画分を、第三の段階で透析
に使用した緩衝液で平衡化したDEAE−セルロースカラム
にかける。このカラムを次に洗浄し、第三の段階で透析
に使用した緩衝液中で0.01〜0.6MのKClのような緩衝液
の直線グラジエントで、酵素を溶出する。熱安定酵素の
活性を有する画分を、適当を方法を用いてデオキシリボ
ヌクレアーゼ（エンド−およびエキソヌクレアーゼ）の
混入について試験する。例えば、エンドヌクレアーゼ活
性は、過剰のDNAポリメラーゼと共にインキュベートし
た後ファージλDNAまたはスーパーコイルプラスミドDNA
の分子量の変化から、電気泳動によって測定することが
できる。同様に、エキソヌクレアーゼ活性は、数個の部
位で開裂する制限酵素を用いて処理した後、DNAの分子
量の変化から電気泳動によって測定することができる。

デオキシリボヌクレアーゼ活性を持たないと決定され
た画分をプールして、第三の段階で用いたのと同じ緩衝
液で透析する。

第六の段階では、プールした画分を、一定のベッドボ
リウムを有するホスホセルロースカラムに入れる。この
カラムを洗浄して、pH7.5でリン酸カリウム緩衝液中0.0
1〜0.4MのKClのような緩衝液の直線グラジエントで酵素
を溶出する。熱安定なポリメラーゼ活性を有し、デオキ
シリボヌクレアーゼ活性を有しないプールした画分を、
pH8.0の緩衝液で透析する。

透析した生成物の分子量は、蛋白質分子量マーカーを
用いてSDS PAGEによる方法等によって決定することがで
きる。好ましい酵素の一つであるテルムス・アクアチク
ス（Thermus aquaticus）から精製されたDNAポリメラ
ーゼの分子量は、前記方法によって、分子量標準ホスホ
リラーゼＢの分子量を92,000ダルトンとした場合、約8
6,000〜90,000ダルトンと決定される。

本発明の熱安定酵素は、この酵素をコードする遺伝子
をテルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）ゲノ
ムDNAからクローン化し、組換えDNA技術によって製造す
ることもできる。テルムス・アクアチクス（Taq）ポリ
メラーゼの完全なコード配列は、約18kb（キロベース）
のゲノムDNAインサートフラグメント内に含まれる約3.5
kbのBg1II-Asp718（部分）制限フラグメントを含むバク
テリオファージCH35:Taq ＃4-2から誘導することができ
る。このバクテリオファージは、1987年５月29日にアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に
寄託され、寄託番号第40,336号を有する。また、この遺
伝子は、プラスミドpFC83（ATCC第67,422号、1987年５
月29日寄託）から単離された約750塩基対（bp）のBg1II
-HindIII制限フラグメントを、プラスミドpFC85（ATCC
第67,421号、1987年５月29日寄託）から単離された約2.
8kb HindIII-Asp718制限フラグメントに連結することに
よって造成することができる。pFC85制限フラグメント
はTaqポリメラーゼ遺伝子のアミノ末端をコードする部
分を有するが、pFC85からの制限フラグメントはカルボ
キシ−末端をコードする部分を有する。したがって、こ
れらの２個のフラグメントを、適当な制御配列を有する
対応して消化されたベクターと連結すると、全長Taqポ
リメラーゼの翻訳が得られる。

所望の酵素活性を有する生物学的に活性な遺伝子生成
物を得るためにはTaqポリメラーゼ遺伝子の全コード配
列は必要でないことも見出された。アミノ末端コード部
分が欠失しており、コード配列の約３分の１が不在であ
るDNAが、ポリメラーゼ分析において完全に活性な遺伝
子生成物を産生した。

Ｎ−末端の欠失に加えて、Taqポリメラーゼを構成す
るペプチド鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、
またはその他の誘導体化によって改変されていてもよ
く、また蛋白質を開裂して活性を保持するフラグメント
を得ることもできる。活性を破壊しないかかる変更は、
遺伝子の定義からこのような蛋白質をコードするDNA配
列を除外しない。

したがって、翻訳の間に配列に組み込まれるアミノ酸
の欠失、付加または変更による一次構造自体の改変は、
蛋白質の活性を破壊することなく行うことができる。か
かる置換またはその他の変更は、本発明の範囲に属する
DNAによってコードされたアミノ酸配列を有する蛋白質
をもたらす。

本発明の精製されたポリメラーゼで免疫したウサギか
らのポリクローナル抗血清を用いて、テルムス・アクア
チクス（Thermus aquaticus）の部分ゲノム発現ライブ
ラリーをプローブして、下記のようにして適当なコード
配列を得た。クローン化されたゲノム配列は融合ポリペ
プチドとして発現させたり、それ自体の制御配列を用い
て直接に発現されたり、または酵素の発現に用いられる
特定の宿主に好適な制御配列を用いる構成によって発現
させることができる。

勿論、これらの配列をコードするDNAの入手可能性
は、コドン配列を改変してDNAポリメラーゼ活性をも有
するムテイン（mutein）形を得る機会を提供する。

例えば、これらの手段は、Taq DNAポリメラーゼのた
めの完全なコード配列を提供して、このコード配列か
ら、各種の宿主系に適用できる発現ベクターを構成し、
そしてコード配列を発現せしめることができる。さら
に、以上のことから、Taqポリメラーゼコード配列の部
分はプローブとして有用であり、色々な種のその他の熱
安定ポリメラーゼコード配列を回収するためのプローブ
として有用であることも明らかである。したがって、少
なくとも６個のアミノ酸をコードするゲノムDNAの部分
をE.コリ（E. coli）において複製しそしてこれを変性
してプローブとして使用し、あるいは少なくとも６個の
アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、こ
れらを用いて熱安定性ポリメラーゼをコードする他のDN
Aを検索することができる。テルムス・アクアチクス（T
hermus aquaticus）におけるヌクレアーゼ配列とその
他の種類の対応する部分の配列は正確には一致しないこ
とがあるので、間違った陽性を排除するのに十分なスト
リンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを行う
ために６個のアミノ酸ストレットをコードする約18個の
ヌクレオチドを有するオリゴマーが必要であろう。６個
のアミノをコードする配列は、かかるプローブのために
十分な情報を供給するであろう。

好適な宿主、制御系および方法一般的に、組換え形のTaqポリメラーゼの製造は、以
下のような工程を含む。

第一に、成熟酵素（この場合、総てのムテインを含む
意味に用いられる）、あるいはTaqポリメラーゼとその
活性を破壊しない追加の配列との融合体、または制御さ
れた条件下で（例えば、ペプチダーゼによる処理によ
る）開裂して活性蛋白質をもたらすことができる追加の
配列との融合体、をコード化するDNAを得る。配列がイ
ントロンによって中断されていないときには、それは如
何なる宿主における発現にも好適である。この配列は、
切り出し可能で且つ回収可能な形であるべきである。

次に、好ましくは、切り出されたまたは回収されたコ
ード配列を、複製可能な発現ベクター中の好適な制御配
列と作用可能に連結する。このベクターを用いて、好適
な宿主を形質転換し、形質転換された宿主を好ましい条
件下で培養して、組換えTaqポリメラーゼを産生させ
る。場合によっては、Taqポリメラーゼを培養液または
細胞から単離するが、ある種の不純物が許容される場合
には、蛋白質の回収および精製は必要でないこともあ
る。

上記の段階のそれぞれは、各種の方法で行うことがで
きる。例えば、所望のコード配列をゲノムフラグメント
から得て、適当な宿主に直接用いることもできる。各種
の宿主で作用可能な発現ベクターの造成は、以下のよう
な適当なレプリコンを用いて行なわれる。好適な制限部
位が通常は利用可能でない場合には、これをコード配列
の末端に加えて切り出し可能な遺伝子を得、これらのベ
クターに挿入することができる。

制御配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子
を発現するのに用いられる宿主細胞の型によって異る。
一般的には、原核細胞、酵母、昆虫または哺乳類細胞が
宿主として現在有用である。原核宿主は、一般的には組
換え蛋白質の産生にとって最も有効で好都合であり、そ
れ故Taqポリメラーゼの発現にとって好ましい。

Taqポリメラーゼの特定の場合には、組換え条件下お
よび自然条件下のいずれにおいても、蛋白質のＮ−末端
でかなり欠失が起こり、そして蛋白質の活性はなお保持
されたままであることを示す証拠が存在する。単離され
た天然蛋白質は、蛋白質分解による分解の結果であり、
不完全な遺伝子の翻訳の結果ではない。しかしながら、
プラスミドpFC85の不完全な遺伝子から産生されたムテ
インは、DNAポリメラーゼの分析で完全な長さを有する
配列をコードするDNAから産生されたムテインと同様
に、完全に活性である。ある種のＮ末端が短縮された形
は活性であることが明らかであるので、用いられる遺伝
子構成物またはポリメラーゼの発現も、対応する短縮さ
れた形状のコード配列を含むことができる。

制御配列および対応する宿主原核生物は、最も一般的には、E.コリ（E. coli）の
各種株によって代表される。しかしながら、バシルス
属、例えばバシルス・ズブチリス（Bacilus subtili
s）、各種のシュドモナス（Psuedomonas）またはその他
の菌株のような他の微生物株を用いることもできる。か
かる原核系では、宿主と適合性の種に由来する複製部位
と制御配列を有するプラスミドベクターが用いられる。
例えば、E.コリ（E. coli）は、典型的には、ボリバー
（Bolivar）ら、Gene,1977年、２巻、95頁によるE.コリ
（E. coli）種に由来するプラスミドであるpBR322の誘
導体を用いて形質転換される。pBR322はアンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性の遺伝子を有し、所望のベク
ターを造成する際に保持されまたは破壊される付加的マ
ーカーを提供する。転写開始を促進し、任意にはオペレ
ーターを有し且つリボゾーム結合部位配列を有する本明
細書記載の一般的に用いられる原核制御配列には、β−
ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（la
c）プロモーター系〔チャン（Chang）ら、Nature（1977
年）198巻、1056頁〕、トリプトファン（trp）プロモー
ター系〔ゲーデル（Goeddel）ら、Nucleic Acids Res.
（1980年）８巻、4057頁〕、およびλ由来のP_Lプロモー
ター〔シマタケ（Shimatake）ら、Nature（1981年）292
巻、128頁〕、およびポータブル制御カセットとして有
用なＮ−遺伝子リボゾーム結合部位があり、このポータ
ブル制御カセットは、N_RBS配列の6bp3′内での開裂を可
能にする少なくとも１個の制限部位を有する第三のDNA
配列のNRBS上流に対応する第二のDNA配列に操作可能に
連結したP_Lプロモーターである第一DNA配列を含んで成
る。チャン（Chang）らの欧州特許出願公開第196,864号
明細書（1986年10月８日発行）に記載され、同じ承継人
に承継されたホスファターゼＡ（phoA）系も有用であ
る。しかしながら、原核生物に適合性の如何なる利用可
能なプロモーターも用いることができる。

細菌に加えて、酵母のような真核微生物も宿主として
用いることができる。サッカロミセス・セレビシアエ
（Saccharomyces cerevisiae）の実験室菌株であるパン
酵母が最も多く用いられるが、その他の多くの菌株も一
般的に利用可能である。２ミクロン複製開始点を用いる
ベクターが示されているが〔ブローチ，ジェイ，アール
（Broach,J.R.），Meth.Enz．（1983年）101巻、307
頁〕、酵母の発現に好適な他のプラスミドベクターも知
られている〔例えば、スチンクコンブ（Stinchcomb）
ら、Nature（1979年）282巻、39頁、チェンペ（Tschemp
e）ら、Gene（1980年）10巻、157頁およびクラーク（Cl
arke）ら、Meth.Enz．（1983年）101巻、300頁を参照さ
れたい〕。酵母ベクターのための制御配列には解糖系酵
素の合成のプロモーターも含まれる〔ヘス（Hess）ら、
J.Adv.Enzyme Reg．（1968年）７巻、149頁、ホランド
（Holland）ら、Biotechnology（1978年）17巻、4900
頁〕。

その他の当業界に知られているプロモーターには、３
−ホスフォグリセレート・キナーゼ（ヒッツェマン（Hi
tzeman）ら、J.Biol.Chem.（1980年）255巻、2073頁）
およびその他の解糖系酵素、例えばグリセルアルデヒド
−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナー
ゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフラクト
キナーゼ、グルコース−６−ホスフェート・イソメラー
ゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベート・
キナーゼ、トリオースホスフェート・イソメラーゼ、ホ
スホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼの遺
伝子のプロモーターがある。増殖条件により制御される
追加の利点を有するその他のプロモーターは、アルコー
ルデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホス
ファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素およびマルト
ースおよびガラクトース利用に関する酵素のプロモータ
ーである〔ホランド（Holland）同上〕。

ターミネーター配列は、コード配列の３′末端におい
て望ましいであろう。かかるターミネーターは、酵母由
来の遺伝子におけるコード配列に続く３′非翻訳領域に
見出される。例示されるベクターの多くは、エノラーゼ
遺伝子を含有するプラスミドpeno46〔ホランド（Hollan
d,M.J.）ら、J.Biol.Chem.（1981年）256巻、1385頁〕
から、またはYEp13から得られるLEU2遺伝子〔ブローチ
（Broach,J.）ら、Gene（1978年）８巻、121頁〕から誘
導される制御配列を有するが、酵母適合性プロモータ
ー、複製開始点および他の制御配列を有する如何なるベ
クターも好適である。

勿論、多細胞生物に由来する真核宿主細胞培養物にお
いてポリペプチドをコードする遺伝子を発現させること
も可能である。例えば、Tissue Culture、アカデミック
・プレス（Academic Press）、クルツ（Cruz）とパター
ソン（Patterson）監修（1973年）を参照されたい。有
用な宿主細胞系には、ネズミミエローマN51,VEROおよび
Hela細胞、並びにチャイニーズハムスター卵巣（CHO）
細胞がある。これらの細胞のための発現ベクターは、通
常は、シミアンウイルス40（SV40）からの一般的に用い
られる前期および後期プロモーター（フィールス（Fier
s）ら、Nature（1978年）273巻、113頁）、またはポリ
オーマ、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルスも
しくはトリザルコーマウイルスに由来するようなプロモ
ーター、または免疫グロブリンプロモーターおよびヒー
トショックプロモーターのような哺乳類細胞に適合性の
プロモーターおよび制御配列を有する。BPVをベクター
として用いる哺乳類系におけるDNA発現系は、米国特許
第4,419,446号明細書に開示されている。この系の変形
は、米国特許第4,601,978号明細書に記載されている。
哺乳類細胞系の形質転換の一般的態様は、米国特許第4,
399,216号明細書に記載されている。「エンハンサー」
領域が、最適な発現において重要であると思われるが、
これらの領域は一般的にはプロモーター領域の上流に見
出される配列である。所望であるならば、複製開始点を
ウイルス源から得ることができる。しかしながら、真核
生物でのDNA複製では染色体への組み込みが一般的な機
構である。

植物細胞も宿主として利用可能であり、植物細胞に適
合する制御配列、例えばノパリン・シンターゼ・プロモ
ーターおよびポリアデニル化シグナル配列〔デピッカー
（Depicker,A.）ら、J.Mol. Appl.Gen．（1982年）１
巻、561頁〕が利用できる。

更に、最近では、バクロウイルス・ベクターによって
提供される制御系を利用する昆虫細胞を用いた発現系も
報告されている〔ミラー（Miller,D.W.）ら、Genetic E
ngineering（1986年），セトロウ（Setlow,J.K.）ら監
修、プレナム・パブリッシング（Plenum Publishin
g）、８巻、277〜297頁〕。これらの系はTaqポリメラー
ゼの産生にも有用である。

形質転換用いる宿主細胞に依存して、形質転換はその細胞に適
当な標準的な技術を用いて行なわれる。塩化カルシウム
を用いるカルシウム処理〔コーヘン（Cohen,S.N.），Pr
oc.Natl.Acad.Sci.(USA)（1972年）69巻、2110頁〕が、
原核生物またはその他の実質的な細胞障壁を有する細胞
に用いられる。アグロバクテリウム・チュメファシエン
ス（Agrobacterium tumefaciens）での感染〔シァウ（S
haw,C.H.）ら、Gene（1983年）23巻、315頁〕が、ある
種の植物細胞で用いられる。前記のような細胞壁を持た
ない哺乳類細胞では、グラハム（Graham）とヴァン・デ
ル・エブ（van der Eb）のリン酸カルシウム沈澱法が好
ましい〔Virology（1978年）52巻、546頁〕。酵母への
形質転換は、ヴァン・ゾリンゲン（Van Solingen,P.）
ら（J.Bact.,1977年、130巻、946頁）およびシアオ（Hs
iao,C.L.）ら（Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,1979年、7
6巻、3829頁）の方法によって行なわれる。

λgt11発現ライブラリーの造成所望の蛋白質をコードするDNA、例えばTaqポリメラー
ゼをコードするDNAをバクテリオファージλgt11を用い
て単離する方法は、次の通りである。ライブラリーは、
テルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）DNAを
完全消化しこれをλgt11ファージのEcoRI部位に挿入す
ることによって得られるEcoRI部位を両端に有するAluI
フラグメントから構成され得る〔ヤング（Young）とデ
ービス（Davis），Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1983年、80
巻、1194〜1198頁〕。このバクテリオファージの中のユ
ニークEcoRI部位がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のカル
ボキシ末端に位置しているので、適当なフレームおよび
方向で挿入されたDNAは、ラクトースオペロンプロモー
ター／オペレーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼと
融合した蛋白質として発現される。

次に、抗体プラークハイブリダイゼーション法を用い
てゲノム発現ライブラリーをスクリーニングする。この
方法は「エピトープ選択」と呼ばれ、このファージによ
ってコードされた融合蛋白質配列に対する抗血清を用い
てハイブリッド形成するプラークを同定するものであ
る。例えば、この組換えファージのライブラリーを、8
6,000〜90,000ダルトンのTaqポリメラーゼを認識する抗
体を用いてスクリーニングして、この蛋白質の抗原決定
基をコードするDNAセグメントを有するファージを同定
することができる。

約２×10⁵個の組換えファージを、全ウサギTaqポリメ
ラーゼ抗血清を用いてスクリーニングする。この一次ス
クリーニングでは、陽性シグナルが検出され、これらの
プラークの１種以上が、免疫前血清と反応せず且つ免疫
血清と反応する候補プラークから精製され、幾分詳細に
分析される。組換えファージによって産生される融合蛋
白質を検査するため、宿主Y1089におけるファージの溶
原株を得る。溶原株を誘発し、生成する蛋白質をゲル電
気泳動した後、それぞれの溶原株が他の溶原株には見ら
れない新たな蛋白質を産生するのを観察することがで
き、または重複配列が生じることもある。陽性シグナル
を有するファージを取り出す。ここに記載する例におい
ては１個の陽性プラークを取り出して更に同定を行な
い、低密度で再プレートして組換体を純化し、純化した
クローンをEcoRI制限酵素での消化によるサイズクラス
によって分析する。次に、単離されたDNA挿入配列から
プローブを作り、適当に標識を行い、そしてこれらのプ
ローブをマニアチス（Maniatis）ら、Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual,1982年に記載されている通常の
プラークハイブリダイゼーション又はコロニーハイブリ
ダイゼーション分析法に用いることができる。

標識したプローブを用いて、シャロン（Charon）35バ
クテリオファージ中に構成された第二のゲノムライブラ
リーをプローブした〔ウイルヘルマイン（Wilhelmine,
A.M.）ら、Gene,1983年、26巻、171〜179頁〕。このラ
イブラリーは、テルムス・アクアチクス（Thermus aqu
aticus）ゲノムDNAをSau3A部分消化しそしてサイズ分別
したフラグメント（15〜20kb）をシャロン35ファージの
BamHI部位にクローン化することにより作製された。こ
のプローブを用いて、TaqポリメラーゼをコードするDNA
を含むファージを単離した。CH35:Taq ＃４−２と命名
した生成するファージの一つは、全遺伝子配列を有する
ことが判明した。この遺伝子の部分をコードする部分配
列も単離された。

ベクターの造成所望のコード配列および制御配列を含有する好適なベ
クターの造成は、当業界で周知の標準的な連結および制
限酵素技術を用いる。単離したプラスミド、DNA配列ま
たは合成されたオリゴヌクレオチドを開裂し、ととの
え、そして再連結して所望の形状にする。

部位特異的DNA開裂は、当業界で周知の条件下で好適
な（１種以上の）制限酵素を用いて処理することによっ
て行ない、その詳細はこれらの市販の制限酵素の製造業
者によって記載されている。例えば、ニュー・イングラ
ンド・バイオラブス（New England Biolabs）、製品カ
タログを参照されたい。一般的には、約１μｇのプラス
ミドまたはDNA配列を、約20μｌの緩衝溶液中で１単位
の酵素で開裂し、本明細書の実施例では、典型的には、
過剰量の制限酵素を用いてDNA基質を完全に消化するよ
うにしている。約37℃で約１〜２時間のインキュベーシ
ョン時間が有効であるが、変更を行なうこともできる。
それぞれのインキュベーションの後に、蛋白質をフェノ
ール／クロロホルムで抽出して、次いでエーテル抽出を
行なうことによって除去して、核酸を水性分画からエタ
ノール沈澱によって回収することができる。所望なら
ば、開裂フラグメントのサイズ分離を、標準的技術を用
いるポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気
泳動によって行なうことができる。サイズ分離の一般的
説明については、Methods in Enzymology,1980年、65
巻、499〜560頁に記載されている。

制限開裂したフラグメントを、50mMのトリス、pH7.6,
50mMのNaCl,10mMのMgCl₂,10mMのDTTおよび50〜100μＭ
のdNTPs中で、20〜25℃で約15〜25分間のインキュベー
ション時間を用いて、４種類のデオキシヌクレオチドト
リホスフェート（dNTP）の存在でE.コリ（E.coli）DNA
ポリメラーゼＩ（クレノウ（Klenow））の大フラグメン
トで処理することによって平滑末端にすることができ
る。クレノウフラグメントは５′接着末端をフィルイン
するが、４種のdNTPsが存在していても、突出する３′
単一鎖をチューバック（chews back）する。所望なら
ば、接着末端の性状によって指定される制限内で唯１種
のまたは選択された複数のdNTPsを供給することによっ
て選択的修復を行なうことができる。クレノウで処理し
た後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エ
タノールで沈澱させた。適当な条件下でS1ヌクレアーゼ
を用いて処理すると、単一鎖部分の加水分解が起こる。

合成オリゴヌクレオチドは、マテウチ（Matteucci）
ら（J.Am.Chem.Soc.,1981年、103巻、3185〜3191頁）の
トリエステル法を用いて、または自動合成法を用いて調
製することができる。アニーリングの前のまたは標識の
ための単一鎖のキナージングは、50mMのトリス、pH7.6,
10mMのMgCl₂,5mMのジチオスレイトール、１〜2mMのATP
の存在下で、1nMの基質に対して過剰量の、例えば約10
単位のポリヌクレオチドキナーゼを用いて行なう。この
キナーゼ処理がプローブの標識するためのものであると
きには、ATPは高比活性のγ‐³²Pを有する。

連結は、下記の標準的条件及び温度で15〜30μｌの容
積で行なう。20mM Tris-HCl,（pH7.5）10mM MgCl₂,10mM
DTT,33μg/ml BSA,10mM〜50mMのNaCl、および（「接着
末端」の連結には）40μＭのATP,0.01〜0.02〔ワイス
（Weiss）〕単位のT4 DNAリガーゼ、０℃；または
（「平滑末端」の連結には）1mMのATP,0.3〜0.6〔ワイ
ス（Weiss）〕単位のT4 DNAリガーゼ、14℃。分子内
「粘着末端」連結は、通常は33〜100μg/mlの総DNA濃度
（５〜100nMの総末端濃度）で行なう。分子間平滑末端
連結（通常は10〜30倍の過剰モルのリンカーを用いる）
は、１μＭの総末端濃度で行なう。

「ベクターフラグメント」を用いるベクターの造成で
は、ベクターフラグメントを通常は細菌性アルカリホス
ファターゼ（BAP）で処理して５′ホスフェートを除去
して、ベクターの再連結を防止する。BAP消化は、pH8
で、約150mMのトリス中で、Na⁺およびMg⁺²の存在で、ベ
クター1mg当たり約１単位のBAPを用いて、60℃で約１時
間行なう。核酸フラグメントを回収するため、調製物を
フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱せ
しめる。また、好ましくないフラグメントを追加的制限
酵素消化によって二重消化されたベクターでは、連結は
防止することができる。

DNA配列の改変配列の改変を必要とするcDNAまたはゲノムDNAに由来
するベクターの部分については、部位特異的なプライマ
ー指令変異誘発を用いる。この技術は現在では当業界で
標準的であり、所望の変異を表わす限定されたミスマッ
チを除いて変異誘発されるべき単一鎖ファージDNAに相
補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行な
われる。要約すれば、ファージに相補的な鎖の合成を指
令するプライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用
い、生成する二本鎖DNAをファージ支持性の宿主細菌に
形質転換する。形質転換された細菌の培養液を上層寒天
に塗布しファージを有する単一細胞からプラークを形成
させる。

理論的には、新たなプラークの50％は変異形を単一鎖
として有するファージを含み、50％はもとの配列を有す
る。プラークをニトロセルロースフィルターに移して、
正確にマッチするハイブリダイゼーションを可能にし且
つもとの鎖とのミスマッチがハイブリダイゼーションを
防止するのに十分であるような温度で、キナーゼ処理し
た合成プライマーで「リフト（lifts）」ハイブリダイ
ゼーションを行なう。次に、このプローブとハイブリッ
ド形成するプラークを採取して、培養し、DNAを回収す
る。

造成の証明以下の造成では、プラスミド造成物の正確な連結を、
最初に連結混合物を用いてE.コリ（E. coli）MM294株
または他の適当な宿主を形質転換することによって確か
める。当業界で理解されているように、好結果の形質転
換体を、プラスミド造成の方式に依存してアンピシリン
耐性、テトラサイクリン耐性またはその他の抗生物質耐
性によって選択する。次に、形質転換体からのプラスミ
ドを、クレウエル（Clewell,D.B.）ら、（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,1969年、62巻、1159頁）の方法により、場
合によってはクロラムフェニコール増幅法〔クレウエル
（Clewell,D.B.）,J.Bacteriol.,1972年、110巻、667
頁〕によって調製する。単離したDNAを、制限処理によ
り分析し、そして／又はサンガー（Sanger,F.）ら（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,1977年、74巻、5463頁）のジデオ
キシ法であって更にメッシング（Messing）ら（Nucleic
Acids Res.,1981年、９巻、309頁）によって記載され
ている方法、またはマクサム（Maxam）ら（Methods in
Enzymology,1980年、65巻、499頁）の方法によって配列
決定する。

宿主の例この発明においてクローニング及び発現に用いられる
宿主菌株は、次の通りである。

クローニング及び配列決定、並びにほとんどの細菌性
プロモーターの制御下での造成物の発現には、E.コリ
（E. coli）ゲネチック・ストック・センターGCSG＃61
35から得たE.コリ（E. coli）MM294を宿主として用い
た。P_L N_RBSプロモーターの制御下での発現には、E.コ
リ（E. coli）K12株MC1000λ溶原株、N₇N₅₃c1857SusP
₈₀,ATCC39531を用いることができる。本明細書では、19
87年４月７日にATCC（ATCC 53606）として寄託されてい
るE.コリ（E. coli）DG116を用いる。

M13ファージ組換体のためには、ファージ感染を受け
やすいE.コリ（E. coli）、例えばE.コリK12株DG98を
用いる。DG98株は1984年７月13日にATCC寄託され、寄託
番号39768を有する。

哺乳類での発現はCOS-7,COS-A2,CV-1およびネズミ細
菌で行うことができ、そして昆虫細胞ではスポドプテラ
・フルジペイダ（Spodoptera frugipeida）での発現を
基礎とする。

酵素活性の安定化酵素は、長期間安定にするためには、１種又は複数種
の非イオン性ポリマー性界面活性剤を含む緩衝液中に貯
蔵するのが好ましい。この様な界面活性剤は一般的には
分子量が約100〜250,000の範囲であり、好ましくは約4,
000〜200,000ダルトンであり、pHが約3.5〜約9.5、好ま
しくは約４〜8.5で酵素を安定化するものである。この
様な界面活性剤の例としては、マック・クチェオン（Mc
Cutcheon）のEmulsifiers&Detergents、北アメリカ版
（1983年）エムシー・パブリッシング・カンパニー（MC
Publishing Co.）のマック・クチェオン部門発行、17
5,ロックロード，グレンロック，ニュージャージー（米
国）、の295〜298頁に記載されているものがあり、その
詳細については上記文献を参照されたい。好ましくは、
界面活性剤はエトキシル化した脂肪族アルコールエーテ
ルおよびラウリルエーテル、エトキシル化したアルキル
フェノール、オクチルフェノキシポリエトキシエタノー
ル化合物、改質オキシエチル化したおよび／またはオキ
シプロピル化した直鎖状アルコール、ポリエチレングリ
コールモノオレエート化合物、ポリソルベート化合物お
よびフェノール性脂肪族アルコールエーテルからなる群
から選択される。更に詳細には、好ましくは、ポリオキ
シエチル化（20）ソルビタンモノラウレートであるツイ
ーン（Tween）20〔ICI・アメリカス・インコーポレーテ
ド（ICI Americas Inc.），ウイルミントン,DE〕および
エトキシル化アルキルフェノール（ノニル）であるイコ
ノール（Iconol）（登録商標）NP-40（バスフ（BASF）
イアンドット・コーポレーション，パーシパニー、ニュ
ージャージー）である。

以下の実施例は、単に例示のために提供するものであ
り、発明の範囲および特許請求の範囲を限定することを
意図するものではない。これらの実施例において、総て
のパーセンテージは、特に断らないかぎり、固体の場合
には重量％、液体の場合には容積％であり、総ての温度
は摂氏で表わしている。

参考例1.テルムス・アクアチクス（Thermus aquaticu
s）からのポリメラーゼの精製アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション,1
2301パークラウンドライブ，ロックビル,MDからATCCNo.
25,104としてなんら制御なく入手できるテルムス・アク
アチクス（Thermus aquaticus）YT1株をフラスコ中で、
下記の培地中で増殖せしめた。

クエン酸ナトリウム 1mM リン酸カリウムpH7.9 5mM 塩化アンモニウム 10mM 硫酸マグネシウム 0.2mM 塩化カルシウム 0.1mM 塩化ナトリウム 1g/l 酵母エキス 1g/l トリプトン 1g/l グルコース 2g/l 硫酸第一鉄 0.01mM （オートクレーブ前にpHを8.0に調整）上記培地中で70℃にて一夜培養したフラスコ種母を10
l発酵槽に接種した。種母フラスコからの合計600mlの種
母を10lの同じ培地に接種した。pHを水酸化アンモニウ
ムにより8.0に調節し、溶存酸素を40％に調節し、温度
を70℃に調節し、そして攪拌速度を400rpmとした。

細胞の増殖の後、最初の５段階についてはKaledin
等、前掲、の方法（わずかに変更を加えて）を用い、そ
して第６段階では異る方法を用いて精製を行った。６段
階すべてを４℃にて行った。カラムでの分画速度は0.5
カラム／時とし、溶出中のグラジエントの容量は10カラ
ム容量とした。これに代る好ましい方法を例６に後記す
る。

要約すれば、上記培養のT.アクアチクス（T.aquaticu
s）細胞を、９時間の培養の後、後期対数期1.4g乾燥重
量/lの細胞濃度において、遠心分離により集菌した。20
gの細胞を、50mM Tris-HCl（pH7.5）及び0.1mM EDTAを
含む緩衝液80ml中に懸濁した。細胞を溶解し、そして溶
解物を４℃のローター中で35,000rpmにて２時間遠心し
た。上清を集め（画分Ａ）、そして硫酸アンモニウムの
45〜75％飽和の間で沈澱する蛋白質画分を集め、0.2Mリ
ン酸カリウム（pH6.5）、10mM2−メルカプトエタノール
及び５％グリセリンを含有する緩衝液中に溶解し、そし
て最後に同じ緩衝液に対して透析して画分Ｂを得た。

画分Ｂを、上記の緩衝液で平衡化されたDEAE−セルロ
ースの2.2×30cmカラムに適用した。次に、このカラム
を同じ緩衝液で洗浄し、そして蛋白質を含有する画分
（280nmにおける吸収により決定する）を集めた。一緒
にした蛋白質画分を、0.01Mリン酸カリウム（pH7.5）、
10mM 2−メルカプトエタノール及び５％グリセリンを含
有する第二緩衝液に対して透析して画分Ｃを得た。

画分Ｃを、第二緩衝液で平衡化されたヒドロキシアパ
タイトの2.6×21cmカラムに適用した。次に、このカラ
ムを洗浄し、そして10mM 2−メルカプトエタノール及び
５％グリセリンを含有する0.01〜0.5Mリン酸カリウム
（pH7.5）緩衝液の直線グラジエントにより酵素を溶出
した。DNAポリメラーゼ活性を含有する画分（90〜180mM
リン酸カリウム）を集め、アミコン攪拌セル及びYM10膜
を用いて４倍に濃縮し、そして第二緩衝液に対して透析
して画分Ｄを得た。

画分Ｄを、第二緩衝液で平衡化したDEAE−セルロース
の1.6×28cmカラムに適用した。このカラムを洗浄し、
そして第二緩衝液中0.01〜0.5Mリン酸カリウムの直線グ
ラジエントによりDNAポリメラーゼを溶出した。画分を
エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼの汚染につ
いて測定した。これは、過剰のDNAポリメラーゼと共に
インキュベートした後のファージλDNA又はスーパーコ
イルプラスミドDNAの分子量の変化を電気泳動により検
出することにより（エンドヌクレアーゼについて）、そ
してDNAを幾つかのフラグメントに開裂せしめる制限酵
素による処理の後に（エキソヌクレアーゼについて）行
った。最少のヌクレアーゼ汚染を有するDNAポリメラー
ゼ画分（65〜95mMリン酸カリウム）のみをプールした。
このプールにオートクレーブしたゼラチンを250μg/ml
の量で添加し、そして第二緩衝液に対して透析を行って
画分Ｅを得た。

画分Ｅをホスホグルコースカラムに適用し、そして20
mMリン酸カリウム（pH7.5）中0.01〜0.4MKClのグラジエ
ント100mlにより溶出した。画分を上記のようにしてエ
ンドヌクレアーゼ／エキソヌクレアーゼの汚染につい
て、そしてさらにポリメラーゼ活性について（Kaledin
等の方法により）測定した。プールした画分を第二緩衝
液に対して透析し、次に50％グリセリン及び第二緩衝液
に対する透析により濃縮した。

ポリメラーゼの分子量をSDS-PAGEにより決定した。マ
ーカー蛋白質はホスホリダーゼＢ（92,000）、ウシ血清
アルブミン（66,200）、オバルブミン（45,000）、カー
ボニックアンヒドラーゼ（31,000）、大豆トリプシンイ
ンヒビター（21,500）、及びリゾチーム（14,400）であ
った。

予備的データは、文献（例えばKaledin等）に報告さ
れている62,000〜63,000ダルトンではなく、約86,000〜
90,000ダルトンであった。

このポリメラーゼを、25mM Tris-HCl（pH6.4及びpH8.
0）,0.1M KCl,10mM MgCl₂,1mM ２−メルカプトエタノー
ル、10nmoleずつのdGTP,dATP及びTTP、及び0.5μCi
（³H）dCTP,8μｇの“活性化されたウシ”胸腺DNA並び
に0.5-5ユニットのポリメラーゼを含有する混合物50μ
ｌ中でインキュベートした。“活性化された"DNAは、DN
Aの５％が酸−溶解性画分に移るまでDNase Iにより消化
して部分加水分解した後のDNAの天然調製物である。こ
の反応は70℃にて30分間行い、そして0.125M EDTA-Na₂
を含有するリン酸ナトリウムの飽和水溶液約50μｌの添
加により停止せしめた。サンプルをKaledin等、前掲に
記載されているようにして処理しそして活性を測定し
た。

この結果は、ポリメラーゼはpH6.4においてpH8.0にお
ける活性の半分より活性であることを示した。これに対
して、Kaledin等は、酸素はpH約7.0において、pH8.3に
おける活性の８％を有することを見出した。従って、本
発明の熱安定酵素のpHプロフィールはKaledin等の酵素
のそれよりも広い。

最後に、DNAポリメラーゼ測定反応混合物から１種類
のみ又は複数種類のヌクレオチドトリホスフェートを除
去した場合、本発明の酵素を用いて活性がほとんど観察
されず、活性は予想値と一致しており、そして酵素は高
い忠実性を示した。これに対して、Kaledin等、前掲、
を用いて観察された活性は予想値と一致しておらず、そ
してヌクレオチドトリホスフェートの間違った導入が示
唆される。

参考例2.遺伝子の検索 A.Taqポリメラーゼ遺伝子のためのDNA配列プローブの同
定 Taqpo1遺伝子のための特異的DNA配列プローブを、λg
t11発現ライブラリーの免疫的スクリーニングにより得
た。T.アクアチクスのDNAをAlu Iにより完全消化し、Ec
oR I 12−マーリンカー（CCGGAATTCCGG、ニューイング
ランドバイオラブス）と連結し、EcoR Iで消化し、その
EcoR I −消化され脱リン酸化されたλgt11 DNA（プロ
ゲマ・バイオテク）と連結した。連結されたDNAをパッ
ケージし（ジガパックプラス、ストラテジーン）、そし
てE.コリK-12株Y1090（R.Youngより入手）にトランスフ
ェクトした。

２×10⁵プラークの最初のライブラリーを、精製され
たTaqポリメラーゼ（参考例１及び参考例４を参照のこ
と）に対するラビットポリクローナル抗血清の1:2000稀
釈物を用いてスクリーニングした〔Young,R.A.及びR.W.
Davis（1983）Science，222:778-782〕。候補プラーク
を限界稀釈で再プレートし、そして均一になるまで（約
３サイクル）再スクリーニングした。免疫前血清と反応
せずそして免疫血清と反応する候補プラークからファー
ジを精製した。

候補ファージを用いてE.コリY-12株Y1089（R.Young）
を溶原化した。溶原菌を、Taqポリメラーゼ抗血清と反
応するIPTG誘導性融合蛋白質（β−ガラクトシダーゼよ
り大）の産生についてスクリーニングした。固相のサイ
ズ分画された融合蛋白質を用いて、全ポリクローナル抗
体からエピトープ特異的抗体をアフィニティー精製した
〔Goldstein,L.S.B.等（1986）J.Cell.Biol. 102:2076
-2087〕。

今度は、“つり上げられた”エピトープ−選択された
抗体をウェスタン分析において用いて、Taqポリメラー
ゼに特異的なDNA配列をコードしているλgt11ファージ
候補を同定した。λgt:1と称する１つのλgt11ファージ
候補が、全ラビットポリクローナルTaqポリメラーゼ抗
血清からの精製されたTaqポリメラーゼ及びTaqポリメラ
ーゼを含有する粗抽出画分の両者と特異的に反応する抗
体を、特異的に選択した。このファージλgt:1を使用し
てさらに検討した。

テルムス・アクアチクスDNAの約115bpのEcoR I−適合
Alu I断片をラベルし（Maniatis等、前掲）て、Taqポリ
メラーゼ特異的プローブを形成した。このプローブをサ
ザン分析において、及びT.アクアチクスDNAランダムゲ
ノムライブラリーをスクリーニングするために用いた。

B.テルムス・アクアチクス−ランダムゲノムライブラリ
ーの造成及びスクリーニング λファージシャロン35（Wilhelmine,A.M.等、前掲）
をその接着末端を介してアニールしそして連結し、BamH
Iにより完全消化し、そしてアニールされたアームをス
タファー（stuffer）フラグメントから、酢酸カルシウ
ム密度勾配超遠心（Maniatis等、前掲）により精製し
た。T.アクアチクスのDNAをSau3Aで部分分解し、そして
15〜20kbサイズの画分をシュークロース密度勾配超遠心
により精製した。標的DNAフラグメント及びベクターDNA
フラグメントを1:1のモル比で連結することによりラン
ダムゲノムライブラリーを造成した。DNAをパッケージ
し、そしてE.コリK-12株LE392又はK802にトランスフェ
クトした。99％以上の組換体を含有する20,000以上の最
初のファージのライブラリーをE.コリK-12株LE392上で
増幅した。

λgt11:1の放射性ラベルされたEcoR I挿入部によりCH
35 Taqゲノムファージライブラリーをスクリーニングし
た（マニアチス等、前掲）。特異的にハイブリダイズす
る候補ファージプラークを精製し、そしてさらに分析し
た。CH35::4−２と称する１つのファージが、HindIIIに
よる消化の後に４個以上のT.アクアチクスDNAフラグメ
ントを放出した（約8.0,4.5,0.8,0.58kb）。

４種類のHindIII T.アクアチクスDNAフラグメント
を、HindIIIで消化したプラスミドBSM13⁺（3.2kb、ベク
タークローニングシステムス、サンジエゴ）に連結し、
そしてそれぞれE.コリK-12株DG98を形質転換してクロー
ン化した。

CH35::4−２からの約8.0kbのHindIII DNAフラグメン
トをプラスミドpFC82（11.2kb）中に単離し、他方CH3
5::4−２からの4.5kb HindIII DNAフラグメントをプラ
スミドpFC83（7.7kb）中に単離した。

pFC82を含有するE.コリDG98株は熱安定性高温DNAポリ
メラーゼ活性を含有することが示された（第１表）。さ
らに、この細胞は、免疫的にTaq DNAポリメラーゼと関
連する新たな約60kdの分子量のポリペプチドを合成し
た。

8.0kb HindIII DNAフラグメントのTaqポリメラーゼコ
ード領域をさらに処理し、8.0kb HindIIIフラグメント
の2.8kbのHindIII-Asp718部分をlas−プロモーターの近
位に位置付けた。この領域をサブクローニングしてプラ
スミドpFC85（6.0kb）を得た。IPTGと共にインキュベー
トした後、プラスミドpFC85を含有するE.コリDG98細胞
は、もとの親クローン（pFC82/DG98）に比べて100倍ま
での熱安定性Taqポリメラーゼ関連活性を合成する（第
１表）。pFC85を含有する細胞は有意量の熱安定DNAポリ
メラーゼ活性を合成するが、Taq pol DNA配列の一部分
のみが翻訳され、約60kdのTaqポリメラーゼ関連ポリペ
プチドの蓄積が起こる。

参考例3. この発明の熱安定酵素の遺伝子は種々の細菌発現ベク
ター、例えばDG141（ATCC 39588）及びpP_LN_RBSATG中で
発現せしめることができる。これらの宿主ベクターの両
者はpBR322の誘導体であって、トリプトファン・プロモ
ーターオペレーター及びATG開始コドンと作用可能に連
結されたリボゾーム結合部位（DG141）、又はλP_Lプロ
モーターを含む配列及びATG開始コドンに作用可能に連
結された遺伝子Ｎ結合部位（pP_LN_RBSATG）を有する。
これらの宿主ベクターのいずれか一方をSacＩにより制
限酵素処理し、そしてKlenow又はS1ヌクレアーゼにより
平滑末端化して、Taqポリメラーゼ遺伝子を後で挿入す
るための便利な部位を作ることができる。

次の様にして、プラスミドpFC83及びpFC85にサブクロ
ーニングされたDNA挿入フラグメントから完全な長さのT
aqポリメラーゼ遺伝子を造成した。ベクターBSM13⁺（ベ
クタークローニングシステムス，サンジエゴ,CAから市
販されている）をユニークHindIII部位において消化
し、Klenow及びdNTPにより修復し、そしてT4 DNAリガー
ゼを用いてBglIIオクタヌクレオチドリンカー５′−CAG
ATCTG−３′に連結し、そしてE.コリDG98株に形質転換
した。Amp^R lacＺ_α ^＋形質転換体からプラスミドを単離
した。クローンの１つをBglII及びAsp718により消化
し、そして大ベクターフラグメントをゲル電気泳動によ
り精製した。

次に、プラスミドpFC83をBglII及びHindIIIで消化
し、そして約750bpのフラグメントを単離した。プラス
ミドpFC85をHindIII及びAsp718で消化し、そして約2.8k
bのフラグメントを単離し、そして３片連結によりpFC83
からの約750bpのBglII-HindIIIフラグメント及びBSM13⁺
のBglII-Asp718ベクターフラグメントと連結した。この
連結混合物を用いてE.コリDG98株（1984年７月13日に寄
託のATCCNo.39,768）を形質転換し、これからAmp^Rコロ
ニーを選択し、そして約6.75kbのプラスミド（pLSG1）
を単離した。pLSG1を含有するイソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトシド（IPTG）により誘導されたDG98細胞
は、T.アクアチクスから単離された天然酵素と区別でき
ないサイズのTaq DNAポリメラーゼを合成した。次に、
プラスミドpLSG1を用いて、ベクタークローニングシス
テムスにより推奨される方法に従って単鎖DNA鋳型を形
成することができる。

次に、オリゴヌクレオチド−指令変異誘発〔Zoller及
びSmith,Nuc.Acids Res.（1982）10:6487-6500〕を用い
てATG開始コドンの部分としてSph I制限部位を導入する
ことができる（Taqポリメラーゼ遺伝子のコード配列中
の内部HindIII部位の上流に）。同様にして、遺伝子の
カルボキシ末端の後（Asp718部位から約0.7kb上流）にB
glII部位を導入して発現ベクターへのTaqポリメラーゼ
遺伝子のサブクローニングを容易にすることができる。
部位特定変異誘導を終った後、遺伝子をBSM13⁺ベクター
から約3.2kbのSph I-BstE II制限フラグメント上に単離
し、Klenowフラグメント及び４種類すべてのdNTPにより
処理し、そしてT4 DNAリガーゼを用いて（平滑末端条
件）、あらかじめSac Iで消化し、Klenow及びdNTPによ
り修復しそしてウシ腸ホスファターゼで処理して脱リン
酸化平滑末端を形成しておいた前記の発現ベクターに挿
入することができる。この連結混合物を用いてE.コリDG
116を形質転換し、そして得られる形質転換体をTaqポリ
メラーゼの産生についてスクリーニングする。酵素の発
現は、ウェスタンイムノブロット分析及び活性分析によ
り確認することができる。

プラスミドpFC85の約2.8kbのHindIII-Asp718フラグメ
ント中に含有されるTaqポリメラーゼ遺伝子のさらに大
きな部分を、例えばプラスミドpP_LN_RBSATGを用いて、
Taq po1遺伝子をコードするアミノ−末端HindIII制限部
位をATG開始コドンに連結することにより、発現せしめ
ることができる。この融合体の発現生成物は約66,000〜
68,000ダルトンの端が切り取られたポリメラーゼをもた
らす。

この特定の造成は、プラスミドpFC85をHindIIIで消化
し、そしてdATP,dGTP及びdCTPの存在下でKlenowフラグ
メントで処理することにより行うことができる。生じた
フラグメントをS1ヌクレアーゼでさらに処理することに
より単鎖延長部を除去し、そして生じたDNAをAsp718で
消化し、そして４種類すべてのdNTPの存在下でKlenowフ
ラグメントにより処理する。回収された断片を、T4 DNA
リガーゼを用いて、あらかじめSac Iにより消化しそし
てdGTPの存在下でKlenowフラグメントで処理してATG平
滑末端を形成しておいた脱リン酸化プラスミドpP_LN
_RBSATGに連結することができる。次に、この連結混合
物を用いてE.コリDG116を形質転換し、そして形質転換
体をTaqポリメラーゼの産生についてスクリーニングす
る。やはり、ウェスタンイムノブロット分析及び活性分
析により発現を確認することができる。

参考例4.精製熱安定性ポリメラーゼは、前に記載した例に従って、
テルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）の培養
物から直接精製する方法に粗抽出物の調製において必要
なわずかな変更を加えて、組換生産された酵素を含有す
る細菌培養物から精製することができる。

遠心分離により集菌した後、60gの細胞を50mM Tris-H
Cl（pH8.1）及び1mM EDTAを含有する緩衝液75ml中に懸
濁した。細胞をフレンチプレス中で14,000〜16,000PSI
にて溶菌し、この後４容積（300ml）の追加のTris-EDTA
を加えた。緩衝液Ａ（β−メルカプトエタノールを5mM
に、そしてNP-40及びトウィーン20をそれぞれ0.5v/v％
に）を添加し、そしてこの溶液を冷却しながら十分に音
波処理した。得られる均質懸濁液を緩衝液Ａによりさら
に稀釈して最後容量が出発細胞重量の7.5〜８倍となる
ようにした。これを画分Ｉと称する。

画分Ｉ及び上清画分中のポリメラーゼ活性を、0.025M
TAPS-HCl（pH9.2,20℃）,0.002M MgCl₂,0.05M KCl,1mM
2−メルカプトエタノール、0.2mMずつのdGTP,dATP,TT
P,0.1mM dCTP〔α−³²P,0.05Ci/mM〕,12.5μｇ“活性化
された”サケ精子DNA及び0.01〜0.2ユニットのポリメラ
ーゼ（10mM Tris-HCl,pH8,50mM KCl,1mg/mlのオートク
レーブされたゼラチン、0.5％NP-40,0.5％トウィーン20
及び1mM 2−メルカプトエタノール中に稀釈）を含んで
成る50μｌの混合物中で測定した。１ユニットは30分間
中10nMの生成物に相当する。“活性化された"DNAは、DN
Aの５％が酸可溶性画分に変るまでDNase Iにより部分加
水分解された後のDNAの天然調製物である。反応を74℃
にて10分間行い、そして次に40μｌを2mM EDTA中50μg/
mlのキャリヤーDNA溶液1.0ml（０℃）中に移した。同容
量（1.0ml）の20％TCA及び２％ピロリン酸ナトリウムを
加えた。０℃にて15〜20分間の後、サンプルをワットマ
ンGF/Cディスクを通して濾過し、そして冷５％TCA-1％
ピロリン酸塩により十分に洗浄し、次に冷95％エタノー
ルで洗浄し、そして乾燥し、計数した。

画分Ｉを、ベックマンTI45ローター中で35,000rpmに
て２時間、２℃にて遠心し、そして集めた上清を画分II
とした。

活性の90〜95％を沈澱せしめるのに必要なポリミン
（Polymin）Ｐの最少量（この量は一般に最終容量の0.2
5〜0.3％であることが見出された）を決定した後、ポリ
ミンＰ（BPL,ガイセルブルグ,MD）（10v/v％,pH7.5に調
整しそしてオートクレーブしたもの）によりTaqポリメ
ラーゼ活性を沈澱せしめた。

０℃にて15分間にわたり攪拌しながら、適当なレベル
のポリミンＰを画分IIに徐々に添加した。この溶液を０
℃にてベックマンJA14ローター中で20分間にわたり13,0
00rpmにて遠心した。上清の活性を測定し、そしてペレ
ットを1/5容量の0.5×緩衝液Ａ（水で1:2に稀釈したも
の）に再懸濁した。この懸濁液を再遠心分離し、そして
ペレットを1/4容量の緩衝液Ａ（0.4M KClを含有）に再
懸濁した。この懸濁液を十分にホモジナイズし、そして
４℃に一夜置いた。このホモジネートを前記のように遠
心し、そして集めた上清を画分IIIと命名した。

蛋白質画分を硫酸アンモニウムの75％飽和での“沈
澱”により集め、遠心分離し（27,000rpm,SW27ロータ
ー、30分間）そして浮上した薄膜を50mM Tris-HCl（pH
8）,1mM EDTA中に再懸濁した。これらの段階を反復し、
そして蛋白質懸濁液を80mM KClを含有するP-cell緩衝液
〔20mM KPO₄,pH7.5,0.5mM EDTA,5mM β−メルカプトエ
タノール、5w/v％グリセロール、0.5v/v％NP-40及びト
ウィーン20〕により十分に透析した。

透析物を遠心ビンに移し、これに、80mM KClを含有す
るP-cell緩衝液ですすがれたサックから回収されたすべ
ての蛋白質を加えた。遠心を20,000×ｇにて行い、そし
て時間は15分間に短縮した。上清を貯蔵し、そして残っ
たペレットをP-cell緩衝液及び80mM KClにより洗浄・抽
出し、そして再遠心した。次に上清を一緒にして画分IV
と命名した。

画分IVを、80mM KClを含有するP-cell緩衝液で平衡化
したホスホセルロースの2.2×22cmのカラムに適用し
た。このカラムを同じ緩衝液で洗浄し（カラムの2.5〜
３倍容量）、そしてP-cell緩衝液中80〜400mM KClの直
線グラジエントを用いて蛋白質を溶出した。DNAポリメ
ラーゼ活性を含有する画分（約0.18〜0.20M KCl）をプ
ールし、そしてアミコン攪拌セル及びYM30膜上で３〜４
倍濃縮した。このセルを、KClを含有しないP-cell緩衝
液ですすぎ、そして画分濃縮物（0.15M KCl最終容量調
整）に加えて画分Ｖとした。

画分Ｖを、P-cell緩衝液及び0.15M KClで平衡化した
ヘパリン・セファロースCL-6Bカラム（ファルマシア）5
mlに適用した。カラムを0.15M KCl緩衝液（３〜４カラ
ム容量）により洗浄し、そしてP-cell緩衝液中0.15〜0.
65M KClの直線グラジエントにより蛋白質を溶出した。S
DS-PAGE分析のためにゼラチンを含まない稀釈剤への1:1
0稀釈を行い、そして酵素の測定に使用するため1mg/ml
のゼラチンを含有する稀釈剤への引続いての1:20稀釈を
行った。活性画分（約0.3MKClで溶出）を、スーパーコ
イルDNA鋳型上で特異的及び非特異的エンドヌクレアー
ゼ／トポイソメラーゼについて、過剰のDNAポリメラー
ゼと共にインキュベートした後のスーパーコイルプラス
ミドDNAの分子量の変化を電気泳動により検出すること
によって測定した。少量の線状DNAフラグメントとのイ
ンキュベーションの後エキソヌクレアーゼの汚染が検出
された。ピーク画分中、約88kd蛋白質が主たるバンドで
あることが見出された。画分VIと称する主要画分は、こ
のプールを約３〜５ポリメラーゼユニット/600ng DNAで
55℃にて30分間測定した場合、最少の検出可能なエンド
ヌクレアーゼ活性を伴って最高のポリメラーゼ活性を有
していた。

画分VIを、10mM KPO₄（pH7.5）,5mM β−メルカプト
エタノール、５％グリセロール、0.2％NP-40及び0.2％
トウィーン20（HA緩衝液）に対して透析した。この透析
されたサンプルを、ヒドロキシアパタイトの3mlのカラ
ムに適用し、そしてHA緩衝液中10〜250mM KPO₄（pH7.
5）の直線グラジエントにより酵素を溶出した。ポリメ
ラーゼ活性は75mM KPO₄において溶出し始め、100mM KPO
₄においてピークを示した。活性ピーク画分を1:100〜1:
300稀釈で測定した。前のクロマトグラフィー段階にお
けるように、SDS-PAGE分析のため、ゼラチンを含まない
稀釈剤中1:10の稀釈物を調製した。５ポリメラーゼユニ
ットで55℃において有意なエンドヌクレアーゼ又は二本
鎖エキソヌクレアーゼ活性を有しない画分をプールし、
そして画分VIIと命名した。

画分VIIを、25mM酢酸ナトリウム（pH5.2）、５％グリ
セロール、5mM β−メルカプトエタノール、0.1mM EDT
A,0.1％NP-40及び0.1％トウィーン20の溶液に対して透
析し、室温においてpH5に調整した。透析されたサンプ
ルを、あらかじめ平衡化した2mlのDEAE-Tris-Acryl-M
（LKB）カラムに適用し、そして次に同じ緩衝液で洗浄
した。カラムに付着しなかったポリメラーゼ活性を含有
する画分をプールし、そして同じ緩衝液中50mM NaClに
調整し、画分VIIIを得た。

画分VIIIを、同じ緩衝液（25mM酢酸ナトリウム、50mM
NaCl,5％グリセロール、0.1mM EDTA,0.1％NP-40及び0.
1％トウィーン20）で平衡化された2mlのCM-Tris-Acryl-
M（LKB）カラムに適用した。このカラムを、４〜５カラ
ム容量の同じ緩衝液で洗浄し、そして酵素を酢酸ナトリ
ウム緩衝液中50〜400mM NaClの直線グラジエントにより
溶出した。ポリメラーゼ活性のピークは約0.15〜0.20M
NaClにおいて溶出された。ポリメラーゼ活性を、SDS-PA
GE分析のためにゼラチンを含有しない稀釈剤中にまず1:
10で稀釈し、1:300〜1:500稀釈において測定した。74℃
にてDNAポリメラーゼアッセイ塩（25mM TAPS-HCl,pH9.
4,2.0mM MgCl₂及び50mM KCl）を用いて特異的及び非特
異的エンドヌクレアーゼ／トポイソメラーゼについてス
ーパーコイルDNA鋳型に対する活性ピークにわたる測定
を行い、さらにM13ssDNA及びpBR322フラグメントに対す
るヌクレアーゼの測定も行った。検出可能なヌクレアー
ゼを含有しない活性画分をプールし、そして銀染色SDS-
PAGEミニゲル上を泳動せしめた。この結果は、約250,00
0ユニット/mgの比活性を有する約88kdの単一バンドを示
す。

実施例1. 参考例４に記載したようにして精製されたTaqポリメ
ラーゼは、Taqエンドヌクレアーゼ活性及びTaqエキソヌ
クレアーゼ活性により汚染されていないことが見出され
た。さらに、Taqポリメラーゼは好ましくは、使用され
る各非イオン性洗剤約0.1〜約0.5v/v％を含有する貯蔵
緩衝液中に貯蔵される。さらに好ましくは、貯蔵緩衝液
は50v/v％グリセロール、100mM KCl,20mM Tris-HCl（pH
8.0）,0.1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1mMジチ
オスレイトール、0.5v/v％NP-40,0.5v/v％トウィーン20
及び20μg/mlゼラチンからなり、そして好ましくは−20
℃で貯蔵される。

実施例2. 参考例１に記載したようにして精製したTaqポリメラ
ーゼを先行する例において記載したようにして貯蔵のた
めに製剤化した。但し、非イオン性ポリマー洗剤を使用
しなかった。その例において記載したようにして活性を
測定した場合、この酵素貯蔵混合物は不活性であること
が見出された。貯蔵緩衝液にNP-20及びトウィーン20を
添加した場合、十分な酵素活性が保存されており、酵素
製剤の安定のために非イオン性洗剤が必要であることが
示された。

下記のバクテリオファージ及び細菌株がシタス・マス
ター・カルチュア・コレクション（Cetus Master Cultu
re Collection）（CMCC）、米国カリホルニア，エメリ
ービル,1400,53ストリート、及びアメリカン・タイプ・
カルチュア・コレクション（ATCC），米国マリーラン
ド，ロックビル,12301パークラウンドライブ、に寄託さ
れた。これらの寄託は、特許手続のための微生物の寄託
の国際的承認についてのブタペスト条約及びそれに基く
規則（ブタペスト条約）の規定のもとに行われた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドBSM13⁺中にサブクローニングされ
た約4.5kbのHindIII T.アクアチクスDNA挿入部を含有す
るプラスミドpFc83の制限地図である。第２図は、プラスミドBSM13⁺中にサブクローニングされ
た約2.8kbのHindIII -Asp718 T.アクアチクスDNA挿入部
を含有するプラスミドpFC85の制限地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き微生物の受託番号ＡＴＣＣ４０３３６微生物の受託番号ＡＴＣＣ６７４２２微生物の受託番号ＡＴＣＣ６７４２１ (72)発明者グレンホーンアメリカ合衆国，カリフォルニア 94608，エミリービル，コモドアードライブ７ (72)発明者デビッドハローゲルファントアメリカ合衆国，カリフォルニア 94611，オークランド，ケルトンドライブ 6208 (72)発明者ランダルケイヒサイキアメリカ合衆国，カリフォルニア 94805，リッチモンド，サーティナインス (72)発明者フランシスクックローヤーアメリカ合衆国，カリフォルニア 94611，オークランド，サロニドライブ 6641 (72)発明者スザンネネトフェルアメリカ合衆国，カリフォルニア 94530，エルセリット，エルムコート 1008 (56)参考文献特開昭51−104087（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−224499（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−160884（ＪＰ，Ａ) ＢＩＯＣＨＭＩＳＴＲＹ，14（４) （1975）Ｐ．789−795

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】１種又は複数種の非イオン性界面活性剤を
含有する緩衝液中に熱安定性DNAポリメラーゼを含んで
成る安定な酵素組成物。
【請求項２】前記非イオン性界面活性剤が100〜250,000
ダルトンの範囲の分子量を有するものである、請求項１
に記載の組成物。
【請求項３】前記非イオン性界面活性剤が4,000〜200,0
00ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項２に記載の
組成物。
【請求項４】各界面活性剤が全組成物に対して0.1％〜
0.5％（体積／体積）の濃度で存在する、請求項１に記
載の組成物。
【請求項５】前記界面活性剤がポリオキシエチル化ソル
ビタンモノラウレート、エトキシル化ノニルフェノール
エトキシル化脂肪アルコールエーテル及びラウリルエー
テル、エトキシル化アルキルフェノール、オクチルフェ
ノキシポリエトキシエタノール化合物、修飾オキシエチ
ル化及び／又はオキシプロピル化直鎖アルコール、ポリ
エチレングリコールモノオレエート化合物、ポリソルベ
ート化合物並びにフェノール性脂肪アルコールエーテ
ル、並びにこれらの組合せ、から成る群から選択された
ものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】前記界面活性剤がポリオキシエチル化ソル
ビタンモノラウレート、エトキシル化ノニルフェノー
ル、又はこれらの組合せである、請求項５に記載の組成
物。
【請求項７】前記緩衝液が、グリセロール、Tris-HCl
（pH8.0）、エチレンジアミン四酢酸、ジチオスレイト
ール、ポリオキシエチル化ソルビタンモノラウレート、
エトキシル化ノニルフェノール、及びゼラチンを含んで
成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】前記緩衝液が50％（体積／体積）グリセロ
ール、20mM Tris-HCl（pH8.0）、0.1Mエチレンジアミン
四酢酸、1mMジチオスレイトール、0.5％（体積／体積）
ポリオキシエチル化ソルビタンモノラウレート、0.5％
（体積／体積）エトキシル化ノニルフェノール、及び20
0μg/mlゼラチンを含んで成る、請求項７に記載の組成
物。
【請求項９】前記緩衝液がpH3.7〜9.5である、請求項１
に記載の組成物。
【請求項１０】前記緩衝液がpH4.0〜8.5である、請求項
９に記載の組成物。
【請求項１１】界面活性剤が0.1〜1.0％の濃度で存在す
る、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】前記DNAポリメラーゼが、テルムス（The
rmus）属の種から由来するものである、請求項１に記載
の組成物。
【請求項１３】前記の種が、テルムス・フラブス（Ther
mus flavus）、テルムス・レベール（Thermus rube
r）、テルムス・サーモフィルス（Thermus thermophil
us）、テルムス・アクアチクス（Thermus aquaticu
s）、テルムス・ラクテウス（Thermus lacteus）及び
テルムス・ルベンス（Thermus rubens）から成る群か
ら選択されたものである、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】前記の種がテルムス・アクアチクス（Th
ermus aquaticus）である、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】前記の種がテルムス・フラブス（Thermu
s flavus）である請求項13に記載の組成物。
【請求項１６】前記の種がテルムス・サーモフィルス
（Thermus thermophilus）である、請求項13に記載の
組成物。