SU1695827A3 - Способ получени полипептида со свойствами проурокиназы и штамм бактерий ЕSснеRIсна coLI - продуцент полипептида со свойствами проурокиназы (варианты) - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано при создании тромболитических средств. Целью изобретени   вл етс  повышение стабильности целевого продукта„ Согласно изобретению генно-инженерными методами конструируют рекомбинантные плазмидные ДИК pMUPIpm, pMUTULpm2, ptrpUK2, кодирующие синтез проуроки-, назы, трансформируют ими гатаммы бактерий Escherichia coli . После культивировани  штаммов выдел ют полипеп- тид, обладающий свойствами проуроки- назы, с аминокислотной последовательностью Met-Ser X35-Y1s7,ivi,e Ketu Ser - аминокислоты метионин и серии, Х-глибо глутамин, либо треонин, -«фенилаланин. 2 табл. сл с

Description

Изобретение относитс  к биотехно- логии и может быть использовано при создании тромболитических средств.

Целью изобретени   вл етс  повышение стабильности полипептида.

Согласно изобретению предлагаетс  способ получени  стабилизированного человеческо-проурокиназо-подобного полипептида, имеющего аминокислотную формулу

(Met) - Ser1- X(V- . .где Met - необ зательно присутствующий иетионин;

Ser - расположенный первым N-концевой серии; X - либо наход щийс  в положении

135 треонин или глутамин; Y - наход щийс  в положении 157

фенилаланин,

сплошна  лини  обозначает аминокислотную последовательность, идентичную соответствующим част м аминокислотной последовательности природной человеческой проурокиназЫо

Пример U Получение РНК. 20 г клеток почечной ткани, замороженных при -80°С, измельчают в сме5

сл

00

ND

и

сителе в жидком азоте и суспендируют в 80 мл 5 М раствора гуанидинизоциана- та (5М гуанидинизоцианата, 0,5% N- лауроилсаркозина-натри , 25 мМ тартра- та натри , 0,1 М меркаптоэтанола и 0,1% анифоума А). Суспензию гомогенизируют в тефлоновом гомогенизаторе и нуклеиновую кислоту выдел ют с помощью центрифугировани  в хлористом цезии.

РНК раствор ют в 2%-ном растворе ацетата кали , добавл ют два объема этанола, оставл ют на ночь при (-20) С и центрифугируют.

Поли(А) РНК вьщел ют и очищают с помощью олиго CdT) целлюлозной хроматографии , 10 г клеток почечной тка- ни дают около 3 мг РНК в целом, из

которых на поли(А) РНК приходитс 

о-1°

/-J/5.

г П р и м е р 2. Построение кДНК- библиотеки.

Синтез кДНК провод т с использованием 40 мкг поли(А)+РНК, полученной в примере 1. Использу | 40 мкг олиго (Т)( в качестве затравки, провод т реакцию с 40 единицами обратной тран- скриптазы в течение 2 ч при 4 2° С дл  синтеза первой цепи и после удалени  матричной РНК путем щелочной обработки синтез второй цепи провод т с использованием 100 единиц фрагмента Кленова полимеразы 1.

После обработки нуклеазой-1 цепь (d С) св зывают с 3 -концом двуни- тевой кДНК с помощью концевой дезок- синуклеотидилтрансферазы и получают около 400 мг кДНК с (dC)-хвостом.

Этот материал клонируют в pBR 322 и получают кДНК-библиотеку, состо щую из 2x10 тетрациклин-резистентных и ампициллин-чувствительных трансфер- мантов.

П р и м е р 3. Получение синтети- ческих ДНК-олигомеров дл  использовани  в качестве зондов дл  классификации кДНК-библиотеки.

С использованием фосфотриэфирного метода синтезируют следующие 16 ДНК- олигомеров, состо щих из 14 нуклеоти- дов, которые комплементарны, и РНК, соответствующей аминокислотной последовательности человеческой урокиназы Asn 169, Gin, Pro , Trp, Phe173:

AACCAAGGTTGATT AACCAAGGTTGGTT AACCAGGGTTGATT AACCACGGTTGATT

Q

5 Q

.,

0

5

AACCACGGTTGGTT

AACCATGGTTGCTT

AACCATGGTTGGTT

AACCAAGGCTGATT

AACCAAGGCTGGTT

AACCAGGGCTGATT

AACCAGGGCTGGTT

AACCACGGCTGATT

AACCACGGCTGGTT

AACCATGGCTGATT

AACCATGGCTGGTT

AACCAGGGTTGGTT

Эти 16 ДНК-олигомеров именуют как зонд Iо

Дл  использовани  в качестве подтверждающих зондов тем же путем синтезированы следующие 8 ДНК-олигомеров, состо щих из 14 нуклеотидов, которые комплементарны, и РНК, соответствующей Met28 Try, Asn, Asp, Pro287:

5 GGATCATTATACAT 3 GGATCGTTATACAT GGATCGTTGTACAT GGATCATTGTACAT GGGTCATTATACAT GGGTCGTTATACAT GGGTCGTT.GT.ACAT GGGTCATTGTACAT

Эти 8 ДНК-олигомеров именуют как зонд II :.

С использованием Т4-полинуклеотиг докиназы, 200 кг каждого из зондов I I и II мет т радиоактивностью на 5 - конце с помощью получени  зондов гибридизации колоний.

П р и м е р 4 „ Классификаци  кДНК-« библиотеки.

1. Классификаци .

Нитроцеллюлозный фильтр помещают на LB-агарную среду,содержащую 15 мкг/мл тетрациклина,, и среду инокулируют трансформантами, полученными в примере 2, чтобы обеспечить рост 2000 колоний трансформантов. По прошествии 8 ч инкубировани  при 37°С колонии реплицируют на два нит- роцеллюлозных фильтра, которые далее инкубируют в течение 3 ч при 37°0с Исходный нитроцеллюлозный фильтр используют в качестве эталона, тогда как два вторых фильтра перенос т на LB-агарную среду,, содержащую 15 мкг/мл тетрациклина и 100 мкг/мл хлорамфени- кола,и подвергают инкубированию, при 37°С в течение ночи. Фильтры затем помещают на 3 мин на 0,5 К NaOH и 1,5 М NaCl дл  осуществлени  лизиса колоний и денатурации ДНК, и после

нейтрализации на 0,5 М рН и 1,5 К NaCl сушат на воздухе и затем в печи при 8П°с в течение 2 ч.

После промывки фильтров в 4-х SSC в течение 30 мин каждый раз при 60°С, предгибридизацию провод т в 4xSSC, ЮхДенхардт и 50 мкг/мл денатурированной ДИК E.coli в течение ча- са при 60°С, и после добавлени  0,1 мК АТР и меченного зонда гибридизацию провод т в течение 16 ч при 37 С. После промывки фильтры сушат на воздухе и классифицируют в отношении трансформантов, гибридизирующихс  с зондом I, что дает 21 клон Плазмиды этих клонов в дальнейшем именуютс  плазмидами pKYU1-pKYU21 . Полученные 21 клон обрабатывают описанным выше путем и получают клоны, гибридизирукг- щиес  с UK их зондом II.Плазмиды в этих клонах в дальнейшем именуютс  плаз- мидой pKYU2 .

2. Характеристики ДНК плазмиды PKYU21.

После переваривани  ДНК плазмиды pKYD21 с различными рестрикционными эндонуклеазами и субклонировани  их в М13 тар8, определение нуклеотидной последовательности провод т с помощью ;методики завершени  дидезокси-цепи . Путем контрастировани  этой последовательности с известной аминокислотной последовательностью урокиназы подтверждают, что хот  кДНК содержит полную кодирующую область низкомоле кул рной урокиназы, отсутствует фрагмент ДНК длиной около 100 п„о. на 5 -конце кодирующей области высокомолекул рной урокиназы.

П р и м е р 5 Построение кДНК-1 библиотеки (II) с помощью реакции продлени  затравки„

Основыва сь на нуклеотидной последовательности , определенной в п. 2. примера 4 с помощью фосфотриэфирного метода получают ДНК-олигомер

5 CTGAAGAGCATCAGA з , состо щий из

15 нуклеотидов, которые комплементарны мРНК-последовательности, соответ- ствующей Ser, Asp-, Ala, Leu, Clu. . Использу  100 мкг поли (А) + РНК в качестве матрицы, синтезируют первую кДНК-цепь с использованием 100 единиц

00

обратной транскриптазы и 1 мкг 7tp- меченной затравки с последующим синтезом второй цепи 100 единицами фрагмента Кленова ДНК полимеразн I К .coli. Затем однонитевую ДНК расщепл ют

„

г JQ J5 20

25

30 , Q

45

,,.

.

176

35

55

S1 -нуклеазоп и цепь (dC)M добавл ют

1ТI

на 3 -конце, использу  концевую деч- оксинуклеотидилтрансферазу. После отпуска этой вставки dC-хвостом (кДНК) и вектора с dG-хвостом (pRR 322), трансформируют I , coli X с получением кДНК-библиотеки, состо -

А.

щей из приблизительно 5хЮ трансфер- мантов.

П р и м е р 6. Классификаци  кДНК- библиотеки.

Полученнне в примере 5 трансформанты подвергают гибридизации по методике примера 4. В этом случае в качестве зонда используют фрагментPstI - Bgl 115 плазмиды pl(YU21 . Гибридизацию провод т при 60°С0 Клоны, гнбридизи- рующиес  с указанным зондом, вы вл ют с помощью ауторадиографии и получают 8 положительных клонов„ Плазмидм этих клонов впоследствии именуютс  плазмидами рРЕ1-рРЕ8. После переваривани  этих плазмидных ДНК рестрикци- онным ферментом PstI подтверждают, что плазмида рРЕЗ содержит кДНК- вставку длиной приблизительно 420 п.о.

Фрагменты, полученные перевариванием ДНК плазмиды рРЕЗ рестриктазой P st I, субклонируют в М13рп8 . В результате подтверждено, что кДНК содержит не только достаточно длинную область кодировани  со стороны 51 конца проурокиназного гена, но также и нетранслируемую область 5 -конца, длиной 66 п.о. перед кодоком АТС инициации трансл ции ,

Пример 7 Построение проуро- киназного гена.

5 мкг ДНК плазмиды pKYU21, содержащей полную область кодировани  низ- комол екул  р ной урокина ы, дважды переваривают 10 единицами рестриктазы Bgl Ни Hind III и выдел ют фрагмент длиной 5,7 т.п„о. Затем ДНК плазмиды pKY21 переваривают дважды 10 единицами Bgl II и Ncol, а затем выдел ют фрагмент размером 66 . После этого 5 мкг ДНК плазмиды рРЕЗ, полученной в примере 6, переваривают лважды 10 единицами NcOI и Hind III с получением ЦИК-фрагмента 1,1 т.п.оа Эти три ДНК-фрагмента повторно экстрагируют фенолхлороформом, осалдают 2 2 объемами этанола, осадок выдел ют и очищают. Эти три разных ДНК-фрагмента св зывают между собой с помощью Т4ДНК-лигазы и трансформируют клетки E.coli X б. Трансформанты к ыгсифи

цируют по методике щелочного лизиса И получают клон, несущий плазмиду jpKYU22, котора  содержит полный ген Проурокиназы,

Примерв. Определ ют нуклео- тидную последовательность сайта плаз-4 миды pKYU22 .

Пример9о Синтез проурокиназ- tioro гена, модифицированного на 5;- }сонце.

Структуру 30 п.о о 5 -концевого участка кДНК, кодирующей проурокиназу (пример 7), измен ют так, чтобы обес- печить эффективную экспрессию проуро- киназного гена под контролем SD-последовательности гена С230 на основе Pseudomonas putjd e .

По фосфотриэфирной методике синте-; зируют следующие три одноцепочечных ДИК олигомера, включающих 29,15 и 20 нуклеотидов соответственно;

(KiAggMgj CTCCACCAGGTTCCGT з 3. TG CTCGIlGj: Ъ

fCGAGGTGGTCCAA(iGCAGC 5

1 мкг каждого из синтетических ДНК-олигомеров нагревают в течение 2 мин при 95 С, фосфорилируют на 5 - конце Т4-тюлинуклеотид-киназой, очи фют и высушивают. Очищенный материал раствор ют в 50 мкл 20 мМ , рН 7,6 и 10 мМ M gCl ,прогревают в течение 2 мин при 95°С, медленно ох- л|аждают до комнатной температуры, а э атем задерживают в течение ночи при

12 С с получением следующей двуните- вой ДНК:

5 мкг ДНК плазмиды pKYU22 дважды переваривают рестриктазами Bgl III и Aat 1Г и вьщел ют ДНК-фрагмент раз- мером 5,7 т„п.о. Затем 5 мкг ДНК той же плазмиды дважды переваривают рестриктазами Pst 1и Bgl II и: получают ДНК-фрагмент размером 400 и.о. Этот фрагмент вновь переваривают рестриктазой Tag I и вьщел ют фрагмент размером 260 п.о. Эти два ДНК-фрагмента очищают экстракцией фенолхлороформом и осаждением 2 объемами этанола.

ДНК-фрагменты и указанный двуните- вой синтетический ДНК-олигомер св зывают с помощью Т4 ДНК-лигазы и трансформируют в клетки E.coli Трансформанты классифицируют по методике щелочного лизиса .и получают клон E.coli X 1776/рКМШ, несущий плазмиду

О

5

Q

5

о

5

0

5

0

рКМШ, котора  содержит модифицированный проурокиназный ген.

Пример Ю. Построение плазмиды pMUT4L .

5 нкг плаэмиды рКМШ из примера 9 переваривают 10 единицами эндонукле- азы Aat II и вьщел ют после обработки кишечной фосфатаэой тел т. Затем 5 мкг плазмиды рТСМ1 переваривают 10 единицами эндонуклеазы Aat II, вьщел ют фрагмент размером 500 п.о. Фрагменты очищают повторной экстракцией фенол/ /хлороформом и осаждением этанолом.

Фрагменты лигируют и трансформируют в Eocoli JM103 Отбирают клон, несущий плазмиду pMU TIL, в которой t аспромотор-оператор и C230SI) - последовательность имеют правильную ориентацию относительно проурокиназ- ного гена.

Пла змида pTCKf содержит область управлени  экспрессией, включающую tac-промотор-оператор, последовательности lac SD, C230SD, а также структурный ген С230.

5 мкг плаэмиды рКК223-3 переваривают 10 единицами рестриктазы Hind III, обрабатывают кишечной фосфатазой тел т.

Затем 1 мкг плазмиды pMU TIL переваривают 4 единицами эндонуклеазы Dral и оставшийс  от переваривани  фрагмент и 1 мкг 5 -фосфоршшрованно- го Hfnd III-линкера (d CAACGTTG) лигируют. Провод т переваривание с использованием 12 единиц эндонуклеазы Hind III и раствор ют в 0,15 К NaCl, экстрагируют равным объемом фенол- хлороформа и ДНК осаждают добавлением 2 объемов этанола. Осадок собирают центрифугированием и высушивают.

Фрагмент переварива.ни  pMUTIL и фрагмент Hind III-pKK223-3 лигируют и трансформируют в E.coli JK103C Отбирают клон E.coli JMlOS/pKU T2L, содержащий плазмиду pMUT2 . .

5 мкг плазмиды pKUT2L переваривают 10 единицами эндонулеаэ Sph и Tth III I и после экстракции фенол - хлоро- - формой ДНК осаждают этанолом ДНК затупл ют с использованием Т4-полиме- разы и лигируют,, ДНК трансформируют в E.coli JMJ03 и клетки выращивают на LB-среде, содержащей 50 мкг/мл ампицилина, и отбирают клон E.coli JMI03/pMUT4L .

у1

ер 11. 1 . Получение одно

т-

Прим нитевой ДНКо

По 1 мкг плазмиды pKYU22иМ13рт 8-фаговой двунитевой ДНК перевариваю в 20 мкл раствора, содержащего Ю мК трис-HCl (рН 7,5), 7 мК tgClg, 7 мМ А-меркаптоэтанола и 50 мК Ка(Я в течение часа при 31°С, с использованием 5 единиц Pst I . фрагменты ДНК выдел ют , лигируют и трансформируют клетки R.coli JM103. Трансформанты высевают на агар, со7 ержащий 0,02% X-gal и 1 мМ fPTC, культивируют в течение ночи при 37°С. Однонитевую ДНК получают из белых бл мек, образованных рекомбинантом.

Однонитевую ДНК используют в каче стве шаблона, определ ют последовательность оснований и подтверждают последовательность клонированной од; нонитевой ДНКо

2. .Синтез двунитевой ДНК.

Использу  клонированную цепь одно- нитевой ДНК в качестве шаблона и син- тетической олигонуклеотид

5 GATGGACAAAAGCCC з

в качестве затравки (1), провод т реакцию полимеризации с помощью ДНК- полимеразы Кленова.

3 Переваривание с помощью SI- нуклеазы.

Переваривание с SI-нуклеазой провод т дл  устранени  из результирующей двунитевой ДНК непрореагировавшей одноиитевой ДНК, служащей в качестве фона. 2 мкл реакционной смеси гидроли зуют SI-нуклеазой, инкубируют при 26°С в течение 30 мин. Реакцию завершают добавлением 10 мкл 0,25 М трис- HCl (рН 8,0).

4.Трансформаци  E.colj. JM103,

10 мкл указанной реакционной смеси трансформируют E.coli JMI03.

5.Классификаци  мутантов.

С использованием зонда - олигонук- еотида, использовавшегос  в качестве затравки, фаговые бл шки классифицируют гибридизацией бл шек дл  определени  мутантного фага. Бл шки перенос т с м гкой агаровой среды на нитроцел- люлозный фильтр, нагревают в вакууме в течение 2 ч при 80°С и гибридизирую в течение ночи в растворе,, ильтр промывают и мутантно-фаговые бл шки, дающие положительные сигналы, изолируют . Мутантный фаг дает мутантно-фаго- вую ДНК двунитевого типа (pn I) .

10

10

15

20

25

-

. г

35

40

Пример 12. введение мутации в кодон 135-й аминокислоты с использованием фага К13 (2).

В качестве шаблона с использованием нового олигонуклеотидного мутагена провод т введение сайт-специфической мутации. К этом случае в качестве затравки (2) использован синтетический олигонуклеотид

S GGAACAAAGCCCTCCTCT з

Этот олигонуклеотид из 18 оснований комплементарен урокиназному гену Б однонитевой шаблонной ДНК, изменено лишь одно основание, как это можно видеть по изменению кодона ААА лизина на кодон АСА треонина.

2 пмоль 5 -фосфорилированной затравки добавл ют к 0,5 пмоль шаблонной однонитевой ДНК и инкубируют в 10 мкл раствора, содержащего 7 мМ трис-HCl (рН 7,5) 0,1 мМ ЭДТА, 20 мМ NaCl и 7 мМ -MgCl 2 в течение 20 мин при ЬО С. Дальнейшее инкубирование провод т в течение 20 мин при 23°С, К реакционной смеси добавл ют ,1АТР, d GTP, d TTP и dCTP до концентрации 0,5 мК и 2 единицы ДНК-полимеразы. Смесь инкубируют 20 мин при 23дС, а после добавлени  1 мкл 10 мК АТР и 1 единицы Т4 ДИК- лигазы инкубируют в течение ночи при 12°С. Смесь трансформируют в E.coli JKI.03.

Бл шки перенос т с агара на нитро- целлюлозный фильтр, прогревают при 80°С 2 ч, гибридизируют с затравочным олигонуклеотидом. Затем фильтр промывают и мутантные фаговые бл шки, дающие положительные сигналы, изолируют. Из мутантного фага получают двуните- вую ДНК (рт2), определ ют нуклеотид- ную последовательность и подтверждают наличие требуемой мутации в виде замещени  одного основани .

Пример 13. Построение плазмиг ды pMUP1, содержащий ген человеческой проурокиназы.

Использу  плазмиду pYTUI, содержащую PL-промотор и SD-последовательность и С230 в качестве вектора, стро т плазмиды, содержащие урокиназ- ную кДНК, полученную на основе человеческой почечной ткани. Дл  -этого 10 мкг плазмиды pYTU I переваривают 10 ед. Sal I и Aat II в 100 Мкл раствора , содержащего 10 мМ трис-НГД (рН 7,4), 7 мМ MgGlgH 150 мК NaCl , в течение 2 ч при 37°С и выдел ют

фрагмент ДНК Sal I - Aat II длиной около 4,5 т.п о о,

10 мкг плазмиды pKMU I переваривают 10 ед. Dra I в 100 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рИ 7,4), 7 мМ MgClg и 60 мМ NaCl в течение .2 ч при 37°С, добавл ют АТР в концентрации 0,66 мК. После добавлени  1 мкм Sal I - ликерной ДНК ..(S GGTCGACC 3) и 100 ед. Т 4 ДНК-ли- газы смесь инкубируют при 12°С в течение ночи. ДНК-фрагменты вьщел ют с помощью обработки фенолом и эта- нольного осаждени  и переваривают 10 ед. Aat II и Sal I в 100 мкл вора, содержащего 10 мМ (рИ 7,4), 7 мМ MgGl2 и 150 мМ NaCl в течение 2 ч при 37°С и с помощью электрофореза в агарозном геле выде- л ют ДНК-фрагмент человеческой уроки - пазы длиной около 2,2 т.п.о. По 1 мкг каждого из фрагментов смешивают и ли гируют в течение ночи в 20 мкл раствора , содержащего 66 мК трис-НС1 (рН 7,4), 7 мМ MgOlfc, 0,66 мК ATP и 10 мМ дитиотреитола при 12°С с использованием 100 единиц Т4 ДИК-лига- зы. Лигазной смесью трансформируют E.coli HB101, отбирают клон, несущий плазмиду pMUPI«.

Пример 14. Построение плазмиды pMUPIpm .

Использу  мутантную М13- фаговую двуиитевую ДНК, содержащую кДНК- фрагмент, в котором кодон ААА, определ ющий лизин в положении 135 от ,К конца урокиназы, мутирован в кодон САА, определ ющий глютамин, и плазми ду pMUPT, имеющую проурокиназный ген ниже PL-промотора и С23О SD-последова тельности, стро т плазмиду, содержа- щую мутированный ген. Дл  этого 10 мкг мутантной М13 - двунитевой ДНК переваривают с помощью E-st I и вьщел ют фрагмент длиной около - 1,2 т.п.о,

10 мкг плазмиды pKUPI частично переваривают с помощью Pst I и выде л ют фрагмент длиной около 5,4 т.п.о, из которого удал ют лишь фрагмент длиной около 1,2 топ.о„ Фрагменты вьщел ют и лигируют. После трансформации получают клон, содержащий плазмиду pMUPIpm..

Плазмида pMUPlpm содержит область, кодирующую человеческо-проурокиназо- подобный полипептид в сайте ниже PL-промотора.и С230 SD-последователь-

..

.10

15

25

™

| ,

.

5

30

35

40

45

50

ности. В этой области кодировани  кодоны, определ ющие шесть N-концевых аминокислот указанного полипептида, заменены кодонами, которые экспрессы- руютс  в E.coli, и кроме того, кодон ААА, определ ющий Lys в положении 135, заменен на кодон САА, определ ю- щий глютамин.

Пример 15. Построение плазмиды pKUT4Lpra2 со структурным геном проурокиназы и точечной мутацией ниже tac-промотора.

10 мкг М13-мутантной двунитевой ДНК гидролизуют рестриктазой Pst I, вьщел ют фрагмент длиной около 1,2 т.п.о. 10 мкг pMUT4L .частично переваривают с помощью Pst I и вьщел ют фрагмент длиной около 4,6 т.п.о. Фрагменты смешивают, лигируют и трансформируют в E.coli НВЮ1„ ТрансФорман- ты классифицируют по методике щелоч- ,ного лизиса и получают клон, содержащий плазмиду рКиТ4 рт2 .

Пример 16..Введение мутации в кодон 157-и аминокислоты, - 1. Получение однонитевой шаблонной ДНК.

По 1 мкг плазмиды pKYU22 и фаговой М13тр8-двунитевой ДНК переваривают в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,5), 7 мК KgCl, 7 мМ и -меркаптоэтанола и 50 мМ NaCl в течение 1 ч при 37°С с использованием 5 единиц Pst I.

Фрагменты вьщел ют, лигируют, k jтрансформируют в E.coli M103 транс- форманты высевают на м гкий агар, содержащий 0,02% X-gal и 1 мК ИПТГ. Пластинки инкубируют при 37°С в тече- ;,ние ночи. Однонитевую ДНК получают из белых бл шек, образованных реком- бинантом. i 2, Введение мутации

С использованием результирующей рекомбинантной М13-фаговой однонитевой ДНК в качестве матрицы введение мутаций провод т с помощью другого олигонуклеотидного мутагена. В этом случае в качестве затравки используют, синтетический олигонуклеотид

5Г GGCCCCCiCGATAA ATTA 3

Хот  этот олигонуклеотид из 18 оснований комплементарен урокиназному Геку в однонитевой шаблонной ДНК, два основани  изменены. Кодон ТТТ, определ ющий фенилаланин, заменен на кодон GAT, определ ющий аспарагиновую кислоту„

25

С использованием упом нутого оли- гонуклеотида в качестве затравки дву- нитевую ДНК синтезируют in vitro, Дл  этого 2 пмоль 5 -фосфорилирован- г ной затравки добавл ют к 0,5 пмоль матричной однонитевой ДНК, инкубируют в 10 мкл раствора, содержащего 7 мМ трис-HCl (рН 7,5), 0,1 мК ЭДТК, 20 мМ NaCl и 7 мК MgCl4, в течение 20 мин |Q при 60°CJ с последующим инкубированием При 23°С в течение 20 мин, к реакционной смеси добавл ют по 0,5 мКЛАТР, dGTP, dTTF и dCTP до объема 20 мкл и 2 единицы ДНК-полимеразного фраг- 15 мента Кленова. Смесь инкубируют при 23°С в течение 20 мин и после добавлени  1 мкл 10 мМ АТР и 1 единицы Т4- ДНК-лигазы еще в течение ночи при 12°С0 Реакционную смесь трансформиру-20 ют в E.coli JK103 и получают около 100000 фаговык бл шек на микролитр указанной реакционной смеси.

После переноса бл шек с м гкого агара на нитроцеллюлозный фильтр фильтр нагревают в вакууме.при 80 С в течение 2ч, гибридизуют с затра- ;вочным олигонуклеотидом, меченым с помощью р, промывают в bxSSC при 52°С и бл шки мутантного фага, даю- щие положительные сигналы, выдел ют ауторадиографически. Кз мутантного фага получают мутантно-фаговую ДНК двунитевого типа (рпЗ) .

Можно заменить кодон ТТТ, опреде- с л ющий фенилаланин в положении 157, Glu-определ ющим кодоном GAA с использованием олигонуклеотида

5 GGCCCCGCGAAAAGATTA 3 в качестве мутагена.

Пример 17. Построение плаз- миды pMUT4Lpro3, в которой структурный ген урокиназы, имеющий точечную мута- цию, вставлен ниже E0coli tac-промо- тора.

10 мкг К13-мутантной двунитевой ДНК (рпЗ) с помощью Pst I выдел ют фрагмент длиной около 1,2 т.п.о. 10 мкг плазмиды pKUTAL частично переваривают с помощью Pst I и выдел ют фрагмент длиной около 4,6 т.п.о.

Фрагменты смешивают, лигируют и используют дл  трансформации E.coli НВ101. Получают клон, содержащий плазмиду pKUT4Lpm3 ,

Пример 18. Построение плазми- ды рКК trp..

5 мкг плазмиды рКК 223-3 гидроли- зуют 30 единицами ЕсоК I и 20 едини-

30

40

45

50

55

5

0

с

0

0

5

0

5

цами Pvu II в 100 мкл буфера (10 мМ , рИ 7,5, 10 мМ KgClj., 50 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ) в течение 1 ч при 37°С. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 0,7% агарозе и л ют ДНК-фрагмент длиной около 2600 п.о, содержащий ген ампицилин- резистентности, область инициировани  репликации в область rrn ВТ Т2 окончани  транскрипции.

Фрагмент обрабатывают ДНК-полимер-1 азой в 25 мл буфера (50 мМ трис-ИС1 (рН 7,2), 10 мМ KgSOf, 0,1 мК DTT и 80 мкМ dNTPS) в течение часа при 25°С и обозначают как (А).

10 мкг плазмиды PSTN16 и по 20 ед гидролизуют рестриктазами Cla I и Pvu II, вьдел ют фрагмент длиной около 300 п.о., содержащий промотор, оператор и рибосомо-св зывающий сайт триптофанового оперона.

Фрагмент обрабатывают ДНК полиме- разой и обозначают (В).

Далее по 0,5 мкг ДИК - фрагментов (А) и (В) лигируют и продукт реакции используют дл  трансформации E.coli НВ101. Ампицилин-резистентные трансформанты отбирают дл  выделени  колоний , несущих плазмиду рКК trp, и требуемую плазмиду выдел ют.

Пример 19. Построение плазми- ды ptrpUK2 .

1 мкг плазмиды рКК trp гидролизуют рестриктазок и выдел ют требуемый ДНК-фрагмент (С).

10 мкг плазмиды гидролизуют рестриктазой, выдел ют фрагмент размером 640 п.о,, содержащий N-концевую область гена человеческой урокиназы. Этот фрагмент обозначен (D).

ДНК-фрагменты (С) и (Д) лигируют и используют дл  трансформации E.coli НВЮ1. Отбирают колонии, несущие плазмиду ptrpUKE, и выдел ют требуемую плазмиду.

1 мкг плазмиды ptrpUK расщепл ют рестриктазой PstI и выдел ют требуемый фрагмент ДНК (Е).

10 мкг плазмиды pKUT4L расщепл ют1 рестриктазой и выдел ют фрагмент (F) длиной 1,2 т.п.о., содержащий С- концевую область гена человеческой урокиназы.

Фрагменты (Е) и (F) лигируют и используют дл  трансформации E.coli НВ101. Из ампицилин-резистентных трансформантов отбирают колонии, несущие плазмиду ptrpUKZ, и выдел ют требуемую плазмиду.

П р и м е р 20. Построение плазми- Ды ptrpUK2 (1135).5

Двунитевой мутантный фаг M13RF (1135), в котором вставлен ДНК-хЬраг- Мент, кодон ААА которого, определ ю- , рщй лизин в положении 135, мутационно заменен на кодон АТА, определ ющий JQ |изолейцин, получают по методике при- ftepa 11, за исключением применени  следующего синтетического олигонукле- Ьтида в качестве затравки:

5 CAGATGGAATAAAGCC З1

t5

1П мкг фаза M13RF (1135) полностью Ьереваривают с использованием PstI р выдел ют ДНК-фрагмент длиной около 1,2 т.п.о. 1 мкг плазмиды ptrpUK2 Полностью переваривают с помощью PstI (выдел ют ДНК-фрагмент длиной около 3,4 т.п.о и используют в качестве ректора. Фрагменты лигируют с использованием Т4-ДНК лигазы и реакционную смесь используют дл  трансформации E.coli НВ101о Классифицируют ампици- лин-резистентные колонии и получают клон, содержащий плаэмиду ptrpUK2 (1135) Все услови  проведени  этой Процедуры соответствуют описанным в примере 4.

Пример 21. Построение плазми- ды ptrpUK (E135).

Двунитевой мутантный фаг M13RF (Е135), в котором вставлен ДНК-фраг- мент, кодон ААА которого определ ю щий лизин в положении 135, мутационно изменен на кодон GAA, определ ющий глютаминовую кислоту, получают по методике примера 10, за исключением применени  следующего синтетического нуклеотида в качестве затравки;

5 GATGGAGAAAAGCCT з

Затем по методике примера 20 из фага M13KF (135) и плазмиды StrpUK2 получают плазмиду ptrpJJK2 (K135).

Пример 22о Построение плазмиды ptrpUK2 (Q135 Д 157)„

Двунитевой мутантный фаг, в котором вставлен ДНК-фрагмент, кодон ААА которого изменен на кодон САА, определ ющий глюамин, получают по методике примера 11, за исключением применени  синтетического нуклеотида в качестве затравки:

5 GATGGACAAAAGCGC 3

Затем по методике примера 1t из указанного фага получают однонитевую фаговую ДНК и по описанной выше мето

Q

5

Q 5 0

дике получают двунитевой мутантный фаг M13RF (Q 135 Д 157), в который вставлен ДНК-фрагмент, кодон ААА которого , определ ющий лизин в положении 135, мутационно изменен на кодон САА, определ ющий глютамин, и кодон ТТТ, определ ющий фенилаланин в положении 157, аналогично изменен на кодон GAT, определ ющий аспарагиновую кислоту, за исключением использовани  синтетического олигонуклеотида 5 GGCCCCGCGATAAGATTA 3 в качестве затравки, в результате чего мен ют кодон ТТТ, определ ющий фенилаланин в положении 157 на кодон CAT, определ ющий аспарагиновую кислоту.

Плазмиду trpUK2 (0135 Д 157) получают из M13RF (0135 Д 157) и плазмиды ptrpl)K2 по методике примера 20.

Пример 23. Построение плазмиды trpUK2 (E135 Д 157).

Двунитевой мутантный фаг M13KF (Е135 Д 157), в котором вставлен ДНК- фрагмент, кодон ААА которого, опреде- л ющий лизин в положении 135, мутаци- онно изменен на кодон GAA, определ ющий глютаминовую кислоту, а кодон ТТТ, определ ющий фенилаланин в положении 157, изменен на кодон GAT определ ющий аспарагиновую кислоту, получают по методике примера 22 за исключением использовани  синтетического нуклео5

0

5

0

.1,

тида 5 САТССАСААААССССТ 3 дл  мутационного изменени  кодона ААА, определ ющего лизин в положении 135, на кодон GAA, определ ющий глютамино- вую кислоту.

Далее по методике примера 20 плазмиду trpUK2 (E135 Д 157).получают из M13RF (Е135 Д 157) и trPUK2 .

Пример 24, Экспресси  проуро- киназо-подобного полипептида.

Плазмиды pMUPI и p ttUPIp, полученные соответственно в примерах 13 и 14, трансформируют обычным путем в E.coli W3110 и результирующие транс- форманты культивируют при 30°с в 50 мл L-бульона Температуру культу- ральногЪ -бульона повышают до 42°С, когда поглощение на 600 нм достигает 0,3, и дальнейшее инкубирование провод т в течение 3 ч при экспрессии урокиназного гена.

Пример 25. Экстракци  генного Продукта из E.coli и его свойства.

Клетки E.coli 3110 собирают из 5 мл жидкой среды, описанной выше, и после суспендировани  клеток в

i 7

0,5 мл раствора, содержащего 7,5 М гуанидин гидрохлорида и О,05 К трис- НС1 (рН 7,5), суспензию оставл ют сто ть на 90 мин при комнатной температуре . Затем суспензию центрифугиру ют при 1(100 об/мин и после разбавлени  надосадочной жидкости в 5 мл раст ( вора, содержащего 1М гуанидин гадро- хлорида, 0,05 трис-HCl, рН 7,5.

2 мМ глутатиона, смесь инкубируют в течение ночи при комнатной температуре . Затем диализируют 4 ч при 4°С относительно 100-кратного объема раствора , содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 0,4 К Nad, и дальнейший диализ провод т 2 ч относительно 100- кратного объема раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 754) и 0,1 М Nad.

К части результирующего сырого экстракта добавл ют трипсин до конечной концентрации 30 мкг/мл и смесь инкубируют 1 ч при 37°С. В качестве контрол  аналогично инкубируют смесь, содержащую воду вместо трипсина.

Указанные смеси подвергают электрофорезу в геле, содержащем 12,5% полиакриламида. Гель погружают в 2,5% тритон X-100 и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Затем гель наслаивают на фибрин-агаровую пластинку и инкубируют 1-2 ч при 37№Со После этого оценивают молекул рную массу по располржению растворенной зоны на фибрино-агаровой пластинке. Дл  сравнени  провод т электрофорети- ческую миграцию стандартной пробы урокиназы, полученной на основе человеческой мочи.

Полученный на основе плазмиды pMUPI генный продукт имеет молекул рную массу около 50.000, часть продукта преобразована в низкомолекул рные фрагменты молекул рной массой около

JQ

Q 5

, 0 58271а

Плазмиду pMUT4Lpn2, полученную в примере 25, трансформируют в E.coli ЛИ 03 и трансформант культивируют в 5 мл L-бульона при 37°С. Экспрессию индуцируют добавлением КГП.Т (изо- пропил- -и-тпогалактопиранозид) до конечной концентрации 1 мМ, когда поглощение на 550 нм достигает 0,5,v и дальнейшее культивирование ПРОВОДЯТ в течение 3 ч при 37°С дл  экспрессии урокиназного гена.

Сырой экстракт получают после обработки 5 мл указанной жидкой среды по методике примера 25 и часть сырого экстракта обрабатывают трипсином0

Эти препараты подвергают электрофорезу в геле, содержащем 10% полиакриламида , гель погружают в 2,5% тритон X-100, после чего инкубируют при комнатной температуре в течение часа. Гель наслаивают на фибрино- агаровую пластинку и инкубируют 2 ч при 37°С. Молекул рную массу оценивают по местоположению растворенной зоны ча фибриноагаровой пластинке. Дл  сравнени  осуществл ют также электрофоретическую миграцию стандартного образца урокиназы из челове- ческой мочи и обработанного трипсином препарата, полученного в примере 25.

Продукт плазмиды pMUT4Lpm2 с трудом преобразуетс  до низкомолекул р- кого компонента, как это происходит в случае генопродукта на основе плаз- миды рМиИрш , Молекул рна  масса этого продукта несколько ниже этого показател  дл  высоко- и низко-молекул рных урокиназ из человеческой мочи, например, 50„000 и 30.000 в сравнении с 54.000 и 33.000, что возможно св зано с неприсоединением гликозидных цепей в клетках E.coli.

Пример 27 Экспресси  проуро-

30

35

30.000 в результате трипсиновой обра- . киназо-подобного полипептида.

50

ботки. Полученный на основе плазмиды pMUHpm генный продукт также имеет молекул рную массу около 50.000, но не преобразуетс  в низкомолекул рный материал в ходе трипсиновой обработки . Молекул рна  масса этих продуктов несколько ниже, чем у высоко- и низкомолекул рных урокиназ, получен- . ньгх из человеческой мочи, 50.000 и 30.000 в сравнении с 54.000 и 33.000, что св зано с неприсоединением гликозидных цепей в клетках E.coli..

Пример 26„ Экспресси  проуро- киназо-подобного полипептида.

Плазмиду pMUT4Lpm3, получе в примере 17, трансформируют JMI03, трансформант инкубирую 5 мл L-бульона при 37°С. Эксп индуцируют добавлением К1ПТ д ной концентрации 1 мМ, когда ние на 550 нм достигает 0,5, нейшее культивирование провот; при 37°С дл  экспрессии уроки гена.

Клетки E.coli JMI03 собира

После суспендировани  клет оставл ют сто ть на 40 мин при натной температуре, затем цен

0

Плазмиду pMUT4Lpm3, полученную в примере 17, трансформируют в E.coli JMI03, трансформант инкубируют в 5 мл L-бульона при 37°С. Экспрессию индуцируют добавлением К1ПТ до конечной концентрации 1 мМ, когда поглощение на 550 нм достигает 0,5, и дальнейшее культивирование провот; т 3 ч при 37°С дл  экспрессии урокиназного гена.

Клетки E.coli JMI03 собирают.

После суспендировани  клеток их оставл ют сто ть на 40 мин при комнатной температуре, затем центрифуги-

pywr и после разбавлени  надосадоч ной жидкости инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Смесь ди ализируют, как описано выше.

Кутантную (РтЗ) урокиназу очищаютt подверга  результирующий сырой экстракт аффинной хроматографии с использованием сефарозной колонки, с кото рой св заны антиурокиназо-монокло- нальные антитела.

I П р и м е р 28. Экспресси  npoypoкиназо-подобного полипептида,

Плазмиды ptrpUK2 (0135Д157) и ptrpUK2 (Е135 Д 157), полученные в примерах 22 и 23, трансформируют в E.colirWSl10, трансформанты инкубируют , индуцируют добавлением IAA (индолуксусна  кислота) до конечной концентрации 50 мкг/млэ когда погло- щение на 550 нм достигает 0,5, и дальнейшее культивирование провод т 3 ч при 37 С дл  экспрессии урокинаэ- ного гена.

Из жидких сред экстрагируют и очи- щают 5 мл среды на основе плазмиды ptrpUK2 ((135Д157) с получением му- тантного проурокиназо-подобного поли- пептида (Q135/J157). Часть полипепти- да обрабатывают трипсином следующим образом.

После определени  ферментной активности по методу синтетического субстрата пробы разбавл ют раствором, содержащим 50 мМ трис-НС1 буфера (рН 7,4), 0,15 К хлористого натри  и 0,1% тритона X-100 до конечной концентрации 100 МЕ/мл. К 50 мкл добавл ют 3 мкл водного раствора трипсина до окончательной концентрации 1 мг/мл 2 мг/мл и 3 мг/мл и смеси инкубируют при 37 С в течение 60 мин. Затем ре акцию прекращают добавлением 5 мкл соевого ингибитора трипсина. В качестве контрол  аналогично обрабатывают пробы, содержащие вместо трипсина воду.

Пробы подвергают электрофорезу в градиентном полиакриламидном геле (10-26%)., Гель погружают в 2,5% три- тон Х-ЮО и инкубируют в течение часа при комнатной температуре, наслаивают на фибрино-агаровую пластинку и инкубируют 2 ч при 37°С. Молекул рную массу оценивают на основании положени  зоны растворени  на фибрин-агаровой пластинке.

Также обрабатывают проурокииазо- подобный полипептид природного типа

0

5 0 5

g

5

,и мутантный проурокиназо-подобный полипептид (0135), полученньм зкст-

-ракцией и очисткой жидкой среды, полученной в примере 25, с помощью методики примера 27« Молекул рна  масса проурокиназы природного типа на основе pMUPI составл ет около 50.000, диссоциаци  трипсином снижа- ет ее до 30.000. С другой стороны никакой конверсии до низкомолекул р- ного материала не происходит при обработке трипсином в случае полипеп- тидов на основе соответственно плаз- мид pMUFIpm и ptrpUK2 ((135Д157). Характеристика штаммов хоз ев Общие свойства.

1 о Длинные стержни размерами 1,1- 1,5 на 2,0-6,0 мкм (живые) или 0,4- 0,7 на 190-3,0 мкм (высушенные и окрашенные ) о

2.G+C содержание ДНК: 50-51 моль.% (плавуча  плотность +Ту,У„

3.Биохимические характеристики приведены в табл.1 и 2.

4.Генотип.

Д (lac pro), thi, str A, supE, end A, sheA, she B, usd 1, F tra П 36, pro AB,. lac If , Z ДМ15

Специфические свойства Escherichia coli / pMUPIpm2 (FERM BP-969) - проду- цент полипептида, обладающего свойствами человеческой проурокиназы, со следующей аминокислотной последовательностью: (Met) - Ser - X - Y-, где X - глутамин в положении 135 и Y-фенилаланин в положении 157

Escherichia coli / pMUT4Lpr.2 (FEPM ) - продуцент полипептида, об- ладающего свойствами человеческой проурокиназы со следующей аминокислотной последовательностью: (Met) - Ser - ;Х - Y-, где X представл ет собой треонин в положении 135,aY-фенилала- нин в положении Т57„

Escherichia coli / ptrpUK2 (QU157) (DSM - 3623) - продуцент полипептида, обладающего свойствами человеческой проурокиназы, где X представл ет собой глутамин в положении 135, a Y - аспарагиновую кислоту в положении 157.

Проурокиназа, полученна  с помощью E.coli W3110 и трансформированна  с помощью pMUPIpro,, составила примерно 2 мкг/мл, полученна  с помощью E0coli ШЮЗ, трансформированной с помощью PMVT4Lpra2, составл ет от 5 до 10 мкг/мл, а полученна  с помощью E.coli W311О,.трансформированной с

10

помощью pKWpIpm, составила примерно от 1 до 2 миг/мл

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   1.Способ получени  полипептида со свойствами проурокиназы, предусматривающий конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК, обеспечивающей синтез проурокиназы, трансформацию рекомбинантными ДНК штамма бактерий Eschericbi a coli, отбор клонов, культивирование штаммов, индукцию образовани  полипептида, выделение j и очистку целевого продукта, о тли - чающийс  тем, что, с целью повышени  стабильности полипептида, конструируют рекомбинантную плазмид- ную ДНК pKUpIpir, трансформируют полу- 20 ченной ДНК штамм бактерий E.coli 3100, культивируют трансформированные клоны при 30 С с последующей индукцией при повышении температуры

   до 42 С образовани  полипептида со 25 следующей аминокислотной последовательностью:

   |Met| - Ser - Gin - Phe 2 .Штамм бактерий Escherichia coli FEKM BP-9b9 - продуцент полипептида зо со свойствами проурокиназы и аминокислотной последовательностью:

   |Met| - Ser-Gin135- Phe 57-. 3. Способ получени  полипептида со свойствами проурокиназы, предус- м тривающий конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК, обеспечиваюей синтез проурокиназы, трансформацию рекомбинантной ДНК штамма бактеий Escheri chia colij отбор клонов, культивирование штаммов, индукцию образовани  полипептида, выделение очистку целевого продукта, отлиающийс  тем, что, с целью овышени  стабильности полипептида, онструируют рекомбинантную плазмид-

   35

   40

   Признак (1)

   Подвижность

   Индол

   на TSI

   2 Талакто-

   зидаза

   Лактоза

   Мукат

   0

   0

   5

   о

   5

   0

   - Ser - ThrW- Phe 57ную ДНК pMUT4Lpm2, трансформируют полученной ДНК штамм бактерий К„coli , культивируют трансформирогшн-i ные клоны при 37°С и путем прибавлени  изопропил-ЯН)-тиогалактопиранози- да индуцируют образование полипептида. со следующей аминокислотной последовательностью:

   |Met|

   4 . Штамм бактерий Escherichia coli FEKM BP-970 - продуцент полипептида со свойствами проурокиназы и аминокислотной последовательностью: Met - Ser - Phe 57.

   5.Способ получени  полипептида со свойствами проурокиназы, предусматривающий конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК, обеспечивающей синтез проурокиназы, трансформацию рекомбинантной ДНК штамма бакте рий Escherichia coli, отбор клонов, культивирование штаммов, индукцию образовани  полипептида, выделение

   и очистку целевого продукта, отличающийс  тем, что, с целью повышени  стабильности полипеп- тида, конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК ptrpUK2 - (0135D 157) трансформируют полученной ДНК штамм бактерий E.coli W3110, культивируют трансформированные клоны при температуре 37 С и путем прибавлени  ин- долуксусной кислоты индуцируют образование полипептида со следующей аминокислотной последовательностью: Met|-Ser-Gln 3 -Asp 57

   6.Штамм бактерий Е s herichia coli DSM-3623 - продуцент полипептида со свойствами проурокиназы и аминокислотной последовательностью

   (Met(-Ser-(;in S5-Asp157 .

   Приоритет по пунк - там:

   25.01.85 по пп 1 и 2; 20,04.85 по пп 3 и 4

   Т а б л и ц а 1

   Наличие (+), отсутствие (-) (II)

   + +

   +

   +/х +

   23

   Признак (1)

   KCN

   Желатин Малонат d-Тартрат Дульцитол

   Каталаза

   Оксидаза

   й-Талактоэидаэа

   Газ из глюкозы

   при 37° С

   KCN (роста)

   Мукат (кислота)

   Восстановленный

   нитрат

   G-C, мол. %

   Адонитол

   Арабиноза

   Лактоза

   Мальтоза

   Маннит

   Салицин

   Сорбит

   Трелалоза

   Близкие углерод

   источники

   Цитрат

   Малонат

   M.R.

   У.Р.

   Гидролиз желати

   H2S из TS I

   Кндол

   Декарбоксилировньв1 лизин

   Т идролизованна 

   мочевина

   Глутаминова  ки

   Фенилаланин

   169582724

   Продолжение табл,1

   Наличие (+), отсутствие (-) (II)

   d (аналоги) d - Таблица 2

   + 50+51

   + + + + f + +

   или X