JPS62214355A - 核酸中に存在する特定のヌクレオチド変化及び遺伝的多型性の検出方法 - Google Patents

核酸中に存在する特定のヌクレオチド変化及び遺伝的多型性の検出方法

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JPS62214355A JP62056985A JP5698587A JPS62214355A JP S62214355 A JPS62214355 A JP S62214355A JP 62056985 A JP62056985 A JP 62056985A JP 5698587 A JP5698587 A JP 5698587A JP S62214355 A JPS62214355 A JP S62214355A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発８Ａは、ヌクレオチド変化、変異又は冬型性（ポ
リモルフイズム、；　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｍｍ）　ｆ
含有すると予想される核酸配列を増幅しそしてこれらを
ドットプロッ）　（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ　）法にお層て配
列特異的オリゴヌクレオチドによフ検出することによる
、これらのヌクレオチド変化、変異又は多機性を検出す
る方法に関する。
〔従来の技術〕
近年、組換ＤＮＡ技法の適用により多数のヒトの遺伝的
疾患の分子的基礎が説明されている。特に、鎌形赤血球
貧血のごとき遺伝的疾患と関連するヒトゲノムＤＮＡ中
の特異的多型性制限部位（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｒ
ａａｔｒｉｃｔＩｏｎ　ａｌｔｏｓ　）の検出が出生前
診断のための臨床的に価値ある情報を与えている。これ
らの研究においては、特異的部位の存在又は不存在が制
限断片最多型性 （ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎ
ｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　；　ＲＦＬＰ）分析
により明らかにされる。この方法においては特異的なゲ
ノム制限断片の長さがサデンブロッティング、及び固定
化されたゲノムＤＮＡとラベルされたプローブとのハイ
ブリダイゼーションにより検出される。疾患の表現型を
与える変異を含む長屋性部位の直接検出において（例え
ば、妙す■及び鎌形赤血球貧血）、並びに家族内で特定
の対立遺伝子制限部位が疾患の遺伝子座にリンクしてい
るが一般集団においては必然的にそうではない場合のリ
ンケージ研究において、ＲＦＬＰ分析が有用であること
が証明されている。例えは、Ｋａｎ及びＤｏｚｙ、　Ｐ
ＮＡＳ　（ＵＳＡ）。
７５．５６３１（１９８７）、並びにＲｕｂｉｎ及びＫ
ａｎ＋　Ｌａｎｃｅｔ、　１９８５−　Ｉ　、　７５　
（１９８５）を参照のこと。さらに、Ｇｅｅマｅｒ等、
μ９旦（ＵＳＡ）　。
７８．５０８１（１９８１）及びＷｌｌｓｏｎ等、煕（
ＵＳＡ）、７９．３６２８（１９８２）を参照のこと。
”オリがマー制限’　（ｏｌｉｇｏｍｅｒ　ｒｅａｔｒ
ｉｃｔｉｏｎ）と称される第２の方法においては、末端
ラベル化合成オリゴヌクレオチド７″ローグが溶液中で
標的ゲノムＤＮＡ配列にアニールされ、そして形成され
たバイブリドを開裂せしめるために制限酵素が添加され
る。この方法は、その特異性が制限部位内の塩基対のミ
スマツチが開裂を廃止し又は妨害する能力に依存してお
シ、そして５ａ１ｋｉ等、によりさらに十分に記載され
ている。さらに、この技法の感度はポリメラーゼ連鎖反
応法を用いて増強することができ、この方法においては
、サンプルがまず特異的プライマー、ポリメラーゼ及び
ヌクレオチドによる処理にかけられ、その後の検出のた
めのシグナルの増幅が行われる。この方法は５ａｉｋ１
等、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０＊　１３５０−１３５３
（１９８５）によりさらに十分に記載されている。
制限部位字型とは独立である対立遺伝子変化を検出する
ための第３の方法は配列特異的な合成オリゴヌクレオチ
ドプローブを使用する。Ｃｏｍｍ＠ｒ等、型態（ＵＳＡ
）　、１曳、７８（１９８３）を参照のこと。この後者
の技法はαｌ−アンテトリグシン欠損の出生前診断［Ｋ
ｌｄｄ等、Ｎａｔｕｒｅ　＊　３０４ｔ２３０（１９８
３）、及びβ−サラセミア診断Ｐｉｒａａｔｕ等、Ｎ、
　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍａｄ、、　３０９　、２８４（
１９８３））に適用されている。さらに、この技法はサ
デンプロットを用いるＪＬＡ−ＤＲβの冬型性の研究に
適用されている（　Ａｎｇｅｌｉｎｌ等、ＰＮＡＳ（Ｕ
ＳＡ）　、旦ユ、４４８９−４４９３（１９８６））。
この方法の基礎は、適切な条件下で１９塩基（１９−ｍ
＠ｒ）以上の短いオリゴヌクレオチドプローブがそれが
完全にマツチする配列とのみアニールし、１個の塩基対
ミスマツチがハイプリダイゼーショ／を回避するのに十
分に不安定化することである。対立遺伝子変異体（ｖａ
ｒｉａｎｔ　）の識別はゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオ
チド（１９−ｍａｒ）プローブとの間のデュプレックス
の熱安定性に基礎を置く。
さらに、ヘテロデュグレックスを開裂せしめるためにす
い臓リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＡ）を用いて２本鎖
ＲＮＡ及びＲＮＡ　：　ＤＮＡへテロデュプレックス中
の塩基対ミスマツチを検出するための方法が記載されて
いる。Ｗｉｎｔｅｒ等、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）＊８２ニ
ア５７５−７５７９（１９８５）、及びＭｙｅｒｓ＄、
　５ｃｉｅｎｃｅｓ　２３０　：　１２４２−１２４６
（１９８５）。この方法の主たる欠点は、すべてのタイ
プの塩基対ミスマツチを認識することはできないことで
ある。
ＲＦＬＰ法及びオリゴヌクレオチドプローブ安定法は比
較的複雑な方法であって、制限酵素消化、ゲノムＤＮＡ
のグル分画、ＤＮＡの変性、Ｐ紙への移行によるか又は
グル自体の乾燥によるＤＮＡの固定化、及び固定化され
たゲノム制限断片の電気泳動的に分離された列へのラベ
ルされたプローグのハイブリダイゼーションを必要とす
る。ヒトゲノムＤＮＡの複雑さ故に、オリゴヌクレオチ
ドプローブ安定法のためにこれらの段階が必要である。
標的配列（″シグナル＃）をゲノムの残シの部分（″′
ノイズ）から分離するために制限酵素処理及び電気泳動
が必要であり、そして標的配列をできるだけ多く維持す
るためにグル中での（フィルターへの移行ではなく）ハ
イブリダイゼーシヨ／が必要である。高比活性キナーゼ
処理プローブを用いての１０　ｎｇサンプル中のシグナ
ルの検出には４日間のオートラジオグラフ露出が必要で
ある。
さらに−Ｃｏｍｍ＊ｒ等の方法は、特異性の理由（よシ
短いプローブはよシ多くのゲノム断片とハイブリダイズ
するであろう）、及びおそらく感度の理由のため、１９
−ｍａｒ以上のプローブを必要とする。しかしながら、
よシ短いプローブ（例えば１６−ｈｏ＠ｒ）はよシ配列
特異的な識別力を示すかもしれない。なぜなら、１１固
のミスマツチが一層不安定にするであろうからである。
〔発明が解決しようとする問題点〕
従って、ゲノムＤＮＡのごとき俵酸中の１個の塩基の相
違を直接検出するための改良された感度及び特異性を有
する簡便化され友方法の必要性が当業界において存在す
る。
従って、本発明は、あらゆるタイプの扶患又は状態の検
出に２いて使用するための、任意の由来の核酸配列中の
１又は複数の変化を検出するための方法を提供する。こ
の発明の方法は、他の方法において必要な制限ｎ素泊化
、電気泳動、及びグルの取扱を必要としないで配列の変
化を直接検出する。さらに、本発明の方法は、プローブ
の改良された特異性及び感度を提供し、０．０４μｇの
サンプルを用いて６時間以内に判断可能なシグナルを得
ることができる。第３に、膜上にスポットされるサンプ
ルの量が０．１〜０．５μｇに増加すれば、従来の方法
において使用された放射性プローブに代えて非放射性ラ
ベルされたオリゴヌクレオチドを使用することができる
。最後に、本発明の方法は１９−ｍｅｒよシ短いサイズ
の配列特異的オリゴヌクレオチドの使用に適し、従って
さらに識別力の高い配列特異的オリゴヌクレオチドの使
用が可能となる。
〔問題点を解決するための手段〕
具体的には、本発明はサンノル中に含まれるｌクレオチ
ドの変化の存在又は不存在を検出する方法を提供し、こ
の方法は、 （Ａ）　　該サンプルを、ハイブリダイゼーション条件
下で、４種類の異るヌクレオチドトリホスフェート、該
ヌクレオチドトリホスフェートの重合のための試薬、及
び前記変化を含有すると予想される各核酸の各錘につき
１つのオリゴ９ヌクレオチドプライマーによりー賭に又
は逐次的に処理し、こうして検出されるべき各県る変化
を含有する各核酸鎖について、各核酸鎖に対して相補的
な各プライマーの延長生成物を合成し、ここで前記ｌ又
に複数のプライマーは各県る変化を含有する各核酸鎖に
実質的に相補的であって、１つのプライマーから合成さ
れた延長生成物が、それがその相補体から分離された際
に他・のプライマーの延長生成物の合成のための鋳型と
して機能する様に選択されており； （ｂ）　　前記サンプルを変性条件下で処理することに
より、検出されるべき変化が存在する場合には離し； （ｃ）　　前記サンプルを前記４種類のヌクレオチドト
リホスフェート、■ヌクレオチドトリホスフェートの重
合のための試、某及びオリゴヌクレオチドプライマーに
よりー緒に又は逐次的に処理し、こうして段階（ｂ）に
おいて生成した各単鎖を鋳盤として使用してプライマー
延長生成物を合成し、ここで配列変化が存在すればそれ
を含有する前記核酸の検出可能な増幅が得られるのに十
分な回数にわ念って段階（ｂ）及び（ｃ）を反復し；（
ｄ）　　段階（ｃ）の生成物を膜に固定し；（ｅ）　　
鉄膜を、ハイツリダイゼーシ、ン条件下で、プローブの
配列が前記増幅された配列のある領域に対して相補的で
ある場合にのみ該増幅された核酸配列とハイブリダイズ
することができるラベルされた配列特異的オリゴヌクレ
オチドプローブにより処理し；そして、 （ｆ）　　該プローブが前記核酸サンプル中の増幅され
た配列とハイブリダイズしたか否かを検出する；こと金
含んで成る。
段階（ｂ）及び（ｃ）は好ましくは５回以上反復し、そ
してさらに好ましくは、サンプルがヒトｒツムＤＮＡを
含む場合には１５〜３０回反復する。サンプルが細胞ｔ
ｔ有する場合、好ましくは段階（＆）に先立ってこれら
を加熱してその中の核酸を試薬に対して露出せしめる。
この段階により試梁の添加前の核酸のＮ製が回避される
。
この方法の変法においては、生ずる増幅された配列がラ
ベルされる様に、プライマー及び／又はヌクレオチドト
リホスフェートがラベルされている。このラベルされた
プライマー及び／又はヌクレオチドトリホスフェートは
最初に反応混合物中に存在せしめることができ、又は後
のサイクルの間に添加することもできる。配列特異的オ
リゴヌクレオチド〔ラベルされていない〕を膜に固定し
、そしてラベルされた増幅生成物によジノーイプリダイ
ゼーション条件下で処理して、増幅生成物中に膜結合配
列が存在する場合にのみノ１イプリダイゼーシ、ンが起
こる様にする。
他の態様において、本発明はサンプル中に含まれるｌ又
は複数の核酸中の配列中の少なくとも１個のヌクレオチ
ドの変化の存在又は不存在を検出するためのキットに関
し、このキットは、（ｃ）　　検出されるべき容具る変
化を含有する各核酸鎖のための各オリゴヌクレオチドに
つき１個の容器（このプライマーは容具る変化を含有す
る各錘に対して実質的に相補的であって１つのプライマ
ーから合成された延長生成物が、それがその相補体から
分離された場合に、他のプライマーの延長生成物の合成
のための鋳型として機能することができ、こうして前記
変化が存在すれば１又は複数の増幅された核酸配列生成
せしめる）；（ｂ）　　ハイブリダイゼーシ、、／の試
薬用容器；（０）　　４種類の異るヌクレオチドトリホ
スフェートのそれぞれのための容器； （ｄ）　　プローブの配列が前記増幅された配列のある
領域に対して相補的である場合にのみ該増幅された核酸
配列とハイブリダイズすることができる各ラベルされた
配列特異的オリゴヌクレオチドプ（ｃ）　　前記増幅さ
れた配列へのプローブの７１イブリダイゼーシ、、／を
検出するための試薬用容器；を有する多容器ユニットを
まとめた形で含んで成る。
遺伝的疾患に関し、ＲＦＬＰは該疾患と関連する多血性
制限部位を必要とするが、配列特異的オリゴヌクレオチ
ドは遺伝的病変を直接検出し、そして一般に１又は複数
の塩基変典から生ずるヘモグロビンＣ疾患、α１−アン
テトリグシン及びβ−サラセミアのごとき遺伝的疾患の
分析のために一層有用である。さらに、異る対立遺伝子
を示す遺伝的変異体（ｖａｒｌａｎｔ　）間の識別（例
えばＨＬＡ。
タイプ分け）のためにオリゴヌクレオチドを使用するこ
とができ、配列特異的オリゴヌクレオチドに基礎を置（
ＨＬＡタイプ分はキットの実現可能性が示される。
〔具体的な説明〕
６配列中のヌクレオチドの変化”なる語は１又いずれに
も関する。これらのヌクレオチドの変化は変異であって
も、又は条壁性対立遺伝子変化であってもよい。従って
、本発明の方法は１塩基変異、付加及び欠失により惹起
されるβ−グロビン遺伝子疾患（幾つかのβ−サラセミ
ア、鎌状赤血球貧血、ヘモグロビンＣ疾患靭おいて生ず
る様な核酸中の１ヌクレオチドの変化を検出することが
でき、さらにα−サラセミア及び幾つかのβ−サラセミ
アと関連する様な多数の塩基変化を検出することができ
る。この方法はまた、疾患と必然的に関連するわけでは
なく２個以上の異るヌクレオチド配列Ｃ１Ｒ換されたヌ
クレオチド塩基対、欠失したヌクレオチド塩基対又は挿
入されたヌクレオチド塩基対のいずれか）がその集団の
核酸中の特定の部位、例えばヒト−ゲノムのＨＬＡ領域
に存在することができる単なる状態である長屋、及びミ
トコンドリアＤＮＡにおけるごとき不規則冬型（ｒａｎ
ｄｏｍ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉａｍ）　ｆ：検出するこ
とができる。後に詳細に記載する冬型性配列特異的オリ
ゴヌクレオチドプローブを、イノシュリン依存糖尿病の
ごとき疾患と関連する遺伝マーカーとして、又は法医学
用途において使用することができる。
核酸配列が２本鎖である場合、配列中のヌクレオチド変
化は配列中の塩基対変化となる。
この明細書において使用される場合、“オリゴヌクレオ
チド”なる語は、２以上のそして好ましくは３以上のデ
オキシリ？ヌクレオチド又はリボヌクレオチドから成る
分子として定義される。その正確なサイズは多くの因子
に依存し、これらの因子は該オリゴヌクレオチドの最終
用途又は機能に依存するであろ５゜オリゴヌクレオチド
は合成により、又はクローニングにより得ることができ
る。
この明細書において開用する場合、“プライマー“なる
語は、核酸鎖に対して相補的であるプライマー延長生成
物の合成が誘導される条件下、すなわち４＠類の異るヌ
クレオチドトリホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼの
ごとき重合のための試薬の存在下、適当な緩衝液（ここ
で“緩＠”とは声、イオン強度、コファクター等を包含
する）中、そして適当な温度に置かれた場合に、合成の
開始点として機能することができるオリゴヌクレオチド
であって、精製された制限酵素消化物であっても合成的
に製造されたものでありてもよい。
プライマーは好ましくは増幅における最大効率のために
単鎖であるが、しかしこれに代って２本鎖であってもよ
い。２本鎖である場合、延長生成物の調製のために使用
する前に、その鎖を分離するためにプライマーをまず処
理する。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリ？
ヌクレオチドである。プライマーは、重合のための試薬
の存在下で延長生成物の合成を開始（プライム）するた
めに十分な長さを有しなければならない。プライマーの
正確な長さは、温度、プライマーの由来及び使用する方
法を含む多くの因子に依存するであろう。例えば、標的
配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマ
ーは典型的には１５〜２５ヌクレオチドを含有するが、
よシ多くの又により少数のヌクレオチドを含むこともで
きる。短語プライマー４￥梁は一層に鰭朋シの＋会に害
宏にバイブリド複合体を形成するために一層低い温度を
必要とする。
この発明においてプライマーは、増幅されるべき各特定
の配列の異る鎖に対して”実質的に”相補的である様に
選択される。これは、プライマーがそれらの対応する鎖
とノ・イブリダイズするのに十分な程度に相補的でなけ
ればならないことを意味する。’ｔｔって、プライマー
配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば
、プライマーの５７−末端に非相補的ヌクレオチド断片
が付加されており、プライマー配列の残シの部分が鎖に
対して相補的であってもよい。典型的には、最良の検出
結果を得るためにプライマーは正確な相補性を有する。
“配列特異的オリゴヌクレオチド”なる語は、検出すれ
るべきヌクレオチド変化をまたぎそして検出されるべき
配列変化に特異的な特定の配列（対立遺伝子上に含まれ
るか否かを問わない）にハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドに関する。
後で詳細に記載する様に分析されるべき配列に依存して
、各配列について１又は複数の配列特異的オリゴヌクレ
オチドを使用することができる。
この明細督において使用する場合、゛熱安定性酵素″は
、熱に対して安定であシそして熱耐性であり、そして各
核酸鎖に対して相補的であるプライマー延長生成物を形
成するために適切な態様でのヌクレオチドの結合を触媒
する（促進する）酵素を意味する。一般に、合成は各プ
ライマーの３′−末端から開始され、そして合成が停止
するまで鋳型にそって５′方向に進行し、異る長さの分
子を生成せしめる。しかしながら、上記と同じ方法を用
いて、５′−末端から合成を開始しそして他の方向に進
行する熱安定性酵素も存在する。Ｎ製され比熱安定性＃
索は、例８においてさらに詳細に記載する。
この発明は、ｌ又は複数の核酸中に存在すると予想され
る任意の１又は複数の特定の核酸配列（１又は複数のヌ
クレオチド変化を含有するものとして定義される）を増
幅するための方法に開けられる。
一般に、この発明の方法は、用いられる反応段数に対し
て指数酌量において少なくとも１つの特定の核酸配列を
生成せしめる連鎖反応を用い、この場合（ｃ）所望の配
列の末端がそれらにノ・イブリダイズするオリゴヌクレ
オチドを合成することができるために十分に詳細に知ら
れていること、及び（ｂ）連鎖反応を開始するために少
量の配列が利用できることが条件となる。連鎖反応の生
成物は使用される特定のプライマーの末端に対応する末
端を有する個別の核酸ディニブレックスである。
検出されるべき配列を含有することが予想される限Ｆ）
、ｎＨされているか又は未精製の形のあらゆる核酸を出
発核酸として使用することができる。
従りて、この方法は例えばＤＮＡ又はＲＮＡ　、例えば
メツセンジャーＲＮＡを用いることができ、このＤＮＡ
又はＲＮＡは単鎖でも２本鎖でもよい。さらに、各１本
鎖を含有するＤＮＡ−ＲＮＡバイブリドｄ用することが
できる。これらの核酸のいずれかの混合物も使用するこ
とができ、又は同一のもしくは異るプライマーを用いる
前ハイツリダイセーフ１フ反応から調製された核酸を使
用することもできる。増幅されるべき特定の核酸配列は
よシ大きな分子の部分でもよく、又は特定の配列が完全
な核酸を構成するように初めから個別の分子として存在
することもできる。
増幅されるべき配列が最初から純粋な形で存在する必要
はなく、複雑な混合物の小部分、例えば全ヒ）　ＤＮＡ
中に含まれる小部分、又は特定の生物学的サンプルの非
常に小さい部分を構成する特定の微生物に基く核酸配列
の部分であってもよい。
出発核酸は、同一であるか又は異る１以上の特定の核酸
配列を含有することができる。従って、この方法は多量
の１つの特定の核酸配列の製造のためのみならず、配列
中に１個よシ多くの塩基対変化が存在する場合には同−
又は異る核酸分子上に位置する１櫨類よシ多くの異る特
定の核酸配列を四時に増幅するためにも有用である。
任意の起原から、例えばｐＢＲ３２２のごときグラスミ
ドから、クローン化されたＤＮＡもしくはＲＮＡから、
又は細菌、酵母、ウィルス、オルガネラ、及び植物もし
くは動物のごとき高等生物を含むあらゆる起原からの天
然ＤＮＡもしくはＲＮＡから、核酸を得ることができる
。ＤＮＡ又はＲＮＡは、種々の技法、例えばＭａｎｉａ
ｔｉｓ等、Ｍｏｌ＠ｅｕｌａｒＣＩｏｎｉｎｇ（１９８
２）＝２８０−２８１により記載されている技法により
、血液、組織材料、例えば絨毛又は羊膜（もしくは羊水
）細胞等から抽出することができる。
細胞を低張緩衝液中に懸濁しそして約９０〜１００℃に
て細胞溶解又は細胞内成分の分散が起こるまで加熱した
場合、核酸を精製することなく細胞を直接使用すること
ができる。加熱段階の後、増幅試薬を溶解した細胞に直
接添加することができる。この直接細胞検出法は末梢血
リンパ球及び羊膜（羊水）細胞に対して使用することが
できる。
この発明の方法により任意の特定の核酸配列を増幅する
ことができる。必要なことは、配列の両端の十分な数の
塩基が十分に詳細に知られておシ、その結果、１つのプ
ライマーから合成された延長生成物が、それがその鋳型
（相補体）から分離された場合に、規定された長さの核
酸への他のプライマーの延長のための鋳型として機能し
得る様に所望の配列上の相対位置において該配列の異る
鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドを調
製することができることのみである。配列の両端の塩基
についての知識が多くなるに従って標的核酸配列に対す
るプライマーの特異性を一層大きくすることができ、そ
してそれ故にこの方法の効率を一層高めることができる
。
今後使用する″ブライマー１なる語は、増幅されるべき
断片の末端配列に関する情報に幾らかのあいまいさが存
在する場合特に、１種類よシ多くのプライマーを意味す
ることができる。例えば、核酸配列が蛋白質配列情報か
ら推定される場合、遺伝コードの縮重に基く可能性ある
すべてのコドンの多様性を代表する配列を倉むプライマ
ーの果合が各錘について使用されよう。この集合中の１
つのプライマーが増幅されるべき所望の配列の末端と相
同であろう。
任意の適当な方法、例えばヌクレオシド誘導体からの核
酸の有機合成を用いてオリゴヌクレオチドプライマーｆ
ｔ調製することができる。この合成は溶液中で又は固体
支持体上で行うことができる。
有機合成の１つのタイプはホスホトリエステル法であり
、この方法は遺伝子断片又は短い遺伝を調製するために
すでに使用されているものである。　　　　−ホスホト
リエステル法においては、オリゴヌクレオチＰが合成さ
れ、これは次により長い核酸を形成するために連結され
得る。この方法の記載についてはＮａｒａｎｇ　Ｓ、Ａ
、等、Ｍ＠ｔｈ−Ｅｎｚｙｍｏｌ、Ｃ６８，９０（１９
７９）、及び米国特許Ｎｏ。
４．３５６．２７０ｔ−参照のこと。この特許はンマト
スクチン遺伝子の合成及びクローニングを記載している
。
有機合成の第２のタイプはホスホジエステル法であり、
この方法はｔＲＮＡ遺伝子のｐｌ製の次めに使用されて
いる。この方法の記載についてはＢｒｏｗｎ、　Ｅ、Ｌ
、等、Ｍｏｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、ｅ　６８１１０９
（１９７９）を参照のこと。ホスホトリエステル法の場
合と同様、このホスホジエステル法はオリゴヌクレオチ
ドの合成を含み、このオリゴヌクレオチドは次に所望の
核ｃＩＲ，を形成するために連結される。
これらの方法の自動化された態様を用いることもできる
。１つのこの様な自動化された態様においてに、出発材
料としてジエチルホスホラミダイトが使用され、そして
Ｂｅａｕｃａｇｅ等、Ｔ＠ｔｒａｈｅｄｒｏｎ−Ｌｅｔ
ｔｅｒａ　（１９８１）　Ｃ２２：１８５９−１８６２
により記載されている様にして合成される。修飾された
固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための１
つの方法は米国特許Ｎｏ、　４，４５８，０６６に記載
されている。生物超厚から単離されたプライマー（例え
ば、制限工／ドヌクレアーゼ消化物）ｔ−使用すること
もできる。
特定の核酸配列が、鋳型としてその配列を含む核酸を用
いて製造される。核酸が２本の鎖を含む場合、鈑核酸を
鋳覆として使用する前に、プライマー延長生成物の合成
と同時に又は別の段階として、該核酸の鎖を分離する必
要がある。この鎖分離は物理的手段、化学的手段、又は
酵素的手段金倉む任意の適当な変性法により達成するこ
とができる。核酸の鎖を分離するための１つの物理的方
法は、核酸が完全に（９９％以上）変性するまでそれを
加熱することを含む。典型的な熱変性は約１〜ｌＯ分間
にわたる約８０℃〜１０５℃の温度を用いる。鎖分離は
一！之、ヘリカーゼ（ｈｅｌｌｅａ−６）群の酵素、又
はへりカーゼ活性を有しそしてＩＪ　ｙｌ＝”ＡＴＰの
存在下でＤＮＡ　ｔ−変性することが知られている酵素
ＲｅｅＡによって誘導することもできる。ヘリカーゼを
用いて核酸の鎖を分離するために適当な反応条件はＫｕ
ｈｎ　Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｌｎｇ、　Ｃ８）［
−により記載されており、そしてＲｅ　ｃＡを用いる技
法はＣ，Ｒａｄｄｉｎｇｅ　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅ
ｎ＠ｔｉｃｓ、　１６：４０５−３７（１９８２）に総
説されている。
増幅されるべき配列変化を含有するものとの核酸が単鎖
であれば、それに１又は２ａ類のオリゴヌクレオチドブ
ライマーを添加することによりその相補体を合成する。
適切な１個のプライマーを加えれば、該プライマー、重
合のための試渠及び下記の４種類のヌクレオチドトリホ
スフェートの存在下でプライマー延長生成物が合成され
る。この生成物は前記単鎖核酸に対して部分的に相補的
であυ、そして該核酸鎖とハイブリダイズして異る長さ
の鎖から成るデュプレックスを形成する。
これは次に、上記の様にして単鎖に分離されて２本の分
離された相補的単鎖を生成する。他の方法として、２櫨
類の適切なプライマーを単鎖核酸に加え、そして反応を
行うことができる。
もとの核酸が増幅されるべき変化を含む全体配列ｔ−ｍ
成する場合、生成するプライマー延長生成物はもとの核
酸の鎖に完全に相補的であり、そしてそれとハイブリダ
イズして同じ長さの鎖から成るデュプレックスを形成し
、これが単鎖分子に分離されるであろ９゜ 核酸が最初に２本鎖であっても１本鎖であっても、核酸
の相補重鎖が分離される場合、七の鎖は追加の核酸鎖の
合成のための鋳盤として容易に使用される。この合成は
、任意のＡ当な方法を用いて行うことができる。これは
一般に、緩衝化された水性溶液中で、好ましくは７〜９
の声、最も好ましくは約ｐＨ８において起こる。好まし
くは、一定モル過剰の（クローン化ＤＮＡについては通
常１０００：１−プライマー：鋳型であり、そしてゲノ
ム核酸についてはおよそ１０’：１＝グライマー二鋳を
である）２ｍ類のオリゴヌクレオチドプライマーを、分
離された鋳型鎖を含有する緩衝液に加える。しかしなが
ら、診断用途のためにこの方法が使用される場合相補鎖
の量がわからず、従りて相補鎖の量に対するプライマー
の量を正確に決定することはできないことが理解されよ
う。しかしながら実際問題として、増幅されるべき配列
が複雑な長鎖核酸鎖の混合物中に含まれる場合、添加さ
れるプライマーの量は相補鎖（５ｓ型）の量に対してモ
ル過剰であろう。方法の効率を改良するため、大モル過
剰が好ましい。
デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートｄＡＴＰ　
ｖ　ｄＣＴＰ　−ｄＧＴＰ及びＴＴＰ４ＪＡ当な量にお
いて合成混合物に加え、そして得られる混合物を約９０
℃〜１００℃にて約１〜１０分間、好ましくは１〜４分
間加熱する。この加熱期間の後、溶液を室温に放冷する
。これはプライマーハイツリダイゼーションのために好
ましい。この冷却された混合物に重合のための試薬を添
加し、そして当業界において知られている条件下で反応
を行う。
この合成反応は、室温からそれよシ高温においては誘導
剤がもはや効率的に機能しなくなる温度までの範囲にお
いて起こる。従りて例えは、重合剤としてＥ、コリＤＮ
Ａ　Ｉｆ！リメラーゼを使用する場合、温度は一般に約
４０℃よシ高くない。最も好ましくは、反応は室温にお
いて起こる。
ヌクレオチドトリホスフェートの重合のための試薬は、
プライマー延長生成物の合成達成するために機能する任
意の化合物又は系、例えば酵素である。この目的のため
の適当な酵素には、例えばＥ、コリＤＮＡポリメラーゼ
１％ｇ−コリＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｖ断面
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手可能なりＮＡポリ
メラーゼ類、逆転写酵素、及び他の酵素、例えば各核酸
鎖に相補的であるプライマー延長生成物を形成するため
に適ｉな態様でのヌクレオチドの結合を促進する熱安定
性酵素が含まれる。一般に、合成は各プライマー〇３沫
゛端から始まシそして合成が停止するｉで鋳塁鎖にそっ
て５′方向に進行し、異る長さの分子を生成せしめる。
しかしながら、上記と同じ方法を使用して５′から合成
を開始しそして他の方向に進行せしめる重合剤も存在す
る。
新しく合成された鎖、及びその相補的核酸鎖は２本鎖分
子を形成し、これはこの方法の後続の段階で使用される
。次の段階において、前記の任意の方法を用いて２本鎖
分子の鎖を分離し、単鎖分子を得る。
単鎖分子上で新たな核酸が合成される。上記の条件下で
反応が進行するために必要であれば、重合のための追加
の試薬、ヌクレオチド及びプライマーを添加することが
できる。やはシ、合成はオリゴヌクレオチドプライマー
の一端から始シそして鋳型の単鎖にそって進行して追加
の核酸を生成するであろう。この段階の後、延長生成物
の半数は２つのプライマーにより挾まれた特定の核酸配
列から成るであろう。
鎖分離の段階及び延長生成物の合成の段階を、所望量の
特定の核酸配列を生成せしめるのに必要な回数反復する
ことができる。後でさらに詳細に記載する様に、生成す
る特定の核酸配列の量は指数的に貯積するであろう。
最初の核酸又は核酸混合物から１Ｍｉ類よシ多くの特定
の核酸配列を製造する事が望まれる場合、適切な数の異
るオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。例えば、２
ａ［類の異る特定の核酸配列を製造する場合、４種類の
プライマーを用いる。２種類のプライマーは特定の核酸
配列の１つに対して特異的であり、そして他の２ｍｍの
プライマーは第２の特定の核酸配列に対して特異的であ
る。
こうして、この発明の方法により２植類の異る特定の配
列を指数的に製造することができる。
この発明の方法は、各段階の後に新たな試薬を加えなが
ら段階的に行う゛ことができ、あるいはすべての試薬を
最初の段階で加えて同時的に行うことができ、ある＾は
また一定数の段階の後に新たな試薬を加えながら半段階
的半同時的に行うことができる。熱感受性酵素の場合の
様に誘導剤を不活性化する鎖分離法、例えば加熱を用い
る場合、各鎖分離段階の後に重合剤を補充する必要があ
る。
鎖分離段階のために酵素的手段が使用される場合、同時
法を用いることができる。同時法においては、反応混合
物は、所望の配列を含有する核酸鎖のほかに、鎖分離酵
素（例えばヘリカーゼ）、鎖分離酵素のための適当なエ
ネルギー源、例えばｒＡＴＰ　。
４撫類のヌクレオチド、モル過剰量のオリゴ９ヌクレオ
テドグライマー、及び誘導剤、例えばＥ、コリＤＮＡポ
リメラーゼＩのＫｌｅｎｏｖｒ断片を含有するであろう
。
同時法において変性のために熱を使用する場合、その温
度において核酸が平衡状態の単鎖と２本鎖とから成るよ
うな上昇した温度、重合剤に依存して好ましくは６５℃
〜９０℃において機能し得る熱安定性酵素、例えば熱安
定性ポリメラーゼを使用することができる。よシ短い核
酸のためには、約５０℃というよシ低い温度を使用する
ことができる。上方温度は、その温度で＃素が破壊され
るような温度、又はそれよシ高温においては不十分なレ
ベルのプライマーハイツリダイゼーションが起るような
温度に依存するであろう。この様な熱安定性酵素は例え
ばＡ、Ｓ、　Ｋａｌ＠ｄｌｎ等、Ｂｌｏｋｈｉｍｉｙａ
　、４５　、６４４−６５１　（１９８０）により記載
されている。すべての試薬が最初から存在するにもかか
わらず、この方法の各段階は逐次的に起こるであろう。
必要に応じて追加の材料を添加することができる。所望
量の特定の核酸配列を生成せしめるのに適当な時間が経
過した後、任意の既知の方法により酵素を不活性化する
ことにより、又は反応の成分を分離することにより反応
を停止せしめる。
熱安定性酵素を用いる他の方法においては、段階（＆）
においてプライマー、酵素及びヌクレオチドトリホスフ
ェートを核酸す／プルと接触せしめる。
段階（ｂ）においてこの混合物を前記酵素と接触せしめ
る。段階（ｃ）において、この混合物音、効果的な＋潟
曲ｌｆ枳４−イ　）２イ内鰺４具小掻腫ル！εプｈ１）
！て増幅されるべき６異る配列について各核酸鎖鋳凰に
対して相補的である各プライマーの延長生成物を合成す
るためには効果的であるがしかし各延長生成物をその相
補鎖から分離する程には高くない温度において加熱する
。
段階（ｄ）においては、前記の混合Ｗを、プライマー延
長生成物をそれらがその上で合成された鋳型から分離し
て単鎖を生成せしめるのに効果的な時間にわたってそし
てその様に効果的な温度において、しかし酵素を非可逆
的に変性せしめる程高くない温度において加熱する。段
階（６）においては、前記混合物を、段階（ｄ）におい
て生成した各単鎖分子への各グライマーハイツリダイゼ
ーションヲ促進するために効果的な時間にわたって、そ
してその様に効果的な温度に冷却する。最後に、或ＩＳ
ｔ＃（ｆ）において、前記混合物を、酵素の活性を促進
しそして増幅されるべき６共る配列について段階（ｄ）
において生成した６核ば＠鋳型に対して相補的である各
プライマーの延長生成物を合成するために効果的に基間
ＦＣ−１−ｒか。で、そ１−でその櫓に効果的た温度に
おいて、しかし各延長生成物をその相補鎖締屋から分離
する程には高くない＠度において加熱する。この場合、
段階（ｃ）及び（１）は同時に行うこともでき、又は逐
次的に行うこともできる。
以下余白 この発明の方法において使用することができる好ましい
熱安定性酵素はサーマス・アクアチヵス（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ　ａｑｕａｔｌｃｕｓ）から抽出されそして精製され
、そして約８６，０００〜９０，０００ダルトンの分子
量を有する。この酵素は、例８においてさらに詳細に記
載する。
この発明の方法は連続的に行うことができる。
熱安定性酵素を使用するこの発明の自動化された方法の
１つの好ましい態様においては、変性領域、ブライマー
アニーリング領域及び反応領域を通じて反応を循環せし
める。他の態様においては、ノライマー延長生成物の合
成のために使用される酵素をカラム中に固定化すること
ができる。他の反応成分をボンデにより直列のカラム及
び加熱コイルを通して連続的に循環せしめることができ
、こうして、酵素を不活性化することなく、生成した核
酸を繰シ返し変性せしめることができる。
熱安定性酵素を使用せずそして１度を上げ下げする１つ
の好ましい態様においては、そのための１つの装置とし
てこの発明の増幅反応を取り扱うための自動化された機
械を使用する。要約すれば、この装置は、第一受器に調
節された温度において貯蔵された酵素の第二受器への液
体輸送を行うためのコンピューター制御された液体取扱
系を用いており、該第二受器の温度は一定のインキュベ
ーションプロフィールに合致する様に制御される。
第二受器は増幅されるべき核酸配列並びにヌクレオチド
トリホスフェート類及びプライマーを貯蔵する。コンピ
ューターは、増幅過程の種々の段階の特徴、例えばイン
キュページ、ンの時間及び温度、輸送すべき酵素の量等
を制御するグロセス・母ラメーターを使用者が入力する
ためのインターフェースを有する。
熱安定性酵素の使用の友めに特に適合した好ましい機械
は、いずれのサイクルにおいても酵素を輸送する必要が
ないために液体取扱系を伴わない温度循環ヲ用いる。要
約すれば、この装置は次の系から成る。
１、　ヌクレオチドトリホスフェート、プライマ定数の
チューブ、好ましくは５００μｌｆユープを保持するた
めの熱伝導性容器。
２、前記熱伝導性容器を室温よシ高温又は低温に加熱し
、冷却し、そして維持するための手段。
この手段は該容器が加熱され、冷却され又は維持される
温度を制御する友めの制御シグナルを受理するための入
力部を有する。（これは、トレンド７　、　Ｎ、Ｊ、の
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｌｃａ　Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できるＰｅ
１ｔ１＠ｒヒートポング、又は水熱交換器であることが
できる。）３、前記手段の入力部に接続され念コンビ、
−タ一手段（例えば、マイクログロセ、サー・コントロ
ーラー）であって、増幅過程、温度レベル、及び温度勾
配及び持続時間を自動的に制御するシグナルを発生させ
るためのもの。
次に、増幅工程を模式的に記載する。相補的な鎖〔Ｓ＋
）及び［８）を含んで成る所望の配列〔Ｓ〕を含有する
２本鎖ＤＮＡが核酸として使用される。第１の及びこれ
に続く各反応サイクルの間、もとの畑荊Ｉ−予め久小ｌ
ゴ０望〃レナ手？プライマーの柾長が、プライマーの１
つのみにより停止する無限長の新しい５ｓＤＮＡ分子生
成物を生成する。今後１長生成物”と称するこれらの生
成物は直線的に蓄積するであろう。すなわち、ある数の
サイクルの後に存在する量がサイクル数に比例するであ
ろう。
こうして生成された長生酸物は、その後のサイクルの間
一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型と
して機能し、そして所望の配列〔Ｓ＋：ｌ又は（：Ｓ−
）の分子を生成するであろう。これらの分子もまた、一
方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型とし
て機能してさらに〔Ｓ”：１及び［Ｓ”−）ｔ−生成し
、そしてそれ故に、サイクル数に対して指数的速度での
〔Ｓ〕の蓄積をもたらすである夛−反応が継続され得る
。
意図されるオリゴヌクレオチドノーイプリダイゼーシ、
Ｊ７以外のオリゴヌクレオテドノ１イプリダイゼーショ
ンにより生成される副産物は自己触媒的ではなく、そし
てそれ故に直線的速度で蓄積する。
以下余白 １つのブライマーのオリゴ０ヌクレオチド配列で停止す
る６鎖及び他方の相補鎖は生成することが所望される特
定の核酸鎖（Ｓｌであることがわかる。
この工程の段階は無限に反復することができ、ブライマ
ー１及び２、誘導剤及び存在するヌクレオチドによって
のみ限定される。もとのヌクレオチドは複製されないの
で、その瞼は全工程を通じて一定に維持される。長生酸
物はもとの核酸からのみ生成されるのでその量は直線的
に増加する。
特異的配列の量は指数的に増加する。すなわち、特異的
配列は支配的な種となる。これは次の表に示される。こ
の表は、各サイクルの効率を１００チとして、ｎサイク
ル後に存在する種の相対ｆｔ−示す。
以下全白 ０〜ｎサイクル後の２本鎖の数 Ｏｌ　　　　　　　　−− １５１１５３２，７５２ ２０１２０１，０４８，５５５ ｎ　　　　　　１　　　　　　ｎ　　　　（２”−ｎ−
１）鋳型として単鎖ヌクレオチドが使用される場合、サ
イクル当り１個のみの長生酸物が生成する。
この反応のサイクルの必要回数は例えばサンプルの性質
に依存するであろう。分析されるべきサンプルが純粋で
あれば、より少いサイクル数で足９よう。サンプルが核
酸の複雑な混合物である場合、シグナルをこの発明の方
法により検出するのに十分に増幅する友めにはより多く
のサイクルが必要であろう。ヒトーｒツムＤＮＡについ
ては、明瞭な検出可能なシグナルが生成するように十分
に配列を増幅するため（すなわちパックグラウンドノイ
ズが検出を妨害しないため）、好ましくは１５〜３０サ
イクルを行う。
この発明の１つの態様においては、配列変化を含むこと
が予想される増幅されたサンプ／Ｉ／ｆ、それが癌、感
染性疾患、遺伝病、又は正常な遺伝的条壁（−リモルフ
イズム）のいずれに由来するものであっても、一連の膜
に直接スポットし、そして各層を異るラベルされた配列
特異的オリゴヌクレオチドゾロープとハイブリダイズせ
しめる。す／ノル′（Ｉ−Ｈにスポットするための１つ
の方法はＫａｆｏｔｏｓ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　＋　７　＋１５４ｉ−１５２２
（１９７９）に記載されている。
要約すれば、プローブの添加に先立って、ドデシル硫酸
ナトリウム、フィコール、血清アルブミン及び種々の塩
を含有するー・イブリダイゼーシ胃／溶液で前処理する
ことによりＤＮＡサンプルを膜に固定する。次に、検出
されるべき各配列に特異的なラベルされ九オリゴヌクレ
オチドプローブを、ブレハイプリダイぜ−ション溶液に
類似するハイブリダイゼーション溶液に加える。ハイプ
リダイぜ−シ１ノ溶液を膜に適用し、そして膜をハイブ
リダイゼーション条件にかける。この条件はプローブの
タイプ及び長さ、成分のタイプ及び濃度等に依存するで
ろろう。一般に、ハイブリダイゼーシヨ／は約２５℃〜
７５℃、好ましくは３５℃〜６５℃において０．２５〜
５０時間、好ましくは３時間未満にわたって行う。条件
のストリンジエンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｍｃｙ）が大に
なるに従ってプローブとサンプルの間のハイブリダイゼ
ーションのために要求される相補性が大になる。バック
グラウンドのレベルが高い場合、従ってストリンジエン
シーが増加されるであろう。ストリンジエンシーはまた
洗浄とも関連する場合がある。
ハイブリダイゼーションの後、任意の適当な手段を用い
て、例えば種々の濃度の標準塩リン酸塩ＥＤＴＡ溶ｇ　
（ＳＳＰＦＪ）（１８０ｍＭＮａＣ２，１０ｍＭ　Ｎａ
Ｃ４゜１０　ｍＭ　ＮａＨＰＯ４及びＩ　Ｍ　ＥＤＴＡ
　、　ｐＨ７，４）により１回又は複数回、２５℃〜７
５℃にて、温度に依存して約１０分間〜１時間、サンプ
ルを洗浄してハイブリダイズしていないプローブを除去
する。次に、任意の適当な検出手段によりラベルを検出
する。
この発明において用いられる配列特異的オリゴヌクレオ
チドは、プライマーの調製及び選択について前記したの
と一般的に同様にして調製されそして選択されたオリゴ
ヌクレオチＰである。配列特異的オリゴ９ヌクレオチド
は検出されるべきヌクレオチド変化をまたぐ配列の領域
を包含しなければならず、そして検出されるべきヌクレ
オチド変化に特異的でなければならない。例えば、サン
プルが鎌形赤血球貧血の変異を含有するか否かを検出す
ることが所望される場合には、正常なβ−グロビン遺伝
子に特異的なヌクレオチド配列部位を含有する１つのオ
リゴヌクレオチドが調製され、そして鎌形赤血球貧血対
立遺伝子に特異的なヌクレオチド配列を含有する１つの
オリゴヌクレオチドが調製されよう。各オリゴヌクレオ
チドを同じサングルの複製物に・・イブリダイズせしめ
て、サングルが変異を含有するか否かを決定する。
ＨＬＡクラスＨの冬型性領域は第２エクンンの特定の領
域に位置し、セして保存された配列に挟まれており、従
って第２エクソンの保存された５′及び３′末端の相対
する鎖に対して相補的なオリゴヌクレオチドブライマー
を調製することができる。
ＨＬＡクラス■遺伝子の冬型性領域の検出のために使用
されるオリゴ９ヌクレオチドの数は遺伝子のタイプに依
存するであろう。この遺伝子は、密集しているか又は分
かれて分布している塩基対変異の領域を有する。この領
域がＨＬＡ−ＤＱαの場合のように密集しておれば各対
立遺伝子のために１つのオリゴヌクレオチＰが使用され
る。ＨＬＡ−ＤＱβ及びＨＬＡ−ＤＲβの場合のように
この領域が分かれて分布しておれば、対立遺伝子変化を
それぞれが含むＬ種類より多くのプローブが各対立遺伝
子のために使用されよ゛う。ＨＬＡ−ＤＱβ及びＨＬＡ
−ＤＲβの場合、対立遺伝子変化が存在するであろう遺
伝子座の３つの領域のために３ａｔ類のプローブが使用
される。インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）に関連
する配列の検出のためには）ＬＡ−ＤＲβ第２エクンン
のために４種類のプローブが使用される。
家族における分離解析（ｓｅｇｒｏｇａｔｉｏｎ　ａｎ
ａｌｙｓｉｓ）から又は個体のＤＮＡサンプルの直接分
析からノ・プロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）を推定す
ることができる。
配列特異的オリゴヌクレオチドの特定の対立遺伝子組合
せ（・・グロタイｆ　’）−ｋ、ヘテロ接合細胞に分い
て、増幅に先立つｒツムＤＮＡの制限酵素消化を用いる
ことによって同定することができる。
例えば、ＤＱβに分いて１つの増幅された領域内に高度
に可変性の３つの亜領Ａ、Ｂ及びＣが見出される場合、
及び各領域に６つの異る配列（Ａｔ−６，８１−６，Ｃ
ｌ−６）が存在する場合、個体はＤＱβ遺伝子座におい
て配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ分析により、
ＡＩ、Ｂ２．Ｃ１：Ａｌ、Ｂ２．Ｃ４：Ａ２，８２．Ｃ
１：Ａ２．Ｂ２．Ｃ４：Ａｌ。
８３、Ｃ１：Ａｌ、Ｂ３．Ｃ４；Ａｌ、Ｂ２．Ｃ１：及
びＡＩ。
Ｂ２．Ｃ４の可能性あるノ・プロタイプの組合せのを伴
って、ＡＩ、Ａ２：Ｂ２．Ｂ３：Ｃ１，Ｃ４を含むもと
としてタイプ分けられ得るであろう。
もしゲノムＤＮＡが増幅に先立って条壁性制限醇素によ
り消化され、そしてもし該酵素がプライマー間の両対立
遺伝子を切断すれば、増幅が起こらないため特異的プロ
ーブとの反応性が存在せず、そして結果は情報に欠ける
。しかしながら、もし該酵素が１つの対立遺伝子のみを
切断すれば、消化されたＤＮＡ及び未消化ＤＮＡについ
てのプローブ反応性・奢ターンを比較することによｐ両
ノ・ゾロタイｆｆ推定することができる。
切断されていないゲノムＤＮＡ及び冬型性でありそして
プライマー間を認識することが知られている１櫨類又は
複数種類の酵素で切断されたｒツムＤＮＡと配列特異的
オリゴ９ヌクレオチドとの反応性を比較することにより
ノ為プロタイプを推定することができる。
配列特異的オリゴヌクレオチドの長さは多くの因子、例
、ｔば検出されるべき特定の標的分子、オリゴ９ヌクレ
オチドの超厚、及びヌクレオチド組成に依存するであろ
う。この発明の目的のｔめには、プローブは典型的には
１５〜２５ヌクレオチドを含有するが、より多数の、又
はより少数のヌクレオチドを含むこともできる。１９−
ｒｒｒｅｒ以上の長さのオリゴヌクレオチド特異性及び
／又は感度を増強するが、１９−ｍａｒよシ短かい、例
えば１６−ｍａｒのプローブが一層配列特異的な識別を
示し、これはおそらく１個のミスマツチが一層不安定に
するからであろう。増幅が特異性を増加し、よｐ長いこ
とが必須ではなくな９、セしてハイブリダイゼーション
及び洗浄の温度を同じ塩濃度に２いて低くすることがで
きるから、１９−ｍａｒより短いプローブを使用するこ
とが好ましい。
サン７’／Ｉ／をまず膜上に置きそして次にオリゴヌク
レオチドを用いて検出する場合、該オリゴヌクレオチド
は安定なラベル成分によってラベルされていなければ凍
らず、このラベル成分は分光的手段、光学的手段、生化
学的手段、免疫化学的手段、又は化学的手段により検出
される。免疫化学的手段は、適当な条件下でオリゴヌク
レオチドと共に複合体を形成することができる状体を含
み、そして生化学的手段は適切な条件下でオリゴヌクレ
オテＰと複合体を形成することができるポリペプチド又
はレクチンを含む。例えば、螢光色素、電子密度試某、
不溶性の反応生成物を沈？ａ＋！：しめることができる
かもしくは色発により検出され得る酵素、例えばアルカ
リ性ホスファターゼ、放射性ラベル、例えば　Ｐ、又は
ビオチンが含まれる。ビオチンを使用する場合、これを
オリゴヌクレオチドに付加するためにスペーサー金使用
することができる。
他の方法として、１つの“逆”ドツトプロ、ト方式に２
いては、少なくとも１種類のプライマー及ヒ／又は４種
類のヌクレオチドトリホスフェートの内の少なくとも１
種を検出可能なラベルによりラベルし、こうすることに
より生ずる増幅された配列をラベルする。これらのラベ
ルされた成分は最初に反応混合物中に存在することがで
き、又は後のサイクル中に添加される。次に、配列中に
変化が存在すれば増幅された核酸配列とノ％イプリダイ
ズすることができるラベルされていない配列４ν異的オ
リゴヌクレオチドを、前日己のゾレノ）イプリダイゼー
ション条件下で膜上にスポット（膜に固定）する。次に
、この前処理され九膜に増幅されたサンプルを前記のハ
イブリダイゼーション条ｒＬ下で加える。最後に、検出
手段を用いて、核酸サンプル中の増幅された配列が膜に
固定されたオリゴ９ヌクレオチドにハイブリダイズした
か否かを決定する。増幅生成物中に変化を含有する膜結
合配列が存在する場合のみ、すなわちプローブの配列が
増幅された起動のある領域に対して相捕的である場合の
みハイブリダイゼーションが起こるであろう。
”逆”ド、トプロ、ト方式の他の変法においては、前記
の“順″ドツトプロ、ト方式の場合の様にラベルを用い
ないで増幅を行い、ぞしてもし存在するとすれば変化を
含有する増幅された核酸配列とハイブリダイズすること
ができるラベルされた起動特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブを前記のプレハイブリダイゼーション条件下で膜
上にス・、２ツト（膜に固定）する。次に、この処理さ
れた一ジョン条件下で加える。次に、ラベルされたオリ
ゴヌクレオチド又はその断片を膜から放出して、サンプ
ル中の増幅された配列がラベルされたオリゴ９ヌクレオ
チドにハイブリダイズしたか否かを決定するために検出
手段を使用することができる様にする。例えは、この放
出は、プローブ中の制限部位１ｒ：認識することができ
る制限酵素を膜に加えることによって行うことができよ
う。オリゴマー制限として知られるこの方法は１９８５
年１２月１１日に公開されたＥＰ特許出願１６４，０５
４にさらに詳細に記載されている。
この発明の目的のため、検出され得る遺伝疾患は、あら
ゆる生物からの核酸例えばゲノムＤＮＡ中のあらゆる塩
基対変異又は長屋における特定の欠失、挿入及び／又は
置換を含むであろう。塩基対変化が知られている疾患の
例には鎌形赤血球貧血、ヘモグロビンＣ疾患１．α−サ
ラセミア、β−サラセミア等が含まれる。検出され得る
他の疾患には癌性疾患、例えばＲＡＳ発癌遺伝子、例え
ばｎ−ＲＡＳ発癌償伝子が関与する疾患、及び感染性疾
患が含まれる。
この発明の方法はまた１組織移植、疾患感受性及び父性
決定の分野におけるＨＬＡタイタイけのためにも使用す
ることができる。ＨＬＡ−ＤＲ，ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬ
Ａ−ＤＰ領領域らのα及びβ遺伝子から成るＨＬＡクラ
ス■遺伝子は高度に冬型性であり、ＤＮＡレベルにおけ
るこれらの遺伝的複雑さは血清学的タイプ分けによって
最近定義され九多型に比べて有意に大である。さらに、
この発明の方法は、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤ
Ｍ）と関連するＨＬＡクラス■β蛋白質（例えば、ＤＲ
β）をコードする幾つかのＤＮＡ配列を検出するために
使用することができる。要約すれば、次の配列： １）　　５’−ＧＡＧＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＣＴＧＡＧ
−３’２）　　５’−ＧＡＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＧＣ
ＴＴＣ−３’３）　　５’−ＣＣＴＧＴＣＧＣＣＧＡＧ
ＴＣＣＴＧＧ−３’４）　　５’−ＧＡＣＡＴＣＣＴＧ
ＧＡＡＧＡＣＧＡＧＡＧＡ−３’又はこれらに対して相
補的なりＮＡ鎖から成る群からＩＤＤＭに関連する４種
類のＤＮＡ配列を選択する。
これらの配列の１つ又は複数とハイブリダイズする配列
特異的プローブを調製する。
本発明はまた、使用される各プライマー及びプローブの
ための容器、プライマー延長生成物全合成するための重
合用試薬例えば酵素、４種類のヌクレオチド９のそれぞ
れのための容器、及びラベルを検出する手段〔例えば、
アビジノ醇素接合体及び酵素基質及び色原体（ラベルが
ビオチンであれば）〕を含む容器を有する−まとめにさ
れた多容器ユニットを含んで成るキットに関する。さら
に、このキットは、検出されるべきヌクレオチド変化を
有するｌ又は複数の核酸を含むプローブ用陽性対照、及
び検出されるべきヌクレオチド変化有する核酸を含有し
ないゾロープ用陰性対照を含む容器を有することができ
る。さらに、このキットはまた、サンプル中に含まれる
２本鎖ＤＮＡの鎖を分離するための手段、例えばヘリカ
ーゼ又は水酸化ナトリウムのための容器をも有すること
ができる。
下記の例は本発明の種々の具体例ｔ−説明するが、発明
の範囲を限定するものではない。例において、特にこと
わらない限り、すべての部及びチは固体については重ｆ
ｊｋＶｃ基き、そして液体については容量によ少、そし
て温度は℃で示す。
例１゜ この例は、鎌形赤血球貧血対立遺伝子（Ｓ）又はヘモグ
ロビンＣ疾患対立遺伝子（Ｃ）から正常対立遺伝子（Ｎ
）を識別するためにこの発明の方法をいかに使用するこ
とができるかを説明する。
次の２８ｉ類のプライマー： ５’−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ−３
’　（ＰＣＯ３）５’−ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧ
ＴＴＣＡＣＣ−３’　（ＰＣＯ４）を下記の方法により
調製した。これらのプライマーはいずれも２０−ｍａｒ
であり、ｒツムＤＮＡの相対する鎖に、１１０塩基対の
距離隔ててそれらの５′端でアニールする。
Ａ、自動合成法 って合成されたゾエチｙホスホラミダイトを、ヌクレナ
チドｆ謁虞伏イにされた聰節すれた菊ｎ矛］、のガラス
支持体に次々と縮合せしめた。この方法は、ゾクはロタ
タン中でのトリクロロ酢酸による脱トリチル化、活性化
プロトン供与体としてぺ／シトリアゾールを用いる縮合
、並びにテトラヒドロフラン及びピリノン中での無水酢
酸及びジメチルアミノピリジンによるキャ２ピング金含
む。サイクル時間は約３０分間でめった。各段階におけ
る収率は実質上定量的であり、そしてこれは脱トリチル
化後のジメトキシトＩＪチルアルコールの収集及び分光
測定により決定され九。
及び精製 固体支持体をカラムから取シ出し、そして室温にて４時
間、密閉チューブ中で１−の濃水酸化アンモニウムに暴
露した。次に、支持体を戸去し、そして部分的に保護さ
れたオリゴ０フＪオキシヌクレオチドを含有する溶液を
５５℃にて５時間置い九アンモニアを除去し、そして残
渣を分取用ポリアクリルアミドダルに適用した。電気線
Ｎｈｆ３０Ｖ／創にて９０分間行い、次に生成物を含有
する７４／ドを螢光プレートのＵＶシャドイングにより
同定した。バンドを切り出し、そして１−の蒸留水によ
り４℃にて一夜溶出した。この溶液をカラムに適用し、
そして１チ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６，０）中７
〜１３％のアセトニトリルのグラジェントにより溶出し
た。溶出液ｋ　２６０　ｎｒｎにおけるＵＶ吸収により
モニターし、そして適切な両分を集め、一定容量中のＵ
Ｖ吸収により定量し、そして真空遠心分離機中で室温に
て蒸発乾固せしめた。
Ｃ６オリゴデオキシリボヌクレオチドの特徴付は精製さ
れ九オリデヌクレオチドの試薬アリコートヲ、ポリヌク
レオチドキナーゼ及びｒ−ｐ−ＡＴＰにより　Ｐ−ラベ
ルした。ラベルされた化合換金、５０ｖ／ｃｎ４にて４
５分間の電気泳動の後１４〜２０％ポリアクリルアミド
ｒルのオートラジオグラフィーにより試験した。この方
法により分子量が確認される。ヘビ毒ジェステラーゼ及
び細菌アルカリ性ホスファターゼの使用によるオリゴ０
デオキシリ？ヌクレアーゼのヌクレオチドへの消化、並
びにこれに続く逆相）ＩＰＬＣカラム及び１０％アセト
ニトリル、１％酢酸アンモニウム移動相を用いるヌクレ
オチドの分離及び定量により、塩基組成を決定した。
■、セルラインからのヒトゲノムＤＮＡの単離高分子ゲ
ノムＤＮＡ　ｉリンパ系セルラインＧＭ２０６４から、
Ｍａｎｌａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌ
ｎｇ（１９８２，２８０−２８１）の方法と実質上同じ
方法を用いて単離した。Ｇ　Ｍ　２０６４　（Ｈｕｍａ
ｎ　ＭｕｔａｎｔＣ＠ｌｌ　Ｒｅｐｏａｉｔｏｒｙ　、
カムデｙ　、　Ｎ、Ｊ、）は元々、遺伝性高胎児ヘモグ
ロビン血症についてホモ接合性の個体から分離されたも
のであり、セしてβ−又はａ−グロビン遺伝子配列を含
有しない。このセルラインは１０％のウシ胎児血清を含
むＲＰＭＩ　−１６４０中に維持され九。
ＡＡ（既知の正常個体から）、ＡＳ（既知の鎌形赤血球
貧血キャリヤーから）、ＳＳ（既知の鎌形赤血球貧血個
体から）、ＳＣ（既知の鎌形赤血球貧血／ヘモグロビン
Ｃ疾患個体から）、及びＡＣ（既知のへ七グロビンＣ疾
患キャリヤーから）と称する５種類の臨床血液サンプル
をカリホルニア、オークランドのＣｈｉｌｄｒｅａｓ　
ＨｉｓｐｉｔａｌのＢｅｒｔｒａｍ　Ｌｕｂｌｎ博士か
ら得た。ＣＣ（既知のヘモグロビンＣ疾患個体から）と
称する１つの臨床サンプルを力リホルニア、サンフラン
シスコのＳａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　Ｇｅｎｅｒａｌ
　Ｈｏ５ｐｉｔａｌのＳｔｅｐｈｅｎＩｉｍｂｕｒｙ博
士から得た。
これらのサンプルの最初の５種類からのゲノムＤＮＡ１
．５ａｉｋｉ等、旧ｏｔ＠ｃｈｎｏｌｏｇｙ　、　３　
：　１００８−１０１２（１９８５）により記載されて
いる様にして、主として末梢血リンパ球から成るバフィ
ーコート画分から調製した。
■、増幅反応 ７個のＤＮＡサンプルのそれぞれからの１μｇのＤＮＡ
　（１００Ａｇ／ｒｓｔのＤＮＡの内１０μ＃）ｅ、Ｚ
ｏ。
ｍＭ　Ｔｒｉａ−ＨＯ２（Ｐ’７．５　）、５００　ｍ
Ｍ　ＮａＣ１及び１００　ｒｎＭ　ＭｇＣＬ２１＆：含
有する溶液１０μＪ：１０μＪの１０μＭプライマーＰ
ＣＯ３：　１０μ！０１０μＭグライマーＰＣＯ４；１
５／ｊＪの４０　ｍＭ　ｄＮＴｐ　１０　ｍＭずつの」
Ａ中Ｏａρ苧ＤＡｔ’−苧Ｄｎｙｃ中〒Ｄあ金子、１・
易γＣＡζμｌの水を含む１００　ｐｉの初発反応容量
中で増幅を行った。
ＤＮＡ　ｔ′変性せしめるため、各反応混合物ヲ９０℃
に設定したヒートブロック中で１０分間保持した。各Ｄ
ＮＡサンプルに２５サイクルのｋａ＠を行った。各サイ
クルは次の４段階を含む。
（１）　　マイクは遠心機中で短時間（１０〜２０秒間
）回転せしめて変性した材料をペレット濃縮しそして３
０℃に設定したヒートプロ、りにすぐに移し、プライマ
ーとゲノムＤＮＡとをアニールせしめ； （２）　　ｐｊ：、コリＤＮＡ　、ｔｌ’リメラーゼ１
のＫｌ＠ｎｏｖ断片にューイングランドビオラブス、５
ユニ、ト／μｍ　）　３９ｆｉｌ　：１００ｍＭ　Ｔｒ
ｉｍ（ｐＨ７，５）、５００ｍＭＮａＣＬ　１００　ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ２の塩混合物３９μｌ；並びに３１２μＥ
の水を混合することによってＡ製した溶液２μｌを添加
し； （３）３０℃にて２分間反応を進行せしめ：そして、 （４）サンプルを９５℃のヒートグロックに２分間移し
て新しく合成されたＤＮＡを変性せしめる（但し、この
反応は最終サイクルにおいては行わなｌＡ）。
最終反応容量は１５０μｌであり、そして反応混合物を
一２０℃にて貯蔵した。
次の配列： ５’−＊ＣＴＣＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣ−３
’　（Ｒ８１７）５’−”ＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡ
ＧＴＣＴＧＣ−３’　（Ｒ８１８）５’−”ＣＴＣＣ’
ｒＧＴＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣ−３’　（Ｒ８２１）
（配列中、＊はラベルを表わす） 含有するＲ８１７訊８１８及びＲ８２１と称する３種類
のラベルされたＤＮＡプローブを次の様にして調製した
。Ｒ８１Ｂは正常β−グロビン対立遺伝子（ｌＡ）に対
して相補的であり、Ｒ８２１は鎌形赤血球貧血対立遺伝
子（１ｍ）に対して相補的であり、そしてＲ８１７はヘ
モグロビンＣ疾患対立遺伝子（βＣ）に対して相補的で
ある。［４８１７及びＲ８２１は１個の塩基対によりＲ
８１Ｂと異る。ブライマー及びプローブの概略の相互関
係は次の通りである。
β−グロビン ＰＣＯ３Ｒ８１７ＰＣＯ４ Ｓ１８ Ｓ２１ これら３種類のプローブｔ−１項に記載した方法により
合成し九。７　Ｑ　ｍＭＴｒ１ｇ緩衝剤（ＰＩ（７，６
）、１０　ｍＭ　ＭｇＣＡ２．１．５　ｍＭスペルミン
、１００ｍＭジチオスレイトール及び水を含有する４０
μｌの反応溶量中で１０　ｐｍｏｌｅのプローブを４二
二、トノＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにューイングラ
ンドビオラブス）及び４０　ｐｍｏｌ＠の７　　Ｐ−Ａ
ＴＰにューイングランドニュクレアー、約７０００Ｃ１
／ｍｍｏｌｅ）と、３７℃にて６０分間接触せしめるこ
とによりプローブをラベルした。次に、２５ｍＭＥＤＴ
Ａにより全容量を１００μｌにし、そしてＭａｎｌｓｔ
ｉｓ等、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｌｎｇ　　
（１９Ｂ　２　　）ｔ４６６−４６７の方法に従って、
Ｔｒ　ｉ　５−ＥＤＴＡ（ＴＩ）緩衝液（１０ｍＭＴｒ
ｉ＠緩衝剤、０．１　ｍＭ　ＭＥＤＴＡ　、　ｐＨ８，
０）によυ平衡化された１−のビオ−１’５Ｐ−３（ビ
オラド）スピンダル透析カラム上で精製した。
反応生成物のＴＣＡ沈澱により、１１８１７について比
活性が５．２μＣ１／ｐｍｏｌｅであり、そして最終濃
度が０．１　ｉ　８　ｐｍｏｌｅ／μＪであることが示
された。Ｒ８１８について、比活性は４．６μＣ１／ｐ
ｍｏｌｅでおり、そして最終濃度は０．１１４　ｐｍｏ
ｌｓ／μｊであ−ＪｏＲ８２１については、比活性が３
．８μＣ１／ｐｍｏｌｅであり、そして最終濃度が０．
１１２　ｐｍｏｌｅ／μｊであることが示され九、 ■項からの１５０μｌの増幅されたサンプルのそれぞれ
から５μｌを１９５　ｐｇの０．４　Ｍ　ＮａＯＨ，２
５ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡで稀釈し、そしてＲｏｗｅｄ及びＭ
ａｎｎ　＋（１９８５）により開示されている様に°し
て、３枚の陽イオン性ナイロンフィルター上にスフＮ　
ｙトした。この方法は、まずフィルターを水で湿し、そ
してこれを所定位置に保持するドツトプロｙ）調エルｔ
−０，４ｍの２０ＸＳＳＰＥ（３，６ＭＮａＣＡ、２０
０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ　）です
すぐことにより実施した。次にフィルターを取り出し、
２ＯＸＳＳＰＥ中ですすぎ、そして真空オープン中で８
０℃にて３０分間加熱（ベーキング）した。
加熱の後、５ｘｓｓｐａ、ｓｘデンハート溶液（Ｉ　Ｘ
＝０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％）（コ
ール、０．０２チウシ血清アル！ミン、０．２ｍＭ　Ｔ
ｒ　ｉｓ　・ＨＣｌ　、　０．２　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、
　ｐＨｓ、ｏ　）及び０．５１％ＳＤ８を含有するハイ
ブリダイゼーション溶液６−と接触せしめ、そして５５
℃にて６０分間インキ、　ぺ−）Ｌ次。次に、５μｌず
つのプローブＲ８１７゜Ｒ８１８及びＲ８２１をハイブ
リダイゼーション溶液に加え、そしてフィルターを５５
℃にて６０分間インキュベートした。
最後に、各ハイブリダイズしたフィルターを１００−の
２　Ｘ　５ＳＰＥ及び０．１チＳＤＳにより２回室温に
て１０分間洗浄した。Ｒ３１７の第３洗浄として。
２５０ｍの５　ｘ　５ｓｐＥ及び０．１　％　ＳＤＢを
加え、そし／−＃、　＋、　Ｊ　　＜−ｅ！　ｅ−Ｉｒ
イー１１　朋＋ｎ　ｊｈ＆　Ｉ　−１ｍＲ８１８及び２
１については、フィルターを２５０ｍ１の４　Ｘ　５Ｓ
ＰＥ及び０．１％ＳＤＳにより５５℃にて５分間処理し
た。５５℃での４　Ｘ　５ＳＰＥは十分なストリンジエ
ンシーがないため、Ｒ８１８及びＲ８２１についてはわ
ずかなパックグラウンドが存在した。Ｒ８１８及びＲ８
２１についての洗浄は２５０−の５　Ｘ　５ＳＰＥ及び
０．１　％　ＳＤＳ中で５５℃にて３分間行った。ノ４
、フグ２クント９に変化はなかつ次。５ＸＳＳＰＥを用
いて６０℃にて１分間洗浄を反復し、そして同じストリ
ンジエンシーの追加の洗浄ｔ−３分間行った。
これによりバ、フグラウンドが実質的に無くなった。９
０分間のオートラジオグラフィーの後、遺伝子型が容易
に現われた。
対立遺伝子特異的β−グロビンプローブＲ８１Ｂ。
Ｒ８２１及びＲ８１７とハイブリダイズせしめた７個の
増幅されたｒツムＤＮＡサンプルのト９．ドブロットの
オートラジオダラムを１２時間後に分析した。
陰性対照ＧＭ２０６４　ｔ−含めた。この結果は、各対
立遺伝子特異的プローブはそれが完全にマツチするβ−
グロビン対立遺伝子のコピー少なくとも１個ヲ有スるＤ
ＮＡサンプルにのみアニールしたことを示した。例えば
、β１−特異的プローブＲ８１８はす／ゾルＡＡ（β”
ＡＡ）、Ａｓ（β”β８）、及びＡＣ（β１βＣ）との
みハイブリダイズし九。
例２゜ ドツトプロットによる検出の最低レベルを決定するため
、！２８．６４．３２，１６．８．４．２及びｌｎＨの
正常ｒツムＤＮＡ−１含有する８個の一連の稀釈換金サ
ンプルＡＡから調製し、そして例１に記載した様にして
２５サイクルの増幅にかけた。
対照として、例１のＡＡ及びＳＳからの増幅されたサン
プルを同様に稀釈した４、 合計７５μｌ（半分）の各サンプルを１２５μＥの０．
６５　Ｎ　ＮａＯＨ及び２５　ｍＭ　ＥＤＴＡと混合し
、そしてこの混合物をナイロンフィルターに適用した。
次に、このフィルター’ｋ　２０　Ｘ　５ＳＰＥ中です
すぎ、そして８０℃にて３０分間加熱（ベーキング）し
た。
次に、フィルターを例１に記載した様にしてＲ８１８（
β１ゾローグ）によりプローブして検出限界を決定した
。グレハイプリダイゼーショ７溶液１ｄ。
８−の５ＸＳＳＰＥ、５Ｘデンハート溶液、０．５％Ｓ
ＤＳ　（５５℃、４０分間）であジ、そしてハイブリダ
イゼーション溶液は前記溶液＋１０μＥのＲ８１８（５
５℃にて８０分間）であった。次に、フィルターｔ−２
Ｘ５ＳＰＥ　、　０．１チＳＤＳにより室温にて１０分
間２回、そして次にｓｘｓｓｐｇ　、　０．１　％ＳＤ
Ｓにより６０℃にて３分間洗浄した。
Ｒ８１８とのハイブリダイゼーションの後に１７時間の
暴露の後に得られたオートラノオグラムはＡＡＤＮＡを
含有するすべてのサンプルにおいて陽性シグナルを示し
た。ＳＳサンプルは１７時間後に可視化されたが、６４
℃ｇＳ８の強度はｌｎｇＡＡの強度と同じであり、これ
は６４：１のシグナル＝ノイズであった。０．５ｎｇス
ポ、ト中に存在するシグナルの強度は、ｌｎｇより実質
的に少い量を含有するサンプルの増幅が可能であること
を示唆した。
（１ナノグラムは１５０個のディグロイド細胞中に存在
するｒツムｏＮＡｏ：ｉである。）以下余白 例３゜ ＤＱα第２エクソンの保存された５′及び３′末端の相
対する鎖に対して相補的なＧＨ２６及びＧＨ２７と称す
るオリゴヌクレオチドを２４０塩基対断片を増幅するた
めのプライマーとして使用した。次の配列： ５　’−ＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧＴ
ＡＣＣＡＧ−３’　（ＧＨ２６）５’−ＣＡＣＧＧＡＴ
ＣＣＧＧＴＡＧＣＡＧＣＧＧＴＡＧＡＧ’ｒＴＧ−３’
（ＧＨ２７）を有するプライマーを例１に記載した様に
して調製した。
対立遺伝子変異体にグループ化される種々の超厚からの
ＨＬＡ−ＤＱα配列の分析に基いて、各変異を含むＤＱ
α第２エクソンの可変領域からの下記のプローブを例１
に記載した様にして合成し、そしてラベルした。ｆ（Ｌ
Ａ−ＤＱαの第２エクソン（エクソン■と称する）の２
つの可変領域、すなわちセグメン）Ａ及びＢ’ｉｉ１表
に示す。プライマ−（ＰＣＲ→により示す）、プローブ
及びＨＬＡ−ＤＱα配列の完全な相互関係を第２表に示
し、そしてここで使用しているアミノ酸省略記号を第３
表に示す。
以下仝白 第３表 アミノ酸省略コード アラニア　　　　　　Ａｌａ　　　　　Ａアルギニン　
　　　　Ａｒｇ　　　　　Ｒアスノ母うギン　　　　Ａ
ｓｎ　　　　　Ｎアスノ母うギン酸　　　Ａｓｐ　　　
　　Ｑシスティン　　　　　Ｃｙｓ　　　　　Ｃグルタ
ミン　　　　　Ｇｉｎ　　　　　Ｑグルタミンｒ！ＲＧ
　１　ｕ　　　　　　Ｅグリシン　　　　　　ＧｌｙＧ ヒスチジン　　　　　Ｈｌｓ　　　　　Ｈインロイシン
　　　　ＩＩｓ　　　　　１０イシン　　　　　　Ｌｅ
ｕ　　　　　Ｌリジン　　　　　　　Ｌ７畠　　　　Ｋ
メチオニン　　　　　Ｍｅｔ　　　　　Ｍフェルアラニ
ン　　　Ｐｈｅ　　　　　Ｆグロリン　　　　　　　Ｐ
ｒｏ　　　　　　ｐセリン　　　　　　Ｓａｙ　　　　
５ スレオニン　　　　　Ｔｈｒ　　　　　’［’トリグト
ファｙ　　　　ＴｒＰ　　　　　Ｗチロシン　　　　　
　Ｔｙｒ　　　　　Ｙバリン　　　　　　ｖａｌ　　　
　ｙ プローブは次の通りである： ５’−＊ＴＧＴＴＴＧＣＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＣ−３
’　　（ＧＨ６６）５’−＊ＴＴＣＣＧＣＡＧＡＴＴＴ
ＡＧＡＡＧＡＴ−３’　　（ＧＨ６７）５’−＊ＴＴＣ
ＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＧＡＴＴＴＧ−３’　　（ＧＨ６
Ｂ）５’−＊ＣＴＣＡＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣＡ
−３’　　（ＧＨ７５）（配列中、＊はラベルを示す）
。
ＧＨ７５ｆロープはＡｕｆｆｒａｙ等、　Ｎａｔｕｒｓ
　＊　３０８：３２７（１９８４）により記載されてい
るＤＲ４配列に由来した。６７プロープはＡｕｆｆｒａ
ｙ等、恩倦［。
７９：６３３７（１９８２）により記載されているＤＲ
４配列に由来し７ｊ、ＧＨ６８７°ロープはＣｈａｎｇ
等、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：８１３（１９８３）により
記載されているＤＲ３配列に由来した。ＧＨ６６プロー
グはＳｃｈｅｎｎｉｎｇ等、ＥＭＢＯＪ、　、　３：４
４７（１９８４）により記載されているＤＲ３配列に由
来した。対照オリゴヌクレオチドはこれらの対立遺伝子
のすべての保存され之セグメイトに由来した。
■、ダゲノＤＮＡの由来及び調製 下記の１１個のＤＮＡサンプルを、例１に記載したよう
な増幅のためにｖｔ４製した。
ＬＧ２セルライン（遺伝子型ＤＲ１）：カリボルニア、
スタンホード、スタンホード大学。
Ｊｏｈｎ　Ｂｅ１ｌ及びＤａｎ　Ｄｅｎｎｙ両博士より
；ＰＧＦセルライン（遺伝子型ＤＲ２）　：　Ｊｏｈｎ
　Ｂｅ１ｌ及びＤａｎ　Ｄｅｎｎｙ両博士より； ＡＶＬセルライン（遺伝子型ＤＲ３）　：　Ｊｏｈｎ　
Ｂａ１ｌ及びＤａｎ　Ｄ＠ｎｎｙ両博士より； ＤＫＢセルライン（遺伝子型ＤＲ４）　：　Ｊｏｈｎ　
Ｂｅ１ｌ及びＤａｎ　Ｄｅｎｎｙ両博士より； ＴＧＬセルライン（遺伝子型ＤＲ５）：ワシントン。
シアトル、プローブニア・マノン・ホスピタル。
Ｇｓｒｒｙ　Ｎｅｐｏｍ博士より； ＡＰＤセルライン（遺伝子型ＤＲ６）　：　Ｊｏｈｎ　
Ｂｅ１ｌ及びＤａｎ　Ｄｅｎｎｙ両博士より； ＬＢＨ’セルライン（遺伝子型ＤＲ７）　：　Ｊｏｈｎ
　Ｂｅ１ｌ及びＤａｎ　Ｄｅｎｎｙ両博士より： ＴＡＢセルライン（遺伝子型ＤＲ８）二ＧｅｒｒｙＮａ
ｐｇｍ博士より； ＫＯＺセルライン（遺伝子型ＤＲ９）　：　Ｇｅｒｒｙ
ＮｅｐＯｍ博士より。
サンプルＧＭ２７４１Ａ（遺伝子型ＤＲＩ、３）：Ｈｕ
ｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃａ１ｌ　Ｒ
ｅｐｏｓｉｔｏｒｙ　。
カムデン、Ｎ、Ｊ、から入手可能； サンプルＧＭ２６７６（遺伝子型ＤＲ４，３）：Ｈｕｍ
ａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｓ
ｐｏｓｉｔｏｒｙがら入手可能。
以下仝白 ■、増幅反応 各ｒツムＤＮＡサンプルを例１に記載した様にして、プ
ライマーとして（ＪＩ２６及びＧＨ２７を用いて２８サ
イクル増幅した。但し、重合段階３は１０重量係のジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下で３７℃におい
て行い、そして増幅反応は前記の自動液体取扱温度循環
装置のアルミニウム加熱ブロック中で、次のプログラム
ニ １）　　２．５分間、３７℃から９８℃へ変温（変性）
；２）　　３．０分間、９８℃から３７℃へ変温（アニ
ール）； ３）　　ｌユニットのＫｌｅｎｏｗ断片の添加；及び、
４）　　２．０分間、３７℃で保持（延長）；を用いた
。
各ＤＮＡサンプルについて、増幅されたゲノムＤＮＡ　
１５０μＥの内５μノを４枚のナイロンフィルターにス
ポットし、そしてこれにプローブＧＨ６６，６７，６８
又は７５のいずれかを例１に記載した様にして適用した
。但し、ナイロンフィルターに適用する前にＤＮＡサン
プルを中和し、６ＸＳＳＰＥ　、１０×デンハー１液及
び０．５　％　ＳＯ８のプレハイブリダイゼーションを
５０℃にて１時間用い、そして同じ溶液を５０℃にて一
夜用いた。フィルターを０、Ｉ　Ｘ　５ＳＰＥ　、　０
．１　％ＳＤＳにより３７℃にて１０〜１５分間洗浄し
た。フィルターを例１に記載した様にして処理してオー
トラジオダラムを得た。
■、オートラジオダラムの検討 ドツトプロットのオートラジオダラムは、４つのＨＬＡ
−ＤＱα対立遺伝子変異体に相補的なＨＬＡ−ＤＱα対
立遺伝子特異的プローブＧＨ６６、ＧＨ６７、ＧＨ６８
及びＧＨ７５はホモ接合体個体及びペテロ接合体個体の
両者からの増幅されたＤＮＡ上のヌクレオチド配列長屋
を特定するために使用することがでキル。プローブＧＨ
７５の反応性のパターンは血清学的に定義されたＤＱｗ
ｌに対応する。
ＤＱ−β第２エクソンの保存された５′及び３′末端の
相対する鎖に対して相補的なＧＨ２８及びＧＨ２９と称
するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。次
の配列： ぎ−ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣ
ＡＣＣＡＡＣＧ−３’（ＧＨ２８） チーＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣ
ＡＣＡＣ−３’（ＧＨ２９） を有するプライマーを例１に記載した様にして調製した
。
■、ゾローブの調製 対立遺伝子変異体にグループ化された種々の超厚からの
ＨＬＡ　−ＤＱβ配列の分析に基いて、各変異を含むＤ
Ｑβ第２エクソンの２つの可変領域からの下記のプロー
グを例１に記載した様にして合成しそしてラベルした。
これらの２つの領域すなわちセグメントＡ　（ＧＨ６９
−７１）及びＢ　（ＧＨ６０−６２）　、並びに第３の
可変領域を第４表に示す。プライマ〜、プローブ及びＨ
ＬＡ　−ＤＱβ配列の完全な相互関連を第５表に示す。
ここで、アミノ酸の略号は第３表に前記した通シである
。
以下仝白 プローブは次の通りである： ５’−”ＣＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧ−３
’　　　（ＧＨ６０）”５’−”ＣＧＧＣＡＧＧＣＡＧ
ＣＣＣＣＡＧＣＡＧ−３’　　（ＧＨ６１）”５’−”
ｅＡＡｃＡＧＧｃｃｃｃｃｃｃＴＧｃＧＧ−３’　　（
ＧＨ６２）５’−”ＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＧＴＣＡＣＡ
ＣＣＣＣＧ−３’　（ＧＨ６９）”５’−”ＧＡＴＧＣ
ＴＴＣＴＧＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＧ−３’　（ＧＨ７０
）５’−”ＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＴＣＡＣＡＡＧＡＣ
Ｇ−３’　（ＧＨ７１）（配列中、中はラベルであり、
そして錦は最良のプローブを示す）。
■、増幅及びドツトプロットハイブリダイゼーション例
３．Ａに記載した方法におよそ従って、プローブがゲノ
ムＤＮＡサンプル中の検出されるべき対立遺伝子の部分
に対する合理的な特異性を有することが見出式れた。
ＤＲβ第２エクソンの保存された５′及び３′末端の相
対する鎖に対して相補的なＧＨ４６及びＧＨ５０と称す
るオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。
５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡ
ＧＣＡＣＧ−３’　（ＧＨ４６）５’−ＣＴＣＣＣＣＡ
ＡＣＣＣＣＧＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡ−了（ＧＨ
５０）を有するプライマーを例１に記載した様にして調
製した。
１［、プローブの調製 対立遺伝子変異体にグループ化され丸柱々の超厚からの
ＨＬＡ　−ＤＲβ配列の分析に基いて、各変異を含むＤ
Ｒβ第２エクソンの２つの可変領域からの下記のプロー
ブを例１に記載した様にして合成しそしてラベルした。
これら２つの領域すなわちセグメントＡ　（ｔｌｌ、Ｈ
５６−５９）、及びＢ　（ＧＨ５１）を第６表に示す。
プライマー、プローブ及びＩ（ＬＡ　−ＤＲβ配列の完
全な相互関係を第６表に示す。ここで、アミノ酸の略号
は第３表に前記した通シである。第６表はＣ０■項に記
載する様にして訪導される。
以下余白 次のプローブ： ５’−”ＣＡＴＧＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣ−３’　
　　　（ＧＨ５９）（配列中、中はラベルである） を使用する。
■、増幅及びドットブロットノ・イブリダイゼーシＬと 例３．Ａに記載した方法におよそ従って、プローブがゲ
ノムＤＮＡサンプル中の検出されるべき対立遺伝子の部
分に対する合理的な特異性を有することが見出された。
Ｆ／、　　ＩＤＤＭに関連するＨＬＡ　−ＤＲβ配列の
分析徨々のＨＬＡ−タイプＩＤＤＭ個体の臨床血液サン
プル（ピッツブルダ大学から臨床的１及びＨｕｍａｎＧ
ｅｎｅｔｌｃ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｓｌ
ｔｏｒｙ、カムデン。
ＮＪから入手可能なＩ　ＤＤＭ個体由来のセルラインか
ら）及び非糖尿病対照（ホモ接合形細胞）から、クロー
ニング法を用いて幾つかのＨＬＡクラス■β遺伝子を単
離した。標準的方法であるこのような１つの方法におい
て、ヒトデツムＤＮＡを患者のサンプルからＭａｎｌａ
ｔｉａ　　等、Ｍｏ１ｅｃｕＩａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ（
１９８２）、２８０−２８１の方法を実質的に用いて、
又は主として末梢血リンパ球から成るバフィーコート画
分から５ａｉｋｉ等、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇＹ＋３
　：　１００８−１０１２（１９８５）により記載てれ
ている様にして単離した。次に、このＤＮＡを全ゲノム
ライブラリーとしてバクテリオファージベクターに、Ｍ
ａｎｌａｔｌｓ等、前掲、２６９−２９４頁に記載され
ている様にしてクローン化した。ＨＬＡ−ＤＲβ遺伝子
のための個々のクローンを、放射性ａ　ＤＮＡプローブ
（Ｍａｎｉａｔｉｓ、３０９　３２８頁）へのハイブリ
ダイゼーションにより選択し、そして制限地図の作成に
より特徴付は念。１９８６年４月１５日発行の米国特許
Ａ４，５８２．７８８を参照のこと。ＩＤＤＭ患者から
のクローンの制限地図を患者の家族内のＲＦＬＰ分離パ
ターンと比較することによ、９　ＩＤＤＭ患者からの個
々のクローンをＤＲ−タイプ分けされたハロタイプに帰
属せしめた。最後に、可変性第２エクソンを代表するこ
れらのクローンの小断片を、ベーリンガーマン・・イム
から自由に入手できるＭｌ　３ｍｐ　］　Ｏクローニン
グベクターにサブクローン化した。
遺伝子をクローン化する他の方法においては、リンカ−
／プライマーとして機能する非相同配列を有するプライ
マーＧＨ４６及びＧＨ５０を用いて例１に記載したよう
にして、各単離された合計１μｌのヒトゲノムＤＮＡか
ら遺伝子の関連部分（第２エクソン）の増幅を行った。
反応混合物を２８サイクルの増幅にかけ、そしてこの混
合物を一２０℃にて貯蔵した。次に、増幅された生成物
について次のクローニング方法を使用した。
反応混合物をＭｌ　３ｍｐ　１０にサブクローニングす
るため、５０　ｍＭ　ＮａＣＬ、　ｌ　ＯｍＭ　　Ｔｒ
ｉｍ−ＨＣｔ（ｐＨ７、８）　ｐ　１０　ｍＭＭｇＣｔ
２＃　２０　ユニｙトのＰｇｔｌ及び２６ユニツトのＨ
ｌｎｄｌｌｌを含有する緩衝液５０μｌ中で３７℃にて
９０分間消化を行った。凍結により反応を停止せしめた
。Ｔｒｉｍ−ＨＣＬ及びＥＤＴＡを含有する緩衝液によ
り容量を１１０μｌに調整し、そして１−のビオグルＰ
−４スピン透析カラム上に負荷した。１つの両分を集め
そしてエタノール沈澱した。
エタノールペレットを１５μノの水に再懸濁し、そして
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７，８）　、　１０　
ｍＭＭｇＣ１２，０，５ｍＭ　　ＡＴＰ　、　１０　ｍ
Ｍジチオスレイトール、０．５μ、９のＭｌ　３ｍｐ　
１０ベクター（Ｐｓｔｌ及びμユｄ■で消化したもの）
及び４００ユニツトのりガーゼを含む２０μ！容に調整
した。この混合物を１６℃にて３時間インキュベートし
た。
Ｍｏ１ｔ　　４　ＤＮＡを含有する連結反応混合物１０
μｌを、ベセスダ、ＭＤのＢＲＬから自由に入手できる
Ｅ、コｌＪＪＭ１０３株のコンピテント細胞に形質転換
Ａ、　Ｗａｌｔｏｎ編、アルゼビー／Ｌ／、アムステル
ダム。
１４３−１５３に記載されている形質転換株の調製方法
に従って行った。
これら２つのクローニング方法からの１８の対立遺伝子
を配列決定した。決定された配列の幾つかにおいて、特
定のＤＮＡ及び蛋白質配列の４つの領域が種々の組合わ
せで存在し、そしてＩ　ＤＤＭと関連することが見出さ
れた。Ｉ　ＤＤＭ患者のゲノム中に見られるＤＮＡ配列
はＤＲβ蛋白質の１〜３個のアミノ酸残基に変化をもた
らした。ＤＲβ第２エクソンのこれら４つの可変領域は
多くの糖尿病患者から得られた配列中に見出され、そし
て上に同定される。この様な配列を検出するために使用
されるプライマー及びプローブを合成するために前記の
領域を使用することができる。これらはＬＲ−Ｓ。
−ＦＬ−１Ｖ−Ｓ、及びＩ　−ＤＥとして同定されてい
る第６表中の配列である。
■、プライマー及び増幅 ＩＤＤＭについて試験されるべきＤＮＡサンプルを増幅
するために、この例のＣ，ｌに記載されているプライマ
ーＧＨ４６及びＧＨ５０を使用することができる。１０
μｌ　ＤＭＳＯを用いて例１又は例３Ａの増幅法を用い
ることもできる。
４種類のラベル化ＤＮＡプローブの内の２種類、すなわ
ち、それぞれ領域Ｃ及びＤからのＧＨ５４（ｖ−−ｓ　
）及ヒａｕ７ａ（Ｉ−ｏａ）を用いることができる。こ
れらのプローブはプライマーについて記載したのと同様
にして会成しそして前記の様にしてラベルすることがで
きる。
■、　ドツトプロットハイブリダイゼーション例１に記
載されているドツトプロット法におよそ従って、ストリ
ンジエンシーの高い条件下で、プローブがｒツムＤＮＡ
中の検出されるべき対立遺伝子の部分に対する合理的な
特異性を有することが予想される。
Ｄ、　　ＨＬＡ　−ＤＰα及びＤＰβ配列の増幅及び検
出すでに知られている長屋性のタイプを示す既知のＤＰ
β配列がＴｒｏｗｇｄａｌａ等、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ　、　Ｎｏ　８５（１９８５）
　ｚ　ｐ　５−４３　、　］　６頁の第６図に示されて
いる。他の冬型を同定することができる。これらの配列
の保存されたセグメントに対するプライマー及び可変性
セグメントへのプローブを上記と同様にして設計するこ
とができるＱ すでに知られている多望性のタイプを示すｃＤＮＡクロ
ーンから得られたＤＰα１対立遺伝子のヌクレオチド配
列がＴｒｏｗｓｄａｌｅ等、前掲、１２頁の第４図に示
されている。
これらの配列の検出及び増幅は、骨髄移植及び組織のタ
イプ分けにおいて臨床的に有用であろう。
例４゜ 凍結されたＭｏ１ｔ４細胞（正常β−グロビンについて
ホモ接合性のＴセルライン：　ＨｕｍａｎＧｅｎ＠ｔｌ
ｃ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、
カムデン。
ＮＪからＧＭ２２１９Ｃとして得られる）、ＳＣＩ細胞
（鎌形赤血球対立遺伝子についてホモ接合性の、ＥＢＶ
で形質転換されたＢセルライン：　ＡＴＣＣ、ロックビ
ル、ＭＤからＣＲＬ８７５６として得られる）、及び０
Ｍ２０６４細胞（β−グロビン又はδ−グロビン配列を
有しない前記の対照）を解凍し、そしてリン酸緩衝化塩
浴液に再懸濁して、セルラインの各タイプにつき細胞数
が３７〜１２００で異る１０μｌの細胞懸濁液を得た。
各セルラインを３５μ！の水と混合し、そして鉱油を重
層した。得られる懸濁液を９５℃にて１０分間加熱した
。次に、プライマーＰＣＯ３及びＰＣＯ４を含む例１に
おいてセルラインを増幅するために用いた試薬５５μノ
を添加し九。
次に、例１の増幅方法を用い、次にドットプロット法を
行うことができる。この細胞の直切使用によればセルラ
イン又は臨床サンプルからゲノムＤＮＡを単離する必要
がない。
例５゜ 例１の方法を用いて、既知の正常個体、既知の鎌形赤血
球貧血個体、及びβ−グロビン遺伝子配列を有しない個
体（０Ｍ２０６４）からのｒツムＤＮＡを使用した。但
し、例３゜Ａに記載した様に増幅を自動化した。
次の配列： ５’−”ＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣ−３’　　　　　
（Ｒ８３３）（配列中、串はラベルを示す） を有するＲ８３１　、Ｒ８３２、及びＲ８３３と称する
３種類のラベル化ＤＮＡプローブを調製した。これらの
プローブはそれぞれ１７．１５、及び１３塩基の長さを
有し、そして正常β−グロビン対立遺伝子（βＡ）に対
して相補的である。これらのプローブは例１に記載した
様にして合成しそしてラベルした。
プローブＲ８３２、Ｒ８３３、及びＲ８１８を増幅され
ていないクローン化正常グロビン配列及び鎌形赤血球貧
血グロビン配列に対する特異性について、例１に記載し
た方法を用いて試験した。但し、ハイブリダイゼーショ
ン温度を５５℃から３２℃以下に下げた。５５℃よシ低
いハイブリダイゼーション温度においてＲ８１８（１９
−ｍ・ｒ）は、塩濃度を下げなければ特異性を水堰なか
った。一層短い２種類のプローブはよシ高い塩濃度にお
いて卓越した特異性を示した。
プローブＲ８３１、Ｒ８３２、Ｒ８３３及びＲ８１８を
増幅されたゲノムＤＮＡに対して試験した。温度及び塩
イブリダイゼーシ、ン温度において特異性を示さなかっ
た。短い方のプローブはいずれも特異性を示した。これ
らの結果は、よシ短いプローブの選択が可能であること
、及び選択性の条件が】９−ｍａｒのために必要とされ
るそれよシも極端ではないことを明瞭に示している。
１７−ｍａｒのグロビンプａ−プＲ８３１は、６×１！
３ＳＰＫ　（］　ＯＸデンハート及び０．１％ＳＯ８を
含む）中３２℃よシ低温でハイブリダイズせしめそして
次に０．　ｌ　Ｘ　５ＳＰＥ中で４２℃にて１０分間洗
浄した場合に最適に機能した。
１５−ｍａｒグロビンプローブＲ８３２は、６　Ｘ　５
ＳＰＥ（１０×デンハート及び０．１係ＳＤ８を含む）
中３２℃より低い温度でハイブリダイズせしめそして次
Ｋ　Ｏ，Ｉ　Ｘ　５ａＰＥ中で３２℃にて１０分間洗浄
した場合に最適に機能した。
１３−ｍａｒグロビンゾロープＲ８３３は、６　Ｘ　５
ＳＰＥ（１０×デンハート及び０．１％ＳＤＳ　）中３
２℃よシ低温でハイブリダイズせしめそして０．　Ｉ　
Ｘ　５ＳＰＥ出ｎ　ｅ　１１／％Ｉ／／−／　１ｎ　１
Ｘｌｆｌｙｈ、ｘ　＋　＋４ＪＬΔｒｙ　Ｊｔ　遠＋ｒ
Ｗｋ　佃した。
例６゜ １、　　ｆロープの合成 β−グロビン遺伝子の第２エクソンの一部分を増幅する
ため、例１に記載した方法により次に示す２種類のプラ
イマーを合成した。
５’−ＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＣＣＴＴＡＧＧＣＴＧ−３
’　　（Ｒ８４０）５’−ＧＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＧＴ
ＧＧＣＡＡＡＧ−３’　　（Ｒ８４２）このプライマ一
対は、３個の比較的一般的なβ−サラセミア変異の部位
、すなわちコドン３９ナンセンス変異、コドン４１−４
２７レームシフト欠失、及びコドン４４フレームシフト
欠失を含む１９８塩基対増幅生成物を規定する。
コドン３９〜４２の領域のβ−グロビン遺伝子はδ−グ
ロビンと正確に相同であるため、β−グロビンにのみ特
異的でありそしてそれのみを増幅する様に設計された。
Ｒ８４０プライマーは第１イントロン−第２エクソン連
結部にわｆｃシ、この部分はδ−グロビンとの間に６塩
基対のミスマツチが存在する。Ｒ８４２はコドン８４−
９２にわたって位置し、やはυδ−グロビンとの間に６
個のミスマツチを含む。これらのミスマツチはδ−グロ
ビン遺伝子へのプライマーのハイブリダイゼーションを
回避するために十分である。２０サイクルの増幅の後、
これらのプライマーの全体効率は約８０幅であり、そし
て１３０，０００倍の増幅に相当する。
予想される様に、増幅生成物は検出可能なδ−グロビン
ＤＮＡを含有していなかった。
■、臨床サンプルからのヒト−ゲノムＤＮＡの単離株々
のβ−サラセミア遺伝子をの臨床ｒツムＤＮＡサンプル
５個をＡｌａｎ　５ｏｏｔｔ及びｆ（ａｉｇＫａｚａｚ
ｉａｎ両博士（ジ、ンズホデキンス大学、パルチモア、
ＭＯ）から入手した。これらのサンプルはＪＨＩ　（正
常／３９ノン）、ＪＨ２（３９ノン／３９ツノ）、ＪＨ
３（正常／４１欠失）、ＪＨ４（１７ノン／４１欠失）
、及びＪＨ５（３９ノン／４４欠りであった。
■、増幅反応 １μｇずつの各ＤＮＡサンプル及び対照としてのＭｏ１
ｔ４μ、５０　ｍＭ　ＮａＣＬ　、　１０　ｍＭＴｒｌ
ｓ−ＨＣＬ（ｐｉ（７，６）　、　１０ｍＭ　ＮａＣＬ
２　、　Ｉ　ＡＭプライマーＰＣＯ３、ｌ　μＭプライ
？　−ＰＣＯ４、１０ｖ／ｖ　４０ＭＳ０．１．５ｍＭ
　　ｄＡＴＰ　、１．５ｍＭ　　ｄＣＴＰ　、１．５ｍ
ＭｄＧＴＰ、及び１．５　ｍＭ　ｄ　ＴＴＰを含む１０
０　ｐｉの容量中に稀釈し、そして各サイクルで１ユニ
ツトのＫｌａｎｏｗ断片を添加しながら、例３．Ａに記
載した様にして２５サイクルの自動増幅を行った。
Ｖ、オリゴ９デオキシ１ゴヌクレオ　ドブロープＸＸＩ
、ＸＸ２、ＸＸ３、及びＸＸ４　と称する下記の４種類
のプローブがジョンズホゾキンス大学の５ｃｏｔｔ及び
Ｋａｚａｚｉａｎ博士により提供された。
５’−”ＧＧＴＴ−−−−ＧＡＧＴＣＣＴＴＴＧＧＧＧ
ＡＴ−３’　　（ＸＸ４）（配列中、中は後で付加した
ラベルを示す。）ＸＸＩ及びＸＸ２の対はコドン３９ナ
ンセンス変異を検出するために使用した。ここでＸＸＩ
は正常対立遺伝子に対して相補的であり、そしてＸＸ２
はナンセンス変異に対して相補的である。他のプローブ
めに設計されており、ＸＸ３は正常対立遺伝子にアニー
ルし、そしてＸＸ４は欠失変異にアニールする。
各プローブは例１に記載した様にしてリン酸化した。
■、　ドツト・プロットハイブリダイゼーション４枚の
ドツトプロットを用意した。各スポットは１８分の１の
増幅生成物（５６ｎ＆のゲノムＤＮＡ　）を含む様にし
た。各フィルターを個別に８−の５　Ｘ　５ＳＰＥ　、
　５Ｘデフハート浴液、　０．５４　ＳＤＳ中で５５℃
にて１５分間ハイツリダイズせしめた。
０．５ｐｍｏｔずつのラベル化プローブ（比活性１．８
〜０、７　μｃｉ／ｐｍｏｔｅ　）を添加し、そしてさ
らに６０分間同じ温度でハイブリダイゼーションを続け
た。
フィルターを室温にて２×リン酸ナトリウム塩ＥＤＴＡ
（ＳＳＰＥ）　、　０．１係ＳＤ８　、中で５〜１０分
間ずつ２回洗浄し、次に５ＸＳＳＰＫ、０．１係ＳＤＳ
中６０℃にて１０分間、高ストリンジエンシー条件下で
洗浄した。１個の強化スクリーンを用いて一夜及び２時
間の暴露の後、オートラジオダラムを発色ｕｌ＆−４← ■、オートラジオダラムの結果 結果は各ＤＮＡサンプルの示された遺伝子型に一致した
。各プローブは、それが完全にマツチするゲノム配列と
のみアニールした。
例７゜ 任意の体サンプル、例えば髪、精液及び血液サンプル、
並びにＤＮＡ　を含有する他のサンプル等の中の例えば
核酸を検出するために不規測多型領域、例えばＨＬＡ又
はミドコシドリアＤＮＡ　’ｅ増幅することによって、
この発明の方法を法医学のために適用することも可能で
ある。核酸はサンプルから任意の手段により抽出するこ
とができ、そして検出されるべき核酸の特徴を同定した
後に又は既知の特徴に基いてプライマー及びプローブを
選択することができる。
例８゜ ■、プライマーの合成 この例においては、例１に記載したプライマーＰＣＯ３
及びＰＣＯ４を用いた。
Ｔセルライン、Ｍｏ１ｔ　４　（Ｉ（ｕｍａｎ　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃＭｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｅｐｏａｉｔｏｒ
ｙ＋カムデン、　ＮＪからＧＭ２２１９Ｃとして入手す
ることができる正常β−グロビンについてホモ接合性で
ある）から、Ｍａｎｉａｔｉｇ等、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ（１９８２）　＋　２８０−２８１
の方法に実質的に従って、高分子鈑ケ゛ツムＤＮＡを単
離した。
アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション、　１
２３０１　、パークラウンドライブ、ロックビル。
即からＡＴＣＣＡ　２５，１０４として無制限に入手可
能なサーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕ
ａｔｉｃｕａ　）ＹＴＩ株を、次の組成： クエン酸ナトリウム　　　　　　　１ｍＭリン酸カリウ
ム、ｐ）（７−９ｓ　ｍＭ塩化アンモニウム　　　　　
　　］ＯｍＭ硫酸マグネシウム　　　　　　　０．２ｍ
Ｍ塩化カルシウム　　　　　　　　０．１ｍＭ塩化ナト
リウム　　　　　　　　　ｌ　ｇ／ｌ酵母エキス　　　
　　　　　　　　１１／１トリプトン　　　　　　　　
　　　１１／１グルコース　　　　　　　　　　　２１
／１硫酸第一鉄　　　　　　　　　０．０１ｍＭ（オー
トクレーブ殺菌の前に−を８．０に調整）を有する培地
中でフラスコ内で増殖せしめた。上記の培地中で７０℃
で一夜培養した種母フラスコからＩＯＪの発酵槽に種母
を接種した。ｌＯｌの同じ培地に合計６００−〇種母を
接種した。水酸化アンモニウムにより−を８．０に調整
し、溶存酸素を４０％に、温度を７０℃にそして攪拌速
度を４０　Ｏｒｐｍに調節した。
細胞の増殖後、上記カレデイン（Ｋａｌｅｄｉｎ）等の
方法（僅かに修正）の最初の５段階を用い、且つ第６段
階のために異った方法上用いてそれらを精製した。６エ
程の全てを４℃において行った。
カラム上の分別速度は０．５力ラム容／時間であシ溶出
時の勾配の容量は１０カラム容であった。
簡単に説明すると、上記Ｔ、アクアティカス細胞１．４
ＪＦ乾燥重ｔ／ｌの細胞密度において遠心分離により採
集した。２０．９の細胞を５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣＬＰ
Ｈ７，５，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡよシなる８０ｔＩｔの
緩衝液中に再懸濁した。細胞ｔｍ解し、そして浴解物を
ａ−ター内において４℃で３５，０００　ｒｐｍＫて２
時間遠心分離した。上澄液を集め（画分Ａ　）　、　４
５〜７５％飽和度の１ａ酸アンモニウムの間で沈澱する
蛋白質画分を集め、０．２Ｍリン酸カリウム（ｉ’（６
，５）　、　］　ＯｍＭ　２−メルカプトエタノール及
び５幅グリセリンよシなる緩衝液中に溶解し、最終的に
同一緩衝液に対して透析して画分Ｂを得た。
画分Ｂを上記緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥ−セルロー
スの２．２Ｘ３０ロカラムにかけた。カラムを次いで同
一緩衝液で洗浄し、蛋白質を含有する画分（２８０ｍに
おける吸光度により測定）を集めた。−緒にした蛋白質
画分を０．ＯＩＭＩＪン酸カリウム（ｐＨ７，５）　、
　１０ｍＭ　　２−メルカプトエタノール及び５％グリ
セリンを含有する第二の緩衝液に対して透析して画分Ｃ
を得た。
シアパタイトの２．６Ｘ２１ｃｒ１ｔカラムにかけた０
カラムを次いで洗浄し、］ＯｍＭメルカプトエタノール
及び５係グリセリンを含む０．０１−０．５Ｍリン酸カ
リウム緩衝液の線形勾配で酵素を溶出した。
ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む両分（９０〜１８０−リ
ン酸カリウム）を−緒にし、Ａｍ１ｃｏｎ攪拌セル及び
ＹＭＩＯ膜を用いて４倍に濃縮し、第二の緩衝液に対し
て透析して画分りを得た。
画分りを第二の緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥ　−セル
ロースの１．６Ｘ２８ｃｒｎカラムにかけた。カラムを
洗浄し、ポリメラーゼを第二緩衝液中の０．０１−０．
５　Ｍリン酸カリウムの線形勾配で溶出した。
両分を過剰のＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベージ
、ンした後（エンドヌクレアーゼについて）。
及びＤＮＡを数個の断片に切断する制限酵素により処理
した後（エキソヌクレアーゼについて）、ファージ入Ｄ
ＮＡ或いはスーパーコイル血漿ＤＮＡの分子量変化を電
気泳動的に検出することにより汚染エンドヌクレアーゼ
及び液相ヌクレアーゼのアッセイを行った。最少のヌク
レアーゼ汚染を有するＤＮＡポリメラーゼ画分のみ（６
５９５ｍＭリン酸カリウム）をゾールした。このゾール
に殺菌したゼラチンを２５０μＩ／−で添加し、透析を
第二の緩衝液に対して行い、画分Ｅを得た。
画分Ｅｉ９ｍｌのホスホセルロースカラムにかけ、］０
０１ｎｔの勾配（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐ）１
７．５中０．０１−０．４　Ｍ　ＫＣＡの勾配）で溶出
した。
これらの両分について上記の如く汚染エンド／エキソヌ
クレアーゼ並びにポリメラーゼ活性（カレディン等の方
法により）のアッセイを行い次いでプールした。プール
した両分を第二の緩衝液に対して透析し、次いで５０％
グリセリン及び第二の緩衝液に対する透析により濃縮し
た。
このポリメラーゼの分子量をＳＯ８ＰＡＧＥにより求め
た。マーカー蛋白質（低分子量標準）はホスホリラーゼ
（９２，５００）、ウシ血清アルブミン（６６，２００
）、オパルグミン（４５，０００）、炭素アンヒドラー
ゼ（３１，０００）、大豆トリプシン阻害因子（２１，
５００）及びリゾチーム（１４，４００）で必っ／ζ０ 予備的データはこのポリメラーゼは文献に報告される６
２．０００〜６３，０００ダルトン（例えばカレディン
等による）ではなく、約８６，０００〜９０．０００ダ
ルトンの分子量を有することを示唆する。
■、増幅反応 １μ９の上記ゲノムＤＮＡ　ｆ　２５ｍＭ　Ｔｒｉａ−
ＨＯ２（ＰＩ（８，０）、５０　ｍＭ　ＫＣｔ、　１０
　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５ｍＭジチオスレイトール、２０
０μｍ１／ｍｌゼラチン、１μＭのプライマーＰＣＯ３
、ｌμＭのプライマーＰＣＯ４，１，５ｍＭ　ｄＡＴＰ
、　１．５　ｍＭｄＣＴＰ　、　１．５　ｍＭ　ｄＧＴ
Ｐ及び１、５　ｍＭ　ＴＴＰを含有する当初１００μノ
の水性反応液中に稀釈した。このサンプルを９８℃で１
０分間加熱して、ゲノムＤＮＡ　’ｉ変性し、次いで室
温に冷却した。サーマス・アクアティカスからの４μＥ
のポリメラーゼを反応液に添加し、１００μノの鉱油キ
ャップを重層した。次に、サンプル’ｉ　、　１１８６
年２月２５日に出願された米国特許出題Ｊｌｉ８３３，
３６８に記載されている液体取扱い及び加熱器具のアル
ミニウム加熱ブロック内に入れた。
クルを繰返して機械内で２０サイクルの増幅を行９た： １）加熱ブロック内における２、５分に亘る３７℃から
９８℃への加熱、及び ２）プライマー及びＤＮＡ　’ｅアニールさせるための
３分間に亘る９８℃から３７℃への冷却。
最終サイクル後、サンプルを５５℃で更に１０分間イン
キュベートして最終延長反応を完結させた。
下記配列のＲ８２４と称される標識されたＤＮＡ　７’
ロープを調整した二 ｆｆ−”ＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡＣＧＧｕｅＧ
ＡＧＩ’Ｃ石−３’（Ｒ８２４） （ここで、本は標識を示す）。
このプローブは例１工に記載した方法により合成した。
このプローブは４０個の塩基長さであり、遺伝子の４番
目〜１７番目のコドンに亘シそしてる。
シライマー及びプローグの概略図を以下に示す；このプ
ローブは実施例１の分節Ｉで説明した操作に従って合成
した。このプローグはその２０ｐｒｎｏＬを７０　ｍＭ
　Ｔｒｉｍ　（ＰＨ７，６）、１０ｍＭ　ＭｇＣ４２，
１，５ｍＭスパーミン及び１０　ｍＭジチオスレイトー
ルを含有する４０μノの反応液中３７℃において６０分
間４単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び約４０　
ｐｍｏＬのγ　Ｐ−ＡＴＰ　（約７０００　Ｃｉ／ｍｍ
ｏｔ・）と接触させることにより標識した。全容量を次
いで２５　ｍＭ　ＥＤＴＡでｘＯＯμＪに調整し、Ｔｒ
ｌａ−ＥＤＴＡ　（ＴＥ）緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｌｇ
、　　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨｓ、ｏ　）で平衡
化された１ｔｎｔのスピン透析カラム上でマニアティス
等（Ｍａｔｈｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　（３９８２）　４６６−４６７　］の方法
に従って精製した。反応生成物のＴＣＡ沈澱は１８２４
について比活性は４．３μＣ１／ｐｍｏｔ＠であυ、最
終濃度は０．１１８　ｐｍｏｔｅ／μｌであることを示
した。
■、からの増幅サンプル４μ！及び７０．７５，８０．
８５．９０．９５、及び１００％の増幅効率を表わすよ
うに計算された適当な稀釈率のβ−グロビンシラスミド
ＤＮＡ　５．６μｌを２００μｌの０．４　Ｎ　ＮａＯ
Ｈ。
２５　ｍＭ　ＥＤＴＡで稀釈し、リード及びマン（Ｒｅ
ｅｄａｎｄ　Ｍａｎｎ　）［：Ｎｕｃｌ＠ｌｅ　Ａｅｌ
ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１３．７２０２−７２２１　
（１９８５））には示されるように、先ずフィルターを
水で濡らし、フィルターを所定位置に保持するドツトプ
ロット作成用装置内にフィルターを入れ、サンプルを適
用しそして各ウェルを０．１−の２０　Ｘ　５ＳＰＥ　
（３，６Ｍ　ＮａＣ１゜２００　ｒｎｈｌ　ＮａＨｚＰ
Ｏ４，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ　）で濯ぐことによりナイロ
ンフィルター上にスポットした。次いでフィルターを取
出し、２０　Ｘ　５ＳＰＥ中で濯ぎ真空オープン中にお
いて８０℃で３０分間焼付けた。
焼付は後裔フィルターを３　Ｘ　５ＳＰＥ、　５　Ｘデ
ンハルト浴液（Ｉ　Ｘ−０，０２％ポリビニルピロリド
ン、０．０２’１６　ＦｉｃａｌＩＳＯ，０２％ウシ血
清アルグミン、０．２ｍＭ　Ｔｒｉｍｌｏ、２ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ、　ｐＨ８，０）、０．５％ＳＤＳ、及び３０係
ホルムアミドよシなる１６−のハイブリダイゼーション
溶液と接触式せ、４２℃で２時間インキュベートした。
次いで２ｐｍｏｌｅのプローブＲ８２４をこのハイブリ
ダイゼーション溶液に添加し、フィルターを４２℃で２
時間インキュベートした。
最後に、各ハイブリダイズされたフィルターを１００ｄ
の２　Ｘ　５ＳＰＥ及び０．１係ＳＯ８で室温において
１０分間２回洗浄し九。次いでフィルターをｌｏｏｍｔ
の２　Ｘ　５ＳＰＥ、　０．１　％　ＳＤＳで６０℃に
おいて１０分間１回処理した。
各フィルターを次いでオートラジオグラフにかけたとこ
ろ、シグナルは２時間後に容易に明らかとなった。
■、オートラジオダラムの検討 ドツトプロットのオートラジオグラフは２時間後に分析
され、上記サイキ等（５ａｉｋｌ　ａｔ　ａｌ・Ｇａ１
ｅｎａｓ）により説明されるようにＨａ＠ＩＩＩ／Ｍａ
ｅ１−消化ｐＢＲ二βＡ（β”は野性種の対立遺伝子で
ある）を用いて調製された標準的逐次稀釈β−グロビン
再構成液に対して強度を対比した。反応生成物の分析は
総括増幅効率が約９５係であり、β−グロビン目標配列
における６３０，０００倍の増大に対応することを示し
た。
例９゜ ！、増幅反応 例８と同様のＭｏ１ｔ４セルラインから抽出された二つ
の１μｇｏｒツムＤＮＡのサンプル金それぞれ５０ｍＭ
　ＫＣＬ、　２５ｍＭ　Ｔｒｉａ・ＨＣｔ（ｐＨｓ、ｏ
　）、１０　ｍＭ　ＭｇＣ２ｚ、１　μＭのプライｆｆ
　−ＰＣＯ３，１ｔｔＭのシライーｒ　−ＰＣＯ２，２
００μｍ１／ｒｄゼラチン、１０係ジメチルスルホキシ
ド（容量幅）、１．５ｍＭｄＡＴＰ、１．５ｍＭ　ｄＣ
ＴＰ、１．５ｍＭ　ｄＧＴＰ、及び１．５ｍＭＴＴＰを
含有する１００μ！の反応液中に稀釈した。
この混合物を９８℃で１０分間加熱して、ゲノムＤＮＡ
　′ｔ−変性後、サンプルを室温に冷却し、例８と同様
のサーマス・アクアティスからのポリメラ−ゼ４μｌを
各サンプルに添加した。これらのサンプルに鉱油を重層
して濃縮及び蒸発損失を防止した。
サンプルの一方を例８と同様の機械の加熱ブロック内に
入れ、次のプログラムサイクルを繰返して２５サイクル
の増幅に付した： （１）　　２．５分間に亘る３７℃から９３℃への加熱
、（２）テライマー及びＤＮＡ　ｔ−アニールさせるた
めの３分間に亘る９３℃から３７℃への冷却、及び （３）２分間に亘る３７℃における維持。
最終サイクル後、サンプルを更に６０℃で１０分間イン
キュベートして最終延長反応を完結させた。
第二のサンプルは上記により詳細に説明した機械の熱伝
導性容器内に入れた。この熱伝導性容器は温度を上方、
及び下方に調整するＰｓｌｔｉｅｒ　　ヒートホング及
びマイクロプロセッサコントローラに結合して自動的に
増幅順序、温度レベル、温度勾配及び温度のタイミング
を制御した。
第二の試料は次のプログラムサイクルを繰返して２５サ
イクルの増幅に付した： （１）３分間に亘る３７℃から９５°Ｃへの加熱、（２
）変性を起こすための０．５分間の９５℃における維持
、 （３）１分間に亘る９５℃から３７℃への冷却、及び （４）１分間の３７℃における維持。
■０分析 分析のために二つの試験、すなわちドツトプロット及び
アガロースゲル分析全行った。
ドツトプロット分析のためには、下記配列のＲ８］８と
称でれる標識ＤＮＡ　ニア’ロープを調製しｆｃ：５’
−”ＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣ−３’　
　　（Ｒ８１８）（串は標識を示す）。
このプローグは１５個の塩基長であり、遺伝子の第４番
目乃至第１７番目のコドンに亘シそして正常なβ−グロ
ビン対立遺伝子（βＡ）に相補的である。ゾライマー及
びプローブの概略図を下記に示す： 以「全白 このプローグは例１．１に示した操作に従って合成した
。このプローブはその１０　ｐｍｏＬｍを４単位のＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ及び約４０−１＠のγ−”Ｐ
−ＡＴＰ　（約７０００　Ｃ１／ｍｍｏｔｅ　）と７Ｑ
ｍＭＴｒｉａ・ＨＣｔ（ｐ’　７．６　）、１０Ｉｌｎ
Ｍ１０ｌ１ｎ、１．５ｍＭスノ９−ミン及び１０ｍＭジ
チオスレイトールを含有する４０μｊの反応液中におい
て３７℃で６０分間接触させることにより標識した。次
いで全容景を２５　ｍＭ　ＥＤＴＡで１００μｌに調整
し、そしてマニアティス等（Ｍｏｌ＠ｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　（１９８２）　４６６−４６７）の操作に
従ってＴｒｌｓ−ＥＤＴＡ　（ＴＩ）緩衝液（１０ｍＭ
　Ｔｒ　ｉ　ｍ−ＨＣＬ緩衝液、０．１　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　。
ｐＨ８，０）で平衡化され九１−のスピン透析カラム上
で精製した。反応生成物のＴＣＡ沈澱はＲ８１８につい
て比活性は４．６μＣ１／　ｐｍｏＬｅであり、最終濃
度は０．１１４　ｐｍｏｔｅ　／μ！であることを示し
た。
４１台８１−＋啼り１−徊　４ト横而■→ト・ノ　フー
ル　　　昌１「磨ｋｌｅζミｍ酵素の代シにＥ、コリ（
Ｅ、　ｃｏｉｌ）　ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ断
片を用いた以外は上記と同様にして増幅したサンプル５
μＡ！を１９５μｌの０．４ＮＮａＯＨ１２５ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡで稀釈し、リード及びマン［：Ｒｅｅｄ　　ａｎ
ｄ　　Ｍａｎｎ、　　Ｎｕａｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。
１３．７２０２−７２２１（１９８５）］に開示される
ように先ずフィルターを水で濡らし、それらをフィルタ
ーを所定位置に保持するドツトプロット作成用装置内に
置き、サンプルを適用し、そして各ウェルヲ０．４−の
２０　Ｘ　５ＳＰＩ　（３，６Ｍ　ＮａＣＬ　。
２００　ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ　
）で濯ぐことにより２個のレプリカナイロンフィルター
上にスポットした。次いでこれらのフィルターを取出し
、２０　Ｘ　５ＳＰＥ中で濯ぎそして真空オープン内で
８０℃において３０分間焼付は友。
加熱後、各フィルターを次いで６−の５　Ｘ　５ＳＰＥ
。
５Ｘデンハルト溶液（ＩＸ−０，０２％ポリビニルピロ
リドン、０．０２％　Ｆｉｃａｌｌ　、　０．０２４ウ
シ血清アルブミン、０．２　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　０．
２　ｍＭ　Ｉｉ：ＤＴＡ、　ｐＨ８，０）及び０．５４
　ＳＯ８よりなる６ｍのハイグリダイゼーション溶液と
接触させ５５℃で６０分間インキュベートした。次いで
、５μノのプローグＲ８］８をハイグリダイゼーショ／
溶液に添加し、フィルターを５５℃で６０分間インキュ
ベートした。
最後に各ハイツリダイズされたフィルターを１００ｍｊ
の２　Ｘ　５ＳＰＥ及び０．１係ＳＤＳで室温において
１０分間２回洗浄した。次いで、フィルターをそれぞれ
１００−の５Ｘ　５ＳＰＥ、　０．１係ＳＯ８で６０℃
において１）１分間及び乃３分間の２回処理した。
次いで各フィルターをオートラジオグラフィにかけたと
ころ、シグナルは９０分後に容易に明らかとなった。
アガロースグル分析において、各５μノの増幅反応液’
ｉ　］　Ｘ　ＴＢＥ緩衝液（０，０８９Ｍ　Ｔｒ１ｇホ
ウ酸塩、０．０８９Ｍホウ酸、及び２　ｍＭ　ＥＤＴＡ
）中の０．５％アガａ−スグルに負荷し、１００Ｖで６
０分間電気泳動させた。エチジウムプロマイドテ染色後
、ＤＮＡをＵＶ螢尤により可視化した。
これらの結果は、例８及び例９で用いた機械はＤＮＡの
増幅に同様に有効であり、所望配列に対応する同様な強
度の個々の高密度の１１０塩基対バンド並びにはるかに
低い強度の僅かのその他の個々のバンドを示し念。これ
に対して、各サイクル後にＥ、コリポリメラーゼ■のフ
レノウ断片を用いる試薬移転を含む増幅方法は多くの非
関連ＤＮＡ配列の非−特異的増幅から生ずるＤＮＡスメ
アを与えた。
）ＩＬＡ−ＤＱ、　ＤＲ及びＤＰ領領域評価においても
同様の増幅及び検出における改良が達成されることが期
待される。
さらに、米国特許４４，５８２．７８９及びＡ４．６１
７，２６１に記載されている様にして調製されたピオチ
ン化プローグを用いて例１の方法を反復することができ
ると予想される。
例１０゜ １５０ｍＭ　ＫＣＬ　、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＨＣｔ
（ｐＨｓ、ａ　）。
］　ＯｍＭ　ＭｇＣｌ２．５ｍＭ　ＤＴＴ、　０．５ｍ
Ｍ　ｄＡＴＰ　、　０．５ｍＭ　ｄＣＴＰ　、　０．５
ｍＭ　ａ’ｒ’ｒｐ　、　０．５　ｍＭ　ｄＧＴＰ　、
　　０．２μＳのオリが（ｄＴ）　１２−１　ｇ　、　
４０ユニツトのＲＮａ　ｍ　ｉ　ｎ及び５ユニツトのＡ
ＭＶ逆転写酵素を含有する１００μｌの反応容量中で４
２℃にて３０分間インキュベートして１μＩのラビット
網状赤血球ｍＲＮＡからｃ　ＤＮＡを調製した。９５℃
にて１０分間加熱することにより反応を停止した。２μ
ｇのＲＮアーゼＡをサンプル（水中２１１１＆／−溶液
２μりに添加し、そして３７℃にて１０分間インキュベ
ートした。
異るプライマ一対を用いて、Ｋｌ＠ｎｏｖ断片によ＃）
３種類の増幅反応を行った。プライマ一対ＰＣＯ３／　
ＰＣＯ４は１１０　ｂｐ生成物を規定し、プライマ一対
Ｒ８４５／オリゴ（ｄＴ）２５−３０は約３７５　ｂｐ
の生成物を規定し、そしてプライマ一対ＰＣＯ３／オリ
ゴ（ｄＴ）２５−３０は約６００　ｂｐの生成物を規定
する。ＰＣＯ３、ＰＣＯ４、及びＲ８４５はヒトβ−グ
ロビン遺伝子に対して相補的であり、そしてそれぞれが
ラビットの遺伝子に対して２個のミスマツチを有する。
ＰＣＯ３及びＰＣＯ４は例１に記載されてい有する。
上記ｃＤＮＡの２０分の１（５μｌ）を用いＣ３０ｍＭ
　ＮａＣ２，１０ｍＭ　Ｔｒｌｓ−ＨＣｔ（ＰＩ（７，
６）　、　１０　ｍＭＭｇＣ１２，２００μＩ／−のゼ
ラチン、１０係の０Ｍ８０゜１μＭ　ＰＣＯ３又はＲ８
４５、１μＭ　ＰＣＯ４又はオリゴ（ｄＴ　）　２５　
３０　＝　１−５　ｒｎＮｌ　ｄＡＴＰ　ｊＩ−５ｒｎ
ＲＩＩ　ａｃ’ｒｐ　＃１．５ｍＭ　ｄＴＴＰ及び１．
５ｍＭ　ｄＧＴＰを含有する１００μノの反応容量中で
増幅反応を行った。サンプルを９８℃にて５分間加熱し
、そして次に室温に冷却し、そして約１００μｌの鉱油
を重層した。
例８に記載した機械及び下記のプログラムを用いて、サ
ンプルを１０サイクルの自動増幅にかけ。
た。
１）ヒートブロック中で２．５分間３７℃から９８°Ｃ
に加熱しく変性）； ２）　　３．０分間にわたって９８℃から３７℃に冷却
しくアニール）： ３）１ユニツトのＫｌ＊ｎｏｗ断片を加え；そして４）
３７℃にて２０分間維持する（延長）。
友、ｌ←ソーｆｒｖｔｌ″１社・致窓掛Ｈ本ｈ１Ａｎｔ
ｉｌ〒ふり今一各サンプルの２０分の１（７μｌ）を２
％アガロースゲル上での電気泳動により分析した。臭化
エチジウムで染色した後、ＰＣＯ３／ＰＣＯ４サンプル
及びＲ８４５／オリゴ（ａＴ）サンプルにおいて個別の
バンドが見られた。バンドのサイズは予想の長すと一致
し、前記については１１０　ｂｐ、後者については３７
０　ｂｐであった。　ＰＣＯ３／オリゴ（ａＴ）プライ
マ一対による約６００ｂｐ断片の増幅の証拠は観察され
なかった。
グルの内容物を陽イオン性ナイロン膜上にサデングＱツ
トし、そして５ａｉｋ１等、　Ｓｃｉ＠ｎｃｅ、前掲。
に記載されているニックトランスレーション・ヒトβ−
グロビンプローブｐＢＲ３２８二ＢＡと、標準的技法に
よりハイグリダイズせしめた。得られたオートラジオダ
ラムはすでに得られた結論と一致した。
すなわち、１１０μｌ断片及び３７０　ｂｐ断片はβ−
グロビン特異的増幅生成物であり、そして約６００ｂｐ
の有意な増幅は検出されなかった。
すでに記載したのと同じプライマ一対を用いて、前記の
様にして得られたサーマス・アクアチカス（Ｔａｑ）ポ
リメラーゼにより３個の追加のサンプルを増幅した。ｃ
ＤＮＡの内の５　ＡＩ　’！：、　５０　ｍＭ　ＫＣＬ
。
２５ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＨＣＬ（ｐＨｓ、ｏ　）　、　１
０ｍＭ　Ｍｇｅｔ２゜２００　Ａｌｌ／ｌｄのゼラチｙ
、　１０％ｏＭｓｏ、１μＭＰＣＯ３又はＲ８４５、１
３Ｍ　ＰＣＯ４又はオリが（ｄＴ）２５−３０　、１．
５ｍＭ　ｄＡＴＰ　、　１．５ｍＭ　ｄＣＴＰ　。
１５ｍＭ　ｄＴＴＰ及び１．５　ｍＭ　ｄＧＴＰ　ｆ含
有する１００μｌの反応容量中で増幅した。サンプルを
９８℃にて５分間加熱し、次に室温に冷却した。１μｌ
のＴａｑポリメラーゼ（ロット２の１／８稀釈物）をそ
れぞれに加え、そして１００μｌの鉱油を重層した。
前の例に記載したＰｓｌｔｉｓｒ装置及び下記のプログ
ラムを用いて、サンプルを９サイクルの増幅にかけた。
１）　　１分間３５℃から６０’Ｃに変温し：２）１２
分間６０℃から７０℃に変温しく延長）；３）１分間７
０℃から９５℃に変温しく変性）；４）３０秒間９５℃
に置き； ５）１分間９５℃から３５℃に変温しくアニール）；そ
して、 ６）３０秒間３５℃に置いた。
最終サイクルの後、サンプルを−ｇらに１０分間６０℃
にてインキュベートすることにより最終（第１０サイク
／Ｉ／）延長を完結した。各最終容積は約１００μノで
あった。
前記の様に、各サンノルの２０分の１（１０μｉ＞を２
％アガロースダル上で分析した。このグル中に、増幅生
成物は３個すべてのサンプルに存在し九。すなわち、Ｐ
ＣＯ３／ＰＣＯ４については１１０ｂｐ、　Ｒ８４５／
、ｔリコ（ｄＴ）については約３７０ｂｐ。
そＬテＰＣＯ３／、ｔ　Ｕ　コ（ｄＴ）については約６
００　ｂｐの生成分ヘ−ｉＥ存在した。これらの結果は
サザン移行、及びｐＢＲ３２８：　ＢＡプローブとのハ
イプリダイゼーショ／により確認された。
Ｔ轟ｑポリメラーゼを使用するがＫｌｅｎｏｗ断片を用
いない６００　ｂｐ生成物の生成は有意であり、そして
ＴａｑポリメラーゼはＫｌｅｎｏＷ断片よシも長いＤＮ
Ａを生成せしめることができることが示唆式れる。
これが次に鋳凰として機能することができる連鎖反応に
おいて核酸が増幅され、そしてこの増幅されたサンプル
が配列特異的プローブを用いて分析される本発明の技法
は幾つかの重要な利点をもたらす。増幅されたサンプル
をフィルター膜上にドツトプロットとしてスポットする
ことができ、これによって、他の方法によれば必要とさ
れる制限酵素消化、電気泳動及びグル操作を回避するこ
とができるから、この方法は単純化された方法である。
増幅は交差ハイブリダイゼーション配列に対する特定の
標的配列の比率を徐々に高めるので、この方法は一層特
異的な方法である。
さらに、この発明の方法は、１０〜１０　　で感度を改
良する。−夜の暴露の後］　Ｊのサンノルから判断可能
なシグナルを得ることができる。最後に、フィルターに
適用されるサンプルの量を０．１〜０，５μｌに増加す
ることにより、ビオチン化オリゴヌクチオチドデロープ
を使用することができる。
以下刃？１→

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、サンプル中に含まれる１又は複数の核酸中の配列中
    の少なくとも１個のヌクレオチドの変化の存在又は不存
    在を検出する方法であって、（ａ）該サンプルを、ハイ
    ブリダイゼーション条件下で４種類の異るヌクレオチド
    トリホスフェート、該ヌクレオチドトリホスフェートの
    重合のための試薬、及び前記変化を含有すると予想され
    る各核酸の各鎖につき１つのオリゴヌクレオチドプライ
    マーにより一緒に又は逐次的に処理し、こうして検出さ
    れるべき各異る変化を含有する各核酸鎖について、各核
    酸鎖に対して相補的な各プライマーの延長生成物を合成
    し、ここで前記１又は複数のプライマーは各異る変化を
    含有する各核酸鎖に実質的に相補的であって１つのプラ
    イマーから合成された延長生成物が、それがその相補体
    から分離された際に他のプライマーの延長生成物の合成
    のための鋳型として機能する様に選択されており； （ｂ）前記サンプルを変性条件下で処理することにより
    、検出されるべき変化が存在する場合には前記プライマ
    ー延長生成物をそれらの鋳型から分離し； （ｃ）前記サンプルを前記４種類のヌクレオチドトリホ
    スフェート、該ヌクレオチドトリホスフェートの重合の
    ための試薬及びオリゴヌクレオチドプライマーにより一
    緒に又は逐次的に処理し、こうして段階（ｂ）において
    生成した各単鎖を鋳型として使用してプライマー延長生
    成物を合成し、ここで配列変化が存在すればそれを含有
    する前記核酸の検出可能な増幅が得られるのに十分な回
    数にわたって段階（ｂ）及び（ｃ）を反復し； （ｄ）段階（ｃ）の生成物を膜に固定し； （ｅ）該膜を、ハイブリダイゼーション条件下で、プロ
    ーブの配列が前記増幅された配列のある領域に対して相
    補的である場合にのみ該増幅された核酸配列とハイブリ
    ダイズすることができるラベルされた配列特異的オリゴ
    ヌクレオチドプローブにより処理し；そして、 （ｆ）該プローブが前記核酸サンプル中の増幅された配
    列とハイブリダイズしたか否かを検出する；ことを含ん
    で成る方法。 ２、段階（ａ）に先立って前記サンプル中に含まれる前
    記核酸を該サンプルから抽出し、そして段階（ｂ）及び
    （ｃ）を少なくとも５回反復する、特許請求の範囲第１
    項に記載の方法。 ３、段階（ａ）及び（ｃ）を、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ
    ）ＤＮＡポリマラーゼ I 、Ｅ．コリＤＮＡポリメラー
    ゼ I のＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、
    熱安定性酵素、及び逆転写酵素から成る群から選択され
    た酵素を用いて行う、特許請求の範囲第１項又は第２項
    に記載の方法。 ４、配列中の前記核酸変化が癌性もしくは感染性疾患、
    鎌形赤血球貧血、ヘモグロビンＣ疾患、ヒトＨＬＡ−Ｄ
    Ｑα、−ＤＱβ、−ＤＲβ、−ＤＰαもしくは−ＤＰβ
    領域、又はミトコンドリアＤＮＡと関連している、特許
    請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の方法
    。 ５、前記サンプルが細胞を含んで成り、そして前記方法
    がさらに段階（ａ）の前に該サンプル中の核酸を露出す
    るために十分なだけ該サンプルを加熱する段階をさらに
    含んで成る、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか
    １項に記載の方法。 ６、前記サンプルが精液、髪又は血液サンプルであり、
    あるいはミトコンドリアＤＮＡを含有し、そして前記方
    法を法医学分析において使用する、特許請求の範囲第１
    項〜第５項のいずれか１項に記載の方法。 ７、サンプル中に含まれる１又は複数の核酸中の配列中
    の少なくとも１個のヌクレオチドの変化の存在又は不存
    在を検出する方法であって、（ａ）該サンプルを、ハイ
    ブリダイゼーション条件下で、４種類の異るヌクレオチ
    ドトリホスフェート、該ヌクレオチドトリホスフェート
    の重合のための試薬、及び前記変化を含有すると予想さ
    れる各核酸の各鎖につき１つのオリゴヌクレオチドプラ
    イマーにより一緒に又は逐次的に処理し、こうして検出
    されるべき各異る変化を含有する各核酸鎖について、各
    核酸鎖に対して相補的な各プライマーの延長生成物を合
    成し、ここで前記１又は複数のプライマーは各異る変化
    を含有する各核酸鎖に実質的に相補的であって１つのプ
    ライマーから合成された延長生成物が、それがその相補
    体から分離された際に他のプライマーの延長生成物の合
    成のための鋳型として機能する様に選択されており； （ｂ）前記サンプルを変性条件下で処理することにより
    、検出されるべき変化が存在する場合には前記プライマ
    ー延長生成物をそれらの鋳型から分離し； （ｃ）前記サンプルを前記４種類のヌクレオチドトリホ
    スフェート、該ヌクレオチドトリホスフェートの重合の
    ための試薬及びオリゴヌクレオチドプライマーにより一
    緒に又は逐次的に処理し、こうして段階（ｂ）において
    生成した各単鎖を鋳型として使用してプライマー延長生
    成物を合成し、ここで配列変化が存在すればそれを含有
    する前記核酸の検出可能な増幅が得られるのに十分な回
    数にわたって段階（ｂ）及び（ｃ）を反復し、そしてこ
    こで、少なくとも１つのプライマー及び／又は前記４種
    類のヌクレオチドトリホスフェートの内の少なくとも１
    種類が検出可能な成分によりラベルされており； （ｄ）オリゴヌクレオチドの配列が前記増幅された配列
    のある領域に対して相補的である場合にのみ該増幅され
    た核酸配列とハイブリダイズすることができる配列特異
    的オリゴヌクレオチドを膜に固定し； （ｅ）該膜をハイブリダイゼーション条件下で段階（ｃ
    ）の生成物によル処理し；そして、 （ｆ）前記核酸サンプル中の増幅された配列が前記膜に
    固定された前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし
    ているか否かを検出する； ことを含んで成る方法。 ８、サンプル中に含まれる１又は複数の核酸中の配列中
    の少なくとも１個のヌクレオチドの変化の存在又は不存
    在を検出する方法であって、（ａ）該サンプルを、ハイ
    ブリダイゼーション条件下で、４種類の異るヌクレオチ
    ドトリホスフェート、該ヌクレオチドトリホスフェート
    の重合のための試薬、及び前記変化を含有すると予想さ
    れる各核酸の各鎖につき１つのオリゴヌクレオチドプラ
    イマーにより一緒に又は逐次的に処理し、こうして検出
    されるべき各異る変化を含有する各核酸鎖について、各
    核酸鎖に対して相補的な各プライマーの延長生成物を合
    成し、ここで前記１又は複数のプライマーは各異る変化
    を含有する各核酸に実質的に相補的であって１つのプラ
    イマーから合成された延長生成物が、それがその相補体
    から分離された際に、他のプライマーの延長生成物の合
    成のための鋳型として機能する様に選択されており； （ｂ）前記サンプルを変性条件下で処理することにより
    、検出されるべき変化が存在する場合には前記プライマ
    ー延長生成物をそれらの鋳型から分離し； （ｃ）前記サンプルを前記４種類のヌクレオチドトリホ
    スフェート、該ヌクレオチドトリホスフェートの重合の
    ための試薬及びヌクレオチドプライマーにより一緒に又
    は逐次的に処理し、こうして段階（ｂ）において生成し
    た各単鎖を鋳型として使用してプライマー延長生成物を
    合成し、ここで配列変化が存在すればそれを含有する前
    記核酸の検出可能な増幅が得られるのに十分な回数にわ
    たって段階（ｂ）及び（ｃ）を反復し； （ｄ）プローブの配列が前記増幅された配列のある領域
    に対して相補的である場合にのみ該増幅された核酸配列
    とハイブリダイズすることができるラベルされた配列特
    異的オリゴヌクレオチドプローブを膜に固定し； （ｅ）該膜をハイブリダイゼーション条件下で段階（ｃ
    ）の生成物により処理し； （ｆ）段階（ｅ）の生成物を制限酵素により処理し、こ
    こでこの酵素は前記プローブ及び検出されるべき変化の
    両者が該酵素により認識される場合に形成されたハイブ
    リドを開裂せしめるものであり；そして （ｇ）ハイブリダイゼーションが起ったことを示す所定
    長さのラベルされた制限断片が制限酵素消化物中に存在
    するか否かを検出する； ことを含んで成る方法。 ９、サンプル中に含まれる１又は複数の核酸中の配列中
    の少なくとも１個のヌクレオチドの変化の存在又は不存
    在を検出するためのキットであって、 （ａ）検出されるべき各異る変化を含有する各核酸鎖の
    ための各オリゴヌクレオチドにつき１個の容器（このプ
    ライマーは各異る変化を含有する各鎖に対して実質的に
    相補的であって１つのプライマーから合成された延長生
    成物が、それがその相補体から分離された場合に、他の
    プライマーの延長生成物の合成のための鋳型として機能
    することができ、こうして前記変化が存在すれば１又は
    複数の増幅された核酸配列生成せしめる）； （ｂ）ハイブリダイゼーションの試薬用容器；（ｃ）４
    種類の異るヌクレオチドトリホスフェートのそれぞれの
    ための容器； （ｄ）プローブの配列が前記増幅された配列のある領域
    に対して相補的である場合にのみ該増幅された核酸配列
    とハイブリダイズすることができる各ラベルされた配列
    特異的オリゴヌクレオチドプローブにつき１個の容器；
    及び （ｅ）前記増幅された配列へのプローブのハイブリダイ
    ゼーションを検出するための試薬用容器；を有する多容
    器ユニットをまとめた形で含んで成るキット。 １０、前記プライマーがオリゴデオキシリボヌクレオチ
    ドであり、前記ヌクレオチドトリホスフェートがｄＡＴ
    Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰであり、前記プロー
    ブがラベルされており、そして配列中の前記ヌクレオチ
    ド変化が鎌形赤血球貧血、ヘモグロビンＣ疾患、ヒトＨ
    ＬＡ−ＤＱα、−ＤＱβ、−ＤＲβ、−ＤＰαもしくは
    −ＤＰβ領域、又はミトコンドリアＤＮＡと関連する、
    特許請求の範囲第９項に記載のキット。
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