JP3124529B2 - 特定のヌクレオチド配列の検出方法及びキット - Google Patents

特定のヌクレオチド配列の検出方法及びキット

Info

Publication number
JP3124529B2
JP3124529B2 JP2000052307A JP2000052307A JP3124529B2 JP 3124529 B2 JP3124529 B2 JP 3124529B2 JP 2000052307 A JP2000052307 A JP 2000052307A JP 2000052307 A JP2000052307 A JP 2000052307A JP 3124529 B2 JP3124529 B2 JP 3124529B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequence
primer
nucleic acid
sample
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2000052307A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2000189199A (ja
Inventor
アンソニー アーリッチ ヘンリー
トマス ホーン グレン
ケーイチ サイキ ランドール
バンクス マリス カリー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27126099&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP3124529(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of JP2000189199A publication Critical patent/JP2000189199A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3124529B2 publication Critical patent/JP3124529B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】この発明は、ヌクレオチド変化、
変異又は多型性（ポリモルフィズム；ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈｉｓｍ）を含有すると予想される核酸配列を増幅しそ
してこれらをドットブロット（ｄｏｔ ｂｌｏｔ）法に
おいて配列特異的オリゴヌクレオチドにより検出する方
法に関する。 【０００２】 【従来の技術】近年、組換ＤＮＡ技法の適用により多数
のヒトの遺伝的疾患の分子的基礎が説明されている。特
に、鎌形赤血球貧血のごとき遺伝的疾患と関連するヒト
ゲノムＤＮＡ中の特異的多型性制限部位（ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈｉｃ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）の
検出が出生前診断のための臨床的に価値ある情報を与え
ている。これらの研究においては、特異的部位の存在又
は不存在が制限断片長多型性（restriction fragment l
ength polymorphism; RFLP) 分析により明らかにされ
る。 【０００３】この方法においては特異的なゲノム制限断
片の長さがサザンブロッティング、及び固定化されたゲ
ノムＤＮＡとラベルされたプローブとのハイブリダイゼ
ーションにより検出される。疾患の表現型を与える変異
を含む多型性部位の直接検出において（例えば、Ｍｓｔ
II及び鎌形赤血球貧血）、並びに家族内で特定の対立遺
伝子制限部位が疾患の遺伝子座にリンクしているが一般
集団においては必然的にそうではない場合のリンケージ
研究において、ＲＦＬＰ分析が有用であることが証明さ
れている。例えば、Ｋａｎ及びDozy, PNAS (USA), 75,
5631 (1987) 、並びにＲｕｂｉｎ及び Kan, Lancet, 19
85-I, 75 (1985) を参照のこと。さらに、Ｇｅｅｖｅｒ
等、PNAS (USA), 78, 5081 (1981) 及びＷｉｌｓｏｎ
等、PNAS (USA), 79, 3628 (1982) を参照のこと。 【０００４】"オリゴマー制限" （ｏｌｉｇｏｍｅｒ
ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）と称される第２の方法におい
ては、末端ラベル化合成オリゴヌクレオチドプローブが
溶液中で標的ゲノムＤＮＡ配列にアニールされ、そして
形成されたハイブリドを開裂せしめるために制限酵素が
添加される。この方法は、その特異性が制限部位内の塩
基対のミスマッチが開裂を廃止し又は妨害する能力に依
存しており、そしてＳａｉｋｉ等、Biotechnology ,
３, 1008-1012 (1985)によりさらに十分に記載されてい
る。 【０００５】さらに、この技法の感度はポリメラーゼ連
鎖反応法を用いて増強することができ、この方法におい
ては、サンプルがまず特異的プライマー、ポリメラーゼ
及びヌクレオチドによる処理にかけられ、その後の検出
のためのシグナルの増幅が行われる。この方法はＳａｉ
ｋｉ等、Science , 230 , 1350-1353 (1985)によりさら
に十分に記載されている。 【０００６】制限部位多型とは独立である対立遺伝子変
化を検出するための第３の方法は配列特異的な合成オリ
ゴヌクレオチドプローブを使用する。Ｃｏｍｍｅｒ等、
PNAS(USA), 80, 78 (1983) を参照のこと。この後者の
技法はα１−アンチトリプシン欠損の出生前診断〔Ｋｉ
ｄｄ等、Nature, 304 , 230 (1983)、及びβ−サラセミ
ア診断Ｐｉｒａｓｔｕ等、N.Engl.J.Med., 309 , 284
(1983)〕に適用されている。さらに、この技法はサザン
ブロットを用いるＨＬＡ−ＤＲβの多型性の研究に適用
されている〔Ａｎｇｅｌｉｎｉ等PNAS (USA), 83, 4489
-4493 (1986)〕。 【０００７】この方法の基礎は、適切な条件下で１９塩
基（１９−ｍｅｒ）以上の短いオリゴヌクレオチドプロ
ーブがそれが完全にマッチする配列とのみアニールし、
１個の塩基対ミスマッチがハイブリダイゼーションを回
避するのに十分に不安定化することである。対立遺伝子
変異体（ｖａｒｉａｎｔ）の識別はゲノムＤＮＡとオリ
ゴヌクレオチド（１９−ｍｅｒ）プローブとの間のデュ
プレックスの熱安定性に基礎を置く。 【０００８】さらに、ヘテロデュプレックスを開裂せし
めるためにすい臓リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＡ）を
用いて２本鎖ＲＮＡ及びＲＮＡ：ＤＮＡヘテロデュプレ
ックス中の塩基対ミスマッチを検出するための方法が記
載されている。Ｗｉｎｔｅｒ等、PNAS (USA), 82: 7575
-7579 (1985)、及びＭｙｅｒｓ等、Science , 230 :124
2-1246 (1985)。この方法の主たる欠点は、すべてのタ
イプの塩基対ミスマッチを認識することはできないこと
である。 【０００９】ＲＦＬＰ法及びオリゴヌクレオチドプロー
ブ安定法は比較的複雑な方法であって、制限酵素消化、
ゲノムＤＮＡのゲル分画、ＤＮＡの変性、濾紙への移行
によるか又はゲル自体の乾燥によるＤＮＡの固定化、及
び固定化されたゲノム制限断片の電気泳動的に分離され
た列へのラベルされたプローブのハイブリダイゼーショ
ンを必要とする。ヒトゲノムＤＮＡの複雑さ故に、オリ
ゴヌクレオチドプローブ安定法のためにこれらの段階が
必要である。 【００１０】標的配列（ "シグナル" ）をゲノムの残り
の部分（ "ノイズ" ）から分離するために制限酵素処理
及び電気泳動が必要であり、そして標的配列をできるだ
け多く維持するためにゲル中での（フィルターへの移行
ではなく）ハイブリダイゼーションが必要である。高比
活性キナーゼ処理プローブを用いての１０ngサンプル中
のシグナルの検出には４日間のオートラジオグラフ露出
が必要である。さらに、Ｃｏｍｍｅｒ等の方法は、特異
性の理由（より短いプローブはより多くのゲノム断片と
ハイブリダイズするであろう）、及びおそらく感度の理
由のため、１９−ｍｅｒ以上のプローブを必要とする。
しかしながら、より短いプローブ（例えば１６−ｍｅ
ｒ）はより配列特異的な識別力を示すかもしれない。な
ぜなら、１個のミスマッチが一層不安定にするであろう
からである。 【００１１】 【発明が解決しようとする課題】従って、ゲノムＤＮＡ
のごとき核酸中の１個の塩基の相違を直接検出するため
の改良された感度及び特異性を有する簡便化された方法
の必要性が当業界において存在する。従って、本発明
は、あらゆるタイプの疾患又は状態の検出において使用
するための、任意の由来の核酸配列中の１又は複数の変
化を検出するための方法を提供する。この発明の方法
は、他の方法において必要な制限酵素消化、電気泳動、
及びゲルの取扱を必要としないで配列の変化を直接検出
する。さらに、本発明の方法は、プローブの改良された
特異性及び感度を提供し、０．０４μｇのサンプルを用
いて６時間以内に判断可能なシグナルを得ることができ
る。 【００１２】第３に、膜上にスポットされるサンプルの
量が０．１〜０．５μｇに増加すれば、従来の方法にお
いて使用された放射性プローブに代えて非放射性ラベル
されたオリゴヌクレオチドを使用することができる。最
後に、本発明の方法は１９−ｍｅｒより短いサイズの配
列特異的オリゴヌクレオチドの使用に適し、従ってさら
に識別力の高い配列特異的オリゴヌクレオチドの使用が
可能となる。 【００１３】 【課題を解決するための手段】具体的には、本発明はサ
ンプル中に含まれる１又は複数の核酸中の配列中の少な
くとも１個のヌクレオチドの変化の存在又は不存在を検
出ことができる方法を提供し、この方法は、 （ａ）該サンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で
４種類の異るヌクレオシドトリホスフェート、該ヌクレ
オシドトリホスフェートの重合のための試薬、及び各核
酸の各鎖につき１つのオリゴヌクレオチドプライマーに
より一緒に又は逐次的に処理し、こうして各核酸鎖につ
いて、各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの延長生
成物を合成し、ここで前記プライマーは、１つのプライ
マーから合成された延長生成物が、それがその相補体か
ら分離された際に他のプライマーの延長生成物の合成の
ための鋳型として機能する様に選択されており； 【００１４】（ｂ）前記サンプルを変性条件下で処理す
ることにより前記プライマー延長生成物をそれらの鋳型
から分離し； （ｃ）前記サンプルを前記４種類のヌクレオシドトリホ
スフェート、該ヌクレオシドトリホスフェートの重合の
ための試薬及びオリゴヌクレオチドプライマーにより一
緒に又は逐次的に処理し、こうして段階（ｂ）において
生成した各単鎖を鋳型として使用してプライマー延長生
成物を合成し、ここで前記特定のヌクレオチド配列が存
在すればそれを含有する前記核酸の検出可能な増幅が得
られるのに十分な回数にわたって段階（ｂ）及び（ｃ）
を反復し； 【００１５】（ｄ）段階（ｃ）の生成物をあらかじめゲ
ル分画することなく直接に膜に固定し； （ｅ）該膜を、ハイブリダイゼーション条件下で、プロ
ーブの配列が前記増幅された配列のある領域に対して相
補的である場合にのみ該増幅された核酸配列とハイブリ
ダイズすることができるラベルされた配列特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブにより処理し；そして、 （ｆ）該プローブが前記核酸サンプル中の増幅された配
列とハイブリダイズしたか否かを検出する；ことを含ん
で成る。 【００１６】段階（ｂ）及び（ｃ）は好ましくは５回以
上反復し、そしてさらに好ましくは、サンプルがヒトゲ
ノムＤＮＡを含む場合には１５〜３０回反復する。サン
プルが細胞を含有する場合、好ましくは段階（ａ）に先
立ってこれらを加熱してその中の核酸を試薬に対して露
出せしめる。この段階により試薬の添加前の核酸の精製
が回避される。 【００１７】この方法の変法においては、生ずる増幅さ
れた配列がラベルされる様に、プライマー及び／又はヌ
クレオチドトリホスフェートがラベルされている。この
ラベルされたプライマー及び／又はヌクレオチドトリホ
スフェートが最初に反応混合物中に存在せしめることが
でき、又は後のサイクルの間に添加することもできる。
配列特異的オリゴヌクレオチド（ラベルされていない）
を膜に固定し、そしてラベルされた増幅生成物によりハ
イブリダイゼーション条件下で処理して、増幅生成物中
に膜結合配列が存在する場合にのみハイブリダイゼーシ
ョンが起こる様にする。 【００１８】遺伝的疾患に関し、ＲＦＬＰは該疾患と関
連する多型性制限部位を必要とするが、配列特異的オリ
ゴヌクレオチドは遺伝的病変を直接検出し、そして一般
に１又は複数の塩基変異から生ずるヘモグロビンＣ疾
患、α１−アンチトリプシン及びβ−サラセミアのごと
き遺伝的疾患の分析のために一層有用である。さらに、
異る対立遺伝子を示す遺伝的変異体（ｖａｒｉａｎｔ）
間の識別（例えばＨＬＡのタイプ分け）のためにオリゴ
ヌクレオチドを使用することができ、配列特異的オリゴ
ヌクレオチドに基礎を置くＨＬＡタイプ分けキットの実
現可能性が示される。 【００１９】 【具体的な説明】"配列中のヌクレオチドの変化" なる
語は１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入
のいずれにも関する。これらのヌクレオチドの変化は変
異であっても、又は多型性対立遺伝子変化であってもよ
い。従って、本発明の方法は１塩基変異、付加及び欠失
により惹起されるβ−グロビン遺伝子疾患（幾つかのβ
−サラセミア、鎌状赤血球貧血、ヘモグロビンＣ疾患
等）において生ずる様な核酸中の１ヌクレオチドの変化
を検出することができ、さらにα−サラセミア及び幾つ
かのβ−サラセミアと関連する様な多数の塩基変化を検
出することができる。 【００２０】この方法はまた、疾患と必然的に関連する
わけではなく２個以上の異るヌクレオチド配列（置換さ
れたヌクレオチド塩基対、欠失したヌクレオチド塩基対
又は挿入されたヌクレオチド塩基対のいずれか）がその
集団の核酸中の特定の部位、例えばヒト−ゲノムのＨＬ
Ａ領域に存在することができる単なる状態である多型、
及びミトコンドリアＤＮＡにおけるごとき不規則多型
（ｒａｎｄｏｍ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出す
ることができる。後に詳細に記載する多型性配列特異的
オリゴヌクレオチドプローブを、インシュリン依存糖尿
病のごとき疾患と関連する遺伝マーカーとして、又は法
医学用途において使用することができる。核酸配列が２
本鎖である場合、配列中のヌクレオチド変化は配列中の
塩基対変化となる。 【００２１】この明細書において使用される場合、 "オ
リゴヌクレオチド" なる語は、２以上のそして好ましく
は３以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオ
チドから成る分子として定義される。その正確なサイズ
は多くの因子に依存し、これらの因子は該オリゴヌクレ
オチドの最終用途又は機能に依存するであろう。オリゴ
ヌクレオチドは合成により、又はクローニングにより得
ることができる。 【００２２】この明細書において使用する場合、 "プラ
イマー" なる語は、核酸鎖に対して相補的であるプライ
マー延長生成物の合成が誘導される条件下、すなわち４
種類の異るヌクレオチドトリホスフェート及びＤＮＡポ
リメラーゼのごとき重合のための試薬の存在下、適当な
緩衝液（ここで "緩衝" とはpH、イオン強度、コファク
ター等を包含する）中、そして適当な温度に置かれた場
合に、合成の開始点として機能することができるオリゴ
ヌクレオチドであって、精製された制限酵素消化物であ
っても合成的に製造されたものであってもよい。 【００２３】プライマーは好ましくは増幅における最大
効率のために単鎖であるが、しかしこれに代って２本鎖
であってもよい。２本鎖である場合、延長生成物の調製
のために使用する前に、その鎖を分離するためにプライ
マーをまず処理する。好ましくは、プライマーはオリゴ
デオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合
のための試薬の存在下で延長生成物の合成を開始（プラ
イム）するために十分な長さを有しなければならない。 【００２４】プライマーの正確な長さは、温度、プライ
マーの由来及び使用する方法を含む多くの因子に依存す
るであろう。例えば、標的配列の複雑さに依存して、オ
リゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５〜２５ヌ
クレオチドを含有するが、より多くの又はより少数のヌ
クレオチドを含むこともできる。短いプライマー分子は
一般に鋳型との十分に安定なハイブリド複合体を形成す
るために一層低い温度を必要とする。 【００２５】この発明においてプライマーは、増幅され
るべき各特定の配列の異る鎖に対して "実質的に" 相補
的である様に選択される。これは、プライマーがそれら
の対応する鎖とハイブリダイズするのに十分な程度に相
補的でなければならないことを意味する。従って、プラ
イマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。
例えば、プライマーの５′−末端に非相補的ヌクレオチ
ド断片が付加されており、プライマー配列の残りの部分
が鎖に対して相補的であってもよい。典型的には、最良
の検出結果を得るためにプライマーは正確な相補性を有
する。 【００２６】"配列特異的オリゴヌクレオチド" なる語
は、検出されるべきヌクレオチド変化をまたぎそして検
出されるべき配列変化に特異的な特定の配列（対立遺伝
子上に含まれるか否かを問わない）にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドに関する。後で詳細に記載する様
に分析されるべき配列に依存して、各配列について１又
は複数の配列特異的オリゴヌクレオチドを使用すること
ができる。 【００２７】この明細書において使用する場合、 "熱安
定性酵素" は、熱に対して安定でありそして熱耐性であ
り、そして各核酸鎖に対して相補的であるプライマー延
長生成物を形成するために適切な態様でのヌクレオチド
の結合を触媒する（促進する）酵素を意味する。一般
に、合成は各プライマーの３′−末端から開始され、そ
して合成が停止するまで鋳型にそって５′方向に進行
し、異る長さの分子を生成せしめる。しかしながら、上
記と同じ方法を用いて、５′−末端から合成を開始しそ
して他の方向に進行する熱安定性酵素も存在する。精製
された熱安定性酵素は、例８においてさらに詳細に記載
する。 【００２８】この発明は、１又は複数の核酸中に存在す
ると予想される任意の１又は複数の特定の核酸配列（１
又は複数のヌクレオチド変化を含有するものとして定義
される）を増幅するための方法に向けられる。一般に、
この発明の方法は、用いられる反応段数に対して指数的
量において少なくとも１つの特定の核酸配列を生成せし
める連鎖反応を用い、この場合（ａ）所望の配列の末端
がそれらにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合
成することができるために十分に詳細に知られているこ
と、及び（ｂ）連鎖反応を開始するために少量の配列が
利用できることが条件となる。連鎖反応の生成物は使用
される特定のプライマーの末端に対応する末端を有する
個別の核酸ディュプレックスである。 【００２９】検出されるべき配列を含有することが予想
される限り、精製されているか又は未精製の形のあらゆ
る核酸を出発核酸として使用することができる。従っ
て、この方法は例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばメッセ
ンジャーＲＮＡを用いることができ、このＤＮＡ又はＲ
ＮＡは単鎖でも２本鎖でもよい。さらに、各１本鎖を含
有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドを使用することができ
る。これらの核酸のいずれかの混合物も使用することが
でき、又は同一のもしくは異るプライマーを用いる前ハ
イブリダイゼーション反応から調製された核酸を使用す
ることもできる。増幅されるべき特定の核酸配列はより
大きな分子の部分でもよく、又は特定の配列が完全な核
酸を構成するように初めから個別の分子として存在する
こともできる。 【００３０】増幅されるべき配列が最初から純粋な形で
存在する必要はなく、複雑な混合物の小部分、例えば全
ヒトＤＮＡ中に含まれる小部分、又は特定の生物学的サ
ンプルの非常に小さい部分を構成する特定の微生物に基
く核酸配列の部分であってもよい。出発核酸は、同一で
あるか又は異る１以上の特定の核酸配列を含有すること
ができる。従って、この方法は多量の１つの特定の核酸
配列の製造のためのみならず、配列中に１個より多くの
塩基対変化が存在する場合には同一又は異る核酸分子上
に位置する１種類より多くの異る特定の核酸配列を同時
に増幅するためにも有用である。 【００３１】任意の起原から、例えばｐＢＲ３２２のご
ときプラスミドから、クローン化されたＤＮＡもしくは
ＲＮＡから、又は細菌、酵母、ウイルス、オルガネラ、
及び植物もしくは動物のごとき高等生物を含むあらゆる
起原からの天然ＤＮＡもしくはＲＮＡから、核酸を得る
ことができる。ＤＮＡ又はＲＮＡは、種々の技法、例え
はＭａｎｉａｔｉｓ等、Molecular Cloning (1982), 28
0-281 により記載されている技法により、血液、組織材
料、例えば絨毛又は羊膜（もしくは羊水）細胞等から抽
出することができる。 【００３２】細胞を低張緩衝液中に懸濁しそして約９０
〜１００℃にて細胞溶解又は細胞内成分の分散が起こる
まで加熱した場合、核酸を精製することなく細胞を直接
使用することができる。加熱段階の後、増幅試薬を溶解
した細胞に直接添加することができる。この直接細胞検
出法は末梢血リンパ球及び羊膜（羊水）細胞に対して使
用することができる。 【００３３】この発明の方法により任意の特定の核酸配
列を増幅することができる。必要なことは、配列の両端
の十分な数の塩基が十分に詳細に知られており、その結
果、１つのプライマーから合成された延長生成物が、そ
れがその鋳型（相補体）から分離された場合に、規定さ
れた長さの核酸への他のプライマーの延長のための鋳型
として機能し得る様に所望の配列上の相対位置において
該配列の異る鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌク
レオチドを調製することができることのみである。配列
の両端の塩基についての知識が多くなるに従って標的核
酸配列に対するプライマーの特異性を一層大きくするこ
とができ、そしてそれ故にこの方法の効率を一層高める
ことができる。 【００３４】今後使用する "プライマー" なる語は、増
幅されるべき断片の末端配列に関する情報に幾らかのあ
いまいさが存在する場合特に、１種類より多くのプライ
マーを意味することができる。例えば、核酸配列が蛋白
質配列情報から推定される場合、遺伝コードの縮重に基
く可能性あるすべてのコドンの多様性を代表する配列を
含むプライマーの集合が各鎖について使用されよう。こ
の集合中の１つのプライマーが増幅されるべき所望の配
列の末端と相同であろう。 【００３５】任意の適当な方法、例えばヌクレオシド誘
導体からの核酸の有機合成を用いてオリゴヌクレオチド
プライマーを調製することができる。この合成は溶液中
で又は固体支持体上で行うことができる。有機合成の１
つのタイプはホスホトリエステル法であり、この方法は
遺伝子断片又は短い遺伝を調製するためにすでに使用さ
れているものである。ホスホトリエステル法において
は、オリゴヌクレオチドが合成され、これは次により長
い核酸を形成するために連結され得る。この方法の記載
についてはＮａｒａｎｇ Ｓ．Ａ．等、Meth.Enzymol.,
68, 90 (1979)、及び米国特許No．４，３５６，２７
０を参照のこと。この特許はソマトスタチン遺伝子の合
成及びクローニングを記載している。 【００３６】有機合成の第２のタイプはホスホジエステ
ル法であり、この方法はｔＲＮＡ遺伝子の調製のために
使用されている。この方法の記載についてはＢｒｏｗ
ｎ，Ｅ．Ｌ．等、Meth.Enzymol., 68, 109 (1979)を参
照のこと。ホスホトリエステル法の場合と同様、このホ
スホジエステル法はオリゴヌクレオチドの合成を含み、
このオリゴヌクレオチドは次に所望の核酸を形成するた
めに連結される。これらの方法の自動化された態様を用
いることもできる。１つのこの様な自動化された態様に
おいては、出発材料としてジエチルホスホラミダイトが
使用され、そしてＢｅａｕｃａｇｅ等、Tetrahedron Le
tters (1981), 22: 1859-1862 により記載されている様
にして合成される。修飾された固体支持体上でオリゴヌ
クレオチドを合成するための１つの方法は米国特許No.
４，４５８，０６６に記載されている。生物起原から単
離されたプライマー（例えば、制限エンドヌクレアーゼ
消化物）を使用することもできる。 【００３７】特定の核酸配列が、鋳型としてその配列を
含む核酸を用いて製造される。核酸が２本の鎖を含む場
合、該核酸を鋳型として使用する前に、プライマー延長
生成物の合成と同時に又は別の段階として、該核酸の鎖
を分離する必要がある。この鎖分離は物理的手段、化学
的手段、又は酵素的手段を含む任意の適当な変性法によ
り達成することができる。核酸の鎖を分離するための１
つの物理的方法は、核酸が完全に（９９％以上）変性す
るまでそれを加熱することを含む。典型的な熱変性は約
１〜１０分間にわたる約８０℃〜１０５℃の温度を用い
る。 【００３８】鎖分離はまた、ヘリカーゼ（ｈｅｌｉｃａ
ｓｅ）群の酵素、又はヘリカーゼ活性を有しそしてリボ
ＡＴＰの存在下でＤＮＡを変性することが知られている
酵素ＲｅｃＡによって誘導することもできる。ヘリカー
ゼを用いて核酸の鎖を分離するために適当な反応条件は
Kuhn Hoffmann-Berling, CSH-Quantitative Biology,
43: 63 (1978) により記載されており、そしてＲｅｃＡ
を用いる技法は C.Radding, Ann.Rev.Genetics, 16: 40
5-37 (1982) に総説されている。 【００３９】増幅されるべき配列変化を含有するものと
の核酸が単鎖であれば、それに１又は２種類のオリゴヌ
クレオチドプライマーを添加することによりその相補体
を合成する。適切な１個のプライマーを加えれば、該プ
ライマー、重合のための試薬及び下記の４種類のヌクレ
オチドトリホスフェートの存在下でプライマー延長生成
物が合成される。この生成物は前記単鎖核酸に対して部
分的に相補的であり、そして該核酸鎖とハイブリダイズ
して異る長さの鎖から成るデュプレックスを形成する。
これは次に、上記の様にして単鎖に分離されて２本の分
離された相補的単鎖を生成する。他の方法として、２種
類の適切なプライマーを単鎖核酸に加え、そして反応を
行うことができる。 【００４０】もとの核酸が増幅されるべき変化を含む全
体配列を構成する場合、生成するプライマー延長生成物
はもとの核酸の鎖に完全に相補的であり、そしてそれと
ハイブリダイズして同じ長さの鎖から成るデュプレック
スを形成し、これが単鎖分子に分離されるであろう。核
酸が最初に２本鎖であっても１本鎖であっても、核酸の
相補的鎖が分離される場合、その鎖は追加の核酸鎖の合
成のための鋳型として容易に使用される。この合成は、
任意の適当な方法を用いて行うことができる。これは一
般に、緩衝化された水性溶液中で、好ましくは７〜９の
pH、最も好ましくは約pH８において起こる。好ましく
は、一定モル過剰の（クローン化ＤＮＡについは通常１
０００：１＝プライマー：鋳型であり、そしてゲノム核
酸についてはおよそ１０6 ：１＝プライマー：鋳型であ
る）２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを、分離さ
れた鋳型鎖を含有する緩衝液に加える。 【００４１】しかしながら、診断用途のためにこの方法
が使用される場合相補鎖の量がわからず、従って相補鎖
の量に対するプライマーの量を正確に決定することはで
きないことが理解されよう。しかしながら実際問題とし
て、増幅されるべき配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物中
に含まれる場合、添加されるプライマーの量は相補鎖
（鋳型）の量に対してモル過剰であろう。方法の効率を
改良するため、大モル過剰が好ましい。 【００４２】デオキシリボヌクレオシドトリホスフェー
トｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びＴＴＰも適当な量
において合成混合物に加え、そして得られる混合物を約
９０℃〜１００℃にて約１〜１０分間、好ましくは１〜
４分間加熱する。この加熱期間の後、溶液を室温に放冷
する。これはプライマーハイブリダイゼーションのため
に好ましい。この冷却された混合物に重合のための試薬
を添加し、そして当業界において知られている条件下で
反応を行う。この合成反応は、室温からそれより高温に
おいては誘導剤がもはや効率的に機能しなくなる温度ま
での範囲において起こる。従って例えば、重合剤として
Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、温度は一
般に約４０℃より高くない。最も好ましくは、反応は室
温において起こる。 【００４３】ヌクレオチドトリホスフェートの重合のた
めの試薬は、プライマー延長生成物の合成達成するため
に機能する任意の化合物又は系、例えば酵素である。こ
の目的のための適当な酵素には、例えばＥ．コリＤＮＡ
ポリメラーゼＩ、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌ
ｅｎｏｗ断面、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手可能
なＤＮＡポリメラーゼ類、逆転写酵素、及び他の酵素、
例えば各核酸鎖に相補的であるプライマー延長生成物を
形成するために適当な態様でのヌクレオチドの結合を促
進する熱安定性酵素が含まれる。 【００４４】一般に、合成は各プライマーの３′末端か
ら始まりそして合成が停止するまで鋳型鎖にそって５′
方向に進行し、異る長さの分子を生成せしめる。しかし
ながら、上記と同じ方法を使用して５′から合成を開始
しそして他の方向に進行せしめる重合剤も存在する。新
しく合成された鎖、及びその相補的核酸鎖は２本鎖分子
を形成し、これはこの方法の後続の段階で使用される。
次の段階において、前記の任意の方法を用いて２本鎖分
子の鎖を分離し、単鎖分子を得る。 【００４５】単鎖分子上で新たな核酸が合成される。上
記の条件下で反応が進行するために必要であれば、重合
のための追加の試薬、ヌクレオチド及びプライマーを添
加することができる。やはり、合成はオリゴヌクレオチ
ドプライマーの一端から始りそして鋳型の単鎖にそって
進行して追加の核酸を生成するであろう。この段階の
後、延長生成物の半数は２つのプライマーにより挾まれ
た特定の核酸配列から成るであろう。 【００４６】鎖分離の段階及び延長生成物の合成の段階
を、所望量の特定の核酸配列を生成せしめるのに必要な
回数反復することができる。後でさらに詳細に記載する
様に、生成する特定の核酸配列の量は指数的に貯積する
であろう。最初の核酸又は核酸混合物から１種類より多
くの特定の核酸配列を製造する事が望まれる場合、適切
な数の異るオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。例
えば、２種類の異る特定の核酸配列を製造する場合、４
種類のプライマーを用いる。２種類のプライマーは特定
の核酸配列の１つに対して特異的であり、そして他の２
種類のプライマーは第２の特定の核酸配列に対して特異
的である。こうして、この発明の方法により２種類の異
る特定の配列を指数的に製造することができる。 【００４７】この発明の方法は、各段階の後に新たな試
薬を加えながら段階的に行うことができ、あるいはすべ
ての試薬を最初の段階で加えて同時的に行うことがで
き、あるいはまた一定数の段階の後に新たな試薬を加え
ながら半段階的半同時的に行うことができる。熱感受性
酵素の場合の様に誘導剤を不活性化する鎖分離法、例え
ば加熱を用いる場合、各鎖分離段階の後に重合剤を補充
する必要がある。鎖分離段階のために酵素的手段が使用
される場合、同時法を用いることができる。同時法にお
いては、反応混合物は、所望の配列を含有する核酸鎖の
ほかに、鎖分離酵素（例えばヘリカーゼ）、鎖分離酵素
のための適当なエネルギー源、例えばｒＡＴＰ、４種類
のヌクレオチド、モル過剰量のオリゴヌクレオチドプラ
イマー、及び誘導剤、例えばＥ．コリＤＮＡポリメラー
ゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を含有するであろう。 【００４８】同時法において変性のために熱を使用する
場合、その温度において核酸が平衡状態の単鎖と２本鎖
とから成るような上昇した温度、重合剤に依存して好ま
しくは６５℃〜９０℃において機能し得る熱安定性酵
素、例えば熱安定性ポリメラーゼを使用することができ
る。より短い核酸のためには、約５０℃というより低い
温度を使用することができる。上方温度は、その温度で
酵素が破壊されるような温度、又はそれより高温におい
ては不十分なレベルのプライマーハイブリダイゼーショ
ンが起るような温度に依存するであろう。 【００４９】この様な熱安定性酵素は例えばＡ．Ｓ．Ｋ
ａｌｅｄｉｎ等、Biokhimiya, 45,644-651 (1980)によ
り記載されている。すべての試薬が最初から存在するに
もかかわらず、この方法の各段階は逐次的に起こるであ
ろう。必要に応じて追加の材料を添加することができ
る。所望量の特定の核酸配列を生成せしめるのに適当な
時間が経過した後、任意の既知の方法により酵素を不活
性化することにより、又は反応の成分を分離することに
より反応を停止せしめる。 【００５０】熱安定性酵素を用いる他の方法において
は、段階（ａ）においてプライマー、酵素及びヌクレオ
チドトリホスフェートを核酸サンプルと接触せしめる。
段階（ｂ）においてこの混合物を処理して核酸を変性せ
しめ、そして核酸サンプル中の相補的配列にプライマー
がハイブリダイズする温度においてインキュベートす
る。段階（ｃ）において、この混合物を、効果的な時間
にわたって、そして酵素の活性を促進しそして増幅され
るべき各異る配列について各核酸鎖鋳型に対して相補的
である各プライマーの延長生成物を合成するためには効
果的であるがしかし各延長生成物をその相補鎖から分離
する程には高くない温度において加熱する。 【００５１】段階（ｄ）においては、前記の混合物を、
プライマー延長生成物をそれらがその上で合成された鋳
型から分離して単鎖を生成せしめるのに効果的な時間に
わたってそしてその様に効果的な温度において、しかし
酵素を非可逆的に変性せしめる程高くない温度において
加熱する。段階（ｅ）においては、前記混合物を、段階
（ｄ）において生成した各単鎖分子への各プライマーハ
イブリダイゼーションを促進するために効果的な時間に
わたって、そしてその様に効果的な温度に冷却する。 【００５２】最後に、段階（ｆ）において、前記混合物
を、酵素の活性を促進しそして増幅されるべき各異る配
列について段階（ｄ）において生成した各核酸鎖鋳型に
対して相補的である各プライマーの延長生成物を合成す
るために効果的な時間にわたって、そしてその様に効果
的な温度において、しかし各延長生成物をその相補鎖鋳
型から分離する程には高くない温度において加熱する。
この場合、段階（ｅ）及び（ｆ）は同時に行うこともで
き、又は逐次的に行うこともできる。 【００５３】この発明の方法において使用することがで
きる好ましい熱安定性酵素はサーマス・アクアチカス
（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から抽出され
そして精製され、そして約８６，０００〜９０，０００
ダルトンの分子量を有する。この酵素は、例８において
さらに詳細に記載する。この発明の方法は連続的に行う
ことができる。熱安定性酵素を使用するこの発明の自動
化された方法の１つの好ましい態様においては、変性領
域、プライマーアニーリング領域及び反応領域を通じて
反応を循環せしめる。他の態様においては、プライマー
延長生成物の合成のために使用される酵素をカラム中に
固定化することができる。他の反応成分をポンプにより
直列のカラム及び加熱コイルを通して連続的に循環せし
めることができ、こうして、酵素を不活性化することな
く、生成した核酸を繰り返し変性せしめることができ
る。 【００５４】熱安定性酵素を使用せずそして温度を上げ
下げする１つの好ましい態様においては、そのための１
つの装置としてこの発明の増幅反応を取り扱うための自
動化された機械を使用する。要約すれば、この装置は、
第一受器に調節された温度において貯蔵された酵素の第
二受器への液体輸送を行うためのコンピューター制御さ
れた液体取扱系を用いており、該第二受器の温度は一定
のインキュベーションプロフィールに合致する様に制御
される。第二受器は増幅されるべき核酸配列並びにヌク
レオチドトリホスフェート類及びプライマーを貯蔵す
る。コンピューターは、増幅過程の種々の段階の特徴、
例えばインキュベーションの時間及び温度、輸送すべき
酵素の量等を制御するプロセスパラメーターを使用者が
入力するためのインターフェースを有する。 【００５５】熱安定性酵素の使用のために特に適合した
好ましい機械は、いずれのサイクルにおいても酵素を輸
送する必要がないために液体取扱系を伴わない温度循環
を用いる。要約すれば、この装置は次の系から成る。 １．ヌクレオチドトリホスフェート、プライマー、核酸
配列及び酵素の反応混合物を含有する一定数のチュー
ブ、好ましくは５００μｌチューブを保持するための熱
伝導性容器。 ２．前記熱伝導性容器を室温より高温又は低温に加熱
し、冷却し、そして維持するための手段。この手段は該
容器が加熱され、冷却され又は維持される温度を制御す
るための制御シグナルを受理するための入力部を有す
る。（これは、トレントン、Ｎ．Ｊ．の Materials Ele
ctronics Products Corporation から入手できるＰｅｌ
ｔｉｅｒヒートポンプ、又は水熱交換器であることがで
きる。） 【００５６】３．前記手段の入力部に接続されたコンピ
ューター手段（例えば、マイクロプロセッサー・コント
ローラー）であって、増幅過程、温度レベル、及び温度
勾配及び持続時間を自動的に制御するシグナルを発生さ
せるためのもの。次に、増幅工程を模式的に記載する。
相補的な鎖〔Ｓ+ 〕及び〔Ｓ- 〕を含んで成る所望の配
列〔Ｓ〕を含有する２本鎖ＤＮＡが核酸として使用され
る。第１の及びこれに続く各反応サイクルの間、もとの
鋳型上での各オリゴヌクレオチドプライマーの延長が、
プライマーの１つのみにより停止する無限長の新しいｓ
ｓＤＮＡ分子生成物を生成する。今後 "長生成物" と称
するこれらの生成物は直線的に蓄積するであろう。すな
わち、ある数のサイクルの後に存在する量がサイクル数
に比例するであろう。 【００５７】こうして生成された長生成物は、その後の
サイクルの間一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライ
マーの鋳型として機能し、そして所望の配列〔Ｓ+ 〕又
は〔Ｓ- 〕の分子を生成するであろう。これらの分子も
また、一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの
鋳型として機能してさらに〔Ｓ+ 〕及び〔Ｓ- 〕を生成
し、そしてそれ故に、サイクル数に対して指数的速度で
の〔Ｓ〕の蓄積をもたらすであろう連鎖反応が継続され
得る。意図されるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼー
ション以外のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンにより生成される副産物は自己触媒的ではなく、そし
てそれ故に直線的速度で蓄積する。 【００５８】 【表１】【００５９】 【表２】【００６０】 【表３】【００６１】 【表４】【００６２】１つのプライマーのオリゴヌクレオチド配
列で停止する各鎖及び他方の相補鎖は生成することが所
望される特定の核酸鎖〔Ｓ〕であることがわかる。この
工程の段階は無限に反復することができ、プライマー１
及び２、誘導剤及び存在するヌクレオチドによってのみ
限定される。もとのヌクレオチドは複製されないので、
その量は全工程を通じて一定に維持される。長生成物は
もとの核酸からのみ生成されるのでその量は直線的に増
加する。特異的配列の量は指数的に増加する。すなわ
ち、特異的配列は支配的な種となる。これは次の表に示
される。この表は、各サイクルの効率を１００％とし
て、ｎサイクル後に存在する種の相対量を示す。 【００６３】 【表５】 【００６４】鋳型として単鎖ヌクレオチドが使用される
場合、サイクル当り１個のみの長生成物が生成する。こ
の反応のサイクルの必要回数は例えばサンプルの性質に
存在するであろう。分析されるべきサンプルが純粋であ
れば、より少いサイクル数で足りよう。サンプルが核酸
の複雑な混合物である場合、シグナルをこの発明の方法
により検出するのに十分に増幅するためにはより多くの
サイクルが必要であろう。ヒト−ゲノムＤＮＡについて
は、明瞭な検出可能なシグナルが生成するように十分に
配列を増幅するため（すなわちバックグラウンドノイズ
が検出を妨害しないため）、好ましくは１５〜３０サイ
クルを行う。 【００６５】この発明の１つの態様においては、配列変
化を含むことが予想される増幅されたサンプルを、それ
が癌、感染性疾患、遺伝病、又は正常な遺伝的多型（ポ
リモルフィズム）のいずれに由来するものであっても、
一連の膜に直接スポットし、そして各膜を異るラベルさ
れた配列特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリ
ダイズせしめる。サンプルを膜にスポットするための１
つの方法はＫａｆｏｔｏｓ等、Nucleic Acids Researc
h, ７, 1541-1522 (1979)に記載されている。 【００６６】要約すれば、プローブの添加に先立って、
ドデシル硫酸ナトリウム、フィコール、血清アルブミン
及び種々の塩を含有するハイブリダイゼーション溶液で
前処理することによりＤＮＡサンプルを膜に固定する。
次に、検出されるべき各配列に特異的なラベルされたオ
リゴヌクレオチドプローブを、プレハイブリダイゼーシ
ョン溶液に類似するハイブリダイゼーション溶液に加え
る。ハイブリダイゼーション溶液を膜に適用し、そして
膜をハイブリダイゼーション条件にかける。この条件は
プローブのタイプ及び長さ、成分のタイプ及び濃度等に
依存するであろう。 【００６７】一般に、ハイブリダイゼーションは約２５
℃〜７５℃、好ましくは３５℃〜６５℃において０．２
５〜５０時間、好ましくは３時間未満にわたって行う。
条件のストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｍｃｙ）が
大になるに従ってプローブとサンプルの間のハイブリダ
イゼーションのために要求される相補性が大になる。バ
ックグラウンドのレベルが高い場合、従ってストリンジ
ェンシーが増加されるであろう。ストリンジェンシーは
また洗浄とも関連する場合がある。 【００６８】ハイブリダイゼーションの後、任意の適当
な手段を用いて、例えば種々の濃度の標準塩リン酸塩Ｅ
ＤＴＡ溶液（ＳＳＰＥ）（１８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０
ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨＰＯ4 及び１Ｍ ＥＤ
ＴＡ、pH７．４）により１回又は複数回、２５℃〜７５
℃にて、温度に依存して約１０分間〜１時間、サンプル
を洗浄してハイブリダイズしていないプローブを除去す
る。次に、任意の適当な検出手段によりラベルを検出す
る。 【００６９】この発明において用いられる配列特異的オ
リゴヌクレオチドは、プライマーの調製及び選択につい
て前記したのと一般的に同様にして調製されそして選択
されたオリゴヌクレオチドである。配列特異的オリゴヌ
クレオチドは検出されるべきヌクレオチド変化をまたぐ
配列の領域を包含しなければならず、そして検出される
べきヌクレオチド変化に特異的でなければならない。 【００７０】例えば、サンプルが鎌形赤血球貧血の変異
を含有するか否かを検出することが所望される場合に
は、正常なβ−グロビン遺伝子に特異的なヌクレオチド
配列部位を含有する１つのオリゴヌクレオチドが調製さ
れ、そして鎌形赤血球貧血対立遺伝子に特異的なヌクレ
オチド配列を含有する１つのオリゴヌクレオチドが調製
されよう。各オリゴヌクレオチドを同じサンプルの複製
物にハイブリダイズせしめて、サンプルが変異を含有す
るか否かを決定する。 【００７１】ＨＬＡクラスIIの多型性領域は第２エクソ
ンの特定の領域に位置し、そして保存された配列に挟ま
れており、従って第２エクソンの保存された５′及び
３′未満の相対する鎖に対して相補的なオリゴヌクレオ
チドプライマーを調製することができる。ＨＬＡクラス
II遺伝子の多型性領域の検出のために使用されるオリゴ
ヌクレオチドの数は遺伝子のタイプに依存するであろ
う。この遺伝子は、密集しているか又は分かれて分布し
ている塩基対変異の領域を有する。 【００７２】この領域がＨＬＡ−ＤＱαの場合のように
密集しておれば各対立遺伝子のために１つのオリゴヌク
レオチドが使用される。ＨＬＡ−ＤＱβ及びＨＬＡ−Ｄ
Ｒβの場合のようにこの領域が分かれて分布しておれ
ば、対立遺伝子変化をそれぞれが含む１種類より多くの
プローブが各対立遺伝子のために使用されよう。ＨＬＡ
−ＤＱβ及びＨＬＡ−ＤＲβの場合、対立遺伝子変化が
存在するであろう遺伝子座の３つの領域のために３種類
のプローブが使用される。インシュリン依存性糖尿病
（ＩＤＤＭ）に関連する配列の検出のためにはＨＬＡ−
ＤＲβ第２エクソンのために４種類のプローブが使用さ
れる。 【００７３】家族における分離解析（ｓｅｇｒｏｇａｔ
ｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）から又は固体のＤＮＡサン
プルの直接分析からハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐ
ｅ）を推定することができる。配列特異的オリゴヌクレ
オチドの特定の対立遺伝子組合せ（ハプロタイプ）を、
ヘテロ接合細胞において、増幅に先立つゲノムＤＮＡの
制限酵素消化を用いることによって同定することができ
る。例えば、ＤＱβにおいて１つの増幅される領域内に
高度に可変性の３つの亜領域Ａ，Ｂ及びＣが見出され、
そして各領域に６つの異る配列（Ａ１〜６，Ｂ１〜６，
Ｃ１〜６）が存在する場合、配列特異的オリゴヌクレオ
チドプローブによりＤＱβ遺伝子座において個体がＡ
１，Ａ２；Ｂ２，Ｂ３；Ｃ１，Ｃ４を含有するものとし
てタイプ分けされれば、可能性あるハプロタイプの組み
合わせはＡ１，Ｂ２，Ｃ１；Ａ１，Ｂ２，Ｃ４；Ａ２，
Ｂ２，Ｃ１；Ａ２，Ｂ２，Ｃ４；Ａ１，Ｂ３，Ｃ１；Ａ
１，Ｂ３，Ｃ４；Ａ１，Ｂ２，Ｃ１；及びＡ１，Ｂ２，
Ｃ４であろう。 【００７４】もしゲノムＤＮＡが増幅に先立って多型性
制限酵素により消化され、そしてもし該酵素がプライマ
ー間の両対立遺伝子を切断すれば、増幅が起こらないた
め特異的プローブとの反応性が存在せず、そして結果は
情報に欠ける。しかしながら、もし該酵素が１つの対立
遺伝子のみを切断すれば、消化されたＤＮＡ及び未消化
ＤＮＡについてのプローブ反応性パターンを比較するこ
とにより両ハプロタイプを推定することができる。 【００７５】切断されていないゲノムＤＮＡ及び多型性
でありそしてプライマー間を認識することが知られてい
る１種類又は複数種類の酵素で切断されたゲノムＤＮＡ
と配列特異的オリゴヌクレオチドとの反応性を比較する
ことによりハプロタイプを推定することができる。配列
特異的オリゴヌクレオチドの長さは多くの因子、例えば
検出されるべき特定の標的分子、オリゴヌクレオチドの
起原、及びヌクレオチド組成に依存するであろう。この
発明の目的のためには、プローブは典型的には１５〜２
５ヌクレオチドを含有するが、より多数の、又はより少
数のヌクレオチドを含むこともできる。 【００７６】１９−ｍｅｒ以上の長さのオリゴヌクレオ
チド特異性及び／又は感度を増強するが、１９−ｍｅｒ
より短かい、例えば１６−ｍｅｒのプローブが一層配列
特異的な識別を示し、これはおそらく１個のミスマッチ
が一層不安定にするからであろう。増幅が特異性を増加
し、より長いことが必須ではなくなり、そしてハイブリ
ダイゼーション及び洗浄の温度を同じ塩濃度において低
くすることができるから、１９−ｍｅｒより短いプロー
ブを使用することが好ましい。 【００７７】サンプルをまず膜上に置きそして次にオリ
ゴヌクレオチドを用いて検出する場合、該オリゴヌクレ
オチドは安定なラベル成分によってラベルされていなけ
ればならず、このラベル成分は分光的手段、光学的手
段、生化学的手段、免疫化学的手段、又は化学的手段に
より検出される。免疫化学的手段は、適当な条件下でオ
リゴヌクレオチドと共に複合体を形成することができる
状体を含み、そして生化学的手段は適切な条件下でオリ
ゴヌクレオチドと複合体を形成することができるポリペ
プチド又はレクチンを含む。例えば、螢光色素、電子密
度試薬、不溶性の反応生成物を沈澱せしめることができ
るかもしくは色発により検出され得る酵素、例えばアル
カリ性ホスファターゼ、放射性ラベル、例えば32Ｐ、又
はビオチンが含まれる。ビオチンを使用する場合、これ
をオリゴヌクレオチドに付加するためにスペーサーを使
用することができる。 【００７８】他の方法として、１つの“逆”ドットブロ
ット方式においては、少なくとも１種類のプライマー及
び／又は４種類のヌクレオチドトリホスフェートの内の
少なくとも１種を検出可能なラベルによりラベルし、こ
うすることにより生ずる増幅された配列をラベルする。
これらのラベルされた成分は最初に反応混合物中に存在
することができ、又は後のサイクル中に添加される。次
に、配列中に変化が存在すれば増幅された核酸配列とハ
イブリダイズすることができるラベルされていない配列
特異的オリゴヌクレオチドを、前記のプレハイブリダイ
ゼーション条件下で膜上にスポット（膜に固定）する。 【００７９】次に、この前処理された膜に増幅されたサ
ンプルを前記のハイブリダイゼーション条件下で加え
る。最後に、検出手段を用いて、核酸サンプル中の増幅
された配列が膜に固定されたオリゴヌクレオチドにハイ
ブリダイズしたか否かを決定する。増幅生成物中に変化
を含有する膜結合配列が存在する場合のみ、すなわちプ
ローブの配列が増幅された配列のある領域に対して相補
的である場合のみハイブリダイゼーションが起こるであ
ろう。 【００８０】“逆”ドットブロット方式の他の変法にお
いては、前記の“順”ドットブロット方式の場合の様に
ラベルを用いないで増幅を行い、そしてもし存在すると
すれば変化を含有する増幅された核酸配列とハイブリダ
イズすることができるラベルされた配列特異的オリゴヌ
クレオチドプローブを前記のプレハイブリダイゼーショ
ン条件下で膜上にスポット（膜に固定）する。次に、こ
の処理された膜に増幅されたサンプルを前記のハイブリ
ダイゼーション条件下で加える。次に、ラベルされたオ
リゴヌクレオチド又はその断片を膜から放出して、サン
プル中の増幅された配列がラベルされたオリゴヌクレオ
チドにハイブリダイズしたか否かを決定するために検出
手段を使用することができる様にする。例えば、この放
出は、プローブ中の制限部位を認識することができる制
限酵素を膜に加えることによって行うことができよう。
オリゴマー制限として知られるこの方法は１９８５年１
２月１１日に公開されたＥＰ特許出願１６４，０５４に
さらに詳細に記載されている。 【００８１】この発明の目的のため、検出され得る遺伝
疾患は、あらゆる生物からの核酸例えばゲノムＤＮＡ中
のあらゆる塩基対変異又は多型における特定の欠失、挿
入及び／又は置換を含むであろう。塩基対変化が知られ
ている疾患の例には鎌形赤血球貧血、ヘモグロビンＣ疾
患、α−サラセミア、β−サラセミア等が含まれる。検
出され得る他の疾患には癌性疾患、例えばＲＡＳ発癌遺
伝子、例えばｎ−ＲＡＳ発癌遺伝子が関与する疾患、及
び感染性疾患が含まれる。 【００８２】この発明の方法はまた、組織移植、疾患感
受性及び父性決定の分野におけるＨＬＡタイプ分けのた
めにも使用することができる。ＨＬＡ−ＤＲ，ＨＬＡ−
ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰ領域からのα及びβ遺伝子から成
るＨＬＡクラスII遺伝子は高度に多型性であり、ＤＮＡ
レベルにおけるこれらの遺伝的複雑さは血清学的タイプ
分けによって最近定義された多型に比べて有意に大であ
る。さらに、この発明の方法は、インシュリン依存性糖
尿病（ＩＤＤＭ）と関連するＨＬＡクラスIIβ蛋白質
（例えば、ＤＲβ）をコードする幾つかのＤＮＡ配列を
検出するために使用することができる。要約すれば、 【００８３】次の配列： １）５′−ＧＡＧＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＣＴＧＡＧ−３′ ２）５′−ＧＡＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＧＣＴＴＣ−３′ ３）５′−ＣＣＴＧＴＣＧＣＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧ−３′ ４）５′−ＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＡＧＡ−３′ 又はこれらに対して相補的なＤＮＡ鎖から成る群からＩ
ＤＤＭに関連する４種類のＤＮＡ配列を選択する。これ
らの配列の１つ又は複数とハイブリダイズする配列特異
的プローブを調製する。 【００８４】本発明はまた、使用される各プライマー及
びプローブのための容器、プライマー延長生成物を合成
するための重合用試薬例えば酵素、４種類のヌクレオチ
ドのそれぞれのための容器、及びラベルを検出する手段
〔例えば、アビジン酵素接合体及び酵素基質及び色原体
（ラベルがビオチンであれば）〕を含む容器を有する一
まとめにされた多容器ユニットを含んで成るキットに関
する。さらに、このキットは、検出されるべきヌクレオ
チド変化を有する１又は複数の核酸を含むプローブ用陽
性対照、及び検出されるべきヌクレオチド変化を有する
核酸を含有しないプローブ用陰性対照を含む容器を有す
ることができる。 【００８５】さらに、このキットはまた、サンプル中に
含まれる２本鎖ＤＮＡの鎖を分離するための手段、例え
ばヘリカーゼ又は水酸化ナトリウムのための容器をも有
することができる。下記の例は本発明の種々の具体例を
説明するが、発明の範囲を限定するものではない。例に
おいて、特にことわらない限り、すべての部及び％は固
体については重量に基き、そして液体については容量に
より、そして温度は℃で示す。 【００８６】例１．この例は、鎌形赤血球貧血対立遺伝
子（Ｓ）又はヘモグロビンＣ疾患対立遺伝子（Ｃ）から
正常対立遺伝子（Ｎ）を識別するためにこの発明の方法
をいかに使用することができるかを説明する。 Ｉ．プライマーの合成 次の２種類のプライマー： ５′−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ−３′（ＰＣＯ３） ５′−ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ−３′（ＰＣＯ４） を下記の方法により調製した。これらのプライマーはい
ずれも２０−ｍｅｒであり、ゲノムＤＮＡの相対する鎖
に、１１０塩基対の距離隔ててそれらの５′端でアニー
ルする。 【００８７】Ａ．自動合成法 Beaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters , 198
1, 22:1859-1862に従って合成されたジエチルホスホラ
ミダイトを、ヌクレオチドで誘導体化された調節された
細孔のガラス支持体に次々と縮合せしめた。この方法
は、ジクロロメタン中でのトリクロロ酢酸による脱トリ
チル化、活性化プロトン供与体としてベンゾトリアゾー
ルを用いる縮合、並びにテトラヒドロフラン及びピリジ
ン中での無水酢酸及びジメチルアミノピリジンによるキ
ャッピングを含む。サイクル時間は約３０分間であっ
た。各段階における収率は実質上定量的であり、そして
これは脱トリチル化後のジメトキシトリチルアルコール
の収集及び分光測定により決定された。 【００８８】Ｂ．オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱
保護及び精製 固体支持体をカラムから取り出し、そして室温にて４時
間、密閉チューブ中で１mlの濃水酸化アンモニウムに暴
露した。次に、支持体を濾去し、そして部分的に保護さ
れたオリゴデオキシヌクレオチドを含有する溶液を５５
℃にて５時間置いた。アンモニアを除去し、そして残渣
を分取用ポリアクリルアミドゲルに適用した。電気泳動
を３０Ｖ／cmにて９０分間行い、次に生成物を含有する
バンドを螢光プレートのＵＶシャドイングにより同定し
た。 【００８９】バンドを切り出し、そして１mlの蒸留水に
より４℃にて一夜溶出した。この溶液をカラムに適用
し、そして１％酢酸アンモニウム緩衝液（pH６．０）中
７〜１３％のアセトニトリルのグラジエントにより溶出
した。溶出液を２６０nmにおけるＵＶ吸収によりモニタ
ーし、そして適切な画分を集め、一定容量中のＵＶ吸収
により定量し、そして真空遠心分離機中で室温にて蒸発
乾固せしめた。 【００９０】Ｃ．オリゴデオキシリボヌクレオチドの特
徴付け 精製されたオリゴヌクレオチドの試薬アリコートを、ポ
リヌクレオチドキナーゼ及びγ−32Ｐ−ＡＴＰにより32
Ｐ−ラベルした。ラベルされた化合物を、５０Ｖ／cmに
て４５分間の電気泳動の後１４〜２０％ポリアクリルア
ミドゲルのオートラジオグラフィーにより試験した。こ
の方法により分子量が確認される。ヘビ毒ジエステラー
ゼ及び細菌アルカリ性ホスファターゼの使用によるオリ
ゴデオキシリボヌクレアーゼのヌクレオチドへの消化、
並びにこれに続く逆相ＨＰＬＣカラム及び１０％アセト
ニトリル、１％酢酸アンモニウム移動相を用いるヌクレ
オチドの分離及び定量により、塩基組成を決定した。 【００９１】II．セルラインからのヒトゲノムＤＮＡの
単離 高分子ゲノムＤＮＡをリンパ系セルラインＧＭ２０６４
から、Maniatis等、Molecular Cloning (1982, 280-28
1) の方法と実質上同じ方法を用いて単離した。ＧＭ２
０６４（Human Mutant Cell Repository、カムデン、N.
J.) は元々、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症についてホ
モ接合性の個体から分離されたものであり、そしてβ−
又はδ−グロビン遺伝子配列を含有しない。このセルラ
インは１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０
中に維持された。 【００９２】III. 臨床サンプルからのヒトゲノムＤＮ
Ａの単離 ＡＡ（既知の正常個体から）、ＡＳ（既知の鎌形赤血球
貧血キャリヤーから）、ＳＳ（既知の鎌形赤血球貧血個
体から）、ＳＣ（既知の鎌形赤血球貧血／ヘモグロビン
Ｃ疾患個体から）、及びＡＣ（既知のヘモグロビンＣ疾
患キャリヤーから）と称する５種類の臨床血液サンプル
をカリホルニア、オークランドのChildrens's Hospital
の Bertram Lubin博士から得た。ＣＣ（既知のヘモグロ
ビンＣ疾患個体から）と称する１つの臨床サンプルをカ
リホルニア、サンフランシスコのSan Francisco Genera
l HospitalのStephen Embury博士から得た。これらのサ
ンプルの最初の５種類からのゲノムＤＮＡを、 Saiki
等、Biotechnology , 3:1008-1012 (1985)により記載さ
れている様にして、主として末梢血リンパ球から成るバ
フィーコート画分から調製した。 【００９３】IV．増幅反応 ７個のＤＮＡサンプルのそれぞれからの１μｇのＤＮＡ
（１００μｇ／mlのＤＮＡの内１０μｌ）を、１００mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、５００mMＮａＣｌ及
び１００mM ＭｇＣｌ2 を含有する溶液１０μｌ；１０
μｌの１０μＭプライマーＰＣ０３；１０μｌの１０μ
ＭプライマーＰＣ０４；１５μｌの４０mM ｄＮＴｐ
１０mMずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びＴＴＰ
を含む）；及び４５μｌの水を含む１００μｌの初発反
応容量中で増幅を行った。 【００９４】ＤＮＡを変性せしめるため、各反応混合物
を９０℃に設定したヒートブロック中で１０分間保持し
た。各ＤＮＡサンプルに２５サイクルの増幅を行った。
各サイクルは次の４段階を含む。 （１）マイクロ遠心機中で短時間（１０〜２０秒間）回
転せしめて変性した材料をペレット濃縮しそして３０℃
に設定したヒートブロックにすぐに移し、プライマーと
ゲノムＤＮＡとをアニールせしめ； 【００９５】（２）Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼ１のＫ
ｌｅｎｏｗ断片（ニューイングランドビオラブス、５ユ
ニット／μｌ）３９μｌ；１００mM Ｔｒｉｓ（pH７．
５）、５００mM ＮａＣｌ １００mM ＭｇＣｌ2 の塩
混合物３９μｌ；並びに３１２μｌの水を混合すること
によって調製した溶液２μｌを添加し； （３）３０℃にて２分間反応を進行せしめ；そして、 （４）サンプルを９５℃のヒートブロックに２分間移し
て新しく合成されたＤＮＡを変性せしめる（但し、この
反応は最終サイクルにおいては行わない）。最終反応容
量は１５０μｌであり、そして反応混合物を−２０℃に
て貯蔵した。 【００９６】Ｖ．オリゴデオキシリボヌクレオチドプロ
ーブの合成及びリン酸化 次の配列： ５′−* ＣＴＣＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣ−３′（ＲＳ１７） ５′−* ＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣ−３′（ＲＳ１８） ５′−* ＣＴＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣ−３′（ＲＳ２１） （配列中、＊はラベルを表わす）を有するＲＳ１７，Ｒ
Ｓ１８及びＲＳ２１と称する３種類のラベルされたＤＮ
Ａプローブを次の様にして調製した。ＲＳ１８は正常β
−グロビン対立遺伝子（β A ）に対して相補的であり、
ＲＳ２１は鎌形赤血球貧血対立遺伝子（βS ）に対して
相補的であり、そしてＲＳ１７はヘモグロビンＣ疾患対
立遺伝子（βC ）に対して相補的である。ＲＳ１７及び
ＲＳ２１は１個の塩基対によりＲＳ１８と異る。プライ
マー及びプローブの概略の相互関係は次の通りである。 【００９７】 【表６】 【００９８】これら３種類のプローブを１項に記載した
方法により合成した。７０mM Ｔｒｉｓ緩衝剤（pH７．
６）、１０mM ＭｇＣｌ2 、１．５mMスペルミン、１０
０mMジチオスレイトール及び水を含有する４０μｌの反
応容量中で１０pmole のプローブを４ユニットのＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドビオラブ
ス）及び４０pmole のγ−32Ｐ−ＡＴＰ（ニューイング
ランドニュクレアー、約７０００Ci／mmole)と、３７℃
にて６０分間接触せしめることによりプローブをラベル
した。 【００９９】次に、２５mM ＥＤＴＡにより全容量を１
００μｌにし、そしてManiatis等、Molecular Cloning
(1982), 466-467の方法に従って、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ
（ＴＥ）緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ緩衝剤、０．１mM
ＭＥＤＴＡ、pH８．０）により平衡化された１mlのビオ
−ゲルＰ−３（ビオラド）スピンゲル透析カラム上で精
製した。反応生成物のＴＣＡ沈澱により、ＲＳ１７につ
いて比活性が５．２μCi／pmole であり、そして最終濃
度が０．１１８pmole ／μｌであることが示された。Ｒ
Ｓ１８について、比活性は４．６μCi／pmole であり、
そして最終濃度は０．１１４pmole ／μｌであった。Ｒ
Ｓ２１については、比活性が３．８μCi／pmole であ
り、そして最終濃度が０．１１２pmole ／μｌであるこ
とが示された。 【０１００】VI．ドットブロットハイブリダイゼーショ
ン III 項からの１５０μｌの増幅されたサンプルのそれぞ
れから５μｌを１９５μｌの０．４Ｍ ＮａＯＨ、２５
mM ＥＤＴＡで稀釈し、そしてReed及びMann,Nucleic A
cids Research, 13, 7202-7221 (1985)により開示され
ている様にして、3 枚の陽イオン性ナイロンフィルター
上にスポットした。この方法は、まずフィルターを水で
湿し、そしてこれを所定位置に保持するドットブロット
調製法装置に入れ、サンプルを適用し、そして各ウエル
を０．４mlの２０×ＳＳＰＥ（３．６Ｍ ＮａＣｌ、２
００mM ＮａＨ2 ＰＯ4 、２０mM ＥＤＴＡ）ですすぐ
ことにより実施した。次にフィルターを取り出し、２０
×ＳＳＰＥ中ですすぎ、そして真空オーブン中で８０℃
にて３０分間加熱（ベーキング）した。 【０１０１】加熱の後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハート
溶液（１×＝０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０
２％フィコール、０．０２％ウシ血清アルブミン、０．
２mMＴｒｉｓ・ＨＣｌ、０．２mM ＥＤＴＡ、pH８．
０）及び０．５％ ＳＤＳを含有するハイブリダイゼー
ション溶液６mlと接触せしめ、そして５５℃にて６０分
間インキュベートした。次に、５μｌずつのプローブＲ
Ｓ１７，ＲＳ１８及びＲＳ２１をハイブリダイゼーショ
ン溶液に加え、そしてフィルターを５５℃にて６０分間
インキュベートした。 【０１０２】最後に、各ハイブリダイズしたフィルター
を１００mlの２×ＳＳＰＥ及び０．１％ ＳＤＳにより
２回室温にて１０分間洗浄した。ＲＳ１７の第３洗浄と
して、２５０mlの５×ＳＳＰＥ及び０．１％ ＳＤＳを
加え、そしてフィルターを５５℃にて５分間加熱した。
ＲＳ１８及び２１については、フィルターを２５０mlの
４×ＳＳＰＥ及び０．１％ ＳＤＳにより５５℃にて５
分間処理した。５５℃での４×ＳＳＰＥは十分なストリ
ンジエンシーがないため、ＲＳ１８及びＲＳ２１につい
てはわずかなバックグラウンドが存在した。 【０１０３】ＲＳ１８及びＲＳ２１についての洗浄は２
５０mlの５×ＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳ中で５５℃に
て３分間行った。バックグラウンドに変化はなかった。
５×ＳＳＰＥを用いて６０℃にて１分間洗浄を反復し、
そして同じストリンジエンシーの追加の洗浄を３分間行
った。これによりバックグラウンドが実質的に無くなっ
た。９０分間のオートラジオグラフィーの後、遺伝子型
が容易に現われた。 【０１０４】VII. オートラジオグラムの検討 対立遺伝子特異的β−グロビンプローブＲＳ１８，ＲＳ
２１及びＲＳ１７とハイブリダイズせしめた７個の増幅
されたゲノムＤＮＡサンプルのドットブロットのオート
ラジオグラムを１２時間後に分析した。陰性対照ＧＭ２
０６４を含めた。この結果は、各対立遺伝子特異的プロ
ーブはそれが完全にマッチするβ−グロビン対立遺伝子
のコピー少なくとも１個を有するＤＮＡサンプルにのみ
アニールしたことを示した。例えば、βA −特異的プロ
ーブＲＳ１８はサンプルＡＡ（β A βA ）、Ａ（βA β
S ）、及びＡＣ（βA βC ）とのみハイブリダイズし
た。 【０１０５】例２．ドットブロットによる検出の最低レ
ベルを決定するため、１２８，６４，３２，１６，８，
４，２及び１ngの正常ゲノムＤＮＡを含有する８個の一
連の稀釈物をサンプルＡＡから調製し、そして例１に記
載した様にして２５サイクルの増幅にかけた。対照とし
て、例１のＡＡ及びＳＳからの増幅されたサンプルを同
様に稀釈した。合計７５μｌ（半分）の各サンプルを１
２５μｌの０．６５Ｎ ＮａＯＨ及び２５mM ＥＤＴＡ
と混合し、そしてこの混合物をナイロンフィルターに適
用した。次に、このフィルターを２０×ＳＳＰＥ中です
すぎ、そして８０℃にて３０分間加熱（ベーキング）し
た。 【０１０６】次に、フィルターを例１に記載した様にし
てＲＳ１８（βA プローブ）によりプローブして検出限
界を決定した。プレハイブリダイゼーション溶液は８ml
の５×ＳＳＰＥ、５×デンハート溶液、０．５％ ＳＤ
Ｓ（５５℃、４０分間）であり、そしてハイブリダイゼ
ーション溶液は前記溶液＋１０μｌのＲＳ１８（５５℃
にて８０分間）であった。次に、フィルターを２×ＳＳ
ＰＥ、０．１％ ＳＤＳにより室温にて１０分間２回、
そして次に５×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳにより６０
℃にて３分間洗浄した。 【０１０７】ＲＳ１８とのハイブリダイゼーションの後
に１７時間の暴露の後に得られたオートラジオグラムは
ＡＡ ＤＮＡを含有するすべてのサンプルにおいて陽性
シグナルを示した。ＳＳサンプルは１７時間後に可視化
されたが、６４ng ＳＳの強度は１ng ＡＡの強度と同
じであり、これは６４：１のシグナル：ノイズであっ
た。０．５ngスポット中に存在するシグナルの強度は、
１ngより実質的に少い量を含有するサンプルの増幅が可
能であることを示唆した。（１ナノグラムは１５０個の
デイプロイド細胞中に存在するゲノムＤＮＡの量であ
る。） 【０１０８】例３． Ａ．ＨＬＡ−ＤＱα配列の増幅及び検出 Ｉ．プライマーの調製 ＤＱα第２エクソンの保存された５′及び３′末端の相
対する鎖に対して相補的なＧＨ２６及びＧＨ２７と称す
るオリゴヌクレオチドを２４０塩基対断片を増幅するた
めのプライマーとして使用した。次の配列： ５′−ＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧ−３′（ＧＨ ２６） ５′−ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＧＣＡＧＣＧＧＴＡＧＡＧＴＴＧ−３′（ ＧＨ２７） を有するプライマーを例１に記載した様にして調製し
た。 【０１０９】II．プローブの調製 対立遺伝子変異体にグループ化される種々の起原からの
ＨＬＡ−ＤＱα配列の分析に基いて、各変異を含むＤＱ
α第２エクソンの可変領域からの下記のプローブを例１
に記載した様にして合成し、そしてラベルした。ＨＬＡ
−ＤＱαの第２エクソン（エクソンＩと称する）の２つ
の可変領域、すなわちセグメントＡ及びＢを表７に示
す。プライマー（ＰＣＲ→により示す）、プローブ及び
ＨＬＡ−ＤＱα配列の完全な相互関係を表８に示し、そ
してここで使用しているアミノ酸省略記号を表９に示
す。 【０１１０】 【表７】 【０１１１】 【表８】【０１１２】 【表９】【０１１３】プローブは次の通りである： ５′−* ＴＧＴＴＴＧＣＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＣ−３′（ＧＨ６６） ５′−* ＴＴＣＣＧＣＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴ−３′（ＧＨ６７） ５′−* ＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＧＡＴＴＴＧ−３′（ＧＨ６８） ５′−* ＣＴＣＡＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣＡ−３′（ＧＨ７５） （配列中、＊はラベルを示す）。 【０１１４】ＧＨ７５プローブは Auffray等、Nature,
308 :327 (1984) により記載されているＤＲ４配列に由
来した。６７プローブは Auffray等、PNAS, 79:6337 (1
982)により記載されているＤＲ４配列に由来した。ＧＨ
６８プローブは Chang等、Nature, 305 :813 (1983) に
より記載されているＤＲ３配列に由来した。ＧＨ６６プ
ローブは Schenning等、EMBO J., ３:447 (1984) によ
り記載されているＤＲ３配列に由来した。対照オリゴヌ
クレオチドはこれらの対立遺伝子のすべての保存された
セグメントに由来した。 【０１１５】III. ゲノムＤＮＡの由来及び調製 下記の１１個のＤＮＡサンプルを、例１に記載したよう
な増幅のために調製した。 ＬＧ２セルライン（遺伝子型ＤＲ１）：カリホルニア、
スタンホード、スタンホード大学、John Bell 及びDan
Denny 両博士より； ＰＧＦセルライン（遺伝子型ＤＲ２）：John Bell 及び
Dan Denny 両博士より； ＡＶＬセルライン（遺伝子型ＤＲ３）：John Bell 及び
Dan Denny 両博士より； ＤＫＢセルライン（遺伝子型ＤＲ４）：John Bell 及び
Dan Denny 両博士より； 【０１１６】ＴＧＬセルライン（遺伝子型ＤＲ５）：ワ
シントン、シアトル、バージニア・マソン・ホスピタ
ル、Gerry Nepom 博士より； ＡＰＤセルライン（遺伝子型ＤＲ６）：John Bell 及び
Dan Denny 両博士より； ＬＢＦセルライン（遺伝子型ＤＲ７）：John Bell 及び
Dan Denny 両博士より； ＴＡＢセルライン（遺伝子型ＤＲ８）：Gerry Nepom 博
士より； ＫＯＺセルライン（遺伝子型ＤＲ９）：Gerry Nepom 博
士より。 サンプルＧＭ２７４１Ａ（遺伝子型ＤＲ１，３）：Huma
n Genetic Mutant Cell Repository、カムデン、N.J.か
ら入手可能； サンプルＧＭ２６７６（遺伝子型ＤＲ４，３）：Human
Genetic Mutant CellRepositoryから入手可能。 【０１１７】IV．増幅反応 各ゲノムＤＮＡサンプルを例１に記載した様にして、プ
ライマーとしてＧＨ２６及びＧＨ２７を用いて２８サイ
クル増幅した。但し、重合段階３は１０重量％のジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下で３７℃において
行い、そして増幅反応は前記の自動液体取扱温度循環装
置のアルミニウム加熱ブロック中で、次のプログラム： １）２．５分間、３７℃から９８℃へ変温（変性）； ２）３．０分間、９８℃から３７℃へ変温（アニー
ル）； ３）１ユニットのＫｌｅｎｏｗ断片の添加；及び、 ４）２．０分間、３７℃で保持（延長）；を用いた。 【０１１８】Ｖ．ドットブロット・ハイブリダイゼーシ
ョン 各ＤＮＡサンプルについて、増幅されたゲノムＤＮＡ
１５０μｌの内５μｌを４枚のナイロンフィルターにス
ポットし、そしてこれにプローブＧＨ６６，６７，６８
又は７５のいずれかを例１に記載した様にして適用し
た。但し、ナイロンフィルターに適用する前にＤＮＡサ
ンプルを中和し、６×ＳＳＰＥ、１０×デンハート溶液
及び０．５％ ＳＤＳのプレハイブリダイゼーションを
５０℃にて１時間用い、そして同じ溶液を５０℃にて一
夜用いた。フィルターを０．１×ＳＳＰＥ、０．１％
ＳＤＳにより３７℃にて１０〜１５分間洗浄した。フィ
ルターを例１に記載した様にして処理してオートラジオ
グラムを得た。 【０１１９】VI．オートラジオグラムの検討 ドットブロットのオートラジオグラムは、４つのＨＬＡ
−ＤＱα対立遺伝子変異体に相補的なＨＬＡ−ＤＱα対
立遺伝子特異的プローブＧＨ６６，ＧＨ６７，ＧＨ６８
及びＧＨ７５はホモ接合体個体及びヘテロ接合体個体の
両者からの増幅されたＤＮＡ上のヌクレオチド配列多型
を特定するために使用することができる。プローブＧＨ
７５の反応性のパターンは血清学的に定義されたＤＱｗ
ｌに対応する。 【０１２０】Ｂ．ＨＬＡ−ＤＱβ配列の増幅及び検出 Ｉ．プライマーの調製 ＤＱ−β第２エクソンの保存された５′及び３′末端の
相対する鎖に対して相補的なＧＨ２８及びＧＨ２９と称
するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。次
の配列： ５′−ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧ−３ ′（ＧＨ２８） ５′−ＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＣ−３′（Ｇ Ｈ２９） を有するプライマーを例１に記載した様にして調製し
た。 【０１２１】II．プローブの調製 対立遺伝子変異体にグループ化された種々の起原からの
ＨＬＡ−ＤＱβ配列の分析に基いて、各変異を含むＤＱ
β第２エクソンの２つの可変領域からの下記のプローブ
を例１に記載した様にして合成しそしてラベルした。こ
れらの２つの領域すなわちセグメントＡ（ＧＨ６９−７
１）及びＢ（ＧＨ６０−６２）、並びに第３の可変領域
を表１０に示す。プライマー、プローブ及びＨＬＡ−Ｄ
Ｑβ配列の完全な相互関連を表１１に示す。ここで、ア
ミノ酸の略号は表９に前記した通りである。 【０１２２】 【表１０】【０１２３】 【表１１】【０１２４】プローブは次の通りである： ５′−* ＣＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧ−３′ （ＧＨ６０）** ５′−* ＣＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧ−３′ （ＧＨ６１）** ５′−* ＣＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＧＧ−３′ （ＧＨ６２） ５′−* ＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＧＴＣＡＣＡＣＣＣＣＧ−３′（ＧＨ６９）** ５′−* ＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＧ−３′（ＧＨ７０） ５′−* ＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＴＣＡＣＡＡＧＡＣＧ−３′（ＧＨ７１） （配列中、＊はラベルであり、そして＊＊は最良のプロ
ーブを示す）。 【０１２５】II．増幅及びドットブロットハイブリダイ
ゼーション 例３．Ａに記載した方法におよそ従って、プローブがゲ
ノムＤＮＡサンプル中の検出されるべき対立遺伝子の部
分に対する合理的な特異性を有することが見出された。 Ｃ．ＨＬＡ−ＤＲβ配列の増幅及び検出 Ｉ．プライマーの調製 ＤＲβ第２エクソンの保存された５′及び３′末端の相
対する鎖に対して相補的なＧＨ４６及びＧＨ５０と称す
るオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。 【０１２６】次の配列： ５′−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧ−３′（Ｇ Ｈ４６） ５′−ＣＴＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＧＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡ−３′（Ｇ Ｈ５０） を有するプライマーを例１に記載した様にして調製し
た。 【０１２７】II．プローブの調製 対立遺伝子変異体にグループ化された種々の起原からの
ＨＬＡ−ＤＲβ配列の分析に基いて、各変異を含むＤＲ
β第２エクソンの２つの可変領域からの下記のプローブ
を例１に記載した様にして合成しそしてラベルした。こ
れら２つの領域すなわちセグメントＡ（ＧＨ５６−５
９）、及びＢ（ＧＨ５１）を表１２及び表１３に示す。 【０１２８】 【表１２】 【０１２９】 【表１３】 【０１３０】次のプローブ： ５′−* ＣＴＧＡＴＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＡＣＴＣＧ−３′（ＧＨ５１） ５′−* ＣＡＧＡＣＧＴＡＧＡＧＴＡＣＴＣＣ−３′ （ＧＨ５６） ５′−* ＣＡＧＡＣＴＴＡＣＧＣＡＧＣＴＣＣ−３′ （ＧＨ５７） ５′−* ＣＡＧＡＣＴＴＡＡＧＣＡＧＣＴＣＣ−３′ （ＧＨ５８） ５′−* ＣＡＴＧＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣ−３′ （ＧＨ５９） （配列中、＊はラベルである）を使用する。 【０１３１】III. 増幅及びドットブロットハイブリダ
イゼーション 例３．Ａに記載した方法におよそ従って、プローブがゲ
ノムＤＮＡサンプル中の検出されるべき対立遺伝子の部
分に対する合理的な特異性を有することが見出された。 【０１３２】IV．ＩＤＤＭに関連するＨＬＡ−ＤＲβ配
列の分析 種々のＨＬＡ−タイプＩＤＤＭ個体の臨床血液サンプル
（ピッツブルグ大学から臨床的に、及びHuman Genetic
Mutant Cell Repository、カムデン、NJから入手可能な
ＩＤＤＭ個体由来のセルラインから）及び非糖尿病対照
（ホモ接合形細胞）から、クローニング法を用いて幾つ
かのＨＬＡクラスIIβ遺伝子を単離した。標準的方法で
あるこのような１つの方法において、ヒトゲノムＤＮＡ
を患者のサンプルからManiatis等、Molecular Cloning
(1982), 280-281の方法を実質的に用いて、又は主とし
て末梢血リンパ球から成るバフィーコート画分から Sai
ki等、Biotechnology , ３:1008-1012 (1985) により記
載されている様にして単離した。 【０１３３】次に、このＤＮＡを全ゲノムライブラリー
としてバクテリオファージベクターに、Maniatis等、前
掲、２６９−２９４頁に記載されている様にしてクロー
ン化した。ＨＬＡ−ＤＲβ遺伝子のための個々のクロー
ンを、放射性ｃＤＮＡプローブ（Maniatis, 309-328
頁) へのハイブリダイゼーションにより選択し、そして
制限地図の作成により特徴付けた。１９８６年４月１５
日発行の米国特許No. ４，５８２，７８８を参照のこ
と。 【０１３４】ＩＤＤＭ患者からのクローンの制限地図を
患者の家族内のＲＦＬＰ分離パターンと比較することに
よりＩＤＤＭ患者からの個々のクローンをＤＲ−タイプ
分けされたハロタイプに帰属せしめた。最後に、可変性
第２エクソンを代表するこれらのクローンの小断片を、
ベーリンガーマンハイムから自由に入手できるＭ１３ｍ
ｐ１０クローニングベクターにサブクローン化した。 【０１３５】遺伝子をクローン化する他の方法において
は、リンカー／プライマーとして機能する非相同配列を
有するプライマーＧＨ４６及びＧＨ５０を用いて例１に
記載したようにして、各単離された合計１μｇのヒトゲ
ノムＤＮＡから遺伝子の関連部分（第２エクソン）の増
幅を行った。反応混合物を２８サイクルの増幅にかけ、
そしてこの混合物を−２０℃にて貯蔵した。次に、増幅
された生成物について次のクローニング方法を使用し
た。 【０１３６】反応混合物をＭ１３ｍｐ１０にサブクロー
ニングするため、５０mM ＮａＣｌ、１０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH７．８）、１０mM ＭｇＣｌ2 、２０ユニ
ットのＰｓｔＩ及び２６ユニットのＨｉｎｄIII を含有
する緩衝液５０μｌ中で３７℃にて９０分間消化を行っ
た。凍結により反応を停止せしめた。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
及びＥＤＴＡを含有する緩衝液により容量を１１０μｌ
に調整し、そして１mlのビオゲルＰ−４スピン透析カラ
ム上に負荷した。１つの画分を集めそしてエタノール沈
澱した。 【０１３７】エタノールペレットを１５μｌの水に再懸
濁し、そして５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．８）、
１０mM ＭｇＣｌ2 、０．５mM ＡＴＰ、１０mMジチオ
スレイトール、０．５μｇのＭ１３ｍｐ１０ベクター
（ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄIII で消化したもの) 及び４０
０ユニットのリガーゼを含む２０μｌ容に調整した。こ
の混合物を１６℃にて３時間インキュベートした。Ｍｏ
ｌｔ ４ ＤＮＡを含有する連結反応混合物１０μｌ
を、ベセスダ、ＭＤのＢＲＬから自由に入手できるＥ．
コリＪＭ１０３株のコンピテント細胞に形質転換した。
Messing J. (1981) Third Cleveland Symposium on Mac
romolecules:Recombinant DNA , A.Walton編、アルゼビ
ール、アムステルダム、１４３−１５３に記載されてい
る形質転換株の調製方法に従って行った。 【０１３８】これら２つのクローニング方法からの１８
の対立遺伝子を配列決定した。決定された配列の幾つか
において、特定のＤＮＡ及び蛋白質配列の４つの領域が
種々の組合わせで存在し、そしてＩＤＤＭと関連するこ
とが見出された。ＩＤＤＭ患者のゲノム中に見られるＤ
ＮＡ配列はＤＲβ蛋白質の１〜３個のアミノ酸残基に変
化をもたらした。ＤＲβ第２エクソンのこれら４つの可
変領域は多くの糖尿病患者から得られた配列中に見出さ
れ、そして上に同定される。この様な配列を検出するた
めに使用されるプライマー及びプローブを合成するため
に前記の領域を使用することができる。これらのＩＤＤ
Ｍ関連酸配列は、ＤＲβ第二エクソンの下記に示す位置
における下記のアミノ酸残基配列をコードするものであ
る。 【０１３９】 【表１４】 【０１４０】Ｖ．プライマー及び増幅 ＩＤＤＭについて試験されるべきＤＮＡサンプルを増幅
するために、この例のＣ．Ｉに記載されているプライマ
ーＧＨ４６及びＧＨ５０を使用することができる。１０
μｌ ＤＭＳＯを用いて例１又は例３Ａの増幅法を用い
ることもできる。 【０１４１】VI．プローブの合成 ４種類のラベル化ＤＮＡプローブの内の２種類、すなわ
ち、ＧＨ５４（Ｖ−−Ｓ；５′−ＣＣＴＧＴＣＧＣＣＧ
ＡＧＴＣＣＴＧＧ）、及びＧＨ７８（Ｉ−−ＤＥ；５′
−ＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＡＧＡ）を用
いることができる。これらのプローブはプライマーにつ
いて記載したのと同様にして合成しそして前記の様にし
てラベルすることができる。 VII. ドットブロットハイブリダイゼーション 例１に記載されているドットブロット法におよそ従っ
て、ストリンシエンシーの高い条件下で、プローブがゲ
ノムＤＮＡ中の検出されるべき対立遺伝子の部分に対す
る合理的な特異性を有することが予想される。 Ｄ．ＨＬＡ−ＤＰα及びＤＰβ配列の増幅及び検出 すでに知られている多型性のタイプを示す既知のＤＰβ
配列が Trowsdale等、Immunological Reviews , No 85
(1985), p5-43, 16 頁の第６図に示されている。他の多
型を同定することができる。これらの配列の保存された
セグメントに対するプライマー及び可変性セグメントへ
のプローブを上記と同様にして設計することができる。 【０１４２】すでに知られている多型性のタイプを示す
ｃＤＮＡクローンから得られたＤＰα１対立遺伝子のヌ
クレオチド配列が Trowsdale等、前掲、１２頁の第４図
に示されている。これらの配列の検出及び増幅は、骨髄
移植及び組織のタイプ分けにおいて臨床的に有用であろ
う。 【０１４３】例４．凍結されたＭｏｌｔ ４細胞（正常
β−グロビンについてホモ接合性のＴセルライン；Huma
n Genetic Mutant Cell Repository、カムデン、NJから
ＧＭ２２１９Ｃとして得られる）、ＳＣ１細胞（鎌形赤
血球対立遺伝子についてホモ接合性の、ＥＢＶで形質転
換されたＢセルライン；ＡＴＣＣ、ロックビル、ＭＤか
らＣＲＬ８７５６として得られる）、及びＧＭ２０６４
細胞（β−グロビン又はδ−グロビン配列を有しない前
記の対照）を解凍し、そしてリン酸緩衝化塩溶液に再懸
濁して、セルラインの各タイプにつき細胞数が３７〜１
２００で異る１０μｌの細胞懸濁液を得た。 【０１４４】各セルラインを３５μｌの水と混合し、そ
して鉱油を重層した。得られる懸濁液を９５℃にて１０
分間加熱した。次に、プライマーＰＣ０３及びＰＣ０４
を含む例１においてセルラインを増幅するために用いた
試薬５５μｌを添加した。次に、例１の増幅方法を用
い、次にドットプロット法を行うことができる。この細
胞の直接使用によればセルライン又は臨床サンプルから
ゲノムＤＮＡを単離する必要がない。 【０１４５】例５．例１の方法を用いて、既知の正常個
体、既知の鎌形赤血球貧血個体、及びβ−グロビン遺伝
子配列を有しない個体（ＧＭ２０６４）からのゲノムＤ
ＮＡを使用した。但し、例３．Ａに記載した様に増幅を
自動化した。 次の配列： ５′−* ＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧ−３′（ＲＳ３１） ５′−* ＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴ−３′ （ＲＳ３２） ５′−* ＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣ−３′ （ＲＳ３３） 【０１４６】（配列中、＊はラベルを示す）を有するＲ
Ｓ３１，ＲＳ３２、及びＲＳ３３と称する３種類のラベ
ル化ＤＮＡプローブを調製した。これらのプローブはそ
れぞれ１７，１５、及び１３塩基の長さを有し、そして
正常β−グロビン対立遺伝子（βA ）に対して相補的で
ある。これらのプローブは例１に記載した様にして合成
しそしてラベルした。 【０１４７】プローブＲＳ３２，ＲＳ３３、及びＲＳ１
８を増幅されていないクローン化正常グロビン配列及び
鎌形赤血球貧血グロビン配列に対する特異性について、
例１に記載した方法を用いて試験した。但し、ハイブリ
ダイゼーション温度を５５℃から３２℃以下に下げた。
５５℃より低いハイブリダイゼーション温度においてＲ
Ｓ１８（１９−ｍｅｒ）は、塩濃度を下げなければ特異
性を示さなかった。一層短い２種類のプローブはより高
い塩濃度において卓越した特異性を示した。 【０１４８】プローブＲＳ３１，ＲＳ３２，ＲＳ３３及
びＲＳ１８を増幅されたゲノムＤＮＡに対して試験し
た。温度及び塩濃度の条件のため、１９−ｍｅｒは３２
℃より低いハイブリダイゼーション温度において特異性
を示さなかった。短い方のプローブはいずれも特異性を
示した。これらの結果は、より短いプローブの選択が可
能であること、及び選択性の条件が１９−ｍｅｒのため
に必要とされるそれよりも極端ではないことを明瞭に示
している。１７−ｍｅｒのグロビンプローブＲＳ３１
は、６×ＳＳＰＥ（１０×デンハート及び０．１％ Ｓ
ＤＳを含む）中３２℃より低温でハイブリダイズせしめ
そして次に０．１×ＳＳＰＥ中で４２℃にて１０分間洗
浄した場合に最適に機能した。 【０１４９】１５−ｍｅｒグロビンプローブＲＳ３２
は、６×ＳＳＰＥ（１０×デンハート及び０．１％ Ｓ
ＤＳを含む）中３２℃より低い温度でハイブリダイズせ
しめそして次に０．１×ＳＳＰＥ中で３２℃にて１０分
間洗浄した場合に最適に機能した。１３−ｍｅｒグロビ
ンプローブＲＳ３３は、６×ＳＳＰＥ（１０×デンハー
ト及び０．１％ ＳＤＳ）中３２℃より低温でハイブリ
ダイズせしめそして０．１×ＳＳＰＥ中２５℃にて１０
分間洗浄した場合に最適に機能した。 【０１５０】例６． Ｉ．プローブの合成 β−グロビン遺伝子の第２エクソンの一部分を増幅する
ため、例１に記載した方法により次に示す２種類のプラ
イマーを合成した。 ５′−ＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＣＣＴＴＡＧＧＣＴＧ−３′（ＲＳ４０） ５′−ＧＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧ−３′（ＲＳ４２） このプライマー対は、３個の比較的一般的なβ−サラセ
ミア変異の部位、すなわちコドン３９ナンセンス変異、
コドン４１−４２フレームシフト欠失、及びコドン４４
フレームシフト欠失を含む１９８塩基対増幅生成物を規
定する。 【０１５１】コドン３９〜４２の領域のβ−グロビン遺
伝子はδ−グロビンと正確に相同であるため、β−グロ
ビンにのみ特異的でありそしてそれのみを増幅する様に
設計された。ＲＳ４０プライマーは第１イントロン−第
２エクソン連結部にわたり、この部分はδ−グロビンと
の間に６塩基対のミスマッチが存在する。ＲＳ４２はコ
ドン８４−９２にわたって位置し、やはりδ−グロビン
との間に６個のミスマッチを含む。これらのミスマッチ
はδ−グロビン遺伝子へのプライマーのハイブリダイゼ
ーションを回避するために十分である。２０サイクルの
増幅の後、これらのプライマーの全体効率は約８０％で
あり、そして１３０，０００倍の増幅に相当する。予想
される様に、増幅生成物は検出可能なδ−グロビンＤＮ
Ａを含有していなかった。 【０１５２】II．臨床サンプルからのヒト−ゲノムＤＮ
Ａの単離 種々のβ−サラセミア遺伝子型の臨床ゲノムＤＮＡサン
プル５個をAlan Scott及びHaig Kazazian 両博士 (ジョ
ンズホプキンス大学、バルチモア、ＭＤ）から入手し
た。これらのサンプルはＪＨ１（正常／３９ノン）、Ｊ
Ｈ２（３９ノン／３９ノン）、ＪＨ３（正常／４１欠
失）、ＪＨ４（１７ノン／４１欠失）、及びＪＨ５（３
９ノン／４４欠失）であった。 【０１５３】III. 増幅反応 １μｇずつの各ＤＮＡサンプル及び対照としてのＭｏｌ
ｔ ４を、５０mM ＮａＣｌ、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（pH７．６）、１０mM ＭｇＣｌ2 、１μＭプライマ
ーＰＣ０３、１μＭプライマーＰＣ０４、１０ｖ／ｖ％
ＤＭＳＯ、１．５mM ｄＡＴＰ、１．５mM ｄＣＴ
Ｐ、１．５mM ｄＧＴＰ、及び１．５mMｄＴＴＰを含む
１００μｌの容量中に稀釈し、そして各サイクルで１ユ
ニットのＫｌｅｎｏｗ断片を添加しながら、例３．Ａに
記載した様にして２５サイクルの自動増幅を行った。 【０１５４】IV．オリゴデオキシリボヌクレオチドプロ
ーブ ＸＸ１，ＸＸ２，ＸＸ３、及びＸＸ４と称する下記の４
種類のプローブがジョンズホプキンス大学の Scott及び
Kazazian博士により提供された。 ５′−* ＣＣＴＴＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＴＴＣＴ−３′ （ＸＸ１） ５′−* ＣＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＴ−３′ （ＸＸ２） ５′−* ＧＧＴＴＣＴＴＴＧＡＧＴＣＣＴＴＴＧＧ−３′ （ＸＸ３） ５′−* ＧＧＴＴ−−−−ＧＡＧＴＣＣＴＴＴＧＧＧＧＡＴ−３′（ＸＸ４） 【０１５５】（配列中、＊は後で付加したラベルを示
す。） ＸＸ１及びＸＸ２の対はコドン３９ナンセンス変異を検
出するために使用した。ここでＸＸ１は正常対立遺伝子
に対して相補的であり、そしてＸＸ２はナンセンス変異
に対して相補的である。他のプローブ対は４１−４２フ
レームシフト欠失を試験するために設計されており、Ｘ
Ｘ３は正常対立遺伝子にアニールし、そしてＸＸ４は欠
失変異にアニールする。各プローブは例１に記載した様
にしてリン酸化した。 【０１５６】Ｖ．ドット・ブロットハイブリダイゼーシ
ョン ４枚のドットブロットを用意した。各スポットは１８分
の１の増幅生成物（５６ngのゲノムＤＮＡ）を含む様に
した。各フィルターを個別に８mlの５×ＳＳＰＥ、５×
デンハート溶液、０．５％ ＳＤＳ中で５５℃にて１５
分間ハイブリダイズせしめた。０．５pmolずつのラベル
化プローブ（比活性１．８〜０．７μCi／pmole)を添加
し、そしてさらに６０分間同じ温度でハイブリダイゼー
ションを続けた。 【０１５７】フィルターを室温にて２×リン酸ナトリウ
ム塩ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ）、０．１％ ＳＤＳ、中で５
〜１０分間ずつ２回洗浄し、次に５×ＳＳＰＥ、０．１
％ＳＤＳ中６０℃にて１０分間、高ストリンジエンシー
条件下で洗浄した。１個の強化スクリーンを用いて一夜
及び２時間の暴露の後、オートラジオグラムを発色せし
めた。 VI．オートラジオグラムの結果 結果は各ＤＮＡサンプルの示された遺伝子型に一致し
た。各プローブは、それが完全にマッチするゲノム配列
とのみアニールした。 【０１５８】例７．任意の体サンプル、例えば髪、精液
及び血液サンプル、並びにＤＮＡを含有する他のサンプ
ル等の中の例えば核酸を検出するために不規則多型領
域、例えばＨＬＡ又はミトコンドリアＤＮＡを増幅する
ことによって、この発明の方法を法医学のために適用す
ることも可能である。核酸はサンプルから任意の手段に
より抽出することができ、そして検出されるべき核酸の
特徴を同定した後に又は既知の特徴に基いてプライマー
及びプローブを選択することができる。 【０１５９】例８． Ｉ．プライマーの合成 この例においては、例１に記載したプライマーＰＣ０３
及びＰＣ０４を用いた。 II．セルラインからのヒトゲノムＤＮＡの調製 Ｔセルライン、Ｍｏｌｔ ４（Human Genetic Mutant C
ell Depository、カムデン、NJからＧＭ２２１９Ｃとし
て入手することができる正常β−グロビンについてホモ
接合性である）から、Maniatis等、Molecular Cloning
(1982), 280-281 の方法に実質的に従って、高分子量ゲ
ノムＤＮＡを単離した。 【０１６０】III. サーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）からのポリメラーゼの精
製 アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション、１２
３０１、パークラウンドライブ、ロックビル、ＭＤから
ＡＴＣＣ No. ２５，１０４として無制限に入手可能な
サーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔ
ｉｃｕｓ）ＹＴ１株を、次の組成： クエン酸ナトリウム １mM リン酸カリウム、pH７．９ ５mM 塩化アンモニウム １０mM 硫酸マグネシウム ０．２mM 塩化カルシウム ０．１mM 塩化ナトリウム １ｇ／ｌ 酵母エキス １ｇ／ｌ トリプトン １ｇ／ｌ グルコース ２ｇ／ｌ 硫酸第一鉄 ０．０１mM (オートクレーブ殺菌の前にpHを８．０に調整） 【０１６１】を有する培地中でフラスコ内で増殖せしめ
た。上記の培地中で７０℃で一夜培養した種母フラスコ
から１０ｌの発酵槽に種母を接種した。１０ｌの同じ培
地に合計６００mlの種母を接種した。水酸化アンモニウ
ムによりpHを８．０に調整し、溶存酸素を４０％に、温
度を７０℃にそして攪拌速度を４００rpm に調節した。
細胞の増殖後、上記カレデイン（Kaledin)等の方法（僅
かに修正）の最初の５段階を用い、且つ第６段階のため
に異った方法を用いてそれらを精製した。６工程の全て
を４℃において行った。カラム上の分別速度は０．５カ
ラム容／時間であり溶出時の勾配の容量は１０カラム容
であった。 【０１６２】簡単に説明すると、上記Ｔ．アクアティカ
ス細胞の培養液を９時間の培養後、後期対数期において
１．４ｇ乾燥重量／ｌの細胞密度において遠心分離によ
り採集した。２０ｇの細胞を５０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
pH７．５、０．１mM ＥＤＴＡよりなる８０mlの緩衝
液中に再懸濁した。細胞を溶解し、そして溶解物をロー
ター内において４℃で３５，０００rpm にて２時間遠心
分離した。上澄液を集め（画分Ａ）、４５〜７５％飽和
度の硫酸アンモニウムの間で沈澱する蛋白質画分を集
め、０．２Ｍリン酸カリウム（pH６．５）、１０mM ２
−メルカプトエタノール及び５％グリセリンよりなる緩
衝液中に溶解し、最終的に同一緩衝液に対して透析して
画分Ｂを得た。 【０１６３】画分Ｂを上記緩衝液で平衡化されたＤＥＡ
Ｅ−セルロースの２．２×３０cmカラムにかけた。カラ
ムを次いで同一緩衝液で洗浄し、蛋白質を含有する画分
（２８０mmにおける吸光度により測定) を集めた。一緒
にした蛋白質画分を０．０１Ｍリン酸カリウム（pH７．
５）、１０mM ２−メルカプトエタノール及び５％グリ
セリンを含有する第二の緩衝液に対して透析して画分Ｃ
を得た。 【０１６４】画分Ｃを第二の緩衝液で平衡化されたヒド
ロキシアパタイトの２．６×２１cmカラムにかけた。カ
ラムを次いで洗浄し、１０mMメルカプトエタノール及び
５％グリセリンを含む０．０１−０．５Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液の線形勾配で酵素を溶出した。ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を含む画分（９０〜１８０mMリン酸カリウム）
を一緒にし、Ａｍｉｃｏｎ攪拌セル及びＹＭ１０膜を用
いて４倍に濃縮し、第二の緩衝液に対して透析して画分
Ｄを得た。 【０１６５】画分Ｄを第二の緩衝液で平衡化されたＤＥ
ＡＥ−セルロースの１．６×２８cmカラムにかけた。カ
ラムを洗浄し、ポリメラーゼを第二緩衝液中の０．０１
−０．５Ｍリン酸カリウムの線形勾配で溶出した。画分
を過剰のＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベーション
した後（エンドヌクレアーゼについて）、及びＤＮＡを
数個の断片に切断する制限酵素により処理した後（エキ
ソヌクレアーゼについて）、ファージλＤＮＡ或いはス
ーパーコイル血漿ＤＮＡの分子量変化を電気泳動的に検
出することにより汚染エンドヌクレアーゼ及び液相ヌク
レアーゼのアッセイを行った。最少のヌクレアーゼ汚染
を有するＤＮＡポリメラーゼ画分のみ（６５−９５mMリ
ン酸カリウム) をプールした。このプールに殺菌したゼ
ラチンを２５０μｇ／mlで添加し、透析を第二の緩衝液
に対して行い、画分Ｅを得た。 【０１６６】画分Ｅを９mlのホスホセルロースカラムに
かけ、１００mlの勾配（２０mMリン酸カリウム緩衝液pH
７．５中０．０１−０．４Ｍ ＫＣｌの勾配）で溶出し
た。これらの画分について上記の如く汚染エンド／エキ
ソヌクレアーゼ並びにポリメラーゼ活性（カレディン等
の方法により）のアッセイを行い次いでプールした。プ
ールした画分を第二の緩衝液に対して透析し、次いで５
０％グリセリン及び第二の緩衝液に対する透析により濃
縮した。 【０１６７】このポリメラーゼの分子量をＳＤＳ ＰＡ
ＧＥにより求めた。マーカー蛋白質（低分子量標準）は
ホスホリラーゼ（９２，５００）、ウシ血清アルブミン
（６６，２００）、オバルブミン（４５，０００）、炭
素アンヒドラーゼ（３１，０００）、大豆トリプシン阻
害因子（２１，５００）及びリゾチーム（１４，４０
０）であった。予備的データはこのポリメラーゼは文献
に報告される６２，０００〜６３，０００ダルトン（例
えばカレディン等による）ではなく、約８６，０００〜
９０，０００ダルトンの分子量を有することを示唆す
る。 【０１６８】IV．増幅反応 １μｇの上記ゲノムＤＮＡを２５mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
（pH８．０）、５０mMＫＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ2 、５
mMジチオスレイトール、２００μｇ／mlゼラチン、１μ
ＭのプライマーＰＣ０３、１μＭのプライマーＰＣ０
４、１．５mMｄＡＴＰ、１．５mM ｄＣＴＰ、１．５mM
ｄＧＴＰ及び１．５mM ＴＴＰを含有する当初１００
μｌの水性反応液中に稀釈した。このサンプルを９８℃
で１０分間加熱して、ゲノムＤＮＡを変性し、次いで室
温に冷却した。サーマス・アクアティカスからの４μｌ
のポリメラーゼを反応液に添加し、１００μｌの鉱油キ
ャップを重層した。次に、サンプルを、１９８６年２月
２５日に出願された米国特許出願No. ８３３，３６８に
記載されている液体取扱い及び加熱器具のアルミニウム
加熱ブロック内に入れた。 【０１６９】このＤＮＡサンプルにつき、次のプログラ
ムサイクルを繰返して機械内で２０サイクルの増幅を行
った： １）加熱ブロック内における２．５分に亘る３７℃から
９８℃への加熱、及び２）プライマー及びＤＮＡをアニ
ールさせるための３分間に亘る９８℃から３７℃への冷
却。最終サイクル後、サンプルを５５℃で更に１０分間
インキュベートして最終延長反応を完結させた。 【０１７０】Ｖ．オリゴデオキシリボヌクレオチドプロ
ーブの合成及びリン酸化 下記配列のＲＳ２４と称される標識されたＤＮＡプロー
ブを調整した： ５′−* ＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣ ＡＧＧＡＧＴＣＡＧ−３′（ＲＳ２４） （ここで、＊は標識を示す）。 このプローブは例１Ｉに記載した方法により合成した。
このプローブは４０個の塩基長さであり、遺伝子の４番
目〜１７番目のコドンに亘りそして正常β−グロビン対
立遺伝子（βA ）に相補的である。プライマー及びプロ
ーブの概略図を以下に示す： 【０１７１】 【表１５】 このプローブは実施例１の分節Ｉで説明した操作に従っ
て合成した。このプローブはその２０pmolを７０mM Ｔ
ｒｉｓ（pH７．６）、１０mM ＭｇＣｌ2 、１．５mMス
パーミン及び１０mMジチオスレイトールを含有する４０
μｌの反応液中３７℃において６０分間４単位のＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ及び約４０pmolのγ−32Ｐ−Ａ
ＴＰ（約７０００Ci／mmole)と接触させることにより標
識した。 【０１７２】全容量を次いで２５mM ＥＤＴＡで１００
μｌに調整し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（１
０mM Ｔｒｉｓ、０．１mM ＥＤＴＡ、pH８．０）で平
衡化された１mlのスピン透析カラム上でマニアティス等
〔Maniatis等、Molecular Cloning (1982) 466-467〕の
方法に従って精製した。反応生成物のＴＣＡ沈澱はＲＳ
２４について比活性は４．３μCi／pmole であり、最終
濃度は０．１１８pmole ／μｌであることを示した。 【０１７３】VI．ドットブロットハイブリダイゼーショ
ン Ｉ．からの増幅サンプル４μｌ及び７０，７５，８０，
８５，９０，９５、及び１００％の増幅効率を表わすよ
うに計算された適当な稀釈率のβ−グロビンプラスミド
ＤＮＡ ５．６μｌを２００μｌの０．４Ｎ ＮａＯ
Ｈ、２５mM ＥＤＴＡで稀釈し、リード及びマン（Reed
and Mann)〔Nucleic Acids Research 13,7202-7221 (1
985) 〕に開示されるように、先ずフィルターを水で濡
らし、フィルターを所定位置に保持するドットブロット
作成用装置内にフィルターを入れ、サンプルを適用しそ
して各ウェルを０．１mlの２０×ＳＳＰＥ（３．６Ｍ
ＮａＣｌ、２００mM ＮａＨ2 ＰＯ4 、２０mM ＥＤＴ
Ａ）で濯ぐことによりナイロンフィルター上にスポット
した。次いでフィルターを取出し、２０×ＳＳＰＥ中で
濯ぎ真空オーブン中において８０℃で３０分間焼付け
た。 【０１７４】焼付け後各フィルターを３×ＳＳＰＥ、５
×デンハルト溶液（１×＝０．０２％ポリビニルピロリ
ドン、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ウシ血清
アルブミン、０．２mM Ｔｒｉｓ、０．２mM ＥＤＴ
Ａ、pH８．０）、０．５％ ＳＤＳ、及び３０％ホルム
アミドよりなる１６mlのハイブリダイゼーション溶液と
接触させ、４２℃で２時間インキュベートした。次いで
２pmole のプローブＲＳ２４をこのハイブリダイゼーシ
ョン溶液に添加し、フィルターを４２℃で２時間インキ
ュベートした。 【０１７５】最後に、各ハイブリダイズされたフィルタ
ーを１００mlの２×ＳＳＰＥ及び０．１％ ＳＤＳで室
温において１０分間２回洗浄した。次いでフィルターを
１００mlの２×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳで６０℃に
おいて１０分間１回処理した。各フィルターを次いでオ
ートラジオグラフにかけたところ、シグナルは２時間後
に容易に明らかとなった。 【０１７６】VII. オートラジオグラムの検討 ドットブロットのオートラジオグラムは２時間後に分析
され、上記サイキ等（Saiki et al.Science)により説明
されるようにＨａｅIII ／ＭａｅＩ−消化ｐＢＲ：βA
（βA は野性種の対立遺伝子である）を用いて調製され
た標準的逐次稀釈β−グロビン再構成液に対して強度を
対比した。反応生成物の分析は総括増幅効率が約９５％
であり、β−グロビン目標配列における６３０，０００
倍の増大に対応することを示した。 【０１７７】例９． Ｉ．増幅反応 例８と同様のＭｏｌｔ ４セルラインから抽出された二
つの１μｇのゲノムＤＮＡのサンプルをそれぞれ５０mM
ＫＣｌ、２５mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH８．０）、１
０mM ＭｇＣｌ2 、１μＭのプライマーＰＣ０３、１μ
ＭのプライマーＰＣ０４、２００μｇ／mlゼラチン、１
０％ジメチルスルホキシド（容量％）、１．５mM ｄＡ
ＴＰ、１．５mM ｄＣＴＰ、１．５mM ｄＧＴＰ、及び
１．５mMＴＴＰを含有する１００μｌの反応液中に稀釈
した。この混合物を９８℃で１０分間加熱して、ゲノム
ＤＮＡを変性後、サンプルを室温に冷却し、例８と同様
のサーマス・アクアティスからのポリメラーゼ４μｌを
各サンプルに添加した。これらのサンプルに鉱油を重層
して濃縮及び蒸発損失を防止した。 【０１７８】サンプルの一方を例８と同様の機械の加熱
ブロック内に入れ、次のプログラムサイクルを繰返して
２５サイクルの増幅に付した： （１）２．５分間に亘る３７℃から９３℃への加熱、
（２）プライマー及びＤＮＡをアニールさせるための３
分間に亘る９３℃から３７℃への冷却、及び（３）２分
間に亘る３７℃における維持。 最終サイクル後、サンプルを更に６０℃で１０分間イン
キュベートして最終延長反応を完結させた。 【０１７９】第二のサンプルは上記により詳細に説明し
た機械の熱伝導性容器内に入れた。この熱伝導性容器は
温度を上方、及び下方に調整するＰｅｌｔｉｅｒヒート
ポンプ及びマイクロプロセッサコントローラに結合して
自動的に増幅順序、温度レベル、温度勾配及び温度のタ
イミングを制御した。第二の試料は次のプログラムサイ
クルを繰返して２５サイクルの増幅に付した： （１）３分間に亘る３７℃から９５℃への加熱、（２）
変性を起こすための０．５分間の９５℃における維持、
（３）１分間に亘る９５℃から３７℃への冷却、及び
（４）１分間の３７℃における維持。 【０１８０】II．分析 分析のために二つの試験、すなわちドットブロット及び
アガロースゲル分析を行った。 ドットブロット分析のためには、下記配列のＲＳ１８と
称される標識ＤＮＡプローブを調製した： ５′−* ＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣ−３′（ＲＳ１８） （＊は標識を示す）。 このプローブは１５個の塩基長であり、遺伝子の第４番
目乃至第１７番目のコドンに亘りそして正常なβ−グロ
ビン対立遺伝子（βA ）に相補的である。プライマー及
びプローブの概略図を下記に示す： 【０１８１】 【表１６】 このプローブは例１．Ｉに示した操作に従って合成し
た。このプローブはその１０pmole を４単位のＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ及び約４０pmole のγ−32Ｐ−Ａ
ＴＰ（約７０００Ci／mmole)と７０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣ
ｌ（pH７．６）、１０mM ＭｇＣｌ2 １．５mMスパーミ
ン及び１０mMジチオスレイトールを含有する４０μｌの
反応液中において３７℃で６０分間接触させることによ
り標識した。 【０１８２】次いで全容量を２５mM ＥＤＴＡで１００
μｌに調整し、そしてマニアティス等〔Molecular Clon
ing (1982) 466-467〕の操作に従ってＴｒｉｓ−ＥＤＴ
Ａ（ＴＥ）緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液、
０．１mM ＥＤＴＡ、pH８．０）で平衡化された１mlの
スピン透析カラム上で精製した。反応生成物のＴＣＡ沈
澱はＲＳ１８について比活性は４．６μCi／pmole であ
り、最終濃度は０．１１４pmole ／μｌであることを示
した。 【０１８３】分節Ｉで得られた増幅サンプル、及び熱安
定性酵素の代りにＥ．コリ（E.coli) ＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレノウ断片を用いた以外は上記と同様にして増
幅したサンプル５μｌを１９５μｌの０．４Ｎ ＮａＯ
Ｈ、２５mM ＥＤＴＡで稀釈し、リード及びマン〔Reed
and Mann, Nucleic Acids Research, 13, 7202-7221(1
985) 〕に開示されるように先ずフィルターを水で濡ら
し、それらをフィルターを所定位置に保持するドットブ
ロット作成用装置内に置き、サンプルを適用し、そして
各ウェルを０．４mlの２０×ＳＳＰＥ（３．６Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、２００mMＮａＨ2 ＰＯ4 、２０mM ＥＤＴＡ）で
濯ぐことにより２個のレプリカナイロンフィルター上に
スポットした。次いでこれらのフィルターを取出し、２
０×ＳＳＰＥ中で濯ぎそして真空オーブン内で８０℃に
おいて３０分間焼付けた。 【０１８４】加熱後、各フィルターを次いで６mlの５×
ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液（１×＝０．０２％ポリ
ビニルピロリドン、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０
２％ウシ血清アルブミン、０．２mM Ｔｒｉｓ、０．２
mM ＥＤＴＡ、pH８．０）及び０．５％ ＳＤＳよりな
る６mlのハイブリダイゼーション溶液と接触させて５５
℃で６０分間インキュベートした。次いで、５μｌのプ
ローブＲＳ１８をハイブリダイゼーション溶液に添加
し、フィルターを５５℃で６０分間インキュベートし
た。 【０１８５】最後に各ハイブリダイズされたフィルター
を１００mlの２×ＳＳＰＥ及び０．１％ ＳＤＳで室温
において１０分間２回洗浄した。次いで、フィルターを
それぞれ１００mlの５×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳで
６０℃において１）１分間及び２）３分間の２回処理し
た。次いで各フィルターをオートラジオグラフィにかけ
たところ、シグナルは９０分後に容易に明らかとなっ
た。 【０１８６】アガロースゲル分析において、各５μｌの
増幅反応液を１×ＴＢＥ緩衝液（０．０８９Ｍ Ｔｒｉ
ｓホウ酸塩、０．０８９Ｍホウ酸、及び２mM ＥＤＴ
Ａ）中の０．５％アガロースゲルに負荷し、１００Ｖで
６０分間電気泳動させた。エチジウムブロマイドで染色
後、ＤＮＡをＵＶ螢光により可視化した。これらの結果
は、例８及び例９で用いた機械はＤＮＡの増幅に同様に
有効であり、所望配列に対応する同様な強度の個々の高
密度の１１０塩基対バンド並びにはるかに低い強度の僅
かのその他の個々のバンドを示した。これに対して、各
サイクル後にＥ．コリポリメラーゼＩのクレノウ断片を
用いる試薬移転を含む増幅方法は多くの非関連ＤＮＡ配
列の非−特異的増幅から生ずるＤＮＡスメアを与えた。 【０１８７】ＨＬＡ−ＤＱ，ＤＲ及びＤＰ領域の評価に
おいても同様の増幅及び検出における改良が達成される
ことが期待される。さらに、米国特許No. ４，５８２，
７８９及びNo. ４，６１７，２６１に記載されている様
にして調製されたビオチン化プローブを用いて例１の方
法を反復することができると予想される。 【０１８８】例１０．１５０mM ＫＣｌ、５０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、１０mM ＭｇＣｌ2 、５mM
ＤＴＴ、０．５mM ｄＡＴＰ、０．５mM ｄＣＴＰ、
０．５mM ｄＴＴＰ、０．５mM ｄＧＴＰ、０．２μｇ
のオリゴ（ｄＴ）１２−１８，４０ユニットのＲＮａｓ
ｉｎ及び５ユニットのＡＭＶ逆転写酵素を含有する１０
０μｌの反応容量中で４２℃にて３０分間インキュベー
トして１μｇのラビット網状赤血球ｍＲＮＡからｃＤＮ
Ａを調製した。９５℃にて１０分間加熱することにより
反応を停止した。２μｇのＲＮアーゼＡをサンプル（水
中２mg／ml溶液２μｌ）に添加し、そして３７℃にて１
０分間インキュベートした。 【０１８９】異るプライマー対を用いて、Ｋｌｅｎｏｗ
断片により３種類の増幅反応を行った。プライマー対Ｐ
Ｃ０３／ＰＣ０４は１１０bp生成物を規定し、プライマ
ー対ＲＳ４５／オリゴ（ｄＴ）２５−３０は約３７５bp
の生成物を規定し、そしてプライマー対ＰＣ０３／オリ
ゴ（ｄＴ）２５−３０は約６００bpの生成物を規定す
る。ＰＣ０３，ＰＣ０４、及びＲＳ４５はヒトβ−グロ
ビン遺伝子に対して相補的であり、そしてそれぞれがラ
ビットの遺伝子に対して２個のミスマッチを有する。Ｐ
Ｃ０３及びＰＣ０４は例１に記載されている。ＲＳ４５
は配列：５′−ＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＡＧＧＴＧＣ
Ｃ−３′を有する。 【０１９０】上記ｃＤＮＡの２０分の１（５μｌ）を用
いて、５０mM ＮａＣｌ、１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．６）、１０mM ＭｇＣｌ2 、２００μｇ／mlのゼラ
チン、１０％のＤＭＳＯ、１μＭ ＰＣ０３又はＲＳ４
５、１μＭ ＰＣ０４又はオリゴ（ｄＴ）２５−３０、
１．５mM ｄＡＴＰ、１．５mM ｄＣＴＰ、１．５mM
ｄＴＴＰ及び１．５mM ｄＧＴＰを含有する１００μｌ
の反応容量中で増幅反応を行った。サンプルを９８℃に
て５分間加熱し、そして次に室温に冷却し、そして約１
００μｌの鉱油を重層した。 【０１９１】例８に記載した機械及び下記のプログラム
を用いて、サンプルを１０サイクルの自動増幅にかけ
た。 １）ヒートブロック中で２．５分間３７℃から９８℃に
加熱し（変性）； ２）３．０分間にわたって９８℃から３７℃に冷却し
（アニール）； ３）１ユニットのＫｌｅｎｏｗ断片を加え；そして ４）３７℃にて２０分間維持する（延長）。 各サンプルの最終容量は約１４０μｌであった。 【０１９２】各サンプルの２０分の１（７μｌ）を２％
アガロースゲル上での電気泳動により分析した。臭化エ
チジウムで染色した後、ＰＣ０３／ＰＣ０４サンプル及
びＲＳ４５／オリゴ（ｄＴ）サンプルにおいて個別のバ
ンドが見られた。バンドのサイズは予想の長さと一致
し、前記については１１０bp、後者については３７０bp
であった。ＰＣ０３／オリゴ（ｄＴ）プライマー対によ
る約６００bp断片の増幅の証拠は観察されなかった。 【０１９３】ゲルの内容物を陽イオン性ナイロン膜上に
サザンブロットし、そして Saiki等、Science 、前掲、
に記載されているニックトランスレーション・ヒトβ−
グロビンプローブｐＢＲ３２８：ＢＡと、標準的技法に
よりハイブリダイズせしめた。得られたオートラジオグ
ラムはすでに得られた結論と一致した。すなわち、１１
０bp断片及び３７０bp断片はβ−グロビン特異的増幅生
成物であり、そして約６００bpの有意な増幅は検出され
なかった。 【０１９４】すでに記載したのと同じプライマー対を用
いて、前記の様にして得られたサーマス・アクアチカス
（Ｔａｑ）ポリメラーゼにより３個の追加のサンプルを
増幅した。ｃＤＮＡの内の５μｌを、５０mM ＫＣｌ、
２５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）、１０mM Ｍｇ
Ｃｌ2 、２００μｇ／mlのゼラチン、１０％ ＤＭＳ
Ｏ、１μＭ ＰＣ０３又はＲＳ４５、１μＭ ＰＣ０４
又はオリゴ（ｄＴ）２５−３０、１．５mM ｄＡＴＰ、
１．５mM ｄＣＴＰ、１．５mM ｄＴＴＰ及び１．５mM
ｄＧＴＰを含有する１００μｌの反応容量中で増幅し
た。サンプルを９８℃にて５分間加熱し、次に室温に冷
却した。１μｌのＴａｑポリメラーゼ（ロット２の１／
８稀釈物）をそれぞれに加え、そして１００μｌの鉱油
を重層した。 【０１９５】前の例に記載したＰｅｌｔｉｅｒ装置及び
下記のプログラムを用いて、サンプルを９サイクルの増
幅にかけた。 １）１分間３５℃から６０℃に変温し； ２）１２分間６０℃から７０℃に変温し（延長）； ３）１分間７０℃から９５℃に変温し（変性）； ４）３０秒間９５℃に置き； ５）１分間９５℃から３５℃に変温し（アニール）；そ
して、 ６）３０秒間３５℃に置いた。 最終サイクルの後、サンプルをさらに１０分間６０℃に
てインキュベートすることにより最終（第１０サイク
ル）延長を完結した。各最終容積は約１００μｌであっ
た。 【０１９６】前記の様に、各サンプルの２０分の１（１
０μｌ）を２％アガロースゲル上で分析した。このゲル
中に、増幅生成物は３個すべてのサンプルに存在した。
すなわち、ＰＣ０３／ＰＣ０４については１１０bp、Ｒ
Ｓ４５／オリゴ（ｄＴ）については約３７０bp、そして
ＰＣ０３／オリゴ（ｄＴ）については約６００bpの生成
分が存在した。これらの結果はサザン移行、及びｐＢＲ
３２８：ＢＡプローブとのハイブリダイゼーションによ
り確認された。Ｔａｑポリメラーゼを使用するがＫｌｅ
ｎｏｗ断片を用いない６００bp生成物の生成は有意であ
り、そしてＴａｑポリメラーゼはＫｌｅｎｏｗ断片より
も長いＤＮＡを生成せしめることができることが示唆さ
れる。 【０１９７】要約すれば、プライマー延長生成物が形成
されこれが次に鋳型として機能することができる連鎖反
応において核酸が増幅され、そしてこの増幅されたサン
プルが配列特異的プローブを用いて分析される本発明の
技法は幾つかの重要な利点をもたらす。増幅されたサン
プルをフィルター膜上にドットブロットとしてスポット
することができ、これによって、他の方法によれば必要
とされる制限酵素消化、電気泳動及びゲル操作を回避す
ることができるから、この方法は単純化された方法であ
る。増幅は交差ハイブリダイゼーション配列に対する特
定の標的配列の比率を徐々に高めるので、この方法は一
層特異的な方法である。 【０１９８】さらに、この発明の方法は、１０3 〜１０
4 で感度を改良する。一夜の暴露の後１ngのサンプルか
ら判断可能なシグナルを得ることができる。最後に、フ
ィルターに適用されるサンプルの量を０．１〜０．５μ
ｇに増加することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチ
ドプローブを使用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グレン トマス ホーン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94608，エミリービル，コモドア ドラ イブ ７ (72)発明者 ランドール ケーイチ サイキ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94805，リッチモンド，サーティナイン ス ストリート−320 (72)発明者 カリー バンクス マリス アメリカ合衆国，カリフォルニア 92037，ラ ジョラ，ネプチューン プ レイス ４，6767 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．サンプル中に含まれる１又は複数の核酸中の特定の
    ヌクレオチド配列の存在又は不存在を検出するためのキ
    ットであって、 （ａ）検出されるべき各異る変化を含有する各核酸につ
    き２種類のオリゴヌクレオチドプライマーであって、１
    つのプライマーから合成された延長生成物が、それがそ
    の相補体から分離された場合に、他のプライマーの延長
    生成物の合成のための鋳型として機能することができ、
    こうして前記核酸を指数的に増幅するように選択された
    プライマー；並びに （ｂ）プローブの配列が前記増幅された配列のある領域
    に対して相補的である場合にのみ該増幅された核酸配列
    とハイブリダイズすることができ、核出すべきヌクレオ
    チド変化をまたぎ且つ該検出されるべきヌクレオチド変
    化に対して特異的である１５〜２５ヌクレオチドの長さ
    の配列特異的オリゴヌクレオチドを有するプローブ、及
    び増幅された核酸を結合させることができる膜；を含ん
    で成るキット。 ２．さらに（ｃ）重合用試薬又は（ｄ）４種類のオリゴ
    ヌクレオシドトリホスフェート、あるいはこの両者を含
    んで成る、請求項１に記載のキット。 ３．サンプル中に含まれる１又は複数の核酸中の特定の
    ヌクレオチド配列の存在又は不存在を検出するためのキ
    ットであって、 （ａ）検出されるべき各異る変化を含有する各核酸につ
    き２種類のオリゴヌクレオチドプライマーであって、１
    つのプライマーから合成された延長生成物が、それがそ
    の相補体から分離された場合に、他のプライマーの延長
    生成物の合成のための鋳型として機能することができ、
    こうして前記核酸を指数的に増幅するように選択された
    プライマー； （ｂ）プローブの配列が前記増幅された配列のある領域
    に対して相補的である場合にのみ該増幅された核酸配列
    とハイブリダイズすることができる配列特異的オリゴヌ
    クレオチドプローブ、及び増幅された核酸を結合させる
    ことができる膜； （ｃ）５０℃以上で作用する核酸ポリメラーゼ；を含ん
    で成るキット。
JP2000052307A 1986-03-13 2000-02-24 特定のヌクレオチド配列の検出方法及びキット Expired - Lifetime JP3124529B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US83933186A 1986-03-13 1986-03-13
US89934486A 1986-08-22 1986-08-22
US899344 1986-08-22
US839331 1997-04-17

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP9281834A Division JP3070837B2 (ja) 1986-03-13 1997-10-15 特定のヌクレオチド配列の検出方法及びキット

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2000189199A JP2000189199A (ja) 2000-07-11
JP3124529B2 true JP3124529B2 (ja) 2001-01-15

Family

ID=27126099

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62056985A Expired - Lifetime JP2726659B2 (ja) 1986-03-13 1987-03-13 核酸中に存在する特定のヌクレオチド配列の検出方法及びそのためのキット
JP7002861A Expired - Lifetime JP2703194B2 (ja) 1986-03-13 1995-01-11 核酸中に存在する特定のヌクレオチド配列の検出方法
JP9281834A Expired - Lifetime JP3070837B2 (ja) 1986-03-13 1997-10-15 特定のヌクレオチド配列の検出方法及びキット
JP2000052307A Expired - Lifetime JP3124529B2 (ja) 1986-03-13 2000-02-24 特定のヌクレオチド配列の検出方法及びキット
JP2000052306A Expired - Lifetime JP3124528B2 (ja) 1986-03-13 2000-02-24 特定のヌクレオチド配列の検出方法及びキット

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62056985A Expired - Lifetime JP2726659B2 (ja) 1986-03-13 1987-03-13 核酸中に存在する特定のヌクレオチド配列の検出方法及びそのためのキット
JP7002861A Expired - Lifetime JP2703194B2 (ja) 1986-03-13 1995-01-11 核酸中に存在する特定のヌクレオチド配列の検出方法
JP9281834A Expired - Lifetime JP3070837B2 (ja) 1986-03-13 1997-10-15 特定のヌクレオチド配列の検出方法及びキット

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000052306A Expired - Lifetime JP3124528B2 (ja) 1986-03-13 2000-02-24 特定のヌクレオチド配列の検出方法及びキット

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5468613A (ja)
EP (3) EP0459532B1 (ja)
JP (5) JP2726659B2 (ja)
AT (2) ATE125307T1 (ja)
AU (1) AU594130B2 (ja)
CA (1) CA1284931C (ja)
DE (2) DE3751423T2 (ja)
HK (1) HK145894A (ja)

Families Citing this family (373)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6818393B1 (en) 1982-07-30 2004-11-16 Biomirieux Sa DNA sequences coding for the DR beta-chain locus of the human lymphocyte antigen complex and polypeptides, diagnostic typing processes and products related thereto
US5721098A (en) * 1986-01-16 1998-02-24 The Regents Of The University Of California Comparative genomic hybridization
US5567809A (en) * 1986-03-13 1996-10-22 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for HLA DRbeta DNA typing
US5310893A (en) * 1986-03-31 1994-05-10 Hoffmann-La Roche Inc. Method for HLA DP typing
US5604099A (en) * 1986-03-13 1997-02-18 Hoffmann-La Roche Inc. Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US6194561B1 (en) * 1986-03-13 2001-02-27 Roche Molecular Systems, Inc. Characterization and detection of sequences associated with autoimmune diseases
CA1338457C (en) * 1986-08-22 1996-07-16 Henry A. Erlich Purified thermostable enzyme
DK495186D0 (da) * 1986-10-16 1986-10-16 Nordisk Gentofte Fremgangsmaade og middel til paavisning af genstrukturer hos personer med stor tilbaejelighed til udvikling af iddm
US5714380A (en) * 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
AU622104B2 (en) * 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
US5202231A (en) * 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US6270961B1 (en) * 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
US5359100A (en) * 1987-10-15 1994-10-25 Chiron Corporation Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5039606A (en) * 1987-10-29 1991-08-13 Virginia Mason Research Center Diagnostic probe for diabetes type I predisposition
CA1323553C (en) * 1987-11-03 1993-10-26 Timothy George Helentjaris Method and device for improved restriction fragment length polymorphism analysis
US4902624A (en) * 1987-11-23 1990-02-20 Eastman Kodak Company Temperature cycling cuvette
FI79342C (fi) * 1987-12-23 1989-12-11 Orion Yhtymae Oy Apparat, del av en apparat och foerfarande foer maongfaldigande av nukleinsyror.
IL88923A (en) * 1988-01-12 1995-07-31 Hoffmann La Roche Gene encoding a thermostable dna polymerase from thermus aquaticus said dna polymerase and its purification
EP0402400B1 (en) * 1988-02-18 1999-09-08 University of Utah Genetic identification employing dna probes of variable number tandem repeat loci
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
IE61148B1 (en) * 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
ATE108491T1 (de) * 1988-03-18 1994-07-15 Baylor College Medicine Mutationsnachweis durch kompetitiven oligonukleotid-priming.
US6054270A (en) * 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US7811751B2 (en) 1988-05-03 2010-10-12 Oxford Gene Technology Limited Analysing polynucleotide sequences
WO1989012697A1 (en) * 1988-06-22 1989-12-28 The Board Of Regents Of The University Of Washingt Method for detecting abnormal genes
US5858652A (en) * 1988-08-30 1999-01-12 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
US5091310A (en) * 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US5142033A (en) * 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US5066584A (en) * 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
JPH02174699A (ja) * 1988-09-27 1990-07-06 Nichirei Corp Ｈｌａ型判別法及び試薬
US5389512A (en) * 1988-10-07 1995-02-14 Hoffman-La Roche Inc. Method for determining the relative amount of a viral nucleic acid segment in a sample by the polymerase chain reaction
DE3834636A1 (de) * 1988-10-11 1990-04-19 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur analyse von laengenpolymorphismen in dna-bereichen
US5766847A (en) * 1988-10-11 1998-06-16 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Process for analyzing length polymorphisms in DNA regions
CA1339731C (en) * 1988-10-12 1998-03-17 Charles T. Caskey Multiplex genomic dna amplification for deletion detection
DE3838269A1 (de) * 1988-11-11 1990-05-17 Behringwerke Ag Nachweis humaner papillomavirus dna und ihrer expression in zervix-abstrichen
US4879214A (en) * 1988-11-15 1989-11-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Differentiation of nucleic acid segments on the basis of nucleotide differences
GB2228086A (en) * 1988-11-25 1990-08-15 Ici Plc Characterisation of genomic DNA
US5514550A (en) * 1989-02-03 1996-05-07 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Nucleic acid test article and its use to detect a predetermined nucleic acid
CA1338505C (en) * 1989-02-03 1996-08-06 John Bruce Findlay Containment cuvette for pcr and method of use
US5041371A (en) * 1989-03-15 1991-08-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Genetic marker for superior milk products in dairy cattle
US5380645A (en) * 1989-03-16 1995-01-10 The Johns Hopkins University Generalized method for assessment of colorectal carcinoma
DE69032864T3 (de) * 1989-03-29 2013-01-31 The Johns Hopkins University Nachweis des Ausfalls des Wildtyps des p53-Gens
US5334499A (en) * 1989-04-17 1994-08-02 Eastman Kodak Company Methods of extracting, amplifying and detecting a nucleic acid from whole blood or PBMC fraction
US5043272A (en) * 1989-04-27 1991-08-27 Life Technologies, Incorporated Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers
US5683896A (en) * 1989-06-01 1997-11-04 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US6379895B1 (en) 1989-06-07 2002-04-30 Affymetrix, Inc. Photolithographic and other means for manufacturing arrays
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
FR2649122B1 (fr) * 1989-07-03 1991-10-18 Pasteur Institut Perfectionnements apportes aux techniques d'amplification par reaction de polymerisation en chaine (pcr)
GB8920097D0 (en) * 1989-09-06 1989-10-18 Ici Plc Amplification processes
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
US5231015A (en) * 1989-10-18 1993-07-27 Eastman Kodak Company Methods of extracting nucleic acids and pcr amplification without using a proteolytic enzyme
CA2032203C (en) * 1989-12-29 2009-05-19 Christine L. Brakel Amplification capture assay
GB9002625D0 (en) * 1990-02-06 1990-04-04 Univ Singapore Human leukocyte antigen typing
US6013431A (en) 1990-02-16 2000-01-11 Molecular Tool, Inc. Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
US6503707B1 (en) * 1990-06-27 2003-01-07 The Blood Center Research Foundation, Inc. Method for genetic typing
US5210015A (en) † 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
NL9002259A (nl) * 1990-10-17 1992-05-18 Eurodiagnostics B V Werkwijze voor het bepalen van een genotype door het vergelijken van de nucleotidensequentie van leden van een genfamilie, alsmede kit voor het opsporen van genetische variaties.
GB9024005D0 (en) * 1990-11-05 1990-12-19 British Bio Technology Process for amplifying nucleic acid
JP3643375B2 (ja) * 1990-12-06 2005-04-27 エフ．ホフマン ― ラ ロシュ アーゲー ＨＬＡ ＤＲβのＤＮＡタイピングのための方法および試薬
EP0515660B1 (en) * 1990-12-21 1997-03-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Hla dqbeta dna typing
WO1992020820A1 (en) * 1991-05-15 1992-11-26 Vanderbilt University Method to determine metastatic potential of tumor cells
ES2091976T3 (es) 1991-06-20 1996-11-16 Hoffmann La Roche Metodos perfeccionados para la amplificacion del acido nucleico.
FR2679252B1 (fr) * 1991-07-17 1993-12-10 Bio Merieux Systeme de sondes permettant d'effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes.
US5976789A (en) * 1991-07-17 1999-11-02 Bio Merieux System of probes enabling HLA-DR typing to be performed, and typing method using said probes
US6943034B1 (en) 1991-11-22 2005-09-13 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
DE69233331T3 (de) 1991-11-22 2007-08-30 Affymetrix, Inc., Santa Clara Kombinatorische Strategien zur Polymersynthese
FR2684688B1 (fr) * 1991-12-04 1994-03-18 Bertin Et Cie Procede de selection d'au moins un crible de mutations, son application a un procede d'identification rapide d'alleles de systemes polymorphes et dispositif pour sa mise en óoeuvre.
ES2161715T3 (es) 1992-03-04 2001-12-16 Univ California Hibridacion genomica comparativa (hgc).
US7534567B2 (en) 1992-03-04 2009-05-19 The Regents Of The University Of California Detection of nucleic acid sequence differences by comparative genomic hybridization
US5843640A (en) * 1992-06-19 1998-12-01 Northwestern University Method of simultaneously detecting amplified nucleic acid sequences and cellular antigens in cells
FI923719A0 (fi) * 1992-08-19 1992-08-19 Jaakko Tuomilehto Detektering av susceptibilitet foer diabetes.
WO1995000530A1 (en) * 1993-06-25 1995-01-05 Affymax Technologies N.V. Hybridization and sequencing of nucleic acids
EP0787183A4 (en) 1993-07-23 1998-05-27 Hyseq Inc METHOD FOR DETECTION OF UNKNOWN ORGANISMS
US5597694A (en) * 1993-10-07 1997-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Interspersed repetitive element-bubble amplification of nucleic acids
FR2718461B1 (fr) * 1994-04-07 1996-05-15 Cis Bio Int Procédé de détection d'un site de restriction dans une séquence d'ADN.
EP0756639B1 (en) * 1994-04-19 1998-12-30 Stichting Centraal Laboratorium van de Bloedtransfusiedienst van het Nederlandse Rode Kruis Methods for the discrimination between syncytium inducing and non syncytium inducing variants of the human immunodeficiency virus and primers to be used in the methods
US7625697B2 (en) 1994-06-17 2009-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for constructing subarrays and subarrays made thereby
AUPN245295A0 (en) * 1995-04-13 1995-05-11 Johnson & Johnson Research Pty. Limited Assay for genetic abnormalities
US5882867A (en) * 1995-06-07 1999-03-16 Dade Behring Marburg Gmbh Detection of nucleic acids by formation of template-dependent product
EP0796347A2 (en) * 1995-09-21 1997-09-24 Becton, Dickinson and Company Detection of nucleic acids in cells by thermophilic strand displacement amplification
US5670325A (en) * 1996-08-14 1997-09-23 Exact Laboratories, Inc. Method for the detection of clonal populations of transformed cells in a genomically heterogeneous cellular sample
WO1997024929A1 (en) * 1996-01-11 1997-07-17 Human Genome Sciences, Inc. Human g-protein coupled receptor
US20030054487A1 (en) * 1996-01-11 2003-03-20 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein coupled receptor
EP0880598A4 (en) 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US5741650A (en) * 1996-01-30 1998-04-21 Exact Laboratories, Inc. Methods for detecting colon cancer from stool samples
US5763184A (en) 1996-01-30 1998-06-09 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleotide sequence variation in the ABO glycosyltransferase gene
FR2749308B1 (fr) * 1996-06-03 1998-07-24 Bio Merieux Sondes nucleotidiques et procede pour determiner le typage hla dqb1
WO1997047768A1 (en) * 1996-06-10 1997-12-18 Fenggang Wang Method for randomly synthesizing biopolymers
US6297027B1 (en) 1996-07-31 2001-10-02 Purina Mills, Inc. Bovine leptin protein, nucleic acid sequences coding therefor and uses thereof
US6277592B1 (en) 1996-07-31 2001-08-21 Purina Mills, Inc. Porcine leptin protein, nucleic acid sequences coding therefor and uses thereof
US6100029A (en) * 1996-08-14 2000-08-08 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of chromosomal aberrations
US5952178A (en) 1996-08-14 1999-09-14 Exact Laboratories Methods for disease diagnosis from stool samples
US6146828A (en) * 1996-08-14 2000-11-14 Exact Laboratories, Inc. Methods for detecting differences in RNA expression levels and uses therefor
US6300077B1 (en) 1996-08-14 2001-10-09 Exact Sciences Corporation Methods for the detection of nucleic acids
US6020137A (en) * 1996-08-14 2000-02-01 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of loss of heterozygosity
US6203993B1 (en) 1996-08-14 2001-03-20 Exact Science Corp. Methods for the detection of nucleic acids
US5928870A (en) * 1997-06-16 1999-07-27 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of loss of heterozygosity
AU4174397A (en) * 1996-08-30 1998-03-19 Life Technologies, Inc. Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cdna and genomic dna
US6361940B1 (en) 1996-09-24 2002-03-26 Qiagen Genomics, Inc. Compositions and methods for enhancing hybridization and priming specificity
US20020042048A1 (en) 1997-01-16 2002-04-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
US6297006B1 (en) 1997-01-16 2001-10-02 Hyseq, Inc. Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments
US6171788B1 (en) 1997-01-28 2001-01-09 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US7138511B1 (en) 1997-01-28 2006-11-21 The Regents Of The University Of California Nucleic acids, kits and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US6475724B1 (en) 1997-01-28 2002-11-05 The Regents Of The University Of California Nucleic acids, kits, and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US6306588B1 (en) * 1997-02-07 2001-10-23 Invitrogen Corporation Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof
US6720141B1 (en) * 1999-11-01 2004-04-13 Interleukin Genetics, Inc. Diagnostics and therapeutics for restenosis
US6387615B2 (en) * 1997-04-11 2002-05-14 Isis Innovation Limited Methods and materials for the diagnosis or prognosis of asthma
CA2287506A1 (en) * 1997-04-18 1998-10-29 Abbott Laboratories Amplification based mutation detection
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
ES2271994T3 (es) 1997-05-02 2007-04-16 Gen-Probe Incorporated Hibridacion en dos pasos y captura de un polinucleotido.
US5994076A (en) * 1997-05-21 1999-11-30 Clontech Laboratories, Inc. Methods of assaying differential expression
US6489455B2 (en) 1997-05-21 2002-12-03 Clontech Laboratories, Inc. Methods of assaying differential expression
US6268136B1 (en) 1997-06-16 2001-07-31 Exact Science Corporation Methods for stool sample preparation
US6406857B1 (en) 1997-06-16 2002-06-18 Exact Sciences Corporation Methods for stool sample preparation
EP0892069B1 (en) * 1997-06-26 2010-07-28 BIO-Rad Medical Diagnostics GmbH A method for determinig the histocompatibility locus antigen class II
US6103468A (en) * 1997-10-07 2000-08-15 Labatt Brewing Company Limited Rapid two-stage polymerase chain reaction method for detection of lactic acid bacteria in beer
US20020064792A1 (en) * 1997-11-13 2002-05-30 Lincoln Stephen E. Database for storage and analysis of full-length sequences
AU1603199A (en) * 1997-12-03 1999-06-16 Curagen Corporation Methods and devices for measuring differential gene expression
EP0953650A1 (en) * 1998-04-20 1999-11-03 Innogenetics N.V. Method for typing of HLA alleles
US6355419B1 (en) 1998-04-27 2002-03-12 Hyseq, Inc. Preparation of pools of nucleic acids based on representation in a sample
US6825328B1 (en) * 1998-07-20 2004-11-30 Stephen W. Scherer Lafora's disease gene
US6207379B1 (en) 1998-09-11 2001-03-27 One Lambda Method for amplification of DNA
US6703228B1 (en) 1998-09-25 2004-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to genotyping and DNA analysis
EP1001037A3 (en) * 1998-09-28 2003-10-01 Whitehead Institute For Biomedical Research Pre-selection and isolation of single nucleotide polymorphisms
AU6074999A (en) 1998-10-14 2000-05-01 Agriculture And Agrifood Canada Hybrid alfalfa ((medicago sativa))
US6503718B2 (en) 1999-01-10 2003-01-07 Exact Sciences Corporation Methods for detecting mutations using primer extension for detecting disease
US6280947B1 (en) 1999-08-11 2001-08-28 Exact Sciences Corporation Methods for detecting nucleotide insertion or deletion using primer extension
GB9902971D0 (en) * 1999-02-11 1999-03-31 Zeneca Ltd Assay
US6551777B1 (en) 1999-02-25 2003-04-22 Exact Sciences Corporation Methods for preserving DNA integrity
CA2366778C (en) 1999-04-09 2008-07-22 Exact Sciences Corporation Methods for detecting nucleic acids indicative of cancer
EP1175501A4 (en) * 1999-05-12 2002-11-27 Invitrogen Corp COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING THE SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF A NUCLEIC ACID SYNTHESIS
WO2000079006A1 (en) * 1999-06-17 2000-12-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Oligonucleotide arrays for high resolution hla typing
WO2000079009A2 (en) 1999-06-22 2000-12-28 Invitrogen Corporation Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
IL147182A0 (en) * 1999-06-30 2002-08-14 Interleukin Genetics Inc Diagnostics and therapeutics for diseases associated with an il-1 inflammatory haplorype
US6830902B1 (en) 1999-07-02 2004-12-14 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
WO2001009183A2 (en) * 1999-07-30 2001-02-08 Epidauros Polymorphisms in the human mdr-1 gene and applications thereof
US6586177B1 (en) 1999-09-08 2003-07-01 Exact Sciences Corporation Methods for disease detection
US6849403B1 (en) 1999-09-08 2005-02-01 Exact Sciences Corporation Apparatus and method for drug screening
US6692918B2 (en) 1999-09-13 2004-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
ES2447419T3 (es) 1999-09-13 2014-03-12 Nugen Technologies, Inc. Composiciones para la amplificación isotérmica lineal de secuencias de polinucleótidos
JP2003521896A (ja) * 1999-11-15 2003-07-22 ユニバーシティ・オブ・サザン・カリフォルニア 治療応答を予測するためのゲノム多形現象
US6919174B1 (en) 1999-12-07 2005-07-19 Exact Sciences Corporation Methods for disease detection
DE60043896D1 (de) * 1999-12-07 2010-04-08 Exact Sciences Corp Verfahren zum nachweis von lungenneoplasmen in fäkalen proben
EP2339005A3 (en) 1999-12-16 2011-10-12 Monsanto Technology LLC Dna constructs for expression of heterologous polypeptides in plants
US6887664B2 (en) 2000-06-06 2005-05-03 Applera Corporation Asynchronous primed PCR
AU2001271595A1 (en) 2000-06-26 2002-01-08 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
EP1366191A2 (en) 2000-12-11 2003-12-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Nested oligonucleotides containing hairpin for nucleic acid amplification
DE60142709D1 (de) 2000-12-13 2010-09-09 Nugen Technologies Inc Methoden und zusammensetzungen zur generierung einer vielzahl von kopien von nukleinsäuresequenzen und methoden zur detektion derselben
US6794141B2 (en) 2000-12-22 2004-09-21 Arcturus Bioscience, Inc. Nucleic acid amplification
US6635451B2 (en) 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
ZA200210369B (en) 2001-03-09 2004-07-08 Nugen Technologies Inc Methods and compositions for amplification or RNA sequences.
CA2439750A1 (en) 2001-03-09 2002-09-19 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to combination oligomers and libraries for their preparation
US6428964B1 (en) 2001-03-15 2002-08-06 Exact Sciences Corporation Method for alteration detection
ATE455857T1 (de) 2001-05-09 2010-02-15 Monsanto Technology Llc Metabolitentransporter
EP1950305A1 (en) 2001-05-09 2008-07-30 Monsanto Technology, LLC Tyr a genes and uses thereof
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7026121B1 (en) 2001-06-08 2006-04-11 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US6905827B2 (en) 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
JP4439262B2 (ja) 2001-09-19 2010-03-24 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 操作されたテンプレートおよび単一プライマー増幅におけるそれらの使用
US7414111B2 (en) 2001-09-19 2008-08-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Engineered templates and their use in single primer amplification
EP2980222A1 (en) 2001-09-24 2016-02-03 One Lambda, Inc. Diagnostic probe detection system
US20030165859A1 (en) 2001-10-23 2003-09-04 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
US20080311581A1 (en) * 2001-11-19 2008-12-18 David Wyllie Functional polymorphisms of the interleukin-1 locus affecting transcription and susceptibility to inflammatory and infectious diseases
US6696254B2 (en) * 2001-11-21 2004-02-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Detection and identification of enteric bacteria
US7211656B2 (en) 2002-01-30 2007-05-01 Abbott Laboratories Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof
US20030148288A1 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Yi-Wei Tang Colorimetric genetic test for clinically significant TNF polymorphism and methods of use thereof
US7776524B2 (en) 2002-02-15 2010-08-17 Genzyme Corporation Methods for analysis of molecular events
EP1504106B1 (en) 2002-05-15 2010-07-07 Monsanto Technology LLC Method of increasing plant seed weight
AU2003240795A1 (en) 2002-05-24 2003-12-12 Invitrogen Corporation Nested pcr employing degradable primers
US20050123924A1 (en) 2002-08-05 2005-06-09 Ayoub Rashtchian Compositions for in vitro amplification of nucleic acids
JP2006516884A (ja) 2002-09-23 2006-07-13 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー リアノジン受容体の単離および使用
CA2500673A1 (en) * 2002-10-01 2004-04-15 Xiaofeng Xiong Hbv mutations associated with reduced susceptibility to adefovir
US7094879B2 (en) 2002-10-02 2006-08-22 Abbott Laboratories Genetically engineered P30 antigen, improved antigen cocktail, and uses thereof
JP3867926B2 (ja) * 2002-10-29 2007-01-17 独立行政法人理化学研究所 核酸の増幅法
CA2506654C (en) 2002-11-07 2014-02-25 Yoichi Matsubara Method of detecting gene mutation
EP2474630B1 (en) * 2002-12-20 2016-04-27 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction, methods of detection and uses thereof
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US20040175704A1 (en) * 2003-03-06 2004-09-09 Stratagene Compositions and methods for polynucleotide sequence detection
WO2004092418A2 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
WO2004094986A2 (en) 2003-04-16 2004-11-04 Handylab, Inc. System and method for electrochemical detection of biological compounds
US7892745B2 (en) 2003-04-24 2011-02-22 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7300755B1 (en) * 2003-05-12 2007-11-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for haplotyping genomic DNA
AU2004203649B2 (en) 2003-08-12 2006-01-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Thermostable Taq polymerase fragment
DK1673475T3 (da) 2003-10-10 2010-07-19 Deutsches Krebsforsch Sammensætninger til diagnose og terapi af sygdomme, som er forbundet med aberrant ekspression af futriner (R-Spondiner) og/eller Wnt
EP1699926B1 (en) 2003-12-10 2014-06-18 Monsanto Technology, LLC Stress tolerant plants and methods thereof
WO2005063977A1 (ja) * 2003-12-25 2005-07-14 Riken 核酸の増幅法およびこれを利用した変異核酸の検出法
WO2005079474A2 (en) 2004-02-17 2005-09-01 The Regents Of The University Of California Detection of nucleic acid sequence differences by comparative genomic hybridization
CA2572450A1 (en) 2004-05-28 2005-12-15 Ambion, Inc. Methods and compositions involving microrna
WO2006012361A2 (en) * 2004-07-01 2006-02-02 University Of Southern California Genetic markers for predicting disease and treatment outcome
US20130055466A1 (en) 2011-08-31 2013-02-28 Monsanto Technology, Llc Methods and Compositions for Watermelon Firmness
WO2006026654A2 (en) 2004-08-27 2006-03-09 Exact Sciences Corporation Method for detecting a recombinant event
US20060135758A1 (en) * 2004-08-31 2006-06-22 Kunsheng Wu Soybean polymorphisms and methods of genotyping
US7456270B2 (en) 2004-09-01 2008-11-25 Abbott Laboratories Δ6-desaturase genes and uses thereof
US20060141495A1 (en) * 2004-09-01 2006-06-29 Kunsheng Wu Polymorphic markers and methods of genotyping corn
WO2006029184A2 (en) 2004-09-08 2006-03-16 Expression Diagnostics, Inc. Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders
ATE469245T1 (de) 2004-09-14 2010-06-15 Univ Colorado Auf genetischem targeting basierendes verfahren zur behandlung mit bucindolol
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
US9109256B2 (en) 2004-10-27 2015-08-18 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Method for monitoring disease progression or recurrence
EP2302055B1 (en) 2004-11-12 2014-08-27 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
US20090017029A1 (en) * 2004-11-18 2009-01-15 Yale University Methods and Compositions for Treating Ocular Disorders
US7790363B2 (en) 2005-02-07 2010-09-07 Abbott Laboratories Inc. Diagnostic test for vitamin B12
WO2007044071A2 (en) 2005-04-21 2007-04-19 Exact Sciences Corporation Analysis of heterogeneous nucleic acid samples
US8624027B2 (en) 2005-05-12 2014-01-07 Abbvie Inc. Combination therapy for treating cancer and diagnostic assays for use therein
DE06801706T1 (de) 2005-08-16 2009-07-30 Merlogen, LLC, College Station Verfahren zur identifizierung des merle-gens
US7838646B2 (en) 2005-08-18 2010-11-23 Quest Diagnostics Investments Incorporated Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations
WO2007030759A2 (en) 2005-09-07 2007-03-15 Nugen Technologies, Inc. Improved nucleic acid amplification procedure
EP3061834B1 (en) 2005-10-21 2020-01-08 The Regents of the University of California Shp-2 gene mutations in melanoma
US20070166738A1 (en) 2005-11-29 2007-07-19 Perlegen Sciences, Inc. Markers for breast cancer
JP5475994B2 (ja) 2005-11-30 2014-04-16 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗Ａβグロブロマー抗体、その抗原結合部分、対応するハイブリドーマ、核酸、ベクター、宿主細胞、前記抗体を作製する方法、前記抗体を含む組成物、前記抗体の使用及び前記抗体を使用する方法。
RS53270B2 (sr) 2005-11-30 2018-05-31 Abbvie Deutschland Monoklonalna antitela protiv amiloidnog beta proteina i njihova upotreba
WO2007081386A2 (en) 2006-01-11 2007-07-19 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices and methods of use
US20110143344A1 (en) * 2006-03-01 2011-06-16 The Washington University Genetic polymorphisms and substance dependence
EP1996733A2 (en) * 2006-03-01 2008-12-03 Perlegen Sciences, Inc. Markers for addiction
US7285388B1 (en) 2006-04-07 2007-10-23 Merlogen, Llc Methods for identification of alport syndrome
US8933209B2 (en) 2006-04-26 2015-01-13 Abbvie Inc. Dep2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders
US9074242B2 (en) 2010-02-12 2015-07-07 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
EP2047910B1 (en) 2006-05-11 2012-01-11 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic device and method
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
CN107012246B (zh) 2006-05-25 2021-10-26 孟山都技术有限公司 大豆抗病性数量性状基因座及其组成的鉴定方法
US7993832B2 (en) 2006-08-14 2011-08-09 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders
US20080083042A1 (en) * 2006-08-14 2008-04-03 David Butruille Maize polymorphisms and methods of genotyping
EP2145001A2 (en) 2006-09-19 2010-01-20 Asuragen, Inc. Mir-15, mir-26, mir -31,mir -145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216 mir-331, mmu-mir-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2008036765A2 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in pancreatic diseases and uses thereof
US8148067B2 (en) 2006-11-09 2012-04-03 Xdx, Inc. Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
JP5159098B2 (ja) 2006-12-01 2013-03-06 キヤノン株式会社 複対立遺伝子のハプロタイプ決定方法
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
US7794937B2 (en) 2006-12-22 2010-09-14 Quest Diagnostics Investments Incorporated Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations
WO2008097559A2 (en) 2007-02-06 2008-08-14 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
EP2124952A2 (en) 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
BRPI0810083B8 (pt) 2007-03-28 2020-10-06 Monsanto Technology Llc métodos para estabelecer onde uma planta de soja ou semente de soja deve ser cultivada, de melhoramento da planta de soja, para selecionar uma semente de soja, de distribuição de uma planta de soja, para isolar sementes de soja de maturidade precoce indeterminada, e para determinar se uma planta de soja tem um grupo de maturidade
WO2008130623A1 (en) 2007-04-19 2008-10-30 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
US9271455B2 (en) * 2007-05-31 2016-03-01 Monsanto Technology Llc Soybean polymorphisms and methods of genotyping
EP2952588A1 (en) 2007-08-06 2015-12-09 Orion Genomics, LLC Single nucleotide polymorphism in igf2 for determining the allele-specific expression of the igf2 gene
EP2735619A3 (en) 2007-08-29 2014-08-13 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for breeding for preferred traits associated with Goss' Wilt resistance in plants
CA2639416C (en) 2007-09-11 2019-12-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Diagnostic test for susceptibility to b-raf kinase inhibitors
US20100086914A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Roche Molecular Systems, Inc. High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing
CA2704809A1 (en) 2007-11-01 2009-05-07 University Of Iowa Research Foundation Rca locus analysis to assess susceptibility to amd and mpgnii
US8367899B2 (en) 2007-12-31 2013-02-05 E I Du Pont De Neumours And Company Gray leaf spot tolerant maize and methods of production
US20090203531A1 (en) 2008-02-12 2009-08-13 Nurith Kurn Method for Archiving and Clonal Expansion
US8268981B2 (en) 2008-03-06 2012-09-18 Abbott Laboratories Plasmodium malariae and plasmodium ovale genes and uses thereof
GB2470672B (en) 2008-03-21 2012-09-12 Nugen Technologies Inc Methods of RNA amplification in the presence of DNA
BRPI0911551B8 (pt) 2008-04-24 2023-10-03 Monsanto Technology Llc Método para produzir planta de soja resistente a ferrugem asiática da soja (asr)
EP2990487A1 (en) 2008-05-08 2016-03-02 Asuragen, INC. Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis
EP2315629B1 (en) 2008-07-18 2021-12-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet libraries
US20100261189A1 (en) * 2008-10-03 2010-10-14 Roche Molecular Systems, Inc. System and method for detection of HLA Variants
RU2517615C2 (ru) 2008-10-06 2014-05-27 Эбботт Лэборетриз Гены дельта-8-десатуразы, ферменты, кодируемые ими, и их применение
US8288124B2 (en) 2008-11-20 2012-10-16 Abbott Laboratories Cloning, expression and purification of recombinant porcine intrinsic factor for use in diagnostic assay
EP2371951A4 (en) 2008-11-27 2012-07-18 Riken NOVEL MUTS PROTEIN AND METHOD OF USING SAME FOR DETERMINING MUTATIONS
WO2010068738A1 (en) 2008-12-10 2010-06-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Mek mutations conferring resistance to mek inhibitors
EP2391734B1 (en) 2009-01-31 2013-06-05 Abbott Laboratories Marker to predict and monitor response to aurora kinase b inhibitor therapy
WO2010093742A1 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Abbott Laboratories Methods and compositions for identifying, classifying and monitoring subject having bcl-2 family inhibitor-resistant tumors and cancers
US20100286926A1 (en) 2009-02-11 2010-11-11 Orion Genomics Llc Combinations of polymorphisms for determining allele-specific expression of igf2
US8063193B2 (en) 2009-03-27 2011-11-22 Abbott Laboratories Nucleotide and amino acid sequences encoding an exported protein 1 derived from Plasmodium vivax and uses thereof
PT2430452E (pt) 2009-05-14 2014-09-30 Univ Arizona State Diagnóstico e tratamentos de carcinoma com base no genótipo odc1
US20100299773A1 (en) * 2009-05-20 2010-11-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for selecting an improved plant
EP2448960A1 (en) 2009-06-30 2012-05-09 Abbott Laboratories Markers of xmrv infection and uses thereof
US8188335B2 (en) 2009-07-17 2012-05-29 Abbott Laboratories Δ9-elongase for production of polyunsaturated fatty acid-enriched oils
WO2011032088A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Arca Biopharma, Inc. Polymorphisms in the pde3a gene
US9175350B2 (en) * 2009-12-22 2015-11-03 Quest Diagnostics Investments Incorporated EML4-ALK translocations in lung cancer
WO2011079273A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Arca Biopharma, Inc. Methods and compositions for cardiovascular diseases and conditions
WO2011094199A1 (en) 2010-01-26 2011-08-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Polynucleotide and polypeptide sequences associated with herbicide tolerance
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
JP5933459B2 (ja) 2010-02-25 2016-06-08 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド Ｂｒａｆ阻害剤に対する耐性を付与するｂｒａｆ突然変異
EP3214174B1 (en) 2010-03-04 2019-10-16 InteRNA Technologies B.V. A mirna molecule defined by its source and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with emt
EA030276B1 (ru) 2010-03-09 2018-07-31 Дана-Фарбер Кэнсер Инститьют, Инк. Способы идентификации страдающих раком пациентов и лечения рака у пациентов, у которых имеется или развивается резистентность к первой терапии рака
CA2796339C (en) 2010-04-15 2020-03-31 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
WO2011128096A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Roche Diagnostics Gmbh Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment
JP6083646B2 (ja) 2010-05-14 2017-02-22 アリゾナ ボード オブ リージェンツ オン ビハーフ オブ ザ ユニバーシティー オブ アリゾナＡｒｉｚｏｎａ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｎ ｂｅｈａｌｆ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ 食事性ポリアミン含量に基づく癌予防及び治療法
CN103097526B (zh) 2010-06-09 2015-09-16 达纳－法伯癌症研究所公司 赋予针对raf和mek抑制剂的抗性的mek1突变
NZ704322A (en) 2010-07-06 2016-07-29 Interna Technologies Bv Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway
JP6147665B2 (ja) 2010-08-14 2017-06-14 アッヴィ・インコーポレイテッド アミロイドベータ結合タンパク質
WO2012024518A1 (en) 2010-08-18 2012-02-23 Abbott Laboratories Molecular detection of xmrv infection
WO2012024513A2 (en) 2010-08-18 2012-02-23 Abbott Laboratories Molecular detection of xmrv infection
WO2012040619A2 (en) 2010-09-24 2012-03-29 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods and compositions for prognosing and/or detecting age-related macular degeneration
US9562897B2 (en) 2010-09-30 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
WO2012065100A2 (en) * 2010-11-11 2012-05-18 The Children's Hospital Of Philadelphia Cxcr4 as a susceptibility locus in juvenile idiopathic arthritis (jia) and methods of use thereof for the treatment and diagnosis of the same
CA2817882C (en) 2010-11-17 2022-08-23 Asuragen, Inc. Mirnas as biomarkers for distinguishing benign from malignant thyroid neoplasms
AU2011349148C1 (en) 2010-12-22 2017-08-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. QTLs associated with and methods for identifying whole plant field resistance to Sclerotinia
EP2474617A1 (en) 2011-01-11 2012-07-11 InteRNA Technologies BV Mir for treating neo-angiogenesis
EP3859011A1 (en) 2011-02-11 2021-08-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for forming mixed droplets
WO2012112804A1 (en) 2011-02-18 2012-08-23 Raindance Technoligies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
WO2012158238A2 (en) 2011-02-28 2012-11-22 University Of Iowa Research Foundation Anti-müllerian hormone changes in pregnancy and prediction ofadverse pregnancy outcomes and gender
US10172305B2 (en) 2011-04-29 2019-01-08 Monsanto Technology Llc Diagnostic molecular markers for seed lot purity traits in soybeans
US9708672B2 (en) 2011-05-02 2017-07-18 Nutech Ventures Plants with useful traits and related methods
US9556470B2 (en) 2011-06-02 2017-01-31 Raindance Technologies, Inc. Enzyme quantification
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
JP2014526900A (ja) 2011-08-31 2014-10-09 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 血管新生阻害剤に対する応答性
WO2013030168A1 (en) 2011-08-31 2013-03-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for predicting risk of hypertension associated with anti-angiogenesis therapy
US9644241B2 (en) 2011-09-13 2017-05-09 Interpace Diagnostics, Llc Methods and compositions involving miR-135B for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
RU2014114617A (ru) 2011-09-19 2015-10-27 Дженентек, Инк. Комбинированные виды лечения, содержащие антагонисты с-мет и антагонисты b-raf
WO2013063519A1 (en) 2011-10-26 2013-05-02 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna expression levels for distinguishing pancreatic cysts
WO2013063544A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Asuragen, Inc. Mirnas as diagnostic biomarkers to distinguish benign from malignant thyroid tumors
CA2854568A1 (en) 2011-11-23 2013-05-30 Life Sciences Research Partners Vzw Responsiveness to angiogenesis inhibitors
MY154507A (en) 2012-03-19 2015-06-22 Malaysian Palm Oil Board Gene Controlling Shell Phenotype in Palm
EP2832863A4 (en) * 2012-03-29 2016-02-24 Mitsubishi Rayon Co MICROARRAY FOR THE DETECTION OF MUTATIONS IN BETA-GLOBIN GENES AND PROOF PROCESS THEREFOR
US10294529B2 (en) 2012-04-10 2019-05-21 Life Sciences Research Partners Vzw Microsatellite instability markers in detection of cancer
US10633707B2 (en) 2012-04-10 2020-04-28 Vib Vzw Markers for detecting microsatellite instability in cancer and determining synthetic lethality with inhibition of the DNA base excision repair pathway
US10077474B2 (en) 2012-05-29 2018-09-18 Abbott Molecular, Inc. Method of designing primers, method of detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs), method of distinguishing SNPs, and related primers, detectable oligonucleotides, and kits
WO2014007623A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Interna Technologies B.V. Diagnostic portfolio and its uses
WO2014055117A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Asuragen, Inc. Diagnostic mirnas for differential diagnosis of incidental pancreatic cystic lesions
US10314253B2 (en) 2012-12-04 2019-06-11 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for watermelon sex expression
CN105229175A (zh) 2013-03-15 2016-01-06 雅培分子公司 用于扩增和测定rna融合基因变体的方法、区分它们的方法以及有关的引物、探针和试剂盒
US9868992B2 (en) 2013-03-15 2018-01-16 Baylor Research Institute Tissue and blood-based miRNA biomarkers for the diagnosis, prognosis and metastasis-predictive potential in colorectal cancer
US10294489B2 (en) 2013-03-15 2019-05-21 Board Of Trustees Of Southern Illinois University Soybean resistant to cyst nematodes
EP2970909A4 (en) 2013-03-15 2017-02-15 The University of Chicago Methods and compositions related to t-cell activity
WO2014151551A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Baylor Research Institute Ulcerative colitis (uc)-associated colorectal neoplasia markers
US10544461B2 (en) 2013-04-16 2020-01-28 The Johns Hopkins University Diagnostic and prognostic test for sturge-weber syndrome, klippel-trenaunay-weber syndrome, and port-wine stains (PWSS)
US10059999B2 (en) 2013-06-10 2018-08-28 Monsanto Technology Llc Molecular markers associated with soybean tolerance to low iron growth conditions
US10767188B2 (en) 2013-09-25 2020-09-08 Nutech Ventures Methods and compositions for obtaining useful plant traits
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
NZ784204A (en) 2013-11-27 2022-10-28 Seminis Vegetable Seeds Inc Disease resistance loci in onion
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
BR112016019007B1 (pt) 2014-02-21 2022-05-17 Syngenta Participations Ag Métodos para produzir uma planta de milho, que expressa vip3a ou germoplasma de milho com fertilidade masculina aumentada, programa de melhoramento, método para melhorar a produção de sementes de uma planta de milho que expressa vip3a, e programa de produção de sementes
NZ630710A (en) 2014-02-27 2016-03-31 Seminis Vegetable Seeds Inc Compositions and methods for peronospora resistance in spinach
SG11201607772WA (en) 2014-03-31 2016-10-28 Debiopharm Int Sa Fgfr fusions
WO2015200377A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 Abbott Molecular Inc. Detection of single nucleotide polymorphisms in human kras
US10316369B2 (en) 2014-06-27 2019-06-11 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and assays for male sterile watermelon
CN106536755A (zh) * 2014-06-30 2017-03-22 陶氏环球技术有限责任公司 用于检测水污染的方法和试剂
US10370673B2 (en) 2014-09-26 2019-08-06 Purecircle Sdn Bhd Single nucleotide polymorphism (SNP) markers for stevia
EP3005862A1 (en) 2014-10-10 2016-04-13 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Melon plants with improved disease tolerance
US11708608B2 (en) 2014-11-10 2023-07-25 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for IL-33-mediated disorders
CN114574612A (zh) 2015-04-28 2022-06-03 孟山都技术有限公司 用于产生短枝玉米植物的方法和组合物
CA2981819A1 (en) 2015-04-30 2016-11-03 Monsanto Technology Llc Methods for producing canola plants with clubroot resistance and compositions thereof
CR20180164A (es) 2015-08-18 2018-09-04 Monsanto Technology Llc Métodos para producir plantas de algodón con tolerancia mejorada a la sequía y composiciones de estas
US10448595B2 (en) 2015-09-03 2019-10-22 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Downy mildew resistant lettuce plants
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
WO2017044744A2 (en) 2015-09-10 2017-03-16 Monsanto Technology Llc Methods for producing corn plants with downy mildew resistance and compositions thereof
EP3389362A4 (en) 2015-12-18 2019-08-07 Monsanto Technology LLC METHODS OF PRODUCING CORN PLANTS HAVING CORN LEAF BURN RESISTANCE AND ASSOCIATED COMPOSITIONS
EP3199642A1 (en) 2016-02-01 2017-08-02 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Plant breeding using high throughput sequencing
WO2017139544A1 (en) 2016-02-11 2017-08-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Qtls associated with and methods for identifying lodging resistance in soybean
WO2017147585A1 (en) 2016-02-26 2017-08-31 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Synthetic translation-sensing riboswitches and uses thereof
KR20230020549A (ko) 2016-03-24 2023-02-10 코테라 바이오사이언스 인코포레이티드 Tg02를 사용한 암의 치료
AU2017250076B2 (en) 2016-04-12 2021-07-22 The Regents Of The University Of Michigan Bet protein degraders
US10837067B2 (en) 2016-08-11 2020-11-17 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for producing corn plants with resistance to late wilt
AU2017326175B2 (en) 2016-09-13 2022-01-27 The Regents Of The University Of Michigan Fused 1,4-diazepines as BET protein degraders
JP6961684B2 (ja) 2016-09-13 2021-11-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニヴァシティ オブ ミシガン Ｂｅｔタンパク質分解物質としての縮合１，４−オキサゼピン
AU2017232187B2 (en) 2016-09-30 2023-11-09 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Xanthomonas resistant brassica oleracea plants
US20180265887A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Jacobs Farm Del Cabo Basil Plants With High Tolerance to Downy Mildew
US11445692B2 (en) 2017-05-15 2022-09-20 Equi-Nom Ltd. Quantitative trait loci (QTL) associated with shatter resistant capsules in sesame and uses thereof
EA202090485A1 (ru) 2017-08-14 2020-05-27 Эпизайм, Инк. Способы лечения рака путем ингибирования setd2
SG11202001441WA (en) 2017-08-18 2020-03-30 Tragara Pharmaceuticals Inc Polymorphic form of tg02
US11267822B2 (en) 2017-09-13 2022-03-08 The Regents Of The University Of Michigan BET bromodomain protein degraders with cleavable linkers
CA3079524A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Interna Technologies B.V. Mirna molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation
WO2019157358A1 (en) 2018-02-09 2019-08-15 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for mast cell-mediated inflammatory diseases
US11268102B2 (en) 2018-05-16 2022-03-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Compositions and methods for identifying and selecting brachytic locus in solanaceae
AU2019356772A1 (en) 2018-10-08 2021-04-01 The Regents Of The University Of Michigan Small molecule MDM2 protein degraders
WO2020150144A1 (en) 2019-01-15 2020-07-23 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green bean plants with improved disease resistance
WO2020210521A2 (en) 2019-04-12 2020-10-15 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for increasing muscle mass and oxidative metabolism
AU2020291936A1 (en) 2019-06-12 2022-02-03 Vanderbilt University Dibenzylamines as amino acid transport inhibitors
WO2020252353A1 (en) 2019-06-12 2020-12-17 Vanderbilt University Amino acid transport inhibitors and the uses thereof
SG10202008262UA (en) 2019-09-26 2021-04-29 Seminis Vegetable Seeds Inc Lettuce plants having resistance to nasonovia ribisnigri biotype nr:1
US20230110203A1 (en) 2020-03-13 2023-04-13 Medimmune Limited Therapeutic methods for the treatment of subjects with risk alelles in il33
US11702689B2 (en) 2020-04-24 2023-07-18 Microsoft Technology Licensing, Llc Homopolymer primers for amplification of polynucleotides created by enzymatic synthesis
US11739359B2 (en) 2020-05-01 2023-08-29 Microsoft Technology Licensing, Llc Universal template strands for enzymatic polynucleotide synthesis
AU2021204717A1 (en) 2020-07-15 2022-02-03 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green Bean Plants with Improved Disease Resistance
US11730133B2 (en) 2020-10-21 2023-08-22 Equi-Nom Ltd High yield sesame
JP2023551542A (ja) 2020-11-30 2023-12-08 エニグマ バイオインテリジェンス，インコーポレイテッド アルツハイマー病の非侵襲的評価
US11395470B1 (en) 2021-09-14 2022-07-26 Equi-Nom Ltd. Sesame with high oil content and/or high yield
US20230101083A1 (en) 2021-09-30 2023-03-30 Microsoft Technology Licensing, Llc Anti-counterfeit tags using base ratios of polynucleotides
US20230101409A1 (en) 2021-09-30 2023-03-30 Microsoft Technology Licensing, Llc Anti-counterfeit tags using high-complexity polynucleotides
US20230193310A1 (en) 2021-12-10 2023-06-22 Seminis Vegetabe Seeds, Inc. Lettuce plants having resistance to downy mildew
US20230404003A1 (en) 2022-06-21 2023-12-21 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Novel qtls conferring resistance to cucumber mosaic virus
WO2024028794A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Temple Therapeutics BV Methods for treating endometrial and ovarian hyperproliferative disorders

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3909363A (en) * 1972-09-11 1975-09-30 Investors In Ventures Inc Method for testing body fluids such as semen
ATE53862T1 (de) * 1982-01-22 1990-06-15 Cetus Corp Verfahren zur charakterisierung von hla und die darin benutzten cdns-testmittel.
US4582788A (en) * 1982-01-22 1986-04-15 Cetus Corporation HLA typing method and cDNA probes used therein
US4521509A (en) * 1982-11-24 1985-06-04 Research Corporation Method for degrading DNA
US4588682A (en) * 1982-12-13 1986-05-13 Integrated Genetics, Inc. Binding nucleic acid to a support
US4605735A (en) * 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
GB8311018D0 (en) * 1983-04-22 1983-05-25 Amersham Int Plc Detecting mutations in dna
GB8311905D0 (en) * 1983-04-29 1983-06-02 Cox R A Isolation and detection of nucleotide sequence
CA1222680A (en) * 1983-07-05 1987-06-09 Nanibhushan Dattagupta Testing dna samples for particular nucleotide sequences
US4683194A (en) * 1984-05-29 1987-07-28 Cetus Corporation Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences
JPS6127467A (ja) * 1984-07-17 1986-02-06 日産自動車株式会社 車両用冷房装置
CA1259966A (en) * 1985-02-27 1989-09-26 Taizo Yamamoto Capsule filling apparatus
CA1278755C (en) * 1985-03-15 1991-01-08 William J. Knowles Labelling of oligonucleotides
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DK171161B1 (da) * 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
CA1314811C (en) * 1985-06-14 1993-03-23 Gerald T. Nepom Methods for identifying alleles associated with increased risk of diabetes
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
EP0228075B1 (en) * 1986-01-03 1991-04-03 Molecular Diagnostics, Inc. Eucaryotic genomic dna dot-blot hybridization method
US5059519A (en) * 1986-07-01 1991-10-22 University Of Massachusetts Medical School Oligonucleotide probes for the determination of the proclivity for development of autoimmune diseases
US4965189A (en) * 1986-07-01 1990-10-23 University Of Massachusetts Medical School Probes for the determination of the proclivity for development of autoimmune diseases
US4994368A (en) * 1987-07-23 1991-02-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Amplification method for polynucleotide assays
US5039606A (en) * 1987-10-29 1991-08-13 Virginia Mason Research Center Diagnostic probe for diabetes type I predisposition
US4971902A (en) * 1987-10-30 1990-11-20 Virginia Mason Research Center Diagnostic probe for rheumatoid arthritis predisposition

Also Published As

Publication number Publication date
AU6996287A (en) 1987-09-17
CA1284931C (en) 1991-06-18
EP0459533A3 (en) 1992-09-02
JPH07313197A (ja) 1995-12-05
DE3751423D1 (de) 1995-08-24
EP0237362B1 (en) 1992-03-11
JP3124528B2 (ja) 2001-01-15
AU594130B2 (en) 1990-03-01
EP0237362A1 (en) 1987-09-16
EP0237362B2 (en) 1998-10-21
JPS62214355A (ja) 1987-09-21
US5468613A (en) 1995-11-21
DE3751423T2 (de) 1995-12-14
JPH10155500A (ja) 1998-06-16
HK145894A (en) 1994-12-30
JP3070837B2 (ja) 2000-07-31
JP2726659B2 (ja) 1998-03-11
JP2000189198A (ja) 2000-07-11
EP0459533A2 (en) 1991-12-04
JP2703194B2 (ja) 1998-01-26
ATE125307T1 (de) 1995-08-15
EP0459532B1 (en) 1995-07-19
EP0459532A2 (en) 1991-12-04
EP0459532A3 (en) 1992-08-12
JP2000189199A (ja) 2000-07-11
DE3777213D1 (ja) 1992-04-16
ATE73502T1 (de) 1992-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3124529B2 (ja) 特定のヌクレオチド配列の検出方法及びキット
US5604099A (en) Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
JP2546576B2 (ja) 核酸配列のクローニング方法
US6040166A (en) Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences, including a probe
US6197563B1 (en) Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences
JP2622327B2 (ja) 核酸配列の増幅手段
US4965188A (en) Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
JP2502042B2 (ja) 熱安定性ｄｎａポリメラ―ゼの製造方法
CA1242627A (en) Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences
US4683195A (en) Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
JP2721671B2 (ja) Ｈｔｌｖウイルス及びｈｔｌｖ▲ｉｉ▼ウイルスの検出方法
JPH0467960B2 (ja)
AU4599797A (en) Compositions and methods for enhancing hybridization specificity
IE83456B1 (en) Kit for use in amplifying and detecting nucleic acid sequences
JP2502042C (ja)
IE19930227A1 (en) Kit for use in amplifying and detecting nucleic acid sequences

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term