JP5933459B2 - Braf阻害剤に対する耐性を付与するbraf突然変異 - Google Patents
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- G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
Description
(関連出願
本願は、2010年2月25日付けで出願された米国特許出願第61/308,275号の優先権を主張する。この出願の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、国立健康研究所(National Institutes of Health)によって付与された認可番号K08CA115927の政府支援のもとでなされた。本発明において政府が一定の権利を有する。)
Eポリペプチド(配列番号4)と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ここでこのアミノ酸置換のうち少なくとも1種は、突然変異型BRAFポリペプチドに、1種またはそれより多くのBRAF阻害剤に対する耐性を付与する。この形態の所定の実施態様において、上記アミノ酸置換のうち少なくとも1種は、以下に示す1種またはそれより多くのアミノ酸位置:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、K483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748で起こる。代表的な実施態様において、上記アミノ酸置換のうち少なくとも1種は、以下に示すもののうち1種またはそれより多く:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194*、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、K483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657*、S683R、P686Q、P686T、C696*、L697I、P722T、F738L、および、C748Fである。
酸置換を有する。代表的な実施態様において、突然変異型BRAFポリペプチドは、1個のアミノ酸置換を有する。その他の代表的な実施態様において、突然変異型BRAFポリペプチドは、以下に示す1種またはそれより多くの配列番号2または配列番号4のアミノ酸位置:V528、T521、および/または、P686に置換を含むBRAFである。前述の形態のいくつかの実施態様において、BRAF阻害剤は、RAF−265である。
も1つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ここでこのアミノ酸置換のうち少なくとも1種は、突然変異型BRAFポリペプチドに、1種またはそれより多くのBRAF阻害剤に対する耐性を付与する。好ましい実施態様において、単離した突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチドの活性を有する。前述の形態の一実施態様において、上記アミノ酸置換のうち少なくとも1種は、以下から選択される1種またはそれより多くのアミノ酸位置:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、K483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748で起こる。代表的な実施態様において、上記アミノ酸置換のうち少なくとも1種は、A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194*、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、K483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657*、S683R、P686Q、P686T、C696*、L697I、P722T、F738L、および、C748Fから選択される。いくつかの実施態様において、突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチドまたはBRAF V600E
ポリペプチドと比較して、1〜5個のアミノ酸置換を有する。代表的な実施態様において、突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチドと比較して、1個のアミノ酸置換を有する。前述の形態のその他の代表的な実施態様において、BRAF阻害剤は、RAF−265である。
析組成物を提供すること、試験化合物の非存在下でBRAF基質のリン酸化を可能にする条件下で、分析組成物を試験化合物と接触させること、および、BRAF基質のリン酸化に対する試験化合物の作用を決定すること、を含み、ここで適切なコントロールと比較してBRAF基質のリン酸化がダウンレギュレーションされていれば、その化合物は第二世代のBRAF阻害剤として同定される。いくつかの実施態様において、分析組成物は、細胞抽出物である。
その他の形態において、本発明は、第二世代のBRAF阻害剤である化合物の同定方法を特徴とし、本方法は、突然変異型BRAFポリペプチドを含む細胞を提供すること、該細胞を試験化合物と接触させること、および、BRAF基質のリン酸化に対する試験化合物の作用を決定することを含み、ここで適切なコントロールと比較してBRAF基質のリン酸化がダウンレギュレーションされていれば、その化合物は第二世代のBRAF阻害剤として同定される。
方法は、コンピューター支援の突然変異型BRAFポリペプチドの三次元結晶または溶液構造を用いたモデリングによって見込みのある薬物を選択すること(ここで前記突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチドまたはBRAF V600Eポ
リペプチドと比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ここで上記アミノ酸置換のうち少なくとも1種は、突然変異型BRAFポリペプチドに、1種またはそれより多くのBRAF阻害剤に対する耐性を付与する);前記見込みのある薬物を突然変異型BRAFポリペプチドと接触させること;および、前記見込みのある薬物と突然変異型BRAFポリペプチドとの相互作用を検出すること;を含み、ここで突然変異型BRAFポリペプチドと相互作用することができる化合物が、第二世代のBRAF阻害剤として同定される。一実施態様において、試験化合物は、化合物ライブラリーに含まれるものである。
ペプチドの活性を阻害する。いくつかの実施態様において、突然変異型BRAFポリペプチドを第二世代のBRAF阻害剤と接触させることは、インビトロで起こる。その他の実施態様において、上記接触は、インビボで起こる。代表的な実施態様において、上記接触は被験者中で起こり、例えば癌を有する被験者中で起こる。いくつかの実施態様において、被験者は、RAF−265での治療後に再発を起こしている。代表的な実施態様において、癌は黒色腫である。
。いくつかの実施態様において、被験者は、RAF−265での治療後に再発を起こしている。代表的な実施態様において、癌は黒色腫である。
配列番号3)と比べて1またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドをコードする核酸分子を同定すること、を含み、ここで該突然変異は、A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、K483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択されるBRAFポリペプチド中の1またはそれより多くのアミノ酸をコードする位置で起こり、ここで癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在する場合、その被験者は、RAF阻害剤での治療に対して耐性を有すると同定される。代表的な実施態様において、このような核酸分子は、野生型BRAFポリペプチド(配列番号2)また
はBRAF V600Eポリペプチド(配列番号4)と比べて、A29V、H72N、S
113I、S124F、P162H、C194*、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、K483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657*、S683R、P686Q、P686T、C696*、L697I、P722T、F738L、および、C748Fからなる群より選択される1またはそれより多くのアミノ酸置換を有するBRAFポリペプチドをコードする。いくつかの実施態様において、癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在する場合、その被験者は、第一世代のBRAF阻害剤での治療中に、再発を起こす比較的高い危険を有すると同定される。その他の実施態様において、癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在する場合、その被験者は、第一世代のBRAF阻害剤での治療に対して反応しないと同定される。代表的な実施態様において、第一世代のBRAF阻害剤は、RAF−265である。いくつかの実施態様において、癌細胞を含むサンプル中に上記核酸分子が存在する場合、その被験者は第二世代のBRAF阻害剤での治療に対して反応するものと層別化される。代表的な実施態様において、癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在するかどうかは、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子の配列を決定することを含む方法によって決定される。その他の実施態様において、癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在するかどうかは、A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、K483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される位置に突然変異を含むBRAFポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、上記核酸分子によってコードされたポリペプチドを検出することによって決定される。代表的な実施態様において、前述の形態で説明される方法は、1またはそれより多くの突然変異型BRAFの突然変異の存在が検出された被験者に第二世代のBRAF阻害剤を投与すること、をさらに含む。
RAFタンパク質ファミリーには3つの種が含まれる:BRAF、ARAF、および、
CRAF(また、RAF−1としても知られている)。これらのRAFタンパク質はそれぞれ、アミノ末端の調節ドメイン、活性化ループ、および、C末端キナーゼドメインを含む。RAFの調節は、調節ドメインおよび触媒ドメインのリン酸化を含む。活性化されたら、RAF分子は、リン酸化によって下流のシグナル伝達分子を活性化することができるセリン/スレオニンキナーゼとして機能する。
突然変異は、MAPKシグナル伝達の活性化を介してメラニン細胞の形質転換に関与している。その他様々なタイプの癌、例えば、これらに限定されないが、結腸、卵巣および甲状腺癌なども同様に、BRAF V600E突然変異を含む。従って、RAFを標的化す
ること、具体的にはBRAF V600Eを標的化することが癌治療に有望なアプローチ
となる。BRAFは、そのMEK1およびMEK2基質に関して示される高度な特異性のために治療にとって魅力的な標的である。現在のところ様々なBRAF阻害剤が臨床開発中である。このような阻害剤の1つは化合物RAF−265であり、これは、3種全てのRAFアイソフォームに加えて、BRAF V600Eに対しても効果的である。RAF
−265は臨床的に有望であることから、RAFの標的化は将来見込みのある癌治療法である。
えばMEK1またはMEK2)との結合、または、RAF基質(例えばMEK1またはMEK2)のリン酸化であってもよい。あるいはRAF活性は、間接的な活性であってもよく、例えばRAFタンパク質とRAF標的分子(例えばMEK1またはMEK2)との相互作用が介在する下流の生物学的な事象であってもよい。RAFはMEK1およびMEK2が関与するシグナル伝達経路中に存在することから、このような下流の生物学的な現象としては、これらに限定されないが、例えばMBPのリン酸化、ERK1またはERK2のリン酸化、ERK1またはERK2標的遺伝子の調節の変化、および、細胞増殖または生存の変化が挙げられる。
RAF阻害剤、例えばBRAF阻害剤での癌治療は有望な治療アプローチであるが、このような治療を受ける患者のなかには再発したりまたは治療に反応を示さない場合もあり、その結果として患者の病気は進行する。本明細書において説明されているように、本発明は、現在のところ臨床開発中のRAF阻害剤に耐性を付与するBRAFにおける突然変異の発見に関する。このような突然変異が癌細胞に取り込まれていれば、その患者は所定のRAF阻害剤での治療に対して耐性を示す。代表的な実施態様において、本発明は、RAF阻害剤のRAF−265に対する耐性の発達に関する。
様々な実施態様において、本発明は、RAF活性を阻害する薬物に対するBRAFポリペプチドの耐性を付与する、BRAFポリペプチドにおける突然変異、または、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子における突然変異を同定する方法に関する。「突然変異型BRAFポリペプチド」は、本明細書において述べられるように、1またはそれより多くの既知のBRAF阻害剤に対する耐性を付与する、1種またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドを含む。BRAF阻害剤に対する耐性を付与する上記1種またはそれより多くの突然変異に加えて、突然変異型BRAFポリペプチドは、V600E置換を含んでいてもよい。野生型BRAFポリペプチド配列と比べてV600E置換のみを含み、それ以外の突然変異をまったく含まないBRAFポリペプチドは、本明細書において定義される「突然変異型BRAFポリペプチド」とはみなされない。「突然変異型BRAF核酸分子」は、本明細書において述べられるように、突然変異型BRAFポリペプチドをコードする核酸分子を含む。1またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドをコードする核酸分子は、当業界でよく知られている様々な適切な方法を用いて作製することができ、このような方法としては、例えば、野生型BRAF核酸配列またはBRAF V600E核酸配列のランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発が挙げ
られ、これらの方法は、大腸菌(E. coli)で行うことができる。代表的な実施態様にお
いて、野生型BRAF核酸配列は、ヒト野生型BRAF核酸配列(配列番号1)であり、BRAF V600E核酸配列は、ヒトBRAF V600E核酸配列(配列番号3)である。続いて、RAF阻害剤での治療に対して耐性を有する突然変異型BRAFポリペプチドをコードする核酸を同定するために、BRAF阻害剤での治療に対して別の方法で感受性を有する細胞中で突然変異型BRAF核酸分子をスクリーニングしてもよい。
害剤の存在下でより大きいBRAF活性を示す。1つの典型的な方法において、突然変異型BRAFポリペプチドをコードする核酸分子は、RAF阻害剤での治療に対して別の方法で感受性を有する細胞中で発現させることができる。この目的において有用な典型的な細胞系は、黒色腫細胞系A375である。突然変異型BRAFポリペプチドを発現させた
後、細胞をRAF阻害剤で処理することができる。続いて突然変異型BRAFポリペプチドの活性を測定して、同様に発現させてRAF阻害剤で治療した野生型BRAFポリペプチド(またはBRAF V600Eポリペプチド)の活性と比較してもよい。
る突然変異型BRAFポリペプチドは、RAF阻害剤に対する耐性を付与する突然変異を含むと同定される。続いてこのようなRAF阻害剤に対する耐性を付与する突然変異は、突然変異型BRAFポリペプチドをコードする核酸を配列解析すること、または、突然変異型BRAFポリペプチドを直接配列解析することによって同定することができる。
前述の方式で、ヒトBRAFポリペプチド中の、突然変異したするとRAF阻害剤RAF−265に対する耐性を付与するアミノ酸残基をいくつか同定した。このようなアミノ酸残基としては、以下に示すアミノ酸残基の1種またはそれより多く:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、K483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748が挙げられる。本発明の所定の実施態様において、突然変異型BRAFポリペプチドは、これらのアミノ酸残基のうち1種またはそれより多くにおいて、野生型ヒトBRAFポリペプチド配列(またはBRAF V600Eポリペプチド配列)と比べて突然変異を含む。関
連する実施態様において、突然変異型BRAF核酸分子は、これらのアミノ酸残基の1種またはそれより多くをコードする1種またはそれより多くのヌクレオチドにおいて、野生型ヒトBRAF核酸配列(またはBRAF V600Eポリペプチド配列)と比べて突然
変異を含む。代表的な実施態様において、本明細書において具体的に述べられた突然変異型BRAFポリペプチドは、以下に示す1種またはそれより多くの耐性突然変異:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194*、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、K483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657*、S683R、P686Q、P686T、C696*、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを含む。その他の代表的な実施態様において、本明細書において具体的に述べられた突然変異型BRAFポリペプチドをコードする突然変異型BRAF核酸分子は、以下に示す1種またはそれより多くの耐性突然変異:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、
C194*、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、K483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657*、S683R、P686Q、P686T、C696*、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを含む。
BRAF耐性突然変異の同定により、「第二世代のRAF阻害剤」の開発および/または同定が可能になる。本明細書で用いられるように、第二世代のRAF阻害剤は、本明細書において説明される1またはそれより多くの突然変異を含む、RAFポリペプチド、例えばBRAFポリペプチドの活性を効果的に阻害する物質である。第二世代のRAF阻害剤は、突然変異型RAFポリペプチドに加えて、野生型RAFポリペプチドの活性を阻害する場合もあるし、阻害しない場合もある。好ましい実施態様において、第二世代のRAF阻害剤は、BRAF V600Eポリペプチド(配列番号4)の活性を阻害し、同様に
、追加で本明細書において説明される1種またはそれより多くの耐性突然変異を有するBRAF V600Eポリペプチドの活性も阻害する。代表的な実施態様において、第二世
代のRAF阻害剤は、以下に示すアミノ酸残基の1種またはそれより多く:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、K483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748に突然変異を含むBRAFポリペプチドの活性を阻害する。
存在または非存在下におけるRAF突然変異型BRAFポリペプチドの相対的な活性を決定することによって、その化合物を第二世代のRAF阻害剤として同定することができる。第二世代のRAF阻害剤である化合物が存在する場合、突然変異型BRAFポリペプチドは、化合物が存在しない場合よりも低いレベルのRAF活性を有する。第二世代のRAF阻害剤ではない化合物が存在する場合、突然変異型BRAFポリペプチドは、化合物が存在しない場合と等価体かまたはそれよりも高いレベルのRAF活性を有する。所定の実施態様において、RAF活性は、インビトロの組換えBRAFポリペプチドを用いた分析で測定することができる。その他の実施態様において、RAF活性は、インビボのBRAFポリペプチドを発現する培養細胞または実験動物を用いた分析で測定することができる。
適している。このような方法としては、これらに限定されないが、ウェスタンブロットおよびマススペクトロスコピーが挙げられる。所定の実施態様において、ERK1/2のリン酸化分析は、インビトロで組換えタンパク質を用いて行うことができる。その他の実施態様において、ERK1/2のリン酸化分析は、インビボで培養細胞または実験動物を用いて行うことができる。
るBRAFポリペプチドとを含む分析組成物を提供すること、試験化合物の非存在下でBRAF基質のリン酸化を可能にする条件下で、分析組成物を試験化合物と接触させること、および、BRAF基質のリン酸化に対する試験化合物の作用を決定すること、を含み、ここで適切なコントロールと比較してBRAF基質のリン酸化がダウンレギュレーションされている場合、その化合物は第二世代のRAF阻害剤として同定される。この方法で同定された化合物は、例えば突然変異型RAFポリペプチドが検出された癌のような癌を治療するのに有用な化合物である。前述の方法において有用なBRAFポリペプチドは、RAF阻害剤のRAF−265に対する耐性を付与する1種またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドであり、例えば、1種またはそれより多くの本明細書において説明された突然変異を含むBRAFポリペプチドである。前述の方法において有用なBRAF基質は、例えばMEK1/2である。MEK1/2のリン酸化の低下、減少またはダウンレギュレーションは、その化合物がRAF阻害剤であることを示す指標である。同様に、前述の方法において有用な下流のRAFシグナル伝達分子は、例えばERK1/2である。ERK1/2リン酸化の低下、減少またはダウンレギュレーションは、その化合物がRAF阻害剤であることを示す指標である。前述の方法はインビトロで行うこともでき、ここでBRAFポリペプチドおよびBRAF基質は、単離タンパク質または精製タンパク質である。また前述の方法は、インビトロで行ってもよく、ここでBRAFポリペプチドおよびBRAF基質は、細胞抽出物の構成要素である。この実施態様において、分析組成物は、細胞抽出物である。適切なコントロールは、当業者にとって上記方法を行う際によく用いられると予想されるあらゆるコントロールであり、このようなコントロールとしては、例えば、試験化合物で処理していない、または、コントロール化合物で処理した類似または同一の分析組成物、または、「野生型」BRAFポリペプチドまたはBRAF
V600Eポリペプチドを含む類似の分析組成物または細胞抽出物が挙げられる。
挙げられる。
Eポリペプチドの活性を阻害するRAF阻害剤である。一実施態様において、第二世代のRAF阻害剤であるかどうかを決定するための試験化合物として用いられる可能性があるRAF阻害剤としては、PLX4032、PLX5568、XL281、および、US2008/0108615(この内容は参照により本明細書に組み入れられる)で説明されているイミダゾール−2−カルボキサミド誘導体が挙げられる。
. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061)。本発明の化合物は、当業界でよく知られているコンビナトリアルライブラリー法における様々なアプローチのいずれかを用いて得ることができ、このようなアプローチとしては、生物学的ライブラリー;三次元的に処理可能なパラレルな固相または液相ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、「1ビーズに対して1化合物」のライブラリー法、および、アフィニティークロマトグラフィーによる選択を利用した合成ライブラリー法が挙げられる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、それ以外の4種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子物質の化合物ライブラリーに適用することができる(Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。その他の典型的な分子ライブラリーの合成方法は当業界でよく知られており、例えば: Erb et al. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Horwell et al. (1996) Immunopharmacology 33:68- ;および、Gallop
et al. (1994); J. Med. Chem. 37:1233-で見出すことができる。化合物ライブラリー
は、溶液で(例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)、または、ビーズ上(Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップ上(Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌(Ladnerの米国特許第5,223,409号)、胞子(Ladnerの米国特許第5,223,409号)、プラスミド (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)、または、ファージ(Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310)に提供されてもよい。さらにその他
の実施態様において、コンビナトリアルポリペプチドは、cDNAライブラリーから生産される。活性でスクリーニングすることができる典型的な化合物としては、これらに限定されないが、ペプチド、核酸、炭水化物、有機小分子および天然産物抽出物ライブラリーが挙げられる。
0Eとの比較が可能になる。第一世代のRAF阻害剤に対する耐性を付与する変更された構造的特徴を知ることにより、突然変異体の対立遺伝子と結合しそれを阻害する阻害剤などのリガンドの合理的な設計および構築が可能になる。このような阻害剤は、本明細書において説明される第二の突然変異を含まないBRAF突然変異体の対立遺伝子、BRAF
V600Eと野生型BRAFとの両方に結合するように設計することができる。本明細
書において説明される1またはそれより多くの突然変異を含むBRAF対立遺伝子と結合するように設計された阻害剤は、第二世代のRAF阻害剤である。このような合理的に設計された阻害剤の突然変異型BRAFポリペプチドの生物活性を阻害する能力は、本明細書において説明されるインビトロおよび/またはインビボの分析を用いて確認することができる。
入れられる))、および、Discovery StudioR (アクセルリス(Accelrys), カリフォルニア州サンディエゴ)などのソフトウェアプログラムの使用が挙げられる。コンピューター支援の分子モデリングに有用な追加の技術は、J BUON. (2007) 12 Suppl 1:S101-18(参
照により本明細書に組み入れられる)で説明されている。また上記タンパク質に結合すると予想される分子を同定するのに、既知の構造を有するタンパク質のコンピューターに基づく解析も使用することができる。このような方法は、分子の受容体部位に相補的な形状に基づいて分子を分類する。例えばDOCKのようなプログラムは、三次元データベースを用いて、XBP−1、IRE−1アルファおよび/またはEDEMに結合すると予想される分子を同定するのに利用することができる。DesJarlias et al. (1988) J. Med. Chem. 31:722; Meng et al. (1992) J. Computer Chem. 13:505; Meng et al. (1993) Proteins 17:266; Shoichet et al. (1993) Science 259:1445を参照。加えて、標的タンパク
質に対する分子の電子的な相補性を解析して、標的に結合する分子を同定することもできる。これは、例えば、Meng et al. (1992) J. Computer Chem. 13:505、および、Meng et
al. (1993) Proteins 17:266で説明されているような分子力学力場を用いて決定するこ
とができる。使用できるその他のプログラムとしては、推定上のリガンドとのドッキングでGRID力場を利用するCLIX(例えば、Lawrence et al. (1992) Proteins 12:31; Goodford et al. (1985) J. Med. Chem. 28:849;および、Boobbyer et al. (1989) J. Med. Chem. 32:1083を参照、これら全体が開示に組み入れられる)が挙げられる。
号;および、5,096,676号(これらの内容は参照により本明細書に組み入れられる)で示されている。このような結晶は、BRAF突然変異体の対立遺伝子の三次元構造を決定するために、X線または中性子回折解析を行うのに利用することができる。BRAFポリペプチドまたは突然変異型BRAFポリペプチドの溶液構造は、当業界でよく知られている技術を利用した核磁気共鳴分光分析を用いて同定することができる。X線結晶学またはNMR分光分析によるポリペプチド構造決定に適した方法は、Brunger et al., (1998) “Crystallography & NMR system (CNS): A new software system for macromolecular structure determination”, Acta Crystallogr D54, 905-921; Brunger et al. (1987) “Solution of a Protein Crystal Structure With a Model Obtained From NMR Interproton Distance Restraints”, Science 235, 1049-1053; Drenth, “Principles of Protein X-ray Crystallography”, (1994), Springer-Verlag. pp. 1-19; and Narula et al. (1995) “Solution structure of the C-terminal SH2 domain of the human tyrosine kinase Syk complexed with a phosphotyrosine pentapeptide”, Structure 3, 1061-1073で説明されており、これらの全体は参照により本明細書に組み入れられる。突然
変異型RAFポリペプチドの結晶または溶液構造が同定されたら、上述のコンピューター支援のモデリングアプローチを利用して突然変異型BRAFポリペプチドの阻害剤を同定することができる。
ば、第二世代のRAF阻害剤は、被験者における癌を治療するのに有用であり、具体的には、突然変異型BRAFポリペプチドが同定されている癌を治療するのに有用である。代表的な実施態様において、第二世代のRAF阻害剤は、以下のアミノ酸残基の1種またはそれより多く:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、K483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748に突然変異を有するBRAFポリペプチドを含む癌を治療するのに有用である。関連する実施態様において、第二世代のRAF阻害剤は、以下に示す突然変異の1種またはそれより多く:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194*、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、K483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657*、S683R、P686Q、P686T、C696*、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを有するBRAFポリペプチドを含む癌を治療するのに有用である。
本発明は、BRAF遺伝子関連のポリヌクレオチドまたは核酸分子およびそれぞれの遺伝子産物に関する。これらのポリヌクレオチドまたは核酸分子は哺乳動物細胞から単離して精製することができる。本発明の具体的な形態において、本明細書において説明される単離したBRAF核酸分子は、BRAF阻害剤に対する耐性を付与する1種またはそれより多くの突然変異を含む。「突然変異型BRAF核酸分子」は、本明細書において述べられるように、突然変異型BRAFポリペプチドをコードする、すなわち1またはそれより多くの既知のBRAF阻害剤に対する耐性を付与する1種またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドをコードするBRAF核酸分子を含む。
的なゲノム配列が好ましい場合もある。あるいは、cDNAはポリペプチドのコード領域を示し、イントロンなどの調節領域が除去されているため、cDNAが有利である可能性がある。
然の変異体または変異株によって示され得ることも考えられる。好ましい実施態様において、活性なBRAFポリペプチドは、活性なヒトBRAFポリペプチドである。特に好ましい実施態様において、活性なBRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチドの活性を有するが、1種またはそれより多くの既知のBRAF阻害剤に対して耐性を有する突然変異型BRAFポリペプチドである。その結果として、本発明の所定の形態は、アミノ酸変化が最小であるが、同じ生物学的機能を有するBRAF誘導体を包含する。
BRAF阻害剤に対する耐性を付与する1またはそれより多くの突然変異を含む。従って、本発明の具体的な形態において、配列を変更させることによって、その配列によってコードされたポリペプチドの特性に、結果的に治療に対する少なくともある程度の耐性、例えばBRAF阻害剤での治療に対する耐性が起るような影響を与える変化が生じる。
,000、100,000、250,000、約500,000、750,000〜約1,000,000個のヌクレオチドを含んでいてもよいし、加えて、酵母人工染色体のような核酸コンストラクトの出現が当業者によく知られていることを考慮すると、それよりも大きいサイズのコンストラクト、例えば最大染色体サイズのヌクレオチドを含んでいてもよい(その間のあらゆる中間の長さおよび中間の範囲を含む)。当然のことながら、本明細書で用いられる「中間の長さ」および「中間の範囲」は、引用された値を含む、または、それらの値の間のあらゆる長さまたは範囲を意味する(すなわち、このような値を含む、および、それらの間の全ての整数)。中間の長さの非限定的な例としては、約11、約12、約13、約16、約17、約18、約19など;約21、約22、約23など;約31、約32など;約51、約52、約53など;約101、約102、約103など;約151、約152、約153、約97001、約1,001、約1002、約50,001、約50,002、約750,001、約750,002、約1,000,001、約1,000,002などが挙げられる。中間の範囲の非限定的な例としては、約3〜約32、約150〜約500,001、約3,032〜約7,145、約5,000〜約15,000、約20,007〜約1,000,003などが挙げられる。
ぞれ参照により本明細書に組み入れられる)で説明されているようなデオキシヌクレオシドH−ホスホン酸中間体を介した技術によって製造された核酸が挙げられる。本発明の方法において、1種またはそれより多くのオリゴヌクレオチドを用いてもよい。オリゴヌクレオチド合成の多種多様なメカニズムが、例えば米国特許第4,659,774号、4,816,571号、5,141,813号、5,264,566号、4,959,463号、5,428,148号、5,554,744号、5,574,146号、5,602,244号で開示されている(これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる)。
より本明細書に組み入れられる)。好ましい形態において、核酸は、薬理学的に許容できる核酸である。薬理学的に許容できる組成物は当業者によく知られており、本明細書において説明されているものである。
本発明は、発現ベクター組成物、および、BRAFポリペプチド、例えば突然変異型BRAFポリペプチドをコードさせるためのこのようなベクターの使用を包含し、加えてこのような発現ベクターが導入された宿主細胞組成物を包含する。用語「ベクター」は、核酸配列を複製することができる細胞に導入するために、核酸配列を挿入することができるキャリアー核酸分子を意味するものとして用いられる。核酸配列は「外因性」であってもよく、ここで外因性とは、その配列が、ベクターを導入しようとする細胞にとって外来のものであること、または、その配列が、細胞中の配列に相同であるが、その配列が通常見出されない宿主細胞内の核酸の位置に存在することを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス)、ならびに人工染色体(例えばYAC)が挙げられる。当業者であれば標準的な組換え技術によってベクターを構築することについて十分に認識しているものと思われ、このような技術は、Sambrook et al., 1989 and Ausubel et al., 1996(いずれも参照により本明細書に組み入れられる)で説明される。
子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。場合によっては、それに続いてRNA分子はタンパク質、ポリペプチド、または、ペプチドに翻訳される。その他のケースにおいて、これらの配列は、例えばアンチセンス分子またはリボザイム生産において翻訳されない。発現ベクターは様々な「制御配列」を含んでいてもよく、ここで制御配列とは、特定の宿主生物中で作動可能なように連結したコード配列の転写および場合によっては翻訳に必要な核酸配列を意味する。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、同様にその他の機能を果たす核酸配列を含んでいてもよい(このような核酸配列については以下で説明する)。
「プロモーター」は、コントロール配列であって、これは、転写開始および速度を制御する核酸配列の領域である。これらは、調節タンパク質および分子が例えばRNAポリメラーゼやその他の転写因子と結合することができる遺伝学的要素を含んでいてもよい。「作動可能なように位置する」、「作動可能に結合した」、「制御下で」および「転写制御下で」という成句は、プロモーターが、転写開始および/またはその配列の発現を制御するための核酸配列に関して適切な機能的な位置および/または方向にあることを意味する。プロモーターは、「エンハンサー」と共に用いられる場合もあるし、そうでない場合もあり、ここで「エンハンサー」は、核酸配列の転写活性化に関するシス作用性の調節配列を意味する。
特異的な開始シグナルも、コード配列の効率的な翻訳に必要な場合がある。これらのシ
グナルは、ATG開始コドンまたは隣接する配列を含む。ATG開始コドンなどの外因性の翻訳制御シグナルを提供する必要性がある場合がある。当業者であれば容易にこのことを決定して必要なシグナルを提供することができるであろう。挿入物全体が確実に翻訳されるように、望ましいコード配列のリーディングフレームと共に開始コドンは「フレーム内に」存在させなければならないことはよく知られている。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然のものであってもよいし、または合成であってもよい。適切な転写エンハンサー要素を包含させることによって発現効率が強化される場合がある。本発明の所定の実施態様において、内部リボソーム侵入部位(IRES)要素の使用は、多重遺伝子または多シストロン性のメッセージを創り出すのに利用することができる。
ベクターは、マルチクローニングサイト(MCS)を含んでいてもよく、ここでマルチクローニングサイトとは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、そのうちのいずれかが、ベクターを消化するための標準的な組換え技術と共に用いることができる(例えば、Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, and Cocea, 1997を参照、参照に
より本明細書に組み入れられる)。「「制限酵素による消化」は、核酸分子中の特異的な位置でのみ機能する酵素を用いた核酸分子の触媒作用による切断を意味する。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。MCS内で切断を行う制限酵素を用いてベクターを直線状にするかまたは断片化することにより、外来配列をベクターにライゲーションさせるようにすることがよく行われる。「ライゲーション」は、2つの核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味し、これらのフラグメントは、互いに連結していてもよいし、そうでなくてもよい。制限酵素およびライゲーション反応を含む技術は、組換え技術分野の当業者にはよく知られている。
ほとんどの転写された真核RNA分子は、一次転写物からイントロンを除去するためにRNAスプライシングを受けると予想される。真核性のゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現のために転写物を適切にプロセシングするために、ドナーおよび/またはアクセプタースプライシング部位を必要とする場合がある(例えば、Chandler et al., 1997を参照、参照により本明細書に組み入れられる)。
本発明のベクターまたはコンストラクトは、一般的に少なくとも1つの終結シグナルを含むと予想される。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写を特定のところで終結させることに関するDNA配列で構成される。従って、所定の実施態様において、RNA転写物の生産を終わらせる終結シグナルが考慮される。ターミネーターは、インビボにおいて、望ましいメッセージレベルを達成するのに必要なことがある。
発現のために、特に真核性の発現のために、典型的には、転写物の適切なポリアデニル化を実行するためのポリアデニル化シグナルを含むと予想される。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功にとって重要なものではないと考えられており、および/または、このような配列ならばどれでも使用できる。好ましい実施態様としては、便利であり、および/または、様々な標的細胞で十分に機能することがわかっている、SV40ポリアデニル化シグナル、および/または、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが挙げられる。ポリアデニル化 は転写の安定性を高めることができるか、または、細胞質内輸送を容易にする可能性がある。
宿主細胞中のベクターを増やすために、1種またはそれより多くの複製起点部位(「ori」と称されることが多い)を含んでいてもよく、この複製起点は、複製を開始させる特異的な核酸配列である。あるいは宿主細胞が酵母である場合、自律複製型配列(ARS)を用いてもよい。
本発明の所定の実施態様において、本発明の核酸コンストラクトを含む細胞は、発現ベクター中にマーカーを含ませることによってインビトロでもインビボでも同定することが可能になる。このようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を付与すると思われ、このような変化によって発現ベクターを含む細胞を容易に同定できるようになる。一般的に、選択マーカーとは、選択を可能にする特性を付与するマーカーのことである。陽性選択マーカーは、マーカーの存在によって選択が可能になるようなマーカーであり、一方で陰性選択マーカーは、マーカーの存在が選択を妨害するようなマーカーである。陽性選択マーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。
本明細書で用いられるように、用語「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」は、同義的に用いることができる。本発明において、BRAFポリヌクレオチドを含む細胞は、BRAFポリヌクレオチドが突然変異型でも野生型でも用いられる可能性がある。またこれらの用語はいずれもそれらの後代も含み、ここで後代とは、その後に続くすべての世代を意味する。当然のことながら、いずれの後代も、計画的な突然変異または偶発的な突然変異のために同一でない場合もある。異種核酸配列を発現することに関して、「宿主細胞」は原核または真核細胞を意味し、このような細胞としては、ベクターを複製することができる、および/または、ベクターによってコードされた異種遺伝子を発現することができるあらゆる形質転換可能な生物が挙げられる。宿主細胞はベクターの受容者として用いることができでき、さらにそのように用いられてきた。宿主細胞は、「トランスフェクション」または「形質転換」されていてもよく、これらは、外来核酸を宿主細胞に移入または導入させるプロセスを意味する。形質転換した細胞は、初代の対象の細胞とその後代を含む。「組換え宿主細胞」は、組換え核酸、すなわちインビトロで操作された核酸、または、そのように操作された核酸の複製コピーである核酸を有する宿主細胞を意味する。
イプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から得ることができ、ATCCとは、生きた培養物や遺伝物質のアーカイブとして役立つ組織である。適切な宿主は、当業者によってベクターの主鎖と要求される結果に基づき決定することができる。多くのベクターを複製するために、例えばプラスミドまたはコスミドを原核生物の宿主細胞に導入することができる。ベクター複製および/または発現のための宿主細胞として用いられる細菌細胞としては、DH5α、JM109およびKC8が挙げられ、加えて様々な市販の細菌宿主、例えばシュアー(SURETM).コンピテント細胞、および、ソロパック(SolopackTM)ゴールド細胞(ストラタジーン(Strategene).RTM., ラホヤ)も挙げられる。あるいは、フ
ァージウイルス用の宿主細胞として、大腸菌(E. coli)LE392のような細菌細胞を用いてもよい。
上記で考察された組成物の少なくとも一部または全部を含む多数の発現系が存在する。BRAF核酸配列またはそれらの同源のポリペプチド、 タンパク質およびペプチドを生
産するために、原核および/または真核細胞ベースの系が本発明と共に用いることができる。このような系の多くは通常市販されている。
発現)系、全長CMVプロモーターを利用した誘導性哺乳動物発現系を含む。クロンテック(ClontechTM)製のTet-OnTMおよびTet-OffTM系は、哺乳動物宿主中での発現をテトラ
サイクリンまたはその誘導体を用いて調節するのに用いることができる。これらの系の実際の使用は、Gossen et al., 1992およびGossen et al., 1995、ならびに米国特許第5,650,298号で説明されている(これらはいずれも参照により本明細書に組み入れられる)。
本発明のその他の形態は、単離および/または精製したBRAFタンパク質、および、それらの生物学的に活性な部分に関する。本発明の具体的な形態において、本明細書において説明されるBRAFポリペプチドは、BRAF阻害剤に対する耐性を付与する1種またはそれより多くの突然変異を含む。「突然変異型BRAFポリペプチド」は、本明細書
において述べられるように、1種またはそれより多くの既知のBRAF阻害剤に対する耐性を付与する、1種またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドを含む。
483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657*、S683R、P686Q、P686T、C696*、L697I、P722T、F738L、および、C748Fが挙げられる。
その他の形態において、本発明は、サンプル(例えば癌患者からの生体サンプル)中の突然変異型BRAFタンパク質の存在を検出する方法に関する。サンプル中の、例えば核酸および/またはポリペプチドサンプル中の本発明の突然変異型BRAFタンパク質の存在を検出するのに、様々なスクリーニング方法を用いることができる。具体的な実施態様において、このようなサンプルは、細胞または細胞抽出物を含む。代表的な実施態様において、このようなサンプルは、被験者、例えば癌を有する被験者から得られたものである。
れらの生物学的に活性な部分中の耐性突然変異の存在を検出する方法も本発明の範囲内で用いることができる。具体的な実施態様において、これらに限定されないが、以下に示す1種またはそれより多くのアミノ酸残基:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、K483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、または、C748に突然変異を有する、BRAFポリペプチドまたはBRAFポリペプチドをコードする核酸分子の存在を検出する方法を用いることができる。代表的な実施態様において、これらに限定されないが、以下に示す1種またはそれより多くの突然変異:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194*、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、K483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657*、S683R、P686Q、P686T、C696*、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを有するBRAFポリペプチドまたはBRAFポリペプチドをコードする核酸分子の存在を検出する方法を用いることができる。
Iは、4種の既知のミスマッチのうち3種を切断することが報告されている。またその他の研究者が、MutSタンパク質または単一の塩基のミスマッチ検出のためのその他のDNA修復酵素を用いたものも説明している。
された個体が第一世代のBRAF阻害剤を用いた治療に対して耐性を有する能力があるかどうかが決定される。このような結果は、本発明によって提供される方法に従って、第一世代のBRAF阻害剤の用量を調節および/または変更したり、または、第二世代のBRAF阻害剤を用いた治療方針を選択したりするのに用いられると予想される。癌を有する被験者の有効な治療は、癌細胞の根絶、癌(例えば固形腫瘍)の増殖の停止または増殖速度の低減、または、癌の症状の少なくとも1つの改善を含んでいてもよい。
突然変異を特徴付けるための最も一般的に使用される方法は、両側に多型を有する遺伝子座の直接のDNA配列解析(direct DNA sequencing of the genetic locus that flanks and includes the polymorphism)である。このような解析 は、「サンガー法」としても知られている「ジデオキシ鎖終結方法」(Sanger, F., et al., 1975)、または、「マクサム・ギルバート法」としても知られている「化学分解法」(Maxam, A. M., et al., 1977)のいずれかを用いて達成することができる。望ましい遺伝子の回収を容易にする
ために、配列解析と、ポリメラーゼ連鎖反応のようなゲノム配列特異的な増幅技術とを併用してもよい(Mullis, K. et al., 1986;欧州特許出願第50,424号;欧州特許出
願第84,796号、欧州特許出願第258,017号、欧州特許出願第237,362号;欧州特許出願第201,184号;米国特許第4,683,202号;4,582,788号;および、4,683,194号、これらはいずれも参照により本明細書に組み入れられる)。またプールしたサンプルの配列解析は、ソレクサ(Solexa)/イルミナ(Illumina)の配列解析(イルミナ(Illumina(R)),カリフォルニア州サンディエゴ)、
パイロシーケンシング、または、その他の単一の分子を配列解析するアプローチを用いて達成することもできる。
突然変異した部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するのに用いることができるその他の方法としては、特殊化したエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を利用する方法がある(米国特許第4,656,127号)。3’直後から多型の部位の対立遺伝子の配列に相補的なプライマーを調査対象のDNAにハイブリダイズさせる。DNA上の多型の部位が、存在する特定のエキソヌクレオチド耐性のヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含む場合、その誘導体は、ポリメラーゼによってハイブリダイズしたプライマーの末端に取り込まれると予想される。このような取り込みによって、プライマーはエキソヌクレアーゼの切断に対して耐性になり、その検出が可能になる。エキソヌクレオチド耐性の誘導体の同一性は既にわかっているため、DNAの多型の部位に存在する特定のヌクレオチドを決定することができる。
DNA中の突然変異部位を分析するための様々なその他のプライマー誘導ヌクレオチド取り込み法が説明されている(Komher, J. S. et al., 1989; Sokolov, B. P., 1990; Syvanen 1990; Kuppuswamy et al., 1991; Prezant et al., 1992; Ugozzoll, L. et al., 1992; Nyren et al., 1993)。これらの方法 は、突然変異部位における塩基を区別する
ための標識されたデオキシヌクレオチドの取り込みによるものである。シグナルは取り込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチド鎖に起った突然変異によって、鎖の長さに比例するシグナルが生じる(Syvanen et al., 1993)。
フランス国特許第2,650,840号およびPCT出願番号WO91/02087は、溶液ベースの突然変異部位のヌクレオチドの同一性の決定方法を論じている。これらの方法によれば、対立遺伝子の配列の3’の直後から多型の部位に相補的なプライマーが用いられる。その部位が多型の部位のヌクレオチドに相補的な場合、プライマーの末端に取り込まれた標識されたジデオキシヌクレオチド誘導体を用いてその部位のヌクレオチドの同一性が決定される。
PCT出願第92/15712号は、標識されたターミネーターと3’から多型の部位の配列に相補的なプライマーとの混合物を使用する方法を説明している。取り込まれた標識されたターミネーターが評価対象の標的分子の多型の部位に存在するヌクレオチドに相補的なので、同定される。ここでこのようなプライマーまたは標的分子は固相に固定される。
オリゴヌクレオチドのライゲーション分析は、上述したものとは異なる方法論を利用する固相方法である(Landegren et al., 1988)。標的DNAの一本鎖の隣接する配列にハイブリダイゼーション可能な2種のオリゴヌクレオチドを利用する。これらのオリゴヌクレオチドのうち一方はビオチン化されており、他方は、検出可能に標識されている。標的分子に正確な相補配列が見出される場合、オリゴヌクレオチドは、それらの末端を隣り合わせてライゲーションの基質が形成されるようにハイブリダイズすると予想される。ライゲーションにより、アビジンを用いた標識されたオリゴヌクレオチドの回収が可能になる。また、この方法に基づくその他のPCR併用の核酸検出分析も説明されている(Nickerson et al., 1990)。ここでPCRは、標的DNAを指数関数的な増幅を達成するのに用いられており、続いて標的DNAはOLAを用いて検出される。
米国特許第5,952,174号は、同様に標的分子の隣接する配列にハイブリダイゼーションすることができる2種のプライマーを用いる方法を説明している。標的が固定された固体支持体上にハイブリダイズした生成物が形成される。ここで、プライマーが、ヌクレオチド1つのスペースをあけて互いに分離されるようにハイブリダイゼーションが起こる。このハイブリダイズした生成物を、ポリメラーゼ、リガーゼ、および、少なくとも1種のデオキシヌクレオシド三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸の混合物の存在下でインキュベートすることにより、あらゆる隣接するハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド対のライゲーションが可能になる。リガーゼ添加により、シグナル、伸長およびライゲーションの発生に必要な2つの現象が起こる。それにより、伸長またはライゲーションのいずれか単独を用いた方法よりも特異性が高く、かつ「ノイズ」も低くなり、さらに、ポリメラーゼベースの分析とは異なり、この方法と第二のハイブリダイゼーションおよび固相に結合するシグナルのライゲーション工程とを組み合わせることによって、この方法はポリメラーゼ工程の特異性を強化する。
本発明の方法のうちいくつかにおいて、核酸の転移方法を用いることができる。本発明の組成物を発現させるための核酸の送達に適した方法は、本明細書で説明されているように、または、当業者が熟知していると思われるように、核酸(例えばDNA、例えばウイ
ルスおよび非ウイルスベクターなど)を細胞器官、細胞、組織または生物に導入することができる実質的にはほとんどすべての方法を含むと考えられる。このような方法としては、これらに限定されないが、例えば注射による直接のDNA送達(米国特許第5,994,624号、5,981,274号、5,945,100号、5,780,448号、5,736,524号、5,702,932号、5,656,610号、5,589,466号および5,580,859号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)、例えばマイクロインジェクションなど(Harlan and Weintraub, 1985;米国特許第5,789,215号、参照により本明細書に組み入れられる);エレクトロポレーションによる方法(米国特許第5,384,253号、参照により本明細書に組み入れられる);リン酸カルシウム沈殿による方法(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987;
Rippe et al., 1990); DEAE−デキストラン、続いてポリエチレングリコールを用いることによる(Gopal, 1985);直接の超音波処理しながらのローディングによる方法(Fechheimer et al., 1987);リポソームが媒介するトランスフェクションによる方法(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991);微粒子銃による方法(PCT出願番号WO94/09699および95/06128;米国特許第5,610,042号;5,322,783号、5,563,055号、5,550,318号、5,538,877号および5,538,880号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる);炭化ケイ素繊維での撹拌による方法(Kaeppler et al., 1990; 米国特許第5,302,523
号および5,464,765号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる);アグロバクテリウム属が媒介する形質転換による方法(米国特許第5,591,616号および5,563,055号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる);プロトプラストのPEGが媒介する形質転換による方法(Omirulleh et al., 1993; 米国特許第4,684,611号および4,952,500号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる);または、枯渇/阻害が媒介するDNAの取り込みによる方法(Potrykus et al., 1985)が挙げられる。このような技術の適用により、細胞器官、細胞、組織または生
物を、安定して、または一時的に形質転換させることができる。
本明細書において説明される1またはそれより多くの耐性突然変異を有するBRAFポリペプチドは、突然変異型BRAFポリペプチドを特異的に認識するが野生型BRAFポリペプチドを認識しない抗体を用いて検出が可能である。1またはそれより多くの耐性突然変異を有するBRAFポリペプチドの1種またはそれより多くの対立形質に対して抗体を発生させることができる。ペプチドまたはタンパク質上のエピトープを特異的に認識する抗体を惹起する抗原として特異的なタンパク質またはオリゴペプチドを用いるための技術は、よく知られている。一実施態様において、標的遺伝子の望ましい対立形質のDNA配列は、適切な発現ベクターに挿入することによりクローニングし、続いて原核または真核宿主細胞中でタンパク質に翻訳することができる。このようなタンパク質を回収して、特異的な抗体の生産を惹起する抗原として使用することができる。その他の実施態様において、標的遺伝子の望ましい対立形質のDNAをPCR技術で増幅させ、その後インビトロでタンパク質に翻訳して、特異的な抗体の生産を惹起するための抗原として使用することができる。第三の実施態様は、特異的な抗体の生産を惹起する抗原として使用するために、対立遺伝子のアミノ酸配列を示す合成ペプチドを生成する基礎として、代替の対立遺伝子のDNA配列を使用することである。
Pober, Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Co. (1991)を参照。用語「抗体」は、抗原に特異的に結合することができる無傷の抗体分子、加えて抗体フラグメントまたは誘導体、例えばFabおよびF(ab’)2などを意味する。このようにして
生産された抗体は、抗体を形成するために抗原として用いられた対立形質で生産された突然変異体タンパク質のみに選択的に結合すると予想される。また、対立形質特異的な抗体を生成する方法は、米国特許第6,200,754号、および、米国特許第6,054,273号(これらの全内容は参照により本明細書に組み入れられる)でも説明されている。
前述の技術は、患者から得られたサンプル中で、BRAF核酸またはポリペプチド分子中の予め同定された耐性突然変異の存在または非存在を決定するのに用いることができる。患者サンプル中の突然変異型BRAF核酸またはポリペプチド分子の同定は、患者の病気または状態を特徴付けるのに有用な可能性がある。例えば、BRAFの異常な発現または活性化に関連する病気(例えば癌)を有する患者の場合、患者から得られたサンプル(例えば癌細胞を含むサンプル)に突然変異型BRAF核酸またはポリペプチド分子が同定された場合、それは、その患者が、比較的高い再発の危険を有するか、または、BRAF阻害剤での治療に対して反応しないことを示す。一実施態様において、患者から得られた癌細胞を含むサンプルに本明細書において説明される1種またはそれより多くの突然変異を含むBRAF核酸またはポリペプチド分子が同定された場合、それは、その患者が、比較的高い再発の危険を有するか、または、第一世代のBRAF阻害剤、例えばRAF−265での治療に対して反応しないことを示す。
P686Q、P686T、C696*、L697I、P722T、F738L、または、C748Fを有するBRAFポリペプチドまたはBRAFポリペプチドをコードする核酸が同定された場合、それは、その患者が、比較的高い再発の危険を有するか、または、例えばBRAF阻害剤での治療に対して反応しないことを示す。
ードする核酸分子を配列解析すること、を含み;ここで、配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、K483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸におけるアミノ酸残基の同一性を変更するヌクレオチドが存在する場合、それは、その被験者をMEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤で治療する必要があることを示す。
くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸残基の同一性を変更する1またはそれより多くの突然変異が存在するかどうかについて分析すること;および、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子中の1種またはそれより多くの突然変異の存在を、MEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤での治療によって利益を得る可能性が高い被験者と関連付けること、を含む。
様々な実施態様において、本発明は、癌を有する被験者の治療方法を提供する。代表的な実施態様において、被験者は、1種またはそれより多くの突然変異、例えば本明細書において説明される1種またはそれより多くの耐性突然変異を有するBRAFポリペプチドを含む癌を有する。関連する実施態様において、被験者は、1種またはそれより多くの突然変異、例えば本明細書において説明される1種またはそれより多くの耐性突然変異を有するBRAFポリペプチドをコードする核酸分子を含む癌を有する。用語「治療した」、「を治療すること」または「治療」は、治療しようとする状態に伴う症状の少なくとも1つを低減または緩和することを含む。例えば、治療によって、例えば癌のような疾患の1種または数種の症状を減少させるか、または、完全に根絶することができる。同様に、化合物の治療有効量とは、治療しようとする状態に伴う症状の少なくとも1つを減少または緩和するのに十分な量である。
076415、US20080166359、WO2008067481、WO2008055236、US20080188453、US20080058340
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、WO2007121481、US20070238710、WO2007121269、WO2007096259、US20070197617、WO2007071951、EP1966155、IN2008MN01163、WO2007044084、AU2006299902、CA2608201、EP1922307、EP1967516、MX200714540、IN2007DN09015、NO2007006412、KR2008019236、WO2007044515、AU2006302415、CA2622755、EP1934174、IN2008DN02771、KR2008050601、WO2007025090、US20070049591、WO2007014011、AU2006272837、CA2618218、EP1912636、US20080058340、MX200802114、KR2008068637、US20060194802、WO2006133417、WO2006058752、AU2005311451、CA2586796、EP1828184、JP2008521858、US20070299103、NO2007003393、WO2006056427、AU2005308956、CA2587178、EP1838675、JP2008520615、NO2007003259、US20070293544、WO2006045514、AU2005298932、CA2582247、EP1802579、CN101065358、JP2008517024、IN2007DN02762、MX200704781、KR2007067727、NO2007002595、JP2006083133、WO2006029862、US20060063814、US7371869、AU2005284293、CA2579130、EP1791837、CN101023079、JP2008513397、BR2005015371、KR2007043895、MX200703166、IN2007CN01145、WO2006024034、AU2005276974、CA2578283、US20060079526、EP1799656、CN101044125、JP2008510839、MX200702208、IN2007DN02041、WO2006018188、AU2005274390、CA2576599、EP1781649、CN101006085、JP2008509950、BR2005014515、AT404556、US20060041146、MX200701846
、IN2007CN00695、KR2007034635、WO2006011466、AU2005265769、CA2575232、EP1780197
、BR2005013750、JP4090070、MX200700736、CN101124199、KR2007041752、IN2007DN01319、WO2005121142、AU2005252110、CA2569850、US20060014768、US7378423、EP1761528、CN101006086、AT383360、BR2005011967、JP2008501631、EP1894932、ES2297723、MX2006PA14478、NO2007000155、IN2007CN00102、KR2007034581、HK1107084、JP2008201788、US20050256123、US20050250782、US20070112038、US20050187247、WO2005082891、WO2005051302、AU2004293019、CA2546353、US20050130943、US20050130976、US20050153942、EP1689233、JP2007511615、WO2005051301AU2004293018、CA2545660、US20050130943、US20050130976、US20050153942、EP1682138、BR2004016692、CN1905873、JP2007511614、MX2006PA05657、IN2006DN03183、NO2006002692、KR2007026343、WO2005028426、EP1674452、US20070105859、US20050054701、US7230099、US20050049419、US7144907、AU2004270699、CA2537321、WO2005023759、EP1673339、BR2004014111、CN1874769、JP2007504241、JP4131741、US20060030610、MX2006PA02466、NO2006001506、US20050049419、US7144907、US20050054701、US7230099、AU2004270699、CA2537321、WO2005023759、EP1673339、BR2004014111、CN1874769、JP2007504241、JP4131741US20060030610、MX2006PA02466、IN2006DN01661、NO2006001506、US20060189808、US20060189649、US7271178、US20060189668、US20050049276、WO2005009975、CA2532067、EP1651214、BR2004012851、JP2006528621、US20050026970、US7160915、MX2006PA00921、WO2005007616、US20050059710、WO2005000818、US20050026964、US7273877、WO2004056789、US20050004186、CA2509405、AU2003286306、EP1578736、BR2003017254、JP2006516967、MX2005PA06803、WO2004044219、AU2003291268、WO2004041811、AU2003278369、EP1575943、JP2006508944、US20050282856、US7173136、US20070191346、WO2004041185、AU2003287366、US20060270643、WO2004030620、AU2003275282、US20040092514、US7232826、EP1545529、US20040039037、US6989451、WO2003077855、CA2478534、AU2003220202、US20030216460、EP1482944、CN1652792、JP2005526076、RU2300528、BR2003006016、MX2004PA08894、US20060106225、WO2003062191、CA2473545、EP1467968、BR2003007060、JP2005515253、TW592692、US20040006245、US6891066、MX2004PA05527
、US20050137263、US7078438、WO2003062189、CA2472367、EP1467965、BR2003007071、JP2005515251、US20030232889、US6770778、MX2004PA05528、WO2003047585、AU2002347360
、WO2003047583、AU2002365665、WO2003047523、CA2466762、AU2002365899、US20030125359、US7307071、JP2005526008、EP1578346、WO2003035626、CA2463101、AU2002359291、EP1438295、JP2005508972、US20050054706、US7253199、US20070293555、AU2008202731、US6506798、WO9901421、WO2000041994、US6310060、WO2002006213、CA2416685、AU2001073
498、BR2001012584、HU2003002781、JP2004504294、JP3811775、EE200300030、NZ524120
、AU2001273498、IN2003MN00028、NO2003000249、KR773621、MX2003PA00591、HR2003000083、BG107564、ZA2003000348、US20040054172、US6960614、HK1055943、US20050176820、US7411001、WO2000042029、JP2000204077、CA2355374、EP1144394、BR9916896、TR200102029、HU2001005092、JP2002534515、EE200100374、NZ513432、AT302761、ES2249060、ZA2001005219、MX2001PA06659、IN2001MN00785、NO2001003451、HR2001000525、BG105801、US6545030、HK1042488、US20030004193、WO2000042022、JP2000204079、CA2355470、EP1144385、BR9916904、TR200102030、HU2001005113、EE200100373、JP2002534510、NZ513433
、AT302193、ES2247859、MX2001PA06568、ZA2001005224、IN2001MN00786、US6469004、NO2001003452、HR2001000524、BG105800、WO2000042003、JP2000212157、CA2349832、EP1144371、BR9916885、AT309205、ES2252996、MX2001PA04332、US6440966、US20030092748、US6750217、WO2000042002、JP2000204075、CA2349467、EP1144372、BR9916894、JP2002534497、AT311363、ES2251851、MX2001PA04331、US6455582、US20030045521、US6835749、WO2000037141、CA2352326、BR9916839、EP1140291、TR200101871、HU2001004844、JP2002532570、EE200100339、NZ512859、AT310567、ES2253928、ZA2001004277、MX2001PA05476、IN2001MN00673、NO2001003099、HR2001000473、BG105715、US20040171632、GB2323845、WO9901426、CA2290506、AU9882627、AU757046、EP993439、BR9810366、NZ501276、HU2000003731、JP2002511092、AT277895、IL132840、PT993439、ES2229515、TW396149、ZA9805728、MX9910649、NO9906491、NO315271、US20030078428、US6821963、US20050049429、US20060052608、US7169816、WO9901421、CA2290509、AU9882626、AU756586、EP993437、BR9810385、JP2002509536、NZ501277、AT344791、ES2274572、TW221831、ZA9805726、MX9910556、US6310060、US6506798、US20020022647、US6492363、US20030149015、および、US 7019033で説明されている化合物が挙げられる(これらの全内容は参照により本明細書に組み
入れられる)。前述の化合物の投与量、 製剤および投与様式は当業界でよく知られてい
る。典型的な投与様式としては、これらに限定されないが、経口、 皮下、 静脈内、または、非経口が挙げられる。経口投与のための液状の投薬形態としては、これらに限定されないが、医薬的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、および、エリキシルが挙げられる。液状の投薬形態は、活性化合物に加えて、当業界において一般的に使用されている不活性希釈剤を含んでいてもよく、このような不活性希釈剤としては、例えば水またはその他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(具体的には、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、および、ゴマ油)、クレモフォール(cremaphor)、グリセロール、テトラ
ヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタン脂肪酸エステル、および、それらの混合物が挙げられる。経口用組成物は、不活性希釈剤の他にも、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、矯味矯臭剤、および、着香料を含んでいてもよい。経口投与のための固形の投薬形態としては、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、および、顆粒が挙げられる。このような固形の投薬形態において、活性化合物は、少なくとも1種の不活性な医薬的に許容される賦形剤またはキャリアーと混合され、このような賦形剤またはキャリアーとしては、例えばクエン酸ナトリウム、または、リン酸二カルシウム、および/または、a)充填剤もしくは増量剤、例えばスターチ、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および、ケイ酸、b)結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、および、アカシア、c)湿潤剤、例えばグリセロール、d)崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ポテトまたはタピオカスターチ、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および、炭酸ナトリウム、e)溶解遅延剤、例えばパラフィン、f)吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物、g)湿潤剤、例えばセチルアルコール、および、モノステアリン酸グリセロール、h)吸収剤、例えばカオリン、および、ベントナイト粘土、および、i)潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエ
チレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、および、それらの混合物が挙げられ、さらに(j)物理的な混合物中または固体分散体の形態の場合、溶解速度促進剤、例えば高分子量ポリエチレングリコール、または、ポリビニルピロリドンも挙げられる。カプセル、錠剤および丸剤の場合、その投薬形態は緩衝剤も含んでいてもよい。
本発明の一部として、様々なキットを組み立てることができる。キットは、特定の患者をBRAF阻害剤を用いた治療に対する耐性を生じさせる危険について評価するために、BRAF中の突然変異を分析する構成要素を含んでいてもよく、それにより、臨床医は、患者にとって代替の治療法が必要か否かを決定することができる。このようなキットは、突然変異を評価することができる試薬を含んでいてもよく、このような試薬としては、例えばBRAF阻害剤(例えばRAF−265)に対する耐性に関する表現型の出現と相関する突然変異を評価するためのプライマーセットが挙げられる。例えば、配列番号1の全部または一部に相補的な、または、それと同一のプライマー(またはプライマー対)が、キットの一部であることも考えられる。好ましい実施態様において、このようなプライマーは、以下に示す1種またはそれより多くのアミノ酸残基:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、K483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748に突然変異を含む突然変異型BRAFポリペプチドをコードする核酸分子を特異的に検出または増幅するのに用いることができる。代表的な実施態様において、このようなプライマーは、以下に示す1種またはそれより多くの突然変異:A29V、H72N、S113I、S124F
、P162H、C194*、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、K483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657*、S683R、P686Q、P686T、C696*、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを含むBRAFポリペプチドをコードする核酸分子を、特異的に検出または増幅する。その他の実施態様において、本キットは、BRAFポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を増幅するために、配列番号1の全部または一部に相補的または同一なプライマーを使用するための説明書を含む。
、RAF−265である。
公開された方法の改変法によって突然変異させたライブラリーを作製した。簡単に言えば、MutS、MutD5−およびMutT−DNA修復遺伝子が欠失したE.coli(XL1−レッド;ストラタジーン(Stratagene))中でBRAF(V600E)発現プラスミド(pWZL−Blast−BRAF(V600E))を増殖させることにより変異誘発を行った。これらの細菌からプラスミドDNAを抽出し、XL1−ブルーE.coli(ストラタジーン)中で増幅した。突然変異BRAF(V600E)プラスミドまたは非突然変異コントロールを用いて、A375黒色腫細胞に感染させた。ブラスチシジンで選択した後、細胞を15cmの培養皿で平板培養し、耐性クローンが出現するまで、RAF阻害剤(RAF265またはPLX4720;それぞれ2μMまたは1.5μM)の存在下で5週間培養した。耐性クローンを配列解析して、高い頻度で出現した突然変異を同定した。図5と図6に結果を示す(図5:RAF265のスクリーニング、および、図6:PLX4720のスクリーニング)。図7は、両方のスクリーニングにおいて高い頻度で発生した3種のBRAF突然変異の位置を示す。
293T細胞をそれぞれ推定上の耐性対立遺伝子に関するBRAFを含むpWZL(BLAST)(6μg)でトランスフェクションし、その後様々な濃度のBRAF(V600E)阻害剤PLX4720(0、0.08、0.4、2、5および10μM)で16時間処理した。標準的手法を用いて免疫ブロット実験を行った。簡単に言えば、処理された細胞をプロテアーゼ阻害剤(ロシュ(Roche))、NaFおよびNaVO3(それぞれ1
mM)を含むTNN緩衝液で溶解させた。溶解産物を定量し(ブラッドフォード分析)、変性させ(95oC)、および、SDSゲル電気泳動で分解した。タンパク質をニトロセルロースメンブレンに移し、BRAFを認識する一次抗体(サンタクルーズ(SantaCruz);1:10,000の希釈液)、p−ERK1/2、p−MEK1/2(Ser−217/221)、および、α−チューブリン(セル・シグナリング・テクノロジー(CellSignalingTechnology);1:1,000の希釈液)で検査した。適切な二次抗体(抗ウサギまたは抗マウスIgG、HRP結合型;1:1,000の希釈液、セル・シグナリング・テクノロジー)とインキュベートした後、タンパク質を化学発光(ピアース(Pierce)を用いて検出した。図8に結果を示す。そこで示したように、BRAF−V600E、BRAF−V600E−T521K、および、BRAF V600E−P686Qを含む細胞において、リン酸化MEK1/2およびERK
1/2のレベルは増加した。リン酸化MEK1/2およびERK1/2の増加は、PLX4720の濃度を増加させるにつれて、BRAF−V600E−T521KおよびBRAF V600E−P686Q細胞において持続した。
293T細胞(70%のコンフルエント)を推定上の耐性対立遺伝子であるBRAF(V600E)を含むpc−DNA−DEST40、キナーゼ欠損BRAFまたは野生型(15μg)でトランスフェクションした。トランスフェクション後48時間で、標準的な方法によって溶解産物を作製した。1mgの全細胞抽出物を、コバルトビーズを用いて4
℃で30分間沈殿させた。タンパク質が結合したコバルトビーズを、20μLのATP/マグネシウム混合物(20mMのMops(pH7.2)、25mMのβ−グリセロリン酸塩、5mMのEGTA、1mMのNa3VO4、1mMのDTT、75mMのMgCl2、および、0.5mMATP)、20μLの希釈緩衝液(20mMのMops、pH7.2、25mMのβ−グリセロールリン酸塩、5mMのEGTA、1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム、1mMのDTT)、および、1μgの不活性なMEK1(ミリポア(Millipore)から入手)と共に30℃で30分間インキュベートした。p−MEK1/2
抗体(セル・シグナリング・テクノロジー)を用いた免疫染色によってリン酸化MEK1生成物を検出した。
本明細書において特定の実施例および実施態様のみを参照しながら本発明を説明した。しかしながら可能な全ての本発明の実施例および実施態様を徹底的に説明する努力がなされた訳ではない。実際に、当業者であれば、以下の請求項で述べられる本発明の目的とする本質および範囲から逸脱することなく上述の実施例および実施態様に様々な付け足し、省略、改変などの変化を施すことができると予想される。このような全ての付け足し、省略、改変などの変化は、以下の請求項の範囲内に含まれるものとする。
Claims (33)
- BRAF活性を有する突然変異型BRAFポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、前記突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチド(配列番号2)またはBRAF V600Eポリペプチド(配列番号4)と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、該少なくとも1つのアミノ酸置換は、突然変異型BRAFポリペプチドに、1種またはそれより多くのBRAF阻害剤に対する耐性を付与し、
前記少なくとも1つのアミノ酸置換は、A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194*、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、K483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657*、S683R、P686Q、P686T、C696*、L697I、P722T、F738L、および、C748Fからなる群より選択される、上記核酸分子。 - 前記突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチドまたはBRAF V600Eポリペプチドと比較して、1〜5個のアミノ酸置換を有する、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチドまたはBRAF V600Eポリペプチドと比較して、1個のアミノ酸置換を有する、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記突然変異型BRAFポリペプチドは、1またはそれより多くのアミノ酸位置T521K、V528F、または、P686Qに置換を含むBRAFポリペプチドである、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記BRAF阻害剤は、RAF−265またはPLX4720である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項6に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項7に記載の宿主細胞によって突然変異型BRAFポリペプチドが生産されるように、該細胞を培養することを含む、突然変異型BRAFポリペプチドの製造方法。
- BRAF活性を有する単離された突然変異型BRAFポリペプチドであって、ここで前記突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチド(配列番号2)またはBRAF V600Eポリペプチド(配列番号4)と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、該少なくとも1つのアミノ酸置換は、突然変異型BRAFポリペプチドに、1種またはそれより多くのBRAF阻害剤に対する耐性を付与し、
前記少なくとも1つのアミノ酸置換は、A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194*、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、K483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657*、S683R、P686Q、P686T、C696*、L697I、P722T、F738L、および、C748Fからなる群より選択される、上記ポリペプチド。 - 野生型BRAFポリペプチドまたはBRAF V600Eポリペプチドと比較して、1〜5個のアミノ酸置換を有する、請求項9に記載の突然変異型BRAFポリペプチド。
- 野生型BRAFポリペプチドまたはBRAF V600Eポリペプチドと比較して、1個のアミノ酸置換を有する、請求項9に記載の突然変異型BRAFポリペプチド。
- 前記BRAF阻害剤がRAF−265である、請求項9〜11のいずれか一項に記載の突然変異型BRAFポリペプチド。
- 癌治療において有用な化合物の同定方法であって、該方法は:
(a)請求項9に記載の突然変異型BRAFポリペプチドおよびBRAF基質を含む分析組成物を提供すること;
(b)試験化合物の非存在下でBRAF基質のリン酸化を可能にする条件下で、分析組成物を試験化合物と接触させること;および
(c)BRAF基質のリン酸化に対する試験化合物の作用を決定すること;
を含み、ここで適切なコントロールと比較してBRAF基質のリン酸化がダウンレギュレーションされていれば、その化合物は癌治療において有用な化合物として同定される、上記方法。 - 前記BRAF基質がMEK1またはMEK2である、請求項13に記載の方法。
- 前記MEK1またはMEK2のリン酸化は、リン酸特異的MEK抗体を用いて決定される、請求項14に記載の方法。
- 前記MEK1またはMEK2のリン酸化は、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)のリン酸化を測定することによって決定される、請求項14に記載の方法。
- 前記分析組成物は、細胞抽出物である、請求項13に記載の方法。
- 癌治療において有用な化合物の同定方法であって、該方法は:
a)請求項9に記載の突然変異型BRAFポリペプチドを含む細胞を提供すること;
b)該細胞を試験化合物と接触させること;および、
c)BRAF基質のリン酸化に対する試験化合物の作用または細胞増殖に対する試験化合物の作用を決定すること;
を含み、ここで適切なコントロールと比較してBRAF基質のリン酸化がダウンレギュレーションされているかまたは細胞増殖が減少していれば、その化合物は癌治療において有用な化合物として同定される、上記方法。 - 前記BRAF基質は、MEK1またはMEK2である、請求項18に記載の方法。
- 試験化合物を第二世代のBRAF阻害剤として同定するための細胞ベースのスクリーニング方法であって、該方法は、請求項7に記載の宿主細胞を試験化合物と接触させることを含み、ここで試験化合物に対する宿主細胞の感受性が、第二世代のBRAF阻害剤としての化合物を同定する、上記方法。
- 前記試験化合物に対する宿主細胞の感受性は、細胞増殖分析、細胞の生存の分析およびMEKリン酸化分析からなる群より選択される分析を用いて測定され、ここで試験化合物の存在下において細胞増殖、細胞の生存、またはMEKリン酸化における減少がみられた場合、その化合物は第二世代のBRAF阻害剤として同定される、請求項20に記載の方法。
- 第二世代のBRAF阻害剤の同定方法であって、該方法は:
a)請求項1に記載の突然変異型BRAFポリペプチドの三次元結晶または溶液構造を用いたコンピューター支援モデリングによって候補薬を選択すること、
ここで前記突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチドまたはBRAF V600Eポリペプチドと比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ここで上記少なくとも1つのアミノ酸置換は、突然変異型BRAFポリペプチドに、1種またはそれより多くのBRAF阻害剤に対する耐性を付与する;
b)前記候補薬を突然変異型BRAFポリペプチドと接触させること;および、
c)前記候補薬と突然変異型BRAFポリペプチドとの相互作用を検出すること;
を含み、ここで突然変異型BRAFポリペプチドと相互作用することができる化合物が、第二世代のBRAF阻害剤として同定される、上記方法。 - 前記試験化合物は、化合物ライブラリーに含まれる化合物である、請求項13〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 癌を有する被験者を、RAF阻害剤での治療に耐性を付与するBRAF突然変異に関してインビトロでスクリーニングする方法であって、該方法は、
被験者から得られた癌細胞を含むサンプル中で野生型BRAFポリペプチド(配列番号1)またはBRAF V600Eポリペプチドをコードする核酸分子(配列番号3)と比べて1種またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドをコードする核酸分子を同定すること、
ここで該突然変異は、A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194*、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、K483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657*、S683R、P686Q、P686T、C696*、L697I、P722T、F738L、および、C748Fからなる群より選択されるBRAFポリペプチド中の1またはそれより多くのアミノ酸をコードする位置で起こる、
を含み、ここで癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在する場合、その被験者は、RAF阻害剤での治療に対して耐性を有すると同定される、上記方法。 - 癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在する場合、その被験者は、第一世代のBRAF阻害剤での治療中に、再発を起こす比較的高い危険を有すると同定される、請求項24に記載の方法。
- 癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在する場合、その被験者は、第一世代のBRAF阻害剤での治療に対して反応しないと同定される、請求項24に記載の方法。
- 前記第一世代のBRAF阻害剤は、RAF−265である、請求項25または26に記載の方法。
- 癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在する場合、その被験者は、MEK阻害剤または第二世代のBRAF阻害剤での治療に層別化される、請求項24に記載の方法。
- 前記癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在するかどうかは、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子の配列を決定することを含む方法によって決定される、請求項24〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在するかどうかは、A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、K483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される位置に突然変異を含むBRAFポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、前記核酸分子によってコードされたポリペプチドを検出することによって決定される、請求項24〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記MEK阻害剤は、CI−1040、AZD6244、PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119、6−メトキシ−7−(3−モルホリン−4−イル−プロポキシ)−4−(4−フェノキシ−フェニルアミノ)−キノリン−3−カルボニトリル、および4−[3−クロロ−4−(1−メチル−1H−イミダゾール−2−イルスルファニル)−フェニルアミノ]−6−メトキシ−7−(3−モルホリン−4−イル−プロポキシ)−キノリン−3−カルボニトリルからなる群より選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記癌は、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、転移性癌、肉腫、腺腫、神経系癌、および、尿生殖器癌からなる群より選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記癌は、黒色腫である、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
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