KR20120123141A - Ｂｒａｆ 억제제들에 저항성을 부여하는 ｂｒａｆ 돌연변이 - Google Patents

Ｂｒａｆ 억제제들에 저항성을 부여하는 ｂｒａｆ 돌연변이 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항암제, 특히 BRAF 억제제를 이용한 치료에 저항성과 관련된 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다. 특히 구체예들에서, 이 발명은 BRAF 억제제에 저항성을 부여하는 BRAF 서열내 돌연변이에 관한 것이다. BRAF 서열내 이러한 돌연변이의 확인으로 차세대 BRAF 억제제들을 확인 및 기획할 수 있다. 시료 안에 돌연변이 BRAF 서열의 존재를 탐지하는 방법 및 키트가 또한 제공된다.

Description

ＢＲＡＦ 억제제들에 저항성을 부여하는 ＢＲＡＦ 돌연변이{BRAF MUTATIONS CONFERRING RESISTANCE TO BRAF INHIBITORS}
관련 출원들
본 출원은 2010년 2월 25일자 제출된 USSN 61/308,275에 우선권을 주장한다. 본 출원의 내용은 여기에 참고자료로 통합된다.
정부 지원
본 발명은 National Institutes of Health에서 수여하는 Grant No. K08 CA115927에 의해 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 보유한다.
암 치료는 현대 의학에서 가장 큰 도전중에 하나다. 화학요법제는 암과 관련된 증상을 치료하거나 감소시키는 일반적으로 효과적인 수단이지만, 일부 경우들에서는 치료 과정동안 하나 이상의 화학요법제에 대한 저항성이 명백하다. 그 결과, 주어진 화학요법제가 특정 개인들에게는 효과가 없을 수 있다. 다양한 유형의 암에서 저항성 발달을 담당하는 분자 기전에 대해서는 잘 모른다. 특정 물질들에 대한 저항성의 근거가 되는 기전의 설명이 약물 저항성을 효과적으로 극복하는 치료 방법들을 개발하는데 필수적이다.
발명의 요약
본 발명은 암의 화학요법적 치료에 대한 돌연변이-중개된 저항성에 관계한다. 특정 구체예들에서, 본 발명은 RAF 폴리펩티드 (가령, BRAF 폴리펩티드)에서 그리고 RAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자에서 확인된 돌연변이에 관계한다. 이들 돌연변이는 치료 용도에서 현재 RAF 억제제들에 대해 저항성을 부여한다. 하나 이상의 돌연변이, 가령, 여기에서 설명된 돌연변이를 보유하는 RAF 폴리펩티드에 대항하는 활성을 나타내는 차세대 RAF 억제제들의 개발이 가능하다. 이러한 차세대 RAF 억제제들은 암 치료를 포함하는 많은 임상적 그리고 치료 용도에 유용하다.
따라서, 이 발명은 제 1 측면에서, BRAF 활성을 보유한 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 단리된 핵산 분자를 특징으로 하며, 여기에서 전술한 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드 (서열 번호: 2) 또는 BRAF V600E 폴리펩티드 (서열 번호:4)와 비교하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 보유한 아미노산 서열을 포함하며, 최소한 하나의 아미노산 치환은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에서 하나 이상의 BRAF 억제제들에 대해 저항성을 부여한다. 이 측면의 특정 구체예들에서, 최소한 하나의 아미노산 치환은 다음의 아미노산 위치중 하나 이상에서 일어난다: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 그리고 C748. 예시적인 구체예들에서, 최소한 하나의 아미노산 치환은 다음중 하나 이상이다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F.
전술한 측면의 한 구체예에서, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드 또는 BRAF V600E 폴리펩티드와 비교하여 1 내지 5개 아미노산 치환을 보유한다. 예시적인 구체예들에서, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 한 개의 아미노산 치환을 보유한다. 또다른 예시적인 구체예에서, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 서열 번호:2 또는 서열 번호:4: V528, T521, 및/또는 P686의 아미노산 위치중 하나 이상에서의 치환을 포함하는 BRAF이다. 전술한 측면들의 일부 구체예들에서, BRAF 억제제는 RAF-265이다.
돌연변이 RAF 폴리펩티드를 인코드하는 단리된 핵산 분자들은 발현 벡터내로 삽입되고, 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 따라서, 또다른 측면에서, 이 발명은 여기에서 제시한 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 특징으로 한다. 또다른 측면에서, 이 발명은 전술한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 특징으로 한다. 또다른 측면에서, 이 발명은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 만드는 방법을 특징으로 하는데, 이 방법은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 발현 벡터를 보유한 숙주 세포를 배양하여, 이 세포에 의해 돌연변이 BRAF 폴리펩티드가 생산되는 것을 포함한다.
다른 구체예들에서, 이 발명은 단리된 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 특징으로 하며, 여기에서 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드 (서열 번호: 2) 또는 BRAF V600E 폴리펩티드 (서열 번호:4)와 비교하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 보유하는 아미노산 서열을 포함하고, 최소한 하나의 아미노산 치환은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에서 하나 이상의 BRAF 억제제들에 대해 저항성을 부여한다. 바람직한 구체예들에서, 단리된 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드의 활성을 보유한다. 전술한 측면의 한 구체예에서, 최소한 하나의 아미노산 치환은 다음에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에서 일어난다: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748. 예시적인 구체예들에서, 최소한 하나의 아미노산 치환은 다음으로부터 선택된다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F. 일부 구체예들에서, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드 또는 BRAF V600E 폴리펩티드와 비교하여 1 내지 5개의 아미노산 치환을 보유한다. 예시적인 구체예들에서, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드와 비교하여 한 개의 아미노산 치환을 보유한다. 전술한 측면의 다른 예시적인 구체예들에서, BRAF 억제제는 RAF-265이다.
또다른 측면에서, 이 발명은 암을 치료하는데 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 하는데, 이 방법은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드와 BRAF 기질을 포함하는 분석 조성물을 제공하고, 테스트 화합물 없이 BRAF 기질의 포스포릴화를 허용하는 조건하에서 이 분석 조성물에 테스트 화합물을 접촉시키고, 그리고 BRAF 기질의 포스포릴화에 이 화합물의 효과를 측정하는 것을 포함하며, 여기에서 적합한 대조군과 비교하여 BRAF 기질의 포스포릴화의 하향조절은 이 화합물이 암 치료에 유용한 화합물이라는 것으로 확인된다. 일부 구체예들에서, 분석 조성물은 세포 추출물이다.
또다른 측면에서, 이 발명은 차세대 BRAF 억제제로써의 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드 및 BRAF 기질을 포함하는 분석 조성물을 제공하고, 이 분석 조성물을 테스트 화합물이 없는 상태에서 BRAF 기질의 포스포릴화를 허용하는 조건하에서 테스트화합물에 접촉시키고, 그리고 BRAF 기질의 포스포릴화에 있어서 화합물의 효과를 판단하고, 여기에서 적합한 대조군과 비교하여 BRAF 기질의 포스포릴화의 하향조정은 이 화합물이 차세대 BRAF 억제제로 확인되는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 이 분석 조성물은 세포 추출물이다.
또다른 측면에서, 이 발명은 암 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 하는데, 이 방법은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공하고, 이 세포에 테스트 화합물을 접촉시키고, 그리고 BRAF 기질의 포스포릴화에 있어서 이 화합물의 효과를 측정하는 것을 포함하며, 여기에서 적합한 대조군과 비교하여 BRAF 기질의 포스포릴화의 하향조정은 암 치료에 이 화합물이 유용함을 확인시킨다.
또다른 측면에서, 이 발명은 차세대 BRAF 억제제인 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 하는데, 이 방법은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공하고, 이 세포에 테스트 화합물을 접촉시키고, 그리고 BRAF 기질의 포스포릴화에 있어서 이 화합물의 효과를 측정하는 것을 포함하며, 여기에서 적합한 대조군과 비교하여 BRAF 기질의 포스포릴화의 하향조정은 이 화합물이 차세대 BRAF 억제제임을 확인시킨다.
전술한 측면들의 한 구체예에서, BRAF 기질은 MEK1 또는 MEK2이다. 예시적인 구체예에서, MEK1 또는 MEK2의 포스포릴화는 포스포-특이적(phospho-specific) MEK 항체를 이용하여 측정한다. 또다른 예시적인 구체예에서, MEK1 또는 MEK2의 포스포릴화는 미엘린 염기성 단백질 (MBP)의 포스포릴화를 측정함으로써 측정된다. 또다른 예시적인 구체예에서, MEK1 또는 MEK2의 포스포릴화는 ERK1 또는 ERK2의 포스포릴화를 측정함으로써 결정된다.
또다른 측면에서, 이 발명은 암 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 하는데, 이 방법은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공하고, 이 세포에 테스트 화합물을 접촉시키고, 그리고 BRAF 기질의 포스포릴화에 있어서 이 화합물의 효과를 측정하는 것을 포함하며, 여기에서 적합한 대조군과 비교하여 세포 증식의 감소는 이 화합물이 암 치료에 유용한 화합물임을 확인시킨다.
또다른 측면에서, 이 발명은 차세대 BRAF 억제제인 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 하는데, 이 방법은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공하고, 이 세포에 테스트 화합물을 접촉시키고, 그리고 세포 증식에 있어서 이 화합물의 효과를 판단하는 것을 포함하며, 여기에서 적합한 대조군과 비교하여 세포 증식의 감소는 이 화합물이 차세대 BRAF 억제제임을 확인시킨다.
또다른 측면에서, 이 발명은 테스트 화합물이 차세대 BRAF 억제제인지를 확인하기 위한 세포-기본 스크리닝 방법을 특징으로 하는데, 이 방법은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포에 테스트 화합물을 접촉시키는 것을 포함하며, 여기에서 적합한 대조군과 비교하여 테스트 화합물에 대한 숙주 세포의 감응성(sensitivity)은 이 화합물이 차세대 BRAF 억제제임을 확인시켜준다. 한 구체예에서, 이 테스트 화합물에 대한 숙주 세포의 감응성은 세포 증식 분석, 세포 생존력 분석, 그리고 MEK 포스포릴화 분석으로 구성된 군으로부터 선택된 분석을 이용하여 측정하고, 여기에서 테스트 화합물 존재하에서 세포 증식, 세포 생존력, 또는 MEK 포스포릴화의 감소는 이 화합물이 차세대 BRAF 억제제임을 확인시켜준다.
또다른 측면에서, 이 발명은 차세대 BRAF 억제제를 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 3차원 결정 또는 용액 구조를 가진 컴퓨터-지원된 모델링을 이용하여 가망(potential) 약물을 선택하고, 여기에서 전술한 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드 또는 BRAF V600E 폴리펩티드와 비교하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 보유한 아미노산 서열을 포함하며, 최소한 하나의 아미노산 치환은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에서 하나 이상의 BRAF 억제제들에 대해 저항성을 부여하며;
전술한 가망 약물에 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 접촉시키고; 그리고
전술한 가망 약물과 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 상호작용을 탐지하는 것을 포함하고; 여기에서 돌연변이 BRAF 폴리펩티드와 상호작용할 수 있는 화합물은 차세대 BRAF 억제제로 확인된다. 한 구체예에서, 이 테스트 화합물은 화합물들의 라이브러리의 구성원이다.
또다른 측면에서, 이 발명은 암 치료에 유용한 차세대 BRAF 억제제 또는 화합물인 단리된 화합물을 특징으로 하며, 여기에서 이 화합물은 여기에서 설명된 방법에 따라 암 치료에 유용한 차세대 BRAF 억제제 또는 화합물로 확인된다.
또다른 측면에서, 이 발명은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 활성을 억제하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에 차세대 BRAF 억제제인 화합물을 접촉시키는 것을 포함한다. 전술한 측면의 바람직한 구체예들에서, 이 화합물은 야생형 BRAF 폴리펩티드 및/또는 BRAF V600E 폴리펩티드의 활성을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에 차세대 BRAF 억제제의 접촉은 시험관내에서 일어난다. 다른 구체예들에서, 이 접촉은 생체내에서 일어난다. 예시적인 구체예들에서, 이 접촉은 피험자, 예를 들면, 암을 가진 피험자에서 일어난다. 일부 구체예들에서, 이 피험자는 RAF-265을 이용한 치료에서 재발하였다. 예시적인 구체예들에서, 이 암은 흑색종이다.
또다른 측면에서, 이 발명은 피험자의 암 치료 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 피험자에게 차세대 BRAF 억제제인 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 이 암은 BRAF에 하나 이상의 돌연변이를 가지고 있으며, 여기에서 하나 이상의 돌연변이는 BRAF 폴리펩티드에 RAF-265에 저항성을 부여한다. 전술한 측면의 바람직한 구체예들에서, 이 화합물은 야생형 BRAF 폴리펩티드 및/또는 BRAF V600E 폴리펩티드의 활성을 더 억제한다. 일부 구체예들에서, 이 피험자는 RAF-265을 이용한 치료에서 재발하였다. 예시적인 구체예들에서, 이 암은 흑색종이다.
또다른 측면에서, 이 발명은 RAF 억제제를 이용한 치료에 저항성을 부여하는 BRAF 돌연변이에 대해 암을 가진 피험자를 스크리닝하는 방법을 특징으로 하는데, 이 방법은 이 피험자로부터 암 세포-함유된 시료를 수득하고, 그리고 이 시료에서 야생형 BRAF 폴리펩티드 (서열 번호:1) 또는 BRAF V600E 폴리펩티드 (서열 번호:3)를 인코드하는 핵산 분자에 대해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 확인하고, 돌연변이는 BRAF 폴리펩티드내 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 인코드하는 위치에서 발생되고, 여기에서 암 세포-함유된 시료내에서 이 핵산 분자의 존재는 이 피험자가 RAF 억제제를 이용한 치료에 저항성임을 확인시킨다. 예시적인 구체예들에서, 이 핵산 분자는 야생형 BRAF 폴리펩티드 (서열 번호:2) 또는 BRAF V600E 폴리펩티드 (서열 번호:4)에 대해 A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 보유한 BRAF 폴리펩티드를 인코드한다. 일부 구체예들에서, 암 세포-함유된 시료 안에 이 핵산 분자의 존재는 이 피험자가 일세대(first generation) BRAF 억제제를 이용한 치료 과정 동안 상대적으로 높은 재발 위험을 보유한다는 것을 확인시킨다. 다른 구체예들에서, 암 세포-함유된 시료내에서 이 핵산 분자의 존재는 이 피험자가 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료에 비동조적임을 확인시킨다. 예시적인 구체예들에서, 일세대 BRAF 억제제는 RAF-265이다. 일부 구체예들에서, 암 세포-함유된 시료내에서 이 핵산 분자의 존재는 이 피험자를 차세대 BRAF 억제제를 이용한 치료로 특화시킨다. 예시적인 구체예들에서, 암 세포-함유된 시료내에서 이 핵산 분자의 존재는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자의 서열을 결정하는 것을 포함하는 방법에 의해 결정된다. 다른 구체예들에서, 암 세포-함유된 시료내에서 이 핵산 분자의 존재는 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 위치에 돌연변이를 보유한 BRAF 폴리펩티드를 특이적으로 인지하는 항체를 이용하여 핵산 분자에 의해 인코드된 폴리펩티드를 탐지함으로써 측정된다. 예시적인 구체예에서, 전술한 측면들에서 설명된 방법들은 하나 이상의 돌연변이 BRAF 돌연변이의 존재가 탐지된 피험자에게 차세대 BRAF 억제제를 투여하는 것을 더 포함한다.
도 1은 야생형 인간 BRAF의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:1)(NCBI 참고 서열 No.: NM_004333.4; gi 187608632)을 나타낸다.
도 2는 야생형 인간 BRAF의 폴리펩티드 서열 (서열 번호:2) (NCBI 참고 서열 No.: NP_004324.2; gi 33188459)을 나타낸다.
도 3은 인간 BRAF V600E의 뉴클레오티드 서열(서열 번호:3)을 나타낸다. 야생형 BRAF 서열에 대해 V600E 아미노산 치환을 설명하는 티미딘에서 아데노신으로의 전좌(transversion)는 밑줄로 표시되어 있다.
도 4는 인간 BRAF V600E의 폴리펩티드 서열 (서열 번호:4)을 나타낸다. 야생형 BRAF 서열에 대한 V600E 치환은 밑줄로 표시되어 있다.
도 5는 RAF265 선별후 BRAF 돌연변이적 상황을 나타낸다. 고빈도 돌연변이의 결과로 발생된 아미노산 치환들을 나타낸다.
도 6은 PLX4720 선별후 BRAF 돌연변이적 상황을 나타낸다. 고빈도 돌연변이의 결과로 발생된 아미노산 치환들을 나타낸다.
도 7은 RAF265 및 PLX4720 스크린에 공통적인 3가지 아미노산 치환의 구조적 위치를 나타낸다.
도 8은 BRAF-야생형, BRAF-V600E, BRAF-V600E-T521K, BRAF-V600E-V528F, 또는 BRAF-V600E-P686Q을 함유하는 세포에서 PLX4720의 농도를 증가시키는 치료 후 BRAF, p-MEK1/2 및 p-ERK1/2 수준의 면역블랏 연구 결과를 나타낸다.
I. BRAF 생물학적 활성
RAF 단백질 패밀리는 3가지 구성요소를 담고있다: BRAF, ARAF, 및 CRAF (RAF-1로도 알려짐). 각 RAF 단백질은 아미노-말단 조절 도메인, 활성화 루프(activation loop), 그리고 C-말단 키나제 도메인을 포함한다. RA의 조절은 조절 및 촉매 도메인들의 포스포릴화와 관련된다. 일단 활성화되면, RAF 분자들은 포스포릴화에 의해 하류 신호발생 분자들을 활성화시킬 수 있는 세린/트레오닌 키나제로 기능한다.
RAF는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 신호발생 경로와의 연합에 의한 세포 증식을 촉진시키는데 연루된다. 특히, RAF 단백질들은 Ras-매개된 신호발생의 주요 효과물질들이다. 활성화된 Ras는 RAF와 직접적으로 상호작용하고 그리고 세포질로부터 RAF를 세포 막으로 모집시킨다. 세포 막으로 전치(translocation)할 때, Ras-결합된 RAF는 일련의 포스포릴화 과정과 형태학적 변화를 겪고 이는 RAF 세린/트레오닌 키나제 활성을 활성화시킨다. RAF는 인터페론 베타, 단백질 키나제 C (PKC) 알파, 항-아팝토시스성 단백질들 가령 Bcl-2, 다양한 골격(scaffolding) 단백질들, 자외선 광, 전리 방사, 레티노이드, 에리트로포에틴, 그리고 RAF 이소폼간의 이량체화가 관련된 Ras-독립적 경로를 통하여 또한 활성화될 수 있다.
일단 활성화되면, RAF는 키나제 MEK1 및 MEK2의 포스포릴화에 의해 하류 신호발생을 중개하고, 이 키나제들은 RAF에 의해 인지될 수 있는 프롤린-풍부한 서열을 포함한다. BRAF는 ARAF 또는 RAF-1 보다는 MEK1 및 MEK2의 훨씬 더 강력한 활성물질이다. 다시 MEK1 및 MEK2는 ERK1 및 ERK2를 포스포릴화시키고 활성화시키며, 그 다음 핵으로 전좌된다. 핵 ERK1 및 ERK2는 Elk-1, Fos, Jun, AP-1 및 Myc와 같은 전사 인자들을 활성화시키고, 궁극적으로 세포 증식, 역분화 및 생존에 관련된 유전자, 예를 들면, cyclin D1, cyclin E, 및 cdc 활성제 25 포스포타제를 포함하는 유전자의 전사를 유도한다.
RAF에서 활성화된 돌연변이의 존재로 인하여 또는 Ras를 통한 이상(aberrant) 신호발생으로 인하여 RAF 신호발생의 상향조절은 전술한 신호 캐스캐이드의 활성화를 통한 종양 형성을 촉진시키고, 이는 세포 증식의 증가 및 생존을 초래한다. RAF 폴리펩티드의 돌연변이 활성화, 특히 BRAF에서 활성화는 고빈도의 인간 암들과 관련되었다. 이러한 BRAF 돌연변이중 하나는 티미딘에서 아데노신으로 단일 전좌이며, 이는 아미노산 600에서 발린을 글루탐산으로 전환시킨다. 흑색종 경우의 대략 2/3는 종양형성 BRAF V600E 돌연변이가 잠복해 있고, 이는 MAPK 신호발생의 활성화를 통하여 멜라닌세포 변형에 기여한다 결장, 난소, 및 갑상선 암을 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 다양한 유형의 다른 암들도 유사하게 BRAF V600E 돌연변이를 숨기고 있다. 따라서, RAF의 표적화 그리고, 특히, BRAF V600E의 표적화는 암 치료법으로 유망한 접근법이다. BRAF는 이의 MEK1 및 MEK2 기질들에 대해 나타내는 높은 수준의 특이성 때문에 치료법에 대해 매력적인 표적이다. 몇 가지 BRAF 억제제들은 현재 임상 개발 단계에 있다. 이러한 억제제중 하나가 화합물 RAF-265이며, 이는 RAF의 세 가지 이소폼 모두에 대해 효과적일 뿐만 아니라 BRAF V600E에 대해서도 유효하다. RAF-265는 임상에서 유망한 것으로 나타났으며, 이는 RAF 표적화가 실행가능한 암 치료방법임을 암시한다.
여기에서 호환되어 사용되는 것과 같이, 용어들 "RAF 활성", "RAF 생물학적 활성" 및 "RAF의 기능적 활성"은 표준 기술들에 따라 시험관 또는 생체내에서 측정하였을 때 RAF-응답 세포 또는 조직, 가령, 암 세포 또는 암에서, 또는 RAF 표적 분자상에서 RAF 단백질, 가령 BRAF에 의해 발휘되는 활성들을 포함한다. RAF 활성은 RAF 표적 분자 가령, MEK1 또는 MEK2, 또는 RAF 기질, 가령, MEK1 또는 MEK2의 포스포릴화와 연합된 직접적인 활성일 수 있다. 대안으로, RAF 활성은 RAF 단백질과 RAF 표적 분자, 가령, MEK1 또는 MEK2의 상호작용에 의해 매개되는 하류 생물학적 사건들과 같은 간접적 활성일 수 있다. RAF는 MEK1 및 MEK2가 관련된 신호 변환 경로에 있기 때문에, 이러한 하류 생물학적 사건들은 예를 들면, MBP의 포스포릴화, ERK1 또는 ERK2의 포스포릴화, ERK1 또는 ERK2 표적 유전자들의 조절에 있어서 변화들 그리고, 세포 증식 또는 생존력에서 변경을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
II . BRAF 저항 돌연변이
RAF 억제제들, 가령, BRAF 억제제들을 이용한 암 치료가 전도유망한 치료 방법이기는 하지만, 이러한 치료를 받은 환자들은 재발하거나 또는 반응하지 않을 수 있고, 그 결과 환자의 질환은 진행된다. 여기에서 설명된 것과 같이, 본 발명은 현재 임상 개발에 있는 RAF 억제제들에 저항성을 부여하는 BRAF내에 돌연변이의 발견과 관계한다. 암 세포들에서 이러한 돌연변이의 획득으로 인하여 환자들은 특정 RAF 억제제들을 이용한 치료에 저항성을 가지도록 만든다. 예시적인 구체예들에서, 이 발명은 RAF 억제제 RAF-265에 대한 저항성 개발과 관련된다.
(A) RAF 억제제들에게 저항성을 부여하는 BRAF 돌연변이의 확인
다양한 구체예들에서, 본 발명은 RAF 활성을 억제하는 약물에게 BRAF 폴리펩티드 저항성을 부여하는 BRAF 폴리펩티드내 돌연변이, 또는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자내 돌연변이를 확인하는 방법들에 관한 것이다. 여기에서 언급된 "돌연변이 BRAF 폴리펩티드"는 하나 이상의 공지의 BRAF 억제제들에 대해 저항성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 담고 있는 BRAF 폴리펩티드를 포함한다. BRAF 억제제에 대해 저항성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이에 추가로, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 V600E 치환을 포함할 수 있다. 야생형 BRAF 폴리펩티드 서열에 대해 임의의 기타 돌연변이 없이 오직 V600E 돌연변이만을 담고 있는 BRAF 폴리펩티드는 여기에서 정의된 "돌연변이 BRAF 폴리펩티드"로 간주하지 않는다. 여기에서 언급된 "돌연변이 BRAF 핵산 분자"는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 하나 이상의 돌연변이를 담고 있는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자들은 당업계에 공지되어 임의의 적절한 방법을 이용하여 만들 수 있는데, 예를 들면, 야생형 BRAF 핵산 서열 또는 BRAF V600E 핵산 서열의 랜덤 돌연변이생성 또는 부위-지정된 돌연변이생성을 포함하며, 이는 대장균에서 실행할 수 있다. 예시적인 구체예들에서, 야생형 BRAF 핵산 서열은 인간 야생형 BRAF 핵산 서열 (서열 번호:1)이며, 그리고 BRAF V600E 핵산 서열은 인간 BRAF V600E 핵산 서열 (서열 번호:3)이다. 돌연변이 BRAF 핵산 분자들은 그 다음 BRAF 억제제를 이용한 치료에 감응성인 세포에서 스크리닝되어 BRAF 억제제를 이용한 치료에 저항성인 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산을 확인할 수 있다.
다수의 적합한 방법들을 이용하여 RAF 억제제 가령, RAF-265를 이용한 치료에 저항성인 돌연변이 BRAF 핵산 및 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 스크리닝할 수 있다. 모든 경우들에서, RAF 억제제를 이용한 치료에 저항성인 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 RAF 억제제 존재하에 야생형 BRAF 폴리펩티드 또는 BRAF V600E 폴리펩티드가 나타내는 활성보다는 RAF 억제제 존재하에 더 큰 BRAF 활성을 나타낸다. 한 가지 예시적인 방법에서, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자는 RAF 억제제를 이용한 치료에 감응성인 세포들에서 발현될 수 있다. 본 목적에 유용한 예시적인 세포계는 흑색종 세포계 A375이다. 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 발현 후, 이 세포들은 RAF 억제제로 처리될 수 있다. 그 다음 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 활성을 측정하고, 그리고 유사하게 발현되고 RAF 억제제로 처리된 야생형 BRAF 폴리펩티드 (또는 BRAF V600E 폴리펩티드)의 활성과 비교할 수 있다.
BRAF 폴리펩티드의 활성은 BRAF 억제제로 치료한 후 세포의 증식 또는 생존력을 측정하여 결정할 수 있고, 여기에서 증식 또는 생존력은 BRAF 활성과 양성적 관계에 있다. 세포 성장, 증식, 또는 생존력은 당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 한 구체예에서, 세포 성장은 MTS 또는 Cell Titer GLo와 같은 잘 근거된 세포 증식/생존력 분석을 이용하여 측정할 수 있고, 이때 RAF 억제제 존재하에 세포 성장은 RAF 억제제 없이 배양된 처리안된 세포들에서 관찰되는 비율로 나타낸다. 특정 구체예들에서, 저항은 적합한 대조군에 대해 GI50 값에서 최소한 2배, 좀더 바람직하게는 최소한 3배, 가장 바람직하게는 4-5배의 변화(shift)로 정의된다. 다른 구체예들에서, 저항은 ~1μM의 GI50 값으로 정의된다. BRAF 폴리펩티드의 활성은 BRAF 억제제로 치료후 세포에 존재하는 포스포릴화된 MEK1/2 또는 ERK1/2의 상대적인 양을 측정함으로써 또한 결정될 수 있다. 야생형 또는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 활성은 시험관내 포스포릴화 분석을 이용하여 또한 측정될 수 있는데, 이때 BRAF 활성은 BRAF 억제제로 치료후 포스포릴화된 MEK1/2 또는 ERK1/2의 비율을 측정함으로써 결정된다. 상기에서 표시한 바와 같이, MEK1/2는 BRAF의 기질이며, ERK1/2는 MEK1/2의 기질로, BRAF 활성의 하류 지표로 작용한다. RAF 억제제를 이용한 치료 후 야생형 BRAF 폴리펩티드 또는 BRAF V600E 폴리펩티드가 보유한 활성보다 훨씬 큰 활성을 보유하는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 RAF 억제제에 대해 저항성을 부여하는 돌연변이를 가지는 것으로 확인된다. 그 다음 RAF 억제제에 대한 저항성을 부여하는 돌연변이는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산을 서열화함으로써, 또는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 직접 서열화함으로써 확인할 수 있다.
(B) RAF -265에 대해 저항성을 부여하는 BRAF 돌연변이
전술한 방식에서, 인간 BRAF 폴리펩티드에서 잔기들이 돌연변이 되었을 때 RAF 억제제 RAF-265에 대해 저항성을 부여하는 몇 가지 아미노산 잔기들이 확인되었다. 이들 아미노산 잔기들은 다음중 하나 이상을 포함한다: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748. 이 발명의 특정 구체예들에서, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 인간 BRAF 폴리펩티드 서열 (또는 BRAF V600E 폴리펩티드 서열)에 대해 이들 아미노산 잔기중 하나 이상에서 돌연변이를 가진다. 관련된 구체예들에서, 돌연변이 BRAF 핵산 분자들은 야생형 인간 BRAF 핵산 서열 (또는 BRAF V600E 폴리펩티드 서열)에 대해 이들 아미노산 잔기를 인코드하는 하나 이상의 뉴클레오티드중 하나 이상에서 돌연변이를 가진다. 예시적인 구체예들에서, 여기에서 특징적인 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 다음의 저항 돌연변이중 하나 이상을 가진다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F. 기타 예시적인 구체예들에서, 여기에서 특징적인 돌연변이 BRAF 핵산 분자들은 다음의 저항 돌연변이중 하나 이상을 포함하는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드한다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F.
본 발명의 돌연변이 BRAF 핵산 분자들과 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 여기에서 설명된 것에 추가하여 다른 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 아미노산 잔기들 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748에서 하나 이상의 돌연변이에 추가하여 다른 아미노산 잔기들 위치에 돌연변이를 포함할 수 있다. 모든 경우에서, 본 발명의 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 BRAF 활성을 보유하고, 본 발명의 돌연변이 BRAF 핵산 분자들은 BRAF 활성을 보유한 폴리펩티드를 인코드한다. 예시적인 구체예에서, 본 발명의 돌연변이 BRAF 분자는 아미노산 잔기들 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748에서 하나 이상의 돌연변이에 추가하여 아미노산 잔기 V600에서 돌연변이를 보유한다. 한 구체예에서, V600에서 돌연변이는 활성화 돌연변이, 예를 들면, V600E 돌연변이다. RAF 억제제 RAF-265는 V600E 활성화 돌연변이를 가지는 BRAF의 활성을 효과적으로 억제한다는 것을 보여주었다. 이 돌연변이는 대략 흑색종의 3/2를 포함한 종양에 높은 빈도로 존재한다. 여기에서 설명된 BRAF 저항 돌연변이는 BRAF-V600E 대립유전자에서 RAF-265와 같은 RAF 억제제들에게 저항성을 부여한다. 따라서, BRAF-V600E를 포함하는 종양을 가진 환자들은 다음 부위중 임의의 부위에서 제 2 BRAF 돌연변이를 획득하기 때문에 RAF-265와 같은 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료 과정 동안 재발 위험에 처한다: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748.
여기에서 설명된 것과 같이, BRAF 억제제들에 대해 저항성을 부여하는 BRAF내 돌연변이의 확인으로 하나 이상의 저항 돌연변이를 보유하는 BRAF 단백질의 억제에 유효한 "차세대 RAF 억제제"를 기획하고 스크리닝이 가능하다. 이러한 차세대 RAF 억제제들은 많은 임상 및 치료 분야, 예를 들면, 암의 치료에 유용하다. BRAF 폴리펩티드내 저항 돌연변이의 확인으로 암에서 하나 이상의 BRAF 저항 돌연변이의 존부를 결정하기 위하여 암에 걸린 환자들의 스크리닝 또한 가능하다. 암에서 하나 이상의 BRAF 저항 돌연변이의 존부 결정은 암 환자의 치료 전략을 변경시킨다. 예를 들면, 암에 걸린 환자로부터 암 세포를 포함하는 시료 안에 여기에서 설명된 하나 이상의 BRAF 저항 돌연변이의 확인을 이용하여 이 환자를 차세대 RAF 억제제를 이용한 치료로 특화시킬 수 있다. 유사하게, 암에 걸린 환자로부터 암 세포를 포함하는 시료 안에 여기에서 설명된 하나 이상의 BRAF 저항 돌연변이의 확인으로 이 환자를 MEK 억제제를 이용한 치료로 특화시킬 수 있다. BRAF 저항 돌연변이의 확인으로 특정 RAF 억제제를 이용한 치료에 반응이 없거나 재발 위험에 처한 환자들을 스크리닝하고 확인할 수 있다.
III . 차세대 BRAF 억제제들을 확인하는 방법들
BRAF 저항 돌연변이의 확인으로 "차세대 RAF 억제제들"의 개발 및/또는 확인이 가능하다. 여기에서 이용된 것과 같이, 차세대 RAF 억제제는 RAF 폴리펩티드, 가령, 여기에서 설명된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 BRAF 폴리펩티드의 활성을 유효하게 억제하는 물질이다. 차세대 RAF 억제제는 돌연변이 RAF 폴리펩티드에 추가하여 야생형 RAF 폴리펩티드의 활성을 억제하거나 억제하지 않을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 차세대 RAF 억제제는 BRAF V600E 폴리펩티드 (서열 번호:4)의 활성을 억제하고, 뿐만 아니라 BRAF V600E 폴리펩티드의 활성을 억제한다. 예시적인 구체예에서, 차세대 RAF 억제제는 다음 아미노산 잔기들 중 하나 이상에서 돌연변이를 보유하는 BRAF 폴리펩티드의 활성을 억제한다: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748.
따라서, 본 발명은 차세대 RAF 억제제로서의 테스트 화합물을 확인하는 방법들을 제공한다. 한 구체예에서, 화합물은 비-돌연변이 BRAF 폴리펩티드 (가령, 야생형 BRAF 폴리펩티드, 또는 BRAF V600E 폴리펩티드)에 대해 이 화합물의 존부하에서 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 관련 RAF 활성을 측정함으로써 차세대 RAF 억제제로 확인될 수 있다. 차세대 RAF 억제제인 화합물의 존재할 때, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 이 화합물이 없을 때보다 더 낮은 수준의 RAF 활성을 보유한다. 차세대 RAF 억제제가 아닌 화합물이 존재할 때, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 이 화합물이 없을 때와 등가의 또는 더 높은 수준의 RAF 활성을 보유한다. 특정 구체예들에서, RAF 활성은 재조합 BRAF 폴리펩티드를 이용하여 시험관 분석으로 측정할 수 있다. 다른 구체예들에서, RAF 활성은 BRAF 폴리펩티드를 발현시키는 배양된 세포 또는 실험 동물을 이용하여 생체내 분석에서 측정할 수 있다.
BRAF 활성의 임의의 지표는 한 화합물이 차세대 RAF 억제제인지 또는 아닌지를 판단하는데 적합하다. 예시적인 구체예에서, BRAF 활성은 RAF 기질 MEK1/2의 포스포릴화를 측정함으로써 결정하고, 여기에서 MEK1/2 포스포릴화의 감소는 RAF 활성의 감소를 나타낸다. 한 구체예에서, MEK1/2 포스포릴화는 세포 또는 세포 추출물에서 측정된다. 대체 구체예에서, MEK1/2 포스포릴화는 정제된 또는 재조합 단백질들을 이용하여 시험관내 포스포릴화 분석에서 측정한다. 당업계에 공지되어 있는 MEK1/2 포스포릴화를 탐지하는 방법들은 BRAF 폴리펩티드 또는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 활성의 지표로써 MEK1/2 포스포릴화를 측정하는데 적합하다. 이러한 방법들은 Western 블랏 및 질량 분석(mass spectroscopy)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예들에서, MEK1/2 포스포릴화 분석은 시험관에서 재조합 단백질들을 이용하여 실행할 수 있다. 다른 구체예들에서, MEK1/2 포스포릴화 분석은 생체내에서 배양된 세포 또는 실험 동물들을 이용하여 실행할 수 있다.
또다른 예시적인 구체예에서, BRAF 활성은 MEK 기질 ERK1/2의 포스포릴화를 측정함으로써 결정되며, 여기에서 ERK1/2 포스포릴화의 감소는 BRAF 활성의 감소를 나타낸다. 한 구체예에서, ERK1/2 포스포릴화는 세포 또는 세포 추출물에서 측정한다. 대체 구체예에서, ERK1/2 포스포릴화는 시험관에서 정제된 또는 재조합 단백질들을 이용한 포스포릴화 분석에서 측정한다. 당업계에 공지되어 있는 ERK1/2 포스포릴화를 탐지하는 방법들은 BRAF 폴리펩티드 또는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 활성의 지표로써 ERK1/2 포스포릴화를 측정하는데 적합하다. 이러한 방법들은 Western 블랏 및 질량 분석을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예들에서, ERK1/2 포스포릴화 분석은 시험관에서 재조합 단백질들을 이용하여 실행할 수 있다. 다른 구체예들에서, ERK1/2 포스포릴화 분석은 생체내에서 배양된 세포 또는 실험 동물들을 이용하여 실행할 수 있다.
한 구체예에서, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 발현시키는 숙주 세포를 차세대 RAF 억제제의 확인에 이용하며, 여기에서 테스트 화합물에 대한 숙주 세포의 감응성은 차세대 RAF 억제제로 이 테스트 화합물을 확인시킨다. 여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "테스트 화합물에 대한 숙주 세포의 감응성"이란 이 테스트 화합물이 세포 성장, 세포 증식, 세포 생존력 및/또는 세포내 신호 변환 (가령, 예를 들면, 하나 이상의 BRAF 기질, 가령 MEK1/2의 포스포릴화, 또는 하나 이상의 하류 신호발생 분자, 가령 ERK1/2의 포스포릴화로 증명되는 것과 같이 BRAF에 의해 매개된 신호 변환)을 포함하는 하나 이상의 매개변수상의 측정가능한 효과를 보유한다는 것을 의미한다.
한 화합물은 이 화합물의 존부하에 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 발현시키는 세포의 생존력 또는 증식율을 결정함으로써 차세대 RAF 억제제임을 확인할 수 있다. 이러한 분석에 이용되는 세포계는 이 세포계가 야생형 BRAF 폴리펩티드를 발현할 때 RAF 억제제에 감응성이어야 하고, 그리고 이 세포계가 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 발현시킬 때 RAF 억제제(가령, 일세대 RAF 억제제)에 저항성이어야만 한다. 차세대 RAF 억제제의 확인에 유용한 예시적인 세포계는 흑색종 세포계 A375이다. A375 세포들은 야생형 BRAF 폴리펩티드를 발현할 때 RAF 억제제 RAF-265에 대해 감응성이지만, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드, 예를 들면, 다음중 하나 이상의 저항 돌연변이를 포함하는 BRAF 폴리펩티드를 발현시킬 때, RAF-265에 저항성이다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F.
차세대 RAF 억제제인 화합물이 존재할 때, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 발현시키는 세포계는 이 화합물이 없을 때 보다 더 낮은 생존력 또는 증식율을 보유한다. 차세대 RAF 억제제가 아닌 화합물이 존재할 때, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 발현시키는 세포계는 이 화합물이 없을 때와 동등한 또는 더 높은 생존력 또는 증식율을 보유한다. 당업계에 공지되어 있는 세포 생존력 및/또는 증식율을 측정하는 방법들은 테스트 화합물에 대한 BRAF 폴리펩티드 또는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 발현시키는 세포계의 감응성을 결정하는데 적합하다. 이러한 방법들은 트립판 블루 압출, 테트라졸리움 화합물들의 대사, 삼중수소화된 티미딘 병합의 측정, BrdU 병합, 포도당 흡수, ATP 농도, 그리고 아팝토시스(apoptosis)의 수준 측정을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 세포 증식은 잘-확립된 세포 증식/생존력 분석 가령 MTS 또는 Cell Titer GLo을 이용하여 판단할 수 있다. 특정 구체예들에서, 감응성은 적합한 대조군에 대해 GI50 값에서 최소한 2배, 좀더 바람직하게는 최소한 3배, 가장 바람직하게는 최소한 4-5배의 변화(shift)로 정의된다.
따라서, 한 구체예에서, 이 발명은 차세대 RAF 억제제인 화합물을 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 BRAF 기질과 야생형 BRAF 폴리펩티드 (또는 BRAF V600E 폴리펩티드)에 대하여 하나 이상의 돌연변이를 보유한 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 분석 조성물을 제공하고, 이 분석 조성물을 테스트 화합물이 없는 상태에서 BRAF 기질의 포스포릴화를 허용하는 조건하에서 테스트 화합물에 접촉시키고, 그리고 BRAF 기질의 포스포릴화에 있어서 화합물의 효과를 판단하는 것을 포함하고, 여기에서 적합한 대조군과 비교하여 BRAF 기질의 포스포릴화의 하향조정은 이 화합물이 차세대 BRAF 억제제임을 확인시킨다. 이 방식에서 확인된 화합물은 암, 가령, 돌연변이 RAF 폴리펩티드가 탐지된 암의 치료에 유용한 화합물이다. 전술한 방법들에서 유용한 BRAF 폴리펩티드는 RAF 억제제 RAF-265에 대해 저항성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 BRAF 폴리펩티드, 가령, 여기에서 설명된 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 BRAF 폴리펩티드이다. 전술한 방법들에서 유용한 BRAF 기질은 예를 들면, MEK1/2이다. MEK1/2 포스포릴화의 감소, 축소 또는 하향조절은 이 화합물이 RAF 억제제임을 나타낸다. 유사하게, 전술한 방법들에서 유용한 하향 RAF 신호 발생 분자는 예를 들면, ERK1/2이다. ERK1/2 포스포릴화의 감소, 축소, 또는 하향조절은 이 화합물이 RAF 억제제임을 나타낸다. 전술한 방법들은 시험관에서 실행할 수 있고, 여기에서 BRAF 폴리펩티드 및 BRAF 기질들은 단리된 또는 정제된 단백질들이다. 전술한 방법들은 또한 시험관에서 실행될 수 있으며, 여기에서 BRAF 폴리펩티드 및 BRAF 기질들은 세포 추출물의 성분들이다. 이 구체예에서, 분석 조성물은 세포 추출물이다. 적합한 대조군은 이 방법을 실시하는 당업자에게 자명한 임의의 대조군이며, 그리고 예를 들면, 테스트 화합물로 처리되지 않은 유사한 또는 동일한 분석 조성물 또는 대조군 화합물, 또는 유사한 분석 조성물 또는 "야생형" BRAF 폴리펩티드, 또는 BRAF V600E 폴리펩티드를 포함하는 세포 추출물로 처리된 분석 조성물을 포함한다.
또다른 구체예에서, 이 발명은 차세대 RAF 억제제인 화합물을 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공하고, 이 세포에 테스트 화합물을 접촉시키고, 그리고 MEK1/2 포스포릴화, ERK1/2 포스포릴화, 또는 세포 증식에서 이 화합물의 효과를 결정하고, 여기에서 적절한 대조군과 비교하여 MEK1/2 포스포릴화, ERK1/2 포스포릴화 또는 세포 증식의 감소, 축소 또는 하향조절은 이 화합물이 차세대 RAF 억제제임을 확인시킨다. 이러한 방식으로 확인된 화합물은 암의 치료, 가령, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드가 탐지된 암의 치료에 유용한 화합물이다. 적합한 대조군은 이 방법을 실시하는 당업자에게 자명한 임의의 대조군이며, 그리고 예를 들면, 테스트 화합물로 처리되지 않은 유사한 또는 동일한 분석 조성물 또는 대조군 화합물, 또는 재조합, "야생형" BRAF, 또는 BRAF V600E가 발현된 유사한 세포 또는 세포 추출물로 처리된 분석 조성물을 포함한다.
한 구체예에서, 전술한 방법들에 이용된 이 테스트 화합물은 야생형 RAF 폴리펩티드, 가령, BRAF 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제시키는 RAF 억제제다. 추가로 또는 대안으로, 전술한 방법들에 이용된 이 테스트 화합물은 BRAF V600E 폴리펩티드의 활성을 억제하는 RAF 억제제다. 한 구체예에서, RAF 억제제들이 차세대 RAF 억제제들인지를 판단하기 위하여 테스트 화합물로 이용될 수 있는 RAF 억제제들은 PLX4032, PLX5568, XL281, 그리고 US2008/0108615에서 설명된 이미다졸-2-카르복사미드 유도체들을 포함하며, 이들의 전문은 참고자료로 여기에 통합된다.
또다른 구체예에서, 이 테스트 화합물은 테스트 화합물들의 라이브러리의 구성원이다. "테스트 화합물들의 라이브러리"는 다수의 테스트 화합물들을 포함하는 패널을 지칭한다. 작은 유기 분자들의 분자 라이브러리의 합성을 위한 방법은 (Carell et al . (1994). Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33:2059; Carell et al . (1994) Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33:2061)에서 설명되고 있다. 본 발명의 이 화합물들은 당업계에 공지된 복합 라이브러리 방법들에 있는 다양한 방법들중 임의의 것을 이용하여 수득할 수 있으며, 다음을 포함한다: 생물학적 라이브러리; 공간적으로 어드레스가능한 평행 고형상 또는 용액 상 라이브러리, 탈회선(deconvolution)을 요구하는 합성 라이브러리 방법들, '1개-비드-한 가지-화합물' 라이브러리 방법, 그리고 친화력 크로마토그래피 선별을 이용한 합성 라이브러리. 생물학적 라이브러리 방법은 펩티드 라이브러리에 한정되지만, 다른 4가지 방법은 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 화합물들의 소(small) 분자 라이브러리에 적용가능하다(Lam , K.S. (1997) Anticancer 약물 Des . 12:145). 분자 라이브러리 합성을 위한 기타 예시적인 방법들은 당업계에서 찾아볼 수 있는데, 예를 들면 : Erb et al . (1994). Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:11422; Horwell et al . (1996) Immunopharmacology 33:68- ; and in Gallop et al . (1994); J. Med . Chem. 37:1233-을 참고한다. 화합물들의 라이브러리은 용액 (가령, Houghten (1992) Bio 기술 13:412-421), 또는 비드 (Lam (1991) Nature 354:82-84), 칩 (Fodor (1993) Nature 364:555-556), 박테리아 (Ladner USP 5,223,409), 포자 (Ladner USP '409), 플라스미드(Cull et al . (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) 또는 파아지 (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al . (1990) Proc . Natl . Acad . Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol . Biol . 222:301-310)에서 제시될 수 있다. 또다른 구체예에서, 복합 폴리펩티드는 cDNA 라이브러리로부터 만든다. 활성에 대해 스크리닝될 수 있는 예시적인 화합물들은 펩티드, 핵산, 탄수화물, 작은 유기 분자들, 그리고 천연 산물 추출물 라이브러리를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
차세대 RAF 억제제들은 여기에서 설명된 하나 이상의 저항 돌연변이를 담고 있는 BRAF 대립유전자들의 구조에 근거하여 합리적으로 기획될 수 있다. 여기에서 설명된 것과 같이, RAF 억제제들에게 저항성을 부여하는 BRAF 잔기들은 일세대 RAF 억제제 RAF-265에 의해 결합된 BRAF의 동일한 영역에 위치한다. RAF 억제제들, 또는 BRAF V600E에 대해 저항성을 부여하는 BRAF 돌연변이 대립유전자들의 확인으로 돌연변이 대립유전자들의 구조와 야생형 BRAF의 구조간에 비교가 가능하다. 일세대 RAF 억제제들에 대해 저항성을 부여하는 변경된 구조적 특징을 앎으로써 돌연변이 대립유전자들에 결합하고 이를 억제할 억제제들을 포함하는 리간드의 합리적인 기획 및 작제가 가능하다. 이러한 억제제들은 BRAF 돌연변이 대립유전자, 여기에서 설명된 제 2 돌연변이를 보유하지 않는 BRAF V600E, 그리고 야생형 BRAF 모두에 결합하도록 기획될 수 있다. 여기에서 설명된 하나 이상의 돌연변이를 담고 있는 BRAF 대립유전자에 결합하도록 기획된 억제제들은 차세대 RAF 억제제들이다. 이러한 합리적으로 기획된 억제제들에 의한 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 능력은 여기에서 설명된 시험관에서 및/또는 생체내에서 분석들을 이용하여 확인할 수 있다.
여기에서 설명된 하나 이상의 저항 돌연변이를 담고 있는 BRAF 폴리펩티드의 구조는 컴퓨터-지원된 모델링에 의해 측정될 수 있거나 또는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 결정 또는 용액 구조를 측정함으로써 측정될 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 구조를 결정하는데 이용될 수 있다.
예시적인 컴퓨터-지원된 모델링 방법들은 PYMOL, CAVITY (J. Comp . Aided . Mol. Des . (1990) 4:337-354에서 설명됨(여기에 참고자료로 통합됨)) 및 Discovery Studio® (Accelrys , San Diego , CA)와 같은 소프트웨어 프로그램의 이용을 포함한다. 컴퓨터-지원된 분자 모델링에 유용한 추가 기술들은 J BUON . (2007) 12 Suppl 1:S101-18 (여기에 참고자료로 통합됨)에서 설명되고 있다. 공지의 구조를 가진 단백질의 컴퓨터에 근거한 분석은 이 단백질에 결합할 분자들을 확인하는데 또한 이용할 수 있다. 이러한 방법들은 수용체 부위에 상보적인 이들 모양에 근거하여 분자들을 분류한다. 예를 들면, 3-D 데이터베이스를 이용하여, DOCK와 같은 프로그램은 XBP-1, IRE-1 알파, 및/또는 EDEM에 결합할 분자들을 확인하는데 이용할 수 있다. DesJarlias et al . (1988) J. Med . Chem . 31:722; Meng et al . (1992) J. Computer Chem . 13:505; Meng et al . (1993) Proteins 17:266; Shoichet et al . (1993) Science 259:1445 참고. 추가로, 표적화된 단백질에 분자의 전기 상보성(electronic complementarity)은 이 표적에 결합하는 분자들을 확인하기 위하여 또한 분석될 수 있다. 예를 들면, Meng et al . (1992) J. Computer Chem . 13:505 and Meng et al . (1993) Proteins 17:266에서 설명된 것과 같은 분자 역학 장(molecular mechanics force field)을 이용하여 측정할 수 있다. 이용될 수 있는 다른 프로그램들은 가상 리간드의 도케팅에 GRID 역학 장을 이용하는 CLIX(예를 들면, Lawrence et al. (1992) Proteins 12:31; Goodford et al. (1985) J. Med. Chem. 28:849; and Boobbyer et al. (1989) J. Med. Chem. 32:1083 참고, 여기에 이들의 전문이 참고자료로 통합됨)을 포함한다. 결정화(crystallization)는 배취(batch), 투석(dialysis) 및 증기 확산 (가령, sitting drop 및 hanging drop) 방법들을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 결정화 방법들에 의해 실행될 수 있다. 결정의 마이크로, 마크로 및/또는 스트레이크 씨딩(streak seeding)을 실행하여 결정화를 촉진시킬 수도 있다. BRAF 돌연변이 대립유전자들을 포함하는 결정들은 당업계에 공지되어 있는 다양한 상이한 방법들에 의해 형성된다. 예를 들면, 결정화는 배취(batch), 투석(dialysis) 및 증기 확산 (가령, sitting drop 및 hanging drop) 방법들에 의해 실행될 수 있다. 염기성 단백질 결정화 셋업의 상세한 설명은 McRee , D., Practical Proteins Crystallography , 2 nd Ed. (1999), Academic Press Inc에서 찾아볼 수 있다. 결정화 실험의 실행에 관련된 추가 설명은 Stevens et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.: 10(5):558-63, 그리고 미국 특허 제6,296,673호; 제5,419,278호; 그리고 제5,096,676호에서 제공하며, 이들 전체 내용은 여기에 참고자료로 통합된다. 이러한 결정들은 BRAF 돌연변이 대립유전자들의 3차원 구조를 측정하기 위한 X-선 또는 중성자 회절 분석을 실행하는데 이용될 수 있다. BRAF 폴리펩티드 또는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 용액 구조는 당업계에 공지되어 있는 기술을 이용하여 핵 자기 공명 분광학을 이용하여 확인할 수 있다. X-Ray 결정학 및 NMR 분광학에 의한 폴리펩티드 구조 측정을 위한 적합한 방법들은 Brunger et al ., (1998) " Crystallography & NMR system ( CNS ): A new software system for macromolecular structure determination ," Acta Crystallogr D54 , 905-921; Brunger et al . (1987) " Solution of a Protein Crystal Structure With a Model Obtained From NMR Interproton Distance Restraints ," Science 235, 1049-1053; Drenth , " Principles of Protein X- ray Crystallography," (1994), Springer - Verlag . pp . 1-19; and Narula et al . (1995) "Solution structure of the C- terminal SH2 domain of the human tyrosine kinase Syk complexed with a phosphotyrosine pentapeptide ," Structure 3, 1061-1073에서 설명되며, 여기에 참고자료로 이들의 전문이 통합된다. 돌연변이 RAF 폴리펩티드의 결정 또는 용액 구조의 확인 시에, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 억제제들은 상기에서 설명된 컴퓨터-기반 모델링 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
전술한 방법들에 의해 확인된 차세대 RAF 억제제들은 야생형 및/또는 돌연변이 RAF 폴리펩티드의 발현과 관련된 질환 또는 상태를 치료하는데 유용하다. 예를 들면, 차세대 RAF 억제제들은 피험자의 암, 특히 돌연변이 BRAF 폴리펩티드가 확인된 암을 치료하는데 유용하다. 예시적인 구체예에서, 차세대 RAF 억제제들은 다음의 아미노산 잔기들중 하나 이상에서 돌연변이를 보유하는 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 암을 치료하는데 유용하다: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748. 관련된 구체예에서, 차세대 RAF 억제제들은 다음의 돌연변이중 하나 이상을 보유하는 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 암을 치료하는데 유용하다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F.
IV . 단리된 핵산 분자들
본 발명은 BRAF 유전자 및 이의 해당 유전자 산물과 관련된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자들에 관한 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자들은 포유동물 세포들로부터 분리가능하고 정제가능하다. 특히 이 발명의 측면들, 여기에서 설명된 단리된 BRAF 핵산 분자들은 BRAF 억제제에 대해 저항성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 여기에서 언급된 것과 같이, "돌연변이 BRAF 핵산 분자"는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드, 가령, 하나 이상의 공지의 BRAF 억제제들에 대해 저항성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 담고 있는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 BRAF 핵산 분자를 포함한다.
단리된 그리고 정제된 BRAF 핵산 분자, 가령, 돌연변이 BRAF 핵산 분자는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있다. 여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "RNA 전사체"는 DNA 핵산 분자의 전사 산물인 RNA 분자를 말한다. 이러한 전사체는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코드할 수 있다.
본 출원에서 이용된 것과 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 전체 게놈 핵산이 없는 단리된 핵산 분자, RNA 또는 DNA를 지칭한다. 따라서, "BRAF를 인코드하는 폴리뉴클레오티드"는 BRAF 코딩 서열들을 포함하나, 전체 게놈 DNA 및 단백질로부터 단리되거나 또는 정제된 핵산 분절(segment)을 지칭한다. 본 출원은 BRAF-인코딩 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 활성 또는 기능을 지칭할 때, 이 폴리뉴클레오티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드의 활성, 예를 들면, MEK1 또는 MEK2 기질들의 포스포릴화를 실행할 수 있는 분자를 인코드한다는 것을 의미한다.
용어 "cDNA"는 주형으로 RNA를 이용하여 준비한 DNA를 지칭한다. 게놈 DNA 또는 RNA 전사체를 이용할 경우와 반대로, cDNA를 이용하는 장점은 재조합 DNA 기술을 이용하여 서열을 조정하는 능력 및 안정성이다(Sambrook , 1989; Ausubel , 1996 참고). 전체 또는 부분적인 게놈 서열이 바람직할 때도 있다. 대안으로, cDNA는 이것이 폴리펩티드의 코딩 영역을 나타내며, 인트론 및 기타 조절 영역들을 제거하기 때문에 유익할 수 있다.
주어진 세포로부터 주어진 BRAF-인코딩 핵산 또는 BRAF 유전자는 약간 상이한 핵산 서열들을 보유하지만, 그럼에도 불구하고 활성 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 천연 변이체 또는 균주에 의해 표시될 수 있다는 것 또한 고려한다. 바람직한 구체예에서, 활성 BRAF 폴리펩티드는 활성 인간 BRAF 폴리펩티드이다. 특히 바람직한 구체예들에서, 활성 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드의 활성을 보유하지만 하나 이상의 공지의 BRAF 억제제들에 대해 저항성인 돌연변이 BRAF 폴리펩티드다. 결과적으로, 본 발명의 특정 측면들은 최소한의 아미노산 변화를 보유하지만 여전히 동일한 생물학적 기능을 가지는 BRAF 유도체들을 포함한다.
용어 "유전자"는 단순하게 기능성 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드-인코딩 단위를 지칭한다. 당분야의 숙련자들이 이해할 수 있는 바와 같이, 이러한 기능성 용어는 단백질들, 폴리펩티드, 도메인들, 융합 단백질들, 및 돌연변이 단백질들을 발현하거나 또는 발현하도록 개작된 게놈 서열들, cDNA 서열들, 그리고 더 작은 조작된 유전자 분절을 포함한다. BRAF를 인코드하는 핵산 분자는 다음의 길이를 가진 연속 핵산 서열을 포함할 수 있다: 최소한 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 400개, 410개, 420개, 430개, 440개, 441개, 450개, 460개, 470개, 480개, 490개, 500개, 510개, 520개, 530개, 540개, 550개, 560개, 570개, 580개, 590개, 600개, 610개, 620개, 630개, 640개, 650개, 660개, 670개, 680개, 690개, 700개, 710개, 720개, 730개, 740개, 750개, 760개, 770개, 780개, 790개, 800개, 810개, 820개, 830개, 840개, 850개, 860개, 870개, 880개, 890개, 900개, 910개, 920개, 930개, 940개, 950개, 960개, 970개, 980개, 990개, 1000개, 1010개, 1020개, 1030개, 1040개, 1050개, 1060개, 1070개, 1080개, 1090개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개, 2000개, 2100개, 2200개, 2300개, 2400개, 2500개, 2600개, 2700개, 2800개, 2900개, 3000개, 3100개, 3200개, 3300개, 3400개, 3500개, 3600개, 3700개, 3800개, 3900개, 4000개, 4100개, 4200개, 4300개, 4400개, 4500개, 4600개, 4700개, 4800개, 4900개, 5000개, 5100개, 5200개, 5300개, 5400개, 5500개, 5600개, 5700개, 5800개, 5900개, 6000개, 6100개, 6200개, 6300개, 6400개, 6500개, 6600개, 6700개, 6800개, 6900개, 7000개, 7100개, 7200개, 7300개, 7400개, 7500개, 7600개, 7700개, 7800개, 7900개, 8000개, 8100개, 8200개, 8300개, 8400개, 8500개, 8600개, 8700개, 8800개, 8900개, 9000개, 9100개, 9200개, 9300개, 9400개, 9500개, 9600개, 9700개, 9800개, 9900개, 10000개, 10100개, 10200개, 10300개, 10400개, 10500개, 10600개, 10700개, 10800개, 10900개, 11000개, 11100개, 11200개, 11300개, 11400개, 11500개, 11600개, 11700개, 11800개, 11900개, 12000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 염기쌍. 이러한 서열들은 예를 들면, 서열 번호:1, 또는 이의 단편과 동일하거나 또는 상보적일 수 있다.
이 발명의 다양한 구체예들은 BRAF내에 유전적 돌연변이에 관한 것이다. 여기에서 이용된 것과 같이, 돌연변이는 BRAF 핵산 분자내 한 부위의 단일 뉴클레오티드의 추가, 결손 또는 치환을 말한다. 예시적인 구체예에서, 돌연변이 BRAF 핵산 분자는 특정 치료법, 가령 BRAF 억제제, 가령, RAF-265에 대해 저항성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 관련된 구체예에서, 돌연변이 BRAF 핵산 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하여, 이 돌연변이 BRAF 핵산 분자는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코하고, 여기에서 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 특정 치료법, 가령 BRAF 억제제, 가령, RAF-265에 대해 저항성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 따라서, 이 발명의 특정 측면들에서, 서열에서 변경은 이 서열에 의해 인코드된 폴리펩티드의 성질에 영향을 주는 변화를 초래하여, 그 결과로써 BRAF 억제제를 이용한 치료법과 같은 치료법에 최소한 약간의 저항성이 발생된다.
"다른 코딩 서열들로부터 실질적으로 단리된"이란 관심 유전자가 핵산 분절의 코딩 영역의 일부를 형성하고, 그리고 이 분절은 자연적으로 발생되는 코딩 핵산, 가령, 거대한 염색체 단편들 또는 기타 기능성 유전자들 또는 cDNA 코딩 영역과 같은 큰 부분들을 보유하지 않는다는 것을 의미한다. 물론, 이는 원래 단리되어 있는 핵산 분절을 지칭하며, 그리고 인간의 조작에 의해 분절에 추가된 유전자 또는 코딩 영역을 배제하지 않는다.
특히 구체예들에서, 이 발명은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에 따른 또는 기본적으로 대응하는 연속 아미노산 서열을 이의 아미노산 서열내에 포함하는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드 또는 펩티드를 인코드하는 DNA 서열들이 통합된 단리된 핵산분절들과 재조합 벡터에 관한 것이다. 예시적인 구체예들에서, 이 발명은 BRAF 억제제에 대해 저항성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 BRAF 폴리펩티드의 연속 아미노산 서열을 이의 아미노산 서열을 포함하는 BRAF 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 인코드하는 DNA 서열들이 통합된 단리된 핵산 분절들과 재조합 벡터에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 하나 이상의 돌연변이는 위치 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748에서 일어난다. 다른 구체예들에서, 하나 이상의 돌연변이는 다음을 포함한다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F.
코딩 서열 자체의 길이에 무관하게, 본 발명에 이용된 핵산 분절은 프로모터, 폴리아데닐화 신호들, 추가 제한효소 부위들, 다중 클로닝 부위들, 기타 코딩 분절들, 및 이와 유사한 것들과 같은 다른 DNA 또는 RNA 서열들과 복합될 수 있고, 따라서 이들의 전체 길이는 매우 다양할 수 있다. 따라서 대부분 임의의 길이의 핵산 단편을 이용할 수 있고, 총 길이는 용이한 제조 및 의도된 재조합 프로토콜에 사용 등에 의해 바람직하게 제한되는 것으로 본다.
본 발명의 핵산 구조물은 BRAF 폴리펩티드 또는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 것을 고려한다. "이종기원(heterologous)" 서열은 나머지 서열에 대해 외부 또는 외인성인 서열을 지칭한다. 이종기원 유전자는 이 서열에 인접하여 자연계에서 볼 수 없는 유전자가 있는 경우 이 유전자를 지칭한다.
비-제한적 실시예에서, 하나 이상의 핵산 구조체들은 모든 BRAF 유전자 또는 일부 BRAF 유전자에 동일한 또는 상보적인 연속 뉴클레오티드 스트레취를 포함하도록 준비할 수 있다. 핵산 구조체는 최소한 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1,000개, 2,000개, 3,000개, 4,000개, 5,000개, 6,000개, 7,000개, 8,000개, 9,000개, 10,000개, 11,000개, 12,000개, 13,000개, 14,000개, 15,000개, 20,000개, 30,000개, 50,000개, 100,000개, 250,000개, 약 500,000개, 750,000개 내지 약 1,000,000개 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 뿐만 아니라 당분야의 당업자에게 효모 인공 염색제와 같은 핵산 구조체들의 출현이 공지되어 있다면 더 큰 크기의 구조체들, 최대 염색체 크기(모든 중간 길이 및 중간 범위 포함)의 구조체들을 포함할 수 있다.
여기에서 이용된 것과 같이, "중간 길이(intermediate lengths)" 및 "중간 범위(intermediate ranges)"는 인용된 값을 포함하는 또는 이들 값 사이의 임의의 길이 또는 범위(가령, 이러한 값들을 포함하거나 이들 사이에 포함된 모든 정수)를 의미한다. 중간 길이의 비-제한적인 실시예는 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 등; 약 21개, 약 22개, 약 23개, 등; 약 31개, 약 32개, 등; 약 51개, 약 52개, 약 53개, 등; 약 101개, 약 102개, 약 103개, 등; 약 151개, 약 152개, 약 153개, 약 97001개, 약 1,001개, 약 1002개, 약 50,001개, 약 50,002개, 약 750,001개, 약 750,002개, 약 1,000,001개, 약 1,000,002개, 등을 포함한다. 중간 범위의 비-제한적인 예는 약 3개 내지 약 32개, 약 150개 내지 약 500,001개, 약 3,032개 내지 약 7,145개, 약 5,000개 내지 약 15,000개, 약 20,007개 내지 약 1,000,003개 등을 포함한다.
본 발명의 특정 구체예들은 벡터, 프로모터, 치료 핵산, 그리고 세포내 변형 및 발현에 관련된 기타 핵산 효소들을 포함한 다양한 핵산에 관계한다. 특정 측면들에서, 핵산은 야생형 또는 돌연변이 핵산을 포함한다. 특히 측면에서, 핵산은 전사된 핵산을 인코드하거나 또는 전사된 핵산을 포함한다.
용어 "핵산"은 당업계에 공지되어 있다. "핵산"은 여기에서 이용된 것과 같이 핵염기를 포함하는 DNA, RNA의 분자(가령, 스트랜드) 또는 이의 유도체 또는 유사체를 일반적으로 지칭할 것이다. 핵염기는 예를 들면, DNA (가령, 아데닌 "A," 구아닌 "G," 티민 "T" 또는 시토신 "C") 또는 RNA (가령, A, G, 우라실 "U" 또는 C)에서 볼 수 있는 자연적으로 생성되는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함한다. 용어 "핵산"은 용어 "올리고뉴클레오티드" 와 "폴리뉴클레오티드"를 포함하는데, 이들 각각은 용어 "핵산"의 아속(subgenus)이다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 길이가 약 3 개 내지 약 100개 핵염기의 분자를 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 약 100개 핵염기 이상의 최소한 하나의 분자를 지칭한다. "유전자"는 유전자 산물 서열 뿐만 아니라, 유전자 산물의 인트론 및 프로모터의 코딩 서열을 지칭한다. BRAF 유전자에 추가하여, BRAF의 인헨서와 같은 기타 조절 영역도 청구된 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 핵산으로 고려된다.
이러한 정의들은 일반적으로 단일-스트랜드 분자를 지칭하지만, 그러나 특정 구체예들은 단일-스트랜드 분자에 부분적으로, 실질적으로 또는 온전히 상보적인 추가 스트랜드를 또한 포함할 것이다. 따라서, 핵산은 분자를 포함하는 특정 서열의 하나 이상의 상보 스트랜드 또는 "보체(complement)"를 포함하는 이중-스트랜드 또는 삼중-스트랜드 분자를 포함할 수 있다. 여기에서 이용된 것과 같이, 단일 스트랜드 핵산은 접두사 "ss", 이중 스트랜드 핵산은 접두사 "ds", 그리고 삼중 스트랜드 핵산은 접두사 "ts"로 표시할 수 있다.
핵산은 당업계 숙련자에게 공지된 임의의 기술을 이용하여 만들 수 있는데, 예를 들면, 화학적 합성, 또는 효소에 의한 생산 또는 생물학적 생산에 의해 만들 수 있다. 합성 핵산(가령, BRAF 억제제에 저항성을 부여하는 돌연변이의 확인을 용이하게 하는 합성 BRAF 프라이머)의 비-제한적인 예들은 포스포트리에스테르, 아인산염(phosphite) 또는 포스포르아미디트(phosphoramidite) 화학물질과 EP 266,032(여기에 참고자료로 통합됨)에서 설명된 것과 같은 고형 상 기술들을 이용하여 시험관에서 화학적으로 합성하여 만든 핵산, 또는 Froehler et al ., 1986 및 미국 특허 제5,705,629호(각각 여기에 참고자료로 통합됨)에 의해 설명된 데옥시뉴클레오시드 H-포스포네이트 중간생성물을 통하여 화학적으로 합성하여 만든 핵산을 포함한다. 본 발명의 방법들에 있어서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드들이 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 합성의 상이한 다양한 기전들은 예를 들면, 미국 특허 제4,659,774호, 제4,816,571호, 제5,141,813호, 제5,264,566호, 제4,959,463호, 제5,428,148호, 제5,554,744호, 제5,574,146호, 제5,602,244호(이들 각각은 여기에 참고자료로 통합됨)에서 공개되어있다.
효소에 의한 생산된 핵산의 비-제한적 실시예는 PCR과 같은 증폭 반응에서 효소에 의해 생샌된 핵산 (예를 들면, 미국 특허 제4,683,202호 및 제4,682,195호, 각각 여기에 참고자료로 통합됨), 또는 미국 특허 제5,645,897호(여기에 참고자료로 통합됨)에서 설명된 것과 같은 올리고뉴클레오티드의 합성에 의해 생산된 핵산을 포함한다. 생물학적으로 생산된 핵산의 비-제한적 실시예는 박테리아에서 복제된 재조합 DNA 벡터와 같은 살아있는 세포안에서 생산된(가령, 복제된) 재조합 핵산을 포함한다(예를 들면, Sambrook et al . 1989, 여기에 참고자료로 통합됨).
핵산은 폴리아크릴 아미드, 세슘 클로라이드 원심분리 그라디언트 또는 BRAF에 대해 저항성을 부여하는 돌연변이에 대한 평가의 일부분으로 당업계에 공지되어 있는 임의의 다른 수단들에 의해 정제될 수 있다(예를 들면, Sambrook et al ., 1989, 여기에 참고자료로 통합됨). 바람직한 측면들에서, 핵산은 약리학적으로 수용가능한 핵산이다. 약리학적으로 수용가능한 조성물들은 당업계에 공지되어 있으며, 그리고 여기에서 설명된다.
특정 측면들에서, 본 발명은 단리된 핵산에 관한 것이다. 여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "단리된 핵산"은 하나 이상의 세포의 전체 게놈 및 전사된 핵산이 없거나 이로부터 단리된 핵산 분자(가령, RNA 또는 DNA 분자)을 지칭한다. 특정 구체예들에서, "단리된 핵산"은 예를 들면, 지질 또는 단백질들, 작은 생물학적 분자들, 및 이와 유사한 것들과 같은 마크로 분자를 포함하는 세포 성분들 또는 시험관내 반응 성분들이 없는, 또는 이로부터 단리된 핵산을 지칭한다.
V. 발현 벡터 및 숙주 세포들
본 발명은 발현 벡터 조성물들과 BRAF 폴리펩티드, 가령, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드하기 위하여 이용되는 이러한 벡터의 용도, 뿐만 아니라 이러한 발현 벡터들이 도입된 숙주 세포 조성물들을 포함한다. 용어 "벡터"는 세포내로 도입시키고 여기에서 복제될 수 있도록 하는 운반 핵산 분자를 지칭할 때 이용한다. 핵산 서열은 "외생성"으로, 이는 벡터가 도입되는 세포에 대해 이질적이거나 또는 이 서열이 세포 안의 서열에 대해서는 상동성이지만, 서열이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 안에 위치한다는 것을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파아지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 그리고 인위적인 염색체 (가령, YACs)를 포함한다. 당업자는 Sambrook et al ., 1989 and Ausubel et al ., 1996, (둘다 여기에 참고자료로 통합됨)에서 설명된 것과 같이 표준 재조합 기술을 통하여 벡터를 만들 수 있도록 잘 갖추어져 있다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구조체"는 전사될 수 있는 유전자 산물의 최소한 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 담고 있는 벡터를 말한다. 일부 경우들에서, RNA 분자들은 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드로 해독된다. 다른 경우들에서, 이들 서열들은 예를 들면, 안티센스 분자 또는 리보자임의 생산에서는 해독되지 않는다. 발현 벡터들은 다양한 "대조군 서열들"들을 포함할 수 있는데, 이들은 전사 및 특정 숙주 유기체 내에서 작동가능하도록 연결된(operably linked) 코딩 서열의 가능한 전사에 필수적인 핵산 서열들을 지칭한다. 전사 및 해독을 관리하는 대조군 서열에 추가로, 벡터 및 발현 벡터들은 다른 기능들 뿐만 아니라 하기에서 설명하는 것을 실행하는 핵산 서열들을 포함한다.
1. 프로모터 및 인헨서들
"프로모터"는 전사의 개시 및 속도를 조절하는 핵산 서열의 영역인 대조군 서열이다. 프로모터는 조절 단백질들 및 분자들이 RNA 폴리머라제 및 기타 전사 인자들에 결합할 수 있는 유전적 요소들을 포함할 수 있다. "작용가능하도록 위치한", "작용가능하도록 연결된", "조절하에" 그리고 "전사 조절하에"라는 의미는 프로모터가 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현 개시를 조절하기 위하여 핵산 서열에 대해 정확하게 기능을 하는 위치 및/또는 방향에 있다는 것을 말한다. 프로모터는 "인헨서(enhancer)"와 병용하여 이용되거나 병용하여 이용되지 않을 수 있고, 이때 인헨서는 핵산 서열의 전사 활성에 관련된 cis-작용 조절 서열을 말한다.
프로모터는 코딩 분절 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 넌-코딩서열들을 분리함으로써 수득할 수 있기 때문에 유전자 또는 서열과 자연적으로 연합될 수 있다. 이러한 프로모터를 "내생적(endogenous)"이라고 부를 수 있다. 유사하게, 인헨서는 해당 서열의 하류 또는 상류에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 연합된 것일 수도 있다. 대안으로, 재조합 또는 이종기원 프로모터의 조절하에 코딩 핵산 분절을 위치시킴으로써 특정 장점을 얻을 수 있는데, 이때 재조합 또는 이종기원 프로모터는 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 연합되지 않는 프로모터를 말한다. 재조합 또는 이종기원 인헨서는 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 연합되지 않는 인헨서를 또한 말한다. 이러한 프로모터 또는 인헨서들은 다른 유전자의 프로모터 또는 인헨서, 그리고 임의의 기타 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인헨서를 포함하고, 그리고 "자연적으로 생성되지 않은" 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소들을 포함하는, 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함하는 프로모터 또는 인헨서들을 포함한다.
자연적으로, 발현을 위하여 선택된 세포 유형, 세포 기관 및 유기체 안에서 핵산 분절의 발현을 유효하게 지시하는 프로모터 및/또는 인헨서를 이용하는 것은 중요할 것이다. 분자 생물학 분야에 당업자는 프로모터, 인헨서의 용도, 그리고 단백질 발현을 위한 세포 유형의 조합을 일반적으로 알 것이다, 예를 들면, Sambrook et al . (1989), (여기에 참고자료로 통합됨) 참고. 이용된 프로모터는 도입된 DNA 분절의 높은 수준의 발현을 지시하기 위하여 적절한 조건하에 유용한 구성적, 조직-특이적, 유도성 프로모터일 수 있다. 이 프로모터는 이종기원 또는 외생성, 예를 들면, BRAF 인코딩서열에 대해 비-BRAF 프로모터일 수 있다. 일부 실시예들에서, 원핵생물 프로모터는 원하는 서열의 전사를 위하여 시험관내에서 사용하기 위하여 이용된다. 많은 시판되는 이용가능한 시스템에 사용할 수 있는 원핵생물 프로모터는 T7, T3, 및 Sp6을 포함한다.
2. 개시 신호 및 내부 리보좀 결합 부위
코딩서열들의 유효한 해독을 위하여 특이적 개시 신호를 또한 요구할 수 있다. 이들 신호들은 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열들을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 해독 대조군 신호들이 제공될 필요가 있을 수 있다. 당업자는 이를 결정하고, 필요한 신호를 바로 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 전체 삽입체의 해독을 확립하기 위하여 원하는 코딩서열의 판독 틀과 같은 "동일 틀 내에(in-frame)"있어야 한다는 것을 알려진 사실이다. 외인성 해독 대조군 신호들과 개시 코돈들은 천연의 것이거나 또는 합성된 것일 수 있다. 발현의 효과는 적합한 전사 인헨서 요소들의 포함에 의해 강화될 수 있다. 이 발명의 특정 구체예들에서 내부 리보좀 인입(entry) 부위(IRES) 요소들은 다중유전자, 또는 다중시스트론성(polycistronic) 메시지를 만드는데 이용된다.
3. 다중 클로닝 부위들
벡터는 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함할 수 있는데, 이 부위는 다중 제한 효소 부위들을 담고 있으며, 이들중 임의의 것은 벡터를 절단하기 위하여 표준 재조합 기술과 함께 이용될 수 있다(예를 들면, Carbonelli et al ., 1999, Levenson et al ., 1998, and Cocea , 1997, 여기에 참고자료로 통합됨). "제한 효소 절단(digestion)"은 핵산 분자 안에 특이적 위치들에서만 기능을 하는 효소로 핵산 분자를 촉매적으로 절단하는 것을 지칭한다. 이들 제한 효소중 많은 것들이 상업적으로 이용가능하다. 이들 효소들의 이용은 당업계 숙련자들에게 광범위하게 인지되고 있다. 빈번하게, 외인성 서열들을 벡터에 결찰시키기 위하여 MCS 내부를 절단하는 제한 효소를 이용하여 벡터를 선형화 또는 단편화시킨다. "결찰(Ligation)"은 서로 인접하여 있거나 또는 인접하지 않은 두 개 핵산 단편들 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 말하는 것이다. 제한 효소들 및 결찰 반응과 관련된 기술들은 재조합 기술의 당업계에 공지되어 있다.
4. 접합( Splicing ) 부위들
대부분의 전사된 진핵생물 RNA 분자들은 RNA 접합을 겪게 되어 1차 전사체들로부터 인트론을 제거한다. 게놈 진핵생물 서열들을 가지고 있는 벡터는 단백질 발현을 위하여 전사체의 적절한 프로세싱이 담보되도록 제공자(donor) 및/또는 수용자(acceptor) 접합 부위들을 요구할 수 있다(예를 들면, Chandler et al., 1997, 참고자료로 여기에 통합됨).
5. 종료 신호들
본 발명의 벡터 또는 구조체들은 일반적으로 최소한 하나의 종료 신호를 포함한다. "종료 신호" 또는 "종료자(terminator)"는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사체의 특이적 종료에 관련된 DNA 서열로 구성된다. 따라서, 특정 구체예들에서 RNA 전사체의 생산을 중단시키는 종료 신호가 고려된다. 종료자는 원하는 메시지 수준을 얻기 위하여 생체내에서 필요할 수 있다.
6. 폴리아데닐화 신호들
발현, 특히 진핵생물 발현을 위하여, 전사체의 적합한 폴리아데닐화를 효과적으로 하기 위한 폴리아데닐화 신호를 일반적으로 포함할 것이다. 폴리아데닐화 신호의 성질은 이 발명의 성공적인 실시에 중요한 것이 아니기 때문에, 및/또는 이러한 임의의 서열을 이용할 수 있다. 바람직한 구체예들은 다양한 표적 세포들에서 잘 기능하는 것으로 또는 편리한 것으로 알려진 SV40 폴리아데닐화 신호 및/또는 소의 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리아데닐화는 전사체의 안정성을 증가시킬 수 있으며, 세포질 운반을 촉진시킬 수 있다.
7. 복제 원점( Origins of Replication )
숙주 세포 안에서 벡터를 증식시키기 위하여, 복제 부위들의 하나 이상의 원점 ("ori"이라고도 함)을 포함할 수 있는데, 이는 복제가 개시되는 특이적 핵산 서열이다. 대안으로 숙주 세포가 효모라면, 자주적 복제 서열(ARS)을 이용할 수 있다.
8. 선택가능한 그리고 선별가능한 표지들
이 발명의 특정 구체예들에서, 본 발명의 핵산구조체를 가지고 있는 세포들은 발현 벡터내 표지를 포함시켜 시험관에서 또는 생체내에서 확인할 수 있다. 이러한 표지들은 이 발현 벡터를 보유하는 세포의 용이한 확인을 허용하도록 세포에 확인가능한 변화를 부여할 것이다. 일반적으로, 선택가능한 표지는 선별을 허용하는 속성을 부여하는 것이다. 선택가능한 양성 표지는 이 표지의 존재로 이의 선별을 허용하고, 선택가능한 음성 표지는 이의 존재로 인하여 선별을 막는 것을 말한다. 선택가능한 양성 표지의 예는 약물 저항 표지이다.
보통 약물 선별 표지를 포함시키면 변환체(transformants)의 클로닝 및 확인에 도움이 되는데, 예를 들면, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 저항성을 부여하는 유전자들이 유용한 선택가능한 표지들이다. 조건들의 실행에 기초하여 변환체의 식별을 위한 표현형을 부여하는 표지들에 추가하여, 열량 측정 분석 원리에 근거한 GFP와 같은 선별가능한 표지들을 포함한 다른 유형의 표지들로 또한 고려된다. 대안으로, 선별가능한 효소들, 가령, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸전이효소 (CAT)를 이용할 수 있다. 당업계 숙련자는 또한 FACS 분석과 연계가 가능한 면역학적 표지들을 어떻게 이용하는지 알 것이다. 이용된 표지는 유전자 산물을 인코드하는 핵산과 동시에 발현될 수 있다면 중요한 것은 아니라고 본다. 선택가능한 그리고 선별가능한 표지들의 추가 예들은 당업계에 공지되어 있다.
9. 숙주 세포들
여기에서 이용된 것과 같이, 용어들 "세포", "세포계" 그리고 "세포 배양물"은 호환하여 이용할 수 있다. 돌연변이된 또는 야생형 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 세포를 이 발명에 이용할 수 있다. 이들 모든 용어들은 이들의 후손, 즉, 임의의 그리고 모든 후속 세대를 또한 포함한다. 모든 후손은 고의적인 또는 우연한 돌연변이로 인하여 동일하지 않을 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이종기원 핵산 서열의 발현에 있어서, "숙주 세포"는 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 지칭하며, 벡터를 복제하고 및/또는 벡터에 의해 인코드된 이종기원 유전자를 발현시킬 수 있는 임의의 형질변환가능한 유기체를 포함한다. 숙주 세포는 벡터의 수령체로 이용되어나 이용되어왔다. 숙주 세포는 "형질감염된" 또는 "형질전환된"것일 수 있는데, 이는 외인성 핵산이 숙주 세포 안으로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. 형질전환된 세포는 1차 대상 세포와 이의 후손을 포함한다. "재조합 숙주 세포"는 재조합 핵산, 가령 시험관에서 조작된 핵산 또는 조작된 핵산의 복제된 카피의 핵산을 운반하는 숙주 세포를 지칭한다.
숙주 세포는 바람직한 결과가 벡터의 복제, 벡터에 인코드된 핵산 서열들의 일부 또는 전부의 발현 또는 감염성 바이러스 입자들의 생산인지에 따라 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유도될 수 있다. 숙주 세포로는 다수의 세포계 및 배양물들이 이용가능하며, 이들은 American Type Culture Collection (ATCC)(ATCC는 살아있는 배양물 또는 유전자 물질들의 보관소 기능을 하는 기구임)를 통하여 구할 수 있다. 적합한 숙주는 벡터 골격 및 원하는 결과에 근거하여 당업계 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 플라스미드 또는 코스미드는 예를 들면, 많은 벡터의 복제를 위하여 원핵생물 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다. 벡터 복제 및/또는 발현을 위하여 숙주 세포로 이용된 박테리아 세포들은 DH5α, JM109, 및 KC8을 포함하고, 뿐만 아니라 SURETM와 같은 다수의 시판되는 박테리아 숙주를 포함한다. Competent Cells and SolopackTM Gold Cells (Strategene.RTM., La Jolla). 대안으로, 박테리아 세포들, 가령 대장균(E. coli) LE392을 파아지 바이러스의 숙주 세포로 이용할 수 있다.
이 발명의 바람직한 진핵생물 숙주 세포는 흑색종 세포계 A375이며, 여기에서 이 세포는 BRAF 폴리펩티드, 가령, 본 발명의 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 발현 벡터로 형질전환되었다.
10. 발현 시스템
상기에서 논의된 조성물의 최소한 일부 또는 전부를 포함하는 다수의 발현 시스템이 존재한다. 원핵생물- 및/또는 진핵생물-기반 시스템은 BRAF 핵산 서열들, 또는 이들의 동족 폴리펩티드, 단백질들 및 펩티드들을 만들기 위하여 본 발명에 사용하기 위하여 이용될 수 있다. 이러한 많은 시스템은 시판되며, 다양하게 이용가능하다.
곤충 세포/베큘로바이러스 시스템은 미국 특허 제5,871,986호, 제4,879,236호(이둘 모두 참고자료로 여기에 통합됨)에서 설명된 것과 같이 높은 이종기원 핵산분절을 수준 발현 수준으로 생산하고, 예를 들면, MaxBac™2.0(Invitrogen™) 및 BacPack™ 베큘로바이러스 발현 시스템 (Clontech™)으로 구입할 수 있다.
발현 시스템의 가타 예들은 Stratagene의 Complete Control™ 유도성 포유동물 발현 시스템을 포함하는데, 합성 엑디손(ecdysone)-유도성 수용체와 관련되며, 또는 이의 pET 발현 시스템, E. coli 발현 시스템을 포함한다. 유도성 발현 시스템의 또다른 예는 Invitrogen의 것들을 이용할 수 있는데, T-Rex™(테트라사이클린-조절된 발현) 시스템, 전장의 CMV 프로모터를 이용한 유도성 포유동물 발현 시스템들이 있다. Tet-On™ 및 Tet-Off™ 시스템(Clontech™)은 테트라사이클린 또는 이의 유도체들을 이용하여 포유동물 숙주에서 발현을 조절할 수 있다. 이들 시스템의 실행은 Gossen et al ., 1992 and Gossen et al ., 1995, 및 미국 특허 제5,650,298호에서 설명하고 있으며, 이들 모두는 참고자료에 통합되어 있다.
Invitrogen은 또한 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica) 발현 시스템으로 불리는 효모 발현 시스템을 제공하는데, 이는 메탄영양성(methylotrophic) 효모 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica)에서 높은 수준으로 재조합 단백질을 생산하도록 기획된 것이다. 당업계 숙련자는 핵산 서열 또는 이의 동족 폴리펩티드, 단백질, 또는 펩티드를 생산하기 위하여 발현 구조체와 같은 벡터를 어떻게 발현시키는 지를 알 수 있을 것이다.
VI . 단리된 폴리펩티드 분자들
본 발명의 또다른 측면은 단리된 및/또는 정제된 BRAF 단백질들, 그리고 생물학적으로 활성 부분들에 관한 것이다. 이 발명의 특정 측면에서, 여기에서 설명된 BRAF 폴리펩티드는 BRAF 억제제에 대해 저항성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 여기에서 언급된 것과 같이 "돌연변이 BRAF 폴리펩티드"는 하나 이상의 공지의 BRAF 억제제들에 대해 저항성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 가지고 있는 BRAF 폴리펩티드를 포함한다.
"단리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성 부분은 재조합 DNA 기술들에 의해 만들어진 경우 실질적으로 세포 물질들이 없거나, 또는 화학적으로 합성되었을 때 화학적 전구물질들 또는 다른 화학물질들이 없다. "실질적으로 세포 물질들이 없는"이란 BRAF 단백질들이 자연적으로 또는 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 성분들로부터 단백질이 분리된 BRAF 단백질 조제물을 포함한다. 한 구체예에서, 실질적으로 세포 물질들이 없는"이란 비-BRAF 단백질 ("오염 단백질"이라고도 부름)의 약 30% 미만(건중량), 좀더 바람직하게는 비-BRAF 단백질의 약 20% 미만, 좀더 바람직하게는 비-BRAF 단백질의 약 10% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 비-BRAF 단백질의 약 5% 미만을 보유하는 BRAF 단백질 조제물을 포함한다. BRAF 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성 부분이 재조합적으로 만들어질 때, 이 또한 바람직하게는 실질적으로 배양물 배지가 없는, 가령, 배양물 배지는 단백질 조제물의 용적의 약 20% 미만, 좀더 바람직하게는 약 10% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 5% 미만이다. "실질적으로 화학적 전구물질 또는 기타 화학물이 없는"이란 단백질의 합성에 관련된 화학적 또는 기타 화학물질로부터 단백질이 분리된 BRAF 단백질 조제물을 포함한다. 한 구체예에서, "실질적으로 화학적 전구물질 또는 기타 화학물이 없는"이란 화학적 전구물질 또는 비-BRAF 화학물질의 약 30% 미만(건중량의), 좀더 바람직하게는 화학적 전구물질 또는 비-BRAF 화학물질의 약 20% 미만, 좀더 바람직하게는 화학적 전구물질 또는 비-BRAF 화학물질의 약 10% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 화학적 전구물질 또는 비-BRAF 화학물질의 약 5% 미만을 보유하는 BRAF 단백질 조제물을 포함한다.
BRAF 단백질의 생물학적으로 활성 부분들은 BRAF 단백질의 아미노산 서열, 가령, 서열 번호:2에 나타낸 아미노산 서열, 또는 BRAF 단백질에 상동성인 단백질의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열들을 포함하는 펩티드들이 포함되는데, 이때 유도된 서열은 전장의 BRAF 단백질 또는 BRAF 단백질에 상동성인 전장의 단백질보다 몇 개 적은 아미노산을 포함하며 그리고 BRAF 단백질의 최소한 하나의 활성을 나타낸다. 전형적으로, 생물학적으로 활성 부분들 (펩티드들, 가령, 길이가 예를 들면, 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개 또는 그 이상의 아미노산인 펩티드)은 BRAF 단백질의 최소한 하나의 활성을 가진 도메인 또는 모티프를 포함한다. 더욱이, 단백질의 다른 영역들이 결손된 다른 생물학적으로 활성 부분들은 재조합 기술에 의해 만들 수 있으며, 여기에서 설명된 하나 이상의 활성에 대해 평가할 수 있다. 바람직하게는, BRAF 단백질의 생물학적으로 활성 부분들은 생물학적 활성을 보유하는 하나 이상의 선별된 도메인들/모티프들 또는 이의 부분들을 포함한다. 바람직한 구체예들에서, BRAF 단백질의 생물학적으로 활성 부분들은야생형 BRAF 서열에 대해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는데, 여기에서 전술한 하나 이상의 돌연변이는 전장의 돌연변이 BRAF 폴리펩티드내에 존재할 때, 공지의 BRAF 억제제들에 대해 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 저항성을 부여한다. 예시적인 구체예들에서, 돌연변이는 야생형 BRAF 단백질에서 다음의 위치들중 하나 이상에 대응하는 아미노산에서 일어난다: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748. 관련된 구체예에서, 돌연변이는 다음의 하나 이상의 BRAF 잔기들에서 일어난다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F.
BRAF 단백질들은 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 예를 들면, 이 단백질을 인코드하는 핵산 분자는 발현 벡터로 클론되고(상기에서 설명된 것과 같이), 이 발현 벡터는 숙주 세포 안으로 도입되며 (상기에서 설명된 것과 같이) 그리고 BRAF 단백질은 숙주 세포에서 발현된다. 그 다음 BRAF 단백질은 표준 단백질 정제 기술을 이용하여 적합한 정제 과정에 의해 세로로부터 단리시킬 수 있다. 재조합 발현에 대안으로, BRAF 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드는 표준 펩티드 합성 기술을 이용하여 화학적으로 합성시킬 수 있다. 더욱이, 고유의 BRAF 단백질 및/또는 돌연변이 BRAF 단백질은 예를 들면 항-BRAF 항체를 이용하여 세포(가령, 암 세포)로부터 단리시킬 수 있으며, 이때 항체는 본 발명의 BRAF 단백질 또는 이의 단편을 이용하여 표준 기술에 의해 만들 수도 있다.
이 발명은 또한 BRAF 키메라 또는 융합 단백질들을 제공한다. 여기에서 이용된 것과 같이, BRAF "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 비-BRAF 폴리펩티드에 작용가능하도록 연결된 BRAF 폴리펩티드를 포함한다. "BRAF 폴리펩티드"는 BRAF 단백질에 대응하는 아미노산 서열을 보유한 폴리펩티드를 지칭하며, 반면에 "비-BRAF 폴리펩티드"는 BRAF 단백질에 실절적으로 상동성이 아닌 단백질, 즉, BRAF와는 실질적으로 상이하며, BRAF 활성을 나타내지 않지만, 동일한 또는 상이한 유기체로부터 유도된 단백질에 대응하는 아미노산 서열을 보유한 폴리펩티드를 말한다. 융합 단백질내에서, "작용가능하도록 연결된"이란 BRAF 폴리펩티드와 비-BRAF 폴리펩티드가 서로 틀내에(in-frame) 있다는 것을 표시하는 말이다. 비-BRAF 폴리펩티드는 BRAF 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서 이 융합 단백질은 BRAF 서열들이 GST 서열들의 C-말단에 융합된 GST-BRAF 융합 단백질이다. 이러한 융합 단백질들은 재조합 BRAF 단백질들의 정제를 용이하게 할 수 있다. 또다른 구체예에서, 이 융합 단백질은 이의 N-말단에 이종기원 신호 서열을 포함하는 BRAF 단백질이다. 특정 숙주 세포(가령, 포유동물 숙주 세포)에서, BRAF 단백질의 발현 및/또는 분비는 종기원 신호 서열을 이용함으로써 증가될 수 있다.
바람직하게는, 이 발명의 BRAF 키메라 또는 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 만든다. 예를 들면, 통상적인 기술, 예를 들면, 결찰을 위한 블런트-단부(blunt-ended) 또는 스태글-단부(stagger-ended) 말단을 이용, 적합한 말단을 제공하기 위하여 제한 효소 절단, 코헤시브 단부(cohesive ends)의 채움, 바람직하지 않은 결합을 피하기 위하여 알칼리 포스포타제 처리 및 효소에 의한 결찰과 같은 기술들을 이용하여 상이한 폴리펩티드 서열들을 코딩하는 DNA 단편들을 결찰시킨다. 또다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기술을 이용하여 합성할 수 있다. 대안으로, 유전자 단편들의 PCR 증폭은 엥커(anchor) 프라이머를 이용하여 실행하는데, 이 프라이머는 두 개의 연속 유전자 단편 사이에 상보적인 오버행(overhang)을 만들어 후속적으로 어닐되고, 재증폭되어 일으켜 키메라 유전자 서열을 만든다(예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology , eds . Ausubel et al . John Wiley & Sons : 1992). 더욱이, 융합 모이어티(가령, GST 폴리펩티드)를 인코드하는 많은 발현 벡터이 시판되고 있다. BRAF-인코딩 핵산은 이러한 융합 모이어티가 BRAF 단백질의 틀내에 연결된 발현 벡터 안으로 클론될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 이 발명의 단리된 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드 서열에 대해 하나 이상의 돌연변이 (가령, 치환 또는 결손)를 가진다. 한 구체예에서, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 인간 야생형 BRAF 폴리펩티드 서열 (서열 번호:2)에 대해 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이는 BRAF 억제제에 대해 저항성을 부여한다. 예시적인 구체예에서, BRAF 억제제는 RAF-265이다. 본 발명의 돌연변이 BRAF 단백질은 야생형 BRAF 단백질의 생물학적 활성 특징들을 나타낸다. 이러한 생물학적 활성은 예를 들면, MEK1 또는 MEK2의 포스포릴화를 포함할 수 있다. 본 발명의 예시적인 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 인간 BRAF 폴리펩티드에 대해 다음의 아미노산 잔기들중 하나 이상에서 돌연변이를 가지는 BRAF 폴리펩티드를 포함한다: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 또는 C748. 본 발명의 예시적인 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 인간 BRAF 폴리펩티드에 대해 다음의 아미노산 치환중 하나 이상을 가지는 BRAF 폴리펩티드를 포함한다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F.
돌연변이 BRAF 단백질들은 야생형 BRAF 단백질의 돌연변이 생성, 또는 야생형 BRAF 단백질을 인코드하는 핵산 분자의 돌연변이 생성에 의해 만들어질 수 있다. 돌연변이 BRAF 단백질들은 바람직한 활성, 가령, BRAF 억제제에 대한 저항성을 보유하는 돌연변이 BRAF 단백질에 대한 BRAF 돌연변이의 복합 라이브러리를 스크리닝함으로써 또한 확인할 수 있다. 점 돌연변이 또는 절두(truncation)에 의해 만들어진 복합 라이브러리의 유전자 산물들을 스크리닝하는 몇 가지 기술, 그리고 선택된 속성을 보유하는 유전자 산물에 대한 cDNA 라이브러리의 스크리닝을 위한 몇 가지 기술들이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 기술은 복합 돌연변이 생성에 의해 만들어진 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 적합하다. 고 용량 분석에 적용할 수 있는 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하는데 가장 널리 이용되는 기술은 전형적으로 이 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터 안으로 클로닝시키고, 적합한 세포를 생성된 벡터 라이브러리로 형질변환시키고, 그리고 바람직한 활성의 탐지로 유전자 산물이 탐지되는 이 유전자를 인코드하는 벡터의 분리를 용이하게 하는 조건하에 복합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다.
VIII . 돌연변이의 탐지
또다른 측면에서, 이 발명은 시료(가령, 암 환자의 생물학적 시료)에서 돌연변이 BRAF 단백질의 존재를 탐지하는 방법에 관계한다. 시료, 가령, 핵산 및/또는 폴리펩티드 시료 안에 본 발명의 돌연변이 BRAF 단백질의 존재를 탐지하는데 다양한 스크리닝 방법들을 이용할 수 있다. 특정 구체예들에서, 이 시료는 세포 또는 세포 추출물을 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 이 시료는 피험자, 가령, 암을 가진 피험자로부터 구한다.
BRAF 단백질, 또는 이의 생물학적으로 활성 부분을 인코드하는 서열을 포함하는 게놈 DNA, cDNA 및 RNA(가령, mRNA)에서 저항 돌연변이의 존재를 탐지하는 방법들은 본 발명의 범위내에서 이용될 수 있다. 유사하게, BRAF 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적으로 활성 부분들내에 저항 돌연변이의 존재를 탐지하는 방법들은 본 발명의 범위내에서 이용될 수 있다. 특히 구체예들에서, 다음의 방법들을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법들은 다음의 아미노산 잔기들중 하나 이상에서 돌연변이를 보유한 BRAF 폴리펩티드 또는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자의 존재를 탐지하는데 이용할 수 있다: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 또는 C748. 예시적인 구체예들에서, 다음의 방법들을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법들은 다음의 하나 이상의 돌연변이를 보유한 BRAF 폴리펩티드 또는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자의 존재를 탐지하는데 이용할 수 있다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F.
점 돌연변이는 변성 그라디언트 겔 전기영동("DGGE"), 제한 단편 길이 다형성 분석("RFLP"), 화학적 또는 효소에 의한 절단 방법들, PCR에 의해 증폭된 표적 영역들의 직접적인 서열화(상기 참고), 단일-스트랜드 형태 다형성 분석("SSCP"), 폴리머라제 연쇄 반응, 서열화, 혼성화, "하이브리드 캡쳐"이후 파이로시퀀싱(pyro서열화) 또는 단일-분자 서열화, 그리고 당업계에 공지되어 기타 방법들을 포함한 방법들을 이용하여 탐지할 수 있다. 점 돌연변이를 스크리닝하는 한 가지 방법은 RNA/DNA 또는 RNA/RNA 이형이중구조(heteroduplexes)에서 염기쌍 미스메취의 RNase 절단에 근거한다. 여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "미스메취(mismatch)"는 이중-스트랜드 RNA/RNA, RNA/DNA 또는 DNA/DNA 분자에서 하나 이상의 쌍을 이루지 못한(unpaired) 또는 잘못 짝지어진(mispaired) 영역으로 정의한다. 따라서, 이 정의는 삽입/결손 돌연변이, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 염기 점 돌연변이로 인한 미스매취를 포함한다. 미국 특허 제4,946,773호는 RNase A 미스매취 절단 분석을 설명하는데, 이 분석은단일-스트랜드 DNA 또는 RNA 테스트 시료를 RNA 프로브에 어닐링시키고, 후속적으로 핵산 이중구조를 RNase A로 처리하는 것을 포함한다. 미스매취의 탐지를 위하여, 크기에 따라 이화학적 전기이동에 의해 분리된 RNase A 처리된 단일-스트랜드 산물들은 처리된 대조군 이중구조들과 비교한다. 대조군 이중구조에서 볼 수 없는 더 작은 단편들(절단 산물들)을 포함하는 시료들은 양성(positive)으로 기록된다.
다른 연구자들은 미스매취 분석에서 RNase I의 이용을 설명한다. 예를 들면, Promega는 4가지 공지의 미스매취중 3개를 절단하는 것으로 보고된 RNase I을 포함하는 키트를 시판한다. 다른 연구자들은 단일-염기 미스매취를 탐지하기 위한 MutS 단백질 또는 기타 DNA-복구 효소들의 이용에 대해 설명하였다.
본 발명을 실행할 때 이용할 수 있는 결손, 삽입 또는 치환 돌연변이를 탐지하기 위한 대체 방법들은 미국 특허 제5,849,483호, 제5,851,770호, 제5,866,337호, 제5,925,525호 및 제5,928,870호(이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합됨)에서 설명하고 있다.
상기에서 확인된 돌연변이의 발생에 대해 개인을 스크리닝하기 위하여 스크리닝 방법들을 실행할 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 유전자형 분석을 위하여 환자로부터 시료 (혈액 또는 기타 체액 또는 세포 또는 조직 시료)를 취한다. 예시적인 구체예에서, 이 환자는 암 환자다. 여기에서 설명된 하나 이상의 돌연변이의 존부는 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료법에 스크리닝된 개인이 저항하는 능력을 결정한다. 이 발명에 의해 제공되는 방법에 따르면, 이 결과들을 이용하여 일세대 BRAF 억제제의 약량을 조정 및/또는 변형하거나, 또는 차세대 BRAF 억제제를 이용한 치료 과정을 선택할 것이다. 암을 가진 피험자의 효과적인 치료는 암 세포의 근절, 암 (충실성 종양과 같은) 성장 속도를 중단 또는 감소, 또는 최소한 하나의 암 증상의 개선을 포함할 수 있다.
BRAF 폴리펩티드, 또는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자들에서 저항 돌연변이는 당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법들, 또는 하기에서 설명된 방법들을 포함하는 이의 변형된 방법들을 이용하여 탐지할 수 있다. 이러한 방법들은 대립유전자-특이적 폴리머라제 연쇄 반응, 해당 부위의 직접 또는 간접 서열화, 부위의 해당 대립유전자가 제한 부위를 만들거나 또는 파괴시키는 제한 효소의 이용, 대립유전자-특이적 혼성화 프로브의 이용, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에 특이적인 항체의 이용, 또는 임의의 기타 생화학적 연출의 이용을 포함한다.
1. DNA 서열화
돌연변이를 특징화시키는 가장 흔히 이용되는 방법은 다형성(polymorphism)의 측면 또는 다형성을 포함하는 유전자 좌의 직접적인 DNA 서열화다. 이러한 분석은 "디데옥시-매개된 쇄 중단 방법"-"Sanger Method" (Sanger , F., et al ., 1975) 이라고 하기도 함- 또는 "화학적 변성 방법"-"Maxam-Gilbert method" (Maxam , A. M., et al ., 1977) 방법이라고도 부름-을 이용하여 실시할 수 있다. 게놈 서열-특이적 증폭 기술, 가령, 폴리머라제 연쇄 반응과 복합하여 서열화 방법을 이용하면 바람직한 유전자들의 회수를 용이하게 할 수 있다(Mullis , K. et al ., 1986; European Patent Appln . 50,424; European Patent Appln . 84,796, European Patent Application 258,017, European Patent Appln . 237,362; 유럽 특허 출원 제 201,184; 미국 특허 제4,683,202호; 미국 특허 제4,582,788호; 그리고 미국 특허 제4,683,194호)-이들 모두 여기에 참고자료로 통합됨. 모아진 시료들의 서열화는 Solexa/Illumina 서열화 (Illumina,® San Diego, CA), 피로시퀀싱, 또는 기타 단일-분자 서열화 방법을 이용하여 실시할 수 있다.
2. 엑소뉴클레아제 저항성
돌연변이된 부위에 있는 뉴클레오티드의 정체성을 결정하는데 이용할 수 있는 기타 방법들은 특화된 엑소뉴클레아제-저항성 뉴클레오티드 유도체를 이용한다(미국 특허 제4,656,127호). 다형성 부위에 대해 3'에 바로 대립유전자 서열에 상보적인 프라미어를 조사중인 DNA에 혼성화시킨다. DNA 상에 다형성 부위가 존재하는 특정 엑소뉴클레오티드-저항성 뉴클레오티드 유도체에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 이 유도체는 폴리머라제에 의해 혼성화된 프라이머의 단부에 통합될 것이다. 이러한 병합으로 프라이머는 엑소뉴클레아제 절단에 대해 저항성이 되며, 따라서 이를 탐지할 수 있게 된다. 엑소뉴클레오티드-저항성 유도체의 정체는 공지되어 있기 때문에, 당업자는 DNA의 다형성 부위에 존재하는 특이적 뉴클레오티드를 결정할 수 있다.
3. 마이크로서열화 방법들
DNA에서 돌연변이된 부위들을 분석하기 위한 몇 가지 다른 프라어머-안내된 뉴클레오티드 병합 과정들이 설명된 바 있다.(Komher , J. S. et al ., 1989; Sokolov, B. P., 1990; Syvanen 1990; Kuppuswamy et al ., 1991; Prezant et al ., 1992; Ugozzoll , L. et al ., 1992; Nyren et al ., 1993). 이들 방법들은 돌연변이된 부위에서 염기 간을 구별하기 위하여 라벨된 데옥시뉴클레오티드의 병합에 의존한다. 신호는 병합된 데옥시뉴클레오티드의 수에 비례하기 때문에, 동일한 뉴클레오티드에서 발생되는 돌연변이는 뉴클레오티드의 길이에 비례사는 신호를 초래한다(Syvanen et al ., 1993).
4. 용액내 연장
프랑스 특허 제2,650,840호 및 PCT 출원 번호 WO91/02087은 돌연변이된 부위의 뉴클레오티드의 정체성을 판단하기 위한 용액-기반 방법을 논의한다. 이들 방법에 따르면, 다형성 부위에 3' 인접 대립 유전자 서열에 상보적인 프라이머를 이용한다. 이 부위의 뉴클레오티드의 정체성은 다형성 부위의 뉴클레오티드에 상보적이라면, 프라이머의 단부에 통합된 라벨된 디데옥시뉴클레오티드 유도체를 이용하여 측정한다.
5. Genetic Bit ™ 분석 또는 고형 상( Solid - Phase ) 연장
PCT 출원 92/15712는 라벨된 종료자와 다형성 부위에 3' 서열에 상보적인 프라이머의 혼합물을 이용하는 방법을 설명한다. 통합된 라벨된 종료자는 평가되는 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드에 상보적이며, 따라서 확인된다. 여기에서, 프라이머 또는 표적 분자는 고형상에 고정된다.
6. 올리고뉴클레오티드 결찰 분석 ( OLA )
올리고뉴클레오티드 결찰 분석은 상기에서 설명한 것과는 상이한 방법을 이용하는 고형상 분석이다(Landegren et al ., 1988). 표적 DNA의 단일 스트랜드의 인접 서열에 혼성화될 수 있는 두 개 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 이들 올리고뉴클레오티드중 하나는 바이오티닐화되며, 다른 하나는 탐지가능하도록 라벨된다. 정확한 상보 서열이 표적 분자에서 발견된다면, 이 올리고뉴클레오티드들은 혼성화되어, 이들 말단이 접하여 결찰 기질을 만든다. 결찰은 아비딘을 이용하여 라벨된 올리고뉴클레오티드를 회수할 수 있도록 한다. 이 방법에 근거하여 PCR과 복합된 다른 핵산 탐지 분석법 또한 설명되고 있다(Nickerson et al ., 1990). 여기에서, PCR을 이용하여 표적 DNA의 기하급수적 증폭을 이루고, 이는 OLA를 이용하여 탐지한다.
7. 리게이즈 / 폴리머라제 - 매개된 유전적 비트( Bit ) 분석
미국 특허 제5,952,174호는 표적 분자의 인접 서열들에 혼성화할 수 있는 두 개 프라이머가 관련된 방법을 설명한다. 혼성화된 산물은 표적이 고정된 고형 지지대에서 형성된다. 여기에서 혼성화가 일어나고, 프라이머들은 단일 뉴클레오티드 공간을 두고 서로 분리된다. 폴리머라제, 리게이즈, 그리고 최소한 하나의 데옥시뉴클레오시드 삼인산염을 포함하는 뉴클레오시드 삼인산염 혼합물 존재하에서 이 혼성화된 산물을 항온처리하면 인접하는 혼성화된 올리고뉴클레오티드의 임의의 쌍의 결찰을 가능하게 한다. 리게이즈를 추가하면 신호, 연장 및 결찰이 일어나는데 필요한 두 사건이 발생된다. 이는 연장 또는 결찰 만을 이용한 방법보다 더 높은 특이성과 더 낮은 "노이즈(noise)"를 제공하고, 폴리머라제-기반 분석과는 달리, 이 방법은 제 2 혼성화와 고형 상에 부착되는 신호를 위한 결찰 단계를 복함시킴으로써 폴리머라제 단계의 특이성을 강화시킨다.
8. 핵산 운반 방법들
본 발명의 몇 가지 방법들을 위하여, 핵산 운반 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 조성물들의 발현을 달성하기 위하여 핵산 운반을 위한 적합한 방법들은 핵산(가령, 바이러스 및 비-바이러스 벡터를 포함하는 DNA)이 여기에서 설명된 것과 같이 또는 당업계 공지된 것과 같이, 세포기관, 세포, 조직 또는 유기체로 도입시키는 임의의 방법들을 포함한다. 이러한 방법들은 현미주사(microinjection) (Harlan and Weintraub , 1985; 미국 특허 제5,789,215호, 여기에 참고자료로 통합됨)를 포함한 주사와 같이 DNA의 직접적인 운반(미국 특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 그리고 제5,580,859호, 각각이 여기에 참고자료로 통합됨); 전기천공에 의해(미국 특허 제5,384,253호, 여기에 참고자료로 통합됨); 인산칼슘 침전에 의해(Graham and Van Der Eb , 1973; Chen and Okayama , 1987; Rippe et al ., 1990); 그리고 DEAE-덱스트란과 이어스 폴리에틸렌 글리콜에 의해(Gopal , 1985); 그리고 직접적인 초음파 로딩에 의해(Fechheimer et al ., 1987); 리포좀 매개된 형질감염에 의해(Nicolau and Sene , 1982; Fraley et al ., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al ., 1980; Kaneda et al ., 1989; Kato et al ., 1991); 미세입자투사법(microprojectile bombardment)에 의해 (PCT 출원 WO 94/09699 및95/06128; 미국 특허 제5,610,042호; 제5,322,783호, 제5,563,055호, 제5,550,318호, 제5,538,877호 및 제5,538,880호, 이들 각각은 여기에 참고자료로 통합됨); 탄화규소 섬유에 의한 교반에 의해(Kaeppler et al., 1990; 미국 특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호, 각각은 여기에 참고자료로 통합됨); 그리고 아그로박테리움-매개된 변형에 의해(미국 특허 제5,591,616호 및 제5,563,055호, 각각은 여기에 참고자료로 통합됨); 원형질체의 PEG-매개된 변형에 의해(Omirulleh et al ., 1993; 미국 특허 제4,684,611호 및 제4,952,500호, 각각은 여기에 참고자료로 통합됨); 또는 건조/억제-매개된 DNA 흡수에 의한(Potrykus et al ., 1985) 운반을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들 기술의 적용을 통하여, 세포기관, 세포, 조직 또는 유기체는 안정적으로 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
9. 대립유전자-특이적 항체들
여기에서 설명된 하나 이상의 저항 돌연변이를 보유하는 BRAF 폴리펩티드는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 특이적으로 인지하지만, 야생형 BRAF 폴리펩티드를 인지하지 않는 항체들을 이용하여 탐지할 수 있다. 하나 이상의 저항 돌연변이를 보유하는 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 대립유전자 형에 대해 항체가 생성될 수 있다. 이 펩티드 또는 단백질에 있는 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체들을 유도하기 위하여 항원으로 특이적 단백질 도는 올리고펩티드를 이용하는 기술들은 당업계에 공지되어 있다. 한 구체예에서, 바람직한 대립유전자 형태의 표적 유전자의 DNA 서열은 적합한 발현 벡터로 삽입에 의해 클론되고, 그리고 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 단백질로 해독될 수 있다. 이 단백질은 회수하여 특이적 항체들의 생산을 유도하기 위한 항원으로 이용할 수 있다. 또다른 구체예에서, 바람직한 대립유전자 형태의 표적 유전자의 DNA는 PCR 기술을 이용하여 증폭되고 그리고 후속적으로 시험관에서 단백질로 해독되어 특이적 항체들의 생산을 유도하기 위하여 항원으로 이용될 수 있다. 3번째 구체예는 특이적 항체들의 생산을 유도하기 위하여 항원으로 이용하기 위한 대립 유전자의 아미노산 서열을 나타내는 합성 펩티드의 생성에 근거하여 대체 대립유전자의 DNA 서열을 이용하는 것이다.
항체는 표준 단클론 항체 기술에 의해 생성되거나 또는 재조합 기반 발현 시스템으로 생성될 수 있다. 일반적으로, Abbas , Lichtman , and Pober , Cellular and 분자 Immunology , W. B. Saunders Co . (1991)을 참고. 용어 "항체들"은 고유 항체 분자들 뿐만 아니라 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편들 또는 유도체들, 가령 Fab 및 F(ab')2를 포함한다. 생산된 이 항체들은 이 항체를 만들기 위하여 항원으로 이용되었던 대립유전자형으로 생산된 돌연변이 단백질에만 선호적으로 결합할 것이다. 대립유전자-특이적 항체들을 만드는 방법들은 또한 미국 특허 제6,200,754호 및 미국 특허 제6,054,273호에 설명하고 있으며, 이의 내용 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
당업계에 공지되어 있는 기술로 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에 특이적인 이들 항체들을 이용하여 시료, 가령, 분석 시료, 세포 시료, 세포 추출물, 생물학적 시료, 또는 환자 시료 안에 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 BRAF 폴리펩티드의 존재를 탐지할 수 있다. 이들 기술은 예를 들면, Western 블랏, 면역조직화학, 간접 면역형광, 그리고 항체 마이크로어레이를 포함한다. 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 특이적으로 인지하는 항체들은 또한 차세대 BRAF 억제제들일 수 있다. 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하기 위하여 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 특이적으로 인지하는 항체의 능력은 차세대 BRAF 억제제들을 확인하기 위하여 여기에서 설명된 방법들을 이용하여 측정할 수 있다.
IX . 진단 및 스크리닝 이용
전술한 기술은 환자로부터 수득한 시료안에 BRAF 핵산 또는 폴리펩티드 분자내에 이미 확인된 저항 돌연변이의 존부를 결정하는데 이용될 수 있다. 환자 시료 안에 돌연변이 BRAF 핵산 또는 폴리펩티드 분자의 확인은 환자의 질환 또는 상태를 특징화하는데 유용할 것이다. 예를 들면, BRAF의 이상 발현 또는 활성화와 관련된 질환 (가령, 암)을 가진 환자에서, 환자로부터 수득한 시료 (가령, 암 세포를 포함하는 시료) 안에 돌연변이 BRAF 핵산 또는 폴리펩티드 분자의 확인은 이 환자가 BRAF 억제제를 이용한 치료에 대한 반응의 결여 또는 재발의 상대적으로 높은 위험에 처해있다는 것을 나타낸다. 한 구체예에서, 환자로부터 수득한 암 세포를 포함하는 시료 안에 여기에서 설명된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 BRAF 핵산 또는 폴리펩티드 분자의 확인은 이 환자가 일세대 BRAF 억제제 가령, RAF-265를 이용한 치료에 대한 반응의 결여 또는 상대적으로 높은 재발 위험에 처해있다는 것을 나타낸다.
여기에서 설명된 BRAF 저항 돌연변이를 가진 환자는 BRAF 저항 돌연변이가 탐지되지 않은 환자보다 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료로부터 재발의 위험을 더 많이 가진다. 따라서, 여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "상대적으로 높은 재발 위험"이란 돌연변이 BRAF 핵산 또는 폴리펩티드 분자가 탐지되지 않은 환자와 관련된다. 즉, 돌연변이 BRAF 핵산 또는 폴리펩티드 분자가 탐지되지 않은 환자와 비교하여 "상대적으로 높은 재발 위험"을 가진 환자는 재발 위험이 더 큰 환자다.
특정 구체예들에서, 다음의 잔기중 하나 이상에서 돌연변이를 보유한 BRAF 폴리펩티드, 또는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산의 확인은 이 환자가 일세대 RAF 억제제 가령, RAF-265를 이용한 치료에 대해 상대적으로 높은 재발 위험에 처한 또는 이 치료에 반응이 결여된다는 것을 나타낸다: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748. 예시적인 구체예들에서, 다음의 저항 돌연변이중 하나 이상을 보유한 BRAF 폴리펩티드, 또는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산의 확인은 이 환자가 BRAF 억제제 가령, RAF-265로 치료에 대해 반응이 부족하거나 상대적으로 재발 위험이 높아는 것을 나타낸다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 또는 C748F.
환자 시료 안에 돌연변이 BRAF 핵산 또는 폴리펩티드 분자의 존부 확인은 이 환자를 위한 최적화된 치료의 선별을 가능하게 하거나 또는 이 환자를 특정 치료 군으로 계층화시키는 것을 가능하게 한다. 한 구체예에서, 환자를 위하여 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료를 포함하는 치료 섭생이 선택되며, 여기에서 환자로부터 수득한 암 세포를 포함하는 시료는 돌연변이 BRAF 핵산 또는 폴리펩티드 분자를 포함하지 않는다. 이러한 환자는 일세대 BRAF 억제제를 포함하는 치료 섭생으로 계층화시킬 수 있다. BRAF 억제제는 이러한 환자에게 표준 투약량으로, 표준 투약 간격으로 제공될 것이다.
또다른 구체예에서, BRAF 억제제를 사용하지 않은 치료를 포함하는 치료 섭생이 환자를 위하여 선택되는데, 여기에서 환자로부터 수득한 암 세포를 포함하는 시료에는 돌연변이 BRAF 핵산 또는 폴리펩티드 분자, 가령, 여기에서 설명된 하나 이상의 돌연변이를 가진 BRAF 핵산 또는 폴리펩티드 분자가 포함되어 있다. 이러한 환자는 BRAF 억제제를 포함하지 않은 치료 섭생으로 계층화될 수 있다.
또다른 구체예에서, 일세대 BRAF 억제제의 상승된 투여량으로 치료하는 것을 포함하는 치료 섭생이 환자를 위하여 선택되는데, 여기에서 환자로부터 수득한 암 세포를 포함하는 시료에는 돌연변이 BRAF 핵산 또는 폴리펩티드 분자가 포함된다. 이러한 환자는 상승된 투여량의 일세대 BRAF 억제제를 포함하는 치료 섭생으로 계층화될 수 있다. 전술한 구체예들의 예시적인 측면에서, 일세대 BRAF 억제제는 RAF-265이다.
대안 구체예에서, 환자로부터 수득한 암 세포를 포함하는 시료 안에 돌연변이 BRAF 핵산 또는 폴리펩티드 분자의 존재 확인은 차세대 BRAF 억제제를 이용한 치료에 반응할 여지가 있음을 나타낸다. 따라서, 한 구체예에서, 차세대 BRAF 억제제를 이용한 치료를 포함하는 치료 섭생이 환자를 위하여 선택되고, 여기에서 환자로부터 수득한 암 세포를 포함하는 시료에는 돌연변이 BRAF 핵산 또는 폴리펩티드 분자가 포함된다. 이러한 환자는 차세대 BRAF 억제제를 포함하는 치료 섭생으로 계층화될 수 있다.
전술한 구체예들의 특정 측면에서, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 다음 잔기들중 하나 이상에서 돌연변이를 가진다: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748. 예시적인 구체예들에서, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 다음의 돌연변이중 하나 이상을 가진다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F. 바람직한 구체예에서, 돌연변이 BRAF 핵산 분자는 전술한 아미노산 잔기들중 하나 이상에서 돌연변이를 가진 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드한다.
따라서, 한 구체예에서, 이 발명은 암을 가진 피험자의 치료를 최적화시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이 암 세포로부터 핵산을 추출하고; 그리고 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 서열화하고; 여기에서 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산에서 아미노산 잔기의 정체를 변경시키는 뉴클레오티드가 존재한다는 것은 이 피험자는 MEK 억제제 또는 차세대 RAF 억제제로 치료할 필요가 있음을 말하는 것이다.
또다른 구체예에서, 이 발명은 암을 가진 피험자의 치료를 최적화시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이 암 세포로부터 핵산을 추출하고; 이 시료는 PCR을 거치게 하고, 그리고 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 것을 포함하는데; 여기에서 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산에서 아미노산 잔기의 정체를 변경시키는 뉴클레오티드가 존재한다는 것은 이 피험자는 MEK 억제제 또는 차세대 RAF 억제제로 치료할 필요가 있음을 말하는 것이다.
또다른 구체예에서, 이 발명은 암을 가진 피험자를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이 암 세포로부터 핵산을 추출하고; BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 서열화하고; 그리고 이 핵산 분자가 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산에서 아미노산 잔기의 정체를 변경시키는 뉴클레오티드를 포함할 경우, MEK 억제제 또는 차세대 BRAF 억제제를 투여하는 것을 포함한다.
또다른 구체예에서, 이 발명은 암을 가진 피험자를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이 암 세포로부터 핵산을 추출하고; 이 시료는 PCR을 거치게 하고, 그리고 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 확인하고, 그리고 이 핵산 분자가 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산에서 아미노산 잔기의 정체를 변경시키는 뉴클레오티드를 포함할 경우, MEK 억제제 또는 차세대 BRAF 억제제를 투여하는 것을 포함한다.
또다른 구체예에서, 이 발명은 MEK 억제제를 이용한 치료 또는 차세대 RAF 억제제로부터 효과를 얻을 가능성이 있는 암을 가진 피험자를 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자 안에 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 인코드된 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기들의 정체를 변경시키는 하나 이상의 돌연변이의 존재에 대하여 암으로부터 수득한 핵산 시료를 분석하고; 그리고 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자 내에 하나 이상의 돌연변이의 존재는 MEK 억제제를 이용한 치료 또는 차세대 RAF 억제제로부터 효과를 볼 것 같은 피험자와 상관관계가 있다.
또다른 구체예에서, 이 발명은 MEK 억제제를 이용한 치료 또는 차세대 RAF 억제제로부터 효과를 얻을 가능성이 있는 암을 가진 피험자를 확인하는 방법을 제공하는데, BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자 안에 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 인코드된 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기들의 정체를 변경시키는 하나 이상의 돌연변이의 존재에 대하여 암으로부터 수득한 핵산 시료를 분석하고; 그리고 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자 내에 하나 이상의 돌연변이의 존재는 MEK 억제제를 이용한 치료 또는 차세대 RAF 억제제로부터 효과를 볼 것 같은 피험자와 상관관계가 있다.
전술한 측면들의 다양한 구체예들에서, MEK 억제제는 CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, 6-메톡시-7-(3-몰포린-4-일-프로폭시)-4-(4-펜옥시-페닐아미노)-퀴놀린-3-카르보니트릴 또는 4-[3-클로로-4-(1-메틸-1H-이미다졸-2-yl술파닐)-페닐아미노]-6-메톡시-7-(3-몰포린-4-yl-프로폭시)-퀴놀린-3-카르보니트릴, 또는 이의 조합들이다.
또다른 구체예에서, 이 발명은 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료 과정 동안 높은 재발 위험에 처한 암을 가진 피험자를 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 암 세포로부터 핵산을 추출하고, 그리고 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 서열화하는 것을 포함하는데, 여기에서 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 인코드된 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기들에서 아미노산의 정체를 변경시키는 뉴클레오티드의 존재는 이 피험자가 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료 과정 동안 높은 재발 위험을 가진다는 것을 나타낸다.
또다른 구체예에서, 이 발명은 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료에 무응답인 암을 가진 피험자를 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 암 세포로부터 핵산을 추출하고, 그리고 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 서열화하는 것을 포함하는데, 여기에서 여기에서 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 인코드된 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기들에서 아미노산의 정체를 변경시키는 뉴클레오티드의 존재는 이 피험자가 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료에 무응답인 피험자임을 나타낸다.
전술한 측면의 다양한 구체예들에서, RAF 억제제는 RAF265 또는 PLX 4720이다. 전술한 측면의 일부 구체예들에서, 이 암은 백혈병, 임파종, 골수종, 암종, 전이성 암종, 육종, 선종, 신경계 암 그리고 비뇨생식기 암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구체예들에서, 이 암은 흑색종이다.
X. 치료 방법들
다양한 구체예들에서, 이 발명은 암을 가진 피험자를 치료하는 방법들을 제공한다. 예시적인 구체예들에서, 이 피험자는 하나 이상의 돌연변이, 가령, 여기에서 설명된 하나 이상의 저항 돌연변이를 보유한 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 암을 가진다. 관련된 구체예들에서, 이 피험자는 하나 이상의 돌연변이, 가령, 여기에서 설명된 하나 이상의 저항 돌연변이를 보유한 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 암을 가진다. 용어 "치료된", "치료하는" 또는 "치료"는 치료될 상태와 연관된 최소한 하나의 징후를 감소 또는 경감시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 치료는 암과 같은 질환의 하나 또는 몇 가지 징후의 감소 또는 완벽한 근절일 수 있다. 유사하게, 화합물의 치료학적으로 유효량은 치료될 상태와 연관된 최소한 하나의 징후를 감소 또는 경감시키는데 충분한 양이다.
따라서, 일부 구체예들에서, 이 발명은 암을 가진 피험자를 치료하는 방법들을 제공하는데, 이 방법은 이 피험자에게 차세대 RAF 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예들에서, 이 발명은 암을 가진 피험자를 치료하는 방법들을 제공하는데, 이 방법은 이 피험자에게 MEK 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 전술한 측면들의 예시적인 구체예들에서, 암에서 BRAF 폴리펩티드, 또는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자 내에 하나 이상의 돌연변이가 확인되며, 이 돌연변이는 여기에서 설명된 것과 같이 하나 이상의 BRAF 억제제들에 대해 저항성을 부여한다. 예를 들면, 이 발명은 선택적으로 V600E에서 BRAF 돌연변이를 가지는 것에 추가하여 BRAF에서 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 암을 치료하는 방법들을 제공하고, 이때 전술한 방법은 이 피험자에게 치료학적으로 유효량의 차세대 BRAF 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 이 발명은 선택적으로 V600E에서 BRAF 돌연변이를 가지는 것에 추가하여, BRAF에서 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 암을 치료하는 방법들을 제공하고, 이때 전술한 방법은 이 피험자에게 치료학적으로 유효량의 MEK 억제제를 투여하는 것을 포함한다. MEK는 RAF의 하류에서 활성화되기 때문에, MEK 억제제는 여기에서 설명된 하나 이상의 RAF 저항 돌연변이를 가진 세포내에서 성공적으로 RAF 신호발생을 억제할 수 있다.
본 발명의 실행에 적합한 MEK 억제제들은 I-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, 6-메톡시-7-(3-몰포린-4-yl-프로폭시)-4-(4-펜옥시-페닐아미노)-퀴놀린-3-카르보니트릴, 4-[3-클로로-4-(1-메틸-1H-이미다졸-2-yl술파닐)-페닐아미노]-6-메톡시-7-(3-몰포린-4-yl-프로폭시)-퀴놀린-3-카르보니트릴, 그리고 Roche 화합물 RG7420을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 실행에 적합한 추가 MEK 억제제들은 다음에서 설명된 적합한 이 화합물들을 포함하나 이에 한정되지 않는다: WO 2008076415, US 20080166359, WO 2008067481, WO 2008055236, US 20080188453, US 20080058340, WO 2007014011, WO 2008024724, US 20080081821, WO 2008024725, US 20080085886, WO 2008021389, WO 2007123939, US 20070287709, WO 2007123936, US 20070287737, US 20070244164, WO 2007121481, US 20070238710, WO 2007121269, WO 2007096259, US 20070197617, WO 2007071951, EP 1966155, IN 2008MN01163, WO 2007044084, AU 2006299902, CA 2608201, EP 1922307, EP 1967516, MX 200714540, IN 2007DN09015, NO 2007006412, KR 2008019236, WO 2007044515, AU 2006302415, CA 2622755, EP 1934174, IN 2008DN02771, KR 2008050601, WO 2007025090, US 20070049591, WO 2007014011, AU 2006272837, CA 2618218, EP 1912636, US 20080058340, MX 200802114, KR 2008068637, US 20060194802, WO 2006133417, WO 2006058752, AU 2005311451, CA 2586796, EP 1828184, JP 2008521858, US 20070299103, NO 2007003393, WO 2006056427, AU 2005308956, CA 2587178, EP 1838675, JP 2008520615, NO 2007003259, US 20070293544, WO 2006045514, AU 2005298932, CA 2582247, EP 1802579, CN 101065358, JP 2008517024, IN 2007DN02762, MX 200704781, KR 2007067727, NO 2007002595, JP 2006083133, WO 2006029862, US 20060063814, US 7371869, AU 2005284293, CA 2579130, EP 1791837, CN 101023079, JP 2008513397, BR 2005015371, KR 2007043895, MX 200703166, IN 2007CN01145, WO 2006024034, AU 2005276974, CA 2578283, US 20060079526, EP 1799656, CN 101044125, JP 2008510839, MX 200702208, IN 2007DN02041, WO 2006018188, AU 2005274390, CA 2576599, EP 1781649, CN 101006085, JP 2008509950, BR 2005014515, AT 404556, US 20060041146, MX 200701846, IN 2007CN00695, KR 2007034635, WO 2006011466, AU 2005265769, CA 2575232, EP 1780197, BR 2005013750, JP 4090070, MX 200700736, CN 101124199, KR 2007041752, IN 2007DN01319, WO 2005121142, AU 2005252110, CA 2569850, US 20060014768, US 7378423, EP 1761528, CN 101006086, AT 383360, BR 2005011967, JP 2008501631, EP 1894932, ES 2297723, MX 2006PA14478, NO 2007000155, IN 2007CN00102, KR 2007034581, HK 1107084, JP 2008201788, US 20050256123, US 20050250782, US 20070112038, US 20050187247, WO 2005082891, WO 2005051302, AU 2004293019, CA 2546353, US 20050130943, US 20050130976, US 20050153942, EP 1689233, JP 2007511615, WO 2005051301 AU 2004293018, CA 2545660, US 20050130943, US 20050130976, US 20050153942, EP 1682138, BR 2004016692, CN 1905873, JP 2007511614, MX 2006PA05657, IN 2006DN03183, NO 2006002692, KR 2007026343, WO 2005028426, EP 1674452, US 20070105859, US 20050054701, US 7230099, US 20050049419, US 7144907, AU 2004270699, CA 2537321, WO 2005023759, EP 1673339, BR 2004014111, CN 1874769, JP 2007504241, JP 4131741, US 20060030610, MX 2006PA02466, NO 2006001506, US 20050049419, US 7144907, US 20050054701, US 7230099, AU 2004270699, CA 2537321, WO 2005023759, EP 1673339, BR 2004014111, CN 1874769, JP 2007504241, JP 4131741 US 20060030610, MX 2006PA02466, IN 2006DN01661, NO 2006001506, US 20060189808, US 20060189649, US 7271178, US 20060189668, US 20050049276, WO 2005009975, CA 2532067, EP 1651214, BR 2004012851, JP 2006528621, US 20050026970, US 7160915, MX 2006PA00921, WO 2005007616, US 20050059710, WO 2005000818, US 20050026964, US 7273877, WO 2004056789, US 20050004186, CA 2509405, AU 2003286306, EP 1578736, BR 2003017254, JP 2006516967, MX 2005PA06803, WO 2004044219, AU 2003291268, WO 2004041811, AU 2003278369, EP 1575943, JP 2006508944, US 20050282856, US 7173136, US 20070191346, WO 2004041185, AU 2003287366, US 20060270643, WO 2004030620, AU 2003275282, US 20040092514, US 7232826, EP 1545529, US 20040039037, US 6989451, WO 2003077855, CA 2478534, AU 2003220202, US 20030216460, EP 1482944, CN 1652792, JP 2005526076, RU 2300528, BR 2003006016, MX 2004PA08894, US 20060106225, WO 2003062191, CA 2473545, EP 1467968, BR 2003007060, JP 2005515253, TW 592692, US 20040006245, US 6891066, MX 2004PA05527, US 20050137263, US 7078438, WO 2003062189, CA 2472367, EP 1467965, BR 2003007071, JP 2005515251, US 20030232889, US 6770778, MX 2004PA05528, WO 2003047585, AU 2002347360, WO 2003047583, AU 2002365665, WO 2003047523, CA 2466762, AU 2002365899, US 20030125359, US 7307071, JP 2005526008, EP 1578346, WO 2003035626, CA 2463101, AU 2002359291, EP 1438295, JP 2005508972, US 20050054706, US 7253199, US 20070293555, AU 2008202731, US 6506798, WO 9901421, WO 2000041994, US 6310060, WO 2002006213, CA 2416685, AU 2001073498, BR 2001012584, HU 2003002781, JP 2004504294, JP 3811775, EE 200300030, NZ 524120, AU 2001273498, IN 2003MN00028, NO 2003000249, KR 773621, MX 2003PA00591, HR 2003000083, BG 107564, ZA 2003000348, US 20040054172, US 6960614, HK 1055943, US 20050176820, US 7411001, WO 2000042029, JP 2000204077, CA 2355374, EP 1144394, BR 9916896, TR 200102029, HU 2001005092, JP 2002534515, EE 200100374, NZ 513432, AT 302761, ES 2249060, ZA 2001005219, MX 2001PA06659, IN 2001MN00785, NO 2001003451, HR 2001000525, BG 105801, US 6545030, HK 1042488, US 20030004193, WO 2000042022, JP 2000204079, CA 2355470, EP 1144385, BR 9916904, TR 200102030, HU 2001005113, EE 200100373, JP 2002534510, NZ 513433, AT 302193, ES 2247859, MX 2001PA06568, ZA 2001005224, IN 2001MN00786, US 6469004, NO 2001003452, HR 2001000524, BG 105800, WO 2000042003, JP 2000212157, CA 2349832, EP 1144371, BR 9916885, AT 309205, ES 2252996, MX 2001PA04332, US 6440966, US 20030092748, US 6750217, WO 2000042002, JP 2000204075, CA 2349467, EP 1144372, BR 9916894, JP 2002534497, AT 311363, ES 2251851, MX 2001PA04331, US 6455582, US 20030045521, US 6835749, WO 2000037141, CA 2352326, BR 9916839, EP 1140291, TR 200101871, HU 2001004844, JP 2002532570, EE 200100339, NZ 512859, AT 310567, ES2253928, ZA 2001004277, MX 2001PA05476, IN 2001MN00673, NO 2001003099, HR 2001000473, BG 105715, US 20040171632, GB 2323845, WO 9901426, CA 2290506, AU 9882627, AU 757046, EP 993439, BR 9810366, NZ 501276, HU 2000003731, JP 2002511092, AT 277895, IL 132840, PT 993439, ES 2229515, TW 396149, ZA 9805728, MX 9910649, NO 9906491, NO 315271, US 20030078428, US 6821963, US 20050049429, US 20060052608, US 7169816, WO 9901421, CA 2290509, AU 9882626, AU 756586, EP 993437, BR 9810385, JP 2002509536, NZ 501277, AT 344791, ES 2274572, TW 221831, ZA 9805726, MX 9910556, US 6310060, US 6506798, US 20020022647, US 6492363, US 20030149015, 및 US 7019033(이들 전체 내용은 여기에 참고자료로 통합됨). 전술한 화합물들의 투약량, 조제, 투여 방식들은 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 투여 방식은 경구, 피하, 정맥 또는 장관외를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 경구 투여용 액상 투약형은 약제학적으로 수용가능한 유액, 미소유액, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘륵시르를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 활성 화합물들에 추가하여, 액체 투약형은 당업계에 통상적으로 이용되는 비활성 희석제, 예를 들면, 물 또는 유기 용매, 가용화 물질, 그리고 유화제, 예를 들면, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조네이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일 (특히, 목화씨, 옥수수, 싹, 올리브, 피마자, 그리고 참깨 오일), 크레마포르, 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 비활성 희석제 이외에, 경구 조성물들은 가습제, 유화제, 그리고 현탁제, 감미제, 풍미제 및 향료와 같은 어쥬번트를 또한 포함할 수 있다. 경구 투여용 고형 투약형은 캡슐, 테블릿, 알약, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고형 투약형에서, 활성 화합물은 가령, 물리적인 혼합물 형태의 또는 고형 분산액 형태로 최소한 하나의 비활성, 약제학적으로 수용가능한 부형제 또는 운반체, 가령, 구연산 나트륨 또는 인산이칼슘 및/또는 a) 충진제 또는 증량제 가령, 전분, 락토즈, 슈크로즈, 글루코즈, 만니톨, 그리고 규산, b) 결합제, 가령, 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오즈, 알긴산염, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 슈크로즈 및 아카시아, c) 습윤제, 가령, 글리세롤, d) 붕해제, 가령, 한천-한천, 칼슘 카르보네이트, 전분 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염 및 소듐 카르보네이트, e) 용액 지연제, 가령, 파라핀, f) 흡수 가속화제, 4차 암모늄, g) 습윤제, 가령 예를 들면, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트, h) 흡수제, 가령, 카올린 및 벤토나이트 점토, 그리고 i) 윤활제, 가령, 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고형 폴리에틸렌글리콜, 소듐 라우릴 술페이트, 및 이의 혼합물, 그리고 (j) 용해 속도 강화제, 고분자량 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리비닐 피롤리돈과 혼합될 수 있다. 캡슐, 정제, 알약의 경우, 투약형은 완충제를 또한 포함할 수 있다.
BRAF의 돌연변이는 다양한 유형의 암에서 광범위하게 저항성을 강화시키기 때문에, 여기에서 설명된 방법 및 차세대 BRAF 억제제들은 충실성 종양과 혈액 종양을 포함하는 광범위한 암을 치료하는데 유용하다. 이러한 종양의 예는 백혈병, 임파종, 골수종, 암종, 전이성 암종, 육종, 선종, 신경계 암 및 비뇨생식기 암을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 구체예들에서, 전술한 방법들은 성인 및 소아 급성 임파성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, AIDS-관련된 암, 항문 암, 맹장의 암, 성상세포종, 기저 세포 암종, 담관 암, 방광암, 골암, 골육종, 섬유성 조직구종, 뇌 암, 뇌 줄기 교종, 소뇌 성상세포종, 악성 교종, 상의세포종, 수막아세포종, 천막상부 원시성 신경외배엽종양, 시상하부 교종, 유방 암, 남성 유방 암, 기관지 선종, Burkitt 임파종, 유암종 종양, 원발부위 불명 암, 중추 신경계 임파종, 소뇌 성상세포종, 악성 교종, 경부 암, 어린이 암, 만성 임파성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골증식성 질환, 결장직장 암, 피부 T-세포 임파종, 자궁내막 암, 상의세포종, 식도 암, Ewing 패밀리 종양, 두 개밖 생식 세포 종양, 생식샘밖 생식 세포 종양, 간장밖의 담관 암, 안구내 흑색종, 망막아종, 담낭 암, 위암, 위장 기질 종양, 두 개밖 생식 세포 종양, 생식샘밖 생식 세포 종양, 난소 생식 세포 종양, 임신성 영양막 종양, 교종, 모(hairy) 세포 백혈병, 머리 및 목 암, 간세포 암, Hodgkin 임파종, 비-Hodgkin 임파종, 하인두선 암, 시상하부 및 시각 경로 교종, 섬 세포 종양, Kaposi 육종, 신장 암, 신장 세포 암, 후두 암, 입술과 구강 암, 소 세포 폐암, 비-소 세포 폐암, 원발성 중추신경계임파종, Waldenstrom 거대글로블린혈종, 악성 섬유성 조직구종, 수모세포종, 흑색종, Merkel 세포 암종, 악성 중피종, 비늘모양의 목 암, 다중 내분비 신형성 증후군, 다중 골수종, 균상식육종, 골이형성 증후군, 골증식성 질환, 만성 골증식성 질환, 비강 및 부비동 암, 비인두 암, 신경아종, 구강인후 암, 난소 암, 췌장 암, 부갑상선 암, 페니스 암, 인두 암, 크롬친화세포종, 송과체모세포종 그리고 천막상부 원시성 신경외배엽종양, 뇌하수체 암, 혈장 세포 신생물, 폐모세포종, 전립선 암, 직장 암, 횡문근육종, 타액선 암, 연조직 육종, 자궁 육종, Sezary 증후군, 비-흑색종 피부 암, 소장 암, 편평 세포 암종, 편평 목 암, 천막상부 원시성 신경외배엽종양, 고환 암, 목 암, 가슴샘종 및 가슴 암종, 갑상선 암, 전이성 세포 암, 영양막 종양, 요도 암, 자궁 암, 자궁 육종, 질 암, 외음부 암, 및 Wilms 종양을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
XI . 키트
본 발명의 일부로 다양한 키트가 조립될 수 있다. 키트는 BRAF 억제제를 이용한 치료에 저항성이 발달할 위험에 대해 특정 환자를 평가하고, 이 환자를 위한 대체 요법이 필요한지를 의사가 판단할 수 있도록 BRAF 안에 돌연변이에 대한 분석 성분들을 포함할 수 있다. 이러한 키트는 BRAF 억제제 (가령, RAF-265)에 저항과 관련된 관련 표면형 현시와 관련된 돌연변이를 평가하기 위한 프라이머 세트와 같은 돌연변이 평가를 허용하는 시약을 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열 번호:1의 전부 또는 일부에 동일한 또는 상보적인 프라이머(또는 프라이머 쌍)이 키트의 일부분이 될 수 있다고 본다. 바람직한 구체예들에서, 프라이머들은 다음의 아미노산 잔기들중 하나 이상에서 돌연변이를 가지는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 특이적으로 탐지하거나 또는 증폭시키는데 이용할 수 있다: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748. 예시적인 구체예들에서, 프라이머들은 다음의 하나 이상에서 돌연변이를 가지는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 특이적으로 탐지하거나 또는 증폭시키는데 이용할 수 있다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F. 다른 구체예들에서, 키트는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위하여 서열 번호:1의 전부 또는 일부에 동일한 또는 상보적인 프라이머를 이용하는 지침을 포함한다.
다른 구체예들에서, 키트는 돌연변이를 탐지하기 위한 조성물을 포함하는데, 이 조성물은 하나 이상의 저항 돌연변이를 가지고 있는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 특이적으로 인지하는 항체다. 예시적인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 잔기들중 하나 이상에서 돌연변이를 가지는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 포함한다: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748. 다른 구체예들에서, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 다음의 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F.
상기에서 논의된 특정 방법에 의해 BRAF 돌연변이를 분석하는데 요구되는 모든 기본 재료 및 시약들이 키트 안에 함께 포함될 수 있다. 키트의 성분들이 하나 이상의 액체 용액으로 제공될 경우, 액체 용액은 바람직하게는 수용액, 특히 바람직하게는 멸균 수용액이다.
키트의 성분들은 건조된 또는 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 시약 또는 성분들이 건조된 형태로 제공될 때, 재구성은 일반적으로 적합한 용매를 추가하여 실사한다. 용매는 또한 또다른 용기 수단으로 제공될 수 있다는 것도 생각해본다.
본 발명의 키트는 시판용 닫힌 상태의 바이알에 포함되는 수단을 일반적으로 포함하는데, 가령, 바람직한 바이알들을 유지시키는 주사 도는 송풍-주조된 플라스틱 용기를 포함한다. 다양한 유형의 용기와는 무관하게, 본 발명의 키트는 또한 시료 수거 및 평가를 지원하는 도구를 포함하거나 또는 이 도구와 함께 포장될 수 있다. 이러한 도구는 예를 들면 흡입기, 주사기, 피펫, 핀셋, 계량 스푼, 눈 점적기 또는 의료용으로 승인된 운반 비이클이 될 수 있다.
본 발명의 키트는 환자에게서 특정 돌연변이가 확인되었을 때, 제안된 대안 요법을 약술하는 지침서도 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 이 발명의 키트에 포함된 지침서는 질환, 가령, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드가 확인된 암을 보유한 환자는 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료를 중단하고, 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료 동안 재발에 대해 모니터링하고, 상승된 투약량으로 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료를 지속하고, 또는 차세대 BRAF 억제제를 이용한 치료를 개시하라고 권장할 수 있다. 이 발명의 키트에 포함된 지침서는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드가 탐지되지 않은 질환을 가진 환자는 표준 투약량으로 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료를 계속할 것을 유사하게 권장할 수 있다. 예시적인 구체예들에서, 일세대 BRAF 억제제는 RAF-265이다.
본 발명은 다음의 실시예들을 통하여 더 설명되지만, 이들 실시예로 한정되지는 않는다. 본 출원을 통하여 언급된 모든 참고자료, 특허, 공개된 특허는 여기에 참고자료로 통합된다.
실시예
실시예 1: BRAF - V600E 랜덤 돌연변이 생성 스크린 ( RAF265 및 PLX4720 )
공개된 방법들의 변형을 이용하여 돌연변이된 라이브러리를 얻었다. 간략하게 설명하자면, MutS, MutD5- 및 MutT- DNA 복구 유전자들이 결핍된 대장균에서 (XL1-Red; Stratagene) BRAF(V600E) 발현 플라스미드 (pWZL-Blast-BRAF(V600E))를 증폭시킴으로써 돌연변이 생성을 실행하였다. 이들 세균으로부터 플라스미드 DNA 를 추출하였고, XL1-Blue 대장균(Stratagene)에서 증폭시켰다. 돌연변이된 BRAF(V600E) 플라스미드 또는 돌연변이안된 대조군을 이용하여 A375 흑색종 세포를 형질감염시켰다. 블라스티시딘(blasticidin)을 이용하여 선별한 후, 세포들을 15-cm 배양접시에 도말하였고, 저항 클론이 출현할 때 까지 RAF 억제제들 (RAF265 또는 PLX4720; 각각 2 μM 또는 1.5 μM) 존재하에 배양하였다. 저항 클론을 서열화하여 고빈도로 발생하는 돌연변이를 확인하였다. 그 결과는 도 5 (RAF265 스크린) 및 도 6 (PLX4720 스크린)에 나타낸다. 도 7 은 이들 두 스크린에서 고빈도로 발생하는 3가지 BRAF 돌연변이 위치를 나타낸다.
실시예 2: BRAF 돌연변이들을 포함하는 세포에서 pMEK1 /2 및 pERK1 /2 활성화의 Western 블랏 분석
293T 세포들은 각각의 가상 저항 대립유전자에 대해 6㎍의 pWZL(BLAST)-BRAF으로 형질감염되었고, 그리고 후속적으로 16시간 동안 일정 농도 범위의 BRAF(V600E) 억제제 PLX4720 (0, 0.08, 0.4, 2, 5 및 10 M)로 처리하였다. 표준 과정을 이용하여 면역블랏 연구를 실행하였다. 간략하게 설명하자면, 처리된 세포들은 프로테아제 억제제 (Roche), NaF 및 NaVO3 (각 1mM)를 포함하는 TNN 완충액으로 용해시켰다. 용해물을 정량화하고(Bradford 분석), 변성시키고(95℃), 그리고 SDS 겔 전기영동으로 해리시켰다. 단백질들을 니트로셀룰로오즈 막으로 옮기고, BRAF를 인지하는 1차 항체 (Santa Cruz; 1:10,000 희석), p-ERK1/2, p-MEK1/2 (Ser-217/221), 그리고 α-튜블린 (Cell Signaling Technology; 1:1,000 희석)으로 프로브시켰다. 적합한 2차 항체 (항-토끼 또는 항-마우스 IgG, HRP-linked; 1:1,000 희석) (Cell Signaling Technology)와 함께 항온처리한 후, 화학적 발광(Pierce)을 이용하여 단백질들을 탐지하였다. 결과는 도 8에 나타낸다. 여기에서 나타낸 것과 같이, 포스포릴화된 MEK1/2 및 ERK1/2의 수준은 BRAF-V600E, BRAF-V600E-T521K, 및 BRAF V600E-P686Q을 포함하는 세포들에서 증가된다. 포스포릴화된 MEK1/2 및 ERK1/2의 증가는 PLX4720의 농도를 증가시키면 BRAF-V600E-T521K 및 BRAF V600E-P686Q 세포에서 지속된다.
실시예 3: BRAF 키나제 분석
293T 세포 (70% 합류)는 BRAF(V600E) 추정 저항 대립유전자, 키나제-데드 BRAF, 또는 야생형을 포함하는 15㎍ pc-DNA-DEST40을 이용하여 형질감염시킨다. 형질감염 후 48시간 시점에서, 표준 방법을 이용하여 용해물을 얻었다. 1 mg의 전체 세포 추출물에서 4℃, 30분간 코발트 비드를 이용한 풀-다운(Pull-down)을 실시하였다. 단백질-결합된 코발트 비드는 20㎕ ATP/마그네슘 혼합물(20 mM Mops pH 7.2, 25 mM β-글리세로포스페이트, 5 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM DTT, 75mM MgCl2, 및 0.5mM ATP), 20㎕의 희석 완충액(20 mM Mops, pH 7.2, 25 mM β-글리세롤 포스페이트, 5 mM EGTA, 1 mM 소듐 오르소바나데이트, 1 mM DTT), 그리고 1 ㎍의 비활성 MEK1 (Millipore)와 함께 30분간, 30℃에서 항온처리하였다. 포스포릴화된 MEK1 산물은 p-MEK1/2 항체를 이용한 면역 착색으로 탐지되었다 (Cell Signaling Technology).
대등구( EQUIVALENTS )
이 발명은 특정 실시예 및 구체예들을 참고하여 여기에서 설명되고 있다. 이 발명의 모든 가능한 실시예 및 구체예들을 남김없이 설명하려는 시도는 하지 않는다. 게다가 당업자는 다음의 청구항에서 언급된 바와 같이 본 발명의 의도된 사상 및 범위를 벗어나지 않고 상기 설명된 실시예 및 구체예들에 대해 다양한 추가, 삭제, 변형 및 기타 변화를 만들 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이러한 추가, 삭제, 변형 및 기타 변화 모두 다음의 청구범위내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, INC. <120> BRAF MUTATIONS CONFERRING RESISTANCE TO BRAF INHIBITORS <130> 52930/09137 <140> New Application <141> Concurrently Herewith <150> 61/308,275 <151> 2010-02-25 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2949 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cgcctccctt ccccctcccc gcccgacagc ggccgctcgg gccccggctc tcggttataa 60 gatggcggcg ctgagcggtg gcggtggtgg cggcgcggag ccgggccagg ctctgttcaa 120 cggggacatg gagcccgagg ccggcgccgg cgccggcgcc gcggcctctt cggctgcgga 180 ccctgccatt ccggaggagg tgtggaatat caaacaaatg attaagttga cacaggaaca 240 tatagaggcc ctattggaca aatttggtgg ggagcataat ccaccatcaa tatatctgga 300 ggcctatgaa gaatacacca gcaagctaga tgcactccaa caaagagaac aacagttatt 360 ggaatctctg gggaacggaa ctgatttttc tgtttctagc tctgcatcaa tggataccgt 420 tacatcttct tcctcttcta gcctttcagt gctaccttca tctctttcag tttttcaaaa 480 tcccacagat gtggcacgga gcaaccccaa gtcaccacaa aaacctatcg ttagagtctt 540 cctgcccaac aaacagagga cagtggtacc tgcaaggtgt ggagttacag 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agaggatttt agtctatatg cttgtgcttc tccaaaaaca cccatccagg cagggggata 2340 tggtgcgttt cctgtccact gaaacaaatg agtgagagag ttcaggagag tagcaacaaa 2400 aggaaaataa atgaacatat gtttgcttat atgttaaatt gaataaaata ctctcttttt 2460 ttttaaggtg aaccaaagaa cacttgtgtg gttaaagact agatataatt tttccccaaa 2520 ctaaaattta tacttaacat tggattttta acatccaagg gttaaaatac atagacattg 2580 ctaaaaattg gcagagcctc ttctagaggc tttactttct gttccgggtt tgtatcattc 2640 acttggttat tttaagtagt aaacttcagt ttctcatgca acttttgttg ccagctatca 2700 catgtccact agggactcca gaagaagacc ctacctatgc ctgtgtttgc aggtgagaag 2760 ttggcagtcg gttagcctgg gttagataag gcaaactgaa cagatctaat ttaggaagtc 2820 agtagaattt aataattcta ttattattct taataatttt tctataacta tttcttttta 2880 taacaatttg gaaaatgtgg atgtctttta tttccttgaa gcaataaact aagtttcttt 2940 ttataaaaa 2949 <210> 2 <211> 766 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Glu Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ala Leu Phe Asn Gly Asp Met Glu Pro Glu Ala Gly Ala Gly Ala Gly 20 25 30 Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Asp Pro Ala Ile Pro Glu Glu Val Trp 35 40 45 Asn Ile Lys Gln Met Ile Lys Leu Thr Gln Glu His Ile Glu Ala Leu 50 55 60 Leu Asp Lys Phe Gly Gly Glu His Asn Pro Pro Ser Ile Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Glu Glu Tyr Thr Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gln Gln Arg Glu 85 90 95 Gln Gln Leu Leu Glu Ser Leu Gly Asn Gly Thr Asp Phe Ser Val Ser 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Met Asp Thr Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu 115 120 125 Ser Val Leu Pro Ser Ser Leu Ser Val Phe Gln Asn Pro Thr Asp Val 130 135 140 Ala Arg Ser Asn Pro Lys Ser Pro Gln Lys Pro Ile Val Arg Val Phe 145 150 155 160 Leu Pro Asn Lys Gln Arg Thr Val Val Pro Ala Arg Cys Gly Val Thr 165 170 175 Val Arg Asp Ser Leu Lys Lys Ala Leu Met Met Arg Gly Leu Ile Pro 180 185 190 Glu Cys Cys Ala Val Tyr Arg Ile Gln Asp Gly Glu Lys Lys Pro Ile 195 200 205 Gly Trp Asp Thr Asp Ile Ser Trp Leu Thr Gly Glu Glu Leu His Val 210 215 220 Glu Val Leu Glu Asn Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Val Arg Lys 225 230 235 240 Thr Phe Phe Thr Leu Ala Phe Cys Asp Phe Cys Arg Lys Leu Leu Phe 245 250 255 Gln Gly Phe Arg Cys Gln Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Gln Arg Cys 260 265 270 Ser Thr Glu Val Pro Leu Met Cys Val Asn Tyr Asp Gln Leu Asp Leu 275 280 285 Leu Phe Val Ser Lys Phe Phe Glu His His Pro Ile Pro Gln Glu Glu 290 295 300 Ala Ser Leu Ala Glu Thr Ala Leu Thr Ser Gly Ser Ser Pro Ser Ala 305 310 315 320 Pro Ala Ser Asp Ser Ile Gly Pro Gln Ile Leu Thr Ser Pro Ser Pro 325 330 335 Ser Lys Ser Ile Pro Ile Pro Gln Pro Phe Arg Pro Ala Asp Glu Asp 340 345 350 His Arg Asn Gln Phe Gly Gln Arg Asp Arg Ser Ser Ser Ala Pro Asn 355 360 365 Val His Ile Asn Thr Ile Glu Pro Val Asn Ile Asp Asp Leu Ile Arg 370 375 380 Asp Gln Gly Phe Arg Gly Asp Gly Gly Ser Thr Thr Gly Leu Ser Ala 385 390 395 400 Thr Pro Pro Ala Ser Leu Pro Gly Ser Leu Thr Asn Val Lys Ala Leu 405 410 415 Gln Lys Ser Pro Gly Pro Gln Arg Glu Arg Lys Ser Ser Ser Ser Ser 420 425 430 Glu Asp Arg Asn Arg Met Lys Thr Leu Gly Arg Arg Asp Ser Ser Asp 435 440 445 Asp Trp Glu Ile Pro Asp Gly Gln Ile Thr Val Gly Gln Arg Ile Gly 450 455 460 Ser Gly Ser Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Lys Trp His Gly Asp Val 465 470 475 480 Ala Val Lys Met Leu Asn Val Thr Ala Pro Thr Pro Gln Gln Leu Gln 485 490 495 Ala Phe Lys Asn Glu Val Gly Val Leu Arg Lys Thr Arg His Val Asn 500 505 510 Ile Leu Leu Phe Met Gly Tyr Ser Thr Lys Pro Gln Leu Ala Ile Val 515 520 525 Thr Gln Trp Cys Glu Gly Ser Ser Leu Tyr His His Leu His Ile Ile 530 535 540 Glu Thr Lys Phe Glu Met Ile Lys Leu Ile Asp Ile Ala Arg Gln Thr 545 550 555 560 Ala Gln Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lys Ser Ile Ile His Arg Asp 565 570 575 Leu Lys Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Asp Leu Thr Val Lys Ile 580 585 590 Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His 595 600 605 Gln Phe Glu Gln Leu Ser Gly Ser Ile Leu Trp Met Ala Pro Glu Val 610 615 620 Ile Arg Met Gln Asp Lys Asn Pro Tyr Ser Phe Gln Ser Asp Val Tyr 625 630 635 640 Ala Phe Gly Ile Val Leu Tyr Glu Leu Met Thr Gly Gln Leu Pro Tyr 645 650 655 Ser Asn Ile Asn Asn Arg Asp Gln Ile Ile Phe Met Val Gly Arg Gly 660 665 670 Tyr Leu Ser Pro Asp Leu Ser Lys Val Arg Ser Asn Cys Pro Lys Ala 675 680 685 Met Lys Arg Leu Met Ala Glu Cys Leu Lys Lys Lys Arg Asp Glu Arg 690 695 700 Pro Leu Phe Pro Gln Ile Leu Ala Ser Ile Glu Leu Leu Ala Arg Ser 705 710 715 720 Leu Pro Lys Ile His Arg Ser Ala Ser Glu Pro Ser Leu Asn Arg Ala 725 730 735 Gly Phe Gln Thr Glu Asp Phe Ser Leu Tyr Ala Cys Ala Ser Pro Lys 740 745 750 Thr Pro Ile Gln Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Phe Pro Val His 755 760 765 <210> 3 <211> 2949 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cgcctccctt ccccctcccc gcccgacagc ggccgctcgg gccccggctc tcggttataa 60 gatggcggcg ctgagcggtg gcggtggtgg cggcgcggag ccgggccagg ctctgttcaa 120 cggggacatg gagcccgagg ccggcgccgg cgccggcgcc gcggcctctt cggctgcgga 180 ccctgccatt ccggaggagg tgtggaatat caaacaaatg attaagttga cacaggaaca 240 tatagaggcc ctattggaca aatttggtgg ggagcataat ccaccatcaa tatatctgga 300 ggcctatgaa gaatacacca gcaagctaga tgcactccaa caaagagaac aacagttatt 360 ggaatctctg gggaacggaa ctgatttttc tgtttctagc tctgcatcaa tggataccgt 420 tacatcttct tcctcttcta gcctttcagt gctaccttca tctctttcag tttttcaaaa 480 tcccacagat gtggcacgga gcaaccccaa gtcaccacaa aaacctatcg ttagagtctt 540 cctgcccaac aaacagagga cagtggtacc tgcaaggtgt ggagttacag tccgagacag 600 tctaaagaaa gcactgatga tgagaggtct aatcccagag tgctgtgctg tttacagaat 660 tcaggatgga gagaagaaac caattggttg ggacactgat atttcctggc ttactggaga 720 agaattgcat gtggaagtgt tggagaatgt tccacttaca acacacaact ttgtacgaaa 780 aacgtttttc accttagcat tttgtgactt ttgtcgaaag ctgcttttcc agggtttccg 840 ctgtcaaaca tgtggttata aatttcacca gcgttgtagt acagaagttc cactgatgtg 900 tgttaattat gaccaacttg atttgctgtt tgtctccaag ttctttgaac accacccaat 960 accacaggaa gaggcgtcct tagcagagac tgccctaaca tctggatcat ccccttccgc 1020 acccgcctcg gactctattg ggccccaaat tctcaccagt ccgtctcctt caaaatccat 1080 tccaattcca cagcccttcc gaccagcaga tgaagatcat cgaaatcaat ttgggcaacg 1140 agaccgatcc tcatcagctc ccaatgtgca tataaacaca atagaacctg tcaatattga 1200 tgacttgatt agagaccaag gatttcgtgg tgatggagga tcaaccacag gtttgtctgc 1260 taccccccct gcctcattac ctggctcact aactaacgtg aaagccttac agaaatctcc 1320 aggacctcag cgagaaagga agtcatcttc atcctcagaa gacaggaatc gaatgaaaac 1380 acttggtaga cgggactcga gtgatgattg ggagattcct gatgggcaga ttacagtggg 1440 acaaagaatt ggatctggat catttggaac agtctacaag ggaaagtggc atggtgatgt 1500 ggcagtgaaa atgttgaatg tgacagcacc tacacctcag cagttacaag ccttcaaaaa 1560 tgaagtagga gtactcagga aaacacgaca tgtgaatatc ctactcttca tgggctattc 1620 cacaaagcca caactggcta ttgttaccca gtggtgtgag ggctccagct tgtatcacca 1680 tctccatatc attgagacca aatttgagat gatcaaactt atagatattg cacgacagac 1740 tgcacagggc atggattact tacacgccaa gtcaatcatc cacagagacc tcaagagtaa 1800 taatatattt cttcatgaag acctcacagt aaaaataggt gattttggtc tagctacaga 1860 gaaatctcga tggagtgggt cccatcagtt tgaacagttg tctggatcca ttttgtggat 1920 ggcaccagaa gtcatcagaa tgcaagataa aaatccatac agctttcagt cagatgtata 1980 tgcatttgga attgttctgt atgaattgat gactggacag ttaccttatt caaacatcaa 2040 caacagggac cagataattt ttatggtggg acgaggatac ctgtctccag atctcagtaa 2100 ggtacggagt aactgtccaa aagccatgaa gagattaatg gcagagtgcc tcaaaaagaa 2160 aagagatgag agaccactct ttccccaaat tctcgcctct attgagctgc tggcccgctc 2220 attgccaaaa attcaccgca gtgcatcaga accctccttg aatcgggctg gtttccaaac 2280 agaggatttt agtctatatg cttgtgcttc tccaaaaaca cccatccagg cagggggata 2340 tggtgcgttt cctgtccact gaaacaaatg agtgagagag ttcaggagag tagcaacaaa 2400 aggaaaataa atgaacatat gtttgcttat atgttaaatt gaataaaata ctctcttttt 2460 ttttaaggtg aaccaaagaa cacttgtgtg gttaaagact agatataatt tttccccaaa 2520 ctaaaattta tacttaacat tggattttta acatccaagg gttaaaatac atagacattg 2580 ctaaaaattg gcagagcctc ttctagaggc tttactttct gttccgggtt tgtatcattc 2640 acttggttat tttaagtagt aaacttcagt ttctcatgca acttttgttg ccagctatca 2700 catgtccact agggactcca gaagaagacc ctacctatgc ctgtgtttgc aggtgagaag 2760 ttggcagtcg gttagcctgg gttagataag gcaaactgaa cagatctaat ttaggaagtc 2820 agtagaattt aataattcta ttattattct taataatttt tctataacta tttcttttta 2880 taacaatttg gaaaatgtgg atgtctttta tttccttgaa gcaataaact aagtttcttt 2940 ttataaaaa 2949 <210> 4 <211> 766 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Glu Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ala Leu Phe Asn Gly Asp Met Glu Pro Glu Ala Gly Ala Gly Ala Gly 20 25 30 Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Asp Pro Ala Ile Pro Glu Glu Val Trp 35 40 45 Asn Ile Lys Gln Met Ile Lys Leu Thr Gln Glu His Ile Glu Ala Leu 50 55 60 Leu Asp Lys Phe Gly Gly Glu His Asn Pro Pro Ser Ile Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Glu Glu Tyr Thr Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gln Gln Arg Glu 85 90 95 Gln Gln Leu Leu Glu Ser Leu Gly Asn Gly Thr Asp Phe Ser Val Ser 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Met Asp Thr Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu 115 120 125 Ser Val Leu Pro Ser Ser Leu Ser Val Phe Gln Asn Pro Thr Asp Val 130 135 140 Ala Arg Ser Asn Pro Lys Ser Pro Gln Lys Pro Ile Val Arg Val Phe 145 150 155 160 Leu Pro Asn Lys Gln Arg Thr Val Val Pro Ala Arg Cys Gly Val Thr 165 170 175 Val Arg Asp Ser Leu Lys Lys Ala Leu Met Met Arg Gly Leu Ile Pro 180 185 190 Glu Cys Cys Ala Val Tyr Arg Ile Gln Asp Gly Glu Lys Lys Pro Ile 195 200 205 Gly Trp Asp Thr Asp Ile Ser Trp Leu Thr Gly Glu Glu Leu His Val 210 215 220 Glu Val Leu Glu Asn Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Val Arg Lys 225 230 235 240 Thr Phe Phe Thr Leu Ala Phe Cys Asp Phe Cys Arg Lys Leu Leu Phe 245 250 255 Gln Gly Phe Arg Cys Gln Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Gln Arg Cys 260 265 270 Ser Thr Glu Val Pro Leu Met Cys Val Asn Tyr Asp Gln Leu Asp Leu 275 280 285 Leu Phe Val Ser Lys Phe Phe Glu His His Pro Ile Pro Gln Glu Glu 290 295 300 Ala Ser Leu Ala Glu Thr Ala Leu Thr Ser Gly Ser Ser Pro Ser Ala 305 310 315 320 Pro Ala Ser Asp Ser Ile Gly Pro Gln Ile Leu Thr Ser Pro Ser Pro 325 330 335 Ser Lys Ser Ile Pro Ile Pro Gln Pro Phe Arg Pro Ala Asp Glu Asp 340 345 350 His Arg Asn Gln Phe Gly Gln Arg Asp Arg Ser Ser Ser Ala Pro Asn 355 360 365 Val His Ile Asn Thr Ile Glu Pro Val Asn Ile Asp Asp Leu Ile Arg 370 375 380 Asp Gln Gly Phe Arg Gly Asp Gly Gly Ser Thr Thr Gly Leu Ser Ala 385 390 395 400 Thr Pro Pro Ala Ser Leu Pro Gly Ser Leu Thr Asn Val Lys Ala Leu 405 410 415 Gln Lys Ser Pro Gly Pro Gln Arg Glu Arg Lys Ser Ser Ser Ser Ser 420 425 430 Glu Asp Arg Asn Arg Met Lys Thr Leu Gly Arg Arg Asp Ser Ser Asp 435 440 445 Asp Trp Glu Ile Pro Asp Gly Gln Ile Thr Val Gly Gln Arg Ile Gly 450 455 460 Ser Gly Ser Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Lys Trp His Gly Asp Val 465 470 475 480 Ala Val Lys Met Leu Asn Val Thr Ala Pro Thr Pro Gln Gln Leu Gln 485 490 495 Ala Phe Lys Asn Glu Val Gly Val Leu Arg Lys Thr Arg His Val Asn 500 505 510 Ile Leu Leu Phe Met Gly Tyr Ser Thr Lys Pro Gln Leu Ala Ile Val 515 520 525 Thr Gln Trp Cys Glu Gly Ser Ser Leu Tyr His His Leu His Ile Ile 530 535 540 Glu Thr Lys Phe Glu Met Ile Lys Leu Ile Asp Ile Ala Arg Gln Thr 545 550 555 560 Ala Gln Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lys Ser Ile Ile His Arg Asp 565 570 575 Leu Lys Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Asp Leu Thr Val Lys Ile 580 585 590 Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His 595 600 605 Gln Phe Glu Gln Leu Ser Gly Ser Ile Leu Trp Met Ala Pro Glu Val 610 615 620 Ile Arg Met Gln Asp Lys Asn Pro Tyr Ser Phe Gln Ser Asp Val Tyr 625 630 635 640 Ala Phe Gly Ile Val Leu Tyr Glu Leu Met Thr Gly Gln Leu Pro Tyr 645 650 655 Ser Asn Ile Asn Asn Arg Asp Gln Ile Ile Phe Met Val Gly Arg Gly 660 665 670 Tyr Leu Ser Pro Asp Leu Ser Lys Val Arg Ser Asn Cys Pro Lys Ala 675 680 685 Met Lys Arg Leu Met Ala Glu Cys Leu Lys Lys Lys Arg Asp Glu Arg 690 695 700 Pro Leu Phe Pro Gln Ile Leu Ala Ser Ile Glu Leu Leu Ala Arg Ser 705 710 715 720 Leu Pro Lys Ile His Arg Ser Ala Ser Glu Pro Ser Leu Asn Arg Ala 725 730 735 Gly Phe Gln Thr Glu Asp Phe Ser Leu Tyr Ala Cys Ala Ser Pro Lys 740 745 750 Thr Pro Ile Gln Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Phe Pro Val His 755 760 765

Claims (66)

  1. BRAF 활성을 보유한 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 단리된 핵산 분자에 있어서, 여기에서 전술한 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드 (서열 번호: 2) 또는 BRAF V600E 폴리펩티드 (서열 번호:4)와 비교하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 보유하는 아미노산 서열을 포함하며, 최소한 하나의 아미노산 치환은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에서 하나 이상의 BRAF 억제제들에 대해 저항성을 부여하는 것을 특징으로 하는, 단리된 핵산 분자.
  2. 청구항 1에 있어서, 여기에서 최소한 하나의 아미노산 치환은 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에서 일어나는, 단리된 핵산 분자.
  3. 청구항 1에 있어서, 여기에서 최소한 하나의 아미노산 치환은 A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F로 구성된 군으로부터 선택된, 단리된 핵산 분자.
  4. 청구항 1에 있어서, 여기에서 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드 또는 BRAF V600E 폴리펩티드와 비교하여 1 내지 5개의 아미노산 치환을 보유하는, 단리된 핵산 분자.
  5. 청구항 1에 있어서, 여기에서 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드 또는 BRAF V600E 폴리펩티드와 비교하여 한 개의 아미노산 치환을 보유하는, 단리된 핵산 분자.
  6. 청구항 1에 있어서, 여기에서 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 아미노산 위치 T521K, V528F, 또는 P686Q중 하나 이상에서 치환을 포함하는 BRAF 폴리펩티드인, 단리된 핵산 분자.
  7. 청구항 1 내지 6 중 임의의 한 항에 있어서, 여기에서 BRAF 억제제는 RAF-265 또는 PLX4720인, 단리된 핵산 분자.
  8. 청구항 1 내지 7 중 임의의 한 항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  9. 청구항 8에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  10. 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 만드는 방법에 있어서, 청구항 9의 숙주 세포를 배양하여, 이 세포에 의해 돌연변이 BRAF 폴리펩티드가 생성되는 것을 포함하는, 방법.
  11. BRAF 활성을 보유한 단리된 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에 있어서,여기에서 전술한 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드 (서열 번호: 2) 또는 BRAF V600E 폴리펩티드 (서열 번호:4)와 비교하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 보유한 아미노산 서열을 포함하고, 최소한 하나의 아미노산 치환은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에서 하나 이상의 BRAF 억제제에 대해 저항성을 부여하는 것을 특징으로 하는, 단리된 돌연변이 BRAF폴리펩티드.
  12. 청구항 11에 있어서, 최소한 하나의 아미노산 치환은 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에서 일어나는, 단리된 돌연변이 BRAF폴리펩티드.
  13. 청구항 11에 있어서, 최소한 하나의 아미노산 치환은 A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F로 구성된 군으로부터 선택된, 단리된 돌연변이 BRAF폴리펩티드.
  14. 청구항 11에 있어서, 야생형 BRAF 폴리펩티드 또는 BRAF V600E 폴리펩티드와 비교하여 1 내지 5개의 아미노산 치환을 보유하는, 단리된 돌연변이 BRAF폴리펩티드.
  15. 청구항 11에 있어서, 야생형 BRAF 폴리펩티드 또는 BRAF V600E 폴리펩티드와 비교하여 한 개의 아미노산 치환을 보유하는, 단리된 돌연변이 BRAF폴리펩티드.
  16. 청구항 11 내지 15 중 임의의 한 항에 있어서, BRAF 억제제는 RAF-265인, 단리된 돌연변이 BRAF폴리펩티드.
  17. 암을 치료하는데 유용한 화합물을 확인하는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 청구항 11의 돌연변이 BRAF 폴리펩티드와 BRAF 기질을 포함하는 분석 조성물을 제공하고;
    (b) 테스트 화합물 없이 BRAF 기질의 포스포릴화를 허용하는 조건하에서 상기 분석 조성물에 이 테스트 화합물을 접촉시키고, 그리고
    (c) BRAF 기질의 포스포릴화에서 이 화합물의 효과를 측정하고;
    여기에서 적합한 대조군과 비교하여 BRAF 기질의 포스포릴화의 하향조절은 테스트 화합물이 암을 치료하는데 유용한 화합물임을 확인시키는 것이다.
  18. 화합물이 차세대 BRAF 억제제임을 확인하는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 청구항 11의 돌연변이 BRAF 폴리펩티드와 BRAF 기질을 포함하는 분석 조성물을 제공하고;
    (b) 테스트 화합물 없이 BRAF 기질의 포스포릴화를 허용하는 조건하에서 상기 분석 조성물에 이 테스트 화합물을 접촉시키고, 그리고
    (c) BRAF 기질의 포스포릴화에서 이 화합물의 효과를 측정하고;
    여기에서 적합한 대조군과 비교하여 BRAF 기질의 포스포릴화의 하향조절은 테스트 화합물이 차세대 BRAF 억제제임을 확인시키는 것이다.
  19. 청구항 17 또는 18에 있어서, BRAF 기질은 MEK1 또는 MEK2인, 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, MEK1 또는 MEK2의 포스포릴화는 포스포-특이적 MEK 항체를 이용하여 측정하는, 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, MEK1 또는 MEK2의 포스포릴화는 미엘린 염기성 단백질 (MBP)의 포스포릴화를 측정함으로써 결정되는, 방법.
  22. 청구항 17 또는 18에 있어서, 분석 조성물은 세포 추출물인, 방법.
  23. 암을 치료하는데 유용한 화합물을 확인하는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 청구항 11의 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공하고;
    (b) 이 세포에 테스트 화합물을 접촉시키고, 그리고
    (c) BRAF 기질의 포스포릴화에 있어서 이 화합물의 효과를 측정하고
    여기에서 적합한 대조군과 비교하여 BRAF 기질의 포스포릴화의 하향조절은 이 화합물이 암 치료에 유용한 화합물임을 확인시킨다.
  24. 암을 치료하는데 유용한 화합물을 확인하는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 청구항 11의 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공하고;
    (b) 이 세포에 테스트 화합물을 접촉시키고, 그리고
    (c) 세포 증식에 있어서 이 화합물의 효과를 측정하고
    여기에서 적합한 대조군과 비교하여 세포 증식의 감소는 이 화합물이 암 치료에 유용한 화합물임을 확인시킨다.
  25. 차세대 BRAF 억제제인 화합물을 확인하는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 청구항 11의 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공하고;
    (b) 이 세포에 테스트 화합물을 접촉시키고, 그리고
    (c) BRAF 기질의 포스포릴화에 있어서 이 화합물의 효과를 측정하고
    여기에서 적합한 대조군과 비교하여 BRAF 기질의 포스포릴화의 하향조절은 이 화합물이 차세대 BRAF 억제제임을 확인시켜준다.
  26. 차세대 BRAF 억제제인 화합물을 확인하는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 청구항 11의 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공하고;
    (b) 이 세포에 테스트 화합물을 접촉시키고, 그리고
    (c) 세포 증식에 있어서 이 화합물의 효과를 측정하고
    여기에서 적합한 대조군과 비교하여 세포 증식의 감소는 이 화합물이 차세대 BRAF 억제제임을 확인시켜준다.
  27. 청구항 23 또는 25에 있어서, BRAF 기질은 MEK1 또는 MEK2인, 방법.
  28. 테스트 화합물이 차세대 BRAF 억제제임을 확인하는 세포-기반 스크리닝 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 9의 숙주 세포에 테스트 화합물을 접촉시키는 것을 포함하고, 여기에서 테스트 화합물에 대한 숙주 세포의 감응성은 이 화합물이 차세대 BRAF 억제제임을 확인시켜주는, 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 테스트 화합물에 대한 숙주 세포의 감응성은 세포 증식 분석, 세포 생존력 분석, 그리고 MEK 포스포릴화 분석으로 구성된 군으로부터 선택된 분석을 이용하여 측정하며, 여기에서 이 테스트 화합물 존재하에, 세포 증식, 세포 생존력, 또는 MEK 포스포릴화의 감소는 이 화합물이 차세대 BRAF 억제제임을 확인시켜주는, 방법.
  30. 차세대 BRAF 억제제를 확인하는, 다음을 포함하는 방법:
    돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 3차원 결정 또는 용액 구조의 컴퓨터-지원된 모델링을 이용하여 가망 약물을 선택하고, 여기에서 전술한 돌연변이 BRAF 폴리펩티드는 야생형 BRAF 폴리펩티드 또는 BRAF V600E 폴리펩티드와 비교하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 보유한 아미노산 서열을 포함하며, 최소한 하나의 아미노산 치환은 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에 하나 이상의 BRAF 억제제들에 대해 저항성을 부여하고;
    전술한 가망 약물에 돌연변이 BRAF 폴리펩티드를 접촉시키고; 그리고
    전술한 가망 약물과 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 상호작용을 탐지하고; 여기에서 돌연변이 BRAF 폴리펩티드와 상호작용할 수 있는 화합물은 차세대 BRAF 억제제임을 확인시킨다.
  31. 청구항 17 내지 30 중 임의의 한 항에 있어서, 이 테스트 화합물은 화합물들의 라이브러리의 구성멤버인, 방법.
  32. 청구항 17 내지 30 중 임의의 한 항에 따른 방법에 의해 확인된, 단리된 화합물.
  33. 청구항 17 내지 30 중 임의의 한 항에 따른 방법에 의해 확인된 화합물을 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에 접촉시키는 것을 포함하는, 돌연변이 BRAF 폴리펩티드의 활성을 억제하는, 방법.
  34. 청구항 33에 있어서, 이 화합물은 야생형 BRAF 폴리펩티드의 활성을 한층 더 억제하는, 방법.
  35. 청구항 33에 있어서, 전술한 접촉은 시험관에서 일어나는 방법.
  36. 청구항 33에 있어서, 전술한 접촉은 생체내에서 일어나는 방법.
  37. 청구항 33에 있어서, 전술한 접촉은 피험자에서 일어나는 방법.
  38. 청구항 33에 있어서, 전술한 접촉은 암을 가진 피험자에서 일어나는 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 이 피험자는 RAF-265을 이용한 치료에서 재발한 환자인, 방법.
  40. 청구항 38 또는 39에 있어서, 이 암은 흑색종인, 방법.
  41. 청구항 17 내지 30 중 임의의 한 항에 따른 방법에 의해 확인된 화합물을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 암을 가진 피험자를 치료하는, 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 이 화합물은 야생형 BRAF 폴리펩티드의 활성을 한층 더 억제하는 방법.
  43. 청구항 41 또는 42에 있어서, 이 피험자는 RAF-265을 이용한 치료에서 재발한 환자인, 방법.
  44. 청구항 41 내지 43 중 임의의 한 항에 있어서, BRAF 폴리펩티드에서 하나 이상의 돌연변이, 또는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자에서 하나 이상의 돌연변이는 이 암에서 확인되며, 여기에서 하나 이상의 돌연변이는 돌연변이 BRAF 폴리펩티드에서 하나 이상의 BRAF 억제제들에 대해 저항성을 부여하는, 방법.
  45. 청구항 41 내지 44 중 임의의 한 항에 있어서, 이 암은 흑색종인, 방법.
  46. RAF 억제제를 이용한 치료에 저항성을 부여하는 BRAF 돌연변이에 대해 암을 가진 피험자를 스크리닝하는, 다음을 포함하는 방법
    (a) 암 세포를 포함하는 시료를 피험자로부터 구하고; 그리고
    (b) 시료 안에서 야생형 BRAF 폴리펩티드 (서열 번호:1) 또는 BRAF V600E 폴리펩티드 (서열 번호:3)를 인코드하는 핵산 분자에 대해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 확인하고, 돌연변이는 BRAF 폴리펩티드의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 인코드하는 위치에서 발생하며,
    여기에서 암 세포-함유된 시료내에서 이 핵산 분자의 존재는 이 피험자가 RAF 억제제를 이용한 치료에 저항성임을 확인시켜준다.
  47. 청구항 46에 있어서, 핵산 분자는 야생형 BRAF 폴리펩티드 (서열 번호:2) 또는 BRAF V600E 폴리펩티드 (서열 번호:4)에 대해 A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, 및 C748F로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 보유한 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는, 방법.
  48. 청구항 46에 있어서, 암 세포-함유된 시료내에서 이 핵산 분자의 존재는 이 피험자가 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료 과정동안 상대적으로 높은 재발 위험을 보유한다는 것을 확인시켜주는, 방법.
  49. 청구항 46에 있어서, 암 세포-함유된 시료내에서 이 핵산 분자의 존재는 이 피험자가 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료에 무응답임을 확인시켜주는, 방법.
  50. 청구항 48 또는 49에 있어서, 일세대 BRAF 억제제는 RAF-265인, 방법.
  51. 청구항 46에 있어서, 암 세포-함유된 시료내에서 이 핵산 분자의 존재는 이 피험자를 차세대 BRAF 억제제를 이용한 치료로 계층화시키는, 방법.
  52. 청구항 46 내지 51 중 임의의 한 항에 있어서, 암 세포-함유된 시료내에서 이 핵산 분자의 존재는 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자의 서열을 결정하는 것을 포함하는 방법에 의해 측정되는, 방법.
  53. 청구항 46 내지 51 중 임의의 한 항에 있어서, 암 세포-함유된 시료내에서 이 핵산 분자의 존재는 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 돌연변이를 포함하는 BRAF 폴리펩티드를 특이적으로 인지하는 항체를 이용하여 핵산 분자에 의해 인코드된 폴리펩티드를 탐지함으로써 측정되는, 방법.
  54. 청구항 46 내지 53 중 임의의 한 항에 있어서, BRAF 폴리펩티드 안에 하나 이상의 돌연변이의 존재가 탐지된 피험자에게 청구항 32의 화합물을 투여하는 것을 더 포함하는, 방법.
  55. 암을 가진 피험자의 치료를 최적화시키는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 암 세포로부터 핵산을 추출하고; 그리고
    (b) BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 서열화하고;
    여기에서 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 인코드된 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산에서 아미노산의 정체성을 변경시키는 뉴클레오티드의 존재는 이 피험자가 MEK 억제제 또는 차세대 RAF 억제제로 치료를 받을 필요가 있음을 나타낸다.
  56. 암을 가진 피험자의 치료를 최적화시키는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 암 세포로부터 핵산을 추출하고; 그리고
    (b) 시료를 PCR하고 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 확인하고;
    여기에서 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 인코드된 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산에서 아미노산의 정체성을 변경시키는 뉴클레오티드의 존재는 이 피험자가 MEK 억제제 또는 차세대 RAF 억제제로 치료를 받을 필요가 있음을 나타낸다.
  57. 암을 가진 피험자를 치료하는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 암 세포로부터 핵산을 추출하고;
    (b) BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 서열화하고; 그리고
    (c) 여기에서 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 인코드된 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산에서 아미노산의 정체성을 변경시키는 뉴클레오티드가 핵산 분자에 포함되어 있을 때, MEK 억제제 또는 차세대 BRAF 억제제를 이 피험자에게 투여한다.
  58. 암을 가진 피험자를 치료하는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 암 세포로부터 핵산을 추출하고; 그리고
    (b) 시료를 PCR하고 BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 확인하고;
    (c) 여기에서 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 인코드된 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산에서 아미노산의 정체성을 변경시키는 뉴클레오티드가 핵산 분자에 포함되어 있을 때, MEK 억제제 또는 차세대 BRAF 억제제를 이 피험자에게 투여한다.
  59. MEK 억제제 또는 차세대 RAF 억제제를 이용한 치료가 유익할 것 같은 암을 가진 피험자를 확인하는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자에 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 인코드된 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산에서 아미노산의 정체성을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이의 존재에 대해 암으로부터 수득한 시료를 분석하고, 그리고
    (b) BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자에 하나 이상의 돌연변이의 존재는 MEK 억제제 또는 차세대 RAF 억제제를 이용한 치료로 효과를 얻을 것 같은 피험자와 관련된다.
  60. MEK 억제제 또는 차세대 RAF 억제제를 이용한 치료가 유익할 것 같은 암을 가진 피험자를 확인하는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자에 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 인코드된 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산에서 아미노산의 정체성을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이의 존재에 암으로부터 수득한 시료를 분석하고, 그리고
    (b) BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자에 하나 이상의 돌연변이의 존재는 MEK 억제제 또는 차세대 RAF 억제제를 이용한 치료로 효과를 얻을 것 같은 피험자와 관련된다.
  61. 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료 동안 높은 재발 위험을 가진 암을 가진 피험자를 확인하는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 암 세포로부터 핵산을 추출하고;
    (b) BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 서열화하고; 그리고
    (c) 여기에서 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 인코드된 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산에서 아미노산의 정체성을 변경시키는 뉴클레오티드의 존재는 이 피험자가 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료 동안 높은 재발 위험을 가진다는 것을 확인시킨다.
  62. 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료에 무응답인 암을 가진 피험자를 확인하는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 암 세포로부터 핵산을 추출하고;
    (b) BRAF 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 서열화하고; 그리고
    (c) 여기에서 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, 및 C748로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 있는 아미노산에 대해 인코드된 BRAF 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산에서 아미노산의 정체성을 변경시키는 뉴클레오티드의 존재는 이 피험자가 일세대 BRAF 억제제를 이용한 치료에 무응답임을 확인시켜 준다.
  63. 청구항 55 내지 60 중 임의의 한 항에 있어서, MEK 억제제는 CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, 6-메톡시-7-(3-몰포린-4-yl-프로폭시)-4-(4-펜옥시-페닐아미노)-퀴놀린-3-카르보니트릴 및 4-[3-클로로-4-(1-메틸-1H-이미다졸-2-yl술파닐)-페닐아미노]-6-메톡시-7-(3-몰포린-4-yl-프로폭시)-퀴놀린-3-카르보니트릴로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  64. 청구항 61 내지 62 중 임의의 한 항에 있어서, RAF 억제제는 RAF265 또는 PLX 4720인, 방법.
  65. 청구항 55 내지 64중 임의의 한 항에 있어서, 이 암은 백혈병, 임파종, 골수종, 암종, 전이성 암종, 육종, 선종, 신경계 암 및 비뇨생식기 암으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  66. 청구항 55 내지 64중 임의의 한 항에 있어서, 이 암은 흑색종인, 방법.
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