MX2012009784A - Mutaciones del protooncogen de serina/treonina-proteina cinasa b-raf (braf) que confieren resistencia a los inhibidores del protooncogen de serina/treonina-proteina cinasa b-raf. - Google Patents

Mutaciones del protooncogen de serina/treonina-proteina cinasa b-raf (braf) que confieren resistencia a los inhibidores del protooncogen de serina/treonina-proteina cinasa b-raf.

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Abstract

La presente invención se relaciona con métodos, composiciones y equipos con respecto a la resistencia al tratamiento con un agente anticanceroso, de manera específica un inhibidor de BRAF. En las modalidades particulares, la invención se relaciona con mutaciones en una secuencia de BRAF que confieren resistencia a un inhibidor de BRAF. La identificación de tales mutaciones en la secuencia de BRAF permite la identificación y el diseño de inhibidores de BFAF de segunda generación. Los métodos y equipos para detectar la presencia de una secuencia de BRAF mutante en una muestra también se proporcionan.

Description

MUTACIONES DEL PROTOONCOGEN DE SERINA/TREONINA-PROTEÍNA CINASA B-RAF (BRAF) QUE CONFIEREN RESISTENCIA A LOS INHIBIDORES DEL PROTOONCOGEN DE SERINA/TREONINA-PROTEÍNA CINASA B-RAF SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad de la USSN 61/308,275, presentada en Febrero 25 del 2010. El contenido de esta solicitud se incorpora en la presente como referencia .
APOYO GUBERNAMENTAL Esta invención se hizo con el apoyo gubernamental bajo la Beca No. K08 CA115927, otorgada por los Institutos Nacionales de Salud. El Gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El tratamiento del cáncer es uno de los desafíos más grandes de la medicina moderna. Aunque los agentes quimioterapéuticos son típicamente un medio efectivo para tratar o reducir los síntomas asociados con el cáncer, en algunos casos, se manifiesta la resistencia a uno o más agentes quimioterapéuticos durante el tratamiento. Como resultado, un agente quimioterapéutico dado puede volverse inefectivo en ciertos individuos. El mecanismo molecular responsable del desarrollo de la resistenica en varios tipos de cáncer se entiende de manera deficiente. La determinación de los mecanismos que subyacen a la resistencia a los agentes específicos es esencial para descubrir procedimientos de tratamiento que eviten de manera efectiva la resistencia al fármaco.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece a la resistencia mediada por la mutación al tratamiento quimioterapéutico del cáncer. En las modalidades específicas, la presente invención está dirigida a mutaciones identificadas en los polipéptidos de RAF (por ejemplo, polipéptidos de BRAF) , y las moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de RAF. Estas mutaciones confieren resistencia a los inhibidores de RAF actualmente en uso terapéutico. La identificación de estas mutaciones permite el desarrollo de inhibidores de RAF de segunda generación, que exhiben actividad contra un polipéptido de RAF que contiene una o más mutaciones, tales como las mutaciones descritas en la presente. Tales inhibidores de RAF de segunda generación son útiles en muchas aplicaciones clínicas y terapéuticas, incluyendo el tratamiento del cáncer.
En consecuencia, la invención tiene como característica, en un primer aspecto, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de BRAF mutante que tiene actividad de BRAF, en donde el polipéptido de BRAF mutante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una sustitución de aminoácidos, en comparación con un polipéptido de BRAF del tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) o un polipéptido de BRAF V600E (SEQ ID NO:4) , al menos una sustitución de aminoácidos confiere resistencia a uno o más inhibidores de BRAF en el polipéptido de BRAF mutante. En ciertas modalidades de este aspecto, al menos una sustitución de aminoácidos ocurre en una o más de las siguientes posiciones de los aminoácidos: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En las modalidades ejemplares, al menos una sustitución de aminoácidos es una o más de las siguientes: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
En una modalidad del aspecto anterior, el polipéptido de BRAF mutante tiene una a cinco sustituciones de aminoácidos, en comparación con el polipéptido de BRAF del tipo silvestre o el polipéptido de BRAF V600E. En las modalidades ejemplares, el polipéptido de BRAF mutante tiene una sustitución de aminoácidos. En otra modalidad ejemplar, el polipéptido de BRAF mutante es un BRAF que comprende una sustitución en una o más de las siguientes posiciones de los aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4: V528, T521 y/o P686. En algunas modalidades de los aspectos anteriores, el inhibidor de BRAF es RAF-265.
Las moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polipéptidos de RAF mutantes pueden insertarse en un vector de expresión y expresarse en una célula hospedera. En consecuencia, en otro aspecto, la invención tiene como característica un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico expuesta en la presente. En otro aspecto, la invención tiene como característica una célula hospedera que comprende el vector de expresión anterior. En otro aspecto, la invención tiene como característica, un método para producir un polipéptido de BRAF mutante, que comprende cultivar una célula hospedera que contiene un vector de expresión que codifica un polipéptido de BRAF mutante, de manera que un polipéptido de BRAF mutante es producido por la célula.
En otras modalidades, la invención tiene "como característica, polipéptidos de BRAF mutantes aislados, en donde los polipéptidos de BRAF mutantes comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una sustitución de aminoácidos, en comparación con un polipéptido de BRAF del tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) o un polipéptido de BRAF V600E (SEQ ID N0:4), al menos una sustitución de aminoácidos confiere resistencia a uno o más inhibidores de BRAF n el polipéptido de BRAF mutante . En las modalidades preferidas, los polipéptidos de BRAF mutantes aislados tienen una actividad de un polipéptido de BRAF del tipo silvestre. En una modalidad del aspecto anterior, al menos una sustitución de aminoácidos ocurre en una o más posiciones de los aminoácidos, seleccionadas de lo siguiente: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En las modalidades ejemplares, al menos una sustitución de aminoácidos se selecciona de lo siguiente: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L, y C748F. En ¦ algunas modalidades, el polipéptido de BRAF mutante tiene una a cinco sustituciones de aminoácidos, en comparación con el polipéptido de BRAF del tipo silvestre o el polipéptido de BRAF V600E. En las modalidades ejemplares, el polipéptido de BRAF mutante tiene una sustitución de aminoácidos en comparación con el polipéptido de BRAF del tipo silvestre. En otras modalidades ejemplares del aspecto anterior, el inhibidor de BRAF es RAF-265.
En otro aspecto, la invención tiene como característica un método para identificar un compuesto que es útil para tratar el cáncer, que comprende proporcionar una composición de ensayo que comprende un polipéptido de BRAF mutante y un sustrato de BRAF, poner en contacto la composición de ensayo con un compuesto de prueba, bajo condiciones que permiten la fosforilación del sustrato de BRAF en la ausencia del compuesto de prueba, y determinar el efecto del compuesto en la fosforilación del sustrato de BRAF, en donde la desmodulación de la fosforilación del sustrato de BRAF en comparación con un control adecuado, identifica el compuesto como un compuesto que es útil para tratar el cáncer. En algunas modalidades, la composición de ensayo es un extracto celular.
En otro aspecto, la invención tiene como característica un método para identificar un compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generación, que comprende proporcionar una composición de ensayo que comprende un polipéptido de BRAF mutante y un sustrato de BRAF, poner en contacto la composición de ensayo con un compuesto de prueba bajo condiciones que permitan la fosforilación del sustrato de BRAF en la ausencia del compuesto de prueba, y determinar el efecto del compuesto en la fosforilación del sustrato de BRAF, en donde la desmodulación de la fosforilación del sustrato de BRAF en comparación con un control adecuado, identifica al compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generación. En algunas modalidades, la composición de ensayo es un extracto celular.
En otro aspecto, la invención tiene como característica un método para identificar un compuesto que es útil para tratar el cáncer, que comprende proporcionar una célula que comprende un polipéptido de BRAF mutante, poner en contacto la célula con un compuesto de prueba, y determinar el efecto del compuesto en la fosforilación de un sustrato de BRAF, en donde la desmodulación de la osforilación del sustrato de BRAF en comparación con un control adecuado, identifica al compuesto como un compuesto que es útil para tratar el cáncer.
En otro aspecto, la invención tiene como característica un método para identificar un compuesto que es un inhibidor de BRAF de segunda generación, que comprende proporcionar una célula que comprende un polipéptido de BRAF mutante, poner en contacto la célula con un compuesto de prueba, y determinar el efecto del compuesto en la fosforilación de un sustrato de BRAF, en donde la desmodulación de la fosforilación del sustrato de BRAF en comparación con un control adecuado, identifica al compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generación.
En una modalidad de los aspectos anteriores, el sustrato de BRAF es MEK1 o MEK2. En una modalidad ejemplar, la fosforilación de EK1 o MEK2 se determina utilizando un anticuerpo MEK fosfoespecífico . En otra modalidad ejemplar, la fosforilación de MEK1 o MEK2 se determina midiendo la fosforilación de. la proteína básica de la mielina (MBP) . En otra modalidad ejemplar, la fosforilación de MEK1 o MEK2 se determina midiendo la fosforilación de ERK1 o ERK2.
En otro aspecto, la invención tiene como característica un método para identificar un compuesto que es útil para tratar el cáncer, que comprende proporcionar una célula que comprende un polipéptido de BRAF mutante, poner en contacto la célula con un compuesto de prueba, y determinar el efecto del compuesto en la proliferación celular, en donde la reducción en la proliferación celular, en comparación con un control adecuado, identifica al compuesto como un compuesto que es útil para tratar el cáncer.
En otro aspecto, la invención tiene como característica un método para identificar un compuesto que es un inhibidor de BRAF de segunda generación, que comprende proporcionar una célula qué comprende un polipéptido de BRAF mutante, poner en contacto la célula con un compuesto de prueba, y determinar el efecto del compuesto en la proliferación celular, en donde la reducción en la proliferación celular en comparación con un control adecuado, identifica al compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generación.
En otro aspecto, la invención tiene como característica un método de selección basado en una célula, para identificar un compuesto de prueba como un inhibidor de BRAF de segunda generación, el método comprende poner en contacto una célula hospedera que comprende un polipéptido de BRAF mutante con un compuesto de prueba, en donde la sensibilidad de la célula "hospedera al compuesto de prueba, en comparación con un control adecuado, identifica al compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generación. En una modalidad, la sensibilidad de la célula hospedera al compuesto de prueba se mide utilizando un ensayo seleccionado del grupo que consiste de un ensayo de proliferación celular, un ensayo de la viabilidad celular y un ensayo de la fosforilación de MEK, en donde una reducción en la proliferación celular, la viabilidad celular o la fosforilación de MEK en la presencia del compuesto de prueba, identifica al compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generación.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un inhibidor de BRAF de segunda generación, que comprende seleccionar un fármaco potencial utilizando un modelado asistido por computadora con un estructura del cristal o la solución tridimensional de un polipéptido de BRAF mutante, en donde el polipéptido de BRAF. imitante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con un polipéptido de BRAF del tipo silvestre o un polipéptido de BRAF V600E, al menos una sustitución de aminoácidos confiere resistencia a uno o más inhibidores de BRAF en el polipéptido de BRAF mutante; poner en contacto el fármaco potencial con el polipéptido de BRAF mutante; y detectar la interacción del fármaco potencial con el polipéptido de BRAF mutante; en donde un compuesto que es capaz de interactuar con el polipéptido de BRAF mutante se identifica como un inhibidor de BRAF de segunda generación. En una modalidad, el compuesto de prueba es un miembro de una biblioteca de compuestos .
En otro aspecto, la invención tiene como característica un compuesto aislado que es un inhibidor de BRAF de segunda generación o un compuesto que es útil para tratar un cáncer, en donde el compuesto se identifica como un inhibidor de BRAF de segunda generación o un compuesto que es útil para tratar el cáncer, de acuerdo con un método descrito en la presente.
En otro aspecto, la invención tiene como característica un método para inhibir la actividad de un polipéptido de BRAF mutante, que comprende poner en contacto el polipéptido de BRAF mutante con un compuesto que es un inhibidor de BRAF de segunda generación. En las modalidades preferidas del aspecto anterior, el compuesto inhibe además, la actividad de un polipéptido de BRAF del tipo silvestre y/o un polipéptido de BRAF V600E. En algunas modalidades, el contacto del polipéptido de BRAF mutante con el inhibidor de BRAF de segunda generación ocurre in vitro. En otras modalidades, el contacto ocurre in vivo. En las modalidades ejemplares, el contacto ocurre en un sujeto, por ejemplo, en un sujeto que tiene cáncer. En algunas modalidades, el sujeto ha recaído del tratamiento con RAF-265. En las modalidades ejemplares, el cáncer es un melanoma.
En otro aspecto, la invención tiene como característica un método para tratar el cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un compuesto que es un inhibidor de BRAF de segunda generación. En las modalidades ejemplares, el cáncer contiene una o más mutaciones en BRAF, en donde una o más mutaciones confieren resistencia a RAF-265 en un polipéptido de BRAF. En las modalidades preferidas del aspecto anterior, el compuesto inhibe además la actividad de un polipéptido de BRAF del tipo silvestre y/o un polipéptido de BRAF V600E. En. algunas modalidades, el sujeto ha recaído del tratamiento con RAF-265. En las modalidades ejemplares, el cáncer es un melanoma.
En otro aspecto, la invención tiene como característica un método para seleccionar un sujeto que tiene cáncer para una mutación de BRAF que confiere resistencia al tratamiento con un inhibidor de RAF, que comprende obtener una muestra que contiene una célula cancerosa del sujeto, e identificar en la muestra una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF que contiene una o más mutaciones con respecto a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF del tipo silvestre (SEQ ID N0:1) o un polipéptido de BRAF V600E (SEQ ID N0:3), las mutaciones ocurren en las posiciones que codifican uno o más aminoácidos en el polipéptido de BRAF seleccionado del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748, en donde la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra que contiene una célula cancerosa, identifica al sujeto como que es resistente al tratamiento con un inhibidor de RAF. En las modalidades ejemplares, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido de BRAF que tiene una o más sustituciones de aminoácidos con respecto a un polipéptido de BRAF del tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) o un polipéptido de BRAF V600E (SEQ ID NO: 4) seleccionado del grupo que consiste de A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F. En algunas modalidades, la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra que contiene una célula cancerosa identifica al sujeto como que tiene un riesgo relativamente alto de recaída durante el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación. En otras modalidades,' la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra que contiene una célula cancerosa, identifica al sujeto como que no es sensible al tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación. En las modalidades ejemplares, el inhibidor de BRAF de primera generación es RAF-265. En algunas modalidades, la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra que contiene una célula cancerosa estratifica al sujeto al tratamiento con un inhibidor de BRAF de segunda generación. En las modalidades ejemplares, la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra que contiene una célula cancerosa se determina por un método que comprende determinar la secuencia de una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de BRAF. En otras modalidades, la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra que contiene una célula cancerosa se determina detectando un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico, utilizando un anticuerpo que reconoce de manera específica un polipéptido de BRAF que contiene una posición seleccionada del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En una modalidad ejemplar, los métodos descritos en los aspectos anteriores, comprenden administrar un inhibidor de BRAF de segunda generación a un sujeto, en quien se detectó la presencia de una o más mutaciones BRAF.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 describe la secuencia nucleotídica del BRAF humano del tipo silvestre (SEQ ID N0:1) (Secuencia de Referencia NCBI No.: NM_004333.4; gi 187608632).
La Figura 2 describe la secuencia polipeptídica del BRAF humano del tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) (Secuencia de Referencia NCBI No.: NP_004324.2; gi 33188459).
La Figura 3 describe la secuencia nucleotídica de BRAF V600E humano (SEQ ID NO: 3). La transversión de timidina a adenosina que constituye la sustitución de aminoácidos de V600E con respecto a la secuencia de BRAF del tipo silvestre está subrayada.
La Figura 4 describe la secuencia polipeptídica de BRAF V600E humano (SEQ ID NO: 4) . La sustitución de V600E con respecto a la secuencia de BRAF del tipo silvestre está subrayada .
La Figura 5 describe el formato de la mutación de BRAF después de la selección de RAF265. Se muestran las sustituciones de aminoácidos que ocurren como resultado de las mutaciones de alta frecuencia.
La Figura 6 describe el formato de la mutación de BRAF después de la selección de PLX4720. Se muestran las sustituciones de aminoácidos que ocurren como resultado de las mutaciones de alta frecuencia.
Figura 7 describe la ubicación estructural de tres sustituciones de aminoácidos comunes a las selecciones con RAF265 y PLX4720.
La Figura 8 describe los resultados de los estudios de inmunotransferencia de los niveles de BRAF, p-MEKl/2 y p-ERK1/2 después del tratamiento con concentraciones que se incrementan de PLX4720 en las células que contienen a BRAF del tipo silvestre, BRAF-V600E, BRAF-V600E-T521K, BRAF-V600E-V528F o BRAF-V600E-P686Q.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Actividad Biológica de BRAF La familia de la proteína RAF contiene tres miembros: BRAF, ARAF y CRAF (también conocido como RAF-1) . Cada una de las proteínas RAF contiene un dominio regulatorio aminoterminal, una espira de activación y un dominio de cinasa C terminal. La 1 regulación de RAF involucre la fosforilación de los dominios regulatorios y catalíticos. Una vez activadas, las moléculas de RAF funcionan como serina/treonina cinasas capaces de activar las moléculas de señalización corriente abajo mediante la fosforilación.
RAF está implicado en fomentar la proliferación celular mediante la asociación con la trayectoria de señalización de la proteína cinasa activada por el mitógeno (MAPK) . En particular; las proteínas RAF son los efectores principales de la señalización mediada por Ras. Ras activado interactúa directamente con RAF y recluta a RAF en la membrana celular del citoplasma. Tras la translocación a la membrana celular, RAF unido a Ras se somete a una serie de eventos de fosforilación y cambios conformacionales que sirven para activar la actividad de serina/treonina cinasa de RAF. RAF también puede activarse a través de trayectorias independientes de Ras que involucran el interferón beta, la proteína cinasa C (PKC) alfa, las proteínas antiapoptóticas tales como Bcl-2, varias proteínas de la estructura, luz ultravioleta, radiación ionizante, retinoides, eritropoyetina y dimerización entre los isoformos de RAF.
Una vez activado, RAF media la señalización corriente abajo fosforilando las cinasas MEK1 y MEK2 , que contienen una secuencia rica en prolina que permite el reconocimiento por RAF. BRAF es un activador mucho más potente de MEK1 y MEK2 que ARAF o RAF-1. MEK1 y EK2 , a su vez, fosforilan y activan a ERK1 y ERK2, que se translocan a continuación al núcleo. ERK1 y ERK2 nucleares, activan los factores de transcripción tales como Elk-1, Fos, Jun, AP-1 y Myc, induciendo finalmente la transcripción de los genes involucrados en la proliferación, desdiferenciación y supervivencia celular, incluyendo, por ejemplo, ciclina DI, ciclina E y la fosfatasa del activador cdc 25.
La sobrerregulacion de la señalización de RAF, que resulta de la presencia de las mutaciones activantes en RAF o la señalización aberrante a través de Ras, fomenta la oncogénesis activando la cascada de la señal anterior, resultando en una proliferación y supervivencia celular incrementadas. Las mutaciones activantes en los polipéptidos de RAF, especialmente en BRAF, se han asociado con una alta frecuencia de cánceres humanos. Una mutación de BRAF tal, es una transversión única de timidina a adenosina, que convierte la valina en el aminoácido 600 a glutamato. Aproximadamente dos tercios de los casos de melanoma alojan esta mutación de BRAF V600E oncogénica, que contribuye a la transformación del melanocito a través de la activación de la señalización de MAPK. Muchos otros tipos de cánceres, incluyendo, de manera no exclusiva cáncer de colon, ovario y tiroides, de igual manera, alojan la mutación de BRAF V600E. En consecuencia, la selección de RAF y en particular, la selección de BRAF V600E, es un proceso promisorio para la terapia para el cáncer. BRAF es un objetivo atractivo para la terapia, debido al alto grado de especificidad mostrada por sus sustratos MEK1 y MEK2. Varios inhibidores de BRAF están actualmente en desarrollo clínico. Un inhibidor tal es el compuesto RAF-265, que es efectivo contra todos los tres isoformos de RAF, así como contra BRAF V600E. RAF-265 ha mostrado ser promisorio en la clínica, indicando que la selección de RAF es un método viable de la terapia para el cáncer.
Como se utilizan de manera indistinta en la presente, los términos "actividad de RAF" "actividad biológica de RAF" y "actividad funcional de RAF" incluyen las actividades ejercidas por una proteína RAF, por ejemplo, BRAF, en una célula o tejido sensible a RAF, por ejemplo, una célula cancerosa o un cáncer, o en una molécula objetivo de RAF, determinado in vivo o in vi tro, de acuerdo, con técnicas estándar. La actividad de RAF puede ser una actividad directa, tal como una asociación con una molécula objetivo de RAF, por ejemplo, MEK1 o MEK2 , o la fosforilación de un sustrato de RAF, por ejemplo, MEK1 o MEK2. De manera alterna, una actividad de RAF puede ser una actividad indirecta, tal como un evento biológico corriente abajo mediado por la interacción de la proteína RAF con una molécula objetivo de RAF, por ejemplo, MEK1 o MEK2. Puesto que RAF está en una trayectoria de transducción de la señal que involucra a MEK1 y MEK2, tales eventos biológicos corriente abajo incluye, de manera no exclusiva, por ejemplo, la fosforilación de MBP, la fosforilación de ERK1 o ERK2, cambios en la regulación de los genes objetivo de ERK1 o ERK2, y alteraciones en la proliferación o viabilidad celular.
II . Mutaciones para la Resistencia a BRAF Aunque el tratamiento del cáncer con inhibidores de RAF, por ejemplo, inhibidores de BRAF, es un proceso terapéutico promisorio, los pacientes que reciben tal terapia pueden recaer o fallar en responder, y como resultado, la enfermedad de los pacientes progresa. Como se describe aquí, la presente invención se relaciona con el descubrimiento de las mutaciones en BRAF que confieren resistencia a los inhibidores de RAF actualmente en desarrollo clínico. La adquisición de tales mutaciones en las células cancerosas hace a los pacientes resistentes al tratamiento con ciertos inhibidores de RAF. En las modalidades ejemplares, la invención se relaciona con el desarrollo de resistencia al inhibidor de RAF RAF-265.
(A) Identificación de las mutaciones de BRAF que confieren resistencia a los inhibidores de RAF En varias modalidades, la presente invención se relaciona con métodos para identificar mutaciones en un polipéptido de BRAF, o mutaciones en una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de BRAF, que confieren resistencia del polipéptido de BRAF a los fármacos que inhiben la actividad de RAF. Un "polipéptido de BRAF mutante" , como se refiere en la presente, incluye un polipéptido de BRAF que contiene una o más mutaciones que confieren resistencia a uno o más inhibidores de BRAF conocidos . Además de una o más mutaciones que confieren resistencia a un inhibidor de BRAF, un polipéptido de BRAF mutante puede contener una sustitución V600E. Un polipéptido de BRAF que contiene sólo la sustitución V600E sin ningún otra mutación, con respecto a la secuencia del polipéptido de BRAF del tipo silvestre, no se considera un "polipéptido de BRAF mutante" como se define en la presente. Una "molécula de ácido nucleico de BRAF mutante" como se refiere en la presente, incluye una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de. BRAF mutante. Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de BRAF que contienen una o más mutaciones pueden crearse utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida al sitio de una secuencia de ácido nucleico de BRAF del tipo silvestre o una secuencia de ácido nucleico de BRAF V600E, que puede realizarse en E. coli. En las modalidades ejemplares, la secuencia de ácido nucleico de BRAF del tipo silvestre es una secuencia de ácido nucleico de BRAF del tipo silvestre humano (SEQ ID NO:l), y la secuencia de ácido nucleico de BRAF V600E es una secuencia de ácido nucleico de BRAF V600E humano (SEQ ID NO: 3) . Las moléculas de ácidos nucleicos de BRAF mutantes pueden seleccionarse entonces en células de otra manera sensibles al tratamiento con un inhibidor de BRAF, para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF mutante que es resistente al tratamiento con el inhibidor de RAF.
Varios métodos adecuados pueden utilizarse para seleccionar los ácidos nucleicos de BRAF mutantes y los polipéptidos de BRAF mutantes para la resistencia al tratamiento con un inhibidor de RAF, por ejemplo, RAF-265. En todos los casos, un polipéptido de BRAF mutante que es resistente al tratamiento con un inhibidor de RAF, exhibe mayor actividad de BRAF en la presencia del inhibidor de RAF que un polipéptido de BRAF del tipo silvestre o un polipéptido de BRAF V600E en la presencia del inhibidor de RAF. En un método ejemplar, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF mutante puede expresarse en células de otra manera sensibles al tratamiento con un inhibidor de RAF. Una línea celular ejemplar, útil para este propósito, es la línea celular de melanoma A375. Después de la expresión del polipéptido de BRAF mutante, las células pueden tratarse con un inhibidor de RAF. Una actividad del polipéptido de BRAF mutante puede medirse entonces y compararse con la actividad de un polipéptido de BRAF del tipo silvestre (o un polipéptido de BRAF V600E) expresado de manera similar y tratarse con el inhibidor de RAF.
La actividad de un polipéptido de BRAF puede determinarse, por ejemplo, midiendo la proliferación o la viabilidad de las células después del tratamiento con el inhibidor de BRAF, en donde la proliferación o viabilidad están correlacionadas de manera positiva con la actividad de BRAF. El crecimiento, la proliferación o la viabilidad celular, puede determinarse utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. En una modalidad, el crecimiento celular puede determinarse utilizando ensayos de la proliferación/viabilidad celular basados en el pozo, tales como MTS o Cell Titer GLo, en los cuales el crecimiento celular en la presencia de un inhibidor de RAF se expresa como un porcentaje del que se observa en las células no tratadas cultivadas en la ausencia del inhibidor de RAF. En ciertas modalidades, la resistencia se define como un cambio en el valor de GI50 de al menos 2 veces, de manera más preferida, al menos 3 veces, de manera aún más preferida de al menos 4 --5 veces, con respecto a un control adecuado. En otras modalidades, la resistencia se define como un valor de GI50 de ~1 uM) . La actividad de un polipéptido de BRAF también puede medirse, por ejemplo, determinando la cantidad relativa de ME 1/2 o ERK1/2 fosforilada, presente en la célula, después del tratamiento con el inhibidor de BRAF. La actividad de un BRAF del tipo silvestre o de un polipéptido de BRAF mutante también puede determinarsé utilizando un ensayo de fosforilación in vitro, en el cual la actividad de BRAF se determina midiendo la proporción de MEKl/2 o ERKl/2 fosforilada en el ensayo, después del tratamiento con el inhibidor de BRAF. Como se indicó anteriormente, MEKl/2 es un sustrato de BRAF, mientras que ERKl/2 es un sustrato de MEKl/2, y sirve como un indicador corriente debajo de la actividad de BRAF. Un polipéptido de BRAF mutante que tiene una mayor actividad que un polipéptido de BRAF del tipo silvestre o un polipéptido de BRAF V600E después del tratamiento con un inhibidor de RAF, se identifica como que contiene una mutación que confiere resistencia a un inhibidor de RAF. La mutación que confiere resistencia a un inhibidor de RAF puede identificarse entonces secuenciando el ácido nucleico que codifica el polipéptido de BRAF mutante, o secuenciando el polipéptido de BRAF mutante directamente.
(B) Mutaciones de BRAF que confieren resistencia a RAF-265 De la manera anterior, se identificaron varios residuos de aminoácidos del polipéptido de BRAF humano, que cuando mutan, confieren resistencia al inhibidor de RAF, RAF-265. Estos residuos de aminoácidos incluyen uno o más de lo siguiente: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En ciertas modalidades de la invención, los polipéptidos de BRAF mutantes contienen una mutación con respecto a la secuencia del polipéptido de BRAF humano del tipo silvestre (o la secuencia del polipéptido de BRAF V600E) en uno o más de estos residuos de aminoácidos. En las modalidades relacionadas, las moléculas de ácidos nucleicos de BRAF mutantes contienen una mutación con respecto a la secuencia de ácidos nucleicos de BRAF humano del tipo silvestre (o la secuencia del polipéptido de BRAF V600E) en uno o más nucleótidos que codifican uno o más de estos residuos de aminoácidos. En las modalidades ejemplares, los polipéptidos de BRAF mutantes de la presente, contienen una o más de las siguientes mutaciones para la resistencia: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F. En otras modalidades ejemplares, las moléculas de ácidos nucleicos de BRAF mutantes de la presente, codifican un polipéptido de BRAF mutante que contiene una o más de las siguientes mutaciones para la resistencia: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
Las moléculas de ácidos nucleicos de BRAF mutantes y los polipéptidos de BRAF mutantes de la invención, pueden contener otras mutaciones, además de aquéllas descritas en la presente. Por ejemplo, un polipéptido de BRAF mutante de la invención puede contener mutaciones en otros residuos de aminoácidos, además de una o más mutaciones en los residuos de aminoácidos A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En todos los casos, los polipéptidos de BRAF mutantes de la invención tienen actividad de BRAF, y las moléculas de ácidos nucleicos de BRAF mutantes de la invención codifican los polipéptidos que tienen actividad de BRAF. En una modalidad ejemplar, una molécula de BRAF mutante de la invención tiene una mutación en el residuo de aminoácidos V600, además de una o más mutaciones en los residuos de aminoácidos A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En una modalidad, la mutación en V600 es una mutación, activante, por ejemplo, una mutación V600E. El inhibidor de RAF, RAF-265, ha mostrado inhibir de manera efectiva la actividad de BRAF que contiene la mutación activante V600E. Esta mutación está presente en un alto porcentaje de tumores, incluyendo aproximadamente dos tercios de los melanomas. Las mutaciones para la resistencia a BRAF descritas en la presente, confieren resistencia a los inhibidores de RAF, tales como RAF-265, en el alelo BRAF-V600E. En consecuencia, los pacientes que tienen un tumor que contiene a BRAF-V600E, están en riesgo de recaída durante el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación, tal como RAF-265, debido a la adquisición de una segunda mutación de BRAF en cualquiera de los siguientes sitios: A29, H72, S113, S124 , P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748.
Como se describe en la presente, la identificación de las mutaciones en BRAF que confieren resistencia a los inhibidores de BRAF, permite diseñar y seleccionar "inhibidores de RAF de segunda generación", que son efectivos para inhibir una proteína BRAF que tiene una o más mutaciones para la resistencia. Tales inhibidores de RAF de segunda generación son útiles en muchas aplicaciones clínicas y terapéuticas, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer. La identificación de las mutaciones para la resistencia en el polipéptido de BRAF, también permite la selección de los pacientes que tienen un cáncer, con el fin de determinar la presencia o ausencia de una o más mutaciones de BRAF para la resistencia en el cáncer. La determinación de la presencia o ausencia de una o más mutaciones de BRAF para la resistencia en un cáncer, permite la alteración de la estrategia de tratamiento de un paciente con cáncer. Por ejemplo, la identificación de una o más de las mutaciones de BRAF para la resistencia descritas en la presente, en una muestra que contiene una célula cancerosa de un paciente que tiene un cáncer, puede utilizarse para estratificar al paciente para el tratamiento con un inhibidor de RAF de segunda generación. De igual manera, la identificación de una o más de las mutaciones de BRAF para la resistencia descritas en la presente, en una muestra que contiene una célula cancerosa de un paciente que tiene un cáncer, puede utilizarse para estratificar al paciente para el tratamiento con un inhibidor de MEK. La identificación de las mutaciones de BRAF para la resistencia, también permite la selección e identificación de los pacientes que tienen un alto riesgo de recaída o falta de respuesta al tratamiento con ciertos inhibidores de RAF.
III. Métodos para Identificar los Inhibidores de BRAF de Segunda Generación La identificación de las mutaciones de BRAF para la resistencia permite el desarrollo y/o identificación de los "inhibidores de RAF de segunda generación" . Como se utiliza en la presente, un inhibidor de RAF de segunda generación es un agente que inhibe de manera efectiva la actividad de un polipéptido de RAF, por ejemplo, un polipéptido de BRAF, que contiene una o más mutaciones descritas en la presente . Un inhibidor de RAF de segunda generación puede o no inhibir la actividad de un polipéptido de RAF del tipo silvestre, además de un polipéptido de RAF mutante. En una modalidad preferida, un inhibidor de RAF de segunda generación inhibe la actividad de un polipéptido de BRAF V600E (SEQ ID N0:4), así como de un polipéptido de BRAF V600E, que tiene además, una o más de las mutaciones para la resistencia descritas en la presente. En una modalidad ejemplar, un inhibidor de RAF de segunda generación inhibe la actividad de un polipéptido de BRAF que contiene mutaciones en uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748.
En consecuencia, la presente invención proporciona métodos para identificar un compuesto de prueba como un inhibidor de RAF de segunda generación. En una modalidad, un compuesto puede identificarse como un inhibidor de RAF de segunda generación, determinando la actividad de RAF relativa de un polipéptido de BRAF mutante en la presencia o ausencia del compuesto, con respecto a un polipéptido de BRAF no mutante (por ejemplo, un polipéptido de BRAF del tipo silvestre, o un polipéptido de BRAF V600E) . Cuando está en la presencia de un compuesto que es un inhibidor de RAF de segunda generación, un polipéptido de BRAF mutante tiene un nivel de actividad de RAF menor que en la ausencia del compuesto. Cuando está én la presencia de un compuesto que no es un inhibidor de RAF de segunda generación, un polipéptido de BRAF mutante tiene un nivel equivalente o mayor de actividad de RAF que en la ausencia del compuesto. En ciertas modalidades, la actividad de RAF puede medirse en un ensayo in vitro utilizando los polipéptidos de BRAF recombinantes . En otras modalidades, la actividad de RAF puede medirse en un ensayo in vivo utilizando células cultivadas o animales experimentales que expresán los polipéptidos de BRAF.
Cualquier indicador de la actividad de BRAF es adecuado para determinar si un compuesto es o no, un inhibidor de RAF de segunda generación. En una modalidad ejemplar, la actividad de BRAF se determina midiendo la fosforilación del sustrato de RAF MEKl/2, en donde una disminución en la fosforilación de MEKl/2 indica una disminución en la actividad de RAF. En una modalidad, la fosforilación de MEKl/2 se mide en una célula o en un extracto celular. En una modalidad alterna, la fosforilación de MEKl/2 se mide en un ensayo de fosforilación in vitro, utilizando proteínas purificadas o recombinantes . Los métodos para detectar la fosforilación de MEKl/2 conocidos en la técnica, son adecuados para medir la fosforilación de MEKl/2 como una indicación de la actividad de un polipéptido de BRAF o un polipéptido de BRAF imitante. Tales métodos incluyen, de manera no exclusiva, inmunotransferencia Western y espectroscopia de masas. En ciertas modalidades, puede realizarse un ensayo de fosforilación de MEKl/2 in vitro, utilizando proteínas recombinantes . En otras modalidades, puede realizarse un ensayo de fosforilación de MEKl/2 in vivo, utilizando células cultivadas o animales experimentales .
En otra modalidad ejemplar, la actividad de BRAF se determina midiendo la fosforilación del sustrato MEK ERKl/2, en donde una disminución en la fosforilación de ERKl/2 indica una disminución en la actividad de BRAF. En una modalidad, la fosforilación de ERKl/2 se mide en una célula o un extracto celular. En una modalidad alterna, la fosforilación de ERKl/2 se mide en un ensayo de fosforilación in vitro, utilizando proteínas purificadas o recombinantes. Los métodos para detectar la fosforilación de ERKl/2, conocidos en la técnica, son adecuados para medir la fosforilación de ERKl/2 como una indicación de la actividad de un polipéptido de BRAF o un polipéptido de BRAF mutante. Tales métodos incluyen, de manera no exclusiva, inmunotransferencia Western y espectroscopia de masas. En ciertas modalidades, puede realizarse un ensayo de fosforilación de ERKl/2 in vitro, utilizando proteínas recombinantes. En otras modalidades, puede realizarse un ensayo de fosforilación de ERK1/2 in vivo, utilizando células cultivadas o animales experimentales.
En una modalidad, una célula hospedera que expresa un polipéptido de BRAF mutante se utiliza en la identificación de un inhibidor de RAF de segunda generación, en donde la sensibilidad de la célula hospedera a un compuesto de prueba identifica al compuesto de prueba como un inhibidor de RAF de segunda generación. Como se utiliza en la presente, el término "sensibilidad de la célula hospedera a un compuesto de prueba", pretende significar que el compuesto de prueba tiene un efecto mensurable en uno o más parámetros, incluyendo el crecimiento celular, la proliferación celular, la viabilidad celular y/o la transduccion de la señal intracelular (por ejemplo, transduccion de la señal mediada por BRAF, como se evidencia, por ejemplo, por la fosforilación de uno o más sustratos BRAF, tales como MEK1/2, o una o más moléculas de señalización corriente abajo, tales como ERK1/2) .
Un compuesto puede identificarse como un inhibidor de RAF de segunda generación determinando la viabilidad o velocidad de proliferación de las células que expresan un polipéptido de BRAF mutante, en la presencia o ausencia del compuesto. La línea celular utilizada en tal ensayo, debe ser sensible a un inhibidor de RAF, cuando la línea celular expresa un polipéptido de BRAF del tipo silvestre, y debe ser resistente al inhibidor de RAF (es decir, un inhibidor de RAF de primera generación) , cuando la línea celular expresa un polipéptido de BRAF mutante . Una línea celular ejemplar útil para la identificación de un inhibidor de RAF de segunda generación, es la línea celular de melanoma A375. Las células A375 son sensibles al inhibidor de RAF RAF-265 cuando expresan un polipéptido de BRAF del tipo silvestre, pero son resistentes a RAF-265 cuando expresan un polipéptido de BRAF mutante, por ejemplo, un polipéptido de BRAF que contiene una o más de las siguientes mutaciones para la resistencia: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P586Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
Cuando está en la presencia de un compuesto que es un inhibidor de RAF de segunda generación, una línea celular que expresa un polipéptido de BRAF mutante tiene una variabilidad o velocidad de proliferación menor que en la ausencia del compuesto. Cuando está en la presencia de un compuesto que no es un inhibidor de RAF de segunda generación, una línea celular que expresa un polipéptido de BRAF mutante tiene una viabilidad o velocidad de proliferación equivalente o mayor que en la ausencia del compuesto. Los métodos para medir la viabilidad celular y/o la velocidad de proliferación conocidos en la técnica, son adecuados para determinar la sensibilidad de una línea celular que expresa un polipéptido de BRAF o un polipéptido de BRAF mutante a un compuesto de prueba. Tales métodos incluyen, de manera no exclusiva, la medición de la exclusión con azul de Trypan, el metabolismo de los compuestos de tetrazolio, la incorporación de timidina tritiada, la incorporación de BrdU, la captación de glucosa, la concentración de ATP y el nivel de apoptosis. En una modalidad, la proliferación celular puede determinarse utilizando ensayos de proliferación/viabilidad celular basados en el pozo, tales como MTS o Cell Titer GLo. En ciertas modalidades, la sensibilidad se define como un cambio en el valor de GI50 de al menos 2 veces, de manera más preferida, al menos 3 veces, de manera aún más preferida, al menos 4-5 veces, con respecto a un control adecuado.
En consecuencia, en una modalidad, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que es un inhibidor de RAF de segunda generación, que comprende proporcionar una composición de ensayo que comprende un sustrato de BRAF y un polipéptido de BRAF que tiene una o más mutaciones con respecto a un polipéptido de BRAF del tipo silvestre (o con respecto a un polipéptido de BRAF V600E) , poner en contacto la composición de ensayo con un compuesto de prueba bajo condiciones que permitan la fosforilación del sustrato de BRAF en la ausencia del compuesto de prueba, y determinar el efecto del compuesto en la fosforilación del sustrato de BRAF, en donde la desmodulación de la fosforilación del sustrato de BRAF en comparación con un control adecuado, identifica al compuesto como un inhibidor de RAF de segunda generación. Un compuesto identificado de esta forma es un compuesto útil para tratar el cáncer, por ejemplo, un cáncer en el cual un polipéptido de RAF mutante se ha detectado. Un polipéptido de BRAF útil en los métodos anteriores, es un polipéptido de BRAF que contiene una o más mutaciones que confieren resistencia al inhibidor de RAF, RAF-265, por ejemplo, un polipéptido de BRAF que contiene una o más de las mutaciones descritas en la presente. Un sustrato de BRAF útil en los métodos anteriores, es por ejemplo, MEK1/2. Una disminución, reducción o desmodulación de la fosforilación de MEK1/2 es una indicación de que el compuesto es un inhibidor de RAF. De igual manera, una molécula de señalización de RAF corriente abajo, útil en los métodos anteriores, es por ejemplo, ERK1/2. Una disminución, reducción o desmodulación de la fosforilación de ERK1/2 es una indicación de que el compuesto es un inhibidor de RAF. Los métodos anteriores pueden realizarse in vi tro, en donde los polipéptidos de BRAF y los sustratos BRAF son proteínas aisladas o purificadas. Los métodos anteriores también pueden realizarse in vitro, en donde los polipéptidos de BRAF y los sustratos BRAF son componentes de un extracto celular.
En esta modalidad, la composición de ensayo es un extracto celular. Un control adecuado es cualquier control que sería evidente para una persona con experiencia que realiza el método, e incluye, por ejemplo, una composición de ensayo similar o idéntica, no tratada con un compuesto de prueba o tratada con un compuésto de control, o una composición de ensayo análoga o extracto celular que comprende un polipéptido de BRAF del "tipo silvestre", o un polipéptido de BRAF V600E.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que es un inhibidor de RAF de segunda generación, que comprende proporcionar una célula que comprende un polipéptido de BRAF mutante, poner en contacto la célula con un compuesto de prueba, y determinar el efecto del compuesto en la fosforilación de MEK1/2, la fosforilación de ERK1/2, o la proliferación celular, en donde una disminución, reducción o desmodulación de la fosforilación de MEK1/2, la fosforilación de ERK1/2 o la proliferación celular, en comparación con un control apropiado, identifica al compuesto como un inhibidor de RAF de segunda generación. Un compuesto identificado de esta forma es un compuesto útil para tratar el cáncer, por ejemplo, un cáncer en el cual un polipéptido de BRAF mutante se ha detectado. Un control adecuado es cualquier control que sería evidente para una persona con experiencia que realiza el método, e incluye, por ejemplo, una célula similar o idéntica no tratada con un compuesto de prueba o tratada con un compuesto de control, o una célula análoga o un extracto celular, en el cual se expresa un BRAF de "tipo silvestre", o BRAF V600E.
En una modalidad, el compuesto de prueba utilizado en los métodos anteriores es un inhibidor de RAF que inhibe una actividad biológica de un polipéptido de RAF del tipo silvestre, por ejemplo, un polipéptido de BRAF.. De manera adicional o alterna, el compuesto de prueba utilizado en los métodos anteriores es un inhibidor de RAF que inhibe la actividad de un polipéptido de BRAF V600E. En una modalidad, los inhibidores de RAF que pueden utilizarse como los compuestos de prueba para determinar si son inhibidores de RAF de segunda generación, incluyen PLX4032, PLX5568, XL281 y los derivados de imidazol-2-carboxamida descritos en la US2008/0108615 , el contenido completo de la cual se incorpora en la presente como referencia.
En otra modalidad, el compuesto de prueba es un miembro de una biblioteca de compuestos de prueba. Una "biblioteca de compuestos de prueba" se refiere a un panel que comprende una multiplicidad de compuestos de prueba. Se ha descrito un procedimiento para la síntesis de las bibliotecas moleculares de moléculas orgánicas pequeñas (Carell et al., (1994). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl . 33:2061). Los compuestos de la presente invención pueden obtenerse utilizando cualquiera de los numerosos procedimientos en los métodos de las bibliotecas combinatorias, conocidos en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas de fase sólida o fase en solución paralelas, tratables espacialmente , métodos de bibliotecas sintéticas que requieren la desconvolución, el método de la biblioteca de "una perla, un compuesto", y los métodos las biblioteca sintéticas que utilizan la selección con cromatografía por afinidad. El procedimiento de la biblioteca biológica está limitado a bibliotecas peptídicas, mientras que los otros cuatro procedimientos son aplicables a bibliotecas de compuestos de oligómeros peptídicos, no peptídicos o de molécula pequeña (Lam, K.S. .(1997) Anticáncer Drug Des. 12: 145) . Otros métodos e emplares para la síntesis de las bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo, en: Erb et al., (1994). Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 91: 11422; Horwell et al., (1996) Immunopharmacology 33:68-; y en Gallop et al., (1994); J. Med. Chem. 37: 1233- . Las bibliotecas de los compuestos pueden presentarse en solución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), o en perlas (Lam (1991) Nature 354:82-84), microplaquetas (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Ladner USP 5,223,409), esporas (Ladner USP 09), plásmidos (Culi et al., (1992) Proc Nati Acad Sci EUA 89: 1865-1869) o en un fago (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al., (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol . 222:301-310). En aún otra modalidad, los polipéptidos combinatorios se producen de una biblioteca de ADNc. Los compuestos ejemplares que pueden seleccionarse para la actividad incluyen, de manera no exclusiva, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, moléculas orgánicas pequeñas y bibliotecas de extractos de productos naturales.
Los inhibidores de RAF de segunda generación también pueden diseñarse racionalmente basándose en la estructura de los alelos de BRAF que contienen una o más de las mutaciones para la resistencia descritas en la presente. Como se describe en la presente, los residuos de BRAF que confieren resistencia a los inhibidores de RAF se localizan en la misma región de BRAF unido por el inhibidor de RAF de primera generación RAF-265. La identificación de los alelos mutantes de BRAF que confieren resistencia a los inhibidores de RAF, permite la comparación entre la estructura de los alelos mutantes y el BRAF de tipo silvestre o a BRAF V600E. El conocimiento de las características estructurales alteradas que confieren resistencia a los inhibidores de RAF de primera generación, permite el diseño racional y la construcción de ligandos, incluyendo inhibidores, que se unirán a, e inhibirán los alelos mutantes. Tales inhibidores pueden diseñarse de manera que unan a los alelos mutantes de BRAF, BRAF V600E que no contiene una mutación secundaria descrita en' la presente y BRAF del tipo silvestre. Los inhibidores diseñados para unir un alelo de BRAF que contiene una o más mutaciones descritas en la presente, son inhibidores de RAF de segunda generación. La capacidad de tales inhibidores diseñados de manera racional, para inhibir la actividad biológica de un polipéptido de BRAF mutante, puede confirmarse utilizando los ensayos in vitro y/o in vivo descritos en la presente.
La estructura de un polipéptido de BRAF que contiene una o más de las mutaciones para la resistencia descritas en la presente, puede determinarse mediante modelado asistido por computadora o determinando la ¦estructura del cristal o la solución del polipéptido de BRAF mutante. Cualquier método adecuado conocido en la técnica puede utilizarse para determinar la estructura de un polipéptido de BRAF mutante.
Los métodos de modelado asistido por computadora, ejemplares, incluyen el uso de programas tales como PYMOL, CAVITY (descrito en J. Comp. Aided. Mol. Des. (1990) 4:337-354 (incorporado en la presente como referencia) ) y Discovery Studio* (Accelrys, San Diego, CA) . Las técnicas adicionales útiles para el modelado molecular asistido por computadora se describen en J BUON. (2007) 12 Supl 1:S101-18 (incorporado en la presente como referencia) . El análisis basado en computadora de una proteína con una estructura conocida, puede utilizarse también para identificar moléculas que se unirán a la proteína. Tales métodos clasifican las moléculas basándose en su forma complementaria a un sitio receptor. Por ejemplo, utilizando una base de datos 3-D, puede utilizarse un programa tal como DOCK para identificar las moléculas que se unirán a XBP-1, IRE-1 alfa y/o EDEM. Véase DesJarlias et al., (1988) J. Med. Chem. 31:722; Meng et al., (1992) J. Computer Chem. 13:505; Meng et al., (1993) Proteins 17:266; Shoichet et al., (1993) Science 259: 1445. Además, la complementariedad electrónica de una molécula para una proteína seleccionada también puede analizarse para identificar las moléculas que se unen al objetivo. Esto puede determinarse, utilizando, por ejemplo, un campo de fuerza mecánica molecular como se describe en Meng et al . , (1992) J. Computer Chem. 13:505 y Meng et al., (1993) Proteins 17:266. Otros programas que pueden utilizarse incluyen CLIX, que utiliza un campo de fuerza GRID para atracar los ligandos putativos (véase, por ejemplo, Lawrence et al., (1992) Proteins 12:31; Goodford et al., (1985) J. Med. Chem. 28:849; y Boobbyer et al., (1989) J. Med. Chem. 32: 1083, incorporados como referencia en su totalidad).
La cristalización puede realizarse mediante cualquier método de cristalización, incluyendo, de manera no exclusiva, métodos por lotes, diálisis y difusión de vapor (por ejemplo, gota asentada y gota colgante) . La microsiembra, macrosiembra y siembra por estrías de los cristales, también pueden realizarse para facilitar la cristalización. Los cristales que comprenden los alelos mutantes de BRAF pueden formarse mediante una variedad de diferentes métodos conocidos en .la técnica. Por ejemplo, las cristalizaciones pueden realizarse mediante métodos por lotes, diálisis y difusión de vapor (gota asentada y gota colgante) . Una descripción detallada de los montajes básicos de cristalización de proteínas puede encontrarse en cRee, D., Practical Protein Crystallography, 2a Ed. (1999), Academic Press Inc. Las descripciones adicionales con respecto a la realización de los experimentos de cristalización se proporcionan en Stevens et al., (2000) Curr. Opin. Struct. Biol: 10 (5) : 558-63 , y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,296,673; 5,419,278 y 5,096,676, el contenido completo de las cuales se incorpora en la presente como referencia. Tales cristales pueden utilizarse para realizar análisis de difracción co rayos X o con neutrones, con el fin de determinar la estructura tridimensional de los alelos mutantes de BRAF. Una estructura de la solución de un polipéptido de BRAF o un polipéptido de BRAF mutante puede identificarse utilizando espectroscopia con resonancia magnética nuclear, utilizando técnicas conocidas en el campo. Los métodos adecuados para la determinación de la estructura del polipéptido mediante cristalografía con rayos X o espectroscopia con RMN se describen en Brunger et al., (1998) "Crystallography & MR system (CNS) : A new software system for macro molecular structure determination" , Acta Crystallogr D54, 905-921; Brunger et al., (1987) "Solution of a Protein Crystal Structure With a Model Obtained From NMR Interproton Distance Restraints" , Science 235, 1049-1053; Drenth, "Principies of Protein X-ray Crystallography" , (1994), Springer-Verlag. pp. 1-19 y Narula et al., (1995) "Solution structure of the C-terminal SH2 domain of the human tyrosine kinase Syk complexed with a phosphotyrosine pentapeptide" , Structure 3, 1061-1073, incorporadas en la presente como referencia en su totalidad. Tras la identificación de la estructura del cristal o la solución de un polipéptido de RAF mutante, los inhibidores del polipéptido de BRAF mutante pueden identificarse utilizando los procedimientos de modelado asistido por computadora descritos anteriormente.
Los inhibidores de RAF de segunda generación • identificados por los métodos anteriores son útiles para tratar una enfermedad o condición asociada con la expresión de un polipéptido de RAF del tipo silvestre y/o mutante. Por ejemplo, los inhibidores de RAF de segunda generación son útiles para tratar el cáncer en un sujeto, particularmente un cáncer en el cual un polipéptido de BRAF imitante se ha identificado. En una modalidad ejemplar, los inhibidores de RAF de segunda generación son útiles para tratar un cáncer que contiene un polipéptido de BRAF que tiene una mutación en' uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En una modalidad relacionada, los inhibidores de RAF de segunda generación son útiles para tratar un cáncer que contiene un polipéptido de BRAF que tiene una o más de las ^siguientes mutaciones: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521 , V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
IV. Moléculas de Ácidos Nucleicos Aisladas La presente invención se relaciona con polinucleótidos o moléculas de ácidos nucleicos que se relacionan con el gen BRAF y su producto génico respectivo. Estos polinucleótidos o moléculas de ácidos nucleicos son aislables y purificables de células de mamífero. En los aspectos particulares de la invención, las moléculas de ácidos nucleicos de BRAF aisladas descritas 1 en la presente, comprenden una o más mutaciones que confieren resistencia a un inhibidor de BRAF. Una "molécula de ácido nucleico de BRAF imitante" , como se refiere en la presente, incluye una molécula de ácido nucleico de BRAF que codifica un polipéptido de BRAF imitante, es decir, un polipéptido de BRAF que contiene una o más mutaciones que confieren resistencia a uno o más inhibidores de BRAF conocidos.
Está contemplado que una molécula de ácido nucleico de BRAF . aislada y purificada, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de BRAF mutante, pueda tomar la forma de AR o ADN. Como se utiliza en la presente, el término "transcripto de ARN" se refiere a una molécula de ARN que es el producto de la transcripción de una molécula de ácido nucleico de ADN. Tal transcripto puede codificar uno o más polipéptidos.
Como se utiliza en esta solicitud, el término ^polinucleótido" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ARN o ADN, que se ha aislado, de manera que está libre del ácido nucleico genómico total. Por lo tanto, un "polinucleótido que codifica a BRAF" se refiere a un segmento de ácido nucleico que contienen secuencias que codifican a BRAF, aunque esté aislado lejos de, o purificado y libre del ADN y las proteínas genómicas totales . Cuando la presente solicitud se refiere a la función o actividad de un polinucleótido o ácido nucleico que codifica a BRAF, se quiere decir que el polinucleótido codifica una molécula qüe es capaz de realizar una actividad de un polipéptido de BRAF del tipo silvestre, por ejemplo, fosforilación de los sustratos MEK1 o MEK2.
El término "ADNc" pretende referirse al ADN preparado utilizando ARN como una plantilla. La ventaja de utilizar el ADNc, en oposición al ADN genómico o un transcripto de ARN, es la estabilidad y la capacidad de manipular la secuencia utilizando la tecnología de ADN recombinante (Véase, Sambrook," 1989; Ausubel, 1996). Puede haber ocasiones en que se prefiera la secuencia genómica completa o parcial. De manera alterna, el ADNc puede ser ventajoso puesto que representa las regiones codificantes de un polipéptido y elimina los intrones y otras regiones regulatorias .
También está contemplado que un ácido nucleico que codifica a BRAF o un gen BRAF dado, de una célula dada, pueda representarse por las variantes o cepas naturales que son secuencias de ácidos nucleicos ligeramente diferentes, pero, sin embargo, codifican un polipéptido de BRAF activo. En una modalidad preferida, el polipéptido de BRAF activo es un polipéptido de BRAF humano activo. En las modalidades particularmente preferidas, el polipéptido de BRAF activo es un polipéptido de BRAF mutante que tiene una actividad de un polipéptido de BRAF del tipo silvestre, pero que es resistente a uno o más inhibidores de BRAF conocidos. En consecuencia, ciertos aspectos de la presente invención abarcan .derivados de BRAF con cambios de aminoácidos mínimos, pero que poseen la misma función biológica.
El término "gen" se utiliza por simplicidad para referirse a una proteína, polipéptido o unidad que codifica un péptido, funcional. Como se entenderá por aquellos con experiencia en la técnica, este término funciona incluye secuencias genómicas, secuencias de ADNc y segmentos del gen diseñados más pequeños, que expresan o pueden adaptarse para expresar las proteínas, polipéptidos, dominios, proteínas de fusión y proteínas imitantes . La molécula de ácido nucleico que codifica a BRAF puede comprender una secuencia de ácido nucleico contigua de las siguientes longitudes: al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100-, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, , 9900, 10000, 10100, 10200, 10300, 10400, 10500, 10600, 10700, 10800, 10900, 11000, 11100, 11200, 11300, 11400, 11500, 11600, 11700, 11800, 11900, 12000 o más nucleótidos, nucleósidos o pares de bases. Tales secuencias pueden ser idénticas o complementarias a, por ejemplo, la SEQ ID NO:l, o un fragmento de la misma.
Varias modalidades de la invención se relacionan con las mutaciones genéticas en BRAF. Como se utiliza en la presente, una mutación se refiere a una adición, supresión o sustitución de un solo nucleótido en un sitio en una molécula de ácido nucleico de BRAF. En una modalidad ejemplar, una molécula de ácido nucleico de BRAF mutante contiene una o más mutaciones que confieren resistencia a una terapia particular, tal como un inhibidor de BRAF, por ejemplo, RAF-265. En una modalidad relacionada, una molécula de ácido nucleico de BRAF mutante contiene una o más mutaciones, de manera que la molécula de ácido nucleico de BRAF mutante codifica un polipéptido de BRAF mutante, en donde el polipéptido de BRAF mutante contiene una o más mutaciones que confieren resistencia a una terapia particular, tal como un inhibidor de BRAF, por ejemplo, RAF-265. Así, en los aspectos particulares de la invención, una alteración en una secuencia resulta en un cambio que afecta las propiedades de un polipéptido codificado por la secuencia, de manera que al menos algo de resistencia a la terapia, tal como la terapia con un inhibidor de BRAF, ocurre como resultado.
"Aislado sustancialmente lejos de otras secuencias codificantes" significa que el gen de interés forma parte de la región codificante del segmento de ácido nucleico, y que el segmento no contiene granes porciones del ácido nucleico codificante natural, tales como fragmentos cromosomales grandes u otros genes funcionales o regiones codificantes del ADNc. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ácido nucleico como se aisló originalmente, y no excluye los genes o regiones codificantes agregadas posteriormente al segmento mediante manipulación humana.
En las modalidades particulares, la invención se relaciona con segmentos aislados de ácidos nucleicos y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican los polipéptidos de BRAF mutantes o los péptidos que incluyen dentro de su secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos contigua, de acuerdo con, o que corresponde esencialmente a los polipéptidos de BRAF mutantes. En las modalidades ejemplares, la invención se relaciona con segmentos de ADN y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican una proteína BRAF, polipéptido o péptido que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos contigua de un polipéptido de BRAF que comprende una o más mutaciones que confieren resistencia a un inhibidor de BRAF. En ciertas modalidades, una o más mutaciones ocurren en las posiciones A29, H72, S113, S124 , P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En otras modalidades, una o más mutaciones incluyen lo siguiente: A29V, H72N, S113I,. S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
Los segmentos de ácidos nucleicos utilizados en la presente invención, sin importar la longitud de la secuencia codificante misma, pueden combinarse con otras secuencias de ADN o ARN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes y lo similar, de manera que su longitud total puede variar de manera considerable. Por lo tanto, esta contemplado que un fragmento de ácidos nucleicos de casi cualquier longitud pueda emplearse, con la longitud total estando limitada de manera preferida por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido.
Está contemplado que los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención codifiquen un polipéptido de BRAF o un polipéptido de BRAF mutante. Una secuencia "heteróloga" , se refiere a una secuencia que es extraña o exógena a la secuencia restante. Un gen heterólogo se refiere a un gen que no se encuentra en la naturaleza, adyacente a las secuencias con las cuales está colocado ahora .
En un ejemplo no limitante, uno o más constructos de ácidos nucleicos pueden prepararse, que incluyen un tramo contiguo de nucleótidos, idéntico a, o complementario a todo o parte de un gen BRAF. Un constructo de ácidos nucleicos que comprende al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 20,000, 30,000, 50,000, 100,000, 250,000, aproximadamente 500,000, 750,000, a aproximadamente 1,000,000 nucleótidos de longitud, así como constructos de mayor tamaño, hasta, e incluyendo los tamaños cromosomales (incluyendo todas las longitudes intermedias e intervalos intermedios) , dado el advenimiento de constructos de ácidos nucleicos tales como un cromosoma artificial de levadura, son conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Se entenderá fácilmente que las "longitudes intermedias" y los "intervalos intermedios", como se utiliza en la presente, significa cualquier longitud o intervalo, incluyendo o entre los valores citados (es decir, todos los enteros, incluyendo y entre tales valores) . Los ejemplos no limitantes de las longitudes intermedias incluyen aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, etc.; aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, etc.; aproximadamente 31, aproximadamente 32, etc.; aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, etc.; aproximadamente 101, aproximadamente 102, aproximadamente 103, etc . ,-aproximadamente 151, aproximadamente 152, aproximadamente 153, aproximadamente 97001, aproximadamente 1,001, aproximadamente 1002, aproximadamente 50,001, aproximadamente 50,002, aproximadamente 750,001, aproximadamente 750,002, aproximadamente 1,000,001, aproximadamente 1,000,002, etc. Los ejemplos no limitantes de los intervalos intermedios incluyen aproximadamente 3 a aproximadamente 32, aproximadamente 150 a aproximadamente 500/001, aproximadamente 3,032 a aproximadamente 7, 145, aproximadamente 5,000 a aproximadamente 15,000, aproximadamente 20,007 a aproximadamente 1,000,003, etc.
Ciertas modalidades de la presente invención se relacionan con varios ácidos nucleicos, incluyendo vectores, promotores, ácidos nucleicos terapéuticos, y otros elementos de ácidos nucleicos involucrados en la transformación y expresión en las células. En ciertos aspectos, un ácido nucleico comprende un ácido nucleico del tipo silvestre 6 mutante. En los aspectos particulares, un ácido nucleico codifica o comprende un ácido nucleico transcrito.
El término "ácido nucleico" , es bien conocido en la técnica. Un "ácido nucleico" como se utiliza en la presente, se referirá generalmente a una molécula (es decir, una hebra) de ADN, ARN o un derivado o análogo del mismo, que comprende una nucleobase. Una nucleobase incluye, por ejemplo, una base de purina o pirimidina natural encontrada en el ADN (por ejemplo, una adenina "A", una guanina "G" , una timina "T" o una citosina "C") o ARN (por ejemplo, una A, una G, un uracilo "U" o una C) . El término "ácido nucleico" abarca los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" , cada uno como un subgénero del término "ácido nucleico" . El término "oligonucleótido" se refiere a una molécula de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 100 nucleobases de longitud. El término "polinucleótido" se refiere a al menos una molécula de más de aproximadamente 100 nucleobases de ' longitud. Un "gen" se refiere a una secuencia codificante de un producto génico, así como intrones y el promotor del producto génico. Además del gen BRAF, otras regiones regulatorias tales como mejoradores para BRAF, están contempladas como ácidos nucleicos para utilizarse con las composiciones y métodos de la invención reclamada.
Estas definiciones generalmente se refieren a una molécula de una sola hebra, pero en las modalidades especificas, también abarca una hebra adicional que es parcial, sustancial o completamente complementaria a la molécula de una sola hebra. Así, un ácido nucleico puede abarcar una molécula de doble hebra o una molécula de triple hebra, que comprende una o más hebras complementarias o "complementos" de una secuencia particular que comprende una molécula. Como se utiliza en la presente, un ácido nucleico de una sola hebra puede denotarse por el prefijo "ss", un ácido nucleico de doble hebra por el prefijo "ds" , y un ácido nucleico de triple hebra por el prefijo "ts" .
Un ácido nucleico puede hacerse mediante cualquier técnica conocida por alguien con experiencia ordinaria en el campo, por ejemplo, mediante síntesis química, o mediante la producción enzimática o la- producción biológica. Los ejemplos no limitantes de un ácido nucleico sintético (por ejemplo, un cebador BRAF sintético que facilita la identificación de una mutación que confiere resistencia a un inhibidor de BRAF) , incluye un ácido nucleico hecho mediante síntesis química in vitro, utilizando la química del fosfotriéster, fosfito o fosforamidita y técnicas en fase sólidas tales como las descritas en la EP 266,032, incorporada en la presente como referencia, o vía intermediarios de H-fosfonato de desoxinucleósido como se describió por Froehler et al., 1986 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,705,629, cada una incorporada en la presente como referencia. En los métodos de la presente invención, pueden utilizarse uno o más oligonucleótidos . Varios diferentes mecanismos de la síntesis oligonucleotídica, se han descrito en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,659,774, 4,816,571, 5,141,813, 5,264,566, 4,959,463, 5,428,148, 5,554,744, 5,574,146, 5,602,244, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia.
Un ejemplo no limitante de un ácido nucleico producido enzimáticamente, incluye uno producido mediante enzimas en reacciones de amplificación tales como PCR (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,683,202 y 4,682,195, cada una incorporada en la presente como referencia) , o uno producido mediante la síntesis de oligonucleótidos, como se describió en la Patente de los Estados Unidos No. 5,645,897, incorporada en la presente como referencia. Un ejemplo no limitante de un ácido nucleico producido biológicamente, incluye un ácido nucleico recombinante producido (es decir, replicado) en una célula viviente, tal como un vector de ADN recombinante replicado en bacterias (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, incorporado en la presente como referencia) .
Un ácido nucleico puede purificarse sobre geles de poliacrilamida, gradientes de centrifugación con cloruro de cesio, o mediante cualquier otro medio conocido por alguien con experiencia ordinaria en la técnica, como parte de la valoración para una mutación que confiera resistencia a BRAF (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, incorporado en la presente como referencia) . En los aspectos preferidos, un ácido nucleico es un ácido nucleico farmacológicamente aceptable. Las composiciones farmacológicamente aceptables son conocidas por aquellos con experiencia en la técnica, y se describen en la presente.
En ciertos aspectos, la presente invención se relaciona con un ácido nucleico que es un ácido nucleico aislado. Como se utiliza en la presente, el término "ácido nucleico aislado", se refiere a una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN o ADN) , que se ha aislado libre de, o que está de otra manera libre del volumen de los ácidos nucleicos genómicos y transcritos totales de una o más células. En ciertas modalidades, "ácido nucleico aislado" se refiere a un ácido nucleico que se ha aislado libre de, o de otra manera está libre del volumen de los componentes celulares o los componentes de una reacción in vi tro, incluyendo, por ejemplo, macromoléculas tales como lípidos o proteínas, moléculas biológicas pequeñas y lo similar .
V. Vectores de Expresión y Células Hospederas La presente invención abarca composiciones de un vector de expresión y el uso de tales vectores para "codificar un polipéptido de BRAF, por ejemplo, un polipéptido de BRAF mutante, así como composiciones de células hospederas en las cuales tales vectores de expresión se han introducido. El término "vector" se utiliza para referirse a una molécula de ácido nucleico portador, en la cual una secuencia de ácido nucleico puede insertarse para la introducción en una célula en donde puede replicarse. Una secuencia de ácidos nucleicos puede ser "exógena" , lo que significa que es extraña a la célula en la cual el vector se está introduciendo, o que la secuencia es homologa a una secuencia en la célula, pero una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedera, en la cual la secuencia no se encuentra de manera ordinaria. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales y virus de plantas) , y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC) . Alguien con experiencia en la técnica estará bien equipado para construir un vector a través de técnicas recombinantes estándar, que se describen en Sambrook et al., 1989 y Ausubel et al., 1996, ambos incorporados en la presente como referencia.
El término "vector de expresión" o "constructo de expresión" , se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifican al menos parte de un producto génico, capaz de ser transcrito. En algunos casos, las moléculas de ARN se traducen a continuación en una proteína, polipéptido o péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una variedad- de "secuencias de control", que se refieren a las secuencias de ácidos nucleicos necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante enlazada de manera operable en un organismo huésped particular. Además de las secuencias de control que gobiernan la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión pueden contener secuencias de ácidos nucleicos que sirven para otras funciones también, y se describen infra. 1. Promotores y Mejoradores Un "promotor" es una secuencia de control que es una región de una secuencia de ácidos nucleicos en la cual el inicio y la velocidad de la transcripción son controlados. Puede contener elementos genéticos, en los cuales las proteínas regulatorias y las moléculas pueden unirse, tales como ARN polimerasa y otros factores de transcripción. Las frases "colocado de manera operativa" , "enlazado de manera operativa", "bajo el control" y "bajo el control transcripcional" , significan que un promotor está en una ubicación y/o orientación funcional correcta, con relación a una secuencia de ácidos nucleicos para controlar el inicio transcripcional y/o expresión de esa secuencia. Un promotor puede o no utilizarse en conjunto con un "mejorador", que se refiere a una secuencia regulatoria que actúa en cis, involucrada en la activación transcripcional de una secuencia de ácidos nucleicos.
Un promotor puede ser uno o asociado naturalmente con un gen o secuencia, como puede obtenerse aislando las secuencias codificantes que no son 5' localizadas corriente arriba del segmento y/o el exón codificante. Tal promotor puede referirse como "endógeno" . De manera similar, un mejorador . puede ser uno asociado naturalmente con una secuencia de ácidos nucleicos, localizada corriente abajo o corriente arriba de esa secuencia. De manera alterna, ciertas ventajas se ganarán colocando el segmento de ácidos nucleicos codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo, que se refiere a un promotor que no está asociado normalmente con una secuencia de ácidos nucleicos en su medio natural. Un mejorador recombinante o heterólogo también se refiere a un mejorador que no está asociado normalmente con una secuencia de ácidos nucleicos en su medio natural. Tales promotores o mejoradores pueden incluir promotores o mejoradores de otros genes, y promotores o mejoradores aislados de cualquier otra célula procariótica, viral o eucariótica, y promotores o mej oradores no "naturales", es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones regulatorias transcripcionales , y/o mutaciones que alteran la expresión.
Naturalmente, será importante emplear un promotor y/o mej orador que dirija de manera efectiva la expresión del segmento de ácidos nucleicos en el tipo de célula, organelo y organismo elegido para la expresión. Aquellos con experiencia en la técnica de la biología molecular, generalmente conocen el uso de los promotores, mej oradores y combinaciones de tipo celular para la expresión de la proteína, por ejemplo, véase Sambrook et al., (1989), incorporado en la presente como referencia. Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos del tejido, inducibles y/o útiles bajo las condiciones apropiadas, para dirigir una expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido. El promotor puede ser heterólogo o exógeno, por ejemplo, un promotor que no es BRAF ???· respecto a una secuencia codificante de BRAF. En algunos ejemplos, un promotor procariótico se emplea para utilizarse con la transcripción in vitro de una secuencia deseada. Los promotores procarióticos para utilizarse con muchos sistemas comercialmente disponibles, incluyen T7, T3 y Sp6. 2. Señales de Inicio y Sitios Internos de Unión al Ribosoma Una señal de inicio específica también puede requerirse para la traducción eficiente de las secuencias codificantes. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG o las secuencias adyacentes. Las señales de control traduceional exógenas, incluyendo el codón de inicio ATG, pueden necesitar proporcionarse. Alguien con experiencia ordinaria en la técnica, será fácilmente capaz de determinar esto y proporcionar las señales necesarias. Es bien conocido que el codón de inicio debe estar "en el marco" , con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción de todo el inserto. Las señales de control traduccional exógenas y los codones de inicio pueden ser naturales o sintéticos. La eficiencia de la expresión puede mejorarse por la inclusión de elementos mej oradores de la transcripción apropiados. En ciertas modalidades de la invención, el uso de los elementos de los sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) , se utilizan para crear mensajes con múltiples genes, o policistrónicos . 3. Sitios de Clonación Múltiple Los vectores pueden incluir un sitio de clonación múltiple (MCS) , que es una región de ácidos nucleicos que contiene múltiples sitios de la enzima de restricción, cualquiera de las cuales pueden utilizarse en conjunto con la tecnología recombinante estándar para digerir el vector (véase, por ejemplo, Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, y Cocea, 1997, incorporadas en la presente como referencia). "Digestión con la enzima de restricción", se refiere a una escisión catalítica de una molécula de ácidos nucleicos con una enzima que funciona sólo en ubicaciones específicas en una molécula de ácidos nucleicos. Muchas de estas enzimas de restricción están comercialmente disponibles. El uso de tales enzimas es entendido ampliamente por aquellos con experiencia en la técnica. Con frecuencia, un vector es linealizado o fragmentado utilizando una enzima de restricción que se corta dentro del MCS para permitir que las secuencias exógenas se liguen al vector. "Ligadura" , se refiere al proceso de formar enlaces de fosfodiéster entre dos fragmentos de ácidos nucleicos, que pueden o no ser contiguos uno al otro. Las técnicas que involucran enzimas de restricción y reacciones de ligadura, son bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica de la tecnología recombinante. 4. Sitios de Empalme La mayoría de las moléculas de ARN eucarióticas transcritas, se someterán a empalme del ARN para eliminar los intrones de los transcriptos primarios. Los vectores que contienen las secuencias eucarióticas genómicas pueden requerir sitios de empalme ;donadores y/o aceptores, para asegurar el procesamiento adecuado del transcripto para la expresión de la proteina (véase, por ejemplo, Chandler et al., 1997, incorporado en la presente como referencia) . 5. Señales de Terminación Los vectores o constructos de la presente invención comprenderán generalmente, al menos una señal de terminación. Una "señal de terminación" o "terminador" , está comprendido de las secuencias de ADN involucradas en la terminación específica de un transcripto de ARN por una ARN polimerasa. Así, en ciertas modalidades, una señal de terminación que finaliza la producción de un transcripto de ARN está contemplada. Un terminador puede ser necesario in vivo para lograr niveles del mensaje deseables. 6. Señales de Poliadenilación Para la expresión, particularmente la expresión eucariótica, uno incluirá típicamente una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación apropiada del transcripto. Se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación no es crucial para la práctica exitosa de la invención, y/o cualquier secuencia puede emplearse. Las modalidades preferidas incluyen la señal de poliadenilación SV40 y/o la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino, conveniente y/o conocida por funcionar bien en varias células objetivo. La poliadenilación puede incrementar la estabilidad del transcripto, o puede facilitar el transporte citoplásmico. 7_. Orígenes de Replicación Con el fin de propagar un vector en una célula hospedera, puede contener uno o más orígenes de los sitios de replicación (denominados con frecuencia "ori" ) , que es una secuencia de ácidos nucleicos específica, en la cual se inicia la replicación. De manera alterna, una secuencia replicante de manera autónoma (ARS) puede emplearse si la célula hospedera es una levadura. 8. Marcadores Seleccionables y Clasificables En ciertas modalidades de la invención, las células que contienen un constructo de ácidos nucleicos de la presente invención, puede identificarse in vitro o in vivo, incluyendo un marcador en el vector de expresión. Tales marcadores conferirían un cambio identificable a la célula, permitiendo la identificación fácil de las células que contienen el vector de expresión. Generalmente, un marcador seleccionable es uno que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador seleccionable positivo es uno en el cual la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador seleccionable negativo es uno en el cual su presencia evita su selección. Un ejemplo de un marcador seleccionable positivo es un marcador de resistencia al fármaco.
Usualmente, la inclusión de un marcador de selección del fármaco ayuda en la clonación e identificación de los transformantes, por ejemplo, los genes que confieren resistencia a la neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol, son marcadores seleccionables útiles. Además de los marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de los transformantes, basándose en la implementación de las condiciones, otros tipos de marcadores que incluyen marcadores clasificables , tales como GFP, cuya base es el análisis calorimétrico, también están contemplado. De manera alterna, pueden utilizarse las enzimas seleccionables tales como la timidina cinasa (tk) del virus del herpes simple o la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) . Alguien con experiencia en la técnica, también sabría como emplear marcadores inmunológicos, posiblemente en conjunto con el análisis FACS. No se cree que el marcador utilizado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse de manera simultánea con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Los ejemplos adicionales de marcadores seleccionables y clasificables son bien conocidos por alguien con experiencia en la técnica. 9^ Células Hospederas Como se utiliza en la presente, los términos "célula", "línea celular" y "cultivo celular", pueden utilizarse de manera indistinta. Una célula que comprende un polinucleótido BRAF, ya sea mutado o del tipo silvestre, puede emplearse en la invención. Todos estos términos también incluyen su progenie, que se refiere a cualquiera y todas las generaciones posteriores . Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas . En el contexto de expresar una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga, "célula hospedera" se refiere a una célula procariótica o eucariótica, e incluye cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar un vector y/o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula hospedera puede, y ha sido, utilizada como un receptor para los vectores . Una célula hospedera puede, "transíectarse" o "transformarse", que se refiere a un proceso mediante el cual el ácido nucleico exógeno es transferido o introducido en la célula hospedera. Una célula transformada incluye la célula objeto primaria y su progenie. Una "célula hospedera recombinante", se refiere a una célula hospedera que porta un ácido nucleico recombinante, es decir, un ácido nucleico que se ha manipulado in vitro o que es una copia replicada de un ácido nucleico que se ha manipulado así .
Una célula hospedera puede derivarse de procariotas o eucariotas, dependiendo de si el resultado deseado es la replicación del vector, la expresión de parte o todas las secuencias de ácidos nucleicos codificadas por el vector, o la producción de partículas virales infecciosas. Numerosas líneas celulares y cultivos están disponibles para utilizarse como una célula hospedera, y pueden obtenerse a través de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) , que es una organización que sirve como un archivo para los cultivos vivientes y los materiales genéticos. Un hospedero apropiado puede determinarse por alguien con experiencia en la técnica, basándose en la cadena principal del vector y el resultado deseado. Un plásmido o cósmido, por ejemplo, puede introducirse en una célula hospedera procariótica para la replicación de mochos vectores. Las células bacterianas utilizadas como las células hospederas para la replicación y/o expresión del vector, incluyen DH5a, J 109 y C8 , así como varios hospederos bacterianos comercialmente disponibles tales como SURE™. Las Células Competentes y Células Gold Solopack™ (Strategene .RTM. , La Jolla) . De manera alterna, las células bacterianas tales como LE392 de E. coli pueden utilizarse como células hospederas para los virus del fago.
Una célula hospedera eucariótica preferida de la invención, es la línea celular de melanoraa A375, en donde la célula se ha transformado con un vector de expresión que codifica un polipéptido de BRAF, por ejemplo, un polipéptido de BRAF mutante de la invención. 10. Sistemas de Expresión Existen numerosos sistemas de expresión que comprenden al menos una parte o toda de las composiciones discutidas anteriormente. Los sistemas basados en procariotas y/o eucariotas, pueden emplearse para utilizarse con la presente invención, para producir secuencias de ácidos nucleicos de BRAF, o sus polipéptidos, proteínas y péptidos análogos. Muchos de tales sistemas son comerciales y ampliamente disponibles.
El sistema de célula de insecto/baculovirus puede producir un alto nivel de expresión de la proteína de un segmento de ácidos nucleicos heterólogo, tal como se describió en las Patentes de los Estados Unidos Nos . 5,871,986, 4,879,236, ambas incorporadas en la presente como referencia, y que pueden comprarse, por ejemplo, bajo el nombre MaxBac™ 2.0 de Invitrogen™ y BacPack™ Baculovirus Expression System de Clontech™.
Otros ejemplos de sistemas de expresión incluyen el Sistema de Expresión Inducible en Mamíferos Complete Control de Stratagene, que involucra un receptor inducible de ecdisona sintético, o su Sistema de Expresión pET, un sistema de expresión de E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresión inducible está disponible de Invitrogen, que porta el Sistema T-Rex™ (expresión regulada por tetraciclina) , un sistema de expresión inducible en mamíferos, que utiliza el promotor CMV de longitud completa. Los sistemas Tet-On™ y Tet-Off™ de Clontech™, pueden utilizarse para regular la expresión en un hospedero mamífero utilizando tetraciclina o sus derivados. La implementación de estos sistemas se describe en Gossen et al., 1992 y Gossen et al., 1995, y la Patente de los Estados Unidos No. 5,650,298, todas las cuales se incorporan como referencia.
Invitrogen también proporciona un sistema de expresión de levadura, llamado Sistema de Expresión de Pichia methanolica , que se diseña para la producción de alto nivel de las proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica ¦Pichia methanolica . Alguien con experiencia en la técnica, sabrá como expresar un vector, tal como un constructo de expresión, para producir una secuencia de ácidos nucleicos o su polipéptido, proteína o péptido análogo.
VI . Moléculas Polipeptídicas Aisladas Otro aspecto de la invención pertenece a las proteínas BRAF aisladas y/o purificadas, y a las porciones biológicamente activas de las mismas. En los aspectos particulares de la invención, los polipéptidos de BRAF descritos en la presente, comprenden una o más mutaciones que confieren resistencia a un inhibidor de BRAF. Un "polipéptido de BRAF mutante" ,* como se refiere en la presente, incluye un polipéptido de BRAF que contiene una o más mutaciones que confieren resistencia a uno o más inhibidores de BRAF conocidos .
Una proteína "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de la misma, está sustancialmente libre de material celular cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante , o precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza de manera química. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular", incluye preparaciones de proteínas BRAF, en las cuales la proteína está separada de los componentes celulares de las células, en las cuales se produce de manera natural o recombinante . En una modalidad, el lenguaje "sustancialmente libre de material celular" , incluye preparaciones de proteínas BRAF que tienen menos que aproximadamente 30% (en peso seco) de proteína que no es BRAF (también referida en la presente como una "proteína contaminante" ) , de manera más preferida menos que aproximadamente 20% de la proteína que no es BRAF, aún de manera más preferida menos que aproximadamente 10% de la proteína que no es BRAF, y de manera más preferida, menos que aproximadamente 5% de la proteína que no es BRAF. Cuando la proteína BRAF o una porción biológicamente activa de la misma se produce de manera recombinante , también está, de manera preferida, sustancialmente libre del medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos que aproximadamente 20%, de manera más preferida menos que aproximadamente 10%, y de manera más preferida menos que aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína. El lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" , incluye preparaciones de proteínas BRAF en las cuales la proteína está separada de los precursores químicos u otros químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína. En una modalidad, el lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" , incluyen preparaciones de proteínas BRAF que tienen menos que aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o químicos que no son BRAF, de manera más preferida, menos que aproximadamente 20% de precursores químicos o químicos que no son BRAF, aún de manera más preferida menos que aproximadamente 10% de precursores químicos o químicos que no son BRAF, y de manera más preferida menos que aproximadamente 5% de precursores químicos o químicos que no son BRAF.
Las porciones biológicamente activas de una proteína BRAF, incluyen pép idos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de una proteína BRAF, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, o la secuencia de aminoácidos de una proteína homologa a una proteína BRAF, que incluye menos aminoácidos que una proteína BRAF de longitud completa o la proteína de longitud completa que es homologa a una proteína BRAF, y exhibe al menos una actividad de una proteína BRAF. Típicamente, las porciones biológicamente activas (péptidos, por ejemplo, péptidos que son, por ejemplo, de 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 o más aminoácidos de longitud) , comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de una proteína BRAF. Además, otras porciones biológicamente activas, en las cuales otras regiones de la proteína se suprimen, pueden prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse para una o más de las actividades descritas en la presente. De manera preferida, las porciones biológicamente activas de una proteína BRAF incluyen uno o más dominios/motivos seleccionados o porciones de los mismos que tienen actividad biológica. En las modalidades preferidas, las porciones biológicamente activas de una proteína BRAF comprenden una o más mutaciones con respecto a una secuencia de BRAF del tipo silvestre, en donde una o más mutaciones, cuando están presentes en un polipéptido de BRAF mutante de longitud completa, confieren resistencia del polipéptido de BRAF mutante a los inhibidores de BRAF conocidos. En las modalidades ejemplares, las mutaciones ocurren en los aminoácidos que corresponden a una o más de las siguientes posiciones en la proteína BRAF del tipo silvestre: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587,' P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738y C748. . En una modalidad relacionada, las mutaciones incluyen uno o más de los siguientes residuos de BRAF: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
Las proteínas BRAF son producidas de manera preferida mediante técnicas de ADN recom inante . Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína, se clona en un vector de expresión (como se describió anteriormente) , el vector de expresión se introduce en una célula hospedera (como se describió anteriormente) , y la proteína BRAF se expresa en la célula hospedera. La proteína BRAF puede aislarse a continuación de las células, mediante un esquema de purificación apropiado, utilizando técnicas de purificación de la proteína estándar. De manera alterna a la expresión recombinante, una proteína BRAF, polipéptido o péptido, puede sintetizarse químicamente utilizando técnicas de síntesis peptídica estándar. Además, una proteína BRAF nativa y/o una proteína BRAF mutante, puede aislarse de las células (por ejemplo, células cancerosas) , por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-BRAF, que puede producirse mediante técnicas estándar, utilizando una proteína BRAF o un fragmento de la misma de esta invención.
La invención también proporciona proteínas BRAF quiméricas o de fusión. Como se utiliza en la presente, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" de BRAF, comprende un polipéptido de BRAF enlazado de manera operativa a un polipéptido que no es BRAF. Un "polipéptido de BRAF" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína BRAF, mientras que un "polipéptido que no es BRAF" , se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína que no es sustancialmente homologa a la proteína BRAF, por ejemplo, una proteína que es sustancialmente diferente de la proteína BRAF, que no muestra una actividad de BRAF, y que es derivada del mismo organismo o de uno diferente. Dentro de la proteína de fusión, el término "enlazado de manera operativa" , pretende indicar que el polipéptido de BRAF y el polipéptido que no es BRAF se fusionan en el marco uno con el otro. El polipéptido que no es BRAF puede fusionarse al término N o al término C del polipéptido de BRAF. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-BRAF en la cual las secuencias BRAF se fusionan al término C de las secuencias GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de las proteínas BRAF recombinantes. En otra modalidad, la proteína de fusión es una proteína BRAF que contiene una secuencia de la señal heteróloga en su término N. En ciertas células hospederas (por ejemplo, células hospederas de mamífero) , la expresión y/o secreción de una proteína BRAF, puede increméntarse a través del uso de una secuencia de la señal heteróloga.
De manera preferida, una proteína BRAF quimérica o de fusión de la invención, se produce mediante técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas , se ligan juntos en el marco, de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando términos con extremo romo o con extremo escalonado para la ligadura, digestión con enzima de restricción para proporcionar los términos apropiados, llenado de los extremos cohesivos conforme sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión -indeseable y ligadura enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales, incluyendo sintetizadores de ADN automáticos. De manera alterna, la amplificación con PCR de los fragmentos del gen puede llevarse a cabo utilizando cebadores de ancla que dan lugar a salientes complementarias entre dos fragmentos gériicos consecutivos, que pueden recocerse y reamplificarse posteriormente, para generar una secuencia de gen quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992) . Además, muchos vectores de expresión están comercialmente disponibles, que codifican fácilmente una porción de fusión {por ejemplo, un polipéptido GST) . Un ácido nucleico que codifica BRAF puede clonarse en tal vector de expresión, de manera que la porción de fusión están enlazada en el marco a la proteína BRAF.
En una modalidad preferida, los polipéptidos de BRAF aislados de la invención, contienen una o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones o supresiones) con respecto a una secuencia del polipéptido de BRAF del tipo silvestre. En una modalidad, los polipéptidos de BRAF mutantes contienen una o más mutaciones con respecto a una secuencia del polipéptido de BRAF del tipo silvestre humana (SEQ ID NO: 2) . En una modalidad particularmente preferida, una o más mutaciones confieren resistencia a un inhibidor de BRAF. En una modalidad ejemplar, el inhibidor de BRAF es RAF-265. Una proteína BRAF mutante de la invención, exhibe una actividad biológica característica de una proteína BRAF del tipo silvestre. Tal actividad biológica puede incluir, por ejemplo, fosforilación de MEK1 o MEK2. Los polipéptidos de BRAF mutantes ejemplares de la invención, incluyen polipéptidos de BRAF que comprenden una mutación en uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos, con respecto al polipéptido de BRAF humano del tipo silvestre: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 o C748. Los polipéptidos de BRAF mutantes ejemplares de la invención, también incluyen polipéptidos de BRAF que comprenden una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos con respecto a la proteína BRAF humana del tipo humano: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, . S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
Las proteínas BRAF mutantes pueden generarse mediante mutagénesis de una proteína BRAF del tipo silvestre, o de la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína BRAF del tipo silvestre. Las proteínas BRAF mutantes también pueden identificarse seleccionando bibliotecas combinatorias de mutantes de BRAF para una proteína BRAF mutante que tiene una actividad deseada, por ejemplo, resistencia a un inhibidor de BRAF. Se conocen varias técnicas en el campo para seleccionar los productos génicos de las bibliotecas combinatorias hechas mediante mutaciones puntuales o truncamiento, y para seleccionar las bibliotecas de ADNc para los productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Tales técnicas son adaptables para la selección rápida de las bibliotecas génicas generadas por la mutagénesis combinatoria. Las técnicas más ampliamente utilizadas, que son susceptibles para un análisis de alto rendimiento, para seleccionar las bibliotecas génicas grandes, incluyen típicamente clonar la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformando las células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante, y expresando los genes combinatorios bajo condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada, facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó.
VIII . Detección de Mutaciones En otro aspecto, la invención pertenece a métodos para detectar la presencia de una proteína BRAF mutañte en una muestra (por ejemplo, una' muestra biológica de un paciente con cáncer) . Puede utilizarse una variedad de métodos de selección para detectar la presencia de una proteína BRAF mutante de la invención en una muestra, por ejemplo, una muestra de ácido nucleico y/o de polipéptido. En las modalidades específicas, la muestra contiene una célula o un extracto celular. En las modalidades ejemplares, la muestra se obtiene de un sujeto, por ejemplo, un sujeto que tiene cáncer.
Los métodos para detectar la presencia de mutaciones para la resistencia en el ADN genómico, ADNc y ARN (es decir, AR m) que contiene una secuencia que codifica una proteína BRAF, o una porción biológicamente activa de la misma, puede utilizarse dentro del alcance de la presente invención. De igual manera, los métodos para detectar la presencia de mutaciones para la resistencia en los polipéptidos de BRAF, o porciones biológicamente activas de los mismos, pueden utilizarse dentro del alcance de la presente invención. En las modalidades particulares, los métodos que incluyen, de manera no exclusiva, lo siguiente, pueden utilizarse para detectar la presencia de un polipéptido de BRAF, o una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF, que tiene una mutación en uno o más de los siguientes residuos de< aminoácidos: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 o C748. En las modalidades ejemplares, los métodos que incluyen de manera no exclusiva, lo siguiente, pueden utilizarse para detectar la presencia de un polipéptido de BRAF, o una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF, que tiene una o más de las siguientes mutaciones: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P.655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
Las mutaciones puntuales pueden detectarse utilizando métodos que incluyen electroforesis sobre gel con gradiente desnaturalizante ( "DGGE" ) , análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción ("RFLP"), métodos de escisión química o enzimática, secuenciamiento directo de las regiones objetivo amplificadas mediante PCR (véase lo anterior) , análisis del polimorfismo de la conformación de una sola hebra ("SSCP"), reacción en cadena de la polimerasa, secuenciamiento, hibridación, "captura híbrida" seguida por el pirosecuenciamiento o el secuenciamiento de una sola molécula y otros métodos conocidos en la técnica. Un método para seleccionar las mutaciones puntuales se basa en la escisión con R asa de las malas correspondencias de los pares de bases en los heterodúplex AR /ADN o ARN/ARN. Como se utiliza en la presente, el término "mala correspondencia" se define como una región de uno o más nucleótidos no apareados o mal apareados en una molécula de ARN/ARN, ARN/ADN o ADN/ADN de doble hebra. Esta definición incluye así, malas correspondencias debidas a las mutaciones por inserción/supresión, así como mutaciones puntuales de una o múltiples bases. La Patente de los Estados Unidos No. 4,946,773 describe un ensayo de escisión de la mala correspondencia con RNasa A, que involucra recocer las muestras de prueba de ADN o ARN de una sola hebra con una sonda de ARN, y el tratamiento posterior de los dúplex de ácido nucleico con la RNasa A. Para la detección de las malas correspondencias, los productos de una sola hebra del tratamiento con RNasa A, separados de manera electroforática de acuerdo al tamaño, se comparan con los dúplex de control tratados de manera similar. Las muestras que contienen fragmentos más pequeños (productos de escisión) no observados en el dúplex de control, se califican como positivas.
Otros investigadores han descrito el uso de la RNasa I en los ensayos de las malas correspondencias . Por ejemplo, Promega comercializa un equipo que contiene RNasa I que se reporta que escinde tres de cuatro malas correspondencias conocidas. Otros han descrito el uso de la proteina MutS u otras enzimas que reparan el ADN para la selección de malas correspondencias de una sola base.
Los métodos alternos para la detección de mutaciones por supresión, inserción o sustitución, que pueden utilizarse en la práctica de la presente invención, se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos . 5,849,483, 5,851,770, 5,866,337, 5,925,525 y 5,928,870, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
Los métodos de selección pueden utilizarse para seleccionar un individuo para la aparición de las mutaciones identificadas anteriormente. Por ejemplo, en una modalidad, una muestra (tal como sangre u otra muestra de fluido corporal o célula o tejido) , se toma de un paciente para el análisis del genotipo. En una modalidad ejemplar, el paciente es un paciente con cáncer. La presencia o ausencia de una o más mutaciones descritas en la presente, determina la capacidad de los individuos seleccionados para resistir la terapia con un inhibidor de BRAF de primera generación. De acuerdo con los métodos proporcionados por la invención, estos resultados se utilizarán para ajustar y/o alterar la dosis del inhibidor de BRAF de primera generación, o para seleccionar un curso de tratamiento utilizando un inhibidor de BRAF de segunda generación. El tratamiento efectivo de un sujeto que tiene cáncer, puede comprender la erradicación de una célula cancerosa, el cese o reducción de la velocidad de crecimiento del cáncer (tal como un .tumor sólido) o el alivio de al menos un síntoma del cáncer.
Las mutaciones para la resistencia en los polipéptidos de BRAF, o en las moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de BRAF, pueden detectarse utilizando cualesquier métodos adecuados conocidos en la técnica o modificaciones de los mismos, incluyendo los métodos descritos a continuación. Tales métodos incluyen el uso de la reacción en cadena de la polimerasa específica del alelo, secuenciamiento directo o indirecto del sitio, el uso de enzimas de restricción, en donde los alelos respectivos del sitio, crean o destruyen un sitio de restricción, el uso de sondas de hibridación específicas del alelo, el uso de anticuerpos que son específicos para los polipéptidos de BRAF rautantes, o cualquier otra interpretación bioquímica. 1_. Secuenciamiento del ADN El método utilizado más comúnmente para caracterizar una mutación es el secuenciamiento directo del ADN, del locus genético que flanquea e incluye el polimorfismo. Tal análisis puede lograrse utilizando el "método de terminación de la cadena mediado por didesoxi" , también conocido como el "Método de Sanger" (Sanger, F. , et al., 1975) o el "método de degradación química", también conocido como el "método de Maxam-Gilbert" (Maxam, A. M. , et al., 1977). El secuenciamiento en combinación con las tecnologías de amplificación específicas de la secuencia genómica, tales como la reacción en cadena de la polimerasa, puede utilizarse para facilitar la recuperación de los genes deseados (Mullís, K. et al., 1986; Solicitud de Patente Europea 50,424; Solicitud de Patente Europea 84,796, Solicitud de Patente Europea 258,017, Solicitud de Patente Europea 237,362; Solicitud de Patente Europea 201,184; Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,683,202; 4,582,788 y 4,683,194), todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. El secuenciamiento de las muestras agrupadas puede lograrse también utilizando el secuenciamiento con Solexa/lIlumina (Illumina,1" San Diego, CA) , pirosecuenciamiento u otros procedimientos de secuenciamiento de una sola molécula. 2. Resistencia a la Exonucleasa Otros métodos que pueden emplearse para determinar la identidad de un nucleótido presente en un sitio mutado, utiliza un derivado nucleotídico resistente al exonucleótido especializado (Patente de los Estados Unidos No. 4,656,127). Un cebador complementario a una secuencia alélica inmediatamente 3'- al sitio polimórfico, se híbrida al ADN bajo investigación. Si el sitio polimórfico en el ADN contiene un nucleótido que es complementario al derivado nucleotídico resistente al exonucleótido particular presente, entonces ese derivado se incorporará mediante una polimerasa al final del cebador hibridado. Tal incorporación hace al cebador resistente a la escisión con la exonucleasa y permite por lo tanto, su detección. Puesto que la identidad del derivado resistente al exonucleótido se conoce, uno puede determinar el nucleótido específico presente en el sitio polimórfico del ADN. 3_. Métodos de Microsecuenciamiento Varios otros procedimientos de incorporación del nucleótido guiado por el cebador, para probar los sitios rautados en el ADN se han descrito (Komher, J. S. et al., 1989; Sokolov, B. P., 1990; Syvanen 1990; Kuppuswamy et al., 1991; Prezant et al., 1992; Ugozzoll, L. et al., 1992; Nyren et al., 1993). Estos métodos se basan en la incorporación de los desoxinucleótidos marcados para discriminar entre las bases en un sitio mutado. Puesto que la señal es proporcional al número de desoxinucleótidos incorporados, las mutaciones que ocurren en las corridas del mismo nucleótido resultan en una señal que es proporcional a la longitud de la corrida (Syvanen et al., 1993). 4. Extensión en la Solución La Patente Francesa 2,650,840 y la Solicitud del PCT No. WO91/02087, discuten un método basado en solución para determinar la identidad del nucleótido de un sitio mutado. De acuerdo con estos métodos, se utiliza un cebador complementario a las secuencias alélicas inmediatamente 3'- a un sitio polimórfico. La identidad del nucleótido de ese sitio se determina utilizando derivados de didesoxinucleótido marcados, que se incorporan al final del cebador si es complementario al nucleótido del sitio polimórfico. 5. Análisis Bit™ Genético o Extensión en Fase Sólida La Solicitud del PCT No. 92/15712 describe un método que utiliza mezclas de terminadores marcados y un cebador que es complementario a la secuencia 3' a un sitio polimórfico. El terminador marcado que se incorpora, es complementario al nucleótido presente en el sitio polimórfico de la molécula objetivo siendo evaluada y es identificada así. Aquí, el cebador o la molécula objetivo se inmoviliza en una fase sólida. 6. Ensayo de Ligadura del Oligonucleótido (OLA) El Ensayo de Ligadura del Oligonucleótido es un método en fase sólida que utiliza una metodología diferente que la descrita anteriormente (Landegren et al., 1988). Se utilizan dos oligonucleótidos capaces de hibridarse para ponerse en contacto con las secuencias de una sola hebra de un ADN objetivo. Uno de estos oligonucleótidos está biotinilado, mientras que el otro está marcado de manera detectable. Si la secuencia complementaria precisa se encuentra en una molécula objetivo, los oligonucleótidos se hibridarán de manera que sus términos están en contacto, y crean un sustrato de ligadura. La ligadura permite la recuperación del oligonucleótido marcado utilizando avidina. Otros ensayos de detección de ácidos nucleicos, basados en este método, combinado con PCR, también se describen (Nickerson et al., 1990). Aquí, la PCR se utiliza para lograr la amplificación exponencial del ADN objetivo, que se detecta a continuación utilizando el OLA. 7. Análisis Bit Genético Mediado por la Ligasa/Polimerasa La Patente de los Estados Unidos No. 5,952,174 describe un método que también involucra dos cebadores capaces de hibridarse para estar en contacto con las secuencias de una molécula objetivo. El producto hibridado se forma en un soporte sólido en el cual se inmoviliza el objetivo. Aquí, la hibridación ocurre de manera que los cebadores se separan uno de otro por un espacio de un solo nucleótido. El incubar este producto hibridado en la presencia de una polimerasa, una ligasa y una mezcla de trifosfato de nucleósido que contiene al menos un trifosfato de desoxinucleósido, permite la ligadura de cualquier par de oligonucleótidos hibridados en contacto. La adición de una ligasa resulta en dos eventos requeridos para generar una señal, la extensión y la ligadura. Esto proporciona una especificidad mayor y un "ruido" menor que los métodos que utilizan la extensión o la ligadura solas, y a diferencia de los ensayos basados en la polimerasa, este método mejora la especificidad del paso de la polimerasa, combinándolo con un segundo paso de hibridación y ligadura para que una señal se una a la fase sólida. 8. Métodos de Transferencia del Ácido Nucleico Para algunos métodos de la presente invención, pueden emplearse métodos de transferencia del ácido nucleico. Se cree que los métodos adecuados para el suministro del ácido nucleico para efectuar la expresión de las composiciones de la presente invención, incluyen virtualmente cualquier método mediante el cual un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, incluyendo vectores virales y no virales) , puede introducirse en un organelo, una célula, un tejido o un organismo, como se describió en la presente o como sabría alguien con experienci ordinaria en la técnica. Tales métodos incluyen, de manera no exclusiva, el suministro directo del ADN, tal como mediante inyección (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 y 5,580,859, cada una incorporada en la presente como referencia) , incluyendo microinyección (Harían y Weintraub, 1985; Patente de los Estados Unidos No. 5,789,215, incorporada en la presente como referencia) ; mediante electroporación (Patente de los Estados Unidos No. 5,384,253, incorporada en la presente como referencia) ; mediante precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); utilizando DEAE-dextrano seguido por polietilen glicol (Gopal, 1985) ; mediante carga sónica directa (Fechheimer et al.., 1987); mediante transfeccion mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al . , 1991); mediante bombardeo con microproyectiles (Solicitudes del PCT Nos. WO 94/09699 y 95/06128; Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,610,042; 5,322,783 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 y 5,538,880, y cada una incorporada en la presente como referencia) ; mediante agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al., 1990; Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,302,523 y 5,464,765, cada una incorporada en la presente como referencia) ; mediante transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,591,616 y 5,563,055, cada una incorporada en la presente como referencia) ; mediante transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh et al., 1993; Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,684,611 y 4,952,500, cada una incorporada en la presente como referencia) ; o mediante captación del ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus et al., 1985). A través de la aplicación de técnicas tales como éstas, los organelos, células, te idos u organismos pueden transformarse de manera estable o transitoria. 9. Anticuerpos específicos del alelo Los polipéptidos de BRAF que tienen una o más mutaciones para la resistencia descritos en la presente, pueden detectarse utilizando anticuerpos que reconocen de manera específica los polipéptidos de BRAF mutantes, pero no reconocen los polipéptidos de BRAF del tipo silvestre. Pueden crearse anticuerpos contra una o más formas alélicas de los polipéptidos de BRAF que tienen una o más mutaciones para la resistencia. Las técnicas para utilizar una proteína específica o un oligopéptido como un antígeno, para provocar anticuerpos que reconocen de manera específica los epitopos en el péptido o proteína, son bien conocidas. En una modalidad, la secuencia de ADN de la forma alélica deseada del gen objetivo, puede clonarse mediante la inserción en un vector de expresión apropiado, y traducirse en la proteína en una célula hospedera procariótica o eucariótica. La proteína puede recuperarse y utilizarse como un antígeno para provocar la producción de los anticuerpos específicos. En otra modalidad, el ADN de la forma alélica deseada del gen objetivo se amplifica mediante tecnología de PCR y se traduce sustancialmente in vitro en la proteína a ser utilizada como el antígeno para provocar la producción de los anticuerpos específicos. Una tercera modalidad es utilizar la secuencia de ADN de los alelos alternativos como una base para la generación de los péptidos sintéticos que representan la secuencia de aminoácidos de los alelos para utilizarlos como un antígeno para provocar la producción de los anticuerpos específicos.
Los anticuerpos pueden generarse mediante técnicas de anticuerpos monoclonales estándar o generarse a través, de sistemas de expresión recombinantes . Véase, generalmente, Abbas, Lichtman y Pober, Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Co. (1991) . El término "anticuerpos" pretende incluir las moléculas de anticuerpos intactos así como fragmentos o derivados de anticuerpos, tales como Fab y F(ab' )2/ ue son capaces de unirse de manera específica al antígeno. Los anticuerpos así producidos, de manera preferida, se unirán sólo a la proteína imitante producida en la forma alélica que se utilizó como un antígeno para crear el anticuerpo. Los métodos para generar anticuerpos específicos del alelo también se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 6,200,754 y la Patente de los Estados Unidos No. 6,054,273, el contenido completo de las cuales se incorpora en la presente como referencia.
Tales anticuerpos específicos para los polipéptidos de BRAF mutantes pueden utilizarse para detectar la presencia de un polipéptido de BRAF que tiene una o más mutaciones para la resistencia en una muestra, por ejemplo, una muestra de ensayo, una muestra de células, un extracto celular, una muestra biológica, o una muestra de un paciente, utilizando técnicas conocidas en el campo. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, inmunotransferencia Western, inmunohistoquimica, inmunofluorescencia indirecta y microarreglo de anticuerpos. Los anticuerpos que reconocen de manera específica los polipéptidos de BRAF mutantes también pueden ser inhibidores de BRAF de segunda generación. La capacidad de un anticuerpo' que reconoce de manera específica un polipéptido de BRAF mutante para inhibir la actividad biológica del polipéptido de BRAF mutante puede determinarse utilizando los métodos descritos en la presente, para identificar los inhibidores de BRAF de segunda generación.
IX. Aplicaciones de Diagnóstico y Selección Las técnicas anteriores pueden utilizarse para determinar la presencia o ausencia de una mutación para la resistencia identificada previamente en una molécula de ácido nucleico o polipéptido de BRAF en una muestra obtenida de un paciente. La identificación de una molécula de ácido nucleico o polipéptido de BRAF mutante en una muestra de un paciente, puede ser útil para caracterizar una enfermedad o condición en el paciente. Por ejemplo, en un paciente que tiene una enfermedad asociada con una expresión aberrante o la activación de BRAF (por ejemplo, un cáncer) , la identificación de una molécula de ácido nucleico o polipéptido de BRAF mutante en la muestra (por ejemplo, una muestra que contiene una célula cancerosa) obtenida del paciente, indica que el paciente tiene un riesgo relativamente alto de recalda o falta de respuesta al tratamiento con un inhibidor de BRAF. En una modalidad, la identificación de una molécula de ácido nucleico o polipéptido de BRAF que contiene una o más mutaciones descritas en la presente en una muestra que contiene una célula cancerosa obtenida de un paciente, indica que el paciente tiene un riesgo relativamente alto de recaída o falta de respuesta al tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación, por ejemplo, RAF-265.
Un paciente que tiene una mutación para la resistencia a BRAF descrita . en la presente, tiene un riesgo mayor de recaída del tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación que un paciente en quien no puede detectarse una mutación para la resistencia a BRAF. En consecuencia, como se utiliza en la presente, el término "riesgo relativamente alto de recaída" es en relación a un paciente en quien no pudo detectarse una molécula de ácido nucleico o polipéptido de BRAF mutante. Esto es, un paciente que tiene un "riesgo relativamente alto de recaída" , es un paciente que tiene un riesgo mayor de recaída, en comparación con un paciente en quien no pudo detectarse una molécula de ácido nucleico o polipéptido de BRAF mutante.
En ciertas modalidades, la identificación de un polipéptido de BRAF, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF, que tiene una mutación en uno o más de los siguientes residuos, indica que el paciente tiene un riesgo relativamente alto de recaída o falta de respuesta para el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación, por ejemplo, RAF-265: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251 , V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En las modalidades ejemplares, la identificación de un polipéptido de BRAF, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF, que tiene una o más de las siguientes mutaciones para la resistencia, indica que el paciente tiene un riesgo relativamente alto de recaída o falta de respuesta al tratamiento con un inhibidor de BRAF, por ejemplo, RAF-265: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, . L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L o C748F.
La determinación de la presencia o ausencia de una molécula de ácido nucleico o polipéptido dé BRAF mutante en una muestra de un paciente, también permite la selección de un régimen de tratamiento optimizado para el paciente, o estratificación del paciente a un cierto grupo de tratamiento. En una modalidad, un régimen de tratamiento que comprende un tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación se selecciona para un paciente en donde una muestra que contiene una célula cancerosa del paciente, no contiene una molécula de ácido nucleico o polipéptido de BRAF mutante. Tal paciente puede estratificarse a un régimen de tratamiento que comprende un inhibidor de BRAF de primera generación. El inhibidor de BRAF puede darse a tal paciente a una dosificación estándar, a intervalos de dosificación estándar.
En otra modalidad, un régimen de tratamiento que comprende el tratamiento sin un inhibidor de BRAF se selecciona para un paciente en donde una muestra que contiene una célula cancerosa del paciente, contiene una molécula de ácido nucleico o polipéptido de BRAF mutante, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico o polipéptido de BRAF que contiene una o más de las mutaciones descritas en la presente. Tal paciente puede estratificarse a un régimen de tratamiento que no comprenda un inhibidor de BRAF.
En otra modalidad, un régimen de tratamiento que comprende un tratamiento con una dosificación elevada de un inhibidor de BRAF de primera generación, se selecciona para un paciente en donde una muestra que contiene una célula cancerosa del paciente, contiene una molécula de ácido nucleico o polipéptido de BRAF mutante. Tal paciente puede estratificarse a un régimen de tratamiento que comprende una dosificación elevada de un inhibidor de BRAF de primera generación. En un aspecto ejemplar de las modalidades anteriores, el inhibidor de BRAF de primera generación es RAF-265.
En una modalidad alterna, la identificación de una molécula de ácido nucleico o polipéptido de BRAF mutante en una muestra que contiene una célula cancerosa obtenida de un paciente, indica que el paciente probablemente responderá al tratamiento con un inhibidor de BRAF de segunda generación. En consecuencia, en una modalidad, un régimen de tratamiento que comprende el tratamiento con un inhibidor de BRAF de segunda generación, se selecciona para un paciente en donde una muestra que contiene una célula cancerosa del paciente, contiene una molécula de ácido nucleico o polipéptido de BRAF mutante. Tal paciente puede estratificarse a un régimen de tratamiento que comprende un inhibidor de BRAF de segunda generación.
En los aspectos particulares de las modalidades anteriores, el polipéptido de BRAF mutante tiene una mutación en uno o más de los siguientes residuos: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En las modalidades ejemplares, el polipéptido de BRAF mutante tiene una o más de la siguientes mutaciones: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F. En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico de BRAF mutante codifica un polipéptido de BRAF mutante que contiene una mutación en uno o más de los residuos de aminoácidos anteriores.
En consecuencia, en una modalidad, la invención proporciona un método para optimizar el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, que comprende extraer el ácido nucleico de las células del cáncer; y secuenciar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF; en donde la presencia de los nucleótidos que alteran la identidad de un residuo de aminoácido en uno o más aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado, con relación al aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO : 2 O la SEQ ID NO: 4, indica la necesidad de tratar a un sujeto con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para optimizar el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, que comprende extraer el ácido nucleico de las células del cáncer; y someter la muestra a PCR e identificar la secuencia nucleotídica de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF; en donde la presencia de nucleótidos que alteran la identidad de un resido de aminoácido en uno o más aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado, con relación al aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, indica la necesidad de tratar al sujeto con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprende extraer el ácido nucleico de las células del cáncer; secuenciar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF; y administrar un inhibidor de MEK o un inhibidor de BRAF de segunda generación al sujeto, cuando la molécula de ácido nucleico contiene nucleótidos que alteran la identidad de un residuo de aminoácidos en uno o más aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado con relación al aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprende extraer el ácido nucleico de las células del cáncer; someter la muestra a PCR e identificar la secuencia nucleotídica de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF; y administrar un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación al sujeto, cuando la molécula de ácido nucleico contiene nucleótidos que alteran la identidad de un residuo de aminoácidos en uno o más aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado con relación al aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 O la SEQ ID NO: 4.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar a un sujeto que tiene cáncer, que probablemente se beneficiará con el tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación, que comprende: probar una muestra de ácido nucleico obtenida del cáncer, para la presencia de una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF que altera la identidad de uno o más residuos de aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado, con relación al aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4; y correlacionar la presencia de una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF, con un sujeto que probablemente se beneficiará con el tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación.
En otra modalidad, la. invención proporciona un método para identificar a un sujeto que tiene cáncer, que probablemente se beneficiará con el tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación, que comprende probar una muestra de ácido nucleico obtenida del cáncer, para la presencia de una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF, que altera la identidad de uno o más residuos de aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado, con relación al aminoácido en una o más posiciones, seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO-.2 o la SEQ ID NO-.4; y correlacionar la presencia de una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF, con un sujeto que probablemente se beneficiará con el tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación.
En varias modalidades de los aspectos anteriores, el inhibidor de MEK es CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, 6-metoxi-7- (3-morfolin-4-il-propoxi) -4- (4-fenoxi-fenilamino) -quinolin-3-carbonitrilo o 4- [3-cloro-4- (1-metil-lH-imidazol-2-ilsulfañil) -fenilamino] -6-metoxi-7- (3-morfolin-4-il-propoxi) -quinolin-3-carbonitrilo, o combinaciones de los mismos.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar a un sujeto que tiene cáncer como que tiene un alto riesgo de recaída durante el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación, que comprende extraer el ácido nucleico de las células del cáncer; y secuenciar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF; en donde la presencia de nucleótidos que alteran la identidad de un residuo de aminoácidos en uno o más aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado, con relación a un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, identifica al sujeto como que tiene un alto riesgo de recaída durante el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar a un sujeto que tiene cáncer, como que no es sensible al tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación, que comprende extraer el ácido nucleico de las células del cáncer; y secuenciar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF; en donde la presencia de nucleótidos que alteran la identidad de un residuo de aminoácidos en uno o más aminoácidos ' del polipéptido de BRAF codificado, con relación a un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO : 2 o la SEQ ID NO: 4, identifica al sujeto como que no es sensible al tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación.
En varias modalidades de los aspectos anteriores, el inhibidor de RAF es RAF265 o PLX 4720. En algunas modalidades de los aspectos anteriores, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de leucemias, linfornas, mielomas, carcinomas, carcinomas metastásicos, sarcomas, adenomas, cánceres del sistema nervioso y cánceres genitourinarios. En otras modalidades, el cáncer es melanoma.
X. Métodos de Tratamiento En varias modalidades, la invención proporciona métodos para .tratar a un sujeto que tiene un cáncer. En las modalidades ejemplares, el sujeto tiene un cáncer que contiene un polipéptido de BRAF que tiene una o más mutaciones, por ejemplo, una o más de las mutaciones para la resistencia descritas en la presente. En las modalidades relacionadas, el sujeto tiene un cáncer que contiene, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF que tiene una o más mutaciones, por ejemplo, una o más de las mutaciones para la resistencia descritas en la presente. Los términos "tratado", "tratar" o "tratamiento" incluyen la disminución o alivio de al menos un síntoma asociado con la condición siendo tratada. Por ejemplo, el tratamiento puede ser la disminución de uno o varios síntomas de un trastorno o la erradicación completa de un trastorno, tal como cáncer. De igual manera, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto es una cantidad suficiente para disminuir o aliviar al menos un síntoma asociado con las condiciones siendo tratadas.
En consecuencia, en algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar al sujeto, un inhibidor de RAF de segunda generación. En otras modalidades, la invención proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar al sujeto un inhibidor de MEK. En las modalidades ejemplares de los aspectos anteriores, una o más mutaciones en un polipéptido de BRAF, o en una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF, se identificaron en el cáncer, que confieren resistencia al uno o más inhibidores de BRAF descritos en la presente. Por ejemplo, la invención proporciona un método para tratar un cáncer, que contiene sustituciones de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones en BRAF, opcionalménte, además de tener una mutación de BRAF en V600E: A29, H72, S113, S124, P162, C194 , L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO : , el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de BRAF de segunda generación. La invención proporciona además, un método para tratar un cáncer, que contiene sustituciones de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones en BRAF, opcionalménte, además de tener una mutación de BRAF en V600E: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, el método comprende administrar al sujeto, una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de MEK. Puesto que MEK se activa corriente debajo de RAF, un inhibidor de MEK puede inhibir de manera exitosa la señalización de RAF en las células que tienen una o más de las mutaciones para la resistencia a RAF descritas en la presente.
Los inhibidores de MEK adecuados para practicar la invención incluyen, de manera no exclusiva, 1-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, 6-metoxi-7- (3 -morfolin-4 -il-propoxi) -4- (4-fenoxi-fenilamino) -quinolin-3-carbonitrilo, 4- [3-cloro-4- (l-metil-lH-imidazol-2-ilsulfanil) -fenilamino] -6-metoxi-7- (3-morfolin-4-il-propoxi) -quinolin-3 -carbonitrilo, y el compuesto de Roche RG7420. Los inhibidores de MEK adicionales, adecuados para practicar la invención incluyen, de manera no exclusiva, los compuestos descritos en WO 2008076415, US 20080166359, WO 2008067481, WO 2008055236, US 20080188453, US 20080058340, WO 2007014011, WO 2008024724, US 20080081821, WO 2008024725, US 20080085886, WO 2008021389, WO 2007123939, US 20070287709, WO 2007123936, US 20070287737, US 20070244164, WO 2007121481, US 20070238710, WO 2007121269, WO 2007096259, US 20070197617, WO 2007071951, EP 1966155, IN 2008MN01163, WO 2007044084, AU 2006299902, CA 2608201, EP 1922307, EP 1967516, MX 200714540, IN 2007DN09015, NO 2007006412, KR 2008019236, WO 2007044515, AU 2006302415, CA 2622755, EP 1934174, IN 2008DN02771, KR 2008050601, WO 2007025090, US 20070049591, WO 2007014011, AU 2006272837, CA 2618218, EP 1912636, US 20080058340, MX 200802114, KR 2008068637, US 20060194802, WO 2006133417, WO 2006058752, AU 2005311451, CA 2586796, EP 1828184, JP 2008521858, US 20070299103, NO 2007003393, WO 2006056427, AU 2005308956, CA 2587178, EP 1838675, JP 2008520615, NO 2007003259, US 20070293544, WO 2006045514, AU 2005298932, CA 2582247, EP 1802579, CN 101065358, JP 2008517024, IN 2007DN02762, MX 200704781, KR 2007067727, NO 2007002595, JP 2006083133, WO 2006029862, US 20060063814, US 7371869, AU 2005284293, CA 2579130, EP 1791837, CN 101023079, JP 2008513397, BR 2005015371, KR 2007043895, MX 200703166, IN 2007CN01145, WO 2006024034, AU 2005276974, CA 2578283, US 20060079526, EP 1799656, CN 101044125, JP 2008510839, MX 200702208, IN 2007DN02041, WO 2006018188, AU 2005274390, CA 2576599, EP 1781649, CN 101006085, JP 2008509950, BR 2005014515, AT 404556, US 20060041146, MX 200701846, IN 2007CN00695, KR 2007034635, WO 2006011466, AU 2005265769, CA 2575232, EP 1780197, BR 2005013750, JP 4090070, MX 200700736, CN 101124199, KR 2007041752, IN 2007DN01319, WO 2005121142, AU 2005252110, CA 2569850, US 20060014768, US 7378423', EP 1761528, CN 101006086, AT 383360, BR 2005011967, JP 2008501631, EP 1894932, ES 2297723, MX 2006PA14478, NO 2007000155, IN 2007CN00102, KR 2007034581, HK 1107084, JP 2008201788, US 20050256123, US 20050250782, US 20070112038, US 20050187247, WO 2005082891, WO 2005051302, AU 2004293019, CA 2546353, US 20050130943, US 20050130976, US 20050153942, EP 1689233, JP 2007511615, WO 2005051301 AU 2004293018, CA 2545660, US 20050130943, US 20050130976, US 20050153942, EP 1682138, BR 2004016692, CN. 1905873, JP 2007511614, MX 2006PA05657, IN 2006DN03183, NO 2006002692, KR 2007026343, WO 2005028426, EP 1674452, US 20070105859, US 20050054701, US 7230099, US 20050049419, US 7144907, AU 2004270699, CA 2537321, WO 2005023759, EP. 1673339, BR 2004014111, CN 1874769, JP 2007504241, JP 4131741, US 20060030610, MX 2006PA02466, NO 2006001506, US 20050049419, US 7144907, US 20050054701, US 7230099, AU 2004270699, CA 2537321, WO 2005023759, EP 1673339, BR 2004014111, CN 1874769, JP 2007504241, JP 4131741 US 20060030610, MX 2006PA02466, IN 2006DN01661, NO 2006001506, US 20060189808, US 20060189649, US 7271178, US 20060189668, US 20050049276, WO 2005009975, CA 2532067, EP 1651214, BR 2004012851, JP 2006528621, US 20050026970, US 7160915, MX 2006PA00921, WO 2005007616, US 20050059710, WO 2005000818, US 20050026964, US 7273877, WO 2004056789, US 20050004186, CA 2509405, AU 2003286306, EP 1578736, BR 2003017254, JP 2006516967, MX 2005PA06803, WO 2004044219, AU 2003291268, WO 2004041811, AU 2003278369, EP 1575943, JP 2006508944, US 20050282856, US 7173136, US 20070191346, WO 2004041185, AU 2003287366, US 20060270643, WO 2004030620, AU 2003275282, US 20040092514, US 7232826, EP 1545529, US 20040039037, US 6989451, WO 2003077855, CA 2478534, AU 2003220202, US 20030216460, EP 1482944, CN 1652792, JP 2005526076, RU 2300528, BR 2003006016, MX 2004PA08894, US 20060106225, WO 2003062191, CA 2473545, EP 1467968, BR 2003007060, JP 2005515253, TW 592692, US 20040006245, US 6891066, MX 2004PA05527, US 20050137263, US 7078438, WO 2003062189, CA 2472367, EP 1467965, BR 2003007071, JP 2005515251, US 20030232889, US 6770778, MX 2004PA05528, WO 2003047585, AU 2002347360, WO 2003047583, AU 2002365665, WO 2003047523, CA 2466762, AU 2002365899, US 20030125359, US 7307071, JP 2005526008, EP 1578346, WO 2003035626, CA 2463101, AU 2002359291, EP 1438295, JP 2005508972, US 20050054706, US 7253199, US 20070293555, AU 2008202731, US 6506798, WO 9901421, WO 2000041994, US 6310060, O 2002006213, CA 2416685, AU 2001073498, BR 2001012584, HU 2003002781, JP 2004504294, JP 3811775, EE 200300030, NZ 524120, AU 2001273498, IN 2003MN00028, NO 2003000249, KR 773621, MX 2003PA00591, HR 2003000083, BG 107564, ZA 2003000348, US 20040054172, US 6960614, HK 1055943, US 20050176820, US 7411001, WO 2000042029, JP 2000204077, CA 2355374, EP 1144394, BR 9916896, TR 200102029, HU 2001005092, JP 2002534515, EE 200100374, NZ 513432, AT 302761, ES 2249060, ZA 2001005219, MX 2001PA06659, IN 2001MN00785, NO 2001003451, HR 2001000525, BG 105801, US 6545030, HK 1042488, US 20030004193, WO 2000042022, JP 2000204079, CA 2355470, EP 1144385, BR 9916904, TR 200102030, HU 2001005113, EE 200100373, JP 2002534510, NZ 513433, AT 302193, ES 2247859, MX 2001PA06568, ZA 2001005224, IN 2001MN00786, US 6469004, NO 2001003452 , . HR 2001000524, BG 105800, WO 2000042003, JP 2000212157, CA 2349832, EP 1144371, BR 9916885, AT 309205, ES 2252996, MX 2001PA04332, US 6440966, US 20030092748, US 6750217, WO 2000042002, JP 2000204075, CA 2349467, EP 1144372, BR 9916894, JP 2002534497, AT 311363, ES 2251851, MX 2001PA04331, US 6455582, US 20030045521, US 6835749, WO 2000037141, CA 2352326, BR 9916839, EP 1140291, TR 200101871, HU 2001004844, JP 2002532570, EE 200100339, Z 512859, AT 310567, ES2253928, ZA 2001004277, MX 2001PA05476, IN 2001MN00673 , NO 2001003099, HR 2001000473, BG 105715, US 20040171632, GB 2323845, O 9901426, CA 2290506, AU 9882627, AU 757046, EP 993439, BR 9810366, NZ 501276, HU 2000003731, JP 2002511092, AT 277895, IL 132840, PT 993439, ES 2229515, TW 396149, ZA 9805728, MX 9910649, NO 9906491, NO 315271, US 20030078428, US 6821963, US 20050049429, US 20060052608, US 7169816, WO 9901421, CA 2290509, AU 9882626, AU 756586, EP 993437, BR 9810385, JP 2002509536, NZ 501277, AT 344791, ES 2274572, TW 221831, ZA 9805726, MX 9910556, US 6310060, US 6506798, US 20020022647, US 6492363, US 20030149015 y US 7019033, el contenido completo de las cuales se incorpora en la presente como referencia .
Las dosificaciones, formulaciones y modos de administración de los compuestos anteriores, son conocidos en la técnica. Los modos ejemplares de administración incluyen, de manera no exclusiva, oral, subcutánea, intravenosa o parenteral . Las formas de dosificación líquidas para la administración oral pueden incluir, de manera no exclusiva, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes utilizados comúnmente en la técnica, tal como por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsificantes , tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilen glicol, 1,3-butilen glicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuate, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo) , cremafor, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilen glicoles y ésteres de ácido graso de sorbitan y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes. Las formas de dosificación sólidas para la administración oral incluyen cápsulas, tabletas, pildoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente o portador inerte, farmacéuticamente aceptable, tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o a) rellenos o extensores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidinona, sacarosa y acacia, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes desintegrantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio, e) agentes que retardan la solución tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita, y i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilen glicoles sólidos, sulfato de laurilo sódico y mezclas de los mismos, y j) mejoradores de la velocidad de disolución como polietilen glicoles o polivinil pirrolidona de peso molecular alto, en mezclas físicas o en forma de dispersiones sólidas. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, la forma de dosificación también puede comprender agentes amortiguadores.
Debido a que las mutaciones en BRAF mejoran ampliamente la resistencia en varios tipos de cáncer, los métodos e inhibidores de BRAF de segunda generación descritos en la presente, son útiles para tratar un amplio espectro de cánceres, incluyendo tumores sólidos y malignidades hematológicas . Los ejemplos de tales tumores incluyen, de manera no exclusiva, leucemias, linfomas, mielomas, carcinomas, carcinomas metastásicos , sarcomas, adenomas, cánceres del sistema nervioso y cánceres genitourinarios . En las modalidades ejemplares, los métodos anteriores son útiles para tratar la leucemia linfoblástica aguda en adultos y pediátrica, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, cáncer anal, cáncer del apéndice, astrocitoma, carcinoma de las células básales, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer óseo, osteosarcoma, histiocitoma fibroso, cáncer cerebral, glioma del tallo cerebral, astrocitoma cerebelar, glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma hipotalámico, cáncer de mama, cáncer de mama masculino, adenomas bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, carcinoma de origen desconocido, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebelar, glioma maligno, cáncer cervical, cánceres de la niñez, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer colorrectal, linfoma de los linfocitos T cutáneos, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer esofágico, tumores de la familia de Ewing, tumor de las .células germinales extracraneales, tumor de las células germinales extragonadales, cáncer del conducto biliar extrahepático, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de la vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor estromal gastrointestinal, tumor de las células germinales extracraneales, tumor de las células germinales extragonadales, tumor de las células germinales ováricas, tumor trofoblástico gestacional, glioma, leucemia de las células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma hipotalámico y de la trayectoria visual, tumores de las células de isleta, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, cáncer de las células renales, cáncer laríngeo, cáncer de labios y de la cavidad oral, cáncer de pulmón de las células pequeñas, cáncer de pulmón de las células no pequeñas, linfoma del sistema nervioso central primario, macroglobulinema de Waldenstrom, histiocitoma fibroso maligno, meduloblastoma, melanoma, carcinoma de las células de erkel, mesotelioma maligno, cáncer de cuello escamoso, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoide, síndromes de mielodisplasia, trastornos mieloproliferativos , trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de la cavidad nasal y de los seños paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer orofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer faríngeo, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales , cáncer de hipófisis, neoplasmas de las células del plasma, blastoma .pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer rectal, rabdomiosarcoma, cáncer de las glándulas salivares, sarcoma del tejido blando, sarcoma uterino, síndrome de Sezary, cáncer de piel que no es melanoma, cáncer del intestino delgado, carcinoma de las células escamosas, cáncer de cuello escamoso, tumores neuroectodérmicos primitivos - supratentoriales, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de las células transicionales , tumores trofoblásticos , cáncer uretral, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer vulvar y tumor de Wilms.
XI . Equipos Varios equipos pueden montarse como parte de la presente invención. Un equipo puede contener componentes para probar las mutaciones en BRAF para evaluar un paciente particular para el riesgo de desarrollar resistencia a la terapia utilizando un inhibidor de BRAF, y permite así que un clínico determine si se necesita un tratamiento alterno para el paciente. Tales equipos pueden contener reactivos que permiten que las mutaciones se evalúen, tales como conjuntos de cebadores para evaluar las mutaciones correlacionadas con las manifestaciones fenotípicas relevantes con respecto a la resistencia a un inhibidor de BRAF (por ejemplo, RAF-265) . Está contemplado que los cebadores (o pares de cebadores) que son complementarios o idénticos a toda o parte de la SEQ ID NO:l, por ejemplo, puedan ser parte del equipo. En las modalidades preferidas, los cebadores pueden ser utilizados para detectar de manera específica o amplificar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF mutante que contiene una mutación en uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En las modalidades ejemplares, los cebadores detectan de manera específica o amplifican una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF que contiene una o más de las siguientes mutaciones: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F. En otras modalidades, los equipos contienen instrucciones para utilizar los cebadores que son complementarios o idénticos a toda o parte de la SEQ ID NO:l para amplificar una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de BRAF.
En otras modalidades, los equipos comprenden composiciones para detectar una mutación que comprende un polipéptido de BRAF, tal como un anticuerpo que reconoce de manera específica un polipéptido de BRAF mutante que contiene una o más mutaciones para la resistencia. Los polipéptidos ejemplares incluyen un polipéptido de BRAF mutante que contiene una mutación en uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En otras modalidades, el polipéptido de BRAF mutante contiene una o más de las siguientes mutaciones: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T,' F738L y C748F.
Todos los materiales y reactivos esenciales requeridos para probar las mutaciones de BRAF por un método particular discutido anteriormente, pueden montarse también juntos en un equipo. Cuando los componentes del equipo se proporcionan en una o más soluciones líquidas, la solución líquida de manera preferida, es una solución acuosa, con una solución acuosa estéril que es particularmente preferida.
Los componentes del equipo también pueden proporcionarse en formas secas o liofilizadas . Cuando los reactivos o componentes se proporcionan como una forma seca, la reconstitución es generalmente mediante la adición de un solvente adecuado. Se considera que el solvente también pueda proporcionarse en otro medio de recipiente.
Los equipos de la presente invención también incluirán, típicamente, un medio para contener los viales en confinamiento estrecho para la venta comercial, tal como por ejemplo, recipientes de plástico inyectados o moldeados por soplado, en los cuales los viales deseados son retenidos. Sin importar el número o tipo de recipientes, los equipos de la invención también pueden comprender, o empacarse con un instrumento para ayudar con la recolección y evaluación de la muestra. Tal instrumento puede ser un inhalante, jeringa, pipeta, fórceps, cuchara graduada, gotero para ojos o cualquier vehículo de suministro aprobado médicamente, por ejemplo.
Los equipos de la invención también pueden incluir una hoja con instrucciones que exponga las terapias alternas sugeridas cuando se identifiquen las mutaciones particulares en un paciente. Por ejemplo, una hoja de instrucciones incluida con los equipos de la invención puede recomendar que un paciente que tiene un trastorno, por ejemplo, un cáncer, en el cual se ha identificado un polipéptido de BRAF mutante, suspenda el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación, sea vigilado para la recaída durante el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación, continúe el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación a una dosificación elevada o inicie el tratamiento con un inhibidor de BRAF de segunda generación. Una hoja de instrucciones incluida con los equipos de la invención, puede de igual manera, recomendar que un paciente que tiene un trastorno en el cual un polipéptido de BRAF mutante no es detectable, continúe el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación a una dosificación estándar. En las modalidades ejemplares, el inhibidor de BRAF de primera generación es RAF-265.
Esta invención se ilustra además por los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes. El contenido de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas, citadas a través de esta solicitud, se incorporan en la presente como referencia.
EJEMPLOS Ejemplo 1 : Selección de la Mutagénesis Aleatoria de BRAF-V600E (RAF265 y PLX4720) La generación de las bibliotecas mutagenizadas se logró utilizando una modificación de los métodos publicados. Brevemente, la mutagénesis de realizó propagando un plásmido de expresión de BRAF(V600E) (pWZL-Blast-BRAF (V600E) ) en E.coli deficiente para los genes de reparación del ADN MutS, MutD5 y MutT (XLl-Red; Stratagene) . El ADN del plásmido se extrajo de estas bacterias y se amplificó en E.coli XLl-Blue (Stratagene). El plásmido de BRAF(V600E) mutagenizado o el control no mutagenizado se utilizó para infectar las células de melanoma A375. Después de la selección con blasticidina, las células se emplacaron en platos de 15 cm y se cultivaron en la presencia de los inhibidores de RAF (RAF265 o PLX4720; 2 µ? o 1.5 µ?, respectivamente) durante 5 semanas hasta que surgieron las clonas resistentes. Las clonas resistentes se secuenciaron para identificar las mutaciones que ocurrieron con alta frecuencia. Los resultados se muestran en la Figura 5 (selección de RAF265) y la Figura 6 (selección de PLX4720) . La Figura 7 describe las ubicaciones de tres mutaciones de BRAF que surgen con alta frecuencia en ambas selecciones.
Ejemplo 2: Análisis de Transferencia Western de la Activación de pMEKl/2 y pERKl/2 en las Células que Contienen los Mu antes de BRAF Las células 293T se transíectaron con 6 µ? de p ZL (BLAST) -BRAF para cada alelo putativo de la resistencia y se trataron posteriormente con una gama de concentraciones del inhibidor de BRAF(V600E) PLX4720 (0, 0.08, 0.4, 2, 5 y 10 µ?) durante 16 horas. Los estudios de inmunotransferencia se realizaron utilizando procedimientos estándar. Brevemente, las células tratadas se lisaron con amortiguador TN que contiene el inhibidor de la proteasa (Roche) , NaF y NaV03 (1 mM cada uno) . Los lisados se cuantificaron (ensayo de Bradford) , se desnaturalizaron (95°C) , y se resolvieron mediante electroforesis sobre gel de SDS. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se probaron con los anticuerpos primarios que reconocen a BRAF (Santa Cruz; dilución 1:10,000), p-ERKl/2, p-MEKl/2 (Ser-217/221) , y 0C-tubulina (Cell Signaling Technology; dilución 1:1,000). Después de la incubación con el anticuerpo secundario apropiado (IgG anti-conejo o anti-ratón, enlazada con HRP; dilución 1:1,000) (Cell Signaling Technology), las proteínas se detectaron utilizando quimioluminiscencia (Pierce) . Los resultados se muestran en la Figura 8. Como se utiliza en la presente, los niveles de MEK1/2 y ERKl/2 fosforiladas se incrementó en las células que contienen BRAF-V600E , BRAF-V600E-T521K y BRAF V600E-P686Q. El incremento en MEK1/2 y ERKl/2 fosforiladas es sustentado en las células de BRAF-V600E-T521K y BRAF V600E-P686Q en la presencia de concentraciones que se incrementan de PLX4720.
Ejemplo 3: Ensayo con la Cinasa de BRAF Las células 293T (70% de confluencia) se transíectaron con 15 µ? de pc-ADN-DEST40 que contiene los alelos putativos de la resistencia a BRAF (V600E) , cinasa-dead de BRAF o el tipo silvestre. A las 48 horas postinfección, los lisados se generaron mediante métodos estándar. La extracción utilizando perlas de cobalto se realizó durante 30 minutos a 4°C en 1 mg del extracto celular completo. Las perlas de cobalto unidas a la proteína se incubaron con µ? de mezcla de ATP/magnesio (Mops 20 mM pH 7.2, ß- glicerofosfato 25 mM, EGTA 5 mM, Na3V04 1 mM, DTT 1 mM, MgCl2 75mM y ATP 0.5 mM) , 20 µ? de amortiguador de dilución (Mops 20 mM, pH 7.2, ß-glicerofosfato 25 mM, EGTA 5 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, DTT 1 mM) , y 1 de MEK1 inactivo (obtenido de Millipore) durante 30 minutos a 30 °C. El producto de MEK1 fosforilado se detectó mediante inmunotinción utilizando un anticuerpo p-MEKl/2 (Cell Signaling Technology) .
EQUIVALENTES La invención se ha descrito en la presente con referencia a ciertos ejemplos y modalidades únicamente. No se hizo un esfuerzo para describir de manera exhaustiva todos los posibles ejemplos y modalidades de la invención. En realidad, aquellos con experiencia en la técnica, apreciarán que varias adiciones, supresiones, modificaciones y otros cambios pueden hacerse a los ejemplos y modalidades descritos anteriormente, sin apartarse del espíritu y alcance pretendidos de la invención, como se expone en las siguientes reivindicaciones. Se pretende que todas de tales adiciones, supresiones, modificaciones y otros cambios estén incluidos dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones .

Claims (66)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de BRAF mutante que tiene una actividad de BRAF, en donde el polipéptido de BRAF mutante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con un polipéptido de BRAF del tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) o un polipéptido de BRAF V600E (SEQ ID N0:4), al menos una sustitución de aminoácidos confiere resistencia a uno o más inhibidores de BRAF en el polipéptido de BRAF mutante.
2. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos una sustitución de aminoácidos ocurre en una o más posiciones de los aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748.
3. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos una sustitución de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521 , V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido de BRAF mutante tiene una a cinco sustituciones de aminoácidos en comparación con el polipéptido de BRAF del tipo silvestre o el polipéptido de BRAF V600E.
5. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido de BRAF mutante tiene una sustitución de aminoácidos en comparación con el polipéptido de BRAF del tipo ' silvestre o el polipéptido de BRAF V600E.
6. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido de BRAF mutante es un polipéptido de BRAF que comprende una sustitución en una o más de las posiciones de los aminoácidos T521K, V528F o P686Q.
7. La molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque el inhibidor de BRAF es RAF-265 o PLX4720.
8. Un vector de expresión, que comprende el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. Una célula hospedera que comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 8.
10. Un método para producir un polipéptido de BRAF mutante, que comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 9, de manera que se produce un polipéptido de BRAF por la célula.
11. Un polipéptido de BRAF mutante aislado que tiene una actividad de BRAF, en donde el polipéptido de BRAF mutante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una sustitución de aminoácidos, en comparación con un polipéptido de BRAF del tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) o un polipéptido de BRAF V600E (SEQ ID NO: ) , al menos una sustitución de aminoácidos confiere resistencia a uno o más inhibidores de BRAF en el polipéptido de BRAF mutante.
12. El polipéptido de BRAF mutante de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque al menos una • sustitución de aminoácidos ocurre en una o más posiciones de los aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748.
13. El polipéptido de BRAF mutante de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque al menos una sustitución de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T,< C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
14. El polipéptido de BRAF mutante de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque tiene una a cinco sustituciones de aminoácidos en comparación con el polipéptido de BRAF del tipo silvestre o el polipéptido de BRAF V600E.
15. El polipéptido de BRAF mutante de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque tiene una sustitución de aminoácidos en comparación con el polipéptido de BRAF del tipo silvestre o el polipéptido de BRAF V600E.
16. El polipéptido de BRAF mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-15, caracterizado porque el inhibidor de BRAF es RAF-265.
17. Un método para identificar un compuesto que es útil para tratar el cáncer, que comprende: (a) proporcionar una composición de ensayo que comprende un polipéptido de BRAF mutante de conformidad con la reivindicación 11 y un sustrato de BRAF; (b) poner en contacto la composición de ensayo con un compuesto de prueba bajo condiciones que permitan la fosforilación del sustrato de BRAF en la ausencia del compuesto de prueba; y (c) determinar el efecto del compuesto en la fosforilación del sustrato de BRAF; en donde la desmodulación de la fosforilación del sustrato de BRAF en comparación con un control adecuado, identifica al compuesto como un compuesto que es útil para tratar el cáncer.
18. Un método para identificar un compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generación, que comprende: (a) proporcionar una composición de ensayo que comprende un polipéptido de BRAF mutante de conformidad con la reivindicación 11 y un sustrato de BRAF; (b) poner en contacto la composición de ensayo con. un compuesto de prueba bajo condiciones que permitan la fosforilación del sustrato de BRAF en la ausencia del compuesto de prueba; y (c) determinar el efecto del compuesto en la fosforilación del sustrato de BRAF; en donde la desmodulación de la fosforilación del sustrato de BRAF en comparación con un control adecuado, identifica al compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generación.
19. El método de conformidad con la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque el sustrato de BRAF es MEK1 o MEK2.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la fosforilación de MEK1 o MEK2 se determina utilizando un anticuerpo MEK fosfoespecífico.
21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la fosforilación de MEK1 o MEK2 se determina midiendo la fosforilación de la proteína básica de la mielina (MBP) .
22. El método de conformidad con la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque la composición de ensayo es un extracto celular.
23. Un método para identificar un compuesto que es útil para tratar el cáncer, que comprende: a) proporcionar una célula que comprende un polipéptido de BRAF mutante de conformidad con la reivindicación 11; b) poner en contacto la célula con un compuesto de prueba; y c) determinar el efecto del compuesto en la fosforilación de un sustrato de BRAF; en donde la desmodulación de la fosforilación del sustrato de BRAF en comparación con un control adecuado, identifica al compuesto como un compuesto que es útil para tratar el cáncer.
2 . Un método para identificar un compuesto que es útil para tratar el cáncer, que comprende: a) proporcionar una célula que comprende un polipéptido de BRAF mutante de conformidad con la reivindicación 11; b) poner en contacto la célula con un compuesto de prueba; y c) determinar el efecto del compuesto en la proliferación celular; en donde la reducción en la proliferación celular en comparación con un control adecuado, identifica al compuesto como un compuesto que es útil para tratar el cáncer.
25. Un método para identificar un compuesto que es un inhibidor de BRAF de segunda generación, que comprende: a) proporcionar una célula que comprende un polipéptido de BRAF mutante de conformidad con la reivindicación 11; b) poner en contacto la célula con un compuesto de prueba; y c) determinar el efecto del compuesto en la fosforilación de un sustrato de BRAF; en donde la desmodulación de la fosforilación del sustrato de BRAF en comparación con un control adecuado, identifica al compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generación.
26. Un método para identificar un compuesto que es un inhibidor de BRAF de segunda generación, que comprende: a) proporcionar una célula que comprende un polipéptido de BRAF mutante de conformidad con la reivindicación 11; b) poner en contacto la célula con un compuesto de prueba; y c) determinar el efecto del compuesto en la proliferación celular; en donde la reducción en la proliferación celular en comparación con un control adecuado, identifica al compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generación.
27. El método de conformidad con la reivindicación 23 ó 25, caracterizado porque el sustrato de BRAF es MEK1 o MEK2.
28. Un método de selección basado en una célula, para identificar un compuesto de prueba como un inhibidor de BRAF de segunda generación, el método comprende poner en contacto la célula hospedera de conformidad . con la reivindicación 9 con un compuesto de prueba, en donde la sensibilidad de la célula hospedera al compuesto de prueba identifica al compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generación.
29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la sensibilidad de la célula hospedera al compuesto de prueba se mide utilizando un ensayo seleccionado del grupo que consiste de un ensayo de proliferación celular, un ensayo de la viabilidad celular, y un ensayo de la fosforilación de MEK, en donde la reducción en la proliferación celular, la viabilidad celular o la fosforilación de MEK en la presencia del compuesto de prueba, identifica al compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generación .
30. Un método para identificar un inhibidor de BRAF de segunda generación, que comprende: a) seleccionar un fármaco potencial utilizando un modelado asistido por computadora con una estructura tridimensional del cristal o de la solución de un polipéptido de BRAF mutante, en donde el polipéptido de BRAF mutante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con un polipéptido de BRAF del tipo silvestre o un polipéptido de BRAF V600E, al menos una sustitución de aminoácidos confiere resistencia a uno o más inhibidores de BRAF en el polipéptido de BRAF mutante ; b) poner en contacto el fármaco potencial con el polipéptido de BRAF mutante; y c) detectar la interacción del fármaco potencial con el polipéptido de BRAF mutante ,- en donde un compuesto que es capaz de interactuar con el polipéptido de BRAF mutante se identifica como un inhibidor de BRAF de segunda generación.
31. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 17-30, caracterizado porque el compuesto de prueba es un miembro de una biblioteca de compuestos.
32. Un compuesto aislado identificado por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-31.
33. Un método para inhibir la actividad de un polipéptido de BRAF mutante, que comprende poner en contacto el polipéptido de BRAF mutante con un compuesto identificado de acuerdo con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-31.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el compuesto inhibe además, la actividad de un polipéptido de BRAF del tipo silvestre.
35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el contacto ocurre in vi tro.
36. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el contacto ocurre in vivo.
37. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el contacto ocurre en un sujeto.
38. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el contacto ocurre en un sujeto que tiene un cáncer.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el sujeto ha recaído con el tratamiento con RAF-265.
40. El método de conformidad con la reivindicación 38 ó 39, caracterizado porque el cáncer es un melanoma.
41. Un método para tratar a un sujeto que tiene un cáncer, que comprende administrar al sujeto, un compuesto identificado de acuerdo con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-31.
42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el compuesto inhibe además, la actividad de un polipéptido de BRAF del tipo silvestre.
.43. El método de conformidad con la reivindicación 41 ó 42, caracterizado porque el sujeto ha recaído con el tratamiento con RAF-265.
44. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 41-43, caracterizado porque una o más mutaciones en un polipéptido de BRAF, o una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF, se identificaron en el cáncer, en donde una o más mutaciones confieren resistencia a uno o más inhibidores de BRAF en el polipéptido de BRAF mutante .
45. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 41-44, caracterizado porque el cáncer es un melanoma.
46. Un método para seleccionar un sujeto que tiene cáncer para una mutación de BRAF, que confiere resistencia al tratamiento con un inhibidor de RAF, el método comprende (a) obtener una muestra que contiene una célula cancerosa del sujeto; y (b) identificar en la muestra, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF que contiene una o más mutaciones con respecto a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF del tipo silvestre (SEQ ID N0:1) o un polipéptido de BRAF V600E (SEQ ID NO: 3), las mutaciones ocurren en las posiciones que codifican uno o más aminoácidos en el polipéptido de BRAF seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657> S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748, en donde la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra que contiene una célula cancerosa, identifica al sujeto como que es resistente al tratamiento con un inhibidor de RAF.
47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido de BRAF que tiene una o más sustituciones de aminoácidos con respecto a un polipéptido de BRAF del tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) o un polipéptido de BRAF V600E (SEQ ID NO: ) seleccionadas del grupo que consiste de A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, V483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
48. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra que contiene una célula cancerosa, identifica al sujeto como que tiene un riesgo relativamente alto de recaída durante el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación.
49. El método de conformidad con la reivindicación 5 46, caracterizado porque la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra que contiene una célula cancerosa, identifica al sujeto como que no es sensible al tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación.
50. El método de conformidad con la reivindicación 10 48 ó 49, caracterizado porque el inhibidor de BRAF de primera generación es RAF-265.
51. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra que contiene una célula cancerosa, 15 estratifica al sujeto al tratamiento con un inhibidor de BRAF de segunda generación.
52. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 46-51, caracterizado porque la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra que contiene una '20 célula cancerosa se determina mediante un método que comprende determinar la secuencia de una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de BRAF.
53. El método de conformidad con. una de las reivindicaciones 46-51, caracterizado porque la presencia de 25 la molécula de ácido nucleico en la muestra que contiene una célula cancerosa se determina detectando un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico, utilizando ' un anticuerpo que reconoce de manera específica un polipéptido de BRAF que contiene una mutación en una posición seleccionada del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748.
54. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 46-53, caracterizado porque comprende además, administrar un compuesto de conformidad con la reivindicación 32 a un sujeto en quien se detectó la presencia de una o más mutaciones en un polipéptido de BRAF.
55. Un método para optimizar el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, que comprende: (a) extraer el ácido nucleico de las células del cáncer; y (b) secuenciar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF; en donde la presencia de nucleótidos que alteran la identidad de un residuo de aminoácidos en uno o más aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado, con relación a un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO : 4 , indica la necesidad de tratar al sujeto con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación.
56. Un método para optimizar el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, que comprende: (a) extraer el ácido nucleico de las células del cáncer; y (b) someter la muestra a PCR e identificar la secuencia nucleotídica de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF; en donde la presencia de nucleótidos que alteran la identidad de un residuo de aminoácidos en uno o más aminoácidos" del polipéptido de BRAF codificado, con relación a un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, indica la necesidad de tratar al sujeto con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación.
57. Un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprende: (a) extraer el ácido nucleico de las células del cáncer; (b) secuenciar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF; y (c) administrar un inhibidor de MEK o un inhibidor de BRAF de segunda generación al sujeto, cuando la molécula de ácido nucleico contiene nucleótidos que alteran la identidad de un residuo de aminoácidos en uno o más aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado, con relación a un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 O la SEQ ID NO: 4.
58. Un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprende: (a) extraer el ácido nucleico de las células del cáncer; (b) someter la muestra a PCR e identificar la secuencia nucleotidica de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF; (c) administrar un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación al sujeto, cuando la molécula de ácido nucleico contiene nucleótidos que alteran la identidad de un residuo de aminoácidos en uno o más aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado, con relación a un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L69.7, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.
59. Un método para identificar a un sujeto que tiene cáncer, que probablemente se beneficiará con el tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación, que comprende: (a) probar una muestra de ácido nucleico obtenida del cáncer para la presencia de una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF, que altera la identidad de uno o más residuos de aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado, con relación a un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: ; y (b) correlacionar la presencia de una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF con un sujeto que probablemente se beneficiará con el tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación.
60. Un método para identificar a un sujeto que tiene cáncer, que probablemente se beneficiará con el tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación, que comprende: (a) probar una muestra de ácido nucleico obtenida del cáncer, para la presencia de una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF que altera la identidad de uno o más residuos de aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado, con relación a un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124 , P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4; y (b) correlacionar la presencia de una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF con un sujeto que probablemente se beneficiará con el tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generación.
61. Un método para identificar a un sujeto que tiene cáncer, como que tiene un alto riesgo de recaída durante el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación, que comprende: (a) extraer el ácido nucleico de las células del cáncer; y (b) secuenciar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF; en donde la presencia de nucleótidos que alteran la identidad de un residuo de aminoácidos en uno o más aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado, con relación a un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, identifica al sujeto como que tiene un alto riesgo de recaída durante el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación.
62. Un método para identificar a un sujeto que tiene cáncer, como que es insensible al tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación, que comprende: (a) extraer el ácido nucleico de las células del cáncer; y (b) secuenciar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BRAF; en donde la presencia de nucleótidos que alteran la identidad de un residuo de aminoácidos en uno o más aminoácidos del polipéptido de BRAF codificado, con relación a un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, V483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, identifica al sujeto como que no es sensible al tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generación .
63. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 55-60, caracterizado porque el inhibidor de MEK se selecciona del grupo que consiste de CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, 6-metoxi-7- (3-morfolin-4-il-propoxi) -4- (4-fenoxi-fenilamino) -quinolin-3 -carbonitrilo y 4- [3-cloro-4- (l-metil-lH-imidazol-2-ilsulfanil) -fenilamino] -6-metoxi-7- (3-morfolin-4-il-propoxi) -quinolin-3-carbonitrilo.
64. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 61-62, caracterizado porque el inhibidor de RAF es RAF265 O PLX 4720.
65. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 55-64, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de leucemias, linfornas, mielomas, carcinomas, carcinomas metastásicos, sarcomas, adenomas, cánceres del sistema nervioso y cánceres genitourinarios .
66. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 55-64, caracterizado porque el cáncer es melanoma.
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