JPH0630640B2

JPH0630640B2 - 熱安定性ポリメラーゼｄｎａシーケエンシング反応濃厚物

Info

Publication number: JPH0630640B2
Application number: JP2503703A
Authority: JP
Inventors: リンカーンビザード，ダグラス; ハドマン，マーティン
Original assignee: イーストマンコダックカンパニー
Priority date: 1989-02-06
Filing date: 1990-01-31
Publication date: 1994-04-27
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: JPH03505528A; DE69002826T2; EP0455744B1; WO1990008839A1; EP0455744A1; DE69002826D1

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の分野〕この発明はＤＮＡシーケエンシング、シーケエンシング
用反応濃厚物、シーケエンシング用プライマーおよびそ
の反応濃厚物を含んでなるキットに関する。

〔発明の背景〕

ＤＮＡシーケエンシングのための数種の方法が存在す
る。最も頻繁に用いられるものは、サンガー（Ｓａｎｇ
ｅｒ）らがProc.Natl.Acad.Sci.USA、第74巻、No.12，5
463〜5467ページに報告しているものである。サンガー
の方法は、オリゴヌクレオチド鎖の伸長を触媒するＤＮ
Ａポリメラーゼの能力に対するジデオキシヌクレオチド
三リン酸（ｄｄＮＴＰ、ここでＮはチミン、グアニン、
シトニンまたはアデニン）のようなヌクレオチド類縁体
の阻害活性に基礎を置いている。

例えば、ｄｄＴＴＰおよびｄＴＴＰならびに１種放射性
ヌクレオチドで標識されている他の３種のデオキシリボ
ヌクレオシド三リン酸の存在下で、プライマーおよび鋳
型がＤＮＡポリメラーゼとインキュベーションされる場
合、３′末端のｄｄＴ残基と同じ５′末端をすべてが有
するものが合成されうるフラグメント混合物が得られて
いる。この混合物を変性アクリルアミドゲル電気泳動で
分画する場合、バンドのパターンは新たに合成されたＤ
ＮＡ中にｄＴの分布を示す。他のヌクレオチド用の類縁
ターミネーターを使用し、そしてゲル上で平行してそれ
らの試料を分析すると、得られたバンドのパターンから
配列を確定できる。

一般的に、配列決定すべきＤＮＡ断片がシーケエンシン
グベクター（例えば、Ｍ１３ファージ）のＤＮＡ中の特
定部位に標準的な組換ＤＮＡスプライシング方法によっ
て継ぎ合わされる。得られる組換えファージＤＮＡを用
いて細菌細胞を感染するとウイルス粒子が産生される。
それらの粒子は、単に二本のＤＮＡ鎖のうち１本を含む
にすぎない。

一本鎖のＤＮＡがウイルスから精製される。これらはプ
ライマーと称されるＤＮＡ片と混合される。プライマー
類は、配列決定すべきＤＮＡが挿入された位置に近いＭ
１３ＤＮＡ領域と相補性である。プライマーはＭ１３Ｄ
ＮＡと塩基対を作り、合成用プライマーとして役立つＤ
ＮＡの短い二本鎖領域を作出する。膨大な数の部分的に
二本鎖になったこれらのＤＮＡ分子が、ＤＮＡホリメラ
ーゼおよび放射性ｄＮＴＰと混合される。ＤＮＡポリメ
ラーゼがＭ１３Ｄ鋳型（短い二本鎖領域の３′末端で開
始）から放射性ＤＮＡを合成する。究極的に、この合成
物は配列決定すべきＤＮＡ領域の鋳型として働くＤＮＡ
領域を伴う。

合成は、生化学反応中にｄｄＮＴＰを含めることによっ
て停止できる。ｄｄＮＴＰがｄｄＴＴＰである場合に
は、通常、新たな放射性鎖は、それが加えられた後にＴ
で終止するであろう。

反応混合物に普通のｄＴＴＰが含まれていると、ｄｄＴ
ＴＰが合成を終止する前にある程度のＤＮＡ合成が可能
である。ヌクレオチド配列中には数多くのＴが存在する
ので前記停止は常に同じ場所ではないであろう。従っ
て、反応中の類縁物の量を注意深く調整することによっ
て、プライマーの３′末端で開始し、かつＴが存在する
様々な位置で終止する放射性ＤＮＡ断片のコレクション
を作出することが可能である。この操作は、必要なｄＮ
ＴＰ類全てを含み、そして類縁体ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴ
ＰまたはｄｄＡＴＰを含んでなる３個の別の試験管で繰
り返えされる。こうして、４種に分類できるＤＮＡ断片
のコレクションをもたらす。各試験管内のそれぞれの断
片は、同じ位置で開始し、そして含められる特定のｄｄ
ＮＴＰに応じてＧ，Ａ，ＴまたはＣの各種長さで終止す
る。それらの分子の長さは、ただ１個のヌクレオチドで
相違するＤＮＡ配列を分離できる程厳密な条件下の電気
泳動によって測定される。次に、４種のコレクションが
相互に電気泳動にかけられ、電気泳動後に写真フィルム
が調製された電気泳動ゲルの放射能にさらされる。現像
フィルムの解析によって、写真フィルムからＤＮＡ配列
を直接読み取ることができる。

この方法は、厳密で正確な配列解析を遂行するには慎重
に実施する必要がある多種多様な工程を要することが普
通である。これらの工程のいずれかを除去することは、
この方法の改良になるであろう。例えば、一般的に行わ
れるような方法では、使用時に必要とするすべての化学
成分を個別に混合することが必要である。すなわち、緩
衝剤、酵素、ヌクレオチド類、ヌクレオチド類縁体類お
よびオリゴヌクレオチドプライマーは、同時に、各ヌク
レオチドＧ，Ｔ，ＡおよびＣに対して別々に混合され
る。

〔発明の要約〕

本発明は、以下の試薬類を含んでなるヌクレオチドシー
クエンシング反応濃厚物を提供する：ａ）１００〜５００I.U.／mLを提供するのに十分な熱安
定性ポリメラーゼ；ｂ）ジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノー
ルから選ばれる還元剤０．３〜３０mM；ｃ）約pH７．５を維持するのに十分なリン酸緩衝剤；ｄ）少なくとも４０％のグリセリン；ｅ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ（ここで、「ａＧ」は７
−デアザグアニンを表わす）１５〜１５０μＭ；ｆ）ｄＡＴＰ１５〜１５０μＭ；ｇ）ｄＴＴＰ１５〜１５０μＭ；ｈ）ｄＣＴＰ１０〜１８μＭの；ならびにｉ）（ｉ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰに対するｄｄＧＴ
Ｐの比が約５となるのに十分なｄｄＧＴＰ； (ii)ｄＡＴＰに対するｄｄＡＴＰの比が約３３となるの
に十分なｄｄＡＴＰ； (iii)ｄＴＴＰに対するｄｄＴＴＰの比が約２８となる
のに十分なｄｄＴＴＰ；および (iv)ｄＣＴＰに対するｄｄＣＴＰの比が約２２となるの
に十分なｄｄＣＴＰ、からなる群より選ばれる１種。

この発明の反応濃厚物は、使用時にヌクレオチド鎖のシ
ーケエンシングに必要なすべての成分を混合することが
不要である。この反応濃厚物は、数サイクルの期間を通
して保存できそして再使用できるプレミックスされた包
装の状態ですべての必須成分を含んでなる。この反応濃
厚物の利点の一つは、シーケエンシング反応工程の遂行
に伴う方法の簡略化にある。このような工程は、すべて
の現在のシーケエンシング操作のうちで最も少ない工程
を必要とするにすぎず、かつシーケエンシングによって
望ましい「単一工程（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ）」プロ
トコールに近づくものである。

好ましい態様では、前記に列挙したものに加え次の試薬
類を含んでなる：ａ）ゼラチンおよびウシ血清アルブミンからなる群より
選ばれるタンパク質濃厚物１７５〜７００μｇ／mL；ｂ）少なくとも２５mMのグルタミン酸カリウム；ｃ）非イオン界面活性剤０．１％〜０．３５％（容量／
容量）；ならびにｄ）酢酸マグネシウムまたは塩化マグネシウムのような
マグネシウム塩９〜３５mM。

この態様では、反応濃厚物は、−８０℃〜２０℃のよう
な低温において、ヌクレオチドシーケエンシングに関連
する化学反応におる成分の反応に対する能力に何等悪影
響を及ぼすことなく貯蔵できる。

実際問題として、反応のｄＣＴＰ濃度は、３μＭまで低
減することができ、それでもなお十分な酵素反応動力学
を維持する。そのようなレベルまで低減できるのは４種
のヌクレオチドのうちただ１種である。従って、放射性
標識の合成標準の標的ヌクレオチド用にｄＣＴＰを使用
することが推奨される。このように低濃度の標的ヌクレ
オチドは、特にｄＣＴＰの³⁵Sチオエステルが使用され
る場合には効率よく標識されることが必要である。他の
放射性ヌクレオチド類は、おおむね低い効率で使用する
ことができる。

〔発明の詳細〕

前記反応濃厚物の必須成分は、１００〜５００、好まし
くは２５０I.U.／mLの熱安定性ポリメラーゼ、好ましく
はサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓｓｑｕ
ａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼ（Ｔａｑｐｏｌ）と；ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）と；リン酸緩衝剤と；マグ
ネシウム塩と；グリセリンと；デオキシヌクレオチド三
リン酸ｄＮＴＰであって、Ｎがグアニン（Ｇ）、７−デ
アザグアニン（ｓＧ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）
およびシトシン（Ｃ）であるものと；Ｇ，Ｔ，Ａおよび
Ｃの反応を終止するためのｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴ
Ｐであって、Ｎは前記定義のとおりである）である。

この発明の態様の一つでは、各ｄＮＴＰ、および特定の
ｄｄＮＴＰの濃度とｄＮＴＰに対するｄｄＮＴＰの比率
が相違するだけの４種の同等な反応濃厚物を提供する。
特定のｄｄＮＴＰはいずれが高分子配列中の終止ヌクレ
オチドと認識されるかにより左右される。サンガー法に
従えば、それはＧ，Ａ，ＴまたＣであろう。

前記必須成分に加え、場合によって反応混合物は、ａ）
タンパク質、ｂ）非イオン洗剤およびｃ）グルタミン酸
カリウムを含んでもよい。

この反応濃厚物は、それらにプライマーならびに放射性
標識ｄＮＴＰを含めることでユーザーにとってさらに便
利になるであろう。しかしながら短い半減期の放射性ｄ
ＮＴＰはそれらを含めることの実用性を低下する。

反応濃厚物は、ＤＮＡシーケエンシングに必須の成分を
ほぼすべて含むものから構成できる。このことが、反応
濃厚混合物に配列決定すべきＤＮＡ溶液を単に加え、あ
とは現在実施されているように、高温でその混合物をイ
ンキュベーションし、反応生成物の終止、次いで解析す
るだけですむような選択肢をユーザーに提供する。この
ような方法は数多くの工程を省略するので、現在実施さ
れているどのシーケエンシング方法よりも遥かに自動化
に適する。

熱安定性酵素は、１の塩基に特異的な反応当たり約０．
５I.U.の活性を供給するのに十分の濃度で存在する。I.
U.はこの酵素を用い温度７０℃の広いpH範囲下で３０分
当たり基質ヌクレオチド１０マイクロモルの重合を触媒
するのに必要な量である。

本明細書で使用する「熱安定性酵素」の語は、熱に安定
で耐熱性であり、そしてヌクレオチドの重合を触媒して
未知ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を形
成するものを意味する。一般的に、合成は各プライマー
の３′末端で開始し、鋳型鎖に沿って５′から３′の方
向に進行し、こうして合成がｄｄＮＴＰによって終止す
るまでシーケエンシングベクターの未知ヌクレオチド配
列中へ進行するので各種鎖長のオリゴヌクレオチドが生
成するであろう。しかしながら、前記と同一の操作によ
り５′末端で合成が開始し、前記と別の方向に進行する
熱安定性酵素が存在するかも知れない。

本発明で好ましい熱安定性酵素は、サーマス・アクアテ
ィカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単
離されるＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑｐｏｌ）であ
る。それらの各種菌株がアメリカンタイプカルチャ
ーコレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕ
ｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）より入手可能であり、それらは
ティー・ディー・ブロック(T.D.Brock)のJ.Bact・(196
9)98：289〜297ページおよびティー・オーシマ(T.Oshim
a)のArch.Microbiol.(1978)117：189〜196ページに記載
されている。これらの好ましい株の一つは、ＹＴ−１株
である。

われわれの実験では、Ｔａｑｐｏｌが次のような性状
を示した：１．低温で反応せず、−２０℃で高濃度の塩と適当な反
応緩衝剤条件下で保存でき；２．ヌクレアーゼとホスファターゼにほとんど汚染され
ていないで、そして３．比較的高濃度のグリセリン中で適切な活性を維持す
る。

これらの結果により、本発明の反応濃厚物の調製が可能
になる。

この酵素をコードする遺伝子がサーマス・アクアティカ
スのゲノムＤＮＡからクローニングされているので、組
換えＤＮＡ技術によっても熱安定性酵素を生成できる。
サーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）ポリメラーゼを完
全にコードする配列は、約１８キロベース(kb)のゲノム
ＤＮＡ挿入断片内に含まれるＢｇIII−Ａｓｐ^７１８部
分消化断片約３．５kb上のものとしてバクテリオファー
ジＣＨ３５：Ｔａｑ＃４−２から誘導できる。このバク
テリオファージは、アメリカンタイプカルチャー
コレクション（ＡＴＣＣ）に第40,336号として寄託され
ている。また、この遺伝子はプラスミドｐＦＣ８３（Ａ
ＴＣＣ６７，４２２、１９８７年５月２９日寄託）から
単離されるＢｇIII−ＨｉｎIII制限断片の約７５０塩基
対(bp)をプラスミドｐＦＣ８５（ＡＴＣＣ６７，４２
１、１９８７年５月２９日寄託）から単離される約２．
８kbのＨｉｎIII−Ａｓｐ７１８制限断片と連結するこ
とによって構築できる。ｐＦＣ８３制限断片はＴａｑポ
リメラーゼ遺伝子のアミノ末端を含んでなり、一方、ｐ
ＦＣ８５に由来する制限断片は、カルボキシル末端を含
んでなる。従って、適当な調節配列を担持する対応する
消化ベクター中に前記２種の断片を連結すると全鎖長Ｔ
ａｑポリメラーゼの翻訳がなされる。

これらのパラメーターは実験的に決定される。１の塩基
特異的反応当たり０．５I.U.未満では、ヌクレオチド鎖
の不自然な末端がもたらされる。１の塩基特異的反応当
たり２I.U.を超える必要はない。

前記タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）また
はゼラチンであることができる。Ｔａｑｐｏｌ酵素活
性はタンパク質環境下で改善される。また、このタンパ
ク質は、反応濃厚物の半減期を延長もする。また、タン
パク質の存在は、Ｔａｑｐｏｌが触媒する重合反応の
際に重合されたヌクレオチド配列への不自然な含有物を
避けられるものと思われる。反応濃厚物中のタンパク質
量は、１７５〜７００μｇ／mL、好ましくは３５０μｇ
／mLが望まれる。１７５μｇ／mLを下廻わる濃度は不安
定さをもたらす。７００μｇ／mLを上廻わる濃度は不要
である。

還元剤は必須である。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が
好ましい。それがＴａｑｐｏｌのスルフヒドリル基を
還元状態に維持する。この還元状態はＴａｑｐｏｌ活
性にとって必要である。他の還元剤としてはβ−メルカ
プトエタノールが挙げられる。ＤＴＴの０．３〜１０mM
量、好ましくは３．５mMが有用である。この範囲外の濃
度は重合反速度に悪影響を及ぼす。この範囲を上廻わる
濃度は不要である。

Ｔａｑｐｏｌの商品は、通常、保存の目的で少量（約
０．１mM）のＥＤＴＡを含む。しかしながら、ＥＤＴＡ
は金属捕捉剤であり、かつＴａｑｐｏｌの活性に必須
であるマグネシウムイオン活動度に影響を及ぼす可能性
があるので、ＥＤＴＡmMを超えると反応に有害であろ
う。

前記反応濃厚物は、塩化マグネシウムや酢酸マグネシウ
ム（±５０％）のような１７．５mMまでのマグネシウム
塩を含むことが好ましい。酢酸マグネシウムが好まし
い。最終反応混合物中にそれが約５mMの濃度で存在する
ことが必要である。５mMの酢酸マグネシウムが±５０％
の範囲内にある量が有効であろう。これらの範囲を上廻
わるか下廻わると酵素活性に悪影響を及ぼすであろう。

グルタミン酸カリウム（Ｋグルタメート）もまた、Ｔａ
ｑｐｏｌ酵素活性を高める。反応濃厚物を長期にわた
り保存する上で必要である。長期間保存では、２５mMの
最低量のグルタミン酸カリウムが必要である。より高濃
度は、この発明によって提供されるシーケエンシング方
法で実施される電気泳動分析に対して有害な影響を及ぼ
す受け入れることができない塩濃度につながる。

リン酸水素カリウムおよびリン酸二水素カリウム（Ｋ_２
ＨＰＯ_４およびＫＨ_２ＰＯ_４）は、約pH７．５を達成す
るのに十分量で存在せしめる。リン酸緩衝剤は熱安定性
の緩衝剤である。温度−２０°〜７５℃の範囲にわたっ
て実質的に同一のpHを維持することができる。Ｔａｑ
ｐｏｌ活性が保存から使用まで一定であるためには、保
存ならびに使用に際して一定pHを維持する必要がある。

グリセリンは凍結防止剤である、使用に向けて解凍と将
来の使用に向けての保存の予期されるサイクルに反応濃
厚物がかけられるのでいずれかの酵素の反復凍結を避け
て酵素活性を保持しなければならない。われわれは、保
存温度−７０℃〜−２０℃で反復凍結を避けるには反応
濃厚物に少なくとも４０％のグリセリンを添加する必要
を認めた。８０％以上のグリセリンがＴａｑｐｏｌ活
性に悪影響を与えることなく使用できる。

反応濃厚物は、０．１〜０．４％の非イオン性洗剤を含
むことができる。具体的なものとしては、エトキシル化
脂肪アルコールエーテルおよびラウリルエーテル、エト
キシル化アルキルフェノール、オクチルフェノキシポリ
エトキシエタノール化合物、修飾オキシエチレン化およ
び／またはオキシプロピレン化直鎖アルコール、ポリエ
チレングリコールモノオレエート化合物、ポリソルベー
ト（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）化合物およびフェノール
系脂肪アルコールエーテルが挙げられる。より具体的に
は、トリトン(TRITON)X-100、ツイーン(Tween)20(ICI A
merican Inc.,Wilmington,DE、製）であって、ポリオキ
シエチレン化（２０）ソルビタンモノラウレート、なら
びにイコノール(Iconol、商標）NP-40(BASF Wyandotte
Corp,Parsippany,NJ、製）であって、エトキシル化アル
キルフェノール（ノニル）が好ましい。

４種の各ｄＮＴＰも、各濃厚物の必須成分である。４種
の各濃厚物は、各反応濃厚物包装中に設計された終止反
応に応じてｄｄＮＴＰ類の１種および１種だけを含めね
ばならない。

一態様では、本発明の材料は各種の態様のキットとして
末端ユーザーに提供できる。ユーザーの便宜を図るこの
発明の精神と矛盾しないためには、希釈工程を伴うこと
なく直接キットの成分が使用できるキットを提供するこ
とが望ましい。従って、最も簡便なキットは、多くの生
化学実験室の慣行に従うことをユーザーに許容し、そし
て直接使用に向けた反応濃厚物が約２μＬとなるように
設計される。

態様の一つでは、キットが標識されていてもよい１）プ
ライマーおよび２）個別の反応濃厚物Ｇ，Ａ，Ｔおよび
Ｃの化学品を別々に分離して包装されたものとして含む
ことができる。

任意のユーザーに便利な包装は、シーケエンシングベク
ターまたは対照ＤＮＡおよび放射性標識ｄＮＴＰを含め
ることができる。対照は、ユーザーがキットの操作性を
確認できるようなＤＮＡ配列である。

シーケエンシングベクターは、配列を決定すべきヌクレ
オチド鎖を含んでなる。最も広汎に使用されるシーケエ
ンシングベクターは、バクテリオファージＭ１３に由来
する。このベクターは、それらの複数クローニング領域
で通常相違するだけのフォーマットとして広範に市販さ
れている。広汎に使用されるこのベクターの変形として
は、Ｍ１３ｍｐ１８およびｍｐ１９が挙げられる。他の
市販のシーケエンシングベクター鋳型としては、ｐＵ
Ｇ，ｐＩＢＩおよびブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ）などが挙げられる。後述するプライマーを使用
する場合には、１ａｃＺヌクレオチド配列を担持するい
ずれかのシーケエンシングベクターが使用できる。

また、ユーザーは用意されているプライマーを選んでも
その用意されているベクターを使用しなくてもよい。ユ
ーザーはまた、放射性標識または蛍光標識を有するプラ
イマーの個々の標識を選んでもよい。この条件下では、
放射性標識のさらなる使用は不要である。プライマー濃
度とバインディング能が実質的に変性していないかぎ
り、この発明の反応濃厚物は有用であろう。

市販の放射性ヌクレオチド類は、水中約３〜１０μＭの
濃度範囲で販売されている。ユーザーが可変できるもの
ではその量が本組成物のユーザーによって変更できる部
分の一定量を４種の反応濃厚物の各々に加えてさらに希
釈される場合には、前記の一定量（約１μＬ）が加えら
れる。すなわち、ユーザーが可変できるものでは１μＬ
の放射活性物質がユーザーのＤＮＡや対照ＤＮＡと共混
合され、水とプライマー５μＬで合計２０〜２３μＬに
調製され、次いで５μＬ当たり最終的に２．５μCiとな
るように４分割され、これらの反応濃厚物を加えて各７
μＬの最終反応混合物を与える。

４種の反応物のそれぞれに必要な放射性ヌクレオチドの
量は、好ましい放射性同位体を用いて２４時以内に配列
分析を終了するものに基づく。好ましい放射性同位体
は、α−標識³⁵S ｄＣＴＰであるが、他の例えば³²Pも
使用できる。従って、好ましい範囲は、キット中α−標
識³⁵S ｄＣＴＰの１〜２μＬであろう。これは、³⁵S
ｄＣＴＰ１mM当たり４００〜６００Ciの比活性において
約１０μCi／μＬを提供する。

ユーザーが放射性ｄＮＴＰを用意できるし、またそれを
反応濃厚物に含めることもできる。ユーザーがシーケエ
ンシングベクターも放射性ｄＮＴＰも用意するときは、
これがユーザーが可変できるものを構成する。

ユーザーが可変できるもの一変種は次のように調製され
る。これらの可変できるものはユーザーにより用意され
る。場合によってそれらをキットの一部として供給して
もよい。

ユーザーが可変できる濃厚物最終
反応混合物の濃度配列決定をすべきＤＮＡ０．４ピコモルに対する１μｇのＭ１３ｍｐ１８またはユーザーが選ぶシーケエンシングベクター………０．１pmole／７μＬ１μＬのα−標識ｄＣＴＰ………２．５μCi／７μＬ（最終容量が１８μＬを超えないように水を加える）このプライマー濃厚物の包装は、５μＬ中適当な濃度の
オリゴヌクレオチドを含んでなる。

Ｔｏｑｐｏｌシーケエンシングに必須なものは、適当
なプライマーエクステンションである。高温合成は、後
述する１７塩基のオリゴマーである「汎用性プライマー
Ａ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒＡ）」の使用に
有効でない。より長いオリゴマーを用いると、高温で鋳
型ＤＮＡのプライミングが「自然（ｓｐｏｎｔａｎｅｏ
ｕｓ）」に起こるので、このような適切なプライマーの
使用が他のＤＮＡシーケエンシング方法にとって必須の
プライミング反応の必要性を不要にする。語「自然に」
とは、ユーザーが介在することなくプライミング反応が
起こることを意味する。

この発明のキットでは、一般に使用される汎用性プライ
マーのＭ１３ｍｐ１８領域を含むが、さらにより安定な
Ｇおよび残基の利点を有するように周囲の配列に追加の
塩基も含む。このオリゴマーは１ａｃＺを基本とするす
べてのベクター（Ｍ１３，ＰＵＣ，ｐＩＢＩおよびＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔなど）と適合性である。このオリゴマ
ー配列は次のとおりである。

５′CCCAGTCCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTG３′下線部分
が伝統的に使用されてきた汎用性プライマーＡ領域であ
る。３３メル（ｍｅｒ）より短いプライマーが使用され
る場合には、自然にプライミングをするためには過剰モ
ル量が必要である。このような過剰量は、不明瞭なシー
ケエンシングの結果につながる非特異的なプライミング
をもたらすであろう。

より長いプライマーも使用できる。しかしながら、それ
らはシーケエンシング結果に厳密には疑いが生じる。Ｇ
の豊富な配列を含むものを誘導する５′方向への伸長は
核酸構造によって生じる不明瞭な電気泳動の移動度をも
たらす。３′方向への伸長はＭ１３ベクターのクローニ
ング部位を妨害する。標的ＤＮＡに対し３モル過剰の前
記プライマーは、まったく自然なプライミングを与え
る。１０モルを超える過剰量は、非特異的なプライミン
グと解釈されるシーケエンシングゲル上にバックグラウ
ンドを生じる。７μＬ反応液当たり特に０．３モルにプ
ライマーの総量を限定すると、プライムされる可能性の
ある標的ＤＮＡ分子の総数を限定する。こうして、ユー
ザーは、ヌクレオチドの蓄積を枯渇させることなくＤＮ
Ａの過剰量を使用できる〔１エクステンション当たり２
００個の平均の塩基におけるプライマー０．３ピコモル
以下では、７μＬの反応液が３μＭのｄＣＴＰ（２１ピ
コモルまで消費可能な量）を含むにもかかわらず、平均
的な未知のＤＮＡ配列のために消費されるｄＣＴＰが１
５ピコモルである〕。

好ましいプライマー濃厚物は次のものを含む。

最終反応混合物中の濃度１mMのトリス／ＨＣｌ（pH８）０．１８mM ０．１mMのＥＤＴＡ０．０１８mM ０．２４μＭのＡ−３３プライマー０．３pmole／７
μＬ合計容量５μＬ第三の個別にラベルされる一群の包装は反応濃厚物であ
る。反応濃厚物は、４種の別々にラベルが貼された包
装、すなわち、濃厚物Ｇ、濃厚物Ａ、濃厚物Ｔおよび濃
厚物Ｃとしてキットて提供してもよい。反応濃厚物のそ
れぞれは、ｄＮＴＰ類とｄｄＮＴＰ類の濃度がそれぞれ
相違することを除き同じ濃度の化学品を含むであろう。
ｄＮＴＰに対するｄｄＮＴＰの比率は、放射性標識ｄＮ
ＴＰの均衡のとれたレーン分布を達成するように各濃度
を実験的に調整されている。均衡のとれたレーン分布は
オリゴヌクレオチド断片の分布を示す写真の均一な外観
をもたらす。これが写真フィルムから配列を読み取る上
で厳密さと正確さをもたらす。

非常に有用な反応濃厚物を下記に示す。

最終反応混合物の濃度 0.25μ／μＬのTaq pol ………０．５μ／７μＬ３５０μｇ／mlのBSA ………１００μｇ／mL ３．５mMのDTT ………１mM 17.5mMの酢酸マグネシウム ………５mM 25mMのＫグルタメート ………7.1mM 13.1mMのK₂HPO₄ ………3.75mM 4.4mM のＫＨ_２ＰＯ_４ ………1.25mM 0.35％のトリトンＸ−１００………０．１％４０％のグリセリン ………１１．４％ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ濃度は下記表Iから選ばれる。

ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの最終反応濃度は、上記キットの
各種化学成分の濃度に基づき表IIIに示す。

キットの別の態様では、反応濃厚物Ｇ，Ａ，ＴおよびＣ
がプライマーおよび／または放射性標識ｄＮＴＰも含む
ことができる。

キットのもう一つの態様では、単一の反応濃厚物が、ｄ
ＮＴＰ類および／または選択されたｄｄＮＴＰ以外のす
べての化学品を含んでよい。ｄＮＴＰ類とｄｄＮＴＰ類
は、表Iに従って個別に包装することができる。これら
の個別に包装されたｄＮＴＰ混合物の各々は、適当なと
き、使用時に反応濃厚物へ加えられるであろう。

反応濃厚物の製造に際し、酵素を最後に加える必要があ
ること以外、添加の順序はそれ程重要でない。一般的な
添加順序は、塩類と緩衝剤、ヌクレオチド類、他の試薬
類、グリセリン、次いで酵素であって、それぞれの添加
の際には十分に混合し、氷温で行われる。

記載様式のいずれかで前記キットを使用する場合、一般
的に、シーケエンシング方法は次の工程を含んでなる：ａ）シーケエンシングベクターの既知ヌクレオチド鎖の
３′末端に隣接して未知ヌクレオチド配列を含んでなる
シーケエンシングベクターを提供する工程；ｂ）そのベクターをプライマーおよび放射性標識ｄＮＴ
Ｐと混合する工程であって、このプライマーが未知ＤＮ
Ａ配列に隣接している既知ベクターＤＮＡ配列の一部と
相補的であるヌクレオチド配列を有するものである工
程；ｃ）混合物ｂ）をＧ，Ａ，ＴおよびＣとラベルを貼した
４種の容器に４つとも等量で分割する工程；ｄ）i)ｄｄＧＴＰを含んでなる本発明に従う反応濃厚物
をＧと選定した容器に添加し、 ii)ｄｄＡＴＰを含んでなる本発明に従う反応濃厚物を
Ａと選定した容器に添加し、 iii)ｄｄＴＴＰを含んでなる本発明に従う反応濃厚物を
Ｔと選定した容器に添加し、そして iv)ｄｄＣＴＰを含んでなる本発明に従う反応濃厚物を
Ｃと選定した容器に添加すること、によって反応濃厚物
を提供する工程；ｅ）４種の容器Ｇ，Ａ，ＴおよびＣを１０〜３０分間７
０〜７４℃でインキュベーションする工程；ｆ）４種のチューブのそれぞれに反応停止混合物３〜５
μＬを添加することによって反応を終止する工程；ｇ）ｅ）で形成されたオリゴヌクレオチドを鎖長に応じ
て電気泳動分離する工程；ならびにｈ）放射性ｄＮＴＰによって生じる放射線に感光性の写
真フィルムを電気泳動分離物で露光して未知ヌクレオチ
ド鎖のヌクレオチド配列を確定する工程。

典型的な反応では、ユーザーは品質的に単一鎖ＤＮＡ調
製物、典型的には濃度＞１００μｇ／mLでＭ１３ｍｐ１
８ＤＮＡ１μｇ（０．４ピコモル）を供給する。ユーザ
ーはこのＤＮＡ、プライマー／緩衝剤５μＬ、水および
放射性ヌクレオチド（通常、１μCiのP³²または１０μC
iの³⁵S、＞６００Ci／mMでα−標識されたｄＣＴＰ）を
併わせて総容量２１μＬにする。このＤＮＡ混合物を、
必須のＧ−特異的反応、Ａ−特異的反応、Ｔ−特異的反
応およびＣ−特異的反応用として選定した４種のチュー
ブ（好ましくは０．５mLの遠心管）に等量（５μ）分割
する。これらのチューブを７０〜７４℃に置く。次に、
特定の反応濃厚物を選定したチューズ中で混合する。こ
れらのチューブの蓋をして、３０分間７０〜７４℃でイ
ンキュベーションを続けた。

反応は、反応停止混合物３μＬの添加で終止できる。反
応停止混合物は周知である。ヨーロッパ特許出願公開第
258017号明細書は、マグネシウムイオンをキレートする
ためのＥＤＴＡ、フェノール、ＳＤＳまたはＣＨＣｌ_３
を含むような混合物を記載する。有用な混合物は、ホル
ムアミド溶媒中、０．０２ＭのＥＤＴＡ；０．０７Ｍのトリス（ＥＤＴＡを中和するためのも
の）；０．０５（重量／容量）％のブロフェノールブルー；な
らびに０．０２（重量／容量）％のキシレンシアノールが存在
するものである。

後者の２成分は、電気泳動の進行を視覚的に評価するた
めのアニオン性発色団である。

残基をシーケエンシングするためにＴａｑｐｏｌを使
用する主な利点は、その高温（鋳型鎖による構造的な妨
害を極小化する）での合成能にあるが、この発明で認め
られる相当な利点は超らせんシーケエンシングを初めと
する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対するそれの適合性
にある。

二本鎖または超らせん化のシーケエンシングの原理は、
一本鎖状態まで不可逆的に変性されている超らせんの区
分に左右されるので、シーケエンシング反応に必須なプ
ライムされた合成に従う。

不可逆的に変性された超らせんの有意な区分は、超らせ
んＤＮＡのアルカリ変性および酸中和によって得られ
る。普通の二本鎖ＤＮＡは同様に処理されるが、得られ
るものは一本鎖ＤＮＡのより高い区分にある。超らせん
と二本鎖ＤＮＡのアルカリ変性とそれに続く酸中和は、
この工程では比較的少量で正確な量を必要としないので
高い蓄積された塩濃度とあまり限定されていないpHをも
たらすであろう。一般的には、処理ＤＮＡを再精製して
塩を除去しそしてpHを調節することが必要である。なぜ
かなら他のすべての現在するシーケエンシングプロトコ
ールは高塩濃度に耐性がなくそして／またはこの方法に
利用されそしてこれらの酵素の活性に必要な緩衝剤系を
だめにする可能性があるからである。

リン酸緩衝剤は、通常使用されるすべての緩衝剤のうち
最も高い熱安定性を有する。リン酸緩衝剤は、pHが−８
０℃程の低温で長期間保存に適するように制御され、そ
して８０℃程の高温で反応を制御しなければならないの
でこの反応濃厚物に選ばれた。逆に、トリス緩衝剤は数
ある緩衝剤の中で最も低い熱安定性を有し、そのpK値を
０℃から７０℃までで２単位以上も低下させる。こうし
てこの発明の方法では超らせん化シーケエンシング反応
が変性ＤＮＡを再生する必要はなく実施できる。

このことは次の工程によって達成される：ａ）１ａｃＺヌクレオチド配列を有する二本鎖シーケエ
ンシングベクターであって、その中に未知ヌクレオチド
配列を有するｄｓＤＮＡがそのベクター中の既知ヌクレ
オチド鎖の３′末端に隣接して挿入されているベクター
を提供する工程；ｂ）前記ベクターをアルカリ性溶液で変性してｓｓＤＮ
Ａを形成する工程；ｃ）変性されたＤＮＡを含有する溶液を中和する工程；
ならびにｄ）上記のヌクレオチドシーケエンシング方法の工程
ｂ）からｈ）までを実施する工程。

上記シーケエンシング方法の典型例では、数μＬ容量の
超らせんＤＮＡ（稀釈緩衝液中、例えば１mMのトリス、
０．１mMのＥＤＴＡ、pH８）を２分間３７℃で０．１Ｍ
のＫＯＨ１μＬを用いて変性する。一般的に、それ以上
苛酷な処理は不要である。氷上、プライマーと放射性ｄ
ＮＴＰを添加し、次いで変性したＤＮＡを０．２Ｍのト
リス塩酸１μＬの添加により中和する。次に、水を加え
て容量２１〜２３μＬを得る。最終的塩濃度とpHは、一
般的に正確でない。しかしながら、この発明の方法はさ
らなる調節を行うことなく使用できる。理論上、得られ
た塩系は、３０〜５０mMのトリス緩衝液（pH７〜９）か
らなる。酵素反応に向けてこの溶液を７０℃まで加熱す
ると、反応濃厚物により提供されるリン酸緩衝剤が全体
的な混合物の最終pHを安定化するのでトリス緩衝剤の影
響をなくする。正常な一本鎖は乱れることなくシーケエ
ンシングが起こり、そして超らせんでは不可逆的に変性
された超らせん区分と同程度の予期された低い効率でシ
ーケエンシングが起こる。こうして、超らせんのシーケ
エンシングは一本鎖のシーケエンシングと実質的に同一
の方法によって、変性された超らせんＤＮＡの再精製を
伴うことなく行われる。

この発明は、その好ましい態様を具体的に引用しながら
詳述してきたが、その変更および改良も本発明の精神お
よびその範囲内で有効であることが理解されるであろ
う。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）１００〜５００I.U.／mLを提供するの
に十分な熱安定性ポリメラーゼ；ｂ）ジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノー
ルから選ばれる０．３〜３０mMの還元剤；ｃ）保存中および使用中の両方で約pH７．５を維持する
のに十分なリン酸緩衝剤；ｄ）少なくとも４０％のグリセリン；ｅ）１５〜７０μＭのｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ；ｆ）１５〜１５０μＭのｄＡＴＰ；ｇ）１５〜１５０μＭのｄＴＴＰ；ｈ）１０〜１８μＭのｄＣＴＰ；ならびにｉ）（ｉ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰに対するｄｄＧＴ
Ｐの比率を約５にするのに十分なｄｄＧＴＰ； (ii)ｄＡＴＰに対するｄｄＡＴＰの比率を約３３にする
のに十分なｄｄＡＴＰ； (iii)ｄＴＴＰに対するｄｄＴＴＰの比率を約２８にす
るのに十分量のｄｄＴＴＰ、および (iv)ｄＣＴＰに対するｄｄＣＴＰの比率を約２２にする
のに十分量のｄｄＣＴＰ、からなる群より選ばれる１種、を含んでなるヌクレオチドシーケエンシング反応濃厚
物。
【請求項２】前記熱安定性ポリメラーゼがサーマス・ア
クアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）
ポリメラーゼである請求の範囲第１項の濃厚物。
【請求項３】ａ）ゼラチンおよびウシ血清アルブミンか
らなる群より選ばれるタンパク質濃厚物１７５〜７００
μｇ／mL；ｂ）グルタミン酸カリウム少なくとも２５mM；ならびにｃ）マグネシウム塩９〜３５mM、をさらに含んでなる請求の範囲第２項記載の反応濃厚
物。
【請求項４】ａ）非イオン界面活性剤０．１〜０．４％
量；ｂ）α−標識された放射性ｄＮＴＰ０．１〜１０μCi／
μＬ；ｃ）マグネシウム塩９〜３５mM、ならびにｄ）ヌクレオチド配列５′CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTG３′ を有するオリゴヌクレオチドプライマー０．１〜１．０
μＭ、もさらに含んでなる請求の範囲第２項の反応濃厚
物。
【請求項５】ａ）サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼ約０．２５
I.U.／μＬ；ｂ）ウシ血清アルブミン約３５０マイクロｇ／mL；ｃ）ジチオスレイトール約３．５mM；ｄ）酢酸マグネシウム約１７．５mM；ｅ）グルタミン酸カリウム約２５mM；ｆ）Ｋ_２ＨＰＯ_４約１３．１mM；ｇ）ＫＨ_２ＰＯ_４約４．４mM；ｈ）トリトンＸ１００界面活性剤約０．３５％；ｉ）４０％のグリセリン、ならびにＡ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ約２２．７μＭ；ｄＡＴＰ１０５μＭ；ｄＴＴＰ５２．５μＭ；ｄＣＴＰ１０．５μＭ；およびｄｄＧＴＰ１１３．７μＭ；Ｂ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ約７０μＭ；ｄＡＴＰ１７．５μＭ；ｄＴＴＰ５２．５μＭ；ｄＣＴＰ１０．５μＭ；およびｄｄＡＴＰ５７７μＭ；Ｃ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ約７０μＭ；ｄＡＴＰ１０５μＭ；ｄＴＴＰ１７．５μＭ；ｄＣＴＰ１０．５μＭ；およびｄｄＴＴＰ４９０μＭ；Ｄ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ約７００μＭ；ｄＡＴＰ１０５μＭ；ｄＴＴＰ５２．５μＭ；ｄＣＴＰ１０．５μＭ；およびｄｄＣＴＰ２３１μＭ、からなる群より選ばれる１の混合物、を含んでなるヌクレオチドシーケエンシング反応濃厚
物。
【請求項６】配列５′CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTG３′ を有するオリゴヌクレオチドプライマー０．１５μＭも
さらに含んでなる請求の範囲第５項の反応濃厚物。
【請求項７】反応濃厚物２μＬ当たりα−標識化放射性
ｄＣＴＰ１〜１０μCiをさらに含んでなる請求の範囲第
６項の反応濃厚物。
【請求項８】放射性標識ヌクレオチドが元素³²Ｐまたは
³²Ｓで標識されたものである請求の範囲第７項の反応濃
厚物。
【請求項９】ａ）ベクター中の既知ヌクレオチド鎖の
３′末端に隣接する未知ヌクレオチド配列を含んでなる
シーケエンシングベクターを提供する工程；ｂ）前記ベクターを放射性標識ｄＮＴＰと混合する工程
であって、前記プライマーが前記未知ＤＮＡ配列と隣接
する前記既知ベクターＤＮＡ配列の一部に対して相補的
であるヌクレオチド配列を有するものである前記工程；ｃ）混合物ｂ）を、Ｇ，Ａ，ＴおよびＣのラベルが貼さ
れた４種の容器に分割する工程；ｄ）（ｉ）Ｇと選定された容器にｄｄＧＴＰを含んでな
る請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加
し、 (ii)Ａと選定された容器にｄｄＡＴＰを含んでなる請求
の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、 (iii)Ｔと選定された容器にｄｄＴＴＰを含んでなる請
求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、そ
して (iv)Ｃと選定された容器にｄｄＣＴＰを含んでなる請求
の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加する、こ
とにより一連の反応混合物を提供する工程；ｅ）１５〜３０分７０〜７４℃の温度で前記４種の容器
Ｇ，Ａ，ＴおよびＣをインキュベーションする工程；ｆ）前記各４種のチューブに反応停止混合物３〜５μＬ
を添加することによって反応を終止する工程；ｇ）鎖長に応じてｅ）で形成されたオリゴヌクレオチド
を電気泳動分離する工程；ならびにｈ）放射性ｄＮＴＰによって生じる放射線に感光性の写
真フィルムを各ゲルで露光して、前記未知ヌクレオチド
鎖のヌクレオチド配列を確定する工程、を含んでなるオリゴヌクレオチドのシーケエンシング方
法。
【請求項１０】各反応濃厚物Ｇ，Ｔ，ＡおよびＣが、既
に放射性ｄＮＴＰを含んでいるために、請求の範囲第９
項の工程ｂ）で前記放射性ｄＮＴＰを含める必要性が除
去されている請求の範囲第９項の方法。
【請求項１１】各反応濃厚物Ｇ，Ｔ，ＡおよびＣが、さ
らにプライマーを含んでいるために、請求の範囲第９項
の工程ｂ）で前記プライマーを含める必要性が除去され
ている請求の範囲第９項の方法。
【請求項１２】シーケエンシングベクターが１ａｃＺヌ
クレオチド配列を担持する請求の範囲第９項の方法。
【請求項１３】シーケエンシングベクターがＭ１３ｍｐ
１８ＤＮＡ，ｐＵＣ，ｐＩＢＩおよびブルースクリプト
(Bluescript)からなる群より選ばれるものである請求の
範囲第９項の方法。
【請求項１４】プライマーがヌクレオチド配列５′CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTG３′を有する
請求の範囲第９項の方法。
【請求項１５】シーケエンシングベクターがＭ１３ｍｐ
１８であり、反応濃厚物が請求の範囲第２，３，４また
は５項に従う組成を有する請求の範囲第９または１１項
の方法。
【請求項１６】ａ）第一容器中に１ａｃＺヌクレオチド
配列とα−標識化放射性ｄＣＴＰ１μＬを有する対照シ
ーケエンシングベクター；ｂ）第二容器中に配列５′CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTG３′ を有するオリゴヌクレオチドプライマー；ならびにｃ）第三容器中に請求の範囲第２，３または５項に従う
反応濃厚物、を含んでなるヌクレオチドシーケエンシングキット。
【請求項１７】第一容器に配列５′CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTG３′ を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、
そして第三容器中に請求の範囲第２，３または５項に従
う反応濃厚物を含んでなるヌクレオチドシーケエンシン
グキット。
【請求項１８】請求の範囲第６，７または８項に従う反
応濃厚物を含んでなるヌクレオチドシーケエンシングキ
ット。
【請求項１９】ヌクレオチド配列５′CCCAGTCCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTG３′ を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】ａ）未知ヌクレオチド配列を有するｄｓ
ＤＮＡがシーケエンシングベクター中の既知ヌクレオチ
ド鎖の３′末端に隣接して挿入されている１ａｃＺヌク
レオチド配列を有する二本鎖シーケエンシングベクター
を提供する工程；ｂ）アルカリ性溶液で前記ベクターを変性してｓｓＤＮ
Ａを形成する工程；ｃ）変性されたＤＮＡ含有溶液を中和する工程；ｄ）前記ベクターを、プライマーと、マグネシウム塩と
放射性標識ｄＮＴと混合する工程であって、プライマー
が未知ＤＮＡ配列に隣接する既知ＤＮＡ配列の少なくと
も１部に相補的であるヌクレオチド配列を有するもので
ある前記工程；ｅ）混合物ｄ）をＧ，Ａ，ＴおよびＣとラベル貼された
４種の容器中に分割する工程；ならびにｆ）（ｉ）Ｇと選定された容器にｄｄＧＴＰを含んでな
る請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加
し、 (ii)Ａと選定された容器にｄｄＡＴＰを含んでなる請求
の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、 (iii)Ｔと選定された容器にｄｄＴＴＰを含んでなる請
求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、 (iv)Ｃと選定された容器にｄｄＣＴＰを含んでなる請求
の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加する、ことによって一連の反応混合物を提供する工程；ｇ）４種の容器Ｇ，Ａ，ＴおよびＣを１５〜３０分７０
〜７４℃の温度でインキュベーションする工程；ｈ）４種のチューブそれぞれに反応停止混合物３〜５μ
Ｌを添加することによって反応を終止する工程；ｉ）鎖長に応じて形成されたオリゴヌクレオチドを電気
泳動分離する工程；ならびにｊ）放射性ｄＮＴＰによって生じた放射線に感光性の写
真フィルムをゲルで露光して、超らせんＤＮＡの配列を
確定する工程、を含んでなる二本鎖（ｄｓＤＮＡ）のシーケエンシング
方法。