JPH03505528A

JPH03505528A - 熱安定性ポリメラーゼｄｎａシーケエンシング反応濃厚物

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Publication number: JPH03505528A
Application number: JP2503703A
Authority: JP
Inventors: ビザード，ダグラス　リンカーン; ハドマン，マーティン
Original assignee: イーストマンコダックカンパニー
Priority date: 1989-02-06
Filing date: 1990-01-31
Publication date: 1991-12-05
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: DE69002826T2; EP0455744A1; WO1990008839A1; DE69002826D1; EP0455744B1; JPH0630640B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】熱安定性ポリメラーゼＤＮＡシーケエンシング反応濃厚物〔発明の分野〕この発明はＤＮＡシーケエンシング、シーケエンシング用反応濃厚物、シーケエンシング用プライマーおよびその反応濃厚物を含んでなるキットに関する。

〔発明の背景〕

ＤＮＡシーケエンシングのための数種の方法が存在する。

最も頻繁に用いられるものは、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らがＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、第７４巻、Ｎ（１１２，５４６３〜５４６７ページに報告しているものである。サンガーの方法は、オリゴヌクレオチド鎖の伸長を触媒するＤＮＡポリメラーゼの能力に対するジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ、ここでＮはチミン、グアニン、シトシンまたはアデニン）のようなヌクレオチド類縁体の阻害活性に基礎を置いている。

例えば、ｄｄＴＴＰおよびｄＴＴＰならびに１種は放射性ヌクレオチドで標識されている他の３種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、ブライマーおよび鋳型がＤＮＡポリメラーゼとインキュベーションされる場合、３′末端のｄｄＴ残基と同じ５′末端をすべてが有するものが合成されうるフラグメント混合物が得られている。この混合物を変性アクリルアミドゲル電気泳動で分画する場合、バンドのパターンは新たに合成されたＤＮＡ中にｄＴの分布を示す。他のヌクレオチド用の類縁ターミネータ−を使用し、そしてゲル上で平行してそれらの試料を分析すると、得られたバンドのパターンから配列を推定できる。

一般的に、配列決定すべきＤＮＡ断片がシーケエンシングベクター（例えば、Ｍ１３ファージ）のＤＮＡ中の特定部位に標準的な組換ＤＮＡスプライシング方法によって継ぎ合わされる。得られる組換えファージＤＮＡを用いて細菌細胞を感染するとウィルス粒子が産生される。これらの粒子は、単に二本のＤＮＡ鎖のうち１本を含むにすぎない。

−木調のＤＮＡがウィルスから精製される。これらはブライマーと称されるＤＮＡ片と混合される。ブライマー類は、配列決定すべきＤＮＡが挿入された位置に近いＭ１３ＤＮＡ領域と相補性である。ブライマーはＭ１３ＤＮＡと塩基対を作り、合成用ブライマーとして役立つＤＮＡの短い二本鎖領域を作出する。膨大な数の部分的に二本鎖になったこれらのＤＮＡ分子が、ＤＮＡポリメラーゼおよび放射性ｄＮＴＰと混合される。ＤＮＡポリメラーゼがＭ１３鋳型（短い二本鎖領域の３′末端で開始）から放射性ＤＮＡを合成する。究極的に、この合成物は配列決定すべきＤＮＡ領域の鋳型として働＜ＤＮＡ領域を伴う。

合成は、生化学反応中にｄｄＮＴＰを含めることによって停止できる。ｄｄＮＴＰがｄｄＴＴＰである場合には、通常、新たな放射性鎮は、それが加えられた後にＴで終止するであろう。反応混合物に普通のｄＴＴＰが含まれていると、ｄｄＴＴＰが合成を終止する前にある程度のＤＮＡ合成が可能である。ヌクレオチド配列中には数多くのＴが存在するので前記停止は常に同じ場所ではないであろう。従って、反応中の類縁物の量を注意深く調整することによって、ブライマーの３′末端で開始し、かつＴが存在する様々な位置で終止する放射性ＤＮＡ断片のコレクションを作出することが可能である。この操作は、必要なｄＮＴＰ類全てを含み、そして類縁体ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰまたはｄｄＡＴＰを含んでなる３個の別の試験管で繰り返えされる。こうして、４種に分類できるＤＮＡ断片のコレクションをもたらす。各試験管内のそれぞれの断片は、同じ位置で開始し、そして含められる特定のｄｄＮＴＰに応じてＧ、　Ａ、　ＴまたはＣの各程良さで終止する。それらの分子の長さは、ただ１個のヌクレオチドで相違するＤＮＡ配列を分離できる程厳密な条件下の電気泳動によって測定される。次に、４種のコレクションが相互に電気泳動にかけられ、電気泳動後に写真フィルムが調製された電気泳動ゲルの放射能にさらされる。現像フィルムの解析によって、写真フィルムからＤＮＡ配列を直接読み取ることができる。

この方法は、厳密で正確な配列解析を遂行するには慎重に実施する必要がある多種多様な工程を要することが普通である。これらの工程のいずれかを除去することは、この方法の改良になるであろう。例えば、一般的に行われるような方法では、使用時に必要とするすべての化学成分を個別に混合することが必要である。

すなわち、緩衝剤、酵素、ヌクレオチド類、ヌクレオチド類縁体類およびオリゴヌクレオチドブライマーは、同時に、各ヌクレオチドＧ、　Ｔ、　ＡおよびＣに対して別々に混合される。

〔発明の要約〕

本発明は、以下の試薬類を含んでなるヌクレオチドシーフェンシング反応濃厚物を提供する：ａ）　　１００〜５００１．Ｕ、／ｍＬを提供するのに十分な熱安定性ポリメラーゼ：ｂ）ジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノールから選ばれる還元剤０．３〜３０ｍＭ；Ｃ）約ｐｔ１７．　５を保持するのに十分なリン酸緩衝剤；ｄ）少なくとも４０％のグリセリン；ｅ）ｄＧＴＰまたはｄ−ａＧＴＰ（ここで、「ａＧ」は７−ジアザグアニンを表わす）１５〜１５０ＪＩＭ　；ｆ）ｄＡＴＰ１５〜１５０ｍ　；ｇ）　ｄＴＴＰ　１５〜１５０Ａ　；ｈ）ｄｃＴＰ１０〜１８声；ならびに比が約５となるのに十分なｄｄＧＴＰ；（ｉｉ）ｄＡＴＰに対するｄｄＡＴＰの比が約３３となるのに十分なｄｄＡＴＰ；（ｉｉｉ）ｄＴＴＰに対するｄｄＴＴＰＯ比が約２８となるのに十分なｄｄＴＴＰ；および（ｉｖ）ｄＣＴＰに対するｄｄＣＴＰの比が約２２となるのに十分なｄｄＣＴＰ、からなる群より選ばれる１種。

この発明の反応濃厚物は、使用時にヌクレオチド鎖のシーケエンジングに必要なすべての成分を混合することが不要である。この反応濃厚物は、数サイクルの期間を通して保存できそして再使用できるプレミックスされた包装の状態ですべての必須成分を含んでなる。この反応濃厚物の利点の一つは、シーケエンシング反応工程の遂行に伴う方法の簡略化にある。

このような工程は、すべての現在のシーケエンシング操作のうちで最も少ない工程を必要とするにすぎず、かつシーケエンシングにとって望ましい「単一工程（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ）Ｊプロトコールに近づくものである。

好ましい態様では、前記に列挙したものに加え次の試薬類を含んでなる：ａ）ゼラチンおよびウシ血清アルブミンからなる群より選ばれるタンパク質濃厚物１７５〜７００ｇ／ｍＬ；ｂ）少なくとも２５ｍＭのグルタミン酸カリウム；Ｃ）非イオン界面活性剤０．１％〜０．３５％（容量／容量）：ならびにｄ）酢酸マグネシウムまたは塩化マグネシウムのようなマグネシウム塩９〜３５ｍＭ０この態様では、反応濃厚物は、−８０℃〜２０℃のような低温において、ヌクレオチドシーケエンシングに関連する化学反応における成分の反応に対する能力に回答悪影響を及ぼすことなく貯蔵できる。

実際問題として、反応のｄＣＴＰ濃度は、３−まで低減することができ、それでもなお十分な酵素反応動力学を維持する。そのようなレベルまで低減できるのは４種のヌクレオチドのうちただ１種である。従って、放射性標識の合成標準の標的ヌクレオチド用にｄＣＴＰを使用することが推奨される。

このように低濃度の標的ヌクレオチドは、特にｄＣＴＰの３Ｓ３チオエステルが使用される場合には効率よく標識されることが必要である。他の放射性ヌクレオチド類は、おおむね低い効率で使用することができる。

〔発明の詳細〕

前記反応濃厚物の必須成分は、１００〜５００、好ましくは２５０１．Ｕ、／ｍＬの熱安定性ポリメラーゼ、好ましくはサール（ＤＴＴ）と；リン酸緩衝剤と；マグネシウム塩と：グリセリンと：デオキシヌクレオチド三すン酸ｄＮＴＰであって、Ｎがグアニン（Ｇ）、７−ジアザグアニン（ａＧ＞、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）であるものと；Ｇ、　Ａ、　ＴおよびＣの反応を終止するためのｄｄＮＴＰ　（ジデオキシＮＴＰであって、Ｎは前記定義のとおりである）である。

この発明の態様の一つでは、各ｄＮＴＰ、および特定のｄｄＮＴＰの濃度とｄＮＴＰに対するｄｄＮＴＰの比率が相違するだけの４種の同等な反応濃厚物を提供する。特定のｄｄＮＴＰはいずれが高分子配列中の終止ヌクレオチドと認識されるかにより左右される。サンガー法に従えば、それはＧ、Ａ、ＴまたＣであろう。

前記必須成分に加え、場合によって反応混合物は、ａ）タンパク質、ｂ）非イオン洗剤およびＣ）グルタミン酸カリウムを含んでもよい。

この反応濃厚物は、それらにブライマーならびに放射性標識ｄＮＴＰを含めることでユーザーにとってさらに便利になるであろう。しかしながら短い半減期の放射性ｄＮＴＰはそれらを含めることの実用性を低下する。

反応濃厚物は、ＤＮＡシーケエンシングに必須の成分をほぼすべて含むものから構成できる。このことが、反応濃厚混合物に配列決定すべきＤＮＡ溶液を単に加え、あとは現在実施されているように、高温でその混合物をインキュベーションし、反応生成物の終止、次いで解析するだけですむような選択肢をユーザーに提供する。このような方法は数多くの工程を省略するので、現在実施されているどのシーケエンシング方法よりも遥かに自動化に適する。

熱安定性酵素は、１の塩基に特異的な反応当たり約０．５１、ＩＩ、の活性を供給するのに十分の濃度で存在する。１．Ｕ、はこの酵素を用い温度７０℃の広いｐＨ範囲下で３０分当たり基質ヌクレオチド１０マイクロモルの重合を触媒するのに必要な量である。

本明細書で使用する「熱安定性酵素」の語は、熱に安定で耐熱性であり、そしてヌクレオチドの重合を触媒して未知ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を形成するものを意味する。一般的に、合成は各プライマーの３′末端で開始し、鋳型鎖に沿って５′から３′の方向に進行し、こうして合成がｄｄＮＴＰによって終止するまでシーケエンシングベクターの未知ヌクレオチド配列中へ進行するので各種鎖長のオリゴヌクレオチドが生成するであろう。しかしながら、前記と同一の操作により５′末端で合成が開始し、前記と別の方向に進行する熱安定性酵素が存在するかも知れない。

本発明で好ましい熱安定性酵素は、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離されるＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ　　ｐｏｌ）である。それらの各種菌株がアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔ　ｉｏｎ　；Ｒｏｃｋｖｉ　Ｉ　Ｉｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）より入手可能であり、それらはティー・ディー・ブロック（Ｔ、Ｄ。

ページに記載されている。これらの好ましい株の一つは、ＹＴ−１株である。

われわれの実験では、Ｔａｑ　　ｐｏｌが次のような性状を示した：１、低温で反応せず、−２０℃で高濃度の塩と適当な反応緩衝剤条件下で保存でき；２、ヌクレアーゼとホスファターゼにほとんど汚染されていないで、そして３、比較的高濃度のグリセリン中で適切な活性を維持する。

これらの結果により、本発明の反応濃厚物の調製が可能になる。

この酵素をコードする遺伝子がサーマス・アクアティカスのゲノムＤＮＡからクローニングされているので、組換えＤＮＡ技術によっても熱安定性酵素を生成できる。サーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）ポリメラーゼを完全にコードする配列は、約１８キロベース（ｋｂ）のゲノムＤＮＡ挿入断片内に含まれるＢｇｍ− Ａｓｐ””部分消化断片的３．　５ｋｂ上のものとしてバクテリオファージＣＨ３５：Ｔａｑ＃４−２から誘導できる。このバクテリオファージは、アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（ＡＴＣＣ）に第４０．３３６号として寄託されている。また、この遺伝子はプラスミドｐＦＣ８３（ＡＴＣＣ６７，４２２，１９８７年５月２９日寄託）から単離されるＢｇＩＩ［−Ｈｉ　ｎＩＩＩ制限断片の約７５０塩基対（ｂｐ）をプラスミドｐＦＣ８５（ＡＴＣＣ６７，４２１，１９る。ｐＦＣ８３制限断片はＴａｑポリメラーゼ遺伝子の−ｒミノ末端を含んでなり、一方、ｐＦＣ８５に由来する制限断片は、カルボキシル末端を含んでなる。従って、適当な調節配列を担持する対応する消化ベクター中に前記２種の断片を連結すると全鎖長Ｔａｑポリメラーゼの翻訳がなされる。

これらのパラメーターは実験的に決定される。１の塩基特異的及応当たり０．　５１．Ｕ、未満では、ヌクレオチド鎮の不自然な末端がもたらされる。１の塩基特異的及応当たり２Ｉ、Ｕ。

を超える必要はない。

前記タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはゼラチンであることができる。Ｔａｑ　　ｐｏｌ酵素活性はタンパク質環境下で改善される。また、このタンパク質は、反応濃厚物の半減期を延長もする。また、タンパク質の存在は、Ｔａｑ　　ｐｏｌが触媒する重合反応の際に重合されたヌクレオチド配列への不自然な含有物を避けられるものと思われる。

反応濃厚物中のタンパク質量は、１７５〜７００ｍ／ｍＬ、好ましくは３５０ｇ／ｍＬが望まれる。１７５Ｎ／ｍＬを下廻わる濃度は不安定さをもたらす。７００ｇ／ｍＬを１廻わる濃度は不要である。

還元剤は必須である。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が好ましい。それがＴａｑ　　ｐｏｌのスルフヒドリル基を還元状態に維持する。この還元状態はＴａｑ　　ｐｏｌ活性にとって必要である。他の還元剤としてはβ−メルカプトエタノールが挙げられる。ＤＴＴの０．　３〜１０ｍＭ量、好ましくは３゜５１ＴＩＭが有用である。この範囲外の濃度は重合及速度に悪影響を及ぼす。この範囲を１廻わる濃度は不要である。

Ｔａｑ　　ｐｏｌの商品は、通常、保存の目的で少量（約０、　１ｍＭ）のＥ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む。しかしながら、ＥＤＴＡは金属捕捉剤であり、かつＴａｑ　　ｐｏｌの活性に必須であるマグネシウムイオン活動度に影響を及ぼす可能性があるので、ＥＤＴＡｌｍＭを超えると反応に有害であろう。

前記反応濃厚物は、塩化マグネシウムや酢酸マグネシウム（±５０％）のような１７．５ｍＭまでのマグネシウム塩を含むことが好ましい。酢酸マグネシウムが好ましい。最終反応混合物中にそれが約５ｍＭの濃度で存在することが必要である。

５ｍＭの酢酸マグネシウムが±５０％の範囲内にある量が有効であろう。これらの範囲を土建わるか上廻わると酵素活性に悪影響を及ぼすであろう。

グルタミン酸カリウム（Ｋグルタメート）もまた、Ｔａｑｐｏｌ酵素活性を高める。反応濃厚物を長期にわたり保存する上で必要である。長期間保存では、２５ｍＭの最低量のグルタミン酸カリウムが必要である。より高濃度は、この発明によって提供されるシーケエンシング方法で実施される電気泳動分析に対して有害な影響を及ぼす受は入れることができない塩濃度につながる。

リン酸水素カリウムおよびリン酸二水素カリウム（Ｋ２ＨＰＯ，およびＫＨ２ＰＯ，）は、約ｐＨ７，５を達成するのに十分量で存在せしめる。リン酸緩衝剤は熱安定性の緩衝剤である。温度−２０°〜７５℃の範囲にわたって実質的に同一のｐＨを維持することができる。Ｔａｑ　　ｐｏｌ活性が保存から使用まで一定であるためには、保存ならびに使用に際して一定ｐＨを維持する必要がある。

グリセリンは凍結防止剤である。使用に向けて解凍と将来の使用に向けての保存の予期されるサイクルに反応濃厚物がかけられるのでいずれかの酵素の反復凍結を避けて酵素活性を保持しなければならない。われわれは、保存温度−７０℃〜 −２０℃で反復凍結を避けるには反応濃厚物に少なくとも４０％のグリセリンを添加する必要を認めた。８０％以上のグリセリンがＴａｑ　　ｐｏｌ活性に悪影響を与えることなく使用できる。

反応濃厚物は、０．１〜０．４％の非イオン性洗剤を含むことができる。具体的なものとしては、エトキシル化脂肪アルコールエーテルおよびラウリルエーテル、エトキシル化アルキルフェノール、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、修飾オキシエチレン化および／またはオキシプロピレン化直鎖アルコール、ポリエチレングリコールモノオレエート化合物、ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）化合物およびフェノール系脂肪アルコールエーテルが挙げられる。より具体的には、トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−１００、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（ＩＣＩ　Ａｍｅｒｉｃａｓ　　Ｉｎｃ、、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＢ、製）であって、ポリオキシエチレン化（２０）ソルビタンモノラウレート、ならびにイコノール（ＩｃｏｎｏＩ、商標）　ＮＰ−４０（ＢＡＳＦ　Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ　Ｃｏｒｐ、　Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、　ＮＪ、製）であって、エトキシル化アルキルフェノール（ノニル）が好ましい。

４種の各ｄＮＴＰも、各濃厚物の必須成分である。４種の各濃厚物は、各反応濃厚物包装中に設計された終止反応に応じてｄｄＮＴＰ類の１種および１種だけを含めねばならない。

−態様では、本発明の材料は各種の態様のキットとして末端ユーザーに提供できる。ユーザーの便宜を図るこの発明の精神と矛盾しないためには、希釈工程を伴うことなく直接キットの成分が使用できるキットを提供することが望ましい。

従って、最も簡便なキットは、多くの生化学実験室の慣行に従うことをユーザーに許容し、そして直接使用に向けた反応濃厚物が約２μＬとなるように設計される。

態様の一つでは、キットが標識されていてもよい１）プライマーおよび２）個別の反応濃厚物Ｇ、　Ａ、　ＴおよびＣの化学品を別々に分離して包装されたものとして含むことができる。

任意のユーザーに便利な包装は、シーケエンシングベクターまたは対照ＤＮＡおよび放射性標識ｄＮＴＰを含めることができる。対照は、ユーザーがキットの操作性を確認できるようなりＮＡ配列である。

シーケエンシングベクターは、配列を決定すべきヌクレオチド釦を含んでなる。

最も広汎に使用されるシーケエンシングベクターは、バクテリオファージＭ１３に由来する。このベクターは、それらの複数クローニング領域で通常相違するだけのフォーマットとして広範に市販されている。広汎に使用されるこのベクターの変形としては、Ｍ１３ｍｐ１８およびｒｎｐ１９が挙げられる。他の市販のシーケエンシングベクター鋳型としては、ｐＵＧ、ｐＩＢＩおよびブルースクリプト（１３１ｕｅｓｃｒｉｐｔ）などが挙げられる。後述するプライマーを使用する場合には、１ａｃＺヌクレオチド配列を担持するいずれかのシーケエンシングベクターが使用できる。

また、ユーザーは用意されているプライマーを選んでもその用意されているベクターを使用しなくてもよい。ユーザーはまた、放射性標識または蛍光標識を有するブライマー０個々の標識を選んでもよい。この条件下では、放射性標識のさらなる使用は不要である。プライマー濃度とパインディング能が実質的に変性していないかぎり、この発明の反応濃厚物は有用であろう。

市販の放射性ヌクレオチド類は、水中約３〜１０−の濃度範囲で販売されている。ユーザーが可変できるものではその量が本組成物のユーザーによって変更できる部分の一定量を４種の反応濃厚物の各々に加えてさらに希釈される場合には、前記の一定量（約１μＬ）が加えられる。すなわち、ユーザーが可変できるものではｌμＬの放射活性物質がユーザーのＤＮＡや対照ＤＮＡと共混合され、水とプライマー５μＬで合計２０〜２３μＬに調製され、次いで５μＬ当たり最終的に２．５μＣｉとなるように４分割され、これらに反応濃厚物を加えて各７μＬの最終反応混合物を与える。

４種の反応物のそれぞれに必要な放射性ヌクレオチドの量は、好ましい放射性同位体を用いて２４時以内に配列分析を終了するものに基づく。好ましい放射性同位体は、α−標識３ｓＳ　　ｄＣＴＰであるが、他の例えば３２Ｐも使用できる。従って、好ましい範囲は、キット中α−標識”Ｓ　　ｄＣＴＰの１〜２μしてあろう。これは、”Ｓ　　ｄＣＴＰ　　１ｍＭ当たり４００〜６００Ｃｉの比活性において約１０μＣｉ／μＬを提供する。

ユーザーが放射性ｄＮＴＰを用意できるし、またそれを反応濃厚物に含めることもできる。ユーザーがシーケエンジングベクターも放射性ｄＮＴＰも用意するときは、これがユーザーが可変できるものを構成する。

ユーザーが可変できるもの一変種は次のように調製される。

これらの可変できるものはユーザーにより用意される。場合によってそれらをキットの一部として供給してもよい。

ユーザーが可変できる濃厚物　　　　最終反応混合物の濃度配列決定をすべきＤＮＡ０．４ピコモルに対する１ｊｒｇのＭ１３ｍｐ１８またはユーザーが選ぶシーケエンシングベクター　・・・・・・・・・　０　、　１　ｐｍｏｌｅ　／　７μＬ１μＬのα−標識ｄＣＴＰ　　・・・・・・・・・　２．５μＣ１／７ μＬ（最終容量が１８μＬを超えないように水を加える）このブライマー濃厚物の包装は、５μＬ中適当な濃度のオリゴヌクレオチドを含んでなる。

Ｔｏｑ　　ｐｏｌシーケエンシングに必須なものは、適当なフライマーエクステンションである。高温合成は、後述する１７塩基のオリコマ−である「汎用性ブライマーＡ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　　ｐｒｉｍｅｒＡ）Ｊの使用に有効でない。

より長いオリゴマーを用いると、高温での鋳型ＤＮＡのブライミングが［自然（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）Ｊに起こるので、このような適切なブライマーの使用が他のＤＮＡシーケエンシング方法にとって必須のブライミング反応の必要性を不要にする。語「自然に」とは、ユーザーが介在することなくプライミング反応が起こることを意味する。

この発明のキットでは、一般に使用される汎用性ブライマーのＭ１３ｍｐ１８領域を含むが、さらにより安定なＧおよびＣ残基の利点を有するように周囲の配列に追加の塩基も含む。このオリゴマーは］ａｃＺを基本とするすべてのベクター　（Ｍ１３．ｐＵｃ、ｐＩＢＩおよびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）と適合性である。このオリゴマー配列は次のとおりで下線部分が伝統的に使用されてきた汎用性ブライマーＡ領域である。３３メル（ｍａｒ）より短いブライマーが使用される場合には、自然にブライミングをするためには過剰モル量が必要である。このような過剰量は、不明瞭なシーケエンシングの結果につながる非特異的なブライミングをもたらすより長いブライマーも使用できる。しかしながら、それらはシーケエンシング結果に厳密には疑いが生じる。Ｇの豊富な配列を含むものを誘導する５′方向への伸長は核酸構造によって生じる不明瞭な電気泳動の移動度をもたらす。３′方向への伸長はＭ１３ベクターのクローニング部位を妨害する。

標的ＤＮＡに対し３モル過剰の前記ブライマーは、まったく自然なブライミングを与える。１０モルを超える過剰量は、非特異的なブライミングと解釈されるシーケエンシングゲル上にバックグラウンドを生じる。７μＬ反応液当たり特にる可能性のある標的ＤＮＡ分子の総数を限定する。こうして、ユーザーは、ヌクレオチドの蓄積を枯渇させることなくＤＮＡの過剰量を使用できる〔１エクステンシヨン当たり２００個の平均の塩基におけるブライマー０．３ピコモル以配列のために消費されるｄＣＴＰが１５ピコモルである〕。

好ましいブライマー濃厚物は次のものを含む。

最終反応混合物中の濃度１ｍＭのトリス／ＨＣＩ！　　（ｐＨ８）　　　　　０．　１８ｍＭ０．１ｍＭのＥＤＴＡ　　　　　　　　　　０．　０１８ｍＭ０．２４ＭのＡ−３３プライマー　　０．　３ｐｍｏｌｅ／７μＬ合計容量　５μＬ第三の個別にラベルされる一部の包装は反応濃厚物である。

反応濃厚物は、４種の別々にラベル力で貼された包装、すなわち、濃厚物Ｇ１濃厚物Ａ、濃厚物Ｔおよび濃厚物Ｃとしてキットで提供してもよい。反応濃厚物のそれぞれは、ｄＮＴＰ類とｄｄＮＴＰ類の濃度がそれぞれ相違することを除き同じ濃度の化学品を含むであろう。ｄＮＴＰに対するｄｄＮＴＰの比率は、放射性標識ｄＮＴＰの均衡のとれたレーン分布を達成するように各濃度を実験的に調整されている。均衡のとれたレーン分布はオリゴヌクレオチド断片の分布を示す写真の均一な外観をもたらす。これが写真フィルムから配列を読み取る上で厳密さと正確さをもたらす。

非常に有用な反応濃厚物を下記に示す。

最終反応混合物の濃度０．２５μ／μＬのＴａｑ　ｐｏｌ　　　＝−０，５μ／　７　ｕ　Ｌ３５０ｘ／ｍｌのＢＳＡ　　　　　　−−−１００ｔａｒ　／　ｍ［。

３．５ｍＭのＤＴＴ　　　　　　　　　−・−・−１ｍＭ１７、５ｍＭの酢酸マグネシウム　・・・・・・・・・　　５ｍＭ２５ｍＭのにグルタメート　　　・ −・・・・・・・　　７．１ｍＭ１３．１ｎ＋Ｍのに２）ＩＰＯ４−・−’−’ −３，７５ｍＭ４．４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４−−−１，２５ｍＭ０．３５％のトリトンＸ−１００・・・・・・・・・　　０．１％４Ｃ％のグリセリン　　　　・・・・・・−・・　１１．４％ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ濃度は下記表Ｉから選ばれる。

ｄａＧＴＰ　　　　　２２．７５　　　７０　　　　７０　　　　７０ｄＡＴＰ　　　　１０５　　　　　１’Ａ５　　１０５　　　１０５ｄＴＴＰ　　　　　５２．５　　　　５２．５　　　１７．５　　　５２．５ｄＣＴＰ　　　　　１０．５　　　　１０．５　　　１（Ｌ５　　　１０．５ｄｄＧＴＰ　　　　１１３．７５　　　　−　　　−　　　−ｄｄＡＴＰ　　　　　　　　　　５７７．５　　　−　　　−ｄｄＴＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　４９０　　　　 −ｄｄＣＴＰ　　　　　−−−２３１ヌクレオチドｄａＧＴＰとｄＧＴＰは置き替えできる。

表　　　■ ｄａＧＴＰ　　６．５　２０　２０　２０ｄＡＴＰ　　３０　５　３０　３０ｄＴＴＰ　　１５　１５　５　　ｌ５ｄＣＴＰ　　３　３　３　３ｄｄ／ｄの比　　５　　　　　３３　　　　２８　　　　２２キツトの別の態様では、反応濃厚物Ｇ、Ａ、ＴおよびＣがブライマーおよび／または放射性標識ｄＮＴＰも含むことができる。

キットのもう一つの態様では、単一の反応濃厚物が、ｄＮＴＰ類および／または選択されたｄｄＮＴＰ以外のすべての化学品を含んでよい。ｄＮＴＰ類とｄｄＮＴＰ類は、表■に従って個別に包装することができる。これらの個別に包装されたｄＮＴＰ混合物の各々は、適当なとき、使用時に反応濃厚物へ加えられるであろう。

反応濃厚物の製造に際し、酵素を最後に加える必要があること以外、添加の順序はそれ程重要でない。一般的な添加順序は、塩類と緩衝剤、ヌクレオチド類、他の試薬類、グリセリン、次いで酵素であって、それぞれの添加の際には十分に混合し、氷温で行われる。

記載様式のいずれかで前記キ７）を使用する場合、一般的に、シーケエンシング方法は次の工程を含んでなる：ａ）シーケエンシングベクターの既知ヌクレオチド鎖の３′末端に隣接して未知ヌクレオチド配列を含んでなるシーケエンジングベクターを提供する工程；ｂ）そのベクターをブライマーおよび放射性標識ｄ　ＮＴＰと混合する工程であって、このブライマーが未知１）ＮＡ配列に隣接している既知ベクターＤＮＡ配列の一部と相補的であるヌクレオチド配列を有するものである工程；Ｃ）混合物ｂ）をＧ、　Ａ、　ＴおよびＣとラベルを貼した４種の容器に４つとも等量で分割する工程；ｄ）ｉ）ｄｄＧＴＰを含んでなる本発明に従う反応濃厚物をＧと選定した容器に添加し、１ｉ）ｄｄＡＴＰを含んでなる本発明に従う反応濃厚物をＡと選定した容器に添加し、１ｉｊ）ａｄＴＴＰを含んでなる本発明に従う反応濃厚物をＴと選定した容器に添加し、そして１ｖ）ｄｄＣＴＰを含んでなる本発明に従う反応濃厚物をＣと選定した容器に添加すること、によって反応混合物を提供する工程；ｅ）４種の容器Ｇ、　Ａ、　ＴおよびＣを１０〜３０分間７０〜７４℃でインキュベーションする工程；ｆ）４種のチューブのそれぞれに反応停止混合物３〜５ μＬを添加することによって反応を終止する工程；ｇ）ｅ）で形成されたオリゴヌクレオチドを鎖長に応じて電気泳動分離する工程；ならびにｈ）放射性ｄＮＴＰによって生じる放射線に感光性の写真フィルムを電気泳動分離物で露光して未知ヌクレオチド鎖のヌクレオチド配列を確定する工程。

典型的な反応では、ユーザーは品質的に単一鎖ＤＮＡ調製物、典型的には濃度＞１００ｘ／ｍＬでＭｌ　３ｍｐ１８ＤＮＡＩｇ　（０，４ピコモル）を供給する。ユーザーはこのＤＮＡ、ブライマー／緩衝剤５μし、水および放射性ヌクレオチド（通常、１μＣｉのＰ　３２または１０μＣｉの３５３．　＞　６００Ｃｉ／ｍＭでα−標識されたｄｃＴＰ）を併わせて総容量２１μＬにする。このＤＮＡ混合物を、必須のＧ−特異的反応、Ａ−特異的反応、Ｔ−特異的反応およびＣ −特異的反応用として選定した４種のチューブ（好ましくは０．５ｍＬの遠心管）に等量（５μ）分割する。これらのチューブを７０〜７４℃に置く。次に、特定の反応濃厚物を選定したチューブ中で混合する。これらのチューブの蓋をして、３０分間７０〜７４℃でインキュベーションを続けた。

反応は、反応停止混合物３μＬの添加で終止できる。反応停止混合物は周知である。ヨーロッパ特許出願公開第２５８０１７号明細書は、マグネシウムイオンをキレートするためのＥＤＴＡ、フェノール、ＳＤＳまたはＣＨＣｔ３を含むような混合物を記載する。有用な混合物は、ホルムアミド溶媒中、０．０２ＭのＥＤＴＡ　。

０．０７Ｍのトリス（ＥＤＴＡを中和するためのもの）；０．０５（重量／容量）％のプロフェノールブルー；ならびに０．０２＜重量／容量）％のキシレンシアツールが存在するものである。

後者の２成分は、電気泳動の進行を視覚的に評価するためのアニオン性発色団である。

残基をシーケエンシングするためにＴａｑ　　ｐｏｌを使用する主な利点は、その高温（鋳型鎮による構造的な妨害を極小化する）での合成能にあるが、この発明で認められる相当な利点は超らせんシーケエンシングを初めとする二本鎖ＤＮＡ　（ｄ　ｓ　ＤＮＡ）に対するそれの適合性にある。

二本鎖または超らせん化のシーケエンシングの原理は、一本鎖状態まで不可逆的に変性されている超らせんの区分に左右されるので、シーケエンシング反応に必須なプライムされた合成に従う。

不可逆的に変性された超らせんの有意な区分は、超らせんＤＮＡのアルカリ変性および酸中和によって得られる。普通の二本鎖ＤＮＡは同様に処理されるが、得られるものは一本領Ｄ　Ｎ　Ａのより高い区分にある。超らせんと二本鎖ＤＮＡのアルカリ変性とそれに続く酸中和は、この工程では比較的少量で正確な量を必要としないので高い蓄積された塩濃度とあまり限定されていないｐＨをもたらすであろう。一般的には、処理ＤＮＡを再精製して塩を除去しそしてｐＨを調節することが必要である。なぜかなら他のすべての現在するシーケエンシングブロトコールは高塩濃度に耐性がなくそして／またはこの方法に利用されそしてこれらの酵素の活性に必要な緩衝剤系をだめにする可能性があるからである。

リン酸緩衝剤は、通常使用されるすべての緩衝剤のうち最も高い熱安定性を有する。リン酸緩衝剤は、ｐＨが一８０℃程の低温で長期間保存に適するように制御され、そして８０℃程の高温で反応を制御しなければならないのでこの反応濃厚物に選ばれた。逆に、トリス緩衝剤は数ある緩衝剤の中で最も低い熱安定性を有し、そのｐＫ値を０℃から７０℃までで２単位以上も低下させる。こうしてこの発明の方法では超らせん化シーケエンシング反応が変性ＤＮＡを再生する必要はな〈実施できる。

このことは次の工程によって達成される：ａ）１ａｃＺヌクレオチド配列を有する二本鎖シーケエンシングベクターであって、その中に未知ヌクレオチド配列を有するｄｓＤＮＡがそのベクター中の既知ヌクレオチド鎖の３′末端に隣接して挿入されているベクターを提唐する工程：ｂ）前記ベクターをアルカリ性溶液で変性して５ｓＤＮＡを形成する工程；Ｃ）変性されたＤＮＡを含有する溶液を中和する工程：ならびにｄ）上記のヌクレオチドシーケエンシング方法の工程ｂ）からｈ）までを実施する工程。

上記シーケエンシング方法の典型例では、数μＬ容量の超らせんＤＮＡ　（希釈緩衝液中、例えば１ｍＭのトリス、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐｆｌｇ＞を２分間３７℃で０．１ＭのＫＯＨ１μＬを用いて変性する。一般的に、それ以上苛酷な処理は不要である。氷上、プライマーと放射性ｄＮＴＰを添加し、次いで変性したＤＮＡを０．２Ｍのトリス塩酸１μＬの添加により中和する。次に、水を加えて容量２１〜２３μＬを得る。最終的塩濃度とｐＨは、一般的に正確でない。しかしながら、この発明の方法はさらなる調節を行うことなく使用できる。理論上、得られた環系は、３０〜５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７〜９）からなる。酵素反応に向けてこの溶液を７０℃まで加熱すると、反応濃厚物により提供されるリン酸緩衝剤が全体的な混合物の最終ｐｕを安定化するのでトリス緩衝剤の影響をなくする。正常な一本鎖は乱れることなくシーケエングが起こる。こうして、超らせんのシーケエンシングは一本鎖のシーケエンシングと実質的に同一の方法によって、変性された超らせんＤＮＡの再精製を伴うことなく行われる。

この発明は、その好ましい態様を具体的に引用しながら詳述してきたが、その変更および改良も本発明の精神およびその範囲内で有効であることが理解されるであろう。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成３年８月デ　日特許庁長官　深　沢　　　亘　殿１　特許出願の表示ＰＣＴ／ＵＳ　９０１００４４０２　発明の名称熱安定性ポリメラーゼＤＮＡシーケエンシング反応濃厚物３　特許出願人住　所　アメリカ合衆国、ニューヨーク　１４６５０　。

ロチェスター、ステイト　ストリート　３４３名称　　イーストマン　コダック　カンパニー４代理人住　所　東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル〒１０５　　電話（３５０４）　０７２１請求の範囲１、　　ａ）　　１００〜５００１．Ｉｌ、／ｍＬを提供するのに十分な熱安定性ポリメラーゼ；ｂ）ジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノールから選ばれる０、３〜３０ｍＭの還元剤；Ｃ）保存中および使用中の両方で約ｐＨ７，５を維持するのに十分なリン酸緩衝剤１ｄ）少なくとも４０％のグリセリン；ｅ）１５〜７０−のｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ；ｆ）１５〜１５０声のｄＡＴＰ；ｇ）１５〜１５０団のｄＴＴＰ；ｈ）１０〜１８−のｄＣＴＰ　；ならびに１）（ｉ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰに対するｄｄＧＴＰの比率を約５にするのに十分なｄｄＧＴＰ；（ｉｉ）ｄＡＴＰに対するｄｄＡＴＰの比率を約３３にするのに十分なｄｄＡＴＰ；（ｉｉｉ）ｄＴＴＰに対するｄｄＴＴＰの比率を約２８にするのに十分量のｄｄＴＴＰ、および（ｉｖ）ｄＣＴＰに対するｄｄＣＴＰの比率を約２２にするのに十分量のｄｄＣＴＰ。

からなる群より選ばれる１種、を含んでなるヌクレオチドシーケエンシング反応濃厚物。

２、前記熱安定性ポリメラーゼがサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼである請求の範囲第１項の濃厚物。

３、ａ）ゼラチンおよびウシ血清アルブミンからなる群より選ばれるタンパク質濃厚物１７５〜７００ｘ／ｍＬ：ｂ）グルタミン酸カリウム少なくとも２５ｍＭ；ならびにＣ）マグネシウム塩９〜３５ｍＭ。

をさらに含んでなる請求の範囲第２項記載の反応濃厚物。

４、ａ）非イオン界面活性剤０．１〜０．４％量；ｂ）α−標識された放射性ｄＮＴＰｏ、１〜１０μＣｉ／μＬ；Ｃ）マグネシウム塩９〜３５ｍＭ、ならびにｄ）ヌクレオチド配列５’　Ｃ［：ＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ　３’を有するオリゴヌクレオチドプライマー０．１〜１．０声、もさらに含んでなる請求の範囲第２項の反応濃厚物。

ｂ）ウシ血清アルブミン約３５０マイクロｇ／ｍＬ；Ｃ）ジチオスレイトール約３．５ｍＭ；ｄ）酢酸マグネシウム約１７．５ｍＭ；ｅ）グルタミン酸カリウム約２５ｍＭ；ｆ）　Ｋ、　ＨＰＯ，約１３．１ｍＭ；ｇ）ＫＨ２ＰＯ４約４．４ｍＭ；ｈ）トリトンｘ１００界面活性剤約０．３５％；１）４０％のグリセリン、ならびにＡ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ約２２．７ｍ；ｄＡＴＰ１０５オ；ｄＴＴＰ５２．５オ；ｄｃＴＰｌｏ、５声；およびｄｄＧＴＰ１１３．７オ；Ｂ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ約７０声；ｄ、ＡＴＰ１７．５団；ｄＴＴＰ５２．５声；ｄｃＴＰｌｏ、５ｚ；およびｄｄＡＴＰ５７７禮；Ｃ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ約７０−；ｄＡＴＰ１０５声；ｄＴＴＰ１７．５声；ｄｃＴＰｌｏ、５犀；およびｄｄＴＴＰ４９０オ；Ｄ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ約７０−；ｄＡＴＰ１０５声：ｄＴＴＰ５２．５犀；ｄｃＴＰｌｏ、５団；およびｄｄｃＴＰ２３１岸、からなる群より選ばれる１の混合物、を含んでなるヌクレオチドシーケエンシング反応濃厚物。

６、配列５’　ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ　３’を有するオリゴヌクレオチドブライマー０．１５−もさらに含んでなる請求の範囲第５項の反応濃厚物。

７、反応濃厚物２μＬ当たりα−標識化放射性ｄｃＴＰ１〜１０μＣｉをさらに含んでなる請求の範囲第６項の反応濃厚物。

８、放射性標識ヌクレオチドが元素３２ｐまたは３２３で標識されたものである請求の範囲第７項の反応濃厚物。

９、ａ）ベクター中の既知ヌクレオチド鎖の３′末端に隣接する未知ヌクレオチド配列を含んでなるシーケエンシングベクターを提供する工程；ｂ）前記ベクターを放射性標識ｄＮＴＰと混合する工程であって、前記プライマーが前記未知ＤＮＡ配列と隣接する前記既知ベクターＤＮＡ配列の一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を有するものである前記工程：Ｃ）混合物ｂ）を、Ｇ、　Ａ、　ＴおよびＣのラベルが貼された４種の容器に分割する工程：ｄ）（ｉ）Ｇと選定された容器にｄｄＧＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、（ｉｉ）Ａと選定された容器にｄｄＡＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、（ｉｉｉ）　Ｔと選定された容器にｄｄＴＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、そして（ｉｖ）Ｃと選定された容器にｄｄｃＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加する、ことにより一連の反応混合物を提供する工程；ｅ）１５〜３０分７０〜７４℃の温度で前記４種の容器Ｇ、Ａ、ＴおよびＣをインキュベーションする工程：ｆ）前記各４種のチューブに反応停止混合物３〜５ μＬを添加することによって反応を終止する工程；ｇ）鎖長に応じてｅ）で形成されたオリゴヌクレオチドを電気泳動分離する工程：ならびにｈ）放射性ｄＮＴＰによって生じる放射線に感光性の写真フィルムを各ゲルで露光して、前記未知ヌクレオチド鎮のヌクレオチド配列を確定する工程、を含んでなるオリゴヌクレオチドのシーケエンシング方法。

１０、各反応濃厚物Ｇ、　Ｔ、　ＡおよびＣが、既に放射性ｄＮＴＰを含んでいるために、請求の範囲第９項の工程ｂ）で前記放射性ｄＮＴＰを含める必要性が除去されている請求の範囲第９項の方法。

１１６各反応濃厚物Ｇ、　Ｔ、　ＡおよびＣが、さらにプライマーを含んでいるために、請求の範囲第９項の工程ｂ）で前記プライマーを含める必要性が除去されている請求の範囲第９項の方法。

１２、シーケエンシングベクターが１ａｃＺヌクレオチド配列を担持する請求の範囲第９項の方法。

１３、シーケエンシングベクターがＭ　１３ｍｐ　１８　ＤＮＡ。

ｐＵＣ，ｐＩＢＩおよびブルースクリプト（Ｂ　Ｉｕｅｓｃｒ　１ｐｔ）からなる群より選ばれるものである請求の範囲第９　項の方法。

１４、プライマーがヌクレオチド配列５’　ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ　３’を有する請求の範囲第９項の方法。

１５、シーケエンシングベクターがＭｌ　３ｍｐ　１８であり、反応濃厚物が請求の範囲第２．　３．　４または５項に従う組成を有する請求の範囲第９または１１項の方法。

１６、ａ）第一容器中に１ａｃＺヌクレオチド配列とα−標識化放射性ｄｃＴＰ１μＬを有する対照シーケエンシングベクター；ｂ）第二容器中に配列５’　ＣＣＣＡＧＴＣＡ［：ＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ　３’を有するオリゴヌクレオチドプライマー；ならびにＣ）第三容器中に請求の範囲第２．３または５項に従う反応濃厚物、を含んでなるヌクレオチドシーケエンシングキット。

１７、第一容器に配列５’　ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ　３’を有するオリゴヌクレオチドブライマーを含んでなり、そして第三容器中に請求の範囲第２，３または５項に従う反応濃厚物を含んでなるヌクレオチドシーケエンシングキット。

１８、請求の範囲第６，７または８項に従う反応濃厚物を含んでなるヌクレオチドシーケエンシングキット。

１９、ヌクレオチド配列５　’　ＣＣＣＡＧＴＣＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ　３　’を有するオリゴヌクレオチド。

２０、ａ）未知ヌクレオチド配列を有するｄｓＤＮＡがシーケエンシングベクター中の既知ヌクレオチド鎖の３′末端に隣接して挿入されている１ａｃＺヌクレオチド配列を有する二本鎖シーケエンシングベクターを提供する工程；ｂ）アルカリ性溶液で前記ベクターを変性して５ｓＤＮＡを形成する工程；Ｃ）変性されたＤＮＡ含有溶液を中和する工程；ｄ）前記ベクターを、プライマーと、マグネシウム塩と放射性標ｍｄＮＴと混合する工程であって、プライマーが未知ＤＮＡ配列に隣接する既知ＤＮＡ配列の少なくとも１部に相補的であるヌクレオチド配列を有するものである前記工程：ｅ）混合物ｄ）をＧ、　Ａ、　ＴおよびＣとラベル貼された４種の容器中に分割する工程：ならびにｆ）（ｉ）Ｇと選定された容器にｄｄＧＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、（ｉｉ）Ａと選定された容器にｄｄＡＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、（ｉｉｉ）Ｔと選定された容器にｄｄＴＴＰを含んでなる請求の範囲第」または２項に従う反応濃厚物を添加し、（ｉｖ）　Ｃと選定された容器にｄｄＣＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加する、ことによって一連の反応混合物を提供する工程；ｇ）４種の容器Ｇ、　Ａ、　ＴおよびＣを１５〜３０分７０〜７４℃の温度でインキュベーションする工程：ｈ）４種のチューブそれぞれに反応停止混合物３〜５μＬを添加することによって反応を終止する工程；ｉ）鎖長に応じて形成されたオリゴヌクレオチドを電気泳動分離する工程：ならびにｊ）放射性ｄＮＴＰによって生じた放射線に感光性の写真フィルムをゲルで露光して、超らせんＤＮＡの配列を確定する工程、を含んでなる二本鎖（ｄｓＤＮＡ）のシーケエンシング方法。」国際調査報告国際調査報告ＰＣＴ／ＵＳ　９０１００４４０Ｓ＾　　　　　３４６６８

Claims

【特許請求の範囲】

１．ａ）１００〜５００ｌ．Ｕ．／ｍＬを提供するのに十分な熱安定性ポリメラーゼ；ｂ）ジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノールから選ばれる０．３〜３０μＭの還元剤；ｃ）約ｐＨ７．５を維持するのに十分なリン酸緩衝剤；ｄ）少なくとも４０％のグリセリン；ｅ）１５〜７０μＭのｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ；ｆ）１５〜１５０μＭのｄＡＴＰ；ｇ）１５〜１５０μＭのｄＴＴＰ；ｈ）１０〜１８μＭのｄＣＴＰ；ならびにｉ）（ｉ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰに対するｄｄＧＴＰの比率を約５にするのに十分なｄｄＧＴＰ；（ｉｉ）ｄＡＴＰに対するｄｄＡＴＰの比率を約３３にするのに十分なｄｄＡＴＰ；（ｉｉｉ）ｄＴＴＰに対するｄｄＴＴＰの比率を約２８にするのに十分量のｄｄＴＴＰ、および（ｉｖ）ｄＣＴＰに対するｄｄＣＴＰの比率を約２２にするのに十分量のｄｄＣＴＰ、からなる群より選ばれる１種、を含んでなるヌクレオチドシーケエンシング反応濃厚物。
２．前記熱安定性ポリメラーゼがサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔＩｃｕｓ）ポリメラーゼである請求の範囲第１項の濃厚物。
３．ａ）ゼラチンおよびウシ血清アルブミンからなる群より選ばれるタンパク質渡厚物１７５〜７００ｍｇ／ｍＬ；ｂ）グルタミン酸カリウム少なくとも２５μ Ｍ；ならびにｃ）マグネシウム塩９〜３５μＭ、をさらに含んでなる請求の範囲第２項記載の反応濃厚物。
４．ａ）非イオン界面活性剤０．１〜０．４％量；ｂ）α−標識された放射性ｄＮＴＰＯ．１〜１０μＣｉ／μＬ；ｃ）マグネシウム塩９〜３５μＭ、ならびにｄ）ヌクレオチド配列５′ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ　３′を有するオリゴヌクレオチドプライマー０．１〜１．０μＭ、もさらに含んでなる請求の範囲第２項の反応濃厚物。
５．ａ）サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｌｃｕｓ）ポリメラーゼ約０２５Ｉ・Ｕ・／μＬ，ｂ）ウシ血清アルブミン約３５０マイクロｇ／ｍＬ；ｃ）ジチオスレイトール約３．５μＭ；ｄ）酢酸マグネシウム約１７．５μＭ；ｅ）グルタミン酸カリウム約２５μＭ；ｆ）Ｋ２ＨＰ０４約１３．１ μＭ；ｇ）ＫＨ２Ｐ０４約４．４μＭ；ｈ）トリトンＸ１００界面活性剤約０．３５％；ｉ）４０％のグリセリン、ならびにＡ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ約２２．７μＭ；ｄＡＴＰ１０５μＭ；ｄＴＴＰ５２．５μＭ；ｄＣＴＰ１０．５μＭ；およびｄｄＧＴＰ１１３．７μＭ；Ｂ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ約７０μＭ；ｄＡＴＰ１７．５μＭ；ｄＴＴＰ５２．５μＭ；ｄＣＴＰ１０．５μＭ；およびｄｄＡＴＰ５７７μＭ；Ｃ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ約７０μＭ；ｄＡＴＰ１０５μＭ；ｄＴＴＰ１７．５μＭ；ｄＣＴＰ１０．５μＭ；およびｄｄＴＴＰ４９０μＭ；Ｄ）ｄＧＴＰまたはｄａＧＴＰ約７０μＭ；ｄＡＴＰ１０５μＭ；ｄＴＴＰ５２．５μＭ；ｄＣＴＰ１０．５μＭ；およびｄｄＣＴＰ２３１μＭ、からなる群より選ばれる１の混合物、を含んでなるヌクレオチドシーケエンシング反応濃厚物。
６．配列５′　ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ　　３′を有するオリゴヌクレオチドプライマー０．１５μＭもさらに含んでなる請求の範囲第５項の反応濃厚物。
７．反応濃厚物２μＬ当たりα−標識化放射性ｄＣＴＰ１〜１０μＣｉをさらに含んでなる請求の範囲第６項の反応濃厚物。
８．放射性標識ヌクレオチドが元素３２Ｐまたは３２Ｓで標識されたものである請求の範囲第７項の反応濃厚物。
９．ａ）ベクター中の既知ヌクレオチド鎖の３′末端に隣接する未知ヌクレオチド配列を含んでなるシーケエンシングベクターを提供する工程；ｂ）前記ベクターを放射性標識ｄＮＴＰと混合する工程であって、前記プライマーが前記未知ＤＮＡ配列と隣接する前記既知ベクターＤＮＡ配列の一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を有するものである前記工程；ｃ）混合物ｂ）を、Ｇ，Ａ，ＴおよびＣのラペルが貼された４種の容器に分割する工程；ｄ）（ｉ）Ｇと選定された容器にｄｄＧＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、（ｉｉ）Ａと選定された容器にｄｄＡＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、（ｉｉｉ）Ｔと選定された容器にｄｄＴＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、そして（ｉｖ）Ｃと選定された容器にｄｄＣＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加する、ことにより一連の反応混合物を提供する工程；ｅ）１５〜３０分７０〜７４℃の温度で前記４種の容器Ｇ，Ａ，ＴおよびＣをインキュベーションする工程；ｆ）前記各４種のチューブに反応停止混合物３〜５ μＬを添加することによって反応を終止する工程；ｇ）鎖長に応じてｅ）で形成されたオリゴヌクレオチドを電気泳動分離する工程；ならびにｈ）放射性ｄＮＴＰによって生じる放射線に感光性の写真フィルムを各ゲルで露光して前記未知ヌクレオチド鎖のヌクレオチド配列を確定する工程、を含んでなるオリゴヌクレオチドのシーケエンシング方法。
１０．各反応濃厚物Ｇ，Ｔ，ＡおよびＣが、既に放射性ｄＮＴＰを含んでいるために、請求の範囲第９項の工程ｂ）で前記放射性ｄＮＴＰを含める必要性が除去されている請求の範囲第９項の方法。
１１．各反応濃厚物Ｇ，Ｔ，ＡおよびＣが、さらにプライマーを含んでいるために、請求の範囲第９項の工程ｂ）で前記プライマーを含める必要性が除去されている請求の範囲第９項の方法。
１２．シーケエンシングペクターが１ａｃＺヌクレオチド配列を担持する請求の範囲第９項の方法。
１３．シーケエンシングベクターがＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ，ｐＵＣ，ｐＩＢＩおよびブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）からなる群より選ばれるものである請求の範囲第９項の方法。
１４．プライマーがヌクレオチド配列５′ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ　３′を有する請求の範囲第９項の方法。
１５．シーケエンシングベクターがＭ１３ｍｐ１８であり、反応濃厚物が請求の範囲第２，３，４または５項に従う組成を有する請求の範囲第９または１１項の方法。
１６．ａ）第一容器中に１ａｃＺヌクレオチド配列とα−標識化放射性ｄＣＴＰ１μＬを有する対照シーケエンシングベクター；ｂ）第二容器中に配列５′　ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ　　３′を有するオリゴヌクレオチドプライマー；ならびにｃ）容器の第二セット中に請求の範囲第２，３または５項に従う反応濃厚物、を含んでなるヌクレオチドシーケエンシングキット。
１７．第一容器に配列５′ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ　３′を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、そして容器の第二セット中に請求の範囲第２，３または５項に従う反応濃厚物を含んでなるヌクレオチドシーケエンシングキツト。
１８．請求の範囲第６，７または８項に従う反応濃厚物を含んでなるヌクレオチドシーケエンシングキット。
１９．ヌクレオチド配列５′　ＣＣＣＡＧＴＣＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ　３′を有するオリゴヌクレオチド。
２０．ａ）シーケエンシングベクター中のｄｓＤＮＡが既知ヌクレオチドの３′ 末端に隣接して挿入された未知ヌクレオチド配列を有し、１ａｃＺヌクレオチド配列を有する二本鎖シーケエンシングベクターを提供する工程；ｂ）アルカリ性溶液でベクターを変性してｓｓＤＮＡを形成する工程；ｃ）変性されたＤＮＡ含有溶液を中和する工程；ｄ）前記ベクターを、プライマーと、マグネシウム塩と放射性標識ｄＮＴと混合する工程であって、プライマーが未知ＤＮＡ配列に隣接する既知ＤＮＡ配列の少なくとも１部に相補的であるヌクレオチド配列を有するものである前記工程；ｅ）混合物ｄ）をＧ，Ａ，ＴおよびＣとラペル貼された４種の容器中に分割する工程；ならびにｆ）（ｉ）Ｇと選定された容器にｄｄＧＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、（ｉｉ）Ａと選定された容器にｄｄＡＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、（ｉｉｉ）Ｔと選定された容器にｄｄＴＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加し、（ｉｖ）Ｃと選定された容器にｄｄＣＴＰを含んでなる請求の範囲第１または２項に従う反応濃厚物を添加する、ことによって一連の反応混合物を提供する工程；ｇ）４種の容器Ｇ，Ａ，ＴおよびＣを１５〜３０分７０〜７４℃の温度でインキュベーションする工程；ｈ）４種のチューブそれぞれに反応停止混合物３〜５μＬを添加することによって反応を終止する工程；ｉ）鎖長に応じて形成されたオリゴヌクレオチドを電気泳動分離する工程；ならびにｊ）放射性ｄＮＴＰによって生じた放射線に感光性の写真フィルムをゲルで露光して、超らせんＤＮＡの配列を確定する工程、を含んでなる二本鎖（ｄｓＤＮＡ）のシーケエンシング方法。