JP2020043794A - プライマーセット、及びそれを用いた標的ヌクレオチド配列の増幅方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ２５ヌクレオチドからなる極めて短い標的配列を、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅するために用いられるプライマーセットを提供すること。【解決手段】 標的ヌクレオチド配列は、２５のヌクレオチドからなり、グアニン及びシトシン（ＧＣ）を少なくとも計１３ヌクレオチド含み、フォワードプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の５’末部分と同一の配列からなり、リバースプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の３’末部分と相補的な配列からなり、両プライマーは各々ＧＣを少なくとも計５ヌクレオチド含み、一方のプライマーは１２ヌクレオチドからなり、他方のプライマーは１３ヌクレオチドからなる、プライマーセット。【選択図】 なし

Description

本発明は、プライマーセット、及びそれを用いた標的ヌクレオチド配列の増幅方法に関する。より詳しくは、２５ヌクレオチドからなる極めて短い標的配列を、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅する方法、及び該方法に用いられるプライマーセットに、本発明は関する。

１９９６年に商業栽培が開始されて以来、遺伝子組換え（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ：ＧＭ）作物は、多くの国や地域で利用されている。その栽培面積は、１９９６年には１７０万ヘクタールであったが、２０１６にはその１００倍以上の１億８千万ヘクタールに達したと報告されている。

ＧＭ作物は有用である一方、そのような作物を食品として利用することに対して抵抗を感じる消費者も少なからず存在する。日本では、消費者への情報提供という観点から、ＧＭ食品の表示制度が設けられている。その内容は食品表示法に定められており、表示対象となるのは、厚生労働省による安全性審査の手続きを経た「大豆」、「とうもろこし」、「ばれいしょ」、「なたね」、「綿実」、「アルファルファ」、「てん菜」、「パパイヤ」の８農作物と、更にこれらを原材料に用いた３３種類の加工食品群である。このような食品表示制度の実効性を担保するためには、信頼性の高いＧＭ検査法の存在が不可欠である。ＧＭ検査法に関しては、組換え遺伝子のＤＮＡを標的としたポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）が、標準的な方法として世界中で利用されている。ＰＣＲとは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて特定のＤＮＡ配列を大量に増幅する技術であり、様々な研究や検査に利用されている。わが国の安全性審査済みＧＭ検知に係る公定検査法は、消費者庁の「安全性審査済みの遺伝子組換え食品の検査方法」（以下、消費者庁マニュアル）に収載されている。現在、消費者庁マニュアルにおいては、３系統のＧＭ大豆及び１３系統のＧＭトウモロコシ、さらに、ハワイ産ウイルス抵抗性パパイヤ等を検知可能な検査法が整備されている。

しかしながら、新たなＧＭ作物が次々と開発され、安全性審査を経ていることから、検知対象となるＧＭ作物の種類は増加し続けており、基本的に減ることはない。わが国では、平成３０年５月現在で、３４３種類のＧＭ作物が食品として商品化可能となっている。増え続けるＧＭ作物を漏れなく効率的に検知するためには、ＧＭ作物に共通する配列を標的として検出するスクリーニング法が有効である。これまでのスクリーニング検査法では、多くのＧＭ作物に導入されている、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）等の共通配列を標的としてきた（非特許文献１）。しかしながら、Ｐ３５Ｓを持たないＧＭ品種も急増してきている。現状では、Ｐ３５Ｓを持たない系統に関しては、個別の特異的検知法を整備して対応しているが、検知対象の増加に合わせて検査法を単純に追加していくだけでは、検査にかかる負担が増え続けることになってしまうことから、抜本的な対策が求められている。

現在、世界で最も広く用いられているＧＭ植物作出技術は、根頭がん種病菌アグロバクテリウムを利用したアグロバクテリウム法である。アグロバクテリウム法では、Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域が植物の核ゲノムに挿入される。したがって、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに由来する配列は、目的の組換え遺伝子と共に宿主作物のゲノムに導入されることから、ＧＭ検知の際には極めて有効な標的配列になり得ると考えられる。

この点に関し、本発明者らが今回データベース等を解析した結果、Ｔ−ＤＮＡの末端に位置する右境界配列（Ｒｉｇｈｔ Ｂｏｒｄｅｒ、ＲＢ）の近傍配列が、ダイズ、トウモロコシ、ワタ、ナタネ等、多くのＧＭ作物のゲノムＤＮＡにおいて、共通して導入されていることを見出した。しかしながら、このＧＭ作物間において共通して完全に保存されている配列（配列番号：１、５’−ＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣＧＡＣＡＡＴＣＴＧＡＴＣ−３’：以下、本配列を「ＲＢ近傍配列」とも称する）は、僅か２５ヌクレオチド（２５塩基）しかなかった（図１ 参照）。

ＰＣＲに関しては、既に様々な教科書的実験プロトコールが存在しており、その代表例である、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（非特許文献２）には、プライマーの長さは通常２０〜２５ヌクレオチドと記載されており、さらに、１８ヌクレオチド未満の長さのプライマーを用いた場合には、鋳型ＤＮＡとの間で非特異的な結合を起こす傾向があると記載されている。すなわち、ＰＣＲにおいて、フォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー２０ヌクレオチド程度とリバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー２０ヌクレオチド程度、さらに、プライマー間に少なくとも数ヌクレオチドのスペースを入れるため、短くとも４０ヌクレオチド以上の長さをＰＣＲ標的として設計することが技術的な一般常識となっている。そのため、前述のような２５ヌクレオチドからなる配列を標的として、当該配列をＰＣＲにより特異的に増幅し、検出することは極めて困難と考えられていた。

「（別添）安全性審査済みの組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法」、２０１２年１１月１６日、インターネット（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａａ．ｇｏ．ｊｐ／ｆｏｏｄｓ／ｐｄｆ／ｓｙｏｋｕｈｉｎ９６１＿１．ｐｄｆ） Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第４版．Ｐａｒｔ１ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ７ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、第４５６〜４５７ページ、Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版

本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、２５ヌクレオチドからなる極めて短い標的配列を、ＰＣＲにより増幅する方法、及び該方法に用いられるプライマーセットを提供することを目的とする。また、前記方法及びプライマーセットを用いて、ＲＢ近傍配列を検出することにより、アグロバクテリウム法によって作製された遺伝子組換え植物の検出を可能とすることも目的とする。

本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＲＢ近傍配列の５’末端から１３ヌクレオチドからなる部分と同一の配列からなるフォワードプライマーと、ＲＢ近傍配列の３’末端から１２ヌクレオチドからなる部分と相補的な配列からなるリバースプライマー（図２Ａに示す、ＲＢＦ２とＲＢＲ２との組み合わせ）を用いてＰＣＲを行なった場合に、２５ヌクレオチドという極めて短いＲＢ近傍配列を、特異的に増幅できることを見出した。

一方、前記フォワードプライマーよりも３’側を１ヌクレオチド長くし、また前記リバースプライマーよりも３’側を４ヌクレオチド長くし、フォワードプライマーとリバースプライマーとが５ヌクレオチド重なる組み合わせ（図２Ａに示す、ＲＢＦとＲＢＲとの組み合わせ）を用いた場合には、ＲＢ近傍配列を、特異的に増幅することはできなかった。

また、ＲＢ近傍配列において重なりが生じないように設計したフォワードプライマー及びリバースプライマー（１３ヌクレオチドからなるフォワードプライマー及び１２ヌクレオチドからなるリバースプライマー（図２Ａに示す、ＲＢＦとＲＢＲ３との組み合わせ）、１４ヌクレオチドからなるフォワードプライマー及び１１ヌクレオチドからなるリバースプライマー（図２Ａに示す、ＲＢＦ４とＲＢＲ４との組み合わせ）、１５ヌクレオチドからなるフォワードプライマー及び１０ヌクレオチドからなるリバースプライマー（図２Ｂに示す、ＲＢＦ５とＲＢＲ５との組み合わせ）、１１ヌクレオチドからなるフォワードプライマー及び１４ヌクレオチドからなるリバースプライマー（図２Ｂに示す、ＲＢＦ６とＲＢＦ６との組み合わせ）、１０ヌクレオチドからなるフォワードプライマー及び１５ヌクレオチドからなるリバースプライマー（図２Ｂに示す、ＲＢＦ７とＲＢＲ７との組み合わせ））を用いても、前記１２ヌクレオチドからなるフォワードプライマー及び１３ヌクレオチドからなるリバースプライマーを用いた場合とは異なり、ＲＢ近傍配列を増幅することはできなかった。

さらに、前記１２ヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、前記１３ヌクレオチドからなるリバースプライマーよりも５’側が１ヌクレオチド短く、１２ヌクレオチドからなるリバースプライマー（図２Ｃに示す、ＲＢＦ２とＲＢＲ８との組み合わせ）を用いた場合にも、リバースプライマーをたった１ヌクレオチド短くしただけにも関わらず、２４ヌクレオチドとなったＲＢ近傍配列を増幅することはできなかった。

さらにまた、前記ＲＢＦ２及びＲＢＲ８とは別の、１２ヌクレオチドからなるフォワードプライマーと１２ヌクレオチドからなるリバースプライマー（図２Ｃに示す、ＲＢＦ８とＲＢＲ３との組み合わせ）を用いても、２４ヌクレオチドとなったＲＢ近傍配列を増幅することはできなかった。

そして、以上のことから、ＧＭ植物において保存性の高いＲＢ近傍配列を増幅可能なプライマーセットは、前記１２ヌクレオチドからなるフォワードプライマー及び１３ヌクレオチドからなるリバースプライマーの１種類のみであることを見出した。

また、標的ヌクレオチド配列を、ＲＢ近傍配列とは異なる植物の内在性配列に替え、更に鋭意研究を重ねた結果、以下のような条件である場合に、標的配列が２５ヌクレオチドと極めて短くとも、ＰＣＲにて増幅できることを見出し、本発明を完成するに至った。
（１）２５ヌクレオチドからなる標的配列において、グアニン及びシトシンの総数を少なくとも１３ヌクレオチドとする。
（２）フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方の鎖長を１２ヌクレオチドとし、他方の鎖長を１３ヌクレオチドとする。また、各プライマーは、グアニン及びシトシンを少なくとも計５ヌクレオチド含む。

すなわち、本発明は、より具体的には以下を提供するものである。
＜１＞ 標的ヌクレオチド配列を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマーセットであって、
前記標的ヌクレオチド配列は、２５のヌクレオチドからなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計１３ヌクレオチド含む、
下記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される１のプライマーセット
（ａ）前記フォワードプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の５’末端から１２ヌクレオチドからなる部分と同一の配列からなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計５ヌクレオチド含み、
前記リバースプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の３’末端から１３ヌクレオチドからなる部分と相補的な配列からなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計５ヌクレオチド含む、プライマーセット、
（ｂ）前記フォワードプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の５’末端から１３ヌクレオチドからなる部分と同一の配列からなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計５ヌクレオチド含み、
前記リバースプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の３’末端から１２ヌクレオチドからなる部分と相補的な配列からなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計５ヌクレオチド含む、プライマーセット。
＜２＞ 下記（１）〜（１１）の群から選択される、＜１＞に記載のプライマーセット
（１）配列番号：１に記載のヌクレオチド配列からなる、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに由来するＲＢ近傍配列を、前記標的ヌクレオチド配列とする、
配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び
配列番号：１６に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（２）配列番号：３４に記載のヌクレオチド配列からなる大豆レクチン遺伝子由来の配列を、前記標的ヌクレオチド配列とする、
配列番号：３５に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び
配列番号：３６に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（３）配列番号：４２に記載のヌクレオチド配列からなる大豆レクチン遺伝子由来の配列を、前記標的ヌクレオチド配列とする、
配列番号：４３に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び
配列番号：４４に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（４）配列番号：４５に記載のヌクレオチド配列からなる大豆レクチン遺伝子由来の配列を、前記標的ヌクレオチド配列とする、
配列番号：４６に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び
配列番号：４７に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（５）配列番号：４５に記載のヌクレオチド配列からなる大豆レクチン遺伝子由来の配列を、前記標的ヌクレオチド配列とする、
配列番号：４８に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び
配列番号：４９に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（６）配列番号：５３に記載のヌクレオチド配列からなる、大豆レクチン遺伝子由来の配列を、前記標的ヌクレオチド配列とする、
配列番号：５４に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び
配列番号：５５に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（７）配列番号：６２に記載のヌクレオチド配列からなる、トウモロコシスターチシンターゼＩＩｂ遺伝子由来の配列を、前記標的ヌクレオチド配列とする、
配列番号：６３に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び
配列番号：６４に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（８）配列番号：７１に記載のヌクレオチド配列からなる、トウモロコシスターチシンターゼＩＩｂ遺伝子由来の配列を、前記標的ヌクレオチド配列とする、
配列番号：７２に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び
配列番号：７３に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（９）配列番号：７１に記載のヌクレオチド配列からなる、トウモロコシスターチシンターゼＩＩｂ遺伝子由来の配列を、前記標的ヌクレオチド配列とする、
配列番号：７４に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び
配列番号：７５に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（１０）配列番号：７９に記載のヌクレオチド配列からなる、トウモロコシＨＭＧ遺伝子由来の配列を、前記標的ヌクレオチド配列とする、
配列番号：８０に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び
配列番号：８１に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（１１）配列番号：８５に記載のヌクレオチド配列からなる、トウモロコシＨＭＧ遺伝子由来の配列を、前記標的ヌクレオチド配列とする、
配列番号：８６に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び
配列番号：８７に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット。
＜３＞ 試料中の標的ヌクレオチド配列を増幅するための方法であって、
試料中の標的ヌクレオチド配列を鋳型として、＜１＞又は＜２＞に記載のプライマーセットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応により、当該配列を増幅する工程を含む、方法。
＜４＞ 試料中の標的ヌクレオチド配列を検出するための方法であって、
＜３＞に記載の方法により、試料中の標的ヌクレオチド配列を増幅する工程と、
前記工程にて増幅した標的ヌクレオチド配列を検出する工程とを、含む方法。
＜５＞ アグロバクテリウム法によって作製された遺伝子組換え植物を検出する方法であって、
被検植物のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：１６に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーのセットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、
前記ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列からなる、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに由来するＲＢ近傍配列を、検出する工程、
前記工程にて、前記ＲＢ近傍配列の増幅が検出された場合に、前記被検植物を、アグロバクテリウム法によって作製された遺伝子組換え植物であると判定する工程を、
含む方法。

本発明によれば、２５ヌクレオチドからなる極めて短い標的配列を、ＰＣＲにより増幅することが可能となる。また、本発明によれば、上述のＲＢ近傍配列を検出することにより、アグロバクテリウム法によって作製された遺伝子組換え（ＧＭ）植物を検出することも可能となる。

遺伝子組換え（ＧＭ）作物のゲノムＤＮＡに挿入されている、Ｔ−ＤＮＡの末端に位置する右境界配列（ＲＢ）及びその近傍の配列等を、示す概略図である。図中、「ｐＢＩ１０１」は、植物の遺伝子組換えに用いられるバイナリーベクター ＧＵＳ遺伝子ベクターのｐＢＩ１０１のＴ−ＤＮＡ領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ１２６３９）のＲＢ及びその近傍配列（配列番号：３）を示す。ＧＭ作物におけるＲＢ及びその近傍配列に関し、ＭＯＮ８９７８８（ダイズ）由来のものは配列番号：４に示し、ＭＯＮ８７７０１（ダイズ）由来のものは配列番号：５に示し、ＭＯＮ８７７６９（ダイズ）由来のものは配列番号：６に示し、ＭＯＮ８８０１７（トウモロコシ）由来のものは配列番号：７に示し、ＭＩＲ６０４（トウモロコシ）由来のものは配列番号：８に示し、ＭＩＲ１６２（トウモロコシ）由来のものは配列番号：９に示し、３２７２（トウモロコシ）由来のものは配列番号：１０に示し、ＲＴ７３（ナタネ）由来のものは配列番号：１１に示し、５３１（ワタ）由来のものは配列番号：１２に示す。また、枠で囲んである配列は、本発明者らが、前記ＧＭ作物のゲノムＤＮＡにおいて共通して導入されていることを見出した配列（配列番号：１、ＲＢ近傍配列）を示す。下線が引いてある配列は、右境界配列（ＲＢ）を示す。 ＲＢ近傍配列及びその相補鎖と、当該配列をＰＣＲによって増幅するために設計したフォワードプライマー及びリバースプライマーとの位置関係を示す概略図である。ＲＢ近傍配列を配列番号：１に示し、その相補鎖の配列を配列番号：２に示す。ＲＢＦ２の配列を配列番号：１５に示し、ＲＢＲ２の配列を配列番号：１６に示し、ＲＢＦの配列を配列番号：１３に示し、ＲＢＲの配列を配列番号：１４に示し、ＲＢＲ３の配列を配列番号：１７に示し、ＲＢＦ４の配列を配列番号：１８に示し、ＲＢＲ４の配列ＲＢＲの配列を配列番号：１９に示す。 ＲＢ近傍配列及びその相補鎖と、当該配列をＰＣＲによって増幅するために設計したフォワードプライマー及びリバースプライマーとの位置関係を示す概略図である。ＲＢ近傍配列を配列番号：１に示し、その相補鎖の配列を配列番号：２に示す。ＲＢＦ５の配列を配列番号：２０に示し、ＲＢＲ５の配列を配列番号：２１に示し、ＲＢＦ６の配列を配列番号：２２に示し、ＲＢＲ６の配列を配列番号：２４に示し、ＲＢＦ７の配列を配列番号：２５に示し、ＲＢＲ７の配列を配列番号：２５に示す。 ＲＢ近傍配列及びその相補鎖と、当該配列をＰＣＲによって増幅するために設計したフォワードプライマー及びリバースプライマーとの位置関係を示す概略図である。ＲＢ近傍配列を配列番号：１に示し、その相補鎖の配列を配列番号：２に示す。ＲＢＦ２の配列を配列番号：１５に示し、ＲＢＲ８の配列を配列番号：２７に示し、ＲＢＦ８の配列を配列番号：２６に示し、ＲＢＲ３の配列を配列番号：１７に示す。 ＲＢＦ２プライマー及びＲＢＲ２プライマーを用いてＰＣＲ（アニーリング温度：２８℃）を行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中、レーン１及び７は分子量マーカー、レーン２、３、４及び５は、それぞれ、非遺伝子組換え（ｎｏｎ−ＧＭ）大豆、ＧＭ大豆 ＭＯＮ８９７８８、ｎｏｎ−ＧＭトウモロコシ及びＧＭトウモロコシ ＭＩＲ１６２から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン６は陰性コントロール（鋳型ＤＮＡなし）の結果を示す。矢印は目的のバンド（ＲＢ近傍配列）の位置を示す。 ＲＢＦ２プライマー及びＲＢＲ２プライマーを用いてＰＣＲ（アニーリング温度：３８℃）を行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中の標記については、図３Ａと同じである。 ＲＢＦ２プライマー及びＲＢＲ２プライマーを用いてＰＣＲ（アニーリング温度：５２℃）を行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中の標記については、図３Ａと同じである。 ＲＢＦ２プライマー及びＲＢＲ２プライマーを用いてＰＣＲを行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中、レーン１、２、３及び４は、それぞれ、ｎｏｎ−ＧＭ大豆、ＧＭ大豆 ＭＯＮ８９７８８、ｎｏｎ−ＧＭトウモロコシ及びＧＭトウモロコシ ＭＩＲ１６２から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン５は陰性コントロール（鋳型ＤＮＡなし）の結果を示す。レーン６は、目的のバンド（ＲＢ近傍配列）を示すために、ＲＢＦプライマー及びＲＢＲプライマーを用いてＰＣＲを行った結果（陽性コントロール）を示す。 ＲＢＦプライマー及びＲＢＲ３プライマーを用いてＰＣＲを行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中の標記については、図４Ａと同じである。 ＲＢＦ４プライマー及びＲＢＲ４プライマーを用いてＰＣＲを行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中の標記については、図４Ａと同じである。 ＲＢＦ５プライマー及びＲＢＲ５プライマーを用いてＰＣＲを行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中の標記については、図４Ａと同じである。 ＲＢＦ６プライマー及びＲＢＲ６プライマーを用いてＰＣＲを行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中の標記については、図４Ａと同じである。 ＲＢＦ７プライマー及びＲＢＲ７プライマーを用いてＰＣＲを行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中の標記については、図４Ａと同じである。 ＲＢＦ８プライマー及びＲＢＲ８プライマーを用いてＰＣＲを行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中の標記については、図４Ａと同じである。 ＲＢＦ８プライマー及びＲＢＲ２プライマーを用いてＰＣＲを行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中の標記については、図４Ａと同じである。 ＲＢＦ２プライマー及びＲＢＲ２プライマーを用いてＰＣＲを行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中、レーン１はｎｏｎ−ＧＭ大豆から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン２〜９は各々、ＧＭ大豆 ＲＲＳ、Ａ２７０４−１２、ＭＯＮ８９７８８、ＤＰ３０５４２３、ＭＯＮ８７７０１、ＭＯＮ８７７０８、ＭＯＮ８７７０５及びＭＯＮ８７７６９から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン１０、１１及び１２はそれぞれ、イネ、コムギ、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン１３は陰性コントロール（鋳型ＤＮＡなし）の結果を示す、レーン１４は、目的のバンド（ＲＢ近傍配列）を示すために、ＲＢＦプライマー及びＲＢＲプライマーを用いてＰＣＲを行った結果（陽性コントロール）を示す。矢印は、目的のバンド（ＲＢ近傍配列）の位置を示す。 ＲＢＦ２プライマー及びＲＢＲ２プライマーを用いてＰＣＲを行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中、レーン１５はｎｏｎ−ＧＭトウモロコシから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン１６〜３０は各々、ＧＭトウモロコシ ＮＫ６０３、Ｅｖｅｎｔ１７６、Ｔ２５、ＧＡ２１、ＭＯＮ８１０、ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１、ＭＩＲ６０４、ＭＯＮ８８０１７、ＤＡＳ５９１２２、ＭＯＮ８６３、ＭＩＲ１６２、３２７２、ＭＯＮ８９０３４及びＭＯＮ８７４６０から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン３１は陰性コントロール（鋳型ＤＮＡなし）の結果を示し、レーン３２は、目的のバンド（ＲＢ近傍配列）を示すために、ＲＢＦプライマー及びＲＢＲプライマーを用いてＰＣＲを行った結果（陽性コントロール）を示す。矢印は、目的のバンド（ＲＢ近傍配列）の位置を示す。 ＲＢＦ２プライマー及びＲＢＲ２プライマーを用いてＰＣＲを行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中、レーン１はｎｏｎ−ＧＭ大豆から抽出したゲノムＤＮＡのみを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン２はＧＭ大豆 ＲＲＳのゲノムＤＮＡのみを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン３〜６は、ＧＭ大豆 ＭＯＮ８９７８８から抽出したゲノムＤＮＡを０．５％、１．０％、５．０％及び１０．０％の比率になるようｎｏｎ−ＧＭ大豆から抽出したゲノムＤＮＡに混合したものを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン７は、ＧＭ大豆 ＭＯＮ８９７８８から抽出したゲノムＤＮＡのみを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。矢印は、目的のバンド（ＲＢ近傍配列）の位置を示す。 ＲＢＦ２プライマー及びＲＢＲ２プライマーを用いてＰＣＲを行い、アクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す、写真である。図中、レーン８はｎｏｎ−ＧＭトウモロコシから抽出したゲノムＤＮＡのみを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン９はＧＭトウモロコシ ＭＯＮ８１０のゲノムＤＮＡのみを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン１０〜１３は、ＧＭトウモロコシ ＭＩＲ１６２から抽出したゲノムＤＮＡを０．５％、１．０％、５．０％及び１０．０％の比率になるようｎｏｎ−ＧＭトウモロコシから抽出したゲノムＤＮＡに混合したものを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン１４は、ＧＭトウモロコシ ＭＩＲ１６２から抽出したゲノムＤＮＡのみを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン１５は陰性コントロール（鋳型ＤＮＡなし）の結果を示す。矢印は、目的のバンド（ＲＢ近傍配列）の位置を示す。 ＲＢＦ２プライマー及びＲＢＲ２プライマーを用いてＰＣＲを行い、核酸クロマト法により分析した結果を示す、写真である。図中、レーン１はｎｏｎ−ＧＭ大豆から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン２〜９は各々、ＧＭ大豆 ＲＲＳ、Ａ２７０４−１２、ＭＯＮ８９７８８、ＤＰ３０５４２３、ＭＯＮ８７７０１、ＭＯＮ８７７０５、ＭＯＮ８７７０８及びＭＯＮ８７７６９から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン１０、１１及び１２は、それぞれイネ、コムギ、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン１３は陰性コントロール（鋳型ＤＮＡなし）の結果を示し、レーン１４は、目的のバンド（ＲＢ近傍配列）を示すために、ＲＢＦプライマー及びＲＢＲプライマーを用いてＰＣＲを行った結果（陽性コントロール）を示す。 ＲＢＦ２プライマー及びＲＢＲ２プライマーを用いてＰＣＲを行い、核酸クロマト法により分析した結果を示す、写真である。図中、レーン１５はｎｏｎ−ＧＭトウモロコシから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン１６〜３０は各々、ＧＭトウモロコシ ＮＫ６０３、Ｅｖｅｎｔ１７６、Ｔ２５、ＧＡ２１、ＭＯＮ８１０、ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１、ＭＩＲ６０４、ＭＯＮ８８０１７、ＤＡＳ５９１２２、ＭＯＮ８６３、ＭＩＲ１６２、３２７２、ＭＯＮ８９０３４及びＭＯＮ８７４６０から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン３１は陰性コントロール（鋳型ＤＮＡなし）の結果を示し、レーン３２は、目的のバンド（ＲＢ近傍配列）を示すために、ＲＢＦプライマー及びＲＢＲプライマーを用いてＰＣＲを行った結果（陽性コントロール）を示す。 ＲＢＦ２プライマー及びＲＢＲ２プライマーを用いてＰＣＲを行い、核酸クロマト法により分析した結果を示す、写真である。図中、レーン１はｎｏｎ−ＧＭ大豆から抽出したゲノムＤＮＡのみを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン２はＧＭ大豆 ＲＲＳのゲノムＤＮＡのみを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン３〜６は、ＧＭ大豆 ＭＯＮ８９７８８から抽出したゲノムＤＮＡを０．５％、１．０％、５．０％及び１０．０％の比率になるようｎｏｎ−ＧＭ大豆から抽出したゲノムＤＮＡに混合したものを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン７は、ＧＭ大豆 ＭＯＮ８９７８８から抽出したゲノムＤＮＡのみを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン８は陰性コントロール（鋳型ＤＮＡなし）の結果を示す。レーン９は、目的のバンド（ＲＢ近傍配列）を示すために、ＲＢＦプライマー及びＲＢＲプライマーを用いてＰＣＲを行った結果（陽性コントロール）を示す。 ＲＢＦ２プライマー及びＲＢＲ２プライマーを用いてＰＣＲを行い、核酸クロマト法により分析した結果を示す、写真である。図中、レーン１０はｎｏｎ−ＧＭトウモロコシから抽出したゲノムＤＮＡのみを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン１１〜１５は、ＧＭトウモロコシ ＭＩＲ１６２から抽出したゲノムＤＮＡを０．３％、０．５％、１．０％、５．０％及び１０．０％の比率になるようｎｏｎ−ＧＭトウモロコシから抽出したゲノムＤＮＡに混合したものを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン１６は、ＧＭトウモロコシ ＭＩＲ１６２から抽出したゲノムＤＮＡのみを鋳型に用いたＰＣＲの結果を示す。レーン１７は陰性コントロール（鋳型ＤＮＡなし）の結果を示す。レーン１８は、目的のバンド（ＲＢ近傍配列）を示すために、ＲＢＦプライマー及びＲＢＲプライマーを用いてＰＣＲを行った結果（陽性コントロール）を示す。

（プライマーセット）
後述の実施例に示すとおり、本発明者らは、２５ヌクレオチドという極めて短い標的配列（標的ヌクレオチド配列）を、以下に示すプライマーセットであれば、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）によって増幅できることを、見出した。

すなわち、本発明は、
標的ヌクレオチド配列を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマーセットであって、
前記標的ヌクレオチド配列は、２５のヌクレオチドからなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計１３ヌクレオチド含む、
下記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される１のプライマーセット
（ａ）前記フォワードプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の５’末端から１２ヌクレオチドからなる部分と同一の配列からなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計５ヌクレオチド含み、
前記リバースプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の３’末端から１３ヌクレオチドからなる部分と相補的な配列からなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計５ヌクレオチド含む、プライマーセット、
（ｂ）前記フォワードプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の５’末端から１３ヌクレオチドからなる部分と同一の配列からなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計５ヌクレオチド含み、
前記リバースプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の３’末端から１２ヌクレオチドからなる部分と相補的な配列からなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計５ヌクレオチド含む、プライマーセット
を提供する。

本発明において「標的ヌクレオチド配列」は、ＰＣＲによって増幅されるヌクレオチド配列を意味し、２５ヌクレオチドから構成される。標的ヌクレオチド配列におけるグアニン及びシトシンの総数（ＧＣ数）は、少なくとも計１３ヌクレオチドであれば良いが、好ましくは１３〜１８ヌクレオチドであり、より好ましくは１４〜１６ヌクレオチドであり、特に好ましくは１５ヌクレオチドである。

本発明においてプライマーを構成する「ヌクレオチド」は、通常、ＤＮＡ（アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル）であるが、塩基対結合を形成し得る限り、他の天然ヌクレオチド（ＲＮＡ）であってもよく、非天然ヌクレオチド（人工ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ）であってもよい。非天然ヌクレオチドとしては、例えば、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ)、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、モルホリノ核酸、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’−Ｏ−メチル化核酸、２’−ＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチル）化核酸、２’−ＡＰ（２’−Ｏ−アミノプロピル）化核酸、２’−フルオロ化核酸、２’Ｆ‐アラビノ核酸（２'−Ｆ−ＡＮＡ）、ＢＮＡ（ＬＮＡ等の架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が挙げられる。

本発明の「プライマー」は、ＰＣＲにおいて、標的ヌクレオチド配列にアニーリングし、ＤＮＡ複製の起点となるオリゴヌクレオチドであり、１種のヌクレオチドのみ（例えば、ＤＮＡのみ）で構成されるオリゴヌクレオチドであってもよく、複数数のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡとＲＮＡ）から構成されるキメラオリゴヌクレオチドであってもよいが、好ましくはＤＮＡのみから構成されるオリゴヌクレオチドである。

本発明の「フォワードプライマー」は、標的ヌクレオチド配列の５’末端から１２ヌクレオチド又は１３ヌクレオチドからなる部分と同一の配列からなるプライマーである。フォワードプライマーにおけるグアニン及びシトシンの総数（ＧＣ数）は、少なくとも計５ヌクレオチドであれば良いが、好ましくは５〜１０ヌクレオチドであり、より好ましくは６〜９ヌクレオチドであり、さらに好ましくは７〜８ヌクレオチドである。

本発明の「リバースプライマー」は、標的ヌクレオチド配列の３’末端から１３ヌクレオチド又は１２ヌクレオチドからなる部分と相補的な配列からなるプライマーである。リバースプライマーにおけるＧＣ数は、少なくとも計５ヌクレオチドであれば良いが、好ましくは５〜１０ヌクレオチドであり、より好ましくは６〜９ヌクレオチドであり、さらに好ましくは７〜８ヌクレオチドである。

本発明のフォワードプライマー及びリバースプライマーは、一方が１２ヌクレオチドからなる場合、他方は１３ヌクレオチドからなる。すなわち、本発明のフォワードプライマーの配列と、本発明のリバースプライマーに相補的な配列とを繋げると、上述の２５ヌクレオチドからなる標的ヌクレオチド配列そのものとなる。したがって、当該配列の条件は、これらプライマーの条件ともなる。また、これらプライマー間のＴｍ値の差は、特に制限はなく、通常０〜２０℃であるが、標的ヌクレオチド配列におけるＧＣ数が１３の場合、好ましくは０〜１０℃であり、より好ましくは０〜５℃、さらに好ましくは０〜３℃、特に好ましくは０〜１℃である。

本発明のプライマーセットは、上述の条件に合うものであれば、特に制限はないが、例えば、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに由来するＲＢ近傍配列（配列番号：１に記載のヌクレオチド配列）を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：１６に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセットが挙げられる。

大豆レクチン遺伝子を増幅対象とし、当該遺伝子における配列番号：３４に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：３５に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：３６に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（１）が挙げられ、
大豆レクチン遺伝子における配列番号：４２に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：４３に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：４４に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（２）が挙げられ、
大豆レクチン遺伝子における配列番号：４５に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：４６に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：４７に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（３）が挙げられ、
大豆レクチン遺伝子における配列番号：４５に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：４８に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：４９に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（４）が挙げられ、
大豆レクチン遺伝子における配列番号：５３に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：５４に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：５５に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（５）が挙げられ、
大豆レクチン遺伝子における配列番号：２８に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：２９に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：３０に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（６）が挙げられ、
大豆レクチン遺伝子における配列番号：３９に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：４０に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：４１に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（７）が挙げられ、
大豆レクチン遺伝子における配列番号：５０に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：５１に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：５２に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（８）が挙げられる。

これらの中で、より特異性高く大豆レクチン遺伝子における標的ヌクレオチド配列を増幅できるという観点から、プライマーセット（１）〜（５）が好ましい。

トウモロコシスターチシンターゼＩＩｂ遺伝子を増幅対象とし、当該遺伝子における配列番号：６２に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：６３に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：６４に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（９）が挙げられ、
トウモロコシスターチシンターゼＩＩｂ遺伝子における配列番号：７１に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：７２に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：７３に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（１０）が挙げられ、
トウモロコシスターチシンターゼＩＩｂ遺伝子における配列番号：７１に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：７４に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：７５に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（１１）が挙げられ、
トウモロコシスターチシンターゼＩＩｂ遺伝子における配列番号：６５に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：６６に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：６７に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（１２）が挙げられ、
トウモロコシスターチシンターゼＩＩｂ遺伝子における配列番号：６８に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：６９に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：７０に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（１３）が挙げられる。

これらの中で、より特異性高くトウモロコシスターチシンターゼＩＩｂ遺伝子における標的ヌクレオチド配列を増幅できるという観点から、プライマーセット（９）〜（１１）が好ましい。

トウモロコシＨＭＧ遺伝子を増幅対象とし、当該遺伝子における配列番号：７９に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：８０に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：８１に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（１４）が挙げられ、
トウモロコシＨＭＧ遺伝子における配列番号：８５に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：８６に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：８７に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（１５）が挙げられ、
トウモロコシＨＭＧ遺伝子における配列番号：７６に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：７７に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：７８に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（１６）が挙げられ、
トウモロコシＨＭＧ遺伝子における配列番号：８２に記載のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とする場合には、配列番号：８３に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：８４に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、プライマーセット（１７）が挙げられる。

これらの中で、より特異性高くトウモロコシＨＭＧ遺伝子における標的ヌクレオチド配列を増幅できるという観点から、プライマーセット（１４）〜（１５）が好ましい。

本発明のプライマーセットは、当業者であれば公知の方法を適宜選択することにより調製することができる。例えば、標的ヌクレオチド配列の情報に基づいて、フォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド配列を設計し、市販の核酸自動合成機（アプライドバイオシステムズ社製、べックマン社製等）を用いて合成し、次いで、得られるオリゴヌクレオチドを逆相カラム等を用いて精製することにより、フォワードプライマー及びリバースプライマーを調製することができる。

また、本発明のプライマーには、ＰＣＲによる増幅産物を検出等し易くするために、標識物質が結合していてもよい。「標識物質」としては、ヌクレオチドに結合することができ、化学的又は光学的方法に検出できるものであれば特に制限されることはなく、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）等の蛍光蛋白質、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）等の酵素、^１２５Ｉ等の放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の蛍光色素、コロイド状金属、着色ラテックス等の呈色標識物質、アビジン、ビオチン、ＤＩＧ、抗ＤＩＧ抗体が挙げられる。なお、標識物質として酵素を用いる場合には、基質として、発色基質、蛍光基質、あるいは化学発光基質等を添加することにより、基質に応じて種々の検出を行うことができる。また、標識物質の結合は、プライマーを構成するヌクレオチドに直接結合していてもよく、他の物質を介して間接的に結合していてもよい。

（標的ヌクレオチド配列の増幅及び検出方法）
本発明は、試料中の標的ヌクレオチド配列を鋳型として、前述のプライマーセットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、当該配列を増幅する工程を含む、方法（試料中の標的ヌクレオチド配列の増幅方法）を提供する。

また、本発明は、前記方法にて試料中の標的ヌクレオチド配列を増幅する工程と、当該工程にて増幅した標的ヌクレオチド配列を検出する工程とを、含む方法（試料中の標的ヌクレオチド配列の検出方法）も提供する。

本発明において、「試料」は、標的ヌクレオチド配列を含有し得る限り、特に制限はないが、例えば、植物、動物のような生体（組織、細胞等）、培養細胞、食品、環境（土壌、排水等）等から単離されるヌクレオチドである。これらからＰＣＲに供するヌクレオチドの単離は、任意の方法で行うことができ、例えば、界面活性剤（ＣＴＡＢ等）による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌及びフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。ヌクレオチドの精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離等により実施することが可能である。より具体的に、ＰＣＲに供する試料としては、前記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖核酸、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖核酸が挙げられる。

本発明において「鋳型」とは、ＰＣＲにおける相補鎖合成の基となる側のヌクレオチドを意味する。鋳型に相補的な配列を持つ相補鎖は、鋳型に対応する鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。また、本発明において増幅又は検出の対象となる「標的ヌクレオチド配列」には、当該配列のみならず、該配列の相補鎖も含まれる。

本発明において「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」は、温度変化を繰り返すことにより、標的ヌクレオチド配列を増幅させることができる。より具体的には、フォワードプライマー及びリバースプライマーを標的ヌクレオチド配列にアニーリングさせるための工程、次いで、前記プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行う工程、当該工程によって合成された標的ヌクレオチド配列を含む二本鎖を熱変性により解離させ一本鎖とする工程、これら三工程からなるサイクルで、ＰＣＲは構成される。

アニーリング工程における温度としては、前記アニーリングが生じ、維持できる温度であれば特に制限はなく、非特異的な増幅産物を抑制するという観点から、好ましくは２５〜６５℃であるが、より好ましくは３５〜６０℃であり、さらに好ましくは４５〜５５℃であり、特に好ましくは５２℃である。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１〜６０秒間、より好ましくは１０〜５０秒間、さらに好ましくは２０〜４０秒間であり、特に好ましくは３０秒間である。また、アニーリング温度はすべてのサイクルで同一温度であっても良いし、異なっていても良い。

伸長工程における温度としては、相補鎖が合成できる温度であれば特に制限はなく、通常５０〜８０℃であるが、好ましくは６５〜７５℃であり、特に好ましくは７２℃である。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１〜６０秒間、より好ましくは５〜４０秒間、さらに好ましくは１０〜２０秒間であり、特に好ましくは１５秒間である。また、アニーリング温度はすべてのサイクルで同一温度であっても良いし、異なっていても良い。アニーリング温度は伸長反応温度と同一温度であってもよいが、伸長反応温度よりも高く設定することはしない。

熱変性工程における温度としては、二本鎖を解離できる温度であれば特に制限はなく、通常８０〜１００℃であるが、好ましくは９０〜９８℃であり、特に好ましくは９５℃である。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１〜３０秒間、より好ましくは１〜２０秒間、さらに好ましくは１〜１０秒間であり、特に好ましくは５秒間である。また、アニーリング温度はすべてのサイクルで同一温度であっても良いし、異なっていても良い。アニーリング温度は伸長反応温度と同一温度であってもよいが、伸長反応温度よりも高く設定することはしない。

ＰＣＲにおいて、サイクル数は、後述の方法において検出できる程度に標的ヌクレオチド配列を増幅できる限り特に制限はないが、通常１０〜５０サイクルであり、好ましくは２０〜４０サイクルであり、より好ましくは３５サイクルである。

このようなＰＣＲにおける反応液には、ＰＣＲを行うために必須な組成が含まれていれば、その組成は特に限定されない。すなわち、反応液には、ＤＮＡを増幅するために必要な組成を含んでいれば良い。すなわち、反応液に含まれるものとしては、例えば、上述のプライマーセット及び後述のＤＮＡポリメラーゼの他、ｄＮＴＰ等の基質、２価イオン（例えば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン）及び１価イオン（例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン）、又はそれらを供するための塩（例えば、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム）及び緩衝液（例えば、トリス塩酸バッファー、リン酸バッファー）が挙げられる。また、本発明にかかるＰＣＲ反応液には、これらに加え、有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、アセトン）、有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、安息香酸）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、トリプトファン）、糖（例えば、グルコース、キシロース、ガラクトース）、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ＤＮＡ結合タンパク質等を、添加剤として含んでいてもよい。

ＰＣＲに用いられる「ＤＮＡポリメラーゼ」としては、標的ヌクレオチド配列に対してＤＮＡからなる相補鎖を合成する活性を有するもの（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）であればよく、常温性、中温姓、耐熱性のものであっても用いることができるが、好ましくは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限はなく、５’→３’エクソヌクレアーゼ活性、３’→５’エクソヌクレアーゼ活性（校正活性）及びＴｄＴ活性のうちの少なくとも１の活性を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。５’→３’エクソヌクレアーゼ活性及びＴｄＴ活性を有するポリメラーゼとしては、Ｐｏｌ型ＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、より具体的にはＴａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼが挙げられる。校正活性を有するポリメラーゼとしては、α型ＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、より具体的にはＰｆｕポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼが挙げられる。また、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼには、天然型ポリメラーゼに限らず、人工的に改変されたポリメラーゼも含まれる。ＤＮＡポリメラーゼの改変体としては、例えば、校正活性が付加されたＴａｑポリメラーゼ（ＥｘＴａｑポリメラーゼ）が挙げられる。

これらの中で、本発明にかかるＤＮＡポリメラーゼとして、好ましくは、５’→３’エクソヌクレアーゼ活性及び３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、具体的には、ＥｘＴａｑポリメラーゼが挙げられる。また、ＰＣＲにおいて、これら両活性は、複数種のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｏｌ型ＤＮＡポリメラーゼとα型ＤＮＡポリメラーゼ）を混合して用いることによっても奏することができる。

本発明において、ＰＣＲにより増幅された標的ヌクレオチド配列の検出は、公知の手法を適宜用いることによって、当業者であれば行なうことができる、公知の手法としては、電気泳動法（例えば、アクリルアミドゲルに増幅産物を展開する電気泳動法）、核酸クロマト法（例えば、ＴＢＡ社のＳＴＨ法）、インターカレーション法、クエンチャー媒介蛍光検出法が挙げられる。

（標的ヌクレオチド配列を増幅又は検出するためのキット）
本発明は、上述のプライマーセットを含む、標的ヌクレオチド配列を増幅又は検出するためのキットをも提供し得る。当該キットには、上述のＤＮＡポリメラーゼ、及びその他のＰＣＲ反応液の組成（基質（ｄＮＴＰ）、前記イオン又はそれらを供するための塩、緩衝液、添加剤）及び当該キットの使用説明書が含まれる。また、本発明のプライマーに標識物質を結合している場合には、当該標識物質を検出するための基質も前記キットに含まれ得る。また、検出方法によっては、ＰＣＲによる増幅産物を展開するための担体（例えば、電気泳動方法におけるポリアクリルアミドゲル、核酸クロマト法におけるクロマト用試験紙）及び溶媒、蛍光物質（例えば、インターカレーション法におけるインターカレーター）、クエンチャー媒介蛍光検出法における蛍光物質及び消光物質が結合したプローブも、前記キットに適宜含まれる。さらに、増幅された標的ヌクレオチド配列を確認するための、ＤＮＡ分子量マーカー及び陽性コントロールも、前記キットに含めてもよい。

（遺伝子組換え植物の検出方法）
後述の実施例において示すとおり、本発明者らによって、アグロバクテリウム法によって作製された遺伝子組換え植物のゲノムＤＮＡにおいて、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに由来するＲＢ近傍配列（配列番号：１に記載のヌクレオチド配列）が共通して挿入されていることが明らかになった。さらに、この２５ヌクレオチドからなる極めて短いＲＢ近傍配列を、配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：１６に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーのセットを用いたＰＣＲにより検出できることも、本発明者らは見出した。

したがって、本発明は、
アグロバクテリウム法によって作製された遺伝子組換え植物を検出する方法であって、
被検植物のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：１６に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーのセットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、
前記ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列からなる、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに由来するＲＢ近傍配列を、検出する工程、
前記工程にて、前記ＲＢ近傍配列の増幅が検出された場合に、前記被検植物を、アグロバクテリウム法によって作製された遺伝子組換え植物であると判定する工程を、
含む方法をも、提供する。

「被検植物」としては、遺伝子組換え植物である可能性のある植物、又は遺伝子組換え植物が混入している可能性のあるものであればよく、特に制限はないが、大豆、とうもろこし、ジャガイモ（ばれいしょ）、なたね、綿、アルファルファ、てん菜、パパイヤが挙げられる。本発明の方法に供されるゲノムＤＮＡの調製方法としては、上述の（標的ヌクレオチド配列の増幅及び検出方法）にて示したとおりであるが、ゲノムＤＮＡの抽出対象としては、特に制限はなく、例えば、被検植物の種子、実、葉、茎、根が挙げられる。

また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びＰＣＲによって得られた増幅産物の検出方法としても上述の（標的ヌクレオチド配列の増幅及び検出方法）にて示したとおりであり、これら方法の実施工程を経て、前記ＲＢ近傍配列の増幅が検出された場合に、前記被検植物を、アグロバクテリウム法によって作製された遺伝子組換え植物であると判定される。

本発明の方法において判定される「アグロバクテリウム法によって作製された遺伝子組換え植物」としては、好ましくは、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列からなるアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに由来するＲＢ近傍配列が、ゲノムＤＮＡに挿入されている遺伝子組換え植物であり、具体的には、ＭＯＮ８９７８８、ＭＯＮ８７７０１、ＭＯＮ８７７０８及びＭＯＮ８７７６９等の遺伝子組換え大豆、ＭＩＲ１６２、ＭＩＲ６０４、ＭＯＮ８８０１７、ＤＡＳ５９１２２及び３２７２等の遺伝子組換えトウモロコシが挙げられる。

また、本発明の遺伝子組換え植物の検出方法は、ゲノム編集において、遺伝子組換えの痕跡が消去された植物を確認するための方法にも応用することができる。すなわち、ゲノム編集においては、標的遺伝子を改変するために、アグロバクテリウム法により、その編集系（ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ等）をコードする外来ＤＮＡが、植物のゲノムＤＮＡに組み込まれる。そして、前記編集系により標的遺伝子に変異が導入された後、通常、前記外来ＤＮＡは、野生型植物との交配や、Ｃｒｅ−ｌｏｘｐ等を用いることによって、前記ゲノムＤＮＡから除去される。この除去（遺伝子組換え痕跡の消去）を確認するためにも、本発明の遺伝子組換え植物の検出方法にも好適に用いられる。

以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、実施例及び比較例は、以下に示す材料と方法を用いて行なった。

（材料と方法）
１．植物種子
日本において、安全性審査を経た旨の公表がなされているＧＭ作物のうち、ＧＭ大豆８系統：ＲＲＳ、Ａ２７０４−１２、ＭＯＮ８９７８８、ＤＰ３０５４２３、ＭＯＮ８７７０１、ＭＯＮ８７７０５、ＭＯＮ８７７０８、ＭＯＮ８７７６９、及び、ＧＭトウモロコシ１５系統：ＮＫ６０３、Ｅｖｅｎｔ１７６、Ｔ２５、ＧＡ２１、ＭＯＮ８１０、ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１、ＭＩＲ６０４、ＭＯＮ８８０１７、ＤＡＳ５９１２２、ＭＯＮ８６３、ＭＩＲ１６２、３２７２、ＭＯＮ８９０３４、ＭＯＮ８７４６０を、以下の実験に供した。

２．ＤＮＡ抽出
大豆及びトウモロコシのゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出した。抽出法は、消費者庁マニュアルに従った（非特許文献２ 「（別添）安全性審査済みの組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法」 参照）。また、抽出ＤＮＡの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ 超微量分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｃｉｆｃ社製）を用いて２６０ｎｍの吸光度を元に定量した。抽出ＤＮＡは５０ｎｇ／μＬに調製し、１００ｎｇをＰＣＲ分析の鋳型として用いた。

３．疑似ＧＭ作物混入試料の調製
各ＧＭ大豆及びトウモロコシの擬似ＧＭ作物混入試料は、それぞれの抽出ＤＮＡを、同じ濃度の非遺伝子組換え（Ｎｏｎ−ＧＭ）大豆及びトウモロコシの抽出ＤＮＡで希釈することにより調製した。具体的には、ＧＭ大豆及びＧＭトウモロコシの抽出ＤＮＡと、Ｎｏｎ−ＧＭ大豆及びＮｏｎ−ＧＭトウモロコシの抽出ＤＮＡとを、同じ濃度になるよう調整し、各々抽出ＤＮＡ溶液の体積比を変えて混合することによって各濃度の擬似混入試料を調製した。

４．ＰＣＲ及び電気泳動による検出
下記表１〜４に示すＰＣＲプライマー用配列を設計し、当該配列に基づき、株式会社ファスマックにて、プライマー用オリゴＤＮＡを合成した。

そして、リアルタイムＰＣＲ用試薬（商品名：ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＩＩ、タカラ社製）１０μＬに、対象プライマーセット溶液（各プライマー終濃度；０．３μＭ）を混合し、更に前記鋳型ＤＮＡを添加し、全量２０μＬのＰＣＲ反応液を調製した。

前記ＰＣＲ反応液をＰＣＲ装置にセットし、９５℃、３０秒間の変性処理の後、９５℃にて５秒間、２８〜５２℃にて３０秒間及び７２℃にて１５秒間を１サイクルとして、３５サイクルの増幅反応を行った。なお、ＰＣＲ装置には、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｃｉｆｃ社のＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９７００を用いた。

なお、陰性コントロールとして、鋳型ＤＮＡを添加しないで前記ＰＣＲを行い（Ｎｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＮＴＣ）、また目的とするＲＢ近傍配列由来のバンド（増幅産物）の位置を示すための陽性コントロールとして、後述のＲＢＦ及びＲＢＲのプライマーセットを用い、前記ＰＣＲを行なった。

得られたＰＣＲ増幅産物については、反応液２０μＬ中１０μＬを１２％アクリルアミドゲルで電気泳動した。また、分子量マーカーとして、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｃｉｆｃ社製）を併せて電気泳動した。次いで、核酸染色液（製品名：Ｇｅｌ Ｒｅｄ、富士フイルム和光純薬社製）を用い、ゲル中の核酸バンドを染色し、検出した。

５．核酸クロマトによる検出
ＰＣＲ増幅産物を、核酸クロマト（ＳＴＨ（Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔａｇ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ））によっても検出した。ＳＴＨ法においては、ビオチンにて標識したプライマーと、シングルタグＤＮＡを付加したプライマーとにより、標的ヌクレオチド配列をＰＣＲにより増幅する。その増幅液をアビジンコートラテックス（青色）と混合してメンブレンストリップに展開した場合、ライン状に固相化された相補タグＤＮＡと前記シングルタグＤＮＡとの強いハイブリダイゼーション反応により、ＰＣＲ増幅産物はトラップされる。トラップされたラテックス標識ＰＣＲ増幅産物にてラインが青色になることによって、検体中の標的ヌクレオチド配列の有無を目視判別することが可能となる。

本実施例においては、ＲＢ近傍配列検出用プライマーの組み合わせとして、前記ＲＢＦ２の５’端にシングルタグＤＮＡ（Ｆ１タグ）を付加したオリゴＤＮＡ、及び前記ＲＢＲ２の５’端にビオチンを標識したオリゴＤＮＡからなるプライマーセット、又は前記ＲＢＦの５’端にシングルタグＤＮＡ（Ｆ２タグ）を付加したオリゴＤＮＡ、及び前記ＲＢＲプライマーの５’端にビオチンを標識したプライマーセットを用いた。なお、これらプライマーにおけるタグＤＮＡの付加及びビオチン標識は、株式会社ＴＢＡにて行なった。

そして、これらプライマーセットを用い、「４．ＰＣＲ及び電気泳動による検出」に記載の条件にてＰＣＲ反応を行った。次いで、反応後の溶液２０μＬのうち１μＬと、展開溶液１０μＬ及びラテックス溶液１μＬとを混合し、全量２０μＬ（塩濃度：７０ｍＭ）に調製して、クロマト展開に供した。クロマト展開は、核酸クロマト用ストリップ（製品名：Ｃ−ＰＡＳ４（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｐｒｉｎｔｅｄ−Ａｒｒａｙ ｓｔｒｉｐ４）、株式会社ＴＢＡ製）を用い、当該会社のマニュアルに従って行なった。

（実施例１） プライマーの配列及びＰＣＲの条件についての検討
既存のＧＭ作物を効率的に検知するために、さらには増え続けるＧＭ作物を漏れなく検知するために、ＧＭ作物に共通する配列を標的として検出するスクリーニング法が有効である。また現在、世界で最も広く用いられているＧＭ植物作出技術は、アグロバクテリウム法であり、当該方法において、Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域が植物の核ゲノムに挿入される。したがって、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに由来する配列は、ＧＭ検知の際には極めて有効な標的配列になり得ると考えられる。

そこで、ＧＭ植物のゲノムＤＮＡに共通して挿入されるＴ−ＤＮＡ由来の配列を同定すべく、各種ＧＭ作物について、特許情報及びインターネットのデータベース等から、アグロバクテリウム法によって作出されたＧＭ作物ゲノムＤＮＡに挿入されたＴ−ＤＮＡ領域由来の配列情報を入手し、アライメント解析を行った（ＧＭＯ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ Ｄａｔａｂａｓｅ （ＧＭＤＤ） ｈｔｔｐ：／／ｇｍｄｄ．ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／、ＷＯ２００９／０６４６５２Ａ１、ＷＯ２００７／１４２８４０Ａ２ 参照）。

その結果、図１に示すとおり、確認可能な全てのＲＢを含む５’側ボーダー配列において完全に保存されていた配列は、２５ヌクレオチドからなるＲＢ近傍配列のみであった。また、当該配列は、ＧＭ大豆やトウモロコシのみならず、ナタネやワタ等、様々なＧＭ作物に保存されていることも明らかになった。

しかしながら、ＰＣＲに関しては、既に様々な教科書的実験プロトコールが存在しており、その代表例である、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇには、プライマーの長さは通常２０〜２５ヌクレオチドと記載されており、さらに、１８ヌクレオチド未満の長さのプライマーを用いた場合には、鋳型ＤＮＡとの間で非特異的な結合を起こす傾向があると記載されている。すなわち、ＰＣＲにおいて、フォワードプライマー２０ヌクレオチド程度とリバースプライマー２０ヌクレオチド程度、さらに、プライマー間に少なくとも数ヌクレオチドのスペースを入れるため、短くとも４０ヌクレオチド以上の長さをＰＣＲの標的として設計することが技術的な一般常識となっている。

すなわち、前述のような２５ヌクレオチドからなる配列を標的として、当該配列を特異的に検出するということは極めて困難と考えられ、また前例のないことであった。そこで、前記２５ヌクレオチドからなるＲＢ近傍配列を、ＰＣＲによって検出可能か否かにつき、鋭意検討を行なった。

具体的には、先ず、ＲＢ近傍配列を検出するために、２５ヌクレオチドからなる当該配列を標的とする、１３ヌクレオチドからなるフォワードプライマー（表１及び図２Ａに示す、ＲＢＦ）と、当該プライマーと５ヌクレオチド（ＧＡＡＡＣ）が重なり、１７ヌクレオチドからなるリバースプライマー（表１及び図２Ａに示す、ＲＢＲ）とを用いたＰＣＲにより、前記標的配列を特異的に増幅できるかどうかについて検討を行った。なお、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとしては、前記ＲＢ近傍配列を有することが既に明らかとなっているＧＭ大豆ＭＯＮ８９７８８又はＧＭトウモロコシＭＩＲ１６２のゲノムＤＮＡを用いた。

その結果、データには示さないが、このプライマーセットを用いてＰＣＲを行なった結果、２５ｂｐの位置にクリアにバンドが検出されたものの、鋳型ＤＮＡを含有していない反応溶液（ＮＴＣ）からも増幅産物が検出され、当該プライマーセットを用いたプライマーセットでは、前記標的配列を特異的に増幅できないということが明らかになった（なお、鋳型ＤＮＡ依存的に増幅しなかったが、２５ｂｐの位置にクリアにバンドが検出されたため、以下の実験にて、ＲＢＦ及びＲＢＲのプライマーセットを用いて得られた増幅産物を、陽性コントロールとして用いた）。

次に、２５ヌクレオチドからなる前記配列を標的とする、１２ヌクレオチドからなるフォワードプライマー（表１及び及び図２Ａに示す「ＲＢＦ２」）と、当該プライマーと重ならず、１３ヌクレオチドからなるリバースプライマー（表１及び図２Ａに示す「ＲＢＲ２」）とを用い、前記標的配列を特異的に増幅できるかどうかについて検討を行った。

その結果、図３Ａ〜Ｃに示すとおり、上述の５ヌクレオチド重なり合うプライマーセットを用いた場合とは異なり、前記１２ヌクレオチド及び１３ヌクレオチドからなるプライマーのセットを用い、ＮＴＣ及び非ＧＭ植物由来のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった場合には、２５ヌクレオチドの位置に標的配列の増幅を示すバンドは認められなかった。一方、ＧＭ植物由来のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった場合には、当該バンドが認められ、前記１２ヌクレオチド及び１３ヌクレオチドからなるプライマーセットを用いた場合には、標的配列を特異的に検出できることが明らかになった。

また、一般的に、ＰＣＲのアニーリング温度は、使用するプライマーのｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｔｍ）値を参考に決定され、プライマーのＴｍ値が異なる場合は、低い方の数値をアニーリング温度として利用することが推奨されている（中山弘樹、バイオ実験イラストレイテッド ３本当に増えるＰＣＲ、秀潤社、１９９６年６月発行）。ＲＢＦ２及びＲＢＲ２のＴｍ値は、ＧＣ法では、それぞれ２８．９℃及び２８．１℃であった（陽イオン濃度を６０ｍＭとして得られた計算値）。

そこで、図３Ａ〜Ｃに示すとおり、これらのうち低い方にアニーリング温度を設定し、ＰＣＲを行ったところ、２５ｂｐの位置にバンドが検出されたものの、目的のバンドは薄く、さらに、高分子側に非特異的なバンドが目立った。一方、アニーリング温度を少しずつ上げていったところ５２℃で非特異的バンドはほとんど見えなくなり、クリアに目的の２５ｂｐのバンドが検出されることを見出した。アニーリング温度を５２℃からさらに上昇させたところ、２５ｂｐのバンドが極端に薄くなる傾向が見られたことから（データは示さず）、本検出法においては、アニーリングの最適温度は５２℃と決定した。

（比較例１） プライマー配列についての検討２
前述のとおり、標的配列において、フォワードプライマーとリバースプライマーとを重なりを生じさせず配置し、これらプライマーのヌクレオチドの合計数が当該標的配列と同じ（２５ヌクレオチド）になるように設計したプライマーセットを用いた結果、前記標的配列を、２５ヌクレオチドという短さにも関わらず特異的に増幅することができた。

そこで、プライマーセットにおけるヌクレオチドの合計数は２５ヌクレオチドとしたまま、各プライマーの長さを変更し、前記標的配列を特異的に増幅できるかどうかを検証した。具体的には、２５ヌクレオチドからなる標的配列に対し、フォワードプライマーとリバースプライマーが、それぞれ、１３ヌクレオチド（ＲＢＦ）と１２ヌクレオチド（ＲＢＲ３）、１４ヌクレオチド（ＲＢＦ４）と１１ヌクレオチド（ＲＢＲ４）、１５ヌクレオチド（ＲＢＦ５）と１０ヌクレオチド（ＲＢＲ５）、１１ヌクレオチド（ＲＢＦ６）と１４ヌクレオチド（ＲＢＲ６）、１０ヌクレオチド（ＲＢＦ７）と１５ヌクレオチド（ＲＢＲ７）となるように設計し、検討を行った。なお、これらプライマーの配列については、表１、並びに図２Ａ及びＢ 参照のほど。

しかしながら、図４Ｂ〜Ｆに示すとおり、いずれのプライマーセットを用いた場合においても、標的配列を特異的に検出することはできなかった。

また、前記標的配列を１ヌクレオチド短く２４ヌクレオチドとし、当該配列を、１２ヌクレオチドからなるＦｏｒｗａｒｄプライマーと１２ヌクレオチドからなるＲｅｖｅｒｓｅプライマー（ＲＢＦ２とＲＢＲ８、ＲＢＦ８とＲＢＲ３）を用い、特異的に増幅・検出することを試みた、なお、これらプライマーの配列については、表１及び図２Ｃ 参照のほど。

しかしながら、図４Ｇ及びＨに示すとおり、いずれのプライマーセットを用いた場合においても、目的の位置にバンドは認められず、標的配列を特異的に検出することはできなかった。

以上の結果から、ＲＢ近傍配列を検出可能なプライマーセットは、ＲＢＦ２及びＲＢＲ２のみの組み合わせであることが強く示唆された。とくに、ＲＢＲ８は、ＲＢＲ２の５’末端のグアニン（Ｇ）１ヌクレオチドを短くしただけであるにも関わらず、ＲＢＦ２との組み合わせでＰＣＲ産物の増幅が見られなかった。

（実施例２） ＲＢ近傍配列検出法の特異性についての確認
上述のとおり、１２ヌクレオチドからなるフォワードプライマー（ＲＢＦ２）と、当該プライマーと重ならず、１３ヌクレオチドからなるリバースプライマー（ＲＢＲ２）とを用いることによって、Ｔ−ＤＮＡのＲＢ近傍配列を有することが既に明らかとなっているＧＭ大豆 ＭＯＮ８９７８８及びＧＭトウモロコシ ＭＩＲ１６２を検知することができた。

そこで、他のＧＭ作物についても、ＲＢＦ２及びＲＢＲ２のプライマーセットを用いたＰＣＲ（「ＲＢ近傍配列検出法」とも称する）によって、検知することができるかどうかを検討した。

その結果、図５Ａ及びＢに示すとおり、アグロバクテリウム法で作出されたことが明らかとなっているＧＭ大豆 ＭＯＮ８７７０１、ＭＯＮ８７７０８及びＭＯＮ８７７６９、並びにＧＭトウモロコシ ＭＩＲ６０４、ＭＯＮ８８０１７、ＤＡＳ５９１２２及び３２７２に関し、目的の位置にバンドが認められた。

一方、アグロバクテリウム法で作出されたＭＯＮ８７７０５、ＭＯＮ８９０３４及びＭＯＮ８７４６０については、目的とするバンドの増幅は認められなかった。しかしながら、これらのＧＭ大豆及びトウモロコシについて、本発明者らが、特許情報（ＷＯ２０１０／０３７０１６Ａ１、ＷＯ２００７／１４０２５６Ａ１、ＷＯ２００９／１１１２６３Ａ１）等を参考に５’側ボーダー付近の配列を確認したが、前記ＲＢ近傍配列は見当たらなかった。すなわち、これら３種類のＧＭ作物は、アグロバクテリウム法で作出されてはいるが、前記ＲＢ近傍配列を有しておらず、そのため増幅しなかった可能性が高いと考えられる。

さらに、パーティクルガン法やエレクトロポレーション法等、アグロバクテリウム法以外の方法で作出されたＧＭ大豆 ＲＲＳ、Ａ２７０４−１２及びＤＰ３０５４２３、並びにＧＭトウモロコシ ＮＫ６０３、Ｅｖｅｎｔ１７６、Ｔ２５、ＧＡ２１、ＭＯＮ８１０、ＴＣ１５０７、Ｂｔ１１及びＭＯＮ８６３においては、目的とするバンドの増幅は認められなかった。

以上の結果から、前記１２ヌクレオチドからなるフォワードプライマー（ＲＢＦ２）及び前記１３ヌクレオチドからなるリバースプライマー（ＲＢＲ２）を用いたＰＣＲによって、前記２５ヌクレオチドからなるＲＢ近傍配列を特異的に検出できることが明らかになった。

また、当該ＰＣＲによって検知することができたＧＭ大豆及びＧＭトウモロコシのうち、ＭＯＮ８９７８８、ＭＯＮ８７７０１、ＭＯＮ８７７０８、ＭＯＮ８７７６９、ＭＩＲ１６２、ＭＩＲ６０４及び３２７２は、消費者庁マニュアルでＧＭ作物のスクリーニング検知に利用されているＰ３５Ｓ配列を有していない。さらに、Ｐ３５Ｓと並んでスクリーニング目的で利用されるアグロバクテリウムのｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子のｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（ＴＮＯＳ）（非特許文献２ 「（別添）安全性審査済みの組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法」 参照）を、ＭＩＲ１６２、ＭＩＲ６０４及び３２７２は有しているが、他のＧＭ大豆４系統は有していない。また、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍのｒｉｂｕｌｏｓｅ １，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ遺伝子の ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（ｔＥ９）（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９８４年、３，１６７１〜１６７９ページ 参照）は、モンサント社のＧＭ大豆に利用されていることが多く、上記ＧＭ大豆のうち、ＭＯＮ８９７８８、ＭＯＮ８７７０８、ＭＯＮ８７７６９は有しているが、それ以外の４系統はｔＥ９を有していない（Ｔａｋａｂａｔａｋｅ， Ｒ．ら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１８年、２５２，３９０〜３９６ページ 参照）。すなわち、既存のスクリーニング的アプローチによって、これら７系統全てを検出することは困難である。一方、本発明の方法によれば、上述のとおり、いずれの系統も検知することができ、当該方法がＧＭ食物の検知において有用であることが示唆される。

（実施例３） ＲＢ近傍配列検出法における検出下限についての検証
ＧＭ検査においては、微量混入したＤＮＡを検出対象とする場合が少なくない。食品表示に関わる安全性審査済みのＧＭ大豆及びＧＭトウモロコシにおいては、適切な分別生産流通管理がなされており、かつ５％までの混入であれば、組換えに関する表示が免除される。そこで、ＭＯＮ８９７８８及びＭＩＲ１６２を０．５、１．０、５．０、１０．０％及び１００％含む試料を調製し、ＲＢ近傍配列検出法による検出の可否を検証した。

その結果、図６Ａ及びＢに示すとおり、ＭＯＮ８９７８８、ＭＩＲ１６２共に、基準値の１／１０にあたる０．５％以上の混入であれば検出可能であることが示された。したがって、本発明のＲＢ近傍配列検出法の検出下限は、ＧＭ大豆、トウモロコシ共に０．５％以下であることが明らかになった。

（実施例４） 核酸クロマトによるＲＢ近傍配列の検出
本発明のＲＢ近傍配列検出法の簡易化のために、核酸クロマト（ＴＢＡ社のＳＴＨ法（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔ−ｂｉｏａｒｒａｙ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ 参照））でも検出できることを確認した。

なお、ＳＴＨ法（ＳＴＨ Ｃ−ＰＡＳシステム）において、５’側にビオチン分子を付加したプライマーと、タグ配列と呼ばれる特殊なヌクレオチド配列を付加したプライマーのセット、さらに、核酸クロマト用試験紙（Ｃ−ＰＡＳ）を用いる。当該プライマーセットでＰＣＲを行うと、ＰＣＲ産物の両端はビオチン分子及びタグ配列が付加された状態で増幅する。Ｃ−ＰＡＳメンブレン上の所定の位置には、タグ配列と相補的な配列を有するＤＮＡが固相化されており、ＰＣＲ産物をクロマト展開すると、タグＤＮＡと相補タグＤＮＡのハイブリダイゼーション反応によって、ＰＣＲ増幅産物はトラップされる。さらに、ラテックス標識されたアビジンビースを用いることによって、電気泳動やＤＮＡ染色を用いずに標的ＤＮＡの有無を目視にて判別することが可能となる。

そこで、ＲＢＦ２及びＲＢＲ２をそれぞれタグ配列（Ｆ１）及びビオチン分子で標識し、これらプライマーセットを用いたＳＴＨ法により、ＲＢ近傍配列を検出できることを確認した。

その結果、図７Ａ及びＢに示すとおり、上記アクリルアミド電気泳動を用いた検出法と同じく、ＳＴＨ法によってもＧＭ作物を特異的に検知することができた。また、ＳＴＨ法における検出下限を検証したところ、図８Ａ及びＢに示すとおり、アクリルアミドゲル電気泳動を用いた場合と同様に、ＧＭ大豆、ＧＭトウモロコシ共に、０．５％以下まで検出可能であることが示された。

（実施例５） ＲＢ近傍配列以外への２５ヌクレオチドＰＣＲの適用性の検討（２５ヌクレオチドＰＣＲの一般化）
上述のとおり、２５ヌクレオチドという極めて短いＲＢ近傍配列をＰＣＲにて検出するができた。しかしながら、そもそも、ＲＢ近傍配列に限らず、このような短い配列をＰＣＲによって検出可能か否か検討された例はほとんど存在しない。

そこで、ゲノムＤＮＡを鋳型に用いた２５ヌクレオチドからなる配列を標的とするＰＣＲ（「２５ヌクレオチドＰＣＲ」とも称する）が、ＲＢ近傍配列以外のヌクレオチド配列にも適用可能か（２５ヌクレオチドを標的とするＰＣＲの一般化が可能か）について検討した。

なお、ＧＭ検知を実施する際には、組換えＤＮＡのみを標的にするのではなく、その作物種特異的内在性配列を同時検出することが一般的である。このような陽性コントロールによって、使用する試薬や機器を含むＰＣＲの反応系が正常に機能していることが確認可能となる。内在性配列として、消費者庁マニュアルには、大豆に関してはレクチン遺伝子（Ｌｅ１）（Ｖｏｄｋｉｎ Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ、１９８３年、３４，１０２３〜１０３１ページ 参照）、トウモロコシに関してはスターチシンターゼＩＩｂ（ＳＳＩＩｂ）（
Ｈａｒｎ，Ｃ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９８年、３７，６３９〜６４９ページ 参照）が記載されている。また、トウモロコシの内在性配列としては、ＨＭＧ（Ｋｒｅｃｈ，Ａ．Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ、１９９９年、２３４，４５〜５０ページ 参照）も海外の検査法においてよく利用されている。そこで、これらＬｅ１、ＳＳＩＩｂ及びＨＭＧ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を元に、様々なヌクレオチド配列からなる２５ヌクレオチドの標的を選び出し、フォワードプライマー（１２ヌクレオチド）及びリバースプライマー（１３ヌクレオチド）、あるいはフォワードプライマー（１３ヌクレオチド）及びリバースプライマー（１２ヌクレオチド）のプライマーセットを設計して、特異的検出の可否を検討した。得られた結果を表５に示す。

表５に示すとおり、標的ヌクレオチド配列におけるＧＣの総数、すなわちフォワードプライマー及びリバースプライマーにおけるＧＣの総数が１２以下である場合には、前記配列の増幅は認められなかった。一方、ＧＣの総数が１４以上である場合に、前記配列の増幅が認められた。

また、ＧＣの総数が１３とした際に、増幅する場合としない場合が認められ、前者においては、フォワードプライマー及びリバースプライマー間のＴｍ差が少ない（０．７℃）一方で、後者はその差が大きかった（１２．４℃）。そのため、ＧＣの数が１３の場合には、プライマー間におけるＴｍ値のバランスが重要であると考えられる。そして、このような観点にて、改めてＲＢ近傍配列についての結果を見直してみると、ＲＢ近傍配列（標的ヌクレオチド配列）中のＧＣ総数は１３であり、ＲＢＦ２（Ｔｍ値：２８．９℃）及びＲＢＲ２（Ｔｍ値：２８．２℃）を用いた場合には前記配列を増幅することができる一方で、ＲＢＦ（Ｔｍ値：３４．５℃）及びＥＢＲ３（Ｔｍ値：２２．１℃）を用いた場合には増幅されなかった理由がうまく説明できる。

また、標的ヌクレオチド配列の増幅が認められたプライマーセットにおいて、より作物種に対して特異性高くプライマーセットとして、Ｌｅ１Ｆ３とＬｅ１Ｒ３、Ｌｅ１Ｆ６とＬｅ１Ｒ６、Ｌｅ１Ｆ７とＬｅ１Ｒ７、Ｌｅ１Ｆ９とＬｅ１Ｒ９、ＳＳＩＩｂＦ１とＳＳＩＩｂＲ１、ＳＳＩＩｂＦ５とＳＳＩＩｂＲ５、ＨＭＧＦ２とＨＭＧＲ２、ＨＭＧＦ６とＨＭＧＲ６を得ることができた。

なお、本発明において、標的ヌクレオチド配列は２５ヌクレオチドと非常に短いこともあり、設計段階にて、特異性が高いプライマーセットが得られるか否かを予想することは困難である。そのため、通常のＰＣＲ同様に、特異性が高く、またプライマーダイマーの形成が抑制されたプライマーセットを得るためには、増幅可能と予想されるプライマーセットを何種類か設計し、さらに、その中から特異性を示したプライマーセットを選抜する方法が有効ではないかと考えられる。

以上説明したように、本発明によれば、２５ヌクレオチドからなる極めて短い標的配列を、ＰＣＲにより増幅することが可能となる。

現在のＰＣＲをはじめとする遺伝子分析の世界において、僅か２５ヌクレオチドという短いＤＮＡを明瞭に検出可能な技術はほとんど存在しない。従来のＰＣＲ法では、上述のとおり、２０ヌクレオチド前後からなるプライマーを二種類用いることから、２５ヌクレオチドのような短い標的を検出することは事実上不可能であった。

ＰＣＲ法は、もともと特定の遺伝子を簡易にクローニングすることを目的として開発された技術であることから、より長い配列からなる対象を増幅させる方向に改良が進められてきた。一方、ＧＭ検知をはじめとする遺伝子検査においては、必ずしも長い配列を増幅させるＰＣＲ条件が、それらの目的に最適であるとは限らない。逆に、特異性が担保されている範囲において、より標的が短い場合の方が、検出感度が向上したり、あるいは適用性が広がるような場合も想定される。例えば、食品研究分野では、加工食品等において、原材料農作物のＤＮＡが著しく断片化されており、従来のＰＣＲでは検出が困難であることが報告されている（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５年、５３，２０６０〜２０６９ページ、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， Ｔ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５年、５３，２０５２〜２０５９ページ 参照）。本発明によれば、従来のＰＣＲよりもはるかに短い配列を検出可能であることから、加工食品を対象とした検査法等の性能改善も可能となり得る。

また、本発明によれば、上述のＲＢ近傍配列を検出することにより、アグロバクテリウム法によって作製された遺伝子組換え（ＧＭ）植物を検出することも可能となる。特に、現在世界中で最も利用されているアグロバクテリウム法によって作出されたＧＭ作物の大部分を、１種類のプライマーセットにて検出することが可能となる。

なお、上述の実施例においては、本発明の対象として、食品表示に関わる安全性審査済みのＧＭ大豆及びＧＭトウモロコシを用いて検討しているが、アグロバクテリウム法で作出された安全性未審査のＧＭ作物への適用も有用ではないかと考えられる。特に、近年、食品として、あるいはカルタヘナ法の観点から安全性が確認されていないＧＭ作物が、海外から日本に流入する、あるいは流入が危惧されるような事例が発生している（日本 厚生労働省「安全性未審査の組換えＤＮＡ 技術応用食品の検査方法」 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｆｉｌｅ／０６−Ｓｅｉｓａｋｕｊｏｕｈｏｕ−１１１３０５００−Ｓｈｏｋｕｈｉｎａｎｚｅｎｂｕ／００００１７１８３９．ｐｄｆ、日本 農林水産省「２０１６年（平成２８年）７月に米国で発見された、我が国で未承認の遺伝子組換え小麦についてのＱ＆Ａ」 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｆｆ．ｇｏ．ｊｐ／ｊ／ｓｙｏｕａｎ／ｋｅｉｋａｋｕ／ｓｏｕｋａｔｕ／ａｔｔａｃｈ／ｐｄｆ／ｉｎｄｅｘ−８．ｐｄｆ、日本 農林水産省プレスリリース ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｆｆ．ｇｏ．ｊｐ／ｊ／ｐｒｅｓｓ／ｓｙｏｕａｎ／ｎｏｕａｎ／１７０５１０．ｈｔｍｌ、日本 農林水産省プレスリリース ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｆｆ．ｇｏ．ｊｐ／ｊ／ｐｒｅｓｓ／ｓｙｏｕａｎ／ｎｏｕａｎ／１４１２２５．ｈｔｍｌ 参照）。また、日本国内においても、安全性未審査のＧＭ植物が不適切な環境で生育していることが発覚した事例が後を絶たない（例えば、国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学プレスリリース ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｉｓｔ．ｊｐ／ｐｒｅｓｓｒｅｌｅａｓｅ／２０１７／０９／００４００１．ｈｔｍｌ、名古屋大学 大学からのお知らせ 「遺伝子組換え生物の第二種使用等に関する事故について」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｆｏ／２０１５０５２２．ｈｔｍｌ、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構（（旧）国立研究開発法人農業生物資源研究所）プレスリリース ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｒｏ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ａｒｃｈｉｖｅ／ｎｉａｓ／ｐｒｅｓｓ／２０１６／２０１６０３２５／ 参照）。これらの中には、アグロバクテリウム法で作出されたＧＭ植物が少なからず含まれている。特に、上述の実施例においては、核酸クロマトを用いた簡易な検出法によってもＧＭ植物を検知できることも確認していることから、細かい系統の特定はできないが、緊急的な状況下において、対象植物がアグロバクテリウム法で作出されたＧＭ植物であるか否かを判定することができる、本発明は有用であると考えられる。

したがって、本発明は、ＧＭ作物の検知等、様々な分野の遺伝子検査において有用である。

Claims (5)

1. 標的ヌクレオチド配列を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマーセットであって、
   前記標的ヌクレオチド配列は、２５のヌクレオチドからなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計１３ヌクレオチド含む、
   下記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される１のプライマーセット
   （ａ）前記フォワードプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の５’末端から１２ヌクレオチドからなる部分と同一の配列からなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計５ヌクレオチド含み、
   前記リバースプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の３’末端から１３ヌクレオチドからなる部分と相補的な配列からなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計５ヌクレオチド含む、プライマーセット、
   （ｂ）前記フォワードプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の５’末端から１３ヌクレオチドからなる部分と同一の配列からなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計５ヌクレオチド含み、
   前記リバースプライマーは、前記標的ヌクレオチド配列の３’末端から１２ヌクレオチドからなる部分と相補的な配列からなり、グアニン及びシトシンを少なくとも計５ヌクレオチド含む、プライマーセット。
2. 配列番号：１に記載のヌクレオチド配列からなる、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに由来するＲＢ近傍配列を、前記標的ヌクレオチド配列とする、
   配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び
   配列番号：１６に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーを含む、請求項１に記載のプライマーセット。
3. 試料中の標的ヌクレオチド配列を増幅するための方法であって、
   試料中の標的ヌクレオチド配列を鋳型として、請求項１又は２に記載のプライマーセットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応により、当該配列を増幅する工程を含む、方法。
4. 試料中の標的ヌクレオチド配列を検出するための方法であって、
   請求項３に記載の方法により、試料中の標的ヌクレオチド配列を増幅する工程と、
   前記工程にて増幅した標的ヌクレオチド配列を検出する工程とを、含む方法。
5. アグロバクテリウム法によって作製された遺伝子組換え植物を検出する方法であって、
   被検植物のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー及び配列番号：１６に記載のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーのセットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、
   前記ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列からなる、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに由来するＲＢ近傍配列を、検出する工程、
   前記工程にて、前記ＲＢ近傍配列の増幅が検出された場合に、前記被検植物を、アグロバクテリウム法によって作製された遺伝子組換え植物であると判定する工程を、
   含む方法。