JPS63179889A - オリゴヌクレオチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、新規で有用なリン化合物の製造法に関し、特
にオリゴヌクレオチドの製造に有用なリン化合物に関す
るものである。

更に詳しくは、本発明は、ポリヌクレオチドを合成する
ために使用する中間体である、新規で、かつ有用なホス
ホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉ　ｔｅ）
に関し、ポリヌクレオチド製造用のオリゴヌクレオチド
を生成するための新規な方法に関するものである。

［従来技術およびその問題点］ 所定のオリゴヌクレオチドを連続的に合成する有利な方
法が多数開発されている。しかしながら、ポリヌクレオ
チド、特にオリゴヌクレオチドの段階的合成方法は、な
お困難でかつ時間を要する工程を含んでおり、またしば
しば収率が低い。１つの先行技術では、ポリヌクレオチ
ド合成中に保持体として有機ポリマーを使用している。

一般的に、ポリマー保持体合成方法の主な問題点は、本
来？リマー保持体の性質にある。このような合成に使用
される従来の種々のポリマーは、（１）保持体中への活
性ヌクレオチドの拡散速度が遅いとと；（２）種々の多
孔性低架橋保持体ポリマーが過度に膨潤するとと；およ
び（３）、ｔｅｌＪマー上への試薬の吸収が不可逆的で
あることのような理由から不適当であることが解った。

例えば、ブイ・アマ−ナス（Ｖ、　Ａｍａｒｎａｔｈ）
およびエイ・ディー・ブルーム（Ａ、　Ｄ、　Ｂｒｏｏ
ｍ）共著、ケミカル・Ｌ／　ヒユーズ（Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓｌ　、第７７巻、１９７７年、１８
３〜２１７頁参照。　　　　。

例えば、液体クロマトグラフィーにおいて、吸収物質と
して主に用いられる変性無機ポリマーは、先行技術にお
いて公知である。トリチル結合基金用いてヌクレオシド
ホスフェートをシリカゲルに結合させることについては
、先行文献に述べられている〔エイチ・コスタ−（Ｈ，
Ｋｏｓｔｅｒ）　著、テトラヘドロン・Ｖタ−ス（Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　ＬｅｔｔｅｒＳｌｌ　１９７２年
、１５２７〜１５３０頁〕。

しかしながら、この方法は明らかにピリミノンヌクレオ
シドにのみ適用できるに過ぎない。シリカ保持体からヌ
クレオシドを開裂することは、プリンヌクレオシドに作
用を及ぼす酸によって達成されるにすぎない。

オリゴチミジレートのホスホトリエステル誘導体の製造
忙ついては、文献〔アール・エル・レチンガー（Ｒ，Ｌ
、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）　　およびグプル・ビー・ラ
ンスフォード（Ｗ、　Ｂ、　Ｌｕｎ５ｆｏｒｄ）　　共
著、ジャーナル・オツ・デ・アメリカン・ケミカル・ソ
サエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉ
ｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）　、９８　
：　１２．３６５５〜３６６１頁〕に述べられており、
これによればホスホロジクロリグイト’に５’−０保護
チミジンと反応させ、連続して生成物ｉ３’−０保護チ
ミジンと反応させ、次に生じた亜リン酸塩を酸化してリ
ン酸塩とし、保護基を除去して、ホスホトリエステルを
得る。この方法を使用するととＫより、四量体および玉
量体、すなわち　ｄＴｐＴｐＴｐＴおよびｄＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＴ（Ｔはチミジン）が生成される。不都合なこと
に、この方法では、添加したヌクレオシドの適切な連続
性を確実にする定め、各段階において生成物の分離およ
び精製が必要である。沈殿操作および沈殿物の洗浄を含
む分離技術は、連続した各段階の反応′ｆ達成させるた
め〈必要である。

同一人に譲渡した上記の特許出願には、ハロホスホリダ
イトと、適切に保護されたヌクレオシドあるいはオリゴ
８ヌクレオチド分子との反応によって、ヌクレオチド間
の結合、即ちオリゴヌクレオチドあるいは？ジヌクレオ
チド中における各ヌクレオシド間の結合を生成させる方
法が述べられている。

デオキシヌクレオシドで変性したシリカゾルは、デオキ
シヌクレオシドの５’−０Ｆ（間にトリエステルホスフ
ァイト結合を生成して、選ばれたヌクレオチドと縮合さ
れる。上記ホスファイト結合は、最初シリカダル上のヌ
クレオシドの５’−ＯＫに亜リン酸基を導入し、次に３
’−ＯＨにより添加ヌクレオシドと縮合するととＫよっ
て生成される。他の態様においては、好ましくは、亜リ
ン酸基が３’−０Ｈ（５’−ＯＨはトリチル化すること
により保護されている）において添加ヌクレオシドに導
入され、次に生じたヌクレオシドホスファイトがシリカ
ゲルのヌクレオシドの５’−ＯＨと反応する。

また、デオキシヌクレオシド変性シリカゲルは、シリカ
ケ９ルのデオキシヌクレオシドの３’−ＯＨト、選ばれ
たデオキシヌクレオシドの５’−ＯＨとの間にトリエス
テルホスファイト結合を形成して、選ばれたヌクレオシ
ドと縮合される。ホスファイト結合は、最初シリカダル
上のヌクレオシドの３’−ＯＨに亜リン酸基を導入し、
次に５’−ＯＨにより添加ヌクレオシドと縮合すること
によって生成される。

他の場合、好ましくは、この方法によって亜リン酸基が
５’−ＯＨにおいて添加ヌクレオシド内に導入され（３
’−ＯＨは技術的方法を使用してトリチル化することに
より保護されている）、次に、生じたヌクレオシドホス
ファイトはシリカケ９ル上のヌクレオシドの３’−ＯＨ
と反応させる。

一般的な反応は次の通りである。

また好ましい反応は次の通りである。

式中、■は塩基の存在において加水分解可能な共有結合
によってヌクレオシドの３′またはぎ一〇−に結合した
無機、ｊ？　リマー；ＲはＨあるいは保護基；Ｒ量は炭
素全１０個まで有するヒドロカルビル基；各Ｂはヌクレ
オシドまたはデオキンヌクレオンド塩基；各ＡはＨｌｏ
Ｉ（又はＯＲ４であり、ここでＲ４は保護基であり；か
つＸはハロダン、好ましくはｃ１４たはＢｒ、または第
ニアミノ基である。

Ｘが第ニアミノ基である構造式■および■ａの化合物は
、アミン基が不飽和窒業複素環であるものを含む。この
複素環は通常共役している少なくとも２つのエチレン性
二重結合を特徴とするテトラゾール、インドール、イミ
ダゾール、ベンゾイミダゾールおよび同様の窒素複素環
化合物であり、またＮ、ＳまたはＯのような他のへテロ
原子をも包含することができる。Ｘがそのような複素環
式アミンである構造式■およびＩ［ａの化合物、即ち、
アミン窒素が環のへテロ原子であるものは、極端に反応
性が高く、そのために特に構造式■および■ａの化合物
の前記の製法において比較的安定性が低いことが％徴で
ある。これらホスホルアミゲイトおよびこれらの製造用
の対応するりＯＩＪダイトは水（加水分解）および空気
（酸化）に対して不安定である。このため、そのような
化合物は不活性な雰囲気の下で、通常密封容器中で、通
常０°Ｃよりかなり低い極端な低温度においてのみ保存
が可能である。従って、構造式■および■ａの化合物の
製造に、これら化合物全使用する場合には、上記の高い
反応性および低い安定性のために、充分な注意と用心深
い取扱いが必要である。

［問題点を解決するための手段］ 本発明の新規な化合物は構造式■および■ａミラしてお
り、式中Ｘは特定の第ニアミノ基である。

詳しくは、本発明の新規な化合物は、Ｘが飽和第ニアミ
ノ基であるもの、即ち第ニアミノ基には二重結合が存在
しないものである。さらに詳しくは、ＸはＮＲ２Ｒ′３
であり、別々に導入される暇およびＲ’３は、それぞれ
１０個までの炭素原子を含むアルキル、アラルキル、シ
クロアルキルおよびンクロアルキルアルキル基を表わし
、馬およびＲ′３が共に導入される時、主鎖に５個まで
の炭素原子を含み、かつ合計１０個までの炭素原子を含
むアルキレン鎖を生成し、このアルキレン鎖の両末端は
Ｒ′２およびＲこと結合する窒素原子に原子価結合され
；叫および馬がこれらと結合する窒素原子と同時に導入
される時、窒素、酸素およびイオウから成る群から選ば
れる少なくとも１つの追加のへテロ原子を含む飽和窒素
含有複素環を生成する。

本発明の新規な化合物は、前記の同時継続出願のもの程
高い反応性を示さずかつ不安定ではない。

しかしながら、本発明の化合物は、通常の条件の下でヌ
クレオシドの保護されていない３’−ＯＨ又は５’−Ｏ
Ｈと容易に反応する。本発明の新規なホスホルアミダイ
トは、通常の試験室条件下で加水分解および空気酸化に
対して安定であり、乾燥性の安定な粉末として貯蔵され
る。従って、本発明の新規なホスホルアミダイトは、上
記同時継続出願において述べられているように、ヌクレ
オチド間の結合全形成する方法において、特にオリゴヌ
クレオチドおよびポリヌクレオチドを生成する自動工程
において、より効果的に用いられる。

ＮＲらＲ′３全３ヲするアミンとしては、ツメチルアミ
ン、ツメチルアミン、ノイノプコビルアミン、ノブチル
アミン、メチルプロピルアミン、メチルベンツアミン、
メチルンクロプロビルアミン、エチルシクロヘキンルア
ミン、メチルベンツルアミン、メチルンクａヘキンルメ
チルアミン、プチルンクロヘキシルアミン、モルホリン
、チオモルホリン、ピロリノン、ピペリノン、２．６−
シメチルピ被リジン、ピ被うソンおよび同様な飽和単環
窒素複素環化合物のような種々の飽和第二アミンが広範
囲に含まれる。

上記式中においてＢによって表わされるヌクレオシドお
よびデオキシヌクレオシドの塩基ハ、周知のものであり
、プリン誘導体、例えはアデニン、。

ヒポキサンチンおよびグアニン、並びにピリミジン誘導
体、例えばシトシン、ウラノルおよびチミンなどを包含
する。

上記式においてＲ４によって表わされる保護基としては
、トリチル、メトキシトリチル、ジメトキ／トリチル、
ノアルキルホスファイト、ピノＪ　ＩＪ　／Ｌ、、ィン
ブチルオキンカルビニル、ｔ−ブチルツメチルシリル、
アセチル基その他がある。

殉によって表わされるヒドロカルビル基としては、約１
０個までの炭素原子を含むアルキル、アルケニル、アリ
ール、アラルキルおよびシクロアルキルが含まれ、広範
囲にわたっている。こねらの代表的な基は、メチル、ブ
チル、ヘキシル、フェネチル、ベンジル、シクロアキル
、フェニル、ナフチル、アリルおよびシクロブチル基な
どである。これらのうち、低級アルキル、特にメチル基
およびエチル基が好ましい。

新規な化合物は、構造式ＩＩａにおいて、Ｘがジ低級ア
ルキルアミノ、ピロリジノ、モルホリノあるいはビ被す
ジノ基であり、とりわけ低級アルキルアミノ基が好まし
く、更にモルホリノ、ジメチルアミノおよびジエチルア
ミン基が好ましく；ＡはＨで；財は低級アルキル基；Ｒ
はトリチル基；Ｂはヌクレオシド又はデオキシヌクレオ
チド塩基；および■はシリカゲルであることが好ましい
。

本発明の新規化合物は、特定の第ニアミノを対応するヌ
クレオシドホスホモノクロリグイトと反応させるような
技術的に認められた方法に従って製造される。この反応
は、テトラヒドロフランまたはアセトニトリルのような
有機溶媒に上記ヌクレオシドを溶解し、さらに選ばれた
第ニアミノを加えることＫより達成する。望ましくない
塩酸塩全除去した後、ホスホルアミダイトの有機溶媒溶
液中、そのままポリヌクレオチドの合成に使用し、ある
いは上記生成物を有機溶媒溶液から単離し、かつ次の反
応の前に精製する。

本発明の他の具体例として、ホスホルアミダイトは、所
望のクロロ−（第ニアミノ）アルコキシホスフィンを生
成し、その後、この生成物を所定のヌクレオシドと縮合
させることにより好適に製造する。この方法は、水分に
よる加水分解および空気（（よる劣化を受は易いヌクレ
オンドホスホモノクｏロダイトの場合における困難な取
扱いの問題を解決している。

クロロ−（第ニアミノ）アルコキシホスフィンの反応は
、縮合反応において生成された塩化水素を吸収する念め
に、好ましくは第三アミンの存在の下で、選ばれたヌク
レオシドの有機溶媒溶液中で行なう。反応は室温に丸・
いて乾燥雰囲気中で、かつＮ２またはヘリウムのような
不活性ガス中で円滑に進行する。本発明に有用な有機溶
媒としては、ジエチルエーテル、クロロホルム、塩化メ
チノン、塩化エチレン、酢酸エチル等のような反応物を
溶解するあらゆる溶媒が含まれる。生成物の溶液は、添
加した第三アミンの塩酸塩沈殿物から分離され、得られ
た溶液はそのままポリヌクレオチドを生成する場合に利
用できるが、そうしない場合には、後に使用する前に溶
媒から分離し、さらに結晶化により精製する。上記の説
明では、塩素化合物の使用について述べたが、必要に応
じて臭素化合物も使用可能であり、本質的に同様の結果
が得られる。

本発明の新規な化合物をヌクレオチド間の結合を生成す
る場合に用いる場合、と九らの化合物は陽子供与体と共
に使用することが好ましい。例えば、ホスホルアミダイ
トは酸性化合物によって陽子化のために活性化され、こ
れが所望のヌクレオチド結合の生成を容易にするもので
ある。上記活性化の目的のために使用する酸性化合物は
、好ましくけ適度の酸性を示し、これら化合物としては
、ハロゲン酸アミン塩、およびテトラゾール、イミダゾ
ール、ニトロイミダゾール、ベンズイミダゾール並びに
同様な窒素複素環式場子供与体のような窒素複素環式化
合物が含まれる。プロトン活性化に使用されるハロゲン
酸アミン塩は、好ましくは第三アミンの塩であり、また
好ましくは塩酸塩であるが、臭化水素酸塩、ヨウ化水素
酸塩あるいはフッ化水素酸塩も使用できる。上記第三ア
ミンとしては、例えば、ツメチルアニリン、ノイソプロ
ピルアニリン、メチルエチルアニリン、メチルノフェニ
ルアミン、ピリノンその他がある。

ヌクレオシドがグアノノンである時、即ち、Ｂがグアニ
ンである場合、アミン塩酸塩を使用することは、活性化
、即ち陽子供与の目的のためには、あまり効果的ではな
い。Ｂがグアニンであるこれら化合物の場合、活性化は
上記窒累複素環式水素供与体によって良好に達成できる
。

もちろん、上記同時継続出願に述べられているように、
一度ヌクレオチド間結合が生成されると、生成物は次に
保護基、例えば保護基Ｒｉ線除去るために処理され、こ
れにより生成物は式■のヌクレオシドとさらに反応し、
この反復反応によれば、共有結合基、例えはエステル結
合基によりシリカダルに結合した所定の連続状ヌクレオ
チドのポリヌクレオチドが生ずる。

各ヌクレオシドを添加した後、好ましくは亜リン酸基を
、通常酸化剤としてのヨウ素との反応により酸化してリ
ン酸塩にする。この処理は、過酸化第三級ブチルおよび
過酸化ベンゾイル、並びにヒドロペルオキシドなどの過
酸化物との反応によっても行なうことができる。

通常アンモニアを用いる加水分解により、Ｒ保護基のよ
うな保護基および前記同時継続出願に述べられているよ
うなヌクレオシド塩基部分の保護基を除去した後に加水
開裂すること妃より、オリゴヌクレオチドをシリカゲル
支持体から分離して得る。

Ｒの代表的な保護基として特に有用なものは、アリール
メチル基であり、こわらアリールメチル基としては、モ
ノアリールノアルキルメチル、ノアリールモノアルキル
メチルおよびトリアリールメチル保護基などを含む。こ
れらのうち、トリアリールメチルが好ましく、そのトリ
チル保護基は周知である。トリアリールメチル保護基は
一般に容易に除去できるが、これら保護基は、またオリ
ゴヌクレオチドの連続状態並びに得られる生成物の収率
を知るために用いる。公知のヌクレオチド合成法の１つ
の主な問題点は、ヌクレオチドの連続縮合において生成
される生成物を追跡することができないことである。こ
のような追跡は、反応系の一部分、例えば、オリゴヌク
レオチドを合成付着したシリカダル又は他の保持体を取
出し、保持体からの生成物を加水分解し、さらに生成物
を最終的に分析することが必要であり、これらの操作は
すべて時間を浪費する。この障害のために１オリゴヌク
レオチドは、通常は適尚な追跡手段なしで合成されるが
、このことは大変望ましくない。

トリアリールメチル保護基金使用することＫより、生成
時にオリゴヌクレオチド生成物中のヌクレオシドの連続
状況、並びにヌクレオノドの各段階的添加時に得られる
生成物の率収を追跡する簡単で正確な方法が得られる。

この方法は、ルイス酸あるいはゾロチン酸（ｐｒｏｔｉ
ｃ　ａｃｉｄ）の存在の下におけるトリアリールメチル
カチオンによる発色に基づいている。酸の下で識別可能
な色彩を与える構造式■又は■ａのホスホルアミダイト
化合物に対して、適切なトリアリールメチル保護基を選
ぶことにより、各ヌクレオシドは識別可能な色彩のトリ
アリールメチル基によって分類される。式■およびｌｌ
ａの化合物中に例示されているリン結合を生成して、各
縮合反応が終了すると、合成の次の段階では、その系か
ら保護基Ｒを除去することである。この除去操作は臭化
亜鉛の、ようなルイス酸により好適九達成され、かつ同
時に発色反応を引起こす。例えば、ジ−ｐ−アニシルフ
ェニルメチル基は、オリゴヌクレオチド阡 呈する。この色は、最初に使用したホスホルアミダイト
’を確認するためのトリアリールメチル保護基を確認す
るために用いることができ、かっ色の濃度全測定するこ
と１（よって、反応の進行状態を測定できる。

経験によれば、殆んどのトリアリールメチル基は酸に会
うと発色する。実際、トリアリールメチル基の組成を変
化させること（Ｃより種々の色彩が得られた。上記トリ
アリールメチル基のアリール基トしては、フェニルおよ
びナフチルのみならず置換フェニルおよび置換ナフチル
、並びにキノリニル、フリル、チェニルのような複素環
、および他の窒素、イオウおよび／又は酸素を含む複素
環が含まれる。上記アリール基は、・・ログン化物（Ｆ
、　Ｃ１％Ｂｒ、　Ｉ　）　、　＝トロ、アルコキシ、
アルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキルおよ
び同様なヒドロカルビル基のような置換基を含む。

これらの置換基の場合、炭素原子の数は１から約１２が
好ましい。

好ましいトリアリールメチル基は次式によって表わされ
る。

式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のそれぞれは、フェニル、
ナフチル、キノリル、フリル、チェニルのようなアリー
ル基、あるいは他の窒素、イオウおよび／又は酸素含有
複素環であり；あるいはそのようなアリール基は、ハロ
ケ０ン化物（Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ又はＩ）、ニトロ、低級ア
ルコキシ、低級アルキル、およびアリール、並びに１０
個までの炭素原子を含むアラルキルおよびシクロアルキ
ルのような置換基を包含する。弓およびＲ３はそれぞれ
１０個までの炭素原子を含むアルキル、シクロアルキル
又はアラルキルである。

好ましいトリアリールメチル基を第１表に示す。

第　　Ｉ　　表 （ａ）　　（ｂｌ　　（ｃ）　　（ｄ）　　（ｅ）（ｆ
ｌ　　（ｑｌ　　（ｈ）　　（ｉｆ　　（ｊ）（ｋ）　
　（１）　　（ｍｌ　　　（ｎ）（ｏ）　　　＋ｐｌ　
　（ｑｌ　　＋ｒ１凡例にお７て定義　　　　　　色 されたアリール官能基 Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃ７Ｒ３＝ａ橙 Ｒ１＝ｃ；Ｒ２＝ｂ；Ｒ３＝ａ赤 Ｒ１＝ｃ；Ｒ２＝ｄ；Ｒ３＝ａ橙 Ｒ１＝　ｃＢ　Ｒ２＝　ｑＨＲ３＝　ａ　　　　　　　
　無色Ｒ１＝Ｃ；Ｒ２＝Ｃ７Ｒ３＝ａ　　　　　　　　
無色Ｒ１＝　ｃ７　Ｒ２＝　ｐＨＲ３＝　ａ　　　　　
　　　橙赤Ｒ１”’Ｒ２＝ｂｉＲ３＝ａ黒 Ｒ１＝　Ｒ２＝　ｑ；Ｒ３＝　ａ　　　　　　　　　無
色Ｒ１＝　Ｒ２＝　ｒ；　Ｒ３＝　ａ　　　　　　　　
　無色Ｒ１＝　Ｒ２＝　ｐ；　Ｒ３＝　ａ　　　　　　
　　　赤紫Ｒ１＝　Ｒ２＝　ａ；　Ｒ３＝　ｃ　　　　
　　　　　黄橙Ｒ１”Ｒ２゛引Ｒ３゛５黄 Ｒ１”Ｒ２＝ａ；Ｒ３＝ｄ黄 Ｒ１＝Ｒ２”引Ｒ３＝ｑ　　　　　　　　　無色Ｒ１＝
Ｒ２；ａ；　Ｒ３＝ｒ　　　　　　　　　無色Ｒ１”Ｒ
２＝Ｃ７Ｒ３”ｎ紫 Ｒ１＝Ｒ２−ｂ；Ｒ３＝ｎ青 Ｒ１＝　Ｒ２＝　ｐｒ　Ｒ３＝　ｎ　　　　　　　　　
暗紫Ｒ１＝　Ｒ２＝　ｃ；　Ｒ３＝　ｏ　　　　　　　
　　暗橙Ｒ１＝　Ｒ２＝　ｃ；　Ｒ３＝　ｐ　　　　　
　　　　赤紫Ｒ１＝Ｒ２＝ｂプＲ３＝ρ　　　　　　　
　　赤紫Ｒ１＝　Ｒ２＝　ｑ；　Ｒ３＝　ｍ　　　　　
　　　　黄橙Ｒ１＝　Ｒ２＝　ｆ；Ｒ３＝　ｍ　　　　
　　　　　　無色Ｒ１＝Ｒ２＝ｐ；Ｒ３＝ｍ桃 Ｒ１＝Ｒ２＝ｅ：Ｒ３＝ｍ黄 Ｒ１“Ｒ２゛ｄ；Ｒ３□ｍ黄 Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃ；Ｒ３＝ｍ黄 Ｒ１＝Ｒ２＝ａ　；　Ｒ３ｍ　　　　　　　　　　無色
Ｒ１；Ｒ２＝Ｃ７Ｒ３；ｍ　　　　　　　　薄紫Ｒ１＝
　Ｒ２＝　ｇ；　Ｒ３冨Ｃ赤橙 Ｒ１＝Ｒ２＝ｆ；Ｒ３−Ｃ黄 Ｒ１＝Ｒ２＝ｐ；Ｒ３＝ｃ赤 Ｒ１＝　Ｒ２＝　ｅ；　Ｒ３＝　ｃ　　　　　　　　　
赤橙Ｒ１＝Ｒ２＝ｄ；Ｒ３＝Ｃ赤 Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝ｃ赤 Ｒ１−ｑ；Ｒ２−ａ；Ｒ３−１濃赤 Ｒ１°ｆ；Ｒ２°ａＨＲ３＝ｉ黄 Ｒ１＝　ｐ：　Ｒ２＝　ａ：　Ｒ３−ｉ　　　　　　　
　　　　黄Ｒ１＝　ｅ；　Ｒ２＝　ａ；　Ｒ３−ｉ　　
　　　　　　赤紫Ｒ１＝ｄ；　Ｒ２＝　ａ；　Ｒ３−ｉ
　　　　　　　　暗橙Ｒ１＝　ｃｒ　Ｒ２＝　ａ；　Ｒ
３−ｉ　　　　　　　　濃紫Ｒ１゛Ｒ２゛ａ７Ｒ３−１
橙 Ｒ１＝ｂＸＲ２＝ａｒＲ３＝ｉ赤 Ｒ１＝ｑ；Ｒ２＝ａ；Ｒ３＝ｊ黄 Ｒ１＝　　ｆ：　　Ｒ２＝　　ａ；　　Ｒ３−コ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　黄Ｒ１＝　ｐＨ
，Ｒ２＝　ａＢ　Ｒ３−〕　　　　　　　　　無色Ｒ１
＝　　ｅ；　　Ｒ２＝　　ａ；　　Ｒ３−ｊ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　橙Ｒ１＝　　
ｄ；　Ｒ２＝　　ａＨＲ３−ｊ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　紅Ｒ１＝　ｃ；　Ｒ２＝　ａ；
　Ｒ３−ｊ　　　　　　　　　潰損Ｒ１＝Ｒ２＝ａ；Ｒ
３＝ｊ黄 Ｒ１”Ｒ２”ｇ’Ｒ３”ゞ黄 Ｒ１＝Ｒ２＝ｆｉＲ３＝に黄 Ｒ１＝Ｒ２”ｐ＋　Ｒ３−ｋ　　　　　　　　　無色Ｒ
１＝　Ｒ２＝　ｅ；、　Ｒ３−ｋ　　　　　　　　　負
担Ｒ１＝Ｒ２−ｄＩＲ３−に黄 Ｒ１”Ｒ２−Ｃ；Ｒ３−に橙 Ｒ１”Ｒ２“ａｉＲ３”’に黄 Ｒ１“９’Ｒ２＝Ｒ３“８黄 Ｒ１＝ＬＲ２＝Ｒ３＝ａ黄 Ｒ１＝ｐ；Ｒ２＝Ｒ３＝ａ黄 Ｒ１＝ｅ；Ｒ２＝Ｒ３＝ａ橙 Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝ａ黄 Ｒ１＝ｎ；Ｒ２＝ｌ；Ｒ３＝ａ緑 Ｒ１＝　ｌｃ　Ｒ２＝　ｌ；　Ｒ３−ａ　　　　　　　
　鮮黄Ｒ１＝ｑｒＲ２＝ＩＨＲ３＝ａ黄 Ｒ１＝ｃ；Ｒ２＝１２Ｒ３＝ａ　　　　　　　　負担Ｒ
１＝ｒＢＲ２＝ｑ７Ｒ３＝ａ緑 Ｒ１＝　ｈ；　Ｒ２＝　ｑ；　Ｒ３−ａ　　　　　　　
　鮮黄Ｒ１：Ｒ２＝ｑ；Ｒ３＝ａ黄 Ｒ１＝　ｃ；Ｒ２＝　ｇＨＲ３−ａ　　　　　　　　負
担Ｒ１＝ｂ；Ｒ２＝ｇ；Ｒ３＝ａ黄 Ｒ１＝ｎ；Ｒ２＝Ｒ３＝ｇ緑 Ｒ１＝　ｈ；　Ｒ２＝　Ｒ３−ｑ　　　　　　　　　鮮
黄Ｒ１”Ｒ２＝Ｒ３＝ｇ黄 Ｒ１＝ｂ；Ｒ２＝Ｒ３＝ｇ黄 Ｒ１”ｎ；Ｒ２＝ｊ；Ｒ３°ａ緑 Ｒ１＝　ｈ；　Ｒ２＝　ｊ；Ｒ３−ａ　　　　　　　　
鮮黄Ｒ１＝　　ｇ；　　Ｒ２＝　　ｊ；　　Ｒ３−ａ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　黄Ｒ１＝　ｃ：　
Ｒ２＝　ｊ；　Ｒ３−ａ　　　　　　　　　負担Ｒ１＝
ｎ；Ｒ，，＝Ｒ３＝ａ緑 Ｒ１＝ｈｉＲ２＝Ｒ３＝ａ　黄 Ｒ１＝ａ；Ｒ２＝ｅ；Ｒ３＝ｎ緑 Ｒ１＝ａ；Ｒ２＝ｅ；Ｒ３＝ｈ黄 Ｒ１＝ａ；Ｒ２＝ｅ７Ｒ３＝ｇ黄 Ｒ１＝　ａＨＲ２＝　ｅ７　Ｒ３−ｃ　　　　　　　　
負担Ｒ１＝ａ；Ｒ２＝ｃＢＲ３＝ｎ赤 すべての色は次の方法により測定した。加水分解された
グリニヤール反応生成物（実施例５に述べられている方
法により生成したトリアリールメチル７　／ｌ／　−ｙ
　−ル）の一部全薄層クロマトグラフィーにより分析し
た。次に、薄層板を塩酸蒸気にさらし、トリチルカチオ
ンの色を記録した。

例えば、Ｒによって示される保護基のうち、アリールメ
チル基、特にトリアリールメチル基、および特に酸と接
触したときに可視色彩を与えるアリールメチル基が好ま
しい。

ここで使用されているように、ヌクレオチド、ポリヌク
ンオチドおよびビリデオキ／ヌクレオチドの符号は、■
ＵＰＡＣ−Ｉ［ＪＢコミノ／ヨナー・オプ・／−？イオ
ケミカル・ノメンクラチャー・リコメンデーノ　＝＋　
　７ｘ”　　（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ　　ｏｆ　　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ
Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａセ１ｏｎｓ）　　（（１９７０）
　　□Ｚ　　イ　オ　ヶ　ミ　ス　ト　リ　−（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　９巻、４０２２頁〕に従う。

次の実施例により本発明をさらに説明する。

実施例１ 次式のホスホルアミゲイトの製造 Ｎ（ＣＨ３）２ このホスホルアミダイトは化合物Ｉ〜■として表わされ
、 化合物■、Ｂ＝１−チミニル； 化合物Ｕ　、　　Ｂ　＝１−　（Ｎ〜４−ベンゾイルシ
トシニル）；化合物■、　Ｂ＝９−（Ｎ−６−ベンゾイ
ルアデニニル）；化合物■、　　Ｂ＝９−（Ｎ〜２−イ
ソブチリルグアニニル）；およびＤＭＴ−ノーｐ〜アニ
シルフェニルメチルである。

化合物Ｉ〜■の合成は、−官能性ホスファイト化剤とし
て用いられるクロロ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノメトキン
ホスフィン〔ＣＨ３０Ｐ（ＣＩ）Ｎ（ＣＨ３）２〕の製
造から始める。１００ｔｎｌの予め冷却した無水エーテ
ル（−７８°Ｃ）および予め冷却した（−７８°Ｃ）無
水ツメチルアミ７Ｃ４５，９９，１，０２モル）　ｆ　
２５０　ｍｌの添加漏斗に入れた。ツメチルアミンの蒸
発を避けるために、ドライアイスを含むアルミホイルで
上記添加漏斗を包んだ。３００ｍ１の無水エーテル中の
メトキシジクロロホスフィン（４７，７ｍｌ、６７．３
２５’、Ｏ，，５１モル）溶液を機械的に攪拌して、上
記溶液ヲ−１５℃（氷−アセトン浴）で２時間かけて滴
下した。添加漏斗を取り外し、次に１ｔの三日丸底フラ
スコにセラムキャップの栓をして銅線で固定した。懸濁
液を室温で２時間機械的に攪拌し、次に濾過し、５００
ｍ／の無水エーテルでアミン塩酸塩全洗浄した。

Ｆ液と洗液を一緒にして大気圧の下で蒸留し、さらに残
渣を減圧下で蒸留した。生成物全４０〜４２°Ｃ１１３
胴Ｈｇの下で蒸留し、７１％の収率（５１，１ｆｉ’、
０．３６モル）で単離し之。ｄ２５＝　１．１１５　ｆ
／ｍｅ。

３１Ｐ−Ｎ　、　Ｍ、　Ｒ＝　　１７９．５　ｐｐｍ（
ＣＤＣｌ２）　（５ｖ／ｖ　％Ｈ３Ｐｏ４内部標準液）
　。”Ｈ−Ｎ、Ｍ、Ｒ、二重線３．８および３　、６　
ｐｐｍ、　Ｊ　ｐ−Ｈ−１４Ｈｚ　（３Ｈ、ＯＣＨ３）
および２つの単一線２．８および２．６　ｐｐｍ（６Ｈ
，Ｎ（ＣＨ３）２　）。

質量スにクトルの親ピークはｍ／＝１４１であった。

乾燥窒素で前もってフラッシュした１０ｍ１の反。

応容器中における酸を含まない乾燥クロロホルム（３＋
＋＋Ｊ）およびノイソプロビルエチルアミン（４ミ’Ｊ
モル）中に、４’−０−ノーｐ−アニンルフェニルメチ
ルヌクレオンド（１ミリモル）を溶解した。この溶液に
〔ＣＨ３０Ｐ（ＣＩ）Ｎ（ＣＨ３）２〕（２ミリモル）
を室温で窒素の下で注入器により滴下した（３０〜６０
秒）。１５分後、溶液を３５ｍ／の酢酸エチルで１２５
ｍＡ’の分液漏斗に移した。溶液をＮａＣ１（８０，ｍ
Ａ’）の飽和水溶液で４回抽出した。有機相を無水Ｎａ
　２　Ｓ　０４上で乾燥し、減圧下で蒸発させ発泡体に
した。この発泡体をトルエン（１０ｄＮ化合物Ｗ　Ｆｉ
ｌｏｍｌの酢酸エチルに溶解）で溶解し、溶液ｔ５０ｍ
／の冷へキサン（−７８°Ｃ）に激シ、＜攪拌しながら
滴下し、た。冷懇濁液を濾過し、白色粉末ｆ７５ｍｌの
冷ヘキサノ（−７８°Ｃ）で１９ｅ浄Ｌｒｖ。

白色粉末を減圧下で乾燥し、窒素中に保存した。

単離した化合物■〜■の収率は９０〜９４％であった（
第２表参照）。生成物の純度は３ｆＰ−Ｎ、Ｍ、Ｒ。

で調べた。３”Ｐ−Ｎ、Ｍ、Ｒ，で分析すると、これら
の化合物は室温で窒素中で貯蔵された時、少なくとも１
ｔ月間安定であった。さらに、多量の（３′−（）ジヌ
クレオシドホスファイトは３１Ｐ−Ｎ、Ｍ、Ｒ，により
検出されなかった（４チ以下）。（３’−３’）ジヌク
レオシドホスファイトの含有量が低いということは、先
行技術のホスファイト結合方法を充分に改良しているこ
とを意味する。なお、上記先行技術においては、望まし
くない（３’−３’　）ジヌクレオシドホスファイトの
存在は不可避である。

アミノホスホルアミダイト■〜ＩＶ’ｉｒ３’−０−保
護ヌクレオシドと縮合し、ヌクレオチド間結合を生成し
た。ホスホルアミダイトラアミン塩酸塩あるいはテトラ
ゾールのような弱酸で活性化した。

Ａ１次の手順により、　３１Ｐ−Ｎ、Ｍ、Ｒ，を用いて
グロセスを追跡した。１０＋ｍ＋＋のＮ、Ｍ、Ｒ，管中
で、０．５ｍｌの乾燥ＣＤＣｌ３中のツメチルアニリン
塩ｅｋＭ　（１ｓ　ＩＩモル）ｆ、２ｒｎｌの乾燥無酸
ＣＤＣｌ３中のアミダイト化゛合物１（０，５ミリモル
、−１４７，７および−１４６，８ｐｐｍ　）に室温お
よびＮ２下で加えることにより混合物を生成し、この混
合物に１．２モル当量の５−ｏ−レズリニルチミノンお
よびコリゾンを加え、ジヌクレオシドホスファイトｒａ
（−１４ｏ、ｓおよび−１３９，９ｐｐｍ）を実質上定
量的な収率で得た。

Ｂ、アミダイト化合物Ｉ（０，５ミリモル）および３′
−〇−レプリニルチミノン（０，６ミリモル）’ｚｌＯ
ｍｍＮ、Ｍ、　Ｒ，管内に入れ、さらに２．５ｍｌの乾
燥アセトニトリル−ｄ３中の昇華したＩＨ−テトラゾー
ル（１，５モル）を窒素雰囲気中で加えた。３１Ｐ−Ｎ
、Ｍ、Ｒ，ス被りトルを直ちに記録し、　　Ｉａの定量
収率を表示した。同様に、化合物■、■およびＩｔ／’
１ｉ＝３’−レブリニルテミノンと反応させ、第■表に
示されている化合物１ｆ、、ＩＩＩａおよび■ａを生成
してジヌクレオシドを得た。５％ｖ／ｖＨ３ＰＯ４水溶
液内部標準に対する化合物■−ＩＶおよび１．、−ＩＶ
、の適切な化学シフトは。

第Ｈ表に記載する 第■表 Ｉ　　−１４６，０，−１４５，４−１４７，７，−１
４６，８９３，９５＊エニー１４６．３．−１４５．５
−１４８．０．−１４７．０　９２，９５＊エエエー１
４６．１．−１４５．８−１４７．４．−１４７．３　
９０．９８＊工Ｖ　−１４５，９，−１４５，７−１４
７，７，−１４７，２９０，９８＊工ａ　−１３９，６
，−１３８，９−１４０，８，−１３９，９９７＊★エ
エａ　−１３９，６，−１３９，０−１４０，６，−１
４０，０９４＊★ＩＩＩａ−１３９，７，−１３８，９
−１４１，０，−１３９，９９７社工Ｖａ　−１４０，
３，−１４０，２−１４３，６，−１４１，９９３★☆
☆　３１Ｐ−Ｎ、Ｍ、Ｒ，から求めた純度嚢☆　”Ｐ−
Ｎ、Ｍ、Ｒ，から求めた収率実施例２ クロロ−Ｎ、Ｎ−２置換アミノメトキシホスフインの他
の製法３１．５９５’のＮ、Ｎ−ツメチルアミノトリメ
チルシラン（４２，１ｍｌ！、０．２７モル）ｔ−５０
ｍＪ滴下漏斗に入れ、とのシラン１２５ｔｈｘＡ’の丸
底フラスコ中の２５ｒｎｌの冷（−１５℃）メトキシジ
クロロホスフィン（３５，１５ｆ、　０．２７モル）に
窒素雰囲気下で１時間にわたって滴下した。添加中に、
白色の未確認沈殿物が生成した。添加終了後、氷−アセ
トン浴を取外し、懸濁液を室温で１時時間攪拌した。次
に、長さ３０ｃｍ（１フイート）の真空ノヤケノト付ガ
ラスらせん（２，４ｍｍ　（３／　３２”　）　）カラ
ムに通して、反応混合物をゆっくり真空蒸留した。生成
物ヲ４０〜４２°Ｃ／　１３　ｍ＋ｎ　Ｈｇにおいて留
出し、かつ８１チの収率（３０，７７ｙ、０．２２モル
）で単離した。ｄ”＝１．１１５　Ｓ’／ｍ１０３１ｐ
　−Ｎ、Ｍ、　Ｒ，＝　（５％ＨＰＯ水溶液の内部標準
に対して）　−１７９，５ｐｐｍ　（ＣＤＣｌ３　）。

”Ｈ−Ｎ、Ｍ、Ｒ二重線３．８および３．６ｐｐｍＪ　
　＝１４Ｈｚ（３Ｈ，０ＣＨ３）および２つの単一線２
，８および２．６ｐｐｍ　（６Ｈ、Ｎ（ＣＨ３）２　）
　Ｏ’Ｊｔ量スペクトルはｍ／ｅ＝１４１において親ピ
ークを示した。ｃ３Ｈ９ｃｌＮｏＰの分析計算値：　Ｃ
，２４，４５；Ｈ，６，４２；Ｎ１９．９０　；　０゜
１１．３０　；　Ｐ１２１．８８、実験値：　Ｃ，２４
，５３；　Ｈ，６，２０；Ｎ、　　１０．０４　；０，
１１．０８；Ｐ、２１．４４上記方法は、クロロ−Ｎ、
Ｎ−クエチルアミノメトキシホスフィンおよびフクロピ
ロリジノ−メトキシホスフィンの製造に良好に適用され
た。

実施例３ 破すマー保Ｐ４ｆ体上におけるｒオキンオリコゝヌクレ
オチドの合成には、ホスホルアミダイトＩ〜■を利用す
る。即ち、シリカケ゛ルに共有結合したＮ−２−インプ
チリルデオキングアノ７ンに化合物Ｉ〜■を縮合させる
。例えば、ゴの位置でシリカゲル（２０■）に共有結合
したＮ−２−イソブチリルデオキングアノンン（１マイ
クロモル）、化合物Ｉ（１０マイクロモル）およびＩＨ
−テトラゾール（０，１ｍｌの乾燥アセトニトリル中の
閏マイクロモル）を２０分間振盪し、次に反応物を水性
ルチゾンで急冷した。同様な反応方法を化合物■、■お
よび■に対して行った。通常の酸化および脱保護基操作
の後、ｄ（ＴｐＧ）、ｄ（ＣｐＧ）、ｄ（ＡｐＧ）およ
びａ（ｃｐ、ｃ）を、それぞれ１００％、９８％、９４
％および９３％の収率で得た（　４９８ｍにおける７×
１０の吸光度を用いてジメトキシトリチルカチオンから
分光計により測定した）。

これらジヌクレオチドを蛇毒ホスホノエステラーゼによ
り完全に消化し、適切なヌクレオシドおよびヌクレオチ
ドを望ましい割合で得た（蛇毒ホスホ ノエステラーゼ フィー分析により確認した）。

次のデオキシヌクレオチドは、この方法音用いて合成さ
れたものである： ｄ（Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ
）　　ｄ（Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｃｌ
ｄ（Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ
ｌ　　ｄ（Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ）ｄ（Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ
−Ｃ−Ａｌ　　ｄ（Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−
Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ）ｄ（Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ
−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇｌ　　（１（Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ
−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｃ）ｄ（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−
’ＡーＴーＴーＧーＴ）　　ｄ（Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ）ｄ（Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ
−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔｌ　　ｄ（Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ）ｄ（Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ
−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ）　　ｄ（Ｃ−Ｇ−Ｇ−
Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ）ｄ（Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ
−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ）　　ｄ（Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ａ−
Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ）ｄ（Ａ，−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−
Ｇ−Ａ−Ｔ−’ｒ．Ｔ−Ａ）　　ｄ（Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−
Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ）ｄ（Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ
−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ）　　　ｄ（Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ
−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ）実施例４ 乾燥ＴＨｐ（３ｍｌ）中の５′−〇ーＤＭＴーＮーベン
ゾイルデオキシアデノシン（　ＤＭＴ　ｒｄ（ｂ　ｚＡ
））　（　０．６６　ｆ，　１ミリモル）を、−７８°
Ｃにおいてメチルジクｏｏホスファイト（０．１１３ゴ
、１．２ミリモル）および２，　４．　６−ドリメチル
ビリノン（０．６３３尻１，４．８ミリモル）含ムＴＨ
Ｆ　（３ｍ１）の攪拌溶液にアルゴン雰囲気中で滴下し
友。−７８°Ｃで１０分間保持した後、反応溶液を焼結
ガラス濾過器により濾過し、溶媒を真空濃縮により除去
した。生成したガム質をトルエン：ＴＨＦ　（２ｒｒｔ
ｌ、２°１）中で溶解することにより、過剰のメチルホ
スホジクロリダイトヲ除去し、真空中で再蒸発しガム状
にした。ツクＯＩＪダイトの除去を確実にするため、こ
の方法を数回くり返した。

ヌクレオシドホスホモノクロリグイトをテトラゾライド
に変換した。最終再蒸発から生じるガムをＴＨＦ（２ｍ
／）中に溶解した。次に、選ばれ次第２アミン（０，９
ミリモル）のＴＨＦ　（２Ｋｌ）溶液をヌクレオシドホ
スホモノクロリグイトに攪拌しながら一７８°Ｃで滴下
した。−７８°Ｃで１０分−間経過し之後、溶液を遠心
管に移し、低速度で回転させ、上澄液を除去した。この
溶液は活性ヌクレオシドホスホルアミダイ）ｔ−含んで
いる。直ちに使用しない場合には、このホスホルアミダ
イトラ乾燥インタン中に滴下して沈殿させ、次にこの沈
殿を集め、真空中で乾燥させ、室温あるいはそれ以下の
温度、例えばＯｏＣで、アルコ８ンあるいは他の不活性
ガスを入れた密封管中において長期間保存することがで
きる。すべての操作は酸化を避けるために不活性ガス中
で行なう。瞬時たりとも活性試薬を空気にさらしてはな
らない。

上記操作は、活性チミジン、デオキシシチジン、および
デオキシアデノシンヌクレオチドのＨ造に適用できる。

活性デオキシグアノシンヌクレオチドの製造の場合、使
用量以外の操作は同じである。

５’−０−ＤＭＴ−Ｎ−イソブチリルデオキシグアノシ
ン（ＤＭＴ　ｒｄ　（ｉｂＧ　）　）　　メチルジクロ
ロホスファイト：２．４．６−４リメチル％　ＩＪジン
°テトラゾールのモル比は、１　：　０．９　：　３．
８　：　０．７である。変性シリカケ９ルポリマ一保持
体に１つのヌクレオチドを添加するために必要な工程は
次の通りである。ジメトギシトリチル基は、０．１Ｍの
ＺｎＢｒ２’ｒ含むニトロメタンに変性シリカゲル保持
体ヲ１５〜３０分間さらすことによりヌクレオチドから
除去する。次に、最初ブタノール：２，６−ルチジン゛
ＴＨＦ　（容量で４°１：５）で、最後Ｋ　ＴＨＦで保
持体を洗浄する。

溶媒比は重要ではない。なぜならば、この工程はヌクレ
オシドの亜鉛エステルを除去するために利用するからで
ある。この工程は省略できるが収率が低下する。Ｚ　ｎ
　Ｂ　ｒ２の代りに、ＢＦ３、ＡｌＣｌ３およびＴ　ｒ
　Ｃ１４のような他のルイス酸も使用できる。しかしな
がらｓ　Ｚ　ｎ　Ｂ　ｒ２が好ましい。プロチン酸もま
た使用することができる。しかしながら、ノメトキシト
リチル基を除去するのに必要な最小限の貴゛まで酸の量
を減少させても、プロチン酸てよる各プリンの脱プリン
化は約３〜５チの割合であった。

この製法の次の工程は、保持体に共有結合したヌクレオ
シドあるいはオリヌクレオチドに対する保護され活性化
されたヌクレオチドの縮合である。

この縮合は、１０〜１５当量の活性ホスホルアミダイト
および約１時間の反応時間により達成することができる
。溶媒は無水ＴＨＦである。工程の次の段階は、未反応
５′−水酸基の保護である。これは無水酢酸、ジメチル
アミノピリジン、ビーリノンおよびＴＨＦの溶液を使用
して行なわれる。この段階ハ、また０、３３モルジエチ
ルモノトリアゾロホスファイトの２，６−ルチジン／’
Ｉ’ＨＦ（容量で１゛５）溶液を用いて行なう。反応時
間は５分であり、その後ＴＩ（Ｆによる洗浄を行なう。

他の態様としては、フェニルイソシアネート／ルチジン
（容量で４５　：　５５　）の溶液を用い、９０分の反
応時間でこの工程を実施する。次に、この溶液’ｉ、　
　ＴＨＦおよびアセトニトリルで保持体を洗浄すること
により変性ノリカグルから除去する。最初に述べた方法
の方が好ましい。この工程は省略することができ、ある
いは５′−水酸基と反応しかつ全く化学的に矛盾のない
他の試薬を用いることができる。しかしながら、この工
程を実施することにより、所望のオリヌクレオチドの最
終精製は非常に容易になる。このことは、保持体に結合
した全合成物質の複雑な状態が著しく減少するからであ
る。各サイクルにおける最終段階はホスファイトラホス
フェートに酸化することである。０．１モルＩ２組成〔
水／２，６−ルチジン／ＴＨＦ（１，１，３）〕は好ま
しいけれども、他の混合比を用いることもできる。さら
に、Ｎ−クロロスクシンイミドあるいはアリールあるい
はアルキル過酸化物、例えば過酸化し一ブチルのような
他の酸「ヒ剤もまた使用できる。所定の連続工程におけ
る適切な活性ヌクレオチドの添加後、チオキンオリゴヌ
クレオチドを塩基性加水分解によって保持体から除去し
、また保護基が存在する場合、その保護基は、選択的に
、即ち段階的に、あるいは水酸化アンモニウム中で５０
°Ｃの温度で加熱するような全体的な加水分解処理によ
り除去できる。Ｒ１がメチル基である場合、保持体から
オリゴヌクレオチドを除去する前に、チオフェノールで
処理することにより上記メチル基を除去する。

実施例５ クロロトリアリールメタンの一般的合成法この一連の化
合物の合成においては、各グリニヤール試薬用に２つの
タイプの基質がある。即ち（１）グリニヤール試薬の１
当量を要求するノアリールケトン、即ちベンゾフェノン
、および（２）　２当量を要求するアリールカルチン酸
のエステル。

次に前者について述べる。後者のタイプの反応に対して
は、適切な調整が必要である。

第■表 トリアリールカルビノールを合成するために使用する試
薬についての要約 試　薬　　　　　　　例　　　　　　　　ミリモル臭化
アリール　　ｐ−ブロモアニソール　　１００マグネシ
ウム　　　　　　　　　　　　　　１１０ソエチルエー
テル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０ｒ
ｎｌヨウ素　　　　　　　　　　　　　　　　２結晶ジ
アリールケトン　４−メトキシベンゾフェノンマグネシ
ウム、臭化アリールおよびエーテルを１０１００Ｏの丸
底フラスコ中で混合する。ヨウ素を加える。臭化アリー
ルマグネシウムの生成を開始させるためには、ガラス棒
でマグネシウムヲ砕くことが必要である。〔注：ワーリ
ングプレンダーを使用してマグネシウムを粉砕すること
も、また反応の進行？助ける。〕反応が開始すると、外
部から加熱することなしに、エーテルが沸騰を終えるま
で還流を続ける。ジアリールケトンのエーテル溶液を攪
拌しながら加える。反応は一晩続ける。

この時点で、エーテル゛ヘキサンが１；１の薄層クロマ
トグラフィー（ｔｉｅ　）によって反応物を分析する。

生成物のＲｆはおよそ０．７になる。

反応が充分に進行したならば、反応物ｒｌｏ％（ｗ／ｖ
）硫酸アンモニウムで急冷する。生成物を３００　ｒａ
ｔのトルエンで４回抽出する。抽出物を硫酸ナトリウム
上で乾燥しできるだけ蒸発させる。濃縮された有機相を
真空中で一晩乾燥する。この時点で、生成物が晶出する
。生成物のトリメタノールを漏斗内に集め、ヘキサンで
洗浄する。

トリメタノールヲ１００１１Ｌｌのトルエン中に入れる
。

２００ミｌＪモルの塩化アセチルを加える。３００ｍＪ
のヘキサンを加える。生成物ヲ−２０°Ｃで一晩再結晶
させる。結晶を集め、ヘキサンで洗浄し、さらに真空中
で乾燥する。

塩化トリチルの反応性を測定するために、その少量を水
および溶媒としてのトルエン含有のｎ−ブタノール中で
急冷する。３：１のヘキサン゛エーテルを用い薄層液体
クロマトグラフィーによって、試料を分析する。トリチ
ルブチルエーテルｌはおよそ０．８のＲｆｉ示し、一方
トリメタノールはおよそ０．４のＲｆを示す。

この方法を用いて、第（表に示す種々のアルコール全製
造した。

トリアリールメチルクロリドのいくつかを、好適に保護
されたデオキシヌクレオシドの５’水酸基と縮合させた
。これら化合物は第■表および第７表に示されている。

注意深く制御した条件全使用して、５’−１−リアリー
ルメチルデオキシヌクレオシド全プロ、チン酸およびル
イス酸で処理した。これらの試験の結果も第■表および
第７表に記載されている。これらの結果は、酸性溶液中
で異なる色を呈するいくつかのトリアリールメチル基が
ｚｎＢｒ２の存在でほぼ同じ速度で加水分解されること
を表わしている。これら速度はプロチン酸の場合に一層
変化し易い。

第　　■　　表　　・ デオキシヌクレオシドの５′−水酸基に結合したトリア
リールメチル基のルイス酸による加水分解速度（※１）
Ｒ１＝ｎ；Ｒ２＝ｃｒＲ３＝ａ　Ｔ　５Ｑ緑Ｒ１＝ｎ；
Ｒ２＝Ｃ；Ｒ３＝ＣＴ　６０赤Ｒ１＝Ｒ２＝ＣアＲ３＝
ａＴ６０橙 Ｒ１＝Ｒ２＝ｂＨＲ３＝ｎ　Ｔ　３Ｑ青Ｒ１”’Ｒ２”
’Ｃ１Ｒ３＝ａＣ４５橙Ｒ１＝Ｒ２＝ｂｉＲ３＝ｎ　Ｃ
３Ｑ青 Ｒ１＝Ｒ２＝ｂ；Ｒ３＝ＣＧ　２０　黒Ｒ１＝Ｒ２＝ｃ
：Ｒ３＝ａ　Ｇ　２０橙Ｒ１＝ｈｉＲ２＝Ｒ３＝ａ　Ａ
　４５黄（組）反応条件は０．０８　ＭＺ　ｎ　Ｂ　ｒ
２のニトロメタン溶液であった。アリコートヲ反応溶液
から取出し、酢酸アンモニウムで急冷し、　　ｔｌｃお
よびＨＣＩ蒸気にさらした後、可視的に分析した。採用
時間は１０．２０．３０．４５．６０．９０．１２０．
１８０、および２４０秒であった。

（東２）芳香族官能基は第１表の凡例に定義されている
。

（※３）記号Ｔ、　Ｃ，ＧおよびＡはヌクレオシドのチ
ミジン、Ｎ−ペンゾイルデオキンシチソン、Ｎ−イノプ
チリルデオそングアノ７ンおよびＮ−ベン／イルデオ牛
ンアデノンンである。ヌクレオシドの５′−水酸基が誘
導体化されトリアリール基？含む。

、ｉＰ　ＩＪママ−持体に共有結合した生成オリゴヌク
レオチドにモノヌクレオチドをくり返し添加する場合、
種々の色で符号化したトリアリールメチル基をほぼ同じ
速度で加水分解することが好ましい。

あるいは、各添加サイクルを人手で行なうならば、個々
にモニターしなければならず、あるいは上記サイクルを
機械で行なうならば、独立してプログラム化しなければ
ならない。ＺｎＢｒ２による加水分解速度は同じである
ので、第■表に概説された結果は、第１表に示したトリ
アリールメチルアルコールのすべてではないがその殆ど
を色符号化保護基として合成方法に利用することができ
るということを示している。

第７表 デオキシヌクレオシドの５′−水酸基に結合したトリア
リールメチル基のグロチン酸による加水分解速度（※１
）Ｒ１”　ｎｉ　Ｒ２−Ｃ；Ｒ３＝ＣＴ２Ｏ緑　　　　
４５Ｒ１＝ｒＢＲ２＝ｅ；　Ｒ３＝ＣＴ　　　　　　　
１８０　　　　　赤　　　　　ン６００Ｒ１＝Ｒ２＝ｃ
；Ｒ３＝ａＴ　　　　　ＯＮ　　　　　３℃Ｒ１°Ｒ２
°ｂｉ　Ｒ３＝　ｎ　　　　　Ｔ４５　　　青　　　　
　９０Ｒ１−Ｒ２＝Ｃ；Ｒ３−ａ　　　Ｃ−〇−橙　　
　　３０Ｒ１＝Ｒ２＝ｂ；　Ｒ３；ｎ　　　　　Ｃ４５
６０青　　　　１２０Ｒ１＝　Ｒ２＝　ｂ：　Ｒ３＝　
ａ　　　　Ｇ　　　　　１５　　　黒　　　　　４５Ｒ
１＝　Ｒ２＝　ｃ；　Ｒ３＝　ａ　　　　Ｇ　　　　−
０−橙　　　　３０Ｒ１＝ｈ２Ｒ２＝Ｒ３＝ａ　　　Ａ
　　　　６ｏ　　黄　　　　２４０（’ｉｆ１　）　反
応条件は２％トルエンスルホン酸のクロロホルム゛メタ
ノール（７：３）溶液であった。アリコーｈｔ反応溶液
から取出し、酢酸アンモニウムで急冷し、ｔｌｃおよび
ＨＣＩ蒸気にさらした後、可視的に分析した。採用時間
は１５．３０．４５．６０．９０．１２０．２４０．３
００オ、１：び６００秒Ｔ　ｈ　ッｆｃ。

（※２）芳香族官能基は第１表の凡例に定義されている
。

（※３）記号Ｔ、　Ｃ，ＧおよびＡはヌクレオシドのチ
ミジン、Ｎ−ペンゾイルデオキシノチノン、Ｎ−イソブ
チリルデオキシグアノノンおよびＮ−ペンゾイルデオキ
ンアデノンンである。ヌクレオシドの５′−水酸基を誘
導体化し、トリアリール基を含有させた。

第■表 第■表は選ばれたトリアリールメチルアルコール（７）
ス−ｅり）ル特性を示す。

Ｒ１＝　Ｒ２＝　ａ；　Ｒ３＝　ｈ　　　　　　　４５
２　　　　４２０００Ｒ１＝ａ；　Ｒ２＝ｃ；　Ｒ３＝
ｎ　　　：：：　　　２５０００Ｒ１＝　Ｒ２＝　ｂｉ
　Ｒ３＝　ｎ　　　　　　　５８６　　　　１５５００
（奎１）官能基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の定義については
第１表の凡例を参照。

（※２）飽和ｚｎＢｒ２ニトロメタン溶液中ですべての
スにクトルを得た。３５０ｎｍがら６００　ｎｍまで走
査して、すべてのスにクトルをカレイ（Ｃａｒｅｙ　）
モデル２１に記録した。

色符号化デオキノヌクレオチドホスホルアミダイトを使
用して、４種のデオキノオリゴヌクレオチドを合成した
。化合物はｄ（Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃｌ
、ｄ　（Ｃ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ
−Ａ　）、ｄ　（Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ
−Ｇ’−Ｃ−Ｔｌおよびｄ　（Ｃ−Ｃ−Ｃ’−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ　）であった。異なったト
リアリールメチル基で各デオキシヌクレオシドの５′−
水酸基を保護した。デオキシオリゴヌクンオチドの合成
に用いたこれらの基を第■表に示す。

第■表 トリアリールメチ４（ｍｌ）　　デオキシヌクレオシド
　　色（※２）Ｒ１；Ｒ２Ｍｂ７Ｒ３＝ｎ　　　Ｎ−ベ
ンゾイル２オヤッ７ｆジ、　　　　青 Ｒ１＝　ｂ；　Ｒ２＝　Ｒ３＝　ａ　　　Ｎ−ベンゾイ
ル　、　　　　黄デオキシアｒノンン Ｒ１”　ＣＸＲ２＝　ｎ；　Ｒ３＝　ａ　　　デオキシ
チミジン　　　　　赤Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃ；Ｒ３＝ａ　　Ｎ
−イソブチリル　　　　橙デオキシグアノシン （※１）芳香族官能基は第１表の凡例に定義されている
。

（栗２）　５’　−トリアリールフェニルデオキシヌク
レオシドをプロチン酸あるいはルイス酸にさらし、トリ
アリールメチル基の色を観察する。

例えば、Ｎ−ベンゾイルデオキシアデノシン、Ｎ−ペン
ゾイルデオキシンチジン、Ｎ−イソブチリルデオキシグ
アノシンおよびデオキシチミジンの５′−トリアリール
メチル基は、ルイス酸あるいはプロチン酸にさらされる
と、それぞれ黄、青、橙、および赤の色を呈する。これ
らのトリアリールメチｌレデオキンヌクレオンドを、こ
の明細書に記載し二ような方法で合成し之。適切な５′
−〇−トリアリールメチルおよびデオキシヌクレオシド
−Ｎ、Ｎ−ツメチルアミノメトキシホスフィンへの変換
ハ実施例６の方法を用いて行なった。

実施例６ ５′−トリアリールメチルアオキシヌクレオシドの一般
的合成５ミリモルのＮ−保護デオキシヌクレオシドある
いはチミジン１５０ｍ／の乾燥ピリジン中に溶解した。

試料を真空中で蒸発し、ガム状にした。２５ｒｔｔｌの
乾燥ピリジンを加えた。６ミリモルの塩化トリアリール
メチルを加えた。反応混合物を一晩振盪した。メタノー
ル：クロロボルム（１：９）ＯＨＱ中で反応をモニター
した。生成物は０．５のＲｆヲ有しかつ未反応のデオキ
シヌクレオシドは０．２のＲｆを有する。反応物’ｉ５
ｍ／の無水メタノールで急冷した。

３０分後、反応混合物を小容量に濃縮し、酢酸エチルに
吸収させ、さらに水で１回抽出した。有機相を硫酸ナト
リウム上で乾燥し、濃縮してガム状にし之。１．０ｒｎ
ｌのトルエノを加え、官らに３発させた。

次に、反応混合物をクロロホルム中に吸収させ、１％ピ
リノン含有クロロホルムを平衡させたンリカグルカラム
（５ｃｍ　Ｘ　２０ｃｍ）に導入した。化合物をカラム
に装填した後、カラムを１％ピリノン含有クロロホルム
で洗浄した。３〜６チのメタノールで化合物をカラムか
ら溶出した。所望の生成物を含む留分を集め、濃縮して
泡状とし、クロロホルム中に吸収させ、さらにヘキサン
中に沈殿させた。

沈殿物をプフナー漏斗内に集め、真空中で乾燥した。平
均収率は８５重量％であった。

第■表に略示したような官能基を有する５′−トリアリ
ールメチルデオキシヌクレオシドヲ、実施例１に従って
クロロ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノメトキシホスフィンに
結合した。実施例４の方法を用いて、デオキシオリゴヌ
クレオチドの合成の中間体として５′−トリアリールメ
チルデオキシヌクレオシド−３’−Ｎ、Ｎ−ツメチルア
ミノメトキンホスフィンを使用し念。従って、ｄ（Ｇ−
Ｔ−Ａ−Ｔ−へ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ）の合成
は、３′−ヒドロキシルに裏ってノリカケ゛ルに共有結
合しｆｔ　Ｎ−ペンゾイルデオキシシテジンから開始し
た。次の工程は５’　−ｏ−ｐ−トＩＪ　／レノフエニ
／Ｌ、　７＋　ｆ　ルー　Ｎ−ペンゾイルーデオキンア
デノン−３’−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノメトキンホスフ
ィンとの縮合である。アシル化および酸化の後、ニトロ
メタン、メタノール（１９：１）のＺ　ｎ　Ｂ　ｒ２飽
和溶液を用いて、脱トリチル化反応を行った。Ｎ−ベン
ゾイルデオキシアデノシンの添加を表示する黄色を観察
した。残りのヌクレオシドを同様な方法で加えた。各説
トリチル化段階中、次の連続順序で色採が観察された。

即ち、青、黄、赤、青、黄、黄、赤、黄、赤および橙。

期待した色が表われ、デオキシオリゴヌクレオチドが正
確に合成されたことを確認した。デオキシオリゴヌクレ
オチドは、逆相高性能液体クロマトグラフィーおよびプ
リアクリルアミドデルの電気泳動により行なった。

特性決定は二次元連続分析により行なった。〔サンガー
　（Ｓａｎｇｅｒ）　ｒ　　　ドネルソン［Ｄｏｎｅｌ
ｓｏｎ）　ｒ　−ｙウルソン　（Ｃｏｕｌｓｏｎ）　ｒ
　　コツセルｆＫｏｓｓｅｌ）　　およびフィッシャー
　（ｒｉｓｃｈｅｒｌ　　共著、ｆ、シーデインダス・
オ′・ナショナル・アカデミ−・オグ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　７Ｑ
巻、１９７３年、１２０９〜１２１３頁〕。この分析結
果から、比色結果によって表示されているように正確な
デオキシ第１ノコ９ヌクレオチドが合成されたことを再
確認し之。他の３つのデオキシオリゴヌクレオチドを合
成し、７５１つ同様にして特性決定を行った。

４つの列挙したオリゴデオキシヌクレオチドの合成に関
して、使用したンリカケ゛ルの量および・ンリカグル保
持体に結合したヌクレオシドの選択については第１表に
要約されている。

各縮合段階において、１２０？イクロモルの５′−〇−
トリアリールメチルヌクレオチド、アセトニトリル、お
よび４８０マイクロモルのテトラゾールを使用した。次
の段階は無水酢酸によるアシル化、■２による酸化およ
びＺｎＢｒ２による脱トリチル化である。各説トリチル
化段階の後、所望のトリチルカチオンに対応する期待し
た色を観察した。

各合成終了後、次の方法によりデオキシオリコゞヌクレ
オチドを単離した。シリカゾル（３０■）に共有結合し
た各デオキシオリコゞヌクレオチドを、最初チオフェノ
ール°トリエチルアミン、ジオキサン（１：１：２）で
９０分間処理し、メタノールで４回洗浄し、さらにノエ
チルエーテルで１回洗浄した。シリカゲルを遠心分離に
よって単離し、空気乾燥した。次に、各試料１ｔ−ブチ
ルアミンメタノール（１°Ｉ）により５０°Ｃで１８時
間処理し之。遠心操作後に得られた上澄み液を取出し、
真空中で乾燥した。次に、シリカケ°ルの試料を濃水酸
化アンモニウムにより室温で３時間処理し、ンリカケゞ
ルからデオキンオリゴヌクレオチドを除去しり。ｔ−ブ
チルアミ／の工程からの残渣を含む試験管に上澄みｉを
移し、溶液を真空中で濃縮した。新たな清水酸ｆヒアン
モニウムを乾燥残渣に加え、溶液を５０’Ｃで２２時間
暖め、アミン保護基をデオキンオリゴヌクレオチド塩基
から除去した。

試料を真空中で濃縮し、次に各試料全２００マイクｏ　
ＩＪノトルの水の中に溶解した。精製は逆相高性能液体
りＣマドグラフィーによって行なった。保持時間および
溶媒条件は第Ｘ表に示す。次に、各デオキシオリゴヌク
レオチド全８０チ酢酸により室温で１時間処理し、トリ
アリールフェニルメチル基を除去した。真空中での濃縮
後、各試料全ぼりアクリルアミドグルの電気泳動により
精製し、かつ正確なデオキシヌクレオチドの特性に関し
ては二次元連続分析により分析した。

第　　Ｘ　　表 （※１）緩衝水溶液は０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモ
ニウムを含む。

（シ＝ミ２）　２．０ｒｔｔｌ１分において１．２分／
に′。

（※３）ｌＪ７１Ｊ−ルメテル基ハソーｐ−アニシルフ
ェニルメチルであり、予備単離は２５％アセトニトリル
の下で行なった。

（※４）ト　リアリールメチル基はジー０−ア二シルー
１−ナフチルメチルであり、予備単離は２５％アセトニ
トリルの下で行なった。

（、＋ｆ５　）　）　ＩＪアリールメチル基ハノーｐ−
アニンルフェニルメチルであり、予備単離は２５％アセ
トニトリルの下で行なった。

特許出願人　　ユニパーシティ・・ぐテンソ、インコー
ホレーテッド

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの３′−
   ＯＨまたは５′−ＯＨ基をヌクレオシドフォスファイト
   と縮合させるオリゴヌクレオチドの製法において、前記
   ヌクレオシドフォスファイトは下記一般式で表わされる
   化合物のいずれかからなることを特徴とする製造法： ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
   表等があります▼ 式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩
   基；ＡはＨ、ＯＨまたはＯＲ＿４で、Ｒ＿４は保護基；
   Ｒは保護基、Ｒ＿１は約１０までの炭素原子を含有する
   ヒドロカルビル基；およびＸはＮＲ＿２Ｒ＿３であり、
   Ｒ＿２およびＲ＿３が個別に導入される場合には、それ
   ぞれ１０までの炭素原子を含有するアルキル、アリール
   、アラルキル、シクロアルキルおよびシクロアルキルア
   ルキルを表わし；Ｒ＿２およびＲ＿３が共に導入される
   場合には主鎖中に５までの炭素原子を含有し、合計で１
   ０までの炭素原子を含有し、かつ前記主鎖の両末端原子
   価結合はＲ＿２およびＲ＿３に結合すべき窒素原子に結
   合したアルキレン鎖を生成し：Ｒ＿２およびＲ＿３が付
   いた窒素と共に導入される場合には、窒素、酸素および
   イオウの群から選ばれた少なくとも１つの追加のヘテロ
   原子を含有する飽和窒素複素環を生成する。
2. （２）前記Ｒがトリチル基である特許請求の範囲第１項
   に記載の製造法。
3. （３）前記Ｒがジ−ｐ−アニシルフェニルメチルである
   特許請求の範囲第１項に記載の製造法。
4. （４）前記Ｒがｐ−アニシルジフェニルメチルである特
   許請求の範囲第１項に記載の製造法。
5. （５）前記Ｒ＿１が低級アルキルである特許請求の範囲
   第１項に記載の製造法。
6. （６）前記Ｘがジ低級アルキルアミノである特許請求の
   範囲第１項に記載の製造法。
7. （７）前記Ｘが飽和窒素複素環である特許請求の範囲第
   １項に記載の製造法。
8. （８）前記Ｂが、アデニン、グアニン、シトシン、ウラ
   シルおよびチミンである特許請求の範囲第１項に記載の
   製造法。
9. （９）前記Ｒがジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、Ｂが
   ９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）、Ｒ＿１がメチ
   ル、ＡがＨ、およびＸがモルホリノである特許請求の範
   囲第１項に記載の製造法。
10. （１０）前記Ｒがジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、Ｂ
    がチミニル、Ｒ＿１がメチル、ＡがＨ、およびＸがジメ
    チルアミノである特許請求の範囲第１項に記載の製造法
    。
11. （１１）前記Ｒがジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、Ｂ
    が１−（Ｎ−４−ベンゾイルシトシニル）、Ｒ＿１がメ
    チル、ＡがＨ、およびＸがジメチルアミノである特許請
    求の範囲第１項に記載の製造法。
12. （１２）前記Ｒがジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、Ｂ
    が９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）、Ｒ、がメチ
    ル、ＡがＨ、およびＸがジメチルアミノである特許請求
    の範囲第１項に記載の製造法。
13. （１３）前記Ｒがジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、Ｂ
    が９−（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）、Ｒ＿１が
    メチル、ＡがＨ、およびＸがジメチルアミノである特許
    請求の範囲第１項に記載の製造法。
14. （１４）前記ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドが
    共有結合で無機ポリマーに結合してなる特許請求の範囲
    第１項に記載の製造法。
15. （１５）前記ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドが
    塩基加水分解性共有結合で無機ポリマーに結合してなる
    特許請求の範囲第１４項に記載の製造法。
16. （１６）前記塩基加水分解性共有結合がエステル結合で
    ある特許請求の範囲第１５項に記載の製造法。