JPS61282396A - 新規ヌクレオチド及びその用途 - Google Patents
新規ヌクレオチド及びその用途Info
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- JPS61282396A JPS61282396A JP60122555A JP12255585A JPS61282396A JP S61282396 A JPS61282396 A JP S61282396A JP 60122555 A JP60122555 A JP 60122555A JP 12255585 A JP12255585 A JP 12255585A JP S61282396 A JPS61282396 A JP S61282396A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、新規で有用なヌクレオチド及びその用途に係
夛、更に詳細には、５′−リン酸化ヌクレオチド及びそ
れを利用した５′−リン酸化オリゴヌクレオチド及びそ
の製造方法に関する。
夛、更に詳細には、５′−リン酸化ヌクレオチド及びそ
れを利用した５′−リン酸化オリゴヌクレオチド及びそ
の製造方法に関する。
５′−リン酸化オリゴヌクレオチドを化学合成により製
造する方法は、液相法ではヌクレイツク・アシッズ・リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
）第１０巻第２３３７頁（１９８２）に記載され、固相
法ではヌクレイツク・アシッズφリサーチ第１２巻第８
６５９頁（１９８４）に記載されている。しかし、これ
らの方法は、合成に要する時間や製造収率の点で問題が
あり実用的な方法とはいい難い。
造する方法は、液相法ではヌクレイツク・アシッズ・リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
）第１０巻第２３３７頁（１９８２）に記載され、固相
法ではヌクレイツク・アシッズφリサーチ第１２巻第８
６５９頁（１９８４）に記載されている。しかし、これ
らの方法は、合成に要する時間や製造収率の点で問題が
あり実用的な方法とはいい難い。
実用的な５′−リン酸化オリゴヌクレオチドの固相リン
酸Ｆリエステμ法を用い九製造法は、特開昭６０−２８
９８５号公報に記載されている。該方法は、５′−リン
酸基に七μホリノ基を結合させたことによシ、収率の向
上に成功している。
酸Ｆリエステμ法を用い九製造法は、特開昭６０−２８
９８５号公報に記載されている。該方法は、５′−リン
酸基に七μホリノ基を結合させたことによシ、収率の向
上に成功している。
以上述べてきた公知の製造法は、すべてリン酸トリエス
テμ法を用いてオリゴヌクレオチド鎖を合成している。
テμ法を用いてオリゴヌクレオチド鎖を合成している。
リン酸トリエステμ法は、１５鎖長前後のヌクレオチド
鎖の合成には適しているが、それ以上の長さのヌクレオ
チド鎖を合成する場合原理的な限界がある。
鎖の合成には適しているが、それ以上の長さのヌクレオ
チド鎖を合成する場合原理的な限界がある。
本発明の目的は、固相面リン酸アミダイト法により、５
′−リン酸オリゴヌクレオチドを製造する九めに有効な
、新規のヌクレオチド、それｔ−利用した新規な５′−
リン酸化オリゴヌクレオチド及びその製造方法を提供す
ることにある。
′−リン酸オリゴヌクレオチドを製造する九めに有効な
、新規のヌクレオチド、それｔ−利用した新規な５′−
リン酸化オリゴヌクレオチド及びその製造方法を提供す
ることにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はヌクレオチ
ドに関する発明であって、下記一般式■： ＯＲ。
ドに関する発明であって、下記一般式■： ＯＲ。
Ｒ，０−Ｐ−Ｒ。
〔式中、Ｂは保護基を有し又は有しないプリン塩基又は
ピリミジン塩基、Ｒ１は式−ＮＲ′Ｒ＃（式中Ｒ′及び
Ｒ“は、同−又は異なシ、アμキμ基、アリーμ基、ア
フルキル基、Ｖクロアｙｖ！ｆｙｖ基若しくはシクロア
μキμアμキ〃基を示すか、又はその結合している窒素
と一緒になって、追加のへテロ原子を含有してもよい含
窒素複素環を形成する基を示す）で表わされる基、Ｒ２
と馬は同−又は異なシ保護基、馬は水素又は保護された
水酸基、Ｘは酸で選択的に除去できる保護基を示す〕で
表わされることを特徴とする。
ピリミジン塩基、Ｒ１は式−ＮＲ′Ｒ＃（式中Ｒ′及び
Ｒ“は、同−又は異なシ、アμキμ基、アリーμ基、ア
フルキル基、Ｖクロアｙｖ！ｆｙｖ基若しくはシクロア
μキμアμキ〃基を示すか、又はその結合している窒素
と一緒になって、追加のへテロ原子を含有してもよい含
窒素複素環を形成する基を示す）で表わされる基、Ｒ２
と馬は同−又は異なシ保護基、馬は水素又は保護された
水酸基、Ｘは酸で選択的に除去できる保護基を示す〕で
表わされることを特徴とする。
また本発明の第２の発明はオリゴヌクレオチドに関する
発明であって、下記一般式ｎ：〔式中Ｂは同−又は異な
シ、保護基を有し又は有しないプリン塩基又はピリミジ
ン塩基、Ｒｓと馬は水素又は同−若しくは異なる保護基
、現は水素、水酸基又は保護された水酸基、馬は水素又
は式−〇〇−Ｚ−Ｃｏ−Ｙ （式中２は直接結合又は２
価の脂肪族基、Ｙは固相担体含有基を示す）で表わされ
る基、Ｘは酸で選択的に除去できる保護基、ｎは０又は
１以上の整数を示す〕で表わされることを特徴とする。
発明であって、下記一般式ｎ：〔式中Ｂは同−又は異な
シ、保護基を有し又は有しないプリン塩基又はピリミジ
ン塩基、Ｒｓと馬は水素又は同−若しくは異なる保護基
、現は水素、水酸基又は保護された水酸基、馬は水素又
は式−〇〇−Ｚ−Ｃｏ−Ｙ （式中２は直接結合又は２
価の脂肪族基、Ｙは固相担体含有基を示す）で表わされ
る基、Ｘは酸で選択的に除去できる保護基、ｎは０又は
１以上の整数を示す〕で表わされることを特徴とする。
更に本発明の第３の発明は、上記第２の発明の保護基を
有する式■で表わされるオリゴヌクレオチド又はその脱
保護した化合物の製造方法に関する発明であって、下記
一般式■：〇〇−Ｚ−Ｃｏ−Ｙ 〔式中Ｂは同−又は異なシ、保護基を有し又は有しない
プリン塩基又はピリミジン塩基、Ｒ１は保護基、馬は水
素又は保護された水酸基、２は直接結合又は２価の脂肪
族基、Ｙは固相担体含有基、ｎはＯ又は１以上の整数を
示す〕で表わされるヌクレオシド−固相担体複合体又は
ヌクレオチド−固相担体複合体を、本発明の第１の発明
の式Ｉで表わされるヌクレオチドと活性化剤の存在下で
反応させ、次いで亜リン酸エステμをリン酸エステμへ
と酸化し、更に必要に応じて脱保護して、保護基を有す
る前記一般式■で表わされるオリゴヌクレオチド又はそ
の脱保護した化合物を得ることを特徴とする。
有する式■で表わされるオリゴヌクレオチド又はその脱
保護した化合物の製造方法に関する発明であって、下記
一般式■：〇〇−Ｚ−Ｃｏ−Ｙ 〔式中Ｂは同−又は異なシ、保護基を有し又は有しない
プリン塩基又はピリミジン塩基、Ｒ１は保護基、馬は水
素又は保護された水酸基、２は直接結合又は２価の脂肪
族基、Ｙは固相担体含有基、ｎはＯ又は１以上の整数を
示す〕で表わされるヌクレオシド−固相担体複合体又は
ヌクレオチド−固相担体複合体を、本発明の第１の発明
の式Ｉで表わされるヌクレオチドと活性化剤の存在下で
反応させ、次いで亜リン酸エステμをリン酸エステμへ
と酸化し、更に必要に応じて脱保護して、保護基を有す
る前記一般式■で表わされるオリゴヌクレオチド又はそ
の脱保護した化合物を得ることを特徴とする。
本発明の第１の発明である上記一般式ＣＩ）で表わされ
る５′末端水酸基が、リン酸化された保護ヌクレオチド
は、あらかじめ塩基部分と糖部分の５′水酸１＆（糖部
分がリボースの場合は２′水酸基をも）を保護した化合
物を原料として用い、例えば下記反応式によって合成す
ることができる。
る５′末端水酸基が、リン酸化された保護ヌクレオチド
は、あらかじめ塩基部分と糖部分の５′水酸１＆（糖部
分がリボースの場合は２′水酸基をも）を保護した化合
物を原料として用い、例えば下記反応式によって合成す
ることができる。
ＮＯ２
−〉−〉
上記式中、Ｒ５はＴＢＤＭ８又はアセチμ基（Ａｃ）Ｃ
Ｈ３ＣＨｓ れる基を示す。（以下同じ）。
Ｈ３ＣＨｓ れる基を示す。（以下同じ）。
まず、公知の方法〔例えばジャーナμ オプジ アメリ
カン ケミ力μ ソサＩティ（Ｊ。
カン ケミ力μ ソサＩティ（Ｊ。
Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、 ８０Ｃ，）第９７巻第７３３２頁
（１？７５つ等参照〕により調製できる化合物（１）を
出発物質として、３′位の水酸基を、好ましくはｔ−ブ
チμジメチＡ／Ｓ／すμクロフィト（又は無水酢酸）で
保護して化合物（２）とした後、５′水酸基を遊離させ
て化合物（３）へ導く。次に公知の方法（例えば特開昭
６０−２８９８５号）に基づき５′リン酸化合物（６）
を合成する。化合物（５）の３′水酸基を遊離させ化合
物（６）とした後その３′位に亜リン酸基を導入すれば
化合物（８）を製造することができる。この亜リン酸基
の導入法には上記反応式に示したとおシ、３種類の方法
がある。まず第１法は、テＦラヘドロン・レターズ（Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒ１３ ）第２４巻第
２４５頁（１９８Ｂ）に記載されている方法に基づいて
調製したＲ８及びＲ２両方が結合したモノハロゲ７′（
好ましくはクロロ）化合物（７）を化合物（６）と結合
させ化合物（８）を製造する方法であシ、第２法はＲ１
のみが結合したジハロゲノ（好ましくはジクロロ）化合
物１０）をまず化合物（６）の３′位に結合させた後向
−反応系内にＲ２０Ｍを添加し化合物（８）を得る方法
であυ、第３法はまず馬０が結合したジハロゲノ（好ま
しくはジクロロ）化合物（ト）を化合物（６）と結合さ
せた後、同一反応系内にＲ，Ｈを添加して化合物（８）
を製造する方法である。
（１？７５つ等参照〕により調製できる化合物（１）を
出発物質として、３′位の水酸基を、好ましくはｔ−ブ
チμジメチＡ／Ｓ／すμクロフィト（又は無水酢酸）で
保護して化合物（２）とした後、５′水酸基を遊離させ
て化合物（３）へ導く。次に公知の方法（例えば特開昭
６０−２８９８５号）に基づき５′リン酸化合物（６）
を合成する。化合物（５）の３′水酸基を遊離させ化合
物（６）とした後その３′位に亜リン酸基を導入すれば
化合物（８）を製造することができる。この亜リン酸基
の導入法には上記反応式に示したとおシ、３種類の方法
がある。まず第１法は、テＦラヘドロン・レターズ（Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒ１３ ）第２４巻第
２４５頁（１９８Ｂ）に記載されている方法に基づいて
調製したＲ８及びＲ２両方が結合したモノハロゲ７′（
好ましくはクロロ）化合物（７）を化合物（６）と結合
させ化合物（８）を製造する方法であシ、第２法はＲ１
のみが結合したジハロゲノ（好ましくはジクロロ）化合
物１０）をまず化合物（６）の３′位に結合させた後向
−反応系内にＲ２０Ｍを添加し化合物（８）を得る方法
であυ、第３法はまず馬０が結合したジハロゲノ（好ま
しくはジクロロ）化合物（ト）を化合物（６）と結合さ
せた後、同一反応系内にＲ，Ｈを添加して化合物（８）
を製造する方法である。
その他、一般式〔■〕における他の基の例としては、又
としてピペリジノ、３−フエ二μピペリジノ、クロロア
セチμ基、Ｒ１としてシアμキμアミノ基（例えばジメ
チルアミノ、ジイソプロピルアミノ）、モμホリノ基、
Ｒ２及びＲ３トして、一般的には、置換基としてハロゲ
ン、ニトロ基又はＶアノ基を持っていてもよいアμキμ
基、アリーμ基、アフμキル基、シクロアμキμ基又は
アシμ基（例えばメチμ、２−若し＜は４−クロロアセ
チμ、４−二Ｆロフエニμ、シアノエチμ、クロロアセ
チμ）、鳥における保護基として、中性又はそれに近い
緩和な条件下で脱離可能な基（例えばＴＢＤＭ８ ）、
そしてＢにおける保護基として、ベンシイｐ１イソブチ
リμ基が挙げられる。
としてピペリジノ、３−フエ二μピペリジノ、クロロア
セチμ基、Ｒ１としてシアμキμアミノ基（例えばジメ
チルアミノ、ジイソプロピルアミノ）、モμホリノ基、
Ｒ２及びＲ３トして、一般的には、置換基としてハロゲ
ン、ニトロ基又はＶアノ基を持っていてもよいアμキμ
基、アリーμ基、アフμキル基、シクロアμキμ基又は
アシμ基（例えばメチμ、２−若し＜は４−クロロアセ
チμ、４−二Ｆロフエニμ、シアノエチμ、クロロアセ
チμ）、鳥における保護基として、中性又はそれに近い
緩和な条件下で脱離可能な基（例えばＴＢＤＭ８ ）、
そしてＢにおける保護基として、ベンシイｐ１イソブチ
リμ基が挙げられる。
本発明方法において使用する一般式〔■〕で表わされる
ヌクレオシド−担体複合体又は、ヌクレオチド−担体複
合体は、不溶性担体として公知の材料例えば、コントロ
ーμド・ボア・グラス、シリカゲμ、ボリスチＶン、ポ
リアクリμアミド等を用い、これらの担体にあらかじめ
公知の方法でアミノ基を導入した後、ヌクレオシドの３
′−水酸基をスクシニμ基等でエステμ化した保護ヌク
レオシドと公知の方法でアミド結合又はイミド結合させ
て例えば下記反応式に従って合成することができる。
ヌクレオシド−担体複合体又は、ヌクレオチド−担体複
合体は、不溶性担体として公知の材料例えば、コントロ
ーμド・ボア・グラス、シリカゲμ、ボリスチＶン、ポ
リアクリμアミド等を用い、これらの担体にあらかじめ
公知の方法でアミノ基を導入した後、ヌクレオシドの３
′−水酸基をスクシニμ基等でエステμ化した保護ヌク
レオシドと公知の方法でアミド結合又はイミド結合させ
て例えば下記反応式に従って合成することができる。
ＱＣ（ＣＨ，）２ＣＯＮＨ−［Ｆ］
Ｉ
ａ■
ガ
上記反応式中、ＨＯＢＴはＮ−ヒドロキシベンゾトリア
シフイドを、ＤＣＣはジンクロヘキｖμカμホシイミド
を、また［Ｆ］は長鎖アμキμアミン・コントローμド
ウボア・グラスを表わ鳴上記式（２）の化合物は、一般
式（Ｉ［［］においてｎが０の場合を表わす。なおｎが
１以上の整数を表わす一般式（ＩＩＩ）のヌクレオチド
−担体複合体は公知の、固相リン酸トリエステμ法〔ヌ
クレイツク・アシッズ・リサーチ＄１０巻第１７５５頁
（１９８２））、固相ホスファイト法〔サイエンス（５
ｃｉｅｎｃｅ ）第２１４巻第２７０頁（１９８１））
、そして固相亜リン酸アミダイト法〔デトヲヘドロン・
レターズ第２２巻第１８５９頁（１？８１））などの方
法を用いて合成することができる。
シフイドを、ＤＣＣはジンクロヘキｖμカμホシイミド
を、また［Ｆ］は長鎖アμキμアミン・コントローμド
ウボア・グラスを表わ鳴上記式（２）の化合物は、一般
式（Ｉ［［］においてｎが０の場合を表わす。なおｎが
１以上の整数を表わす一般式（ＩＩＩ）のヌクレオチド
−担体複合体は公知の、固相リン酸トリエステμ法〔ヌ
クレイツク・アシッズ・リサーチ＄１０巻第１７５５頁
（１９８２））、固相ホスファイト法〔サイエンス（５
ｃｉｅｎｃｅ ）第２１４巻第２７０頁（１９８１））
、そして固相亜リン酸アミダイト法〔デトヲヘドロン・
レターズ第２２巻第１８５９頁（１？８１））などの方
法を用いて合成することができる。
本発明の第３の発明は前述した一般式［Ｉ）の保護ヌク
レオチドと、一般式（ＩＩＩ）のヌクレオシド又はヌク
レオチド−担体複合体を固相アミダイト法で結合させる
ものである。
レオチドと、一般式（ＩＩＩ）のヌクレオシド又はヌク
レオチド−担体複合体を固相アミダイト法で結合させる
ものである。
この結合を実現するに当っては、一般式［Ｉ）の保護ヌ
クレオチドを一般式（ｍ）の固相であるヌクレオシド−
担体複合体又はヌクレオチド−担体複合体に対して過剰
になるように使用するとよい。例えば、一般式（ｍ）の
固相に結合しているヌクレオシド又はヌクレオチドの５
′水酸基１モμに対して、一般式ＣＩ）の保護ヌクレオ
チドを２〜１０モ〃使用するのがよく、条件は、２０℃
〜３０℃の温度で３分〜１０分間反応させる。
クレオチドを一般式（ｍ）の固相であるヌクレオシド−
担体複合体又はヌクレオチド−担体複合体に対して過剰
になるように使用するとよい。例えば、一般式（ｍ）の
固相に結合しているヌクレオシド又はヌクレオチドの５
′水酸基１モμに対して、一般式ＣＩ）の保護ヌクレオ
チドを２〜１０モ〃使用するのがよく、条件は、２０℃
〜３０℃の温度で３分〜１０分間反応させる。
反応は、一般に溶媒中に一般式ＣＩ）の保護ヌクレオチ
ドと活性化剤を溶かした液に、一般式（ｍ”ｌ Ｏｙｔ
クレオシド又はヌクレオチドが結合した固相担体を分散
させて行う。使用しうる溶媒としては、例えば無水アセ
トニトリルが用いられる。用いる量は可能な限り少量を
用いるが、一般には一般式（Ｉ）の保護ヌクレオチドの
濃度が（Ｌ１〜α４モル濃度になるように使用する。
ドと活性化剤を溶かした液に、一般式（ｍ”ｌ Ｏｙｔ
クレオシド又はヌクレオチドが結合した固相担体を分散
させて行う。使用しうる溶媒としては、例えば無水アセ
トニトリルが用いられる。用いる量は可能な限り少量を
用いるが、一般には一般式（Ｉ）の保護ヌクレオチドの
濃度が（Ｌ１〜α４モル濃度になるように使用する。
縮合剤の使用量は、一般式〔Ｉ〕の保護ヌクレオチドに
対して七μ比で２〜４倍量を用いるのが好ましい。
対して七μ比で２〜４倍量を用いるのが好ましい。
かくすることによって一般式（Ｉｆ）で表わされる本発
明の１つの目的とする保護基のついたオリゴヌクレオチ
ドを合成できる。
明の１つの目的とする保護基のついたオリゴヌクレオチ
ドを合成できる。
本発明方法を実施するに当って、一般式ＣＩ）の保護ヌ
クレオチド及び一般式〔■〕のヌクレオシド又はヌクレ
オチドの結合した固相担体複合体中に存在する官能基、
例えばアミノ基、カルしておく必要がある。式ＣＩ）と
同じく、例えば前記Ｂで表わされる塩基部分のアミノ基
の保護基としてはアシμ基が好ましく、分子内ヌクレオ
チドリン酸基及び５′末端に結合したリン酸基の保護基
としては、例えばＱ−クロロフェニル基、ｐ−クロロフ
ェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、Ｖアノエチル基、メ
チμ基などが好ましく、３′末端のリン酸基の保護基は
Ｎ、Ｎ−ジイソプロピμエチｐアミ７基、モルホリノ基
などが好ましく、Ｒ４が保護された水酸基でおる場合、
その保護基は中性の緩和な条件で脱離できる置換基、例
えばｔ−ブチμジメチμシリμ基などのシリμ系の保護
基が好ましい。
クレオチド及び一般式〔■〕のヌクレオシド又はヌクレ
オチドの結合した固相担体複合体中に存在する官能基、
例えばアミノ基、カルしておく必要がある。式ＣＩ）と
同じく、例えば前記Ｂで表わされる塩基部分のアミノ基
の保護基としてはアシμ基が好ましく、分子内ヌクレオ
チドリン酸基及び５′末端に結合したリン酸基の保護基
としては、例えばＱ−クロロフェニル基、ｐ−クロロフ
ェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、Ｖアノエチル基、メ
チμ基などが好ましく、３′末端のリン酸基の保護基は
Ｎ、Ｎ−ジイソプロピμエチｐアミ７基、モルホリノ基
などが好ましく、Ｒ４が保護された水酸基でおる場合、
その保護基は中性の緩和な条件で脱離できる置換基、例
えばｔ−ブチμジメチμシリμ基などのシリμ系の保護
基が好ましい。
本発明方法によって製造される保護基を有すル一般式〔
■〕のオリゴヌクレオチドは次のごとく処理することに
より、５′−リン酸化オリゴマーとして得られる。
■〕のオリゴヌクレオチドは次のごとく処理することに
より、５′−リン酸化オリゴマーとして得られる。
すなわち、前記の保護基を有するオリゴヌクレオチドか
ら、保護基Ｘ及びＹで示されるポリマー残基部分、分子
内リン酸基の保護基の脱離を行う。
ら、保護基Ｘ及びＹで示されるポリマー残基部分、分子
内リン酸基の保護基の脱離を行う。
例えばまず、チオフェノ−μｍトリエチＡ／７ミンージ
オキサンの混液によりｓ Ｒ１で示される分子内リン酸
基の脱保護を行い、次に濃アンモニア水で塩基部分の脱
保護及び、固相担体からの切離しを行う。通常この段階
で、ゲ／Ｉ／Ｆ’過によって本発明の方法の反応中に形
成されることのある低分子区分を除去するとよい。
オキサンの混液によりｓ Ｒ１で示される分子内リン酸
基の脱保護を行い、次に濃アンモニア水で塩基部分の脱
保護及び、固相担体からの切離しを行う。通常この段階
で、ゲ／Ｉ／Ｆ’過によって本発明の方法の反応中に形
成されることのある低分子区分を除去するとよい。
次に、生成物を含む水溶液を希塩酸を用いてｐＨ２，０
にすることによシ５′末端リン酸基の保護基（ト）、例
えばモルホリノ基を脱離除去することができる。
にすることによシ５′末端リン酸基の保護基（ト）、例
えばモルホリノ基を脱離除去することができる。
かくして得られた目的物の精製は、例えばイオン交換ク
ロマトグツフィ又は逆相クロマトグラフィを用いて行い
必要とあればこれを繰返すことによって精製することが
できる。
ロマトグツフィ又は逆相クロマトグラフィを用いて行い
必要とあればこれを繰返すことによって精製することが
できる。
かくして得られた精製物が、５′末端にリン酸基が結合
した目的物であるか否かの検定には、種々の方法がある
が、一般には、酸で処理するカ又はアルカリホスファタ
ーゼで処理することで５′−リン酸基の除去を行い、そ
の前後のイオン交換クロマトグツフィー（ＨＰＬＣ）パ
ターンを比較することＫよυ、５′−末端リン酸基の存
在の有無を確認できる。また例えば自己相補鎖をつくる
ＤＮＡであれば、ＤＮＡリガーゼによって自己結合が生
ずるか否かを調査することにより確認することができる
。ま九生成物の塩基配列は、マクサム・ギルバート法又
は２次元ホモクロマトグラフィーで調査することができ
る。
した目的物であるか否かの検定には、種々の方法がある
が、一般には、酸で処理するカ又はアルカリホスファタ
ーゼで処理することで５′−リン酸基の除去を行い、そ
の前後のイオン交換クロマトグツフィー（ＨＰＬＣ）パ
ターンを比較することＫよυ、５′−末端リン酸基の存
在の有無を確認できる。また例えば自己相補鎖をつくる
ＤＮＡであれば、ＤＮＡリガーゼによって自己結合が生
ずるか否かを調査することにより確認することができる
。ま九生成物の塩基配列は、マクサム・ギルバート法又
は２次元ホモクロマトグラフィーで調査することができ
る。
以上述べたごとく本発明方法によれば、酸性条件で選択
的に脱離しうる保護基を有するリン酸基を５′−水酸基
に導入した一般式ＣＩ）の保護ヌクレオチドを用いるこ
とにより５′−末端水酸基が完全にリン酸化された一般
式〔■〕で示されるオリゴヌクレオチドの亜リン酸アミ
ダイト法による固相合成が可能であり、５′リン酸化オ
リゴヌクレオチドの化学合成において有利な技術を搗供
するものである。
的に脱離しうる保護基を有するリン酸基を５′−水酸基
に導入した一般式ＣＩ）の保護ヌクレオチドを用いるこ
とにより５′−末端水酸基が完全にリン酸化された一般
式〔■〕で示されるオリゴヌクレオチドの亜リン酸アミ
ダイト法による固相合成が可能であり、５′リン酸化オ
リゴヌクレオチドの化学合成において有利な技術を搗供
するものである。
版下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されない。
本発明はこれらに限定されない。
なお、第１表には、本発明の第１の発明における一般式
（Ｉ）で表わされる化合物の例の構造式を示す。また第
２表には、それら例示の化合物の元素分析１ｉｌ（４）
及び赤外吸収スペクトμ（ｆｆｉ−”）の各測定値を示
す。
（Ｉ）で表わされる化合物の例の構造式を示す。また第
２表には、それら例示の化合物の元素分析１ｉｌ（４）
及び赤外吸収スペクトμ（ｆｆｉ−”）の各測定値を示
す。
夾施例１
第１表に示す化合物Ｉａの製造
公知の方法により調製した化合物（１） （１１２ミリ
モＮ）をテトラヒドロフラン（５ｄ）Ｋ溶かし、氷水浴
で冷却下ピリジン（１ミリモ／Ｉ／）、ｔ−ブチ／Ｌ／
！／メチ／Ｌ／ Ｖ ｊｊμクロッイド（１４ミリモｆ
ｉ／）及び硝酸銀（α４ミリ七μ）を加えた。
モＮ）をテトラヒドロフラン（５ｄ）Ｋ溶かし、氷水浴
で冷却下ピリジン（１ミリモ／Ｉ／）、ｔ−ブチ／Ｌ／
！／メチ／Ｌ／ Ｖ ｊｊμクロッイド（１４ミリモｆ
ｉ／）及び硝酸銀（α４ミリ七μ）を加えた。
その後氷水浴を除き室温中１６時間かくはんを続ける。
反応の進行を薄層クロマトグラブイ−（ＴＩ、Ｃ）にて
確認した後、析出した＠塩をＰ別し、ｆ液を濃縮した。
確認した後、析出した＠塩をＰ別し、ｆ液を濃縮した。
濃＃１残渣をトルエン（５−）に溶かし、共沸によって
ピリジンを完全に除き、その残渣をクロロホルム（５（
ｌｄ）ｔ−用い抽出した。トリエチμアンモニウムビカ
ーボネート緩衝液（’Ｉ”ＥＡＢａ！ｆｒ液）（１，０
１！：μ濃度、２０−）次に水（２０ｍｇ）の順に洗浄
し、有機層を脱水後濃縮し、その残渣を少量のクロロホ
ルムに溶かし、シリカゲルカラムクロマトグツフィー（
キーゼμゲｌｖ６０ Ｈ，１５ｇ）に供した。クロロホ
ルム−メタノ−／Ｉ／混合溶液にて分離溶出させ、上記
化合物（２） （ＣＬ １７５ミｊＪ ｓｅ： ／Ｌ／
Ｖ ？ ７７’、８Ｚ５−）を得た。工”’：５４５
Ｑ（Ｎｕ）、１６７１及び１５５７（アミド）、１４８
８及び１２５４ （８１０Ｈ３）ｅｒａ−”、 ；ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣＡｓ）δ （ＬＯ９（ｓ、６ Ｈ、８１（Ｃ
Ｈｍ）＊）、ＩＩＬ８７（ｓ、 ９ Ｈ，８１Ｃ（ＣＨ
ｓ）ｓ）、 ２．４（ｍ。
ピリジンを完全に除き、その残渣をクロロホルム（５（
ｌｄ）ｔ−用い抽出した。トリエチμアンモニウムビカ
ーボネート緩衝液（’Ｉ”ＥＡＢａ！ｆｒ液）（１，０
１！：μ濃度、２０−）次に水（２０ｍｇ）の順に洗浄
し、有機層を脱水後濃縮し、その残渣を少量のクロロホ
ルムに溶かし、シリカゲルカラムクロマトグツフィー（
キーゼμゲｌｖ６０ Ｈ，１５ｇ）に供した。クロロホ
ルム−メタノ−／Ｉ／混合溶液にて分離溶出させ、上記
化合物（２） （ＣＬ １７５ミｊＪ ｓｅ： ／Ｌ／
Ｖ ？ ７７’、８Ｚ５−）を得た。工”’：５４５
Ｑ（Ｎｕ）、１６７１及び１５５７（アミド）、１４８
８及び１２５４ （８１０Ｈ３）ｅｒａ−”、 ；ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣＡｓ）δ （ＬＯ９（ｓ、６ Ｈ、８１（Ｃ
Ｈｍ）＊）、ＩＩＬ８７（ｓ、 ９ Ｈ，８１Ｃ（ＣＨ
ｓ）ｓ）、 ２．４（ｍ。
２Ｈ１Ｈ−２’）、＆４ ５ （ｍ、２Ｈ，Ｈ−５’
）、＆ ９ ０ （ａ、 ６ Ｈ，２０ＣＨ１）、
４．１０（ｍ。
）、＆ ９ ０ （ａ、 ６ Ｈ，２０ＣＨ１）、
４．１０（ｍ。
ＩＨ％Ｈ−５’）、４．４５ （ｆｉｌ、 Ｉ Ｈ，Ｈ
−４’入＆２８ （ｔ、 Ｉ Ｈ，！’！−１’）
、 ＆８５（（１，ＩＨ。
−４’入＆２８ （ｔ、 Ｉ Ｈ，！’！−１’）
、 ＆８５（（１，ＩＨ。
Ｈ−５）、 ７．３ ０ （ｍ、 １ ９ Ｈ，Ｂ
ｚ、Ｔｒ、ＮＨ）、ａ！５９（ｄ、 ＩＨ％ Ｈ−６
） 上記の化合物（２） （１ミリ−ｖ＝ ＊ ）を１［Ｌ
５’ｄ（７）塩化メチレンに溶かし、氷水浴中にて冷却
下かくはんしなから６チ（ｗ／ｖ ） ）リクロロ酢酸
塩化メチＶン溶液（１α９−）を滴下した。５０分間冷
却下かくはんを続けながら’Ｉ’ＬＣにてチェック後炭
酸水素すｔリウムを加え中和し反応を止めた。塩化メチ
レン（５０，ｔ）にて抽出し、水（２Ｘ５０ｍ）で洗浄
した後有機層を乾燥後濃縮し、残渣をカラムクロマトグ
ツフィー（？ｅ−−ゼμゲ／Ｌ／６０）！、５０ｇ）に
供した。クロロホルム−メタノ−／Ｉ−／混合液にて分
離溶出させ、上記化合物（３） （０，９ｆｉリモ／ｌ
／、 ９ Ｑ ％、 Ｖ’） ７Ｂｒ プ）を得た。ＩＲ，ν ５４２７（ＮＨ及び５ＬＸ ＯＨ）、１６６０及び１５５８（アミド）１４８６及び
１２６０ （５ｉＣＨ，）備−１；凋桓ＣＤＣｔｓ）δ
０．０９ ＣＢ、 ６Ｈ，８１（ＣＨ３）ｚ）、（１８
８〔８，９Ｈ、５ｉＣ（ＣＨｓ）ｓ ）、２．４２（ｍ
ｌ ２Ｈ１Ｈ−２’ ）、五９５（ｍ、３ＨＳＨ−３’
、Ｔ（−５’）、４．５０ （ｍ１１ Ｈ，Ｈ−４’）
、６．１８（ｔ。
ｚ、Ｔｒ、ＮＨ）、ａ！５９（ｄ、 ＩＨ％ Ｈ−６
） 上記の化合物（２） （１ミリ−ｖ＝ ＊ ）を１［Ｌ
５’ｄ（７）塩化メチレンに溶かし、氷水浴中にて冷却
下かくはんしなから６チ（ｗ／ｖ ） ）リクロロ酢酸
塩化メチＶン溶液（１α９−）を滴下した。５０分間冷
却下かくはんを続けながら’Ｉ’ＬＣにてチェック後炭
酸水素すｔリウムを加え中和し反応を止めた。塩化メチ
レン（５０，ｔ）にて抽出し、水（２Ｘ５０ｍ）で洗浄
した後有機層を乾燥後濃縮し、残渣をカラムクロマトグ
ツフィー（？ｅ−−ゼμゲ／Ｌ／６０）！、５０ｇ）に
供した。クロロホルム−メタノ−／Ｉ−／混合液にて分
離溶出させ、上記化合物（３） （０，９ｆｉリモ／ｌ
／、 ９ Ｑ ％、 Ｖ’） ７Ｂｒ プ）を得た。ＩＲ，ν ５４２７（ＮＨ及び５ＬＸ ＯＨ）、１６６０及び１５５８（アミド）１４８６及び
１２６０ （５ｉＣＨ，）備−１；凋桓ＣＤＣｔｓ）δ
０．０９ ＣＢ、 ６Ｈ，８１（ＣＨ３）ｚ）、（１８
８〔８，９Ｈ、５ｉＣ（ＣＨｓ）ｓ ）、２．４２（ｍ
ｌ ２Ｈ１Ｈ−２’ ）、五９５（ｍ、３ＨＳＨ−３’
、Ｔ（−５’）、４．５０ （ｍ１１ Ｈ，Ｈ−４’）
、６．１８（ｔ。
ＩＨ，Ｈ−１）、７．２２１−１１３２（，８Ｈ１Ｈ−
５、ＮＨ，ＢＺ、 Ｈ，６） 上記の化合物（３）（α８ミリモ／Ｉ／）を特開昭６０
−２８９８５号公報に記載されている方法に従ってリン
酸化し化合物（５） （０，７２ミリモル、９０チ、シ
ラツブ）を得た。ＩＲ，νｍａ工。
５、ＮＨ，ＢＺ、 Ｈ，６） 上記の化合物（３）（α８ミリモ／Ｉ／）を特開昭６０
−２８９８５号公報に記載されている方法に従ってリン
酸化し化合物（５） （０，７２ミリモル、９０チ、シ
ラツブ）を得た。ＩＲ，νｍａ工。
３４３６（ＮＨ）、１６６８及び１５５４（アミド）、
１４８６及び１２６０ （５ｉＣＨ，）、１３４８ （
Ｎｏ、）、１２６０及び９１ Ｂ （Ｐ−ＯＰｈ）ｙＲ
づ； ＮＭＲ（ＣＤＣｔ、）δα０９（ｓ、６１．５１
（Ｃ）ｉｓ）ｚ・〕、α８８ （１３、９Ｈ、５ｉＣ（
ＣＨＢ）ｓ ）、２．３（ｍ、２ＨＳＨ−２’）、五２
及び五５５（ｍ、８Ｈ，モルホリノ）、４．３２（ｍ、
４Ｈ。
１４８６及び１２６０ （５ｉＣＨ，）、１３４８ （
Ｎｏ、）、１２６０及び９１ Ｂ （Ｐ−ＯＰｈ）ｙＲ
づ； ＮＭＲ（ＣＤＣｔ、）δα０９（ｓ、６１．５１
（Ｃ）ｉｓ）ｚ・〕、α８８ （１３、９Ｈ、５ｉＣ（
ＣＨＢ）ｓ ）、２．３（ｍ、２ＨＳＨ−２’）、五２
及び五５５（ｍ、８Ｈ，モルホリノ）、４．３２（ｍ、
４Ｈ。
Ｈ−３′、４′、５′）、＆１６（ｔ、ＩＨ，Ｈ−１’
λ７．２−δ２５（ｍ、１２Ｈ，ＮＨ％Ｈ−５，６、Ｂ
ｚ ％ＰｈＮ０． ）。
λ７．２−δ２５（ｍ、１２Ｈ，ＮＨ％Ｈ−５，６、Ｂ
ｚ ％ＰｈＮ０． ）。
上記の化合物（５） （（Ｌ ４ミリモ／Ｌ／）をＡ２
ｄのテトラヒドロフランに溶かし、９．６ｇの酢酸を加
えた後テトフプチｐアンモニウムクロライド（１モル濃
度テトフヒドロフラン溶液）を４−滴下した。２４時間
室温にてかくはんを続けＴＬＣにて反応の進行を調べた
後溶媒を留去狐残渣ヲクロロホｐム（５０ｍ）にて抽出
した。
ｄのテトラヒドロフランに溶かし、９．６ｇの酢酸を加
えた後テトフプチｐアンモニウムクロライド（１モル濃
度テトフヒドロフラン溶液）を４−滴下した。２４時間
室温にてかくはんを続けＴＬＣにて反応の進行を調べた
後溶媒を留去狐残渣ヲクロロホｐム（５０ｍ）にて抽出
した。
Ｔ Ｅ Ａ、 Ｂ緩衝液（２０ｍ）、水（２０ｄＸ２）
の順に洗浄し、有機層を乾燥後濃縮した。その残渣をシ
リカゲμカラムクロマトグフフイー（キーゼμゲＡ／６
０Ｈ，２０ｇ）に供しクロロホμムーメタノー／Ｌ’混
合液にて分離溶出させ上記化合物（６）（１２７ミリモ
μ、６８チ、シラツブ）を得た。ＩＲν盃Ｒ至３３９０
（ＮＨ，Ｏ）り、１６５４及び１５６６（アミド）、１
４８６（Ｎｏｗ ）、１２６２及び９８２ （Ｐ−ＯＰ
ｈ）ｃｓｉ”’；ＮＭＲ（ＣＤＣ２３）δ１．０ （ｍ
、 Ｉ Ｈ，Ｈ−２’）、２．２５ （ｍ、 Ｉ
Ｈ，Ｈ−２’）、２．８０ （ｍ。
の順に洗浄し、有機層を乾燥後濃縮した。その残渣をシ
リカゲμカラムクロマトグフフイー（キーゼμゲＡ／６
０Ｈ，２０ｇ）に供しクロロホμムーメタノー／Ｌ’混
合液にて分離溶出させ上記化合物（６）（１２７ミリモ
μ、６８チ、シラツブ）を得た。ＩＲν盃Ｒ至３３９０
（ＮＨ，Ｏ）り、１６５４及び１５６６（アミド）、１
４８６（Ｎｏｗ ）、１２６２及び９８２ （Ｐ−ＯＰ
ｈ）ｃｓｉ”’；ＮＭＲ（ＣＤＣ２３）δ１．０ （ｍ
、 Ｉ Ｈ，Ｈ−２’）、２．２５ （ｍ、 Ｉ
Ｈ，Ｈ−２’）、２．８０ （ｍ。
ＩＨ，Ｏ）り、五２、Ｘ６（ｍ、８Ｈ，七μホリ ）
） 、 ４、 ５８（ｍ １ ４Ｈ，Ｈ−
３’ 、 ４’、５’）、＆２２ （ｔ、 Ｉ
Ｈ，Ｈ−１’）、７．３５− ａ １５（ｍ、１２Ｈ
，ＮＨ％Ｂｚ 、Ｈ−５，６、ＰｈＮ０２） 上記の化合物（６） （０，２ミリモ／Ｌ／）を６００
μｔのクロロホルムに溶解し、ジイソプロピμエチμア
ミン（Ｑ、８ミリモＪｖ）を加え氷水浴中にて冷却した
。その中にかくはんしながら、公知の方法〔テトラヘド
ロン・Ｖターズ第２４巻第２４５頁（１９８５）など〕
にて調製したリン酸化剤（７） （０，４ミリモ／Ｉ／
）を滴下した。’ｒＬＣ’にて反応の進行を確認し、２
０分後かくはんを止め、酢酸エチ／ｌ／（Ｓ Ｏｍｔ）
にて抽出した。
） 、 ４、 ５８（ｍ １ ４Ｈ，Ｈ−
３’ 、 ４’、５’）、＆２２ （ｔ、 Ｉ
Ｈ，Ｈ−１’）、７．３５− ａ １５（ｍ、１２Ｈ
，ＮＨ％Ｂｚ 、Ｈ−５，６、ＰｈＮ０２） 上記の化合物（６） （０，２ミリモ／Ｌ／）を６００
μｔのクロロホルムに溶解し、ジイソプロピμエチμア
ミン（Ｑ、８ミリモＪｖ）を加え氷水浴中にて冷却した
。その中にかくはんしながら、公知の方法〔テトラヘド
ロン・Ｖターズ第２４巻第２４５頁（１９８５）など〕
にて調製したリン酸化剤（７） （０，４ミリモ／Ｉ／
）を滴下した。’ｒＬＣ’にて反応の進行を確認し、２
０分後かくはんを止め、酢酸エチ／ｌ／（Ｓ Ｏｍｔ）
にて抽出した。
１５ ％ （ｗ／ｖ ）炭酸水素ナトリウム水溶液（２
〇−）、水（２０ｄＸ２）の順で洗浄し有機層を乾燥後
濃縮した。得られた残渣を２−のトμ二ンに溶解し、−
７８℃に冷却したヘキサン中に滴下し化合物（Ｉａ）（
０，１９６ミリモμ、ｑ ａ ｑｂ、 ハｅｙｆ −）
ｔｍｆｃ。ＩＲシＫＢｒ１６６８ａｘ 及び１５６０（アミド）、１４８６ （Ｎｏｗ）、１２
６２及び９ ａ ｏ （ｐ−ｏｐｈ）、１１８４及び１
０５８ （Ｐ−ＯＣ，Ｈ３）５に一’、ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｔ、 ） δ１．１５、ｔ ２３ （２ｇ、１２ Ｈ
、Ｎ（Ｃ（ＣＨｓ）ｚ）ｔｌ２．２５ （ｍ、 ２Ｈ，
Ｈ−２’）、五２及び五７（２ｍ ｓ ８ Ｈｚモル
ホリノ）、五５５ （ｄ。
〇−）、水（２０ｄＸ２）の順で洗浄し有機層を乾燥後
濃縮した。得られた残渣を２−のトμ二ンに溶解し、−
７８℃に冷却したヘキサン中に滴下し化合物（Ｉａ）（
０，１９６ミリモμ、ｑ ａ ｑｂ、 ハｅｙｆ −）
ｔｍｆｃ。ＩＲシＫＢｒ１６６８ａｘ 及び１５６０（アミド）、１４８６ （Ｎｏｗ）、１２
６２及び９ ａ ｏ （ｐ−ｏｐｈ）、１１８４及び１
０５８ （Ｐ−ＯＣ，Ｈ３）５に一’、ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｔ、 ） δ１．１５、ｔ ２３ （２ｇ、１２ Ｈ
、Ｎ（Ｃ（ＣＨｓ）ｚ）ｔｌ２．２５ （ｍ、 ２Ｈ，
Ｈ−２’）、五２及び五７（２ｍ ｓ ８ Ｈｚモル
ホリノ）、五５５ （ｄ。
５ Ｈ，Ｐ−ＯＣＲ，、ＪｐＨ−１４Ｈｚ ）、Ａ８（
ｍ。
ｍ。
２ Ｈ、Ｎ（ＣＨ）２ ）、４．５６（ｍ、４Ｈ，Ｈ−
３、；４．５）、＆２（ｔｌ １Ｈ，Ｈ−１’）、７．
５Ｏ−ａｌ ６ （ｍ、 １ ２Ｈ，Ｂｚ 、
ＮＨ，Ｈ−５゜６ ＰｈＮＯ２） 実施例２ 前記化合物Ｉｂの製造 実施例１において使用した化合物（７） （０，４Ｅリ
モ／Ｉ／）の代わりに下記化合物 を［１４ミリ七μを使用し、実施例１記載と同様の方法
による処理を行い−、下記化合物ｒｂ（１１６ミリモル
、８０％、パウダー）を得た。
３、；４．５）、＆２（ｔｌ １Ｈ，Ｈ−１’）、７．
５Ｏ−ａｌ ６ （ｍ、 １ ２Ｈ，Ｂｚ 、
ＮＨ，Ｈ−５゜６ ＰｈＮＯ２） 実施例２ 前記化合物Ｉｂの製造 実施例１において使用した化合物（７） （０，４Ｅリ
モ／Ｉ／）の代わりに下記化合物 を［１４ミリ七μを使用し、実施例１記載と同様の方法
による処理を行い−、下記化合物ｒｂ（１１６ミリモル
、８０％、パウダー）を得た。
廻施例３ 前記化合物ＩＩａの製造
実施例１において使用した化合物（１） （（ＩＬ ２
ミリモ〜〕の代わシに下記化合物 ＯＨ をα２ミリモル使用し、実施例１記載と同様の方法によ
る処理を行い下記化合物ｎａ（１１６４ミリ七μ、８２
％、パウダー）を得た。
ミリモ〜〕の代わシに下記化合物 ＯＨ をα２ミリモル使用し、実施例１記載と同様の方法によ
る処理を行い下記化合物ｎａ（１１６４ミリ七μ、８２
％、パウダー）を得た。
実施例４ 前記化合物ｎｂの製造
実施例１において使用した化合物（１） （（Ｌ ２ミ
リモｌ′ｖ）の代わりに下記化合物 ０）！ を１２ミリ七μ使用し、化合物（７） （ＣＬ ４ミリ
モμ）の代わシに下記化合物 をα４ミリモμ使用する点を除いて実施例１記載と同様
の方法による処理を行い下記化合物■ｂｌＬ１５ミリモ
／Ｍ、７５％、パウダー）を得た。
リモｌ′ｖ）の代わりに下記化合物 ０）！ を１２ミリ七μ使用し、化合物（７） （ＣＬ ４ミリ
モμ）の代わシに下記化合物 をα４ミリモμ使用する点を除いて実施例１記載と同様
の方法による処理を行い下記化合物■ｂｌＬ１５ミリモ
／Ｍ、７５％、パウダー）を得た。
実施例５ 前記化合物ｍａの製造
実施例１において使用した化合物（１）（１２ミリモｌ
ｖ）の代わシに下記化合物 ＯＨ をα２ミリ七μ使用する点を除いて実施例１記載と同様
の方法による処理を行ない下記化合物Ｈａ（ＣＬ１９５
ミリ七μ、９７チ、パウダー）を得た。
ｖ）の代わシに下記化合物 ＯＨ をα２ミリ七μ使用する点を除いて実施例１記載と同様
の方法による処理を行ない下記化合物Ｈａ（ＣＬ１９５
ミリ七μ、９７チ、パウダー）を得た。
実施例６ 前記化合物ｍｂの製造
実施例１において使用した化合物（１） （（Ｌ ２ミ
リモ／Ｌ／）の代わシに下記化合物 Ｈ をα２ミリ七μ使用し、化合物（７） （（Ｌ ４ミリ
モ／Ｌ／）の代わシに下記化合物 を（Ｌ４ミリ七ｙ使用する点を除いて実施例１記載と同
様の方法による処理を行い下記化合物■ｂ（（１１７ｔ
リモ／Ｉｚ、８５％、／（？ダー）ヲ得た。
リモ／Ｌ／）の代わシに下記化合物 Ｈ をα２ミリ七μ使用し、化合物（７） （（Ｌ ４ミリ
モ／Ｌ／）の代わシに下記化合物 を（Ｌ４ミリ七ｙ使用する点を除いて実施例１記載と同
様の方法による処理を行い下記化合物■ｂ（（１１７ｔ
リモ／Ｉｚ、８５％、／（？ダー）ヲ得た。
実施例７ 前記化合物Ｉ％’ａの製造
実施例１において使用した化合物（１） （１２ミリモ
逅）の代わりに下記化合物 ０Ｈ をα２ミリ七μ使用する点を除いて実施例１記載と同様
の方法による処理を行い下記化合物■ａ（α１７６ミリ
モμ、８８チ、パウダー）を得た。
逅）の代わりに下記化合物 ０Ｈ をα２ミリ七μ使用する点を除いて実施例１記載と同様
の方法による処理を行い下記化合物■ａ（α１７６ミリ
モμ、８８チ、パウダー）を得た。
実施例８ 前記化合物ＩＶｂの製造
実施例１において使用した化合物（１）（１２ミリモｆ
ｉ／）の代わシに下記化合物 Ｈ をα２ミリモル使用し、化合物（７） （０，４ミリモ
ｆｉ／）の代わりに下記化合物 ＯＣＲ，ＣＨ，ＣＮ をα４ミリモル使用する点を除いて実施例１記載と同様
の方法による処理を行い下記化合物■ｂ（０，１６ミリ
モμ、８０−、パウダー）を得た。
ｉ／）の代わシに下記化合物 Ｈ をα２ミリモル使用し、化合物（７） （０，４ミリモ
ｆｉ／）の代わりに下記化合物 ＯＣＲ，ＣＨ，ＣＮ をα４ミリモル使用する点を除いて実施例１記載と同様
の方法による処理を行い下記化合物■ｂ（０，１６ミリ
モμ、８０−、パウダー）を得た。
実施例 ９ ｄ（ｐＣＣＴＣＧＡＧＧ） ｐＸｈｏ
Ｉリンカ−の合成 公知の方法により合成した下記式 〔式中Ｏはコントロールド・ボア・グラス（ピアス（株
）製）を表わす〕を有するヌクＶオシドー固相担体（３
１１９，ヌクＶオＶド１μモｐ相当）を所定のカフムに
充てんし、核酸自動合成機（アプライド・バイオシステ
ムズ社製、モダ／Ｌ’５８０Ａ）を用いて亜すン酸アミ
ダイト沃のモノヌクレオチド結合方式（各５μ七μ使用
）にてＧ、Ａ、Ｇ、ｃ、Ｔ、そしてＣと順次結合させ最
後の結合に実施例１で得られた化合物ｌ５Ｌ（５μモ／
Ｉ／）を結合させた。公知の方法にて固相担体よシ切出
し、脱保護を行った後イオン交換中圧クロマトグラフィ
〔トーヨーバーμ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ） ６５０
ｇ （東洋曹達（株））〕にて精ＩＪしｐＸｈｏ Ｉリ
ンカ−（４０Ａ燗ユニツト）を得た。ポリヌクレオチド
キナーゼの交換に応を利用し、５′末端を１！Ｐでフペ
μした後２次元ホモクロマトグフフイを行い塩基配列が
正しいことを確認した。また得られたｐＸｈｏＩリンカ
−の５′末端にリン酸基が存在することは次の２種の方
法により調べた。まずイオン交換ＨＰＬＣ（’Ｉ’ＳＫ
−ゲμ、ＤｌｌｅＡＥ−２８Ｗ、 ４．６ Ｘ ２５０
胃）を用いてその溶出時間を測定した。ｐＸｈｏ Ｉ
！Ｊンカーにアルカリホスファターゼを作用すせた後の
溶出時間は５′末端にリン酸基の存在しないＸｈｏＩ
リンカ−（寅酒造（株）製）と一致することを確認した
。次にｐＸｈｏ Ｉリンカ−にＴ４ＤＮＡリガーゼを用
い自己結合を生成させ、その重合体が制限酵素ＸｈＯＩ
にて切断されることをポリアクリμアミトゲｐ電気泳動
によシ確認した。
Ｉリンカ−の合成 公知の方法により合成した下記式 〔式中Ｏはコントロールド・ボア・グラス（ピアス（株
）製）を表わす〕を有するヌクＶオシドー固相担体（３
１１９，ヌクＶオＶド１μモｐ相当）を所定のカフムに
充てんし、核酸自動合成機（アプライド・バイオシステ
ムズ社製、モダ／Ｌ’５８０Ａ）を用いて亜すン酸アミ
ダイト沃のモノヌクレオチド結合方式（各５μ七μ使用
）にてＧ、Ａ、Ｇ、ｃ、Ｔ、そしてＣと順次結合させ最
後の結合に実施例１で得られた化合物ｌ５Ｌ（５μモ／
Ｉ／）を結合させた。公知の方法にて固相担体よシ切出
し、脱保護を行った後イオン交換中圧クロマトグラフィ
〔トーヨーバーμ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ） ６５０
ｇ （東洋曹達（株））〕にて精ＩＪしｐＸｈｏ Ｉリ
ンカ−（４０Ａ燗ユニツト）を得た。ポリヌクレオチド
キナーゼの交換に応を利用し、５′末端を１！Ｐでフペ
μした後２次元ホモクロマトグフフイを行い塩基配列が
正しいことを確認した。また得られたｐＸｈｏＩリンカ
−の５′末端にリン酸基が存在することは次の２種の方
法により調べた。まずイオン交換ＨＰＬＣ（’Ｉ’ＳＫ
−ゲμ、ＤｌｌｅＡＥ−２８Ｗ、 ４．６ Ｘ ２５０
胃）を用いてその溶出時間を測定した。ｐＸｈｏ Ｉ
！Ｊンカーにアルカリホスファターゼを作用すせた後の
溶出時間は５′末端にリン酸基の存在しないＸｈｏＩ
リンカ−（寅酒造（株）製）と一致することを確認した
。次にｐＸｈｏ Ｉリンカ−にＴ４ＤＮＡリガーゼを用
い自己結合を生成させ、その重合体が制限酵素ＸｈＯＩ
にて切断されることをポリアクリμアミトゲｐ電気泳動
によシ確認した。
実施例１０ ｄ（ｐＧＣＴＧＣＡＧＣ）ｐＰｓｔ Ｉ
リンカ−の合成 公知の方法にて合成した下記式 を有するヌクレオシド−固相担体（５０岬、ヌクＶオシ
ド１９μモル相当）を所定のカフムに充てんし、実施例
９と同様にして、順次ヌクレオチドを結合させ最後に実
施例４で得られた化合物ｎｂ（５μモ／Ｉ／）を結合さ
せた。実施例９と同様の処理を行いｐＰｓｔ Ｉ ！ｊ
ンカー（３５Ａ、 ２６゜ユニット）を得た。塩基配列
決定及び５′末端のリン酸基の調査は、実施例９と同様
の手法により行いそれぞれ確認された。
リンカ−の合成 公知の方法にて合成した下記式 を有するヌクレオシド−固相担体（５０岬、ヌクＶオシ
ド１９μモル相当）を所定のカフムに充てんし、実施例
９と同様にして、順次ヌクレオチドを結合させ最後に実
施例４で得られた化合物ｎｂ（５μモ／Ｉ／）を結合さ
せた。実施例９と同様の処理を行いｐＰｓｔ Ｉ ！ｊ
ンカー（３５Ａ、 ２６゜ユニット）を得た。塩基配列
決定及び５′末端のリン酸基の調査は、実施例９と同様
の手法により行いそれぞれ確認された。
以上詳細に説明したように、本発明により、５′−リン
酸化オリゴヌクレオチドの製゛造に有用な５′−リン酸
化ヌクレオチドが新たに提供された。本発明による５′
−リン酸化ヌクレオチドは亜リン酸アミダイト法に使用
することが可能であり、長鎖の５′−リン酸化オリゴヌ
クレオチドを効率よく製造することができる。
酸化オリゴヌクレオチドの製゛造に有用な５′−リン酸
化ヌクレオチドが新たに提供された。本発明による５′
−リン酸化ヌクレオチドは亜リン酸アミダイト法に使用
することが可能であり、長鎖の５′−リン酸化オリゴヌ
クレオチドを効率よく製造することができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下記一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔 I 〕 〔式中、Ｂは保護基を有し又は有しないプリン塩基又は
ピリミジン塩基、Ｒ＿１は式−ＮＲ′Ｒ″（式中Ｒ′及
びＲ″は、同一又は異なり、アルキル基、アリール基、
アラルキル基、シクロアルキル基若しくはシクロアルキ
ルアルキル基を示すか、又はその結合している窒素と一
緒になつて、追加のヘテロ原子を含有してもよい含窒素
複素環を形成する基を示す）で表わされる基、Ｒ＿２と
Ｒ＿３は同一又は異なり保護基、Ｒ＿４は水素又は保護
された水酸基、Ｘは酸で選択的に除去できる保護基を示
す〕で表わされることを特徴とするヌクレオチド。 ２、下記一般式II： ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔II〕 〔式中Ｂは同一又は異なり、保護基を有し又は有しない
プリン塩基又はピリミジン塩基、Ｒ＿５とＲ＿６は水素
又は同一若しくは異なる保護基、Ｒ＿７は水素、水酸基
又は保護された水酸基、Ｒ＿８は水素又は式−ＣＯ−Ｚ
−ＣＯ−Ｙ（式中Ｚは直接結合又は２価の脂肪族基、Ｙ
は固相担体含有基を示す）で表わされる基、Ｘは酸で選
択的に除去できる保護基、ｎは０又は１以上の整数を示
す〕で表わされることを特徴とするオリゴヌクレオチド
。 ３、下記一般式III： ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔III〕 〔式中Ｂは同一又は異なり、保護基を有し又は有しない
プリン塩基又はピリミジン塩基、Ｒ＿２は保護基、Ｒ＿
４は水素又は保護された水酸基、Ｚは直接結合又は２価
の脂肪族基、Ｙは固相担体含有基、ｎは０又は１以上の
整数を示す〕で表わされるヌクレオシド−固相担体複合
体又はヌクレオチド−固相担体複合体を、下記一般式
I ： ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔 I 〕 〔式中、Ｂは保護基を有し又は有しないプリン塩基又は
ピリミジン塩基、Ｒ＿１は式−ＮＲ′Ｒ″（式中Ｒ′及
びＲ″は、同一又は異なり、アルキル基、アリール基、
アラルキル基、シクロアルキル基若しくはシクロアルキ
ルアルキル基を示すか、又はその結合している窒素と一
緒になって、追加のヘテロ原子を含有してもよい含窒素
複素環を形成する基を示す）で表わされる基、Ｒ＿２と
Ｒ＿３は同一又は異なり保護基、Ｒ＿４は水素又は保護
された水酸基、Ｘは酸で選択的に除去できる保護基を示
す〕で表わされるヌクレオチドと活性化剤の存在下で反
応させ、次いで亜リン酸エステルをリン酸エステルへと
酸化し、更に必要に応じて脱保護して、下記一般式II： ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔II〕 〔式中、Ｘ′は水酸基又はＸであり、Ｂ、Ｘ及びｎは前
記と同義であり、Ｒ＿５とＲ＿６は水素又は同一若しく
は異なる保護基、Ｒ＿７は水素、水酸基又は保護された
水酸基、Ｒ＿８は水素又は式−ＣＯ−Ｚ−ＣＯ−Ｙ（式
中Ｚ及びＹは前記式IIIと同義である）で表わされる基
を示す〕で表わされる化合物を得ることを特徴とするオ
リゴヌクレオチドの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60122555A JPS61282396A (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規ヌクレオチド及びその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60122555A JPS61282396A (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規ヌクレオチド及びその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61282396A true JPS61282396A (ja) | 1986-12-12 |
Family
ID=14838781
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60122555A Pending JPS61282396A (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規ヌクレオチド及びその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61282396A (ja) |
-
1985
- 1985-06-07 JP JP60122555A patent/JPS61282396A/ja active Pending
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