JPS61171497A - ルア−・ヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は天然のデオキシヌクレオチドとその塩基部分が
異なる、新規な化合物に関するものである。

遺伝子の塩基配列が明らかである場合には、その一部分
に相補的なりＮＡオリゴマーをプローブ（探索子）とし
て用い、コロニー・ハイブリダイゼーションやサザーン
・ハイブリダイゼーションの手法によって目的とする遺
伝子、それを含むプラスミドやコロニーを検出・単離す
ることができる。しかし現実には、ある遺伝子の発現に
よって産生される蛋白あるいはペプチドの部分的アミノ
酸配列が解明されていて、その配列に対応する遺伝子の
塩基配列を推定した上で、これを化学的に合成し、プロ
ーブとして利用する場合の方が圧倒的に多い。しかし、
アミノ酸コドンの３番目の塩基は、少数の例外を除いて
、２乃至４個の塩基が線型しており、そのうちどの塩基
が用いられているかは全く予想がつかないのである。そ
こで、通常は、考えられるすべての塩基配列の混合物と
してプローブを合成している。しかし、ハイブリダイゼ
ーションを有効に行うためには、１２から加個のヌクレ
オチドから成るＤＮＡオリゴマーが必要とされ、必然的
に混合物の組成は複雑なものとなる。更にこれ等混合プ
ローブを合成する場合、塩基によって縮合収率が異なる
とされ、最終的に得られるＤＮＡオリゴマー混合物中に
予想される塩基配列がすべて均等に含まれる可能性はな
い。原理的には唯一つの塩基配列が遺伝子に結合するこ
とになるのであるが、不幸にして本来必要であるべき配
列が欠落していることもありうる。故に混合プローブ合
成に際しては、理論的に可能な配列が全部含まれている
ことの実証が重要なのであるが、それを確認する一般的
方法は全く存在しない。

そこで一般的には、ｆ＃製操作時に不純物が混入する危
険を冒すことを覚悟の上で、目的物と思われる部分は徹
底的に回収する必要がある。かくして得られた混合プロ
ーブは通常、その５′末端水酸基を３２ｐ燐酸で放射標
識するが、プローブの組成が複雑なほど高比活性のγ−
（３２ｐ）　−ＡＴＰが要求され、実験を困難なものと
している。

ハイブリダイゼーションにおけるＤＮＡ二重鎖の安定性
は、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）あるン いはグアニン（Ｇ）とシ１４ン（Ｃ）間の塩基間水素結
合とそれらによって形成された塩基対の重なり（スタッ
キング）効果によるものとされている。ここで非天然型
の塩基でＡ、Ｔ、Ｃ，Ｇのいずれともある程度の水素結
合を形成し、更に塩基対同志のスタッキングをも可能な
らしめるものが存在すれば、縮重部分にそれを含む単一
組成のＤＮＡプローブが可能となる。

最近、フェニル基を上記目的に使用せんとした試み（Ｔ
、Ａ、ＭｉＺＬｉｃａｎら：　ＮｕｃＡｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　１２．７４３５（１９８４）
）が公表さ　　　　　　）れているが、この場合には塩
基間水素結合は全く存在せず、単なる塩基部分の「穴埋
め」として使用されたにすぎず、ハイブリダイゼーショ
ンの効果を著しく低下させる結果に留まった。

のスタッキングをも可能ならしめる塩基を含むヌクレオ
チドに対し「ルアー・ヌクレオチド」なる名称を提唱し
、この名称にふされしい化合物を提供すべく研究を重ね
た結果、次の一般式（１）で表わされる新規な化合物、 ２−オキソ−４−イミダゾリン−４−カルボキサミド（
ＯＩＣＡと略称）を含むデオキシヌクレオチド（ｄＯＩ
ｃＡ） （式中、Ｒ１は水素、水酸基の保護基、保護されていて
もよいホスホリル基、または５′位で結合する保護され
ていてもよいデオキシヌクレオチド鎖であり、Ｒ２は水
素、水酸基の保護基、保護されていてもよいホスホリル
基、または３′位で結合する保護されていてもよいデオ
キシヌクレオチド鎖である）。

が上記目的に適うことを見出し、本発明を完成したもの
である。

一般式（Ｉ）で表わされる本発明化合物において、ａｌ
　、　Ｒ２の水酸基の保護基としては、炭素数１〜２０
の脂肪酸残基、炭素数７〜１０の芳香族アシル基があり
、それらの具体例としては、アセチル。

イソブチリル、トリメチルアセチル、トリフルオロアセ
チル、クロルアセチル、トリチルオキシアセチル、フェ
ノキシアセチル、メトキシアセチル等の脂肪族アシル基
、及びその置換体、ベンゾイル、アニソイル等の芳香族
アシル基及びその置換体の他、ｐ−ニトロフェノキシカ
ルボニル、イソブチルオキシカルボニル、トリプロムエ
トキシカルホニル、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボ
ニルなどのアリールオキシカルボニル基、アルコキシカ
ルボニル基、及びその置換体が挙げられる。

さらに炭素数３〜１０のアルキルシリル（例えば、ｔ−
ブチルジメチルシリル）、炭素数５〜８のテトラヒドロ
ピラニル（例えば、テトラヒドロピラニル、メトキシテ
トラヒドロピラニル）、炭素数３〜ＩＯのアルコキシア
ルキル（例えば、２−エトキシエチル、２−メトキシエ
チル）、トリチルおよびその置換体（例えば、４−メト
キシトリチル。

４．４′−メトキシトリチルなど）等が例示される。

ａｌ　、　ａ２におけるホスホリル基の保護基としては
、０−クロルフェニル基、ｐ−クロルフェニル基、アニ
フィル基などのフェニル置換体、２，２゜２−トリクロ
ルエチル基、２−シアノエチル基（ＣＮＥ）、２−フェ
ニルチオエチル基など低級アルキル置換体、アニリノ基
またはその置換体、エチルチオ基など低級アルキルチオ
基が挙げられる。

几１．Ｒ２が５′位もしくは３′位で結合する保護され
ていてもよいデオキシヌクレオチド鎖である場合、デオ
キシヌクレオチド鎖はモノマーでもよいし２乃至（ト）
のヌクレオチドのオリゴマーでもよい。

０ＩＣＡは第１図に示す通り、イミダゾール環とカルバ
モイル基を利用して、Ａ、Ｔ、Ｃ，ＧのいずれともＨｏ
ｏｇｓｔｅｅｎ型あるいはＷａｔｓｏｎ　−Ｃｒｉｃｋ
型類似の水素結合を形成し、なお塩基対間のスクッキン
グにも寄与できると予想される。

因みに二重鎖ＤＮＡにおいては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉ
ｃｋ型の水素結合（第２図）が一般的とされるが、最近
では異常塩基を含むＲＮＡやＤＮＡにおいて、Ｈｏｏｇ
ｓｔｅｅｎ型の水素結合が存在しえると言われており、
さらに真核生物の遺伝子調節部位の一部であるＴＡＴＡ
−ＢｏｘにはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型の　Ａ−Ｔ塩基対が
優先する可能性のあることが示唆されている（中西洋志
９名用吉信、平石次部、山本修２第２回次世代産業基盤
技術シンポジウム（バ　　　　　　　１′イオテクノロ
ジー）予稿集、３９−５４頁）。

一般式（１）で表わされる本発明の化合物の製法の一例
を第３図に示す。

一般式（１）で表わされる化合物は、例えば５−ブロモ
ウリジン（Ｂ　Ｕ　ｄ　Ｒ，）　（ａ）を炭酸水素ナト
リウム水溶液中炭酸ガスを通じながら加熱して製造され
る公知化合物１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノ
シル）−２−オキソ−４−イミダゾリン−４−カルボン
酸（ｂ）（Ｂ、　Ａ、０ｔｔｅｒら、Ｊ。

Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、、３４．２６３６（１９６９））　
　を低級脂肪酸無水物（無水酢酸など）と塩基触媒の存
在下反応し、３′および５′位の水酸基を保護した後、
カルボン酸をエステル化する。該エステルとしては低級
アルキルエステル（Ｃ）や活性エステル（ｄ）（サクシ
ンイミドエステルなど）が挙げられる。

本エステル化は公知の方法、例えば塩基触媒（炭酸カリ
ウムなど）の存在下ハロゲン化アルキル（ヨードメタン
など）と有機溶媒（アセトンなど）中５〜３０時間加熱
するかまたは脱水触媒（ジシクロへキシルカルボジイミ
ドなど）の存在下活性エステル化剤（Ｎ−ヒドロキシ−
５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなど）
と有機溶媒（アセトニトリルなど）中氷冷下反応するこ
とにより製造できる。さらに上記で得たエステル体（Ｃ
またはｄ）をアンモノリシスすることによりアミド体（
ｅ）（化合物１：Ｒ，’、Ｒ２＝Ｈ）を製造することが
できる。アンモノリシスは低級アルキルエステルの場合
、例えば塩基性溶媒（ピリジンなど）液浸アンモニア水
と封管中４０〜１００℃で５〜３０時間反応する。また
活性エステルの場合、例えば濃アンモニア水と水冷下５
分〜１時間反応する。上記アンモノリシスにより３′お
よび５′位の水酸基の保護基は同時に除去されるが、必
要により、さらに濃アンモニア水と室温で０．５〜５時
間反応することにより除去することもできる。

上記で製造される化合物（（：Ｒ”、Ｒ２＝Ｈ）は、所
望により、公知の方法によりＦＬｌが水酸基の保護基、
保護されていてもよいホスホリル基または５′位で結合
する保護されていてもよいデオキシヌクレオチド鎖であ
り、几２が水酸基の保護基、保護されていてもよいホス
ホリル基または３′位で結合する保護されていてもよい
デオキシヌクレオチド鎖であ極比合物（１）に導くこと
ができる。

例えば、アミド体（ｅ）を完全保護されたトリエステル
法（例えば、８．　Ａ、Ｎａｒａｎｇら、　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓＥｎｚｙｍｏＺ、　、　　６８　９０　（’　７９
　）　ｉＣ付し、即ちアミド体（ｅ）の５′位の水酸基
を４，４′−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ　）等によ
り保護した後、３′位をリン酸化し、ｐ−クロルフェニ
ル、２−シアノエチル基等で該リン酸基を保護したもの
（ｆ：完全保護ルアー・ヌクレオチド）を得ることがで
きる。

上記した化合物Ｉの製造法の一例を第３図に示す。

この他、上記アミド化合物（ｅ）は亜燐酸エステル法と
称せられる方法（例えば、Ｌ、　Ｊ、　ＭｃＢｒｉｄｅ
ら、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　　
２４５（１９８３））を採用するための３価燐化合物中
間体とすることもできる。

ルアー・ヌクレオチドを含むＤＮＡオリゴマーの合成は
、通常のオリゴマー固相合成法（例えば、Ｊ、Ｅ、　Ｄ
ａｖｉｅｓら、　Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅｍ、、　９５２６
　（１９８３））によって実施することができる。更に
液相合成を行う場合には、（Ｉ）の３′位燐酸残基の保
護基の一つ（例えば、２−シア／エチル基）を除去した
のち、５′位に水酸基を有する適当な保護モノヌクレ言
ド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを縮合剤の存在
下反応せしめるか、あるいは（１）の５′位保護基を脱
離せしめたのち、３′位の燐酸保膿基の一つが除去され
た保護モノヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドを
縮合せしめる。かくして得られる完全保護オリゴマーは
更に保護オリゴマー縮合させ鎖を伸長させることができ
る。固相法によって任意の塩基配列を有するオリゴマー
を合成した場合にはオリゴマーの結合した担体をピリジ
ン−２−アルドキシムおよびテトラメチルグアニジン溶
液中、４０℃で一夜放置したのち（液相法の場合は必要
としない）、担体をテ去し、ろ液を濃縮し、濃アンモニ
ア水中でアシル保護基を除去する。粗生成分をＭＭＣ−
ＦＧＥＬ（山村化学研究新製、　ＯＤ８　　Ｉ　−４０
／４６）を用いて大まかに精製したのち、イオン交換高
速液体クロマト装置で目的とするオリゴマーを分取し、
脱塩したのち、８０％酢酸中でＤＭＴ保護基を除去する
。更に逆相系高速液体クロマトグラフ装置上で目的とす
るオリゴマーを精製する。

作用 次に０ＩＣＡの有効性を調べるために互いに相補的な２
本の１０１− ３’　　ＧＣＡＴＣＧＴＡＣＧ　　　５’・・・・・・
■５’　ＣＧＴＡＧＣＡＴＧＣ３’・・・・・・■を合
成し、■と■から成る二本鎖形成体（ｄｕｐＺｅｘ　）
の融解曲線を測定した。他方、ルアー・ヌクレオチドを
含む■の誘導体（１１１３，１１１’、１１１’、ＩＩ
Ｉ’、［［３・６）と■における５′末端から６番目の
ＣをＴに変更した化合物■０を各々合成した（第４図）
。

これらの合成したオリゴマー類は、Ｍａｘａｍ　−Ｑｉ
ｔｂｅｒｔ法（Ａ、　Ｍａｘａｍら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４．５６０（１９７７））によって
目的とする塩基配列を有することが確認されたが、０Ｉ
ＣＡが存在する部位には各レーン共同時にオリゴマーの
バンドが検出され、０ＩＣＡはＭａｘａｍ−Ｇｉ７ｂｅ
ｒｔ法におけるプリンおよびピリミジン塩基の修飾反応
を受けることが判明した。

次に■と■から成るｄｕｐｔｅｘの融解曲線と■の誘導
体と■とのｄｕｐｌｅｘの融解曲線を測定し、比較した
結果を第５図に示す。

第５図（ａ）　、　（ｂ）　、　（Ｃ）は■と■のｄｕ
ｐｔｅｘの融解曲線と、■と■の誘導体（ｌｌｌ３．　
ｍ’　、　ｍ’　、　ｍ’　、　ｍ３・６゜ＩＩＴ）の
ｄｕｐＬｅｘの融解曲線を併せて示した図であり、■に
おけるＡあるいはＴを０ＩＣＡで置換したものがルアー
・ヌクレオチドとしてより効果的であること、また■に
おけるＣあるいはＧを０ＩＣＡで置換したものも、天然
に存在する非ワトソンークリック型のＧ−φ塩基対を有
するｎ：ｎｔ”ｄｕｐｌｅｘとほぼ同等の融解温度をも
ち、ルアー・ヌクレオチドとして有効であることが判っ
た。

プローブとしての応用のほかにも、ルアー・ヌクレオチ
ドを含むＤＮＡオリゴマーは、一本鎖ＤＮＡファージを
利用する部位特異的変異法（５ｉｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃ
　ｍｕｔａｔｉｏｎ、例えばＣ６Ａ、Ｈｕｔｃｈｉｓｏ
ｎら、　Ｊ、　Ｂｉｏ４．Ｃｈｅｍ、　、　２５３　、
１５５１（１９７８））において、特殊な使い方が可能
である。すなわち、変異させる部位（１乃至４ケ所）に
は特異的であるが、同時にある塩基を他の３種の塩基に
変換させる方法（５ｉｔｅ　５ｐｅｃｉｆｉｅ　ｒａｎ
ｄｏｍ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）に応用することによって、
例えばプロモータ領域の数ケ所に可能な限りの変異を同
時に起こさせ、下流の構造遺伝子の発現量を指標するこ
とによって強力なプロモータ塩基配列を探索することが
できる。

以下の実施例によって、本発明をより具体的に説明する
。

実施例 実施例１゜ １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−
オキソ−４−イミダゾリン−４−カルボキシアミド（Ｉ
　：　Ｒ’、　Ｒ２＝Ｈ）の合成（其の−）＝１−（２
−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−
４−イミダゾリン−４−カルボン酸（１１ｇ、　５０ｍ
ｍｏｌ　）をピリジン（ｉｏｏ　ｍｉ　）に溶解し、さ
らに無水酢酸（ｉｏｏｍｇ）を加え、室温で２０時間攪
拌した。次に水（１０ｍ１　’）を加え、室温で１時間
攪拌したのち、溶媒を留去し、シリカゲル・カラムクロ
マトグラフィー〔メルク：キーゼルゲル６０　（０，０
６３−０，２００’ｍｔＩＬ、　４００　ｇ）　、展開
溶媒（酢酸／メタノール／クロロホルム、１：２：２８
））で精製し、油状のジアセタート（９，９９，６０，
２チ）を得た。ジアセタート（６０８■。

２ｍｍｏｌ）をアセトン（３０７７１１）に溶解し、こ
れに炭酸カリウム（２７６ｍｇ、　　２ｍｍｏｌ　）と
ヨードメタン（０，６ａｌｌ　）を加え、攪拌下１８時
間加熱還流させた。不溶物を戸去したのち、溶媒を留去
し、残留物を分取用薄層クロマトグラフィー〔メルク・
ＤＣ−フエルティッヒプラッテン帝キーゼルゲ／Ｌ／　
６０　Ｆ２．（層厚０．２５　ｍｍ　）　、展開溶媒（
メタノール／クロロホルム、１：５））によって展開し
、目的物を含む層をメタノール／クロロホルム（１“゛
）″″′′抽出油状０”−（°・５−Ｏ−）ｙｙセチル
−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキ
ソ−４−イミダゾリン−４−カルボン酸メチルエステル
（３７０ｒｎ９．５８％）を得た。本品にピリジン（５
ｍｌ）と濃アンモニア水（５ｒＩＬｌ）を混合し、封管
中６０°Ｃで四時間加熱した。溶媒を留去し、残留物を
上記薄層クロマトグラフィーで精製（展開溶媒、メタノ
ール／クロロホルム。

１：３）Ｌ／、含水エタノールで再結晶し、目的物（１
２３ｍ９．７４％）を得た。融点２０２−２０４℃　Ｈ
ｌ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）：δ２．　Ｏ−２，２（２Ｈ
。

ｍ　）　、　３．４７　（２Ｈ、ｔ　）　、　３．６３
−３．８１（ＩＨ。

ｍ　）　、　４．１２−４．３４　（ＩＨ、ｍ　）　、
　４．７６（ＩＨ。

ｔ）、５．１４（ＩＨ，ｄ）、５．８０（ＩＨ，ｔ）。

７．１９（２Ｈ，ｂ、ｓ、　）　、　７．３４（ＩＨ，
ｓ　）　。

１０．３９　（Ｉ　Ｈ、ｂ、ｓ、） 元素分析（Ｃｏ　Ｈ１３Ｎ３０５・　Ｈ２Ｏとして）計
算値：　Ｃ、４８，３６；　Ｈ，７，５４；　Ｎ　、　
１３．４３実験値：　Ｃ，４７，９８；　Ｈ，７，２３
；　Ｎ、　１３．２６実施例２゜ １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）＝２−
オキソ−４−イミダゾリン−４−カルボキシアミド（Ｉ
　：　Ｒ’　、　Ｒ２＝Ｈ）の合成（其の二）：実施例
１における中間体（カルボン酸のジアセタート、　９．
０９．２７．４ｍｍ０１　）とＮ−ヒドロキシ−５−ノ
ルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド（５，９ｇ、
　３２．９ｒｒＬｍＯｔ　）をアセトニトリル（１００
ｍｌ　）に溶解し、水冷下ジシクロへキシルカルボジイ
ミド（７，３ｇ、　３５．６ｍｍｏｌ　）を加え、室温
にて１時間攪拌した。析出物を戸去し、涙液に水冷下濃
アンモニア水（１３，８ｍ１）を加え、１５分間攪拌し
た。溶媒を留去し、残留物をメタノール／水（２：３）
混液（７０ｍｌ　）に溶解し、不溶物を戸去し、涙液を
濃縮乾固した。残留物を少量のクロロホルムに溶かし、
エーテル中に滴下することによって再沈澱を行い、１−
（３，５−０−ジアセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リ
ボフラノシル）−２−オキソ−４−イミダゾリン−４−
カルボキシアミド（８，０ｇ）を得た。本品を水／メタ
ノール（１：３）混液（４０ｍｌ）Ｋ溶カシ、濃アンモ
ニア水（２０ｍｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌した
のち、溶媒を留去した。残留物を含水エタノールで再結
晶し、目的物（４，５，９，６７，５％）を得た。

融点２０２−２０４℃。

元素分析（Ｃ９Ｈ１３Ｎ３０．・Ｈ２Ｏとして）計算値
：　Ｃ、４８，３６；　Ｈ，７，５４；　Ｎ、　１３．
４３実験値：　Ｃ，４８，２２；Ｈ，７，３３；Ｎ、　
１３．５０実施例３゜ ■−〔２−デオキシ−５−０−（４，４’−ジメトキシ
トリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−
４−イミダゾリン−４−カルボキサミド（Ｉ：几’＝Ｈ
、Ｒ２＝ＤＭＴ　）の合成：１−〔２−デオキシ−β−
Ｄ−リボフラノシル〕−２−オキソ−４−イミダゾリン
−４−カルボキサミド（３，３ｇ、　１３．５ｒｎｍｏ
ｌ　）を無水ピリジンで２回共沸脱水したのち、無水ピ
リジン（２０ｍｌ）に溶解し、４，４′−ジメトキシト
リチルクロリド（５，０ｇ、　１４．８ｍｍ０１　）を
加え室温で３時間攪拌した。溶媒を留去し、残留物をク
ロロホルム（１００ｍｌ）に溶かし、水洗したのち、ク
ロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、カラムク
ロマトグラフィー〔メルク・キーセルゲル６０　（０゜
０６３−０．２００　ｍｍ　、　１００　／　）　、展
開溶媒（メタノール／クロロホルム、１：２０）で精製
し、ニーチル／シクロヘキサン（１：２）混液中で粉末
化し、目的物（６，９９ｇ、　９４％）を得た。本品の
薄層クロマトグラフィー〔メルク・キーセルゲル６０Ｆ
２Ｓ４（Ｑ、５ｍｘ厚）プレート、溶媒（メタノール／
クロロホルム、１：１０））におけるＢｙ値は０．４５
であった。

実施例４゜ １−〔２−デオキシ−３−（ｐ−クロルフェル）−（２
−シアンエチル）ホスホリル−５−〇−（４，４’−ジ
メトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル〕−２−
オキソ−４−イミダゾリン−４−カルボキサミド（Ｒ”
＝　ＤＭＴ　。

以１・保護１−と略称す６）Ｏｆ成゛　　　　　　　　
　　）実施例３．で得られたジメトキシトリチル体（２
，７／ｉ　、　４０ｇｔｎｍｏｌ、　）を無水ピリジン
（ｌＱｍｌ）に溶解し、あらかじめ常法（例えば、Ｓ、
Ａ、Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏ７
．６８　、９０　（’７９　）　）に従ってｐ−クロル
フェニル燐酸ジクロリド（３，６１ｇ、　１４，７ｒｎ
ｍｏｌ　’）と１．２．４−トリアゾール（２，２６ｇ
、　３２．３　ｍｍｏＬ　）とから調製Ｌ／りｐ　−ク
ロルフェニル燐酸ジ・トリアゾリドのジオキサン溶液（
６０ＴｒＬｌ）を加えた。室温にて１時間攪拌したのち
、１−メチルイミダヅール（１，０ｍｌ　、　１２゜７
ｍｍｏｌ）と２−シアノエタノール（１，８７１！ｌ。

２６　ｍｍｏｌ　）を加え、更に室温で２時間攪拌を続
けた。次に５０Ｌ４ピリジン水（４ｍｌ）を添加したの
ち、クロロホルム（５０ｍｌ　）溶液とし、０．５Ｍ燐
酸−カリウム水溶液に続いて飽和食塩水で洗浄し、クロ
ロホルム層を濃縮乾固した。残留物をカラムクロマトグ
ラフィー〔メルク・キーセルゲル６０（０，０６３−０
，２００ｒｒＬｍ　、　６０　ｇ）　、展開溶媒（メタ
ノール／クロロホルム、１：２０））でｆｆ製り、、更
にシクロヘキサン中で粉末化し、目的物（３，０，９，
７８％）を得た。本品の薄層クロマトグラフィー〔メル
ク・キーセルゲル６０Ｆ２５４（０，５ｎＬｍ厚）プレ
ート、展開溶媒（メタノール／クロロホルム（１：１０
））におけるＲｆ値は０．６０であった。

実施例５゜ ５’　ＣＧＴＩｍＧＣＡＴＧＣ（［［’）の合成：ポリ
スチレンに保持されたＤＭＴＣ２−■（３０ダ、和光紬
薬製造）を固相合成装置に納め、３チドリクロル酢酸（
ＴＣＡと略称）のジクロルメタン溶液と接触させ、５′
位のＤＭＴ基を除去し、ＰＡｒＣｌ　はｐ−クロルフェ
ニルおよび２−シアＮＥ ノエチル基で保護された３′位燐酸残基を示す）の２−
シアノエチルをあらかじめ塩基性条件下で除去したもの
を、メシチレシスルホニルー３−二トロトリアゾリド（
ＭＳＮＴと略称）３０ｍｙの存在下、４０°Ｃ９２０分
間反応させた。かくして得られた　　ＴＧｉＢＣＢ２−
■を再びＴＣＡ溶液で処ＭＴ 理して５′位のＤＭＴ基を除去したのち、常法に従って
、ＣＡ、Ｇ、保護されたＩｍ　、ＧＴ　、Ｃの順に七ツ
マー乃至ダイマーを縮合させ、を得た。

これを０．５Ｍピリジンアルドキシムおよびテトラメチ
ルグアニジンの混合溶液（１，８７ＦＬｎ）で処理した
のち、樹脂を除去し、涙液を濃縮し、濃アンモニア水（
２０ｍｌ）を加えて、６０℃、４時間封管中で加熱した
。反応液を一旦濃縮したのち、イオン交換高速液体クロ
マトグラフィー（ＰａｒｔｉｓｉｌｌｏＳＡＸ、溶媒＝
５チアセトニトリルおよび３１アセトニトリルの０．３
Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４溶液（ＰＨ６，３））により直線濃度
勾配法により精製した。

最も遅く溶出される目的フラクションを脱塩したのち、
８０チ酢酸でＤＭＴを除去し、逆相高速液体クロ７トグ
ラ７　イー　（ＮｕｃＡｅｏｓｉ１５　Ｃ１，。

溶媒：５チアセトニトリルを含む０．１ＭＭリエチルア
ミンー酢酸（ＴＥＡＡ）溶液および４０％アセトニトリ
ルを含む０．ＩＭＴＥＡＡ溶液の直線濃度勾配法で溶出
〕によって精製し、目的とするＤＮ八へリゴ７−　（３
００Ｄ　２１！Ｏ）を得た。

実施例６゜ ５′　ＣＧＩｍＡＧＩｍＡＴＧＣ（■３１６）の合成：
ＤＭＴＣ８２−■２５１ｎ９．市販ノ保護七ツマ−アル
いはダイマーを用い、実施例５．と同様にして、次の順
序で 含１ｍ１Ｏマーを合成し、逆相およびイオン交換高速液
体クロマトグラフィーを用いて精製し、目的物（２５０
Ｄ　２６Ｇ　）を得た。

実施例７゜ 溶解温度（Ｔ−）曲線０測定゛　　　　　　　　　　　
　　　１１０マー（ＩＩ　、　０．３０Ｄ２６゜）にｍ
、ｍ３．ｍ’。

Ｉｎ５．ＩＩＩ’　ｔ　ＤＩ”　＊　ＤＩ３・６をそれ
ぞれ０．３０Ｄ２６゜混合し、１Ｍ食塩水溶液（０，５
ｙｘＡ）としたものを１００°Ｃで５分加熱したのち、
徐々に室温迄戻し、ＧｉＺｆｏｒｄ　２５０　Ｐｈｏｔ
ｏｍｅｔｅｒを使用して、２０”Ｏから９０°Ｃ迄毎分
１℃の速度で温度を上昇させ、Ｔｍ曲線を描かせた。各
Ｔｍ曲線を第５図（ａ）　、　（ｂ）　、　（Ｃ）に示
す。

第５図において一一一が■と■のｄｕｐｌｅｘの融解曲
線であり、第５図（ａ）では■におけるＡあるいはＴを
０ＩＣＡで置換したｎｒ３　、　ｍ４と■との融解曲線
を併せて示しているが、この場合融解温度の低下が僅か
であり、０ＩＣＡを有するルアー・ヌクレオチドが効果
的に働いていることが判る。

一方、＠５図（ｂ）に見られるように、ＧあるいはＣを
０１ＣＡで置換した■ｓ　、　ｍ６は大幅なＴｍ値低下
が認められた。

ＤＮＡの二本鎖において、ＡとＴの対よりもＧとＣの対
の方が強固な水素結合を形成していることはよく知られ
ている事実であるが、第５図（ａ）と第５図（ｂ）とか
らもＣあるいはＧを他の塩基に変化させた場合の影響の
大なることが示された。しかし、天然にも存在し、非Ｗ
ａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の水素結合とスクッキングを
通じて分子安定化に関与しているＧ−Ｔ塩基対（第６図
、　Ｄ、　Ｊ、Ｐａｔｅｌら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　
４３７　（１９８２）　）を有する■１が■５あるいは
■６とほぼ同等なＴｍ値を示す（第５図（ｂ））ことか
ら、０ＩＣＡはＧあるいはＣとＧ−Ｔ塩基対に匹敵する
水素結合を形成していると結論づけられる。

更に第５図（Ｃ）に示されるように２個の０ＩＣＡを有
する■３・６においても、Ｔｍ値は加速的に減少するの
ではなく、■３と■６の場合におけるＴｍ値減少を加酸
したものにほぼ等しいことが見出された。

以上の知見は、０ＩＣＡを有するルアー・ヌクレオチド
が縮重部位を含むＤＮＡプローブにおいて有効に利用さ
れうろことを示すものである。

【図面の簡単な説明】

＠１図は０ＩＣＡと天然のＤＮＡのＡ、Ｔ、Ｃ。 ＧとのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型あるいはＷａｔｓｏｎ−Ｃ
ｒｉｃｋ型類似の水素結合を示す模式図であり、第２図
は天然二重鎖ＤＮＡにおけるワトソンークリック型の水
素結合を示す模式図である。 第３図は本発明ｄＯＩｃＡ化合物の製造法の一例を示す
工程図である。 第４図は天然およびｄＯＩｃＡで一部置換されりＤ　Ｎ
　Ａオリコマ−の構成、および各ｄｕｐｌｅｘの融解温
度を示す図である。 第５図（ａ）　、　（ｂ）　、　（Ｃ）は第４図に示し
た各ｄｕｐｔｅｘの融解曲線である。 第６図は天然のＤＮＡに存在するＧ−Ｔ塩基対の非ワト
ソンークＩＪ　、り型水素結合を示す模式図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 次の一般式（ I ）で表わされる１−（２−デオキシ−
   β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−４−イミダゾ
   リン−４−カルボキサミド化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒ＾１は水素、水酸基の保護基、保護されてい
   てもよいホスホリル基、または５′位で結合する保護さ
   れていてもよいデオキシヌクレオチド鎖であり、Ｒ＾２
   は水素、水酸基の保護基、保護されていてもよいホスホ
   リル基、または３′位で結合する保護されていてもよい
   デオキシヌクレオチド鎖である）。