ES2873933T3 - Una mutación de MEK1 que confiere resistencia a inhibidores de RAF y de MEK - Google Patents

Una mutación de MEK1 que confiere resistencia a inhibidores de RAF y de MEK Download PDF

Info

Publication number
ES2873933T3
ES2873933T3 ES17201390T ES17201390T ES2873933T3 ES 2873933 T3 ES2873933 T3 ES 2873933T3 ES 17201390 T ES17201390 T ES 17201390T ES 17201390 T ES17201390 T ES 17201390T ES 2873933 T3 ES2873933 T3 ES 2873933T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
mek1
protein
inhibitor
amino acid
mek
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17201390T
Other languages
English (en)
Inventor
Levi Garraway
Caroline Emery
Nikhil Wagle
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dana Farber Cancer Institute Inc
Original Assignee
Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dana Farber Cancer Institute Inc filed Critical Dana Farber Cancer Institute Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2873933T3 publication Critical patent/ES2873933T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/005—Enzyme inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/12—Dual-specificity kinases (2.7.12)
    • C12Y207/12002—Mitogen-activated protein kinase kinase (2.7.12.2), i.e. MAPKK or MEK1 or MEK2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Abstract

Un método de identificación de un compuesto eficaz para inhibir una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido C121S, comprendiendo el método: a) proporcionar una composición de ensayo que comprende: una proteína MEK1 mutante que tiene actividad MEK1, donde la actividad MEK1 comprende la fosforilación de ERK1/2, comprendiendo la proteína MEK1 mutante una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2 donde la sustitución de aminoácido es una sustitución de aminoácido C121S, confiriendo la sustitución de aminoácido C121S resistencia a un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK; y un sustrato de MEK; b) poner en contacto la composición de ensayo con un compuesto de ensayo en condiciones que permiten la fosforilación del sustrato de MEK en ausencia del compuesto de ensayo; y c) determinar el efecto del compuesto en la fosforilación de un sustrato de MEK; en el que la reducción modulada de la fosforilación del sustrato de MEK en comparación con un control adecuado identifica al compuesto de ensayo como un compuesto eficaz para inhibir una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido C121S.

Description

DESCRIPCIÓN
Una mutación de MEK1 que confiere resistencia a inhibidores de RAF y de MEK
Investigación o desarrollo patrocinado por el gobierno
La presente invención se realizó con apoyo del Gobierno en virtud de la subvención n.° K08 CA115927, otorgada por el Instituto Nacional de la Salud. El Gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
Antecedentes de la invención
El tratamiento del cáncer es uno de los mayores desafíos de la medicina moderna. Aunque los agentes quimioterapéuticos normalmente son un medio eficaz de tratamiento o reducción de los síntomas asociados con el cáncer, en algunos casos, durante el tratamiento, se manifiesta resistencia a uno o más agentes quimioterapéuticos. Como resultado de ello, un agente quimioterapéutico dado puede volverse ineficaz en ciertos individuos. Los mecanismos moleculares responsables del desarrollo de resistencia en diversos tipos de cáncer apenas se entienden. El esclarecimiento de los mecanismos que subyacen a la resistencia a agentes específicos es esencial para descubrir enfoques de tratamiento que eviten eficazmente la resistencia farmacológica.
En particular, un tipo de cáncer para el que se necesitan enfoques de tratamiento adicionales es el melanoma maligno. El melanoma maligno es el sexto diagnóstico de cáncer más común en EE. UU., con 68.729 nuevos casos estimados en 2009. El melanoma metastásico se asocia con un pronóstico muy malo, con una mediana de supervivencia de 6 a 15 meses. En el melanoma, la actividad incontrolada de la vía de la MAP quinasa es casi omnipresente y ocurre más comúnmente a través de mutaciones de ganancia de función que implican el codón 600 del oncogén BRAF (BRAF V600E). Más del 50 % del melanoma metastásico porta mutaciones de BRAF V600E. Además, las mutaciones de BRAF V600E se han encontrado en el 10 % de los cánceres colorrectales y en el 8 % de todos los tumores sólidos.
Recientemente, los esfuerzos para dirigir específicamente BRAF mutado en el melanoma han dado resultados prometedores. PLX4032 es un fármaco oral dirigido que inhibe específicamente BRAF V600E. En el ensayo de fase 1 de pacientes con melanoma con mutaciones BRAF V600E, el 70 % de los pacientes (19 de 27) tuvieron al menos un 30 % de respuesta tumoral según los criterios RECIST. Actualmente, hay ensayos de fase II y fase III de PLX4032 en curso. Sin embargo, como con el resto de las terapias dirigidas, la resistencia a PLX4032 ha comenzado a emerger, con pacientes que recaen después de una media de 9 meses.
Sumario de la invención
La presente divulgación se refiere a la resistencia mediada por mutación al tratamiento quimioterapéutico del cáncer. En realizaciones específicas, la presente divulgación se dirige a una mutación identificada en una proteína MEK1, y en moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína MEK1, en las que la mutación comprende una sustitución en la posición del aminoácido 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre establecida en SEQ ID NO: 2. La mutación confiere resistencia a los inhibidores de RAF y de MEK actualmente en uso terapéutico. La identificación de la mutación permite la identificación de los pacientes con cáncer que pueden ser susceptibles a la resistencia a agentes quimioterapéuticos. Por otra parte, la identificación de la mutación permite el desarrollo de inhibidores de MEK de segunda generación que presentan actividad contra una proteína MEK1 que contiene la mutación de resistencia, tal como la mutación descrita en el presente documento. Dichos inhibidores de MEK de segunda generación son útiles en muchas aplicaciones clínicas y terapéuticas, incluyendo el tratamiento del cáncer.
La presente invención invención es como definen las reivindicaciones.
La invención proporciona además un método de identificación de un compuesto eficaz para inhibir una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido C121S, comprendiendo el método:
a) proporcionar una célula que comprende una proteína MEK1 mutante que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2 donde la sustitución de aminoácido es una sustitución de aminoácido C121S, confiriendo la sustitución de aminoácido C121S resistencia a un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK;
b) poner en contacto la célula con un compuesto de ensayo; y
c) determinar el efecto del compuesto en la fosforilación de un sustrato de MEK;
donde la reducción modulada de la fosforilación del sustrato de MEK en comparación con un control adecuado identifica al compuesto como eficaz para inhibir una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido C121S.
La invención proporciona además un método de cribado en células in vitro para identificar un compuesto de ensayo para tratar el cáncer en un sujeto, donde el cáncer es un cáncer en el que se ha detectado una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido C121S, comprendiendo el método proporcionar una célula que comprende una proteína MEK1 mutante que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2 donde la sustitución de aminoácido es una sustitución de aminoácido C121S, confiriendo la sustitución C121S resistencia a un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK; proporcionar una línea celular de control que expresa la proteína MEK1 de tipo silvestre; y poner en contacto la célula y la línea celular de control con el compuesto de ensayo para determinar la sensibilidad de la célula al compuesto de ensayo, donde la sensibilidad de la célula al compuesto de ensayo se mide utilizando un ensayo seleccionado del grupo que consiste en un ensayo de proliferación celular, un ensayo de viabilidad celular y un ensayo de fosforilación del sustrato de MEK, donde una reducción en la proliferación celular, viabilidad celular o fosforilación del sustrato de MEK en presencia del compuesto de ensayo identifica al compuesto como un compuesto para tratar el cáncer.
En este documento se describe una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína MEK1 mutante que tiene actividad MEK1, donde dicha proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2, confiriendo la sustitución de aminoácido resistencia a uno o más inhibidores de RAF o MEK en una célula que expresa la proteína MEK1 mutante. En varias realizaciones, el inhibidor de RAF se selecciona del grupo que consiste en PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), ZM 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613 y CJS352. Los inhibidores de RAF preferidos son los inhibidores de BRAF PLX4720 y PLX4032. En varias realizaciones, el inhibidor de MEK se selecciona del grupo que consiste en CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, Compuesto A, y Compuesto B. En algunas realizaciones, el inhibidor de MEK es el inhibidor de MEK1 AZD6244. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es una sustitución de aminoácidos 121 C>S. En algunas realizaciones, la proteína MEK1 mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican las proteínas MEK1 mutantes pueden insertarse en un vector de expresión y expresarse en una célula hospedadora. En el presente documento, se describe un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico como se establece en el presente documento. En el presente documento, también se describe una célula hospedadora que comprende el vector de expresión anterior. En el presente documento, también se describe un método de producción de una proteína MEK1 mutante, que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene un vector de expresión que codifica una proteína MEK1 mutante, de manera que la célula produce una proteína MEK mutante.
En el presente documento, también se describe una proteína MEK1 mutante aislada que tienen actividad MEK1, donde dicha proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2, confiriendo la sustitución de aminoácido resistencia a uno o más inhibidores de RAF o MEK en una célula que expresa la proteína MEK1 mutante. En varias realizaciones, el inhibidor de RAF se selecciona del grupo que consiste en PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), ZM 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613 y Cj S352. En varias realizaciones, los inhibidores de RAF son los inhibidores de BRAF PLX4720 y PLX4032. En varias realizaciones, el inhibidor de MEK se selecciona del grupo que consiste en CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, Compuesto A y Compuesto B. En algunas realizaciones, el inhibidor de MEK es el inhibidor de MEK1 AZD6244. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido es una sustitución de aminoácido 121C>S. En algunas realizaciones, la proteína MEK1 mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
En el presente documento, también se describe un método de identificación de un compuesto que es útil para tratar el cáncer, que comprende: proporcionar una composición de ensayo que comprende una proteína MEK1 mutante, en la que la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2, y un sustrato de MEK1; poner en contacto la composición de ensayo con un compuesto de ensayo en condiciones que permitan la fosforilación del sustrato de MEK1 en ausencia del compuesto de ensayo; y determinar el efecto del compuesto sobre la fosforilación del sustrato de MEK1; en el que la modulación por disminución de la fosforilación del sustrato de MEK1 en comparación con un control adecuado identifica el compuesto como un compuesto que es útil en el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución del aminoácido 121C>S.
En el presente documento, también se describe un método de identificación de un compuesto como inhibidor de MEK1 de segunda generación, que comprende: proporcionar una composición de ensayo que comprende una proteína MEK1 mutante, en la que la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2, y un sustrato de MEK1; poner en contacto la composición de ensayo con un compuesto de ensayo en condiciones que permitan la fosforilación del sustrato de MEK1 en ausencia del compuesto de ensayo; y determinar el efecto del compuesto sobre la fosforilación del sustrato de MEK1; en el que la modulación por disminución de la fosforilación del sustrato de MEK1 en comparación con un control adecuado identifica el compuesto como un inhibidor de MEK1 de segunda generación. En algunas realizaciones, la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución del aminoácido 121C>S.
En realizaciones ilustrativas de los aspectos anteriores, el sustrato de MEK1 es ERK1/2. En otras realizaciones, la composición de ensayo es un extracto celular.
En el presente documento, también se describe un método de identificación de un compuesto que es útil para tratar el cáncer, que comprende: proporcionar una célula que comprende una proteína MEK1 mutante, en la que la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2; poner en contacto la célula con un compuesto de ensayo; y determinar el efecto del compuesto sobre la fosforilación de ERK1/2; en el que la modulación por disminución de la fosforilación de ERK1/2 en comparación con un control apropiado identifica el compuesto como un compuesto que es útil en el tratamiento del cáncer. En el presente documento, también se describe un método de identificación de un compuesto que es un inhibidor de MEK1 de segunda generación, que comprende: proporcionar una célula que comprende una proteína MEK1 mutante, en la que la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2; poner en contacto la célula con un compuesto de ensayo; y determinar el efecto del compuesto sobre la fosforilación de ERK1/2; en el que la modulación por disminución de la fosforilación de ERK1/2 en comparación con un control apropiado identifica el compuesto como un inhibidor de MEK1 de segunda generación. En algunas realizaciones, de ambos de estos métodos, la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución del aminoácido 121C>S.
En el presente documento, también se describe un método de identificación de un compuesto que es útil para tratar el cáncer, que comprende: proporcionar una célula que comprende una proteína MEK1 mutante, en la que la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2; poner en contacto la célula con un compuesto de ensayo; y determinar el efecto del compuesto sobre la proliferación celular; en el que la reducción de la proliferación celular en comparación con un control apropiado identifica el compuesto como un compuesto que es útil en el tratamiento del cáncer. En el presente documento, también se describe un método de identificación de un compuesto que es un inhibidor de MEK1 de segunda generación, que comprende: proporcionar una célula que comprende una proteína MEK1 mutante, en el que la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2; poner en contacto la célula con un compuesto de ensayo; y determinar el efecto del compuesto sobre la proliferación celular; en el que la reducción en la proliferación celular en comparación con un control apropiado identifica el compuesto como un inhibidor de MEK1 de segunda generación. Para algunas realizaciones de ambos métodos, la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido 121C>S.
En el presente documento, también se describe un método de detección basado en células para identificar un compuesto de ensayo como un inhibidor de MEK1 de segunda generación, método que comprende poner en contacto una célula hospedadora con un compuesto de ensayo, en el que la célula hospedadora comprende una proteína MEK1 mutante, en el que la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2, en el que la sensibilidad de la célula hospedadora hacia el compuesto de ensayo identifica el compuesto como un inhibidor de MEK1 de segunda generación. En una realización de este aspecto, la sensibilidad de la célula hospedadora hacia el compuesto de ensayo se mide usando un ensayo seleccionado del grupo que consiste en un ensayo de proliferación celular, un ensayo de viabilidad celular y un ensayo de fosforilación de ERK1/2, en el que una reducción en la proliferación celular, la viabilidad celular o la fosforilación de ERK1/2 en presencia del compuesto de ensayo identifica el compuesto como un inhibidor de MEK1 de segunda generación. En algunas realizaciones, la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido 121C>S.
En el presente documento, también se describe un método de identificación de un inhibidor de MEK1 de segunda generación, que comprende: seleccionar un posible fármaco usando modelización asistida por ordenador con una estructura de cristal tridimensional o solución de una proteína MEK1 mutante, en el que dicha proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2; poner en contacto dicho posible fármaco con la proteína MEK1 mutante; y detectar la interacción de dicho posible fármaco con la proteína MEK1 mutante; en el que se identifica un compuesto que es capaz de interactuar con la proteína MEK1 mutante como un inhibidor de MEK1 de segunda generación. En algunas realizaciones, la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido 121C>S.
En una realización de los aspectos anteriores, el compuesto de ensayo es un miembro de una biblioteca de compuestos.
En el presente documento, también se describe un compuesto identificado por uno de los métodos anteriores. Dichos compuestos son útiles, por ejemplo, en la inhibición de la actividad de una proteína MEK1 mutante que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2, en algunas realizaciones, una sustitución de aminoácido 121C>S. En el presente documento, también se describeun método de inhibición de la actividad de una proteína MEK1 mutante, en el que la proteína MEK1 mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2 (preferentemente, una sustitución de aminoácido 121C>S), método que comprende poner en contacto la proteína MEK1 mutante con un compuesto identificado de acuerdo con uno de los métodos anteriores. En una realización ilustrativa, el compuesto inhibe la actividad de una proteína MEK1 mutante y una proteína MEK1 de tipo silvestre. En una realización, dicha puesta en contacto tiene lugar in vitro. En otra realización, dicha puesta en contacto tiene lugar in vivo. En otra realización, dicha puesta en contacto tiene lugar en un sujeto. En una realización ilustrativa, dicha puesta en contacto tiene lugar en un sujeto que tiene un cáncer. En una realización, el sujeto que tiene un cáncer ha tenido una recaída del tratamiento con un inhibidor de RAF, tal como un inhibidor de RAF seleccionado del grupo que consiste en PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), ZM 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613, y CJS352 (preferentemente, los inhibidores de BRAF p Lx 4720 y PLX4032). Además o como alternativa, el sujeto que tiene cáncer ha tenido una recaída del tratamiento con un inhibidor de MEK de primera generación, tal como un inhibidor de MEK seleccionado del grupo que consiste en CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, Compuesto A, y Compuesto B. En algunas realizaciones, el inhibidor de MEK1 es AZD6244. En una realización ilustrativa, el cáncer es un melanoma.
En el presente documento, también se describe un método de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer, que comprende administrar al sujeto un compuesto identificado de acuerdo con uno de los métodos anteriores. En una realización ilustrativa, el compuesto inhibe la actividad de una proteína MEK1 mutante, que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2 (preferentemente, una sustitución de aminoácido 121C>S), y una proteína MEK1 de tipo silvestre. En una realización, el sujeto que tiene un cáncer ha tenido una recaída del tratamiento con un inhibidor de RAF, tal como un inhibidor de RAF seleccionado del grupo que consiste en PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), ZM 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613, y CJs 352. En algunas realizaciones, los inhibidores de BRAF se seleccionan de PLX4720 y PLX4032. Además o como alternativa, el sujeto que tiene cáncer ha tenido una recaída del tratamiento con un inhibidor de MEK de primera generación, tal como un inhibidor de MEK seleccionado del grupo que consiste en CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, Compuesto A y Compuesto B. En algunas realizaciones, el inhibidor de MEK1 es AZD6244. En una realización particular, el cáncer comprende una proteína MEK1 que tiene una sustitución de aminoácido 121C>S con respecto a una proteína MEK1 de tipo silvestre, y/o una molécula de ácido nucleico de MEK1 que codifica una proteína MEK1 que tiene una sustitución de aminoácido 121C>S con respecto a una proteína MEK1 de tipo silvestre, en el que la sustitución 121C>S de aminoácido confiere resistencia a uno o más inhibidores de RAF o MEK en células que expresan la proteína MEK1 mutante. En una realización ilustrativa, el cáncer es un melanoma.
En el presente documento, también se describe un método de exploración de un sujeto que tiene cáncer, método que comprende obtener una muestra que contiene células cancerosas del sujeto; y determinar la presencia o ausencia de una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína m EK1 de tipo silvestre, mostrada en SEQ ID NO: 2, en la muestra que contiene células cancerosas. En algunas realizaciones, se determina la presencia o ausencia de una sustitución de aminoácido 121C>S.
En una realización del aspecto anterior, la detección de la mutación en la posición 121 de la proteína MEK1 identifica que el sujeto tiene un riesgo relativamente alto de recaída durante el tratamiento con un inhibidor de RAF. En otra realización, la detección de la mutación en la posición 121 de la proteína MEK identifica que el sujeto no responde al tratamiento con un inhibidor de RAF. En realizaciones ilustrativas, el inhibidor de RAF se selecciona del grupo que consiste en PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), ZM 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613, y CJS352. En algunas realizaciones, el inhibidor de BRAF se selecciona de PLX4720 y PLX4032). En otra realización del aspecto anterior, la presencia de la mutación en la posición 121 (preferentemente, C121S) de la proteína MEK1 estratifica al sujeto al tratamiento con un inhibidor de MEK1 de segunda generación que se dirige a la proteína MEK1 mutante. En otra realización, la presencia de la mutación en la posición 121 de la proteína MEK1 estratifica al sujeto al tratamiento con una terapia de combinación que incluye la administración de tanto un inhibidor de RAF como un inhibidor de MEK1 de segunda generación que se dirige a la proteína MEK1 mutante. En algunas realizaciones, la mutación en la posición 121 es C121S.
En el presente documento, también se describe un método que identifica a un sujeto con cáncer que tiene un alto riesgo de recaída durante el tratamiento con un inhibidor de RAF, que comprende:
(a) extraer ácido nucleico de células del cáncer; y
(b) secuenciar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1;
en el que la presencia de nucleótidos que producen una sustitución de aminoácido 121C>S en la proteína MEK1, en comparación con la proteína MEK1 de tipo silvestre, identifica al sujeto que tiene un alto riesgo de recaída durante el tratamiento con un inhibidor de RAF.
En el presente documento, también se describe un método que identifica a un sujeto con cáncer que no responde al tratamiento con un inhibidor de RAF, que comprende:
(a) extraer ácido nucleico de células del cáncer; y
(b) secuenciar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1;
en el que la presencia de nucleótidos que producen una sustitución de aminoácido 121C>S en la proteína MEK1, en comparación con la proteína MEK1 de tipo silvestre, identifica que el sujeto no responde al tratamiento con un inhibidor de RAF.
En el presente documento, también se describe un método de optimización del tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, que comprende:
(a) extraer ácido nucleico de células del cáncer; y
(b) secuenciar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1;
en el que la presencia de nucleótidos que producen una sustitución de aminoácido 121C>S en la proteína MEK1, en comparación con la proteína MEK1 de tipo silvestre, indica una necesidad de tratar al sujeto con un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido 121C>S. En el presente documento, también se describe un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, que comprende:
(a) extraer ácido nucleico de células del cáncer;
(b) secuenciar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1; y
(c) administrar un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido 121C>S al sujeto cuando la molécula de ácido nucleico contiene nucleótidos que producen una sustitución de aminoácido 121C>S en la proteína MEK1, en comparación con la proteína MEK1 de tipo silvestre.
En el presente documento, también se describe un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, que comprende:
(a) extraer ácido nucleico de células del cáncer;
(b) someter la muestra a PCR e identificar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1;
(c) administrar un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido 121C>S al sujeto cuando la molécula de ácido nucleico contiene nucleótidos que producen una sustitución de aminoácido 121C>S en la proteína MEK1, en comparación con la proteína MEK1 de tipo silvestre.
En el presente documento, también se describe un método de identificación de un sujeto que tiene cáncer que es probable que se beneficie del tratamiento con un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido 121C>S, que comprende:
(a) ensayar una muestra de ácido nucleico obtenida del cáncer para determinar la presencia de una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1 que producen una sustitución de aminoácido 121C>S de la proteína MEK1, en comparación con la proteína MEK1 de tipo silvestre; y
(b) correlacionar la presencia de la una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1 que producen una sustitución de aminoácido 121C>S en la proteína MEK1 con un sujeto que es probable que se beneficie del tratamiento con un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido 121C>S.
En el presente documento, también se describe un método de identificación de un sujeto que tiene cáncer que es probable que se beneficie del tratamiento con un inhibidor de MEK que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido 121C>S, que comprende:
(a) extraer ácido nucleico de células del cáncer; y
(b) secuenciar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1;
en el que la presencia de nucleótidos que producen una sustitución de aminoácido 121C>S en la proteína MEK1, en comparación con la proteína MEK1 de tipo silvestre, identifica que el sujeto es probable que se beneficie del tratamiento con un inhibidor de MEK que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido 121C>S.
En diversas realizaciones de los aspectos anteriores, el inhibidor de RAF se selecciona del grupo que consiste en PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), ZM 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613, y CJS35. En algunas realizaciones, el inhibidor de RAF es PLX4720 o PLX4032. En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, el cáncer es una leucemia, un linfoma, un mieloma, un carcinoma, un carcinoma metastásico, un sarcoma, un adenoma, un cáncer del sistema nervioso o un cáncer geritourinario. En una realización ilustrativa, el cáncer es un melanoma.
En el presente documento, también se describen kits para identificar un sujeto que tiene cáncer que tiene un alto riesgo de recaída durante el tratamiento con un inhibidor de RAF o para identificar un sujeto que tiene cáncer que no responde al tratamiento con un inhibidor de RAF o para optimizar el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer o para identificar un sujeto que tiene cáncer que es probable que se beneficie del tratamiento con un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido 121C>S o para identificar un sujeto que tiene cáncer que es probable que se beneficie del tratamiento con un inhibidor de MEK que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene un aminoácido 121C>S, comprendiendo los kits: (a) un reactivo de detección útil para identificar la presencia o ausencia de una mutación en la posición del aminoácido 121 de una proteína MEK1 de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2; y (b) instrucciones que describen un método expuesto en el presente documento. En una realización ilustrativa, el reactivo de detección comprende cebadores de ácido nucleico útiles para la amplificación de una proteína MEK1 de SEQ ID NO: 1 o 2.
En diversas realizaciones de los aspectos anteriores, la presencia de una mutación en la posición del aminoácido 121 (por ejemplo, una mutación C121S) de una proteína MEK1, por ejemplo, una proteína MEK1 de una muestra que contiene células cancerosas, se determina mediante un método que comprende determinar la secuencia de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína MEK1. En otras realizaciones, la presencia de una mutación en la posición del aminoácido 121 de una proteína MEK1 se determina usando un anticuerpo que reconoce una proteína MEK1 que comprende la mutación. En otra realización, los métodos anteriores comprenden además administrar un compuesto identificado de acuerdo con un método descrito en el presente documento a un sujeto en quien se ha detectado la presencia de una o más mutaciones en una proteína MEK1.
En el presente documento, también se describe un método de inhibición de una proteína MEK1 mutante en un sujeto, comprendiendo la proteína MEK1 mutante una sustitución de aminoácido en la posición 21 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2, método que comprende administrar un compuesto identificado por uno de los métodos anteriores a un sujeto en quien se ha detectado la presencia de la proteína MEK1 mutante. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido es una sustitución de aminoácido 121C>S.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1A y 1B son gráficos que muestran el porcentaje de inhibición del crecimiento de las células de melanoma A375 tratadas con concentraciones crecientes (en |jM) del inhibidor de BRAF PLX4720 (Figura 1A) o el inhibidor de MEK1 AZK6244 (Figura 1B), en las que las células A375 bien eran no transfectadas (A375), transfectadas con MEK1 de tipo silvestre (MEK-WT), transfectadas con la MEK1 mutante C121S (MEK-C121S) o transfectadas con una variante de MEK constitutivamente activa (MEK-DD).
Las Figuras 2A y 2B muestran la actividad de quinasa de la MEK1 mutante C121S en comparación con la MEK1 de tipo silvestre (MEK-WT) y una variante de MEK constitutivamente activa (MEK-DD). La Figura 2A es una fotografía de una inmunotransferencia. La Figura 2B es un gráfico de barras que cuantifica el porcentaje relativo de ERK fosforilada (pERK).
La Figura 3 representa la secuencia de ácido nucleico de MEK1 humana de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) (n.° de acceso NM_002755; gi: 169790828).
La Figura 4 representa la secuencia de proteína MEK1 humana de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) (n.° de acceso NP_002746; gi:5579478).
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere al desarrollo de resistencia a terapia quimioterapéutica para el cáncer, en particular, a resistencia en el melanoma maligno tratado con un inhibidor de la RAF. En el presente documento, se describe un paciente con melanoma metastásico que desarrolló resistencia al inhibidor de BRAF PLX4032 después de una respuesta inicial espectacular. Como se describe en el Ejemplo 1, se usó la secuenciación masivamente paralela para realizar un análisis genómico comparativo de 3 muestras de ADN diferentes del paciente: (i) tumor que era sensible a PLX4032, (ii) tumor que era resistente a PLX4032 e (iii) piel normal. Se identificó una mutación de MEK1 en la posición del aminoácido 121, en particular, una mutación C121S, que confiere resistencia al inhibidor de RAF, así como resistencia a un inhibidor de MEK, en células que expresan la proteína MEK1 mutante. Por lo tanto, el desarrollo de una mutación de MEK1 en respuesta a la inhibición de BRAF representa el primer ejemplo informado en un paciente de un mecanismo de resistencia adquirido en el que el tumor desarrolla una mutación activadora cadena abajo de la quinasa diana.
En una realización ilustrativa, la mutación en la posición del aminoácido 121 de la proteína MEK1 confiere resistencia a los inhibidores de RAF PLX4032 y PLX4720, así como al inhibidor de MEK AZD6244. Por consiguiente, una "mutación de resistencia", como se usa en el presente documento, es una mutación en una proteína MEK1 que confiere resistencia a uno o más inhibidores de RAF o MEK. Como se usa en el presente documento, la expresión "resistencia a uno o más inhibidores de RAF o MEK" pretende significar que la resistencia puede ser a uno o más inhibidores de RAF, uno o más inhibidores de MEK o una combinación de inhibidores de RAF y MEK (por ejemplo, un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK).
La identificación de la mutación en la posición del aminoácido 121 de la proteína MEK1 que confiere resistencia a los inhibidores de RAF, así como a los inhibidores de MEK, permite el desarrollo de "inhibidores de MEK de segunda generación" dirigidos específicamente a esta proteína mutante MEK1. Como se usa en el presente documento, la expresión "inhibidor de MEK de segunda generación" se refiere a un agente que inhibe una actividad biológica de una proteína MEK1 que contiene una mutación en la posición del aminoácido 121, tal como la mutación descrita en el presente documento (C121S). En una realización preferida, un inhibidor de MEK de segunda generación también inhibe una actividad biológica de una proteína MEK1 de tipo silvestre. Por consiguiente, un inhibidor de MEK de segunda generación como se describe en el presente documento puede inhibir una actividad biológica de una proteína MEK1 que contiene una mutación de resistencia y puede inhibir una actividad biológica de una proteína MEK de tipo silvestre. Dichos inhibidores de MEK de segunda generación son útiles en muchas aplicaciones clínicas y terapéuticas, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer. Por el contrario, la expresión "inhibidor de MEK de primera generación", como se usa en el presente documento, se refiere a un agente que inhibe una actividad biológica de una proteína MEK de tipo silvestre, pero que no inhibe una actividad biológica de una proteína MEK1 que contiene una mutación de resistencia en la posición del aminoácido 121, tal como la mutación descrita en el presente documento.
Los ejemplos no limitantes de inhibidores de RAF incluyen PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), ZM 336372, RAF 265, AAL-881 (Novartis), LBT-613 (Novartis), y CJS352. PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), ZM 336372, RAF 265 se muestran en la Tabla 1. También se pueden usar inhibidores de RAF adicionales conocidos en la técnica.
Tabla 1: Inhibidores de RAF ilustrativos
Figure imgf000008_0001
Los ejemplos no limitantes de inhibidores de MEK incluyen CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, Compuesto A y Compuesto B (Tabla 2). Los Compuestos A y B (6-metoxi-7-(3-morfolin-4-il-propoxi)-4-(4-fenoxi-fenilamino)-quinolin-3-carbonitrilo y 4-[3-cloro-4-(1-metil-1H-imidazol-2-ilsulfanil)-fenilaiTiino]-6-iTietoxi-7-(3-morfolin-4-il-propoxi)-quinolin-3-carbonitrilo, respectivamente) se describen además en Zhang et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 11(11): 1407-1410 (2001) y Mallon et al., Mol Cáncer Ther. Jun; 3(6):755-62 (2004).
Tabla 2: Inhibidores de MEK ilustrativos
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Los inhibidores de MEK mostrados en la Tabla 2 así como inhibidores de MEK adicionales conocidos en la técnica se pueden analizar usando los métodos descritos en el presente documento para determinar si son "inhibidores de MEK de primera generación" o "inhibidores de MEK de segunda generación".
La identificación de mutaciones de resistencia en la proteína MEK1 también permite la exploración de pacientes que tienen cáncer para determinar la presencia o ausencia de una mutación de resistencia de MEK1 en la posición del aminoácido 121 en el cáncer. La determinación de la presencia o ausencia de una o más mutaciones de resistencia a MEK en un cáncer permite la modificación de la estrategia de tratamiento de un paciente con cáncer. Dichas alteraciones pueden incluir, por ejemplo, iniciar o interrumpir el tratamiento con un inhibidor de MEK1 de primera generación o un inhibidor de RAF, o iniciar o interrumpir el tratamiento con un inhibidor de MEK1 de segunda generación.
Varios aspectos de la invención se describen en más detalle en las siguientes subsecciones. A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que les adjudica habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento para poner en práctica la invención, a continuación, se describen ejemplos de métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos descritos en el presente documento son únicamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
I. Actividad biológica de MEK
Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína MEK1" se refiere a una proteína, también conocida como MKK1 (MAP quinasa quinasa 1), que es una tirosina quinasa y serina/treonina quinasa doble específica que desempeña un papel clave en la señalización intracelular de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK). MEK1 tiene un tamaño de aproximadamente 45 kDa y se expresa de forma ubicua en células de mamífero. MEK1 contiene un bucle de activación que incluye dos restos de serina en las posiciones 217 y 221. La fosforilación de estos restos por la proteína quinasa Raf produce la activación de MEK1 durante la señalización de MAPK. MEK1 también contiene dos sitios reguladores de fosforilación fuera del bucle de activación. La fosforilación en la serina 298 puede ayudar a MEK1 a activarse. Por el contrario, la fosforilación en la serina 212 puede disminuir la actividad de MEK1.
La cascada de proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) es una vía de señalización intracelular fundamental que regula la transducción de señales en respuesta a diversos estímulos extracelulares, incluyendo factores de crecimiento, citocinas y protooncogenes. La activación de esta vía produce la activación del factor de transcripción y alteraciones en la expresión génica, que finalmente conducen a cambios en las funciones celulares, incluyendo la proliferación celular, la regulación del ciclo celular, la supervivencia celular, la angiogénesis y la migración celular. La señalización clásica de MAPK es iniciada por receptores tirosina quinasas en la superficie celular; sin embargo, muchas otras moléculas de la superficie celular son capaces de activar la cascada de MAPK, incluyendo integrinas, proteínas G heterotriméricas y receptores de citocinas.
La unión del ligando a un receptor de la superficie celular, por ejemplo, un receptor de tirosina quinasa, normalmente produce la fosforilación del receptor. La proteína adaptadora Grb2 se asocia con el dominio intracelular fosforilado del receptor activado, y esta asociación recluta factores de intercambio de nucleótidos de guanina que incluyen SOS-1 y CDC25 a la membrana celular. Estos factores de intercambio de nucleótidos de guanina interactúan y activan la GTPasa Ras. Las isoformas comunes de Ras incluyen K-Ras, N-Ras, H-Ras y otras. Después de la activación de Ras, la serina/treonina quinasa Raf (por ejemplo, A-Raf, B-Raf o Raf-1) se recluta a la membrana celular mediante interacción con Ras. A continuación, se fosforila Raf. Raf activa directamente MEK1 y MEK2 por fosforilación de dos restos de serina en las posiciones 217 y 221. Tras la activación, MEK1 y MEK2 fosforilan restos de tirosina (Tyr-185) y treonina (Thr-183) en serina/treonina quinasas Erk1 y Erk2, produciendo la activación de Erk. Erk activada regula muchas dianas en el citosol y también se translocaliza al núcleo, donde fosforila una serie de factores de transcripción que regulan la expresión génica. Erk quinasa tiene numerosas dianas, incluyendo Elk-1, c-Ets1, c-Ets2, p90RSK1, MNK1, MNK2, MSK1, MSK2 y TOB. Si bien la vía anterior es una representación clásica de la señalización de MAPK, existe una interacción considerable entre la vía MAPK y otras cascadas de señalización.
Las aberraciones en la señalización de MAPK tienen un papel significativo en la biología del cáncer. La expresión alterada de Ras es común en muchos cánceres y también se han identificado mutaciones de activación en Ras. Dichas mutaciones se encuentran en hasta el 30 % de todos los cánceres, y son especialmente comunes en los carcinomas pancreáticos (90 %) y de colon (50 %). Además, se han identificado mutaciones de activación en Raf en melanoma y cáncer de ovario. La mutación más común, BRAF 600V>E, produce la activación constitutiva de la vía de MAP quinasa cadena abajo, y es necesaria para la proliferación de células de melanoma, el crecimiento de agar blando y la formación de xenoinjertos tumorales. Basándose en el papel definido de la sobreactivación de MAPK en cánceres humanos, los componentes dirigidos de la vía de MAPK con inhibidores específicos son un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer. MEK1 y MEK2 son dianas atractivas para la terapia debido al alto grado de especificidad que muestran para sus substratos de Erk1/2. El alto grado de homología entre MEK1 y MEK2 hace probable que un inhibidor de MEK de molécula pequeña pueda inhibir eficazmente ambas proteínas. CI-1040 (también conocido como PD184352) es un inhibidor de MEK que se ha probado en ensayos clínicos de Fase I y Fase II. Se descubrió que CI-1040 inhibe MEK1 con una CI50 in vitro de 17 nmol/l (Friday et al. Clin. Cáncer Res. (2008) 14(2):342-346). CI-1040 inhibió además a MEK en ensayos basados en células y redujo el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de colon humano, lo que indica que la inhibición de MEK es un método viable de tratamiento del cáncer.
Como se usan indistintamente en el presente documento, las expresiones "actividad de MEK1", "actividad biológica de MEK1" o "actividad funcional de MEK1" incluyen las actividades ejercidas por una proteína MEK1 en una célula o en un tejido sensible a MEK, por ejemplo, una célula cancerosa, o en una molécula de ácido nucleico o una molécula diana de proteína de MEK, determinadas in vivo o in vitro, de acuerdo con técnicas convencionales. La actividad de MEK1 puede ser una actividad directa, tal como una asociación con una molécula diana de MEK, por ejemplo, ERK1/2, o fosforilación de un sustrato (por ejemplo, ERK1/2). Como alternativa, una actividad de MEK1 es una actividad indirecta, tal como un evento biológico cadena abajo mediado por la interacción de la proteína MEK1 con una molécula diana de MEK, por ejemplo, ERK1/2. Como MEK está en una vía de transducción de señales que implica ERK1/2, la modulación de MEK1 modula una molécula en una vía de transducción de señales que implica a ERK1/2.
II. Mutaciones de resistencia de MEK
Aunque el tratamiento del cáncer con inhibidores de RAF, tales como PLX4032, o con inhibidores de MEK, incluyendo AZD6244 y CI-1040, son enfoques terapéuticos prometedores, los pacientes que reciben dichos tratamientos con frecuencia recaen o no responden y, como resultado de ello, progresa la enfermedad del paciente. Como se describe en el presente documento, la presente divulgación se refiere al descubrimiento de una mutación en MEK1 que confiere resistencia a los inhibidores de RAF y MEK actualmente en desarrollo clínico. La adquisición de dicha mutación en las células cancerosas hace que los pacientes sean resistentes al tratamiento con ciertos inhibidores de RAF y MEK. En realizaciones ilustrativas, la divulgación se refiere al desarrollo de resistencia a los inhibidores de RAF PLX4032 y PLX4720, y al inhibidor de MEK AZD6244.
La aparición clínica de una mutación de MEK1 resistente en el melanoma BRAFv600E metastásico como se describe en el presente documento sugiere que la relevancia biológica de la dependencia asociada a RAF/MEK se mantiene incluso en etapas avanzadas de malignidad. Por lo tanto, la incapacidad de los inhibidores de RAF o MEK de primera generación para generar respuestas tumorales duraderas en muchos melanomas BRAFV600E puede indicar una potencia o farmacodinámica del fármaco subóptima en el entorno clínico. Basándose en los hallazgos descritos en el presente documento, las modalidades de tratamiento que implican agentes dirigidos en tumores dirigidos por RAF o MEK pueden beneficiarse de fármacos más potentes, de dosis modificadas de fármacos existentes o de la inhibición combinada de RAF y MEK. Estas innovaciones terapéuticas, junto con un robusto perfil genómico tumoral para estratificar a los pacientes, deberían acelerar el advenimiento del tratamiento personalizado contra el cáncer en los cánceres con mutaciones de oncogenes "farmacorresibles".
(A) Identificación de la mutación de MEK1 que confiere resistencia a los inhibidores de RAF y de MEK
En diversas realizaciones, la presente divulgación se refiere a métodos para identificar mutaciones en una proteína MEK1, o mutaciones en una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína MEK1, que confieren resistencia en las células que expresan la proteína MEK1 a fármacos que inhiben la actividad de RAF o MEK. Una "proteína MEK1 mutante", como se hace referencia en el presente documento, incluye una proteína MEK1 que contiene una o más mutaciones que confieren resistencia a uno o más inhibidores de RAF o MEK conocidos. Del mismo modo, una "molécula de ácido nucleico MEK1 mutante", como se hace referencia en el presente documento, incluye una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1 mutante. Las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas MEK1 que contienen una o más mutaciones se pueden crear usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, que incluye, por ejemplo, mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida de una secuencia de ácido nucleico MEK1 de tipo silvestre, que puede realizarse en E. coli. En realizaciones ilustrativas, la secuencia de ácido nucleico de MEK1 de tipo silvestre es una secuencia de ácido nucleico de MEK1 de tipo silvestre de ser humano. En realizaciones específicas, la secuencia de ácido nucleico de MEK1 de tipo silvestre es MEK1 humana de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), que se muestra en la Figura 3. A continuación, se pueden detectar las moléculas de ácido nucleico de MEK1 mutante en células que, de otro modo, serían sensibles al tratamiento con un inhibidor de RAF o MEK para identificar un ácido nucleico codificante de una proteína MEK1 mutante que es resistente al tratamiento con el inhibidor de RAF o MEK.
Se puede usar cualquier método adecuado para explorar los ácidos nucleicos de MEK1 mutantes y las proteínas MEK1 mutantes para determinar la resistencia al tratamiento con un inhibidor de RAF o de MEK. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1 mutante se puede expresar en células que, de otro modo, serían sensibles al tratamiento con un inhibidor de RAF o de MEK. Una estirpe celular ilustrativa útil para este fin es la estirpe celular de melanoma A375. Tras la expresión de la proteína MEK1 mutante, se pueden tratar las células con un inhibidor de RAF o de MEK. La actividad de la proteína MEK1 mutante puede medirse y compararse entonces con la actividad de una proteína MEK1 de tipo silvestre expresada de forma similar y tratada con el inhibidor de RAF o de MEK. La actividad de una proteína MEK1 puede determinarse, por ejemplo, midiendo la proliferación o la viabilidad de las células tras el tratamiento con el inhibidor de RAF o de MEK, estando la proliferación o la viabilidad correlacionadas positivamente con la actividad de MEK1. El crecimiento, la proliferación o la viabilidad celulares se pueden determinar usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. En una realización, el crecimiento celular puede determinarse usando ensayos de viabilidad/proliferación celular basados en pocillos, tales como MTS o Cell Titer GLo, en los que el crecimiento celular en presencia de un inhibidor de RAF o de MEK se expresa como un porcentaje del observado en células no tratadas cultivadas en ausencia del inhibidor de RAF o de MEK. En ciertas realizaciones, la resistencia se define como un cambio en el valor de IC50 de al menos 2 veces, más preferentemente al menos 3 veces, lo más preferentemente al menos 4-5 veces, con respecto a un control adecuado. En otras realizaciones, la resistencia se define como un valor de IC50 de ~1 uM). La actividad de una proteína MEK1 también se puede medir, por ejemplo, determinando la cantidad relativa de ERK1/2 fosforilada presente en la célula tras el tratamiento con el inhibidor de RAF o de MEK. La actividad de una proteína MEK1 de tipo silvestre o mutante también puede determinarse usando un ensayo de fosforilación in vitro, en el que la actividad de MEK1 se determina midiendo la proporción de sustrato ERK 1/2 fosforilado en el ensayo tras el tratamiento con el inhibidor de RAF o de MEK. Una proteína MEK1 mutante que tiene una actividad mayor que una proteína MEK1 de tipo silvestre tras el tratamiento con un inhibidor de RAF o de MEK se identifica como aquella que contiene una mutación que confiere resistencia a un inhibidor de RAF o de MEK. La mutación que confiere resistencia a un inhibidor de RAF o de MEK puede identificarse después secuenciando el ácido nucleico que codifica la proteína MEK1 mutante, o secuenciando directamente la proteína MEK1 mutante.
De esta manera, además de usar métodos de secuencias masivamente paralelas, como se describe en el Ejemplo 1, se identificó una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 humana que, cuando está mutada, confiere resistencia a los inhibidores de RAF PLX4032 y PLX4720, así como el inhibidor de MEK AZD6244. En particular, se identificó que la sustitución de la cisteína de tipo silvestre de la posición 121 con serina (denominada en el presente documento C121S o 121C>S) confiere resistencia a los inhibidores de RAF o de MEK. Además, la divulgación abarca otras sustituciones en la posición del aminoácido 121 de MEK1 que confieren resistencia a uno o más inhibidores de RAF o de MEK. Por ejemplo, las sustituciones de la cisteína en la posición 121 con otro aminoácido estructuralmente similar a la serina, tales como alanina, treonina o glicina, están abarcadas por la divulgación. Por lo tanto, en diversas realizaciones, la proteína MEK1 mutante de la divulgación puede comprender una mutación tal como C121A, C121T o C121G.
Como se describe en el presente documento, la identificación de mutaciones en MEK que confieren resistencia a inhibidores de RAF o de MEK permite el diseño y la selección de “inhibidores de MEK de segunda generación”, que son eficaces para inhibir una proteína MEK1 mutante que tiene una mutación de resistencia en la posición del aminoácido 121. Dichos inhibidores de MEK de segunda generación son útiles en muchas aplicaciones clínicas y terapéuticas, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer. La identificación de mutaciones de resistencia en la proteína MEK1 también permite la exploración de pacientes que tienen cáncer para determinar la presencia o ausencia de una mutación de resistencia a MEK1 en la posición 121 del cáncer. La determinación de la presencia o ausencia de una mutación de resistencia a MEK en la posición 121 en un cáncer permite la modificación de la estrategia de tratamiento de un paciente con cáncer. Por ejemplo, la identificación de una mutación de resistencia a MEK1 descrita en el presente documento en una muestra que contiene células cancerosas de un paciente que tiene un cáncer se puede usar para estratificar al paciente al tratamiento con un inhibidor de MEK1 de segunda generación. La identificación de las mutaciones de resistencia a MEK1 también permite la detección e identificación de pacientes que tienen un alto riesgo de recaída o falta de respuesta al tratamiento con ciertos inhibidores de RAF o de MEK.
Las mutaciones de resistencia a MEK1 anteriores también confieren resistencia a los inhibidores de RAF quinasa, por ejemplo, al inhibidor de B-RAF PLX4720. La resistencia a los inhibidores de una RAF quinasa puede determinarse, por ejemplo, midiendo la actividad de una proteína MEK1 mutante en presencia de un inhibidor de RAF, y comparando la actividad con la de una proteína MEK1 de tipo silvestre tratada de manera similar con el inhibidor de RAF. La actividad de una proteína MEK1 se puede determinar usando los métodos expuestos en el presente documento.
III. Métodos de identificación de inhibidores de MEK de segunda generación
La identificación de mutaciones de resistencia a MEK1 permite el desarrollo y/o la identificación de "inhibidores de MEK1 de segunda generación". Como se usa en el presente documento, un inhibidor de MEK1 de segunda generación es un agente que inhibe eficazmente la actividad de una proteína MEK1 mutante que contiene una mutación en la posición del aminoácido 121 como se describe en el presente documento. Un inhibidor de MEK1 de segunda generación puede inhibir o no la actividad de una proteína MEK1 de tipo silvestre además de una proteína MEK1 mutante. En una realización preferida, un inhibidor de MEK1 de segunda generación inhibe la actividad tanto de una proteína MEK1 de tipo silvestre como de una proteína MEK1 mutante. En una realización ilustrativa, un inhibidor de MEK1 de segunda generación inhibe la actividad de una proteína MEK1 que contiene una mutación en la posición del aminoácido 121, preferentemente una mutación C121S.
Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos de identificación de un compuesto de ensayo como un inhibidor de MEK1 de segunda generación. En una realización, un compuesto puede identificarse como un inhibidor de MEK1 de segunda generación determinando la actividad relativa de MEK1 de una proteína MEK1 mutante (que tiene una sustitución en la posición 121) en presencia o ausencia del compuesto, con respecto a una proteína MEK1 de tipo silvestre. Cuando, en presencia de un compuesto que es un inhibidor de MEK1 de segunda generación, una proteína MEK1 mutante tiene un nivel inferior de actividad de MEK1 que en ausencia del compuesto. Cuando en presencia de un compuesto que no es un inhibidor de MEK1 de segunda generación, una proteína MEK1 mutante has un nivel equivalente o superior de actividad de MEK1 que en ausencia del compuesto. En ciertas realizaciones, la actividad de MEK1 se puede medir en un ensayo in vitro usando proteínas MEK1 recombinantes. En otras realizaciones, la actividad de MEK1 puede medirse en un ensayo in vivo usando células cultivadas o animales de experimentación.
Cualquier indicador de actividad de MEK1 es adecuado para determinar si un compuesto es o no un inhibidor de MEK1 de segunda generación. En una realización ilustrativa, la actividad de MEK1 se determina midiendo la fosforilación del sustrato de MEK ERK1/2, en el que una disminución en la fosforilación de ERK1/2 indica una disminución en la actividad de MEK1. En una realización, la fosforilación de ERK1/2 se mide en una célula o un extracto celular. En una realización alternativa, la fosforilación de ERK1/2 se mide en un ensayo de fosforilación in vitro usando proteínas purificadas o recombinantes. Los métodos de detección de la fosforilación de ERK1/2 conocidos en la técnica son adecuados para medir la fosforilación de ERK1/2 como una indicación de la actividad de una proteína MEK1 o una proteína MEK1 mutante. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, transferencia Western y espectroscopia de masas. En ciertas realizaciones, se puede realizar un ensayo de fosforilación de ERK1/2 in vitro usando proteínas recombinantes. En otras realizaciones, se puede realizar un ensayo de fosforilación de ERK1/2 in vivo usando células cultivadas o animales de experimentación.
En una realización, se usa una célula hospedadora que expresa una proteína MEK1 mutante en la identificación de un inhibidor de MEK1 de segunda generación, en la que la sensibilidad de la célula hospedadora a un compuesto de ensayo identifica el compuesto de ensayo como un inhibidor de MEK1 de segunda generación. Como se usa en el presente documento, la expresión "sensibilidad de la célula hospedadora a un compuesto de ensayo" significa que el compuesto de ensayo tiene un efecto medible sobre uno o más parámetros que incluyen crecimiento celular, proliferación celular, viabilidad celular y/o transducción de señales intracelulares (por ejemplo, transducción de señal mediada por MEK1 como se evidencia mediante, por ejemplo, la fosforilación de uno o más sustratos de MEK, tales como ERK1/2).
Se puede identificar un compuesto como un inhibidor de MEK1 de segunda generación determinando la viabilidad o velocidad de proliferación de las células que expresan una proteína MEK1 mutante en presencia o ausencia del compuesto. La estirpe celular usada en dicho ensayo debe ser sensible a un inhibidor de MEK1 cuando la estirpe celular expresa una proteína MEK1 natural, y debe ser resistente al inhibidor de MEK1 (es decir, un inhibidor de MEK de primera generación) cuando la estirpe celular expresa una proteína MEK1 mutante. Una estirpe celular ilustrativa útil para la identificación de un inhibidor de MEK1 de segunda generación es la estirpe celular de melanoma A375. Las células A375 son sensibles al inhibidor de MEK1 AZD6244 cuando expresan una proteína MEK1 de tipo silvestre, pero son resistentes a AZD6244 cuando expresan una proteína MEK1 mutante que comprende una mutación C121S.
Cuando en presencia de un compuesto que es un inhibidor de MEK1 de segunda generación, una estirpe celular que expresa la proteína MEK1 mutante tiene una viabilidad o velocidad de proliferación inferior que en ausencia del compuesto y/o una viabilidad o velocidad de proliferación inferior que una estirpe celular que expresa una proteína MEK1 de tipo silvestre en presencia del compuesto. Cuando, en presencia de un compuesto que no es un inhibidor de MEK1 de segunda generación, una estirpe celular que expresa la proteína MEK1 mutante tiene una viabilidad o velocidad de proliferación equivalente o superior que en ausencia del compuesto y/o una viabilidad o velocidad de proliferación equivalente o superior que una estirpe celular que expresa una proteína MEK1 de tipo silvestre en presencia del compuesto. Los métodos de medición de la viabilidad y/o la velocidad de proliferación celular conocidos en la técnica son adecuados para determinar la sensibilidad de una estirpe celular que expresa una proteína MEK1 o la proteína MEK1 mutante a un compuesto de ensayo. Dichos métodos incluyen, entre otros, la medición de la exclusión del azul de trípano, el metabolismo de compuestos del tetrazolio, la incorporación de timidina tritiada, la incorporación de BrdU, la captación de glucosa, la concentración de ATP y el nivel de apoptosis. En una realización, la proliferación celular se puede determinar usando ensayos de viabilidad/proliferación celular basados en pocillos, tales como MTS o Cell Titer GLo. En ciertas realizaciones, la sensibilidad se define como un cambio en el valor de IC50 de al menos 2 veces, más preferentemente al menos 3 veces, lo más preferentemente al menos de 4 a 5 veces, con respecto a un control adecuado.
Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona un método de identificación de un compuesto que es un inhibidor de MEK1 de segunda generación, que comprende proporcionar una composición de ensayo que comprende un sustrato de MEK y una proteína MEK1 mutante que tiene una mutación C121S con respecto a una proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2, poner en contacto la composición de ensayo con un compuesto de ensayo en condiciones que permitan la fosforilación del sustrato de MEK en ausencia del compuesto de ensayo, y determinar el efecto del compuesto de fosforilación del sustrato de MEK, en el que la modulación por disminución de la fosforilación del sustrato de MEK en comparación con un control adecuado identifica el compuesto como un inhibidor de MEK1 de segunda generación. Un compuesto identificado de esta manera es un compuesto útil para tratar un cáncer, por ejemplo, un cáncer en el que se ha detectado la proteína MEK1 mutante. Una proteína MEK1 útil en los métodos anteriores es una proteína MEK1 que contiene la mutación C121S que confiere resistencia a un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK. Un sustrato de MEK útil en los métodos anteriores es ERK1/2. Una disminución, reducción o modulación por disminución de la fosforilación de ERK1/2 es una indicación de que el compuesto es un inhibidor de MEK1. Los métodos anteriores se pueden realizar in vitro en los que la proteína MEK1 y el sustrato de MEK son proteínas aisladas o purificadas. Los métodos anteriores también se pueden realizar in vitro en los que la proteína MEK1 y el sustrato de MEK son componentes de un extracto celular. En esta realización, la composición de ensayo es un extracto celular. Un control adecuado es cualquier control que sería evidente para un experto que realiza el método, e incluye, por ejemplo, una composición de ensayo similar o idéntica no tratada con un compuesto de ensayo o tratada con un compuesto de control o una composición de ensayo análoga o extracto celular que comprende una proteína MEK1 de "tipo silvestre".
En otra realización, la invención proporciona un método de identificación de un compuesto que es un inhibidor de MEK1 de segunda generación, que comprende proporcionar una célula que comprende una proteína MEK1 mutante que comprende una mutación C121S en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2, confiriendo la mutación resistencia a un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK, poner en contacto la célula con un compuesto de ensayo, y determinar el efecto del compuesto sobre la fosforilación de ERK1/2 o la proliferación celular, en el que una disminución, reducción o modulación por disminución de la fosforilación de ERK1/2 o proliferación celular en comparación con un control apropiado identifica el compuesto como un inhibidor de MEK1 de segunda generación. Un compuesto identificado de esta manera es un compuesto útil para tratar un cáncer, por ejemplo, un cáncer en el que se ha detectado una proteína MEK1 mutante. Un control adecuado es cualquier control que sería evidente para un experto que realiza el método, e incluye, por ejemplo, una célula similar o idéntica no tratada con un compuesto de ensayo o tratada con un compuesto de control o una célula análoga o extracto celular en el que se ha expresado una m EK1 de "tipo silvestre", recombinante.
En una realización, el compuesto de ensayo usado en los métodos anteriores es un inhibidor de MEK que inhibe una actividad biológica de una proteína MEK1 de tipo silvestre. Los inhibidores de MEK que son inhibidores de MEK1 de segunda generación se describen en el presente documento.
En otra realización, el compuesto de ensayo es un miembro de una biblioteca de compuestos de ensayo. Una “biblioteca de compuestos de ensayo” se refiere a un grupo que comprende múltiples compuestos de ensayo. Se ha descrito un enfoque para la síntesis de bibliotecas moleculares de moléculas orgánicas pequeñas (Carell et al. (1994). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061). Los compuestos de la presente divulgación pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos enfoques en métodos de bibliotecas combinatorias conocidas de la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas de fase en solución o fase sólida paralela abordables espacialmente, métodos de bibliotecas sintéticas que requieren desconvolución, el método de la biblioteca de “una perla un compuesto”, y métodos de bibliotecas sintéticas usando selección de cromatografía de afinidad. El enfoque de biblioteca biológica se limita a bibliotecas peptídicas, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de compuestos de péptidos, oligómeros no peptídicos o moléculas pequeñas (Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145). Otros métodos ilustrativos para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo, en: Erb et al. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:11422; Horwell et al. (1996) Immunopharmacology 33:68; y en Gallop et al. (1994); J. Med. Chem.
37:1233. Las bibliotecas de compuestos se pueden presentar en solución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421) o en perlas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Ladner USP 5.223.409), esporas (Ladner USP .409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 89:1865-1869) o en fagos (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310). En otra realización más, los polipéptidos combinatorios se producen a partir de una biblioteca de ADNc. Los compuestos ilustrativos que pueden explorarse con respecto a la actividad incluyen, pero sin limitación, péptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, moléculas orgánicas pequeñas y bibliotecas de extractos de productos naturales.
Los inhibidores de MEK de segunda generación también pueden diseñarse racionalmente basándose en la estructura de alelos de MEK1 que contienen una mutación de resistencia descrita en el presente documento. Como se describe en el presente documento, una sustitución en la posición 121 de MEK1 que confiere resistencia a inhibidores de RAF o de MEK está localizada en o cerca de la hélice C de la proteína MEK1. La identificación de los alelos mutantes de MEK1 que confieren resistencia a los inhibidores de RAF y de MEK permite la comparación entre la estructura de la hélice C de los alelos mutantes y la proteína de tipo silvestre. El conocimiento de las características estructurales alteradas que confieren resistencia los inhibidores de RAF y de MEK permite el diseño racional y la construcción de ligandos, incluyendo inhibidores, que se unirán a la hélice C, el bucle de activación y/o el bolsillo de unión a ATP de los alelos mutantes. Dichos inhibidores se pueden diseñar de modo que se unan tanto a los alelos de MEK1 mutantes como a los de tipo silvestre. Los inhibidores diseñados para unirse a la hélice C, al bucle de activación y/o al bolsillo de unión a ATP de los alelos de MEK1 que contienen las mutaciones descritas en el presente documento son inhibidores de MEK1 de segunda generación. La capacidad de dichos inhibidores diseñados racionalmente para inhibir una actividad biológica de una proteína MEK1 mutante puede confirmarse usando los ensayos in vitro y/o in vivo descritos en el presente documento.
La estructura de una proteína MEK que contiene una mutación de resistencia descrita en el presente documento puede determinarse mediante modelización asistida por ordenador o mediante la determinación de la estructura cristalina o de solución de la proteína MEK1 mutante. Se puede usar cualquier método adecuado conocido en la técnica para determinar la estructura de una proteína MEK1 mutante.
Los ejemplos de métodos de modelización asistida por ordenador incluyen el uso de programas de software tales como PYMOL, CAVITY (descrito en J. Comp. Aided. Mol. Des. (1990) 4:337-354) y Discovery Studio® (Accelrys, San Diego, CA). Técnicas adicionales útiles para la modelización molecular asistida por ordenador se describen en J BUON. (2007) 12 Supl 1:S101-18. También puede usarse análisis basado en ordenador de una proteína con una estructura conocida para identificar moléculas que se unirán a la proteína. Dichos métodos clasifican moléculas basándose en su forma complementaria a un sitio de receptor. Por ejemplo, usando una base de datos tridimensional, puede usarse un programa tal como DOCK para identificar moléculas que se unirán con XBP-1, IRE-1 alfa y/o EDEM. Véase DesJarlias et al. (1988) J. Med. Chem. 31:722; Meng et al. (1992) J. Computer Chem.
13:505; Meng et al. (1993) “Proteins” 17:266; Shoichet et al. (1993) Science 259:1445. Además, también puede analizarse la complementariedad electrónica de una molécula con una proteína diana para identificar moléculas que se unan a la diana. Esto puede determinarse usando, por ejemplo, un campo de fuerza de mecánica molecular como se describe en Meng et al. (1992) J. Computer Chem. 13:505 y Meng et al. (1993) “Proteins” 17:266. Otros programas que pueden usarse incluyen CLIX que usa un campo de fuerza de GRID en el acoplamiento de ligandos potenciales (véase, por ejemplo, Lawrence et al. (1992) “Proteins” 12:31; Goodford et al. (1985) J. Med. Chem.
28:849; y Boobbyer et al. (1989) J. Med. Chem. 32:1083).
Puede realizarse cristalización mediante cualquier método de cristalización, incluyendo, pero sin limitación, métodos discontinuos, de diálisis y de difusión por vapor (por ejemplo, gota en reposo y gota colgante). También pueden realizarse microsiembra, macrosiembra y/o siembra en estrías de cristales para facilitar la cristalización. Pueden formarse cristales que comprendan alelos mutantes de MEK1 mediante una variedad de diferentes métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden realizarse cristalizaciones mediante métodos discontinuos, de diálisis y de difusión de vapor (gota en reposo y gota colgante). Puede encontrarse una descripción detallada de preparaciones de cristalización de proteínas básicas enMcRee, D., “Practical Protein Crystallography”, 2a Ed. (1999), Academic Press Inc. Se proporcionan descripciones adicionales con respecto a la realización de experimentos de cristalización en Stevens et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.: 10(5):558-63, y las patentes de EE.UU. n.° 6.296.673; 5.419.278; y 5.096.676. Dichos cristales pueden usarse para realizar análisis de difracción de rayos X o neutrones para determinar la estructura tridimensional de alelos mutantes de MEK1. Puede identificarse una estructura en solución de una proteína MEK1 o proteína MEK1 mutante usando espectroscopia de resonancia magnética nuclear usando técnicas conocidas en la materia. Se describen métodos adecuados de determinación de la estructura proteica por cristalografía de Rayos X o espectroscopia de RMN en Brunger et al., (1998) "Crystallography & NMR system (CNS): A new software system for macromolecular structure determination," Acta Crystallogr D54, 905-921; Brunger et al. (1987) "Solution of a Protein Crystal Structure with a Model Obtained From NMR Interproton Distance Restraints," Science 235, 1049-1053; Drenth, "Principles of Protein X-ray Crystallography", (1994), Springer-Verlag. pp. 1-19; y Narula et al. (1995) "Solution structure of the C-terminal SH2 domain of the human tyrosine kinase Syk complexed with a phosphotyrosine pentapeptide", Structure 3, 1061-1073. Tras la identificación de la estructura cristalina o en solución de una proteína MEK1, pueden identificarse inhibidores de la proteína MEK1 mutante usando los enfoques de modelización asistidos por ordenador descritos anteriormente.
Los inhibidores de MEK1 de segunda generación identificados mediante los métodos anteriores son útiles para tratar una enfermedad o afección asociadas con la expresión de una proteína MEK1 de tipo silvestre y/o mutante. Por ejemplo, los inhibidores de MEK1 de segunda generación son útiles para tratar un cáncer en un sujeto, en particular, un cáncer en el que se haya identificado una proteína MEK1 mutante que comprende la sustitución en la posición
121. En una realización ilustrativa, los inhibidores de MEK1 de segunda generación son útiles para tratar un cáncer que contiene una proteína MEK1 que tiene una mutación C121S.
IV. Moléculas de ácido nucleico aisladas
La presente divulgación se refiere a polinucleótidos o moléculas de ácido nucleico relacionadas con el gen de MEK1 y su producto génico respectivo. Estos polinucleótidos o moléculas de ácido nucleico se pueden aislar y purificar de células de mamífero. En aspectos particulares de la divulgación, las moléculas de ácido nucleico de MEK1 aisladas descritas en el presente documento comprenden una mutación que confiere resistencia a inhibidores de RAF o de
MEK. Una “molécula de ácido nucleico de MEK1 mutante”, como se hace referencia en el presente documento, incluye una molécula de ácido nucleico de MEK1 que codifica una proteína MEK1 mutante, es decir, una proteína
MEK1 que contiene una o más mutaciones que confieren resistencia a uno o más inhibidores de RAF o de MEK conocidos.
En una realización preferida, el ácido nucleico aislado de la divulgación que codifica una proteína MEK1 mutante comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 3. En otra realización más, el ácido nucleico aislado de la divulgación codifica una proteína MEK1 mutante que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4.
Se contempla que una molécula de ácido nucleico de MEK1 aislada y purificada, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de MEK1 mutante, puede adoptar la forma de ARN o ADN. Como se usa en el presente documento, la expresión “transcripción de ARN" se refiere a una molécula de ARN que es el producto de la transcripción de una molécula de ácido nucleico de ADN. Dicha transcripción puede codificar una o más proteínas.
Como se usa en la presente solicitud, el término "polinucleótido" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ARN o
ADN, que se ha aislado, tal como que está libre de ácido nucleico genómico total. Por lo tanto, un "polinucleótido que codifica MEK1" se refiere a un segmento de ácido nucleico que contiene secuencias codificantes de MEK1, aunque está aislado de, o purificado y libre de, ADN genómico total y proteínas. Cuando la presente solicitud se refiere a la función o actividad de un polinucleótido o ácido nucleico que codifica MEK1, se entiende que el polinucleótido codifica una molécula que es capaz de realizar una actividad de una proteína MEK1 de tipo silvestre, por ejemplo, la fosforilación del sustrato ERK1/2.
El término "ADNc" pretende referirse al ADN preparado usando ARN como molde. La ventaja de usar un ADNc, a diferencia del ADN genómico o una transcripción de ARN, es la estabilidad y la capacidad de manipular la secuencia usando tecnología de ADN recombinante (véase Sambrook, 1989; Ausubel, 1996). Puede haber momentos en que se prefiera la secuencia genómica completa o parcial. Como alternativa, el ADNc puede ser ventajoso, porque representa regiones codificantes de una proteína y elimina intrones y otras regiones reguladoras.
También se contempla que un ácido nucleico que codifica MEK1 o gen de MEK1 dados de una célula dada se puede representar por variantes naturales o cepas que tengan secuencias de ácido nucleico ligeramente diferentes, pero, no obstante, codificantes de una proteína MEK1 activa. En una realización preferida, la proteína MEK1 activa es una proteína MEK1 humana activa. En realizaciones particularmente preferidas, la proteína MEK1 activa es una proteína MEK1 mutante que tiene una actividad de una proteína MEK1 de tipo silvestre, pero que es resistente a uno o más inhibidores de RAF o MEK conocidos. Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación engloban derivados de MEK1 con cambios mínimos de aminoácidos, pero que poseen la misma función biológica.
El término “gen” se usa para mayor simplicidad para hacer referencia a una proteína funcional, una proteína o una unidad codificante de péptidos. Como se entenderá por los expertos en la materia, este término funcional incluye secuencias genómicas, secuencias de ADNc y segmentos génicos modificados por ingeniería genética más pequeños que expresan, o que pueden adaptarse para expresar, proteínas, dominios, proteínas de fusión y proteínas mutantes. La molécula de ácido nucleico que codifica MEK1 puede comprender una secuencia de ácido nucleico contigua de las siguientes longitudes: al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,
90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310,
320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 51 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630,
Figure imgf000016_0001
640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 74 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 97 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800,
1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600,
3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400,
5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200,
7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000,
9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900, 10000, 10100, 10200, 10300, 10400, 10500, 10600, 10700, 10800, 10900, 11000, 11100, 11200, 11300, 11400, 11500, 11600, 11700, 11800, 11900, 12000 o más nucleótidos, nucleósidos o pares de bases. Dichas secuencias pueden ser idénticas o complementarias, por ejemplo, SEQ ID NO:1 o un fragmento de la misma.
Diversas realizaciones de la divulgación se refieren a mutaciones genéticas en MEK1. Como se usa en el presente documento, una mutación se refiere a una adición, deleción o sustitución de un solo nucleótido en un sitio de una molécula de ácido nucleico de MEK1. En una realización ilustrativa, una molécula de ácido nucleico de MEK1 mutante contiene una o más mutaciones que confieren resistencia a un determinado tratamiento, tal como uno o más inhibidores de RAF o MEK. En una realización relacionada, una molécula de ácido nucleico de MEK1 mutante contiene una o más mutaciones de modo que la molécula de ácido nucleico de MEK1 mutante codifica una proteína MEK1 mutante, donde la proteína MEK1 mutante contiene una o más mutaciones que confieren resistencia a un determinado tratamiento, tal como uno o más inhibidores de RAF o MEK. Por lo tanto, en aspectos particulares de la divulgación, una alteración en una secuencia produce un cambio que afecta a las propiedades de una proteína codificada por la secuencia de manera que se produce en consecuencia al menos cierta resistencia al tratamiento, tal como al tratamiento con inhibidor de RAF o de MEK.
"Aislado sustancialmente de otras secuencias codificantes" significa que el gen de interés forma parte de la región codificante del segmento de ácido nucleico y que el segmento no contiene grandes partes de ácido nucleico codificante de origen natural, tales como fragmentos cromosómicos grandes u otros genes funcionales o regiones codificantes de ADNc. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ácido nucleico como se aisló originalmente, y no excluye los genes ni regiones codificantes que posteriormente se añaden al segmento mediante manipulación humana.
En realizaciones particulares, la divulgación se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y vectores recombinantes que tienen incorporadas secuencias de ADN que codifican proteínas o péptidos MEK1 mutantes que incluyen dentro de su secuencia de aminoácidos una secuencia de aminoácidos contigua de acuerdo con, o que corresponde esencialmente a, proteínas MEK1 mutantes. En realizaciones ilustrativas, la divulgación se refiere a segmentos de ADN aislados y vectores recombinantes que tienen incorporadas secuencias de ADN que codifican una proteína, un polipéptido o un péptido MEK1 que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos una secuencia de aminoácidos contigua de una proteína MEK1 que comprende una o más mutaciones que confieren resistencia a uno o más inhibidores de RAF o de MEK. En una realización ilustrativa, las mutaciones se producen en la posición 121 y preferentemente es una sustitución C121S.
Los segmentos de ácido nucleico usados en la presente divulgación, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, se pueden combinar con otras secuencias de ADN o ARN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes y similares, de modo que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que se puede emplear un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, estando la longitud total preferentemente limitada por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante deseado.
Se contempla que las construcciones de ácido nucleico de la presente divulgación codifiquen una proteína MEK1 o una proteína MEK1 mutante. Una secuencia "heteróloga" se refiere a una secuencia que es foránea o exógena para la secuencia restante. Un gen heterólogo se refiere a un gen que no se encuentra en la naturaleza adyacente a las secuencias con las que se ubica ahora.
En un ejemplo no limitante, se pueden preparar una o más construcciones de ácido nucleico que incluyen un tramo contiguo de nucleótidos idénticos o complementarios a todo o parte de un gen MEK1. Una construcción de ácido nucleico puede comprender al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 20.000, 30.000, 50.000, 100.000, 250.000, aproximadamente 500.000, 750.000 a aproximadamente 1.000.000 de nucleótidos de longitud, así como construcciones de mayor tamaño, hasta e incluyendo tamaños cromosómicos (incluyendo todas las longitudes intermedias y los intervalos intermedios), dado el advenimiento de construcciones de ácidos nucleicos tales como un cromosoma artificial de levadura, son conocidos por los expertos en la materia. Se entenderá fácilmente que las "longitudes intermedias" y los "intervalos intermedios", como se usa en el presente documento, significa cualquier longitud o intervalo que incluye o entre los valores citados (es decir, todos los números enteros que incluyen y entre dichos valores). Los ejemplos no limitantes de longitudes intermedias incluyen aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, etc.; aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, etc.; aproximadamente 31, aproximadamente 32, etc.; aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, etc.; aproximadamente 101, aproximadamente 102, aproximadamente 103, etc.; aproximadamente 151, aproximadamente 152, aproximadamente 153, aproximadamente 97.001, aproximadamente 1.001, aproximadamente 1.002, aproximadamente 50.001, aproximadamente 50.002, aproximadamente 750.001, aproximadamente 750.002, aproximadamente 1.000.001, aproximadamente 1.000.002, etc. Los ejemplos no limitantes de intervalos intermedios incluyen de aproximadamente 3 a aproximadamente 32, de aproximadamente 150 a aproximadamente 500.001, de aproximadamente 3.032 a aproximadamente 7.145, de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 15.000, de aproximadamente 20.007 a aproximadamente 1.000.003, etc.
Ciertas realizaciones de la presente divulgación se refieren a diversos ácidos nucleicos que incluyen vectores, promotores, ácidos nucleicos terapéuticos y otros elementos de ácido nucleico implicados en la transformación y expresión en células. En ciertos aspectos, un ácido nucleico comprende un ácido nucleico de tipo silvestre o mutante. En aspectos particulares, un ácido nucleico codifica o comprende un ácido nucleico transcrito.
El término "ácido nucleico" es muy conocido en la técnica. Un "ácido nucleico" como se usa en el presente documento se referirá, en general, a una molécula (es decir, una cadena) de ADN, ARN o un derivado o análogo de los mismos, que comprende una nucleobase. Una nucleobase incluye, por ejemplo, una base de purina o pirimidina natural que se encuentra en el ADN (por ejemplo, una adenina "A", una guanina "G", una timina "T" o una citosina "C") o ARN (por ejemplo, una A, una G, un uracilo "U" o una C). El término "ácido nucleico" abarca los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido", cada uno como un subgénero del término "ácido nucleico". El término "oligonucleótido" se refiere a una molécula de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 100 nucleobases de longitud. El término "polinucleótido" se refiere a al menos una molécula de más de aproximadamente 100 nucleobases de longitud. Un "gen" se refiere a la secuencia codificante de un producto génico, así como a los intrones y al promotor del producto génico. Además del gen MEK1, se contemplan otras regiones reguladoras tales como potenciadores para MEK1 como ácidos nucleicos para su uso con composiciones y métodos de la divulgación reivindicada.
Estas definiciones se refieren, en general, a una molécula monocatenaria, pero, en realizaciones específicas, también englobará una cadena adicional que sea parcial, sustancial o totalmente complementaria a la molécula monocatenaria. De este modo, un ácido nucleico puede abarcar una molécula bicatenaria o una molécula de triple cadena que comprende una o más cadenas complementarias o "complementos" de una determinada secuencia que comprende una molécula. Como se usa en el presente documento, un ácido nucleico monocatenario se puede indicar mediante el prefijo "mc", un ácido nucleico bicatenario por el prefijo "bc" y un ácido nucleico de triple cadena por el prefijo "tc".
Un ácido nucleico se puede preparar mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante síntesis química, o mediante producción enzimática o producción biológica. Los ejemplos no limitantes de un ácido nucleico sintético (por ejemplo, un cebador de MEK1 sintético que facilita la identificación de una mutación que confiere resistencia a uno o más inhibidores de RAF o MEK), incluyen un ácido nucleico preparado mediante síntesis química in vitro usando química de fosfotriéster, fosfito o fosforamidita y técnicas de fase sólida tales como las descritas en el documento EP 266.032 o a través de productos intermedios de desoxinucleósido H-fosfonato según lo descrito por Froehler et al., 1986 y la patente de EE.UU. n.° 5.705.629. En los métodos de la presente divulgación, se pueden usar uno o más oligonucleótidos. Se han desvelado diversos mecanismos diferentes de síntesis de oligonucleótidos en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 4.659.774, 4.816.571, 5.141.813, 5.264.566, 4.959.463, 5.428.148, 5.554.744, 5.574.146, 5.602.244.
Un ejemplo no limitante de un ácido nucleico producido enzimáticamente incluye aquel producido por enzimas en reacciones de amplificación tales como PCR (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 4.683.202 y 4.682.195) o aquel producido por síntesis de oligonucleótidos, según lo descrito en la patente de EE.UU. n.° 5.645.897. Un ejemplo no limitante de un ácido nucleico producido biológicamente incluye un ácido nucleico recombinante producido (es decir, replicado) en una célula viva, tal como un vector de ADN recombinante replicado en bacterias.
Un ácido nucleico puede purificarse en geles de poliacrilamida, gradientes de centrifugación de cloruro de cesio o mediante cualquier otro medio conocido por un experto en la materia como parte de la evaluación de una mutación que confiere resistencia a inhibidores de RAF y de MEK. En aspectos preferidos, un ácido nucleico es un ácido nucleico farmacológicamente aceptable. Los expertos en la materia conocen composiciones farmacológicamente aceptables, y se describen en el presente documento.
En ciertos aspectos, la presente divulgación se refiere a un ácido nucleico que es un ácido nucleico aislado. Como se usa en el presente documento, la expresión “ácido nucleico aislado” se refiere a una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN o ADN) que se ha aislado de, o que está de otro modo libre de, el volumen de los ácidos nucleicos transcritos y genómicos totales de una o más células. En ciertas realizaciones, “ácido nucleico aislado” se refiere a un ácido nucleico que se ha aislado de, o que está de otro modo libre de, el volumen de componentes celulares o componentes de reacción in vitro, incluyendo, por ejemplo, macromoléculas tales como lípidos o proteínas, moléculas biológicas pequeñas y similares.
V. Vectores de expresión y células hospedadoras
La presente divulgación abarca composiciones de vectores de expresión y el uso de dichos vectores para codificar una proteína MEK1, por ejemplo, una proteína MEK1 mutante, así como composiciones de células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores de expresión. El término “vector” se usa para hacer referencia a una molécula de ácido nucleico vehículo en la que puede insertarse una secuencia de ácido nucleico para la introducción en una célula en la que puede replicarse. Una secuencia de ácido nucleico puede ser “exógena”, lo que significa que es ajena a la célula en la que se introduce el vector o que la secuencia es homóloga a una secuencia de la célula, pero que está en una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedadora en la que la secuencia no se encuentra habitualmente. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales y virus vegetales) y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). Un experto en la materia estaría bien preparado para construir un vector a través de técnicas recombinantes convencionales.
La expresión “vector de expresión” o “construcción de expresión” se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico capaz de transcribirse. En algunos casos, las moléculas de ARN se traducen después a una proteína o un péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de “secuencias de control”, que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y, posiblemente, la traducción de una secuencia codificante unida operativamente en un determinado organismo hospedador. Además de controlar secuencias que gobiernan la transcripción y la traducción, los vectores y vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que también cumplen otras funciones y se describen posteriormente.
1. Promotores y potenciadores
Un “promotor” es una secuencia de control que es una región de una secuencia de ácido nucleico en la que se controlan el inicio y la velocidad de transcripción. Puede contener elementos genéticos en los que las proteínas y moléculas reguladoras pueden unirse tales como ARN polimerasa y otros factores de transcripción. Las expresiones “situado operativamente”, “unido operativamente”, “bajo el control” y “bajo el control de la transcripción” significan que un promotor está en una ubicación y/u orientación funcionales correctas en relación con una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio de la transcripción y/o la expresión de esa secuencia. Un promotor puede usarse o no junto con un “potenciador”, que se refiere a una secuencia reguladora de acción en cis implicada en la activación de la transcripción de una secuencia de ácido nucleico.
Un promotor puede ser aquel asociado de forma natural con un gen o una secuencia, como puede obtenerse aislando las secuencias 5' no codificantes situadas cadena arriba del segmento codificante y/o exón. Dicho promotor puede denominarse “endógeno”. De forma similar, un potenciador puede ser aquel asociado de forma natural con una secuencia de ácido nucleico, situado bien cadena abajo o cadena arriba de esa secuencia. Como alternativa, se obtendrán ciertas ventajas situando el segmento de ácido nucleico codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo, que se refiere a un promotor que no está normalmente asociado con una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Un potenciador recombinante o heterólogo se refiere también a un potenciador no asociado normalmente con una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Dichos promotores o potenciadores pueden incluir promotores o potenciadores de otros genes, y promotores o potenciadores aislados de cualquier otra célula procariota, vírica o eucariota, y promotores o potenciadores no “de origen natural”, es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras de la transcripción y/o mutaciones que alteran la expresión.
De forma natural, será importante emplear un promotor y/o potenciador que dirija eficazmente la expresión del segmento de ácido nucleico en el tipo celular, orgánulo y organismo escogido para la expresión. Los expertos en la materia de la Biología molecular conocen, en general, el uso de promotores, potenciadores y combinaciones de tipos celulares para la expresión de proteínas. Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos del tejido, inducibles y/o útiles en las condiciones apropiadas para dirigir la expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido. El promotor puede ser heterólogo o exógeno, por ejemplo, un promotor no MEK1 con respecto a la secuencia codificante de MEK1. En algunos ejemplos, se emplea un promotor procariota para su uso con la transcripción in vitro de una secuencia deseada. Los promotores procariotas para su uso con muchos sistemas disponibles en el mercado incluyen T7, T3 y SP6.
2. Señales de inicio y sitios de unión de ribosomas internos
También puede requerirse una señal de inicio específica para la traducción eficaz de secuencias codificantes. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales de control de la traducción exógenas, incluyendo el codón de inicio ATG. Un experto en la materia sería capaz de determinar fácilmente esto y proporcionar las señales necesarias. Se conoce bien que el codón de inicio debe estar “en fase” con la fase de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traducción de toda la inserción. Las señales de control de la traducción exógenas y los codones de inicio pueden ser naturales o sintéticos. La eficacia de expresión puede estar potenciada por la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados. En ciertas realizaciones de la divulgación, el uso de elementos de sitios de entrada de ribosomas internos (IRES) se emplea para crear mensajes multigénicos o policistrónicos.
3. Sitios de clonación múltiple
Los vectores pueden incluir un sitio de clonación múltiple (MCS), que es una región de ácido nucleico que contiene múltiples sitios de enzimas de restricción, cualquiera de los cuales puede usarse junto con la tecnología recombinante convencional para digerir el vector (véase, por ejemplo, Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, y Cocea, 1997). “Digestión con enzimas de restricción” se refiere a la escisión catalítica de una molécula de ácido nucleico con una enzima que solo funciona en ubicaciones específicas de una molécula de ácido nucleico. Muchas de estas enzimas de restricción se encuentran disponibles en el mercado. El uso de dichas enzimas es ampliamente comprendido por los expertos en la materia. Con frecuencia, un vector se linealiza o fragmenta usando una enzima de restricción que corta dentro del MCS para permitir que se liguen secuencias exógenas con el vector. “Ligadura” se refiere al proceso de formar enlaces de fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico, que pueden estar o no contiguos entre sí. Los expertos en la materia de la tecnología recombinante conocen bien las técnicas que incluyen las enzimas de restricción y reacciones de ligadura.
4. Sitios de corte y empalme
La mayoría de las moléculas de ARN eucariotas transcritas experimentarán el corte y empalme de ARN para retirar intrones de las transcripciones primarias. Los vectores que contienen secuencias eucariotas genómicas pueden requerir sitios de corte y empalme donantes y/o aceptores para garantizar el procesamiento apropiado de la transcripción para la expresión de proteínas (véase, por ejemplo, Chandler et al., 1997).
5. Señales de terminación
Los vectores o las construcciones de la presente divulgación, en general, comprenderán al menos una señal de terminación. Una “señal de terminación” o un “terminador” se compone de las secuencias de ADN implicadas en la terminación específica de una transcripción de ARN por una ARN polimerasa. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, se contempla una señal de terminación que termina la producción de una transcripción de ARN. Un terminador puede ser necesario in vivo para conseguir niveles de mensaje deseables.
6. Señales de poliadenilación
Para la expresión, en particular, la expresión eucariota, normalmente, se incluirá una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación apropiada de la transcripción. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica exitosa de la divulgación, y/o puede emplearse cualquiera de dichas secuencias. Las realizaciones preferidas incluyen la señal de poliadenilación de SV40 y/o la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, convenientes y/o que se sabe que funcionan bien en diversas células diana. La poliadenilación puede aumentar la estabilidad de la transcripción o puede facilitar el transporte citoplasmático.
7. Orígenes de replicación
Para propagar un vector en una célula hospedadora, puede contener uno o más orígenes de sitios de replicación (que se suelen denominar “ori”), que es una secuencia de ácido nucleico específica en la que se inicia la replicación. Como alternativa, puede emplearse una secuencia de replicación autónoma (ARS) si la célula hospedadora es levadura.
8. Marcadores seleccionables y explorables
En ciertas realizaciones de la divulgación, las células que contienen una construcción de ácido nucleico de la presente divulgación pueden identificarse in vitro o in vivo incluyendo un marcador en el vector de expresión. Dichos marcadores conferirían un cambio identificable a la célula permitiendo la fácil identificación de las células que contienen el vector de expresión. En general, un marcador seleccionable es aquel que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador seleccionable positivo es aquel en el que la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador seleccionable negativo es aquel en el que su presencia evita su selección. Un ejemplo de un marcador seleccionable positivo es un marcador de resistencia a fármacos.
Habitualmente, la inclusión de un marcador de selección de fármacos ayuda en la clonación e identificación de transformantes, por ejemplo, los genes que confieren resistencia a la neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores seleccionables útiles. Además de marcadores que confieren un fenotipo que permite la diferenciación de transformantes basándose en la implementación de condiciones, también se contemplan otros tipos de marcadores incluyendo marcadores explorables, tales como GFP, que se basan en el análisis calorimétrico. Como alternativa, pueden utilizarse enzimas explorables tales como timidina quinasa (tk) del virus del herpes simple o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Un experto en la materia también sabría cómo emplear marcadores inmunológicos, posiblemente junto con análisis de FACS. No se cree que el marcador usado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Los expertos en la materia conocen bien ejemplos adicionales de marcadores seleccionables y explorables.
9. Célula hospedadoras
Como se usa en el presente documento, el término “célula”, y las expresiones “línea celular” y “cultivo celular” se pueden usar indistintamente. En la invención, se puede emplear una célula que comprenda un polinucleótido de MEK1, bien mutado o de tipo silvestre. Todos estos términos también incluyen su descendencia, que se refiere a todas y cada una de las generaciones posteriores. Se entiende que toda la descendencia puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. En el contexto de la expresión de una secuencia de ácido nucleico heteróloga, “célula hospedadora” se refiere a una célula procariota o eucariota, e incluye cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar un vector y/o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula hospedadora puede usarse, y se ha usado, como un receptor para vectores. Una célula hospedadora puede “transfectarse” o “transformarse”, lo que se refiere a un proceso mediante el que se transfiere o introduce ácido nucleico exógeno en la célula hospedadora. Una célula transformada incluye la célula objeto primaria y su descendencia. Una “célula hospedadora recombinante” se refiere a una célula hospedadora que porta un ácido nucleico recombinante, es decir, un ácido nucleico que se ha manipulado in vitro o que es una copia replicada de un ácido nucleico que se ha manipulado de este modo.
Una célula hospedadora puede derivar de procariotas o eucariotas, dependiendo de si el resultado deseado es la replicación del vector, la expresión de parte de o todas las secuencias de ácido nucleico codificadas por el vector, o la producción de partículas víricas infecciosas. Hay disponibles para su uso como una célula hospedadora numerosas estirpes celulares y cultivos, y pueden obtenerse a través de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), que es una organización que sirve de archivo para cultivos vivos y materiales genéticos. El experto en la materia puede determinar un hospedador apropiado basándose en la estructura principal del vector y el resultado deseado. Puede introducirse un plásmido o cósmido, por ejemplo, en una célula hospedadora procariota para la replicación de muchos vectores. Las células bacterianas usadas como células hospedadoras para la replicación y/o expresión del vector incluyen DH5a, JM109, y KC8, así como una serie de hospedadores bacterianos disponibles en el mercado tales como Células competentes SURE™ y Células Solopack™ Gold (Strategene. RTM., La Jolla). Como alternativa, podrían usarse células bacterianas tales como E. coli LE392 como células hospedadoras para virus de fagos.
Una célula hospedadora eucariota preferida de la divulgación es la estirpe celular de melanoma A375, en la que la célula se ha transformado con un vector de expresión que codifica una proteína MEK1, por ejemplo, una proteína MEK1 mutante de la divulgación.
10. Sistemas de expresión
Existen numerosos sistemas de expresión que comprenden al menos una parte de o todas las composiciones analizadas anteriormente. Pueden emplearse sistemas basados en procariotas y/o eucariotas para su uso con la presente divulgación para producir secuencias de ácido nucleico de MEK1, o sus proteínas y péptidos afines. Muchos de dichos sistemas están disponibles en el mercado y ampliamente.
El sistema de células de insecto/baculovirus puede producir un alto nivel de expresión de proteínas de un segmento de ácido nucleico heterólogo, tal como se describe en las patentes de EE.UU. n.° 5.871.986, 4.879.236 y que puede obtenerse, por ejemplo, bajo el nombre MaxBac™ 2.0 de Invitrogen™ y sistema de expresión de baculovirus BacPack™ de Clontech™.
Otros ejemplos de sistemas de expresión incluyen Sistema de Expresión de Mamífero Inducible Complete Control™ de Stratagene, que incluye un receptor inducible por ecdisona sintético o su sistema de expresión de pET, un sistema de expresión de E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresión inducible está disponible de Invitrogen, que porta el sistema T-Rex™ (expresión regulada por tetraciclina), un sistema de expresión de mamífero inducible que usa el promotor de CMV de longitud completa. Los sistemas de Tet-On™ y Tet-Off™ de Clontech™ pueden usarse para regular la expresión en un hospedador mamífero usando tetraciclina o sus derivados. La implementación de estos sistemas se describe en Gossen et al., 1992 y Gossen et al., 1995, y la patente de EE.UU. n.° 5.650.298.
Invitrogen también proporciona un sistema de expresión de levadura denominado el Sistema de Expresión de Pichia methanolica, que se diseña para la producción de alto nivel de proteínas recombinantes en la levadura metilotrópica Pichia methanolica. Un experto en la materia sabría cómo expresar un vector, tal como una construcción de expresión, para producir una secuencia de ácido nucleico o su proteína o péptido afín.
VI. Moléculas de proteína aisladas
Otro aspecto de la divulgación se refiere a proteínas MEK1 aisladas y/o purificadas, y partes biológicamente activas de las mismas. En aspectos particulares de la divulgación, las proteínas MEK1 descritas en el presente documento comprenden una mutación en la posición del aminoácido 121 que confiere resistencia a uno o más inhibidores de RAF y/o de MEK. Una "proteína MEK1 mutante", como se menciona en el presente documento, incluye una proteína MEK1 que contiene una mutación en la posición del aminoácido 121 que confiere resistencia a uno o más inhibidores de RAF y/o de MEK conocidos. Preferentemente, la proteína MEK1 mutante aislada comprende una mutación C121S. En una realización preferida, la proteína MEK1 mutante aislada comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4.
Una proteína "aislada" o "purificada" o una parte biológicamente activa de la misma están esencialmente libres de material celular cuando se producen mediante técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. La expresión "esencialmente libre de material celular" incluye preparados de proteínas MEK1 en los que la proteína se separa de los componentes celulares de las células en las que se produce de manera natural o recombinante. En una realización, la expresión "esencialmente libre de material celular" incluye preparados de proteína MEK1 que tienen menos de aproximadamente el 30 % (en peso seco) de proteína no MEK1 (también denominada en el presente documento "proteína contaminante"), más preferentemente menos de aproximadamente el 20 % de proteína no MEK1, aún más preferentemente menos de aproximadamente el 10 % de proteína no MEK1, y lo más preferentemente menos de aproximadamente el 5 % de proteína no MEK1. Cuando la proteína MEK1 o su parte biológicamente activa se producen recombinantemente, también están preferentemente esencialmente libres de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20 %, más preferentemente menos de aproximadamente el 10 % y lo más preferentemente menos de aproximadamente el 5 % del volumen del preparado de proteína. La expresión "esencialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparados de proteína MEK1 en los que la proteína está separada de los precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En una realización, la expresión "esencialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparados de proteína MEK1 que tienen menos de aproximadamente el 30 % (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos no MEK1, más preferentemente menos de aproximadamente el 20 % de precursores químicos o productos químicos no MEK1, aún más preferentemente menos de aproximadamente el 10 % de precursores químicos o productos químicos no MEK1, y lo más preferentemente menos de aproximadamente el 5 % de precursores químicos o productos químicos no MEK1.
Las partes biológicamente activas de una proteína MEK1 incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de una proteína MEK1, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 y 4, que incluyen menos aminoácidos que una proteína MEK1 completa, y presentan al menos una actividad de una proteína MEK1. Por lo general, las partes biológicamente activas (péptidos, por ejemplo, péptidos que son de, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos de longitud) comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de una proteína MEK1. Además, otras partes biológicamente activas, en las que se eliminan otras regiones de la proteína, pueden prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse para determinar una o más de las actividades descritas en el presente documento. Preferentemente, las partes biológicamente activas de una proteína MEK1 incluyen uno o más dominios/motivos seleccionados o partes de los mismos que tienen actividad biológica. En realizaciones preferidas, las partes biológicamente activas de una proteína MEK1 comprenden una mutación en la posición del aminoácido 121 con respecto a una secuencia de MEK1 de tipo silvestre, donde dicha mutación, cuando está presente en una proteína MEK1 mutante de longitud completa, confiere resistencia de la proteína MEK1 mutante a inhibidores de RAF y de MEK conocidos. En una realización ilustrativa, la mutación se produce en el aminoácido 121, preferentemente una mutación C121S.
Las proteínas MEK1 se producen preferentemente mediante técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína se clona en un vector de expresión (como se ha descrito anteriormente), el vector de expresión se introduce en una célula hospedadora (como se ha descrito anteriormente) y la proteína MEK1 se expresa en la célula hospedadora. A continuación, se puede aislar la proteína MEK1 de las células mediante un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de proteínas convencionales. Como alternativa a la expresión recombinante, una proteína o péptido MEK1 se puede sintetizar químicamente usando técnicas de síntesis de péptidos convencionales. Además, se puede aislar una proteína MEK1 nativa y/o una proteína MEK1 mutante de células (por ejemplo, células cancerosas), por ejemplo usando un anticuerpo anti-MEK1, que puede producirse mediante técnicas convencionales que utilizan una proteína MEK1 o un fragmento de la misma de la presente divulgación.
La divulgación también proporciona proteínas MEK1 quiméricas o de fusión. Como se usa en el presente documento, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" MEK1 comprende una proteína MEK1 operativamente unida a una proteína no MEK1. Una "proteína MEK1" se refiere a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína MEK1, mientras que una "proteína no MEK1" se refiere a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la proteína MEK1, por ejemplo, una proteína que es sustancialmente diferente de la proteína MEK1, que no muestra una actividad de MEK1 y que se deriva del mismo organismo o de un organismo diferente. Dentro de la proteína de fusión, la expresión "unida operativamente" pretende indicar que la proteína MEK1 y la proteína no MEK1 se fusionan en fase entre sí. La proteína no MEK1 se puede fusionar al extremo N o al extremo C de la proteína MEK1. Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-MEK1 en la que las secuencias de MEK1 se fusionan con el extremo C de las secuencias de GST. Dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de proteínas MEK1 recombinantes. En otra realización, la proteína de fusión es una proteína MEK1 que contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N. En ciertas células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras de mamífero), la expresión y/o secreción de una proteína MEK1 puede aumentarse a través del uso de una secuencia señal heteróloga.
Preferentemente, una proteína MEK1 quimérica o de fusión de la divulgación se produce mediante técnicas de ADN recombinante convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de proteínas se ligan entre sí en fase de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos con terminación roma o escalonada para ligadura, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, rellenado de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseada y ligadura enzimática. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automáticos. Como alternativa, la amplificación por PCR de fragmentos de genes puede llevarse a cabo usando cebadores de anclaje que den lugar a proyecciones complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente pueden volverse a asociar y volverse a amplificar para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, “Current Protocols in Molecular Biology”, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, hay muchos vectores de expresión que se encuentran disponibles en el mercado que ya codifican una fracción de fusión (por ejemplo, una proteína GST). Se puede clonar un ácido nucleico que codifica MEK1 en un vector de expresión de manera que la fracción de fusión se enlaza en fase a la proteína MEK1.
En una realización preferida, las proteínas MEK1 aisladas de la divulgación contienen una o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones o deleciones) con respecto a una secuencia de proteína MEK1 de tipo silvestre. En una realización, las proteínas MEK1 mutantes contienen una o más mutaciones con respecto a una secuencia de proteína MEK1 de tipo silvestre humana (SEQ ID NO: 2). En una realización particularmente preferida, la una o más mutaciones confieren resistencia a uno o más inhibidores de RAF y/o de MEK. En una realización ilustrativa, el inhibidor de RAF es PLX4032 y/o PLX4720, y el inhibidor de MEK es AZD6244. Una proteína MEK1 mutante de la divulgación presenta una actividad biológica característica de una proteína MEK1 de tipo silvestre. Dicha actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la fosforilación de ERK1/2. Los ejemplos de proteínas MEK1 mutantes de la divulgación incluyen proteínas MEK1 que comprenden una mutación en la posición del aminoácido 121, preferentemente una mutación C121s.
Las proteínas MEK1 mutantes pueden generarse mediante mutagénesis de una proteína MEK1 de tipo silvestre o de la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1 de tipo silvestre. Las proteínas MEK1 mutantes también pueden identificarse explorándose bibliotecas combinatorias de MEK1 mutantes para una proteína MEK1 mutante que tiene una actividad deseada, por ejemplo, resistencia a uno o más inhibidores de RAF y/o de MEK. Se conocen varias técnicas en la materia para explorar productos génicos de bibliotecas combinatorias preparadas mediante mutaciones puntuales o truncamiento, y para explorar bibliotecas de ADNc en busca de productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Dichas técnicas son adaptables para la exploración rápida de las genotecas generadas por mutagénesis combinatoria. Las técnicas más ampliamente usadas, que son susceptibles de análisis de alto rendimiento, para la exploración de grandes genotecas incluyen normalmente la clonación de la genoteca en vectores de expresión replicables, la transformación de células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y la expresión de genes combinatorios en condiciones cuya detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó.
VIII. Detección de mutaciones
En otro aspecto, la divulgación se refiere a métodos de detección de la presencia de una proteína MEK1 mutante en una muestra (por ejemplo, una muestra biológica de un paciente con cáncer). Se puede usar una variedad de métodos de selección para detectar la presencia de una proteína MEK1 mutante de la divulgación en una muestra, por ejemplo, una muestra de ácido nucleico y/o una muestra de proteína. En realizaciones específicas, la muestra contiene una célula o un extracto celular. En realizaciones ilustrativas, la muestra se obtiene de un sujeto, por ejemplo, un sujeto que tiene cáncer.
Los métodos de detección de la presencia de mutaciones de resistencia en ADN genómico, ADNc y ARN (es decir, ARNm) que contienen una secuencia que codifica una proteína MEK1, o una parte biológicamente activa de la misma, se pueden usar dentro del alcance de la presente divulgación. Asimismo, los métodos de detección de la presencia de mutaciones de resistencia en proteínas MEK1, o partes biológicamente activas de las mismas, se pueden usar dentro del alcance de la presente divulgación. En realizaciones particulares, se pueden usar los métodos que incluyen, pero sin limitación, los siguientes para detectar la presencia de una proteína MEK1, o una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1, que tiene una mutación en la posición del aminoácido 121 en comparación con la MEK1 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).
Las mutaciones puntuales pueden detectarse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, que incluye, por ejemplo, electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante ("DGGE"), análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción ("RFLP"), métodos de escisión química o enzimática, secuenciación directa de regiones diana amplificadas por PCR (véase lo expuesto anteriormente), análisis de polimorfismos de configuración monocatenaria ("SSCP"), reacción en cadena de la polimerasa, secuenciación, hibridación o "captura híbrida" seguida de la pirosecuenciación o secuenciación de una sola molécula. Un método para la exploración de mutaciones puntuales se basa en la escisión con RNasa de apareamientos erróneos de pares de bases en heterodúplex de ARN/ADN o ARN/ARN. Como se usa en el presente documento, el término "desapareamiento" se define como una región de uno o más nucleótidos desapareados o mal apareados en una molécula de ARN/ARN, ARN/ADN o ADN/ADN bicatenaria. Por lo tanto, esta definición incluye desapareamientos debidos a mutaciones de inserción/deleción, así como a mutaciones puntuales de una sola base o de múltiples bases. La patente de EE.UU. n.° 4.946.773 describe un ensayo de escisión de apareamientos erróneos de RNasa A que implica la hibridación de muestras de ensayo de ADN o ARN monocatenario en una sonda de ARN y el posterior tratamiento de los dúplex de ácido nucleico con ARNasa A. Para la detección de apareamientos erróneos, se comparan los productos monocatenarios del tratamiento con RNasa A, separados electroforéticamente de acuerdo con el tamaño, con los dúplex de control tratados de forma similar. Las muestras que contienen fragmentos más pequeños (productos de escisión) no vistas en el dúplex de control se puntúan como positivas.
Otros investigadores han descrito el uso de RNasa I en ensayos de apareamientos erróneos. Por ejemplo, Promega comercializa un kit que contiene RNasa I que, según los informes, escinde tres de cuatro apareamientos erróneos conocidos. Otros han descrito el uso de la proteína MutS u otras enzimas reparadoras de ADN para detectar los apareamientos erróneos de una sola base.
Los métodos alternativos para la detección de mutaciones de deleción, inserción o sustitución que se pueden usar en la práctica de la presente divulgación se desvelan en las patentes de EE.UU. n.° 5.849.483, 5.851.770, 5.866.337, 5.925.525 y 5.928.870.
Los métodos de exploración se pueden realizar para examinar a un individuo en busca de la aparición de las mutaciones identificadas anteriormente. Por ejemplo, en una realización, se toma una muestra (tal como una muestra de sangre o de otro fluido corporal, o de célula o de tejido) de un paciente para su análisis. En una realización ilustrativa, el paciente es un paciente con cáncer. Los métodos adecuados para procesar dichas muestras para la detección de una mutación en un ácido nucleico de MEK1 o una proteína MEK1 son conocidos en la técnica, y el experto en la materia puede adaptar el procesamiento de dichas muestras de acuerdo con el método de detección escogido. Por ejemplo, al detectar la presencia de mutaciones en un ácido nucleico que codifica una proteína MEK1, se pueden procesar muestras biológicas (por ejemplo, muestras de células o muestras de tejido) de manera que el material de ácido nucleico de la muestra sea accesible a los reactivos usados para detectar mutaciones (por ejemplo, sondas de ácidos nucleicos, cebadores, etc.). Por consiguiente, en ciertas realizaciones, el material de ácido nucleico en una muestra biológica se extrae de las células dentro de la muestra. "Extracción" de material de ácido nucleico como se usa en el presente documento se refiere al proceso de hacer que el material de ácido nucleico en una muestra biológica sea accesible al contacto mediante reactivos usados para la detección. Por ejemplo, en una muestra de células, el material de ácido nucleico (por ejemplo, ARNm que codifica una proteína MEK1, ADN que codifica una proteína MEK1, etc.) está situado dentro de la membrana celular, haciéndolo inaccesible mediante reactivos de detección añadidos a la muestra. Por consiguiente, la extracción del material de ácido nucleico mediante la interrupción de la integridad de la membrana celular se emplea comúnmente. Los medios ilustrativos para extraer material de ácido nucleico de una célula son conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, interrupción mecánica (por ejemplo, ultrasonidos, prensa francesa, agitación con movimiento de vórtice, homogeneización Dounce, etc.) y/o interrupción mediada por detergente (por ejemplo, interrupción en tampón de lisis que contiene detergentes tales como Triton-X-100, CHAPS, SDS, etc.). Dependiendo del método de detección, el material de ácido nucleico puede aislarse o no de otros componentes de la muestra durante o después de la extracción. Por ejemplo, para métodos de detección que emplean la amplificación por PCR de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1, se puede usar material de ácido nucleico que se ha extraído de células sin aislamiento adicional (por ejemplo, como un componente de un lisado en bruto). En una realización, se puede aislar una muestra biológica en papel filtrante que luego se procesa usando técnicas de extracción convencionales antes de la amplificación por PCR de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1. Dicho papel filtrante puede contener reactivos químicos que lisan células, y pueden contener además reactivos que estabilizan y protegen el material de ácido nucleico (por ejemplo, Whatman FTA™, GE Healthcare). La amplificación por PCR de una molécula de ácido nucleico de MEKl se puede realizar a partir de muestras almacenadas en papel filtrante sin el aislamiento de otros componentes celulares. En otras realizaciones, el material de ácido nucleico puede aislarse de otros componentes de ácido no nucleico en la muestra usando técnicas conocidas en la materia. Como se describe en las mismas, se pueden usar modificaciones en los métodos de extracción y/o aislamiento dependiendo del tipo de material de ácido nucleico que se vaya a analizar (por ejemplo, ADN o ARN). Los métodos de detección de mutaciones en una proteína MEK1 también pueden emplear extracción y/o aislamiento de proteínas de una muestra biológica. Las técnicas adecuadas para extraer y/o aislar proteínas de una muestra biológica son bien conocidas en la materia.
La presencia o ausencia de una o más mutaciones descritas en el presente documento determina la capacidad de los individuos examinados para resistir el tratamiento con un inhibidor de RAF y/o un inhibidor de MEK1 de primera generación. De acuerdo con los métodos proporcionados por la divulgación, estos resultados se usarán para ajustar y/o alterar la dosis del inhibidor de RAF y/o del inhibidor de MEK1 de primera generación, o para seleccionar un ciclo de tratamiento usando un inhibidor de MEK1 de segunda generación. El tratamiento eficaz de un sujeto que tiene cáncer puede comprender la erradicación de una célula cancerosa, el cese o la reducción de la velocidad de crecimiento del cáncer (tal como el tumor sólido), o la mejora de al menos un síntoma del cáncer.
Las mutaciones de resistencia de las proteínas MEK1, o de las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas MEK1, pueden detectarse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, o modificaciones de los mismos, que incluyen los métodos descritos a continuación. Dichos métodos incluyen el uso de la reacción en cadena de la polimerasa específica del alelo, la secuenciación directa o indirecta del sitio, el uso de enzimas de restricción donde los respectivos alelos del sitio crean o destruyen un sitio de restricción, el uso de sondas de hibridación específicas del alelo, el uso de anticuerpos que son específicos de proteínas MEK1 mutantes o cualquier otra interpretación bioquímica.
1. Secuenciación del ADN
El método más habitualmente usado para caracterizar una mutación es la secuenciación de ADN directa del locus genético que flanquea e incluye el polimorfismo. Dicho análisis puede realizarse usando bien el “método de terminación de cadena mediada por didesoxi”, también conocido como “Método de Sanger” (Sanger, F., et al., 1975) o el “método de degradación química”, también conocido como “método de Maxam-Gilbert” (Maxam, A. M., et al., 1977). La secuenciación en combinación con tecnologías de amplificación específicas de secuencia genómica, tales como la reacción en cadena de la polimerasa, puede utilizarse para facilitar la recuperación de los genes deseados (Mullis, K. et al., 1986; solicitud de patente europea 50.424; solicitud de patente europea 84.796, solicitud de patente europea 258.017, solicitud de patente europea 237.362; solicitud de patente europea 201.184; patentes de EE.UU. n.° 4.683.202; 4.582.788; y 4.683.194). También puede realizarse la secuenciación de muestras agrupadas usando la secuenciación de Solexa/Illumina (Illumina® San Diego, CA), pirosecuenciación u otros enfoques de secuenciación de moléculas individuales. En una realización, las mutaciones del gen de MEK1 se pueden detectar mediante la clonación y la secuenciación de un alelo de MEK1 presente en una muestra obtenida del sujeto. Si se desea, el ARNm de MEK1 se puede secuenciar directamente, o se puede usar la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”) para amplificar ADN o ARNm de MEK1 para producir ADN codificante (“ADNc”) y el ADNc resultante se puede secuenciar. También se puede usar la PCR para amplificar selectivamente una región del alelo de MEK1.
2. Resistencia a exonucleasa
Otros métodos que pueden emplearse para determinar la identidad de un nucleótido presente en un sitio mutado utilizan un derivado de nucleótidos resistente a exonucleasa especializado (patente de EE.UU. n.° 4.656.127). Un cebador complementario de una secuencia alélica inmediatamente 3' con respecto al sitio polimórfico se hibrida con el ADN objeto de investigación. Si el sitio polimórfico en el ADN contiene un nucleótido que es complementario al derivado de nucleótidos resistente a exonucleótido en particular presente, entonces ese derivado será incorporado por una polimerasa en el extremo del cebador hibridado. Dicha incorporación vuelve al cebador resistente a la escisión por exonucleasa y, de este modo, permite su detección. Como se conoce la identidad del derivado resistente a exonucleótido, se puede determinar el nucleótido específico presente en el sitio polimórfico del ADN.
3. Métodos de microsecuenciación
Se han descrito otros varios procedimientos de incorporación de nucleótidos guiados por cebador para ensayar sitios mutados en ADN (Komher, J. S. et al., 1989; Sokolov, B. P., 1990; Syvanen 1990; Kuppuswamy et al., 1991; Prezant et al., 1992; Ugozzoll, L. et al., 1992; Nyren et al., 1993). Estos métodos se basan en la incorporación de desoxinucleótidos marcados para diferenciar entre bases en un sitio mutado. Como la señal es proporcional al número de desoxinucleótidos incorporados, las mutaciones que tienen lugar en procesamientos del mismo nucleótido producen una señal que es proporcional a la longitud del procesamiento (Syvanen et al., 1993).
4. Extensión en solución
La patente francesa 2.650.840 y la solicitud de PCT n.° WO91/02087 analizan un método basado en solución para determinar la identidad del nucleótido de un sitio mutado. De acuerdo con estos métodos, se usa un cebador complementario a secuencias alélicas inmediatamente 3' de un sitio polimórfico. La identidad del nucleótido de ese sitio se determina usando derivados de didesoxinucleótidos marcados que se incorporan en el extremo del cebador si son complementarios al nucleótido del sitio polimórfico.
5. Análisis por Genetic Bit™ o extensión de fase sólida
La solicitud de PCT n.° 92/15712 describe un método que usa mezclas de terminadores marcados y un cebador que es complementario a la secuencia 3' de un sitio polimórfico. El terminador marcado que se incorpora es complementario al nucleótido presente en el sitio polimórfico de la molécula diana que se está evaluando, y por lo tanto, se identifica. Aquí, el cebador de la molécula diana se inmoviliza en una fase sólida.
6. Ensayo de ligadura de oligonucleótidos (OLA)
El ensayo de ligadura de oligonucleótidos es un método de fase sólida que usa diferente metodología que la descrita anteriormente (Landegren et al., 1988). Se utilizan dos oligonucleótidos capaces de hibridarse con secuencias adyacentes de una sola cadena de un ADN diana. Uno de estos oligonucleótidos está biotinilado mientras que el otro está marcado de forma detectable. Si se encuentra la secuencia complementaria precisa en una molécula diana, los oligonucleótidos se hibridarán de modo que sus extremos estén adyacentes, y creen un sustrato de ligadura. La ligadura permite la recuperación del oligonucleótido marcado usando avidina. También se describen otros ensayos de detección de ácido nucleico, basándose en este método, en combinación con la PCR (Nickerson et al., 1990). En este caso, se usa la PCR para obtener la amplificación exponencial del ADN diana, que después se detecta usando el OLA.
7. Análisis por Genetic Bit mediado por ligasa/polimerasa
La Patente de EE.UU. n.° 5.952.174 describe un método que también implica dos cebadores capaces de hibridarse con secuencias adyacentes de una molécula diana. El producto hibridado se forma en un soporte sólido en el que se inmoviliza la diana. En este caso, la hibridación se produce de modo que los cebadores se separen entre sí por un espacio de un solo nucleótido. La incubación de este producto hibridado en presencia de una polimerasa, una ligasa y una mezcla de nucleósidos trifosfato que contiene al menos un desoxinucleósido trifosfato permite la ligadura de cualquier par de oligonucleótidos hibridados contiguos. La adición de una ligasa produce dos acontecimientos requeridos para generar una señal, la extensión y la ligadura. Esto proporciona una mayor especificidad y un menor “ruido” que los métodos que solo usan extensión o ligadura, y, a diferencia de los ensayos basados en polimerasa, este método potencia la especificidad de la etapa de polimerasa combinándola con una segunda hibridación y una etapa de ligadura para unir una señal a la fase sólida.
8. Métodos de transferencia de ácido nucleico
Para algunos métodos de la presente divulgación, pueden emplearse métodos de transferencia de ácido nucleico. Se cree que los métodos adecuados para la administración de ácido nucleico con el fin de efectuar la expresión de las composiciones de la presente divulgación incluyen casi cualquier método mediante el que pueda introducirse un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, incluyendo vectores víricos y no víricos) en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo, según lo descrito en el presente documento o lo conocido por un experto habitual en la materia. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, la administración directa de ADN tal como por inyección (patentes de EE.UU.
5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859), incluyendo la microinyección (Harlan y Weintraub, 1985; patente de EE.UU. n.° 5.789.215); por electroporación (patente de EE.UU. n.° 5.384.253); por precipitación de fosfato cálcico (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); usando DEAE-dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga ultrasónica directa (Fechheimer et al., 1987); por transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991); por bombardeo de microproyectiles (n.° de solicitud PCT WO 94/09699 y 95/06128; patentes de EE.UU. n.° 5.610.042; 5.322.783; 5.563.055; 5.550.318; 5.538.877 y 5.538.880); por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al., 1990; patentes de EE.UU. n.° 5.302.523 y 5.464.765); por transformación mediada por Agrobacterium (patentes de EE.UU. n.° 5.591.616 y 5.563.055); por transformación de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh et al., 1993; patentes de EE.UU. n.° 4.684.611 y 4.952.500); o por captación de ADN mediada por inhibición/desecación (Potrykus et al., 1985). A través de la aplicación de técnicas tales como estas, se pueden transformar de forma estable o transitoria uno o varios orgánulos, células, tejidos u organismos
9. Anticuerpos específicos de alelos
Pueden detectarse proteínas MEK1 que tienen una mutación de resistencia descrita en el presente documento usando anticuerpos que reconocen específicamente la proteína MEK1 mutante, pero que no reconocen la proteína MEK1 de tipo silvestre. Pueden generarse anticuerpos contra una o más formas alélicas de la proteína MEK1 que tienen una o más mutaciones de resistencia. Se conocen bien técnicas de uso de una proteína específica o un oligopéptido como un antígeno para generar anticuerpos que reconozcan específicamente epítopos en el péptido o la proteína. En una realización, la secuencia de ADN de la forma alélica deseada del gen diana puede clonarse mediante la inserción en un vector de expresión apropiado y traducirse a una proteína en una célula hospedadora procariota o eucariota. La proteína puede recuperarse y usarse como un antígeno para generar la producción de anticuerpos específicos. En otra realización, el ADN de la forma alélica deseada del gen diana se amplifica mediante la tecnología de PCR y se traduce posteriormente in vitro a proteína para su uso como el antígeno para generar la producción de anticuerpos específicos. Una tercera realización consiste en usar la secuencia de ADN de los alelos alternativos como base para la generación de péptidos sintéticos que representen la secuencia de aminoácidos de los alelos para su uso como antígeno para generar la producción de anticuerpos específicos.
Pueden generarse anticuerpos bien mediante técnicas de anticuerpos monoclonales convencionales o generarse a través de sistemas de expresión basados en recombinantes. Se entiende que el término “anticuerpos” incluye moléculas de anticuerpos intactas así como fragmentos o derivados de anticuerpos, tales como Fab y F(ab')2, que son capaces de unirse específicamente con un antígeno. Los anticuerpos producidos de este modo se unirán preferentemente solo con la proteína mutante producida en forma alélica que se usó como un antígeno para crear el anticuerpo. También se describen métodos de generación de anticuerpos específicos de alelos en la patente de EE.UU. n.° 6.200.754 y la patente de EE.UU. n.° 6.054.273.
Dichos anticuerpos específicos de proteínas MEK1 mutantes se pueden usar para detectar la presencia de una proteína MEK1 que tenga una o más mutaciones de resistencia en una muestra, por ejemplo, una muestra de ensayo, una muestra celular, un extracto celular, una muestra biológica, o una muestra de paciente, usando técnicas conocidas en la materia. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, transferencia Western, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia indirecta y micromatrices de anticuerpos. Los anticuerpos que reconocen específicamente proteínas MEK1 mutantes también pueden ser inhibidores de MEK1 de segunda generación. La capacidad de un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína MEK1 mutante para inhibir la actividad biológica de la proteína MEK1 mutante puede determinarse usando los métodos descritos en el presente documento para identificar inhibidores de MEK1 de segunda generación.
IX. Aplicaciones de diagnóstico y exploración
Las técnicas anteriores se pueden usar para determinar la presencia o ausencia de una mutación de resistencia previamente identificada en una molécula de ácido nucleico o proteína MEK1 en una muestra obtenida de un paciente. La identificación de una molécula de ácido nucleico o proteína MEK1 mutante en una muestra de paciente puede ser útil para caracterizar una enfermedad o afección en el paciente. Por ejemplo, en un paciente que tenga una enfermedad asociada con la expresión o activación aberrante de MEKl (por ejemplo, un cáncer), la identificación de una molécula de ácido nucleico o proteína MEK1 mutante en la muestra (por ejemplo, una muestra que contenga células cancerosas) obtenida del paciente indica que el paciente tiene un riesgo relativamente alto de recaída o falta de respuesta al tratamiento con un inhibidor de RAF o de MEK. En una realización, la identificación de una molécula de ácido nucleico o proteína MEK1 que contiene una o más mutaciones descrita en el presente documento en una muestra que contiene células cancerosas obtenida de un paciente indica que el paciente está en riesgo relativamente alto de recaída o falta de respuesta al tratamiento con un inhibidor de RAF, tal como PLX4032 o PLX4720 o con un inhibidor de MEK de primera generación, por ejemplo, CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, Compuesto A o Compuesto B.
Un paciente que tiene una mutación de resistencia a MEK1 descrita en el presente documento tiene un mayor riesgo de recaída del tratamiento con un inhibidor de RAF o de MEK de primera generación que un paciente en el que no pueda detectarse una mutación de resistencia a MEK1. Por consiguiente, como se usa en el presente documento, la expresión “riesgo relativamente alto de recaída” está en relación con un paciente en el que no puede detectarse una molécula de ácido nucleico o proteína MEK1 mutante. Es decir, un paciente que tiene un “riesgo relativamente alto de recaída” es un paciente que tiene un mayor riesgo de recaída en comparación con un paciente en el que no puede detectarse una molécula de ácido nucleico o proteína MEK1 mutante.
En ciertas realizaciones, la identificación de una proteína MEK1, o un ácido nucleico que codifica una proteína MEK1, que tiene una mutación en la posición del aminoácido 121 de MEK1 de tipo silvestre que se muestra en SEQ ID NO: 2, indica que el paciente tiene un riesgo relativamente alto de recaída o falta de respuesta al tratamiento con un inhibidor de RAF y/o un inhibidor de MEK de primera generación.
La determinación de la presencia o ausencia de una molécula de ácido nucleico o proteína MEK1 mutante en una muestra de paciente también permite la selección de un régimen de tratamiento optimizado para el paciente o la estratificación del paciente a un determinado grupo de tratamiento. En una realización, se selecciona un régimen de tratamiento que comprende un tratamiento con un inhibidor de RAF y/o un inhibidor de MEK de primera generación para un paciente en el que una muestra que contiene células cancerosas no contiene una molécula de ácido nucleico o proteína MEK1 mutante. Dicho paciente puede estratificarse a un régimen de tratamiento que comprende un inhibidor de RAF y/o un inhibidor de MEK de primera generación. El inhibidor de RAF y/o MEK se puede administrar a dicho paciente a una dosis convencional, a intervalos de dosificación convencionales.
En otra realización, se selecciona un régimen de tratamiento que comprende una terapia de combinación con un inhibidor de MEK y un inhibidor de RAF para un paciente en el que una muestra que contiene células cancerosas del paciente no contiene una molécula de ácido nucleico o proteína MEK1 mutante. Dicho paciente se puede estratificar a un régimen de tratamiento que comprende un inhibidor de MEK de primera generación o un inhibidor de MEK de segunda generación, en combinación con un inhibidor de RAF. Un régimen de tratamiento que comprende una terapia de combinación con un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK que se dirige a la mutación C121S MEK1 suprime ventajosamente la aparición de alelos resistentes a MEK en un paciente cuyo cáncer no contiene una molécula de MEK1 mutante.
En otra realización, se selecciona un régimen de tratamiento que comprende un tratamiento sin un inhibidor de MEK para un paciente en el que una muestra que contiene células cancerosas del paciente contiene una molécula de ácido nucleico o proteína MEK1 mutante, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico o proteína MEK1 que contiene uno o más de las mutaciones descritas en el presente documento. Dicho paciente puede estratificarse a un régimen de tratamiento que no comprende un inhibidor de MEK.
En una realización alternativa, la identificación de una molécula de ácido nucleico o proteína MEK1 mutante, en la que la MEK1 mutante comprende una mutación C121S, en una muestra que contiene células cancerosas obtenida de un paciente indica que es probable que el paciente responda al tratamiento con un inhibidor de MEK de segunda generación que se dirige a una MEK1 mutante que comprende una mutación C121S. Por consiguiente, en una realización, se selecciona un régimen de tratamiento que comprende tratamiento con un inhibidor de MEK de segunda generación que se dirige a una proteína MEK1 mutante con C121 para un paciente en el que una muestra que contiene células cancerosas del paciente contiene una molécula de ácido nucleico o proteína MEK1 mutante que comprende la mutación C121S. Dicho paciente puede estratificarse a un régimen de tratamiento que comprenda dicho inhibidor de MEK de segunda generación.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de Biología molecular, Inmunología, Microbiología, Biología celular y ADN recombinante, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, “MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL”, (edición actual); “CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY” (F. M. Ausubel et al. eds., (edición actual)); la serie “METHODS EN ENZYMOLOGY” (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (edición actual) “ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL AND ANIMAL CELL CULTURE” (R. I. Freshney, ed. (1987)). “DNA Cloning: A Practical Approach”, vol. I y II (D. Glover, ed.); “Oligonucleotide Synthesis” (N. Gait, ed., edición actual); “Nucleic Acid Hybridization” (B. Hames y S. Higgins, eds., edición actual); “Transcription and Translation” (B. Hames y S. Higgins, eds., edición actual); “Fundamental Virology”, 2a edición, vol. I y II (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds.).
X. Métodos de tratamiento
En diversas realizaciones, la divulgación proporciona métodos de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer. Dichos métodos comprenden, en general, la administración de un inhibidor de MEK1, por ejemplo, un inhibidor de MEK1 de segunda generación, según lo descrito en el presente documento, que se dirige a una MEK1 mutante que tiene una sustitución en la posición del aminoácido 121 en comparación con la MEK1 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 2 (por ejemplo, una mutación C121S). En una realización ilustrativa, el sujeto tiene un cáncer que contiene una proteína MEK1 mutante que tiene una mutación de resistencia según lo descrito en el presente documento. En realizaciones relacionadas, el sujeto tiene un cáncer que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1 que tiene una mutación de resistencia según lo descrito en el presente documento. El término "tratado", "tratar" o "tratamiento" incluye la disminución o el alivio de al menos un síntoma asociado con la afección que se está tratando. Por ejemplo, el tratamiento puede ser la disminución de uno o varios síntomas de un trastorno o la erradicación completa de un trastorno, como el cáncer.
En una realización ilustrativa, el cáncer es un melanoma, tal como un melanoma metastásico. En otras realizaciones ilustrativas, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en leucemias, linfomas, mielomas, carcinomas, carcinomas metastásicos, sarcomas, adenomas, cánceres del sistema nervioso y cánceres geritourinarios. Sin embargo, debido a que las mutaciones en MEK1 mejoran ampliamente la resistencia en varios tipos de cáncer, los métodos y los inhibidores de MEK1 de segunda generación descritos en el presente documento son útiles en el tratamiento de un amplio espectro de tumores, incluyendo todos los tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Los ejemplos de dichos tumores incluyen, pero sin limitación, leucemias, linfomas, mielomas, carcinomas, carcinomas metastásicos, sarcomas, adenomas, cánceres del sistema nervioso y cánceres geritourinarios. En realizaciones ilustrativas, los métodos anteriores son útiles en el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda de adultos y pediátrica, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, carcinoma de células basales, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, osteosarcoma, histiocitoma fibroso, cáncer de cerebro, glioma de tronco encefálico, astrocitoma cerebeloso, glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma hipotalámico, cáncer de mama, cáncer de mama masculino, adenomas bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, carcinoma de origen desconocido, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, glioma maligno, cáncer cervical, cáncer infantil, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de linfocitos T, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer esofágico, tumores de la familia del tumor de Ewing, tumor de células germinales extracraneales, tumor de células germinales extragonadal, cáncer de vías biliares extrahepáticas, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor del estroma gastrointestinal, tumor de células germinales extracraneales, tumor de células germinales extragonadales, tumor de células germinales ováricas, tumor trofoblástico gestacional, glioma, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma hipotalámico y de vía visual, melanoma intraocular, tumores de células de islote, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de células renales, cáncer de laringe, cáncer de labio y cavidad oral, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón no microcítico, linfoma primario del sistema nervioso central, macroglobulinema de Waldenstrom, histiocitoma fibroso maligno, meduloblastoma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma maligno, cáncer de cuello escamoso, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, trastornos mieloproliferativos, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de la orofaringe, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, cáncer de pituitaria, neoplasmas de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer de recto, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, síndrome de Sezary, cáncer de piel no melanoma, cáncer de intestino delgado, carcinoma de células escamosas, cáncer de cuello escamoso, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales, tumores trofoblásticos, cáncer de uretra, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer vulvar y tumor de Wilms.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de los compuestos (o combinaciones) de la divulgación pueden estar en forma de dosificación unitaria adecuada para la administración por vía oral, rectal o mediante inyección parenteral. Por ejemplo, en la preparación de composiciones en forma farmacéutica oral, se puede emplear cualquiera de los medios farmacéuticos habituales tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y similares, como en el caso de preparados líquidos orales tales como suspensiones, jarabes, elixires y soluciones; o vehículos sólidos tales como almidones, azúcares, caolín, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes y similares en el caso de polvos, píldoras, cápsulas y comprimidos. Debido a su facilidad en la administración, los comprimidos y las cápsulas representan la forma de dosificación unitaria oral más ventajosa, en cuyo caso se emplean vehículos farmacéuticos sólidos. Para composiciones parenterales, los vehículos normalmente comprenden agua estéril, al menos en gran parte, aunque pueden incluirse otros ingredientes, por ejemplo, para ayudar a la solubilidad. Las soluciones inyectables, por ejemplo, se preparan usando un vehículo que comprende solución salina, solución de glucosa o una mezcla de solución salina y glucosa. También se pueden preparar suspensiones inyectables en cuyo caso se pueden emplear vehículos líquidos apropiados, agentes de suspensión y similares. En caso de composiciones adecuadas para la administración percutánea, el vehículo comprende opcionalmente un agente potenciador de la penetración y/o un agente humectante adecuado, que se puede combinar con aditivos adecuados de cualquier naturaleza en proporciones menores, aditivos que no causan un efecto perjudicial significativo sobre la piel. Los aditivos pueden facilitar la administración en la piel y/o pueden ser útiles para preparar las composiciones deseadas. Estas composiciones pueden administrarse de diversas maneras, por ejemplo, en forma de un parche transdérmico, como una unción dorsal puntual, como una pomada.
Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Son ejemplos de dichas formas de dosificación unitarias los comprimidos (incluyendo comprimidos ranurados o recubiertos), cápsulas, píldoras, paquetes de polvos, obleas, soluciones o suspensiones inyectables, cucharaditas, cucharadas y similares, y múltiplos segregados de las mismas.
En general, se contempla que una cantidad terapéuticamente eficaz de un primer o segundo compuesto sería de aproximadamente 0,0001 mg/kg a 0,001 mg/kg; de 0,001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal o de aproximadamente 0,02 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de un primer o un segundo compuesto es de aproximadamente 0,007 mg a aproximadamente 0,07 mg, de aproximadamente de 0,07 mg a aproximadamente 700 mg, o de aproximadamente 1,4 mg a aproximadamente 350 mg. Un método de tratamiento profiláctico o curativo también puede incluir la administración de la composición en un régimen de entre una a cinco tomas al día.
En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de un primer compuesto o un segundo compuesto incluye, pero sin limitación, la cantidad de inferior a aproximadamente 0,01 mg/dosis, o inferior a aproximadamente 0,5 mg/dosis, o inferior a aproximadamente 1 mg/dosis, o inferior a aproximadamente 2 mg/dosis, o inferior a aproximadamente 5 mg/dosis, o inferior a aproximadamente 10 mg/dosis, o inferior a aproximadamente 20 mg/dosis, o inferior a aproximadamente 25 mg/dosis, o inferior a aproximadamente 50 mg/dosis, o inferior a aproximadamente 100 mg/dosis. El número de veces al día que se administra un primer o un segundo compuesto a un sujeto se puede determinar basándose en diversos criterios usados comúnmente en la técnica y/o descritos en el presente documento.
También puede haber agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes presentes en las composiciones.
Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes hidrosolubles tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes liposolubles tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, a-tocoferol y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
Las formulaciones de la presente divulgación incluyen aquellas adecuadas para la administración oral, nasal, tópica, bucal, sublingual, rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquier método bien conocido en la técnica farmacéutica. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material de vehículo para producir una única forma farmacéutica será, en general, la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En general, de un cien por ciento, esta cantidad variará del aproximadamente 1 por ciento al aproximadamente noventa y nueve por ciento de principio activo, preferentemente del aproximadamente 5 por ciento al aproximadamente 70 por ciento, lo más preferentemente del aproximadamente 10 por ciento al aproximadamente 30 por ciento.
Los métodos de preparación de estas formulaciones o composiciones incluyen la etapa de poner en asociación una composición de la presente divulgación con el vehículo y, opcionalmente, uno o más ingredientes auxiliares. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima una composición de la presente divulgación con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto.
Las formulaciones de la divulgación adecuadas para la administración oral pueden estar en forma de cápsulas, sellos, píldoras, comprimidos, pastillas (que usan una base aromatizada, en general, sacarosa y goma arábiga o tragacanto), polvos, gránulos, o como una solución o una suspensión en una líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite, o como elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga) ) y/o enjuagues bucales y similares, cada uno con un cantidad predeterminada de una composición de la presente divulgación como principio activo. Una composición de la presente divulgación también se puede administrar en forma de un bolo, electuario o pasta.
En las formas farmacéuticas sólidas de la divulgación para la administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), el principio activo se mezcla con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o cualquiera de los siguientes: cargas o expansores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; humectantes tales como glicerol; agentes desintegrantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio; agentes retardantes de la solución tales como parafina; aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita; lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos; y agentes colorantes. En caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes de tamponamiento. Las composiciones sólidas de un tipo similar también pueden emplearse como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Se puede fabricar un comprimido mediante compresión o moldeo, opcionalmente, con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos pueden prepararse usando aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante (por ejemplo, glicolato de almidón sódico o carboximetilcelulosa de sodio reticulada), tensioactivo o agente dispersante. Los comprimidos moldeados pueden prepararse moldeando en una máquina adecuada una mezcla de la composición en polvo humedecida con un diluyente líquido inerte.
Los comprimidos y otras formas farmacéuticas sólidas de las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación, tales como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, pueden ranurarse o prepararse opcionalmente con recubrimientos y cubiertas, tales como cubiertas entéricas y otras cubiertas bien conocidas en la técnica de formulaciones farmacéuticas. También pueden formularse para proporcionar una liberación lenta o controlada del principio activo en el mismo usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación deseado, otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas. Se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que retiene bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en agua estéril, o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes del uso. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición en la que solo o preferentemente liberan el/los ingrediente/s activo/s, en una cierta parte del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de forma retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras. El principio activo también puede estar en forma microencapsulada, si es apropiado, con uno o más de los excipientes descritos anteriormente.
Las formas farmacéuticas líquidas para la administración oral de las composiciones de la divulgación incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del principio activo, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener un diluyente inerte comúnmente usado en la técnica, tal como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, semilla de algodón, cacahuete, maíz, gérmenes, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes.
Las suspensiones, además de las composiciones activas, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isostearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas de la divulgación para la administración rectal o vaginal se pueden presentar como un supositorio, que se puede preparar mezclando una o más composiciones de la divulgación con uno o más excipientes o vehículos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera de supositorio o un salicilato, y que es sólido a temperatura ambiente, pero líquido a temperatura corporal y, por lo tanto, se fundirá en el recto o en la cavidad vaginal y liberará la composición activa.
Las formulaciones de la presente divulgación que son adecuadas para la administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverización que contienen dichos vehículos que se conocen en la técnica como apropiados.
Las formas farmacéuticas para la administración tópica o transdérmica de una composición de la presente divulgación incluyen polvos, pulverizados, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. La composición activa se puede mezclar en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservante, tampón o propulsor que pueda requerirse.
Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además de una composición activa de la presente divulgación, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y los pulverizados pueden contener, además de una composición de la presente divulgación, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los pulverizados pueden contener además propulsores habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos tales como butano y propano.
Los parches transdérmicos tienen la ventaja adicional de proporcionar una administración controlada de una composición de la presente divulgación al cuerpo. Dichas formas farmacéuticas pueden prepararse disolviendo o dispersando la composición en el medio apropiado. También se pueden usar potenciadores de la absorción para aumentar el flujo de la composición a través de la piel. La velocidad de dicho flujo puede controlarse proporcionando una membrana de control de la velocidad o dispersando la composición activa en una matriz o en un gel de polímero.
Las formulaciones oftálmicas, pomadas oculares, polvos, soluciones y similares, también se contemplan dentro del alcance de la presente divulgación.
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación adecuadas para la administración parenteral comprenden una o más composiciones de la divulgación en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor deseado o agentes de suspensión o espesantes.
Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la divulgación incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. Se puede garantizar la prevención de la acción de microorganismos mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como el monoestearato de aluminio y la gelatina.
En algunos casos, para prolongar el efecto de un fármaco, es deseable disminuir la absorción del fármaco por inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tenga una escasa hidrosolubilidad. La velocidad de absorción del fármaco depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo de aceite.
Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices microencapsuladas de las composiciones objeto en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la proporción de fármaco con respecto a polímero, y la naturaleza del polímero empleado en particular, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). También se preparan formulaciones inyectables de depósito atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.
Los preparados de la presente divulgación pueden administrarse por vía oral, parenteral, tópica o rectal. Por supuesto, se administran mediante formas adecuadas para cada vía de administración. Por ejemplo, se administran en forma de comprimidos o de cápsulas, mediante inyección, inhalación, loción para los ojos, pomada, supositorio, etc., administración mediante inyección, infusión o inhalación; tópica por loción o pomada; y rectal por supositorios. Se prefiere la administración oral y/o IV.
Las expresiones "administración parenteral" y "administrado/a por vía parenteral" como se usan en el presente documento significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal.
Las expresiones "administración sistémica", "administrado/a sistémicamente", "administración periférica" y "administrado/a periféricamente" como se usan en el presente documento significan la administración de un compuesto, fármaco u otro material distinto directamente al sistema nervioso central, de modo que entre en el sistema del paciente y, por lo tanto, se someta al metabolismo y a otros procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea.
Estos compuestos se pueden administrar a seres humanos y otros animales para terapia por cualquier vía de administración adecuada, incluyendo la vía oral, nasal, como, por ejemplo, un pulverizado, por vía rectal, intravaginal, parenteral, intracisternal y tópica, como por polvos, pomadas o gotas, incluyendo bucal y sublingualmente.
Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente divulgación, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.
Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden variarse para obtenerse una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración en particular, sin que sea tóxica para el paciente.
El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto en particular de la presente divulgación empleado, o el éster, la sal o la amida del mismo, la vía de administración, el momento de administración, la velocidad de excreción del compuesto empleado en particular, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con el compuesto en particular empleado, la edad, el sexo, el peso, el estado, la salud general y el historial médico previo del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Un médico o veterinario que tenga una experiencia normal en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar dosis de los compuestos de la divulgación empleados en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los necesarios para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograrse el efecto deseado.
En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la divulgación será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis eficaz más baja para producir un efecto terapéutico. Dicha dosis eficaz, en general, dependerá de los factores descritos anteriormente. En general, las dosis intravenosa y subcutánea de los compuestos de la presente divulgación para un paciente, cuando se usan para los efectos analgésicos indicados, variarán de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal al día, más preferentemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg por kg al día, y aún más preferentemente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 100 mg por kg al día. Una cantidad eficaz puede ser, por ejemplo, una cantidad que inhiba el crecimiento de células tumorales en el sujeto.
Si se desea, la dosis diaria eficaz del compuesto activo puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosificación unitarias.
Si bien es posible que un compuesto de la presente divulgación se administre solo, es preferible administrar el compuesto como una composición farmacéutica.
XI. Métodos de tratamiento usando una terapia combinada
La presente divulgación describe además métodos de supresión de la aparición de mutaciones de resistencia a MEK1 en un sujeto que tiene cáncer. Dichos métodos implican la administración combinada de un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK1 de segunda generación que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución en la posición del aminoácido 121 en comparación con MEK1 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1. Preferentemente, el inhibidor de MEK1 de segunda generación se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución C121S. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona una terapia de combinación para tratar o prevenir los síntomas de un cáncer, que comprende la administración de un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK1 que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución en la posición del aminoácido 121 en comparación con MEK1 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1 (preferentemente, una mutación C121S). La expresión "terapia de combinación", como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de dos o más sustancias terapéuticas, por ejemplo, un inhibidor de MEK1 o un inhibidor de RAF. El inhibidor de MEK1 se puede administrar concomitante con, antes o después de la administración de un inhibidor de RAF. Como se expone en el presente documento, una terapia de combinación que implica un inhibidor de MEK1 de segunda generación y un inhibidor de RAF suprime la aparición de mutaciones de resistencia a MEK en mayor medida que la administración de un inhibidor de MEK1 o de un inhibidor de RAF solo. Las dosis convencionales del inhibidor de MEK1 de segunda generación y de los inhibidores de RAF también son adecuadas para las terapias de combinación descritas en el presente documento. Los ejemplos de cánceres que pueden tratarse con una terapia de combinación incluyen los descritos en el presente documento, por ejemplo, melanoma, leucemias, linfomas, mielomas, carcinomas, carcinomas metastásicos, sarcomas, adenomas, cánceres del sistema nervioso y tumores geritourinarios, por ejemplo, melanoma, síndrome mielodisplásico, leucemia, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer peritoneal, cáncer de pulmón no microcítico y cáncer de mama.
Los inhibidores de MEK1 de segunda generación que se dirigen a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución en la posición del aminoácido 121 en comparación con MEK1 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1 (preferentemente, una mutación C121S) se pueden identificar según lo descrito en el presente documento. Los ejemplos de inhibidores de RAF útiles para la terapia de combinación incluyen inhibidores de RAF pan, inhibidores de RAF B, inhibidores de RAF A e inhibidores de RAF-1. En realizaciones ilustrativas, los inhibidores de RAF útiles para la terapia de combinación incluyen PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), ZM 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613, y CJS352. Los ejemplos de inhibidores de RAF incluyen además los compuestos establecidos en la publicación PCT n.° WO/2008/028141. Los inhibidores de RAF ilustrativos incluyen además los derivados de quinazolinona descritos en la Publicación PCT n.° WO/2006/024836, y los derivados de piridinilquinazolinamina descritos en la Publicación PCT n.° W0/2008/020203.
Por consiguiente, la divulgación proporciona métodos de tratamiento del cáncer en un sujeto, que comprenden administrar una terapia de combinación que comprende un inhibidor de MEK1 de segunda generación y un inhibidor de RAF, según lo descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el método comprende además explorar un sujeto para detectar la presencia o ausencia de una o más mutaciones en MEK1. En una realización preferida, se selecciona una terapia de combinación que comprende un inhibidor de MEK1 de segunda generación y un inhibidor de RAF para un sujeto en el que no se ha detectado una o más mutaciones de resistencia en MEK1. En dicho sujeto, la terapia de combinación suprime ventajosamente la aparición de mutaciones de resistencia en MEK1. La divulgación proporciona además métodos de supresión de la aparición de mutaciones de resistencia en MEK1 en un sujeto que tiene cáncer, que comprenden administrar al sujeto una terapia de combinación que comprende un inhibidor de MEK1 de segunda generación y un inhibidor de rAf , según lo descrito en el presente documento. Por consiguiente, se puede administrar una terapia de combinación que comprende un inhibidor de MEK1 de segunda generación y un inhibidor de RAF a un sujeto en quien se han detectado una o más mutaciones en MEK1. Dicha terapia de combinación suprime el crecimiento de células que contienen mutaciones de resistencia en MEK1. En algunas realizaciones, el método comprende además la exploración de un sujeto para detectar la presencia o ausencia de una o más mutaciones en MEK1. En estas realizaciones, se puede administrar una terapia de combinación que comprende un inhibidor de MEK1 de segunda generación y un inhibidor de RAF, por ejemplo, a un sujeto en quien no se ha detectado una mutación de resistencia a MEK1 o, por ejemplo, to un sujeto en quien se ha detectado una mutación de resistencia a MEK1.
En otra realización de la divulgación, una composición farmacéutica puede comprender (a) un inhibidor de MEK1 de segunda generación que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución en la posición del aminoácido 121 en comparación con MEK1 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1 (preferentemente una mutación C121S) y también (b) un inhibidor de RAF. En algunas realizaciones, el inhibidor de RAF puede ser un inhibidor de RAF pan, un inhibidor de RAF B, un inhibidor de RAF A y un inhibidor de RAF-1. En realizaciones preferidas, el inhibidor de RAF puede ser PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), ZM 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613 y CJS352. En una realización particular, el inhibidor de RAF es (a) PLX4720 o PLX4032.
Otra realización de la divulgación se dirige a métodos de administración de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. Por consiguiente, la presente divulgación se dirige a un método de tratamiento de un sujeto para el cáncer que comprende administrar al sujeto un inhibidor de MEK1 de segunda generación que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución en la posición del aminoácido 121 en comparación con MEK1 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1 (preferentemente, una mutación C121S); y administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de RAF. El inhibidor de MEK1 de segunda generación y el inhibidor de RAF se pueden administrar al sujeto secuencial o simultáneamente. Una administración secuencial incluye (a) administrar primero el inhibidor de MEK1 de segunda generación seguido de (b) la administración del inhibidor de RAF. Una administración secuencial alternativa incluye (a) administrar primero el inhibidor de RAF seguido de (b) la administración del inhibidor de MEK1 de segunda generación. Una administración simultánea incluye administrar el inhibidor de MEK1 de segunda generación y el inhibidor de RAF al mismo tiempo; o sustancialmente al mismo tiempo.
Cuando la administración implica la administración separada (por ejemplo, la administración secuencial) del primer compuesto (por ejemplo, un inhibidor de MEK1 de segunda generación) y un segundo compuesto (por ejemplo, un inhibidor de RAF), como se describe en el presente documento, los compuestos se administran suficientemente cerca en el tiempo para tener el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, el período de tiempo entre cada administración, que puede dar lugar al efecto terapéutico deseado, puede variar de minutos a horas y puede determinarse en función de las propiedades de cada compuesto, tales como potencia, solubilidad, biodisponibilidad, semivida en plasma y perfil cinético. Por ejemplo, los compuestos se pueden administrar en cualquier orden en el plazo de aproximadamente 24 horas entra sí o en el plazo de un tiempo inferior a 24 horas entre sí.
Cuando el inhibidor de MEK1 de segunda generación y el inhibidor de RAF se administran secuencialmente, se formulan por separado y pueden proporcionarse en cualquier orden. Sin embargo, cuando el inhibidor de MEK1 de segunda generación y el inhibidor de RAF se administran simultáneamente, pueden formularse por separado o combinarse en la misma formulación. Cuando se combinan en la misma formulación, el inhibidor de MEK1 de segunda generación y el inhibidor de RAF pueden formularse para liberarse en el sujeto al mismo tiempo o en momentos diferentes. El perfil de liberación de una formulación que comprende tanto el inhibidor de MEK1 de segunda generación como el inhibidor de RAF incluye lo siguiente:
A) liberación y biodisponibilidad del inhibidor de MEK1 de segunda generación seguido de liberación y biodisponibilidad del inhibidor de RAF;
B) liberación y biodisponibilidad del inhibidor de RAF seguido de liberación y biodisponibilidad del inhibidor de MEK1 de segunda generación;
C) liberación y biodisponibilidad del inhibidor de MEK1 de segunda generación al mismo tiempo (o sustancialmente al mismo tiempo) que liberación y biodisponibilidad del inhibidor de RAF.
En otra realización, en el presente documento, se proporciona un método de tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto una composición que comprende un inhibidor de MEK1 de segunda generación y un inhibidor de RAF. En otra realización más, en el presente documento, se proporciona un método de tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende un inhibidor de MEK1 de segunda generación y un inhibidor de RAF, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, leucemias, linfomas, mielomas, carcinomas, carcinomas metastásicos, sarcomas, adenomas, cánceres del sistema nervioso y cánceres geritourinarios, por ejemplo, melanoma, síndrome mielodisplásico, leucemia, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer peritoneal, cáncer de pulmón no microcítico y cáncer de mama.
Una combinación de compuestos descritos en el presente documento (por ejemplo, un inhibidor de MEK1 de segunda generación y un inhibidor de RAF) puede producir un aumento sinérgico en la actividad anticancerígena, o dicho aumento puede ser aditivo. Las composiciones descritas en el presente documento normalmente incluyen dosis más bajas de cada compuesto en una composición, evitando de ese modo las interacciones adversas entre los compuestos y/o los efectos secundarios perjudiciales, tales como los que se han informado para compuestos similares. Además, las cantidades normales de cada compuesto cuando se administran en combinación podrían proporcionar una mayor eficacia en sujetos que no responden o que responden mínimamente a cada compuesto cuando se usan solos. Por ejemplo, cuando se administran en combinación, un inhibidor de MEK1 de segunda generación y un inhibidor de RAF suprime la aparición de alelos de resistencia a MEK1 en mayor medida que cuando cualquiera de los compuestos se usa solo.
Se puede calcular un efecto sinérgico, por ejemplo, usando métodos adecuados tales como la ecuación Sigmoid-Emax (Holford, N. H. G. y Scheiner, L. B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453 (1981)), la ecuación de la aditividad de Loewe (Loewe, S. y Muischnek, H., Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326 (1926)) y la ecuación de efecto mediano (Chou, T. C. y Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984)). Cada ecuación referida anteriormente se puede aplicar a datos experimentales para generar un gráfico correspondiente para ayudar a evaluar los efectos de la combinación de fármacos. Los gráficos correspondientes asociados con las ecuaciones mencionadas anteriormente son la curva de concentración-efecto, curva de isobolograma y curva de índice de combinación, respectivamente.
En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona una composición farmacéutica de cualquiera de las composiciones de la presente divulgación. En una realización relacionada, la divulgación proporciona una composición farmacéutica de cualquiera de las composiciones de la presente divulgación y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable de cualquiera de estas composiciones.
En una realización, la divulgación incluye un tratamiento de cáncer envasado. El tratamiento envasado incluye una composición de la divulgación envasada con instrucciones para usar una cantidad eficaz de la composición de la divulgación para un uso previsto. En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona el uso de cualquiera de las composiciones de la divulgación para la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer en un sujeto.
En otra realización de la divulgación, el inhibidor de MEK1 de segunda generación y el inhibidor de RAF pueden administrarse secuencialmente (en cualquier orden) o simultáneamente con otros agentes farmacéuticos normalmente administrados a sujetos que están siendo tratados por cáncer. Dichos otros agentes farmacéuticos incluyen, sin limitación, antieméticos, agentes que aumentan el apetito, otros agentes citotóxicos o quimioterapéuticos y agentes que alivian el dolor.
XII. Kits
Se pueden montar diversos kits como parte de la presente divulgación. Un kit puede contener componentes para ensayar mutaciones en MEK1 para evaluar a un paciente en particular en cuanto al riesgo de desarrollar resistencia a la terapia usando uno o más inhibidores de RAF y/o inhibidor de MEK, y así permitir que un médico determine si es necesario un tratamiento alternativo para el paciente. Dichos kits pueden contener reactivos que permitan la evaluación de mutaciones, tales como conjuntos de cebadores para evaluar mutaciones correlacionadas con manifestaciones fenotípicas relevantes con respecto a la resistencia a un inhibidor de RAF y/o un inhibidor de MEK. Se contempla que los cebadores (o pares de cebadores) que son complementarios o idénticos a todo o parte de SEQ ID NO: 1, que codifican MEK1 humano silvestre, por ejemplo, pueden ser parte de un kit. En realizaciones preferidas, los cebadores pueden usarse para detectar o amplificar específicamente una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína MEK1 mutante que contiene una mutación en la posición del aminoácido 121, tal como una mutación C121S. En otras realizaciones, los kits contienen instrucciones para usar cebadores que son complementarios o idénticos a todo o parte de SEQ ID NO: 1 para amplificar una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína MEK1.
En otras realizaciones, los kits comprenden composiciones para detectar una mutación que comprende una proteína MEK1, tal como un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína MEK1 mutante que contiene una mutación de resistencia. Las proteínas ilustrativas incluyen una proteína MEK1 mutante que contiene una mutación en la posición del aminoácido 121, tal como una mutación C121S.
Todos los materiales esenciales y reactivos requeridos para analizar las mutaciones MEK1 mediante un método particular analizado anteriormente también se pueden montar juntos en un kit. Cuando los componentes del kit se proporcionan en una o más soluciones líquidas, la solución líquida preferentemente es una solución acuosa, prefiriéndose en particular una solución acuosa estéril.
La divulgación proporciona además kits que comprenden composiciones, (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), que comprenden un inhibidor de MEK1 de segunda generación que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una mutación en la posición del aminoácido 121 en comparación con la MEK1 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 2, tal como la mutación C121S. Dichos kits se pueden usar en los métodos expuestos en el presente documento, por ejemplo, para tratar un cáncer en un sujeto. Por consiguiente, los kits pueden contener instrucciones que describen el uso de la composición para el tratamiento del cáncer.
Asimismo, la divulgación proporciona kits que comprenden composiciones adecuadas para su uso en una terapia de combinación que implica un inhibidor de MEK1 de segunda generación que se dirige a una proteína MEK1 mutante que tiene una mutación en la posición del aminoácido 121 en comparación con la MEK1 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 2, tal como la mutación C121S y un inhibidor de RAF. Dichos kits pueden incluir, por ejemplo, una composición que comprende un inhibidor de MEK1 de segunda generación y una composición que comprende un inhibidor de RAF. Dichos kits pueden incluir, como alternativa, una composición que comprende tanto un inhibidor de MEK1 de segunda generación como un inhibidor de RAF. Los kits pueden contener además instrucciones que describen el uso de la composición para el tratamiento del cáncer y/o para suprimir la aparición de alelos de resistencia a MEK1 en un sujeto que tiene cáncer. Las instrucciones pueden describir la administración de una composición que comprende un inhibidor de MEK1 de segunda generación simultáneamente, antes o después de la administración de un inhibidor de RAF.
Los componentes del kit también se pueden proporcionar en formas secas o liofilizadas. Cuando los reactivos o componentes se proporcionan como una forma seca, la reconstitución, en general, es mediante la adición de un disolvente adecuado. Se prevé que el disolvente también pueda proporcionarse en otro recipiente.
Los kits de la presente divulgación normalmente también incluirán un medio para contener los viales en un confinamiento cerrado para su venta comercial tal como, por ejemplo, envases de plástico inyectados o moldeados por soplado en los que se retengan los viales deseados. Independientemente del número o tipo de recipientes, los kits de la divulgación también pueden comprender, o pueden envasarse con, un instrumento para ayudar con la recogida y la evaluación de muestras. Dicho instrumento puede ser un inhalante, una jeringa, una pipeta, un fórceps, una cuchara medida, cuentagotas o cualquier vehículo de administración médicamente aprobado, por ejemplo.
Los kits de la divulgación también pueden incluir una hoja de instrucciones que describa las terapias alternativas sugeridas cuando se identifican mutaciones particulares en un paciente. Por ejemplo, una hoja de instrucciones incluida con los kits de la divulgación puede recomendar que un paciente que tenga un trastorno, por ejemplo, un cáncer, en el que se ha identificado una proteína MEK1 mutante, suspenda el tratamiento con un inhibidor de MEK1 de primera generación y/o un inhibidor de RAF, sea controlada en cuanto a la recaída durante el tratamiento con un inhibidor de la MEK1 de primera generación y/o un inhibidor de RAF, siga el tratamiento con un inhibidor de MEK1 de primera generación y/o un inhibidor de RAF en una dosis elevada, o inicie el tratamiento con un inhibidor de MEK1 de segunda generación, solo o en combinación con un inhibidor de RAF. Una hoja de instrucciones incluida con los kits de la divulgación también puede recomendar que un paciente que tenga un trastorno en el que una proteína MEK1 mutante no sea detectable continúe el tratamiento con un inhibidor de MEK1 de primera generación y/o un inhibidor de RAF a una dosis convencional. En realizaciones ilustrativas, el inhibidor de MEK de primera generación es CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, Compuesto A o Compuesto B.
La presente divulgación se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Identificación de la activación de la mutación C121S en MEK1
En este ejemplo, se usaron muestras de ADN de un paciente con melanoma metastásico que desarrolló resistencia al inhibidor de BRAF PLX4032 para identificar una mutación de MEK1 de activación que confiere resistencia a inhibidores tanto de BRAF como de MEK1. Más específicamente, se usó la secuenciación masivamente paralela para realizar un análisis genómico comparativo de 3 muestras de ADN diferentes del paciente: (i) tumor que era sensible a PLX4032, (ii) tumor que era resistente a PLX4032, y (iii) piel normal, para permitir de ese modo la identificación de la mutación MEK1 de activación.
El paciente era un varón de 38 años que fue diagnosticado de melanoma metastásico en febrero de 2009. Inicialmente se presentó con una masa en la axila derecha, y una PET-TC de determinación de la fase demostró una gran lesión en el dorsal ancho derecho así como múltiples focos hipermetabólicos en los pulmones, el hígado, los huesos y varios sitios subcutáneos. La biopsia de la masa del dorsal ancho mostró melanoma maligno. Fue tratado con varios regímenes terapéuticos con una respuesta clínica mínima. En octubre de 2009, el paciente había desarrollado numerosos depósitos metastásicos subcutáneos. La genotipificación del oncogén BRAF en este momento demostró una mutación V600E, y se inscribió en un ensayo clínico del inhibidor de BRAF específico PLX4032. El paciente tuvo una profunda respuesta a la terapia, con una respuesta parcial visible en las 2 semanas posteriores al inicio de PLX4032 y una regresión casi completa de todos los nódulos tumorales visibles en enero de 2010, tras 15 semanas de tratamiento.
A finales de febrero de 2010, tras 4 meses de tratamiento con PLX4032, el paciente desarrolló rápidamente nuevos nódulos subcutáneos en todo el cuerpo y se detuvo el PLX4032. En este momento, proporcionó el consentimiento informado por escrito y se obtuvo una biopsia central percutánea de un nódulo subcutáneo recurrente en el tórax.
Para determinar los posibles mecanismos de resistencia a PLX4032 en este tumor, se secuenciaron los exones de 138 genes de cáncer de esta muestra usando secuenciación masivamente paralela. El paciente siguió teniendo una progresión rápida de su enfermedad y murió en un hospital en marzo de 2010.
Se secuenciaron todos los exones de 138 genes de cáncer de ADN aislado tanto de piel normal como del tumor resistente a PLX4032. Se generaron genotecas de secuenciación con Illumina de ADN genómico extraído de la piel normal del paciente y de la muestra tumoral resistente. La captura de híbridos dirigida de las regiones genómicas de interés se realizó como se describió previamente (Gnirke, A. et al. (2009) Nature Biotechnol. 27:182-189). En resumen, se diseñaron y sintetizaron aproximadamente 7000 cebos de ARN biotinilados correspondientes a la secuencia codificante de 138 genes que se sabe que sufren alteraciones genómicas somáticas en el cáncer. Se sometieron las genotecas de ADN genómico a captura de híbridos en fase de solución con los cebos de ARN biotinilados seguidos de la secuenciación paralela masiva. Se secuenciaron 36 bases de ambos extremos de las muestras usando un Illumina GAIIx. Se deconvolucionaron los datos de secuenciación para hacerlos coincidir con todas las lecturas de alta calidad con las muestras de tumores correspondientes e identificar las mutaciones, inserciones, deleciones y alteraciones del número de copias de bases.
Se observó un total de 14 sustituciones somáticas de bases. De estas, 9 causaron cambios de aminoácidos (no sinónimos), siendo todas ellas mutaciones sin sentido. Hubo 5 sustituciones silenciosas (sinónimas). No hubo inserciones, eliminaciones o alteraciones significativas en el número de copias. Se volvió a detectar la mutación BRAF V600E previamente vista. Además, se observaron cambios de aminoácidos en ERBB4, FLT1, MEK1, PTPRD, RET, RUNX1T1 y TERT. Para validar estas 9 mutaciones sin sentido, se diseñaron ensayos genotípicos de espectrometría de masas para cada mutación somática observada en la muestra tumoral. El total de las 9 mutaciones sin sentido se confirmó mediante genotipado espectrométrico de masas. En particular, se ensayaron las mutaciones detectadas mediante secuenciación paralela masiva para usar la química de extensión de hME multibase mediante métodos conocidos en la técnica. Para confirmar aún más los resultados de la secuenciación, también se secuenciaron el ADN tumoral y el ADN normal usando un conjunto independiente mayor mediante la dirección a exones de aproximadamente 2.000 genes, y se volvieron a ver las 9 mutaciones.
A continuación, para determinar si alguna de estas mutaciones eran mutaciones de novo que se desarrollaron después de que el paciente comenzara con PLX4032, se usaron los ensayos genotípicos de espectrometría de masas para consultar la muestra de biopsia previa a PLX4032 original para detectar la presencia de estas mutaciones. Dos de las 9 mutaciones sin sentido detectadas en el tumor resistente a PLX4032 no se detectaron en el tumor original sensible a PLX4032, lo que sugiere que eran mutaciones somáticas de novo. La primera fue una mutación sin sentido (C121S) en MEK1, la quinasa inmediatamente cadena abajo de BRAF, con una frecuencia de alelo mutante del 14 %. La otra fue una mutación sin sentido en RET con una frecuencia de alelo mutante del 28 %.
Se ha demostrado previamente que las mutaciones proximales a la hélice C de MEK1 pueden conferir resistencia a la inhibición de BRAF por PLX4032 mediante la regulación por aumento de la actividad de MEK1 quinasa intrínseca (Emery, C. M. et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 106:20411-20416). Por lo tanto, parecía plausible que la mutación MEK1 C121, que también se encuentra próxima a la hélice C, podría haber causado resistencia a PLX4032 en el tumor recurrente del paciente. Para ensayar esto, se introdujo la mutación C121S en la secuencia de MEK1 de tipo silvestre y se expresó el ADNc mutante en la estirpe celular de melanoma A375, que alberga una mutación BRAF V600E. Para introducir la mutación C1212S en la secuencia de MEK1 de tipo silvestre, se realizó la mutagénesis dirigida de MEK1 como se ha descrito previamente (Emery, C. M. et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 106:20411-20416). En resumen, se amplificó el ADNc de MEK1 por PCR y se realizó la mutagénesis dirigida usando Quick-Change II (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. Como controles, se expresó la secuencia de MEK1 de tipo silvestre o una variante constitutivamente activa de MEK1, denominada MEK1-DD, en las células de melanoma A375.
Para examinar el efecto de la mutación C121S en MEK1 sobre la capacidad de respuesta de las células de melanoma A375 a inhibidores, se trataron células A375 (células no transfectadas o células transfectadas con MEK1 de tipo silvestre, MEK1 mutante con C121S o la variante constitutivamente activa MEK1-DD) con cantidades crecientes del inhibidor de BRAF PLX4720 (adquirido en Symansis, Inc.), que es un compuesto estrechamente relacionado con PLX4032, o el inhibidor de MEK1 AZD6244 (adquirido en Selleck Chemical Co., Ltd ). Los resultados se muestran en los gráficos de las Figuras 1A (tratamiento con PLX4720) y 1B (tratamiento con AZD6244).
Como se muestra en la Figura 1A, las células que expresan la mutación C121S en MEK1 son fuertemente resistentes a PLX4720, con valores de GI-50 100 veces mayores que las células A375 de tipo silvestre o las células A375 que expresan MEK1 de tipo silvestre (MEK-WT). Las células A375 que expresan una variante constitutivamente activa de MEK1 (MEK-DD) mostraron una resistencia similar a PLX4720 como C121S de MEK1. De manera similar, como se muestra en la Figura 1B, las células que expresan la mutación C121S en MEK1 son fuertemente resistentes a AZD6244, con un valor de IC50 casi 1000 veces superior a las células A375 de tipo silvestre, las células A375 que expresan MEK-WT y las células A375 que expresan MEK-DD.
La evidencia bioquímica sugiere que esta resistencia se debe, de hecho, al aumento de la actividad de la quinasa de MEK1 C121S. Para examinar esto, se realizaron estudios de inmunotransferencia usando procedimientos convencionales. En resumen, se lisaron las células de melanoma A375 con tampón TNN que contenía inhibidor de proteasa (Roche), NaF y NaV03 (1 mM cada uno). Los lisados se cuantificaron (ensayo de Bradford), se desnaturalizaron (95 °C) y se resolvieron mediante electroforesis en gel de SDS. La proteína se transfirió a membranas de nitrocelulosa y se sondeó con anticuerpos primarios que reconocían p-ERK1/2, p-MEK1/2 (Ser217/221), MEK1/2 y a-tubulina (Tecnología de señalización celular, dilución 1:1000). Tras la incubación con el anticuerpo secundario apropiado (IgG anti-conejo o anti-ratón, enlazado a HRP, dilución 1:1000) (Tecnología de señalización celular), se detectaron las proteínas usando quimioluminiscencia (Pierce). Los resultados se resumen en las Figuras 2A y 2B, en las que la Figura 2A muestra los resultados de inmunotransferencia y la Figura 2B es un gráfico que cuantifica el porcentaje relativo de ERK1 fosforilada (pERK1). Como se muestra en las Figuras 2A y 2B, las células A375 que expresan MEK1 C121S tienen niveles más elevados de ERK1/2 fosforilada en comparación con las células A375 que expresan la MEK-WT. Las células A375 que expresan la variante de MEK1 constitutivamente activa MEK1-DD presentaron niveles aún más elevados de ERK1/2 fosforilada.
Un ensayo de quinasa in vitro también demostró un aumento de la actividad de quinasa de MEK1 C121S en comparación con MEK1-WT. Se transfectaron células 293T al 70 % de confluencia con 15 |jg de pc-DNA-DEST40 que contenía MEK-WT, MEK-DD o MEK C121S. 48 horas después de la infección, se generó lisado y se redujo con 40 j l de perlas de cobalto durante 30 minutos a 4 °C con 1 mg de extracto de células enteras. Después del despliegue, se realizaron ensayos de quinasa in vitro como se ha descrito previamente (Emery, C. M. et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 106:20411-20416).
En resumen, se ha identificado una nueva mutación activadora en MEK1, que surgió de nuevo en un paciente con melanoma metastásico mutante BRAF que había desarrollado resistencia al inhibidor selectivo de BRAF PLX4032. El paciente inicialmente fue muy sensible a PLX4032, pero tras una drástica respuesta de 4 meses desarrolló una rápida progresión de la enfermedad. El análisis de una biopsia del tumor resistente a PLX4032 con secuenciación masiva paralela reveló una mutación en MEK1 (C121S) que no se detectó en la muestra de biopsia sensible al PLX4032 previa al tratamiento. Esta mutación produce un aumento de la actividad de la quinasa y confiere resistencia a la inhibición selectiva de BRAF, así como a la inhibición de MEK1, in vitro. Tomados en conjunto, esto sugiere un mecanismo mediante el que el tumor de este paciente se volvió resistente a la inhibición de BRAf .
Se describió previamente una mutación MEK1 (P124L) que había surgido en un paciente con melanoma metastásico que había desarrollado resistencia al inhibidor de MEK1 AZT6244 (Emery et al. (2009) supra). Al igual que MEK1 C121S, la mutación P124L en MEK1 era proximal a la hélice C y confería resistencia tanto al inhibidor de MEK1 AZD6244 como al inhibidor de BRAF PLX4720. Sin embargo, una diferencia notable es que la mutación C121S de MEK1 aquí observada surgió en el marco de la inhibición de BRAF en lugar de la inhibición directa de MEK1.
Se han descrito varios mecanismos de resistencia adquirida a la inhibición de la quinasa dirigida en pacientes, la mayoría de los cuales se pueden agrupar en dos categorías. En la primera categoría, las alteraciones genómicas secundarias en la quinasa diana impiden el acceso del fármaco a la quinasa mutante a través de diversos mecanismos mientras se mantiene la actividad catalítica oncogénica. Estas alteraciones se encuentran entre los mecanismos más comunes de resistencia adquirida a los inhibidores de quinasas y se han descrito en BCR-ABL, EGFR y FLT3. El desarrollo de MEK P124L en respuesta a la inhibición de MEK1 con AZD6244, como se describe en Emery et al. (2009) supra, es un ejemplo de este tipo de mecanismo de resistencia. Notablemente, no se detectaron mutaciones secundarias en BRAF en la muestra resistente a PLX4032.
La segunda categoría implica alteraciones genómicas en la vía de señalización diana en genes distintos de la diana de la inhibición. Estas alteraciones compensan las señales perdidas debido a la inhibición de la diana, “evitando” así la inhibición de la quinasa diana. El mejor ejemplo descrito de esto en pacientes es la amplificación del oncogén MET, que se ha observado en el 20 % de los cánceres de pulmón mutantes de EGFR con resistencia adquirida a gefitinib. La amplificación de MET conduce a la activación persistente de la señalización tanto de PI3K/AKT como de ERK en presencia de la inhibición de EGFR. Otros mecanismos de tipo similar, que incluyen la activación de la señalización de IGF-1Rp/IRS-1 y la señalización a través del ligando de MET HGF, también se han descrito en estirpes celulares con resistencia adquirida a la inhibición de quinasas dirigidas.
El desarrollo de una mutación de MEK1 en respuesta a la inhibición de BRAF representa el primer ejemplo informado en un paciente de un mecanismo de resistencia adquirido en el que el tumor desarrolla una mutación activadora cadena abajo de la quinasa diana. MEK1 C121S, en particular, añade una capa adicional de complejidad, ya que el tratamiento con el inhibidor de BRAF conduce a la adquisición de una alteración genética que confiere resistencia tanto al inhibidor de BRAF como a un inhibidor de MEK1. Esto tiene importancia clínica cuando se consideran inhibidores de MEK1 alostéricos en pacientes que progresan con PLX4032 u otros inhibidores de BRAF. De hecho, actualmente hay en curso ensayos combinados de PLX4032 y AZD6244; el desarrollo de una MEK C121S o una mutación similar podría hacer que un paciente fuera simultáneamente resistente a ambas terapias. La superación de la resistencia debida a MEK1 C121S probablemente requiera inhibición cadena abajo de MEK1 o un mecanismo alternativo de inhibición de MEK1.
La reversión de la mutación de quinasa diana a tipo silvestre no se ha descrito en pacientes tratados con inhibidores de quinasa dirigidos, lo que sugiere que los cánceres siguen dependiendo de las mutaciones oncogénicas originales. De acuerdo con esto, se detectó la presencia continuada de la mutación V600E. Sin embargo, la mutación de BRAF se detectó a una frecuencia alélica del 37 %, que es inferior al 50 % esperado. Aunque es probable que esto se deba a la "contaminación" del ADN normal del estroma circundante, no se puede descartar la posibilidad de que un subconjunto de las células tumorales haya perdido la mutación BRAF V600E. Una posibilidad intrigante es que las células tumorales con la mutación C121S en MEK1 (que estaba presente a una frecuencia alélica del 14 %) ya no requieren BRAF V600E para activar la vía MAPK. Apoyando esta idea, los presentes inventores han observado una reversión a BRAF de tipo silvestre en cultivos a corto plazo derivados del paciente resistente a AZD6244 con melanoma metastásico con MEK1 P124L. No obstante, el hecho de que BRAF permanezca mutado al menos en algún subconjunto de las células cancerosas indica que un enfoque de tratamiento preferido es continuar el tratamiento con un inhibidor de BRAF más una segunda terapia dirigida para superar la mutación de resistencia. Equivalentes
La invención se ha descrito en el presente documento haciendo referencia solo a ciertos ejemplos y realizaciones. No se ha hecho el esfuerzo de describir de manera exhaustiva todos los ejemplos y realizaciones posibles de la invención. Ciertamente, los expertos en la técnica apreciarán que se pueden realizar diversas adiciones, deleciones, modificaciones y otros cambios en los ejemplos y realizaciones descritos anteriormente. Se pretende que todas estas adiciones, deleciones y modificaciones y otros cambios estén incluidos en el alcance de las siguientes reivindicaciones.
Sumario del listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 - Secuencia de ácido nucleico de MEK1 humana de tipo silvestre (NM_002755; gi:169790828) [el codón de inicio y el codón que codifica la posición del aminoácido 121 están en negrita y subrayadas].
aggcgaggct tccccttccc cgcccctccc ccggcctcca gtccctccca gggccgcttc gcagagcggc taggagcacg gcggcggcgg cactttcccc ggcaggagct ggagctgggc tctggtgcgc gcgcggctgt gccgcccgag ccggagggac tggttggttg agagagagag aggaagggaa tcccgggctg ccgaaccgca cgttcagccc gctccgctcc tgcagggcag cctttcggct ctctgcgcgc gaagccgagt cccgggcggg tggggcgggg gtccactgag accgctaccg gcccctcggc gctgacggga ccgcgcgggg cgcacccgct gaaggcagcc ccggggcccg cggcccggac ttggtcctgc gcagcgggcg cggggcagcg cagcgggagg aagcgagagg tgctgccctc cccccggagt tggaagcgcg ttacccgggt ccaaaatgcc caagaagaag ccgacgccca tccagctgaa cccggccccc gacggctctg cagttaacgg gaccagctct gcggagacca acttggaggc cttgcagaag aagctggagg agctagagct tgatgagcag cagcgaaagc gccttgaggc ctttcttacc cagaagcaga aggtgggaga actgaaggat gacgactttg agaagatcag tgagctgggg gctggcaatg gcggtgtggt gttcaaggtc tcccacaagc cttctggcct ggtcatggcc agaaagctaa ttcatctgga gatcaaaccc gcaatccgga accagatcat aagggagctg caggttctgc atgagtgcaa ctctccgtac atcgtgggct tctatggtgc gttctacagc gatggcgaga tcagtatctg catggagcac atggatggag gttctctgga tcaagtcctg aagaaagctg gaagaattcc tgaacaaatt ttaggaaaag ttagcattgc tgtaataaaa ggcctgacat atctgaggga gaagcacaag atcatgcaca gagatgtcaa gccctccaac atcctagtca actcccgtgg ggagatcaag ctctgtgact ttggggtcag cgggcagctc atcgactcca tggccaactc cttcgtgggc acaaggtcct acatgtcgcc agaaagactc caggggactc attactctgt gcagtcagac atctggagca tgggactgtc tctggtagag atggcggttg ggaggtatcc catccctcct ccagatgcca aggagctgga gctgatgttt gggtgccagg tggaaggaga tgcggctgag accccaccca ggccaaggac ccccgggagg ccccttagct catacggaat ggacagccga cctcccatgg caatttttga gttgttggat tacatagtca acgagcctcc tccaaaactg cccagtggag tgttcagtct ggaatttcaa gattttgtga ataaatgctt aataaaaaac cccgcagaga gagcagattt gaagcaactc atggttcatg cttttatcaa gagatctgat gctgaggaag tggattttgc aggttggctc tgctccacca tcggccttaa ccagcccagc acaccaaccc atgctgctgg cgtctaagtg tttgggaagc aacaaagagc gagtcccctg cccggtggtt tgccatgtcg cttttgggcc tccttcccat gcctgtctct gttcagatgt gcatttcacc tgtgacaaag gatgaagaac acagcatgtg ccaagattct actcttgtca tttttaatat tactgtcttt attcttatta ctattattgt tcccctaagt ggattggctt tgtgcttggg gctatttgtg tgtatgctga tgatcaaaac ctgtgccagg ctgaattaca gtgaaatttt ggtgaatgtg ggtagtcatt cttacaattg cactgotgtt cctgctccat gactggctgt ctgcctgtat tttcgggatt ctttgacatt tggtggtact ttattcttgc tgggcatact ttctctctag gagggagcct tgtgagatcc ttcacaggca gtgcatgtga agcatgcttt gctgctatga aaatgagcat cagagagtgt acatcatgtt attttattat tattatttgc ttttcatgta gaactcagca gttgacatcc aaatctagcc agagcccttc actgccatga tagctggggc ttcaccagtc tgtctactgt ggtgatctgt agacttctgg ttgtatttct atatttattt tcagtatact gtgtgggata cttagtggta tgtctcttta agttttgatt aatgtttctt aaatggaatt attttgaatg tcacaaattg atcaagatat taaaatgtcg gatttatctt tccccatatc caagtaccaa tgctgttgta aacaacgtgt atagtgccta aaattgtatg aaaatccttt taaccatttt aacctagatg tttaacaaat ctaatctctt attctaataa atatactatg aaataaaaaa aaaaggatga aagctaaaaa aaaaaaaaaa aaa
SEQ ID NO: 2 - Secuencia de aminoácidos de MEK1 humana de tipo silvestre (NP_002746; gi:5579478) [la cisteína de la posición del aminoácido 121 está en negrita y subrayada]
mpkkkptpiq lnpapdgsav ngtssaetnl ealqkkleel eldeqqrkrl eafltqkqkv gelkdddfek iselgagngg vvfkvshkps glvmarklih leikpairnq iirelqvlhe cnspyivgfy gafysdgeis icmehmdggs ldqvlkkagr ipeqilgkvs iavikgltyl rekhkimhrd vkpsnilvns rgeiklcdfg vsgqlidsma nsfvgtrsym sperlqgthy svqsdiwsmg lslvemavgr ypipppdake lelmfgcqve gdaaetpprp rtpgrplssy gmdsrppmai felldyivne pppklpsgvf slefqdfvnk cliknpaera dlkqlmvhaf ikrsdaeevd fagwlcstig lnqpstptha agv
SEQ ID NO: 3 - Secuencia de ácido nucleico de MEK1 C121S mutante [el codón de inicio y el codón que codifica la posición del aminoácido 121 están en negrita y subrayadas; n = a, c, g o t]
aggcgaggct tccccttccc cgcccctccc ccggcctcca gtccctccca gggccgcttc gcagagcggc taggagcacg gcggcggcgg cactttcccc ggcaggagct ggagctgggc tctggtgcgc gcgcggctgt gccgcccgag ccggagggac tggttggttg agagagagag aggaagggaa tcccgggctg ccgaaccgca cgttcagccc gctccgctcc tgcagggcag cctttcggct ctctgcgcgc gaagccgagt cccgggcggg tggggcgggg gtccactgag accgctaccg gcccctcggc gctgacggga ccgcgcgggg cgcacccgct gaaggcagcc ccggggcccg cggcccggac ttggtcctgc gcagcgggcg cggggcagcg cagcgggagg aagcgagagg tgctgccctc cccccggagt tggaagcgcg ttacccgggt ccaaaatgcc caagaagaag ccgacgccca tccagctgaa cccggccccc gacggctctg cagttaacgg gaccagctct gcggagacca acttggaggc cttgcagaag aagctggagg agctagagct tgatgagcag cagcgaaagc gccttgaggc ctttcttacc cagaagcaga aggtgggaga actgaaggat gacgactttg agaagatcag tgagctgggg gctggcaatg gcggtgtggt gttcaaggtc tcccacaagc cttctggcct ggtcatggcc agaaagctaa ttcatctgga gatcaaaccc gcaatccgga accagatcat aagggagctg caggttctgc atgagtcnaa ctctccgtac atcgtgggct tctatggtgc gttctacagc gatggcgaga tcagtatctg catggagcac atggatggag gttctctgga tcaagtcctg aagaaagctg gaagaattcc tgaacaaatt ttaggaaaag ttagcattgc tgtaataaaa ggcctgacat atctgaggga gaagcacaag atcatgcaca gagatgtcaa gccctccaac atcctagtca actcccgtgg ggagatcaag ctctgtgact ttggggtcag cgggcagctc atcgactcca tggccaactc cttcgtgggc acaaggtcct acatgtcgcc agaaagactc caggggactc attactctgt gcagtcagac atctggagca tgggactgtc tctggtagag atggcggttg ggaggtatcc catccctcct ccagatgcca aggagctgga gctgatgttt gggtgccagg tggaaggaga tgcggctgag accccaccca ggccaaggac ccccgggagg ccccttagct catacggaat ggacagccga cctcccatgg caatttttga gttgttggat tacatagtca acgagcctcc tccaaaactg cccagtggag tgttcagtct ggaatttcaa gattttgtga ataaatgctt aataaaaaac cccgcagaga gagcagattt gaagcaactc atggttcatg cttttatcaa gagatctgat gctgaggaag tggattttgc aggttggctc tgctccacca tcggccttaa ccagcccagc acaccaaccc atgctgctgg cgtctaagtg tttgggaagc aacaaagagc gagtcccctg cccggtggtt tgccatgtcg cttttgggcc tccttcccat gcctgtctct gttcagatgt gcatttcacc tgtgacaaag gatgaagaac acagcatgtg ccaagattct actcttgtca tttttaatat tactgtcttt attcttatta ctattattgt tcccctaagt ggattggctt tgtgcttggg gctatttgtg tgtatgctga tgatcaaaac ctgtgccagg ctgaattaca gtgaaatttt ggtgaatgtg ggtagtcatt cttacaattg cactgctgtt cctgctccat gactggctgt ctgcctgtat tttcgggatt ctttgacatt tggtggtact ttattcttgc tgggcatact ttctctctag gagggagcct tgtgagatcc ttcacaggca gtgcatgtga agcatgcttt gctgctatga aaatgagcat cagagagtgt acatcatgtt attttattat tattatttgc ttttcatgta gaactcagca gttgacatcc aaatctagcc agagcccttc actgccatga tagctggggc ttcaccagtc tgtctactgt ggtgatctgt agacttctgg ttgtatttct atatttattt tcagtatact gtgtgggata cttagtggta tgtctcttta agttttgatt aatgtttctt aaatggaatt attttgaatg tcacaaattg atcaagatat taaaatgtcg gatttatctt tccccatatc caagtaccaa tgctgttgta aacaacgtgt atagtgccta aaattgtatg aaaatccttt taaccatttt aacctagatg tttaacaaat ctaatctctt attctaataa atatactatg aaataaaaaa aaaaggatga aagctaaaaa aaaaaaaaaa aaa
SEQ ID NO: 4 - Secuencia de aminoácidos de MEK1 C121S mutante [la serina de la posición del aminoácido 121 está en negrita y subrayada]
mpkkkptpiq lnpapdgsav ngtssaetnl ealqkkleel eldeqqrkrl eafltqkqkv gelkdddfek iselgagngg vvfkvshkps glvmarklih leikpairnq iirelqvlhe _snspyivgfy gafysdgeis icmehmdggs ldqvlkkagr ipeqilgkvs iavikgltyl rekhkimhrd vkpsnilvns rgeiklcdfg vsgqlidsma nsfvgtrsym sperlqgthy svqsdiwsmg lslvemavgr ypipppdake lelmfgcqve gdaaetpprp rtpgrplssy gmdsrppmai felldyivne pppklpsgvf slefqdfvnk cliknpaera dlkqlmvhaf ikrsdaeevd fagwlcstig lnqpstptha agv

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método de identificación de un compuesto eficaz para inhibir una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido C121S, comprendiendo el método:
a) proporcionar una composición de ensayo que comprende:
una proteína MEK1 mutante que tiene actividad MEK1, donde la actividad MEK1 comprende la fosforilación de ERK1/2, comprendiendo la proteína MEK1 mutante una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2 donde la sustitución de aminoácido es una sustitución de aminoácido C121S, confiriendo la sustitución de aminoácido C121S resistencia a un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK; y
un sustrato de MEK;
b) poner en contacto la composición de ensayo con un compuesto de ensayo en condiciones que permiten la fosforilación del sustrato de MEK en ausencia del compuesto de ensayo; y
c) determinar el efecto del compuesto en la fosforilación de un sustrato de MEK;
en el que la reducción modulada de la fosforilación del sustrato de MEK en comparación con un control adecuado identifica al compuesto de ensayo como un compuesto eficaz para inhibir una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido C121S.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el sustrato de MEK es ERK1/2.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la composición de ensayo es un extracto celular o una proteína purificada.
4. El método de la reivindicación 1, en el que el inhibidor de RAF es PLX4720 o PLX4032.
5. El método la reivindicación 1, en el que el inhibidor de MEK es AZD6244.
6. Un método de identificación de un compuesto eficaz para inhibir una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido C121S, comprendiendo el método:
a) proporcionar una célula que comprende una proteína MEK1 mutante que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2 donde la sustitución de aminoácido es una sustitución de aminoácido C121S, confiriendo la sustitución de aminoácido C121S resistencia a un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK;
b) poner en contacto la célula con un compuesto de ensayo; y
c) determinar el efecto del compuesto en la fosforilación de un sustrato de MEK;
en el que la reducción modulada de la fosforilación del sustrato de MEK en comparación con un control adecuado identifica al compuesto como eficaz para inhibir una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido C121S.
7. El método de la reivindicación 6, en el que el sustrato de MEK es ERK1/2.
8. El método de la reivindicación 6, en el que el inhibidor de RAF es PLX4720 o PLX4032.
9. El método de la reivindicación 6, en el que el inhibidor de MEK es AZD6244.
10. Un método de cribado en células in vitro para identificar un compuesto de ensayo para tratar cáncer en un sujeto, en el que el cáncer es un cáncer en el que se ha detectado una proteína MEK1 mutante que tiene una sustitución de aminoácido C121S, comprendiendo el método
proporcionar la célula que comprende una proteína MEK1 mutante que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 121 de la proteína MEK1 de tipo silvestre mostrada en SEQ ID NO: 2 donde la sustitución de aminoácido es una sustitución de aminoácido C121S, confiriendo la sustitución C121S resistencia a un inhibidor de RAF y un inhibidor de MEK;
proporcionar una línea celular que expresa la proteína MEK1 de tipo silvestre; y
poner en contacto la célula y la línea celular de control con el compuesto de ensayo para determinar la sensibilidad de la célula al compuesto de ensayo, en el que la sensibilidad de la célula al compuesto de ensayo se mide utilizando un ensayo seleccionado del grupo que consiste en un ensayo de proliferación celular, un ensayo de viabilidad celular y un ensayo de fosforilación del sustrato de MEK, en el que una reducción en la proliferación celular, viabilidad celular o fosforilación del sustrato de MEK en presencia del compuesto de ensayo identifica al compuesto como un compuesto para tratar el cáncer.
11. El método de la reivindicación 10, en el que el ensayo de fosforilación del sustrato de MEK comprende ERK1/2.
12. El método de la reivindicación 10, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en leucemias, linfomas, mielomas, carcinomas, carcinomas metastásicos, sarcomas, adenomas, cánceres del sistema nervioso y cánceres geritourinarios, preferentemente en el que el cáncer es melanoma.
ES17201390T 2010-06-09 2011-06-09 Una mutación de MEK1 que confiere resistencia a inhibidores de RAF y de MEK Active ES2873933T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35295910P 2010-06-09 2010-06-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2873933T3 true ES2873933T3 (es) 2021-11-04

Family

ID=44357961

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17201390T Active ES2873933T3 (es) 2010-06-09 2011-06-09 Una mutación de MEK1 que confiere resistencia a inhibidores de RAF y de MEK
ES11735711.1T Active ES2660239T3 (es) 2010-06-09 2011-06-09 Una mutación de MEK1 que confiere resistencia a inhibidores de RAF y de MEK

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11735711.1T Active ES2660239T3 (es) 2010-06-09 2011-06-09 Una mutación de MEK1 que confiere resistencia a inhibidores de RAF y de MEK

Country Status (14)

Country Link
US (5) US20130143911A1 (es)
EP (3) EP3333259B1 (es)
JP (2) JP5908466B2 (es)
KR (1) KR101865426B1 (es)
CN (1) CN103097526B (es)
AU (1) AU2011264833B2 (es)
BR (1) BR112012030838A2 (es)
CA (1) CA2799790A1 (es)
EA (1) EA028080B1 (es)
ES (2) ES2873933T3 (es)
MX (1) MX342966B (es)
PL (1) PL2580322T3 (es)
PT (1) PT2580322T (es)
WO (1) WO2011156588A1 (es)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI577680B (zh) 2008-10-22 2017-04-11 亞雷生物製藥股份有限公司 作為ＴＲＫ激酶抑制劑之經取代吡唑并〔１，５－ａ〕嘧啶化合物
GB201201332D0 (en) 2012-01-26 2012-03-14 Imp Innovations Ltd Method
WO2015191857A1 (en) * 2014-06-13 2015-12-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Erk1 and erk2 mutations that confer resistance to mapk pathway inhibitors
WO2017065277A1 (ja) * 2015-10-14 2017-04-20 日東紡績株式会社 ２種のプロテインキナーゼの活性測定を用いる解析方法による、薬剤感受性ヒト細胞株の判定方法
MX2018005087A (es) * 2015-10-26 2019-05-16 Loxo Oncology Inc Mutaciones puntuales en cáncer resistente a trk y métodos relacionados con las mismas.
US10045991B2 (en) 2016-04-04 2018-08-14 Loxo Oncology, Inc. Methods of treating pediatric cancers
JP7061602B2 (ja) 2016-04-04 2022-04-28 ロクソ オンコロジー， インコーポレイテッド （Ｓ）－Ｎ－（５－（（Ｒ）－２－（２，５－ジフルオロフェニル）－ピロリジン－１－イル）－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）－３－ヒドロキシピロリジン－１－カルボキサミドの液体製剤
DK3458456T3 (da) 2016-05-18 2020-12-14 Array Biopharma Inc Fremstilling af (s)-n-(5-((r)-2-(2,5-difluorphenyl)pyrrolidin-1-yl)pyrazol[1,5-a]pyrimidin-3-yl)-3-hydroxypyrrolidin-1-carboxamid
JOP20190092A1 (ar) 2016-10-26 2019-04-25 Array Biopharma Inc عملية لتحضير مركبات بيرازولو[1، 5-a]بيريميدين وأملاح منها
JP7300394B2 (ja) 2017-01-17 2023-06-29 ヘパリジェニックス ゲーエムベーハー 肝再生の促進又は肝細胞死の低減もしくは予防のためのプロテインキナーゼ阻害
KR101991454B1 (ko) 2017-05-23 2019-06-20 차의과학대학교 산학협력단 크로메논 유도체를 유효성분으로 포함하는 폐섬유화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
WO2022255401A1 (ja) * 2021-06-03 2022-12-08 国立大学法人 東京大学 Ｅｒｋ－ｍａｐｋ経路の異常な活性化に伴い発現する疾患マーカー
WO2023125788A1 (en) * 2021-12-31 2023-07-06 Edigene Therapeutics (Beijing) Inc. Biomarkers for colorectal cancer treatment

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57501692A (es) 1980-09-24 1982-09-16
US4582788A (en) 1982-01-22 1986-04-15 Cetus Corporation HLA typing method and cDNA probes used therein
DE3381518D1 (de) 1982-01-22 1990-06-07 Cetus Corp Verfahren zur charakterisierung von hla und die darin benutzten cdns-testmittel.
NL8200523A (nl) 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
GB8311018D0 (en) 1983-04-22 1983-05-25 Amersham Int Plc Detecting mutations in dna
US4879236A (en) 1984-05-16 1989-11-07 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4683194A (en) 1984-05-29 1987-07-28 Cetus Corporation Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4682195A (en) 1985-09-30 1987-07-21 General Electric Company Insulated gate device with configured emitter contact pad
US4959463A (en) 1985-10-15 1990-09-25 Genentech, Inc. Intermediates
US4659774A (en) 1985-11-01 1987-04-21 American Hoechst Corporation Support for solid-phase oligonucleotide synthesis
US4946773A (en) 1985-12-23 1990-08-07 President And Fellows Of Harvard College Detection of base pair mismatches using RNAase A
CA1284931C (en) 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
CA1338457C (en) 1986-08-22 1996-07-16 Henry A. Erlich Purified thermostable enzyme
EP0266032A1 (en) 1986-08-29 1988-05-04 Beecham Group Plc Modified fibrinolytic enzyme
US4816571A (en) 1987-06-04 1989-03-28 Applied Biosystems, Inc. Chemical capping by phosphitylation during oligonucleotide synthesis
US4952500A (en) 1988-02-01 1990-08-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning systems for Rhodococcus and related bacteria
US5602244A (en) 1988-05-26 1997-02-11 Competitive Technologies, Inc. Polynucleotide phosphorodithioate compounds
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5096676A (en) 1989-01-27 1992-03-17 Mcpherson Alexander Crystal growing apparatus
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5925525A (en) 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
FR2650840B1 (fr) 1989-08-11 1991-11-29 Bertin & Cie Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications
US5141813A (en) 1989-08-28 1992-08-25 Clontech Laboratories, Inc. Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5610042A (en) 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat
DE4204650C1 (es) 1992-02-15 1993-07-08 Hoffmeister, Helmut, Dr., 4400 Muenster, De
US5428148A (en) 1992-04-24 1995-06-27 Beckman Instruments, Inc. N4 - acylated cytidinyl compounds useful in oligonucleotide synthesis
WO1994000977A1 (en) 1992-07-07 1994-01-20 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
US5702932A (en) 1992-07-20 1997-12-30 University Of Florida Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA
EP0652965A1 (en) 1992-07-27 1995-05-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
GB9222888D0 (en) 1992-10-30 1992-12-16 British Tech Group Tomography
CA2165162C (en) 1993-06-14 2000-05-23 Hermann Bujard Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
WO1995003335A1 (en) 1993-07-26 1995-02-02 K.O. Technology, Inc. Inhibitors of alternative alleles of genes as a basis for cancer therapeutic agents
JP3175110B2 (ja) 1994-02-07 2001-06-11 オーキッド・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド リガーゼ／ポリメラーゼ媒体された単一ヌクレオチド多型のジェネティックビットアナリシスおよび遺伝子解析におけるその使用
US5851770A (en) 1994-04-25 1998-12-22 Variagenics, Inc. Detection of mismatches by resolvase cleavage using a magnetic bead support
US5419278A (en) 1994-05-25 1995-05-30 Carter; Daniel C. Vapor equilibration tray for growing protein crystals
US5656610A (en) 1994-06-21 1997-08-12 University Of Southern California Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue
US5849483A (en) 1994-07-28 1998-12-15 Ig Laboratories, Inc. High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids
US5574146A (en) 1994-08-30 1996-11-12 Beckman Instruments, Inc. Oligonucleotide synthesis with substituted aryl carboxylic acids as activators
US5871986A (en) 1994-09-23 1999-02-16 The General Hospital Corporation Use of a baculovirus to express and exogenous gene in a mammalian cell
US5554744A (en) 1994-09-23 1996-09-10 Hybridon, Inc. Method for loading solid supports for nucleic acid synthesis
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5866337A (en) 1995-03-24 1999-02-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method to detect mutations in a nucleic acid using a hybridization-ligation procedure
US5705629A (en) 1995-10-20 1998-01-06 Hybridon, Inc. Methods for H-phosphonate synthesis of mono- and oligonucleotides
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
US5945100A (en) 1996-07-31 1999-08-31 Fbp Corporation Tumor delivery vehicles
US5928870A (en) 1997-06-16 1999-07-27 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of loss of heterozygosity
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
US5994624A (en) 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
US6200754B1 (en) 1998-03-19 2001-03-13 Variagenics, Inc. Inhibitors of alternative alleles of genes encoding products that mediate cell response to environmental changes
US6296673B1 (en) 1999-06-18 2001-10-02 The Regents Of The University Of California Methods and apparatus for performing array microcrystallizations
US6376747B1 (en) * 1999-08-27 2002-04-23 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Canada Plant-derived map kinase kinase
US20070037165A1 (en) 2000-09-08 2007-02-15 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
US7892730B2 (en) 2000-12-22 2011-02-22 Sagres Discovery, Inc. Compositions and methods for cancer
AU2002348791A1 (en) 2001-12-21 2003-07-09 Warner-Lambert Company Llc Modified mek1 and mek2, crystal of a peptide: ligand: cofactor complex containing such modified mek1 or mek2, and methods of use thereof
US20050084905A1 (en) * 2002-03-21 2005-04-21 Prescott John C. Identification of kinase inhibitors
CA2539064A1 (en) 2003-09-17 2005-04-21 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Identification of kinase inhibitors
KR100894755B1 (ko) * 2004-03-19 2009-04-24 더 펜 스테이트 리서어치 파운데이션 흑색종을 치료하기 위한 조합 방법 및 조성물
JP2008511600A (ja) 2004-09-01 2008-04-17 アストラゼネカ アクチボラグ キナゾリン誘導体およびＢ−Ｒａｆ抑制剤としてそれらの使用
US20100216791A1 (en) 2006-08-17 2010-08-26 Astrazeneca Pyridinylquinazolinamine derivatives and their use as b-raf inhibitors
CA2662285A1 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Array Biopharma Inc. Raf inhibitor compounds and methods of use thereof
EP2139512B1 (en) * 2007-03-30 2013-04-24 Pronas Pharma AB Ischemic disorder or disease inhibitors
WO2008120004A1 (en) * 2007-04-02 2008-10-09 Astrazeneca Ab Combination of a mek- inhibitor and a b-raf inhibitor for the treatment of cancer
WO2009028629A1 (ja) * 2007-08-29 2009-03-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited 複素環化合物およびその用途
US9084781B2 (en) * 2008-12-10 2015-07-21 Novartis Ag MEK mutations conferring resistance to MEK inhibitors
CN107614762B (zh) * 2015-02-24 2022-08-05 台湾地区“中央研究院” 一种由噬菌体表达的单链变异片段抗体库

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016176942A (ja) 2016-10-06
CN103097526A (zh) 2013-05-08
AU2011264833A1 (en) 2012-12-06
PT2580322T (pt) 2018-03-01
MX342966B (es) 2016-10-19
WO2011156588A1 (en) 2011-12-15
JP5908466B2 (ja) 2016-04-26
JP6254630B2 (ja) 2017-12-27
US11789022B2 (en) 2023-10-17
EP2580322B1 (en) 2018-01-10
EA028080B1 (ru) 2017-10-31
EP3333259A1 (en) 2018-06-13
US20240094208A1 (en) 2024-03-21
BR112012030838A2 (pt) 2016-11-08
KR20130084987A (ko) 2013-07-26
US20130143911A1 (en) 2013-06-06
EP3889254A1 (en) 2021-10-06
AU2011264833B2 (en) 2014-07-03
US9880169B2 (en) 2018-01-30
ES2660239T3 (es) 2018-03-21
JP2013535955A (ja) 2013-09-19
CN103097526B (zh) 2015-09-16
PL2580322T3 (pl) 2018-09-28
US20180217147A1 (en) 2018-08-02
CA2799790A1 (en) 2011-12-15
EP3333259B1 (en) 2021-02-24
US20210008147A1 (en) 2021-01-14
MX2012014310A (es) 2013-04-17
US20160216266A1 (en) 2016-07-28
KR101865426B1 (ko) 2018-07-13
EP2580322A1 (en) 2013-04-17
EA201291206A1 (ru) 2013-05-30
US10788496B2 (en) 2020-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2873933T3 (es) Una mutación de MEK1 que confiere resistencia a inhibidores de RAF y de MEK
ES2674682T3 (es) Mutaciones de BRAF que confieren resistencia a inhibidores de BRAF
US20150346204A1 (en) MEK Mutations Conferring Resistance to MEK Inhibitors