MD3554553T2 - Conjugați de oligomeri de omitere a exonului, pentru distrofie musculară - Google Patents

Conjugați de oligomeri de omitere a exonului, pentru distrofie musculară Download PDF

Info

Publication number
MD3554553T2
MD3554553T2 MDE20191207T MDE20191207T MD3554553T2 MD 3554553 T2 MD3554553 T2 MD 3554553T2 MD E20191207 T MDE20191207 T MD E20191207T MD E20191207 T MDE20191207 T MD E20191207T MD 3554553 T2 MD3554553 T2 MD 3554553T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
dystrophin
exon
antisense oligomer
skipping
antisense
Prior art date
Application number
MDE20191207T
Other languages
English (en)
Inventor
Marco A Passini
Gunnar J Hanson
Original Assignee
Sarepta Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sarepta Therapeutics Inc filed Critical Sarepta Therapeutics Inc
Publication of MD3554553T2 publication Critical patent/MD3554553T2/ro

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Sunt descrise conjugatele oligomer antisens complementare unui situs ţintă selectat în gena distrofinei umane pentru a induce omisia exonului 51.

Description

INFORMAŢII CONEXE
Această cerere de brevet revendică beneficiul cererii de brevet provizorii U.S. Nr. 62/436182, înregistrată la 19 decembrie 2016, cererii de brevet provizorii U.S. Nr. 62/443476, înregistrată la 6 ianuarie 2017, cererii de brevet provizorii U.S. Nr. 62/479173, înregistrată la 30 martie 2017 şi al cererii de brevet provizorii U.S. Nr. 62/562080, înregistrată la 22 septembrie 2017.
DOMENIUL DEZVĂLUIRII
Prezenta dezvăluire se referă la noi conjugaţi de oligomeri antisens adecvaţi pentru omiterea exonului 51 în gena distrofinei umane, şi la compoziţii farmaceutice ale acestora. Dezvăluirea furnizează, de asemenea, conjugaţi de oligomeri antisens şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în inducerea omiterii exonului 51 care produce distrofină la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51, şi tratarea unui subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51.
CONTEXTUL DEZVĂLUIRII
Tehnologiile antisens sunt dezvoltate folosind o serie de reacţii chimice pentru a afecta expresia genelor la o varietate de niveluri diferite (transcripţie, îmbinare, stabilitate, traducere). O mare parte din aceste cercetări s-au concentrat pe utilizarea compuşilor antisens pentru a corecta sau compensa genele anormale sau asociate bolii într-o gamă largă de indicaţii. Moleculele antisens sunt capabile să inhibe expresia genelor cu specificitate şi, din această cauză, multe eforturi de cercetare privind oligomerii ca modulatori ai expresiei genelor s-au concentrat pe inhibarea expresiei genelor ţintite sau a funcţiei elementelor cu acţiune cis. Oligomerii antisens sunt în mod obişnuit îndreptaţi împotriva ARN-ului, fie a catenei sens (de exemplu, ARNm), fie a catenei minus în cazul unor ţinte de ARN viral. Pentru a obţine efectul dorit de reglare prin scădere a genei specifice, oligomerii, fie promovează dezintegrarea ARNm ţintit, blochează traducerea ARNm, fie blochează funcţia elementelor ARN cu acţiune cis, prevenind astfel eficient, fie sinteza proteinei ţintă de novo, fie replicarea ARN-ului viral.
Cu toate acestea, astfel de tehnici nu sunt utile atunci când obiectivul este de a regla în sens crescător producţia de proteină nativă, sau de a compensa mutaţiile care induc terminarea prematură a traducerii, cum ar fi mutaţii nonsens sau de schimbare a cadrului. În aceste cazuri, transcriptul genei defecte nu trebuie supus degradării ţintite sau inhibării sterice, astfel încât structura chimică a oligomerului antisens nu ar trebui să promoveze dezintegrarea ARNm-ului ţintă sau să blocheze traducerea.
Într-o varietate de boli genetice, efectele mutaţiilor asupra exprimării eventuale a unei gene pot fi modulate printr-un proces de omitere a exonului ţintit în timpul procesului de îmbinare. Procesul de îmbinare este condus de mecanisme complexe cu mai multe componente care aduc joncţiunile exon-intron adiacente din pre-ARNm în proximitate şi realizează scindarea legăturilor fosfodiester la capetele intronilor, cu formarea lor ulterioară din nou între exonii care urmează să fie îmbinaţi împreună. Acest proces complex şi extrem de precis este mediat de motivele de secvenţă din pre-ARNm, care sunt segmente de ARN relativ scurte, semi-conservate, la care se leagă diverşi factori nucleari de îmbinare care sunt apoi implicaţi în reacţiile de îmbinare. Prin schimbarea modului în care mecanismul de îmbinare citeşte sau recunoaşte motivele implicate în procesarea pre-ARNm, este posibil să se creeze molecule de ARNm îmbinate în mod diferenţiat. S-a recunoscut acum că majoritatea genelor umane sunt îmbinate alternativ în timpul expresiei genice normale, deşi mecanismele implicate nu au fost identificate. Bennett şi colab. (Brevetul U.S. nr. 6,210,892) descriu modularea antisens a prelucrării ARNm celulare de tip sălbatic folosind analogi de oligomeri antisens care nu induc scindarea mediată de ARNaza H a ARN-ului ţintă. Acest lucru îşi găseşte utilitatea în a putea genera mARN-uri îmbinate alternativ care nu au exoni specifici (vezi, de ex., aşa cum este descris de Sazani, Kole şi colab. 2007 pentru generarea de receptori solubili ai superfamiliei TNF care nu au exoni care codifică domeniile de acoperire a membranei).
În cazurile în care o proteină în mod normal funcţională este terminată prematur din cauza mutaţiilor din aceasta, s-a dovedit că este posibil un mijloc de restabilire a producţiei de proteine funcţionale prin tehnologia antisens prin intervenţie în timpul proceselor de îmbinare şi că, dacă exonii asociaţi cu mutaţii care cauzează boli pot să fie şterşi în mod specific din unele gene, se poate produce uneori un produs proteic scurtat care are proprietăţi biologice similare cu proteina nativă sau care are o activitate biologică suficientă pentru a ameliora boala cauzată de mutaţiile asociate cu exonul (vezi, de ex., Sierakowska, Sambade şi colab. 1996; Wilton, Lloyd şi colab. 1999; van Deutekom, Bremmer-Bout şi colab. 2001; Lu, Mann şi colab. 2003; Aartsma-Rus, Janson şi colab. 2004). Kole şi colab. (brevetele U.S. numerele: 5,627,274; 5,916,808; 5,976,879; şi 5,665,593) dezvăluie metode de combatere a îmbinării aberante folosind analogi de oligomeri antisens modificaţi care nu promovează degradarea pre-ARNm ţintă. Bennett şi colab. (Brevetul U.S. nr. 6,210,892) descriu modularea antisens a prelucrării ARNm celulare de tip sălbatic folosind, de asemenea, analogi de oligomeri antisens care nu induc scindarea mediată de ARNază H a ARN-ului ţintă.
Procesul de omitere a exonului ţintit este probabil să fie deosebit de util în genele lungi în care există mulţi exoni şi introni, în care există redundanţă în constituţia genetică a exonilor sau în care o proteină este capabilă să funcţioneze fără unu sau mai mulţi anumiţi exoni. Eforturile de redirecţionare a prelucrării genelor pentru tratamentul bolilor genetice asociate cu trunchiere cauzată de mutaţii în diferite gene, s-au concentrat pe utilizarea oligomerilor antisens care fie: (1) se suprapun complet sau parţial cu elementele implicate în procesul de îmbinare; fie (2) se leagă de pre-ARNm într-o poziţie suficient de apropiată de element pentru a perturba legarea şi funcţia factorilor de îmbinare care ar media în mod normal o anumită reacţie de îmbinare care are loc la acel element.
Distrofia musculară Duchenne (DMD) este cauzată de un defect în exprimare a proteinei distrofină. Gena care codifică proteina conţine 79 de exoni răspândiţi pe peste 2 milioane de nucleotide de ADN. Orice mutaţie exonică care schimbă cadrul de citire al exonului, sau introduce un codon de oprire, sau este caracterizată prin îndepărtarea unui întreg exon sau de exoni din afara cadrului, sau dublează unu sau mai mulţi exoni, are potenţialul de a perturba producţia de distrofină funcţională, rezultând DMD
O formă mai puţin severă de distrofie musculară, distrofia musculară Becker (DMO) s-a descoperit că apare atunci când o mutaţie, de obicei, o ştergere a unuia sau mai multor exoni, are ca rezultat un cadru corect de citire de-a lungul întregului transcript al distrofinei, astfel încât traducerea ARNm în proteină nu este oprită prematur. Dacă îmbinarea exonilor din amonte şi din aval în procesarea unui pre-ARNm de distrofină mutantă menţine cadrul de citire corect al genei, rezultatul este un ARNm care codifică o proteină cu o ştergere scurtă internă care păstrează o anumită activitate, rezultând un fenotip Becker.
De mulţi ani se ştie că ştergerea unui exon sau a exonilor care nu modifică cadrul de citire al unei proteine distrofină ar da naştere unui fenotip BMD, în timp ce o ştergere a exonului care provoacă o schimbare a cadrului va da naştere la DMD (Monaco, Bertelson şi colab. 1988). În general, mutaţiile distrofinei, incluzând mutaţiile punctiforme şi ştergerile exonilor care schimbă cadrul de citire şi astfel întrerup traducerea adecvată a proteinei, au ca rezultat DMD. De asemenea, trebuie remarcat faptul că unii pacienţi cu DMO şi DMD au ştergeri de exon care acoperă mai mulţi exoni.
Modularea îmbinării pre-ARNm al distrofinei mutante cu oligoribonucleotide antisens a fost raportată, atât in vitro şi in vivo (vezi, de ex., Matsuo, Masumura şi colab. 1991; Takeshima, Nishio şi colab. 1995; Pramono, Takeshima şi colab. 1996; Dunckley, Eperon şi colab. 1997; Dunckley, Manoharan şi colab. 1998; Wilton, Lloyd şi colab. 1999; Mann, Honeyman şi colab. 2002; Errington, Mann şi colab. 2003).
Oligomerii antisens au fost special concepuţi pentru a ţinti regiuni specifice ale pre-ARNm, de obicei, exoni pentru a induce omiterea unei mutaţii a genei DMD, restabilind astfel aceste mutaţii din afara cadrului în cadru pentru a permite producerea de proteine distrofină scurtate intern, dar totuşi funcţionale. Se ştie că astfel de oligomeri antisens ţintesc complet în interiorul exonului (aşa numitele secvenţe interne ale exonului) sau la o joncţiune donor de îmbinare sau acceptor de îmbinare care traversează de la exon într-o porţiune a intronului.
Descoperirea şi dezvoltarea unor astfel de oligomeri antisens pentru DMD a fost un domeniu de cercetare anterioară. Aceste evoluţii includ cele din: (1) University of Western Australia şi Sarepta Therapeutics (cesionar al acestei cereri): WO 2006/000057; WO 2010/048586; WO 2011/057350; WO 2014/100714; WO 2014/153240; WO 2014/153220; (2) Academisch Ziekenhuis Leiden/Prosensa Technologies (acum BioMarin Pharmaceutical): WO 02/24906; WO 2004/083432; WO 2004/083446; WO 2006/112705; WO 2007/133105; WO 2009/139630; WO 2009/054725; WO 2010/050801; WO 2010/050802; WO 2010/123369; WO 2013/112053; WO 2014/007620; (3) Carolinas Medical Center: WO 2012/109296; (4) Royal Holloway: brevete şi cereri care revendică beneficiul priorităţii, şi includ, cererile US. Nr. 61/096.073 şi 61/164.978; cum ar fi US 8.084.601 şi US 2017-0204413 (4) JCR Pharmaceuticals and Matsuo: US 6,653,466; brevete şi cereri care revendică beneficiul, şi care includ, JP 2000-125448, cum ar fi US 6.653.467; brevete şi cereri care revendică beneficiul şi care includ, JP 2000-256547, cum ar fi US 6,727,355; WO 2004/048570; (5) Nippon Shinyaku: WO 2012/029986; WO 2013/100190; WO 2015/137409; WO 2015/194520; şi (6) Association Institut de Myologie/Universite Pierre et Marie Curie/Universität Bern/Centre national de la Recherche Scientifique/Synthena AG: WO 2010/115993; WO 2013/053928.
În plus, WO 2017/062835 A2 dezvăluie oligomeri antisens modificaţi pentru tratamentul distrofiei musculare Duchenne şi al tulburărilor asociate. Oligomerii dezvăluiţi aici cuprind o secvenţă de ţintire complementară cu 12 sau mai multe nucleotide contigue dintr-o regiune ţintă care cuprinde un exon de pre-ARNm de distrofină umană şi cel puţin o subunitate care este un analog de nucleotide care are (i) o legătură internucleozidă modificată, (ii) un fragment de zahăr modificat sau (iii) o combinaţie a celor de mai sus.
Documentul WO 2014/144978 dezvăluie o metodă pentru tratarea distrofiei musculare Duchenne cu oligonucleotida antisens PMO Eteplirsen.
Eteplirsen este un oligomer morfolino fosforodiamidat (PMO) conceput pentru a omite exonul 51 al genei distrofinei umane la pacienţii cu DMD care sunt susceptibili la omiterea exonului 51 pentru a restabili cadrul de citire şi a produce o formă funcţională mai scurtă a proteinei distrofină. Administraţia Statelor Unite pentru Alimente şi Medicamente (FDA) a aprobat în 2016 Exondys 51™ (eteplirsen) pentru tratamentul distrofiei musculare Duchenne (DMD) la pacienţii care au o mutaţie confirmată a genei DMD care este susceptibilă de omitere a exonului 51.
Descoperirea şi dezvoltarea oligomerilor antisens conjugaţi cu peptide care pătrund celulele pentru DMD a fost, de asemenea, un domeniu de cercetare (vezi Publicaţia PCT Nr. WO 2010/048586; Wu, B. şi colab., The American Journal of Pathology, vol. 181 (2): 392-400, 2012; Wu, R. şi colab., Nucleic Acids Research, Vol. 35 (15): 5182-5191, 2007; Mulders, S. şi colab., Al 19-lea Congres Internaţional al World Muscle Society, Poster Presentation Berlin, octombrie 2014; Bestas, B. şi colab., The Journal of Clinical Investigation, doi: 10.1172/JCI76175, 2014; Jearawiriyapaisarn, N. şi colab., Molecular Therapy, Vol. 16(9): 1624-1629, 2008; Jearawiriyapaisarn, N. şi colab., Cardiovascular Research, Vol. 85: 444-453, 2010; Moulton, H.M. şi colab., Biochemical Society Transactions, Vol. 35 (4): 826-828, 2007; Yin, H. şi colab., Molecular Therapy, Vol. 19 (7): 1295-1303, 2011; Abes, R. şi colab., J. Pept. Sci., voi. 14: 455-460, 2008; Lebleu, B. şi colab., Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 60: 517-529, 2008; McClorey, G. şi colab., Gene Therapy, Vol. 13: 1373-1381, 2006; Alter, J. şi colab., Nature Medicine, Voi. 12 (2): 175-177, 2006; şi Youngblood, D. şi colab., American Chemical Society, Bioconjugate Chem., 2007, 18 (1), pp. 50-60).
Peptidele care pătrund în celule (CPP), de exemplu, un fragment de transport de peptidă bogată în arginină, pot fi eficiente pentru a îmbunătăţi penetrarea într-o celulă, de exemplu, a unui oligomer antisens conjugat cu CPP.
În ciuda acestor eforturi, rămâne o nevoie de oligomeri antisens îmbunătăţiţi care ţintesc exonul 51 şi de compoziţii farmaceutice corespunzătoare care sunt potenţial utile pentru metodele terapeutice pentru producerea distrofinei şi tratarea DMD.
EXPUNEREA PE SCURT A DEZVĂLUIRII
Prezenta dezvăluire furnizează conjugaţi de oligomeri antisens cu Formula (IV):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează conjugaţi de oligomeri antisens cu Formula (IVA):
Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează compoziţii farmaceutice care includ conjugaţii de oligomeri antisens din dezvăluire şi un purtător acceptabil farmaceutic. În unele variante de realizare, purtătorul acceptabil farmaceutic este o soluţie salină care include un tampon fosfat.
Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează conjugaţi de oligomeri antisens ca mai sus, şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în tratarea distrofiei musculare Duchenne (DMD) la un subiect care are nevoie de aceasta, în care subiectul are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51.
Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează conjugaţi de oligomeri antisens ca mai sus, şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în restabilirea unui cadru de citire a ARNm pentru a induce producţia de distrofină la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51. Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează conjugaţi de oligomeri antisens ca mai sus, şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în excluderea exonului 51 din pre-ARNm de distrofină în timpul prelucrării ARNm la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51. Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează conjugaţi de oligomeri antisens ca mai sus, şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în legarea exonului 51 al pre-ARNm de distrofină la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51.
Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează un conjugat de oligomer antisens din dezvăluirea de aici pentru utilizare în terapie. Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează, de asemenea, kituri pentru tratarea distrofiei musculare Duchenne (DMD) la un subiect care are nevoie de aceasta, în care subiectul are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51, kituri care cuprind cel puţin un conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire, ambalat într-un recipient adecvat, şi instrucţiuni pentru utilizarea acestuia.
Acestea şi alte obiecte şi caracteristici vor fi înţelese mai pe deplin atunci când următoarea descriere detaliată a dezvăluirii este citită împreună cu figurile.
SCURTĂ DESCRIERE A FIGURILOR
Figura 1 ilustrează o secţiune de pre-ARNm de distrofină normală şi ARNm matur.
Figura 2 ilustrează o secţiune de pre-ARNm anormal de distrofină (exemplu de DMD) şi distrofină nefuncţională, instabilă rezultată.
Figura 3 ilustrează eteplirsen, conceput pentru a omite exonul 51, restabilirea citirii "în cadru" a pre-ARNm pentru a produce distrofină ştearsă intern.
Figura 4 furnizează un grafic cu bare al procentului de omitere a exonului 51 în miocite umane diferenţiate de către PMO#1 şi PPMO#1 la diferite concentraţii la 96 de ore după tratament, aşa cum a fost măsurat prin RT-PCR.
Figurile 5A-5D (nu fac parte din prezenta invenţie) furnizează imagini reprezentative ale analizei Western Blot care măsoară proteina distrofină în cvadriceps la şoareci mdx trataţi cu PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) pentru diferite momente de timp [7 zile (5A), 30 de zile (5B), 60 de zile (5C) şi 90 de zile (5D)].
Figura 6A (nu face parte din prezenta invenţie) furnizează un grafic cu linii care ilustrează procentul de distrofină de tip sălbatic indus de către PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în cvadricepsul şoarecilor mdx pe parcursul a 90 de zile după injectare, aşa cum este determinat prin analiza Western Blot.
Figura 6B (nu face parte din prezenta invenţie) furnizează un grafic liniar care ilustrează procentul de omitere a exonului 23 indusă de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în cvadricepsul şoarecilor mdx pe parcursul a 90 de zile după injectare, aşa cum este determinat prin RT-PCR.
Figurile 7A-7D (nu fac parte din prezenta invenţie) furnizează imagini reprezentative ale analizei Western Blot care măsoară proteina distrofină în diafragma şoarecilor mdx trataţi cu PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) pentru diferite momente de timp [7 zile (7A), 30 de zile (7B), 60 de zile (7C) şi 90 de zile (7D)].
Figura 8A (nu face parte din prezenta invenţie) furnizează un grafic cu linii care ilustrează procentul de distrofină de tip sălbatic indus de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în diafragma şoarecilor mdx la 90 de zile după injectare, aşa cum este determinat prin analiza Western Blot.
Figura 8B (nu face parte din prezenta invenţie) furnizează un grafic liniar care ilustrează procentul de omitere a exonului 23 indus de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în diafragma şoarecilor mdx pe parcursul a 90 de zile după injectare, aşa cum este determinat prin RT-PCR.
Figurile 9A-9D (nu fac parte din prezenta invenţie) furnizează imagini reprezentative ale analizei Western Blot care măsoară proteina distrofină în inima şoarecilor mdx trataţi cu PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) pentru diferite momente de timp [7 zile (9A), 30 de zile (9B), 60 de zile (9C) şi 90 de zile (9D)].
Figura 10A (nu face parte din prezenta invenţie) furnizează un grafic cu linii care ilustrează procentul de distrofină de tip sălbatic indus de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în inima şoarecilor mdx pe parcursul a 90 de zile după injectare, aşa cum este determinat prin analiza Western Blot.
Figura 10B (nu face parte din prezenta invenţie) furnizează un grafic liniar care ilustrează procentul de omitere a exonului 23 indusă de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în inima şoarecilor mdx pe parcursul a 90 de zile după injectare, aşa cum este determinat prin RT-PCR.
Figura 11 (nu face parte din prezenta invenţie) furnizează o analiză imunohistochimică care arată distrofina indusă de către PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în cvadricepsul stâng al şoarecelui mdx.
Figura 12 furnizează grafice liniare care arată procentul de omitere a exonului 51 la primatele non-umane tratate cu PMO#1 sau PPMO#1 săptămânal, timp de patru săptămâni, la diferite doze. Procentul de omitere a exonului 51 a fost măsurat din probe de muşchi al diafragmei (stânga) şi de cvadriceps (dreapta), aşa cum a fost determinat prin RT-PCR.
Figura 13 furnizează grafice liniare care arată procentul de omitere a exonului 51 la primatele non-umane tratate cu PMO#1 sau PPMO#1 săptămânal, timp de patru săptămâni, la diferite doze. Procentul de omitere a exonului 51 a fost măsurat din probe de muşchi al inimii (stânga) şi duodenului (dreapta), aşa cum a fost determinat prin RT-PCR.
Figura 14 furnizează grafice liniare care arată procentul de omitere a exonului 51 la primatele non-umane tratate cu PMO#1 sau PPMO#1 săptămânal, timp de patru săptămâni, la diferite doze. Procentul de omitere a exonului 51 a fost măsurat din probe de muşchi al bicepsului (stânga) şi al deltoidului (dreapta), aşa cum a fost determinat prin RT-PCR.
Figura 15 furnizează grafice liniare care arată procentul de omitere a exonului 51 la primatele non-umane tratate cu PMO#1 sau PPMO#1 săptămânal, timp de patru săptămâni, la diferite doze. Procentul de omitere a exonului 51 a fost măsurat din probe de muşchi al esofagului (stânga) şi al aortei (dreapta), aşa cum a fost determinat prin RT-PCR.
Figurile 16A-B (nu fac parte din prezenta invenţie) furnizează imagini reprezentative ale analizei Western Blot care măsoară proteina distrofină în inima şoarecilor mdx trataţi cu PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225), pentru diferite doze: 40 mg/kg, 80 mg/kg şi 120 mg/kg.
Figura 17 (nu face parte din prezenta invenţie) furnizează un grafic cu bare care ilustrează procentul de distrofină de tip sălbatic indus de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în inima şoarecilor mdx, aşa cum este determinat prin analiza Western Blot la 30 de zile după injectare la diferite doze: 40 mg/kg, 80 mg/kg şi 120 mg/kg.
Figurile 18A-B (nu fac parte din prezenta invenţie) furnizează imagini reprezentative ale analizei Western Blot care măsoară proteina distrofină în diafragma şoarecilor mdx trataţi cu PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) pentru diferite doze de 40 mg/kg, 80 mg/kg şi 120 mg/kg.
Figura 19 (nu face parte din prezenta invenţie) furnizează un grafic cu bare care ilustrează procentul de distrofină de tip sălbatic indus de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în diafragma şoarecilor mdx, aşa cum a fost determinat prin analiza Western Blot la 30 de zile după injectare la diferite doze: 40 mg/kg, 80 mg/kg şi 120 mg/kg.
Figurile 20A-B (nu fac parte din prezenta invenţie) furnizează imagini reprezentative ale analizei Western Blot care măsoară proteina distrofină în cvadricepsul şoarecilor mdx trataţi cu PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) la doze diferite: 40 mg/kg, 80 mg/kg şi 120 mg/kg.
Figura 21 (nu face parte din prezenta invenţie) furnizează un grafic cu bare care ilustrează procentul de distrofină de tip sălbatic indus de PMO (PMO4225) sau PPMO (PPMO4225) în cvadricepsul şoarecilor mdx, aşa cum este determinat prin analiza Western Blot, la 30 de zile după injectare la diferite doze: 40 mg/kg, 80 mg/kg şi 120 mg/kg.
Figura 22 furnizează grafice cu bare care arată procentul de omitere a exonului 51 la primatele non-umane tratate cu o singură doză de 40 mg/kg de PPMO#1 la 30 şi 60 de zile după injectare. Procentul de omitere a exonului 51 a fost măsurat din probele musculare ale cvadricepsului, diafragmei, inimii şi tractului gastrointestinal, aşa cum a fost determinat prin RT-PCR.
Figura 23 furnizează ciclurile de cuplare efectuate prin metoda B de sinteză a PMO.
Figura 24 (nu face parte din prezenta invenţie) furnizează o analiză imunohistochimică care arată distrofina şi laminina din diafragma şi inima de şoarece mdx, induse de PPMO (PPMO4225), în comparaţie cu soluţia salină, la şoarecii mdx şi la şoarecii de tip sălbatic.
Figura 25 furnizează un grafic cu bare al procentului de omitere a exonului 51 din mioblastele umane sănătoase, de către PMO#1 şi PPMO#1 la diferite concentraţii, la 96 de ore după tratament, aşa cum este măsurat prin RT-PCR. Barele de eroare ilustrează media ± SD.
Figura 26 furnizează un grafic cu bare al procentului de omitere a exonului 51 în miotuburi umane sănătoase, de către PMO#1 şi PPMO#1 la diferite concentraţii, la 96 de ore după tratament, aşa cum a fost măsurat prin RT-PCR. Barele de eroare ilustrează media ± SD.
DESCRIEREA DETALIATĂ A DEZVĂLUIRII
Variantele de realizare a prezentei dezvăluiri se referă, în general, la conjugaţi de oligomeri antisens îmbunătăţiţi şi la utilizările acestora, care sunt special concepute pentru a induce omiterea exonilor în gena distrofinei umane. Distrofina joacă un rol vital în funcţia musculară, şi diferite boli legate de muşchi sunt caracterizate de forme mutante ale acestei gene. Prin urmare, în anumite variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens îmbunătăţiţi descrişi aici induc omiterea exonilor în formele mutante ale genei distrofinei umane, cum ar fi genele distrofinei mutante găsite în distrofia musculară Duchenne (DMD) şi distrofia musculară Becker (BMD).
Din cauza evenimentelor aberante de îmbinare a ARNm cauzate de mutaţii, aceste gene mutante ale distrofinei umane, fie exprimă proteina distrofină defectuoasă, fie nu exprimă deloc distrofină măsurabilă, o afecţiune care conduce la diferite forme de distrofie musculară. Pentru a remedia această afecţiune, conjugaţii de oligomeri antisens din prezenta dezvăluire hibridizează cu regiuni selectate ale unui ARNm preprocesat al unei gene a distrofinei umane mutante, induc omiterea exonilor şi îmbinarea diferenţiată prin aceea că, altfel, ARNm-ul distrofinei este îmbinat în mod aberant şi, prin urmare, permit celulelor musculare să produce o transcriere ARNm care codifică o proteină distrofină funcţională. În anumite variante de realizare, proteina distrofină rezultată nu este neapărat forma "de tip sălbatic" a distrofinei, ci este mai degrabă o formă trunchiată, dar funcţională, de distrofină.
Prin creşterea nivelurilor de proteină distrofină funcţională în celulele musculare, acestea şi variantele de realizare înrudite sunt utile pentru profilaxia şi tratamentul distrofiei musculare, în special, pentru acele forme de distrofie musculară, cum ar fi DMD şi BMD, care sunt caracterizate prin exprimarea proteinelor distrofină defecte din cauza îmbinării aberant a ARNm-ului. Conjugaţii de oligomeri antisens specifici descrişi aici asigură, în plus, o ţintire specifică îmbunătăţită a exonului distrofină faţă de alţi oligomeri şi, prin urmare, oferă avantaje semnificative şi practice faţă de tratamente alternative ale formelor relevante de distrofie musculară. \tabAstfel, dezvăluirea se referă la conjugaţi de oligomeri antisens cu formula (IV)
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
Situsul de aliniere este H51A(+66+95).
Cu excepţia cazului în care sunt definiţi altfel, toţi termenii tehnici şi ştiinţifici utilizaţi aici au aceeaşi semnificaţie pe care o înţeleg în mod obişnuit specialiştii cu calificare obişnuită în domeniul căruia îi aparţine dezvăluirea. Deşi orice metode şi materiale similare sau echivalente cu cele descrise aici pot fi utilizate la punerea în practică sau la testarea prezentei dezvăluiri, sunt descrise metode şi materiale preferate. În scopul prezentei dezvăluiri, următorii termeni sunt definiţi mai jos.
I. Definiţii
Prin "aproximativ" se înţelege o cantitate, nivel, valoare, număr, frecvenţă, procent, dimensiune, mărime, cantitate, greutate sau lungime, care variază cu până la 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 sau 1% faţă de o cantitate, nivel, valoare, număr, frecvenţă, procent, dimensiune, mărime, cantitate, greutate sau lungime de referinţă.
"Susceptibil de omitere a exonului 51", aşa cum este utilizat aici cu privire la un subiect sau pacient, se intenţionează să includă subiecţi şi pacienţi care au una sau mai multe mutaţii ale genei distrofinei care, în absenţa omiterii exonului 51 al pre-ARNm de distrofină, provoacă cadrul de citire să fie în afara cadrului, perturbând astfel traducerea pre-ARNm ceea ce conduce la incapacitatea subiectului sau pacientului de a produce distrofină funcţională sau semi-funcţională. Exemple de mutaţii ale genei distrofinei care sunt susceptibile de omitere a exonului 51 includ, de exemplu, mutaţii în exonii 45-50, 47-50, 48-50, 49-50, 50, 52 şi 52-63 (baza de date cu mutaţii de distrofie musculară Leiden Duchenne, Centrul Medical al Universităţii din Leiden, Ţările de Jos). Determinarea dacă un pacient are o mutaţie în gena distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonilor este în domeniul de competenţă al unui specialist în domeniu (vezi, de exemplu, Aartsma-Rus şi colab. (2009) Hum Mutat. 30:293-299; Gurvich şi colab., Hum Mutat. 2009; 30(4) 633-640; şi Fletcher şi colab. (2010) Terapie moleculară 18(6) 1218-1223.).
Termenul "oligomer", aşa cum este utilizat aici, se referă la o secvenţă de subunităţi conectate prin legături între subunităţi. În anumite cazuri, termenul "oligomer" este utilizat cu referire la un "oligomer antisens". Pentru "oligomeri antisens", fiecare subunitate constă din: (i) un zahar riboză sau un derivat al acestuia; şi (ii) o nucleobază legată de aceasta, astfel încât ordinea fragmentelor de împerechere de baze să formeze o secvenţă de baze care este complementară cu o secvenţă ţintă dintr-un acid nucleic (de obicei un ARN) prin împerecherea bazelor Watson-Crick, pentru a forma un heteroduplex acid nucleic: oligomer în cadrul secvenţei ţintă, cu condiţia ca, fie subunitatea, legătura între subunităţi, fie ambele să nu apară în mod natural. Oligomerul antisens este un PMO. Variante de realizare suplimentare sunt descrise aici.
Termenii "complementar" şi "complementaritate" se referă la doi sau mai mulţi oligomeri (adică, fiecare cuprinzând o secvenţă de nucleobază) care sunt înrudiţi unul cu celălalt prin regulile de împerechere a bazelor Watson-Crick. De exemplu, secvenţa de nucleobaze "T-G-A (5'→3')" este complementară cu secvenţa de nucleobază "A-C-T (3'→5')". Complementaritatea poate fi "parţială", în care mai puţine decât toate nucleobazele unei anumite secvenţe de nucleobaze sunt potrivite cu cealaltă secvenţă de nucleobaze conform regulilor de împerechere a bazelor. De exemplu, în unele variante de realizare, complementaritatea între o anumită secvenţă de nucleobaze şi cealaltă secvenţă de nucleobază poate fi de aproximativ 70%, aproximativ 75%, aproximativ 80%, aproximativ 85%, aproximativ 90% sau aproximativ 95%. Sau, poate exista complementaritate "completă" sau "perfectă" (100%) între o anumită secvenţă de nucleobază şi cealaltă secvenţă de nucleobază pentru a continua exemplul. Gradul de complementaritate între secvenţele de nucleobaze are efecte semnificative asupra eficienţei şi puterii hibridizării dintre secvenţe.
Termenii "cantitate eficientă" şi "cantitate eficientă terapeutic" sunt utilizaţi în mod interschimbabil aici şi se referă la o cantitate de compus terapeutic, cum ar fi un oligomer antisens, administrat unui subiect mamifer, fie sub forma unei singure doze, fie ca parte a unei serii de doze, care este eficientă pentru a produce efectul terapeutic dorit. Pentru un oligomer antisens, acest efect este produs, de obicei, prin inhibarea traducerii sau a prelucrării naturale prin îmbinare a unei secvenţe ţintă selectate, sau prin producerea unei cantităţi semnificative clinic de distrofină (semnificaţie statistică).
În unele variante de realizare, o cantitate eficientă este de cel puţin 10 mg/kg, sau cel puţin 20 mg/kg de o compoziţie care include un oligomer antisens pentru o perioadă de timp pentru a trata subiectul. În unele variante de realizare, o cantitate eficientă este de cel puţin 20 mg/kg de o compoziţie care include un oligomer antisens pentru a creşte numărul de fibre pozitive pentru distrofină într-un subiect la cel puţin 20% din normal. În anumite variante de realizare, o cantitate eficientă este de 10 mg/kg, sau cel puţin 20 mg/kg de o compoziţie care include un oligomer antisens pentru a stabiliza, menţine sau îmbunătăţi distanţa de mers pe jos de la un deficit de 20%, de exemplu, într-un 6 MWT, la un pacient, în raport cu unul egal sănătos. În diverse variante de realizare, o cantitate eficientă este de la cel puţin 10 mg/kg până la aproximativ 30 mg/kg, cel puţin 20 mg/kg până la aproximativ 30 mg/kg, aproximativ 25 mg/kg până la aproximativ 30 mg/kg sau aproximativ 30 mg/kg până la aproximativ 50 mg/kg. În unele variante de realizare, o cantitate eficientă este de aproximativ 10 mg/kg, aproximativ 20 mg/kg, aproximativ 30 mg/kg sau aproximativ 50 mg/kg. Într-un alt aspect, o cantitate eficientă este de cel puţin aproximativ 10 mg/kg, aproximativ 20 mg/kg, aproximativ 25 mg/kg, aproximativ 30 mg/kg sau aproximativ 30 mg/kg până la aproximativ 50 mg/kg, pentru cel puţin 24 de săptămâni, cel puţin 36 de săptămâni sau cel puţin 48 de săptămâni, pentru a creşte astfel numărul de fibre pozitive pentru distrofină la un subiect la cel puţin 20%, aproximativ 30%, aproximativ 40%, aproximativ 50%, aproximativ 60%, aproximativ 70%, aproximativ 80%, aproximativ 90%, aproximativ 95% din normal, şi stabilizează sau îmbunătăţeşte distanţa de mers pe jos de la un deficit de 20%, de exemplu, într-un 6 MWT, la pacient în raport cu unul egal sănătos. În unele variante de realizare, tratamentul creşte numărul de fibre pozitive pentru distrofină la 20-60% sau 30-50% din cel normal la pacient.
Prin "sporeşte" sau "sporirea", sau "creşte" sau "creştere", sau "stimulează" sau "stimulare", se face referire, în general, la capacitatea unuia sau mai multor conjugaţi de oligomeri antisens sau compoziţii farmaceutice de a produce sau de a provoca un răspuns fiziologic mai mare (adică, efecte în aval) într-o celulă sau într-un subiect, în comparaţie cu răspunsul provocat, fie de lipsa unui conjugat de oligomer antisens, fie de un compus de control. Un răspuns fiziologic mai mare poate include expresia crescută a unei forme funcţionale a unei proteine distrofină, sau o activitate biologică crescută legată de distrofină în ţesutul muscular, printre alte răspunsuri evidente din înţelegerea în domeniu şi din descrierea de aici. Se poate măsura şi creşterea funcţiei musculare, incluzând creşteri sau îmbunătăţiri ale funcţiei musculare cu aproximativ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, sau 100%. Se poate măsura şi procentul de fibre musculare care exprimă o distrofină funcţională, incluzând creşterea expresiei distrofinei în aproximativ 1%, 2%, 5%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, sau 100% din fibrele musculare. De exemplu, a fost arătat că aproximativ 40% din îmbunătăţirea funcţiei musculare poate avea loc dacă 25-30% din fibre exprimă distrofină (vezi, de ex., DelloRusso şi colab., Proc Natl Acad Sci USA 99: 12979-12984, 2002). O cantitate "crescută" sau "sporită" este, de obicei, o cantitate "semnificativă din punct de vedere statistic" şi poate include o creştere care este de 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 sau de mai multe ori (de ex., de 500, 1000 de ori, incluzând toate numerele întregi şi zecimale dintre ele şi peste 1, de ex., 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) cantitatea produsă în lipsa unui conjugat de oligomer antisens (absenţa unui agent) sau de un compus de control.
Aşa cum este utilizat aici, termenii "funcţie" şi "funcţional" şi alţii asemenea se referă la o funcţie biologică, enzimatică sau terapeutică.
O proteină distrofină "funcţională" se referă, în general, la o proteină distrofină care are o activitate biologică suficientă pentru a reduce degradarea progresivă a ţesutului muscular, care este altfel caracteristică distrofiei musculare, de obicei, în comparaţie cu forma modificată sau "defectuoasă" a proteinei distrofină care este prezentă în anumiţi subiecţi cu DMD sau DMO. În anumite variante de realizare, o proteină funcţională distrofină poate avea aproximativ 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau 100% (incluzând toate numerele întregi dintre ele) din activitatea biologică in vitro sau in vivo a distrofinei de tip sălbatic, aşa cum este măsurată conform tehnicilor de rutină din domeniu. Ca un exemplu, activitatea legată de distrofină în culturile musculare in vitro poate fi măsurată în funcţie de dimensiunea miotubului, organizarea miofibrilei (sau dezorganizarea), activitatea contractilă şi gruparea spontană a receptorilor de acetilcolină (vezi, de ex., Brown şi colab., Journal of Cell Science. 112:209-216, 1999). Modelele animale sunt, de asemenea, resurse valoroase pentru studiul patogenezei bolii şi furnizează un mijloc de testare a activităţii legate de distrofină. Două dintre cele mai utilizate modele animale pentru cercetarea DMD sunt şoarecele mdx şi câinele cu distrofie musculară Golden Retriever (GRMD), ambele fiind negative la distrofină (vezi, de ex., Collins & Morgan, Int J Exp Pathol 84: 165-172, 2003). Acestea şi alte modele animale pot fi utilizate pentru a măsura activitatea funcţională a diferitelor proteine distrofină. Sunt incluse formele trunchiate de distrofină, cum ar fi acele forme care sunt produse în urma administrării unora dintre conjugaţii de oligomeri antisens de omitere a exonului din prezenta dezvăluire.
Termenii "nepotrivire" sau "nepotriviri" se referă la una sau mai multe nucleobaze (fie contigue, fie separate) dintr-o secvenţă de nucleobază de oligomer care nu sunt potrivite cu un pre-ARNm ţintă conform regulilor de împerechere a bazelor. În timp ce complementaritatea perfectă este adesea dorită, unele variante de realizare pot include una sau mai multe, dar preferabil 6, 5, 4, 3, 2 sau 1 nepotriviri cu privire la pre-ARNm-ul ţintă. Sunt incluse variaţii în orice locaţie din oligomer. În anumite variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens din dezvăluire includ variaţii ale secvenţei de nucleobaze în apropierea variaţiilor terminale din interior şi, dacă sunt prezente, sunt de obicei în aproximativ 6, 5, 4, 3, 2 sau 1 subunitate a capătului 5' şi/sau 3'.
Termenii "morfolino", "oligomer morfolino" şi "PMO" se referă la un oligomer morfolino fosforodiamidat cu următoarea structură generală:
şi aşa cum este descris în Figura 2 din Summerton, J., şi colab., Antisens & Nucleic Acid Drug Development, 7: 187-195 (1997). Morfolino, aşa cum este descris aici include toţi stereoizomerii şi tautomerii cu structura generală de mai sus. Sinteza, structurile şi caracteristicile de legare ale oligomerilor morfolino sunt detaliate în brevetele U.S. numerele: 5,698,685; 5,217,866; 5,142,047; 5,034,506; 5,166,315; 5,521,063; 5,506,337; 8,076,476; şi 8,299,206.
Morfolino din prezenta invenţie este conjugat la capătul 5' al oligomerului cu un fragment "tail" pentru a creşte stabilitatea şi/sau solubilitatea acestuia. Fragmentul tail are structura:
Fragmentul tail de mai sus este, de asemenea, denumit aici "TEG" sau "EG3".
Aşa cum este utilizat aici, termenii "-G-R6" şi "-G-R6-Ac" sunt utilizaţi interschimbabil şi se referă la un fragment peptidic conjugat cu un oligomer antisens din dezvăluire. În diverse variante de realizare, "G" reprezintă un reziduu de glicină conjugat cu "R6" printr-o legătură amidă, şi fiecare "R" reprezintă un reziduu de arginină conjugat împreună prin legături amidice, astfel încât "R6" înseamnă şase (6) reziduuri de arginină conjugate împreună prin legături amidice. Reziduurile de arginină sunt reziduuri de L-arginină. "-G-R6" sau "-G-R6-Ac" este conjugat cu azotul din ciclul morfolină al subunităţii 3', cea mai morfolinică a unui oligomer antisens PMO din dezvăluire. "-G-R6" sau "-G-R6-Ac" este conjugat la capătul 3' al unui oligomer antisens din dezvăluire şi are următoarea formulă:
sau
Termenii "nucleobază" (Nu), "fragment de împerechere a bazelor" sau "bază" sunt utilizaţi interschimbabil pentru a se referi la o bază purină sau pirimidină găsită în ADN sau ARN existent în mod natural sau "nativ" (de ex., uracil, timină, adenină, citozină şi guanină), precum şi la analogi ai acestor purine şi pirimidine care există în mod natural. Aceşti analogi pot conferi proprietăţi îmbunătăţite pentru oligomer, cum ar fi afinitatea de legare. Analogi exemplificatori includ hipoxantină (componenta de bază a inozinei); 2,6-diaminopurină; 5-metil citozină; pirimidine modificate C5-propinil; şi 10-(9-(aminoetoxi)fenoxazinil) (clemă G).
Expresiile "administrare parenterală" şi "administrat parenteral", aşa cum este utilizat aici, înseamnă alte moduri de administrare decât administrarea enterală şi topică, de obicei, prin injectare, şi includ, fără limitare, injectare sau perfuzie intravenoasă, intramusculară, intraarterială, intratecală, intracapsulară, intraorbitală, intracardiacă, intradermică, intraperitoneală, transtraheală, subcutanată, subcuticulară, intraarticulară, subcapsulară, subarahnoidiană, intraspinală şi intrasternală.
Pentru claritate, structurile din dezvăluire, incluzând, de exemplu, Formula (IV), sunt continue de la 5' până la 3' şi, pentru comoditatea descrierii întregii structuri într-o formă compactă, au fost incluse diverse întreruperi de ilustrare etichetate "RUPTURA A", "RUPTURA B" şi "RUPTURA C". Aşa cum ar fi înţeles de către specialistul în domeniu, de exemplu, fiecare menţionare "RUPTURA A" arată o continuare a ilustrării structurii în acele puncte. Specialistul în domeniu înţelege că acelaşi lucru este valabil pentru fiecare exemplu de "RUPTURA B" şi pentru "RUPTURA C" din structurile de mai sus. Niciuna dintre rupturile ilustraţiei, totuşi, nu este destinată să indice, şi nici un specialist în domeniu nu le-ar înţelege, că înseamnă o întrerupere reală a structurii de mai sus.
Aşa cum este utilizat aici, un set de paranteze utilizate într-o formulă structurală indică faptul că caracteristica structurală dintre paranteze este repetată. În unele variante de realizare, parantezele folosite pot fi "[" şi "]", iar în anumite variante de realizare, parantezele folosite pentru a indica caracteristicile structurale repetate pot fi "(" and ")". În unele variante de realizare, numărul de iteraţii repetate ale caracteristicii structurale dintre paranteze este numărul indicat în afara parantezelor, cum ar fi 2, 3, 4, 5, 6, 7, şi aşa mai departe. În diverse variante de realizare, numărul de iteraţii repetate ale caracteristicii structurale dintre paranteze este indicat printr-o variabilă indicată în afara parantezei, cum ar fi "Z".
Aşa cum este utilizat aici, o legătură dreaptă sau o legătură ondulată desenată la un atom de carbon sau de fosfor chiral într-o formulă structurală indică faptul că stereochimia carbonului sau fosforului chiral este nedefinită şi se intenţionează să includă toate formele centrului chiral. Exemple de astfel de ilustraţii sunt reprezentate mai jos.
Expresia "acceptabil farmaceutic" înseamnă că substanţa sau compoziţia trebuie să fie compatibilă, din punct de vedere chimic şi/sau toxicologic, cu celelalte ingrediente care cuprind o formulare şi/sau cu subiectul care este tratat cu aceasta.
Expresia "purtător acceptabil farmaceutic", aşa cum este utilizată aici, înseamnă un material de umplutură, diluant, material de încapsulare netoxic inert solid, semisolid sau lichid, sau o formulare de auxiliar de orice tip. Câteva exemple de materiale care pot servi ca purtători acceptabili farmaceutic sunt: zaharuri, cum ar fi lactoză, glucoză şi zaharoză; amidon, cum ar fi amidon de porumb şi amidon de cartofi; celuloză şi derivaţii săi, cum ar fi carboximetil celuloza de sodiu, etilceluloza şi acetat de celuloză; tragacant pulverulent; malţ; gelatină; talc; excipienţi, cum ar fi unt de cacao şi ceruri pentru supozitoare; uleiuri, cum ar fi ulei de arahide, ulei de seminţe de bumbac, ulei de şofrănel, ulei de susan, ulei de măsline, ulei de porumb şi ulei de soia; glicoli, cum ar fi propilenglicol; esteri, cum ar fi oleatul de etil şi laurat de etil; agar; agenţi de tamponare, cum ar fi hidroxid de magneziu şi hidroxid de aluminiu; acid alginic; apă apirogenă; soluţie salină izotonică; soluţie Ringer; alcool etilic; soluţii de tampon fosfat; lubrifianţi compatibili netoxici, cum ar fi lauril sulfat de sodiu şi stearat de magneziu; agenţi de colorare; agenţi de eliberare; agenţi de acoperire; agenţi de îndulcire; agenţi de aromatizare; agenţi de parfumare; conservanţi; şi antioxidanţi; în conformitate cu judecata persoanei care formulează.
Termenul "restabilire", cu privire la sinteza sau producerea distrofinei, se referă, în general, la producerea unei proteine distrofină, incluzând forme trunchiate de distrofină, într-un pacient cu distrofie musculară în urma tratamentului cu un conjugat de oligomer antisens descris aici. În unele variante de realizare, tratamentul are ca rezultat o creştere a producţiei noi de distrofină la un pacient cu 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, sau 100% (incluzând toate numerele întregi dintre acestea). În unele variante de realizare, tratamentul creşte numărul de fibre pozitive pentru distrofină în subiect la cel puţin aproximativ 20%, aproximativ 30%, aproximativ 40%, aproximativ 50%, aproximativ 60%, aproximativ 70%, aproximativ 80%, aproximativ 90% sau aproximativ 95% până la 100% din normal. În alte variante de realizare, tratamentul creşte numărul de fibre pozitive pentru distrofină în subiect la aproximativ 20% până la aproximativ 60%, sau aproximativ 30% până la aproximativ 50% din normal. Procentul de fibre pozitive pentru distrofină la un pacient după tratament poate fi determinat printr-o biopsie musculară folosind tehnici cunoscute. De exemplu, o biopsie musculară poate fi luată de la un muşchi adecvat, cum ar fi muşchiul biceps brahial al unui pacient.
Analiza procentului de fibre pozitive pentru distrofină poate fi efectuată înainte de tratament şi/sau după tratament sau la momente de timp pe parcursul tratamentului. În unele variante de realizare, o biopsie după tratament este prelevată de la muşchiul contralateral din care a fost biopsia de înainte de tratament. Analiza expresiei distrofinei înainte şi după tratament poate fi efectuată utilizând orice test adecvat pentru distrofină. În unele variante de realizare, detectarea imunohistochimică este efectuată pe secţiuni de ţesut din biopsia musculară folosind un anticorp care este un marker pentru distrofină, cum ar fi un anticorp monoclonal sau policlonal. De exemplu, poate fi utilizat anticorpul MANDYS106 care este un marker foarte sensibil pentru distrofină. Poate fi utilizat orice anticorp secundar adecvat.
În unele variante de realizare, procentul de fibre pozitive pentru distrofină este calculat prin împărţirea numărului de fibre pozitive la fibrele totale numărate. Probele normale de muşchi au fibre 100% pozitive pentru distrofină. Prin urmare, procentul de fibre pozitive pentru distrofină poate fi exprimat ca procent din normal. Pentru a controla prezenţa unor urme de distrofină în muşchiul de înainte de tratament, precum şi a fibrelor revertante, se poate stabili o linie de referinţă folosind secţiuni de muşchi de înainte de tratament de la un pacient atunci când se numără fibrele pozitive pentru distrofină din muşchi după tratament. Aceasta poate fi folosită ca un prag pentru numărarea fibrelor pozitive pentru distrofină în secţiuni ale muşchilor după tratamentul acelui pacient. În alte variante de realizare, secţiunile de ţesut colorate cu anticorpi pot fi utilizate, de asemenea, pentru cuantificarea distrofinei folosind software-ul de analiză prin imagistică Bioquant (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN). Intensitatea totală a semnalului de fluorescenţă a distrofinei poate fi raportată ca procent din normal. În plus, analiza Western blot cu anticorpi monoclonali sau policlonali anti-distrofină poate fi utilizată pentru a determina procentul de fibre pozitive pentru distrofină. De exemplu, poate fi utilizat anticorpul anti-distrofină NCL-Dys1 de la Leica Biosystems. Procentul de fibre pozitive pentru distrofină poate fi analizat, de asemenea, prin determinarea expresiei componentelor complexului sarcoglican (β,γ) şi/sau NOS neuronal.
În unele variante de realizare, tratamentul cu un conjugat de oligomer antisens din dezvăluire încetineşte sau reduce disfuncţia şi/sau insuficienţa progresivă a muşchilor respiratori la pacienţii cu DMD care ar fi de aşteptat fără tratament. În unele variante de realizare, tratamentul cu un conjugat de oligomer antisens din dezvăluire poate reduce sau elimina nevoia de asistenţă de ventilaţie care ar fi de aşteptat fără tratament. În unele variante de realizare, măsurătorile funcţiei respiratorii pentru urmărirea cursului bolii, precum şi evaluarea potenţialelor intervenţii terapeutice includ presiunea inspiratorie maximă (MIP), presiunea expiratorie maximă (MEP) şi capacitatea vitală forţată (FVC). MIP şi MEP măsoară nivelul de presiune pe care o persoană îl poate genera în timpul inspiraţie şi, respectiv, expiraţiei, şi sunt măsuri sensibile ale forţei muşchilor respiratori. MIP este o măsură a slăbiciunii muşchilor diafragmei.
În unele variante de realizare, MEP poate scădea înainte de modificările din alte teste ale funcţiei pulmonare, incluzând MIP şi FVC. În anumite variante de realizare, MEP poate fi un indicator precoce al disfuncţiei respiratorii. În anumite variante de realizare, FVC poate fi utilizată pentru a măsura volumul total de aer expulzat în timpul expiraţiei forţate după inspiraţia maximă. La pacienţii cu DMD, FVC creşte concomitent cu creşterea fizică până la începutul adolescenţei. Cu toate acestea, pe măsură ce creşterea încetineşte sau este oprită de progresia bolii şi slăbiciunea musculară progresează, capacitatea vitală intră într-o fază descendentă şi scade cu o rată medie de aproximativ 8 până la 8,5% pe an după vârsta de 10 până la 12 ani. În anumite variante de realizare, procentul MIP preconizat (MIP ajustat pentru greutate), procentul MEP preconizat (MEP ajustat pentru vârstă) şi procentul FVC preconizat (FVC ajustat pentru vârstă şi înălţime) sunt analize de susţinere.
Termenii "subiect" şi "pacient", aşa cum este utilizat aici, includ orice animal care prezintă un simptom sau care prezintă riscul de a prezenta un simptom, care poate fi tratat cu un conjugat de oligomer antisens din dezvăluire, cum ar fi un subiect (sau pacient) care are sau prezintă risc de a avea DMD sau DMO sau oricare dintre simptomele asociate cu aceste afecţiuni (de ex., pierderea fibrei musculare). Subiecţii adecvaţi (sau pacienţii) includ animale de laborator (cum ar fi şoarece, şobolan, iepure sau porc de guineea), animale de fermă şi animale domestice sau animale de companie (cum ar fi o pisică sau un câine). Sunt incluse primate non-umane şi, de preferinţă, pacienţi (sau subiecţi) oameni. De asemenea, sunt incluse metode de producere a distrofinei într-un subiect (sau pacient) care are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51.
Expresiile "administrare sistemică", "administrat sistemic", "administrare periferică" şi "administrat periferic", aşa cum este utilizat aici, înseamnă administrarea unui compus, medicament sau alt material, în alt mod decât direct în sistemul nervos central, astfel încât acesta să intre în sistemul pacientului şi, astfel, să fie supus metabolismului şi altor procese similare, de exemplu, administrarea subcutanată.
Expresia "secvenţă de ţintire" se referă la o secvenţă de nucleobaze ale unui oligomer care este complementară cu o secvenţă de nucleotide dintr-un pre-ARNm ţintă. Secvenţa de nucleotide din pre-ARNm ţintă este un situs de aliniere a exonului 51 în pre-ARNm de distrofină, denumit H51A (+66+95).
"Tratamentul" unui subiect (de ex., un mamifer, cum ar fi un om) sau al unei celule este orice tip de intervenţie utilizată în încercarea de a modifica cursul natural al subiectului sau celulei. Tratamentul include, dar nu se limitează la, administrarea unui oligomer sau a unei compoziţii farmaceutice a acestuia, şi poate fi efectuat fie profilactic, fie ulterior iniţierii unui eveniment patologic sau contactului cu un agent etiologic. Tratamentul include orice efect de dorit asupra simptomelor sau patologiei unei boli sau afecţiuni asociate cu proteina distrofină, cum ar fi în anumite forme de distrofie musculară, şi poate include, de exemplu, modificări sau îmbunătăţiri minime ale unuia sau mai multor markeri măsurabili ai bolii sau afecţiunii care este tratată. Sunt incluse, de asemenea, tratamentele "profilactice", care pot fi îndreptate către reducerea ratei de progresie a bolii sau afecţiunii care este tratată, întârzierea apariţiei acelei boli sau afecţiuni, sau reducerea severităţii debutului acesteia. "Tratamentul" sau "profilaxia" nu indică în mod necesar eradicarea completă, vindecarea sau prevenirea bolii sau afecţiunii sau a simptomelor asociate acestora.
În unele variante de realizare, tratamentul cu un conjugat de oligomer antisens din dezvăluire creşte producţia de distrofină nouă, întârzie progresia bolii, încetineşte sau reduce pierderea deambulaţiei, reduce inflamaţia musculară, reduce afectarea musculară, îmbunătăţeşte funcţia musculară, reduce pierderea funcţiei pulmonare şi/sau îmbunătăţeşte regenerarea musculară care ar fi de aşteptat fără tratament. În unele variante de realizare, tratamentul menţine, întârzie sau încetineşte progresia bolii. În unele variante de realizare, tratamentul menţine deambulaţia sau reduce pierderea deambulaţiei. În unele variante de realizare, tratamentul menţine funcţia pulmonară sau reduce pierderea funcţiei pulmonare. În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau creşte o distanţă de mers pe jos stabil la un pacient, aşa cum este măsurată, de exemplu, prin testul de mers pe jos 6 minute (6MWT). În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau reduce timpul de mers/alergare 10 metri (adică, testul de mers/alergare de 10 metri). În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau reduce timpul de şedere în decubit dorsal (adică, timpul de stat la test). În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau reduce timpul de urcare a patru scări standard (adică, testul de urcare pe patru scări). În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau reduce inflamaţia musculară la pacient, aşa cum este măsurată, de exemplu, prin RMN (de ex., RMN al muşchilor picioarelor). În unele variante de realizare, RMN măsoară T2 şi/sau fracţia de grăsime pentru a identifica degenerarea musculară. RMN poate identifica modificări ale structurii şi compoziţiei musculare cauzate de inflamaţie, edem, leziuni musculare şi infiltrarea grăsimilor.
În unele variante de realizare, tratamentul cu un conjugat de oligomer antisens din dezvăluire măreşte producţia de distrofină nouă şi încetineşte sau reduce pierderea deambulaţiei care ar fi de aşteptat fără tratament. De exemplu, tratamentul poate stabiliza, menţine, îmbunătăţi sau creşte deambulaţia (de ex., stabilizarea deambulaţiei) la subiect. În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau creşte o distanţă de mers pe jos stabil la un pacient, aşa cum este măsurată, de exemplu, prin testul de mers pe jos 6 minute (6MWT) descris de McDonald şi colab. (Muscle Nerve, 2010; 42:966-74). O modificare a distanţei parcurse mergând pe jos 6 minute (6MWD) poate fi exprimată ca o valoare absolută, o modificare procentuală sau o modificare a valorii procentuale preconizate. În unele variante de realizare, tratamentul menţine sau îmbunătăţeşte o distanţă de mers pe jos stabil într-un 6MWT de la un deficit de 20% la subiect faţă de unul egal sănătos. Performanţa unui pacient cu DMD în 6MWT în raport cu performanţa tipică a unui egal sănătos poate fi determinată prin calcularea unei valori % preconizate. De exemplu, procentul 6MWD preconizat poate fi calculat folosind următoarea ecuaţie pentru bărbaţi: 196,72 + (39,81 x vârstă) - (1,36 x vârstă2) + (132,28 x înălţimea în metri). Pentru femei, procentul 6MWD preconizat poate fi calculat folosind următoarea ecuaţie: 188,61 + (51,50 x vârstă) - (1,86 x vârstă2) + (86,10 x înălţime în metri) (Henricson şi colab. PLoS Curr., 2012, versiunea 2). În unele variante de realizare, tratamentul cu un oligomer antisens creşte distanţa de mers pe jos stabil la pacient de la valoarea iniţială la mai mult decât 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 sau 50 de metri (incluzând toate numerele întregi dintre ele).
Pierderea funcţiei musculare la pacienţii cu DMD poate apărea pe fondul creşterii şi dezvoltării normale a copilăriei. Într-adevăr, copiii mai mici cu DMD pot prezenta o creştere a distanţei parcurse în timpul 6MWT pe parcursul a aproximativ 1 an, în ciuda deficienţei musculare progresive. În unele variante de realizare, 6MWD la pacienţii cu DMD este comparat cu subiecţii de control în curs de dezvoltare în mod obişnuit şi cu datele normative existente de la subiecţii potriviţi ca vârstă şi sex. În unele variante de realizare, creşterea şi dezvoltarea normală pot fi luate în considerare utilizând o ecuaţie bazată pe vârstă şi înălţime, adaptată la datele normative. O astfel de ecuaţie poate fi utilizată pentru a converti 6MWD într-o valoare preconizată procentual (preconizată în %) la subiecţii cu DMD. În anumite variante de realizare, analiza datelor 6MWD preconizate în % reprezintă o metodă de a ţine cont de creşterea şi dezvoltarea normală, şi poate arăta că câştigurile de funcţie la vârste fragede (de ex., mai mici sau egale cu vârsta de 7 ani) reprezintă mai degrabă stabilitatea decât îmbunătăţirea abilităţilor la pacienţii cu DMD (Henricson şi colab. PLoS Curr., 2012, versiunea 2).
A fost propus şi publicat un sistem de nomenclatură a moleculelor antisens pentru a face distincţia între diferitele molecule antisens (vezi Mann şi colab., (2002) J Gen Med 4, 644-654). Această nomenclatură a devenit deosebit de relevantă la testarea mai multor molecule antisens uşor diferite, toate îndreptate către aceeaşi regiune ţintă, după cum se arată mai jos:
H#A/D(x:y).
Prima literă desemnează specia (de ex., H: om, M: murin, C: canin). "#" desemnează numărul exonului de distrofină ţintă. "A/D" indică locul de îmbinare a acceptorului sau donorului la începutul şi, respectiv, la sfârşitul exonului. (x y) reprezintă coordonatele de aliniere în care "-" sau "+" indică secvenţe intronice sau, respectiv, exonice. De exemplu, A(-6+18) ar indica ultimele 6 baze ale intronului care preced exonul ţintă şi primele 18 baze ale exonului ţintă. Cel mai apropiat situs de îmbinare ar fi acceptorul, astfel încât aceste coordonate ar fi precedate de un "A". Descrierea coordonatelor de aliniere la situsul de îmbinare a donorului ar putea fi D(+2-18), în care ultimele 2 baze exonice şi primele 18 baze intronice corespund situsului de aliniere al moleculei antisens. Coordonatele de aliniere în întregime exonice care ar fi reprezentate de A(+65+85), adică situsul dintre a 65-a şi a 85-a nucleotidă de la începutul acelui exon.
II. Oligomeri antisens
A. Conjugaţi de oligomeri antisens concepuţi pentru a induce omiterea exonului 51
Conjugaţii de oligomeri antisens au Formula (IV) şi sunt complementari unei regiuni ţintă a exonului 51 a genei distrofinei, şi induc omiterea exonului 51. În special, dezvăluirea se referă la conjugaţi de oligomeri antisens complementari unei regiuni ţintă a exonului 51 a pre-ARNm de distrofină desemnată ca un situs de aliniere. Situsul de aliniere este H51A(+66+95).
Oligomerii antisens conjugaţi din dezvăluire ţintesc pre-ARNm de distrofină şi induc omiterea exonului 51, astfel încât acesta este exclus sau omis din transcriptul ARNm matur îmbinat. Prin omiterea exonului 51, cadrul de citire întrerupt este restabilit la o mutaţie în cadru. În timp ce DMD este compus din diferite subtipuri genetice, conjugaţii de oligomeri antisens din dezvăluire au fost concepuţi în mod deosebit pentru a omite exonul 51 al pre-ARNm de distrofină. Mutaţiile DMD susceptibile de omitere a exonului 51 cuprind un subgrup de pacienţi cu DMD (13%).
B. Caracteristici ale chimiei oligomerului
Oligomeri morfolino
Conjugatul de oligomer antisens din prezenta invenţie este conform formulei (IV):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
În unele variante de realizare, un conjugat de oligomer antisens cu Formula (IV) este o sare de HCI (acid clorhidric) a acestuia. În anumite variante de realizare, sarea HCI este o sare de.6HCI.
În unele variante de realizare, incluzând, de exemplu, variante de realizare a conjugaţilor de oligomeri antisens cu Formula (IV), un conjugat de oligomer antisens din dezvăluire este conform Formulei (IVA):
Săruri acceptabile farmaceutic ale conjugaţilor de oligomeri antisens
Anumite variante de realizare a conjugaţilor de oligomeri antisens descrise aici pot să conţină o grupare funcţională bazică, cum ar fi amino sau alchilamino, şi, astfel, sunt capabili să formeze săruri acceptabile farmaceutic cu acizi acceptabili farmaceutic. Termenul "săruri acceptabile farmaceutic" în aceste cazuri, se referă la sărurile de adiţie cu acid anorganic şi organic relativ netoxice ale conjugaţilor de oligomeri antisens din prezenta dezvăluire. Aceste săruri pot fi preparate in situ în vehiculul de administrare sau în procesul de fabricare a formei de dozare, sau prin reacţia separată a unui conjugat de oligomer antisens purificat din dezvăluire în forma sa de bază liberă cu un acid organic sau anorganic adecvat, şi izolarea sării astfel formate în timpul purificării ulterioare. Sărurile reprezentative includ sărurile bromhidrat, clorhidrat, sulfat, bisulfat, fosfat, azotat, acetat, valerat, oleat, palmitat, stearat, laurat, benzoat, lactat, tosilat, citrat, maleat, fumarat, succinat, tartrat, naftilat, mesilat, glucoheptonat, lactobionat şi laurilsulfonat. (Vezi, de ex., Berge şi colab. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1-19).
Sărurile acceptabile farmaceutic ale conjugaţilor de oligomeri antisens includ sărurile convenţionale netoxice sau sărurile de amoniu cuaternar ale conjugaţilor de oligomeri antisens, de ex., din acizi organici sau anorganici netoxici. De exemplu, astfel de săruri netoxice convenţionale le includ pe cele derivate din acizi anorganici, cum ar fi clorhidric, bromhidric, sulfuric, sulfamic, fosforic şi nitric; şi sărurile preparate din acizi organici cum ar fi acetic, propionic, succinic, glicolic, stearic, lactic, malic, tartric, citric, ascorbic, palmitic, maleic, hidroximaleic, fenilacetic, glutamic, benzoic, salicilic, sulfanilic, 2-acetoxibenzoic, fumaric, toluensulfonic, metansulfonic, etan disulfonic, oxalic şi izotionic.
În anumite variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens din prezenta dezvăluire pot să conţină una sau mai multe grupări funcţionale acide şi, astfel, sunt capabili să formeze săruri acceptabile farmaceutic cu baze acceptabile farmaceutic. Termenul "săruri acceptabile farmaceutic" în aceste cazuri, se referă la sărurile de adiţie a bazelor anorganice şi organice relativ netoxice ale conjugaţilor de oligomeri antisens din prezenta dezvăluire. Aceste săruri pot fi, de asemenea, preparate in situ în vehiculul de administrare sau în procesul de fabricare a formei de dozare, sau prin reacţia separată a conjugatului de oligomer antisens purificat în forma sa de acid liber cu o bază adecvată, cum ar fi hidroxidul, carbonatul sau bicarbonatul unui cation metalic acceptabil farmaceutic, cu amoniac sau cu o amină organică primară, secundară sau terţiară acceptabilă farmaceutic. Sărurile alcaline sau alcalino-pământoase reprezentative includ sărurile de litiu, sodiu, potasiu, calciu, magneziu şi aluminiu. Amine organice reprezentative utile pentru formarea sărurilor de adiţie de bază includ etilamină, dietilamină, etilendiamină, etanolamină, dietanolamină şi piperazină. (Vezi, de ex., Berge şi colab., de mai sus).
III. Formulări şi moduri de administrare
În anumite variante de realizare, prezenta dezvăluire furnizează formulări sau compoziţii farmaceutice adecvate pentru furnizarea terapeutică a conjugaţilor de oligomeri antisens, aşa cum este descris aici. Prin urmare, în anumite variante de realizare, prezenta dezvăluire furnizează compoziţii acceptabile farmaceutic care cuprind o cantitate eficientă terapeutic de unu sau mai mulţi dintre conjugaţii de oligomeri antisens descrişi aici, formulaţi împreună cu unu sau mai mulţi purtători (aditivi) şi/sau diluanţi acceptabili farmaceutic. Deşi este posibil ca un conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire să fie administrat singur, este de preferat ca conjugatul de oligomer antisens să se administreze sub forma unei formulări (compoziţii) farmaceutice. Conjugatul de oligomer antisens al formulării este conform Formulei (IV) sau este o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
Metodele de furnizare a moleculelor de acid nucleic, care pot fi aplicabile la conjugaţii de oligomeri antisens din prezenta dezvăluire, sunt descrise, de exemplu, în: Akhtar şi colab., 1992, Trends Cell Bio., 2:139; Delivery Strategies for Antisens Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, CRC Press; şi Sullivan şi colab., PCT WO 94/02595. Acestea şi alte protocoale pot fi utilizate practic pentru furnizarea oricărei molecule de acid nucleic, incluzând conjugaţii de oligomeri antisens din prezenta dezvăluire.
Compoziţiile farmaceutice din prezenta dezvăluire pot fi formulate special pentru administrare în formă solidă sau lichidă, incluzând pe cele adaptate pentru următoarele: (1) administrare orală, de exemplu, băuturi (soluţii sau suspensii apoase sau neapoase), tablete (ţintite pentru absorbţie bucală, sublinguală sau sistemică), bolusuri, pulberi, granule, paste pentru aplicare pe limbă; (2) administrare parenterală, de exemplu, prin injecţie subcutanată, intramusculară, intravenoasă sau epidurală, sub formă de, de exemplu, o soluţie sau suspensie sterilă sau o formulare cu eliberare susţinută; (3) aplicare locală, de exemplu, sub formă de cremă, unguent sau plasture cu eliberare controlată sau spray aplicat pe piele; (4) intravaginal sau intrarectal, de exemplu, sub formă de pesar, cremă sau spumă; (5) sublingual; (6) ocular; (7) transdermic; sau (8) nazal.
Câteva exemple de materiale care pot servi ca purtători acceptabili farmaceutic includ, fără limitare: (1) zaharuri, cum ar fi lactoză, glucoză şi zaharoză; (2) amidon, cum ar fi amidon de porumb şi amidon de cartofi; (3) celuloză şi derivaţii săi, cum ar fi carboximetil celuloză de sodiu, etil celuloză şi acetat de celuloză; (4) praf de tragacant; (5) malţ; (6) gelatină; (7) talc; (8) excipienţi, cum ar fi unt de cacao şi ceară pentru supozitoare; (9) uleiuri, cum ar fi ulei de arahide, ulei de seminţe de bumbac, ulei de şofrănel, ulei de susan, ulei de măsline, ulei de porumb şi ulei de soia; (10) glicoli, cum ar fi propilenglicol; (11) polioli, cum ar fi glicerină, sorbitol, manitol şi polietilen glicol; (12) esteri, cum ar fi oleat de etil şi laurat de etil; (13) agar; (14) agenţi de tamponare, cum ar fi hidroxid de magneziu şi hidroxid de aluminiu; (15) acid alginic; (16) apă apirogenă; (17) ser fiziologic izotonic; (18) Soluţie Ringer; (19) alcool etilic; (20) soluţii tamponate pentru pH; (21) poliesteri, policarbonaţi şi/sau polianhidride; şi (22) alte substanţe compatibile netoxice utilizate în formulările farmaceutice.
Exemple suplimentare nelimitative de agenţi adecvaţi pentru formulare cu conjugaţii de oligomeri antisens din prezenta dezvăluire includ: acizi nucleici conjugaţi cu PEG; acizi nucleici conjugaţi cu fosfolipide; acizi nucleici care conţin fragmente lipofile; fosforotioaţi; inhibitori ai glicoproteinei P (cum ar fi Pluronic P85) care pot îmbunătăţi intrarea medicamentelor în diferite ţesuturi; polimeri biodegradabili, cum ar fi microsfere de poli(D,L-lactidă-coglicolidă) pentru administrare cu eliberare susţinută după implantare (Emerich, D F şi colab., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.; şi nanoparticule încărcate, cum ar fi cele realizate din polibutilcianoacrilat, care pot elibera medicamente prin bariera hematoencefalică şi pot modifica mecanismele de captare neuronală (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999).
Dezvăluirea prezintă, de asemenea, utilizarea compoziţiei care cuprinde lipozomi modificaţi la suprafaţă care conţin lipide poli(etilen glicol) ("PEG") (PEG modificate, ramificate şi neramificate sau combinaţii ale acestora, sau lipozomi de circulaţie lungă sau lipozomi ascunşi). Aceste formulări oferă o metodă de creştere a acumulării de medicamente în ţesuturile ţintă. Această clasă de purtători de medicament rezistă la opsonizare şi eliminare de către sistemul fagocitar mononuclear (MPS sau RES), permiţând astfel timpi mai lungi de circulaţie în sânge şi o expunere sporită a ţesuturilor la medicamentul încapsulat (Lasic şi colab. Chim. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata şi colab., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). A fost arătat că astfel de lipozomi se acumulează selectiv în tumori, probabil prin extravazare şi captare în ţesuturile ţintă neovascularizate (Lasic şi colab., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku şi colab., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Lipozomii de circulaţie lungă îmbunătăţesc farmacocinetica şi farmacodinamia ADN-ului şi ARN-ului, în special, în comparaţie cu lipozomii cationici convenţionali despre care se ştie că se acumulează în ţesuturile MPS (Liu şi colab., J. Biol. Chim. 1995, 42, 24864-24870; Choi şi colab., Publicaţia internaţională PCT Nr. WO 96/10391; Ansell şi colab., Publicaţia internaţională PCT Nr. WO 96/10390; Holland şi colab., Publicaţia internaţională PCT Nr. WO 96/10392). Este, de asemenea, probabil ca lipozomii de circulaţie lungă să protejeze medicamentele faţă de degradarea nucleazei într-o măsură mai mare în comparaţie cu lipozomii cationici, pe baza capacităţii lor de a evita acumularea în ţesuturile MPS agresive din punct de vedere metabolic, cum ar fi ficatul şi splina.
Într-o altă variantă de realizare, prezenta dezvăluire include compoziţii farmaceutice cu conjugaţi de oligomeri antisens preparate pentru furnizare aşa cum este descris în Brevetele U.S. numerele: 6,692,911; 7,163,695; şi 7,070,807. În acest caz, într-o variantă de realizare, prezenta dezvăluire furnizează un conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire într-o compoziţie care cuprinde copolimeri de lizină şi histidină (HK) (aşa cum este descris în brevetele U.S. numerele: 7,163,695; 7,070,807; şi 6,692,911), fie singur, fie în combinaţie cu PEG (de ex., PEG ramificat sau neramificat sau un amestec al ambelor), în combinaţie cu PEG şi un fragment de ţintire, sau oricare dintre cele de mai sus în combinaţie cu un agent de reticulare. În anumite variante de realizare, prezenta dezvăluire furnizează conjugaţi de oligomeri antisens în compoziţii farmaceutice care cuprind polihistidină modificată cu acid gluconic sau polihistidină gluconilată/transferină-polilizină. O persoană de specialitate în domeniu va recunoaşte, de asemenea, că aminoacizii cu proprietăţi similare cu His şi Lys pot fi substituiţi în compoziţie.
În compoziţii pot fi prezenţi, de asemenea, agenţi de umectare, emulgatori şi lubrifianţi (cum ar fi lauril sulfat de sodiu şi stearat de magneziu), agenţi de colorare, agenţi de eliberare, agenţi de acoperire, agenţi de îndulcire, agenţi de aromatizare, agenţi de parfumare, conservanţi şi antioxidanţi.
Exemple de antioxidanţi acceptabili farmaceutic includ: (1) antioxidanţi solubili în apă, cum ar fi acid ascorbic, clorhidrat de cisteină, bisulfat de sodiu, metabisulfit de sodiu şi sulfit de sodiu; (2) antioxidanţi solubili în ulei, cum ar fi palmitat de ascorbil, hidroxianisol butilat (BHA), hidroxitoluen butilat (BHT), lecitină, galat de propil, şi alfa-tocoferol; şi (3) agenţi de chelatare a metalelor, cum ar fi acid citric, acid etilendiamin tetraacetic (EDTA), sorbitol, acid tartric şi acid fosforic.
Formulările din prezenta dezvăluire le includ pe cele adecvate pentru administrare orală, nazală, topică (incluzând bucală şi sublinguală), rectală, vaginală şi/sau parenterală. Formulările pot fi prezentate în mod convenabil în formă de dozare unitară şi pot fi preparate prin orice metode bine cunoscute în domeniul farmaciei. Cantitatea de ingredient activ care poate fi combinată cu un material purtător pentru a produce o formă de dozare unitară va varia în funcţie de subiectul care este tratat şi de modul particular de administrare. Cantitatea de ingredient activ care poate fi combinată cu un material purtător pentru a produce o formă de dozare unitară va fi în general acea cantitate de ingredient activ care produce un efect terapeutic. În general, această cantitate va varia de la aproximativ 0,1 procente până la aproximativ nouăzeci şi nouă procente de ingredient activ, de preferinţă, de la aproximativ 5 procente până la aproximativ 70 procente, cel mai preferabil, de la aproximativ 10 procente până la aproximativ 30 procente.
În anumite variante de realizare, o formulare din prezenta dezvăluire cuprinde un excipient selectat dintre ciclodextrine, celuloze, lipozomi, agenţi formatori de miceliu, de exemplu, acizi biliari, şi purtători polimerici, de exemplu, poliesteri şi polianhidride; şi un conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire. Conjugatul de oligomer antisens din formulare este conform cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. În anumite variante de realizare, o formulare menţionată mai sus face biodisponibil oral un conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire.
Metodele de preparare a acestor formulări sau compoziţii farmaceutice includ etapa de asociere a unui conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire cu purtătorul şi, opţional, cu unu sau mai multe ingrediente accesorii. În general, formulările sunt preparate prin asocierea uniformă şi intimă a unui conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire cu purtători lichizi, sau purtători solizi fin divizaţi, sau cu ambii, şi apoi, dacă este necesar, modelarea produsului.
Formulările din dezvăluire adecvate pentru administrare orală pot fi sub formă de capsule, caşete, pilule, tablete, pastile (folosind o bază aromatizată, de obicei, zaharoză şi salcâm sau tragacant), pulberi, granule, sau sub formă de soluţie sau suspensie într-un lichid apos sau neapos, sau sub formă de emulsie lichidă ulei-în-apă sau apă-în-ulei, sau sub formă de elixir sau sirop, sau sub formă de pastile (folosind o bază inertă, cum ar fi gelatină şi glicerină, sau zaharoză şi salcâm), şi/sau sub formă de apă de gură, fiecare conţinând o cantitate predeterminată de un conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire ca ingredient activ. Un conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire poate fi administrat, de asemenea, sub formă de bolus, lictar sau pastă.
În formele de dozare solide pentru administrare orală din dezvăluire (capsule, tablete, pilule, drajeuri, pulberi, granule, pastile), ingredientul activ poate fi amestecat cu unu sau mai mulţi purtători acceptabili farmaceutic, cum ar fi citrat de sodiu sau fosfat dicalcic şi/sau oricare dintre următoarele: (1) agenţi de umplere sau diluanţi, cum ar fi amidon, lactoză, zaharoză, glucoză, manitol şi/sau acid silicic; (2) lianţi, cum ar fi, de exemplu, carboximetilceluloză, alginaţi, gelatină, polivinil pirolidonă, zaharoză şi/sau acacia; (3) umectanţi, cum ar fi glicerol; (4) agenţi de dezintegrare, cum ar fi agar-agar, carbonat de calciu, amidon de cartofi sau tapioca, acid alginic, anumiţi silicaţi şi carbonat de sodiu; (5) agenţi de întârziere a soluţiei, cum ar fi parafină; (6) acceleratori de absorbţie, cum ar fi compuşi de amoniu cuaternar şi surfactanţi, cum ar fi poloxamer şi lauril sulfat de sodiu; (7) agenţi de umectare, cum ar fi, de exemplu, alcool cetilic, monostearat de glicerol şi surfactanţi neionici; (8) absorbanţi, cum ar fi caolin şi argilă bentonită; (9) lubrifianţi, cum ar fi talc, stearat de calciu, stearat de magneziu, polietilen glicoli solizi, lauril sulfat de sodiu, stearat de zinc, stearat de sodiu, acid stearic, şi amestecuri ale acestora; (10) agenţi de colorare; şi (11) agenţi de eliberare controlată, cum ar fi crospovidonă sau etil celuloză. În cazul capsulelor, tabletelor şi pilulelor, compoziţiile farmaceutice pot să conţină, de asemenea, agenţi de tamponare. Compoziţiile farmaceutice solide de un tip similar pot fi, de asemenea, folosite ca umpluturi în capsule de gelatină moi şi cu înveliş tare utilizând excipienţi, cum ar fi lactoză sau zaharuri din lapte, precum şi polietilenglicoli cu greutate moleculară mare.
O tabletă poate fi realizată prin comprimare sau turnare, opţional, cu unu sau mai multe ingrediente accesorii. Tabletele comprimate pot fi preparate folosind liant (de ex., gelatină sau hidroxipropilmetil celuloză), lubrifiant, diluant inert, conservant, dezintegrant (de ex., amidon glicolat de sodiu sau carboximetil celuloză de sodiu reticulat), agent activ de suprafaţă sau de dispersare. Tabletele turnate pot fi realizate prin turnare într-o maşină adecvată a unui amestec de compus sub formă de pulbere umezit cu un diluant lichid inert.
Tabletele şi alte forme de dozare solide ale compoziţiilor farmaceutice din prezenta dezvăluire, cum ar fi drajeurile, capsulele, pilulele şi granulele, pot fi opţional marcate sau preparate cu acoperiri şi învelişuri, cum ar fi acoperiri enterice şi alte acoperiri bine cunoscute în domeniul formulărilor farmaceutice. Ele pot fi, de asemenea, formulate astfel încât să asigure eliberarea lentă sau controlată a ingredientului activ din acestea utilizând, de exemplu, hidroxipropilmetil celuloză în proporţii variabile pentru a furniza profilul de eliberare dorit, alte matrice polimerice, lipozomi şi/sau microsfere. Ele pot fi formulate pentru eliberare rapidă, de exemplu, liofilizate. Acestea pot fi sterilizate, de exemplu, prin filtrare printr-un filtru de reţinere a bacteriilor sau prin încorporarea agenţilor de sterilizare sub formă de compoziţii farmaceutice solide sterile care pot fi dizolvate în apă sterilă sau în alt mediu injectabil steril imediat înainte de utilizare. Aceste compoziţii farmaceutice pot să conţină, de asemenea, opţional, agenţi de opacizare şi pot avea o compoziţie care eliberează numai ingredientul (ingredientele) activ, sau preferenţial, într-o anumită porţiune a tractului gastrointestinal, opţional, într-o manieră întârziată. Exemple de compoziţii de înglobare care pot fi utilizate includ substanţe polimerice şi ceruri. Ingredientul activ poate fi, de asemenea, sub formă micro-încapsulată, dacă este cazul, cu unu sau mai mulţi dintre excipienţii descrişi mai sus.
Formele de dozare lichide pentru administrare orală a conjugaţilor de oligomeri antisens din dezvăluire includ emulsii, microemulsii, soluţii, suspensii, siropuri şi elixiruri acceptabile farmaceutic. În plus faţă de ingredientul activ, formele de dozare lichide pot să conţină diluanţi inerţi utilizaţi în mod obişnuit în domeniu, cum ar fi, de exemplu, apă sau alţi solvenţi, agenţi de solubilizare şi emulgatori, cum ar fi alcool etilic, alcool izopropilic, carbonat de etil, acetat de etil, alcool benzilic, benzoat de benzil, propilen glicol, 1,3-butilen glicol, uleiuri (în special, uleiuri de seminţe de bumbac, arahide, porumb, germeni, măsline, ricin şi susan), glicerol, alcool tetrahidrofurilic, polietilen glicoli şi esteri ai acizilor graşi ai sorbitanului, şi amestecuri ale acestora.
Pe lângă diluanţii inerţi, compoziţiile farmaceutice orale pot include, de asemenea, adjuvanţi, cum ar fi agenţi de umectare, agenţi de emulsionare şi de suspendare, agenţi de îndulcire, aromatizare, colorare, parfumare şi conservanţi.
Suspensiile, în plus faţă de compuşii activi, pot să conţină agenţi de suspendare, cum ar fi, de exemplu, alcooli izostearilici etoxilaţi, polioxietilen sorbitol şi esteri de sorbitan, celuloză microcristalină, metahidroxid de aluminiu, bentonită, agar-agar şi tragacant, şi amestecuri ale acestora.
Formulările pentru administrare rectală sau vaginală pot fi prezentate sub formă de supozitor, care poate fi preparat prin amestecarea unuia sau mai multor compuşi din dezvăluire cu unu sau mai mulţi excipienţi sau purtători neiritanţi adecvaţi, care cuprind, de exemplu, unt de cacao, polietilen glicol, o ceară pentru supozitoare sau un salicilat, şi care este solid la temperatura camerei, dar lichid la temperatura corpului şi, prin urmare, se va topi în rect sau în cavitatea vaginală şi va elibera compusul activ.
Formulările sau formele de dozare pentru administrare topică sau transdermică a unui oligomer, aşa cum este furnizat aici, includ pulberi, spray-uri, unguente, paste, creme, loţiuni, geluri, soluţii, plasturi şi inhalanţi. Conjugaţii de oligomeri activi pot fi amestecaţi în condiţii sterile cu un purtător acceptabil farmaceutic şi cu orice conservanţi, soluţii tampon sau propulsori care pot fi necesari. Unguentele, pastele, cremele şi gelurile pot să conţină, în plus faţă de un compus activ din această dezvăluire, excipienţi, cum ar fi grăsimi animale şi vegetale, uleiuri, ceară, parafine, amidon, tragacant, derivaţi de celuloză, polietilen glicoli, siliconi, bentonite, acid silicic, talc şi oxid de zinc, sau amestecuri ale acestora.
Pulberile şi spray-urile pot să conţină, în plus faţă de un conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire, excipienţi, cum ar fi lactoză, talc, acid silicic, hidroxid de aluminiu, silicaţi de calciu şi pulbere de poliamidă, sau amestecuri ale acestor substanţe. Spray-urile pot să conţină suplimentar propulsori obişnuiţi, cum ar fi clorofluorohidrocarburi şi hidrocarburi volatile nesubstituite, cum ar fi butan şi propan.
Plasturii transdermici au avantajul suplimentar de a asigura eliberarea controlată în organism a unui conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire. Astfel de forme de dozare pot fi realizate prin dizolvarea sau dispersarea oligomerului în mediul adecvat. Amplificatorii de absorbţie pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru a creşte fluxul de agent prin piele. Viteza unui astfel de flux poate fi controlată, printre alte metode cunoscute în domeniu, fie prin furnizarea unei membrane de control al vitezei, fie prin dispersarea agentului într-o matrice polimerică sau gel.
Compoziţiile farmaceutice adecvate pentru administrare parenterală pot cuprinde unu sau mai mulţi oligomeri conjugaţi din dezvăluire în combinaţie cu una sau mai multe soluţii, dispersii, suspensii sau emulsii apoase sau neapoase sterile izotonice acceptabile farmaceutic sau pulberi sterile care pot fi reconstituite în soluţii injectabile sterile sau în dispersii chiar înainte de utilizare, care pot să conţină zaharuri, alcooli, antioxidanţi, tampoane, bacteriostatice, substanţe dizolvate care fac formularea izotonică cu sângele beneficiarului, sau agenţi de suspendare sau de îngroşare. Exemple de purtători apoşi şi neapoşi adecvaţi care pot fi folosiţi în compoziţiile farmaceutice din dezvăluire includ apă, etanol, polioli (cum ar fi glicerol, propilen glicol şi polietilen glicol) şi amestecuri adecvate ale acestora, uleiuri vegetale, cum ar fi uleiul de măsline, şi esteri organici injectabili, cum ar fi oleatul de etil. Fluiditatea adecvată poate fi menţinută, de exemplu, prin utilizarea materialelor de acoperire, cum ar fi lecitina, prin menţinerea dimensiunii necesare a particulelor în cazul dispersiilor şi prin utilizarea surfactanţilor. Conjugatul de oligomer antisens din compoziţia farmaceutică este conform cu Formula (IV) sau este o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
Aceste compoziţii farmaceutice pot să conţină, de asemenea, adjuvanţi, cum ar fi conservanţi, agenţi de umectare, agenţi de emulsionare şi agenţi de dispersare. Prevenirea acţiunii microorganismelor asupra conjugaţilor de oligomeri aflaţi în discuţie poate fi asigurată prin includerea diverşilor agenţi antibacterieni şi antifungici, de exemplu, paraben, clorbutanol şi acid fenol sorbic. De asemenea, poate fi de dorit să se includă în compoziţii agenţi izotonici, cum ar fi zaharuri, şi clorură de sodiu. În plus, absorbţia prelungită a formei farmaceutice injectabile poate fi realizată prin includerea de agenţi care întârzie absorbţia, cum ar fi monostearat de aluminiu şi gelatină.
În unele cazuri, pentru a prelungi efectul unui medicament, este de dorit să fie încetinită absorbţia medicamentului injectat subcutanat sau intramuscular. Acest lucru poate fi realizat, printre alte metode cunoscute în domeniu, prin utilizarea unei suspensii lichide de material cristalin sau amorf care are o solubilitate slabă în apă. Viteza de absorbţie a medicamentului depinde apoi de viteza sa de dizolvare care, la rândul său, poate depinde de dimensiunea cristalului şi de forma cristalină. În mod alternativ, absorbţia întârziată a unei forme de medicament administrate parenteral este realizată prin dizolvarea sau suspendarea medicamentului într-un vehicul uleios.
Formele de depozit injectabile pot fi realizate prin formarea matricelor de microcapsule ale conjugaţilor de oligomeri aflaţi în discuţie în polimeri biodegradabili, cum ar fi polilactidă-poliglicolidă. În funcţie de raportul dintre oligomer şi polimer şi de natura polimerului particular utilizat, viteza de eliberare a oligomerului poate fi controlată. Exemple de alţi polimeri biodegradabili includ poli(ortoesteri) şi poli(anhidride). Formulările de depozit injectabile pot fi preparate, de asemenea, prin captarea medicamentului în lipozomi sau microemulsii care sunt compatibile cu ţesuturile corpului.
Atunci când conjugaţii de oligomeri antisens din prezenta dezvăluire sunt administraţi sub formă de produse farmaceutice la oameni şi animale, ei pot fi administraţi per se sau sub forma unei compoziţii farmaceutice care conţine, de exemplu, 0,1 până la 99% (mai preferabil, 10 până la 30%) de conjugat de oligomer antisens în combinaţie cu un purtător acceptabil farmaceutic.
Formulările sau preparatele din prezenta dezvăluire pot fi administrate oral, parenteral, topic sau rectal. Ele sunt administrate, de obicei, în forme adecvate pentru fiecare cale de administrare. De exemplu, ele sunt administrate sub formă de tablete sau capsule, prin injecţie, inhalare, loţiune pentru ochi, unguent, supozitor sau perfuzie; topic prin loţiune sau unguent; sau rectal prin supozitoare.
Indiferent de calea de administrare aleasă, conjugaţii de oligomeri antisens din prezenta dezvăluire, care pot fi utilizaţi într-o formă hidratată adecvată, şi/sau compoziţiile farmaceutice din prezenta dezvăluire, pot fi formulate în forme de dozare acceptabile farmaceutic prin metode convenţionale cunoscute specialiştilor în domeniu. Nivelurile reale de dozare ale ingredientelor active din compoziţiile farmaceutice din această dezvăluire pot fi variate astfel încât să se obţină o cantitate de ingredient activ care este eficientă pentru a obţine răspunsul terapeutic dorit pentru un anumit pacient, compoziţie şi mod de administrare, fără a fi inacceptabil de toxice pentru pacient.
Nivelul de dozare selectat va depinde de o varietate de factori, incluzând activitatea conjugatului de oligomer antisens particular din prezenta dezvăluire utilizat sau a esterului, a sării sau a amidei acestuia, calea de administrare, timpul de administrare, viteza de excreţie sau metabolismul oligomerului particular utilizat, viteza şi gradul de absorbţie, durata tratamentului, alte medicamente, compuşi şi/sau materiale utilizate în combinaţie cu oligomerul particular utilizat, vârsta, sexul, greutatea, afecţiunea, starea generală de sănătate şi antecedentele medicale ale pacientului tratat, şi factori similari bine cunoscuţi în domeniul medical.
Un medic sau un medic veterinar cu o calificare obişnuită în domeniu poate determina şi prescrie cu uşurinţă cantitatea eficientă de compoziţie farmaceutică necesară. De exemplu, medicul sau medicul veterinar ar putea începe cu doze de conjugaţi de oligomeri antisens din dezvăluire folosiţi în compoziţia farmaceutică la niveluri mai mici decât cele necesare pentru a obţine efectul terapeutic dorit, şi să crească treptat doza până la obţinerea efectului dorit. În general, o doză zilnică adecvată de conjugat de oligomer antisens din dezvăluire va fi acea cantitate de conjugat de oligomer antisens care este cea mai mică doză eficientă pentru a produce un efect terapeutic. O astfel de doză eficientă va depinde, în general, de factorii descrişi aici. În general, dozele orale, intravenoase, intracerebroventriculare şi subcutanate de conjugaţi de oligomeri antisens din această dezvăluire pentru un pacient, atunci când sunt utilizate pentru efectele indicate, vor varia de la aproximativ 0,0001 până la aproximativ 100 mg la fiecare kilogram de greutate corporală pe zi.
În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens din prezenta dezvăluire sunt administraţi în doze, în general, de la aproximativ 10-160 mg/kg sau 20-160 mg/kg. În unele cazuri, pot fi necesare doze mai mari decât 160 mg/kg. În unele variante de realizare, dozele pentru administrare i.v. sunt de la aproximativ 0,5 mg până la 160 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi în doze de aproximativ 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg sau 10 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi în doze de aproximativ 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 18 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg 50 mg/kg, 51 mg/kg, 52 mg/kg, 53 mg/kg, 54 mg/kg, 55 mg/kg, 56 mg/kg, 57 mg/kg, 58 mg/kg, 59 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 105 mg/kg, 110 mg/kg, 115 mg/kg, 120 mg/kg, 125 mg/kg, 130 mg/kg, 135 mg/kg, 140 mg/kg, 145 mg/kg, 150 mg/kg, 155 mg/kg, 160 mg/kg, incluzând toate numerele întregi dintre ele. În unele variante de realizare, oligomerul este administrat la 10 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul este administrat la 20 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul este administrat la 30 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul este administrat la 40 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul este administrat la 60 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul este administrat la 80 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul este administrat la 160 mg/kg. În unele variante de realizare, oligomerul este administrat la 50 mg/kg.
În unele variante de realizare, conjugatul de oligomer antisens cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat în doze, în general, de la aproximativ 10-160 mg/kg sau 20-160 mg/kg. În unele variante de realizare, dozele de conjugat de oligomer antisens cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia pentru administrare i.v. sunt de la aproximativ 0,5 mg până la 160 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul de oligomer antisens cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat în doze de aproximativ 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg sau 10 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul de oligomer antisens cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat în doze de aproximativ 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 18 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg 50 mg/kg, 51 mg/kg, 52 mg/kg, 53 mg/kg, 54 mg/kg, 55 mg/kg, 56 mg/kg, 57 mg/kg, 58 mg/kg, 59 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 105 mg/kg, 110 mg/kg, 115 mg/kg, 120 mg/kg, 125 mg/kg, 130 mg/kg, 135 mg/kg, 140 mg/kg, 145 mg/kg, 150 mg/kg, 155 mg/kg, 160 mg/kg, incluzând toate numerele întregi dintre ele. În unele variante de realizare, conjugatul de oligomer antisens cu Formula (IVI) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 10 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul de oligomer antisens cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 20 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul de oligomer antisens cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 30 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul de oligomer antisens cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 40 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul de oligomer antisens cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 60 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul de oligomer antisens cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 80 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul de oligomer antisens cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 160 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugatul de oligomer antisens cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia este administrat la 50 mg/kg.
Dacă se doreşte, doza zilnică eficientă de compus activ poate fi administrată ca două, trei, patru, cinci, şase sau mai multe subdoze administrate separat la intervale adecvate pe parcursul zilei, opţional, în forme de dozare unitară. În anumite situaţii, doza este de o administrare pe zi. În anumite variante de realizare, dozarea este de una sau mai multe administrări la fiecare 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 zile sau la fiecare 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 săptămâni sau la fiecare 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 luni, după cum este necesar, pentru a menţine expresia dorită a unei proteine distrofină funcţională. În anumite variante de realizare, dozarea este cu una sau mai multe administrări o dată la două săptămâni. În unele variante de realizare, dozarea este o administrare o dată la două săptămâni. În diverse variante de realizare, dozarea este una sau mai multe administrări în fiecare lună. În anumite variante de realizare, dozarea este o administrare în fiecare lună.
În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi săptămânal la 10 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi săptămânal la 20 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi săptămânal la 30 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi săptămânal la 40 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi săptămânal la 60 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi săptămânal la 80 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi săptămânal la 100 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi săptămânal la 160 mg/kg. Aşa cum este utilizat aici, săptămânal este înţeles ca care are semnificaţia acceptată în domeniu de fiecare săptămână.
În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la două săptămâni la 10 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la două săptămâni la 20 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la două săptămâni la 30 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la două săptămâni la 40 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la două săptămâni la 60 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la două săptămâni la 80 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la două săptămâni la 100 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la două săptămâni la 160 mg/kg. Aşa cum este utilizat aici, la două săptămâni este înţeles ca are semnificaţia acceptată în domeniu: la fiecare două săptămâni.
În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la fiecare trei săptămâni la 10 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la fiecare trei săptămâni la 20 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la fiecare trei săptămâni la 30 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la fiecare trei săptămâni la 40 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la fiecare trei săptămâni la 60 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la fiecare trei săptămâni la 80 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la fiecare trei săptămâni la 100 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi la fiecare trei săptămâni la 160 mg/kg. Aşa cum este utilizat aici, se înţelege că fiecare trei săptămâni are semnificaţia acceptată în domeniu de o dată la trei săptămâni.
În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi lunar la 10 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi lunar la 20 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi lunar la 30 mg/kg. În diverse variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi lunar la 40 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi lunar la 60 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi lunar la 80 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi lunar la 100 mg/kg. În unele variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi lunar la 160 mg/kg. Aşa cum este utilizat aici, lunar este înţeles ca care are semnificaţia acceptată în domeniu de în fiecare lună.
După cum s-ar înţelege în domeniu, administrările săptămânale, la două săptămâni, la fiecare a treia săptămână sau lunare pot fi în una sau mai multe administrări sau subdoze aşa cum a fost discutat aici.
Moleculele de acid nucleic şi conjugaţii de oligomeri antisens descrise aici pot fi administrate la celule printr-o varietate de metode cunoscute celor familiari cu domeniul, incluzând, dar fără limitare la, încapsularea în lipozomi, prin iontoforeză sau prin încorporare în alte vehicule, cum ar fi hidrogeluri, ciclodextrine, nanocapsule biodegradabile şi microsfere bioadezive, aşa cum sunt descrise aici şi cunoscute în domeniu. În anumite variante de realizare, tehnologia de microemulsionare poate fi utilizată pentru a îmbunătăţi biodisponibilitatea agenţilor farmaceutici lipofili (insolubili în apă). Exemplele includ trimetrină (Dordunoo, S. K., şi colab., Drug Development and Industrial Pharmacy, 17(12), 1685-1713, 1991) şi REV 5901 (Sheen, P. C., şi colab., J Pharm Sci 80(7), 712-714, 1991). Printre alte beneficii, microemulsifierea asigură o biodisponibilitate îmbunătăţită prin absorbţia direcţionată preferenţial către sistemul limfatic în locul sistemului circulator, care ocoleşte astfel ficatul şi previne distrugerea compuşilor în circulaţia hepatobiliară.
Într-un aspect al dezvăluirii, formulările conţin micelii formaţi dintr-un oligomer aşa cum este furnizat aici, şi cel puţin un purtător amfifil, în care miceliile au un diametru mediu mai mic decât aproximativ 100 nm. Variantele de realizare mai preferate furnizează micelii care au un diametru mediu mai mic decât aproximativ 50 nm, şi variantele de realizare chiar mai preferate furnizează micelii care au un diametru mediu mai mic decât aproximativ 30 nm, sau chiar mai mic decât aproximativ 20 nm.
Deşi sunt luaţi în considerare toţi purtătorii amfifilii adecvaţi, purtătorii preferaţi în prezent sunt, în general, cei care au statutul General Recunoscut ca Sigur (Generally-Recognized-as-Safe) (GRAS) şi care pot, atât să solubilizeze un conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire, cât şi să îl microemulsioneze într-o etapă ulterioară când soluţia intră în contact cu o fază apoasă a complexului (cum ar fi cea găsită în tractul gastro-intestinal uman). De obicei, ingredientele amfifile care satisfac aceste cerinţe au valori HLB (echilibru hidrofil până la lipofil) de 2-20, şi structurile lor conţin radicali alifatici cu catenă liniară în intervalul C-6 până la C-20. Exemple sunt gliceridele grase polietilenglicolizate şi polietilenglicolii.
Exemple de purtători amfifilii includ gliceridele acizilor graşi polietilenglicolizaţi saturate şi mononesaturate, cum ar fi cele obţinute din diferite uleiuri vegetale complet sau parţial hidrogenate. Astfel de uleiuri pot consta în mod avantajos din acizi graşi tri-, di- şi mono-gliceride şi esteri di- şi mono-poli(etilen glicol) ai acizilor graşi corespunzători, cu o compoziţie de acizi graşi preferată în mod deosebit incluzând acid capric 4-10%, acid capric 3-9%, acid lauric 40-50%, acid miristic 14-24%, acid palmitic 4-14% şi acid stearic 5-15%. O altă clasă utilă de purtători amfifilii include sorbitanul şi/sau sorbitolul parţial esterificat, cu acizi graşi saturaţi sau mono-nesaturaţi (seria SPAN) sau analogii etoxilaţi corespunzători (seria TWEEN).
Purtătorii amfifili disponibili comercial pot fi deosebit de utili, incluzând seria Gelucire, Labrafil, Labrasol sau Lauroglicol (toate fabricate şi distribuite de Gattefosse Corporation, Saint Priest, Franţa), PEG-mono-oleat, PEG-di-oleat, PEG-mono-laurat şi di-laurat, Lecitina, Polisorbat 80, etc. (produse şi distribuite în SUA şi în întreaga lume de către o serie de companii).
În anumite variante de realizare, furnizarea poate avea loc prin utilizarea de lipozomi, nanocapsule, microparticule, microsfere, particule lipidice şi vezicule, pentru introducerea compoziţiilor farmaceutice din prezenta dezvăluire în celule gazdă adecvate. În special, compoziţiile farmaceutice din prezenta dezvăluire pot fi formulate pentru furnizare, fie încapsulate într-o particulă lipidică, un lipozom, o veziculă, o nanosferă, o nanoparticulă, fie prin altele asemenea. Formularea şi utilizarea unor astfel de vehicule de furnizare pot fi efectuate folosind tehnici cunoscute şi convenţionale.
Polimerii hidrofili adecvaţi pentru utilizare în prezenta dezvăluire sunt cei care sunt uşor solubili în apă, pot fi ataşaţi covalent la o lipidă care formează vezicule, şi cei care sunt toleraţi in vivo fără efecte toxice (adică sunt biocompatibili). Polimerii adecvaţi includ poli(etilen glicol) (PEG), acid polilactic (denumit, de asemenea, polilactidă), acid poliglicolic (denumit, de asemenea, poliglicolidă), un copolimer acid polilactic-poliglicolic şi alcool polivinilic. În anumite variante de realizare, polimerii au o greutate moleculară medie de la aproximativ 100 sau 120 daltoni până la aproximativ 5000 sau 10000 daltoni, sau de la aproximativ 300 daltoni până la aproximativ 5000 daltoni. În alte variante de realizare, polimerul este poli(etilen glicol) care are o greutate moleculară medie de la aproximativ 100 până la aproximativ 5000 daltoni sau care are o greutate moleculară medie de la aproximativ 300 până la aproximativ 5000 daltoni. În anumite variante de realizare, polimerul este un poli(etilen glicol) care are o greutate moleculară medie de aproximativ 750 daltoni, de exemplu, PEG(750). Polimerii pot fi definiţi, de asemenea, prin numărul de monomeri din ei; o variantă de realizare preferată a prezentei dezvăluiri utilizează polimeri care au cel puţin aproximativ trei monomeri, astfel de polimeri PEG constând din trei monomeri care au o greutate moleculară de aproximativ 132 daltoni.
Alţi polimeri hidrofili care pot fi adecvaţi pentru utilizare în prezenta dezvăluire includ polivinilpirolidonă, polimetoxazolină, polietiloxazolină, polihidroxipropil metacrilamidă, polimetacrilamidă, polidimetilacrilamidă, şi celuloze derivatizate, cum ar fi hidroximetilceluloză sau hidroxietilceluloză.
În anumite variante de realizare, o formulare din prezenta dezvăluire cuprinde un polimer biocompatibil selectat din grupul constând din poliamide, policarbonaţi, polialchilene, polimeri de esteri acrilici şi metacrilici, polimeri polivinilici, poliglicolide, polisiloxani, poliuretani şi copolimeri ai acestora, celuloze, polipropilenă, polietilene, polistiren, polimeri de acid lactic şi acid glicolic, polianhidride, poli(orto)esteri, poli(acid butic), poli(acid valeric), poli(lactidă-co-caprolactonă), polizaharide, proteine, acizi polihialuronici, policianoacrilaţi, şi amestecuri intime, amestecuri sau copolimeri ai acestora.
Ciclodextrinele sunt oligozaharide ciclice, formate din 6, 7 sau 8 unităţi de glucoză, indicate prin litera greacă α, β, sau, respectiv, γ. Unităţile de glucoză sunt legate prin legături α-1,4-glucozidice. Ca o consecinţă a conformaţiei în formă de scaun a unităţilor de zahar, toate grupările hidroxil secundare (la C-2, C-3) sunt situate pe o parte a ciclului, în timp ce toate grupările hidroxil primare la C-6 sunt situate pe cealaltă latură. Ca urmare, feţele externe sunt hidrofile, făcând ciclodextrinele solubile în apă. În schimb, cavităţile ciclodextrinelor sunt hidrofobe, deoarece sunt căptuşite cu hidrogenul atomilor C-3 şi C-5, şi cu oxigenii asemănători cu eterul. Aceste matrice permit complexarea cu o varietate de compuşi relativ hidrofobi, incluzând, de exemplu, compuşi steroizi, cum ar fi 17α-estradiol (vezi, de ex., van Uden şi colab. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 38:1-3-113 (1994)). Complexarea are loc prin interacţiuni Van der Waals şi prin formarea legăturilor de hidrogen. Pentru o revedere generală a chimiei ciclodextrinelor, vezi, Wenz, Agnew. Chim. Int. Ed. Engl., 33:803-822 (1994).
Proprietăţile fizico-chimice ale derivaţilor de ciclodextrină depind puternic de tipul şi gradul de substituţie. De exemplu, solubilitatea lor în apă variază de la insolubil (de ex., triacetil-beta-ciclodextrină) până la 147% solubil (g/v) (G-2-beta-ciclodextrină). În plus, sunt solubili în mulţi solvenţi organici. Proprietăţile ciclodextrinelor permit controlul asupra solubilităţii diferitelor componente ale formulării prin creşterea sau scăderea solubilităţii acestora.
Au fost descrise numeroase ciclodextrine şi metode de preparare a acestora. De exemplu, Parmeter (I), şi colab. (brevetul U.S. Nr. 3,453,259) şi Gramera şi colab. (Brevetul U.S. Nr. 3,459,731) au descris ciclodextrine electroneutre. Alţi derivaţi includ ciclodextrine cu proprietăţi cationice [Parmeter (II), Brevetul U.S. Nr. 3,453,257], ciclodextrine reticulate insolubile (Solms, Brevetul U.S. Nr. 3,420,788), şi ciclodextrine cu proprietăţi anionice [Parmeter (III), Brevetul U.S. Nr. 3,426,011]. Dintre derivaţii de ciclodextrină cu proprietăţi anionice, acizii carboxilici, acizii fosforici, acizii fosfinoşi, acizii fosfonici, acizii fosforici, acizii tiofosfonici, acizii tiosulfinici şi acizii sulfonici au fost ataşaţi la ciclodextrina părinte [vezi, Parmetrul (III), supra]. Mai mult, derivaţii de ciclodextrină sulfoalchil eter au fost descrişi de Stella, şi colab. (Brevetul U.S. Nr. 5,134,127).
Lipozomii constau din cel puţin o membrană cu două straturi lipidice care cuprinde un compartiment intern apos. Lipozomii pot fi caracterizaţi prin tipul membranei şi prin dimensiune. Veziculele mici unilamelare (SUV) au o singură membrană şi, de obicei, variază între 0,02 şi 0,05 µm în diametru; veziculele mari unilamelare (LUVS) sunt de obicei mai mari decât 0,05 µm. Veziculele mari oligolamelare şi veziculele multilamelare au straturi de membrană multiple, de obicei, concentrice, şi sunt de obicei mai mari de 0,1 µm. Lipozomii cu mai multe membrane neconcentrice, adică câteva vezicule mai mici conţinute într-o veziculă mai mare, sunt denumiţi vezicule multiveziculare.
Un aspect al prezentei dezvăluiri se referă la formulări care cuprind lipozomi care conţin un conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire, în care membrana lipozomului este formulată pentru a furniza un lipozom cu capacitate de transport crescută. În mod alternativ sau suplimentar, conjugatul de oligomer antisens din prezenta dezvăluire poate fi conţinut în, sau adsorbit pe, stratul dublu de lipozom al lipozomului. Un conjugat de oligomer antisens din prezenta dezvăluire poate fi agregat cu un surfactant lipidic şi este transportat în spaţiul intern al lipozomului; în aceste cazuri, membrana lipozomală este formulată pentru a rezista la efectele perturbatoare ale agregatului agent activ-surfactant.
Conform unei variante de realizare a prezentei dezvăluiri, stratul dublu lipidic al unui lipozom conţine lipide derivate cu poli(etilen glicol) (PEG), astfel încât lanţurile PEG se extind de la suprafaţa interioară a stratului dublu lipidic în spaţiul interior încapsulat de lipozom şi se extind din exteriorul stratului dublu lipidic în mediul înconjurător.
Agenţii activi conţinuţi în lipozomii din prezenta dezvăluire sunt sub formă solubilizată. Agregatele de surfactant şi agent activ (cum ar fi emulsii sau micelii care conţin agentul activ de interes) pot fi prinse în spaţiul interior al lipozomilor conform prezentei dezvăluiri. Un surfactant acţionează pentru a dispersa şi solubiliza agentul activ şi poate fi selectat dintre orice surfactant alifatic, cicloalifatic sau aromatic adecvat, incluzând, dar fără limitare la, lizofosfatidilcoline (LPG-uri) biocompatibile cu lungimi de lanţ variabile (de ex., de la aproximativ C14 până la aproximativ C20). Lipidele derivate din polimer, cum ar fi lipidele PEG, pot fi, de asemenea, utilizate pentru formarea miceliilor, deoarece acestea vor acţiona pentru a inhiba fuziunea miceliu/membrană, şi deoarece adăugarea unui polimer la moleculele de surfactant scade CMC a surfactantului şi ajută la formarea miceliilor. Sunt preferaţi surfactanţii cu CMO în intervalul micromolar; surfactanţii cu CMC mai mare pot fi utilizaţi pentru a prepara micelii prinşi în lipozomii din prezenta dezvăluire.
Lipozomii conform prezentei dezvăluiri pot fi preparaţi prin oricare dintre o varietate de tehnici care sunt cunoscute în domeniu. Vezi, de ex., brevetul U.S. Nr. 4,235,871; cererea PCT publicată WO 96/14057; New RRC, Lipozomi: O abordare practică, IRL Press, Oxford (1990), paginile 33-104; şi Lasic DD, Liposomes from physics to applications, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1993. De exemplu, lipozomii din prezenta dezvăluire pot fi preparaţi prin difuzarea unei lipide derivatizate cu un polimer hidrofil în lipozomi preformaţi, cum ar fi prin expunerea lipozomilor preformaţi la micelii formaţi din polimeri grefaţi cu lipide, la concentraţii de lipide corespunzătoare procentului molar final al lipidei derivatizate care este dorită în lipozom. Lipozomii care conţin un polimer hidrofil pot fi formaţi, de asemenea, prin tehnici de omogenizare, hidratare în câmp lipidic sau extrudare, aşa cum este cunoscut în domeniu.
Într-o altă procedură exemplificatoare de formulare, agentul activ este mai întâi dispersat prin sonicare într-o lizofosfatidilcolină sau într-un alt surfactant cu CMC scăzut (incluzând lipide grefate cu polimer) care solubilizează uşor moleculele hidrofobe. Suspensia micelară de agent activ rezultată este apoi utilizată pentru a rehidrata o probă de lipide uscată care conţine un procent molar adecvat de lipide grefate cu polimer sau de colesterol. Suspensia de lipide şi agent activ este apoi transformată în lipozomi utilizând tehnici de extrudare, aşa cum este cunoscut în domeniu, şi lipozomii rezultaţi sunt separaţi din soluţia neîncapsulată prin separare pe coloană standard.
Într-un aspect al prezentei dezvăluiri, lipozomii sunt preparaţi astfel încât să aibă dimensiuni substanţial omogene într-un interval de dimensiuni selectat. O metodă eficientă de dimensionare implică extrudarea unei suspensii apoase de lipozomi printr-o serie de membrane de policarbonat care au o dimensiune a porilor uniformă selectată; dimensiunea porilor membranei va corespunde aproximativ cu cele mai mari dimensiuni ale lipozomilor produşi prin extrudare prin acea membrană. Vezi, de ex., brevetul U.S. Nr. 4,737,323 (Apr. 12, 1988). În anumite variante de realizare, reactivi, cum ar fi DharmaFECT® şi Lipofectamine® pot fi utilizaţi pentru a introduce polinucleotide sau proteine în celule.
Caracteristicile de eliberare ale unei formulări din prezenta dezvăluire depind de materialul de încapsulare, de concentraţia medicamentului încapsulat şi de prezenţa modificatorilor de eliberare. De exemplu, eliberarea poate fi manipulată pentru a fi dependentă de pH, de exemplu, folosind o acoperire sensibilă la pH care eliberează numai la un pH scăzut, cum ar fi în stomac, sau la un pH mai mare, cum ar fi în intestin. Un înveliş enteric poate fi utilizat pentru a preveni eliberarea până după trecerea prin stomac. Mai multe acoperiri sau amestecuri de cianamidă încapsulate în diferite materiale pot fi utilizate pentru a obţine o eliberare iniţială în stomac, urmată de o eliberare ulterioară în intestin. Eliberarea poate fi, de asemenea, manipulată prin includerea de săruri sau agenţi de formare a porilor, care pot creşte absorbţia de apă sau eliberarea medicamentului prin difuzie din capsulă. Excipienţii care modifică solubilitatea medicamentului pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru a controla viteza de eliberare. Agenţii care sporesc degradarea matricei sau eliberarea din matrice pot fi de asemenea încorporaţi. Aceştia pot fi adăugaţi la medicament, pot fi adăugaţi ca o fază separată (adică, sub formă de particule) sau pot fi dizolvaţi împreună în faza de polimer în funcţie de compus. În cele mai multe cazuri, cantitatea ar trebui să fie între 0,1 şi 30 procente (g/g de polimer). Tipurile de amplificatori de degradare includ săruri anorganice, cum ar fi sulfatul de amoniu şi clorura de amoniu, acizi organici, cum ar fi acidul citric, acidul benzoic şi acidul ascorbic, baze anorganice, cum ar fi carbonatul de sodiu, carbonatul de potasiu, carbonatul de calciu, carbonatul de zinc şi hidroxidul de zinc, şi baze organice, cum ar fi sulfatul de protamină, spermina, colina, etanolamina, dietanolamina si trietanolamina, şi surfactanţi, cum ar fi Tween® şi Pluronic®. Agenţii de formare a porilor care adaugă microstructură matricelor (adică compuşi solubili în apă, cum ar fi săruri anorganice şi zaharuri) sunt adăugaţi sub formă de particule. Intervalul este de obicei între unu şi treizeci procente (g/g de polimer).
Absorbţia poate fi, de asemenea, manipulată prin modificarea timpului de rezidenţă a particulelor în intestin. Acest lucru poate fi realizat, de exemplu, prin acoperirea particulei cu, sau selectând ca material de încapsulare, un polimer adeziv pentru mucoase. Exemplele includ majoritatea polimerilor cu grupări carboxil libere, cum ar fi chitosan, celuloze şi, în special, poliacrilaţi (aşa cum este utilizat aici, poliacrilaţii se referă la polimeri care includ grupări acrilat şi grupări acrilat modificate, cum ar fi cianoacrilaţi şi metacrilaţi).
Un conjugat de oligomer antisens poate fi formulat astfel încât să fie conţinut în, sau, să fie adaptat pentru eliberare printr-un dispozitiv sau implant chirurgical sau medical. În anumite aspecte, un implant poate fi acoperit sau tratat în alt mod cu un conjugat de oligomer antisens. De exemplu, hidrogelurile sau alţi polimeri, cum ar fi polimerii biocompatibili şi/sau biodegradabili, pot fi utilizate pentru a acoperi un implant cu compoziţiile farmaceutice din prezenta dezvăluire (adică, compoziţia poate fi adaptată pentru utilizare cu un dispozitiv medical prin utilizarea unui hidrogel sau alt polimer). Polimerii şi copolimerii pentru acoperirea dispozitivelor medicale cu un agent sunt bine cunoscuţi în domeniu. Exemple de implanturi includ, dar nu se limitează la, stenturi, stenturi cu eliberare de medicamente, suturi, proteze, catetere vasculare, catetere de dializă, grefe vasculare, valve cardiace protetice, stimulatoare cardiace, defibrilatoare cardioverter implantabile, ace IV, dispozitive pentru fixarea şi formarea oaselor, cum ar fi ştifturi, şuruburi, plăci şi alte dispozitive şi matrice de ţesut artificial pentru vindecarea rănilor.
În plus faţă de metodele furnizate aici, conjugaţii de oligomeri antisens pentru utilizare conform dezvăluirii pot fi formulaţi pentru administrare în orice mod convenabil pentru utilizare în medicina umană sau veterinară, prin analogie cu alte produse farmaceutice. Conjugaţii de oligomeri antisens şi formulările lor corespunzătoare pot fi administrate singure sau în combinaţie cu alte strategii terapeutice, pentru tratamentul distrofiei musculare, cum ar fi transplantul de mioblast, terapiile cu celule stem, administrarea de antibiotice aminoglicozide, inhibitori de proteazom şi terapii de reglare în sens crescător (de ex., reglarea în sens crescător a utrofinei, un paralog autozomal al distrofinei).
În unele variante de realizare, agentul terapeutic suplimentar poate fi administrat înainte, concomitent sau ulterior administrării conjugatului de oligomer antisens din prezenta dezvăluire. De exemplu, conjugaţii de oligomeri antisens pot fi administraţi în combinaţie cu un steroid şi/sau antibiotic. În anumite variante de realizare, conjugaţii de oligomeri antisens sunt administraţi unui pacient care se află în terapie de fond cu steroizi (de ex., terapie de fond intermitentă sau cronică/continuă cu steroizi). De exemplu, în unele variante de realizare pacientul a fost tratat cu un corticosteroid înainte de administrarea unui oligomer antisens şi continuă să primească terapia cu steroizi. În unele variante de realizare, steroidul este glucocorticoid sau prednison.
Căile de administrare descrise sunt destinate doar ca un ghid, deoarece un medic calificat va fi capabil să determine cu uşurinţă calea optimă de administrare şi orice doză pentru orice animal şi afecţiune particulare. Au fost încercate abordări multiple pentru introducerea de material genetic funcţional nou în celule, atât in vitro, cât şi in vivo (Friedmann (1989) Science, 244:1275-1280). Aceste abordări includ integrarea genei care urmează să fie exprimată în retrovirusuri modificate (Friedmann (1989) de mai sus; Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S-5079S); integrarea în vectori non-retroviruşi (de ex., vectori virali adeno-asociaţi) (Rosenfeld şi colab. (1992) Cell, 68:143-155; Rosenfeld şi colab. (1991) Science, 252:431-434); sau furnizarea unei transgene legată la un element promotor-amplificator heterolog prin lipozomi (Friedmann (1989), de mai sus; Brigham şi colab. (1989) Am. J. Med. Sci., 298:278-281; Nabel şi colab. (1990) Science, 249:1285-1288; Hazinski, şi colab. (1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209; şi Wang şi Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (SUA), 84:7851-7855); cuplaţi la sisteme de transport bazate pe cationi specifice ligandului (Wu şi Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624) sau utilizarea vectorilor de expresie a ADN-ului liber (Nabel şi colab. (1990), de mai sus; Wolff şi colab. (1990) Science, 247:1465-1468). Injectarea directă a transgenelor în ţesut produce doar expresie localizată (Rosenfeld (1992) de mai sus; Rosenfeld şi colab. (1991) de mai sus; Brigham şi colab. (1989) de mai sus; Nabel (1990) de mai sus; şi Hazinski şi colab. (1991) de mai sus). Grupul Brigham şi colab. (Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278-281 şi Clinical Research (1991) 39 (rezumat)) a raportat transfecţia in vivo numai a plămânilor de şoareci după administrarea, fie intravenoasă, fie intratraheală a unui complex de lipozomi ADN. Un exemplu de articol de revizuire a procedurilor de terapie genică umană este: Anderson, Science (1992) 256:808-813.
Într-o altă variantă de realizare, compoziţiile farmaceutice din dezvăluire pot cuprinde suplimentar un carbohidrat aşa cum este prevăzut în Han şi colab., Nat. Comms. 7, 10981 (2016). În unele variante de realizare, compoziţiile farmaceutice din dezvăluire pot cuprinde 5% de un carbohidrat de hexoză. De exemplu, compoziţia farmaceutică din dezvăluire poate cuprinde 5% glucoză, 5% fructoză sau 5% manoză. În anumite variante de realizare, compoziţiile farmaceutice din dezvăluire pot să conţină 2,5% glucoză şi 2,5% fructoză. În unele variante de realizare, compoziţiile farmaceutice din dezvăluire pot cuprinde un carbohidrat selectat dintre: arabinoză prezentă într-o cantitate de 5% din volum, glucoză prezentă într-o cantitate de 5% din volum, sorbitol prezent într-o cantitate de 5% din volum, galactoză prezentă în cantitate de 5% din volum, fructoză prezentă în cantitate de 5% din volum, xilitol prezent în cantitate de 5% din volum, manoză prezentă în cantitate de 5% din volum, o combinaţie de glucoză şi fructoză, fiecare prezentă într-o cantitate de 2,5% din volum, şi o combinaţie de glucoză prezentă în cantitate de 5,7% din volum, fructoză prezentă în cantitate de 2,86% din volum, şi xilitol prezent într-o cantitate de 1,4% din volum.
IV. Utilizări
Restabilirea cadrului de citire a distrofinei folosind omiterea exonului
O abordare potenţial terapeutică a tratamentului DMD cauzat de mutaţii în afara cadrului genei distrofinei este sugerată de forma mai uşoară de distrofinopatie cunoscută cu denumirea de BMD, care este cauzată de mutaţii în cadru. Capacitatea de a transforma o mutaţie din afara cadrului într-o mutaţie în cadru ar păstra, ipotetic, cadrul de citire a ARNm-ului şi ar produce o proteină distrofină scurtată intern, dar funcţională. Conjugaţii de oligomeri antisens din dezvăluire au fost concepuţi pentru a realiza acest lucru.
Hibridizarea PMO cu secvenţa pre-ARNm ţintită interferează cu formarea complexului de îmbinare pre-ARNm şi şterge exonul 51 din ARNm matur. Structura şi conformaţia conjugaţilor de oligomeri antisens din dezvăluire permit împerecherea bazelor specifice secvenţei cu secvenţa complementară. Prin mecanism similar, eteplirsenul, de exemplu, care este un PMO care a fost conceput pentru a omite exonul 51 al pre-ARNm de distrofină, permite împerecherea bazelor specifice secvenţei cu secvenţa complementară conţinută în exonul 51 al pre-ARNm de distrofină.
ARNm de distrofină normală care conţine toţi cei 79 de exoni va produce proteina normală de distrofină. Graficul din Fig. 1 ilustrează o mică secţiune a pre-ARNm de distrofină şi ARNm matur, de la exonul 47 până la exonul 53. Forma fiecărui exon ilustrează modul în care codonii sunt împărţiţi între exoni; este de remarcat că un codon este format din trei nucleotide. Exonii de formă dreptunghiulară încep şi se termină cu codoni compleţi. Exonii în formă de săgeată încep cu un codon complet, dar se termină cu un codon divizat, care conţine doar nucleotida #1 a codonului. Nucleotidele #2 şi #3 ale acestui codon sunt conţinute în exonul următor, care va începe cu o formă de zig-zag.
ARNm de distrofină cu lipsă de exoni întregi din gena distrofinei conduce, în mod obişnuit, la DMD. Graficul din Fig. 2 ilustrează un tip de mutaţie genetică (ştergerea exonului 50) despre care se ştie că are ca rezultat DMD. Deoarece exonul 49 se termină într-un codon complet şi exonul 51 începe cu a doua nucleotidă a unui codon, cadrul de citire după exonul 49 este deplasat, rezultând un cadru de citire ARNm în afara cadrului şi încorporarea de aminoacizi incorecţi în aval de mutaţie. Absenţa ulterioară a unui domeniu funcţional de legare a distroglicanului C-terminal are ca rezultat producerea unei proteine distrofină instabilă.
Eteplirsen omite exonul 51 pentru a restabili cadrul de citire a ARNm. Deoarece exonul 49 se termină într-un codon complet, iar exonul 52 începe cu prima nucleotidă a unui codon, ştergerea exonului 51 restabileşte cadrul de citire, ducând la producerea unei proteine distrofină scurtată intern cu un situs de legare a distroglicanului intact, similar cu o mutaţia BMD "în cadru" (Fig. 3).
Fezabilitatea ameliorării fenotipului DMD utilizând omiterea exonului pentru a restabili cadrul deschis de citire a ARNm al distrofinei este susţinută de cercetările nonclinice. Numeroase studii pe modele animale distrofice cu DMD au arătat că restabilirea distrofinei prin omiterea exonului conduce la îmbunătăţiri fiabile ale forţei şi funcţiei musculare (Sharp 2011; Yokota 2009; Wu 2008; Wu 2011; Barton-Davis 1999; Goyenvalle 2004; Gregore 2004; Yue 2006; Welch 2007; Kawano 2008; Reay 2008; van Putten 2012). Un exemplu convingător în acest sens vine dintr-un studiu în care nivelurile de distrofină în urma terapiei cu omiterea exonilor (folosind o PMO) au fost comparate cu funcţia musculară din acelaşi ţesut. La şoarecii mdx distrofici, muşchii tibial anterior (TA) trataţi cu un PMO specific pentru şoarece şi-au menţinut ~ 75% din capacitatea lor maximă de forţă după contracţiile care induc stres, în timp ce muşchii TA contralaterali netrataţi au menţinut doar ~ 25% din capacitatea lor maximă de forţă (p <0,05) (Sharp 2011). Într-un alt studiu, 3 câini CXMD distrofici au primit, la vârsta de 2-5 luni, terapie de excludere a exonului folosind un PMO specific pentru mutaţia lor genetică, o dată pe săptămână timp de 5 până la 7 săptămâni sau la două săptămâni timp de 22 de săptămâni. În urma terapiei cu omiterea exonilor, toţi cei 3 câini au demonstrat o expresie extinsă, la nivelul întregului corp, a distrofinei în muşchii scheletici, precum şi o ambulaţie menţinută sau îmbunătăţită (test de alergare de 15 m), faţă de valoarea iniţială. Spre deosebire de aceasta, câini CXMD netrataţi potriviţi ca vârstă au prezentat o scădere marcată a deplasării pe parcursul studiului (Yokota 2009).
A fost arătat că PMO-urile au mai multă activitate de omitere a exonului la concentraţii echimolare decât fosforotioaţii, atât la şoarecii mdx, cât şi la modelul de şoarece DMD umanizat (hDMD), care exprimă întreaga transcriere a DMD umană (Heemskirk 2009). Experimente in vitro care utilizează reacţia în lanţ a polimerazei cu transcripţie inversă (RT-PCR) şi Western blot (WB) în celule musculare scheletice umane normale sau celule musculare de la pacienţi cu DMD cu diferite mutaţii susceptibile de omitere a exonului 51, au identificat că eteplirsen (un PMO) este un inductor puternic al omiterii exonului 51. Omiterea exonului 51 indusă de eteplirsen a fost confirmată in vivo în modelul de şoarece hDMD (Arechavala-Gomeza 2007).
Rezultatele clinice pentru analizarea efectului unui conjugat de oligomer antisens care este complementar unei regiuni ţintă a exonului 51 a pre-ARNm de distrofină umană şi induce omiterea exonului 51, includ procente de fibre pozitive pentru distrofină (PDPF), test de mers pe jos şase minute (6MWT), pierderea ambulaţiei (LOA), Evaluarea Ambulatorie North Star (NSAA), teste ale funcţiei pulmonare (PFT), capacitatea de a se ridica (din decubit dorsal) fără sprijin din exterior, producţia de distrofină de novo, şi alte măsuri funcţionale.
În unele variante de realizare, prezenta dezvăluire furnizează conjugaţi de oligomeri antisens ca mai sus, şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în producerea distrofinei la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51. În anumite variante de realizare, prezenta dezvăluire furnizează conjugaţi de oligomeri antisens ca mai sus, şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în restabilirea unui cadru de citire a ARNm pentru a induce producţia de proteine distrofină la un subiect cu distrofie musculară Duchenne (DMD) care are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51. Producţia de proteine poate fi măsurată prin reacţia în lanţ a polimerazei cu transcripţie inversă (RT-PCR), analiză Western blot sau imunohistochimie (IHC).
În unele variante de realizare, prezenta dezvăluire furnizează conjugaţi de oligomeri antisens ca mai sus, şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în tratarea DMD la un subiect care are nevoie de aceasta, în care subiectul are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51. În diverse variante de realizare, tratamentul subiectului este măsurat prin întârzierea progresiei bolii. În unele variante de realizare, tratamentul subiectului este măsurat prin menţinerea deambulaţiei la subiect sau prin reducerea pierderii deambulaţiei la subiect. În unele variante de realizare, deambulaţia este măsurată utilizând testul de mers pe jos 6 minute (6MWT). În anumite variante de realizare, deambulaţia este măsurată utilizând Evaluarea Ambulatorie North Start (NSAA).
În diverse variante de realizare, prezenta dezvăluire furnizează conjugaţi de oligomeri antisens ca mai sus, şi compoziţii ale acestora pentru utilizare în menţinerea funcţiei pulmonare sau reducerea pierderii funcţiei pulmonare la un subiect cu DMD, în care subiectul are o mutaţie a genei DMD care este susceptibilă de omitere a exonului 51. În unele variante de realizare, funcţia pulmonară este măsurată ca presiune maximă expiratorie (MEP). În anumite variante de realizare, funcţia pulmonară este măsurată ca presiune maximă inspiratorie (MIP). În unele variante de realizare, funcţia pulmonară este măsurată ca Capacitate Vitală Forţată (FVC).
Într-o altă variantă de realizare, compoziţiile farmaceutice din dezvăluire pot fi administrate concomitent cu un carbohidrat în metodele din dezvăluire, fie în aceeaşi formulare, fie este o formulare separată, aşa cum este prevăzut în Han şi colab., Nat. Comms. 7, 10981 (2016). În unele variante de realizare, compoziţiile farmaceutice din dezvăluire pot fi administrate concomitent cu 5% de un carbohidrat de hexoză. De exemplu, compoziţiile farmaceutice din dezvăluire pot fi administrate concomitent cu 5% glucoză, 5% fructoză sau 5% manoză. În anumite variante de realizare, compoziţiile farmaceutice din dezvăluire pot fi administrate concomitent cu 2,5% glucoză şi 2,5% fructoză. În unele variante de realizare, compoziţia farmaceutică din dezvăluire poate fi administrată concomitent cu un carbohidrat selectat dintre: arabinoză prezentă într-o cantitate de 5% din volum, glucoză prezentă într-o cantitate de 5% din volum, sorbitol prezent într-o cantitate de 5% din volum, galactoză prezentă în cantitate de 5% din volum, fructoză prezentă în cantitate de 5% din volum, xilitol prezent în cantitate de 5% din volum, manoză prezentă în cantitate de 5% din volum, o combinaţie de glucoză şi fructoză prezente fiecare într-o cantitate de 2,5% din volum, şi o combinaţie de glucoză prezentă în cantitate de 5,7% din volum, fructoză prezentă într-o cantitate de 2,86% din volum şi xilitol prezent într-o cantitate de 1,4% din volum.
În diverse variante de realizare, un conjugat de oligomer antisens din dezvăluire este administrat concomitent cu o cantitate eficientă terapeutic de un compus antiinflamator nesteroidian. În unele variante de realizare, compusul antiinflamator nesteroidian este un inhibitor de NF-kB. De exemplu, în unele variante de realizare, inhibitorul de NF-kB poate fi CAT-1004 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. În diverse variante de realizare, inhibitorul de NF-kB poate fi un conjugat de salicilat şi DHA. În unele variante de realizare, inhibitorul de NF-kB este CAT-1041 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. În anumite variante de realizare, inhibitorul de NF-kB este un conjugat de salicilat şi EPA. În diverse variante de realizare, inhibitorul de NF-kB este
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
În unele variante de realizare, compusul antiinflamator nesteroidian este un inhibitor de TGF-b. De exemplu, în anumite variante de realizare, inhibitorul de TGF-b este HT-100.
În anumite variante de realizare, este descris un conjugat de oligomer antisens aşa cum este descris aici, pentru utilizare în terapie.
V. Kituri
Dezvăluirea furnizează, de asemenea, kituri pentru tratamentul unui pacient cu o boală genetică, kit care cuprinde cel puţin un conjugat de oligomer antisens ca mai sus, ambalat într-un recipient adecvat împreună cu instrucţiuni de utilizare. Kiturile pot să conţină, de asemenea, reactivi externi, cum ar fi tampoane, stabilizatori, etc. Persoanele cu calificare obişnuită în domeniu ar trebui să înţeleagă că aplicările metodei de mai sus au o largă aplicaţie pentru identificarea moleculelor antisens adecvate pentru utilizare în tratamentul multor alte boli. Kitul cuprinde un conjugat de oligomer antisens conform cu Formula (IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
Exemple Materiale şi metode
Condiţii de tratament pentru culturi de celule şi ţesuturi
Miocitele umane diferenţiate (ZenBio, Inc.) au fost utilizate pentru a măsura omiterea exonilor. Mai exact, mioblaste (ZenBio, Inc., SKB-F) au fost crescute la confluenţă de 80-90%, la 37 °C şi 5% CO2 în medii de creştere (SKB-M; ZenBio, Inc.). Diferenţierea a fost iniţiată prin înlocuirea mediului de creştere cu medii de diferenţiere (SKM-D; ZenBio, Inc.). Pentru a analiza omiterea exonului 51, 1×104 celule diferenţiate au fost placate pe o placă cu 24 de godeuri şi 1 mL de mediu de diferenţiere (SKM-D; ZenBio, Inc.) care conţine diferite concentraţii de PMO, sau a fost adăugat PPMO la fiecare godeu, şi au fost incubate timp de 96 de ore.
Analiza Western Blot
Pentru analiza Western blot, ţesutul a fost omogenizat cu tampon de omogenizare (4% SDS, 4M uree, 125 mM tris-HCl (pH 6,8)) într-un raport de 9 la 18 x 20 µm de secţiuni de ţesut la aproximativ 5 mm în diametru, în 133 µL de tampon. Lizatul corespunzător a fost colectat şi supus cuantificării proteinei utilizând kitul de testare a proteinelor RC DC conform instrucţiunilor producătorului (BioRad Cat. 500-0122). Probele de extract de ţesut au fost diluate 1:10 folosind tampon de omogenizare pentru a se încadra în intervalul curbei standard BSA. Probele au fost preparate astfel încât 35 µl de probă să conţină cantitatea dorită de proteină, folosind 25 µl de lizat de proteine, 7 µl tampon de probă NuPAGE LDS (Life Technologies Cat. NP0008, Carlsbad, California, SUA) şi 3 µl de agent de reducere NuPAGE (10×) (Life Technologies Cat. NP0004). După încălzirea probelor de proteine timp de 5 minute la 95 °C, probele au fost centrifugate, şi supernatantul a fost încărcat pe un gel de tris-acetat de poliacrilamidă mini 3-8% NuPAGE Novex cu 10 godeuri de 1 mm (Life Technologies Cat. EA0375) la maximum de 50 µg încărcătură proteică totală pe bandă. Gelul a fost prelucrat la 150 volţi la temperatura camerei până când partea frontală a colorantului s-a îndepărtat de gel. Gelurile proteice rezultate au fost transferate pe membrane PVDF (Life Technologies Cat. LC2007) timp de 75 de minute la temperatura camerei cu 30 volţi folosind tampon de transfer NuPAGE (Life Technologies NP006-1), 10% metanol şi 0,1% antioxidant NuPAGE (Life Technologies NP0005).
După transferul proteinei, membranele PVDF au fost scufundate în tampon TTBS (IX TBS (Amresco Cat. J640-4L), 0,1% (v/v) tween-20). Membranele au fost transferate în tampon de blocare (5% (g/v) lapte praf fără grăsimi (Lab Scientific Cat. M0841) în TTBS) şi au fost înmuiate peste noapte la 4 °C cu balansare uşoară. După blocare, membranele au fost incubate, fie timp de 60 de minute la temperatura camerei în DYS1 (Leica Cat. NCL-DYS1) diluat 1:20 folosind tampon de blocare, fie timp de 20 de minute la temperatura camerei în anticorp anti-α-actinină (Sigma-Aldrich Cat. NA931V) diluat 1:100000 cu tampon de blocare, urmată de şase spălări (cinci minute fiecare cu TTBS). IgG anti-şoarece conjugată cu peroxidază de hrean (GE Healthcare Cat. NA931V) a fost diluată 1:40000 folosind tampon de blocare şi a fost adăugată la membrane timp de 45 de minute (DYS1) sau timp de 15 minute (α-actinină), urmată din nou de şase spălări. Folosind kitul ECL Prime Western Detection (GE Healthcare Cat. RPN2232), filmul a fost expus la gel şi a fost developat în consecinţă. Filmul developat a fost scanat şi analizat folosind software-ul ImageQuant TL Plus (versiunea 8.1) şi analiza de regresie liniară a fost efectuată folosind software-ul Graphpad.
Fiecare gel Western blot include o curbă standard de distrofină cu 4 sau 5 puncte, preparată folosind proteina totală extrasă din ţesut normal (cvadriceps, diafragmă sau inimă de şoarece) diluată la, de exemplu, 64%, 16%, 4%, 1% şi 0,25 % (vezi, de exemplu, Figurile 5A şi 5B) şi au fost prevăzute în ţesutul DMD (de ex., cvadriceps, diafragmă sau inimă de şoarece mdx, sau extract de cvadriceps, diafragmă sau muşchi neted (GI) NHP). Probele cu curbă standard au fost prelucrate aşa cum este descris mai sus. Nivelurile de proteină distrofină ca procente din nivelurile de distrofină de tip sălbatic (%WT) au fost determinate prin compararea intensităţilor benzii de distrofină cu curba standard de gel.
Analiza RT-PCR
Pentru analiza RT-PCR, ARN-ul a fost izolat din celule folosind kitul de spin Illustra GE urmând protocolul producătorului. Concentraţia şi puritatea ARN-ului au fost determinate folosind un NanoDrop. Omiterea exonului 51 a fost măsurată prin RT-PCR cu un primer direct de legare a exonului 49 SECV ID NR: 5 (5'-CCAGCCACTCAGCCAGTGAAG-3') şi un primer invers de legare a exonului 52 SECV ID NR: 6 (5'-CGATCCGTAATGATTGTTCTAGCC- 3'). Un exon 51 omis a avut ca rezultat un amplicon de 246 bp, iar un exon 51 care nu a fost omis a avut ca rezultat un amplicon de 478 bp.
Omiterea exonului 23 de şoarece a fost măsurată prin RT-PCR cu un primer primer-SECV ID NR: 7 (5'-CACATCTTTGATGGTGTGAGG-3') şi un primer invers SECV ID NR: 8 (5'-CAACTTCAGCCATCCATTTCTG -3').
După ce ARN-ul a fost supus la RT-PCR, probele au fost analizate folosind o maşină Caliper, care utilizează electroforeză capilară pe gel. Procentul de omitere a exonului a fost calculat folosind următoarea ecuaţie: (aria de sub curbă pentru benzile omise)/(suma ariei de sub curbă pentru benzile omise şi pentru cele care nu au fost omise) x100.
Imunohistochimie: colorarea distrofinei:
Secţiuni de 10 microni de ţesut congelat de cvadriceps de şoarece au fost utilizate pentru a detecta distrofină cu anticorp primar de distrofină (diluţie 1:250, iepure, Abcam, pisica #ab15277) în ser de capră 10% + BSA 1% în PBS şi anticorp secundar Alexa-Fluoro 488 de capră anti-iepure (diluţie de 1:1000) în ser de capră 10% + BSA 1%.
Prepararea subunităţilor Morfolino
Referitor la Schema 1, în care B reprezintă un fragment de împerechere a bazelor, subunităţile morfolino pot fi preparate din ribinucleozida (1) corespunzătoare, aşa cum este arătat. Subunitatea morfolino (2) poate fi opţional protejată prin reacţia cu un precursor de grupare protectoare adecvată, de exemplu, clorură de tritil. Gruparea protectoare 3' este în general îndepărtată în timpul sintezei oligomerului în stare solidă, aşa cum este descris mai detaliat mai jos. Fragmentul de împerechere a bazelor poate fi protejat în mod adecvat pentru sinteza oligomerului în fază solidă. Grupările protectoare adecvate includ benzoil pentru adenină şi citozină, fenilacetil pentru guanină, şi pivaloiloximetil pentru hipoxantină (I). Gruparea pivaloiloximetil poate fi introdusă în poziţia N1 a bazei heterociclice hipoxantină. Deşi poate fi utilizată o subunitate de hipoxantină neprotejată, randamentele în reacţiile de activare sunt cu mult superioare atunci când baza este protejată. Alte grupări protectoare adecvate le includ pe cele descrise în brevetul U.S. nr. 8,076,476.
Reacţia lui 3 cu compusul de fosfor activat 4 are ca rezultat subunităţi morfolino care au fragmentul 5 de legătură dorit.
Compuşii cu structura 4 pot fi preparaţi utilizând orice număr de metode cunoscute specialiştilor în domeniu. Cuplarea cu fragmentul morfolino este realizată apoi aşa cum a fost evidenţiat mai sus.
Compuşii cu structura 5 pot fi utilizaţi în sinteza oligomerilor în fază solidă pentru prepararea oligomerilor care cuprind legăturile între subunităţi. Astfel de metode sunt bine cunoscute în domeniu. Pe scurt, un compus cu structura 5 poate fi modificat la capătul 5' pentru a conţine un linker la un suport solid. Odată susţinută, gruparea protectoare a lui 5 (de ex., tritil la capătul 3') este îndepărtată, şi amina liberă reacţionează cu un fragment de fosfor activat al unui al doilea compus cu structura 5. Această secvenţă se repetă până când este obţinută lungimea dorită pentru oligo. Gruparea protectoare din capătul terminal 3' poate fi, fie îndepărtată, fie lăsată activă dacă se doreşte o modificare 3'. Oligo poate fi îndepărtat de pe suportul solid folosind orice număr de metode, sau exemplu de tratament cu o bază pentru a scinda legătura la suportul solid.
Prepararea oligomerilor morfolino, în general, şi a oligomerilor morfolino specifici din dezvăluire sunt descrise mai detaliat în Exemple.
Prepararea oligomerilor Morfolino
Prepararea compuşilor din dezvăluire este realizată utilizând următorul protocol, în conformitate cu Schema 2:
Prepararea de tritil piperazină fenil carbamat 35: La o suspensie răcită de compus 11 în diclormetan (6 ml/g 11) a fost adăugată o soluţie de carbonat de potasiu (3,2 echiv.) în apă (4 mL/g de carbonat de potasiu). La acest amestec în două faze a fost adăugată încet o soluţie de cloroformiat de fenil (1,03 echiv.) în diclormetan (2 g/g cloroformiat de fenil). Amestecul de reacţie a fost încălzit la 20°C. După terminarea reacţiei (1-2 ore), straturile au fost separate. Stratul organic a fost spălat cu apă şi a fost uscat pe carbonat de potasiu anhidru. Produsul 35 a fost izolat prin cristalizare din acetonitril.
Prepararea alcoolului carbamat 36: Hidrură de sodiu (1,2 echiv.) a fost suspendată în 1-metil-2-pirolidinonă (32 mL/g de hidrură de sodiu). La această suspensie au fost adăugate trietilen glicol (10,0 echiv.) şi compus 35 (1,0 echiv.). Suspensia rezultată a fost încălzită la 95 °C. La terminarea reacţiei (1-2 ore), amestecul a fost răcit la 20°C. La acest amestec au fost adăugate 30% diclormetan/metil terţ-butil eter (v:v) şi apă. Stratul organic care conţine produsul a fost spălat succesiv cu NaOH apos, acid succinic apos şi clorură de sodiu apoasă saturată. Produsul 36 a fost izolat prin cristalizare din diclormetan/metil terţ-butil eter/heptan.
Prepararea acidului Tail 37: La o soluţie de compus 36 în tetrahidrofuran (7 ml/g 36) au fost adăugate anhidridă succinică (2,0 echiv.) şi DMAP (0,5 echiv.). Amestecul a fost încălzit la 50°C. După terminarea reacţiei (5 ore), amestecul a fost răcit la 20°C şi a fost ajustat la pH 8,5 cu NaHCO3 apos. A fost adăugat metil terţ-butil eter, şi produsul a fost extras în stratul apos. A fost adăugat diclormetan, şi amestecul a fost ajustat la pH 3 cu acid citric apos. Stratul organic care conţine produsul a fost spălat cu un amestec de tampon citrat pH=3 şi soluţie apoasă saturată de clorură de sodiu. Această soluţie de diclormetan de 37 a fost utilizat fără izolare la prepararea compusului 38.
Prepararea lui 38: La soluţia de compus 37 au fost adăugate imida acidului N-hidroxi-5-norbornen-2,3-dicarboxilic (HONB) (1,02 echiv.), 4-dimetilaminopiridină (DMAP) (0,34 echiv.) şi apoi clorhidrat de 1-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimidă (EDC) (1,1 echiv). Amestecul a fost încălzit la 55°C. După terminarea reacţiei (4-5 ore), amestecul a fost răcit la 20°C şi a fost spălat succesiv cu acid citric/saramură 1:1 0,2 M şi saramură. Soluţia de diclormetan a suferit un schimb de solvent cu acetonă şi apoi cu N,N-dimetilformamidă şi produsul a fost izolat prin precipitare din acetonă/N,N-dimetilformamidă în clorură de sodiu apoasă saturată. Produsul brut a fost resuspendat de câteva ori în apă pentru a îndepărta N,N-dimetilformamida reziduală şi sărurile.
Metoda A de sinteză a PMO: Utilizarea de ancoră disulfură
Introducerea "Tail" activat pe răşina încărcată cu ancoră a fost efectuată în dimetil imidazolidinonă (DMI) prin procedura utilizată pentru încorporarea subunităţilor în timpul sintezei în fază solidă.
Această procedură a fost efectuată într-un vas silanizat, cu manta, pentru peptide, (ChemGlass, NJ, SUA) cu o frită din sticlă cu porozitate grosieră (40-60 µm), agitator superior, şi robinet de închidere din teflon cu 3 căi pentru a permite N2 să barboteze prin frită sau o extracţie în vid.
Etapele de tratare/spălare a răşinii din următoarea procedură constau în două operaţii de bază: fluidizarea răşinii sau a patului agitator din reactor şi extracţia cu solvent/soluţie. Pentru fluidizarea răşinii, robinetul de închidere a fost poziţionat pentru a permite curgerea N2 prin frită şi răşina specificată pentru tratament/spălare a fost adăugată în reactor şi răşina a fost lăsată să se impregneze şi să se umezească complet. Amestecarea a fost apoi începută, şi suspensia de răşină a fost amestecată pe parcursul timpului specificat. Pentru extracţia cu solvent/soluţie, amestecarea şi fluxul de N2 au fost oprite şi pompa de vid a fost pornită şi apoi robinetul de închidere a fost poziţionat pentru a permite evacuarea tratamentului/spălăturii răşinii către deşeuri. Toate volumele de tratament/spălare a răşinii au fost de 15 mL/g de răşină, dacă nu este menţionat altfel.
La răşina aminometil polistiren (100-200 ochiuri; ~1,0 mmoli/g de încărcătură pe baza substituţiei de azot; 75 g, 1 echiv., Polymer Labs, Marea Britanie, partea #1464-X799), într-un vas silanizat, cu manta, pentru peptide, a fost adăugată 1-metil-2-pirolidinonă (NMP; 20 ml/g de răşină), şi răşina a fost lăsată să se umfle cu amestecare timp de 1-2 ore. După evacuarea solventului de umflare, răşina a fost spălată cu diclormetan (2 x 1-2 min), 5% diizopropiletilamină în 25% izopropanol/diclormetan (2 x 3-4 min) şi diclormetan (2 x 1-2 min). După evacuarea spălăturii finale, răşina a fost tratată cu o soluţie de disulfură ancoră 34 în 1-metil-2-pirolidinonă (0,17 M; 15 ml/g de răşină, ~2,5 echiv.), şi amestecul de răşină/reactiv a fost încălzit la 45 °C timp de 60 de ore. La terminarea reacţiei, încălzirea a fost întreruptă, şi soluţia de ancoră a fost evacuată şi răşina a fost spălată cu 1-metil-2-pirolidinonă (4 x 3-4 min) şi diclormetan (6 x 1-2 min). Răşina a fost tratată cu o soluţie de 10% (v/v) dicarbonat de dietil în diclormetan (16 mL/g; 2 x 5-6 min) şi apoi a fost spălată cu diclormetan (6 x 1-2 min). Răşina 39 a fost uscată în flux de N2 timp de 1-3 ore şi apoi în vid până la greutate constantă (± 2%). Randament: 110-150% din greutatea răşinii iniţiale.
Determinarea încărcării răşinii aminometil polistiren-disulfură: încărcarea răşinii (numărul de situsuri reactive potenţial disponibile) este determinată printr-un test spectrometric pentru numărul de grupări trifenilmetil (tritil) la fiecare gram de răşină.
O greutate cunoscută de răşină uscată (25 ± 3 mg) este transferată într-un balon volumetric silanizat de 25 ml şi se adaugă ~5 ml de acid trifluoracetic 2% (v/v) în diclormetan. Conţinutul este amestecat prin agitare uşoară şi apoi este lăsat să stea timp de 30 de minute. Volumul este adus la 25 mL cu acid trifluoracetic 2% (v/v) suplimentar în diclormetan şi conţinutul este amestecat bine. Folosind o pipetă cu deplasare pozitivă, o alicotă din soluţia care conţine tritil (500 µL) este transferată într-un balon volumetric de 10 ml, şi volumul este adus la 10 ml cu acid metansulfonic.
Conţinutul de cationi tritil din soluţia finală este măsurat prin absorbanţa UV la 431,7 nm, şi încărcarea cu răşină este calculată în grupări tritil la fiecare gram de răşină (µmol/g) utilizând volumele, diluţiile, coeficientul de extincţie adecvate (ε: 41 µmol-1cm-1) şi greutatea răşinii. Analiza este efectuată în trei exemplare şi se calculează o încărcare medie.
Procedura de încărcare a răşinii din acest exemplu va furniza răşină cu o încărcare de aproximativ 500 µmol/g. A fost obţinută o încărcare de 300-400 în µmol/g dacă etapa de încorporare a ancorei disulfură este efectuată timp de 24 de ore la temperatura camerei.
Încărcarea cu Tail: Folosind aceeaşi configuraţie şi volume ca pentru prepararea răşinii aminometil polistiren-disulfură, Tail poate fi introdus în suport solid. Răşina încărcată cu ancora a fost mai întâi deprotejată în condiţii acide, şi materialul rezultat a fost neutralizat înainte de cuplare. Pentru etapa de cuplare, o soluţie de 38 (0,2 M) în DMI care conţine 4-etilmorfolină (NEM, 0,4 M) a fost utilizată în locul soluţiei de ancoră disulfură. După 2 ore la 45 °C, răşina 39 a fost spălată de două ori cu 5% diizopropiletilamină în 25% izopropanol/diclormetan, şi o dată cu DCM. La răşină au fost adăugate o soluţie de anhidridă benzoică (0,4 M) şi NEM (0,4 M). După 25 de minute, mantaua reactorului a fost răcită la temperatura camerei, şi răşina a fost spălată de două ori cu 5% diizopropiletilamină în 25% izopropanol/diclormetan, şi de opt ori cu DCM. Răşina 40 a fost filtrată şi a fost uscată în vid înalt. Încărcarea pentru răşină 40 este definită a fi încărcarea răşinii iniţiale aminometil polistiren-disulfură 39 folosit la încărcarea cu Tail.
Sinteza în fază solidă: Oligomerii morfolino au fost preparaţi pe un sintetizator automat de peptide Gilson AMS-422 în coloane de reacţie de polipropilenă Gilson de 2 mL (Parte # 3980270). Un bloc de aluminiu cu canale pentru curgerea apei a fost plasat în jurul coloanelor în timp ce acestea au fost aşezate pe sintetizator. AMS-422 va adăuga în mod alternativ soluţii de reactiv/spălare, vor fi menţinute pentru un timp specificat şi coloanele vor fi evacuate folosind vid.
Pentru oligomerii cu lungime în intervalul de până la aproximativ 25 de subunităţi este preferată răşina aminometil polistiren-disulfură cu încărcare de aproape 500 µmol/g de răşină. Pentru oligomerii mai mari, este preferată răşina aminometil polistiren-disulfură cu încărcare de 300-400 µmol/g de răşină. Dacă se doreşte o moleculă cu Tail 5', răşina care a fost încărcată cu Tail este aleasă cu aceleaşi ghiduri de încărcare.
Au fost preparate următoarele soluţii de reactivi:
Soluţie de detritilare: 10% acid cianoacetic (g/v) în diclormetan/acetonitril 4:1;
Soluţie de neutralizare: 5% diizopropiletilamină în diclormetan/izopropanol 3:1; şi
Soluţie de cuplare: 0,18 M (sau 0,24 M pentru oligomerii care au crescut mai lungi decât 20 de subunităţi) subunitate Morfolino activată de tipul de bază şi de legătură dorit, şi etilmorfolină 0,4 M N, în 1,3-dimetilimidazolidinonă.
Diclormetan (DCM) a fost utilizat ca o spălare de tranziţie care separă diferitele soluţii de spălături de reactiv.
Pe sintetizator, cu blocul reglat la 42 °C, la fiecare coloană care conţine 30 mg de răşină aminometil polistiren-disulfură (sau răşină cu Tail) au fost adăugaţi 2 ml de 1-metil-2-pirolidinonă şi au fost lăsate să stea la temperatura camerei timp de 30 min. După spălarea de 2 ori cu 2 ml de diclormetan, a fost folosit următorul ciclu de sinteză:
Etapa Volum Furnizare Timp de menţinere Detritilare 1,5 mL Manifold 15 secunde Detritilare 1,5 mL Manifold 15 secunde Detritilare 1,5 mL Manifold 15 secunde Detritilare 1,5 mL Manifold 15 secunde Detritilare 1,5 mL Manifold 15 secunde Detritilare 1,5 mL Manifold 15 secunde Detritilare 1,5 mL Manifold 15 secunde DCM 1,5 mL Manifold 30 secunde Neutralizare 1,5 mL Manifold 30 secunde Neutralizare 1,5 mL Manifold 30 secunde Neutralizare 1,5 mL Manifold 30 secunde Neutralizare 1,5 mL Manifold 30 secunde Neutralizare 1,5 mL Manifold 30 secunde Neutralizare 1,5 mL Manifold 30 secunde DCM 1,5 mL Manifold 30 secunde Cuplare 350-500µL Seringă 40 minute DCM 1,5 mL Manifold 30 secunde Neutralizare 1,5 mL Manifold 30 secunde Neutralizare 1,5 mL Manifold 30 secunde DCM 1,5 mL Manifold 30 secunde DCM 1,5 mL Manifold 30 secunde DCM 1,5 mL Manifold 30 secunde
Secvenţele oligomerilor individuali au fost programate în sintetizator, astfel încât fiecare coloană să primească soluţia de cuplare adecvată (A,C,G,T,I) în secvenţa corespunzătoare. Atunci când oligomerul dintr-o coloană a finalizat încorporarea subunităţii sale finale, coloana a fost îndepărtată din bloc şi a fost efectuat un ciclu final manual cu o soluţie de cuplare compusă din clorură de 4-metoxitrifenilmetil (0,32 M în DMI) care conţine 0,89 M 4-etilmorfolină.
Scindarea din răşină şi îndepărtarea grupărilor de protecţie a bazelor şi a structurii principale: După metoxitritilare, răşina a fost spălată de 8 ori cu 2 mL de 1-metil-2-pirolidinonă. A fost adăugat un mL de o soluţie de scindare constând din 0,1 M 1,4-ditiotreitol (DTT) şi 0,73 M trietilamină în 1-metil-2-pirolidinonă, coloana a fost acoperită şi a fost lăsată să stea la temperatura camerei timp de 30 de minute. După acest timp, soluţia a fost drenată într-un flacon Wheaton de 12 ml. Răşina foarte restrânsă a fost spălată de două ori cu 300 µl de soluţie de scindare. La soluţie au fost adăugaţi 4,0 ml de amoniac apos concentrat (depozitat la -20 °C), flaconul a fost închis etanş (cu capac filetat căptuşit cu teflon) şi amestecul a fost agitat pentru a amesteca soluţia. Flaconul a fost plasat într-un cuptor la 45 °C timp de 16-24 ore pentru a efectua scindarea grupărilor de protecţie a bazei şi a structurii principale.
Purificarea produsului brut: Soluţia de amonoliză ambalată în flacon a fost îndepărtată din cuptor şi a fost lăsată să se răcească la temperatura camerei. Soluţia a fost diluată cu 20 mL de amoniac apos 0,28% şi a fost trecută printr-o coloană de 2,5 x 10 cm care conţine răşină Macroprep HQ (BioRad). Un gradient de sare (A: 0,28% amoniac cu B: 1 M clorură de sodiu în 0,28% amoniac; 0-100% B în 60 de minute) a fost utilizat pentru a elua vârful care conţine metoxitritil. Fracţiunile combinate au fost reunite şi prelucrate suplimentar în funcţie de produsul dorit.
Demetoxitritilarea oligomerilor Morfolino: fracţiunile reunite din purificarea Macroprep au fost tratate cu 1 M H3PO4 pentru a reduce pH-ul la 2,5. După amestecarea iniţială, probele au stat la temperatura camerei timp de 4 minute, moment în care sunt neutralizate la pH 10-11 cu 2,8% amoniac/apă. Produsele au fost purificate prin extracţie în fază solidă (SPE).
Umplerea şi condiţionarea coloanei SPE: Amberchrome CG-300M (Rohm şi Haas; Philadelphia, PA) (3 mL) este umplut în coloane fritate de 20 mL (Coloane cromatografice BioRad Econo-Pac (732-1011)) şi răşina a fost clătită cu 3 mL dintre următoarele: 0,5 M NaOH / 20% etanol; apă; 50 mM H3PO4 / 80% acetonitril; apă; 0,5 NaOH / 20% etanol; apă; 0,28% NH4OH.
Purificarea SPE: Soluţia din demetoxitritilare a fost încărcată pe coloană şi răşina a fost clătită de trei ori cu 3-6 mL 0,28% amoniac apos. Un flacon Wheaton (12 mL) a fost plasat sub coloană, şi produsul a fost eluat prin două spălări cu 2 mL de acetonitril 45% în amoniac apos 0,28%.
Izolarea produsului: Soluţiile au fost congelate în gheaţă carbonică şi flacoanele au fost plasate într-un uscător prin congelare pentru a se obţine o pulbere albă pufoasă. Probele au fost dizolvate în apă, au fost filtrate printr-un filtru de 0,22 microni (Pall Life Sciences, filtru de seringă Acrodisc 25 mm, cu o membrană HT Tuffryn de 0,2 microni) folosind o seringă, şi densitatea optică (OD) a fost măsurată pe un spectrofotometru UV pentru a determina unităţile OD de oligomer prezente, precum şi proba distribuită pentru analiză. Soluţiile au fost apoi plasate înapoi în flacoane Wheaton pentru liofilizare.
Analiza oligomerilor Morfolino cu MALDI: spectrometria de masă MALDI-TOF a fost utilizată pentru a determina compoziţia fracţiunilor la purificări, precum şi pentru a furniza dovezi pentru identitatea (greutatea moleculară) a oligomerilor. Probele au fost analizate după diluare cu soluţie de acid 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinamic (acid sinapinic), 3,4,5-trihidoxiacetofenonă (THAP) sau acid alfa-ciano-4-hidoxicinamic (HCCA), ca matrice.
Metoda B de sinteză a PMO: Utilizarea ancorei NCP2
Sinteza ancorei NCP2:
1. Prepararea 4-fluor-3-nitrobenzoatului de metil (1)
Într-un balon de 100 L au fost încărcate 12,7 kg de acid 4-fluor-3-nitrobenzoic, au fost adăugate 40 kg de metanol şi 2,82 kg de acid sulfuric concentrat. Amestecul a fost agitat la reflux (65°C) timp de 36 de ore. Amestecul de reacţie a fost răcit la 0°C. Cristalele s-au format la 38 °C. Amestecul a fost menţinut la 0°C timp de 4 ore apoi a fost filtrat în atmosferă de azot. Balonul de 100 L a fost spălat, şi turta de filtrare a fost spălată cu 10 kg de metanol care fusese răcit la 0 °C. Turta solidă de filtrare a fost uscată pe pâlnie timp de 1 oră, a fost transferată în tăvi şi a fost uscată într-un cuptor cu vid la temperatura camerei până la o greutate constantă de 13,695 kg de 4-fluor-3-nitrobenzoat de metil (randament 100%; HPLC 99%).
2. Prepararea acidului 3-nitro-4-(2-oxopropil)benzoic
A. 4-(3-hidroxi-1-metoxi-1-oxobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoat de (Z)-metil (2)
Într-un balon de 100 L au fost încărcate 3,98 kg de 4-fluor-3-nitrobenzoat de metil (1) din etapa anterioară, 9,8 kg DMF, 2,81 kg de acetoacetat de metil. Amestecul a fost agitat şi răcit la 0°C. La acesta au fost adăugate 3,66 kg de DBU timp de aproximativ 4 ore în timp ce temperatura a fost menţinută la sau sub 5 °C. Amestecul a fost agitat încă 1 oră. La balonul de reacţie a fost adăugată o soluţie de 8,15 kg de acid citric în 37,5 kg de apă purificată în timp ce temperatura de reacţie a fost menţinută la sau sub 15 °C. După adăugare, amestecul de reacţie a fost agitat suplimentar 30 de minute, apoi a fost filtrat în atmosferă de azot. Turta de filtrare umedă a fost returnată în balonul de 100 L împreună cu 14,8 kg de apă purificată. Suspensia a fost agitată timp de 10 minute apoi a fost filtrată. Turta umedă a fost returnată din nou în balonul de 100 L, a fost suspendată cu 14,8 kg de apă purificată timp de 10 minute şi a fost filtrată până la (Z)-metil 4-(3-hidroxi-1-metoxi-1-oxobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoat brut.
B. Acid 3-nitro-4-(2-oxopropil)benzoic
4-(3-hidroxi-1-metoxi-1-oxobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoatul de (Z)-metil brut a fost încărcat într-un balon de reacţie de 100 L în atmosferă de azot. La acesta au fost adăugate 14,2 kg de 1,4-dioxan şi au fost agitate. La amestec a fost adăugată o soluţie de 16,655 kg de HCI concentrat şi 13,33 kg de apă purificată (6 M HCI) timp de 2 ore, în timp ce temperatura amestecului de reacţie a fost menţinută sub 15°C. Atunci când adăugarea a fost terminată, amestecul de reacţie a fost încălzit la reflux (80°C) timp de 24 de ore, a fost răcit la temperatura camerei şi a fost filtrat în atmosferă de azot. Turta solidă de filtrare a fost triturată cu 14,8 kg de apă purificată, a fost filtrată, triturată din nou cu 14,8 kg apă purificată şi filtrată. Solidul a fost returnat în balonul de 100 L cu 39,9 kg de DCM şi au fost refluxate cu agitare timp de 1 oră. Au fost adăugate 1,5 kg de apă purificată pentru a dizolva solidele rămase. Stratul organic inferior a fost împărţit într-un balon preîncălzit de 72 L, apoi a fost returnat într-un balon curat uscat de 100 L. Soluţia a fost răcită la 0°C, a fost menţinută timp de 1 oră, apoi a fost filtrată. Turta solidă de filtrare a fost spălată de două ori, de fiecare dată cu o soluţie de 9,8 kg de DCM şi 5 kg de heptan, apoi a fost uscată pe pâlnie. Solidul a fost transferat pe tăvi şi a fost uscat până la o greutate constantă de 1,855 kg de acid 3-nitro-4-(2-oxopropil)benzoic. Randament total a fost de 42% din compusul 1. HPLC 99,45%.
3. Prepararea succinatului de N-tritilpiperazină (NTP)
Într-un balon cu manta de 72 L au fost încărcate în atmosferă de azot 1,805 kg de clorură de trifenilmetil şi 8,3 kg de toluen (soluţie TPC). Amestecul a fost agitat până când solidele s-au dizolvat. Într-un balon de reacţie cu manta de 100 L au fost adăugate în atmosferă de azot 5,61 kg de piperazină, 19,9 kg de toluen şi 3,72 kg de metanol. Amestecul a fost agitat şi răcit la 0°C. La acestea a fost adăugată încet, în porţii, soluţia de TPC timp de 4 ore, în timp ce temperatura de reacţie a fost menţinută la sau sub 10 °C. Amestecul a fost agitat timp de 1,5 ore la 10°C, apoi a fost lăsat să se încălzească la 14°C. 32,6 kg de apă purificată au fost încărcate în balonul de 72 L, apoi au fost transferate în balonul de 100 L, în timp ce temperatura internă a lotului a fost menţinută la 20°C +/- 5 °C. Straturile au fost lăsate să se despartă şi stratul apos inferior a fost separat şi depozitat. Stratul organic a fost extras de trei ori, de fiecare dată, cu 32 kg de apă purificată, şi straturile apoase au fost separate şi combinate cu soluţia apoasă depozitată.
Stratul organic rămas a fost răcit la 18°C şi a fost adăugat încet, în porţii, la stratul organic o soluţie de 847 g de acid succinic în 10,87 kg apă purificată. Amestecul a fost agitat timp de 1,75 ore la 20 +/- 5°C. Amestecul a fost filtrat, şi solidele au fost spălate cu 2 kg de TBME şi 2 kg de acetonă, apoi a fost uscat pe pâlnie. Turta de filtrare a fost triturată de două ori, de fiecare dată, cu 5,7 kg de acetonă şi, între triturări, a fost filtrată şi spălată cu 1 kg de acetonă. Solidul a fost uscat pe pâlnie, apoi a fost transferat în tăvi şi a fost uscat într-un cuptor cu vid la temperatura camerei până la o greutate constantă de 2,32 kg de NTP. Randament 80%.
4. Prepararea (4-(2-hidroxipropil)-3-nitrofenil)(4-tritilpiperazin-1-il)metanonei
A. Prepararea 1-(2-nitro-4(4-tritilpiperazin-1-carbonil)fenil)propan- 2-onei
Într-un balon cu manta de 100 L au fost încărcate în atmosferă de azot 2 kg de acid 3-nitro-4-(2-oxopropil)benzoic (3), 18,3 kg de DCM şi 1,845 kg de clorhidrat de N-(3-dimetilaminopropil)-N'etilcarbodiimidă (EDC.HCl). Soluţia a fost agitată până când s-a format un amestec omogen. Au fost adăugate 3,048 kg de NTP timp de 30 de minute la temperatura camerei, şi au fost agitate timp de 8 ore. La amestecul de reacţie au fost adăugate 5,44 kg de apă purificată şi au fost agitate timp de 30 de minute. Straturile au fost lăsate să se separe, şi stratul organic inferior care conţine produsul a fost drenat şi depozitat. Stratul apos a fost extras de două ori cu 5,65 kg de DCM. Straturile organice combinate au fost spălate cu o soluţie de 1,08 kg de clorură de sodiu în 4,08 kg apă purificată. Straturile organice au fost uscate pe 1,068 kg de sulfat de sodiu şi au fost filtrate. Sulfatul de sodiu a fost spălat cu 1,3 kg de DCM. Straturile organice combinate au fost suspendate cu 252 g de silicagel şi au fost filtrate printr-o pâlnie de filtrare care conţine un pat de 252 g de silicagel. Patul de silicagel a fost spălat cu 2 kg de DCM. Straturile organice combinate au fost evaporat pe un evaporator rotativ. La reziduu au fost adăugate 4,8 kg de THF şi apoi au fost evaporate pe evaporator rotativ până când s-a ajuns la 2,5 volume de 1-(2-nitro-4(4-tritilpiperazin-1-carbonil)fenil)propan-2-onă brută în THF.
B. Prepararea (4-(2-hidroxipropil)-3-nitrofenil)(4-tritilpiperazin-1-il)metanonei (5)
Într-un balon cu manta de 100 L au fost încărcate în atmosferă de azot 3600 g de 4 din etapa anterioară şi 9800 g de THF. Soluţia agitată a fost răcită la ≤ 5°C. Soluţia a fost diluată cu 11525 g de etanol şi au fost adăugate 194 g de borohidrură de sodiu timp de aproximativ 2 ore la ≤ 5 °C. Amestecul de reacţie a fost agitat încă 2 ore la ≤ 5°C. Reacţia a fost stinsă cu o soluţie de aproximativ 1,1 kg de clorură de amoniu în aproximativ 3 kg apă prin adăugare lentă pentru a menţine temperatura la ≤ 10 °C. Amestecul de reacţie a fost agitat încă 30 de minute, a fost filtrat pentru a îndepărta substanţele anorganice şi a fost încărcat din nou într-un balon cu manta de 100 L şi a fost extras cu 23 kg de DCM. Stratul organic a fost separat şi soluţia apoasă a fost extrasă încă de două ori, de fiecare dată, cu 4,7 kg de DCM. Straturile organice combinate au fost spălate cu o soluţie de aproximativ 800 g de clorură de sodiu în aproximativ 3 kg de apă, apoi au fost uscate pe 2,7 kg de sulfat de sodiu. Suspensia a fost filtrată şi turta de filtrare a fost spălată cu 2 kg de DCM. Filtratele combinate au fost concentrate până la 2,0 volume, au fost diluate cu aproximativ 360 g de acetat de etil şi au fost evaporate. Produsul brut a fost încărcat pe o coloană de silicagel de 4 kg de silice umplută cu DCM în atmosferă de azot, şi a fost eluat cu 2,3 kg de acetat de etil în 7,2 kg de DCM. Fracţiunile combinate au fost evaporate şi reziduul a fost preluat în 11,7 kg de toluen. Soluţia de toluen a fost filtrată, şi turta de filtrare a fost spălată de două ori, de fiecare dată, cu 2 kg de toluen. Turta de filtrare a fost uscată până la o greutate constantă de 2,275 kg de compus 5 (randament 46% din compusul 3) HPLC 96,99%.
5. Prepararea carbonatului de 2,5-dioxopirolidin-1-il(1-(2-nitro-4-(4-trifenilmetilpiperazin-1 carbonil)fenil)propan-2-il) (ancoră NCP2)
Într-un balon cu manta de 100 L au fost încărcate în atmosferă de azot 4,3 kg de compus 5 (greutate ajustată, pe baza toluenului rezidual, prin H1 RMN; toţi reactivii de aici după ce au fost scalaţi corespunzător) şi 12,7 kg de piridină. Pentru aceasta au fost încărcate 3,160 kg de DSC (78,91 % în greutate prin H1 RMN), în timp ce temperatura internă a fost menţinută la ≤ 35 °C. Amestecul de reacţie a fost învechit timp de aproximativ 22 de ore în mediul ambiant, apoi a fost filtrat. Turta de filtrare a fost spălată cu 200 g de piridină. În două loturi, fiecare cuprinzând jumătate din volumul de filtrat, filtratul a fost încărcat lent într-un balon cu manta de 100 L care conţine o soluţie de aproximativ 11 kg de acid citric în aproximativ 50 kg de apă, şi a fost agitat timp de 30 de minute pentru a permite precipitarea solidului. Solidul a fost colectat cu o pâlnie de filtrare, a fost spălat de două ori, de fiecare dată, cu 4,3 kg de apă spălare, şi a fost uscat în vid pe pâlnia de filtrare.
Solidele combinate au fost încărcate într-un balon cu manta de 100 L şi au fost dizolvate în 28 kg de DCM şi au fost spălate cu o soluţie de 900 g de carbonat de potasiu în 4,3 kg apă. După 1 oră, straturile au fost lăsate să se separe, şi stratul apos a fost îndepărtat. Stratul organic a fost spălat cu 10 kg de apă, a fost separat şi a fost uscat pe 3,5 kg de sulfat de sodiu. DCM a fost filtrat, evaporat şi a fost uscat în vid până la 6,16 kg de Ancoră NCP2 (Randament 114%).
Sinteza răşinii încărcată cu ancoră NCP2
Într-un reactor de 75 L de sinteză în fază solidă cu un robinet de închidere din teflon au fost încărcate aproximativ 52 L de NMP şi 2300 g de răşină aminometil polistiren. Răşina a fost agitată în NMP pentru a se umfla timp de aproximativ 2 ore, apoi a fost drenată. Răşina a fost spălată de două ori cu aproximativ 4 L de DCM la fiecare spălare, apoi de două ori cu 39 L de soluţie de neutralizare la fiecare spălare, apoi de două ori cu 39 L de DCM la fiecare spălare. Soluţia de ancoră NCP2 a fost adăugată lent la soluţia de răşină, cu agitare, a fost agitată timp de 24 de ore la temperatura camerei şi a fost drenată. Răşina a fost spălată de patru ori cu 39 L de NMP la fiecare spălare şi de şase ori cu 39 L de DCM la fiecare spălare. Răşina a fost tratată şi agitată cu jumătate din soluţia de acoperire DEDC, timp de 30 de minute, a fost drenată şi a fost tratată şi agitată cu cealaltă jumătate din soluţia de acoperire DEDC timp de 30 de minute, şi a fost drenată. Răşina a fost spălată de şase ori cu 39 L de DCM la fiecare spălare, apoi a fost uscată într-un cuptor până la o greutate constantă de 3573,71 g de răşină încărcată cu ancoră.
Prepararea Oligomerului morfolino folosind ancoră NCP2
Sinteza de referinţă a 50L în fază solidă de substanţă medicamentoasă brută Eteplirsen (PMO#1)
1. Materiale
Masa 2: Materii prime
Denumire material Denumire chimică Număr CAS Formulă chimică Greutate moleculară Subunitate A activată Ester N,N-dimetil-,[6-[6-(benzoilamino)-9H-purin-9-il]-4-(trifenilmetil)-2-morfolinil]metilic al acidului fosforamidocloridic 1155373-30-0 C38H37ClN7O4P 722,2 Subunitate C activată Ester N,N-dimetil-,[6-[4-(benzoilamino)-2-oxo-1(2H)-pirimidinil]-4-(trifenilmetil)-2-morfolinil]metilic al acidului fosforamidocloridic 1155373-31-1 C37H37ClN5O5P 698,2 Subunitate DPG activată Ester 2,2-dimetil-,4-[[[9-[6-[[[clor(dimetilamino)fosfinil]oxi]metil]-4-(trifenilmetil)-2-morfolinil]-2-[(2-fenilacetil)amino]-9H-purin-6-il]oxi]metil]fenil al acidului propanoic 1155309-89-9 C51H53ClN7O7P 942,2 Subunitate T activată Ester N,N-dimetil-,[6-(3,4-dihidro-5-metil-2,4-dioxo-1(2H)-pirimidinil)]-4-(trifenilmetil)-2-morfolinil]metil al acidului fosforamidocloridic 1155373-34-4 C31H34ClN4O5P 609,1 Coada EG3 activată Ester 1-[3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-hexahidro-1,3-dioxo-4,7-metan-2H-izoindol-2-il]4-[2-[2-[2-[[[4-(trifenilmetil)-1-piperazinil]carbonil]oxi]etoxi]etoxi]etil] al acidului butandioic 1380600-06-5 C43H47N3O10 765,9
Structurile chimice ale materiilor prime:
A. Tail EG3 activat
B. Subunitatea C activată (Pentru preparare, vezi brevetul U.S. nr. 8,067,571)
C. Subunitatea A activată (Pentru preparare, vezi brevetul U.S. nr. 8,067,571)
D. Subunitatea DPG activată (Pentru preparare, vezi WO 2009/064471)
E. Subunitatea T activată (Pentru preparare, vezi WO 2013/082551)
F. Răşină încărcată cu ancoră
în care R1 este un mediu suport.
Tabelul 3: Descrierea soluţiilor pentru sinteza oligomerului în fază solidă al substanţei medicamentoase brute Eteplirsen
Denumirea soluţiei Compoziţia soluţiei Soluţie de ancoră NCP2 37,5 L de NMP şi 1292 g de ancoră NCP2 Soluţie de acoperire DEDC 4,16 L de dicarbonat de dietil (DEDC), 3,64 L de NEM şi 33,8 L de DCM Soluţie CYTFA 2,02 kg de 4-cianopiridină, 158 L de DCM, 1,42 L de TFA, 39 L de TFE şi 2 L de apă purificată Soluţie de neutralizare 35,3 L de IPA, 7,5 L de DIPEA şi 106,5 L de DCM Soluţie de scindare 1530,04 g de DTT, 6,96 L de NMP şi 2,98 L de DBU
2. Sinteza de referinţă a substanţei medicamentoase brute Eteplirsen
A. Umflarea răşinii
750 g de răşină încărcată cu ancoră şi 10,5 L de NMP au fost încărcate într-un reactor silanizat de 50 l şi au fost agitate timp de 3 ore. NMP a fost drenat şi răşina încărcată cu ancoră a fost spălată de două ori, de fiecare dată, cu 5,5 L de DCM şi de două ori, de fiecare dată, cu 5,5 L de 30% TFE/DCM.
B. Ciclul 0: Cuplarea Tail EG3
Răşina încărcată cu ancoră a fost spălată de trei ori, de fiecare dată, cu 5,5 L de 30% TFE/DCM, şi a fost drenată, spălată cu 5,5 L de soluţie CYFTA timp de 15 minute şi drenată şi a fost spălată din nou cu 5,5 L de soluţie CYTFA timp de 15 minute fără drenare, la care au fost încărcaţi 122 mL de NEM/DCM 1:1, şi suspensia a fost agitată timp de 2 minute şi a fost drenată. Răşina a fost spălată de două ori cu 5,5 L de soluţie de neutralizare timp de 5 minute şi a fost drenată, apoi de două ori, de fiecare dată, cu 5,5 L de DCM şi a fost drenată. O soluţie de 706,2 g de Tail EG3 activat (MW 765,85) şi 234 mL de NEM în 3 L de DMI a fost încărcată în răşină şi a fost agitată timp de 3 ore la temperatura camerei, şi a fost drenată. Răşina a fost spălată de două ori, de fiecare dată, cu 5,5 L de soluţie de neutralizare timp de 5 minute pentru fiecare spălare şi o dată cu 5,5 L de DCM şi a fost drenată. O soluţie de 374,8 g de anhidridă benzoică şi 195 mL de NEM în 2680 mL de NMP a fost încărcată şi agitată timp de 15 minute şi a fost drenată. Răşina a fost agitată cu 5,5 I de soluţie de neutralizare timp de 5 minute, apoi a fost spălată o dată cu 5,5 I de DCM şi de două ori de fiecare dată cu 5,5 I de 30% TFE/DCM. Răşina a fost suspendată în 5,5 L de 30% TFE/DCM şi a fost menţinută timp de 14 ore.
C. Cicluri 1-30 de cuplare a subunităţii
i. Tratamente înainte de cuplare
Înainte de fiecare ciclu de cuplare, aşa cum este descris în Figura 23, răşina a fost: 1) spălată cu 30% TFE/DCM; 2) a) tratată cu soluţie de CYTFA timp de 15 minute şi a fost drenată, şi b) tratată cu soluţie de CYTFA timp de 15 minute, la care a fost adăugat 1:1 NEM/DCM, a fost agitată şi a fost drenată; 3) agitată de trei ori cu soluţie de neutralizare; şi 4) spălată de două ori cu DCM. Vezi Figura 23.
ii. Tratamente după cuplare
După ce fiecare soluţie de subunitate a fost drenată aşa cum este descris în Figura 23, răşina a fost: 1) spălată cu DCM; şi 2) spălată de două ori cu 30% TFE/DCM. Dacă răşina a fost menţinută pentru o perioadă de timp înainte de următorul ciclu de cuplare, a doua spălare cu TFE/DCM nu a fost drenată şi răşina a fost reţinută în respectiva soluţie de spălare cu TFE/DCM. Vezi Figura 23.
iii. Cicluri de cuplare a subunităţii activate
Ciclurile de cuplare au fost efectuate aşa cum este descris în Figura 23.
iv. Spălare finală cu IPA
După ce etapa finală de cuplare a fost efectuată aşa cum este descris în Figura 23, răşina a fost spălată de 8 ori, de fiecare dată, cu 19,5 L de IPA şi a fost uscată în vid la temperatura camerei timp de aproximativ 63,5 ore până la o greutate uscată de 5,579,8 g.
C. Scindarea
Substanţa medicamentoasă brută Eteplirsen legată de răşina de mai sus a fost împărţită în două loturi, fiecare lot a fost tratat după cum urmează. Un lot de 2789,9 g de răşină a fost: 1) agitat cu 10 L de NMP timp de 2 ore, apoi NMP a fost drenat; 2) spălat de 3 ori, de fiecare dată, cu 10 L de 30% TFE/DCM; 3) tratat cu 10 L de soluţie de CYTFA timp de 15 minute; şi 4) 10 L de soluţie de CYTFA timp de 15 minute la care au fost adăugaţi apoi 130 ml de 1:1 NEM/DCM şi au fost agitate timp de 2 minute şi au fost drenate. Răşina a fost tratată de trei ori, de fiecare dată, cu 10 l de soluţie de neutralizare, a fost spălată de şase ori cu 10 l de DCM şi de opt ori, de fiecare dată, cu 10 l de NMP. Răşina a fost tratată cu o soluţie de scindare de 1530,4 g DTT şi 2980 DBU în 6,96 L de NMP timp de 2 ore pentru a detaşa substanţa medicamentoasă brută Eteplirsen din răşină. Soluţia de scindare a fost drenată şi reţinută într-un vas separat. Reactorul şi răşina au fost spălate cu 4,97 L de NMP care a fost combinat cu soluţia de scindare.
D. Deprotejarea
Soluţia de scindare combinată şi spălătura de NMP au fost transferate într-un vas sub presiune la care au fost adăugaţi 39,8 L de NH4OH (NH3•H2O) care a fost răcit la o temperatură de -10 °C până la -25 °C într-un congelator. Vasul sub presiune a fost sigilat şi încălzit la 45 °C timp de 16 ore, apoi a fost lăsat să se răcească la 25 °C. Această soluţie de deprotejare, care conţine substanţa medicamentoasă brută Eteplirsen, a fost diluată 3:1 cu apă purificată, şi pH-ul a fost ajustat la 3,0 cu acid fosforic 2 M, apoi la pH 8,03 cu NH4OH. HPLC (C18) 73-74%.
Purificarea de referinţă a substanţei medicamentoase brute Eteplirsen (PMO#1).
Soluţia de deprotejare din partea D de mai sus, care conţine substanţa medicamentoasă brută Eteplirsen, a fost încărcată pe o coloană de răşină schimbătoare de anioni ToyoPearl Super-Q 650S (Tosoh Bioscience) şi a fost eluată cu un gradient de 0-35% B pe 17 volume de coloană (tampon A: 10 mM hidroxid de sodiu; Tampon B: 1 M clorură de sodiu în 10 mM hidroxid de sodiu) şi fracţiunile de puritate acceptabilă (C18 şi SCX HPLC) au fost reunite cu o soluţie purificată de produs medicamentos. HPLC: 97,74% (C18) 94,58% (SCX).
Soluţia purificată de substanţă medicamentoasă a fost desărată şi liofilizată la 1959 g de substanţă medicamentoasă purificată Eteplirsen. Randament 61,4%; HPLC: 97,7% (C18) 94,6% (SCX).
Tabelul 5. Acronime
Acronim Denumire DBU 1,8-Diazabicycloundec-7-enă DCM Diclormetan DIPEA N,N-diizopropiletilamină DMI 1,3-Dimetil-2-imidazolidinonă TDT Ditiotreitol IPA Alcool izopropilic MW Greutate moleculară NEM N-etilmorfolină NMP N-metil-2-pirolidonă RT Temperatura camerei TFA Acid 2,2,2-trifluoracetic TFE 2,2,2-Trifluoretanol
Proceduri analitice: Spectrele de masă în timpul de zbor la ionizare cu desorbţie laser asistată de matrice (MALDI-TOF-MS) au fost înregistrate pe un Bruker AutoflexTM Speed, utilizând o matrice de acid sinapinic (SA). SCX-HPLC a fost efectuată pe un sistem Thermo Dionex UltiMate 3000 echipat cu un detector cu matrice de diode 3000 şi o coloană ProPacTM SCX-20 (250 x 4 mm) folosind un debit de 1,0 mL/min (pH = 2; coloană cu temperatura de 30 °C). Fazele mobile au fost A (25% acetonitril în apă care conţine 24 mM H3PO4) şi B (25% acetonitril în apă care conţine 1 M KCI şi 24 mM H3PO4). A fost folosită eluarea cu gradient: 0 min, 35% B; 2 min, 35% B; 22 min, 80% B; 25 min, 80% B; 25,1 min, 35% B; 30 min, 35% B.
La un amestec de PMO#1 (1,82 g, 0,177 mmol, proaspăt uscat prin liofilizare timp de două zile), Ac-L-Arg-L-Arg-L-Arg-L-Arg-L-Arg-L-Arg-Gly-OH hexatrifluoracetat (614,7 mg, 0,354 mmol) şi 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridiniu 3-oxid hexafluorofosfat (HATU, 134,4 mg, 0,354 mmol) a fost adăugat dimetil sulfoxid (DMSO, 20 mL). Amestecul a fost agitat la temperatura camerei timp de 3 minute, apoi a fost adăugată N,N-diizopropiletilamină (DIPEA, 68,5 mg, 0,530 mmol). După 5 minute, amestecul tulbure a devenit o soluţie limpede. Reacţia a fost monitorizată prin SCX-HPLC. După 2 ore, au fost adăugaţi 20 ml de soluţie de hidroxid de amoniu 10% (2,8% NH3). Amestecul a fost agitat la temperatura camerei timp de încă 2 ore. Reacţia a fost încheiată prin adăugarea a 400 ml de apă. La soluţie a fost adăugat trifluoretanol (2,0 mL).
Soluţia a fost împărţită în două porţii, şi fiecare porţie a fost purificată printr-o coloană WCX (10 g răşină la fiecare coloană). Fiecare coloană WCX a fost mai întâi spălată cu acetonitril 20% în apă (v/v) pentru a îndepărta materia primă PMO#1. Spălările (225 ml pentru fiecare coloană) au fost oprite când analiza spectrului de masă MALDI-TOF a arătat absenţa semnalului PMO#1. Fiecare coloană a fost apoi spălată cu apă (100 mL la fiecare coloană). Produsul dorit, PPMO#1, a fost eluat cu 2,0 M guanidină HCI (140 mL pentru fiecare coloană). Soluţiile de PPMO#1 purificate au fost reunite împreună şi apoi au fost împărţite în două porţiuni şi fiecare a fost desărată printr-o coloană SPE (10 g de răşină pentru fiecare coloană).
Coloana SPE a fost mai întâi spălată cu soluţie apoasă de NaCI 1,0 M (100 mL pentru fiecare coloană) pentru a genera sarea hexaclorhidrat a PPMO#1. Fiecare coloană SPE a fost apoi spălată cu apă (200 mL pentru fiecare coloană). PPMO#1 desărat final a fost eluat cu acetonitril 50% în apă (v/v, 150 ml pentru fiecare coloană). Acetonitrilul a fost îndepărtat prin evacuare la presiune redusă. Soluţia apoasă rezultată a fost liofilizată pentru a se obţine clorhidratul hexaclorhidrat PPMO#1 dorit (1,93 g, randament 94,5%).
Exemplu de referinţă 1: PMO#1
Folosind metoda B a protocolului de sinteză a PMO descrisă mai sus, PMO#1 a fost sintetizat:
în care fiecare Nu de la 1 până la 30 şi de la 5' până la 3' este:
Poziţia nr. 5' până la 3' Nu Poziţia nr. 5' până la 3' Nu Poziţia nr. 5' până la 3' Nu Poziţia nr. 5' până la 3' Nu Poziţia nr. 5' până la 3' Nu Poziţia nr. 5' până la 3' Nu 1 C 6 A 11 A 16 A 21 G 26 T 2 T 7 C 12 A 17 G 22 C 27 C 3 C 8 A 13 G 18 A 23 A 28 T 4 C 9 T 14 G 19 T 24 T 29 A 5 A 10 C 15 A 20 G 25 T 30 G
în care A este
Cis
Gis
şi T este
HPLC: 97,7% (C18) 94,6% (SCX).
Exemplul 2: PPMO#1
Folosind protocolul descris mai sus, PPMO#1 a fost sintetizat din PMO#1:
PPMO#1 în care fiecare Nu de la 1 până la 30 şi de la 5' până la 3' este:
Poziţia nr. 5' până la 3' Nu Poziţia nr. 5' până la 3' Nu Poziţia nr. 5' până la 3' Nu Poziţia nr. 5' până la 3' Nu Poziţia nr. 5' până la 3' Nu Poziţia nr. 5' până la 3' Nu 1 C 6 A 11 A 16 A 21 G 26 T 2 T 7 C 12 A 17 G 22 C 27 C 3 C 8 A 13 G 18 A 23 A 28 T 4 C 9 T 14 G 19 T 24 T 29 A 5 A 10 C 15 A 20 G 25 T 30 G
în care A este
Cis
Gis
, şi T este
Analiza SCX-HPLC arată că puritatea este de 93,3% prin integrarea vârfului principal şi 99,69% prin integrarea totală a PPMO#1. Spectrul de masă MALDI-TOF: m/z calculat pentru C404H647N202O130P30 [M+1]+: 11342,25; găsit: 11342,12.
Exemplul 3: Omiterea exonului 51 in vitro (Miocite)
Doi compuşi care ţintesc exonul 51 de distrofină umană, aşa cum este descris în tabelul de mai jos, PMO#1 şi PPMO#1, ambii asamblaţi în aceeaşi secvenţă, au fost evaluaţi pentru capacitatea de a induce omiterea exonului 51.
Denumire Secvenţă de ţintire (TS) TS SECV ID NR. 5' 3' PMO#1 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG 1 EG3 H PPMO# 1 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG 1 EG3 -G-R6
În mod specific, au fost utilizate miocite umane diferenţiate pentru a determina capacitatea compuşilor de mai sus de a induce omiterea exonului 51 la diferite concentraţii (adică, 40 µm, 20 µm, 10 µm, 5 µm, 2,5 µm şi 1,25 µm). După diferenţiere, celulele au fost incubate cu compuşi timp de nouăzeci şi şase de ore, urmată de izolarea ARN, şi a fost măsurată omiterea exonului 51 prin RT-PCR aşa cum este descris mai sus. Rezultatele, care arată că PPMO#1 măreşte semnificativ omiterea exonului 51 în comparaţie cu PMO#1, sunt prezentate în următorul tabel şi în Figura 4:
Procent de omitere a exonului Doză (µm) 40 20 10 5 2,5 1,25 Compus PMO#1 41,93 34,56 22,23 15,3 12,8 4,16 PPMO# 1 68,03 58,9 56,76 37,46 23,53 12,13
Exemplul de referinţă 4: Studiu pe şoarece MDX
Şoarecele mdx este un model animal acceptat şi bine caracterizat pentru distrofia musculară Duchene (DMD) care conţine o mutaţie în exonul 23 al genei distrofinei. Secvenţa antisens M23D (SECV ID NR: 2) este cunoscută că induce omiterea exonului 23 şi restabilirea expresiei funcţionale a distrofinei. Şoarecii MDX la vârsta de 6-7 săptămâni au primit o singură injecţie în vena cozii, fie cu un PPMO4225, fie cu un PMO4225 din tabelul de mai jos, la o doză de 40 mg/kg, sau cu ser fiziologic.
Denumire Secvenţă de ţintire (TS) TS SECV ID NR. 5' 3' PMO4225 GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT 2 EG3 H PPMO4225 GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT 2 EG3 -G-R6
Fiecare dintre PMO4225 şi PPMO4225 a fost preparat prin metoda PMO A şi metodele de conjugare CPP descrise mai sus.
Şoarecii trataţi au fost sacrificaţi la 7, 30, 60 şi 90 de zile după injectarea cu doză unică (n=6 în fiecare grup). Diafragma, inima şi cvadricepsul drept au fost prelucrate pentru analiza Western blot pentru a măsura producţia de proteină distrofină, şi pentru analiza RT-PCR pentru a măsura procentul de omitere a exonilor, iar cvadricepsul stâng a fost prelucrat pentru imunohistochimie şi colorare H/E, aşa cum este descris mai sus.
Restabilirea proteinei distrofină a fost cuantificată prin Western blot, şi procentul de omitere a exonului 23 a fost măsurat prin RT-PCR, fiecare, aşa cum este descris mai sus.
Rezultatele RT-PCR sunt prezentate în figurile 5A-10B şi în tabelele de mai jos. În mod surprinzător, PPMO4225 a indus niveluri semnificativ mai mari şi susţinute de restabilire a distrofinei şi de omitere a exonului 23, în comparaţie cu PMO4225, cele mai ridicate niveluri apar la 30 de zile după injectare. Şi mai surprinzător, PPMO4225 a crescut nivelurile de distrofină în inimă atunci când PMO4225 nu a făcut-o; distrofină şi omiterea exonilor nu au fost observate în inimă în toate momentele cu PMO4225.
Cuantificarea proteinei distrofină ca procent de proteină de tip sălbatic (%WT) prin Western Blot Compus PMO4225 PPMO4225 Zi 7 30 60 90 7 30 60 90 Ţesut Cvadriceps 1,1 2,3 1,6 0,7 20,7 28,1 20,8 8,2 Diafragmă 1,4 1,9 1,3 0,6 14,5 15,2 9,8 2,3 Inimă 0 0 0 0 2,0 1,0 0,9 0,1 Procentul de omitere a exonului măsurat prin RT-PCR Compus PMO4225 PPMO4225 Zi 7 30 60 90 7 30 60 90 Ţesut Cvadriceps 21,2 5,5 7,9 2,8 61,5 42,02 28,8 6,9 Diafragmă 29,9 2,6 0,5 0 51,6 36,76 3,05 0 Inimă 0 0 0 0 13,15 2,64 0 0
Rezultatele imunohistochimiei sunt prezentate în Figura 11. Aici, PPMO4225 restabileşte distrofina în întregul cvadriceps, în timp ce 4225 produce un model de expresie 'de tip petice'. Distribuţia uniformă a distrofinei cu tratamentul PPMO4225 indică faptul că ţintirea pe scară largă a muşchilor scheletici este realizabilă. PPMO4225 a îmbunătăţit semnificativ in vivo furnizarea faţă de PMO4225.
Exemplul 5: Omiterea exonului 51 în NHP
Pentru a demonstra în continuare eficacitatea oligomerilor antisens PPMO de omitere a exonilor, au fost utilizate primate non-umane. În mod specific, maimuţe cynomolgus care au ţesuturi musculare intacte au fost injectate intravenos cu PPMO#1, PMO#1 (din Exemplul 2) sau cu soluţie salină conform programului de dozare din tabelul de mai jos:
Programul de dozare pentru Cynomolgus
Grup Compus Doză (mg/kg) Număr în fiecare grup Strategia de furnizare 1 PPMO#1 20 3 2 PPMO#1 40 3 3 PPMO#1 80 3 4 PPMO#1 160 3 O dată pe săptămână, în total 4 doze Animalele au fost sacrificate la 48 de ore după ultima doză, în ziua 22 5 PMO#1 40 3 6 Salină 0 2 7 PPMO#1 40 2 Doză unică în ziua 1 cu recuperare de 4 săptămâni 8 PPMO#1 40 2 Doză unică în ziua 1 cu recuperare de 8 săptămâni
Animalele din grupurile 1-5 au tolerat toate cele 4 doze de 20, 40 şi 80 mg/kg. Animalele nu au tolerat 160 mg/kg după a treia doză, ceea ce a avut ca rezultat eutanasia a două animale în ziua administrării şi a unui animal a fost eutanasiat a doua zi. Aceste animale au prezentat pierdere în greutate corporală.
La fiecare necropsie programată sau eutanasiere in extremis, secţiuni de diafragmă, muşchi netezi ai duodenului, esofagului şi aortei, cvadricepsului, deltoidului, bicepsului şi inimii au fost colectate şi au fost congelate. Procentul de omitere a exonului 51 a fost determinat utilizând RT-PCR aşa cum este descris mai sus. Rezultatele sunt prezentate în figurile 12-15 şi în tabelul de mai jos.
nd = nedeterminat
Procent de omitere a exonului Muşchi PPMO#1 PMO#1 20 mg/kg 40 mg/kg 80 mg/kg 160 mg/kg 40 mg/kg Cvadriceps 5,2 43,8 92,4 nd 0,0 Diafragmă 30,2 80,5 94,9 100,0 0,0 Biceps 4,4 30,2 65,7 90,6 0,0 Deltoid 6,8 36,4 78,2 95,0 0,0 Inimă 0,0 2,6 60,7 98,5 0,0 Duoden 14,9 17,0 61,0 71,4 0,0 Esofag 4,1 22,4 66,6 97,4 0,0 Aortă 26,1 40,8 60,1 nd 4,8
În mod surprinzător, PPMO#1 a produs niveluri profunde de omitere a exonilor în ţesuturile intacte testate, în comparaţie cu PMO#1. În mod specific, în timp ce administrarea PMO#1 nu a avut ca rezultat nicio omitere detectată în niciunul dintre ţesuturile colectate, PPMO#1 a produs omiterea exonilor, de exemplu, peste 90% în cvadriceps şi diafragmă, şi peste 60% în duoden la nivel de dozare de 80 mg/kg. Deosebit de surprinzător este nivelul de omitere a exonilor atins în inimă la, de exemplu, 80 mg/kg, caz în care omiterea de exoni a fost peste 60%. Fără a dori să fim legaţi de vreo teorie anume, administrarea sistematică şi furnizarea de PPMO#1 în ţesuturile musculare NHP nedistrofice intacte şi realizarea omiterii exonului 51 sărind la nivelul atins cu PPMO#1, în special, în muşchiul cardiac, nu ar fi putut fi preconizată la şoarecele mdx de mai sus din Exemplul 4. Mai degrabă, furnizarea către ţesutul sănătos, ca în NHP diferă de furnizarea către ţesutul distrofic.
Pentru grupurile 7 şi 8, procentul de omitere a exonului 51 a fost determinat folosind RT-PCR, aşa cum este descris mai sus. Rezultatele sunt prezentate în Figura 22 şi în tabelul de mai jos.
Muşchi Procent de omitere a exonilor cu PPMO#1 30 zile 60 zile Cvadriceps 13,7 4,6 Diafragmă 62,4 49,1 Inimă 3,1 0 Tractul GI 1,25 0
Aşa cum se vede din rezultate, omiterea exonilor a fost mai mare la 30 de zile, comparativ cu 60 de zile în fiecare muşchi analizat, ceea ce demonstrează că eficienţa omiterii exonilor scade în timp după o singură doză.
Exemplul de referinţă 6: Studiu de răspuns la doză la şoarece MDX
Şoareci MDX cu vârsta de 6-7 săptămâni au primit o singură injecţie în vena cozii, fie cu un PPMO4225, fie cu PMO4225 descris mai sus, la o doză de 40 mg/kg, 80 mg/kg sau 120 mg/kg (n=6 în fiecare grup).
Şoarecii trataţi au fost sacrificaţi la 30 de zile după injectare. Diafragma, cvadricepsul şi inima au fost prelucrate pentru analiza western blot pentru a măsura producţia de proteină distrofină pe baza protocolului western blot descris mai sus (utilizat, de exemplu, în Exemplul 4) cu următoarele modificări:
Parametru Protocolul Western Blot din exemplul 4 Modificări ale protocolului Western Blot Cuantificarea proteinelor Kit de testare a proteinelor RC DC Metoda BCA Etapa de blocare Peste noapte la 4°C 1 Ora la RT Incubare cu anticorpi primari 1 oră la RT Peste noapte la 4°C Concentraţia de anticorpi primari 1:20 1:500
Restabilirea proteinei distrofină ca % de tip sălbatic este prezentată în tabelul de mai jos şi în figurile 16-19.
Cuantificarea prin Western Blot a proteinei distrofină ca procent de proteină de tip sălbatic (%WT) Compus PMO4225 PPMO4225 Doză (mg/kg) 40 80 120 40 80 120 Ţesut Diafragmă 0,80 0,97 1,83 8,02 26,03 42,77 Inimă 0,13 0,24 0,34 0,61 6,34 19,48 Cvadriceps 3,5 2,6 3,0 43 90 144
În mod surprinzător, datele arată că o singură doză de PPMO4225 creşte nivelurile de distrofină într-o manieră dependentă de doză la şoarecii mdx într-o măsură semnificativ şi substanţial mai mare decât cea de PMO4225.
Exemplul de referinţă 7: Studiu IHC al diafragmei şi inimii şoarecilor MDX
Şoareci MDX cu vârsta de 6-7 săptămâni au primit o singură injecţie în vena cozii de PPMO4225 la o doză de 80 mg/kg sau de soluţie salină, şi şoareci de tip sălbatic cu vârsta de 6-7 săptămâni au primit o singură injecţie de soluţie salină. Şoarecii mdx trataţi, şoarecii mdx cu soluţie salină, şi şoarecii de tip sălbatic au fost sacrificaţi la 30 de zile după injectarea cu doză unică (n=4 în fiecare grup). Rezultatele de imunohistochimie sunt prezentate în Figura 24. Aici, rezultatele arată o creştere uniformă a distrofinei în ţesuturi asociată cu morbiditatea şi mortalitatea la şoarecii mdx cu DMD trataţi cu PPMO4225.
Exemplul 8: Omiterea exonului 51 in vitro (Mioblaste)
Doi conjugaţi de oligomeri antisens care ţintesc exonul 51 de distrofină umană (DMD), aşa cum este descris în tabelul de mai jos, PMO#1 şi PPMO#1, ambii conţinând aceeaşi secvenţă, au fost evaluaţi pentru omiterea exonului 51 în DMD în mioblaste umane sănătoase.
Secvenţe de PMO#1 şi PPMO#1 pentru exonul 51 uman în DMD.
Denumire Secvenţă de ţintire (TS) TS SECV ID NR. 5' 3' PMO#1 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG 1 EG3 H PPMO# 1 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG 1 EG3 -G-R6
În mod specific, mioblastele umane sănătoase (pasajul 5-6, SKB-F-SL achiziţionat de la Zen-Bio, Inc.) au fost placate la confluenţă de ~40% atunci când au fost tratate cu PMO#1 sau PPMO#1 la diferite concentraţii (adică, 40 µm, 20 µm, 10 µm, 5 µm, 2,5 µm şi 1,25 µm) în mediu SKM-M (Zen-Bio, Inc.). După nouăzeci şi şase de ore de incubare, mioblastele au fost spălate cu PBS şi au fost lizate cu tampon de liză RA1 în kitul Illustra GE RNAspin 96 (Cat#25-055-75, GE Healthcare Bio-Sciences). ARN-ul total a fost izolat conform recomandării producătorului, cu excepţia faptului că au fost folosiţi 40 µL de apă fără RNază pentru eluarea ARN-ului.
Pentru a determina omiterea exonului 51 cu ambii compuşi, a fost efectuată RT-PCR finală în două etape. În mod specific, unsprezece microlitri de ARN total au fost mai întâi transcrişi invers la ADNc prin kitul de sinteză SuperScript IV First-strand (Cat#18091200, Invitrogen) folosind hexameri aleatori conform instrucţiunilor producătorului. PCR a fost efectuată prin adăugarea a 9 µL de ADNc în Platinum Taq DNA polymerase PCR Supermix High Fidelity (Cat#12532024, Invitrogen) cu primeri care ţintesc exonii 49 şi 52 în DMD umană [primer direct (SECV ID NR: 5): CCAGCCACTCAGCCAGTGAAG; primer invers (SECV ID NR: 6): CGATCCGTAATGATTGTTCTAGCC]. Amplificarea PCR a fost efectuată utilizând termociclorul în timp real BioRad CFX96 utilizând programul prezentat în tabelul de mai jos. Expresia produselor PCR ignorate sau omise a fost evaluată prin încărcarea a 32 µL de produs PCR în sistemul LabChip GX utilizând kitul de reactiv de înaltă sensibilitate ADN (CLS760672, Perkin Elmer). Procentul de omitere a exonului 51 în DMD a fost calculat ca procent de molaritate (nmol/1) pentru banda omisă a exonului 51 (246 bp) în comparaţie cu suma molarităţii pentru benzile omise (246 bp) şi pentru cele care nu sunt omise (478 bp).
Testul t Student nepereche cu două cozi (homoscedastic) a fost utilizat pentru a evalua dacă mediile celor 2 grupuri sunt diferite statistic una de cealaltă la fiecare doză. Valoarea p < 0,05 a fost considerată semnificativă statistic.
Programul termociclor folosit pentru amplificarea ampliconilor în DMD, cu sau fără omiterea exonului 51.
Etapă Temperatură Timp 1. Denaturare 94 °C 2 min 2. Denaturare 94 °C 30 sec 3. Aliniere 55 °C 30 sec 4. Prelungire 68 °C 1 min 5. Repetarea etapelor 2-4 34 cicluri 6. Prelungire finală 68 °C 5 min 7. Depozitare 4 °C ∞
Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos şi în Figura 25.
Procent de omitere a exonului 51 în DMD, cu PMO#1 şi PPMO#1 în mioblastele umane.
Compus/ Doză (µm) Procent de omitere a exonului (medie ± SD) 1,25 2,5 5 10 20 40 PMO# 1 0,66 ± 0,76 1,49 ± 0,67 2,76 ± 1,69 2,63 ±0,48 5,29 ± 1,36 8,46 ± 1,83 PPMO# 1 2,20 ± 0,09 2,92 ± 0,69 6,28 ± 0,14 8,71 ± 1,26 18,92 ± 0,73 29,24 ± 1,64
Aceste rezultate in vitro arată că PPMO#1 creşte semnificativ omiterea exonului 51 în DMD, în comparaţie cu PMO#1, în mioblastele umane.
Exemplul 9: Omiterea exonului 51 in vitro (Miotuburi)
Doi conjugaţi de oligomeri antisens care ţintesc exonul 51în distrofina umană (DMD), PMO#1 şi PPMO#1, ambele conţinând aceeaşi secvenţă, au fost evaluate pentru omiterea exonului 51 în DMD, în miotuburi umane sănătoase.
Denumire Secvenţă de ţintire (TS) TS SECV ID NR. 5' 3' PMO#1 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG 1 EG3 H PPMO# 1 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG 1 EG3 -G-R6
În mod specific, mioblastele umane sănătoase (etapele 5-6, SKB-F-SL achiziţionat de la Zen-Bio, Inc.) au fost cultivate pentru a atinge o confluenţă de 80-90% în mediul SKM-M înainte de iniţierea diferenţierii prin incubare în medii cu ser puţin. (SKM-D, Zen-Bio, Inc.). La cinci zile după diferenţiere, miotuburile mature au fost incubate cu PMO#1 sau PPMO#1 la diferite concentraţii (adică, 40 µm, 20 µm, 10 µm, 5 µm, 2,5 µm şi 1,25 µm). După nouăzeci şi şase de ore de incubare, miotuburile au fost spălate cu PBS şi au fost lizate cu tampon de liză RA1 într-un kit Illustra GE RNAspin 96 (Cat#25-055-75, GE Healthcare Bio-Sciences). ARN-ul total a fost izolat conform recomandării producătorului, cu excepţia faptului că au fost folosiţi 40 µL de apă fără RNază pentru eluarea ARN.
Pentru a determina omiterea exonului 51 în DMD cu PMO#1 sau PPMO#1, a fost efectuată RT-PCR finală în două etape. În mod specific, unsprezece microlitri de ARN total au fost mai întâi transcrişi invers la cADN prin kitul de sinteză SuperScript IV First-strand (Cat#18091200, Invitrogen) folosind hexameri aleatori conform instrucţiunilor producătorului. PCR a fost efectuată prin adăugarea a 9 µL de ADNc în Platinum Taq DNA polymerase PCR Supermix High Fidelity (Cat#12532024, Invitrogen) cu primeri care ţintesc exonii 49 şi 52 în DMD umană [primer direct (SECV ID NR: 5): CCAGCCACTCAGCCAGTGAAG; primer invers (SECV ID NR: 6): CGATCCGTAATGATTGTTCTAGCC]. Amplificarea PCR a fost efectuată utilizând un termociclor BioRad CFX96 în timp real utilizând programul prezentat în tabelul de mai jos. Expresia produselor PCR omise şi care nu au fost omise a fost evaluată prin încărcarea a 32 µL de produs PCR pe sistemul LabChip GX utilizând kitul de reactiv de înaltă sensibilitate ADN (CLS760672, Perkin Elmer). Procent de omitere a exonului 51 în DMD a fost calculată ca procent de molaritate (nmol/1) pentru banda omisă a exonului 51 (246 bp) în comparaţie cu suma molarităţii pentru benzile omise (246 bp) şi care nu au fost omise (478 bp).
Testul t Student nepereche cu două cozi (homoscedastic) a fost utilizat pentru a evalua dacă mediile celor 2 grupuri sunt diferite statistic una de cealaltă la fiecare doză. Valoarea p < 0,05 a fost considerată semnificativă statistic.
Programul termociclor folosit pentru amplificarea ampliconilor în DMD, cu sau fără omiterea exonului 51.
Etapa Temperatura Timp 8. Denaturare 94 °C 2 min 9. Denaturare 94 °C 30 sec 10. Aliniere 55 °C 30 sec 11. Prelungire 68 °C 1 min 12. Repetarea paşilor 2-4 34 cicluri 13. Prelungire finală 68 °C 5 min 14. Depozitare 4 °C ∞
Rezultatele, care arată că PPMO#1 creşte semnificativ omiterea exonului 51 în DMD, în comparaţie cu PMO#1, sunt prezentate în tabelul următor şi în Figura 26.
Procent de omitere a exonului 51 în DMD, cu PMO#1 şi PPMO#1, în miotuburi umane.
Compus/ Doză (µm) Procent de omitere a exonului (medie ± SD) 1,25 2,5 5 10 20 40 PMO#1 0,64 ± 0,84 0,70 ± 0,08 1,23 ± 0,49 2,11 ± 0,88 2,85 ± 1,06 5,68 ± 1,83 PPMO# 1 1,61 ± 1,16 2,80 ± 0,98 5,71 ± 2,19 8,18 ± 2,94 16,08 ± 1,90 27,79 ± 4,04
REFERINŢE
Aartsma-Rus, A., A. A. Janson, şi colab. (2004). "Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense." Am J Hum Genet 74(1): 83-92.
Abes, R., şi colab. (2008). "Arginine-rich cell penetrating peptides: design, structure-activity, and applications to alter pre-mRNA splicing by steric-block oligonucleotides." J Pept. Sci. 14: 455-460.
Alter, J., şi colab. (2006). "Systemic delivery of morpholino oligonucleotide restores dystrophin expression bodywide and improves dystrophic pathology." Nat. Med. 12(2): 175-177.
Bestas, B., şi colab. (2014). "Splice-correcting ligonucleotides restore BTK function in X-linked agammaglobulinemia model." J. Clin. Invest.
Cirak, S., V. Arechavala-Gomeza, şi colab. (2011). "Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study." Lancet 378(9791): 595-605.
Dunckley, M. G., I. C. Eperon, şi colab. (1997). "Modulation of splicing in the DMD gene by antisense oligoribonucleotides." Nucleosides & Nucleotides 16(7-9): 1665-1668.
Dunckley, M. G., M. Manoharan, şi colab. (1998). "Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides." Hum Mol Genet 7(7): 1083-90.
Errington, S. J., C. J. Mann, şi colab. (2003). "Target selection for antisense oligonucleotide induced exon skipping in the dystrophin gene." J Gene Med 5(6): 518-27.
Goemans, N. M., M. Tulinius, şi colab. (2011). "Systemic Administration of PR0051 in Duchenne's Muscular Dystrophy." N Engl J Med.
Jearawiriyapaisarn, N., H. M. Moulton, şi colab. (2008). "Sustained Dystrophin Expression Induced by Peptide-conjugated Morpholino Oligomers in the Muscles of mdx Mice." Mol Ther.
Jearawiriyapaisarn, N., şi colab. (2010). "Long-term improvement in mdx cardiomyopathy after therapy with peptide-conjugated morpholino oligomers." Cardiovascular Research 85: 444-453.
Kinali, M., V. Arechavala-Gomeza, şi colab. (2009). "Local restoration of dystrophin expression with the morpholino oligomer AVI-4658 in Duchenne muscular dystrophy: a single-blind, placebo-controlled, dose-escalation, proof-of-concept study." Lancet Neurol 8(10): 918-28.
Leblue, B., şi colab. (2008). "Cell penetrating peptide conjugates of steric block oligonucleotides." Adv. Drug Deliv. Rev. 60: 517-529.
Lu, Q. L., C. J. Mann, şi colab. (2003). "Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse." Nat Med 9(8): 1009-14.
Mann, C. J., K. Honeyman, şi colab. (2002). "Improved antisense oligonucleotide induced exon skipping in the mdx mouse model of muscular dystrophy." J Gene Med 4(6): 644-54.
Marshall, N. B., S. K. Oda, şi colab. (2007). "Arginine-rich cell-penetrating peptides facilitate delivery of antisense oligomers into murine leukocytes and alter pre-mRNA splicing." Journal of Immunological Methods 325(1-2): 114-126.
Matsuo, M., T. Masumura, şi colab. (1991). "Exon skipping during splicing of dystrophin mRNA precursor due to an intraexon deletion in the dystrophin gene of Duchenne muscular dystrophy kobe." J Clin Invest 87(6): 2127-31.
McClory, G., şi colab. (2006). "Antisense oligonucleotide-induced exon skipping restored dystrophin expression in vitro in a canine model of DMD." Gene Therapy 13: 1373-1381.
Monaco, A. P., C. J. Bertelson, şi colab. (1988). "An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus." Genomics 2(1): 90-5.
Moulton, H.M., (2007). "Cell-penetrating peptide-morpholino conjugates alter pre-mRNA splicing of DMD (Duchenne muscular dystrophy) and inhibit murine coronavirus replication in vivo." Biochem. Society Trans 35(4): 826-828.
Pramono, Z. A., Y. Takeshima, şi colab. (1996). "Induction of exon skipping of the dystrophin transcript in lymphoblastoid cells by transfecting an antisense oligodeoxynucleotide complementary to an exon recognition sequence." Biochem Biophys Res Commun 226(2): 445-9.
Sazani, P., R. Kole, şi colab. (2007). Splice switching oligomers for the TNF superfamily receptors and their use in treatment of disease. PCT WO2007058894, University of North Carolina
Sierakowska, H., M. J. Sambade, şi colab. (1996). "Repair of thalassemic human beta-globin mRNA in mammalian cells by antisense oligonucleotides." Proc Natl Acad Sci U S A 93(23): 12840-4.
Summerton, J. and D. Weller (1997). "Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7(3): 187-95.
Takeshima, Y., H. Nishio, şi colab. (1995). "Modulation of in vitro splicing of the upstream intron by modifying an intra-exon sequence which is deleted from the dystrophin gene in dystrophin Kobe." J Clin Invest 95(2): 515-20.
van Deutekom, J. C., M. Bremmer-Bout, şi colab. (2001). "Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells." Hum Mol Genet 10(15): 1547-54.
van Deutekom, J. C., A. A. Janson, şi colab. (2007). "Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051." N Engl J Med 357(26): 2677-86.
Wilton, S. D., A. M. Fall, şi colab. (2007). "Antisense oligonucleotide-induced exon skipping across the human dystrophin gene transcript." Mol Ther 15(7): 1288-96.
Wilton, S. D., F. Lloyd, şi colab. (1999). "Specific removal of the nonsense mutation from the mdx dystrophin mRNA using antisense oligonucleotides." Neuromuscul Disord 9(5): 330-8.
Wu, B., H. M. Moulton, şi colab. (2008). "Effective rescue of dystrophin improves cardiac function in dystrophin-deficient mice by a modified morpholino oligomer." Proc Natl Acad Sci U S A 105(39): 14814-9.
Wu, B., şi colab. (2012). "Long-term rescue of dystrophin expression and improvement in muscle pathology and function in dystrophic mdx mice by peptide-conjugated morpholino." The Am. J. Pathol. 181(2): 392-400.
Wu, P., şi colab. (2007) "Cell-penetrating peptides as transporters for morpholino oligomers: effects of amino acid composition on intracellular delivery and cytotoxicity." Nucleic Acids Research 35(15): 5182-5191.
Yin, H., H. M. Moulton, şi colab. (2008). "Cell-penetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function." Hum Mol Genet 17(24): 3909-18.
Yin, H., şi colab. (2011). "Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotidemediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice." Mol. Ther 19(7): 1295-1303.
Youngblood, D., şi colab. (2006). "Stability of cell-penetrating peptide- morpholino oligomer conjugates in human serum and in cells." Am. Chem. Soc.

Claims (12)

1. Conjugat de oligomer antisens cu Formula (IV):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. 2. Conjugat de oligomer antisens din revendicarea 1, în care oligomerul antisens are Formula (IVA):
3. Compoziţie farmaceutică, care cuprinde un conjugat de oligomer antisens din revendicarea 1 sau 2, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia şi un purtător acceptabil farmaceutic.
4. Conjugat de oligomer antisens sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia din revendicarea 1 sau 2, pentru utilizare în terapie.
5. Conjugat de oligomer antisens sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia din revendicarea 1 sau 2, sau compoziţia farmaceutică din revendicarea 3, pentru utilizare în tratarea distrofiei musculare Duchenne (DMD) la un subiect care are nevoie de aceasta, în care subiectul are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51.
6. Conjugat de oligomer antisens sau sare acceptabilă farmaceutic a acestuia din revendicarea 1 sau 2, sau compoziţia farmaceutică din revendicarea 3, pentru utilizare în restabilirea unui cadru de citire a ARNm pentru a induce producţia de distrofină la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51.
7. Conjugat de oligomer antisens sau sarea acceptabilă farmaceutic a acestuia sau compoziţia farmaceutică, pentru utilizarea din revendicarea 5 sau din revendicarea 6, în care utilizarea cuprinde administrarea conjugatului de oligomer antisens săptămânal.
8. Conjugat de oligomer antisens sau sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, sau compoziţia farmaceutică, pentru utilizarea din revendicarea 5 sau din revendicarea 6, în care utilizarea cuprinde administrarea conjugatului de oligomer antisens la două săptămâni.
9. Conjugat de oligomer antisens sau sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, sau compoziţia farmaceutică, pentru utilizarea din revendicarea 5 sau din revendicarea 6, în care utilizarea cuprinde administrarea conjugatului de oligomer antisens la fiecare trei săptămâni.
10. Conjugat de oligomer antisens sau sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, sau compoziţia farmaceutică, pentru utilizarea din revendicarea 5 sau din revendicarea 6, în care utilizarea cuprinde administrarea lunară a conjugatului de oligomer antisens.
11. Compoziţia farmaceutică din revendicarea 3, pentru utilizare în excluderea exonului 51 din pre-ARNm de distrofină în timpul prelucrării ARNm-ului la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51.
12. Compoziţia farmaceutică din revendicarea 3, pentru utilizare în legarea exonului 51 al pre-ARNm de distrofină la un subiect care are o mutaţie a genei distrofinei care este susceptibilă de omitere a exonului 51.
MDE20191207T 2016-12-19 2017-12-13 Conjugați de oligomeri de omitere a exonului, pentru distrofie musculară MD3554553T2 (ro)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662436182P 2016-12-19 2016-12-19
US201762443476P 2017-01-06 2017-01-06
US201762479173P 2017-03-30 2017-03-30
US201762562080P 2017-09-22 2017-09-22
PCT/US2017/066222 WO2018118599A1 (en) 2016-12-19 2017-12-13 Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3554553T2 true MD3554553T2 (ro) 2022-10-31

Family

ID=61006315

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20191207T MD3554553T2 (ro) 2016-12-19 2017-12-13 Conjugați de oligomeri de omitere a exonului, pentru distrofie musculară

Country Status (27)

Country Link
US (4) US10888578B2 (ro)
EP (1) EP3554553B1 (ro)
JP (3) JP7118063B2 (ro)
KR (2) KR102552428B1 (ro)
CN (1) CN110290812B (ro)
AU (1) AU2017382723B2 (ro)
CA (1) CA3046793A1 (ro)
CO (1) CO2019007397A2 (ro)
DK (1) DK3554553T3 (ro)
ES (1) ES2927079T3 (ro)
HR (1) HRP20220943T1 (ro)
HU (1) HUE059843T2 (ro)
IL (2) IL267244B (ro)
LT (1) LT3554553T (ro)
MD (1) MD3554553T2 (ro)
MX (1) MX2019006882A (ro)
MY (1) MY195801A (ro)
NZ (1) NZ755416A (ro)
PL (1) PL3554553T3 (ro)
PT (1) PT3554553T (ro)
RS (1) RS63610B1 (ro)
SA (1) SA519402154B1 (ro)
SG (1) SG10202012839TA (ro)
SM (1) SMT202200366T1 (ro)
TW (1) TWI760402B (ro)
WO (1) WO2018118599A1 (ro)
ZA (1) ZA201904092B (ro)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
DK3464306T3 (da) 2016-05-24 2024-05-21 Sarepta Therapeutics Inc Fremgangsmåder til fremstilling af phosphorodiamidat-morpholino-oligomerer
WO2017205496A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Sarepta Therapeutics, Inc. Processes for preparing oligomers
SG10202012839TA (en) * 2016-12-19 2021-01-28 Sarepta Therapeutics Inc Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
MD3554554T2 (ro) 2016-12-19 2022-12-31 Sarepta Therapeutics Inc Conjugați de oligomeri de omitere a exonului, pentru distrofie musculară
BR112019012664A2 (pt) * 2016-12-19 2020-01-21 Sarepta Therapeutics Inc conjugados de oligômero de salto de éxon para distrofia muscular
MX2019008199A (es) 2017-01-06 2019-11-25 Avidity Biosciences Llc Composiciones de acido nucleico polipeptido y metodos de induccion de la omision de exon.
GB201711809D0 (en) * 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
GB201821269D0 (en) 2018-12-28 2019-02-13 Nippon Shinyaku Co Ltd Myostatin signal inhibitor
EP3955966A1 (en) * 2019-04-18 2022-02-23 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions for treating muscular dystrophy
EP3987029A1 (en) * 2019-06-19 2022-04-27 Sarepta Therapeutics, Inc. Methods for treating muscular dystrophy
KR20220122673A (ko) 2019-12-26 2022-09-02 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 엑손 50의 스키핑을 유도하는 안티센스 핵산
JPWO2021172498A1 (ro) 2020-02-28 2021-09-02
CA3211038A1 (en) * 2021-02-12 2022-08-18 Oxford University Innovation Limited Cell-penetrating peptide conjugates and methods of their use
KR20240004609A (ko) 2021-04-30 2024-01-11 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 근이영양증에 대한 치료 방법
MX2023014417A (es) 2021-06-23 2023-12-15 Nippon Shinyaku Co Ltd Combinacion de oligomeros antisentido.
EP4368176A4 (en) 2021-07-08 2025-06-25 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Nephrotoxicity reducing agent
KR20240035502A (ko) 2021-07-08 2024-03-15 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 신독성 경감제
JPWO2023282346A1 (ro) 2021-07-08 2023-01-12
CN120129745A (zh) 2022-03-10 2025-06-10 日本新药株式会社 抗病毒反义低聚物
EP4493693A1 (en) 2022-03-17 2025-01-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Phosphorodiamidate morpholino oligomer conjugates

Family Cites Families (177)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH445129A (fr) 1964-04-29 1967-10-15 Nestle Sa Procédé pour la préparation de composés d'inclusion à poids moléculaire élevé
US3459731A (en) 1966-12-16 1969-08-05 Corn Products Co Cyclodextrin polyethers and their production
US3426011A (en) 1967-02-13 1969-02-04 Corn Products Co Cyclodextrins with anionic properties
US3453257A (en) 1967-02-13 1969-07-01 Corn Products Co Cyclodextrin with cationic properties
US3453259A (en) 1967-03-22 1969-07-01 Corn Products Co Cyclodextrin polyol ethers and their oxidation products
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5217866A (en) 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US5521063A (en) 1985-03-15 1996-05-28 Antivirals Inc. Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use
JP2528107B2 (ja) 1985-03-15 1996-08-28 サマ−トン，ジエ−ムス ポリヌクレオチド測定試薬と方法
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
US5087617A (en) 1989-02-15 1992-02-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides
US5670617A (en) 1989-12-21 1997-09-23 Biogen Inc Nucleic acid conjugates of tat-derived transport polypeptides
KR0166088B1 (ko) 1990-01-23 1999-01-15 . 수용해도가 증가된 시클로덱스트린 유도체 및 이의 용도
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
GB9209032D0 (en) 1992-04-25 1992-06-10 Ciba Geigy Ag New peptide derivatives
JPH07509133A (ja) 1992-07-17 1995-10-12 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 動物疾患の処置のための方法および剤
AU667244B2 (en) 1992-08-21 1996-03-14 Biogen Idec Ma Inc. Tat-derived transport polypeptides
DK0690726T3 (da) 1993-01-07 2002-03-11 Univ Jefferson Antisense-inhibibering af c-myc til modulering af proliferationen af glat muskel-celler
CA2162361C (en) 1993-05-11 2008-10-21 Ryszard Kole Antisense oligonucleotides which combat aberrant splicing and methods of using the same
US5753613A (en) 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
IL115849A0 (en) 1994-11-03 1996-01-31 Merz & Co Gmbh & Co Tangential filtration preparation of liposomal drugs and liposome product thereof
US5849727A (en) 1996-06-28 1998-12-15 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and methods for altering the biodistribution of biological agents
WO2000011014A1 (en) 1998-08-25 2000-03-02 Human Genome Sciences, Inc. 49 human secreted proteins
CA2291074C (en) 1997-05-21 2008-04-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Composition and method for enhancing transport across biological membranes
US6329501B1 (en) 1997-05-29 2001-12-11 Auburn University Methods and compositions for targeting compounds to muscle
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
WO1999042091A2 (en) 1998-02-19 1999-08-26 Massachusetts Institute Of Technology Use of polycations as endosomolytic agents
US6683173B2 (en) 1998-04-03 2004-01-27 Epoch Biosciences, Inc. Tm leveling methods
US6210892B1 (en) 1998-10-07 2001-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
JP2000125448A (ja) 1998-10-14 2000-04-28 Yazaki Corp 電気接続箱
JP2002535015A (ja) 1999-01-29 2002-10-22 エイブイアイ バイオファーマ， インコーポレイテッド 標的ｒｎａを検出するための非侵襲性方法
JP2000256547A (ja) 1999-03-10 2000-09-19 Sumitomo Dow Ltd 耐熱性プラスチックカード用樹脂組成物
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
WO2000061810A1 (en) 1999-04-08 2000-10-19 Oasis Biosciences, Inc. Antisense oligonucleotides comprising universal and/or degenerate bases
AU776362B2 (en) 1999-05-04 2004-09-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S L-ribo-LNA analogues
JP2000325085A (ja) 1999-05-21 2000-11-28 Masafumi Matsuo デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
ATE402257T1 (de) 1999-05-24 2008-08-15 Avi Biopharma Inc Antisense gegen c-myc zur behandlung von polyzystischer nierenkrankheit
US6303573B1 (en) 1999-06-07 2001-10-16 The Burnham Institute Heart homing peptides and methods of using same
JP2003507438A (ja) 1999-08-24 2003-02-25 セルゲイト， インコーポレイテッド オリゴアルギニン部分を使用する上皮組織を横切るおよび上皮組織内への薬物送達の増強
US7229961B2 (en) 1999-08-24 2007-06-12 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into ocular tissues
US6669951B2 (en) 1999-08-24 2003-12-30 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
US20030104622A1 (en) 1999-09-01 2003-06-05 Robbins Paul D. Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses
US7070807B2 (en) 1999-12-29 2006-07-04 Mixson A James Branched histidine copolymers and methods for using same
AU2281201A (en) 1999-12-29 2001-07-09 A. James Mixson Histidine copolymer and methods for using same
US20020009491A1 (en) 2000-02-14 2002-01-24 Rothbard Jonathan B. Compositions and methods for enhancing drug delivery across biological membranes and tissues
US6653467B1 (en) 2000-04-26 2003-11-25 Jcr Pharmaceutical Co., Ltd. Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy
US6727355B2 (en) 2000-08-25 2004-04-27 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy
US20040170955A1 (en) 2000-09-08 2004-09-02 Wadih Arap Human and mouse targeting peptides identified by phage display
US6559279B1 (en) 2000-09-08 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing peptide derivatized oligomeric compounds
EP1191097A1 (en) 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
WO2002038764A2 (en) 2000-11-10 2002-05-16 The Regents Of The University Of California Il-17 receptor-like protein, uses thereof, and modulation of catabolic activity of il-17 cytokines on bone and cartilage
EP1364201A4 (en) 2001-02-06 2005-01-05 Univ Auburn LIGAND SENSOR DEVICES AND USES THEREOF
US20030031655A1 (en) 2001-02-08 2003-02-13 Sequitur, Inc. Methods of light activated release of ligands from endosomes
EP1401473B1 (en) 2001-02-16 2009-07-29 Cellgate Inc. Transporters comprising spaced arginine moieties
US7456146B2 (en) 2001-05-09 2008-11-25 Ghc Research Development Corporation Lytic peptide prodrugs
NZ530101A (en) 2001-05-17 2007-01-26 Avi Biopharma Inc Methods for treating cancer by administering an oligomer antisense to c-myc together with a cancer chemotherapeutic agent
JP3735292B2 (ja) 2001-07-26 2006-01-18 三菱重工業株式会社 ダイエット効果のある健康食品および製剤
US6645974B2 (en) 2001-07-31 2003-11-11 Merck & Co., Inc. Androgen receptor modulators and methods for use thereof
US20090075377A1 (en) 2001-08-03 2009-03-19 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in cells
AU2002334307A1 (en) 2001-09-04 2003-03-18 Exiqon A/S Novel lna compositions and uses thereof
WO2003049772A2 (en) 2001-12-11 2003-06-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Guanidinium transport reagents and conjugates
KR100464261B1 (ko) 2002-01-24 2005-01-03 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
KR20030084444A (ko) 2002-04-26 2003-11-01 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
WO2004043978A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
CA3001404C (en) 2002-11-25 2020-07-28 Masafumi Matsuo Ena nucleic acid pharmaceuticals capable of modifying splicing of mrna precursors
US7482016B2 (en) 2003-03-19 2009-01-27 The J. David Gladstone Institutes Immunogenic compositions comprising HIV-1 acetylated Tat polypeptides
AU2003225410A1 (en) 2003-03-21 2004-10-11 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
EP1629105B1 (en) 2003-04-29 2010-09-01 AVI BioPharma, Inc. Compositions for enhancing transport and antisense efficacy of nucleic acid analog into cells
AU2004259638C1 (en) 2003-07-08 2018-12-20 Novartis Pharma Ag IL-17 A/F heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof
US7211668B2 (en) 2003-07-28 2007-05-01 Panagene, Inc. PNA monomer and precursor
US20050222068A1 (en) 2003-10-23 2005-10-06 Mourich Dan V Method and antisense composition for selective inhibition of HIV infection in hematopoietic cells
US20050203041A1 (en) 2003-09-23 2005-09-15 Mourich Dan V. Antisense compound and method for selectively killing activated T cells
US7786151B2 (en) 2004-01-09 2010-08-31 Kinopharma, Inc. Therapeutic composition of treating abnormal splicing caused by the excessive kinase induction
AU2005208710A1 (en) 2004-01-23 2005-08-11 Avi Biopharma, Inc. Antisense oligomers and methods for inducing immune tolerance and immunosuppression
WO2005077333A2 (en) 2004-02-10 2005-08-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Gel-based delivery of recombinant adeno-associated virus vectors
US7402574B2 (en) 2004-03-12 2008-07-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense composition and method for treating cancer
US20050288246A1 (en) 2004-05-24 2005-12-29 Iversen Patrick L Peptide conjugated, inosine-substituted antisense oligomer compound and method
US20060014712A1 (en) 2004-05-30 2006-01-19 Cemines, Inc. Controlled delivery of therapeutic compounds
PL1766010T3 (pl) 2004-06-28 2011-07-29 Univ Western Australia Antysensowne oligonukleotydy do indukcji pominięcia egzonu i sposoby ich zastosowania
CA2572151A1 (en) 2004-06-30 2006-08-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
US7947645B2 (en) 2004-09-02 2011-05-24 Cognosci, Inc. APO E analogs and methods for their use
WO2006031996A2 (en) 2004-09-14 2006-03-23 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Targeting viruses using a modified sindbis glycoprotein
US8129352B2 (en) 2004-09-16 2012-03-06 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating ssRNA viral infection
US8357664B2 (en) 2004-10-26 2013-01-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection
US7524829B2 (en) 2004-11-01 2009-04-28 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
EP1855694B1 (en) 2005-02-09 2020-12-02 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense composition for treating muscle atrophy
WO2006088833A2 (en) 2005-02-14 2006-08-24 Wyeth Interleukin-17f antibodies and other il-17f signaling antagonists and uses therefor
KR20080031164A (ko) 2005-04-22 2008-04-08 아카데미슈 지켄후이스 라이덴 ＳＲ 단백질의 결합의 방해에 의해 그리고 이차 ＲＮＡ구조의 방해에 의한 ｐｒｅ－ｍＲＮＡ에서 엑손 인식의조절
EP1874800A4 (en) 2005-04-26 2009-11-18 Karyon Ctt Ltd DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC AGENTS
WO2008005002A1 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Oligos Ets. Inc. Compositions and methods for the treatment of muscle wasting
AU2006267051B2 (en) 2005-07-13 2013-03-07 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antibacterial method and compound
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
US7790694B2 (en) 2005-07-13 2010-09-07 Avi Biopharma Inc. Antisense antibacterial method and compound
WO2007030691A2 (en) 2005-09-08 2007-03-15 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection
AU2006287530A1 (en) 2005-09-08 2007-03-15 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection
US8137670B2 (en) 2005-09-29 2012-03-20 Medimmune, Llc Method of identifying membrane IgE specific antibodies and use thereof for targeting IgE producing precursor cells
US20070111962A1 (en) 2005-11-08 2007-05-17 Mourich Dan V Immunosuppression compound and treatment method
US8501704B2 (en) 2005-11-08 2013-08-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Immunosuppression compound and treatment method
EP2535413A3 (en) 2005-11-10 2016-04-13 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Splice switching oligomers for the TNF superfamily receptors and their use in treatment of disease
EP2002018B1 (en) 2006-03-07 2010-05-12 AVI BioPharm, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating arenavirus infection
SI2735568T1 (en) 2006-05-10 2018-01-31 Sarepta Therapeutics, Inc. Analogues of the oligonucleotide, with cationic links between subunits
US8785407B2 (en) 2006-05-10 2014-07-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection
CN201272342Y (zh) 2006-05-17 2009-07-15 S·A·索科洛娃 运输装置
DK2049664T3 (da) 2006-08-11 2012-01-02 Prosensa Technologies Bv Enkeltstrengede oligonukleotider, som er komplementære til repetitive elementer, til behandling af med DNA-repetitiv-ustabilitet associerede lidelser
US20080199961A1 (en) 2006-08-25 2008-08-21 Avi Biopharma, Inc. ANTISENSE COMPOSITION AND METHOD FOR INHIBITION OF miRNA BIOGENESIS
US20080267978A1 (en) 2006-08-28 2008-10-30 Mary Zutter Anti-angiogenic targets for cancer therapy
WO2008036406A2 (en) 2006-09-21 2008-03-27 University Of Rochester Compositions and methods related to protein displacement therapy for myotonic distrophy
FR2908999B1 (fr) 2006-11-29 2012-04-27 Biomerieux Sa Nouveau medicament destine a l'inhibition, la prevention ou le traitement de la polyarthrite rhumatoide.
EP1938802A1 (en) 2006-12-22 2008-07-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Interfering RNAs targeting pro-inflammatory cytokines
US20100016215A1 (en) 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
WO2009005793A2 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Avi Biopharma, Inc. Tissue specific peptide conjugates and methods
AU2008273094B2 (en) 2007-07-12 2013-05-09 Prosensa Technologies B.V. Molecules for targeting compounds to various selected organs, tissues or tumor cells
WO2009026412A1 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Children's Medical Center Corporation Treatment of airway hyperreactivity
CN101896186A (zh) 2007-10-26 2010-11-24 莱顿教学医院 对抗肌肉病症的方式和方法
US8076476B2 (en) 2007-11-15 2011-12-13 Avi Biopharma, Inc. Synthesis of morpholino oligomers using doubly protected guanine morpholino subunits
CA2704261C (en) 2007-11-15 2015-05-26 Avi Biopharma, Inc. Method of synthesis of morpholino oligomers
US8299206B2 (en) 2007-11-15 2012-10-30 Avi Biopharma, Inc. Method of synthesis of morpholino oligomers
EP2235034B1 (en) 2007-12-28 2016-11-23 Sarepta Therapeutics, Inc. Immunomodulatory agents and methods of use
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
EP2119783A1 (en) 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
US20110130346A1 (en) 2008-05-30 2011-06-02 Isis Innovation Limited Peptide conjugates for delvery of biologically active compounds
US8084601B2 (en) 2008-09-11 2011-12-27 Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London Oligomers
SMT201900159T1 (it) 2008-10-24 2019-05-10 Sarepta Therapeutics Inc Composizioni di salto di esone per dmd
DK2607484T3 (en) 2008-10-27 2016-03-07 Biomarin Technologies B V Methods and means for efficient skipping of exon 45 in Duchenne muscular dystrophy pre-MRNA
KR101881596B1 (ko) 2008-12-02 2018-07-24 웨이브 라이프 사이언시스 재팬 인코포레이티드 인 원자 변형된 핵산의 합성 방법
WO2010080554A1 (en) 2008-12-17 2010-07-15 Avi Biopharma, Inc. Antisense compositions and methods for modulating contact hypersensitivity or contact dermatitis
PL2417257T3 (pl) 2009-04-10 2016-11-30 Antysensowne oligonukleotydy tricyklo-dna, kompozycje i sposoby leczenia choroby
CA2759899A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Prosensa Technologies B.V. Oligonucleotide comprising an inosine for treating dmd
US20110269665A1 (en) 2009-06-26 2011-11-03 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
RU2612521C2 (ru) 2009-07-06 2017-03-09 Онтории, Инк. Новые пролекарства нуклеиновых кислот и способы их применения
ES2586683T3 (es) 2009-09-16 2016-10-18 Wave Life Sciences Japan, Inc. Grupo protector novedoso para sintetizar ARN y derivados del mismo
KR20230137491A (ko) 2009-11-12 2023-10-04 더 유니버시티 오브 웨스턴 오스트레일리아 안티센스 분자 및 이를 이용한 질환 치료방법
EP2569431B1 (en) 2010-05-13 2015-09-23 Sarepta Therapeutics, Inc. Methods for identifying compounds which modulate interleukins 17 and 23 signaling activity
NZ603606A (en) 2010-05-28 2015-06-26 Sarepta Therapeutics Inc Oligonucleotide analogues having modified intersubunit linkages and/or terminal groups
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
JP5868324B2 (ja) 2010-09-24 2016-02-24 株式会社Wave Life Sciences Japan 不斉補助基
CN103501793A (zh) 2011-02-08 2014-01-08 夏洛特-梅克伦堡医院(商业用名:卡罗来纳保健系统) 反义寡核苷酸
JP6478632B2 (ja) 2011-05-05 2019-03-06 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート
US9161948B2 (en) * 2011-05-05 2015-10-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
US9607308B2 (en) 2011-06-29 2017-03-28 American Express Travel Related Services Company, Inc. Spend based digital ad targeting and measurement
PT2581448E (pt) 2011-10-13 2015-05-21 Institut National De La Santé Et De La Rech Médicale (Inserm) Dna triciclo-fosforotioato
US9944926B2 (en) 2011-11-30 2018-04-17 Sarepta Therapeutics, Inc. Induced exon inclusion in spinal muscle atrophy
CN108611349A (zh) 2011-12-28 2018-10-02 日本新药株式会社 反义核酸
BR112014018427B1 (pt) 2012-01-27 2021-11-03 Biomarin Technologies B.V. Oligonucleotídeos moduladores de rna com características melhoradas para o tratamento da distrofia muscular de duchenne e becker
DE102012101676A1 (de) 2012-02-29 2013-08-29 Klaus-Dieter Rösler Verfahren und Vorrichtung zum Bearbeiten von Formularen mit einer Datenverarbeitungsanlage
CN110257379B (zh) 2012-07-03 2023-08-11 马林生物科技有限公司 用于治疗肌肉萎缩症患者的寡核苷酸
CN112007045A (zh) 2012-07-13 2020-12-01 波涛生命科学有限公司 手性控制
ES2862073T3 (es) 2012-07-13 2021-10-06 Wave Life Sciences Ltd Grupo auxiliar asimétrico
EP2935584A1 (en) 2012-12-20 2015-10-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Improved exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
NZ631245A (en) 2013-03-14 2017-09-29 Sarepta Therapeutics Inc Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
KR20240094032A (ko) 2013-03-14 2024-06-24 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 근육 이영양증의 치료를 위한 엑손 스키핑 조성물
HK1220154A1 (zh) * 2013-03-15 2017-04-28 Sarepta Therapeutics, Inc. 改进的用於治疗肌营养不良的组合物
US20150197534A1 (en) * 2013-09-05 2015-07-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon2 inclusion in acid alpha-glucosidase
EP3095459A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having antitumor effect and antitumor agent
US10144933B2 (en) 2014-01-15 2018-12-04 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
EP3095460A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
CN113278617A (zh) 2014-01-16 2021-08-20 波涛生命科学有限公司 手性设计
SG11201607095RA (en) 2014-03-12 2016-10-28 Nippon Shinyaku Co Ltd Antisense nucleic acids
CN111575282B (zh) 2014-06-17 2024-05-14 日本新药株式会社 反义核酸
EP3212793B1 (en) 2014-11-02 2020-01-08 Arcturus Therapeutics, Inc. Messenger una molecules and uses thereof
MA43072A (fr) 2015-07-22 2018-05-30 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
NZ781029A (en) 2015-10-09 2025-07-25 Wave Life Sciences Ltd Oligonucleotide compositions and methods thereof
EP3359668A4 (en) 2015-10-09 2019-06-05 Sarepta Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING DUCHENNE MUSCLE DYSTROPHY AND ASSOCIATED ILLNESSES THEREOF
MA45270A (fr) 2016-05-04 2017-11-09 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
MA45290A (fr) 2016-05-04 2019-03-13 Wave Life Sciences Ltd Procédés et compositions d'agents biologiquement actifs
SG10202012839TA (en) * 2016-12-19 2021-01-28 Sarepta Therapeutics Inc Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy

Also Published As

Publication number Publication date
US20180177814A1 (en) 2018-06-28
NZ755416A (en) 2023-05-26
SA519402154B1 (ar) 2022-12-19
DK3554553T3 (da) 2022-09-19
CN110290812B (zh) 2023-06-02
ES2927079T3 (es) 2022-11-02
CO2019007397A2 (es) 2019-10-09
MY195801A (en) 2023-02-22
HUE059843T2 (hu) 2023-01-28
ZA201904092B (en) 2022-01-26
IL267244A (en) 2019-08-29
US20210169919A1 (en) 2021-06-10
US11642364B2 (en) 2023-05-09
PT3554553T (pt) 2022-08-04
US10888578B2 (en) 2021-01-12
TW201828996A (zh) 2018-08-16
TWI760402B (zh) 2022-04-11
IL267244B (en) 2021-10-31
AU2017382723A1 (en) 2019-08-01
RS63610B1 (sr) 2022-10-31
PL3554553T3 (pl) 2022-11-07
JP2020503009A (ja) 2020-01-30
CN110290812A (zh) 2019-09-27
US20220280546A1 (en) 2022-09-08
AU2017382723B2 (en) 2025-01-30
JP2021045160A (ja) 2021-03-25
SG10202012839TA (en) 2021-01-28
WO2018118599A1 (en) 2018-06-28
EP3554553B1 (en) 2022-07-20
KR20230110811A (ko) 2023-07-25
KR20190099237A (ko) 2019-08-26
BR112019012647A2 (pt) 2019-11-19
IL287047A (en) 2021-12-01
EP3554553A1 (en) 2019-10-23
MX2019006882A (es) 2019-08-16
KR102810425B1 (ko) 2025-05-21
SMT202200366T1 (it) 2022-11-18
JP2023156512A (ja) 2023-10-24
JP7118063B2 (ja) 2022-08-15
US20230381216A1 (en) 2023-11-30
HRP20220943T1 (hr) 2022-10-28
KR102552428B1 (ko) 2023-07-06
LT3554553T (lt) 2022-08-25
CA3046793A1 (en) 2018-06-28
JP7691462B2 (ja) 2025-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7728923B2 (ja) 筋ジストロフィーに対するエクソンスキッピングオリゴマーコンジュゲート
JP7691462B2 (ja) 筋ジストロフィーに対するエクソンスキッピングオリゴマーコンジュゲート
JP7465320B2 (ja) 筋ジストロフィーに対するエクソンスキッピングオリゴマーコンジュゲート
HK40087674B (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40087674A (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40015449B (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40015449A (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40009617B (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40009617A (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40014131B (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40014131A (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
EA044076B1 (ru) Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии