JP2023156512A - 筋ジストロフィーに対するエクソンスキッピングオリゴマーコンジュゲート - Google Patents

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Abstract

【課題】筋ジストロフィーに対するエクソンスキッピングオリゴマーコンジュゲートの提供。【解決手段】ヒトジストロフィン遺伝子の選択した標的部位に相補的でありエクソン５１スキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載されている。一態様では、本開示は、選択した標的と結合してヒトジストロフィン遺伝子にエクソンスキッピングを誘導することが可能な長さ３０サブユニットのアンチセンスオリゴマーであって、アニーリング部位と命名されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１標的領域に相補的な塩基の配列を含むアンチセンスオリゴマー；およびアンチセンスオリゴマーとリンカー部分によりコンジュゲートした細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明
（関連情報）
本特許出願は、２０１６年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／４３６１８２号、２０１７年１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／４４３４７６号、２０１７年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／４７９１７３号および２０１７年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６２０８０号の利益を主張するものである。上記参照仮特許出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（本開示の分野）
本開示は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１スキッピングに適した新規なアンチセンスオリゴマーコンジュゲートおよびその医薬組成物に関する。本開示は、新規なアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを用いてエクソン５１スキッピングを誘導する方法、エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有する対象にジストロフィンを産生させる方法およびエクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有する対象を治療する方法も提供する。
様々な異なるレベル（転写、スプライシング、安定性、翻訳）で遺伝子発現に影響を及ぼす一連の化学的性質を用いてアンチセンス技術が開発されている。その研究の多くが、多岐にわたる適応症の異常遺伝子または疾患関連遺伝子を修正または代償するアンチセンス化合物の使用に焦点を当てたものである。アンチセンス分子は遺伝子発現を特異的に阻害することが可能であり、このため、遺伝子発現のモジュレーターとしてのオリゴマーに関する研究努力の多くが標的遺伝子の発現またはシス作用エレメントの機能を阻害することに焦点を当てたものである。アンチセンスオリゴマーは通常、センス鎖（例えば、ｍＲＮＡ）または一部のウイルスＲＮＡ標的の場合はマイナス鎖のＲＮＡに対するものである。特定の遺伝子をダウンレギュレートする所望の効果を得るには一般に、オリゴマーにより標的ｍＲＮＡの崩壊、ｍＲＮＡの翻訳阻止またはシス作用ＲＮＡエレメントの機能阻止を促進し、それにより標的タンパク質のｄｅ ｎｏｖｏ合成またはウイルスＲＮＡの複製を効率的に妨害する。
しかし、目的が天然タンパク質の産生をアップレギュレートすることまたは翻訳の中途終止を誘導するナンセンス変異もしくはフレームシフト変異などの変異を代償することである場合、このような技術は有効ではない。このような場合、欠陥遺伝子の転写物が標的化分解も立体阻害も受けてはならず、このため、アンチセンスオリゴマーの化学的性質が標的ｍＲＮＡの崩壊を促進することも、翻訳阻止を促進することもあってはならない。
様々な遺伝性疾患では、スプライシング過程で標的エクソンスキッピングの過程を介して最終的な遺伝子発現に対する変異の作用を調節することができる。スプライシング過程は複数の構成要素からなる複雑な機序により方向付けられ、この機序により、プレｍＲＮＡの隣接したエクソン・イントロン接合部が接近してイントロン末端でホスホジエステル結合が切断されたのち、一緒にスプライスされるエクソン同士の間で再編成が起こる。この複雑で精度の高い過程は、プレｍＲＮＡ内にあり、のちにスプライシング反応に関与する様々な核内スプライシング因子が結合する準保存的ＲＮＡセグメントである、比較的短い配列モチーフにより媒介される。スプライシング機序がプレｍＲＮＡのプロセシングに関与するモチーフを読み取る、または認識する仕組みを変化させることにより、異なる形でスプライスされたｍＲＮＡ分子を作製することが可能である。これまでに、ヒト遺伝子の大部分は正常な遺伝子発現の過程で選択的にスプライスされることが認められているが、それに関与する機序は明らかにされていない。Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，２１０，８９２号）は、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅＨ媒介性切断を誘導しないアンチセンスオリゴマー類似体を用いる野生型細胞内ｍＲＮＡプロセシングのアンチセンス調節について記載している。これは、選択的スプライシングを受け特定のエクソンを欠くｍＲＮＡを作製することが可能であるという点で有用である（例えば、膜貫通ドメインをコードするエクソンを欠く可溶性ＴＮＦスーパーファミリー受容体の作製についてＳａｚａｎｉ，Ｋｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００７により記載されているのを参照されたい）。
通常に機能するタンパク質がその変異により中途終止する場合、アンチセンス技術により一部の機能性タンパク質の産生を回復させる手段がスプライシング過程への介入により可能であり、また、一部の遺伝子から病原変異のあるエクソンを特異的に削除することができれば、天然タンパク質と同じ生物学的特性を有するか、エクソンにある変異によって引き起こされる疾患を改善できる程度の生物活性を有する短いタンパク質の産生が可能であることが示されている（例えば、Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ，Ｓａｍｂａｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｗｉｌｔｏｎ，Ｌｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９；ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，Ｂｒｅｍｍｅｒ－Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｕ，Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ａａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓ，Ｊａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４を参照されたい）。Ｋｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，６２７，２７４号；同第５，９１６，８０８号；同第５，９７６，８７９号；および同第５，６６５，５９３号）には、標的プレｍＲＮＡの崩壊を促進しない修飾アンチセンスオリゴマー類似体を用いて異常なスプライシングを食い止める方法が開示されている。Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，２１０，８９２号）は、同じく標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅＨ媒介性切断を誘導しないアンチセンスオリゴマー類似体を用いる野生型細胞内ｍＲＮＡプロセシングのアンチセンス調節について記載している。
標的化エクソンスキッピングの過程は、エクソンおよびイントロンが多数存在する、エクソンの遺伝子構成に冗長性がある、または１つもしくは複数の特定のエクソンがなくてもタンパク質が機能することができる長い遺伝子に特に有用であると思われる。様々な遺伝子の変異を原因とする短縮に関連する遺伝性疾患の治療のために遺伝子プロセシングを再指令するこれまでの努力は、（１）スプライシング過程に関与するエレメントと全部もしくは一部が重複している；または（２）エレメントと十分に近い位置でプレｍＲＮＡに結合して、通常そのエレメントで起こる特定のスプライシング反応を媒介するスプライシング因子の結合および機能を阻害するアンチセンスオリゴマーの使用に焦点を当てたものである。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、タンパク質ジストロフィンの発現の欠陥を原因とするものである。このタンパク質をコードする遺伝子の中には、ＤＮＡの２００万個を超えるヌクレオチドにわたって７９のエクソンが散在している。エクソンのリーディングフレームが変化する、停止コドンが導入される、あるいはアウトオブフレームエクソン（複数可）の完全な除去または１つもしくは複数のエクソンの重複を特徴とするエクソン変異があれば、機能的ジストロフィンの産生が阻害されてＤＭＤが起こる可能性がある。
比較的重症度の低い筋ジストロフィーであるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、変異、通常１つまたは複数のエクソンの欠失によりジストロフィン転写物全体にわたって正しいリーディングフレームが生じるため、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が中途終止しない場合に起こることがわかっている。変異したジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングで上流と下流のエクソンが連結されることにより正しい遺伝子のリーディングフレームが維持されれば、その結果として短い内部欠失があり一部の活性を保持するタンパク質をコードするｍＲＮＡが生じ、ベッカー型表現型となる。
長年、ジストロフィンタンパク質のリーディングフレームが変化しない１つまたは複数のエクソンの欠失があればＢＭＤ型表現型が生じるのに対し、フレームシフトを引き起こすエクソン欠失ではＤＭＤが生じることが知られている（Ｍｏｎａｃｏ，Ｂｅｒｔｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。一般に、リーディングフレームが変化し、ひいては適切なタンパク質翻訳を妨げる点変異およびエクソン欠失を含めたジストロフィン変異があるとＤＭＤが生じる。また、ＢＭＤ患者およびＤＭＤ患者の一部には複数のエクソンにわたるエクソン欠失がみられることにも注目するべきである。
アンチセンスオリゴリボヌクレオチドによる変異ジストロフィンプレｍＲＮＡのスプライシングの調節がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で報告されている（例えば、Ｍａｔｓｕｏ，Ｍａｓｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，Ｎｉｓｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｐｒａｍｏｎｏ，Ｔａｋｅｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，Ｅｐｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｗｉｌｔｏｎ，Ｌｌｏｙｄ
ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｍａｎｎ，Ｈｏｎｅｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００３を参照されたい）。
プレｍＲＮＡの特定の領域、通常はエクソンを標的としてＤＭＤ遺伝子の変異のスキッピングを誘導し、それによりこれらのアウトオブフレーム変異をインフレームに戻して内部が短縮しているが機能的なジストロフィンタンパク質の産生を可能にするアンチセンスオリゴマーが特異的に設計されている。このようなアンチセンスオリゴマーは、完全にエクソンの内部（いわゆるエクソン内部配列）またはエクソンからイントロンの一部分にわたるスプライスドナーもしくはスプライスアクセプター接合部を標的とすることが知られている。
このようなＤＭＤに対するアンチセンスオリゴマーの発見および開発がこれまでの研究の分野である。このような開発としては：（１）西オーストラリア大学およびＳａｒｅｐｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社（本願の譲受人）：国際公開第２００６／００００５７号；国際公開第２０１０／０４８５８６号；国際公開第２０１１／０５７３５０号；国際公開第２０１４／１００７１４号；国際公開第２０１４／１５３２４０号；国際公開第２０１４／１５３２２０号；（２）Ａｃａｄｅｍｉｓｃｈ Ｚｉｅｋｅｎｈｕｉｓ Ｌｅｉｄｅｎ／Ｐｒｏｓｅｎｓａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（現ＢｉｏＭａｒｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社）：国際公開第０２／２４９０６号；国際公開第２００４／０８３４３２号；国際公開第２００４／０８３４４６号；国際公開第２００６／１１２７０５号；国際公開第２００７／１３３１０５号；国際公開第２００９／１３９６３０号；国際公開第２００９／０５４７２５号；国際公開第２０１０／０５０８０１号；国際公開第２０１０／０５０８０２号；国際公開第２０１０／１２３３６９号；国際公開第２０１３／１１２０５３号；国際公開第２０１４／００７６２０号；（３）Ｃａｒｏｌｉｎａｓ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ：国際公開第２０１２／１０９２９６号；（４）ロイヤルホロウェイ：特許ならびにその利益を主張する米国特許出願第６１／０９６，０７３号および同第６１／１６４，９７８号を含めた出願；例えば米国特許第８，０８４，６０１号および米国特許出願公開第２０１７－０２０４４１３号など（４）ＪＣＲ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社およびＭａｔｓｕｏ：米国特許第６，６５３，４６６号；特許ならびにその利益を主張する特開２０００－１２５４４８号を含めた出願、例えば米国特許第６，６５３，４６７号など；特許ならびにその利益を主張する特開２０００－２５６５４７号を含めた出願、例えば米国特許第６，７２７，３５５号など；国際公開第２００４／０４８５７０号；（５）日本新薬社：国際公開第２０１２／０２９９８６号；国際公開第２０１３／１００１９０号；国際公開第２０１５／１３７４０９号；国際公開第２０１５／１９４５２０号；ならびに（６）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ
Ｍｙｏｌｏｇｉｅ／ピエール・マリー・キュリー大学／ベルン大学／フランス国立科学研究センター／Ｓｙｎｔｈｅｎａ ＡＧ：国際公開第２０１０／１１５９９３号；国際公開第２０１３／０５３９２８号のものが挙げられる。
Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎは、リードフレームを回復させ機能的な短い形態のジストロフィンタンパク質を産生させるエクソン５１スキッピングが可能なＤＭＤ患者のヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１をスキップするよう設計されたホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は２０１６年、エクソン５１スキッピングが可能なＤＭＤ遺伝子の変異が確認された患者のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）治療にＥｘｏｎｄｙｓ ５１（商標）（ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ）を承認している。
ＤＭＤに対する細胞透過性ペプチドとコンジュゲートしたアンチセンスオリゴマーの発見および開発も一研究分野となっている（国際公開第２０１０／０４８５８６号；Ｗｕ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８１（２）：３９２－４００，２０１２；Ｗｕ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３５（１５）：５１８２－５１９１，２００７；Ｍｕｌｄｅｒｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｍｕｓｃｌｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｐｏｓｔｅｒ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｅｒｌｉｎ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４；Ｂｅｓｔａｓ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ７６１７５，２０１４；Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１６（９）：１６２４－１６２９，２００８；Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８５：４４４－４５３，２０１０；Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．３５（４）：８２６－８２８，２００７；Ｙｉｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１９（７）：１２９５－１３０３，２０１１；Ａｂｅｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１４：４５５－４６０，２００８；Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．６０：５１７－５２９，２００８；ＭｃＣｌｏｒｅｙ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１３：１３７３－１３８１，２００６；Ａｌｔｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１２（２）：１７５－１７７，２００６；およびＹｏｕｎｇｂｌｏｏｄ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２００７，１８（１），ｐｐ５０－６０を参照されたい）。
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、例えばアルギニンリッチペプチド輸送部分は、例えばＣＰＰとコンジュゲートしたアンチセンスオリゴマーの細胞内への透過を増大させるのに効果的であると思われる。
このような努力にもかかわらず、ジストロフィンを産生させＤＭＤを治療する治療法に潜在的に有用なエクソン５１を標的とする改善されたアンチセンスオリゴマーならびにそれに対応する医薬組成物が依然として必要とされている。
米国特許第６，２１０，８９２号明細書
本明細書に提供されるアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ＣＰＰとコンジュゲートしたアンチセンスオリゴマー部分を含む。一態様では、本開示は、
選択した標的と結合してヒトジストロフィン遺伝子にエクソンスキッピングを誘導することが可能な長さ３０サブユニットのアンチセンスオリゴマーであって、アニーリング部位と命名されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１標的領域に相補的な塩基の配列を含むアンチセンスオリゴマー；および
アンチセンスオリゴマーとリンカー部分によりコンジュゲートした細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
を含む、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。
いくつかの実施形態では、アニーリング部位はＨ５１Ａ（＋６６＋９５）である。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーの塩基はモルホリノ環構造と結合しており、モルホリノ環構造は、１つの環構造のモルホリノ窒素と、隣接する環構造の５’環外炭素とを連結する亜リン酸含有サブユニット間結合により連結されている。ある特定の実施形態では、細胞透過性ペプチドは６アルギニン単位（「Ｒ６」）であり、リンカー部分はグリシンである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１と命名される塩基の配列を含む。
様々な態様では、本開示は、式（Ｉ）：
によるものであり得るアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を提供し、式中：
各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり；
Ｔは：
から選択される部分であり；
Ｒ１はＣ１～Ｃ６アルキルであり；
標的化配列は、Ｈ５１Ａ（＋６６＋９５）と命名されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１アニーリング部位に相補的である。
また別の態様では、本開示は、式（ＩＶ）：
のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を提供する。
また別の態様では、本開示は、式（ＩＶＡ）：
のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。
また別の態様では、本開示は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、リン酸緩衝剤を含む生理食塩水である。
また別の態様では、本開示は、必要とする対象のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する方法を提供し、ここでは、対象はエクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、対象に本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを投与することを含む。本開示は、必要とする対象のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療のための薬物の製造への本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの使用にも関するものであり、ここでは、対象はエクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有する。
また別の態様では、本開示は、エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有する対象にｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてジストロフィン産生を誘導する方法であって、対象に本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを投与することを含む、方法を提供する。また別の態様では、本開示は、エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡプロセシング時にジストロフィンプレｍＲＮＡからエクソン５１を排除する方法であって、対象に本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを投与することを含む、方法を提供する。また別の態様では、本開示は、エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１を結合させる方法であって、対象に本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを投与することを含む、方法を提供する。
また別の態様では、本開示は、治療に使用する本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用する本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、治療に使用する薬物の製造に使用する本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための薬物の製造に使用する本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。
また別の態様では、本開示は、必要とする対象のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療するためのキットも提供し、ここでは、対象はエクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有し、キットは、適切な容器に包装された少なくとも１つの本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートと、その使用のための指示とを含む。
上記およびその他の目的および特徴については、以下の本開示の詳細な説明を図面と併せて読めばさらに十全に理解されよう。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
式（Ｉ）
のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートであって、
式中、各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり；
Ｔが、
から選択される部分であり；
Ｒ１がＣ１～Ｃ６アルキルであり；
前記標的化配列が、Ｈ５１Ａ（＋６６＋９５）と命名されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１アニーリング部位に相補的である、
アンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
（項目２）
Ｎｕがそれぞれ独立に、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される、項目１に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
（項目３）
前記標的化配列が配列番号１（５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’）であり、式中、各チミン（Ｔ）が必要に応じてウラシル（Ｕ）である、項目１に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
（項目４）
Ｔが
であり、前記標的化配列が配列番号１（５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’）であり、式中、各チミン（Ｔ）が必要に応じてウラシル（Ｕ）である、項目１に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
（項目５）
Ｔが
であり、前記標的化配列が配列番号１（５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’）である、項目１に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
（項目６）
式（ＩＩ）
のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートであって、
式中、１～３０および５’～３’の各Ｎｕが（配列番号１）：
であり、表中、Ａが
であり、Ｃが
であり、Ｇが
であり、Ｘがそれぞれ独立に
である、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
（項目７）
各Ｘが
である、項目６に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
（項目８）
前記アンチセンスオリゴマーが式（ＩＩＡ）：
のものであり、式中、１～３０および５’～３’の各Ｎｕが（配列番号１）：
であり、表中、Ａが
であり、Ｃが
であり、Ｇが
であり、Ｘがそれぞれ独立に
である、項目６に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
（項目９）
各Ｘが
である、項目８に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
（項目１０）
式（ＩＶ）
のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
（項目１１）
前記アンチセンスオリゴマーが式（ＩＶＡ）
のものである、項目９に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
（項目１２）
項目１～１１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
（項目１３）
必要とする対象のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する方法であって、前記対象が、エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有し、前記方法が、前記対象に項目１～１１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを投与することを含む、方法。
（項目１４）
前記アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎週投与する、項目１３に記載の方法。（項目１５）
前記アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを隔週に投与する、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを３週間毎に投与する、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎月投与する、項目１３に記載の方法。（項目１８）
エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有する対象のｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてジストロフィン産生を誘導する方法であって、前記対象に項目１～１１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを投与することを含む、方法。
（項目１９）
前記アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎週投与する、項目１８に記載の方法。（項目２０）
前記アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを隔週に投与する、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを３週間毎に投与する、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎月投与する、項目１８に記載の方法。（項目２３）
必要とする対象のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する方法であって、前記対象が、エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有し、前記方法が、前記対象に項目１２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
（項目２４）
エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有する対象のｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてジストロフィン産生を誘導する方法であって、前記対象に項目１２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
（項目２５）
エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡプロセシング時にジストロフィンプレｍＲＮＡからエクソン５１を排除する方法であって、前記対象に項目１２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
（項目２６）
エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有する対象のジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１を結合させる方法であって、前記対象に項目１２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
図１は、正常なジストロフィンプレｍＲＮＡおよび成熟ｍＲＮＡのセクションを示す。 図２は、異常なジストロフィンプレｍＲＮＡ（ＤＭＤの例）のセクションおよびそれによって生じる非機能性で不安定なジストロフィンを示す。 図３は、エクソン５１をスキップし、プレｍＲＮＡの「インフレーム」リーディングを回復させて、内部欠損のあるジストロフィンを産生させるよう設計されたＥｔｅｐｌｉｒｓｅｎを示す。 図４は、処置から９６時間後にＲＴ－ＰＣＲにより測定した分化ヒト筋細胞での様々な濃度のＰＭＯ＃１およびＰＰＭＯ＃１によるエクソン５１スキッピングの割合の棒グラフである。 図５Ａ～図５Ｄは、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの四頭筋のジストロフィンタンパク質を測定したウエスタンブロット解析の様々な時点［７日後（５Ａ）、３０日後（５Ｂ）、６０日後（５Ｃ）および９０日後（５Ｄ）］を代表する画像である。 同上。 図６Ａは、ウエスタンブロット解析により求めた、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によってｍｄｘマウスの四頭筋に誘導された野生型ジストロフィンの割合を注射後９０日間にわたって示す線グラフである。 図６Ｂは、ＲＴ－ＰＣＲによって求めた、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によってｍｄｘマウスの四頭筋に誘導されたエクソン２３スキッピングの割合を注射後９０日間にわたって示す線グラフである。 図７Ａ～図７Ｄは、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの横隔膜のジストロフィンタンパク質を測定したウエスタンブロット解析の様々な時点［７日後（７Ａ）、３０日後（７Ｂ）、６０日後（７Ｃ）および９０日後（７Ｄ）］を代表する画像である。 同上。 図８Ａは、ウエスタンブロット解析により求めた、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によってｍｄｘマウスの横隔膜に誘導された野生型ジストロフィンの割合を注射後９０日間にわたって示す線グラフである。 図８Ｂは、ＲＴ－ＰＣＲにより求めた、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によってｍｄｘマウスの横隔膜に誘導されたエクソン２３スキッピングの割合を注射後９０日間にわたって示す線グラフである。 図９Ａ～図９Ｄは、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの心臓のジストロフィンタンパク質を測定したウエスタンブロット解析の様々な時点［７日後（９Ａ）、３０日後（９Ｂ）、６０日後（９Ｃ）および９０日後（９Ｄ）］を代表する画像である。 同上。 図１０Ａは、ウエスタンブロット解析により求めた、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によってｍｄｘマウスの心臓に誘導された野生型ジストロフィンの割合を注射後９０日間にわたって示す線グラフである。 図１０Ｂは、ＲＴ－ＰＣＲにより求めた、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によってｍｄｘマウスの心臓に誘導されたエクソン２３スキッピングの割合を注射後９０日間にわたって示す線グラフである。 図１１は、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によってｍｄｘマウスの左側四頭筋に誘導されたジストロフィンを示す免疫組織化学解析を示す。 図１２は、様々な用量のＰＭＯ＃１またはＰＰＭＯ＃１で毎週、４週間にわたって処置した非ヒト霊長類のパーセントエクソン５１スキッピングを示す線グラフである。横隔膜（左側）および四頭筋（右側）の筋肉試料からＲＴ－ＰＣＲによって求められるパーセントエクソン５１スキッピングを測定した。 図１３は、様々な用量のＰＭＯ＃１またはＰＰＭＯ＃１で毎週、４週間にわたって処置した非ヒト霊長類のパーセントエクソン５１スキッピングを示す線グラフである。心臓（左側）および十二指腸（右側）の筋肉試料からＲＴ－ＰＣＲによって求められるパーセントエクソン５１スキッピングを測定した。 図１４は、様々な用量のＰＭＯ＃１またはＰＰＭＯ＃１で毎週、４週間にわたって処置した非ヒト霊長類のパーセントエクソン５１スキッピングを示す線グラフである。二頭筋（左側）および三角筋（右側）の筋肉試料からＲＴ－ＰＣＲによって求められるパーセントエクソン５１スキッピングを測定した。 図１５は、様々な用量のＰＭＯ＃１またはＰＰＭＯ＃１で毎週、４週間にわたって処置した非ヒト霊長類のパーセントエクソン５１スキッピングを示す線グラフである。食道（左側）および大動脈（右側）の筋肉試料からＲＴ－ＰＣＲによって求められるパーセントエクソン５１スキッピングを測定した。 図１６Ａ～図１６Ｂは、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの心臓のジストロフィンタンパク質を測定した、様々な用量、すなわち、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇおよび１２０ｍｇ／ｋｇについてのウエスタンブロット解析の代表画像である。 図１７は、様々な用量、すなわち、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇおよび１２０ｍｇ／ｋｇで注射してから３０日後にウエスタンブロット解析により求めた、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によってｍｄｘマウスの心臓に誘導された野生型ジストロフィンの割合を示す棒グラフである。 図１８Ａ～図１８Ｂは、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの横隔膜のジストロフィンタンパク質を測定した、様々な用量、すなわち、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇおよび１２０ｍｇ／ｋｇについてのウエスタンブロット解析の代表画像である。 図１９は、様々な用量、すなわち、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇおよび１２０ｍｇ／ｋｇで注射してから３０日後にウエスタンブロット解析により求めた、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によってｍｄｘマウスの横隔膜に誘導された野生型ジストロフィンの割合を示す棒グラフである。 図２０Ａ～図２０Ｂは、様々な用量、すなわち、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇおよび１２０ｍｇ／ｋｇのＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの四頭筋のジストロフィンタンパク質を測定したウエスタンブロット解析の代表画像である。 図２１は、様々な用量、すなわち、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇおよび１２０ｍｇ／ｋｇで注射してから３０日後にウエスタンブロット解析により求めた、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によってｍｄｘマウスの四頭筋に誘導された野生型ジストロフィンの割合を示す棒グラフである。 図２２は、単回用量４０ｍｇ／ｋｇのＰＰＭＯ＃１で処置した非ヒト霊長類の注射から３０日後および６０日後のパーセントエクソン５１スキッピングを示す棒グラフである。四頭筋、横隔膜、心臓およびＧＩ管の筋肉試料からＲＴ－ＰＣＲによって求められるパーセントエクソン５１スキッピングを測定した。 図２３は、ＰＭＯの合成方法Ｂにより実施したカップリングサイクルを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２４は、ｍｄｘマウスおよび野生型マウスを用いて、ＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によってｍｄｘマウスの横隔膜および心臓に誘導されるジストロフィンおよびラミニンを生理食塩水と比較したものを示す免疫組織化学解析を示す。 図２５は、処置から９６時間後にＲＴ－ＰＣＲにより測定した健常ヒト筋芽細胞での様々な濃度のＰＭＯ＃１およびＰＰＭＯ＃１によるエクソン５１スキッピングの割合の棒グラフである。エラーバーは平均±ＳＤを表す。 図２６は、処置から９６時間後にＲＴ－ＰＣＲにより測定した健常ヒト筋管での様々な濃度のＰＭＯ＃１およびＰＰＭＯ＃１によるエクソン５１スキッピングの割合の棒グラフである。エラーバーは平均±ＳＤを表す。
実施形態の説明
（開示の詳細な説明）
本開示の諸実施形態は一般に、ヒトジストロフィン遺伝子にエクソンスキッピングを誘導するよう特異的に設計された改善されたアンチセンスオリゴマーコンジュゲートおよびその使用方法に関する。ジストロフィンは筋肉の機能に極めて重要な役割を果たしており、筋肉に関連する様々な疾患は変異型のジストロフィン遺伝子を特徴とする。このため、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される改善されたアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、変異型のヒトジストロフィン遺伝子、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）にみられる変異ジストロフィン遺伝子などにエクソンスキッピングを誘導するものである。
これらの変異ヒトジストロフィン遺伝子は、変異を原因とする異常なｍＲＮＡスプライシング事象により、欠陥のあるジストロフィンタンパク質を発現するか、測定可能なジストロフィンを全く発現しないようになり、このような病態が様々な形態の筋ジストロフィーを引き起こす。この病態を治療するため、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは変異ヒトジストロフィン遺伝子のプロセシング前のｍＲＮＡの選択した領域とハイブリダイズし、本来であれば異常にスプライスされるジストロフィンｍＲＮＡにエクソンスキッピングおよびディファレンシャルスプライシングを誘導し、それにより筋細胞に機能性ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物を産生させる。ある特定の実施形態では、得られるジストロフィンタンパク質は必ずしも「野生型」のジストロフィンであるわけではなく、むしろ短縮されているが、それでも機能型のジストロフィンである。
筋細胞内の機能性ジストロフィンタンパク質のレベルを増大させることにより、これらおよびそれに関連する実施形態は筋ジストロフィー、特に、異常なｍＲＮＡスプライシングに起因する欠陥ジストロフィンタンパク質の発現を特徴とするＤＭＤおよびＢＭＤなどの形態の筋ジストロフィーの予防および治療に有用である。本明細書に記載される特異的アンチセンスオリゴマーコンジュゲートはさらに、ジストロフィンエクソン特異的標的化が他のオリゴマーより改善されており、それにより、関連する形態の筋ジストロフィーの別の治療方法より重要性および実用性の面で優れた利点をもたらす。
したがって、本開示は、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートであって、
選択した標的と結合してヒトジストロフィン遺伝子にエクソンスキッピングを誘導することが可能な長さ３０サブユニットのアンチセンスオリゴマーであって、アニーリング部位と命名されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１標的領域に相補的な塩基の配列を含む、アンチセンスオリゴマー；および
アンチセンスオリゴマーとリンカー部分によりコンジュゲートした細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
を含む、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートに関する。
いくつかの実施形態では、アニーリング部位はＨ５１Ａ（＋６６＋９５）である。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーの塩基はモルホリノ環構造と結合しており、モルホリノ環構造は、１つの環構造のモルホリノ窒素と、隣接する環構造の５’環外炭素とを連結する亜リン酸含有サブユニット間結合により連結されている。ある特定の実施形態では、細胞透過性ペプチドはＲ６であり、リンカー部分はグリシンである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１と命名される塩基配列を含み、式中、各チミン塩基（Ｔ）は必要に応じてウラシル塩基（Ｕ）である。
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の実施または検証には、本明細書に記載されるものと類似した、または等価の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料を記載する。本開示を目的として、これより以下の用語を定義する。
Ｉ．定義
「約」は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、大きさ、量、重量または長さに対して３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％だけばらつきのある数量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、大きさ、量、重量または長さを意味する。
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、特に明記されない限り、飽和の直鎖または分岐鎖炭化水素を指す。ある特定の実施形態では、アルキル基は、第一級、第二級または第三級炭化水素である。ある特定の実施形態では、アルキル基は１～１０個の炭素原子、すなわち、Ｃ１～Ｃ１０アルキルを含む。ある特定の実施形態では、アルキル基は１～６個の炭素原子、すなわち、Ｃ１～Ｃ６アルキルを含む。ある特定の実施形態では、アルキル基は、メチル、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＦＣ１２、ＣＦ２Ｃｌ、エチル、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、３－メチルペンチル、２，２－ジメチルブチルおよび２，３－ジメチルブチルからなる群より選択される。この用語は、ハロゲン化アルキル基を含めた置換アルキル基および未置換アルキル基をともに包含する。ある特定の実施形態では、アルキル基はフッ素化アルキル基である。アルキル基を置換することができる部分の非限定的な例は、保護されていない、または必要に応じて、当業者に公知のように、例えば参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，第２版，１９９１に教示されるように保護されている、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸またはホスホネートからなる群より選択される。
本明細書で対象または患者に関して使用される「エクソン５１スキッピングが可能である」は、ジストロフィン遺伝子に１つまたは複数の変異があり、その変異は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１をスキップしなければリーディングフレームがアウトオブフレームになり、それによりプレｍＲＮＡの翻訳が障害を受け、対象または患者が機能性または半機能性のジストロフィンを産生することができなくなるものである、対象および患者を包含するものとする。エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異の例としては、例えば、エクソン４５～５０、エクソン４７～５０、エクソン４８～５０、エクソン４９～５０、エクソン５０、エクソン５２およびエクソン５２～６３の変異が挙げられる（ライデンデュシェンヌ型筋ジストロフィー変異データベース、ライデン大学医療センター、オランダ）。ある患者がエクソンスキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有するかどうかの判定は、当業者の理解の範囲内に十分に収まるものである（例えば、Ａａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．３０：２９３－２９９；Ｇｕｒｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２００９；３０（４）６３３－６４０；およびＦｌｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８（６）１２１８－１２２３を参照されたい）。
本明細書で使用される「オリゴマー」という用語は、サブユニット間結合によって連結した一続きのサブユニットを指す。ある特定の場合には、「オリゴマー」という用語は「アンチセンスオリゴマー」に関連して使用される。「アンチセンスオリゴマー」については、各サブユニットは：（ｉ）リボース糖またはその誘導体；および（ｉｉ）それと結合した核酸塩基であって、サブユニット、サブユニット間結合またはその両方が天然に存在するものではないことを条件として、塩基対形成部分の順序がワトソン・クリック型塩基対形成により核酸（通常、ＲＮＡ）内の標的配列に相補的な塩基配列を形成して標的配列内で核酸：オリゴマーヘテロ二本鎖を形成するような核酸塩基からなる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーはＰＭＯである。他の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは２’－Ｏ－メチルホスホロチオアートである。他の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）または２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン－架橋化核酸（ＥＮＡ）などの架橋化核酸（ＢＮＡ）である。本明細書にはさらなる例示的実施形態も記載する。
「相補的」および「相補性」という用語は、ワトソン・クリック型塩基対形成の法則により互いに関連し合う２つ以上のオリゴマー（すなわち、それぞれが核酸塩基配列を含む）を指す。例えば、核酸塩基配列「Ｔ－Ｇ－Ａ（５’→３’）」は核酸塩基配列「Ａ－Ｃ－Ｔ（３’→５’）」に相補的である。相補性は「部分的」なものであり得、この場合、所与の核酸塩基配列の全部に満たない数の核酸塩基が塩基対形成の法則に従って他の核酸塩基配列とマッチする。例えば、いくつかの実施形態では、所与の核酸塩基配列と他方の核酸塩基配列との間の相補性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％であり得る。あるいは、所与の核酸塩基配列と他方の核酸塩基配列との間に「全面的」または「完全」な（１００％の）相補性が存在し、その例が続くこともある。核酸塩基配列間の相補性の高さは、配列間のハイブリダイゼーション効率および強さに大きな影響を及ぼす。
「有効量」および「治療有効量」という用語は、本明細書では互換的に使用され、単回投与として、または一連の投与の一部として哺乳動物対象に投与され、所望の治療効果を得るのに有効なアンチセンスオリゴマーなどの治療用化合物の量を指す。アンチセンスオリゴマーでは、この効果は通常、選択した標的配列の翻訳もしくは自然なスプライスプロセシングの阻害または臨床的に意義のある量のジストロフィン（統計的有意性）の産生によってもたらされる。
いくつかの実施形態では、有効量は、対象を治療する一定期間の間、アンチセンスオリゴマーを含む少なくとも１０ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの組成物である。いくつかの実施形態では、対象のジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも２０％まで増大させる有効量は、アンチセンスオリゴマーを含む少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの組成物である。ある特定の実施形態では、患者の歩行距離を例えば６ＭＷＴで健常な同等者に対して２０％の不足から安定化、維持または改善する有効量は、アンチセンスオリゴマーを含む１０ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの組成物である。様々な実施形態では、有効量は、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇまたは約３０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇまたは約５０ｍｇ／ｋｇである。別の態様では、有効量は、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間または少なくとも４８週間にわたって少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇまたは約３０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇであり、それにより、対象のジストロフィン陽性線維の数が正常の少なくとも２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％に増大し、患者の歩行距離が例えば６ＭＷＴで健常な同等者に対して２０％の不足から安定化または改善する。いくつかの実施形態では、治療により患者のジストロフィン陽性線維の数が正常の２０～６０％または３０～５０％に増大する。
「増強する」もしくは「増強すること」、「増大させる」もしくは「増大させること」または「刺激する」もしくは「刺激すること」は一般に、１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは医薬組成物が、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートがない場合に、または対照化合物によって引き起こされる反応と比較して、細胞または対象の生理反応（すなわち、下流の作用）の増大を生じさせる、または引き起こすことができることを指す。生理反応の増大としては、当該技術分野での理解および本明細書の記載から明らかな反応の中でも特に、機能型ジストロフィンタンパク質の発現増大または筋組織のジストロフィンに関連する生物活性の増大を挙げ得る。筋機能の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増大または改善を含めた筋機能の増大も測定することができる。筋線維のジストロフィン発現の約１％、２％、５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増大を含めた機能性ジストロフィンを発現する筋線維の割合も測定することができる。例えば、線維の２５～３０％がジストロフィンを発現すれば、筋機能に約４０％の改善が生じ得ることが示されている（例えば、ＤｅｌｌｏＲｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１２９７９－１２９８４，２００２を参照されたい）。「増大した」または「増強された」量は通常、「統計的に有意な」量であり、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートがない場合に（薬剤の不在下で）または対照化合物によってもたらされる量の１．１倍、１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍の、またはそれを上回る（例えば、５００倍、１０００倍、間のおよび１より大きいあらゆる整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）増大がこれに含まれ得る。
本明細書で使用される「機能」および「機能性」などの用語は、生物学的、酵素的または治療的機能を指す。
「機能性」ジストロフィンタンパク質は一般に、通常ＤＭＤまたはＢＭＤを有する特定の対象に存在する変化型または「欠陥」型のジストロフィンタンパク質と比較して、筋ジストロフィーの別の特徴である進行性の筋組織分解を抑えるのに十分な生物活性を有するジストロフィンタンパク質を指す。ある特定の実施形態では、機能性ジストロフィンタンパク質は、当該技術分野で日常的な技術による測定で、野生型ジストロフィンのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの生物活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（間のあらゆる整数を含む）の生物活性を有し得る。一例として、筋管の大きさ、筋原線維の組織化（または組織崩壊）、収縮活動およびアセチルコリン受容体の自発的クラスター形成により筋培養物のジストロフィンによる活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することができる（例えば、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１１２：２０９－２１６，１９９９を参照されたい）。動物モデルも疾患の原因の研究に価値ある資源であり、ジストロフィンによる活性を試験する手段となる。ＤＭＤの研究に最も広く用いられている２種類の動物モデルが、ｍｄｘマウスとゴールデンレトリーバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）イヌであり、ともにジストロフィン陰性である（例えば、ＣｏｌｌｉｎｓおよびＭｏｒｇａｎ，Ｉｎｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ ８４：１６５－１７２，２００３を参照されたい）。上記およびその他の動物モデルを用いて様々なジストロフィンタンパク質の機能活性を測定することができる。短縮型のジストロフィン、例えば本開示の特定のエクソンスキッピングアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの投与後に生じる短縮型などが含まれる。
「ミスマッチ（１つまたは複数）」という用語は、オリゴマー核酸塩基配列内にあり塩基対形成の法則に従い標的プレｍＲＮＡとマッチしない１個または複数個の核酸塩基（連続しているか、分離しているかを問わない）を指す。完全な相補性が望まれることが多いが、いくつかの実施形態は、標的プレｍＲＮＡに対して１つまたは複数、好ましくは６つ、５つ、４つ、３つ、２つまたは１つのミスマッチを含み得る。オリゴマー内の任意の位置にあるばらつきが含まれる。ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、内部の末端のばらつき付近の核酸塩基配列にばらつきを含み、それが存在する場合、通常、５’末端および／または３’末端の約６個、５個、４個、３個、２個または１個以内のサブユニットである。
「モルホリノ」、「モルホリノオリゴマー」および「ＰＭＯ」という用語は、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７：１８７－１９５（１９９７）の図２に記載されている以下の一般構造：
のホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーを指す。本明細書に記載されるモルホリノは、上記の一般構造のあらゆる立体異性体および互換異性体を包含する。モルホリノオリゴマーの合成、構造および結合特性については米国特許第５，６９８，６８５号；同第５，２１７，８６６号；同第５，１４２，０４７号；同第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，５２１，０６３号；同第５，５０６，３３７号；同第８，０７６，４７６号；および同第８，２９９，２０６号に詳述されており、上記の特許はいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、モルホリノをオリゴマーの５’末端または３’末端で「テール」部分とコンジュゲートして、その安定性および／または溶解性を増大させる。例示的テールとしては：
が挙げられる。
上記の例示的テール部分のうち、「ＴＥＧ」または「ＥＧ３」は以下のテール部分：
を指す。
上記の例示的テール部分のうち、「ＧＴ」は以下のテール部分：
を指す。
本明細書で使用される「－Ｇ－Ｒ６」および「－Ｇ－Ｒ６－Ａｃ」という用語は互換的に使用され、本開示のアンチセンスオリゴマーとコンジュゲートしたペプチド部分を指す。様々な実施形態では、「Ｇ」は、「Ｒ６」とアミド結合によりコンジュゲートしたグリシン残基を表し、「Ｒ」はそれぞれ、アミド結合により互いにコンジュゲートしたアルギニン残基を表し、したがって、「Ｒ６」は、アミド結合により互いにコンジュゲートした６つの（６）アルギニン残基を意味する。アルギニン残基は任意の立体配置を有するものであり得、例えば、アルギニン残基はＬ－アルギニン残基、Ｄ－アルギニン残基またはＤ－アルギニン残基とＬ－アルギニン残基の混合物であり得る。ある特定の実施形態では、「－Ｇ－Ｒ６」または「－Ｇ－Ｒ６－Ａｃ」は、本開示のＰＭＯアンチセンスオリゴマーの最も３’側のモルホリノサブユニットのモルホリン環窒素とコンジュゲートしている。いくつかの実施形態では、「－Ｇ－Ｒ６」または「－Ｇ－Ｒ６－Ａｃ」は、本開示のアンチセンスオリゴマーの３’末端とコンジュゲートしており、以下の式：
のものである。
「核酸塩基」（Ｎｕ）、「塩基対形成部分」または「塩基」という用語は、天然に存在する、または「天然の」ＤＮＡまたはＲＮＡにみられるプリン塩基またはピリミジン塩基（例えば、ウラシル、チミン、アデニン、シトシンおよびグアニン）ならびにこれらの天然に存在するプリンおよびピリミジンの類似体を指すのに互換的に使用される。これらの類似体は、オリゴマーに結合親和性などの特性の改善をもたらし得る。例示的類似体としては、ヒポキサンチン（イノシンの塩基成分）；２，６－ジアミノプリン；５－メチルシトシン；Ｃ５－プロピニル修飾ピリミジン；１０－（９－（アミノエトキシ）フェノキサジニル）（Ｇクランプ）などが挙げられる。
塩基対形成部分のさらなる例としては、特に限定されないが、アミノ基がそれぞれアシル保護基によって保護されたウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニンおよびヒポキサンチン（イノシン）、２－フルオロウラシル、２－フルオロシトシン、５－ブロモウラシル、５－ヨードウラシル、２，６－ジアミノプリン、アザシトシン、ピリミジン類似体、例えばプソイドイソシトシンおよびプソイドウラシルならびにその他の修飾核酸塩基、例えば８－置換プリン、キサンチンまたはヒポキサンチン（最後の２つは天然の分解産物である）などが挙げられる。ＣｈｉｕおよびＲａｎａ，ＲＮＡ，２００３，９，１０３４－１０４８；Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，２１８３－２１９６；ならびにＲｅｖａｎｋａｒおよびＲａｏ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７，３１３に開示されている修飾核酸塩基も企図され、上記参考文献の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
塩基対形成部分のさらなる例としては、特に限定されないが、ベンゼン環が１つまたは複数付加されサイズが増大した核酸塩基が挙げられる。Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）；Ｋｒｕｅｇｅｒ ＡＴ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００７，４０，１４１－１５０；Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００２，３５，９３６－９４３；Ｂｅｎｎｅｒ Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，６，５５３－５４３；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００３，７，７２３－７３３；およびＨｉｒａｏ，Ｉ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，１０，６２２－６２７に記載されている核酸塩基置換が本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーコンジュゲートに有用であるものとして企図され、上記参考文献の内容が参照により本明細書に組み込まれる。サイズが増大した核酸塩基の例としては、以下に示すもの
およびその互変異性型が挙げられる。
本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口的に投与する」という語句は、経腸および局所投与以外の通常は注射による投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内および胸骨内への注射および注入が非限定的に含まれる。
明確にするため、例えば式（ＩＶ）を含めた本開示の構造は、５’から３’まで連続したものであり、構造全体をコンパクトな形態で図示する都合上、「中断Ａ」、「中断Ｂ」および「中断Ｃ」と表示される様々な図の中断が含まれている。当業者であれば理解されるように、例えば、「中断Ａ」という表示はそれぞれ、構造の図がその地点で連続していることを示す。当業者には、上の構造の「中断Ｂ」および「中断Ｃ」の場合もそれぞれ同じことが当てはまることが理解される。しかし、図の中断はいずれも、上の構造が実際に不連続であることを意味することを意図するものではなく、また当業者にも、図の中断がそのような意味を有するものと理解されるものではない。
本明細書で使用される場合、構造式内で使用される１組の括弧は、括弧と括弧の間にある構造的特徴が反復されることを示す。いくつかの実施形態では、使用される括弧は「［」と「］」であり得、ある特定の実施形態では、反復される構造的特徴を示すのに使用される括弧は「（」と「）」であり得る。いくつかの実施形態では、括弧と括弧の間にある構造的特徴の反復回数は、括弧の外に示される２、３、４、５、６、７などの数字である。様々な実施形態では、括弧と括弧の間にある構造的特徴の反復回数は、括弧の外に示される「Ｚ」などの変数によって示される。
本明細書で使用される場合、構造式内のキラル炭素原子またはキラルリン原子に対して描かれる直線状の結合または曲がりくねった結合は、そのキラル炭素またはキラルリンの立体化学が定まったものではなく、あらゆる形態のキラル中心を含むことを意図するものであることを示す。このような図示の例を下に示す。
「薬学的に許容される」という語句は、物質または組成物が、製剤を構成する他の成分および／またはそれで治療する対象と化学的かつ／または毒物学的に適合性があるものでなければならないことを意味する。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、任意のタイプの無毒性で不活性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、封入材料または製剤助剤を意味する。薬学的に許容される担体としての役割を果たし得る材料のいくつかの例として、製剤者の判断により、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびバレイショデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤ワックスなどの補形剤；ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；無発熱物質水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；無毒性で適合性のある滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム；着色剤；放出剤；コーティング剤；甘味剤；香味剤；着香剤；保存剤ならびに抗酸化剤がある。
ジストロフィンの合成または産生に関する「回復」という用語は一般に、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーコンジュゲートで治療した後、筋ジストロフィー患者に短縮型のジストロフィンを含めたジストロフィンタンパク質が産生されることを指す。いくつかの実施形態では、治療により患者の新たなジストロフィン産生が１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（間のあらゆる整数を含む）増大する。いくつかの実施形態では、治療により対象のジストロフィン陽性線維の数が正常の少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％～１００％まで増大する。他の実施形態では、治療により対象のジストロフィン陽性線維の数が正常の約２０％～約６０％または約３０％～約５０％まで増大する。治療後の患者のジストロフィン陽性線維のパーセントは、既知の技術を用いて筋生検により求めることができる。例えば、患者の上腕二頭筋などの適切な筋肉から筋生検試料を採取し得る。
治療前および／または治療後あるいは治療過程全体を通じた複数の時点でジストロフィン陽性線維の割合の解析を実施し得る。いくつかの実施形態では、治療前の生検と反対側の筋肉から治療後の生検試料を採取する。ジストロフィンに適した任意のアッセイを用いて治療前および治療後のジストロフィン発現解析を実施し得る。いくつかの実施形態では、筋生検から得た組織切片にジストロフィンのマーカーとなるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの抗体を用いて免疫組織化学的検出を実施する。例えば、高感度のジストロフィンマーカーであるＭＡＮＤＹＳ１０６抗体を使用することができる。任意の適切な二次抗体を使用し得る。
いくつかの実施形態では、陽性線維の数をカウントした総線維数で除することによりジストロフィン陽性線維のパーセントを算出する。正常な筋試料ではジストロフィン陽性線維が１００％である。したがって、ジストロフィン陽性線維のパーセントを正常に対する割合で表すことができる。治療前の筋肉および復帰変異体線維中にジストロフィンが微量に存在することを考慮に入れて制御するため、治療後の筋肉中のジストロフィン陽性線維をカウントする際に、患者の治療前の筋肉の切片を用いてベースラインを設定することができる。これをその患者の治療後の筋肉の切片に存在するジストロフィン陽性線維をカウントする際の閾値として使用し得る。他の実施形態では、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像解析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ社、ナッシュビル、テネシー州）を用いるジストロフィン定量化に抗体で染色した組織切片を使用することもできる。総ジストロフィン蛍光シグナル強度を正常に対する割合で報告することができる。さらに、モノクローナルまたはポリクローナル抗ジストロフィン抗体によるウエスタンブロット解析を用いてジストロフィン陽性線維の割合を求めることができる。例えば、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の抗ジストロフィン抗体ＮＣＬ－Ｄｙｓ１を使用し得る。サルコグリカン複合体（β、γ）および／または神経型ＮＯＳの成分の発現を求めることによりジストロフィン陽性線維の割合を解析することもできる。
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートでの治療により、治療を実施しない場合にＤＭＤ患者に予想される進行性の呼吸筋機能障害および／または呼吸筋不全が緩徐化または軽減される。いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートでの治療により、治療を実施しない場合に予想される呼吸補助の必要性が軽減または除去され得る。いくつかの実施形態では、疾患の経過を追跡する呼吸機能測定値および治療的介入の可能性の評価に最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）および努力肺活量（ＦＶＣ）を含める。ＭＩＰおよびＭＥＰはそれぞれ、人が吸息時および呼息時に発生させることができる圧力のレベルを測定するものであり、感度の高い呼吸筋力の尺度である。ＭＩＰは横隔膜筋力低下の尺度の１つである。
いくつかの実施形態では、ＭＩＰおよびＦＶＣを含めた他の肺機能検査値が変化する前にＭＥＰが低下し得る。ある特定の実施形態では、ＭＥＰを呼吸機能障害の初期の指標とし得る。ある特定の実施形態では、ＦＶＣを用いて、最大吸息後の努力呼息時に排出される空気の総体積を測定し得る。ＤＭＤ患者では、１０代前半までＦＶＣが身体成長に伴って増大する。しかし、疾患進行により成長速度の低下または成長停止が起こると、筋力低下が進行し、肺活量が下降期に入り、１０～１２歳を過ぎてから年間約８～８．５パーセントの平均割合で低下する。ある特定の実施形態では、ＭＩＰの予測パーセント（体重に合わせて調整したＭＩＰ）、ＭＥＰの予測パーセント（年齢に合わせて調整したＭＥＰ）およびＦＶＣの予測パーセント（年齢および身長に合わせて調整したＦＶＣ）を補助的解析とする。
本明細書で使用される「対象」および「患者」という用語は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートで治療することができる症状を呈するか、そのような症状を呈するリスクがある任意の動物、例えばＤＭＤもしくはＢＭＤまたはこれらの病態に関連するいずれかの症状（例えば、筋線維の減少）を有するか、これを有するリスクがある対象（または患者）などを包含する。適切な対象（または患者）としては、実験動物（マウス、ラット、ウサギまたはモルモットなど）、家畜および飼育動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が挙げられる。非ヒト霊長類、好ましくはヒト患者（または対象）が含まれる。エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子に変異を有する対象（または患者）にジストロフィンを産生させる方法も含まれる。
本明細書で使用される「全身投与」、「全身に投与する」、「末梢投与」および「末梢に投与する」という語句は、化合物、薬物またはその他の物質を中枢神経系内に直接投与するのではなく、患者の全身に入り、したがって、代謝およびその他の同様の過程を受けるように投与すること、例えば皮下投与を意味する。
「標的化配列」という相は、標的プレｍＲＮＡ内のヌクレオチドの配列に相補的なオリゴマーの核酸塩基の配列を指す。本開示のいくつかの実施形態では、標的プレｍＲＮＡ内のヌクレオチドの配列は、Ｈ５１Ａ（＋６６＋９５）と命名されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１アニーリング部位である。
対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）または細胞の「治療」とは、対象または細胞の自然な過程を変化させるために用いる任意のタイプの介入のことである。治療は、特に限定されないが、オリゴマーまたはその医薬組成物の投与を含み、予防として、または病的事象の開始もしくは病原体との接触の後に実施し得る。治療には、特定の形態の筋ジストロフィーのようなジストロフィンタンパク質に関連する疾患または病態の症状または病変に対する任意の所望の効果が含まれ、例えば、治療する疾患または病態の１つまたは複数の測定可能なマーカーの最小限の変化または改善が含まれ得る。治療する疾患もしくは病態の進行速度の低下、その疾患もしくは病態の発症の遅延またはその発症の重症度の軽減を対象とし得る「予防的」治療も含まれる。「治療」または「予防」は、必ずしも疾患もしくは病態またはその関連症状を完全に根絶、治癒または予防することを表すものではない。
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートでの治療により、治療を実施しない場合に予想される新たなジストロフィン産生が増大し、疾患進行が遅延し、歩行能力低下の緩徐化もしくは軽減がみられ、筋炎が軽減され、筋肉損傷が軽減され、筋機能が改善され、肺機能低下が軽減され、かつ／または筋再生が増強される。いくつかの実施形態では、治療により疾患進行が維持される、遅延する、または緩徐化する。いくつかの実施形態では、治療により歩行能力が維持される、または歩行能力低下が軽減される。いくつかの実施形態では、治療により肺機能が維持される、または肺機能低下が軽減される。いくつかの実施形態では、治療により、例えば６分間歩行検査（６ＭＷＴ）により測定される患者の安定歩行距離が維持される、または増大する。いくつかの実施形態では、治療により、１０メートル歩く／走るのにかかる時間（すなわち、１０メートル歩行／走検査）が維持または短縮される。いくつかの実施形態では、治療により、仰臥位から起立するのにかかる時間（すなわち、起立時間検査）が維持または短縮される。いくつかの実施形態では、治療により、４段の標準階段を昇るのにかかる時間（すなわち、４段昇段検査）が維持または短縮される。いくつかの実施形態では、治療により、例えばＭＲＩ（例えば、脚筋のＭＲＩ）により測定される患者の筋炎が維持または軽減される。いくつかの実施形態では、ＭＲＩによりＴ２および／または脂肪含有率を測定して筋変性を確認する。ＭＲＩにより炎症、浮腫、筋損傷および脂肪浸潤を原因とする筋肉の構造および組成の変化を確認することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートでの治療により新たなジストロフィン産生が増大し、治療を実施しない場合に予想される歩行能力低下が緩徐化または軽減される。例えば、治療により対象の歩行能力が安定化し得る、維持され得る、改善され得る、または増大し得る（例えば、歩行の安定化）。いくつかの実施形態では、治療により、例えばＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ，２０１０；４２：９６６－７４、参照により本明細書に組み込まれる）により記載されている６分間歩行検査（６ＭＷＴ）により測定される患者の安定歩行距離が維持される、または増大する。６分間歩行距離（６ＭＷＤ）の変化は絶対値、割合の変化または％予測値の変化で表され得る。いくつかの実施形態では、治療により、６ＭＷＴでの患者の安定歩行距離が健常な同等者に対して２０％の不足から維持または改善される。％予測値を算出することにより、６ＭＷＴでの健常な同等者の典型的な成績と比較したＤＭＤ患者の成績を求めることができる。例えば、男性には以下の方程式：１９６．７２＋（３９．８１×年齢）－（１．３６×年齢２）＋（１３２．２８×身長（メートル））を用いて％予測６ＭＷＤを算出し得る。女性には以下の方程式：１８８．６１＋（５１．５０×年齢）－（１．８６×年齢２）＋（８６．１０×身長（メートル））を用いて％予測６ＭＷＤを算出し得る（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｃｕｒｒ．，２０１２，ｖｅｒｓｉｏｎ ２、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーでの治療により、患者の安定歩行距離がベースラインから３メートル、５メートル、６メートル、７メートル、８メートル、９メートル、１０メートル、１５メートル、２０メートル、２５メートル、３０メートルまたは５０メートル（間のあらゆる整数を含む）超まで増大する。
ＤＭＤ患者の筋機能低下は、正常な小児の成長および発育を背景に起こり得る。実際、ＤＭＤを有する低年齢の小児では、進行性の筋機能障害があるにもかかわらず、約１年間にわたって６ＭＷＴでの歩行距離が増大し得る。いくつかの実施形態では、ＤＭＤ患者の６ＭＷＤを通常の発育がみられる対照被験者ならびに年齢および性別が一致する被験者の既存の標準データと比較する。いくつかの実施形態では、年齢と身長に基づく方程式を標準データに当てはめて用い、正常な成長および発育を説明することができる。このような方程式を用いて、ＤＭＤを有する被験者の６ＭＷＤをパーセント予測（％予測）値に変換することができる。ある特定の実施形態では、％予測６ＭＷＤデータの解析が正常な成長および発育を説明する方法となり、低年齢（例えば、７歳以下）時の機能増大が、ＤＭＤ患者の能力の改善ではなく安定を表すことを示すものとなり得る（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｃｕｒｒ．，２０１２，ｖｅｒｓｉｏｎ ２、参照により本明細書に組み込まれる）。
異なるアンチセンス分子を識別するため、アンチセンス分子の命名法が提唱され公開された（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｇｅｎ Ｍｅｄ ４，６４４－６５４を参照されたい）。この命名法は、いずれも下に示す同じ標的領域に方向付けられたわずかに異なる複数のアンチセンス分子を試験する際に特に重要なものとなった：
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）。
１番目の文字は種（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス、Ｃ：イヌ）を表す。「＃」は標的ジストロフィンエクソンの番号を表す。「Ａ／Ｄ」は、エクソンの先頭および末尾にあるアクセプタースプライス部位またはドナースプライス部位をそれぞれ表す。（ｘ ｙ）はアニーリング座標を表し、座標中、「－」または「＋」はそれぞれイントロン配列またはエクソン配列を表す。例えば、Ａ（－６＋１８）は、標的エクソンに先行するイントロンの最後の６塩基および標的エクソンの最初の１８塩基を表す。最も近いスプライス部位がアクセプターとなるため、その座標の前には「Ａ」が記載される。ドナースプライス部位でのアニーリング座標を記述すればＤ（＋２－１８）となり、座標中、最後の２個のエクソン塩基および最初の１８個のイントロン塩基がアンチセンス分子のアニーリング部位に対応する。全体がエクソンでありＡ（＋６５＋８５）により表されるアニーリング座標は、そのエクソンの先頭から６５番目のヌクレオチドと８５番目のヌクレオチドの間にある部位である。
ＩＩ．アンチセンスオリゴマー
Ａ．エクソン５１スキッピングを誘導するよう設計したアンチセンスオリゴマーコンジュゲート
ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１標的領域に相補的であり、エクソン５１スキッピングを誘導する。具体的には、本開示は、アニーリング部位と命名されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１標的領域に相補的なアンチセンスオリゴマーコンジュゲートに関する。いくつかの実施形態では、アニーリング部位はＨ５１Ａ（＋６６＋９５）である。
本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ジストロフィンプレｍＲＮＡを標的としてエクソン５１のスキッピングを誘導し、このため、スプライスされた成熟ｍＲＮＡ転写物からエクソン５１が排除またはスキップされる。エクソン５１をスキップすることにより、崩壊していたリーディングフレームがインフレーム変異に回復する。ＤＭＤは様々な遺伝子サブタイプからなるが、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートはジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１をスキップするよう特異的に設計されたものである。エクソン５１のスキッピングが可能なＤＭＤ変異は、ＤＭＤ患者の１つのサブグループ（１３％）を構成する。
エクソン５１スキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの核酸塩基配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１内にある特定の標的配列になるよう設計されている。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートのアンチセンスオリゴマーはＰＭＯであり、ＰＭＯの各モルホリノ環は、例えばＤＮＡにみられる核酸塩基（アデニン、シトシン、グアニンおよびチミン）を含めた核酸塩基と結合している。
Ｂ．オリゴマーの化学的特徴
本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは様々なアンチセンスオリゴマー化学を用いることができる。オリゴマー化学の例としては、特に限定されないが、モルホリノオリゴマー、ホスホロチオアート修飾オリゴマー、２’Ｏ－メチル修飾オリゴマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオアートオリゴマー、２’Ｏ－ＭＯＥ修飾オリゴマー、２’－フルオロ修飾オリゴマー、２’Ｏ，４’Ｃ－エチレン－架橋化核酸（ＥＮＡ）、トリシクロ－ＤＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡホスホロチオアートサブユニット、２’－Ｏ－［２－（Ｎ－メチルカルバモイル）エチル］修飾オリゴマーが挙げられ、上記のいずれかのものの組合せもこれに含まれる。ホスホロチオアート化学と２’－Ｏ－Ｍｅ－修飾化学を組み合わせて２’Ｏ－Ｍｅ－ホスホロチオアート主鎖を作製することができる。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１３／１１２０５３号および同第２００９／００８７２５号を参照されたい。本開示のオリゴマー化学の例示的実施形態について以下でさらに記載する。
１．ペプチド核酸（ＰＮＡ）
ペプチド核酸（ＰＮＡ）とは、主鎖がデオキシリボース主鎖と構造的に同形であり、ピリミジン塩基またはプリン塩基が結合したＮ－（２－アミノエチル）グリシン単位からなるＤＮＡ類似体のことである。天然のピリミジン塩基およびプリン塩基が含まれるＰＮＡは、ワトソン・クリック型塩基対形成の法則に従い相補的なオリゴマーとハイブリダイズし、塩基対認識の点でＤＮＡを模倣する（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｂｕｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ＰＮＡの主鎖はホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって形成され、このため、ＰＮＡはアンチセンス用途によく適している（下の構造を参照されたい）。主鎖は非荷電であるため、通常よりも高い熱安定性を示すＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖が生じる。ＰＮＡはヌクレアーゼにもプロテアーゼにも認識されない。ＰＮＡの非限定的な例を下に図示する：
ＰＮＡは、天然の構造が根本的に変化したものであるにもかかわらず、ＤＮＡまたはＲＮＡと配列特異的にらせん形に結合することができる。ＰＮＡの特徴としては、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡに対する高い結合親和性、単一塩基ミスマッチによる不安定化作用、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する耐性、塩濃度とは無関係なＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションおよびホモプリンＤＮＡとの三重鎖形成が挙げられる。ＰＡＮＡＧＥＮＥ（商標）社は、その独自のＢｔｓ ＰＮＡモノマー（Ｂｔｓ；ベンゾチアゾール－２－スルホニル基）および独自のオリゴマー化工程を開発した。Ｂｔｓ ＰＮＡモノマー用いるＰＮＡオリゴマー化は、脱保護、カップリングおよびキャッピングの反復サイクルからなるものである。ＰＮＡは、当該技術分野で公知の任意の技術を用いて合成により作製することができる。例えば、米国特許第６，９６９，７６６号；同第７，２１１，６６８号；同第７，０２２，８５１号；同第７，１２５，９９４号；同第７，１４５，００６号；および同第７，１７９，８９６号を参照されたい。ＰＮＡの調製については、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号も参照されたい。さらに、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７－１５００，１９９１にはＰＮＡ化合物の教示をみることができる。上記のものはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２．ロックト核酸（ＬＮＡ）
アンチセンスオリゴマーコンジュゲートには「ロックト核酸」サブユニット（ＬＮＡ）も含まれ得る。「ＬＮＡ」は、架橋化核酸（ＢＮＡ）と呼ばれる修飾クラスのメンバーである。ＢＮＡは、リボース環の立体配座をＣ３０－ｅｎｄｏ（ノーザン）糖パッカーに固定する共有結合を特徴とする。ＬＮＡでは、架橋が２’－Ｏ位と４’－Ｃ位の間のメチレンからなる。ＬＮＡは、主鎖の事前組織化および塩基スタッキングを促進してハイブリダイゼーションおよび熱安定性を増大させる。
ＬＮＡの構造は、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＷｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９８）４５５；Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８）５４：３６０７；Ｊｅｓｐｅｒ Ｗｅｎｇｅｌ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）３２：３０１；Ｏｂｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９７）３８：８７３５；Ｏｂｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９８）３９：５４０１；およびＯｂｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）１６：９２３０にみることができる。ＬＮＡの非限定的な例を下に図示する：
本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは１つまたは複数のＬＮＡが組み込まれていてよく；いくつかの場合には、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは完全にＬＮＡからなるものであってよい。個々のＬＮＡヌクレオシドサブユニットの合成およびそのオリゴマーへの組込みの方法は、例えば、それぞれ全体が参照により組み込まれる米国特許第７，５７２，５８２号；同第７，５６９，５７５号；同第７，０８４，１２５号；同第７，０６０，８０９号；同第７，０５３，２０７号；同第７，０３４，１３３号；同第６，７９４，４９９号；および同第６，６７０，４６１号に記載されている。典型的なサブユニット間リンカーとしてはホスホジエステル部分およびホスホロチオアート部分が挙げられ；あるいは、非亜リン酸含有リンカーを用いてもよい。さらなる実施形態は、各ＬＮＡサブユニットがＤＮＡサブユニットによって隔てられているＬＮＡ含有アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含む。特定のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、交互に並ぶＬＮＡサブユニットとＤＮＡサブユニットとからなり、サブユニット間リンカーがホスホロチオアートである。
２’Ｏ，４’Ｃ－エチレン－架橋化核酸（ＥＮＡ）はＢＮＡクラスのまた別のメンバーである。非限定的な例を下に図示する：
ＥＮＡオリゴマーおよびその調製については、全体が参照により本明細書に組み込まれるＯｂｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ（１９９７）３８（５０）：８７３５に記載されている。本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは１つまたは複数のＥＮＡサブユニットが組み込まれていてよい。
３．アンロックト核酸（ＵＮＡ）
アンチセンスオリゴマーコンジュゲートはアンロックト核酸（ＵＮＡ）サブユニットも含み得る。ＵＮＡおよびＵＮＡオリゴマーは、サブユニットのＣ２’－Ｃ３’結合が切断されているＲＮＡの類似体である。ＬＮＡが（ＤＮＡおよびＲＮＡと比較して）立体構造的に制限されているのに対し、ＵＮＡは極めて柔軟性に富む。ＵＮＡは例えば国際公開２０１６／０７０１６６号に開示されている。ＵＮＡの非限定的な例を下に示す。
典型的なサブユニット間リンカーとしては、ホスホジエステル部分およびホスホロチオアート部分が挙げられ；あるいは、非亜リン酸含有リンカーを用いてもよい。
４．ホスホロチオアート
「ホスホロチオアート」（またはＳオリゴ）は、通常のＤＮＡの非架橋酸素の１つが硫黄に置き換わったバリアントである。ホスホロチオアートの非限定的な例を下に図示する：
ヌクレオチド間結合の硫化により、５’～３’および３’～５’ＤＮＡ ＰＯＬ １エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１およびＰ１、ＲＮａｓｅ、血清ヌクレアーゼならびにヘビ毒ホスホジエステラーゼを含めたエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの作用が低下する。ホスホロチオアートは、２つの主要な経路によって、すなわち、二硫化炭素中の元素硫黄の溶液のホスホン酸水素に対する作用によって、または亜リン酸トリエステルをテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）もしくは３Ｈ－１，２－ベンソジチオール（ｂｅｎｓｏｄｉｔｈｉｏｌ）－３－オン１，１－ジオキシド（ＢＤＴＤ）で硫化する方法によって作製される（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＩｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５，４６９３－４６９９，１９９０を参照されたい）。後者の方法では、元素硫黄が大部分の有機溶媒に不溶性であることおよび二硫化炭素の毒性という問題点が回避される。ＴＥＴＤ法およびＢＤＴＤ法でもさらに高純度のホスホロチオアートが得られる。
５．トリシクロＤＮＡおよびトリシクロホスホロチオアートサブユニット
トリシクロＤＮＡ（ｔｃ－ＤＮＡ）は、主鎖の配座柔軟性を制限し、ねじれ角γの主鎖構造を最適化するため各ヌクレオチドがシクロプロパン環の導入により修飾されている、制約のあるＤＮＡ類似体のクラスである。ホモ塩基性のアデニン含有ｔｃ－ＤＮＡおよびチミン含有ｔｃ－ＤＮＡは、相補的なＲＮＡと極めて安定なＡ－Ｔ塩基対を形成する。トリシクロ－ＤＮＡおよびその合成については、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第２０１０／１１５９９３号に記載されている。本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは１つまたは複数の三環ＤＮＡサブユニットが組み込まれていてよく；いくつかの場合には、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは完全に三環ＤＮＡサブユニットからなるものであってよい。
トリシクロホスホロチオアートサブユニットはホスホロチオアートサブユニット間結合を有するトリシクロＤＮＡサブユニットである。トリシクロホスホロチオアートサブユニットおよびその合成については、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第２０１３／０５３９２８号に記載されている。本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは１つまたは複数の三環ＤＮＡサブユニットが組み込まれていてよく；いくつかの場合には、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは完全に三環ＤＮＡサブユニットからなるものであってよい。三環ＤＮＡ／三環ホスホチオアートサブユニットの非限定的な例を下に図示する：
６．２’Ｏ－メチル、２’Ｏ－ＭＯＥおよび２’－Ｆオリゴマー
「２’－Ｏ－Ｍｅオリゴマー」分子はリボース分子の２’－ＯＨ残基にメチル基を有するものである。２’－Ｏ－Ｍｅ－ＲＮＡもＤＮＡと同じ（または類似した）挙動を示すが、ヌクレアーゼによる分解から保護されている。２’－Ｏ－Ｍｅ－ＲＮＡは、さらに安定化させるためにホスホロチオアートオリゴマー（ＰＴＯ）と組み合わせることもできる。２’Ｏ－Ｍｅオリゴマー（ホスホジエステルまたはホスホチオアート）は当該技術分野で日常的な技術により合成することができる（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＹｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：２００８－１６，２００４を参照されたい）。２’Ｏ－Ｍｅオリゴマーの非限定的な例を下に図示する：
２’Ｏ－メトキシエチルオリゴマー（２’－Ｏ ＭＯＥ）は、リボース分子の２’－ＯＨ残基にメトキシエチル基を有し、全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８，４８６－５０４，１９９５で論じられている。２’Ｏ－ＭＯＥサブユニットの非限定的な例を下に図示する：
２’－フルオロ（２’－Ｆ）オリゴマーは前述のアルキル化２’ＯＨリボース誘導体とは対照的に、２’ＯＨの代わりに２’位にフルオロラジカルを有する。２’－Ｆオリゴマーの非限定的な例を下に図示する：
２’－フルオロオリゴマーについては、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００４／０４３９７７号にさらに記載されている。
２’Ｏ－メチル、２’Ｏ－ＭＯＥおよび２’Ｆオリゴマーは、下に図示するように１つまたは複数のホスホロチオアート（ＰＳ）結合も含み得る：
さらに、２’Ｏ－メチル、２’Ｏ－ＭＯＥおよび２’Ｆオリゴマーは、例えば下に図示する２’Ｏ－メチルＰＳオリゴマーのドリサペルセンのように、オリゴマー全体にＰＳサブユニット間結合を含み得る：
あるいは、２’Ｏ－メチル、２’Ｏ－ＭＯＥおよび／または２’Ｆオリゴマーは、下に図示するようにオリゴマーの末端にＰＳ結合を含み得る：
式中、
ＲはＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（メトキシエチルまたはＭＯＥ）であり；
ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ５’ウィング領域、中央ギャップ領域および３’ウィング領域と命名される部分のそれぞれに含まれるヌクレオチドの数を表す。
本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つまたは複数の２’Ｏ－メチル、２’Ｏ－ＭＯＥおよび２’Ｆサブユニットが組み込まれていてよく、ここに記載したサブユニット間結合のいずれかを用いたものであり得る。いくつかの場合には、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、完全に２’Ｏ－メチル、２’Ｏ－ＭＯＥまたは２’Ｆサブユニットからなるものであり得る。本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの１つの実施形態は、完全に２’Ｏ－メチルサブユニットからなるものである。
７．２’－Ｏ－［２－（Ｎ－メチルカルバモイル）エチル］オリゴマー（ＭＣＥ）
ＭＣＥは、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートに有用な２’Ｏ修飾リボヌクレオシドのまた別の例である。ここでは、２’ＯＨを２－（Ｎ－メチルカルバモイル）エチル部分に誘導体化してヌクレアーゼ耐性を増大させる。ＭＣＥオリゴマーの非限定的な例を下に図示する：
ＭＣＥおよびその合成については、全体が参照により本明細書に組み込まれるＹａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２０１１）７６（９）：３０４２－５３に記載されている。本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは１つまたは複数のＭＣＥサブユニットが組み込まれていてよい。
８．立体特異的オリゴマー
立体特異的オリゴマーとは、実質的に立体的に純粋なオリゴマーが得られる合成方法により各亜リン酸含有結合の立体化学が固定されたオリゴマーのことである。立体特異的オリゴマーの非限定的な例を下に図示する：
上の例では、オリゴマーの各亜リン酸は同じ立体配置を有する。ほかの例としては、上記のオリゴマーが挙げられる。例えば、ＬＮＡ、ＥＮＡ、トリシクロＤＮＡ、ＭＣＥ、２’Ｏ－メチル、２’Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｆおよびモルホリノ系オリゴマーを立体特異的亜リン酸含有ヌクレオシド間結合、例えば，ホスホロチオアート結合、ホスホジエステル結合、ホスホラミダート結合、ホスホロジアミダート結合またはその他の亜リン酸含有ヌクレオシド間結合などにより調製することができる。立体特異的オリゴマー、このようなオリゴマーの調製に用いる調製方法、キラル制御合成、キラルの設計およびキラル補助基については、例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７１９２６６４号、同第２０１７１９２６７９号、同第２０１７０６２８６２号、同第２０１７０１５５７５号、同第２０１７０１５５５５号、同第２０１５１０７４２５号、同第２０１５１０８０４８号、同第２０１５１０８０４６号、同第２０１５１０８０４７号、同第２０１２０３９４４８号、同第２０１００６４１４６号、同第２０１１０３４０７２号、同第２０１４０１０２５０号、同第２０１４０１２０８１号、同第２０１３０１２７８５８号および同第２０１１００５７６１号に詳述されている。
立体特異的オリゴマーは、ＲＰ立体配置またはＳＰ立体配置の亜リン酸含有ヌクレオシド間結合を有し得る。結合の立体配置が制御されたキラル亜リン酸含有結合を「立体的に純粋」と言い、結合の立体配置が制御されていないキラル亜リン酸含有結合を「立体的にランダム」と言う。ある特定の実施形態では、本開示のオリゴマーは、複数の立体的に純粋な結合および立体的にランダムな結合を含み、このため、得られるオリゴマーは、オリゴマーの予め特定された位置に立体的に純粋なサブユニットを有する。国際公開第２０１７／０６２８６２（Ａ２）号の図７Ａおよび７Ｂには、立体的に純粋なサブユニットの位置の例が記載されている。一実施形態では、オリゴマー内のいずれのキラル亜リン酸含有結合も立体的にランダムである。一実施形態では、オリゴマー内のいずれのキラル亜リン酸含有結合も立体的に純粋である。
ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマー内のｎ個のキラル亜リン酸含有結合がいずれも立体的にランダムである。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマー内のｎ個のキラル亜リン酸含有結合がいずれも立体的に純粋である。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマー内のｎ個の亜リン酸含有結合の少なくとも１０％（最も近い整数に丸めて）が立体的に純粋である。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマー内のｎ個の亜リン酸含有結合の少なくとも２０％（最も近い整数に丸めて）が立体的に純粋である。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマー内のｎ個の亜リン酸含有結合の少なくとも３０％（最も近い整数に丸めて）が立体的に純粋である。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマー内のｎ個の亜リン酸含有結合の少なくとも４０％（最も近い整数に丸めて）が立体的に純粋である。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマー内のｎ個の亜リン酸含有結合の少なくとも５０％（最も近い整数に丸めて）が立体的に純粋である。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマー内のｎ個の亜リン酸含有結合の少なくとも６０％（最も近い整数に丸めて）が立体的に純粋である。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマー内のｎ個の亜リン酸含有結合の少なくとも７０％（最も近い整数に丸めて）が立体的に純粋である。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマー内のｎ個の亜リン酸含有結合の少なくとも８０％（最も近い整数に丸めて）が立体的に純粋である。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマー内のｎ個の亜リン酸含有結合の少なくとも９０％（最も近い整数に丸めて）が立体的に純粋である。
ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも２個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも３個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも４個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも５個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも６個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも７個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも８個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも９個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも１０個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも１１個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも１２個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも１３個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも１４個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも１５個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも１６個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも１７個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも１８個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも１９個含む。ｎ個のキラル亜リン酸含有結合（ｎは１以上の整数である）を有するオリゴマーの一実施形態では、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＲＰ配向またはＳＰ配向のいずれか）の連続する立体的に純粋な亜リン酸含有結合を少なくとも２０個含む。
９．モルホリノオリゴマー
本開示の例示的実施形態は、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７：１８７－１９５（１９９７）の図２に記載されている以下の一般構造：
のホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーに関する。本明細書に記載されるモルホリノは、上記の一般構造のあらゆる立体異性体および互換異性体を包含するものとする。モルホリノオリゴマーの合成、構造および結合特性については米国特許第５，６９８，６８５号；同第５，２１７，８６６号；同第５，１４２，０４７号；同第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，５２１，０６３号；同第５，５０６，３３７号；同第８，０７６，４７６号；および同第８，２９９，２０６号に詳述されており、上記の特許は参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、モルホリノをオリゴマーの５’末端または３’末端で「テール」部分とコンジュゲートして、その安定性および／または溶解性を増大させる。例示的テールとしては：
が挙げられる。
様々な実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは式（Ｉ）：
によるものまたはその薬学的に許容される塩であり、式中：
各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり；
Ｔは：
から選択される部分であり；
Ｒ１はＣ１～Ｃ６アルキルであり；
標的化配列は、Ｈ５１Ａ（＋６６＋９５）と命名されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１アニーリング部位に相補的である。
様々な実施形態では、Ｔは
である。
様々な実施形態では、Ｒ１は、メチル、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＦＣｌ２、ＣＦ２Ｃｌ、エチル、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、３－メチルペンチル、２，２－ジメチルブチルまたは２，３－ジメチルブチルである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、そのＨＣｌ（塩酸）塩である。ある特定の実施形態では、ＨＣｌ塩は．６ＨＣｌ塩である。
いくつかの実施形態では、Ｎｕはそれぞれ独立に、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される。
いくつかの実施形態では、標的化配列は配列番号１（５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’）であり、式中、各チミン（Ｔ）は必要に応じてウラシル（Ｕ）である。
様々な実施形態では、Ｔは
であり、標的化配列は配列番号１（５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’）であり、式中、各チミン（Ｔ）は必要に応じてウラシル（Ｕ）である。
様々な実施形態では、Ｔは
であり、標的化配列は配列番号１（５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’）である。
例えば式（Ｉ）のいくつかの実施形態を含めたいくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは式（ＩＩ）
によるものまたはその薬学的に許容される塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってＨ５１Ａ（＋６６＋９５）と命名されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１アニーリング部位に相補的な標的化配列を形成する核酸塩基である。
いくつかの実施形態では、Ｎｕはそれぞれ独立に、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される。
様々な実施形態では、１～３０および５’～３’の各Ｎｕは（配列番号１）：
であり、表中、Ａは
であり、Ｃは
であり、Ｇは
であり、Ｘは
である。ある特定の実施形態では、Ｘはそれぞれ独立に
である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、そのＨＣｌ（塩酸）塩である。ある特定の実施形態では、ＨＣｌ塩は．６ＨＣｌ塩である。
例えば式（ＩＩ）のいくつかの実施形態を含めたいくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは式（ＩＩＡ）：
によるものであり、式中、各Ｎｕは、一緒になってＨ５１Ａ（＋６６＋９５）と命名されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１アニーリング部位に相補的な標的化配列を形成する核酸塩基である。
いくつかの実施形態では、Ｎｕはそれぞれ独立に、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される。
様々な実施形態では、１～３０および５’～３’の各Ｎｕは（配列番号１）：
であり、表中、Ａは
であり、Ｃは
であり、Ｇは
であり、Ｘは
である。ある特定の実施形態では、各Ｘは
である。
例えば式（ＩＩ）および式（ＩＩＡ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含めたいくつかの実施形態では、標的化配列は配列番号１（５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’）であり、式中、各チミン（Ｔ）は必要に応じてウラシル（Ｕ）である。例えば式（ＩＩ）および式（ＩＩＡ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含めた様々な実施形態では、標的化配列は配列番号１（５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’）である。
例えば式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含めたいくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは式（ＩＩＩ）：
によるものまたはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、そのＨＣｌ（塩酸）塩である。ある特定の実施形態では、ＨＣｌ塩は．６ＨＣｌ塩である。
例えば式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含めたいくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは式（ＩＩＩＡ）：
によるものである。
式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートのいくつかの実施形態および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含めた本開示のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは式（ＩＶ）：
によるものまたはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、そのＨＣｌ（塩酸）塩である。ある特定の実施形態では、ＨＣｌ塩は．６ＨＣｌ塩である。
例えば式（ＩＶ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含めたいくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは式（ＩＶＡ）：
によるものである。
１０．核酸塩基の修飾および置換
ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートはＲＮＡ核酸塩基およびＤＮＡ核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ぶことが多い）からなる。ＲＮＡ塩基は一般に、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）として知られている。ＤＮＡ塩基は一般に、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）として知られている。様々な実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）およびヒポキサンチン（Ｉ）からなる。
ある特定の実施形態では、オリゴマー中の１つまたは複数のＲＮＡ塩基またはＤＮＡ塩基をＲＮＡ塩基またはＤＮＡ塩基以外の塩基で修飾または置換し得る。修飾または置換された塩基が含まれるオリゴマーとしては、核酸に最もよくみられる１つまたは複数のプリンまたはピリミジン塩基が、まれな塩基または非天然の塩基に置き換わったオリゴマーが挙げられる。
プリン塩基は以下の一般式：
によって表されるように、イミダゾール環と縮合したピリミジン環を含む。アデニンおよびグアニンは核酸に最もよくみられる２つのプリン核酸塩基である。その他の天然に存在するプリンとしては、特に限定されないが、Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ２－メチルグアニン、ヒポキサンチンおよび７－メチルグアニンが挙げられる。
ピリミジン塩基は、以下の一般式：
ピリミジン
によって表されるように、６員ピリミジン環を含む。シトシン、ウラシルおよびチミンは核酸に最もよくみられるピリミジン塩基である。その他の天然のピリミジンとしては、特に限定されないが、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、プソイドウラシルおよび４－チオウラシルが挙げられる。一実施形態では、本明細書に記載されるオリゴマーは、ウラシルの代わりにチミン塩基を含む。
その他の適切な塩基としては、特に限定されないが、２，６－ジアミノプリン、オロト酸、アグマチジン、ライシジン、２－チオピリミジン（例えば、２－チオウラシル、２－チオチミン）、Ｇクランプおよびその誘導体、５－置換ピリミジン（例えば、５－ハロウラシル、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－アミノメチルウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－アミノメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、Ｓｕｐｅｒ Ｔ）、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、７－アザ－２，６－ジアミノプリン、８－アザ－７－デアザグアニン、８－アザ－７－デアザアデニン、８－アザ－７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、Ｓｕｐｅｒ Ｇ、Ｓｕｐｅｒ ＡおよびＮ４－エチルシトシンまたはその誘導体；Ｎ２－シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ－Ｇ）、Ｎ２－シクロペンチル－２－アミノプリン（ｃＰｅｎｔ－ＡＰ）およびＮ２－プロピル－２－アミノプリン（Ｐｒ－ＡＰ）、プソイドウラシルまたはその誘導体；ならびに２，６－ジフルオロトルエンのような縮重塩基もしくはユニバーサル塩基または脱塩基部位のような非存在塩基（例えば、１－デオキシリボース、１，２－ジデオキシリボース、１－デオキシ－２－Ｏ－メチルリボース；または環酸素が窒素に置き換わっているピロリジン誘導体（アザリボース））が挙げられる。Ｓｕｐｅｒ Ａ、Ｓｕｐｅｒ ＧおよびＳｕｐｅｒ Ｔの誘導体の例は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６８３，１７３号（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にみることができる。ｃＰｅｎｔ－Ｇ、ｃＰｅｎｔ－ＡＰおよびＰｒ－ＡＰは、ｓｉＲＮＡに組み込むと免疫刺激効果が低下することが示されている（Ｐｅａｃｏｃｋ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，９２００）。プソイドウラシルは、通常のＮグリコシドではなくウリジンのようにＣグリコシドを有する天然に存在する異性化型のウラシルである。プソイドウリジンを含有する合成ｍＲＮＡは、ウリジンを含有するｍＰｖＮＡと比較して改善された安全性プロファイルを有し得る（全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９１２７２３０号）。
ある特定の核酸塩基は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの結合親和性を増大させるのに特に有用である。このようなものとしては、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルならびに５－プロピニルシトシンを含めた５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンならびにＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリンが挙げられる。５－メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６～１．２℃増大させることが示されており、現時点で好ましい、さらにより具体的には２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせると好ましい塩基置換である。さらなる例示的な修飾核酸塩基としては、核酸塩基の少なくとも１個の水素原子がフッ素に置き換わったものが挙げられる。
１１．アンチセンスオリゴマーコンジュゲートの薬学的に許容される塩
本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの特定の実施形態は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含み得るものであり、したがって、薬学的に許容される酸とともに薬学的に許容される塩を形成することができる。これに関して、「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの比較的無毒性の無機または有機酸付加塩を指す。これらの塩は、投与媒体または剤形の製造工程の現場で調製するか、別途、精製した遊離塩基形態の本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートと適切な有機酸または無機酸とを反応させ、このようにして形成された塩をのち精製過程で分離することにより調製することができる。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１－１９を参照されたい）。
対象アンチセンスオリゴマーコンジュゲートの薬学的に許容される塩としては、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートの従来の無毒性塩または第四級アンモニウム塩、例えば無毒性の有機酸または無機酸由来の塩が挙げられる。例えば、このような従来の無毒性塩としては、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などに由来する塩；および有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などから調製される塩が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つまたは複数の酸性官能基を含み得るものであり、したがって、薬学的に許容される塩基とともに薬学的に許容される塩を形成することができる。この場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの比較的無毒性の無機および有機塩基付加塩を指す。これらの塩も同様に、投与媒体または剤形の製造工程の現場で調製するか、別途、精製した遊離酸形態のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを、適切な塩基、例えば薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩または炭酸水素塩と、アンモニアと、または薬学的に許容される有機第一級、第二級または第三級アミンと反応させることにより調製することができる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩およびアルミニウム塩などが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい）。
ＩＩＩ．製剤および投与様式
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの治療的送達に適した製剤または医薬組成物を提供する。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、治療有効量の１つまたは複数の本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含み、１つもしくは複数の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤とともに製剤化された薬学的に許容される組成物を提供する。本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを単独で投与することも可能であるが、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを医薬製剤（組成物）として投与するのが好ましい。一実施形態では、製剤のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは式（ＩＩＩ）によるものである。
本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートに適用することができる核酸分子の送達方法については、例えば、Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２：１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，編，Ａｋｈｔａｒ １９９５， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；およびＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９４／０２５９５号に記載されている。これらおよびその他のプロトコルを本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含めた実質的に任意の核酸分子の送達に用いることができる。
本開示の医薬組成物は特に、以下のものに適合したものを含めた固体または液体形態で投与するよう製剤化され得る：（１）経口投与、例えば、水薬（水溶液もしくは非水溶液または懸濁液）、錠剤（バッカル、舌下または全身吸収を目的とするもの）、巨丸剤、散剤、顆粒剤、舌に塗布するパスタ剤；（２）例えば、例えば無菌溶液もしくは懸濁液として皮下、筋肉内、静脈内もしくは硬膜外注射または徐放性製剤による非経口投与；（３）例えば、皮膚に塗布するクリーム、軟膏または放出制御貼付剤もしくはスプレーとしての局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリーム、または泡として膣内または直腸内；（５）舌下；（６）眼球；（７）経皮；あるいは（８）経鼻。
薬学的に許容される担体としての役割を果たし得る材料の一部の例としては、非限定的に：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよびバレイショデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；（４）トラガント末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオ脂および坐剤ワックスなどの補形剤；（９）ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）無発熱物質水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカルボナート、および／またはポリ酸無水物；ならびに（２２）医薬製剤に用いられるその他の無毒性で適合性のある物質が挙げられる。
本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートとの製剤化に適した剤のほかの非限定的な例としては：薬物が様々な組織の中に侵入するのを促進することができるＰＥＧコンジュゲート核酸；リン脂質コンジュゲート核酸；親油性部分を含む核酸；ホスホロチオアート；Ｐ糖タンパク質阻害剤（プルロニックＰ８５など）；生分解性ポリマー、例えば埋込み後に徐放送達させるためのポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コグリコリド）マイクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈ，Ｄ Ｆ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７－５８）（Ａｌｋｅｒｍｅｓ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）など；および薬物を血液脳関門を横断して送達することができ、ニューロンによる取込み機序を変化させることができる充填ナノ粒子、例えばポリブチルシアノアクリラート製のもの（Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９４１－９４９，１９９９）などが挙げられる。
本開示は、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）脂質を含有する表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾、分岐鎖状および非分岐鎖状もしくはその組合せまたは長時間循環リポソーあるいはステルスリポソーム）を含む組成物の使用も特徴とする。本開示のオリゴマーコンジュゲートは、共有結合した様々な分子量のＰＥＧ分子も含み得る。これらの製剤は、標的組織への薬物の蓄積を増大させる方法となる。このクラスの薬物担体は、オプソニン化および単核食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）による除去に耐性を示し、それにより封入薬物の血中循環時間を延ばし組織への曝露を増大させる（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１－２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５－１０１１）。このようなリポソームは、推測ではあるが、血管新生した標的組織での血管外漏出および捕捉により、腫瘍に選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６７，１２７５－１２７６；Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６－９０）。長時間循環リポソームは、特にＭＰＳの組織に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態および薬力学を増強する（Ｌｉｕ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４－２４８７０；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９６／１０３９１号；Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９６／１０３９０号；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９６／１０３９２号）。長時間循環リポソームは、それが肝臓および脾臓などの代謝活動が盛んなＭＰＳ組織への蓄積を回避することが可能であることに基づけば、薬物をヌクレアーゼ分解から保護する作用がカチオン性リポソームより強いという可能性も考えられる。
さらなる実施形態では、本開示は、米国特許第６，６９２，９１１号；同第７，１６３，６９５号；および同第７，０７０，８０７号に記載される送達に合わせて調製したアンチセンスオリゴマーコンジュゲート医薬組成物を含む。この点に関して、一実施形態では、本開示は、リジンとヒスチジンのコポリマー（ＨＫ）（米国特許第７，１６３，６９５号；同第７，０７０，８０７号；および同第６，６９２，９１１号に記載されている）を単独で、またはＰＥＧ（例えば、分岐鎖もしくは非分岐鎖ＰＥＧまたはその両方の混合物）と組み合わせて、ＰＥＧおよび標的化部分と組み合わせて、あるいは架橋剤と組み合わせた上記のいずれかのものを含む、組成物の形で本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、グルコン酸修飾ポリヒスチジンまたはグルコニル化ポリヒスチジン／トランスフェリン－ポリリジンを含む医薬組成物の形でアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。当業者には、組成物内でＨｉｓおよびＬｙｓと特性が類似したアミノ酸に置換し得ることも認識されよう。
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および着香剤、保存剤、および抗酸化剤が組成物中に存在してもよい。
薬学的に許容される抗酸化剤の例としては：（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
本開示の製剤は、経口投与，経鼻投与，局所（バッカルおよび舌下を含む）投与，経直腸投与，経膣投与および／または非経口投与に適した製剤を含む。製剤は、単位投与剤形で提供するのが好都合であり得、薬学分野で周知の任意の方法により調製され得る。担体材料と組み合わせて単一剤形を作製することができる有効成分の量は、治療する対象、および具体的な投与様式に応じて異なるものとなり得る。担体材料と組み合わせて単一剤形を作製することができる有効成分の量は一般に、治療効果が得られる有効成分の量となる。この量は一般に、約０．１パーセント～約９９パーセントの有効成分、好ましくは約５パーセント～約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント～約３０パーセントの範囲となる。
ある特定の実施形態では、本開示の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸およびポリマー担体、例えばポリエステルおよびポリ酸無水物から選択される補形剤と；本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートとを含む。一実施形態では、製剤のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは式（ＩＩＩ）によるものである。ある特定の実施形態では、上記の製剤は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを経口的に生体利用可能にするものである。
これらの製剤および医薬組成物を調製する方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートと、担体および必要に応じて１つまたは複数の補助成分とを組み合わせる段階を含む。製剤は一般に、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートと、液体担体もしくは微粉化した固体担体またはその両方とを均一かつ密に組み合せ、次いで必要に応じて製品を成形することにより調製される。
経口投与に適した本開示の製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、トローチ剤（風味を付けた基剤、通常はスクロースおよびアラビアゴムもしくはトラガントを用いるもの）、散剤、顆粒剤の形態、または水性液体もしくは非水性液体を用いた液剤もしくは懸濁剤、または水中油型もしくは懸濁液油中水型液体エマルション、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤、または香錠剤（ゼラチンとグリセリンもしくはスクロースとアラビアゴムなどの不活性な基剤を用いるもの）および／または洗口剤などであり得、それぞれ有効成分として所定量の本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含有する。本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを巨丸剤、舐剤またはパスタ剤として投与してもよい。
経口投与用の本開示の固形剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、散剤、顆粒剤、トラウチ（ｔｒｏｕｃｈ）など）では、有効成分をクエン酸ナトリウムもしくは第二リン酸カルシウムなどの１つもしくは複数の薬学的に許容される担体および／または以下のうちいずれかのもの：（１）充填剤または増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸など；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴムなど；（３）グリセロールなどの保湿剤；（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウムなど；（５）パラフィンなどの溶解遅延剤；（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物ならびにポロキサマーおよびラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、グリセロールモノステアラートおよび非イオン界面活性剤など；（８）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸着剤；（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸およびその混合物など；（１０）着色剤；ならびに（１１）クロスポビドンまたはエチルセルロースなどの放出制御剤と混合し得る。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、医薬組成物は緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固形医薬組成物をラクトースまたは乳糖などの補形剤および高分子ポリエチレングリコールなどを用いた軟殻および硬殻ゼラチンカプセル剤に充填剤として用いてもよい。
錠剤は、必要に応じて１つまたは複数の補助成分とともに圧縮または成形することにより作製され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を用いて調製され得る。成形錠剤は、粉末化し不活性な液体希釈剤で湿潤させた化合物の混合物を適切な機械で成形することにより作製され得る。
本開示の医薬組成物の錠剤およびその他の固形剤形、例えば糖衣錠剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤などは、必要に応じて、割線を入れる、またはコーティング剤およびシェル、例えば医薬製剤技術分野で周知の腸溶性コーティング剤およびその他のコーティング剤などを用いて製剤化してよい。それらは、例えば、所望の放出プロファイルが得られる様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを用いて、その中の有効成分の徐放または制御放出がもたらされるよう調製してもよい。それらは、速放されるよう製剤化する、例えば凍結乾燥させてよい。それらは、例えば、細菌保持フィルターでろ過することにより、または使用直前に滅菌水もしくは何らかの他の無菌注射媒体に溶かすことができる無菌固形医薬組成物の形態に滅菌剤を組み込むことにより、滅菌してよい。これらの医薬組成物は、必要に応じて乳白剤を含有してもよく、また有効成分（１つまたは複数）を、必要に応じて遅延させ、消化管の特定の部分で単独で、または優先的に放出する組成物のものであってよい。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー性物質またはロウが挙げられる。有効成分は、必要に応じて上記の１つまたは複数の補形剤を含む、マイクロカプセル化形態であってもよい。
本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルション剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。液体剤形は、有効成分に加えて、当該技術分野でよく用いられる不活性希釈剤、例えば、水またはその他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタン脂肪酸エステルならびにその混合物などを含有し得る。
経口医薬組成物は、不活性希釈剤以外にも、補助剤、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、着香剤および保存剤なども含み得る。
懸濁剤は、活性化合物に加えて、懸濁化剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガントならびにその混合物などを含有し得る。
経直腸または経膣投与用の製剤は、坐剤として提供してよく、坐剤は、１つまたは複数の本開示の化合物と、例えばカカオ脂，ポリエチレングリコール，坐剤ワックスまたはサリチラートを含む１つまたは複数の適切な無刺激性の補形剤または担体とを混合することにより調製され得るものであり、また室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔の中で融解して活性化合物を放出する。
本明細書に提供されるオリゴマーの局所または経皮投与用の製剤または剤形としては、散剤、スプレー剤、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、貼付剤および吸入剤が挙げられる。活性なオリゴマーコンジュゲートを薬学的に許容される担体および必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤または噴射剤と無菌条件下で混合し得る。軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤およびゲル剤は、本開示の活性化合物に加えて、補形剤、例えば動物性および植物性脂肪、油、ロウ、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛またはその混合物などを含有し得る。
散剤およびスプレー剤は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートに加えて、補形剤、例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末または上記の物質の混合物などを含有し得る。スプレー剤はさらに、通常の噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素ならびにブタンおよびプロパンなどの揮発性非置換炭化水素などを含有し得る。
経皮貼付剤には、体内への本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの制御送達がもたらされるというさらなる利点がある。このような剤形は、オリゴマーを適切な媒体に溶解または分散させることにより作製することができる。吸収促進剤を用いて、皮膚を通過する薬剤の流動を増大させてもよい。このような流動速度は、当該技術分野で公知の方法のなかでも特に、速度制御膜を設けるか、ポリマーマトリックスまたはゲルに薬剤を分散させることにより制御することができる。
非経口投与に適した医薬組成物は、１つまたは複数の本開示のオリゴマーコンジュゲートと、１つあるいは複数の薬学的に許容される無菌等張水溶液もしくは非水溶液、分散液剤、懸濁剤もしくは乳剤あるいは使用直前に糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を目的とする受益者の血液と等張にする溶質または懸濁化剤もしくは増粘剤を含有し得る無菌注射用液剤または分散液剤に再構成され得る無菌散剤とを組み合わせて含み得る。本開示の医薬組成物に使用され得る適切な水性または非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物、オリーブ油などの植物油ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液剤の場合は必要な粒子径を維持することにより、また界面活性剤の使用により維持することができる。一実施形態では、医薬組成物のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは式（ＩＩＩ）によるものである。
これらの医薬組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤も含有し得る。対象オリゴマーコンジュゲートに対する微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール ソルビン酸（ｐｈｅｎｏｌ
ｓｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）などを含ませることにより確保され得る。組成物中に糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めるのも望ましいことであり得る。さらに、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどを含ませることにより、注射用医薬形態の持続的吸収がもたらされ得る。
いくつかの場合には、薬物の効果を持続させるため、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収速度を低下させるのが望ましい。このことは、当該技術分野で公知の方法のなかでも特に、水への溶解性が低い結晶性または非晶質物質の液体懸濁液の使用により達成され得る。このため、薬物の吸収速度はその溶解速度に左右され、ひいては結晶の大きさおよび結晶の形態に左右され得る。あるいは、薬物を油性媒体に溶解または懸濁させることにより、非経口投与する薬物形態の遅延吸収が達成される。
注射デポ剤形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマーで対象オリゴマーコンジュゲートのマイクロ封入マトリックスを形成することにより作製され得る。ポリマーに対するオリゴマーの比および用いる具体的なポリマーの性質に応じて、オリゴマー放出速度が制御され得る。その他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）が挙げられる。デポ剤注射製剤は、身体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルションに薬物を封入することにより調製してもよい。
本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを医薬品としてヒトおよび動物に投与する場合、それ自体を、または薬学的に許容される担体とともにアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを例えば０．１～９９％（より好ましくは１０～３０％）含有する医薬組成物として投与することができる。
本開示の製剤または調製物を経口的に、非経口的に、局所的にまたは直腸内に投与し得る。通常、各投与経路に適した形態でそれらを投与する。例えば、それらを錠剤もしくはカプセル形態で、注射、吸入、点眼剤、軟膏、坐剤もしくは注入により；ローションもしくは軟膏により局所的に；または坐剤により経直腸的に投与する。
選択する投与経路に関係なく、適切な水和形態で使用され得る本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートおよび／または本開示の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。本開示の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、具体的な患者、組成物および投与様式で、患者に対して許容されない毒性を示さずに所望の治療反応を得るのに効果的な有効成分の量になるよう変化させ得る。
選択する投与量レベルは、用いる具体的な本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる具体的なオリゴマーの排泄または代謝の速度、吸収の速度および程度、治療の持続期間、用いる具体的なオリゴマーと併用する他の薬物、化合物および／または材料、治療する患者の年齢、性別、体重、体調、全般的健康状態および以前の既往歴ならびに医学分野で周知のこれと同様の因子を含めた様々な因子に左右される。
通常の技術を有する医師または獣医師であれば、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医師が、医薬組成物に用いる本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの用量を所望の治療効果を得るのに必要なレベルより低いレベルから開始し、所望の効果が得られるまで投与量を漸増させることが考えられる。本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの適切な１日量は一般に、何らかの治療効果を得るのに有効な最小用量であるアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの量となる。このような有効量は一般に、本明細書に記載される因子に左右される。必要な効果を得るのに使用する場合、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの患者に対する経口、静脈内、脳室内および皮下の用量は一般に、体重１キログラム当たり１日約０．０００１～約１００ｍｇの範囲となる。
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを一般に約１０～１６０ｍｇ／ｋｇまたは２０～１６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの場合には、１６０ｍｇ／ｋｇを超える用量が必要となり得る。いくつかの実施形態では、ｉ．ｖ．投与の用量は約０．５ｍｇ～１６０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを約０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを間のあらゆる整数を含めた約１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５１ｍｇ／ｋｇ、５２ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ、５４ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、５６ｍｇ／ｋｇ、５７ｍｇ／ｋｇ、５８ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１０５ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１１５ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１４５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１５５ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態では、オリゴマーを１０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、オリゴマーを２０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、オリゴマーを３０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、オリゴマーを４０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、オリゴマーを６０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、オリゴマーを８０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、オリゴマーを１６０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、オリゴマーを５０ｍｇ／ｋｇで投与する。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを一般に約１０～１６０ｍｇ／ｋｇまたは２０～１６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートのｉ．ｖ．投与の用量は、約０．５ｍｇ～１６０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを約０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを間のすべての整数を含めた約１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５１ｍｇ／ｋｇ、５２ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ、５４ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、５６ｍｇ／ｋｇ、５７ｍｇ／ｋｇ、５８ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１０５ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１１５ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１４５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１５５ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを１０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを２０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを３０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを４０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを６０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを８０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを１６０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを５０ｍｇ／ｋｇで投与する。
必要に応じて、有効な１日量の活性化合物を必要に応じて単位剤形の形で、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれより多くのサブ用量として１日を通して適切な間隔を空けて別々に投与し得る。ある特定の状況下では、投与を１日１回の投与とする。ある特定の実施形態では、所望の機能性ジストロフィンタンパク質発現を維持するため、投与を必要に応じて２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、８日毎、９日毎、１０日毎、１１日毎、１２日毎、１３日毎、１４日毎、または、１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、１０週間毎、１１週間毎、１２週間毎または１か月毎、２か月毎、３か月毎、４か月毎、５か月毎、６か月毎、７か月毎、８か月毎、９か月毎、１０か月毎、１１か月毎、１２か月毎に１回または複数回の投与とする。ある特定の実施形態では、投与を２週間毎に１回、１回または複数回の投与とする。いくつかの実施形態では、投与を２週間毎に１回、１回の投与とする。様々な実施形態では、投与を１か月ごとに１回または複数回の投与とする。ある特定の実施形態では、投与を毎月１回の投与とする。
様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎週１０ｍｇ／ｋｇで投与する。様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎週２０ｍｇ／ｋｇで投与する。様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎週３０ｍｇ／ｋｇで投与する。様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎週４０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎週６０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎週８０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎週１００ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎週１６０ｍｇ／ｋｇで投与する。本明細書で使用される毎週は、当該技術分野で認められている毎週という意味を有するものと理解される。
様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを隔週に１０ｍｇ／ｋｇで投与する。様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを隔週に２０ｍｇ／ｋｇで投与する。様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを隔週に３０ｍｇ／ｋｇで投与する。様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを隔週に４０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを隔週に６０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを隔週に８０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを隔週に１００ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを隔週に１６０ｍｇ／ｋｇで投与する。本明細書で使用される隔週は、当該技術分野で認められている隔週という意味を有するものと理解される。
様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを３週間毎に１０ｍｇ／ｋｇで投与する。様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを３週間毎に２０ｍｇ／ｋｇで投与する。様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを３週間毎に３０ｍｇ／ｋｇで投与する。様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを３週間毎に４０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを３週間毎に６０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを３週間毎に８０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを３週間毎に１００ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを３週間毎に１６０ｍｇ／ｋｇで投与する。本明細書で使用される３週間毎は、当該技術分野で認められている３週間毎に１回という意味を有するものと理解される。
様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎月１０ｍｇ／ｋｇで投与する。様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎月２０ｍｇ／ｋｇで投与する。様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎月３０ｍｇ／ｋｇで投与する。様々な実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎月４０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎月６０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎月８０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎月１００ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを毎月１６０ｍｇ／ｋｇで投与する。本明細書で使用される毎月は、当該技術分野で認められている毎月という意味を有するものと理解される。
当該技術分野で理解されるように、毎週、隔週、３週間毎または毎月の投与は、本明細書で論じられるとおりの、１回もしくは複数回の投与または１つもしくは複数のサブ用量のものであり得る。
本明細書に記載される核酸分子およびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、特に限定されないが、リポソームへの封入を含めた当業者に周知の様々な方法により、イオン導入法により、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着マイクロスフェアなどの本明細書に記載されるおよび当該技術分野で公知の他の媒体への組込みにより細胞に投与することができる。ある特定の実施形態では、マイクロエマルション化技術を用いて親油性（不水溶性）医薬品のバイオアベイラビリティを改善し得る。例としては、Ｔｒｉｍｅｔｒｉｎｅ（Ｄｏｒｄｕｎｏｏ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１７（１２），１６８５－１７１３，１９９１）およびＲＥＶ５９０１（Ｓｈｅｅｎ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ８０（７），７１２－７１４，１９９１）が挙げられる。有益性のなかでも特に、マイクロエマルション化は、循環系の代わりにリンパ系に優先的に吸収させ、それにより肝臓を迂回し、肝胆道循環中での化合物の破壊を防ぐことによりバイオアベイラビリティを増大させる。
本開示の一態様では、製剤は、本明細書に提供されるオリゴマーと少なくとも１つの両親媒性担体とから形成されるミセルを含有し、このミセルは平均直径が約１００ｎｍ未満である。より好ましい実施形態では、平均直径が約５０ｎｍ未満のミセルが提供され、さらにより好ましい実施形態では、平均直径が約３０ｎｍ未満または場合によっては約２０ｎｍ未満のミセルが提供される。
あらゆる適切な両親媒性担体が企図されるが、現時点で好ましい担体は一般に、Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ－Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ－ａｓ－Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ）ステータスを有し、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを可溶化するとともに、のちの段階で溶液が複合水相（ヒトの胃腸管にみられるものなど）と接触するときにアンチセンスオリゴマーコンジュゲートをマイクロエマルション化するものである。これらの必要条件を満たす両親媒性成分は通常、ＨＬＢ（親水性と親油性のバランス）値が２～２０であり、その構造にはＣ－６～Ｃ－２０の範囲内の直鎖脂肪族ラジカルが含まれている。例として、ポリエチレングリコール化脂肪グリセリドおよびポリエチレングリコールがある。
両親媒性担体の例としては、飽和および単不飽和ポリエチレングリコール化脂肪酸グリセリド、例えば完全水素化または部分水素化された様々な植物油から得られるものなどが挙げられる。このような油は、トリ脂肪酸グリセリド、ジ脂肪酸グリセリドおよびモノ脂肪酸グリセリドと、対応する脂肪酸のジポリ（エチレングリコール）エステルおよびモノポリ（エチレングリコール）エステルとからなり、カプリン酸４～１０％、カプリン酸３～９％、ラウリン酸４０～５０％、ミリスチン酸１４～２４％、パルミチン酸４～１４％およびステアリン酸５～１５％を含む特に好ましい脂肪酸組成を有する点で有利であり得る。また別の有用なクラスの両親媒性担体としては、飽和または単不飽和脂肪酸との部分エステル化ソルビタンおよび／またはソルビトール（ＳＰＡＮシリーズ）またはこれに相当するエトキシ化類似体（ＴＷＥＥＮシリーズ）が挙げられる。
Ｇｅｌｕｃｉｒｅシリーズ、Ｌａｂｒａｆｉｌ、ＬａｂｒａｓｏｌまたはＬａｕｒｏｇｌｙｃｏｌ（いずれもフランス、サン＝プリエストのＧａｔｔｅｆｏｓｓｅ社が製造および流通を行っている）、ＰＥＧ－モノ－オレアート、ＰＥＧ－ジ－オレアート、ＰＥＧ－モノ－ラウラートおよびジ－ラウラート、レシチン、ポリソルベート８０など（米国および世界にある多数の会社が製造および流通を行っている）を含めた市販の両親媒性担体が特に有用であり得る。
ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物を適切な宿主細胞に導入するため、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞などの使用による送達を実施し得る。具体的には、本開示の医薬組成物を送達するため、これを脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、ナノ粒子などのいずれかに封入して製剤化し得る。製剤化およびそのような送達媒体の使用は、既知の従来技術を用いて実施することができる。
本開示での使用に適した親水性ポリマーは、易水溶性であり、小胞を形成する脂質と共有結合することができ、毒性作用がなくｉｎ ｖｉｖｏでの耐容性がある（すなわち、生体適合性である）ものである。適切なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ポリラクチドとも呼ばれる）、ポリグリコール酸（ポリグリコリドとも呼ばれる）、ポリ乳酸－ポリグリコール酸コポリマーおよびポリビニルアルコールが挙げられる。ある特定の実施形態では、ポリマーは、約１００もしくは１２０ダルトンから約５，０００もしくは１０，０００ダルトンまで、または約３００ダルトン～約５，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。他の実施形態では、ポリマーは、約１００～約５，０００ダルトンの重量平均分子量を有するか、約３００～約５，０００ダルトンの重量平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）である。ある特定の実施形態では、ポリマーは約７５０ダルトンの重量平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）、例えばＰＥＧ（７５０）である。ポリマーは、その中に含まれるモノマーの数によっても定義され得るものであり；本開示の好ましい実施形態では、少なくとも約３つのモノマーからなるポリマーを用い、このような３つのモノマーからなるＰＥＧポリマーは、約１３２ダルトンの分子量を有する。
本開示での使用に適し得るその他の親水性ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミドおよびヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが挙げられる。
ある特定の実施形態では、本開示の製剤は、ポリアミド、ポリカルボナート、ポリアルキレン、アクリル酸およびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコ－ポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、多糖、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリラートならびにその配合物、混合物またはコポリマーからなる群より選択される生体適合性ポリマーを含む。
シクロデキストリンは、６個、７個または８個のグルコース単位からなり、それぞれα、βまたはγのギリシャ文字で命名される環状オリゴ糖である。グルコース単位はα－１，４－グルコシド結合によって結合している。糖単位がいす形配座であるため、（Ｃ－２、Ｃ－３の）第二級ヒドロキシル基がいずれも環の一方に位置し、Ｃ－６の第一級ヒドロキシル基がいずれも他方に位置している。その結果、外面が親水性となり、それによりシクロデキストリンが水溶性となる。これとは対照的に、シクロデキストリンの空洞は、Ｃ－３およびＣ－５原子の水素およびエーテル様酸素に覆われているため疎水性となる。これらのマトリックスにより、例えば１７α－エストラジオールなどのステロイド化合物を含めた相対的に疎水性が強い様々な化合物との錯体形成が可能となる（例えば、ｖａｎ Ｕｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．３８：１－３－１１３（１９９４）を参照されたい）。錯体形成はファンデルワールス相互作用および水素結合形成によって起こる。シクロデキストリンの化学的性質に関する概説についてはＷｅｎｚ，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：８０３－８２２（１９９４）を参照されたい。
シクロデキストリン誘導体の物理化学的特性はその種類および置換度に大きく左右される。例えば、それらの水への溶解性は不溶性（例えば、トリアセチル－ベータ－シクロデキストリン）～１４７％の可溶性（ｗ／ｖ）（Ｇ－２－ベータ－シクロデキストリン）の範囲内にある。さらに、それらは多数の有機溶媒に可溶性である。このシクロデキストリンの特性は、その溶解性を増大または低下させることにより様々な製剤成分の溶解性を制御することを可能にする。
シクロデキストリンおよびその調製方法が多数記載されている。例えば、Ｐａｒｍｅｔｅｒ（Ｉ）ｅｔ ａｌ．（米国特許第３，４５３，２５９号）およびＧｒａｍｅｒａ ｅｔ ａｌ．（米国特許第３，４５９，７３１号）は電気的に中性のシクロデキストリンについて記載している。その他の誘導体としては、カチオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩ），米国特許第３，４５３，２５７号］、不溶性架橋シクロデキストリン（Ｓｏｌｍｓ，米国特許第３，４２０，７８８号）およびアニオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ），米国特許第３，４２６，０１１号］が挙げられる。アニオン特性を有するシクロデキストリン誘導体には、親シクロデキストリンにカルボン酸、亜リン酸、亜ホスフィン酸、ホスホン酸、リン酸、チオホスホン酸、チオスルフィン酸およびスルホン酸を付加したものがある［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ）、上記を参照されたい］。さらに、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体がＳｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．により記載されている（米国特許第５，１３４，１２７号）。
リポソームは、水性内部区画を取り囲む少なくとも１つの脂質二重層膜からなるものである。リポソームは膜のタイプおよび大きさにより特徴付けられ得る。小さい一枚膜小胞（ＳＵＶ）は、単一の膜を有し、通常、直径が０．０２～０．０５μｍの範囲内にあるものであり；大きい一枚膜小胞（ＬＵＶ）は通常、０．０５μｍより大きいものである。オリゴラメラの大きい小胞および多重膜小胞は、通常は同心円状の膜層を複数有し、通常、０．１μｍより大きい。同心円状でない複数の膜を有するリポソーム、すなわち、大きい小胞の中にそれより小さい複数の小胞が含まれたものを多胞小胞と呼ぶ。
本開示の一態様は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含有するリポソームを含み、運搬能が増大したリポソームが得られるようリポソーム膜が製剤化された製剤に関する。これに代えて、または加えて、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートをリポソームのリポソーム二重膜の中に含ませても、リポソーム二重膜上に吸着されてもよい。本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを脂質界面活性剤で凝集させ、リポソームの内部空間内に運搬してもよく；このような場合、活性薬剤－界面活性剤凝集体の破壊作用に耐性を示すようリポソーム膜を製剤化する。
本開示の一実施形態では、ＰＥＧ鎖が脂質二重層の内表面からリポソームに取り囲まれた内部空間内に伸長し、脂質二重層の外側から周囲環境内に伸長するように、リポソームの脂質二重層の中にポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）で誘導体化された脂質が含まれている。
本開示のリポソーム内に含まれている活性薬剤は可溶化形態である。界面活性剤と活性薬剤の凝集体（目的の活性薬剤が含まれたエマルションまたはミセルなど）が本開示によるリポソームの内部空間内に封入され得る。界面活性剤は、活性薬剤を分散および可溶化させる作用を示し、特に限定されないが様々な鎖長（例えば、約Ｃ１４～約Ｃ２０）の生体適合性リゾホスファチジルコリン（ＬＰＧ）を含めた任意の適切な脂肪族、脂環式または芳香族界面活性剤から選択され得る。ＰＥＧ脂質などのポリマー誘導体化脂質は、それがミセル／膜融合を阻害する作用を示し、界面活性剤分子へのポリマー付加が界面活性剤のＣＭＣを低下させミセル形成を促進することから、ミセル形成にも使用し得る。好ましいのはマイクロモルの範囲内のＣＭＯを有する界面活性剤であるが、これよりＣＭＣが高い界面活性剤を用いて、本開示のリポソーム内に封入されたミセルを調製してもよい。
本開示によるリポソームは、当該技術分野で公知の様々な技術のいずれかにより調製され得る。例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；国際公開第９６／１４０５７号；Ｎｅｗ ＲＲＣ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０），ｐａｇｅｓ ３３－１０４；およびＬａｓｉｃ ＤＤ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９３を参照されたい。例えば、本開示のリポソームは、予め形成したリポソームを脂質グラフトポリマーからなるミセルに曝露することなどにより、親水性ポリマーで誘導体化した脂質をリポソームに望まれる誘導体化脂質の最終モルパーセントに相当する脂質濃度で、予め形成したリポソーム内に分散させることにより調製され得る。親水性ポリマーを含有するリポソームは、当該技術分野で公知のホモジナイゼーション技術、脂質領域水和技術または押出し技術により形成することもできる。
また別の例示的製剤方法では、最初に、活性薬剤を超音波処理により、疎水性分子を容易に可溶化するリゾホスファチジルコリンまたはその他の低ＣＭＣ界面活性剤（ポリマーグラフト脂質を含む）に分散させる。次いで、得られた活性薬剤のミセル懸濁液を用いて、適切なモルパーセントのポリマーグラフト脂質またはコレステロールを含有する乾燥脂質試料を再水和する。次いで、当該技術分野で公知の押出し技術を用いて脂質と活性薬剤の懸濁液をリポソームにし、得られたリポソームを標準的なカラム分離により未封入溶液から分離する。
本開示の一態様では、選択した大きさの範囲内の実質的に均一な大きさになるようリポソームを調製する。ある有効なサイズ決定方法では、リポソームの水性懸濁液を選択した均一な細孔径を有する一連のポリカルボナート膜に通して押し出し；膜の細孔径は、その膜に通して押し出すことによって得られるリポソームの最大に大きさにほぼ相当する。例えば、米国特許第４，７３７，３２３号（１９８８年４月１２日）を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）などの試薬を用いてポリヌクレオチドまたはタンパク質を細胞内に導入し得る。
本開示の製剤の放出特性は、封入材料、封入薬物の濃度および放出調節剤の存在に左右される。例えば、例えば胃内のような低ｐＨまたは腸内のような高ｐＨでのみ放出するｐＨ感受性コーティング剤を用いて、放出をｐＨ依存性になるよう操作することができる。腸溶性コーティング剤を用いて、胃を通過するまで放出が起こらないようにすることができる。複数のコーティング剤または様々な材料に封入したシアナミドの混合物を用いて、最初に胃内で放出させたのち、腸内で放出させることができる。水の取込みまたはカプセルからの拡散による薬物の放出を増大させることができる塩または細孔形成剤を含ませることによって放出を操作することもできる。薬物の溶解性を調節する補形剤を用いて放出速度を制御することもできる。マトリックスの分解またはマトリックスからの放出を促進する剤を組み込むこともできる。これらは化合物に応じて、薬物に添加することも、分離相として（すなわち、微粒子として）添加することも、あるいはポリマー相に共溶解させることもできる。ほとんどの場合、その量は０．１～３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）にするべきである。分解促進剤のタイプとしては、硫酸アンモニウムおよび塩化アンモニウムなどの無機塩、クエン酸、安息香酸およびアスコルビン酸などの有機酸、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛および水酸化亜鉛などの無機塩基、ならびに、硫酸プロタミン、スペルミン、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミンなどの有機塩基ならびにＴｗｅｅｎ（登録商標）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）などの界面活性剤が挙げられる。マトリックス（すなわち、無機塩および糖などの水溶性化合物）に微細構造を与える細孔形成剤を微粒子として添加する。その範囲は通常、１～３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）である。
粒子の消化管内での滞留時間を変化させることにより取込みを操作することもできる。これは例えば、粒子を粘膜付着性ポリマーでコーティングするか、封入材料に粘膜付着性ポリマーを選択することにより達成することができる。例としては、遊離カルボキシル基を有する大部分のポリマー、例えばキトサン、セルロース、特にポリアクリラート（本明細書で使用されるポリアクリラートは、アクリラート基ならびにシアノアクリラートおよびメタクリラートなどの修飾アクリラート基を含めたポリマーを指す）などが挙げられる。
アンチセンスオリゴマーコンジュゲートを外科もしくは医療デバイスまたは埋植物の中に収まるよう製剤化する、あるいは外科もしくは医療デバイスまたは埋植物により放出されるよう適合させ得る。ある特定の態様では、埋植物をアンチセンスオリゴマーコンジュゲートでコーティングするか、別の方法によりアンチセンスオリゴマーコンジュゲートで処理し得る。例えば、ヒドロゲルまたはその他のポリマー、例えば生体適合性ポリマーおよび／または生分解性ポリマーなどを用いて、埋植物を本開示の医薬組成物でコーティングし得る（すなわち、ヒドロゲルまたはその他のポリマーを用いることにより、組成物を医療デバイスでの使用に適合させ得る）。医療デバイスを薬剤でコーティングするためのポリマーおよびコポリマーは当該技術分野で周知である。埋植物の例としては、特に限定されないが、ステント、薬物溶出ステント、縫合糸、人工器官、血管カテーテル、透析カテーテル、血管移植、人工心臓弁、心ペースメーカー、植込み型除細動器、ＩＶ針、ピン、スクリュー、プレートなどの骨の固定および形成のためのデバイスならびに創傷治癒のためのその他のデバイスおよび人工組織マトリックスが挙げられる。
本明細書に提供される方法に加えて、本開示に従って使用するアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを他の医薬品と同様に人間医学または獣医学に使用するのに好都合な任意の方法で投与するよう製剤化し得る。アンチセンスオリゴマーコンジュゲートおよびその対応する製剤を単独で、または筋ジストロフィー治療の他の治療戦略、例えば筋芽細胞移植、幹細胞療法、アミノグリコシド系抗生物質の投与、プロテアソーム阻害剤およびアップレギュレーション療法（例えば、ジストロフィンの常染色体パラログであるユートロフィンのアップレギュレーション）などと組み合わせて投与し得る。
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの投与の前に、それと同時に、またはその後に追加の治療薬を投与し得る。例えば、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートをステロイドおよび／または抗生物質と組み合わせて投与し得る。ある特定の実施形態では、バックグランドステロイド療法（例えば、間欠的または長期的／継続的バックグランドステロイド療法）を受けている患者にアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを投与する。例えば、いくつかの実施形態では、患者は、アンチセンスオリゴマーの投与の前に副腎皮質ステロイドによる治療を受けており、そのステロイド治療を受け続ける。いくつかの実施形態では、ステロイドはグルココルチコイドまたはプレドニゾンである。
当業者であれば任意の特定の動物および病態に対して最適な投与経路および任意の投与量を容易に決定することが可能であるため、記載した投与経路は単なる指針に過ぎない。機能性の遺伝物質をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで細胞内に新たに導入する方法が複数試みられている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５－１２８０）。これらの方法には、発現させる遺伝子を改変レトロウイルス内に組み込むこと（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）上記；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１（１８），ｓｕｐｐｌ．：５０７４Ｓ－５０７９Ｓ）；非レトロウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）への組込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，６８：１４３－１５５；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１－４３４）；または異種プロモーター－エンハンサーエレメントと連結した導入遺伝子をリポソームにより送達すること（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９），上記；Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８－２８１；Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５－１２８８；Ｈａｚｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，４：２０６－２０９；ならびにＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４：７８５１－７８５５）；リガンド特異的カチオンに基づく輸送系と連動した導入遺伝子の送達（ＷｕおよびＷｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１－１４６２４）またはネイキッドＤＮＡ、発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），上記；Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５－１４６８）が含まれる。導入遺伝子を組織内に直接注入すれば局所発現のみが起こる（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２）上記；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）上記；Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８９）上記；Ｎａｂｅｌ（１９９０）上記；およびＨａｚｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）上記）。Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．のグループ（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）２９８：２７８－２８１およびＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３９（ａｂｓｔｒａｃｔ））は、ＤＮＡリポソーム複合体をマウスの静脈内または気管内に投与すると肺のみにｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションが起こることを報告している。ヒト遺伝子治療の方法に関する総説にはＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８－８１３がある。
さらなる実施形態では、本開示の医薬組成物は、全体が参照により本明細書に組み込まれるＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．７，１０９８１（２０１６）に記載されているように、炭水化物をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５％のヘキソース炭水化物を含み得る。例えば、本開示の医薬組成物は、５％のグルコース、５％のフルクトースまたは５％のマンノースを含み得る。ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、２．５％のグルコースと２．５％のフルクトースとを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５体積％の量で存在するアラビノース、５体積％の量で存在するグルコース、５体積％の量で存在するソルビトール、５体積％の量で存在するガラクトース、５体積％の量で存在するフルクトース、５体積％の量で存在するキシリトール、５体積％の量で存在するマンノース、それぞれが２．５体積％の量で存在するグルコースとフルクトースの組合せ、および５．７体積％の量で存在するグルコースと２．８６体積％の量で存在するフルクトースと１．４体積％の量で存在するキシリトールの組合せから選択される炭水化物を含み得る。
ＩＶ．使用方法
エクソンスキッピングを用いるジストロフィンリーディングフレームの回復
ジストロフィン遺伝子のアウトオブフレーム変異を原因とするＤＭＤの治療に有望な治療方法が、インフレーム変異を原因としＢＭＤとして知られる比較的軽度の型のジストロフィン異常症によって示唆されている。アウトオブフレーム変異をインフレーム変異に変換することができれば、仮説上はｍＲＮＡリーディングフレームを保存し、内部が短縮されてはいるが機能性であるジストロフィンタンパク質を産生させることができる。本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、このことを達成するため設計したものである。
ＰＭＯと標的プレｍＲＮＡ配列がハイブリダイズすると、プレｍＲＮＡスプライシング複合体の形成が阻害され、成熟ｍＲＮＡからエクソン５１が欠失する。本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの構造および立体配座は相補的配列との配列特異的塩基対形成を可能にするものである。例えば、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１をスキップするよう設計されたＰＭＯであるｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎは、これと同様の機序により、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に含まれる相補的配列との配列特異的塩基対形成を可能にする。
７９エクソンがすべて含まれる正常なジストロフィンｍＲＮＡからは正常なジストロフィンタンパク質が産生される。図１の図は、ジストロフィンのプレｍＲＮＡおよび成熟ｍＲＮＡエクソン４７からエクソン５３までの小さいセクションを示している。各エクソンの形状は、コドンがエクソン間でどのように分割されているかを示しており；注目すべきなのは、各コドンが３個のヌクレオチドからなることである。長方形のエクソンは、完全なコドンで始まり、完全なコドンで終わっている。矢印形のエクソンは、完全なコドンで始まるが、コドンのヌクレオチド＃１のみが含まれる分割されたコドンで終わっている。このコドンのヌクレオチド＃２および＃３は、山形で始まる次のエクソンに含まれている。
通常、ジストロフィン遺伝子からエクソン全体が失われたジストロフィンｍＲＮＡがあるとＤＭＤが生じる。図２の図は、ＤＭＤが生じることが知られている遺伝子変異のタイプ（エクソン５０の欠失）を示している。エクソン４９は完全なコドンで終わり、エクソン５１はコドンの２番目のヌクレオチドで始まるため、エクソン４９の後のリーディングフレームがシフトし、それによりアウトオブフレームのｍＲＮＡリーディングフレームおよび変異下流の誤ったアミノ酸の組込みが生じる。その結果、機能的Ｃ末端ジストログリカン結合ドメインが欠如して不安定なジストロフィンタンパク質が産生される。
ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎはエクソン５１をスキップしてｍＲＮＡリーディングフレームを回復させる。エクソン４９は完全なコドンで終わり、エクソン５２はコドンの１番目のヌクレオチドで始まるため、エクソン５１が欠失すればリーディングフレームが回復し、それにより「インフレーム」ＢＭＤ変異と同じくインタクトのジストログリカン結合部位を有し内部が短縮したジストロフィンタンパク質が産生される（図３）。
エクソンスキッピングを用いジストロフィンｍＲＮＡオープンリーディングフレームを回復させてＤＭＤ表現型を改善することが実現可能であることは、非臨床研究により裏付けられている。ＤＭＤのジストロフィン動物モデルを用いた多数の試験でエクソンスキッピングによるジストロフィン回復により筋力および筋機能が確実に回復することが示されている（Ｓｈａｒｐ ２０１１；Ｙｏｋｏｔａ ２００９；Ｗｕ ２００８；Ｗｕ ２０１１；Ｂａｒｔｏｎ－Ｄａｖｉｓ １９９９；Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ２００４；Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ ２００６；Ｙｕｅ ２００６；Ｗｅｌｃｈ ２００７；Ｋａｗａｎｏ ２００８；Ｒｅａｙ ２００８；ｖａｎ Ｐｕｔｔｅｎ ２０１２）。このことに関する説得力のある例の１つに、エクソンスキッピング（ＰＭＯを使用）療法後のジストロフィンレベルを同じ組織の筋機能と比較した試験がある。ジストロフィンｍｄｘマウスでは、マウス特異的ＰＭＯで処置した前脛骨（ＴＡ）筋がストレス誘導性収縮後にその最大許容荷重の約７５％を維持したのに対し、反対側の未処置ＴＡ筋はその最大許容荷重の約２５％を維持するにとどまった（ｐ＜０．０５）（Ｓｈａｒｐ ２０１１）。また別の試験では、２～５か月齢のジストロフィンＣＸＭＤイヌ３例にその遺伝子変異に特異的なＰＭＯを用いたエクソンスキッピング療法を週１回で５～７週間または隔週で２２週間実施した。エクソンスキッピング療法を実施した場合、３例全例で全身の骨格筋にジストロフィンの盛んな発現がみられたほか、ベースラインと比較して歩行能力（１５ｍ走検査）の維持または改善がみられた。これとは対照的に、月齢の一致する未処置ＣＸＭＤイヌには、試験期間を通じて歩行能力の著明な低下がみられた（Ｙｏｋｏｔａ ２００９）。
ＰＭＯはｍｄｘマウスでも、ヒトＤＭＤ転写物全体を発現するヒト化ＤＭＤ（ｈＤＭＤ）マウスモデルでも、等モル濃度でのエクソンスキッピング活性がホスホロチオアートより高いことが示されている（Ｈｅｅｍｓｋｉｒｋ ２００９）。正常ヒト骨格筋細胞またはエクソン５１スキッピングが可能な様々な変異を有するＤＭＤ患者由来筋細胞に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）およびウエスタンブロット（ＷＢ）を用いたｉｎ
ｖｉｔｒｏの実験では、ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ（ＰＭＯ）がエクソン５１スキッピングの強力な誘導因子であることが明らかになった。ｈＤＭＤマウスモデルではｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ誘導エクソン５１スキッピングがｉｎ ｖｉｖｏで確認されている（Ａｒｅｃｈａｖａｌａ－Ｇｏｍｅｚａ ２００７）。
ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の標的領域に相補的でありエクソン５１スキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの効果を解析するための臨床転帰としては、パーセントジストロフィン陽性線維（ＰＤＰＦ）、６分間歩行検査（６ＭＷＴ）、歩行能力の低下（ＬＯＡ）、Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＡ）、肺機能検査（ＰＦＴ）、外からの支援を受けずに起立する能力（仰臥位からの）、ｄｅ ｎｏｖｏのジストロフィン産生量、およびその他の機能測定が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示は、エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有する対象にジストロフィンを産生させる方法であって、対象に本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、エクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を有する対象にｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてジストロフィンタンパク質産生を誘導する方法を提供する。タンパク質産生は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ウエスタンブロット解析または免疫組織化学（ＩＨＣ）により測定することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、必要とする対象のＤＭＤを治療する方法を提供し、ここでは、対象はエクソン５１スキッピングが可能なジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、対象に本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。様々な実施形態では、対象の治療を疾患進行の遅延により測定する。いくつかの実施形態では、対象の治療を対象の歩行能力の維持または対象の歩行能力低下の抑制により測定する。いくつかの実施形態では、６分間歩行検査（６ＭＷＴ）を用いて歩行能力を測定する。ある特定の実施形態では、Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒｔ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＡ）を用いて歩行能力を測定する。
様々な実施形態では、本開示は、ＤＭＤを有する対象の肺機能を維持する、または肺機能低下を抑制する方法を提供し、ここでは、対象はエクソン５１スキッピングが可能なＤＭＤ遺伝子の変異を有し、方法は、対象に本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。いくつかの実施形態では、肺機能を最大呼気圧（ＭＥＰ）として測定する。ある特定の実施形態では、肺機能を最大吸気圧（ＭＩＰ）として測定する。いくつかの実施形態では、肺機能を努力肺活量（ＦＶＣ）として測定する。
さらなる実施形態では、本開示の方法で本開示の医薬組成物を、全体が参照により本明細書に組み込まれるＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．７，１０９８１（２０１６）に記載されているように、同じ製剤で、または別個の製剤で炭水化物と共投与し得る。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物を５％のヘキソース炭水化物と共投与し得る。例えば、本開示の医薬組成物を５％のグルコース、５％のフルクトースまたは５％のマンノースと共投与し得る。ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物を２．５％のグルコースおよび２．５％のフルクトースと共投与し得る。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物を５体積％の量で存在するアラビノース、５体積％の量で存在するグルコース、５体積％の量で存在するソルビトール、５体積％の量で存在するガラクトース、５体積％の量で存在するフルクトース、５体積％の量で存在するキシリトール、５体積％の量で存在するマンノース、それぞれが２．５体積％の量で存在するグルコースとフルクトースの組合せ、および５．７体積％の量で存在するグルコースと、２．８６体積％の量で存在するフルクトースと、１．４体積％の量で存在するキシリトールの組合せから選択される炭水化物と共投与し得る。
様々な実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを治療有効量の非ステロイド性抗炎症化合物と共投与する。いくつかの実施形態では、非ステロイド性抗炎症化合物はＮＦ－ｋＢ阻害剤である。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、ＣＡＴ－１００４またはその薬学的に許容される塩であり得る。様々な実施形態では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤はサリチル酸塩とＤＨＡのコンジュゲートであり得る。いくつかの実施形態では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、ＣＡＴ－１０４１またはその薬学的に許容される塩である。ある特定の実施形態では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤はサリチル酸塩とＥＰＡのコンジュゲートである。様々な実施形態では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は
またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、非ステロイド性抗炎症化合物はＴＧＦ－ｂ阻害剤である。例えば、ある特定の実施形態では、ＴＧＦ－ｂ阻害剤はＨＴ－１００である。
ある特定の実施形態では、治療に使用する本明細書に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載される。ある特定の実施形態では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用する本明細書に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載される。ある特定の実施形態では、治療に使用する薬物の製造に使用する本明細書に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載される。ある特定の実施形態では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための薬物の製造に使用する本明細書に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載される。
Ｖ．キット
本開示は、遺伝性疾患を有する患者を治療するためのキットも提供し、このキットは、適切な容器に包装された少なくとも１つのアンチセンス分子（例えば、配列番号１で記載されるアンチセンスオリゴマーを含むアンチセンスオリゴマーコンジュゲート）をその使用のための指示とともに含む。キットは、緩衝剤、安定剤などの特定の周辺試薬も含み得る。当業者は、上の方法の適用が他の多くの疾患の治療に使用するのに適したアンチセンス分子の特定に広い適用範囲を有することを理解するべきである。一実施形態では、キットは式（ＩＩＩ）によるアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含む。
（実施例）
上記の開示は、明確な理解を目的として図および例によってある程度詳細に記載されているが、本開示の教示を踏まえれば、添付の「特許請求の範囲」の趣旨も範囲も逸脱することなく本開示に特定の改変および修正を施し得ることが当業者に容易に明らかになるであろう。以下の実施例は単に説明を目的とするものであって、限定を目的とするものではない。当業者には、改変または修正を施しても実質的にほぼ同じ結果が得られる様々な重要性の低いパラメータが容易に認識されよう。
材料および方法
細胞および組織の培養処理条件
分化ヒト筋細胞（ＺｅｎＢｉｏ社）を用いてエクソンスキッピングを測定した。具体的には、筋芽細胞（ＺｅｎＢｉｏ社、ＳＫＢ－Ｆ）を増殖培地（ＳＫＢ－Ｍ；ＺｅｎＢｉｏ社）中、３７℃、５％ＣＯ２で８０～９０％のコンフルエンスまで増殖させた。増殖培地を分化培地（ＳＫＭ－Ｄ；ＺｅｎＢｉｏ社）に入れ替えることにより分化を開始させた。エクソン５１スキッピングをアッセイするため、分化した細胞１×１０４個を２４ウェルプレートに播き、各ウェルに様々な濃度のＰＭＯまたはＰＰＭＯを含有する分化培地（ＳＫＭ－Ｄ；ＺｅｎＢｉｏ社）１ｍＬを加え、９６時間インキュベートした。
ウエスタンブロット法解析
ウエスタンブロット解析には、直径約５ｍｍの９～１８×２０μｍ組織切片に対して緩衝液１３３μＬの比でホモジナイゼーション緩衝液（４％ＳＤＳ、４Ｍ尿素、１２５ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ６．８））を用いて組織をホモジナイズした。対応する溶解物を収集し、ＲＣ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ社、カタログ番号５００－０１２２）を製造業者の指示通りに用いたタンパク質定量化に供した。ホモジナイゼーション緩衝液を用いて組織抽出試料を１：１０に希釈してＢＳＡ標準曲線の範囲内に収まるようにした。タンパク質溶解物２５μｌ、ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号ＮＰ０００８、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）７μｌ、およびＮｕＰＡＧＥ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（１０倍）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号ＮＰ０００４）３μｌを用いて、試料３５μｌに所望の量のタンパク質が含まれるよう試料を調製した。タンパク質試料を９５℃で５分間加熱した後、試料を遠心分離し、上清をＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ １０ウェル、１ｍｍ、ミニ３～８％ポリアクリルアミドトリス酢酸ゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号ＥＡ０３７５）上に１レーン当たりの総タンパク質負荷量が最大５０μｇになるように負荷した。ゲルを室温にて、ダイフロントがゲルからはみ出るまで１５０ボルトで泳動させた。得られたタンパク質ゲルをＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号ＬＣ２００７）に室温で７５分間、ＮｕＰＡＧＥ転写緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＮＰ００６－１）、１０％メタノールおよび０．１％ＮｕＰＡＧＥ抗酸化剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＮＰ０００５）を用いて３０ボルトで転写した。
タンパク質転写後、ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳ緩衝液（１×ＴＢＳ（Ａｍｒｅｓｃｏ社、カタログ番号Ｊ６４０－４Ｌ）、０．１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ－２０）に浸した。膜をブロッキング緩衝液（ＴＴＢＳ中５％（ｗ／ｖ）の無脂肪粉乳（Ｌａｂ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号Ｍ０８４１）に移し、４℃で一晩、穏やかに振盪しながら浸漬した。ブロッキング後、ブロッキング緩衝液を用いて１：２０に希釈したＤＹＳ１（Ｌｅｉｃａ社、カタログ番号ＮＣＬ－ＤＹＳ１）中、室温で６０分間、またはブロッキング緩衝液で１：１００，０００に希釈した抗α－アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号ＮＡ９３１Ｖ）中、室温で２０分間、膜をインキュベートし、次いで６回洗浄した（毎回ＴＴＢＳで５分間）。ブロッキング緩衝液を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号ＮＡ９３１Ｖ）を１：４０，０００に希釈し、膜に４５分間（ＤＹＳ１）または１５分間（α－アクチニン）加えた後、再び６回洗浄した。ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号ＲＰＮ２２３２）を用いて、フィルムをゲルに曝し、しかるべく現像した。現像したフィルムをスキャンし、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ Ｐｌｕｓソフトウェア（バージョン８．１）を用いて解析し、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを用いて直線回帰分析を実施した。
ウエスタンブロットゲルにはそれぞれ、正常組織（マウスの四頭筋、横隔膜または心臓）から抽出した全タンパク質を例えば６４％、１６％、４％、１％および０．２５％に希釈し（例えば、図５Ａおよび５Ｂを参照されたい）、ＤＭＤ組織（例えば、ｍｄｘマウスの四頭筋、横隔膜もしくは心臓、またはＮＨＰの四頭筋、横隔膜もしくは平滑筋（ＧＩ））抽出物に添加したものを用いて作成した４ポイントまたは５ポイントのジストロフィン標準曲線が含まれる。標準曲線試料を上記の通りに処理した。ジストロフィンのバンド強度とゲル標準曲線とを比較することにより、ジストロフィンタンパク質レベルを野生型ジストロフィンレベルに対するパーセント（％ＷＴ）として求めた。
ＲＴ－ＰＣＲ解析
ＲＴ－ＰＣＲ解析には、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＥスピンキットを製造業者のプロトコル通りに用いて、細胞からＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐを用いてＲＮＡの濃度および純度を求めた。エクソン４９と結合する順方向プライマー、配列番号５（５’－ＣＣＡＧＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧ－３’）およびエクソン５２と結合する逆方向プライマー、配列番号６（５’－ＣＧＡＴＣＣＧＴＡＡＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＡＧＣＣ－３’）を用いたＲＴ－ＰＣＲによりエクソン５１スキッピングを測定した。スキップされたエクソン５１から２４６ｂｐのアンプリコンが得られ、スキップされなかったエクソン５１から４７８ｂｐのアンプリコンが得られた。
順方向プライマー、配列番号７（５’－ＣＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＧＧ－３’）および逆方向プライマー、配列番号８（５’－ＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＣＴＧ－３’）を用いたＲＴ－ＰＣＲによりマウスのエクソン２３スキッピングを測定した。
ＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲに供した後、ゲルキャピラリー電気泳動を用いるＣａｌｉｐｅｒ社製機器を用いて試料を解析した。以下の方程式：（スキップのあるバンドの曲線下面積）／（スキップのあるバンドとスキップのないバンドの曲線下面積の合計）×１００を用いて、エクソンスキッピングのパーセントを算出した。
免疫組織化学：ジストロフィン染色：
１０ミクロンのマウス四頭筋凍結組織切片を用いて、ＰＢＳ中１０％のヤギ血清＋１％のＢＳＡに溶かしたジストロフィン一次抗体（希釈比１：２５０、ウサギ、Ａｂｃａｍ社、カタログ番号ａｂ１５２７７）および１０％ヤギ血清＋１％ＢＳＡに溶かした二次抗体Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒｏ ４８８ヤギ抗ウサギ（希釈比１：１０００）によりジストロフィンを検出した。
モルホリノサブユニットの調製
Ｂが塩基対形成部分を表すスキーム１を参照すると、図のように、対応するリビヌクレオシド（ｒｉｂｉｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）（１）からモルホリノサブユニットを調製し得る。必要に応じて、適切な保護基前駆体、例えば塩化トリチルとの反応によりモルホリノサブユニット（２）を保護し得る。下でさらに詳細に記載するように、３’保護基は一般に固相オリゴマー合成の過程で除去される。塩基対形成部分は固相オリゴマー合成に適した方法で保護し得る。適切な保護基として、アデニンおよびシトシンにはベンゾイル、グアニンにはフェニルアセチル、ヒポキサンチン（Ｉ）にはピバロイルオキシメチルが挙げられる。ピバロイルオキシメチル基はヒポキサンチン複素環塩基のＮ１位上に導入することができる。保護されていないヒポキサンチンサブユニットを用いてもよいが、塩基が保護されているときの方が活性化反応の収率がはるかに優れている。その他の適切な保護基としては、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０７６，４７６号に開示されているものが挙げられる。
３と活性化リン化合物４との反応により、所望の結合部分５を有するモルホリノサブユニットが得られる。
構造４の化合物は当業者に公知の多数の方法を用いて調製することができる。次いで、上に概説したようにモルホリノ部分とのカップリングが進行する。
サブユニット間結合を含むオリゴマーを調製には、構造５の化合物を固相オリゴマー合成に用いることができる。このような方法は当該技術分野で周知である。簡潔に述べれば、構造５の化合物の５’末端を固体支持体に対するリンカーが含まれるよう修飾し得る。支持されたのち、５の保護基（例えば、３’末端のトリチル）を除去し、遊離アミンを第二の構造５の化合物の活性化リン部分と反応させる。この配列を所望の長さのオリゴが得られるまで繰り返す。終末の３’末端にある保護基は、除去しても、あるいは３’修飾を望む場合は残してもよい。オリゴは、多数の方法または固体支持体との結合を切断する塩基を用いる例示の処理により固体支持体から切り離すことができる。
モルホリノオリゴマー全般および本開示の特定のモルホリノオリゴマーの調製について実施例でさらに詳細に記載する。
モルホリノオリゴマーの調製
スキーム２による以下のプロトコルを用いて本開示の化合物の調製を実施する：
トリチルピペラジンフェニルカルバマート３５の調製：冷却した化合物１１のジクロロメタン（６ｍＬ／ｇ１１）懸濁液に炭酸カリウム（３．２ｅｑ）の水溶液（４ｍＬ／ｇ炭酸カリウム）を加えた。この２相混合物にクロロギ酸フェニル（１．０３ｅｑ）のジクロロメタン溶液（２ｇ／ｇクロロギ酸フェニル）を徐々に加えた。反応混合物を２０℃に温めた。反応終了時（１～２時間）、層を分離した。有機層を水で洗浄し、無水炭酸カリウムで乾燥させた。生成物３５を晶析によりアセトニトリルから単離した。
カルバミン酸アルコール３６の調製：水素化ナトリウム（１．２ｅｑ）を１－メチル－２－ピロリジノン（３２ｍＬ／ｇ水素化ナトリウム）に懸濁させた。この懸濁液にトリエチレングリコール（１０．０ｅｑ）および化合物３５（１．０ｅｑ）を加えた。得られたスラリーを９５℃に加熱した。反応終了時（１～２時間）、混合物を２０℃に冷却した。この混合物に３０％ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ｖ：ｖ）および水を加えた。生成物が含まれる有機層をＮａＯＨ水溶液、コハク酸水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で連続的に洗浄した。生成物３６を晶析によりジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル／ヘプタンから単離した。
テール酸３７の調製：化合物３６のテトラヒドロフラン溶液（７ｍＬ／ｇ３６）に無水コハク酸（２．０ｅｑ）およびＤＭＡＰ（０．５ｅｑ）を加えた。混合物を５０℃に加熱した。反応終了時（５時間）、混合物を２０℃に冷却し、ＮａＨＣＯ３水溶液でｐＨ８．５に調整した。メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを加え、生成物を水層内に抽出した。ジクロロメタンを加え、クエン酸水溶液で混合物をｐＨ３に調整した。生成物が含まれる有機層をｐＨ＝３のクエン酸緩衝液と飽和塩化ナトリウム水溶液の混合物で洗浄した。この３７のジクロロメタン溶液を単離せずに化合物３８の調製に用いた。
３８の調製：化合物３７の溶液にＮ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２ｅｑ）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．３４ｅｑ）、次いで１－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）（１．１ｅｑ）を加えた。混合物を５５℃に加熱した。反応終了時（４～５時間）、混合物を２０℃に冷却し、１：１の０．２Ｍクエン酸／ブラインおよびブラインで連続的に洗浄した。ジクロロメタン溶液にアセトン、次いでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドへの溶媒交換を実施し、アセトン／Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドから飽和塩化ナトリウム水溶液中への沈殿により生成物を単離した。粗生成物を水で数回再スラリー化して残存するＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドおよび塩を除去した。
ＰＭＯの合成方法Ａ：ジスルフィドアンカーの使用
固相合成過程のサブユニットの組込みに用いた方法により、アンカーを担持した樹脂への活性化「テール」の導入をジメチルイミダゾリジノン（ＤＭＩ）中で実施した。
この方法は、Ｎ２をフリットまたは真空抽出に通して泡立たせるための粗多孔性（４０～６０μｍ）ガラスフリット、オーバーヘッドスターラーおよび三方Ｔｅｆｌｏｎ活栓を備えたシラン処理ジャケット式ペプチド容器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ社、ニュージャージー州、米国）内で実施した。
以下の方法の樹脂の処理／洗浄段階は、樹脂流動化または攪拌床反応器および溶媒／溶液抽出の２つの基本操作からなる。樹脂流動化では、Ｎ２がフリットを通って上向きに流れるよう活栓を位置させ、反応器に指定の樹脂処理／洗浄剤を加え、樹脂に浸透させて完全に湿らせた。次いで、混合を開始し、樹脂スラリーを指定の時間にわたって混合した。溶媒／溶液抽出では、混合およびＮ２流を停止し、真空ポンプを起動し、次いで、樹脂処理／洗浄剤を排出して廃棄するよう活栓を位置させた。別途言及されない限り、樹脂処理／洗浄剤の体積は樹脂１ｇ当たり１５ｍＬとした。
シラン処理ジャケット式ペプチド容器に入ったアミノメチルポリスチレン樹脂（１００～２００メッシュ；窒素置換に基づく担持量約１．０ｍｍｏｌ／ｇ；７５ｇ、１ｅｑ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ社、イギリス、パート番号１４６４－Ｘ７９９）に１－メチル－２－ピロリジノン（ＮＭＰ；２０ｍｌ／ｇ樹脂）を加え、樹脂を１～２時間混合して膨潤させた。膨潤溶媒を排出した後、樹脂をジクロロメタン（２×１～２分）、２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中５％のジイソプロピルエチルアミン（２×３～４分）およびジクロロメタン（２×１～２分）で洗浄した。最後の洗浄剤を排出した後、樹脂をジスルフィドアンカー３４の１－メチル－２－ピロリジノン溶液（０．１７Ｍ；１５ｍＬ／ｇ樹脂、約２．５ｅｑ）で処理し、樹脂／試薬混合物を４５℃で６０時間加熱した。反応終了時、加熱をやめ、アンカー溶液を排出し、樹脂を１－メチル－２－ピロリジノン（４×３～４分）およびジクロロメタン（６×１～２分）で洗浄した。樹脂をジエチルジカルボナートの１０％（ｖ／ｖ）ジクロロメタン溶液（１６ｍＬ／ｇ；２×５～６分）で処理し、次いでジクロロメタン（６×１～２分）で洗浄した。樹脂３９をＮ２流下で１～３時間、次いで真空下で一定重量（±２％）になるまで乾燥させた。収率：元の樹脂重量の１１０～１５０％。
アミノメチルポリスチレン－ジスルフィド樹脂の担持量の決定：樹脂１グラム当たりのトリフェニルメチル（トリチル）基の数に関する分光アッセイにより樹脂の担持量（利用可能であると考えられる反応部位の数）を決定する。
既知の重量の乾燥樹脂（２５±３ｍｇ）をシラン処理２５ｍｌメスフラスコに移し、２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液約５ｍＬを加える。内容物を穏やかにかき混ぜて混合し、次いで３０分間静置する。追加の２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液で体積を２５ｍＬにし、内容物を十分に混合する。ポジティブディスプレイスメント式ピペットを用いて、一定量のトリチル含有溶液（５００μＬ）を１０ｍＬメスフラスコに移し、メタンスルホン酸で体積を１０ｍＬにする。
最終溶液中のトリチルカチオン含有量を４３１．７ｎｍでのＵＶ吸光度により測定し、適切な体積、希釈率、吸光係数（ε：４１μｍｏｌ－１ｃｍ－１）および樹脂重量を用いて、樹脂の担持量を樹脂１ｇ当たりのトリチル基（μｍｏｌ／ｇ）として算出する。アッセイは三重反復で実施し、平均担持量を算出する。
この実施例の樹脂担持法では、樹脂の担持量が約５００μｍｏｌ／ｇとなる。ジスルフィドアンカー組込み段階を室温で２４時間実施した場合、μｍｏｌ／ｇで３００～４００の担持量が得られた。
テール担持：アミノメチルポリスチレン－ジスルフィド樹脂の調製と同じ装置および体積を用いて、テールを固体支持体に導入することができる。最初にアンカー担持樹脂を酸性条件下で脱保護し、得られた材料をカップリング前に中和した。カップリング段階では、ジスルフィドアンカー溶液の代わりに４－エチルモルホリン（ＮＥＭ、０．４Ｍ）を含有する３８のＤＭＩ溶液（０．２Ｍ）を使用した。４５℃で２時間経過した後、樹脂３９を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中５％のジイソプロピルエチルアミンで２回、ＤＣＭで１回洗浄した。樹脂に無水安息香酸（０．４Ｍ）とＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液を加えた。２５分後、反応器のジャケットを室温に冷却し、樹脂を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中５％のジイソプロピルエチルアミンで２回、ＤＣＭで８回洗浄した。樹脂４０をろ過し、高真空下で乾燥させた。樹脂４０の担持量をテール担持に使用した元のアミノメチルポリスチレン－ジスルフィド樹脂３９の担持量と定義する。
固相合成：Ｇｉｌｓｏｎ ＡＭＳ－４２２ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いてモルホリノオリゴマーを２ｍＬ Ｇｉｌｓｏｎポリプロピレン反応カラム（パート番号３９８０２７０）中で調製した。カラムを合成装置に置く際に、水流用のチャネルを有するアルミニウムブロックをその周囲に置いた。あるいは、ＡＭＳ－４２２は試薬／洗浄溶液を加え、指定の時間にわたって保持し、真空を用いてカラムを空にする。
長さが約２５サブユニットまでの範囲のオリゴマーには、樹脂の担持量が約５００μｍｏｌ／ｇのアミノメチルポリスチレン－ジスルフィド樹脂が好ましい。これより大きいオリゴマーには、樹脂の担持量が３００～４００μｍｏｌ／ｇのアミノメチルポリスチレン－ジスルフィド樹脂が好ましい。５’テールを有する分子を望む場合、テールが担持された樹脂を同じ担持指針で選択する。
以下の試薬溶液を調製した：
・脱トリチル化溶液：４：１のジクロロメタン／アセトニトリル中１０％のシアノ酢酸（ｗ／ｖ）；
・中和溶液：３：１のジクロロメタン／イソプロパノール中５％のジイソプロピルエチルアミン；ならびに
・カップリング溶液：１，３－ジメチルイミダゾリジノンに溶かした所望の塩基と結合タイプの０．１８Ｍ（または２０サブユニットより長く伸長したオリゴマーには０．２４Ｍ）活性化モルホリノサブユニットおよび０．４Ｍ Ｎエチルモルホリン。
異なる試薬溶液洗浄液を分離する移行洗浄剤としてジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いた。
合成装置では、ブロックを４２℃に設定し、アミノメチルポリスチレン－ジスルフィド樹脂（またはテール樹脂）３０ｍｇの入った各カラムに１－メチル－２－ピロリジノン２ｍＬを加え、室温で３０分間静置した。ジクロロメタン２ｍＬで２回洗浄した後、以下の合成サイクルを用いた：
各カラムに適切なカップリング溶液（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｉ）が適切な順序で入るよう個々のオリゴマーの配列をプログラムした。カラム内のオリゴマーにその最後のサブユニットが完全に組み込まれたとき、カラムをブロックから取り外し、０．８９Ｍの４－エチルモルホリンを含有する４－メトキシトリフェニルメチルクロリド（ＤＭＩ中０．３２Ｍ）からなるカップリング溶液を用いて最後のサイクルを手動で実施した。
樹脂からの切断ならびに塩基および主鎖保護基の除去：メトキシトリチル化の後、樹脂を１－メチル－２－ピロリジノン２ｍＬで８回洗浄した。１－メチル－２－ピロリジノン中０．１Ｍの１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と０．７３Ｍのトリエチルアミンとからなる切断溶液１ｍＬを加え、カラムにキャップをし、室温で３０分間静置した。そののち、溶液を１２ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアルの中に注いだ。大幅に収縮した樹脂を切断溶液３００μＬで２回洗浄した。溶液に濃アンモニア水溶液（－２０℃で保管したもの）４．０ｍＬを加え、バイアルに（Ｔｅｆｌｏｎで内張りしたスクリューキャップで）きつくキャップをし、混合物をかき混ぜて溶液を混合した。バイアルを４５℃のオーブンの中に１６～２４時間置いて塩基および主鎖保護基の切断を実施した。
粗生成物の精製：バイアルに入った加アンモニア分解溶液をオーブンから取り出し、室温まで冷却させた。溶液を０．２８％アンモニア水溶液２０ｍＬで希釈し、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ ＨＱ樹脂（ＢｉｏＲａｄ社）の入った２．５×１０ｃｍのカラムに通した。塩勾配（Ａ：０．２８％アンモニアとＢ：０．２８％アンモニア中１Ｍの塩化ナトリウム；６０分間で０～１００％のＢ）を用いて、ピークが含まれるメトキシトリチルを溶離した。合わせた画分をプールし、所望の生成物に応じてさらに処理した。
モルホリノオリゴマーの脱メトキシトリチル化：Ｍａｃｒｏｐｒｅｐによる精製でプールした画分を１Ｍ Ｈ３ＰＯ４で処理してｐＨを２．５に低下させた。最初の混合の後、試料を室温で４分間静置し、その時点で２．８％アンモニア／水を用いて試料をｐＨ１０～１１に中和する。生成物を固相抽出（ＳＰＥ）により精製した。
ＳＰＥカラムの充填および調整：２０ｍＬのフリットカラム（ＢｉｏＲａｄ Ｅｃｏｎｏ－Ｐａｃ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎｓ（７３２－１０１１））にＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ ＣＧ－３００Ｍ（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ社；フィラデルフィア、ペンシルベニア州）（３ｍＬ）を充填し、樹脂を３ｍＬの以下のもの：０．２８％ＮＨ４ＯＨ／８０％アセトニトリル；０．５Ｍ ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；５０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４／８０％アセトニトリル；水；０．５ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；０．２８％ＮＨ４ＯＨですすいだ。
ＳＰＥ精製：脱メトキシトリチル化で得た溶液をカラムにかけ、樹脂を０．２８％アンモニア水溶液３～６ｍＬで３回すすいだ。Ｗｈｅａｔｏｎバイアル（１２ｍＬ）をカラムの下に置き、０．２８％アンモニア水溶液中４５％のアセトニトリル２ｍＬで２回洗浄することにより生成物を溶離した。
生成物の単離：溶液をドライアイスで凍結させ、バイアルを凍結乾燥機の中に置いて、綿毛状の白色粉末を得た。試料を水に溶かし、シリンジを用いて０．２２ミクロンフィルター（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、０．２ミクロンＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ膜を有するＡｃｒｏｄｉｓｃ ２５ｍｍシリンジフィルター）に通してろ過し、ＵＶ分光光度計で吸光度（ＯＤ）を測定して存在するオリゴマーのＯＤ単位を求め、試料を解析用に分注した。次いで、溶液をＷｈｅａｔｏｎバイアルに戻して凍結乾燥させた。
ＭＡＬＤＩによるモルホリノオリゴマーの解析：ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法を用いて、精製で得た画分の組成を明らかにし、オリゴマーの同一性（分子量）を示す証拠を得た。試料をマトリックスである３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）、３，４，５－トリヒドキシアセトフェノン（ｔｒｉｈｙｄｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）（ＴＨＡＰ）またはアルファ－シアノ－４－ヒドキシケイ皮酸（ｈｙｄｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）（ＨＣＣＡ）の溶液で希釈した後、流した。
ＰＭＯの合成方法Ｂ：ＮＣＰ２アンカーの使用
ＮＣＰ２アンカーの合成：
１．メチル４－フルオロ－３－ニトロベンゾアート（１）の調製
１００Ｌフラスコに４－フルオロ－３－ニトロ安息香酸１２．７ｋｇを入れ、メタノール４０ｋｇおよび濃硫酸２．８２ｋｇを加えた。混合物を３６時間還流攪拌（６５℃）した。反応混合物を０℃に冷却した。３８℃で結晶が形成された。混合物を０℃で４時間保持した後、窒素下でろ過した。１００Ｌフラスコを洗浄し、ろ塊を０℃に冷却したメタノール１０ｋｇで洗浄した。固体のろ塊を漏斗上で１時間乾燥させ、トレーに移し、真空オーブン中、一定重量１３．６９５ｋｇのメチル４－フルオロ－３－ニトロベンゾアートになるまで室温で乾燥させた（収率１００％；ＨＰＬＣ ９９％）。
２．３－ニトロ－４－（２－オキソプロピル）安息香酸の調製
Ａ．（Ｚ）－メチル４－（３－ヒドロキシ－１－メトキシ－１－オキソブタ－２－エン－２－イル）－３－ニトロベンゾアート（２）
１００Ｌフラスコに前段階で得たメチル４－フルオロ－３－ニトロベンゾアート（１）３．９８ｋｇ、ＤＭＦ ９．８ｋｇ、アセト酢酸メチル２．８１ｋｇを入れた。混合物を攪拌し、０℃に冷却した。これに温度を５℃以下に維持しながらＤＢＵ ３．６６ｋｇを約４時間かけて加えた。混合物をさらに１時間攪拌した。クエン酸８．１５ｋｇを精製水３７．５ｋｇに溶かした溶液を反応フラスコに反応温度を１５℃以下に維持しながら加えた。添加後、反応混合物をさらに３０分間攪拌した後、窒素下でろ過した。水分を含むろ塊を精製水１４．８ｋｇとともに１００Ｌフラスコに戻した。スラリーを１０分間攪拌した後、ろ過した。水分を含む塊を再び１００Ｌフラスコに戻し、精製水１４．８ｋｇを用いて１０分間スラリー化し、ろ過して、粗（Ｚ）－メチル４－（３－ヒドロキシ－１－メトキシ－１－オキソブタ－２－エン－２－イル）－３－ニトロベンゾアートを得た。
Ｂ．３－ニトロ－４－（２－オキソプロピル）安息香酸
粗（Ｚ）－メチル４－（３－ヒドロキシ－１－メトキシ－１－オキソブタ－２－エン－２－イル）－３－ニトロベンゾアートを窒素下で１００Ｌ反応フラスコに入れた。これに１，４－ジオキサン１４．２ｋｇを加え、攪拌した。混合物に反応混合物の温度を１５℃未満に維持しながら濃ＨＣｌ １６．６５５ｋｇと精製水１３．３３ｋｇの溶液（６Ｍ ＨＣｌ）を２時間かけて加えた。添加終了後、反応混合物を２４時間加熱還流し（８０℃）、室温に冷却し、窒素下でろ過した。固体のろ塊を精製水１４．８ｋｇで研和し、ろ過し、精製水１４．８ｋｇで再び研和し、ろ過した。固体をＤＣＭ ３９．９ｋｇとともに１００Ｌフラスコに戻し、攪拌しながら１時間還流した。精製水１．５ｋｇを加えて残りの固体を溶かした。底部の有機層を予め温めた７２Ｌフラスコに分けた後、清潔な乾いた１００Ｌフラスコに戻した。溶液を０℃に冷却し、１時間保持した後、ろ過した。固体のろ塊を２回、それぞれＤＣＭ ９．８ｋｇとヘプタン５ｋｇの溶液で洗浄した後、漏斗上で乾燥させた。固体をトレーに移し、一定重量１．８５５ｋｇの３－ニトロ－４－（２－オキソプロピル）安息香酸になるまで乾燥させた。化合物１からの全収率４２％。ＨＰＬＣ ９９．４５％。
３．Ｎ－トリチルピペラジンスクシナート（ＮＴＰ）の調製
７２Ｌのジャケット付きフラスコにトリフェニルメチルクロリド１．８０５ｋｇおよびトルエン８．３ｋｇ（ＴＰＣ溶液）を窒素下で加えた。固体が溶けるまで混合物を攪拌した。１００Ｌのジャケット付き反応フラスコにピペラジン５．６１ｋｇ、トルエン１９．９ｋｇおよびメタノール３．７２ｋｇを窒素下で加えた。混合物を攪拌し、０℃に冷却した。これに反応温度を１０℃以下に維持しながらＴＰＣ溶液を４時間かけて少量ずつ徐々に加えた。混合物を１０℃で１．５時間攪拌した後、放置して１４℃に温めた。精製水３２．６ｋｇを７２Ｌフラスコに入れた後、内部のバッチ温度を２０±５℃に維持しながら１００Ｌフラスコに移した。層を分離させ、底部の水層を分離し保管した。有機層を精製水３２ｋｇで３回抽出し、水層を分離し、保管しておいた水溶液と合わせた。
残った有機層を１８℃に冷却し、コハク酸８４７ｇを精製水１０．８７ｋｇに溶かした溶液を少量ずつ有機層に徐々に加えた。混合物を２０±５℃で１．７５時間攪拌した。混合物をろ過し、固体をＴＢＭＥ ２ｋｇおよびアセトン２ｋｇで洗浄した後、漏斗上で乾燥させた。ろ塊を２回、それぞれアセトン５．７ｋｇで研和し、ろ過し、研和と研和の間にアセトン１ｋｇで洗浄した。固体を漏斗上で乾燥させた後、トレーに移し、真空オーブン中、一定重量２．３２ｋｇのＮＴＰになるまで室温で乾燥させた。収率８０％。
４．（４－（２－ヒドロキシプロピル）－３－ニトロフェニル）（４－トリチルピペラジン－１－イル）メタノンの調製
Ａ．１－（２－ニトロ－４（４－トリチルピペラジン－１－カルボニル）フェニル）プロパン－２－オンの調製
１００Ｌのジャケット付きフラスコに３－ニトロ－４－（２－オキソプロピル）安息香酸（３）２ｋｇ、ＤＣＭ １８．３ｋｇおよびＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）１．８４５ｋｇを窒素下で入れた。均一な混合物が形成されるまで溶液を攪拌した。ＮＴＰ ３．０４８ｋｇを室温で３０分間かけて加え、８時間攪拌した。反応混合物に精製水５．４４ｋｇを加え、３０分間攪拌した。層を分離させ、生成物が含まれる底部の有機層を抜き取り、保管した。水層をＤＣＭ ５．６５ｋｇで２回抽出した。合わせた有機層を、塩化ナトリウム１．０８ｋｇを精製水４．０８ｋｇに溶かした溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム１．０６８ｋｇで乾燥させ、ろ過した。硫酸ナトリウムをＤＣＭ １．３ｋｇで洗浄した。合わせた有機層をシリカゲル２５２ｇでスラリー化し、シリカゲル床２５２ｇの入ったフィルター漏斗でろ過した。シリカゲル床をＤＣＭ ２ｋｇで洗浄した。合わせた有機層をロータリーエバポレーターで蒸発させた。残渣にＴＨＦ ４．８ｋｇを加えた後、粗１－（２－ニトロ－４（４－トリチルピペラジン－１－カルボニル）フェニル）プロパン－２－オンがＴＨＦ中２．５体積に達するまでロータリーエバポレーターで蒸発させた。
Ｂ．（４－（２－ヒドロキシプロピル）－３－ニトロフェニル）（４－トリチルピペラジン－１－イル）メタノン（５）の調製
１００Ｌのジャケット付きフラスコに前段階で得た４を３６００ｇおよびＴＨＦを９８００ｇ、窒素下で入れた。攪拌した溶液を５℃以下に冷却した。溶液をエタノール１１５２５ｇで希釈し、水素化ホウ素ナトリウム１９４ｇを５℃以下で約２時間かけて加えた。反応混合物を５℃以下でさらに２時間攪拌した。塩化アンモニウム約１．１ｋｇを水約３ｋｇに溶かした溶液を徐々に加えることにより反応を停止させて温度を１０℃以下に維持した。反応混合物をさらに３０分間攪拌し、ろ過して無機物を除去し、再び１００Ｌのジャケット付きフラスコに入れ、ＤＣＭ ２３ｋｇで抽出した。有機層を分離し、水層をさらに２回、それぞれＤＣＭ ４．７ｋｇで抽出した。合わせた有機層を、塩化ナトリウム約８００ｇを水約３ｋｇに溶かした溶液で洗浄した後、硫酸ナトリウム２．７ｋｇで乾燥させた。懸濁液をろ過し、ろ塊をＤＣＭ ２ｋｇで洗浄した。合わせたろ液を２．０体積まで濃縮し、酢酸エチル約３６０ｇで希釈し、蒸発させた。粗生成物を窒素下、シリカ４ｋｇをＤＣＭとともに充填したシリカゲルカラムにかけ、酢酸エチル２．３ｋｇ／ＤＣＭ
７．２ｋｇで溶離した。合わせた画分を蒸発させ、残渣をトルエン１１．７ｋｇに溶かした。トルエン溶液をろ過し、ろ塊を２回、それぞれトルエン２ｋｇで洗浄した。ろ塊を一定重量２．２７５ｋｇの化合物５になるまで乾燥させた（化合物３からの収率４６％）。ＨＰＬＣ ９６．９９％。
５．２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（１－（２－ニトロ－４－（４－トリフェニルメチルピペラジン－１カルボニル）フェニル）プロパン－２－イル）カルボナート（ＮＣＰ２アンカー）の調製
１００Ｌのジャケット付きフラスコに化合物５ ４．３ｋｇ（残留トルエンに基づきＨ１ＮＭＲにより重量を調整した；それに応じて以降の全試薬を計量した）およびピリジン１２．７ｋｇを窒素下で入れた。これに内部温度を３５℃以下に維持しながらＤＳＣ ３．１６０ｋｇ（Ｈ１ＮＭＲで７８．９１重量％）を入れた。反応混合物を周囲温度で約２２時間熟成させた後、ろ過した。ろ塊をピリジン２００ｇで洗浄した。それぞれ２分の１の体積のろ液を含む２つのバッチで、クエン酸約１１ｋｇを水約５０ｋｇに溶かした溶液を含む１００Ｌのジャケット付きフラスコにろ液洗浄液を徐々に入れ、３０分間攪拌して固体を沈殿させた。固体をフィルター漏斗で収集し、１回当たり４．３ｋｇの水で２回洗浄し、真空下、フィルター漏斗上で乾燥させた。
合わせた固体を１００Ｌのジャケット付きフラスコに入れ、ＤＣＭ ２８ｋｇに溶かし、炭酸カリウム９００ｇを水４．３ｋｇに溶かした溶液で洗浄した。１時間後、層を分離させ、水層を除去した。有機層を水１０ｋｇで洗浄し、分離し、硫酸ナトリウム３．５ｋｇで乾燥させた。ＤＣＭをろ過し、蒸発させ、６．１６ｋｇのＮＣＰ２アンカーになるまで真空下で乾燥させた（収率１１４％）。
ＮＣＰ２アンカー担持樹脂の合成
Ｔｅｆｌｏｎ止水栓を備えた７５Ｌの固相合成反応器にＮＭＰ約５２Ｌおよびアミノメチルポリスチレン樹脂２３００ｇを入れた。樹脂をＮＭＰ中で約２時間攪拌して膨潤させた後、排出した。樹脂を１回当たり約４ＬのＤＣＭで２回洗浄し、次いで、１回当たり３９Ｌの中和溶液で２回洗浄し、次いで、１回当たり３９ＬのＤＣＭで２回洗浄した。攪拌している樹脂溶液にＮＣＰ２アンカー溶液を徐々に加え、室温で２４時間攪拌し、排出した。樹脂を１回当たり３９ＬのＮＭＰで４回洗浄し、１回当たり３９ＬのＤＣＭで６回洗浄した。樹脂を２分の１のＤＥＤＣキャッピング溶液で３０分間処理して攪拌し、排出し、次の２分の１のＤＥＤＣキャッピング溶液で３０分間処理して攪拌し、排出した。樹脂を１回当たり３９ＬのＤＣＭで６回洗浄した後、一定重量３５７３．７１ｇのアンカー担持樹脂になるまでオーブンで乾燥させた。
ＮＣＰ２アンカーを用いたモルホリノオリゴマーの調製
Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ（ＰＭＯ＃１）粗原薬の５０Ｌ固相合成
１．原料

出発物質の化学構造：
Ａ．活性化ＥＧ３テール
Ｂ．活性化Ｃサブユニット（調製用、米国特許第８，０６７，５７１号を参照されたい）
Ｃ．活性化Ａサブユニット（調製用、米国特許第８，０６７，５７１号を参照されたい）
Ｄ．活性化ＤＰＧサブユニット（調製用、国際公開第２００９／０６４４７１号を参照されたい）
Ｅ．活性化Ｔサブユニット（調製用、国際公開第２０１３／０８２５５１号を参照されたい）
Ｆ．アンカー担持樹脂
式中、Ｒ１は支持媒体である。
２．Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ粗原薬の合成
Ａ．樹脂膨潤
アンカー担持樹脂７５０ｇおよびＮＭＰ １０．５Ｌを５０Ｌのシラン処理反応器に入れ、３時間攪拌した。ＮＭＰを排出し、アンカー担持樹脂をそれぞれ５．５ＬのＤＣＭで２回洗浄し、それぞれ５．５Ｌの３０％ＴＦＥ／ＤＣＭで２回洗浄した。
Ｂ．サイクル０：ＥＧ３テールのカップリング
アンカー担持樹脂を３回、それぞれ３０％ＴＦＥ／ＤＣＭ ５．５Ｌで洗浄し、排出し、ＣＹＦＴＡ溶液５．５Ｌで１５分間洗浄し、排出し、再びＣＹＴＦＡ溶液５．５Ｌで１５分間洗浄し、排出せずに１：１のＮＥＭ／ＤＣＭ １２２ｍＬを入れ、懸濁液を２分間攪拌し、排出した。樹脂を中和溶液５．５Ｌで５分間、２回洗浄し、排出し、次いでそれぞれ５．５ＬのＤＣＭで２回洗浄し、排出した。活性化ＥＧ３テール（ＭＷ７６５．８５）７０６．２ｇおよびＮＥＭ ２３４ｍＬをＤＭＩ ３Ｌに溶かした溶液を樹脂に加え、室温で３時間攪拌し、排出した。樹脂を１回当たり５．５Ｌの中和溶液で５分間、２回洗浄し、ＤＣＭ ５．５Ｌで１回洗浄し、排出した。無水安息香酸３７４．８ｇおよびＮＥＭ １９５ｍＬをＮＭＰ ２６８０ｍＬに溶かした溶液を入れ、１５分間攪拌し、排出した。樹脂を中和溶液５．５Ｌとともに５分間攪拌した後、ＤＣＭ ５．５Ｌで１回洗浄し、それぞれ５．５Ｌの３０％ＴＦＥ／ＤＣＭで２回洗浄した。樹脂を３０％ＴＦＥ／ＤＣＭ ５．５Ｌに懸濁させ、１４時間保持した。
Ｃ．サブユニットカップリングサイクル１～３０
ｉ．カップリング前の処理
図２３に記載される各カップリングサイクルの前に、樹脂を：１）３０％ＴＦＥ／ＤＣＭで洗浄し；２）ａ）ＣＹＴＦＡ溶液で１５分間処理して排出し、ｂ）ＣＹＴＦＡ溶液で１５分間処理し、これに１：１のＮＥＭ／ＤＣＭを加え、攪拌し、排出し；３）中和溶液とともに３回攪拌し；４）ＤＣＭで２回洗浄した。図２３を参照されたい。
ｉｉ．カップリング後の処理
図２３に記載されるように各サブユニット溶液を排出した後、樹脂を：１）ＤＣＭで洗浄し；２）３０％ＴＦＥ／ＤＣＭで２回洗浄した。次のカップリングサイクルの前に樹脂を一定時間保持した場合、２回目のＴＦＥ／ＤＣＭ洗浄液は排出せず、前記ＴＦＥ／ＤＣＭ洗浄溶液中に樹脂を保持した。図２３を参照されたい。
ｉｉｉ．活性化サブユニットカップリングサイクル
図２３に記載される通りにカップリングサイクルを実施した。
ｉｖ．最後のＩＰＡ洗浄
図２３に記載されるように最後のカップリング段階を実施した後、樹脂を８回、それぞれＩＰＡ １９．５Ｌで洗浄し、真空下、重量５，５７９．８ｇになるまで室温で約６３．５時間乾燥させた。
Ｃ．切断
上記の樹脂に結合したＥｔｅｐｌｉｓｅｎ粗原薬を２つのロットに分け、各ロットを以下の通りに処理した。２，７８９．９ｇのロットの樹脂を：１）ＮＭＰ １０Ｌとともに２時間攪拌した後、ＮＭＰを排出し；２）それぞれ１０Ｌの３０％ＴＦＥ／ＤＣＭで３回洗浄し；３）ＣＹＴＦＡ溶液１０Ｌで１５分間処理し；４）ＣＹＴＦＡ溶液１０Ｌで１５分間処理し、次いで、これに１：１のＮＥＭ／ＤＣＭ １３０ｍｌを加え、２分間攪拌し、排出した。樹脂をそれぞれ１０Ｌの中和溶液で３回処理し、ＤＣＭ １０Ｌで６回洗浄し、それぞれ１０ＬのＮＭＰで８回洗浄した。ＤＴＴ １５３０．４ｇおよびＤＢＵ ２９８０をＮＭＰ ６．９６Ｌに溶かした切断溶液で樹脂を２時間処理して樹脂からＥｔｅｐｌｉｒｓｅｎ粗原薬を脱離させた。切断溶液を排出し、別の容器に保持した。反応器および樹脂をＮＭＰ ４．９７Ｌで洗浄し、これを切断溶液と合わせた。
Ｄ．脱保護
合わせた切断溶液とＮＭＰ洗浄液を圧力容器に移し、これに冷凍庫で－１０℃～－２５℃の温度に冷却しておいたＮＨ４ＯＨ（ＮＨ３・Ｈ２Ｏ）３９．８Ｌを加えた。圧力容器を密閉し、１６時間、４５℃に加熱した後、２５℃まで冷却させた。Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ粗原薬を含有するこの脱保護溶液を精製水で３：１に希釈し、２Ｍリン酸でｐＨを３．０に調整し、次いでＮＨ４ＯＨでｐＨ８．０３に調整した。ＨＰＬＣ（Ｃ１８）７３～７４％。
Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ（ＰＭＯ＃１）粗原薬の精製
上のＤ部で得たＥｔｅｐｌｉｒｓｅｎ粗原薬を含有する脱保護溶液をＴｏｙｏＰｅａｒｌ Ｓｕｐｅｒ－Ｑ ６５０Ｓ陰イオン交換樹脂（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）のカラムにかけ、０～３５％のＢの勾配で１７カラム体積分（緩衝液Ａ：１０ｍＭ水酸化ナトリウム；緩衝液Ｂ：１０ｍＭ水酸化ナトリウム中１Ｍの塩化ナトリウム）溶離し、許容される純度の画分（Ｃ１８およびＳＣＸ ＨＰＬＣ）をプールして精製製剤溶液とした。ＨＰＬＣ：９７．７４％（Ｃ１８）９４．５８％（ＳＣＸ）。
精製した原薬溶液を脱塩し、１９５９ｇの精製Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ原薬になるまで凍結乾燥させた。収率６１．４％；ＨＰＬＣ：９７．７％（Ｃ１８）９４．６％（ＳＣＸ）。
ＣＰＰのコンジュゲーション
解析手順：Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ（商標）Ｓｐｅｅｄでシナピン酸（ＳＡ）マトリックスを用いてマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）を記録した。３０００ダイオードアレイ検出器とＰｒｏＰａｃ（商標）ＳＣＸ－２０カラム（２５０×４ｍｍ）を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００システムで流速１．０ｍＬ／分（ｐＨ＝２；カラム温度３０℃）を用いてＳＣＸ－ＨＰＬＣを実施した。移動相をＡ（２４ｍＭ Ｈ３ＰＯ４を含有する２５％アセトニトリル水溶液）およびＢ（１Ｍ ＫＣｌと２４ｍＭ Ｈ３ＰＯ４を含有する２５％アセトニトリル水溶液）とした。以下の勾配溶離を用いた：０分、Ｂ３５％；２分、Ｂ３５％；２２分、Ｂ８０％；２５分、Ｂ８０％；２５．１分、Ｂ３５％；３０分、Ｂ３５％。
ＰＭＯ＃１（１．８２ｇ、０．１７７ｍｍｏｌ、２日間凍結乾燥させることにより新たに乾燥させたもの）、Ａｃ－Ｌ－Ａｒｇ－Ｌ－Ａｒｇ－Ｌ－Ａｒｇ－Ｌ－Ａｒｇ－Ｌ－Ａｒｇ－Ｌ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－ＯＨヘキサトリフルオロアセタート（６１４．７ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）および１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ、１３４．４ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）の混合物にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で３時間攪拌した後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、６８．５ｍｇ、０．５３０ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、濁った混合物が透明な溶液になった。ＳＣＸ－ＨＰＬＣにより反応をモニターした。２時間後、１０％水酸化アンモニウム溶液（２．８％ＮＨ３）２０ｍＬを加えた。混合物を室温でさらに２時間攪拌した。水４００ｍＬを添加することにより反応を停止させた。この溶液にトリフルオロエタノール（２．０ｍＬ）を加えた。
溶液を２部に分け、ＷＣＸカラム（１カラム当たり樹脂１０ｇ）により各部を精製した。最初に各ＷＣＸカラムを２０％アセトニトリル水溶液（ｖ／ｖ）で洗浄してＰＭＯ＃１出発物質を除去した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量スペクトル解析でＰＭＯ＃１のシグナルがみられなくなったとき、洗浄（各カラムに対し２２５ｍＬ）を止めた。次いで、各カラムを水（１カラム当たり１００ｍＬ）で洗浄した。２．０ＭグアニジンＨＣｌ（各カラムに対し１４０ｍＬ）により所望の生成物ＰＰＭＯ＃１を溶離した。精製したＰＰＭＯ＃１の溶液をともにプールした後、２部に分け、それぞれＳＰＥカラム（各カラムとも樹脂１０ｇ）により脱塩した。
最初に、ＳＰＥカラムを１．０Ｍ ＮａＣｌ水溶液（各カラムに対し１００ｍＬ）で洗浄してＰＰＭＯ＃１の六塩酸塩を得た。次いで、各ＳＰＥカラムを水（各カラムに対し２００ｍＬ）で洗浄した。最終的な脱塩ＰＰＭＯ＃１を５０％アセトニトリル水溶液（ｖ／ｖ、各カラムに対し１５０ｍＬ）により溶離した。減圧排出によりアセトニトリルを除去した。得られた水溶液を凍結乾燥させて、所望のコンジュゲートＰＰＭＯ＃１六塩酸塩を得た（１．９３ｇ、収率９４．５％）。
実施例１：ＰＭＯ＃１
上記のＰＭＯ合成方法Ｂのプロトコルを用いてＰＭＯ＃１を合成した：
式中、１～３０および５’～３’の各Ｎｕは以下の通りである：
表中、Ａは
であり、Ｃは
であり、Ｇは
であり、Ｔは
である。
ＨＰＬＣ：９７．７％（Ｃ１８）９４．６％（ＳＣＸ）。
実施例２：ＰＰＭＯ＃１
上記のプロトコルを用いて、ＰＭＯ＃１からＰＰＭＯ＃１を合成した：
式中、１～３０および５’～３’の各Ｎｕは以下の通りである：
表中、Ａは
であり、Ｃは
であり、Ｇは
であり、Ｔは
である。
ＳＣＸ－ＨＰＬＣ解析では、純度は主要ピークの積分により９３．３％、ＰＰＭＯ＃１全体の積分により９９．６９％であることがわかる。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量スペクトル：Ｃ４０４Ｈ６４７Ｎ２０２Ｏ１３０Ｐ３０［Ｍ＋１］＋に関して算出したｍ／ｚ：１１３４２．２５；実測値：１１３４２．１２。
実施例３：ｉｎ ｖｉｔｒｏ（筋細胞）のエクソン５１スキッピング
下の表に記載するヒトジストロフィンエクソン５１を標的とする２種類の化合物、ＰＭＯ＃１およびＰＰＭＯ＃１をともに同じ配列に組み立て、エクソン５１スキッピングの誘導能を評価した。
具体的には、分化したヒト筋細胞を用いて、上記化合物の様々な濃度（すなわち、４０μｍ、２０μｍ、１０μｍ、５μｍ、２．５μｍおよび１．２５μｍ）でのエクソン５１スキッピング誘導能を求めた。細胞を分化させた後、化合物と９６時間インキュベートし、次いでＲＮＡ単離を実施し、上記のようにＲＴ－ＰＣＲによりエクソン５１スキッピングを測定した。ＰＰＭＯ＃１がＰＭＯ＃１と比較してエクソン５１スキッピングを有意に増大させることを示す結果を下の表および図４に示す：
実施例４：ｍｄｘマウス試験
ｍｄｘマウスは、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３に変異を含み、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の動物モデルとして認められよく特徴付けられたモデルである。Ｍ２３Ｄアンチセンス配列（配列番号２）は、エクソン２３スキッピングを誘導し機能性ジストロフィンの発現を回復されることがわかっている。６～７週齢のｍｄｘマウスの尾静脈に下の表のＰＰＭＯ４２２５またはＰＭＯ４２２５を用量４０ｍｇ／ｋｇで単回注射するか、または生理食塩水を単回注射した。
ＰＭＯ４２２５およびＰＰＭＯ４２２５は、それぞれ上記のＰＭＯの方法ＡおよびＣＰＰのコンジュゲーション方法により調製した。
単回用量注射から７日後、３０日後、６０日後および９０日後、処置マウスを屠殺した（１グループあたりｎ＝６）。ジストロフィンタンパク質の産生量を測定するウエスタンブロット解析およびエクソンスキッピングの割合を測定するＲＴ－ＰＣＲ解析に横隔膜、心臓および右側四頭筋を、免疫組織化学およびＨ／Ｅ染色に左側四頭筋を上記の通りに処理した。
それぞれ上記の通りに、ジストロフィンタンパク質回復をウエスタンブロットにより定量化し、エクソン２３スキッピングの割合をＲＴ－ＰＣＲにより測定した。
ＲＴ－ＰＣＲの結果を図５Ａ～１０Ｂおよび下の表に示す。驚くべきことに、ＰＰＭＯ４２２５はＰＭＯ４２２５と比較して、有意に高く持続的なレベルのジストロフィン回復およびエクソン２３スキッピングを誘導し、注射から３０日後に最大レベルがみられた。さらに驚くべきことに、ＰＰＭＯ４２２５は、ＰＭＯ４２２５が心臓のジストロフィンレベルを増大させなくてもこれを増大させ；ＰＭＯ４２２５では、いずれの時点でも心臓にジストロフィンおよびエクソンスキッピングが観察されなかった。
免疫組織化学の結果を図１１に示す。図から、ＰＰＭＯ４２２５によって四頭筋全体にジストロフィンが回復しているのに対し、４２２５では「斑状」の発現パターンがみられる。ＰＰＭＯ４２２５で処置するとジストロフィンの均一な分布がみられることから、骨格筋を広範囲にわたって標的化することが可能であることがわかる。ＰＰＭＯ４２２５はｉｎ ｖｉｖｏでの送達がＰＭＯ４２２５よりも大幅に改善されている。
実施例５：ＮＨＰでのエクソン５１スキッピング
ＰＰＭＯアンチセンスオリゴマーによるエクソンスキッピングの有効性をさらに明らかにするため、非ヒト霊長類を用いた。具体的には、下の表の投与スケジュールに従い、インタクトの筋組織を有するカニクイザルの静脈内にＰＰＭＯ＃１、ＰＭＯ＃１（実施例２のもの）または生理食塩水を注射した：
２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇおよび８０ｍｇ／ｋｇでは、グループ１～５の個体が全４回の投与に耐容性を示した。１６０ｍｇ／ｋｇでは３回目の投与後に耐容性がみられず、投与当日に２個体を安楽死させ、その翌日に１個体を安楽死させる結果となった。これらの個体には体重減少が認められた。
スケジュールに組み込んだ剖検または瀕死状態での安楽死の際にはその都度、横隔膜、十二指腸、食道および大動脈の平滑筋、四頭筋、三角筋、二頭筋ならびに心臓の切片を収集し、急速凍結させた。上記のようにＲＴ－ＰＣＲを用いてパーセントエクソン５１スキッピングを求めた。結果を図１２～１５および下の表に示す。
驚くべきことに、ＰＰＭＯ＃１では、試験したインタクトの組織にＰＭＯ＃１と比較して深いレベルのエクソンスキッピングがみられた。具体的には、ＰＭＯ＃１投与では、収集したいずれの組織にもスキッピングが検出されなかったのに対し、ＰＰＭＯ＃１では、例えば、投与量レベル８０ｍｇ／ｋｇで四頭筋および横隔膜には９０％を上回るエクソンスキッピングが、十二指腸には６０％を上回るスキッピングがみられた。特に驚くべきなのは、例えば８０ｍｇ／ｋｇで心臓にみられたエクソンスキッピングのレベルであり、この場合、エクソンスキッピングは６０％を上回るものであった。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＰＰＭＯ＃１の全身投与およびインタクトの非ジストロフィーＮＨＰ筋組織内への送達ならびにＰＰＭＯ＃１により特に心筋にまで得られたエクソン５１スキッピングの達成は、上記の実施例４のｍｄｘマウスからは予測できるものではなかった。むしろ、ＮＨＰでの健常組織への送達とジストロフィー組織への送達には差がみられる。
グループ７および８に関しては、上記のようにＲＴ－ＰＣＲを用いてパーセントエクソン５１スキッピングを求めた。結果を図２２および下の表に示す。
結果からわかるように、解析した各筋肉で３０日の方が６０日よりもエクソンスキッピングが高い値を示し、このことは、エクソンスキッピングの効率が単回投与後に経時的に低下することを示している。
実施例６：ｍｄｘマウスの用量反応試験
６～７週齢のｍｄｘマウスの尾静脈に上記のＰＰＭＯ４２２５またはＰＭＯ４２２５を用量４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇまたは１２０ｍｇ／ｋｇで単回注射した（１グループ当たりｎ＝６）。
注射から３０日後、処置マウスを屠殺した。上記のウエスタンブロットプロトコル（例えば、実施例４で用いたもの）をベースとし以下のように改変を施したジストロフィンタンパク質の産生量を測定するウエスタンブロット解析用に横隔膜、四頭筋および心臓を処理した：
野生型に対する％で表したジストロフィンタンパク質回復を下の表および図１６～１９に示す。
驚くべきことに、データから、ｍｄｘマウスではＰＰＭＯ４２２５の単回投与によってジストロフィンレベルが用量依存性にＰＭＯ４２２５より有意かつ大幅に増大することがわかる。
実施例７：ｍｄｘマウスの横隔膜および心臓に関するＩＨＣ試験
６～７週齢のｍｄｘマウスの尾静脈にＰＰＭＯ４２２５を用量８０ｍｇ／ｋｇで単回注射するか、または生理食塩水を単回注射し、６～７週齢の野生型マウスに生理食塩水を単回注射した。単回用量注射から３０日後、処置ｍｄｘマウス、生理食塩水ｍｄｘマウスおよび野生型マウスを屠殺した（１グループ当たりｎ＝４）。免疫組織化学の結果を図２４に示す。図の結果から、ＰＰＭＯ４２２５で処置したｍｄｘマウスでは、ＤＭＤの罹患率および死亡率と関連する組織中のジストロフィンが均一に増大していることがわかる。
実施例８：ｉｎ ｖｉｔｒｏ（筋芽細胞）のエクソン５１スキッピング
ヒトジストロフィン（ＤＭＤ）エクソン５１を標的とし同じ配列を含む下の表に記載の２種類のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、ＰＭＯ＃１およびＰＰＭＯ＃１のＤＭＤエクソン５１スキッピングを健常ヒト筋芽細胞で評価した。
具体的には、健常ヒト筋芽細胞（継代第５～６代、Ｚｅｎ－Ｂｉｏ社から購入したＳＫＢ－Ｆ－ＳＬ）を約４０％のコンフルエンスで平板培養し、ＳＫＭ－Ｍ培地（Ｚｅｎ－Ｂｉｏ社）中、様々な濃度（すなわち、４０μｍ、２０μｍ、１０μｍ、５μｍ、２．５μｍおよび１．２５μｍ）のＰＭＯ＃１またはＰＰＭＯ＃１で処置した。９６時間インキュベートした後、筋芽細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＥ ＲＮＡｓｐｉｎ ９６キット（カタログ番号２５－０５５－７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でＲＡ１溶解緩衝液により溶解させた。ＲＮＡの溶離に無ＲＮアーゼ水４０μＬを使用した以外は製造業者の推奨に従って全ＲＮＡを単離した。
両化合物によるエクソン５１スキッピングを求めるため、２段階エンドポイントＲＴ－ＰＣＲを実施した。具体的には、最初に、ランダムヘキサマーを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ鎖合成キット（カタログ番号１８０９１２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により１１マイクロリットルの全ＲＮＡを製造業者の指示通りにｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡ ９μＬをＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ
Ｓｕｐｅｒｍｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（カタログ番号１２５３２０２４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にヒトＤＭＤエクソン４９および５２を標的とするプライマー［順方向プライマー（配列番号５）：ＣＣＡＧＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧ；逆方向プライマー（配列番号６）：ＣＧＡＴＣＣＧＴＡＡＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＡＧＣＣ］とともに加えることによりＰＣＲを実施した。ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６リアルタイムサーモサイクラーを用い下の表に示すプログラムを用いてＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ産物３２μＬをＬａｂＣｈｉｐ ＧＸシステムにかけ、ＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔキット（ＣＬＳ７６０６７２、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いてスキップのあるＰＣＲ産物またはスキップのないＰＣＲ産物の発現を評価した。スキップのあるバンド（２４６ｂｐ）とスキップのないバンド（４７８ｂｐ）の合計モル濃度と比較したエクソン５１スキップのあるバンド（２４６ｂｐ）のモル濃度（ｎｍｏｌ／ｌ）の割合としてＤＭＤエクソン５１スキッピングの割合を算出した。
対応のない両側スチューデントｔ検定（等分散性）を用いて、各用量で２群の平均値に互いに統計学的差がみられるかどうかを評価した。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意であるとした。
結果を下の表および図２５に記載する。
これらのｉｎ ｖｉｔｒｏの結果から、ヒト筋芽細胞ではＰＰＭＯ＃１がＤＭＤエクソン５１スキッピングをＰＭＯ＃１と比較して有意に増大させることがわかる。
実施例９：ｉｎ ｖｉｔｒｏ（筋管）のエクソン５１スキッピング
ヒトジストロフィン（ＤＭＤ）エクソン５１を標的とし同じ配列を含む２種類のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、ＰＭＯ＃１およびＰＰＭＯ＃１のＤＭＤエクソン５１スキッピングを健常ヒト筋管で評価した。
具体的には、健常ヒト筋芽細胞（継代第５～６代、Ｚｅｎ－Ｂｉｏ社から購入したＳＫＢ－Ｆ－ＳＬ）をＳＫＭ－Ｍ培地で８０～９０％のコンフルエンスに達するまで培養した後、低血清培地（ＳＫＭ－Ｄ、Ｚｅｎ－Ｂｉｏ社）でインキュベートすることにより分化を開始させた。分化から５日後、成熟筋管を様々な濃度（すなわち、４０μｍ、２０μｍ、１０μｍ、５μｍ、２．５μｍおよび１．２５μｍ）のＰＭＯ＃１またはＰＰＭＯ＃１とインキュベートした。９６時間インキュベートした後、筋管をＰＢＳで洗浄し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＥ ＲＮＡｓｐｉｎ ９６キット（カタログ番号２５－０５５－７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でＲＡ１溶解緩衝液により溶解させた。ＲＮＡの溶離に無ＲＮアーゼ水４０μＬを使用した以外は製造業者の推奨に従って全ＲＮＡを単離した。
ＰＭＯ＃１またはＰＰＭＯ＃１によるＤＭＤエクソン５１スキッピングを求めるため、２段階エンドポイントＲＴ－ＰＣＲを実施した。具体的には、最初に、ランダムヘキサマーを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ鎖合成キット（カタログ番号１８０９１２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により１１マイクロリットルの全ＲＮＡを製造業者の指示通りにｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡ ９μＬをＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（カタログ番号１２５３２０２４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にヒトＤＭＤエクソン４９および５２を標的とするプライマー［順方向プライマー（配列番号５）：ＣＣＡＧＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧ；逆方向プライマー（配列番号６）：ＣＧＡＴＣＣＧＴＡＡＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＡＧＣＣ］とともに加えることによりＰＣＲを実施した。ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６リアルタイムサーモサイクラーを用い下の表に示すプログラムを用いてＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ産物３２μＬをＬａｂＣｈｉｐ ＧＸシステムにかけ、ＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔキット（ＣＬＳ７６０６７２、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いてスキップのあるＰＣＲ産物およびスキップのないＰＣＲ産物の発現を評価した。スキップのあるバンド（２４６ｂｐ）とスキップのないバンド（４７８ｂｐ）の合計モル濃度と比較したエクソン５１スキップのあるバンド（２４６ｂｐ）のモル濃度（ｎｍｏｌ／ｌ）の割合としてＤＭＤエクソン５１スキッピングの割合を算出した。
対応のない両側スチューデントｔ検定（等分散性）を用いて、各用量で２群の平均値に互いに統計学的差がみられるかどうかを評価した。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意であるとした。
ＰＰＭＯ＃１がＤＭＤエクソン５１スキッピングをＰＭＯ＃１と比較して有意に増大させることを示す結果を下の表および図２６に示す。
本明細書で引用される刊行物および特許出願はいずれも、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることをそれぞれ具体的かつ個別に明記した場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
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Claims (1)

  1. 図面に記載の発明。
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