KR100886139B1 - 올리고뉴클레오타이드의 제조방법 - Google Patents

올리고뉴클레오타이드의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 이용하며 다음의 단계를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 제조방법을 제공한다: (a) (i) 출발물질로서 고상 지지체에 결합된 뉴클레오사이드에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시키거나, (ⅱ) 출발물질로서의 유니버셜 고상 지지체(universal solid support)에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머를 커플링시키거나, 또는 (ⅱ) 출발물질로서의 유니버셜 고상 지지체에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시키는 단계; 그리고, (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시켜 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 단계. 특히, 본 발명은 고체지지상을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 합성법에서 고체상에 축합시키는 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타사이드를 모노머가 아닌 다이머 혹은 트라이머로 이용함으로써 최종적으로 얻어지는 올리고뉴클레오타이드의 순도를 확연히 개선시킨다. 본 발명의 방법에 따르면, 고순도의 올리고뉴클레오타이드를 보다 단축된 시간으로 효율적으로 합성할 수 있다. 본 발명의 방법은 종래 기술과 비교하여 15-20% 정도 높은 순도의 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 합성

Description

올리고뉴클레오타이드의 제조방법{Method for Preparing Oligonucleotide}
본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 고상(solid phase)에서의 올리고뉴클레오타이드의 제조방법에 관한 것이다.
올리고뉴클레오타이드의 제조방법에 대한 많은 기술들이 알려져 있다. 예를 들어, Khorana et al., J. Molec. Biol. 72:209(1972), Reese, Tetrahedron Lett. 34:3143(1978), Beaucage와 Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859(1981), 미국 특허 제5,149,798호, Agrawal 및 Goodchild, Tetrahedron Lett. 28:3539 (1987), Connolly et al. Biochemistry 23, 3443(1984), Jager et al., Biochemistry 27:7237(1988), Agrawal et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7079(1988), E.g., Methods in Molecular Biology, Vol. 20, Protocols for Oligonucleotides and Analogs, p. 63-80 (S. Agrawal, Ed., Humana Press 1993); Methods in Molecular Biology, Vol. 26: Protocols for Oligonucleotide Conjugates (Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, N.J. 1994); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach pp. 155-183 (Eckstein, Ed., IRL Press, Oxford 1991); Antisense Res. and Applns. pp. 375 (Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla. 1993); Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Erickson and Izant, eds., Raven Press, New York, 1992) 등에 올리고뉴클레오타이드의 제조방법에 대한 기술들이 소개되어 있다.
한편, 안티센스 RNA는 핵산 분자에 혼성화 되어 유전자 발현을 억제한다. 많은 연구자들이 안티센스 RNA를 이용하여 특정 유전자의 발현을 억제하거나 특정 질환의 치료 가능성을 보고한 바 있다(Barker et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:514(1996); Agrawal et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 85:7079(1988); Letter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:3420-3434(1990); Offensperger et al. EMBO J. 12:1257(1993)).
한편, RNA-매개 방해 (RNA-mediated interference: RNAi)는 21-25 뉴클레오타이드(nt) 크기의 작은 RNA 조각이 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 선택적으로 결합하여 분해함으로써 단백질 발현을 억제하는 현상이다(Shen C, et al., FEBS Lett. 539(1-3):111-4(2003)). RNAi 현상은 1995년에 C. elegance와 식물에서 유전자를 조절하는 메커니즘의 일부로 처음 발견되었으며, 1998년 미국 카네기 연구소의 Andrew Fire와 매사츄세츠 의과대학의 Craig Mello 팀의 실험을 통해, 특정 유전자의 염기서열에 해당하는 이중쇄 RNA (dsRNA)를 선충(Caenorphabditis elegans)의 체내에 주입하였을 때 그 유전자의 발현이 현저히 억제될 수 있음이 밝혀졌다(Fire A, et al., Nature. 391(6669):806-11(1998)). C. elegans에 주입된 장쇄의 dsRNA는 RNase Ⅲ 패밀리에 속하는 Dicer라는 효소에 의해 21-25 bp 크기의 작은 방해 RNA (small interfering RNA: siRNA)로 절단되고, 그 절단된 짧은 dsRNA는 RISC (RNA-induced silencing complex) 효소 결합체에 합체되어 siRNA의 이중나선이 풀리게 된다. 이후, 단일 가닥으로 분리된 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 특정 유전자의 mRNA에 결합하여 분해함으로써 그 유전자의 발현을 억제한다). 또한, Elbashir 연구팀에서 21개 염기의 짧은 dsRNA (siRNA)를 배양된 포유동물 세포에 주입하여 특정 유전자의 발현을 선택적으로 억제할 수 있음을 보고한 후, 포유동물세포에서의 RNAi 이용 가능성이 크게 증가하였다(Elbashir, S.M. et al., Nature 411(6836):494-8(2001)).
현재, siRNA를 이용한 유전자 발현 억제 기술은 다양한 종류의 유전자들의 기능을 이해하는데 널리 이용되고 있을 뿐 아니라, 암, 감염성 질환과 같은 난치성 질환을 치료하는 치료제로서도 활발히 개발되고 있다(Mouldy Sioud. Therapeutic siRNAs . Trends in pharmacological Sciences 2004;22-28).
상술한 바와 같이, 안티센스 RNA 및 siRNA를 이용하여 치료제 또는 진단제를 개발하려는 많은 시도가 있으며, 이러한 활발한 개발 활동을 뒷받침하기 위하여 올리고리보뉴클레오타이드를 대량으로 합성을 하고 있다. 따라서 올리고리보뉴클레오타이드에 대한 효율적인 생산 방법에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다.
올리고뉴클레오타이드의 합성은 통상적으로 고체수지에서 각 모노머를 축합하여 자동합성기로 합성된다. DNA 올리고의 경우는 축합수율이 좋으나, 특히 RNA 올리고, 즉 올리고리보뉴클레오타이드는 2’-OH기에 대한 보호기로 인하여 합성시간이 길고, 수율이 낮아 고순도의 RNA 올리고를 얻기가 어렵다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 올리고뉴클레오타이드, 특히 올리고리보뉴클레오타이드 또는 siRNA(small interfering) RNA와 같은 올리고 분자를 보다 높은 순도로 보다 편리하게 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 올리고 분자를 화학적으로 제조하는 경우, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 이용하면 크게 개선된 순도로 올리고뉴클레오타이드 분자를 제조할 수 있다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 올리고뉴클레오타이드의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 리보뉴클레오타이드 다이머 및 트라이머를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 리보뉴클레오타이드 다이머 및 트라이머의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 이용하며 다음의 단계를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 제조방법을 제공한다:
(a) (i) 출발물질로서 고상 지지체에 결합된 뉴클레오사이드에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시키거나, (ⅱ) 출발물질로서의 유니버셜 고상 지지체(universal solid support)에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머를 커플링시키거나, 또는 (ⅱ) 출발물질로서의 유니버셜 고상 지지체에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시키는 단계; 그리고,
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시켜 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 단계.
본 발명자들은 올리고뉴클레오타이드, 특히 올리고리보뉴클레오타이드 또는 siRNA(small interfering) RNA와 같은 올리고 분자를 보다 높은 순도로 보다 편리하게 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 올리고 분자를 화학적으로 제조하는 경우, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 이용하면 크게 개선된 순도로 올리고뉴클레오타이드 분자를 제조할 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명은 고체 지지상을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 합성법에서 고체상에 축합시키는 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 모노머가 아닌 다이머 혹은 트라이머를 이용함으로써 최종적으로 얻어지는 올리고뉴클레오타이드의 순도를 확연히 개선시킨다. 올리고뉴클레오타이드 합성에서 발생하는 불순물은 주로 완전한 서열(Nmer)에서 축합이 덜 된 짧은 서열로 구성되어 있으며, 이들은 보통 (N-1)mer, (N-2)mer, (N-x)mer 등으로 표현된다. 이는 고체상에 뉴클레오타이드를 축합시킬시 축합반응 후 캡핑단계에서 완전히 캡핑이 되지 않아 Nmer보다 짧은 서열의 불순물이 발생한다. 이러한 불완전한 캡핑반응은 고체지지상에 첫 번째 축합반응에서 많이 발생한다.
또한, 올리고뉴클레오타이드의 정제과정에서 가장 분리가 어려운 불순물은 크로마토그램에서 비슷한 위치에서 용출되는 (N-1)mer이다.
본 발명에 따르면, 첫 번째 축합반응에서 모노머가 아닌 다이머 혹은 트라이머를 이용함으로써 정제과정에서 제거가 힘든 (N-1)mer의 발생을 차단하고 정제가 쉬운 (N-2)mer 및 (N-3)mer를 발생시켜 보다 순수한 올리고뉴클레오타이드를 얻는 다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명은 주로 첫 번째 반응에서 많이 발생하는 (N-1)mer의 감소는 물론 전체적인 (N-x)mer의 발생감소를 초래하였다. 이는 고체상의 첫 번째 축합반응에서 모노머 대신 긴 구조의 다이머 혹은 트라이머가 축합된 후 다음 모노머 축합반응시 캡핑이 안된 곳보다 축합된 다이머 혹은 트라이머에 결합하는 것이 보다 공간적으로 유리하여 전반적인 짧은 서열의 발생을 감소시켜 순도가 높은 올리고뉴클레오타이드 합성결과를 초래하기 때문이다.
본 발명은 다양한 올리고뉴클레오타이드, 즉 디옥시리보뉴클레오타이드 올리고머, 리보뉴클레오타이드 올리고머 및 이들의 유도체에 적용될 수 있다. 보다 상세하게는, 본 발명은 자연(naturally occurring)의 올리고뉴클레오타이드뿐만 아니라 변형 올리고뉴클레오타이드에도 적용될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 의해 제조되는 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 포스포로티오에이트 DNA 또는 RNA, 포스포로디티오에이트 DNA 또는 RNA, 포스포로아미데이트 DNA 또는 RNA; 당 변형된 올리고뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-O-에틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2‘-할로겐 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA; 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸 -, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 리보뉴클레오타이드 올리고머에 적용된다.
본 명세서에서, 용어 “리보뉴클레오타이드”는 2’-H를 가지지 않는 뉴클레오타이드를 의미하며, 자연(naturally occurring)의 리보뉴클레오타이드뿐만 아니라 그의 유사체를 포함한다. 예를 들어, 당의 2번 탄소에 있는 -OH기에 알킬기(예컨대, 메틸 또는 에틸)가 결합되거나, 2번 탄소에 -OH기 대신에 할로겐족 원소(예컨대, 플루오로) 또는 아미노기가 결합된 리보뉴클레오타이드의 유사체도 본 명세서의 용어 “리보뉴클레오타이드”에 포함된다.
2’-H를 갖는 뉴클레오타이드는 디옥시리보뉴클레오타이드로 명명된다.
본 명세서, 용어 “뉴클레오타이드”는 특별한 언급이 없는 한, 리보뉴클레오타이드, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 이들의 유도체들을 포괄한다.
본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 첫 번째 커플링 반응에 이용하는 것이다.
본 발명의 방법은 뉴클레오타이드 다이머또는 뉴클레오타이드 트라이머를 이용한다는 측면에서 공통점을 갖지만, 3’-말단에 있는 뉴클레오타이드, 즉 고체 지지상에 결합된 뉴클레오타이드의 종류에 따라 다음과 같이 크게 3가지 공정으로 나눌 수 있다:
3가지 공정 중 하나는, 3’-말단에 뉴클레오사이드가 위치하는 것이다. 즉, 합성 과정의 출발물질로서 뉴클레오사이드 모노머가 프리로딩(preloading)된 고상 지지체가, 여기에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머가 커플링 되고, 이어 결과물에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머가 커플링되어 원하는 서열의 올리고뉴클레오타이드를 제조한다.
3가지 공정 중 다른 하나는, 3’-말단에 뉴클레오타이드 다이머가 위치하는 것이다. 이 경우에는 유니버셜 고상 지지체가 출발물질로서 이용된다.
본 명세서에서 용어 “유니버셜 고상 지지체”는 공유결합되어 있는 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드가 없는 고상 지지체를 의미한다. 프리로딩된 지지체와 다르게, 유니버셜 고상 지지체는 올리고뉴클레오타이드의 말단에 있는 서열에 제한되지 않고 어떠한 올리고뉴클레오타이드도 합성할 수 있다. 유니버셜 지지체를 이용하면, 올리고뉴클레오타이드의 첫 번째 커플링 반응에 적용되는 뉴클레오타이드 씬톤(nucleotide synthon)에 의해 최종적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드의 말단 서열이 결정된다.
합성 과정의 첫 단계에서 출발물질로서 유니버셜 고상 지지체가 이용되며, 여기에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머가 이용된다. 이어 결과물에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머가 커플링되어 원하는 서열의 올리고뉴클레오타이드를 제조한다. 예를 들어, 3’-말단에 있는 뉴클레오타이드 다이머에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머를 결합시켜 원하는 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다. 또한, 3’-말단에 있는 뉴클레오타이드 다이머에 적절하게 뉴클레오타이드 다이머 및 뉴클레 오타이드 모노머를 커플링시켜 원하는 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다.
3가지 공정 중 마지막 하나는, 3’-말단에 뉴클레오타이드 트라이머가 위치하는 것이다. 이 경우에는 유니버셜 고상 지지체가 출발물질로서 이용된다. 합성 과정의 첫 단계에서 출발물질로서 유니버셜 고상 지지체가 이용되며, 여기에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 트라이머가 이용된다. 이어 결과물에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머가 커플링되어 원하는 서열의 올리고뉴클레오타이드를 제조한다. 예를 들어, 3’-말단에 있는 뉴클레오타이드 트라이머에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머를 결합시켜 원하는 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다. 또한, 3’-말단에 있는 뉴클레오타이드 트라이머에 적절하게 뉴클레오타이드 다이머, 뉴클레오타이드 모노머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시켜 원하는 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다.
3가지 공정 중 가장 바람직한 것은, 출발물질로서 고상 지지체에 하나의 뉴클레오사이드가 결합된 것을 이용하고, 여기에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시키는 반응이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 (a) 출발물질로서 고상 지지체에 결합된 뉴클레오사이드에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시키는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a) 결과물에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머를 커플링시켜 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 (a) 출발물질로서의 유니버셜 고상 지지체에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시키는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a) 결과물에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머를 커플링시켜 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
본 발명의 방법은 고상(solid phase) 합성법에 따라 실시된다.
본 발명의 방법이 고상 합성법에 따라 실시되는 경우, 본 발명의 바람직한 구현예는 다음의 단계를 포함한다:
(a) 고상 지치체-뉴클레오사이드[(NS)1]에 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]를 커플링시켜 SS-(NS)1-(NMP)2 또는 SS-(NS)1-(NMP)3를 제조하는 단계;
(b) 상기 단계 (a) 결과물에 연속적으로 뉴클로레오타이드 모노머를 커플링시켜 SS-(NS)1-(NMP)2-(NMP)n-3 또는 SS-(NS)1-(NMP)3-(NMP)n-4를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 SS-(NS)1-(NMP)2-(NMP)n-3 또는 SS-(NS)1-(NMP)3-(NMP)n-4로부터 고상 지지체(SS)를 제거하여 (NMP)n를 얻는 단계.
첫 번째 단계에서 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]를 뉴클레오사이드 모노머가 결합된 고상 지치체에 커플링시킨 다음, 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머를 커플링시키면, 크게 개선된 순도로 올리고뉴 클레오타이드 분자를 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 고상 지치체-뉴클레오사이드[SS-(NS)1]에 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]를 커플링시켜 SS-(NS)1-(NMP)2 또는 SS-(NS)1-(NMP)3를 제조한다.
지지체-뉴클레오사이드[SS-(NS)1]는 고상 지지체에 하나의 리보뉴클레오사이드 혹은 디옥시리보뉴클레오사이드 분자가 결합된 것이다. 상기 고상 지지체로는 뉴클레오타이드 분자의 고상 합성(solid phase synthesis)에 이용되는 어떠한 것도 이용할 수 있다. 리보뉴클레오사이드 혹은 디옥시리보뉴클레오사이드가 부착되지 않은 유니버셜 고상지지체도 사용할 수 있다. 이러한 고상 지지체는 다음과 같은 특성을 갖는 것이 바람직하다: (i) 올리고뉴클레오타이드 합성에 이용되는 시약에 대하여 실질적으로 용해되지 않고, (ⅱ) 올리고뉴클레오타이드 합성에 이용되는 시약에 대하여 화학적으로 안정되어야 하며, (ⅲ) 화학적 변형이 가능하여야 하고, (iv) 원하는 올리고뉴클레오타이드 로딩을 제공하여야 하며, (ⅴ) 적합한 압축 세기(compression strength)를 가지고 있어 합성 과정 동안의 증가되는 압력을 견뎌내야 하고, (ⅵ) 원하는 입자 크기 및 분포를 가져야 한다.
본 발명에서 고상 지지체로 이용 가능한 것은, 바람직하게는 무기 중합체로서, 예를 들어, 실리카, 다공성 유리, 알루미늄실리케이트, 폴리스타이렌, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 보로실리케이트, 금속 산화물(예컨대, 알루미나 및 니켈 산화물) 및 클레이를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 고상 지지체는 CPG(controlled pore glass) 및 폴리스타이렌 이다.
고상 지치체의 표면에 뉴클레오사이드가 결합된 [SS-(NS)1]가 이용되며, 바람직하게는 고상 지치체의 표면에 리보뉴클레오사이드가 결합된 [SS-(rNS)1]가 이용된다. 뉴클레오사이드는 통상적으로 당의 3‘위치의 -OH 기를 통하여 고상 지지체에 결합한다.
본 발명의 가장 큰 특징은, [SS-(NS)1]에 뉴클레오타이드 모노머 대신에, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링 시킨다는 것이다. 이러한 초기 반응의 변형은 최종적으로 합성되는 올리고뉴클레오타이드의 순도를 크게 향상시키는 결과를 초래한다.
뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 [SS-(NS)1]에 커플링시키는 것은, 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,458,066호, 미국 특허 제4,415,732호, Caruthers et al., Genetic Engineering, 4:1-17 (1982); 및 Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, pages 6-1 through 6-22, Applied Biosystems, Part No. 901237 (1991)에 상세하게 커플링 방법이 기재되어 있다.
바람직하게는, 상기 커플링은 포스포라미다이트 방법(phosphoramidite method)에 따라 실시된다. 예를 들어, 다음과 같이 실시할 수 있다. [SS-(NS)1]에 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]의 포스포 라미다이트 유도체를 첨가하되, 활성제(activator), 예를 들어 약산(예컨대, 테트라졸, 5-에틸티오테트라졸, 벤질티오테트라졸 등)과 동시에 첨가한다. 가장 바람직하게는, 이용되는 활성제는 5-에틸티오테트라졸이다. 상기 약산은 포스포라미다이트의 질소를 프로토네이션하여 반응성의 중간체를 형성시킨다. 이어, 캡핑을 실시한다. 캡핑은 바라직하게는, 아세트산 무수물 및 1-메틸이미다졸로 실시한다. 이어, 요오딘과 같은 산화제를 이용하여 산화를 시켜 뉴클레오타이드간 결합을 포스파이트(phosphite)로부터 보다 안정한 포스포다이에스테르로 전환시킨다. 캡핑과 산화단계는 순서를 바꿀 수도 있다. 산화 단계 이후, 양성자성 산, 예컨대, 트리클로로아세트산 또는 다이클로로아세트산을 이용하여 하이드록실 보호기를 제거한다.
고상 지치체-뉴클레오사이드(SS-NS)1에 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]가 커플링되어, SS-(NS)1-(NMP)2 또는 SS-(NS)1-(NMP)3가 제조된다.
상기 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]는 다양한 결합(linkage)을 가질 수 있으며, 바람직하게는 포스포다이에스테르, 포스포라미데이트, 알킬포스포라미데이트, 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 알킬포스포트리에스테르, 또는 알킬포스포노티오에이트 결합을 가지며, 가장 바람직하게는 포스포다이에스테르 또는 포스포라미데이트 결합을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 및 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]는 각각 뉴클레오타이드 다이머 포스포라미다이트 및 뉴클레오타이드 트라이머 포스포라미다이트이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리보뉴클레오타이드 다이머[(rNMP)2]는 하기 화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 단계를 포함하는 반응에 의해 제조된다:
화학식 1
Figure 112007081204613-pat00001
화학식 2
Figure 112007081204613-pat00002
상기 화학식 1 및 2에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이 고, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다.
바람직하게는, 보호기 R1 및 R4는 서로 독립적으로 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 픽실(9-phenyl xanthen-9-yl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R2 및 R5는 서로 독립적으로 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R3는 할로페닐 또는 카르보벤족실기이나, 이에 한정되는 것은 아니다. B1 및 B2는 각각 독립적으로 아데닌, 사이토신, 구아닌, 우라실 또는 그의 유도체이다.
보다 바람직하게는, 상기 화학식 1 및 2에서 R1 및 R4는 디메톡시트리틸, 이고, R2 및 R5는 티-부틸-디메틸실릴이며, R3는 할로페닐(가장 바람직하게는, 2-클로로페닐)이다.
B1 및 B2는 보호기가 결합되어 있거나 또는 결합되어 있지 않은 염기(base) 이다. B1 및 B2에 위치할 수 있는 염기는, 일반적인 염기, 즉 아데닌, 사이토신, 구아닌 및 우라실뿐만 아니라, 그의 유도체도 포함한다. 염기의 유도체는, 바람직하게는, 잔틴(xanthine), 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 5-할로 우라실과 사이토신, 6-아조 우라실과 사이토신, 5-우라실(슈도 우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 옥사, 아미노, 티올, 티오알킬 및 하이드록실 아데닌과 구아닌, 5-트리플루오로-메틸 우라실과 사이토신, 7-메틸구아닌 또는 이노신이다.
B1 및 B2는 보호기가 결합될 수 있으며, 예를 들어, 벤조일 또는 이소부티릴, 아세틸, 디메틸포름아미딘 (DMF), 페녹시아세틸 (PAC) 및 이의 유도체, 4-티-부틸페녹시아세틸 (TAC) 등의 보호기가 결합될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 과정에서 활성제의 선택이 중요하다. 가장 바람직하게는, 상기 활성제는 1-메틸이미다졸이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 리보뉴클레오타이드 다이머[(rNMP)2]는 하기 화학식 3의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 단계를 포함하는 반응에 의해 제조된다:
화학식 3
Figure 112007081204613-pat00003
화학식 2
Figure 112007081204613-pat00004
상기 화학식 2 및 3에서, R1, R2, R4 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다.
바람직하게는, 보호기 R1 및 R4는 서로 독립적으로 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 픽실 (9-phenyl xanthen-9-yl) 등을 포함한, 이에 한정되는 것은 아니다. R2 및 R5는 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4- methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R31는 사이아노에틸, 사이아노알킬기 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R32는 다이알킬아미노 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. B1 및 B2는 각각 독립적으로 아데닌, 사이토신, 구아닌, 우라실 또는 그의 유도체이다.
보다 바람직하게는, 상기 화학식 3에서 R1은 디메톡시트리틸이고, R2는 tert-부틸-디메틸실릴이며, R31은 2-사이아노에틸이고, 그리고 R32는 디알킬아미노(가장 바람직하게는, 디이소프로필아미노)이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 화학식 4의 화합물과 화학식 3의 화합물을 커플링시키는 경우, 활성제로서 5-에틸티오테트라졸이 이용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 리보뉴클레오타이드 트라이머[(rNMP)3]는 다음의 단계를 포함하는 반응에 의해 제조된다:
(i) 다음 화학식 4의 리보뉴클레오타이드 다이머에서 R1기를 제거하는 단계; 및
화학식 4
Figure 112007081204613-pat00005
상기 화학식 4에서 R1, R2, R3 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다;
(ⅱ) 단계 (i)의 결과물과 리보뉴클레오사이드 3‘-포스포라미다이트를 커플링시켜 리보뉴클레오타이드 트라이머를 제조하는 단계.
바람직하게는, 보호기 R1은 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 픽실 (9-phenyl xanthen-9-yl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R2, R5는 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이다. R3는 수소, 할로페닐 또는 카르보벤족실기 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. B1 및 B2는 각각 독립적으로 아데닌, 사이토신, 구아닌, 우라실 또는 그의 유도체이다.
보다 바람직하게는, 상기 화학식 4에서 R1은 디메톡시트리틸이고, R2는 tert-부틸-디메틸실릴이며, R3는 수소 혹은 할로페닐(가장 바람직하게는, 클로로페닐)이고, R5는 tert-부틸-디메틸실릴이다.
화학식 4의 리보뉴클레오타이드 다이머에서 R1기를 제거하는 과정은 당업계에 공지된 통상의 탈보호기(deprotecting) 방법을 이용하여 실시할 수 있으며, 강산, 예컨대, 벤젠술폰산을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고상 지치체-뉴클레오사이드 [SS-(NS)1]에 결합된 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]에 연속적으로 리보뉴클로레오타이드 모노머를 커플링시켜 원하는 서열을 갖는 SS-(NS)1-(NMP)2-(NMP)n-3 또는 SS-(NS)1-(NMP)3-(NMP)n-4를 최종적으로 제조한다.
이 때 이용되는 뉴클로레오타이드 모노머는 바람직하게는, 뉴클레오사이드 포스포라미다이트이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 연속적으로 뉴클로레오타이드 모노머를 커플링시키는 경우, 활성제로서 5-에틸티오테트라졸이 이용된다.
최종적으로, SS-(NS)1-(NMP)2-(NMP)n-3 또는 SS-(NS)1-(NMP)3-(NMP)n-4로부터 고상 지지체(SS)를 제거하여 (NMP)n를 얻는다. 리보뉴클레오사이드 혹은 뉴클레오사이드가 부착되지 않은 유니버셜 고상지지체를 사용할 경우는 SS-(NMP)2-(NMP)n-2 또는 SS-(NMP)3-(NMP)n-3로부터 고상 지지체(SS)를 제거하여 (NMP)n를 얻는다.
고상 지지체를 제거하는 과정은 당업계에 공지된 통상의 방법에 의해 실시될 수 있으며, 예를 들어, 암모늄 하이드록사이드를 이용하여 고상 지지체를 제거할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (c)를 실시하기 전 또는 후에 올리고뉴클레오타이드[(NMP)n]에 결합되어 있는 보호기를 제거하는 단계를 추가적으로 포함한다. 보호기의 제거는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 포스페이트 보호기는 티오페놀 혹은 암모늄 하이드록사이드 용액 처리로 제거할 수 있고, 염기에 결합된 벤조일 및 이소부티릴은 암모늄 하이드록사이드 용액에서 올리고뉴클레오타이드를 가열함으로서 제거할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 올리고뉴클레오타이드[(NMP)n]의 길이는 특별히 제한되지 않으며, 일반적으로 10-50 뉴클레오타이드이다.
본 발명의 방법에 따르면, 고순도의 올리고뉴클레오타이드, 특히 올리고리보뉴클레오타이드를 보다 단축된 시간으로 효율적으로 합성할 수 있다. 본 발명의 방법은 종래 기술과 비교하여 15-20% 정도 높은 순도의 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 화학식 5로 표시되는 리보뉴클레오타이드 다이머를 제공한다:
화학식 5
Figure 112007081204613-pat00006
상기 화학식 5에서 R1, R2, R3 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이며, R6는 수소 또는
Figure 112007081204613-pat00007
(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)-포스포아미다이트기 이고, 상기 iPr은 이소프로필이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 화학식 6으로 표시되는 리보뉴클레오타이드 트라이머를 제공한다:
화학식 6
Figure 112007081204613-pat00008
상기 화학식 6에서 R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 보호기이고, B1, B2 및 B3는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이며, R7은 수소 또는
Figure 112007081204613-pat00009
이고, 상기 iPr은 이소프로필이다.
본 발명자가 알고 있는 범위 하에서, 상술한 RNA 다이머 및 트라이머는 본 발명자들에 의해 최초로 개발된 것이다.
바람직하게는, 상기 화학식 5에서, 보호기 R1은 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 픽실 (9-phenyl xanthen-9-yl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R2, R4 , R5는 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R3 , R5는 수소, 할로페닐 또는 카르보 벤족실기 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. B1, B2 및 B3는 각각 독립적으로 아데닌, 사이토신, 구아닌, 우라실 또는 그의 유도체이다.
보다 바람직하게는, 상기 화학식 5에서 R1은 디메톡시트리틸이고, R2는 tert-부틸-디메틸실릴이며, R3는 할로페닐(가장 바람직하게는, 클로로페닐)이고, R5는 tert-부틸-디메틸실릴이다.
바람직하게는, 상기 화학식 6에서, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 디메톡시트리틸, 벤질, tert-부틸, 메틸, 토실, tert-부틸-디메틸실릴, 할로페닐 또는 카르보벤족시기이고, B1, B2 및 B3는 각각 독립적으로 아데닌, 사이토신, 구아닌, 우라실 또는 그의 유도체이다.
보다 바람직하게는, 상기 화학식 6에서 R1은 디메톡시트리틸이고, R2, R4 및 R5는 tert-부틸-디메틸실릴이며, R3 및 R5는 수소 혹은 할로페닐(가장 바람직하게는, 클로로페닐)이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 활성제(activator)로서 1-메틸이미다졸의 존재 하에서 하기 화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 단계를 포함하는 리보뉴클레오타이드 다이머의 제조방법을 제공한다:
화학식 1
Figure 112007081204613-pat00010
화학식 2
Figure 112007081204613-pat00011
상기 화학식 1 및 2에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다.
위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드[(NMP)n]의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 고순도의 올리고뉴클레오타이드를 보다 단축된 시간으로 효율적으로 합성할 수 있다. 본 발명의 방법은 종래 기술과 비교하여 15-20% 정도 높은 순도의 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 I: 다이뉴클레오타이드 합성(포스포트라이에스테르 방법)
Figure 112007081204613-pat00012
다이뉴클레오타이드 UpU, CpU 및 GpA의 합성(2b-2d)
R1 = DMTr(dimethoxytrityl), R2 = TBDMS(tert-butyldimethylsilyl), R = o-클로로페닐. 2a - B1 = U, B2 = U; 2b - B1 = bzC, B2 = U; 2c - B1 = ibG, B2 = bzA; 3a - B1 = U; 3b - B1 = bzC; 3c - B1 = ibG; 4a - B2 = U; 4b - B2 = bzA. bz = 벤조일, ib = 이소부티릴
실시예 1: 5'-O-다이메틸옥시트리틸-2'-O-(터트-부틸디메틸실릴)유리딘-3'-O-클로로페닐포스페이트-5'-O-2'-O-(터트-부틸디메틸실릴)유리딘의 합성(2a)
단계 1: 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-터트-부틸디메틸실릴유리딘-3'-O-(2-클로로페닐포스페이트)(트리에틸암모늄 염)의 합성 (3a)
디옥산(20 mL)에 트리아졸(0.63 g, 9.24 mmol, Sigma Aldrich)과 무수 트리에틸아민(1.3 mL, 9.15 mmol, Sigma Aldrich)을 용해한 다음, 5℃에서 냉각하였다. 디옥산 5 mL에 O-클로로페닐포스포디클로리데이트 1.1 g(4.53 mmol, Sigma Aldrich)을 녹인 용액을 위의 용액에 적가하였다. 1시간 후, 상기 용액을 여과하고 -5℃로 냉각되어 있는 10 mL 피리딘에 용해되어 있는 5‘-O-다이메톡시트리틸-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴유리딘 (4a, 2 g, 3.02 mmol)에 첨가하였다. 이어, 1-메틸이미다졸 (0.38 mL, 4.6 mmol, Sigma Aldrich)을 위 용액에 첨가하였다. 1시간 후 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate buffer, 10 mL)을 냉각된 상태의 위 용액에 가한 후 용액을 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 (50 mL)에 용 해한 다음, 0.1 M TEAB (50 mL)로 세척하고 수층을 다이클로로메탄 각 20 mL을 사용하여 2번 추출하였다. 유기층을 수집하여 이를 0.1 M TEAB (100 mL)로 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조한 후 진공펌프를 사용하여 농축하여 2.78 g의 목표 화합물을 수득하였다(수율 97%).
단계 2: 5'-O- 다이메톡시트리틸 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 유리딘 -3'-O- 클로로페닐포스페이트 -5'-O-2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 유리딘의 합성 (2a)
단계 1에서 제조된 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-tert-부틸다이메틸실릴유리딘-3'-O-(2-클로로페닐포스페이트)트리에틸암모늄 염(3a, 1.47 g, 1.54 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-tert-부틸다이메틸실릴유리딘(4a, 0.5 g, 1.4 mmol)을 20 mL의 피리딘에 용해하고, 진공펌프를 이용하여 건조하였다. 새로 제조한 피리딘 5 mL에 용해된 MSNT(1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole, 0.68 g, 2.31mmol, Sigma Aldrich)를 상기 건조 결과물에 첨가하였다. 반응액을 약 3 mL까지 농축시킨 후 0.16 mL의 1-메틸이미다졸(1.89 mmol)을 가하였다. 1시간 후 반응액을 0℃로 냉각한 후 2 mL의 물을 첨가하였다. 반응액을 농축한 후 잔사 오일을 15 mL의 다이클로로메탄에 녹인 후 15 mL의 0.1 M TEAB를 사용하여 세척하였다. 수층액은 다이클로로메탄을 사용하여 세척하고 (3 x 5 mL) 유기층을 수집한 다음, 소듐 설페이트로 건조하였다. 목표화합물은 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(0.68 g, 수율 41 %). 31P NMR (DMSO), dppm : -6.38, -6.25
실시예 2: 5'-O-다이메톡시트리틸-N 4 -벤조일-2'-O-(터트-부틸다이메틸실릴)사이티딘-3'-O-클로로페닐포스페이트-5'-O-2'-O-(터트-부틸다이메틸실릴)유리딘의 합성 (2b)
단계 1: 5'-O-다이메톡시트리틸-N 4 -벤조일-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴사이티딘-3'-O-(2-클로로페닐포스페이트)(트리에틸암모늄 염)의 합성 (3b)
디옥산(20 mL)에 트리아졸(0.69 g, 10 mmol) 과 무수 트리에틸아민(1.4 mL, 9.9 mmol) 을 용해한 다음, 5℃로 냉각하였다. 디옥산 5 mL에 O-클로로페닐포스포다이클로리데이트 1.2 g (4.90 mmol)을 녹인 용액을 위의 용액에 적가하였다. 1시간 후, 상기 용액을 여과하고 -5℃로 냉각되어 있는 10 mL 무수 피리딘에 용해되어 있는 5‘-O-다이메톡시트리틸-N4-벤조일-2’-O-터트-부틸다이메틸실릴사이티딘(2.5g, 3.27 mmol, Sigma Aldrich)에 첨가하였다. 이어, 1-메틸이미다졸 (0.40 mL, 4.9 mmol, Sigma Aldrich)을 위 용액에 첨가하였다. 1시간 후 0.1 M TEAB(10 mL)을 냉각된 상태의 위 용액에 가한 후 용액을 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄(50 mL)에 용해한 다음, 0.1 M TEAB(50 mL)로 세척하고 수층을 다이클로로메탄 각 20 mL을 사용하여 2번 추출하였다. 유기층을 수집하여 이를 0.1 M TEAB(100 mL)로 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조한 후 진공펌프를 사용하여 농축하여 3.08 g의 목표 화합물을 수득하였다(수율 94%).
단계 2: 5'-O-다이메톡시트리틸-N 4 -벤조일-2'-O-(터트-부틸다이메틸 실릴)사이티딘-3'-O-클로로페닐포스페이트-5'-O-2'-O-(터트-부틸다이메틸실릴)유리딘의 합성 (2b)
상기 단계 1에 제조된 5'-O-다이메톡시트리틸-N4-벤조일-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴사이티딘-3'-O-(2-클로로페닐포스페이트)(트리에틸암모늄 염)(3b, 3.24g, 3.07 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-tert-부틸다이메틸실릴유리딘(4a, 1 g, 2.8 mmol)을 20 mL의 피리딘에 용해하고, 진공펌프를 이용하여 건조하였다. 새로 제조한 피리딘 10 mL에 용해된 MSNT(1.364 g, 4.61mmol)를 상기 건조 결과물에 첨가하였다. 반응액을 약 3 mL까지 농축시킨 후 0.25 mL의 1-메틸이미다졸(3.07 mmol)을 가하였다. 1시간 후 반응액을 0℃로 냉각한 후 2 mL의 물을 첨가하였다. 반응액을 농축한 후 잔사 오일을 15 mL의 다이클로로메탄에 녹인 후 15 mL의 0.1 M TEAB를 사용하여 세척하였다. 수층액은 다이클로로메탄을 사용하여 세척하고 (3 x 5 mL) 유기층을 수집한 다음, 소듐 설페이트로 건조하였다. 목표화합물은 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(1.47 g, 수율 40 %). 31P NMR (DMSO), dppm : -6.42, -6.10
실시예 3: 5'-O-다이메톡시트리틸-N 2 -이소부티릴-2'-O-(터트-부틸다이메틸실릴)구아노신-3'-O-클로로페닐포스페이트-5'-O-2'-O-(터트-부틸다이메틸실릴)아데닌의 합 성(2c)
단계 1: 5'-O- 다이메톡시트리틸 - N 2 - 이소부티릴 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 구아노신 -3'-O-(2- 클로로페닐포스페이트 )( 트리에틸암모늄 염)의 합성 (3c)
디옥산(20 mL)에 트리아졸(1.37 g, 19.87 mmol)과 무수 트리에틸아민(2.8 mL, 19.87 mmol) 을 용해한 다음, 5℃로 냉각하였다. 디옥산 5 mL에 O-클로로페닐포스포다이클로리데이트 2.386 g (9.74 mmol)을 녹인 용액을 위의 용액에 적가하였다. 1시간 후, 상기 용액을 여과하고 -5℃로 냉각되어 있는 10 mL 무수 피리딘에 용해되어 있는 5‘-O-다이메톡시트리틸-N2-이소부틸릴-2’-O-터트부틸다이메틸실릴구아노신(5 g, 6.5 mmol)에 첨가하였다. 이어, 1-메틸이미다졸(0.80 mL, 9.74 mmol)을 위 용액에 첨가하였다. 1시간 후 0.1 M TEAB(10 mL)을 냉각된 상태의 위 용액에 가한 후 용액을 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄(50 mL)에 용해한 다음, 0.1 M TEAB(50 mL)로 세척하고 수층을 다이클로로메탄 각 20 mL을 사용하여 2번 추출하였다. 유기층을 수집하여 이를 0.1 M TEAB(100 mL)로 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조한 후 진공펌프를 사용하여 농축하여 6.55 g의 목표 화합물을 수득하였다(수율 95%).
단계 2: 5'-O- 다이메톡시트리틸 - N 2 - 이소부티릴 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 구아노신 -3'-O- 클로로페닐포스페이트 -5'-O-2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 )아데닌의 합 성(2c)
상기 단계 1에서 제조된 5'-O-다이메톡시트리틸-N2-이소부티릴-2'-O-(터트-부틸다이메틸실릴)구아노신-3'-O-(2-클로로페닐포스페이트)(트리에틸암모늄 염)(3c, 1.34 g, 1.26 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-tert-부틸다이메틸실릴아데닌(4b, 1 g, 2.8 mmol)을 20 mL의 피리딘에 용해하고, 진공펌프를 이용하여 건조하였다. 새로 제조한 피리딘 10 mL에 용해된 MSNT(0.6 g, 1.89 mmol)를 상기 건조 결과물에 첨가하였다. 반응액을 약 3 mL까지 농축시킨 후 0.16 mL의 1-메틸이미다졸(1.89 mmol)을 가하였다. 30분 후 반응액을 0℃로 냉각한 후 2 mL의 물을 첨가하였다. 반응액을 농축한 후 잔사 오일을 15 mL의 다이클로로메탄에 녹인 후 15 mL의 0.1 M TEAB를 사용하여 세척하였다. 수층액은 다이클로로메탄을 사용하여 세척하고 (3 x 5 mL) 유기층을 수집한 다음, 소듐 설페이트로 건조하였다. 목표화합물은 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(1.265 g, 수율 84%). 31P NMR (DMSO), dppm : -6.33, -6.14
실시예 Ⅱ: 다이뉴클레오타이드 합성( 포스포라미다이트 방법)
Figure 112007081204613-pat00013
다이뉴클레오타이드 UU, CU, GU 및 GA의 합성 (1a-1d).
R1 = DMTr, R2 = TBDMS, R = 2-사이아노에틸. 1a - B1 = U, B2 = U, 1b - B1 = bzC, B2 = U, 1c - B1 = ibG, B2 = U, 1d - B1 = ibGU, B2 = bzA, 2d - B1 = U, B2 = U, 2e - B1 = bzC, B2 = U, 2f - B1 = ibG, B2 = U, 2g - B1 = ibG, B2 = bzA. 4a - B2 = U, 4b - B2 = bzA. 5a - B1 = U, 5b - B1 = bzC, 5c - B1 = ibG.
실시예 4: 5'-O- 다이메톡시트리틸 -P- 사이아노에틸포스포릴 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 유리딜 -3'-O-[(N,N-다 이이소프 로필아미노) 사이아노에톡시포스피노 ](3'->5')- 2'-O- 터트 - 부틸다이메틸실릴유리딘의 합성 (2d)
5'-다이메톡시트리틸-유리딘-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴-3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]포스포라미다이트(5a, 1.085 g, 1.26 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴유리딘(4a, 0.3g, 0.84 mmol)을 무수 아세토니트릴 10 mL에 녹인 후, 검상태가 될 때까지 농축하였다. 5-벤질티오테트라 졸(0.483 g, 2.52 mmol, ChemGene)을 20 mL의 아세토니트릴에 녹이고 이 용액을 결정이 생길 때까지 농축한 후 아세토니트릴 20 mL을 사용하여 위 두 용액을 합친 후 다시 3 mL 정도가 될 때까지 농축하였다. 1시간 후 용액을 0℃로 냉각하고 7.6 mL의 (THF:피리딘:물 = 7:1:2)에 녹인 0.5 M 요오딘 용액을 가하였다. 이 용액을 상온에서 5분간 방치한 후 3.8 mL의 2 M Na2S2O3 수용액을 가하였다. 용액을 검상태가 될 때까지 농축한 후 잔사를 20 mL의 다이클로로메탄에 녹이고 수층을 다이클로로메탄 5 mL을 사용하여 3번 추출하였다. 유기층을 수집하여 0.1 M TEAB 수용액으로 3번(각 10mL) 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조하였다. 용액을 농축한 후 톨루엔(2 x 10 mL)을 사용하여 증발시켜 남은 피리딘을 제거하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 녹인 후 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(0.5 g, 수율 53%). 31P NMR (DMSO), dppm : -1.03, -0.71
실시예 5: 5'-O- 다이메톡시트리틸 - N 4 - 벤조일 -P- 사이아노에틸포스포릴 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 사이티딜 -3'-O-[(N,N- 다이이소프로필아미노 ) 사이아노에톡시포스피노 ](3'->5')- 2'-O- 터트 - 부틸다이메틸실릴유리딘의 합성 (2e)
5'-다이메톡시트리틸-N4-벤조일사이티딘-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴-3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]포스포라미다이트(5b, 1.928 g, 2.00 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴유리딘(4a, 0.358 g, 1.00 mmol)을 무수 아세토니트릴 10 mL에 녹인 후, 검상태가 될 때까지 농축하였다. 5-에틸티오테트라졸(0.528 g, 4 mmol, Sigma Aldrich)을 20 mL의 아세토니트릴에 녹이고 이 용액을 결정이 생길 때까지 농축한 후 아세토니트릴 20 mL을 사용하여 위 두 용액을 합쳤다. 그런 다음, 상기 용액을 3 mL 정도가 될 때까지 농축한 후, 4시간이 경과한 다음 0℃로 냉각하고 12 mL의 (THF:피리딘:물 = 7:1:2)에 녹인 0.5 M 요오딘 용액을 가하였다. 이 용액을 상온에서 5분간 방치한 후 6 mL의 2 M Na2S2O3 수용액을 가하였다. 용액을 검상태가 될 때까지 농축한 후 잔사를 20 mL의 다이클로로메탄에 녹이고 수층을 다이클로로메탄 5 mL을 사용하여 3번 추출하였다. 유기층을 수집하여 0.1 M TEAB 수용액으로 3번(각 10 mL) 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조하였다. 용액을 농축한 후 톨루엔(2 x 10 mL)을 사용하여 증발시켜 남은 피리딘을 제거하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 녹인 후 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(0.868 g, 수율 70%). 31P NMR (DMSO), dppm : -1.05, -0.74
실시예 6: 5‘-O- 다이메톡시트리틸 - N 2 - 이소부티릴 -P- 사이아노에틸포스포릴 -2'- O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 구아노실 -3'-O-[(N,N- 다이이소프로필아미노 ) 사이아노에톡시 포스피노 ](3'->5')- 2'-O- 터트 -부틸다이메틸실릴유리딘의 합성 (2f)
5‘-다이메톡시트리틸-N2-이소부티릴구아노신-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴- 3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]포스포라미다이트(5c, 3.48g, 3.59 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴유리딘(4a, 0.644 g, 1.8 mmol)을 무수 아세토니트릴 10 mL에 녹인 후, 검상태가 될 때까지 농축하였다. 5-벤질티오테트라졸(0.379 g, 7.18 mmol)을 20 mL의 아세토니트릴에 녹이고 이 용액을 결정이 생길 때까지 농축한 후 아세토니트릴 20 mL을 사용하여 위 두 용액을 합쳤다. 그런 다음, 상기 용액을 3 mL 정도가 될 때까지 농축한 후, 1.5시간이 경과한 다음 0℃로 냉각하고 22 mL의 (THF:피리딘:물 = 7:1:2)에 녹인 0.5 M 요오딘 용액을 가하였다. 이 용액을 상온에서 5분간 방치한 후 11 mL의 2 M Na2S2O3 수용액을 가하였다. 용액을 검상태가 될 때까지 농축한 후 잔사를 20 mL의 다이클로로메탄에 녹이고 수층을 다이클로로메탄 5 mL을 사용하여 3번 추출하였다. 유기층을 수집하여 0.1 M TEAB 수용액으로 3번(각 10 mL) 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조하였다. 용액을 농축한 후 톨루엔(2 x 10 mL)을 사용하여 증발시켜 남은 피리딘을 제거하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 녹인 후 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(1.126 g, 수율 50%). 31P NMR (DMSO), dppm : -0.52 , -0.68
실시예 7: 5‘-O- 다이메톡시트리틸 - N 2 - 이소부티릴 -P- 사이아노에틸포스포릴 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 구아노실 -3'-O-[(N,N- 다이이소프로필아미노 ) 사이아노에톡시 포스피노 ](3'->5')- N 4 - 벤조일 -2'-O-터트- 부틸다이메틸실릴아데닌의 합성 (2g)
5‘-다이메톡시트리틸-N2-이소부티릴구아노신-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴-3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]포스포라미다이트(5c, 2.8 g, 2.88 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-N4-벤조일-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴아데닌(4b, 0.7 g, 1.44 mmol)를 무수 아세토니트릴 10 mL에 녹인 후, 검상태가 될 때까지 농축하였다. 5-벤질티오테트라졸(1.075 g, 5.6 mmol)을 20 mL의 아세토니트릴에 녹이고 이 용액을 결정이 생길 때까지 농축한 후 아세토니트릴 20 mL을 사용하여 위 두 용액을 합쳤다. 그런 다음, 상기 용액을 3 mL 정도가 될 때까지 농축한 후, 1.5시간이 경과한 다음 0℃로 냉각하고 18 mL의 (THF:피리딘:물 = 7:1:2)에 녹인 0.5 M 요오딘 용액을 가하였다. 이 용액을 상온에서 5분간 방치한 후 9 mL의 2 M Na2S2O3 수용액을 가하였다. 용액을 검상태가 될 때까지 농축한 후 잔사를 20 mL의 다이클로로메탄에 녹이고 수층을 다이클로로메탄 5 mL을 사용하여 3번 추출하였다. 유기층을 수집하여 0.1 M TEAB 수용액으로 3번(각 10 mL) 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조하였다. 용액을 농축한 후 톨루엔(2 x 10 mL)을 사용하여 증발시켜 남은 피리딘을 제거하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 녹인 후 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(2.182 g, 수율 96%). 31P NMR (DMSO), dppm : -0.69, -0.81
실시예 Ⅲ: RNA 다이머 포스포라미다이트 합성
Figure 112007081204613-pat00014
RNA 다이뉴클레오타이드 포스포라미다이트 UU, CU, GU 및 GA (1a - 1d)
R1 = DMTr, R2 = TBDMS, R = 2-사이아노에틸. 1a - B1 = U, B2 = U, 1b - B1 = bzC, B2 = U, 1c - B1 = ibG, B2 = U, 1d - B1 = ibGU, B2 = bzA, 2d - B1 = U, B2 = U, 2e - B1 = bzC, B2 = U, 2f - B1 = ibG, B2 = U, 2g - B1 = ibG, B2 = bzA. 4a - B2 = U, 4b - B2 = bzA. 5a - B1 = U, 5b - B1 = bzC, 5c - B1 = ibG.
실시예 8: 5'-O- 다이메톡시트리틸 -P- 사이아노에틸포스포릴 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 유리딜 -3'-O-[(N,N-다 이이소프 로필아미노) 사이아노에톡시포시피노 ] (3'->5')-2'-O- 터트 - 부틸다이메틸실릴유리딘의 합성 (1a)
실시예 4번의 2d 화합물(0.503 g, 0.44 mmol)과 5-에틸티오테트라졸(0.074 g, 0.57 mmol)을 10 mL의 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 10 mL의 아세토니트릴을 넣고 반응 플라스크를 아르곤으로 충진한 후 bis-(다이이소프로필아미노)사이아노에톡시 포스핀(0.17 mL, 0.57 mmol)을 적가하였다. 반응액을 약 1 mL이 될 때까지 농축하고 2시간 방치한 후 완전히 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 10 mL에 녹인 후 포화 NaHCO3 수용액으로 포화시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3 수용액으로(5 x 20 mL)으로 세척하고 소듐 설페이트로 건조하였다. 반응액을 완전히 농축한 후 용액이 흐려질 때까지 물을 가하고 LiChroprep RP18 레진(머크)을 이용하여 정제하였다(0.4 g, 수율 70%). 31P NMR (DMSO), dppm : ~ 138.4 , ~ 148.9, ~ -1.03, ~ -0.73
실시예 9: 5'-O- 다이메톡시트리틸 - N 4 - 벤조일 -P- 사이아노에틸포스포릴 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 사이티딜 -3'-O-[(N,N- 다이이소프로필아미노 ) 사이아노에톡시포시피노 ] (3'->5')-2'-O- 터트 - 부틸다이메틸실릴유리딘의 합성 (1b)
실시예 5번의 2e 화합물(0.868 g, 0.70 mmol)과 5-에틸티오테트라졸(0.11 g, 0.84 mmol)을 10 mL의 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 10 mL의 아세토니트릴을 넣고 반응 플라스크를 아르곤으로 충진한 후 bis-(다이이소프로필아미노)사이아노에톡시 포스핀(0.17 mL, 0.57 mmol)을 적가하였다. 반응액을 약 1 mL이 될 때 까지 농축하고 4시간 방치한 후 완전히 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 10 mL에 녹인 후 포화 NaHCO3 수용액으로 포화시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3 수용액으로(5 x 20 mL)으로 세척하고 소듐 설페이트로 건조하였다. 반응액을 완전히 농축한 후 용액이 흐려질 때까지 물을 가하고 LiChroprep RP18 레진을 이용하여 정제하였다(0.58 g, 수율 60%). 31P NMR (DMSO), dppm : ~ 148.7 , ~ 143.9, ~ -1.18, ~ -0.77
실시예 10: 5'-O- 다이메톡시트리틸 - N 2 - 이소부티릴 -P- 사이아노에틸포스포릴 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 구아노실 -3'-O-[(N,N- 다이이소프로필아미노 ) 사이아노에톡시포시피노 ] (3'->5')-2'-O- 터트 - 부틸다이메틸실릴유리딘의 합성 (1c)
실시예 6번의 2f 화합물 (1.126 g, 0.09 mmol)과 5-에틸티오테트라졸(0.15 g, 1.17 mmol)을 10 mL의 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 10 mL의 아세토니트릴을 넣고 반응 플라스크를 아르곤으로 충진한 후 bis-(다이이소프로필아미노)사이아노에톡시 포스핀(0.35 mL, 1.17 mmol)을 적가하였다. 반응액을 약 1 mL이 될 때까지 농축하고 4시간 방치한 후 완전히 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 10 mL에 녹인 후 포화 NaHCO3 수용액으로 포화시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3 수용액으로(5 x 20 mL)으로 세척하고 소듐 설페이트로 건조하였다. 반응액을 완전히 농축한 후 용액이 흐려질 때까지 물을 가하고 LiChroprep RP18 레진을 이용하여 정제 하였다(0.75 g, 수율 57%). 31P NMR (DMSO), dppm : ~ 150, ~ 148.9, ~ -0.66, ~ -0.49
실시예 11: 5'-O- 다이메톡시트리틸 - N 2 - 이소부티릴 -P- 사이아노에틸포스포릴 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 구아노실 -3'-O-[(N,N- 다이이소프로필아미노 ) 사이아노에톡시포시피노 ] (3'->5')- N 4 - 벤조일 -2'-O-터트- 부틸다이메틸실릴아데닌의 합성 (1d)
실시예 7번의 2g 화합물 (1.5 g, 1.09 mmol)과 5-에틸티오테트라졸(0.18 g, 1.42 mmol)을 10 mL의 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 10 mL의 아세토니트릴을 넣고 반응 플라스크를 아르곤으로 충진한 후 bis-(다이이소프로필아미노)사이아노에톡시 포스핀(0.43 mL, 1.42 mmol)을 적가하였다. 반응액을 약 1 mL이 될 때까지 농축하고 4시간 방치한 후 완전히 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 10 mL에 녹인 후 포화 NaHCO3 수용액으로 포화시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3 수용액으로(5 x 20 mL)으로 세척하고 소듐 설페이트로 건조하였다. 반응액을 완전히 농축한 후 용액이 흐려질 때까지 물을 가하고 LiChroprep RP18 레진을 이용하여 정제하였다(1.081 g, 수율 63%). 31P NMR (DMSO), dppm : ~ 150 , ~ 148.8, ~ -0.63, ~ -0.41
실시예 Ⅳ: RNA 트리뉴클레오타이드의 합성
Figure 112007081204613-pat00015
RNA 트리뉴클레오타이드의 합성 UGpA (6a) 및 CGpA (6b)
R1 = o-클로로페닐, R2 = TBDMS. 6a - B1 = U, 6b - B1 = bzC
실시예 12: 5'-O- 다이메톡시트리틸 - N 2 - 이소부티릴 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 유리딘 -3'-일 클로로페닐포스페이트 -5'-일 N 2 - 이소부티릴구아노신 -3'-일 N 4 - 벤조일 -2'-O- 터트 - 부틸다이메틸실릴아데닌 -5'-일 사이아노에틸포스페이트(6a)의 합성
단계1 : N 2 - 이소부티릴 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 구아노신 -3'-일 클로로페닐 포스페이트 -5'-일 N 4 -벤조일-2'-O- 터트 - 부틸다이메틸실릴아데닌 (2h)의 합성
4% 벤젠술폰산 9 mL을 다이클로로메탄:메탄올(7:3) 용액을 사용하여 제조한 후 0℃로 냉각하였다. 이 용액을 다이클로로메탄:메탄올(7:3) 용액 9 mL에 녹인 화합물 2c(1.265 g, 0.88 mmol)에 가하고 0℃에서 3분간 방치하였다. 포화 NaHCO3 수용액 25 mL을 가한 후 유기층을 다시 포화 NaHCO3 수용액으로 세척한 뒤 유기층을 소듐 설페이트로 건조시키고 농축하였다. 목표화합물은 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(0.62 g, 수율 63%).
단계 2: 5'-O- 다이메톡시트리틸 - N 2 - 이소부티릴 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 유리딘 -3'-일 클로로페닐포스페이트 -5'-일 N 2 - 이소부티릴구아노신 -3'-일 N 4 - 벤조일 -2'-O- 터트 - 부틸다이메틸실릴아데닌 -5'-일 사이아노에틸포스페이트(6a)의 합성
U 포스포라미다이트(5a, 0.335 g, 0.39 mmol)과 위 단계 1의 화합물(2h, 0.292 g, 0.26 mmol)을 무수 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 반응 플라스크를 아르곤가스로 채우고 무수 아세토니트릴을 1 0mL을 가하였다. 5-벤질티오테트라졸(0.15 g, 0.78 mmol)을 무수 아세토니트릴 10 mL에 녹인 후 결정이 생길 때까지 농축한 후 뉴클레오사이드 용액에 가하였다. 반응액을 약 3 mL이 될 때까지 농축한 후 2시간 방치하였다. 반응액을 0℃로 냉각하고 2.4 mL의 (THF:피리딘:물 =7:1:2)에 녹인 0.5M 요오딘 용액을 가하였다. 이 용액을 상온에서 5분간 방치한 후 1.2 mL의 2 M Na2S2O3 수용액을 가하였다. 용액을 검상태가 될 때까지 농축한 후 잔사를 20 mL의 다이클로로메탄에 녹이고 유기층을 0.1 M TEAB 수용액 세척한 후 수층을 다이클로로메탄 5 mL을 사용하여 3번 추출하였다. 유기층을 모아 0.1 M TEAB 수용액으로 3번 (각 10 mL) 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조하였다. 용액을 농축한 후 톨루엔 (2 x 10 mL)을 사용하여 증발시켜 남은 피리딘을 제거하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 녹인 후 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(0.413 g, 수율 84%). 31P NMR (DMSO), dppm : -6.3, -1.4
실시예 13: 5'-O- 다이메톡시트리틸 - N 4 - 벤조일 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 사이티딘 -3'-일 클로로페닐포스페이트 -5'-일 N 4 - 이소부티릴구아노신 -3'-일 N 4 - 벤조일 -2'-O- 터트 - 부틸다이메틸실릴아데닌 -5'-일 사이아노에틸포스페이트의 합성(6b)
rC 포르포라미다이트(5b, 0.409 g, 0.42 mmol)과 실시예 12번의 단계 1의 화합물 (2h, 0.238 g, 0.21 mmol)을 무수 아세토니트릴에 녹인 후 농축시켰다. 반응 플라스크를 아르곤가스로 채우고 무수 아세토니트릴을 10mL을 가하였다. 5-벤질티오테트라졸(0.123 g, 0.64 mmol)을 무수 아세토니트릴 10 mL에 녹인 후 결정이 생길 때까지 농축한 후 뉴클레오사이드 용액에 가하였다. 반응액을 약 3 mL이 될 때까지 농축한 후 3시간 방치하였다. 반응액을 0℃로 냉각하고 2.6 mL의 (THF:피리 딘:물=7:1:2)에 녹인 0.5 M 요오딘 용액을 가하였다. 이 용액을 상온에서 5분간 방치한 후 1.3 mL의 2 M Na2S2O3 수용액을 가하였다. 용액을 검상태가 될 때까지 농축한 후 잔사를 20 mL의 다이클로로메탄에 녹이고 유기층을 0.1 M TEAB 수용액 세척한 후 수층을 다이클로로메탄 5 mL을 사용하여 3번 추출하였다. 유기층을 모아 0.1 M TEAB 수용액으로 3번 (각 10 mL) 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조하였다. 용액을 농축한 후 톨루엔 (2 x 10 mL)을 사용하여 증발시켜 남은 피리딘을 제거하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 녹인 후 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(0.298 g, 수율 71%). 31P NMR (DMSO), dppm : -6.3, -1.2
실시예 Ⅴ: RNA 트라이머 포스포라미다이트의 합성
Figure 112007081204613-pat00016
RNA 트라이머 포스포라미다이트의 합성(7a, 7b).
R1 = o-클로로페닐, R2 = 2-사이아노에틸, R3 = TBDMS. 6a, 7a - B1=U, 6b, 7b - B1=bzC
실시예 14: 5'-O- 다이메톡시트리틸 -2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 유리딘 -3'-일 클로로페닐포스페이트 -5'-일 N 2 - 이소부티릴구아노신 -3'-일 N 4 - 벤조일 -2'-O- 터트 - 부틸다이메틸실릴아데닌 -5'-일 사이아노에틸포스페이트 -3-O-(2- 사이아노에틸 )-N,N- 다이이소 프로필포스포라미다이트의 합성 (7a)
실시예 12번의 6a 화합물 (0.41g, 0.21mmol)과 5-에틸티오테트라졸(0.037g, 0.57mmol)을 10 mL의 무수 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 10 mL의 무수 아 세토니트릴을 넣고 반응플라스크를 아르곤으로 충진한 후 bis-(다이이소프로필아미노)사이아노에톡시 포스핀 (0.084mL, 0.28mmol)을 적가하였다. 반응액을 약 1 mL이 될 때까지 농축하고 4시간 방치한 후 완전히 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 10 mL에 녹인 후 포화 NaHCO3 수용액으로 포화시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3 수용액으로 (5 x 20 mL)으로 세척하고 소듐 설페이트로 건조하였다. 반응액을 완전히 농축한 후 용액이 흐려질 때까지 물을 가하고 LiChroprep RP18 레진을 이용하여 정제하였다(0.319g, 수율 72%). 31P NMR (DMSO), dppm : ~ 150.2 , ~ 148.9, ~ -6, ~ -1.4
실시예 15: 5'-O- 다이메톡시트리틸 - N 4 - 벤조일 2'-O-( 터트 - 부틸다이메틸실릴 ) 사이티딘 -3'-일 클로로페닐포스페이트 -5'-일 N 4 - 이소부티릴구아노신 -3'-일 N 4 - 벤조일 -2'-O- 터트 - 부틸다이메틸실릴아데닌 -5'-일 사이아노에틸포스페이트 -3-O-(2- 사이아노에틸 )-N,N- 다이이소 프로필포스포라미다이트의 합성 (7b)
실시예 13번의 6b 화합물 (0.298g, 0.15mmol)과 5-에틸티오테트라졸(0.025g, 0.20mmol)을 10 mL의 무수 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 10 mL의 무수 아세토니트릴을 넣고 반응플라스크를 아르곤으로 충진한 후 bis-(다이이소프로필아미노)사이아노에톡시 포스핀(0.06mL, 0.20mmol)을 적가하였다. 반응액을 약 1 mL이 될 때까지 농축하고 4시간 방치한 후 완전히 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 10 mL에 녹인 후 포화 NaHCO3 수용액으로 포화시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3 수용액으로 (5 x 20 mL)으로 세척하고 소듐 설페이트로 건조하였다. 반응액을 완전히 농축한 후 용액이 흐려질 때까지 물을 가하고 LiChroprep RP18 레진을 이용하여 정제하였다(0.180 g, 수율 60%). 31P NMR (DMSO), dppm : ~ 150.2 , ~ 148.9, ~ -6, ~ -1.0
실시예 VI : RNA 다이머 포스포아미다이트를 이용한 siRNA 의 합성
모든 siRNA를 Polygen DNA/RNA 합성기(Polygen 사)를 이용하여 0.8 μmole 스케일로 트리틸-오프(trityl-off) 상태로 합성하였다. 3‘-말단은 RNA CPG를 사용하였다. RNA CPG는 30 μmole/g loading (Glen Research사에서 구입)을 사용하고 그리고 각 모노머 염기로는 rAtac, rCtac, rGtac 및 U 포스포라미다이트(Proligo 사에서 구입)를 사용하였다. 모노머 및 다이머 포스포라미다이트는 아세토니트릴에 녹인 0.05 M 용액을 사용하였다. 모노머 및 다이머 당량은 한 사이클당 모두 각 2.5 당량을 사용하였다. 활성자는 0.5 M 5-에틸티오테트라졸 (in 아세토니트릴)을 이용하였다. 고체지지물과 보호기는 암모니아수:에탄올(3:1)의 혼합물을 사용하여 65℃에서 2시간 가열하여 분리한 후 이 용액을 동결 건조하였다. 잔사를 0.4 mL의 [N-메틸피리돈:트리에틸아민:트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드] (6:3:4) 용액에 녹이고 65℃에서 2시간 가열하였다. 4 mL의 n-부틸알코올을 가하 고 냉동고에서 2시간 냉각시킨 후 원심분리하여 고체의 siRNA를 얻어 이를 동결건조 시켰다. 크루드 siRNA의 수율을 UV 스펙트로포토미터를 사용하여 260 nm에서 정량하고 순도는 역상 HPLC를 이용하여 분석하였다. 농도 계산을 위한 자연 리보뉴클레오타이드의 흡광 계수는 다음과 같다: rA, 15400: rC, 7200: U, 9900: rG, 11500. siRNA의 분자량은 MALDI-TOF (Bruker, Autoflex)를 이용한 질량 분석을 통하여 확인되었다.
실시예 16: GU RNA 다이머를 이용한 GFP - sense siRNA 의 합성
GFP-sense siRNA의 서열은 5'-GUU CAG CGU GUC CGG CGA GUU-3' 이다. 합성은 실시예 15번의 방법으로 실시되었고 다이머 GU 및 모노머의 축합시간은 모두 10분을 사용하였다. 첫 번째 축합반응에 이용되는 다이머 GU이고 이후 모노머를 결합시켰다. 순도는 역상크로마토그래피를 이용하여 측정하였으며 분석기는 Agilent 1100 시스템을 사용하였다. 크로마토그래피의 버퍼는 100 mM TEAA, pH 7.0과 아세토니트릴을 혼합하여 사용하였으며 순도 및 수율은 모노머를 사용한 GFP-sense siRNA와 비교하였다. 결과는 아래 표 1에 서술되어 있다.
첫번째 리보뉴클레오타이드 siRNA 순도
모노머 52%
다이머 73%
실시예 17: CU RNA 다이머를 이용한 GFP - antisense siRNA 의 합성
GFP-antisense siRNA의 서열은 5'-CUC GCC GGA CAC GCU GAA CUU-3' 이다. 합성은 실시예 15번의 방법으로 실시되었고 다이머 CU 및 모노머의 축합시간은 모두 10분을 사용하였다. 첫 번째 축합반응에 이용되는 다이머 CU이고 이후 모노머를 결합시켰다. 순도는 역상크로마토그래피를 이용하여 측정하였으며 분석기는 Agilent 1100 시스템을 사용하였다. 크로마토그래피의 버퍼는 100 mM TEAA, pH 7.0과 아세토니트릴을 혼합하여 사용하였으며 순도 및 수율은 모노머를 사용한 GFP-antisense siRNA와 비교하였다. 결과는 아래 표 2에 서술되어 있다.
첫번째 리보뉴클레오타이드 siRNA 순도
모노머 63%
다이머 78%
실시예 18: UU RNA 다이머를 이용한 JNK - antisense siRNA 의 합성
JNK-antisense siRNA의 서열은 5'-AGA AGG UAG GAC AUU CUU UUU-3' 이다. 합성은 실시예 15번의 방법으로 실시되었고 다이머 UU 및 모노머의 축합시간은 모두 10분을 사용하였다. 첫 번째 축합반응에 이용되는 다이머 UU이고 이후 모노머를 결합시켰다. 순도는 역상크로마토그래피를 이용하여 측정하였으며 분석기는 Agilent 1100 시스템을 사용하였다. 크로마토그래피의 버퍼는 100 mM TEAA, pH 7.0과 아세토니트릴을 혼합하여 사용하였으며 순도 및 수율은 모노머를 사용한 JNK-antisense siRNA와 비교하였다. 결과는 아래 표 3에 서술되어 있다.
첫번째 리보뉴클레오타이드 siRNA 순도
모노머 71%
다이머 88%
실시예 19: GA RNA 다이머를 이용한 SEI - sense siRNA 의 합성
SEI-sense siRNA의 서열은 5'-GCA AGG GUC UGA AGC GGA A-3' 이다.합성은 실시예 15번의 방법으로 실시되었고 모노머의 축합시간은 10분을 사용하고 다이머 GA의 축합시간은 15분을 사용하였다. 첫 번째 축합반응에 이용되는 다이머 GA이고 이후 모노머를 결합시켰다. 순도는 역상크로마토그래피를 이용하여 측정하였으며 분석기는 Agilent 1100 시스템을 사용하였다. 크로마토그래피의 버퍼는 100 mM TEAA, pH 7.0과 아세토니트릴을 혼합하여 사용하였으며 순도 및 수율은 모노머를 사용한 SEI-sense siRNA와 비교하였다. 결과는 아래 표 4에 서술되어 있다.
첫번째 리보뉴클레오타이드 siRNA 순도
모노머 65%
다이머 78%
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 다음의 단계를 포함하는 올리고리보뉴클레오타이드[r(NMP)n]의 제조방법:
    (a) 고상 지치체-리보뉴클레오사이드[SS-(rNS)1]에 리보뉴클레오타이드 다이머[(rNMP)2] 또는 리보뉴클레오타이드 트라이머[(rNMP)3]를 커플링시켜 SS-(rNS)1-(rNMP)2 또는 SS-(rNS)1-(rNMP)3를 제조하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 연속적으로 리보뉴클레오타이드 모노머를 커플링시켜 SS-(rNS)1-(rNMP)2-(rNMP)n-3 또는 SS-(rNS)1-(rNMP)3-(rNMP)n-4를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 SS-(rNS)1-(rNMP)2-(rNMP)n-3 또는 SS-(rNS)1-(rNMP)3-(rNMP)n-4 로부터 고상 지지체(SS)를 제거하여 [r(NMP)n]를 얻는 단계.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 리보뉴클레오타이드는 포스포다이에스테르, 포스포라미데이트, 알킬포스포라미데이트, 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 알킬포스포트리에스테르, 또는 알킬포스포노티오에이트 결합을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 리보뉴클레오타이드 다이머는 하기 화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 단계를 포함하는 반응에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 방법:
    화학식 1
    Figure 112008084943550-pat00017
    화학식 2
    Figure 112008084943550-pat00018
    상기 화학식 1 및 2에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고,
    상기 보호기 R1 및 R4는 서로 독립적으로 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 또는 픽실(9-phenyl xanthen-9-yl)이고,
    상기 보호기 R2 및 R5는 서로 독립적으로 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), 또는 NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl)이고,
    상기 보호기 R3는 할로페닐 또는 카르보벤족실기이며,
    B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 리보뉴클레오타이드 다이머는 하기 화학식 3의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 단계를 포함하는 반응에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 방법:
    화학식 3
    Figure 112008084943550-pat00019
    화학식 2
    Figure 112008084943550-pat00020
    상기 화학식 2 및 3에서, R1, R2, R4 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고,
    상기 보호기 R1 및 R4는 서로 독립적으로 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 또는 픽실 (9-phenyl xanthen-9-yl)이고,
    상기 보호기 R2 및 R5는 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), 또는 NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl)이고,
    R31은 2-사이아노에틸, 메틸, 메톡시, 4-사이아노-2-부테닐 또는 디페닐메틸실릴에틸기이며, R32 디알킬아미노이고,
    B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 리보뉴클레오타이드 트라이머는 다음의 단계를 포함하는 반응에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 다음 화학식 4의 리보뉴클레오타이드 다이머에서 R1기를 제거하는 단계; 및
    화학식 4
    Figure 112008084943550-pat00021
    상기 화학식 4에서 R1, R2, R3 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고,
    상기 보호기 R1은 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸 또는 픽실 (9-phenyl xanthen-9-yl)이고,
    R2 및 R5는 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl) 또는 NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl)이고,
    R3는 수소, 할로페닐 또는 카르보벤족실기이며,
    B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다;
    (ⅱ) 단계 (i)의 결과물과 리보뉴클레오사이드 3‘-포스포라미다이트를 커플링시켜 리보뉴클레오타이드 트라이머를 제조하는 단계.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 리보뉴클레오타이드 모노머는 리보뉴클레오사이드 포스포라미다이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 활성제(activator)로서 1-메틸이미다졸의 존재 하에서 하기 화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 단계를 포함하는 리보뉴클레오타이드 다이머의 제조방법:
    화학식 1
    Figure 112008084943550-pat00026
    화학식 2
    Figure 112008084943550-pat00027
    상기 화학식 1 및 2에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고,
    상기 보호기 R1 및 R4는 서로 독립적으로 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 또는 픽실(9-phenyl xanthen-9-yl)이고,
    상기 보호기 R2 및 R5는 서로 독립적으로 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), 또는 NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl)이고,
    상기 보호기 R3는 할로페닐 또는 카르보벤족실기이며,
    B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 제조되는 올리고리보뉴클레오타이드[r(NMP)n]는 2'-할로겐 리보뉴클레오타이드, 2'-아미노 리보뉴클레오타이드 및 2'-O-알킬 리보뉴클레오타이드 중 하나 이상의 당 변형된 리보뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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