KR20030081303A - 올리고뉴클레오티드 합성용 신톤 - Google Patents

올리고뉴클레오티드 합성용 신톤 Download PDF

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KR20030081303A
KR20030081303A KR10-2003-7003308A KR20037003308A KR20030081303A KR 20030081303 A KR20030081303 A KR 20030081303A KR 20037003308 A KR20037003308 A KR 20037003308A KR 20030081303 A KR20030081303 A KR 20030081303A
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KR10-2003-7003308A
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난다 신하
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아베시아 바이오테크놀러지, 아이엔씨.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

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Abstract

본 발명은 포스포라미디트 화합물, 특히 3가 포스포러스 다량체, 올리고뉴클레오티드 제조에 3가 포스포러스 다량체를 사용하는 방법 및 3가 포스포러스 다량체의 제조 방법에 관한다. 또한, 본 발명은 3가 포스포러스 다량체와 유도되는 고체 보조체 및 이의 제조 방법에 관한다.

Description

올리고뉴클레오티드 합성용 신톤{SYNTHONS FOR OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS}
발명의 배경
합성 올리고뉴클레오티드는 유전병 및 바이러스성 질병 검사를 위한 진단 영역에서 중요하다. 또한, 안티센스 및 관련된 치료에 사용되는 올리고뉴클레오티드의 대규모 합성은, 사이토메갈로바이러스(CMV) 치료용 올리고뉴클레오티드 유사체를 FDA 가 인증하였기 때문에, 점점 더 중요해지고 있으며, 다른 몇몇 올리고뉴클레오티드 유사체는 현재 임상 실험 중이다. 킬로그램 단위인 상당한 양의 정제된 올리고뉴클레오티드 유사체가 각 임상 실험에서 필요하다.
포스포로티오에이트 결합 또는 포스포로티오에이트와 포스페이트 디에스테르 결합의 조합(키메라 올리고뉴클레오티드:chimeric oligonucleotide)과 같은, 뉴클레오티드 사이의 개질된 결합을 함유하고 있는 올리고뉴클레오티드 유사체는 신체 내에서 더 잘 분해되지 않기(resistant to degradation) 때문에, 안티센스에 사용하는 경우 포스페이트 디에스테르 결합만이 있는 올리고뉴클레오티드보다 유용하다는 것이 밝혀졌다. 통상적으로, 올리고뉴클레오티드 유사체는 목적하는 서열이 완성될 때까지 각 뉴클레오티드 단량체를 한꺼번에 첨가하여 합성된다. 각각의 뉴클레오티드 첨가에 있어서, 최소한 3 개의 반응 단계{커플링(coupling) 단계, 산화 및 황화 단계 및 5'-디프로텍팅(5'-deprotection) 단계}를 갖는 주기(cycle)가 요구된다. 통상적으로 캡핑(capping) 단계 또한 산화 및 황화 단계 이후에 수행된다. 따라서, 21 개의 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드 합성에는 20 개의 주기 또는 60-80 개의 반응(캡핑 단계가 각 주기에서 수행되는지 여부에 따라 다름)이 필요하다. 각 반응 단계에 있어서의 수율은 통상적으로 100 % 이하이므로, 양호한 수율로 긴 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것은 어려우며, 현재 기술로 약 150 개 이상의 뉴클레오티드 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것이 불가능하지는 않지만 매우 어렵다. 또한, 다수의 반응 단계에서 다량의 시약이 사용되므로, 합성은 더욱 고가가 된다. 양호한 수율로 더 긴 올리고뉴클레오티드를 얻고 및/또는 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 시약 비용을 감소시키려면, 올리고뉴클레오티드 합성에 필요한 반응 단계의 수를 감소시키는 것이 바람직할 것이다.
더 긴 합성 올리고뉴클레오티드의 수율 및 사용가능성을 증대시키기 위하여, 이량체(dimer) 또는 삼량체(trimer)의 사용이 제안되어 왔다. 그러나, 현재까지 사용된 이량체 및 삼량체는 산화되어서 포스페이트 디에스테르를 형성되었거나 또는 황화되어서 포스포로티오에이트가 형성되어 있는 포스포러스(인:phosphorus)결합을 갖고 있다. 따라서, 이러한 빌딩 블록(building block)은, 포스페이트 디에스테르, 포스포로티오에이트 주쇄(backbone) 또는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트의 주쇄 조합이 있는 올리고뉴클레오티드를 형성에 사용되는 단량체(monomer) 빌딩 블록만큼 유용한 것은 아니다.
합성 후, 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 합성동안 생성된 불순물로부터 분리된다. 통상적으로, 이러한 불순물은 시약, 반응 부산물 및 실패 서열(failuresequences)로 이루어진다. 실패 서열은 하나 이상의 커플링 단계가 성공하지 못한 올리고뉴클레오티드로서, 이러한 실패 서열은 목적하는 길이보다 하나 이상의 뉴클레오티드 정도가 짧다. 실패 서열은 일반적으로 이온-교환 크로마토그래피로 제거된다. 그러나, 목적한 길이보다 단지 하나의 뉴클레오티드만 짧은 실패 서열(즉, N-1 형)의 구조는 바람직한 생성물의 구조와 유사하여, 이러한 실패 서열의 크로마토그래피에서의 이동도는 생성물 올리고뉴클레오티드의 이동도와 유사하므로, 이들을 분리하기 어렵다. N-2 및 N-3 실패 서열은 이들이 생성물 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 상이한 크로마토그래피 이동도를 갖기에 충분할 정도로 생성물 뉴클레오티드와 구조적으로 상이하므로, 바람직한 생성물로부터 훨씬 용이하게 분리된다. 따라서, 바람직한 올리고뉴클레오티드의 수율과 순도를 개선시키기 위하여는 N-1 실패 서열이 생성되지 않는 합성 방법이 바람직하다.
올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 치료에 필요한 정도로 다량 및 양질로 생성하기 위하여, 이의 합성을 개선시키는 것은 필수적이다. 또한, 유용한 수율로 더 긴 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있어야 치료 및 재조합 응용에 있어서의 이들의 용도를 확장시킬 수 있다.
발명의 개요
본 발명은 3가 포스포러스 다량체(trivalent phosphorus multimer), 올리고뉴클레오티드 제조에 3가 포스포러스 다량체를 사용하는 방법 및 3가 포스포러스 다량체의 제조 방법에 관한다. 또한, 본 발명은 3가 포스포러스 다량체와 함께 유도되는(derivatized) 고체 보조체(solid support) 및 이의 제조 방법에도 관한다.
본 발명의 제 1 양상에 있어서, 하나 이상의 인터뉴클레오시드 포스포러스 원자(internucleoside phosphorus atom)와 결합되어 있는 2 이상의 뉴클레오시드 부분(nucleoside moieties)을 포함하고 있는 포스포라미디트(phosphoramidite) 화합물이 제공되는데, 상기 인터뉴클레오시드 포스포러스 원자는 포스포러스(III) 원자이다.
포스포라미디트 화합물은 포스포라미디트 부분을 갖고 있을 수 있는 5'-위치 또는 바람직하게는 3'-위치의 뉴클레오시드 부분에 결합될 수 있는, 포스포라미디트 부분을 포함한다. 포스포라미디트 부분은 바람직하게는 식 -X1-PR3NR4R5[식 중, R3, R4및 R5은 이하 기재된 바와 동일함] 그룹이다.
뉴클레오시드 부분은 d-뉴클레오시드 또는 l-뉴클레오시드일 수 있으나, 많은 구체예의 경우 d-뉴클레오시드이다. 뉴클레오시드는 염기성이 아닐(abasic)수 있으나, 많은 구체예의 경우 핵염기(nucleobase)를 포함한다. 통상적으로, 핵염기는 업계에 공지되어 있는 적당한 프로텍팅 그룹(protecting group)으로 프로텍팅된다.
인터뉴클레오시드 포스포러스(III) 원자는 바람직하게는 포스파이트 트리에스테르 그룹을 포함한다. 다수의 구체예에 있어서, 포스파이트 트리에스테르 그룹은 포스포라미디트 부분을 갖고 있는 뉴클레오시드 부분의 5'-위치를 두 번째 뉴클레오시드 부분의 3'-위치에 결합시킨다. 더욱 바람직하게는, 포스파이트 트리에스테르 그룹은 베타-시아노에틸옥시 또는 베타-시아노에틸티오 부분을 포함한다.
제 2 의 양상에 있어서, 하기 구조식 I 또는 이의 입체 이성질체로 나타낼 수 있는 3가 포스포러스 다량체가 제공된다 :
상기 구조식 I 중, 각각의 X1는 독립적으로, -O- 또는 -S-이다. 각각의 X2는 독립적으로, -O-, -S- 또는 -NR-이다. 각각의 X3는 독립적으로, -O-, -S-, -CH2- 또는 -(CH2)2- 이다. 바람직한 구체예에서, 각각의 X1, X2및 X3은 -O- 이다. R1은 프로텍팅 그룹으로서, 바람직하게는 산성의 불안정한 프로텍팅 그룹 또는t-부틸디메틸실릴 또는 트리이소프로필실릴과 같은 트리알킬실릴 그룹이다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, R1은 치환된 또는 치환되지 않은 트리틸, 9-(페닐-)크산테닐(이하, "픽실(pixyl)") 또는 테트라하이드로피라닐(이하, "THP")이다. 더욱 더 바람직한 구체예에 있어서, R1은 치환되지 않은 트리틸, 모노알콕시트리틸, 디알콕시트리틸, 트리알콕시트리틸, THP 또는 픽실이다. 가장 바람직하게, R1은 4,4'-디메톡시트리틸이다. 각각의 R2은 독립적으로, -H, -F, -NHR6, -CH2R6또는 -OR6이다. 각각의 R3은 독립적으로, -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹 또는 식 -OR7또는 -SR7의 그룹이다. 바람직하게, 각각의 R3은 독립적으로, -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, 4-시아노부트-2-에닐티오, 4-시아노부트-2-에닐옥시, 알릴티오, 알릴옥시, 크로틸티오 또는 크로틸옥시이다. R4또는 R5은 각각 독립적으로, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬 그룹이거나 ; 또는 R4및 R5은 이들이 결합되어 있는 질소와 함께 헤테로사이클로알킬 그룹 또는 헤테로방향족(heteroaromatic) 그룹을 형성하는데, 이 때 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로방향족 그룹은 바람직하게는 5 또는 6 원 고리이다. 바람직하게, 각각의 R4및 R5는 이소프로필 그룹이다. R 은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹 또는 아민 프로텍팅그룹이다. R6은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬 또는 알콜 프로텍팅 그룹(예를 들면,t-부틸디메틸실릴) 또는 아민 프로텍팅 그룹과 같은 프로텍팅 그룹이다. R7은 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬 그룹, THP, 4-메톡시테트라하이드로피라닐 또는 2 -플루오로페닐-메톡시피페리딘-4-일이다. 특정예에서 있어서, R7은o-클로로페닐 또는p-클로로페닐이다. 각각의 B 는 독립적으로, 프로텍팅된 또는 프로텍팅되지 않은 뉴클레오시드 염기이거나 또는 하나 이상의 염기가 아닌 부분이 존재하는 경우에는 H 이다. n 은 0 또는 양의 정수이다. 본 발명의 3가 포스포러스 다량체가 고체 보조체 상의 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 경우, n 은 바람직하게는 0 내지 2 이다. 3가 포스포러스 다량체가 용액 내 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 경우, 바람직하게 n 은 0 내지 10 이다. 혹종의 구체예에 있어서, R2은 C-알릴 그룹이다. 가장 바람직하게 R2은 H, O 또는 OCH2CH2OMe 이다.
제 1 의 구체예에 있어서, 3가 포스포러스 다량체는 하기 구조식 II 또는 이의 입체 이성질체로 나타낼 수 있다 :
상기 구조식 II 중, B 및 R2은 상기 구조식 I 에 대하여 정의된 바와 동일하다. R8은 치환된 또는 치환되지 않은 트리틸(이를 테면, 4,4'-디메톡시트리틸)이다. R10및 R11은 각각 독립적으로 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹이다. 바람직하게, 각각의 R10및 R11은 이소프로필 그룹이다. m 은 0 또는 1 이다.
구조식 I 의 3가 포스포러스 다량체는 하기 구조식 III 또는 이의 입체 이성질체인 올리고뉴클레오티드 제조에 사용될 수 있다:
상기 구조식 III 중, X1, X2, X3, R2, R3및 B 는 구조식 I 에서 정의된 바와 동일하다. 각각의 X4는 독립적으로, =O 또는 =S 이다. R13은 하이드록실 프로텍팅 그룹, 티올 프로텍팅 그룹, 아민 프로텍팅 그룹, 식 -Y2-L-Y1의 그룹, 고체 보조체 또는 식 -Y2-L-Y2-R15의 그룹이다. Y1는 아민, 티올 또는 하이드록실 그룹과 반응할 수 있는 관능 그룹(funtional group)이다. 바람직하게, Y1는 에스테르 또는 카르복실산 그룹이다. 각각의 Y2는 독립적으로, 단일 결합, -C(O), -C(O)NR17-, -C(O)O-, -NR17- 또는 -O-이다. L 은 바람직하게는 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹 또는 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹인 링커(linker)이다. 더욱바람직하게, L 은 에틸렌 그룹이다. R17은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹 또는 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹이다. R15은 조절된-세공 (controlled-pore) 유리, 폴리스티렌, 미세공 폴리아미드(이를 테면, 폴리디메틸아크릴아미드), 폴리에틸렌 글리콜로 코팅된 폴리스티렌 및 폴리스티렌 상에 지지된 폴리에틸렌 글리콜(이를 테면, Tentagel이라는 상표명으로 시판되는 고체 보조체)과 같은, 고체 상 올리고뉴클레오티드 합성에 적합한 고체 보조체이다. R14는 -H 또는 프로텍팅 그룹이다. 바람직하게, R14가 프로텍팅 그룹일 경우, 이는 산성의 불안정한 프로텍팅 그룹,t-부틸디메틸실릴 또는 트리이소프로필실릴이다. p 는 양의 정수이다. 어떤 구체예에서, 3가 포스포러스 다량체로 합성된 올리고뉴클레오티드는 포스페이트이고, 따라서 포스페이트 결합만 갖는다(즉, 각각의 인터뉴클레오티드 포스포러스는 단지 산소에만 결합됨). 기타 구체예에 있어서, 합성된 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트이고, 따라서 포스포로티오에이트 결합만을 갖는다(즉, 각각의 인터뉴클레오티드 포스포러스는 하나 이상의 S, 바람직하게는 하나의 S 에만 결합됨). 다른 구체예에 있어서, 합성된 올리고뉴클레오티드는 포스페이트와 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합을 모두 포함하고 있는 키메라 올리고뉴클레오티드이다.
구조식 III 의 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법 중, 구조식 I 의 3가 포스포러스 다량체는 하기 구조식 IV 또는 이의 입체 이성질체인 5'-디프로텍팅된(5'-deprotected) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드와 커플링된다:
상기 구조식 IV 중, X1, X2, X3, X4, R2, R3, R13및 B 는 상기 정의되는 바와 동일하다. X5는 -OH 또는 -SH 이다. q 는 0 또는 양의 정수이다. 커플링 반응으로하기 구조식 V 또는 이의 입체 이성질체인 제 1 중간체가 형성된다 :
상기 구조식 V 중, X1, X2, X3, X4, R1, R2, R3, R13, B, n 및 q 는 상기 정의된 바와 동일하다. 제 1 중간체의 3가 포스포러스 그룹은 이후 산화 또는 황화되어하기 구조식 IV 또는 이의 입체 이성질체인 제 2 중간체를 형성한다 :
상기 구조식 VI 중, R1, R2, R3, R13, X1, X2, X3, X4, B 및 q 는 상기 정의된 바와 동일하다. 반응 혼합물 내에 남아 있는 상기 구조식 IV 의 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 선택적으로 시약으로 처리하여, 처리되지 않은 X5그룹을 캐핑시킬 수 있다. 제 2 중간체를 이후 R1이 제거되도록 처리한다. R1이 산성의 불안정한 프로텍팅 그룹일 경우, 제 2 중간체를 산으로 처리하여 R1을 제거한다. R1이 트리알킬실릴 그룹(이를 테면,t-부틸디메틸실릴 그룹 또는 트리이소프로필실릴 그룹)인 경우, 제 2 중간체를 플루오라이드 이온으로 처리하여 R1을 제거한다. 통상적으로,t-부틸디메틸실릴 및 트리이소프로필실릴을 THF 내 테트라부틸암모늄 플루오라이드 용액으로 처리하여 제거한다.t-부틸디메틸실릴 제거 방법은Greene 등 저Protective Groups in Organic Synthesis(1991), John Wiley & Sons, Inc.의 77-83 면에서 알 수 있으며, 이의 내용은 이하 본 문헌에 전체적으로 합체되어 있다. 상기 반응 단계 또는 반응 주기를 1 회 이상 반복하여, 목적하는 길이의 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 5'-말단 그룹이 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 생성물을 얻는 것이 바람직한 경우, 캡핑 단계가 수행된다면, 반응 주기의 최종 단계는 캡핑 단계일 수 있거나, 또는 캡핑 단계가 수행되지 않는다면, 반응의 최종 단계는 산화 또는 황화 단계일 수 있다. 이와는 별개로, 5'-프로텍팅 그룹이 없는 올리고뉴클레오티드를 얻는 것이 바람직한 경우, 반응 주기의 최종 단계는 R1의 제거일 수 있다.
본 발명은 또한 구조식 I 또는 이의 입체 이성질체인 3가 포스포러스 다량체 제조 방법에 관한다. 본 방법은 하기 구조식 VII 또는 이의 입체 이성질체인 뉴클레오시드 3'-치환체를 프로텍팅시켜 :
하기 구조식 VIII 또는 이의 입체 이성질체인 제 1 중간체를 형성하는 것을포함한다 :
상기 구조식 VII 및 VIII 중, X1, X2, X3, R1및 B 는 상기 정의된 바와 동일하다. 구조식 VIII 중, R16은 R1에 직각인 프로텍팅 그룹이다. 따라서, R1은 R16의 존재 하에서 R16에 반응을 일으키지 않으면서 제거될 수 있는 프로텍팅 그룹이고, R16은 R1의 존재 하에서 R1에 반응을 일으키지 않으면서 제거될 수 있는 프로텍팅 그룹이다. 바람직하게, R16은 레불리노일(levulynoyl) 그룹 또는 3-벤조일프로피오닐 그룹이다. 구조식 VIII 의 제 1 중간체를 이후 R1이 제거되도록 처리하여, 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 형성한다. R1이 산성의 불안정한 프로텍팅 그룹인 경우, 제 1 중간체를 산으로 처리하여, 산성의 불안정한 프로텍팅 그룹을 제거한다. R1이 트리알킬실릴 프로텍팅 그룹인 경우, 제 1 중간체를 통상적으로 플루오라이드 이온으로 처리하여 R1을 제거한다. 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 커플링 촉매의 존재 하에서 하기 구조식 IX 또는 이의 입체 이성질체인 화합물과 반응시킨다 :
상기 구조식 IX 중, X1, X2, X3, R1, R2, R3, R4, R5및 B 는 상기 정의된 바와 동일하다. 상기 반응으로부터 형성된 3',5'-프로텍팅된 이량체는 하기 구조식 X 또는 이의 입체 이성질체로 나타낼 수 있다 :
상기 구조식 X 중, X1, X2, X3, R1, R2, R3, R16및 B 는 상기 기재된 바와 동일하다. 3',5'-프로텍팅된 이량체를 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 이량체를 형성한다. 3'-디프로텍팅된 이량체를 커플링 촉매의 존재 하에서 하기 구소식 XI 또는 이의 입체 이성질체인 화합물과 선택적으로 반응시킨다 :
상기 구조식 XI 에 있어서, X1, X2, X3, R3, R4, R5, R16및 B 는 상기 정의된 바와 동일하다. 상기 반응의 생성물은 하기 구조식 XII 또는 이의 입체 이성질체 인 3',5'-프로텍팅된 삼량체이다 :
상기 구조식 XII 중, X1, X2, X3, R1, R2, R3, R16및 B 는 상기 정의된 바와 동일하다.
선택적으로, 3',5'-프로텍팅된 삼량체를 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 삼량체를 형성할 수 있는데, 이 때 상기 3'-디프로텍팅된 삼량체를 커플링 촉매 하에서 구조식 XI 의 화합물과 반응시켜, 3',5'-프로텍팅된 다량체를 형성할 수 있다. 3',5'-프로텍팅된 다량체를 이후 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 다량체를 형성한다. 3'-디프로텍팅된 다량체를 하기 XIIIa 및 XIIIb 의 3가 포스포러스 화합물과 반응시켜, :
구조식 I 의 3가 포스포러스 다량체를 형성한다. 상기 구조식 XIIIa 및 XIIIb 중, R3, R4및 R5은 상기 정의된 바와 동일하다. X6는 할로겐, 바람직하게는 클로로 또는 브로모이다.
이와는 별개로, 구조식 I 또는 이의 입체 이성질체인 3가 포스포러스 다량체를, 구조식 VII 또는 이의 입체 이성질체인 뉴클레오시드 3'-치환체를 프로텍팅함으로써 제조하여, 구조식 VIII 또는 이의 입체 이성질체인 제 1 중간체를 형성할 수 있다. 제 1 중간체를 R1이 제거되도록 처리하여, 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 형성한다. 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 구조식 XIIIa 또는 XIIIb 의 3가 포스포러스 화합물과 반응시켜, 구조식 XI 또는 이의 입체 이성질체인 5'-포스포라미디트를 형성한다. 5'-포스포라미디트를 커플링 촉매 하에서 구조식 XII 또는 이의 입체 이성질체인 화합물과 반응시켜, 구조식 X 또는 이의 입체 이성질체인 3',5'-프로텍팅된 이량체를 형성한다. 3',5'-프로텍팅된 이량체를 R16이 제거되도록 처리하여 3'-디프로텍팅된 이량체를 형성한다. 선택적으로, 3'-디프로텍팅된 이량체를 커플링 촉매의 존재 하에서 구조식 XI 또는 이의 입체 이성질체인 화합물과 반응시켜, 구조식 XII 또는 이의 입체 이성질체인 3',5'-프로텍팅된 삼량체를 형성한다. 선택적으로, R16의 제거 및 커플링 단계를 1 회 이상 반복하여, 3',5'-프로텍팅된 다량체를 형성한다. R16을 3',5'-프로텍팅된 다량체로부터 제거하여, 3'-디프로텍팅된 다량체를 형성하는데, 상기 3'-프로텍팅된 다량체를 구조식 XIIIa 또는 XIIIb 중 하나인 3가 포스포러스 화합물과 반응시켜, 구조식 I 또는 이의 입체 이성질체인 3가 포스포러스 다량체를 형성한다.
본 발명의 기타 구체예는 3가 포스포러스 다량체가 유도되는(derivatized) 고체 보조체 및 이의 제조 방법이다. 3가 포스포러스 다량체가 유도되는 고체 보조체는 하기 구조식 XIV 또는 이의 입체 이성질체로 나타낼 수 있다 :
상기 구조식 XIV 중, X1, X2, X3, R1, R2, R3, R15, B, L 및 n 은 상기 정의된 바와 동일하다.
구조식 XIV 의 3가 포스포러스 다량체가 유도되는 고체 보조체의 제조 방법은 3'-디프로텍팅된 다량체를 상기 기재된 방법 중 하나의 방법으로 제조하는 것을 포함한다. 3'-디프로텍팅된 다량체를 염기 존재 하에 하기 구조식 XVa 또는 XVb 의 화합물과 반응시켜 :
하기 구조식 XVI 또는 이의 입체 이성질체인 고체 보조체 로딩 시약(solidsupport loading reagent)을 형성한다 :
상기 구조식 XVa, XVb 및 XVI 중, L 은 상기 정의된 바와 동일하다. 구조식 XVI 중, X1, X2, X3, R1, R2, R3및 B 는 이전에 정의된 바와 동일하다. 고체 보조체 로딩 시약을 염기 및 치환된 또는 치환되지 않은 디-지방족 카보디이미드 (dialiphatic carbodiimide)의 존재 하에서 1차 또는 2차 아민 관능 그룹으로 유도된 고체 보조체와 반응시켜, 구조식 XIV 의, 3가 포스포러스 다량체가 유도되는 고체 보조체를 형성한다.
혹종의 구체예에서, 구조식 I 내지 XII, XIV 및 XVI 의 화합물의 입체 이성질체는 당 부분이 예시된 d-입체 이성질체과 반대인 l-입체 이성질체인 대응 구조식이다.
3가 포스포러스 결합, 키메라 올리고뉴클레오티드(즉, 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 결합 모두를 갖고 있는 올리고뉴클레오티드)를 갖고 있는 본발명의 다량체는 3가 포스포러스 다량체로부터 합성될 수 있다. 3가 포스포러스 다량체를 사용하는 올리고뉴클레오티드 합성에는, 단량체가 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 경우보다 더 적은 반응 단계가 필요하므로, 바람직한 생성물의 수율을 개선시킬 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 3가 포스포러스 다량체의 사용은 현재 가능한 사용되고 있는 기법보다, 더 긴 올리고뉴클레오티드를 용이하게 합성할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 다량체의 사용하면, 정해진 길이의 올리고뉴클레오티드 합성에, 단량체를 사용하여 합성하는 경우의 반 또는 이보다 적은 반응 단계가 요구되므로, 시약이 절약될 것이다. 마지막으로, 다량체가 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 경우 N-1 부산물이 잘 생성되지 않으므로, 바람직한 올리고뉴클레오티드가 실패 서열로부터 더욱 용이하게 분리될 것이다. 따라서, 목적하는 생성물은 정제되는 동안 덜 손실됨으로써, 이는 고순도 및 더 큰 수율로 제조될 수 있다.
도 1 은 3가 포스포러스 다량체 합성에 대한 합성 도식이다.
도 2 는 3가 포스포러스 다량체 합상에 대한 다른 합성 도식이다.
도 3 은 실시예 2 에서 제조되는 2'-O-메틸 이량체를 나타낸 것이다.
도 4 는 실시예 4 에서 합성된 포스포디에스테르 및 2 개의 포스포로티오에이트 제조에 사용된 2 개의 이량체를 나타낸 것이다.
도 5 는 3가 포스포러스 이량체를 사용하여 실시예 4 에서 합성된 올리고뉴클레오티드 합성에 대한 합성 도식이다. 고체 보조체에 결합된 것으로 나타난 티미딘 부분은 제조되기에 바람직한 서열에 적당한 이와는 별개의 뉴클레오시드 부분으로 치환될 수 있다고 인지될 것이다.
이하, 지방족 그룹은 완전히 포화되었거나 또는 방향족이 아닌 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 직쇄 사슬형 또는 분지형 C1-C18탄화수소 또는 완전히 포화되었거나 컨쥬게이팅되지 않은(unconjugated) 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 고리형 C3-C18탄화수소를 포함한다. 저급 알킬 그룹은 완전히 포화된 직쇄형 또는 분지형 C1-C8탄화수소 또는 C3-C8고리형 탄화수소이다. 지방족 그룹은 바람직하게는 저급 알킬 그룹이다.
방향족 그룹은 카복사이클릭(carbocyclic) 방향족 고리 시스템(예를 들면, 페닐) 및 하나 이상의 카보사이클릭 방향족 또는 방향족이 아닌 고리와 융합된 카보사이클릭 방향족 고리 시스템(예를 들면, 나프틸, 안트라세닐 및 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸)을 포함한다.
이하 사용되는 헤테로방향족 그룹에는 헤테로아릴 고리 시스템(예를 들면, 티에틸, 피리딜, 피라졸, 이속사졸일, 티아디아졸일, 옥사디아졸일, 인다졸일, 푸란, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 트리아졸, 피리미딘, 피라진, 티아졸, 이속사졸, 이소티아졸, 테트라졸 또는 옥사디아졸) 및 카보사이클릭 방향족 고리, 카보사이클릭 방향족이 아닌 고리, 헤테로아릴 고리 또는 헤테로사이클로알킬 고리가 하나 이상의 다른 헤테로아릴 고리와 융합되어 있는 헤테로아릴 고리 시스템(예를 들면, 벤조(b)티에닐, 벤즈이미다졸, 인돌, 트테라하이드로인돌, 아자인돌, 인다졸, 퀴놀린, 이미다조피리딘, 푸린, 피롤[2,3-d]피리미딘 및 피라졸[3,4-d]피리미딘)이 포함된다.
이하 사용되는 아랄킬 그룹은 바람직하게는 1 내지 약 6 개의 탄소 원자를 갖고 있는 지방족 그룹으로서 부분이 결합된 방향족 치환체이다.
이하 사용되는 헤테로사이클로알킬 그룹은 바람직하게는 5 내지 6 개의 원자가 있고 하나 이상의 이종 원자(이를 테면, 질소, 산소 또는 황)를 포함하는 방향족이 아닌 고리 시스템이다. 헤테로사이클로알킬 그룹의 예에는 포르폴린, 피페리딘 및 피페라진이 포함된다.
지방족 그룹, 방향족 그룹, 아랄킬 그룹, 헤테로방향족 그룹 및 헤테로사이클로알킬 그룹에 대한 적당한 치환체에는 방향족 그룹, 할로겐화된 방향족 그룹, 저급 알킬 그룹, 할로겐화된 저급 알킬(예를 들면, 트리플루오로메틸 및 트리클로로메틸), -O-(지방족 그룹 또는 치환된 지방족 그룹), -O-(방향족 그룹 또는 치환된 방향족 그룹), 벤질, 치환된 벤질, 할로겐, 시아노, 니트로, -S-(지방족 또는 치환된 지방족 그룹) 및 -S-(방향족 또는 치환된 방향족)이 포함된다.
아민, 알콜 및 티올 프로텍팅 그룹은 업계에 공지되어 있다. 아민 프로텍팅 그룹의 예는 Greene 등 저Protective Groups in Organic Synthesis(1991), John Wiley & Sons, Inc. 의 309-405 면을 참조하며, 이의 내용은 본 문헌에 전체적으로 합체되어 있다. 바람직하게, 아민은 아미드 또는 카바메이트로서 프로텍팅된다. 알콜 프로텍팅 그룹의 예는 전술한 문헌의 10-142 면을 참조하며, 이의 내용은 본 문헌에 전체적으로 합체되어 있다. 바람직한 알콜 프로텍팅 그룹은t-부틸디메틸실릴 그룹이다. 티올 프로텍팅 그룹의 예는 전술한 문헌의 277-308 면을 참조하며, 이의 내용은 본 문헌에 전체적으로 합체되어 있다.
산성의 불안정한 프로텍팅 그룹은 이러한 그룹을 브뢰스테드 또는 루이스 산과 접촉시킴으로써 제거될 수 있는 프로텍팅 그룹이다. 산성의 불안정한 그룹은 업계에 공지되어 있다. 통상적인 산성의 불안정한 프로텍팅 그룹의 예에는 치환된 또는 치환되지 않은 트리틸 그룹(전술한 문헌의 60-62면 참조), 치환된 또는 치환되지 않은 테트라하이드로피라닐 그룹(전술한 문헌의 31-34면 참조), 치환된 또는 치환되지 않은 테트라하이드로푸라닐 그룹(전술한 문헌의 36-37면 참조) 또는 픽실 그룹(전술한 문헌의 65면 참조)이 포함된다. 바람직한 산성의 불안정한 프로텍팅 그룹은 치환되었거나 치환된 트리틸{예를 들면, 4.4'-디메톡시트리틸(이하, "DMT"라 함)}이다. 트리틸 그룹은 바람직하게는 알콕시 그룹과 같은 전자 공여 치환체로 치환된다.
뉴클레오시드 염기에는 원래 존재하던 염기(이를 테면, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실) 및 개질된 염기(이를 테면, 7-디아자구아닌, 7-디아자-8-아자구아닌, 5-프로피닐시토신, 5-프로피닐우리실, 7-디아자아데닌, 7-디아자-8-아자아제닌, 7-디아자-6-옥소푸린, 6-옥소푸린, 3-디아자아데노신, 2-옥소-5-메틸피리미딘, 2-옥소-4-메틸티오-5-메틸피리미딘, 2-티오카보닐-4-옥소-5-메틸피리미딘, 4-옥소-5-메틸피리미딘, 2-아미노-푸린, 5-플루오로우리실, 2,6-디아미노푸린, 8-아미노푸린, 4-트리아졸로-5-메틸티민 및 4-트리아졸로-5-메틸우리실)가 포함된다.
프로텍팅된 뉴클레오시드 염기는 염기의 반응 관능 그룹이 프로텍팅된 뉴클레오시드 염기이다. 통상적으로, 뉴클레오시드 염기는 아민 프로텍팅 그룹으로 프로텍팅될 수 있는(이를 테면, 아미드 또는 카바메이트 그룹의 형성에 의하여) 아민 그룹을 갖는다. 예를 들면, 아데닌 및 시토신의 아민 그룹은 통상적으로 벤조일 프로텍팅 그룹으로 프로텍팅되고, 구아닌의 아민 그룹은 통상적으로 이소부티릴 그룹, 아세틸 그룹 또는 t-부틸페녹시아세틸 그룹으로 프로텍팅된다. 그러나, 기타 프로텍팅 형태가 사용될 수 있다. 예를 들면, 신속한 디프로텍팅을 위하여, 아데닌 및 구아닌의 아민 그룹을 페녹시아세틸 그룹으로 프로텍팅하고 시토신의 아민 그룹을 이소부티릴 그룹으로 프로텍팅한다. 올리고뉴클레오티드가 프로텍팅된 뉴클레오티드 염기가 있는 본 발명의 다량체로부터 합성되는 경우, 프로텍팅 그룹 제거를 위한 조건은 사용된 프로텍팅 그룹에 따라 상이할 것이다. 아미드 그룹으로 프로텍팅된 아미노 그룹이 사용되는 경우, 이는 올리고뉴클레오티드를 염기성 용액(이를 테면, 농축된 암모늄 하이드록사이드 용액,n-메틸아민 용액 또는 암모늄 하이드록사이드 내t-부틸아민 용액)으로 처리함으로써 제거될 수 있다.
이 부분에서 구조식들에 대한 언급은 적절한 대응 입체 이성질체를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
구조식 I 또는 II 의 3가 포스포러스 다량체는 구조식 III 의 올리고뉴클레오티드 제조에 사용될 수 있다. 단량체를 사용하는 것보다 3가 포스포러스 다량체를 사용하는 것의 잇점은 더 적은 반응 단계가 필요하다는 점이다. 따라서, 더 긴 올리고뉴클레오티드가 합성될 수 있다. 150 개의 뉴클레오티드 염기보다 긴 올리고뉴클레오티드는 3가 포스포러스 다량체를 이용하여 합성될 수 있다고 예상된다. 본 발명의 다량체는 또한 약 50 개 이하의 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 같은 더 짧은 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 8 내지 35 개의 염기)의 합성에 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 용액 내 또는 고체 보조체 상에서 합성될 수 있다. 용액 내에서 합성되는 경우, R13은 알콜, 아민 또는 티올 프로텍팅 그룹이다. 올리고뉴클레오티드 합성 후, 알콜, 아민 또는 티올 프로텍팅 그룹은 제거될 수 있다. 올리고뉴클레오티드가 고체 보조체 상에서 합성되는 경우, R13은 고체 보조체 또는 -Y2-L-Y2-R15을 나타내는 것이다. 통상적으로, 3가 포스포러스 다량체를 사용하는 용액 상(phase) 올리고뉴클레오티드 합성 또는 고체 상 올리고뉴클레오티드 합성은, 다량체가 사용된다는 점을 제외하고는, 단량체로부터 올리고뉴클레오티드를 합성하도록 개발된 방법과 유사하게 수행되며, 커플링 단계는 종종 단량체가 사용되는 경우보다 약 25 % 내지 약 75 % 더 걸린다. 3가 포스포러스 다량체를 사용하는 용액 상 올리고뉴클레오티드 합성 및 고체 상 올리고뉴클레오티드 합성의 통상적인 조건의 예는 하기 기재되어 있다.
올리고뉴클레오티드 제조의 제 1 단계는 구조식 IV 의 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드와 3가 포스포러스 다량체를 커플링시키는 것을 포함한다. 커플링 반응 동안, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 5'-디프로텍팅된 그룹은-NR4R5그룹을 치환시킴으로써, 다량체와 반응한다. 용액 내에서 합성되는 동안, 5'-디프로텍팅된 뉴클레오티드는 종종 약 0.02 M 내지 약 2 M 의 농도로 존재하고, 다량체는 바람직하게 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 약 1.1 당량 내지 약 2 당량의 농도로 존재한다. 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드에 대하여, 약 2.5 당량 내지 약 5.0 당량의 친핵성(nucleophilic) 커플링 촉매(이를 테면, 테트라졸, S-에틸티오테트라졸, 디시아노아미다졸 또는 피리디늄 클로라이드와 같은 피리디늄 염)이 커플링 반응을 용이하게 하기 위하여 통상적으로 첨가된다. 반응 시간은 일반적으로 약 20 분 내지 약 60 분이다.
올리고뉴클레오티드를 제조하는 제 2 단계는 올리고뉴클레오티드의 3가 포스포러스 그룹을 산화 또는 황화시키는 것을 포함한다. 이러한 단계에서, 다량체의 3가 포스포러스 그룹(5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드는 물론, 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드와 다량체 사이의 새로이 형성된 3가 포스포러스 결합과도 커플링됨)은 산화되거나 또는 황화된다.
용액 상 합성 중, 산화 반응은 종종 올리고뉴클레오티드를 물 또는 퍼옥사이드(이를 테면, 유기 용매 내t-부틸 하이드로겐 퍼옥사이드)의 존재 하에서 산화제(예를 들면, I2)로 처리함으로써 수행된다. I2및 물이 사용되는 경우, 산화에 사용되는 용액은 염기 및 미량의 물의 존재 하에서 통상적으로 약 1.1 내지 1.8 당량의 I2를 함유한다. 반응은 염기(이를 테면, 3차 알킬 아민)와 조합된 비양성자성 용매(이를 테면, THF) 및 약 1 % 의 물 내에서 수행된다. 비양성자성 용매와 염기의 비는 약 4 : 1 (vol./vol.) 내지 약 1 : 4 (vol./vol.)이다. 약 5 분 내지 약 20 분 후, 반응 혼합물을 소듐 비설파이트 수용액에 부어 과량의 요오드를 가라앉힌 다음, 유기 용매 내로 추출한다.
이와는 별개로, 3가 포스포러스 그룹은 올리고뉴클레오티드 합성을 이용하는 업계의 당업자에게 공지된 혹종의 황 전달제를 사용하여 황화될 수 있다. 황 전달제의 예에는 3H-벤조디티올-3-온 1, 1-디옥사이드("Beaucage reagent"라고도 함), 디벤조일 테트라설파이드, 페닐아세틸 디설파이드, N,N,N',N'-테트라에틸티우람 디설파이드, 3-아미노-[1,2,4]-디티아졸-5-티온(미국 특허 제6,096,881호 참조. 이의 전체 내용은 본 문헌에 합체되어 있음) 또는 황 원소가 포함된다. 상기 시약을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 황화시키는 반응 조건의 예는 Beaucage 등 저Tetrahedron(1993), 49:6123 에서 알 수 있고, 이의 내용은 본 문헌에 전체적으로 합체되어 있다. 3-아미노-[1,2,4]-디티아졸-5-티온이 바람직한 황 전달제이다. 통상적으로, 올리고뉴클레오티드는 약 0.04 M 내지 약 0.2 M 의 농도인, 유기 용매(이를 테면, 피리딘/아세토니트릴(1:9 w/w)) 내 3-아미노-[1,2,4]-디티아졸-5-티온 용액과 접촉된다. 황화 반응은 약 30 초 내지 약 2 분 내에 완결된다.
올리고뉴클레오티드의 산화 또는 황화 후, 혹종의 처리되지 않은 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드는 종종 캡핑시켜, 이후의 커플링 단계에서 반응하지 못하도록 한다. 캡핑되는 실패 서열은 완전한 길이의(full length) 올리고뉴클레오티드 생성물로부터 더욱 용이하게 분리될 수 있게 한다. 친핵성 5'-말단 그룹(즉, -OH, -SH또는 -NH2)과 반응하고, 이것이 3가 포스포러스 다량체와 반응하는 것을 방해할 혹족의 시약이 캡핑제(capping reagent)로서 사용될 수 있다. 통상적으로, 염기 존재 하의 언하이드라이드(이를 테면, 아세틱 언하이드라이드 또는 이소부티릭 언하이드라이드) 또는 클로라이드 산(이를 테면, 아세틸 클로라이드 또는 이소부티릴 클로라이드)가 캡핑제로서 사용된다.
캡핑 반응이 완결된 후, R1으로 나타내어지는 5'-프로텍팅 그룹을 제거한다. R1이 산성의 불안정한 프로텍팅 그룹인 경우, R1은 올리고뉴클레오티드를 산으로 처리함으로써 제거된다. 바람직하게, 5'-프로텍팅 그룹은 4,4'-디메톡시트리틸과 같은 트리틸 그룹이다. 5'-프로텍팅 그룹이 트리틸 그룹인 경우, 이는 올리고뉴클레오티드를 유기 용매(이를 테면, 디클로로메탄) 내의 디클로로아세트산 또는 트리클로로아세트산 용액으로 처리함으로써 제거될 수 있다. 5'-프로텍팅 그룹이 제거된 다음, 반응 주기(즉, 커플링 단계, 산화 또는 황화 단계, 캡핑 단계(선택적임) 및 디프로텍팅 단계)는 선택적으로 1 회 이상 반복되어, 바람직한 길이의 올리고뉴클레오티드를 얻을 수 있다.
포스페이트 올리고뉴클레오티드는 3가 포스포러스 그룹을 산화시키고 인터뉴클레오티드 포스포러스 프로텍팅 그룹(이를 테면, R3로 나타내어짐)을 선택함으로써 제조되어, 인터뉴클레오티드 그룹이 디프로텍팅되는 경우, 포스페이트 그룹이 형성되도록 할 수 있다. 예를 들면, 베타-시아노에틸옥시 프로텍팅된 3가 포스포러스 산화 후 염기 디프로텍팅함으로써 포스페이트 그룹을 형성할 수 있다.
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 3가 포스포러스 그룹을 황화시키거나 또는 3가 포스포러스 그룹을 산화시키고 인터뉴클레오티드 포스포러스 프로텍팅 그룹(이를 테면, R3으로 나타내어짐)을 선택함으로서 제조되어, 인터뉴클레오티드 그룹이 디프로텍팅된 경우, 포스포로티오에이트 그룹이 형성되도록 할 수 있다. 예를 들면, 베타-시아노에틸티오 프로텍팅된 3가 포스포러스를 산화시킨 다음 무수 염기 디프로텍팅함으로써 포스포로티오에이트 그룹을 형성할 수 있다.
키메라 올리고뉴클레오티드는 목적하는 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 결합을 형성하는 인터뉴클레오티드 포스포러스 프로텍팅 그룹(이를 테면, R3로 나타냄)의 적합한 선택을 조합시키면서, 하나 이상의 반응 주기에서 3가 포스포러스 그룹을 산화시키거나 또는 하나 이상의 상이한 반응 주기에서 3가 포스포러스 그룹을 황화시킴으로써 제조될 수 있다. 이와는 별개로, 키메라 올리고뉴클레오티드는 일부 인터뉴클레오티드 프로텍팅 그룹은 디프로텍팅 시 베타-시아노에틸티오 프로텍팅 그룹과 같은 포스포로티오에이트 결합을 형성하고, 일부 인터뉴클레오티드 프로텍팅 그룹은 디프로텍싱 시 베타-시아노에틸옥시 프로텍팅 그룹과 같은 포스페이트 결합을 형성하는, 다량체를 선택함으로서 제조될 수 있다. 이와 같은 방법으로, 올리고뉴클레오티드는 각 반응 주기에서 커플링 단계 후에 산화된다.
5'-말단 그룹이 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 생성물을 얻는 것이 바람직한 경우, 캡핑 단계가 수행된다면, 반응 주기의 최종 단계는 캡핑 단계일 수 있고,캐핑 단계가 수행되지 않는다면, 반응의 최종 단계는 산화 또는 황화 단계일 수 있다. 5'-디프로텍팅된 올리고뉴클레오티드가 바람직하다면, 반응 주기는 디프로텍팅 단계로 종결될 수 있다. 일반적으로, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제되는 경우, 5'-프로텍팅된 올리고뉴클레오티드가 바람직한 생성물이다. 올리고뉴클레오티드가 이온-교환 크로마토그래피로 정제된다면, 5'-디프로텍팅된 올리고뉴클레오티드가 일반적으로 바람직한 생성물이다.
3가 포스포러스 다량체를 사용하는 고체 상 올리고뉴클레오티드 합성은 일반적으로 용액 상 합성과 동일한 반응 주기 및 시약을 사용한다. 그러나, 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 고체 보조체에 로딩되는(loaded) 경우, 보조체 1 그램 당 약 50 μmole 내지 약 100 μmole 로 종종 로딩된다. 커플링 단계에서, 통상적으로 유기 용매(이를 테면, 아세토니트릴) 내 약 0.01 M 내지 약 1 M, 바람직하게는 약 0.1 M 의 농도의 3가 포스포러스 다량체 용액은 고체 보조체에 첨가된다. 약 1.5 mmol 내지 약 1.5 M 의 농도인 친핵성 커플링 촉매 용액은 커플링 반응 전에 또는 반응 동안에, 다량체를 함유하고 있는 용액에 일반적으로 혼합된다. 이후 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드와 결합된 보조체는 약 2 분 내지 약 10 분, 바람직하게는 약 5 분 동안 혼합물과 접촉된다.
커플링 반응이 완결된 후 3가 포스포러스 결합이 산화되는 경우, 고체 보조체는 I2와 물 또는 유기 용매(이를 테면, THF, 아세토니트릴 또는 톨루엔) 내의 퍼옥사이드(이를 테면,t-부틸 하이드로퍼옥사이드)와의 혼합물과 같은 산화제에 접촉된다. I2와 H2O 의 혼합물이 바람직한 산화제이다. I2와 물의 혼합물이 사용되는 경우, 물과 혼화가능한 기타 유기 용매 또한 존재할 수 있다. 통상적으로, 3가 포스포러스 인터뉴클레오티드 결합을 함유하고 있는, 고체 보조체에 결합된 올리고뉴클레오티드는 물, 비양성자성, 물과 혼화가능한 용매 및 염기의 용매 혼합물 내의 I2용액과 접촉될 수 있다. 통상적인 산화 용액은 물/테트라하이드로푸란/루티딘 (2:80:20)(vol./vol./vol.) 용액 내 약 0.05 M 내지 약 1.5 M 의 I2이다. 고체 보조체는 통상적으로 약 30 초 내지 약 1.5 분 동안 I2용액으로 처리된다.
이와는 별개로, 고체 보조체는 유기 용매 내 황 전달제 용액과 접촉되어 3가 포스포러스 그룹을 황화시킬 수 있다. 예를 들면, 고체 보조체를 아세토니트릴과 같은 유기 용매 내 3H-벤조디티올-3-온-1, 1-디옥사이드(약 0.05 M-0.2 M) 용액과 약 30 초 내지 약 1 분 동안 접촉시킬 수 있다.
고체 상 올리고뉴클레오티드 합성에 있어서, 고체 보조체를 선택적으로 약 30 초 내지 약 1 분 동안 캡핑제 용액과 접촉시킬 수 있다. 캡핑 단계에 이어, 고체 보조체를 약 1 분 내지 약 3 분 동안 산성 용액에 접촉시킴으로써 디프로텍팅 단계가 수행된다. 반응 주기는 목적하는 길이의 올리고뉴클레오티드가 합성될 때까지 선택적으로 1 회 이상 반복된다. 용액 상 합성에서, 반응 주기가 캡핑 단계 또는 산화 또는 황화 단계로 종결되는 경우, 5'-프로텍팅된 올리고뉴클레오티드가 얻어진다. 5'-디프로텍팅된 올리고뉴클레오티드는 반응 주기가 디프로텍팅 단계로 종결되는 경우 얻어진다.
고체 상 합성이 완결되는 경우, 올리고뉴클레오티드는 표준 방법으로 고체 보조체와 분리될 수 있다. 일반적으로, 고체 보조체는 농축 암모늄 하이드록사이드 용액으로 25 ℃ - 60 ℃ 에서 약 0.5 시간 내지 약 16 시간 동안 또는 그 이상(이는 올리고뉴클레오티드 서열과 상기 단계 중에서 핵염기 프로텍팅 그룹이 제거되는 것이 바람직한지 여부에 따라 다름)동안 처리된다.
3가 포스포러스 다량체는 2 개의 상이한 방법으로 제조될 수 있다. 제 1 방법(이러한 방법의 예는 도 1 을 참조할 것)에서, 구조식 VII 의 뉴클레오시드를 프로텍팅시켜 구조식 VIII 의 제 1 중간체를 형성한다. 바람직하게는, 프로텍팅 그룹이 레불리노일 프로텍팅 그룹 또는 3-벤조일프로피오닐 프로텍팅 그룹이다. 레불리노일 프로텍팅 그룹은 몇몇 상이한 방법(Greene 등 저Protective Groups in Organic Synthesis(1991), John Wily & Sons, Inc., 97 면 참조. 상기 내용은 본 문헌에 전체적으로 합체되어 있음)으로 뉴클레오시드에 첨가될 수 있다. 뉴클레오시드를 레불리노일 또는 3-벤조일프로피오닐 프로텍팅 그룹으로 프로텍팅시키는 바람직한 방법은 이를 피리딘 내 레불린(levulinic) 무수물 또는 3-벤조일프로피오닉 무수물로 약 16 - 24 시간 동안 처리함으로써 이루어진다. 이와는 별개로, 레불리노일 또는 3-벤조일프로피오닐 프로텍팅 그룹은 뉴클레오시드를 디클로로메탄 및 피리딘 용액 내의 레불린산 또는 3-벤조일프로피온산 및 디사이클로헥실카보디이미드로 처리함으로서 첨가될 수 있다.
제 1 중간체를 R1이 제거되도록 처리하여, 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를형성한다. 트리틸 그룹을 제거하는 방법은 Greene 등 저Protective Groups in Organic Synthesis(1991), John Wily & Sons, Inc., 60-62 면에 기재되어 있으며, 상기 내용은 본 문헌에 전체적으로 합체되어 있다. 테트라하이드로피라닐 프로텍팅 그룹(31-34 면) 및 테트라하이드로푸라닐 프로텍팅 그룹(36-37 면)을 제거하는 방법은 Greene 등 저Protective Groups in Organic Synthesis(1991), John Wily & Sons, Inc.에서 알 수 있으며, 상기 내용은 본 문헌에 전체적으로 합체되어 있다. 트리틸 그룹은, 바람직하게는 제 1 중간체를 물 내의 80 % (vol./vol.) 아세트산 수용액으로 약 7 시간 동안 처리하거나 또는 디클로로메탄 내의 약 2 % 의 트리플루오로아세트산 또는 디클로로아세트산으로 약 15 분 동안 처리함으로써 제거된다.
5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 이후 구조식 IX 의 포스포라미디트와 커플링시켜, 구조식 X 의 이량체를 형성할 수 있다. 커플링 반응은 통상적으로 유기 용매 내에서 건조 반응 조건으로 수행된다. 반응물의 농도는 약 0.05 M 내지 약 0.5 M 이다. H-테트라졸 또는 S-에틸티오테트라졸과 같은 커플링 촉매 또한 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드에 대하여 약 2 당량 내지 약 6 당량으로 반응 혼합물 내에 종종 존재한다. 커플링 반응은 통상적으로 약 2 시간 내지 약 16 시간 동안 일어난다.
3',5'-프로텍팅된 이량체를 이후 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 이량체를 형성한다. R16이 레불리노일 프로텍팅 그룹인 경우, 이는 Greene 등 저Protective Groups in Organic Synthesis(1991), John Wily & Sons, Inc., 97면에 기재된 방법으로 제거될 수 있으며, 이러한 내용은 본 문헌에 전체적으로 합체되어 있다. 바람직하게, 3',5'-프로텍팅된 이량체를 피리딘과 아세트산의 비가 4 : 1 (vol./vol.) 내지 약 1 : 4 (vol./vol.) 인 피리딘/아세트산 내 약 0.05 M 내지 약 1 M 의 하이드라진 용액에 약 15 분 내지 약 1 시간동안 접촉시킴으로써, 레불리노일 또는 3-벤조일프로피오닐 프로텍팅 그룹이 제거된다.
3'-디프로텍팅된 이량체를 선택적으로 커플링 촉매의 존재 하에 구조식 XI 의 화합물과 반응시킨다. 상기 커플링 반응은 건조 반응 조건으로 유기 용매 내에서 수행된다. 3'-디프로텍팅된 이량체 및 구조식 XI 의 화합물의 농도는 약 0.05 M 내지 약 0.5 M 이다. H-테트라졸 또는 S-에틸티오테트라졸과 같은 커플링 촉매는 3'-디프로텍팅된 이량체에 대하여 약 2 당량 내지 약 6 당량으로 존재한다. 구조식 XII 의 3',5'-프로텍팅된 이량체는 상기 반응에 의하여 형성된 생성물이다.
출발 물질로서 3',5'-프로텍팅된 삼량체가 사용된 R16디프로텍팅 반응 및 커플링 반응을 선택적으로 1 회 이상 반복하여, 3',5'-프로텍팅된 다량체를 형성할 수 있다.
3',5'-프로텍팅된 다량체를 이후 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 다량체를 형성한다.
3'-디프로텍팅된 다량체를 포스포릴레이팅 시약(phosphorylating reagent)과 반응시켜, 구조식 I 의 3가 포스포러스 다량체를 형성한다. 구조식 XIIIa 또는 XIIIb 의 포스포릴레이팅 시약은 유기 용매(이를 테면, 디클로로메탄, 아세토니트릴 또는 THF) 내 3'-디프로텍팅된 다량체의 건조 용액에 서서히 첨가된다. 포스포릴레이팅 시약이 구조식 XIIIb 의 화합물인 경우, 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민과 같은 비양성자성 유기 염기 또한 반응 혼합물에 첨가된다. 포스포릴레이팅 시약은 종종 다량체에 대하여 약 1.1 당량 내지 약 1.5 당량의 과량으로 존재한다. 반응은 약 4 시간 내지 약 24 시간동안 진행된다. 반응이 완결된 후, n-옥탄올을 반응 혼합물에 선택적으로 첨가하여, 혹종의 잔류 포스포릴레이팅 시약과 반응시킬 수 있다. 바람직하게, 다량체는 이량체(2 개의 뉴클레오티드 염기) 또는 삼량체(3 개의 뉴클레오티드 염기)이다.
포스포러스 다량체를 제조하는 제 2 방법(예를 들어 도 2 를 참조할 것)에 있어서, 구조식 VII 의 뉴클레오시드 염기를 R1과 직교하는 프로텍팅 그룹인 R16로 프로텍팅시켜, 구조식 VIII 의 제 1 중간체를 형성한다. 바람직하게 R16은 레불리노일 또는 3-벤조일프로피오닐 프로텍팅 그룹이다. 제 1 중간체는 3가 포스포러스 다량체를 제조하는 제 1 방법과 동일한 방법으로서 R1이 제거되도록 처리한다. 이러한 반응 순서로 형성된 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 구조식 XIIIa 또는 XIIIb 의 포스포릴레이팅 시약으로 처리하여, 구조식 XI 의 5'-포스포라미디트 뉴클레오시드를 형성한다. 5'-포스포릴레이팅 조건은 3가 포스포러스 다량체를 형성하는 제 1 방법의 3'-포스포릴레이팅 조건에 기재된 바와 동일하다. 5'-포스포라미디트를 이후 구조식 VII 의 화합물과 커플링 촉매의 존재 하에서 구조식 VII 의 화합물과 커플링시켜, 구조식 X 의 3',5'-프로텍팅된 이량체를 형성한다. 커플링 반응의 반응 조건은 다량체를 형성하는 제 1 방법의 커플링 반응의 조건과 동일한다. 3',5'-프로텍팅된 이량체를 상기 기재된 바와 같이 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 이량체를 형성한다. 또한 상기 기재된 바와 같이, 3'-디프로텍팅된 이량체를 커플링 촉매의 존재 하에서 구조식 XI 의 화합물과 선택적으로 반응시켜, 구조식 XII 의 3',5'-프로텍팅된 삼량체를 형성한다. 3'-디프로텍팅 반응 및 커플링 반응을 선택적으로 1 회 이상 반복하여 3',5'-프로텍팅된 다량체를 형성할 수 있다. R16를 3',5'-프로텍팅된 다량체로부터 제거하여 3'-디프로텍팅된 다량체를 형성하고, 3'-디프로텍팅된 다량체를 상기 기재된 바와 같이 포스포릴레이팅시켜 구조식 I 의 3가 포스포러스 다량체를 형성한다.
3가 포스포러스 다량체와 함께 유도되는, 구조식 XII 의 고체 보조체는, 상기 기재된 방법으로 형성된 3'-디프로텍팅된 다량체를 구조식 XVa 또는 XVb 의 화합물과 반응시켜 제조되어, 고체 보조체 로딩 시약을 형성한다. 3'-디프로텍팅된 다량체를 구조식 XVa 의 화합물과 반응시키는 경우, 피리딘과 같은 염기의 존재 하에 반응을 수행한다. 3'-디프로텍팅된 다량체를 구조식 XVb 의 화합물과 반응시키는 경우, 구조식 XVb 의 화합물에 대하여 약 1 당량 이상의 디-지방족(dialiphatic) 카보디이미드 또한 반응 혼합물에 존재하여야 한다. 고체 보조체 로딩 시약은 말단의 카복실산을 활성 에스테르로 전환시키는 화합물과 반응시킴으로써 선택적으로 활성화시킬 수 있다. 말단 카복실산과 반응하여 활성 에스테르를 형성하는 화합물의 예에는p-니트로페놀,o,p-디니트로페놀, 아미다졸 및N-하이드록시숙신아미드가 포함된다.p-니트로페놀 또는o,p-디니트로페놀로 활성 에스테르를 형성하는 반응에서, 지방족 카보디이미드 또한 반응 혼합물에 존재하여야 한다.
고체 보조체 로딩 시약 또는 활성화된 고체 보조체 로딩 시약이 사용되어 아민 관능화된 고체 보조체를 유도화할 수 있다. 고체 보조체 상의 아민 관능화 그룹은 1차 또는 2차 아민일 수 있다. 아민 관능화 보조체는 염기성 용액 내 활성화된 고체 보조체 로딩 시약에 접촉시켜 유도화된 고체 보조체가 형성할 수 있다. 반응 조건의 예는 미국 특허 제5,668,268호를 참조하며, 이의 내용은 본 문헌 전체에 합체되어 있다. 이와는 별개로, 아민 관능화 고체 보조체는 염기성 용액 내 디-지방족 카보디이미드의 존재 하의 불활성화 로딩 시약에 접촉시켜 고체 보조체가 유도된다. 반응 조건의 예는 미국 특허 제5,668,268호 및 제4,812,512호를 참조하며, 이의 내용은 본 문헌에 전체적으로 합체되어 있다. 바람직한 디-지방족 카보디이미드는 디사이클로헥실 카보디이미드 및 디이소프로필 카보디이미드이다.
실시예 1 및 실시예 2 에 기재된 절차를 사용하여 포스포라미디트 이량체를 제조하였다. 포스포라미디트 삼량체를 제조하는 절차는 실시예 3 에 기재되어 있다. 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 결합이 있는 올리고뉴클레오티드를 실시에 4 에서 상술된 방법을 사용하여 제조하였다. 실시예 1-4 에서, 모든 부 또는 퍼센트는 다른 기재가 없는 한 중량 기준이다.
실시예 1 (도 1 참조):
A. 2'-디옥시-N4-벤조일-3'-O-레불리노일-시티딘의 합성:
상기 표제의 화합물을 시판되는 2'-디옥시-N4-벤조일-5'-O-DMT-시티딘으로부터 제조하였다. 상온에서 5 시간동안 2'-디옥시-N4-벤조일-5'-O-DMT-시티딘을 건조 피리딘 내 레불린산 무수물(1.5 당량)으로 처리하여 2'-디옥시-N4-벤조일-3'-O-레불리노일-5'-O-DMT-시티딘을 얻었다. 상온에서 1.5 시간동안 2'-디옥시-N4-벤조일-3'-O-레불리노일-5'-O-DMT-시티딘을 물 내 80 % (vol./vol.) 의 아세트산에 둠으로써, 5'-O-DMT 프로텍팅 그룹을 제거하여 2'-디옥시-N4-벤조일-3'-O-레불리노일-시티딘을 얻었다. 이렇게 얻어진 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
B. 2'-디옥시-5'-O-DMT-N2-이소부티릴-구아노신-3'-O-P-(OCH2CH2CN)-5'-O-N4-벤조일-2'디옥시시티딘-3-O-레불리네이트의 합성:
A 단계에서 합성된 N4-벤조일-2'-디옥시시티딘-3'-O-레불리네이트(8.58g, 20mmol) 및 테트라졸(0.56g, 80mmol)을 건조된 톨루엔으로 감압 하에 동시에 증발시켜 건조시킨 다음 건조 아세토니트릴(100mL)내에 용해시켰다. 시판되는 N2-이소부티릴-5'-O-DMT-2'디옥시구아노신-3'-O-포스포라미디트(16.0g, 19mmol)을 상기 용액에 가하고 상기 용액을 아르곤 하에서 4 시간 동안 상온으로 교반시켰다. 상기 용액을 비스코스물(viscous mass)로 농축시킨 다음, 아르곤 기체로 포화된 에틸 아세테이트 내에 두었다. 상기 용액을 냉각시킨 소듐 비카보네이트 용액으로 세척한 다음 냉각수로 세척하였다. 무수 소듐 설페이트로 건조시킨 다음, 상기 용액을 감압 하에서 농축시켜 밝은 황색의 거품을 얻었다. 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 완전히 프로텍팅된 이량체 뉴클레오시드 포스파이트 트리에스테르(NMR 로 확인함)(19.5g)를 얻었다.
C. 2'-디옥시-5'-O-DMT-N2-이소부티릴-구아노신-3'-O-P-(OCH2CH2CN)-5'-O-N4-벤조일-2'디옥시시티딘-3'-OH 의 합성:
B 단계에서 합성된 완전히 프로텍팅된 디-뉴클레오시드 포스파이트 트리에스테르(17.5g, 15mmol)을 피리딘/아세트산(4:1 vol./vol.)내 하이드라진 용액(0.5M, 100ml)으로 30 분간 상온에서 처리하였다. 피리딘(100ml)을 상기 용액에 가하고, 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 생성물을 디클로로메탄(500ml)내에 둔 다음, 조심스럽게 소듐 비카보네이트 용액(2 ×300ml)으로 세척한 후, 물(300ml)로 세척하였다. 유기 상을 무수 소듐 설페이트로 건조시켰다. 상기 용액을 감압 하에 여과하고 농축하여 고체 거품을 얻었다. 고체 거품을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 생성물(13.4g, 83.4%)을 얻었다.
D. 2'-디옥시-5'-O-DMT-N2-이소부티릴-구아노신-3'-O-P-(OCH2CH2CN)-5'-O-N4-벤조일-2'디옥시시티딘-3'-O-β-시아노에틸-(N,N-디이소프로필아미노)-포스포라미디트의 합성:
C 단계에서 합성된 5'-O-DMT-N2-이소부티릴-2'-디옥시구아노신-3'-O-P-(OCH2CH2CN)-5'-O-N4-벤조일-2'디옥시시토신-3-OH(12.5g, 11.7mmol)를 아세토니트릴과 함께 감압 하에 증발시켜 건조시켰다. 건조된 물질을 증류시킨 디클로로메탄 내에 용해시켰다. 비스-(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시포스핀(4.5g, 15mmol)을 주사기를 사용하여 상기 용액에 가하고, S-에틸티오테트라졸(1.6g, 12.5mmol)을 고체로서 가하였다. 상온에서 16 시간 동안 교반시킨 다음, n-옥탄올(500l)을 가하고, 상기 용액을 2 시간 더 교반시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(500ml)내에 용해된 비스코스 용액으로 농축시킨 다음, 소듐 비카보네이트 용액에 이어서 소듐 클로라이드 용액으로 세척하였다. 에틸 아세테이트 용액을 무수 소듐 설페이트로 건조시키 다음, 고체로 농축시켰다. 크루드 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제시켜, 목적하는 이량체 포스포라미디트(12.8g, 86.2%)를 얻었다.
실시예 2:
A. 2'-디옥시-2'-O-메틸-3'-O-레불리노일-우리딘의 합성:
2'-디옥시-2'-O-메틸-5'-O-디메톡시트리틸-우리딘(11.2g, 20mmol)을 피리딘 (3 ×100ml)와 함께 증발시켜 건조시킨 다음 건조 피리딘(150ml)내에 용해시켰다. 레불린산 무수물(6.5g, 30mmol) 및 N,N-디메틸아미노피리딘(0.1g, 촉매량)을 가하고 상기 용액을 상온에서 5 시간 동안 교반시켰다. tlc로 측정하여, 용액 내에 잔류하는 출발 물질이 없는 경우, 상기 용액을 비스코스물로 농축시킨 다음, 에틸 아세테이트 내에 두었다. 에틸 아세테이트 용액을 소듐 비카보네이트 용액에 이어서 소듐 클로라이드 용액으로 세척하였다. 에틸 아세테이트 층을 소듐 설페이트로 건조시킨 다음, 거품으로 농축시켜 2'-디옥시-2'-O-메틸-3'-레불리노일-5'-O-디메톡시트리틸-우리딘(프로톤 NMR 로 확인함)을 얻었다. 상기 물질을 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
2'-디옥시-2'-O-메틸-3'-레불리노일-5'-O-디메톡시트리틸-우리딘(14.0g)을 물(500ml) 내 80 % (vol./vol.) 의 아세트산 용액으로 1.5 시간동안 상온에서 처리하였다. 피리딘(400ml)을 상기 용액에 가하고 혼합물을 비스코스 액체로 감압 하에서 농축시켰다. 비스코스물을 에테르로 분쇄하여 고무질의 고체를 얻었는데, 이를 메탄올의 퍼센트를 증가시키면서 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 바람직한 단편을 모아 고체로 농축시켰다. 2'-디옥시-2'-O-메틸-3'-O-레불리노일-우리딘을 메틸렌 클로라이드 및 에테르 혼합물로 결정화하였다. 생성물을 프로톤 NMR 로 확인하였다.
B. 2'-디옥시-2'-O-메틸-5'-O-DMT-우리딘-3'-O-P-(OCH2CH2CN)-5'-O-우리딘-2'-디옥시-2'-O-메틸-3'-O-레불리네이트의 합성(커플링 반응):
단계 A 에서 합성된 2'-디옥시-2'-O-메틸-3'-O-레불리노일-우리딘(5.0g, 14.0mmol)과 테트라졸을 건조 아세토니트릴에 용해시키고 감압 하에서 동시 증발시켰다. 건조된 물질을 1 시간 동안 고진공 펌프로 펌핑시킨 다음 아세토니트릴(70ml) 내에 용해시켰다. 2'-디옥시-2'-O-메틸-5'-O-DMT-우리딘-3'-포스포라미디트(9.5g, 12.5mmol)을 상기 용액에 가하고 반응 혼합물을 16 시간 동안 상온에서 교반시켰다. 유기 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 아르곤으로 포화된 에틸 아세테이트에 두었다. 용액을 소듐 비카보네이트 용액에 이어 소듐 클로라이드로 세척하였다. 유기 층을 무수 소듐 설페이트로 건조시킨 다음, 감압 하에서 농축시켰다. 크루드 생성물을 에틸 아세테이트를 사용하고 메탄올의 퍼센트를 증가시키면서 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다. 수집된(pooled) 목적하는 단편을 모아 농축시켜 9.5g 의 완전히 프로텍팅된 이량체를 얻었다. 최종적으로 생성물을 프로톤 및 포스포러스 NMR 로 확인하였다.
C. 2'-디옥시-2'-O-메틸-5'-O-DMT-우리딘-3'-O-P-(OCH2CH2CN)-5'-O-우리딘-2'-디옥시-2'-O-메틸의 합성(3'-O-레불리노일 그룹의 제거):
B 단계에서 합성된 완전히 프로텍팅된 디-뉴클레오시드 포스파이트 트리에스테르(8.0g, 8.75mmol)를 피리딘:아세트산(4:1) 내 하이드라진 하이드레이트 용액(0.5M, 50ml)으로 30 분동안 상온에서 처리하였다. 피리딘(50ml)을 상기 용액에 가한 다음, 혼합물을 비스코스 액체로 농축시켰다. 상기 물질을 클로로포름 내에 둔 다음, 소듐 비카보네이트 용액과 물로 세척하였다. 클로로포름 추출물을 소듐 설페이트로 건조시킨 다음, 증발시켜 건조시켰다. 이렇게 얻은 크루드 물질을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 3'-디프로텍팅된 이량체(6.5g, 8.0mmol)을 얻었다. 이를 프로톤 및 포스포러스 MNR 로 확인하였다.
D. 2'-디옥시-2'-O-메틸-5'-O-DMT-우리딘-3'-O-P-(OCH2CH2CN)-5'-O-우리딘-2'-디옥시-2'-O-메틸-3'-O-β-시아노에틸-(N,N-디이소프로필아미노)-포스포라미디트의 합성(이량체 뉴클레오시드 포스포라미디트 신톤):
C 단계에서 합성된 3'-디프로텍팅된 디뉴클레오시드 포스파이트 트리에스테르(6.1g, 7.46mmol)를 건조된 아세토니트릴과 함께 감압 하에 증발시켜 건조시켰다. 건조된 물질을 새 증류시킨 건조 메틸렌 클로라이드(50ml)에 용해시켰다. 포스피틸레이팅 시약(phosphitylating reagent) 비스-(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡실포스핀(3.4mol, 11.2mmol)에 이어 S-에틸티오테트라졸(0.75g, 6.0mmol)을 상기 용액에 가한 다음, 반응 혼합물을 상온에서 16 시간 동안 교반시켰다. n-옥탄올(0.13ml)을 반응 혼합물에 가하여 과량의 포스피틸레이팅 시약과 반응시킨 다음, 반응물을 2 시간 더 교반시켰다. 마지막으로, 반응 혼합물을 클로로포름 내 5 % (vol./vol.)의 디이소프로필에틸 아민(350ml)으로 희석시키고 즉시 소듐 비카보네이트 용액(2 ×150ml) 및 소듐 클로라이드 용액(150ml)으로 세척하였다. 클로로포름 층을 소듐 설페이트로 건조시킨 다음, 고체로 농축시켰다. 이량체 포스포라미디트 생성물(도 3 참조)를 에틸 아세테이트 내 0.1 % (vol./vol.) 의 디이소프로필에틸 아민을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다. 6.5 g 의 수집된 목적하는 단편을 NMR 로 측정한 결과 98 % 의 순도로 얻었다.
실시예 3 : 삼량체 포스포라미디트의 합성 :
삼량체 포스포라미디트를 포스포라미디트 이량체 뉴클레오시드(예를 들면, 실시예 1D 또는 2D 에서 제조된 화합물)와 5'-하이드록시-2'-디옥시-3'-O-레불리노일-뉴클레오시드 또는 5'-하이드록시-2'-O-프로텍팅된-3'-O-레불리노일-뉴클레오시드를, 실시예 1B 또는 2B 에서 주어진 반응 조건과 유사한 반응 조건을 사용하여, 아세토니트릴 내의 4.0 당량의 테트라졸의 존재 하에서 반응시켜 제조할 수 있다. 삼량체-뉴클레오시드의 3'-말단으로부터의 레불리노일을 실시예 1C 또는 2C 에서 주어진 반응 조건과 유사한 반응 조건을 사용하여, 피리딘 및 아세트산 내의 하이드라진 용액을 사용하여 제거할 수 있다. 정제 후, 2 개의 포스파이트 트리에스테르 결합이 있는 3'-디프로텍팅된 삼량체 뉴클레오시드를 실시예 1D 또는 2D 에서 주어진 반응 조건과 유사한 반응 조건을 사용하여, 비스-(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시-포스핀 및 S-에틸 티오-테트라졸로 포스피틸레이팅시켜, 2 개의 포스파이트 트리에스테르 결합이 있는 삼량체-뉴클레오시드 포스포라미디트를 얻었다.
실시예 4 : 포스페이트 디에스테르와 포스포로티오에이트 디에스테르 결합을 모두 갖고 있는 올리고뉴클레오티드의 합성(도 5 참조) :
올리고뉴클레오티드를 DNA synthesizer 8909 Expedite(Biosystems에서 시판됨)에서 합성하였다. 합성을 약간 개질시키기 위하여 표준 포스포로라미디트 화학 프로토콜을 따랐다. 포스파이트 트리에스테르 결합이 있는 포스포라미디트 이량체 뉴클레오시드의 농도는 아세토니트릴 내 0.1 M 이다. 합성에 사용된 이량체를 도 4 에 나타내었다. 이량체 포스포라미디트를 사용하여 사슬 확장에 사용된 커플링 시간은 단량체 포스포라미디트에 비하여 50 % 더 길었다. 커플링 후, 포스파이트 트리에스테르 결합을 안정한 요오드 용액에 있는 포스페이트 트리에스테르 또는 Beaucage 시약과 함께 있는 안정한 포스포로티오에이트로 전환되었다. 10 개의 반응 주기를 각각의 합성에서 수행하여 21 개의 뉴클레오티드 염기가 있는 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 서열 ACACACACACACACACACACT (서열 번호 1) 가 있는 포스페이트 21mer 및 서열 ACACACACACACACACACACT (서열 번호 1) 및 GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTT (서열 번호 2) 가 있는 2 개의 포스포로티오에이트 21mer를 제조하였다. 합성이 종결될 때, 완전히 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 사슬과 결합되어 있는 고체 보조체를 농축된 암모늄 하이드록사이드로 16 시간 동안 50 ℃ 에서 처리하여, 사슬이 분리되고 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 및 뉴클레오시드 염기 프로텍팅 그룹이 제거되도록 하였다. 크루드 올리고뉴클레오티드를 이온 교환 HPLC 로 분석하였다. 크로마토그램의 주요 피크는 목적하는 생성물이었다. 포스포로티오에이팅된(phosphorothioated) 디에스테르 결합이 있는 올리고뉴클레오티드의 경우, 크루드 생성물 또한 포스포러스 NMR 로 분석하였다. 스펙트럼은 포스포로티오에이트 디에스테르의 특징적인 화학 쉬프트(shift)가 나타났으나, 포스페이트 디에스테르 결합을 나타내는 화학 쉬프트는 발견할 수 없었다.
균등(EQUIVALNETS)
본 발명은 이의 바람직한 구체예에 대하여 기재하고 나타내었으나, 형식 및 세부 사항은 이하 청구항에 포함되는 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 다양하게 변화될 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다.

Claims (55)

1 이상의 인터뉴클레오시드 포스포러스 원자로 결합되어 있는 2 이상의 뉴클레오시드 부분을 포함하는 포스포라미디트 화합물로서, 상기 인터뉴클레오시드 포스포러스 원자는 포스포러스 (III) 원자인 화합물.
제 1 항에 있어서, 포스포라미디트 부분을 갖고 있는 뉴클레오시드 부분의 3'-위치에 결합되어 있는 포스포라미디트 부분을 포함하는 포스포라미디트 화합물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 포스포라미디트 부분이 식 -X1-PR3NR4R5[식 중, R3는 베타-시아노에틸옥시 또는 베타-시아노에틸티오 그룹이고 R4및 R5은 이소프로필 그룹임]의 그룹인 포스포라미디트 화합물.
전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 인터뉴클레오시드 포스포러스 (III) 원자가 포스파이트 트리에스테르 그룹을 포함하는 포스포라미디트 화합물.
제 4 항에 있어서, 포스파이트 트리에스테르 그룹이 포스포라미디트 부분을 갖고 있는 뉴클레오시드 부분의 5'-위치를 제 2 뉴클레오시드 부분의 3'-위치에 결합시키는 포스포라미디트 화합물.
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 3가 포스포러스 다량체 :
[식 중,
각각의 X1은 독립적으로, -O- 또는 -S- 이고 ;
각각의 X2는 독립적으로, -O-, -S- 또는 -NR- 이고 ;
각각의 X3는 독립적으로, -O-, -S-, -CH2- 또는 -(CH2)2- 이고 ;
R1은 프로텍팅 그룹이고 ;
각각의 R2는 독립적으로, -H-, -F, -NHR6, -CH2R6또는 -OR6이고 ;
각각의 R3는 독립적으로, -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, -OR7또는 -SR7이고 ;
R4및 R5는 각각 독립적으로, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬이거나 ; 또는
R4및 R5는 이들이 결합되어 있는 질소와 함께 헤테로사이클로알킬 그룹 또는 헤테로방향족 그룹을 형성하고 ;
R 은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 또는 아민 프로텍팅 그룹이고 ;
R6는 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬 또는 프로텍팅 그룹이고 ;
R7은 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬이고 ;
각각의 B 는 독립적으로, H 또는 프로텍팅된 또는 프로텍팅되지 않은 뉴클레오시드 염기이고; 및
n 은 0 또는 양의 정수임]
제 6 항에 있어서, 각각의 X1, X2및 X3가 -O- 인 3가 포스포러스 다량체.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, R3가 -OCH2CH2CN 또는 -SCH2CH2CN 인 3가 포스포러스 다량체.
제 6 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 산성의 불안정한 프로텍팅 그룹인 3가 포스포러스 다량체.
제 6 항, 제 7 항, 제 8 항 및 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 -H 인 3가 포스포러스 다량체.
제 6 항, 제 7 항, 제 8 항 및 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 -OR6이고 R6는 Me, -CH2CH2OMe 또는 하이드록시 프로텍팅 그룹인 3가 포스포러스 다량체.
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 3가 포스포러스 다량체 :
[식 중,
R2는 -H 또는 -OR6이고 ;
R6는 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬 또는 알콜 프로텍팅 그룹이고 ;
R8은 치환된 또는 치환되지 않은 트리틸이고 ;
R10및 R11은 각각 독립적으로, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹이고;
각각의 B 는 독립적으로, H 또는 프로텍팅된 또는 프로텍팅되지 않은 뉴클레오시드 염기이고 ; 및
m 은 0 또는 1 임]
제 12 항에 있어서,
R8은 4,4'-디메톡시트리틸이고 ;
R2는 -H 이고 ; 및
R10및 R11은 이소프로필인 다량체.
제 12 항에 있어서,
R8은 4,4'-디메톡시트리틸이고 ;
R2는 -OR6이고 ;
R10및 R11은 이소프로필이고 ; 및
R6는 Me, -CH2CH2OMe,t-부틸디메틸실릴, 테트라하이드로피라닐, 4-메톡시-테트라하이드로피라닐 또는 Fpmp인 다량체.
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 올리고뉴클레오티드의 제조 방법으로서, :
[식 중,
각각의 X1은 독립적으로, -O- 또는 -S- 이고 ;
각각의 X2는 독립적으로, -O-, -S- 또는 -NR- 이고 ;
각각의 X3는 독립적으로, -O-, -S-, -CH2- 또는 -(CH2)2- 이고 ;
각각의 X4는 독립적으로, =O 또는 =S 이고 ;
R 은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹 또는 아민 프로텍팅 그룹이고 ;
각각의 R2은 독립적으로, -H, -F, -NHR6, -CH2R6또는 -OR6이고 ;
R6는 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬 또는 프로텍팅 그룹이고 ;
각각의 R3는 독립적으로, -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, -OR7또는 -SR7이고 ;
R7은 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹 또는 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬이고 ;
R13은 알콜 프로텍팅 그룹, 아민 프로텍팅 그룹, 티올 프로텍팅 그룹, 식 -Y2-L-Y1인 그룹, 식 -Y2-L-Y2-R15인 그룹 또는 고체 보조체이고 ;
R14은 -H 또는 프로텍팅 그룹이고 ;
각각의 B 는 독립적으로, H 또는 프로텍팅된 또는 프로텍팅되지 않은 뉴클레오시드 염기이고 ;
p 는 양의 정수이고 ;
Y1는 에스테르 또는 카복실산 그룹이고 ;
Y2는 단일 결합, -C(O)-, -C(O)NR17-, -C(O)O-, -NR17- 또는 -O- 이고 ;
L 은 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹 또는 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹이고 ; 및
R17은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹 또는 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹임]
a) 하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 3가 포스포러스 다량체를, :
[식 중,
R1은 프로텍팅 그룹이고 ;
R4및 R5는 각각 독립적으로, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬이거나 ; 또는
R4및 R5는 이들이 결합되어 있는 질소와 함께 헤테로사이클로알킬 그룹 또는 헤테로방향족 그룹을 형성하고 ; 및
n 은 0 또는 양의 정수임]
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드와 커플링시켜, :
[식 중,
X5는 -OH 또는 -SH 이고 ; 및
q 는 0 또는 양의 정수임]
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 제 1 중간체를 형성하는 단계 :
b) 제 1 중간체 내 3가 포스포러스 그룹을 산화 또는 황화시켜, 하기 구조식또는 이의 입체 이성질체인 제 2 중간체를 형성하는 단계 :
c) 단계 a)에서 3가 포스포러스 다량체와 반응되지 않은 X5그룹을 선택적으로 캡핑시키는 단계 ;
d) 제 2 중간체를 R1이 제거되도록 처리하여, 5'-디프로텍팅된 올리고뉴클레오티드를 형성하는 단계 ;
c) 최종 단계가 단계 c) 또는 d)가 되도록, 단계 a)-d) 를 1 회 이상 선택적으로 반복하여, 올리고뉴클레오티드를 제조하는 단계
를 포함하는 제조 방법.
제 15 항에 있어서, R13이 고체 보조체인 방법.
제 16 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 생성물을 고체 보조체로부터 분리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 15 항, 제 16 항 및 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 염기를 디프로텍팅시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 15 항에 있어서, X2가 -O- 이고 R13은 알콜 프로텍팅 그룹인 방법.
제 19 항에 있어서, R13프로텍팅 그룹을 올리고뉴클레오티드 생성물로부터 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 15 항, 제 16 항, 제 17 항, 제 18 항, 제 19 항 및 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 치환되지 않은 트리틸, 모노알콕시트리틸, 디알콕시트리틸, 트리알콕시트리틸, 테트라하이드로피라닐 또는 픽실 그룹인 방법.
제 21 항에 있어서, 디클로로메탄 내 디클로로아세트산 용액 및 디클로로메탄 내 트리클로로아세트산 용액으로부터 선택된 산으로 R1이 제거되는 방법.
제 15 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R3가 -OCH2CH2CN 또는 -SCH2CH2CN 인 방법.
제 23 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 염기로 처리함으로써 -OCH2CH2CN 또는 -SCH2CH2CN 으로부터 -CH2CH2CN 이 제거되는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 24 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 염기로 처리하는 동안 뉴클레오티드 염기가 디프로텍팅되는 방법.
제 15 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 중간체를 I2및 물을 함유하고 있는 용액으로 처리함으로써, 3가 포스포러스 그룹이 산화되는 방법.
제 15 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 중간체를 3-아미노-[1,2,4]-디티아졸-5-티온 또는 3H-벤조디티올-3-온1,1-디옥사이드로 처리함으로써, 3가 포스포러스 그룹이 황화되는 방법.
제 15 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a), b), c) 및 d) 의1 이상의 주기가 수행되고, 생성된 올리고뉴클레오티드가 키메라 올리고뉴클레오티드인 방법.
제 15 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 올리고뉴클레오티드가 포스페이트인 방법.
제 15 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트인 방법.
제 15 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 제조된 올리고뉴클레오티드가 50 개 이하의 뉴클레오티드 염기를 갖고 있는 방법.
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 3가 포스포러스 다량체의 제조방법으로서, :
[식 중,
각각의 X1은 독립적으로, -O- 또는 -S- 이고 ;
각각의 X2는 독립적으로, -O-, -S- 또는 -NR- 이고 ;
각각의 X3는 독립적으로, -O-, -S-, -CH2- 또는 -(CH2)2- ;
R1은 프로텍팅 그룹이고 ;
각각의 R2은 독립적으로, -H, -F, -NHR6, -CH2R6또는 -OR6이고 ;
각각의 R3은 독립적으로, -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, -OR7또는 -SR7이고 ;
R4및 R5는 각각 독립적으로, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬이거나 ; 또는
R4및 R5는 이들이 결합되어 있는 질소와 함께 헤테로사이클로알킬 그룹 또는 헤테로방향족 그룹을 형성하고 ;
R 은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 또는 아민 프로텍팅 그룹이고 ;
R6는 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬, 또는 프로텍팅 그룹이고 ;
R7은 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬이고 ;
각각의 B 는 독립적으로, H 또는 프로텍팅된 또는 프로텍팅되지 않은 뉴클레오시드 염기이고 ; 및
n 은 0 또는 양의 정수임]
a) 하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 뉴클레오시드 3'-치환체를 프로텍팅시켜, :
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 제 1 중간체를 형성하는 단계 :
[식 중, R16은 R1과 직교하는 프로텍팅 그룹임]
b) 제 1 중간체를 R1이 제거되도록 처리하여, 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 형성하는 단계 ;
c) 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 커플링 촉매의 존재 하에서 하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 화합물과 반응시켜, :
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 이량체를 형성하는 단계 :
d) 3',5'-프로텍팅된 다량체를 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 이량체를 형성하는 단계 ;
e) 커플링 촉매의 존재 하에서 3'-디프로텍팅된 이량체를 하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 화합물과 선택적으로 반응시켜, :
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 3',5'-프로텍팅된 삼량체를 형성하는 단계 ;
f) 단계 e) 및 f) 를 1 회 이상 선택적으로 반복하여, 3',5'-프로텍팅된 다량체를 형성하는 단계 ;
g) 3',5'-프로텍팅된 다량체를 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 다량체를 형성하는 단계 ;
h) 3'-디프로텍팅된 다량체와 하기 구조식 중 하나인 3가 포스포러스 화합물을 반응시켜, :
[식 중, X6는 할로겐임]
3가 포스포러스 다량체를 형성하는 단계
를 포함하는, 제조 방법.
제 32 항에 있어서, 커플링 촉매가 테트라졸 또는 S-에틸티오테트라졸인 방법.
제 32 항 또는 제 33 항에 있어서, R16이 레불리노일이고, 이는 3',5'-프로텍팅된 다량체를 피리딘/아세트산 내 하이드라진 하이드레이트로 처리함으로써 제거되는 방법.
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 3가 포스포러스 다량체의 제조 방법으로서, :
[식 중,
각각의 X1은 독립적으로, -O- 또는 -S- 이고 ;
각각의 X2는 독립적으로, -O-, -S- 또는 -NR- 이고 ;
각각의 X3는 독립적으로, -O-, -S-, -CH2- 또는 -(CH2)2- 이고 ;
R1은 프로텍팅 그룹이고 ;
각각의 R2은 독립적으로, -H, -F, -NHR6, -CH2R6또는 -OR6이고 ;
각각의 R3은 독립적으로, -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, -OR7또는 -SR7이고 ;
R4및 R5는 각각 독립적으로, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬이거나 ; 또는
R4및 R5는 이들이 결합되어 있는 질소와 함께 헤테로사이클로알킬 그룹 또는 헤테로방향족 그룹을 형성하고 ;
R 은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 또는 아민 프로텍팅 그룹이고 ;
R6은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬 또는 프로텍팅 그룹이고 ;
R7은 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬이고 ;
각각의 B 는 독립적으로, H 또는 프로텍팅된 또는 프로텍팅되지 않은 뉴클레오시드 염기이고 ; 및
n 은 0 또는 양의 정수임]
a) 하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 뉴클레오시드 3'-치환체를 프로텍팅시켜, :
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 제 1 중간체를 형성하는 단계 :
[식 중, R16은 R1에 직교하는 프로텍팅 그룹임]
b) 제 1 중간체를 R1이 제거되도록 처리하여 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 형성하는 단계 ;
c) 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 하기 구조식 중 하나인 3가 포스포러스 화합물과 반응시켜, :
[식 중, X6는 할로겐임]
5'-포스포라미디트를 형성하는 단계 ;
d) 5'-포스포라미디트를 커플링 촉매의 존재 하에서 하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 화합물과 반응시켜, :
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 3',5'-프로텍팅된 이량체를 형성하는 단계 :
e) 3',5'-프로텍팅된 이량체를 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 이량체를 형성하는 단계 ;
f) 커플링 촉매의 존재 하에서, 3'-디프로텍팅된 이량체를 하기 구조식 또는이의 입체 이성질체인 화합물과 선택적으로 반응시켜, :
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 3',5'-프로텍팅된 삼량체를 형성하는 단계 ;
g) 단계 e) 및 f) 를 1 회 이상 선택적으로 반복하여, 3',5'-프로텍팅된 다량체를 형성하는 단계 ;
h) 3',5'-프로텍팅된 다량체를 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 다량체를 형성하는 단계 ;
i) 3'-디프로텍팅된 다량체를 하기 구조식 중 하나인 3가 포스포러스 화합물과 반응시켜, :
[식 중, X6는 할로겐임]
3가 포스포러스 다량체를 형성하는 단계
를 포함하는, 제조 방법.
제 35 항에 있어서, 커플링 촉매가 테트라졸 또는 S-에틸티오테트라졸인 방법.
제 30 항 또는 제 36 항에 있어서, R16이 레불리노일이고, 이는 3',5'-프로텍팅된 다량체를 피리딘/아세트산 내 하이드라진 하이드레이트로 처리함으로써 제거되는 방법.
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인, 3가 포스포러스 다량체가 유도되는고체 보조체 :
[식 중,
각각의 X1은 독립적으로, -O- 또는 -S- 이고 ;
각각의 X2는 독립적으로, -O-, -S- 또는 -NR- 이고 ;
각각의 X3는 독립적으로, -O-, -S-, -CH2- 또는 -(CH2)2- 이고 ;
R1은 프로텍팅 그룹이고 ;
각각의 R2은 독립적으로, -H, -F, -NHR6, -CH2R6또는 -OR6이고 ;
각각의 R3은 독립적으로, -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, -OR7또는 -SR7이고 ;
R 은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹 또는 아민 프로텍팅 그룹이고 ;
R6은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬, 또는 프로텍팅 그룹이고 ;
R7은 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬이고 ;
각각의 B 는 독립적으로, H 또는 프로텍팅된 또는 프로텍팅되지 않은 뉴클레오시드 염기이고 ;
L 은 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹 또는 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹이고 ;
n 은 0 또는 양의 정수이고 ; 및
R15은 고체 보조체임]
제 38 항에 있어서, 각각의 X1, X2및 X3는 -O- 인 고체 보조체.
제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, R3는 -OCH2CH2CN 인 고체 보조체.
제 38 항, 제 39 항 및 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 산성의 불안정한 프로텍팅 그룹인 고체 보조체.
제 41 항에 있어서, R1은 4,4'-디메톡시트리틸인 고체 보조체.
제 38 항, 제 39 항, 제 40 항, 제 41 항 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 -H 인 고체 보조체.
제 38 항, 제 39 항, 제 40 항, 제 41 항 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 -OR6이고 R6은 하이드록시 프로텍팅 그룹인 고체 보조체.
제 38 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, L 은 -CH2CH2- 인 고체 보조체.
제 38 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, R15는 조절된-세공 유리, 폴리스티렌 또는 미세공 폴리아미드를 포함하는 고체 보조체.
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인, 다량체가 유도되는 고체 보조체의 제조 방법으로서, :
[식 중,
각각의 X1은 독립적으로, -O- 또는 -S- 이고 ;
각각의 X2는 독립적으로, -O-, -S- 또는 -NR- 이고 ;
각각의 X3는 독립적으로, -O-, -S-, -CH2또는 -(CH2)2- 이고 ;
R1은 프로텍팅 그룹이고 ;
각각의 R2은 독립적으로 -H, -F, -NHR6, -CH2R6또는 -OR6이고 ;
각각의 R3은 독립적으로 -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, -OR7또는 -SR7이고 ;
R 은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬 그룹이고, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 또는 아민 프로텍팅 그룹이고 ;
R6은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬, 또는 프로텍팅 그룹이고 ;
R7은 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬이고 ;
각각의 B 는 독립적으로, H 또는 프로텍팅된 또는 프로텍팅되지 않은 뉴클레오시드 염기이고 ;
L 은 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹 또는 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹이고 ;
n 은 0 또는 양의 정수이고 ; 및
R15은 고체 보조체임]
a) 하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 뉴클레오시드 3'-치환체를 프로텍팅시켜, :
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 제 1 중간체를 형성하는 단계 :
[식 중, R16은 R1에 직교하는 프로텍팅 그룹임];
b) 제 1 중간체를 R1이 제거되도록 처리하여, 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 형성하는 단계 ;
c) 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 커플링 촉매의 존재 하에서 하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 화합물과 반응시켜, :
[식 중,
R4및 R5는 각각 독립적으로, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬이거나 ; 또는
R4및 R5는 이들이 결합되어 있는 질소와 함께 헤테로사이클로알킬 그룹 또는 헤테로방향족 그룹을 형성함]
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 이량체를 형성하는 단계 ;
d) 3',5'-프로텍팅된 이량체를 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 이량체를 형성하는 단계 ;
e) 커플링 촉매의 존재 하에서 3'-디프로텍팅된 이량체를 하기 구조식 또는이의 입체 이성질체인 화합물과 선택적으로 반응시켜, :
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 3',5'-프로텍팅된 삼량체를 형성하는 단계 :
f) 단계 e) 및 f) 를 1 회 이상 선택적으로 반복하여, 3'.5'-프로텍팅된 다량체를 형성하는 단계 ;
g) 3',5'-프로텍팅된 다량체를 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 다량체를 형성하는 단계 ;
h) 3'-디프로텍팅된 다량체를 염기 존재 하에서 하기 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물과 반응시켜, :
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 고체 보조체 로딩 시약을 형성하는 단계 : 및
i) 고체 보조체 로딩 시약을 염기 및 치환된 또는 치환되지 않은 디-지방족 카보디이미드의 존재 하에서 1차 또는 2차 아민 그룹으로 관능화된 고체 보조체와 반응시켜, 상기 다량체가 유도되는 고체 보조체를 제조하는 단계 ;
를 포함하는, 제조 방법.
제 47 항에 있어서, 단계 f) 에서 제조된 고체 보조체 로딩 시약을 염기 및 치환된 또는 치환되지 않은 디-지방족 카보디이미드의 존재 하에서 p-니트로페놀과 반응시켜, 활성화된 고체 보조체 로딩 시약을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 48 항에 있어서, 치환된 또는 치환되지 않은 디-지방족 카보디이미드는 디사이클로헥실 카보디이미드 또는 디이소프로필 카보디이미드인 방법.
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인, 다량체가 유도되는 고체 보조체의 제조 방법으로서, :
각각의 X1은 독립적으로, -O- 또는 -S- 이고 ;
각각의 X2는 독립적으로, -O-, -S- 또는 -NR- 이고 ;
각각의 X3는 독립적으로, -O-, -S-, -CH2- 또는 -(CH2)2- 이고 ;
R1은 프로텍팅 그룹이고 ;
각각의 R2은 독립적으로 -H, -F, -NHR6, -CH2R6또는 -OR6이고 ;
각각의 R3은 독립적으로 -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, -OR7또는 -SR7이고 ;
R 은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬 그룹이고, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 또는 아민 프로텍팅 그룹이고 ;
R6은 -H, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬, 또는 프로텍팅 그룹이고 ;
R7은 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬이고 ;
각각의 B 는 독립적으로, H 또는 프로텍팅된 또는 프로텍팅되지 않은 뉴클레오시드 염기이고 ;
L 은 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹 또는 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹이고 ;
n 은 0 또는 양의 정수이고 ; 및
R15은 고체 보조체임]
a) 하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 뉴클레오시드 3'-치환체를 프로텍팅시켜, :
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 제 1 중간체를 형성하는 단계 :
[식 중, R16은 R1에 직교하는 프로텍팅 그룹임]
b) 제 1 중간체를 산으로 처리함으로써 R1을 제거하여, 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 형성하는 단계 ;
c) 5'-디프로텍팅된 뉴클레오시드를 하기 구조식 중 하나인 3가 포스포러스화합물과 반응시켜, :
[식 중,
X6는 할로겐이고 ;
R4및 R5는 각각 독립적으로, 치환된 또는 치환되지 않은 지방족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환된 또는 치환되지 않은 아랄킬이거나 ; 또는
R4및 R5는 이들이 결합되어 있는 질소와 함께 헤테로사이클로알킬 그룹 또는 헤테로방향족 그룹을 형성함]
5'-포스포로라미디트를 형성하고 ;
d) 5'-포스포로라미디트를 커플링 촉매의 존재 하에서 하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 화합물과 반응시켜, :
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 3',5'-프로텍팅된 이량체를 형성하는 단계 :
e) 3',5'-프로텍팅된 이량체를 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 이량체를 형성하는 단계 ;
f) 커플링 촉매의 존재 하에서 3'-디프로텍팅된 이량체를 하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 화합물과 선택적으로 반응시켜, :
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 3',5'-프로텍팅된 삼량체를 형성하는 단계 :
g) 단계 e) 및 f) 를 1 회 이상 선택적으로 반복하여, 3',5'-프로텍팅된 다량체를 형성하는 단계 ;
h) 3',5'-프로텍팅된 다량체를 R16이 제거되도록 처리하여, 3'-디프로텍팅된 다량체를 형성하는 단계 ;
i) 3'-디프로텍팅된 다량체를 염기의 존재 하에서 하기 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물와 반응시켜, :
하기 구조식 또는 이의 입체 이성질체인 고체 보조체 로딩 시약을 형성하는단계 :
j) 고체 보조체 로딩 시약을 염기 및 치환된 또는 치환되지 않은 디-지방족 카보디이미드의 존재 하에서 1차 또는 2차 아민 관능화 그룹으로 관능화된 고체 보조체와 반응시켜, 상기 다량체가 유도되는 고체 보조체를 제조하는 단계
를 포함하는, 제조 방법.
제 50 항에 있어서, 단계 h)에서 제조된 고체 보조체 로딩 시약을 염기 및 치환된 또는 치환되지 않은 디-지방족 카보디이미드의 존재 하에서 p-니트로페놀과 반응시켜, 활성화된 고체 보조체 로딩 시약을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 51 항에 있어서, 치환된 또는 치환되지 않은 디-지방족 카보디이미드는 디사이클로헥실 카보디이미드 또는 디이소프로필 카보디이미드인 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 포스포라미디트 화합물의 올리고뉴클레오티드 합성에서의 용도.
제 6 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 3가 포스포러스 다량체의 올리고뉴클레오티드 합성에서의 용도.
제 38 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항의, 3가 포스포러스 다량체가 유도되는 고체 보조체의 올리고뉴클레오티드 합성에서의 용도.
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