KR20000069706A - 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성 방법 - Google Patents

포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성 방법 Download PDF

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파샬 비. 린네
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Abstract

본 발명은 지지-결합된 포스포아미디트 중간물을 이용하여 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명의 방법을 실시하는데 있어서 유용한 포스포아미디트 중간물도 개시되어 있다.

Description

포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성 방법{Method of Synthesizing Phosphorothioate Oligonucleotides}
포유동물에 있어서 대부분의 질병들을 포함하는 신체 상태의 대부분이 단백질의 영향을 받는다는 것은 잘 알려져 있다. 상기 단백질은 직접적 혹은 효소적 작용을 통해 동물이나 사람의 여러 가지 질병에 있어서 중요한 부분을 차지하고 있다. 전통적인 치료법은 병을 유발하거나 혹은 그것을 가능하게 하는 작용을 조절하기 위하여 그러한 단백질들 사이의 상호작용에 중점을 두고 있었다. 그러나 최근에, 세포내 RNA와 같은 단백질 합성을 유도하는 분자의 상호작용으로 상기 단백질의 실질적인 생성을 조절할 수 있었다. 단백질의 생성을 방해함으로 인해, 치료적 측면의 결과에 있어서 최상의 효과와 아주 약간의 부작용이 있을 것으로 예측되어 왔다. 상기 치료적 연구의 일반적인 목적은 바람직하지 않은 단백질 형성을 유도하는 유전자의 발현을 방해하거나 조절하기 위한 것이다.
특정한 유전자 발현을 저해하기 위한 한가지 방법은 안티센스제(antisense agent)로서 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드의 유사체를 이용하는 것이다. 상기 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체는 특이적으로, 표적된 전령 RNA(mRNA) 염기서열과 상보적이다. 안티센스 방법은 세포내 핵산의 정상적이며 본질적인 작용이 방해되는 것과 같이, 단일-가닥 mRNA 또는 단일-가닥 DNA와 그에 비해 상대적으로 길이가 짧은 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체간의 상보적인 잡종화를 제공한다. 잡종화란 Watson-Crick의 RNA 염기쌍 혹은 단일-가닥 DNA와 올리고뉴클레오티드 혹은 올리고뉴클레오티드 유사체간의 서열 특이적 수소결합을 의미한다. 상기 염기쌍은 서로 다른 것에 상보적이다.
안티센스 치료법에 대한 초기의 연구는 잡종화에 의해 특정 mRNA에 특이한 방법으로 결합되도록 고안된 올리고뉴클레오티드 혹은 올리고뉴클레오티드 유사체를 제공해 왔다(즉, 표적 mRNA와 특이적으로 잡종화될 수 있는 올리고뉴클레오티드). 상기 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체는 여러 기작들 즉, mRNA에 의해 암호화되는 단백질을 생성하는 해독 반응들을 방해하여 선택된 mRNA의 활성을 저해하도록 하였다. 상기 mRNA 염기서열에 의해 암호화되는 특정 단백질 형성을 저해하는 것은 치료적으로 실익이 있을 것이라고 기대하고 있다; 그러나 여전히 해결해야 하는 문제들은 남아있다(Cook, P.D. Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585; Cook, P.D. Medicinal Chemistry Strategies for Antisense Research, in Antisense Research & Applications, Crooke 외, CRC Press, Inc.; Boca Raton, FL, 1993; 및 Uhlmann 외, A. Chem. Rev. 1990, 90, 543).
올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체들은 치료 및 진단 방법을 위해 보장된 치료제로서 이용된다. 그러나 치료 목적, 진단 목적 및 연구 시약을 위한 안티센스제로서, 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 출원하는 출원인들은 대량으로 합성되며, 세포에 의해 흡착되고 혹은 세포막간을 이동하며, 표적된 RNA 혹은 DNA에 적절하게 잡종화될 수 있는, 그리고 핵산의 기능을 일시적으로 종결시키고 방해하는 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 종종 필요로 한다. 이러한 중요한 기능들은 뉴클레아제 분해에 대한 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체의 초기 안정성에 달려 있다.
상기 목적, 특히 안티센스 치료법을 위한 비변형된 올리고뉴클레오티드의 결핍 현상은 세포내 및 세포외에 어디에나 존재하는 여러 가지 뉴클레오리틱 (nucleolytic) 효소가 투여된 올리고뉴클레오티드를 효소적으로 분해하는 것이다.
많은 화학적 변형은 치료적 활성을 증가시키기 위하여 안티센스제(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체)에 도입된다. 상기 변형은 안티센스제의 세포 침투력을 증가시키고, 신체내에서 그것들의 구조 혹은 활성을 저하시키거나 방해하는 뉴클레아제 및 다른 효소들로부터 안티센스제를 안정화시키고, 표적 RNA에 안티센스제가 결합되는 것을 증진시키며, 안티센스제가 표적 RNA에 서열-특이적으로 결합되었을 경우 방해 작용(종결되는 것)이 제공되고, 그리고 안티센스제의 파마코키네틱(pharmacokinetic) 및 파마코다이나믹(pharmacodynamic) 특성을 증진시키기 위한 것이다. 비변형된 "야생형(wild type)" 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 빠르게 분해되기 때문에 유용한 치료제가 될 가능성이 없다.
특정한 포스포로티오에이트 결합이 변형되어 있는 올리고뉴클레오티드는 RNA와의 잡종화에 있어서 RNase H의 활성으로 RNA를 종결시키는 작용을 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드 유사체는 진핵생물 및 원핵생물의 기관에 있어서 유전자 발현의 서열 특이적 조절자라는 것이 알려져 왔으며, 지금까지 실제 출원된 바에 의하면 가장 잘 보장된 "안티센스" 치료제이다(Eckstein, Oligonucleotide and Analogs, A Practical Approach, 1991, IRL Press, pp. 87-103).
약품으로서 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 출원하고자 하는 잠재적인 출원들에 의해 상기의 화합물을 거대한 규모로 합성하기 위한 새로운 방법들이 시도되고 있다. 그러므로 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해서는 보다 향상된 방법들이 요구된다. 본 발명은 또 다른 필요성들과 함께, 상기의 목적을 위해서 제공된다.
본 발명은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성 방법 및 상기 방법에 있어서 신규의 유용한 합성 중간물을 제공한다. 상기 방법은 고체상 지지체 위에서 아미디트(amidites)가 생성되는 것을 포함한다. 상기 방법은 진단 시약, 연구 시약 및 치료제로서 사용될 수 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 다른 방법들보다 유용하다.
발명의 요약
본 발명의 포스포로티오에이트 결합을 갖는 올리고머 화합물을 제공하는 신규의 방법을 제시한다. 지지-결합된 포스포아미디트(phosphoramidite)를 생성하는 것을 포함하는 고체상 지지체 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
하기 구조식의 포스포디아미디트(phosphordiamidite)와:
(상기에서 R1은 보호기이고; R2및 R3는 디알킬아미노 혹은 모폴리노이며; B는 뉴클레오시드 염기이며; 그리고 R6은 할로겐, O-알킬, O-알킬아미노, O-알킬알콕시, 보호된 O-알킬아미노, O-알킬아미노알킬, O-알킬 이미다졸 혹은 구조식 (O-알킬)m의 폴리에스테르이며, 여기에서 상기 m은 1 내지 10의 수임);
하기 구조식의 지지-결합된 신톤을 반응시켜:
(상기에서 R4는 고체상 지지체에 연결되는 링커이며; R5는 포스포릴 보호기이고; 그리고 n은 0 내지 100의 수임);
지지-결합된 포스포아미디트를 형성한다. 상기 지지-결합된 포스포아미디트는 하기 구조식을 갖는다:
상기 지지-결합된 포스포아미디트를 R5-OH의 구조식을 갖는 반응물로 바람직하게 반응시켜 보호하여 하기 구조식의 지지-결합된 포스파이트를 형성한다:
보호된 포스포로티오에이트를 형성하기 위해 상기 지지-결합된 포스파이트를 황화시킨 후, n이 1씩 증가하면서 지지-결합된 신톤을 형성하기 위하여 상기 보호된 포스포로티오에이트를 디프로텍트(deprotect) 한다.
여러 가지 치환체 R1-6은 올리고머 하부단위에 있어서 동일하거나 상이할 수 있다는 것은 널리 알려져 있다.
여러 가지 바람직한 구체예에서, R2및 R3는 디이소프로필아미노이다. 다른 바람직한 구체예에서, R5는 2-시아노에틸, 4-시아노-2-부테닐 혹은 디페닐메틸실릴에틸이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 유기 염기, 바람직하게는 테트라졸이 존재하는 상태에서 지지-결합된 신톤과 함께 포스파이트 화합물을 반응시킨다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 지지-결합된 포스파이트는 뷰케이지 시약, 테트라에틸티우람 다이설파이드, 디벤조일 테트라설파이드, 펜아세틸 다이설파이드, 1,2,4-디티우아졸린-5-원, 3-에톡시-1,2,4-디티우아졸린-5-원, 설폰산의 다이설파이드, 황 또는 트리아릴, 트리알킬, 트리아랄킬 혹은 트리알카릴 포스핀과 같은 리간드와 결합한 황과 같은 황화 반응물과 함께 산화된다.
본 발명의 방법은 비자연적으로 생성되는 뉴클레오염기와 마찬가지로 자연적으로 생성되는 뉴클레오시드 염기인 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실을 포함하는 매우 다양한 뉴클레오시드 염기로 이루어지는 올리고뉴클레오티드의 합성을 제공한다.
바람직한 구체예에서, n은 0 내지 약 100이며, 바람직하게는 1 내지 약 30이며, 그리고 더욱 바람직하게는 15 내지 약 25이다.
본 발명은 하기 구조식의 화합물을 제공한다:
상기식에서 B, R1, R2, R4, R5및 R6은 위에서 기재한 바와 같으며, n은 1 내지 약 100의 수이다.
바람직한 구체예에 대한 상세한 설명
본 발명은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 합성하는 신규의 방법을 제공하는 것으로, 고체상 지지체에 결합되어 있는 포스포아미디트의 생성을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 하기 구조식의 포스포디아미디트 화합물과:
(상기식에서 R1은 보호기이고; B는 뉴클레오시드 염기이며; R2및 R3는 디알킬아미노 혹은 모폴리노이며; 그리고 R6은 할로겐, O-알킬, O-알킬아미노, O-알킬알콕시, 보호된 O-알킬아미노, O-알킬아미노알킬, O-알킬 이미다졸 혹은 구조식 (O-알킬)m의 폴리에스테르이며, 여기에서 상기 m은 1 내지 10의 수임);
하기 구조식의 지지-결합된 신톤을 반응시켜:
(상기식에서 R4는 고체상 지지체에 연결되는 링커이며; R5는 포스포릴 보호기이고; 그리고 n은 0 내지 100의 수임);
하기 구조식의 지지-결합된 포스포아미디트를 형성한다:
포스포디아미디트는 예를 들어, Uznanski 외, Tetrahedron Letters 1989, 30 (5) 543-546에 기재되어 있는 절차에 따라 5'-보호된 뉴클레오시드와 함께 비스(디알킬아미노)클로로포스핀을 축합하여 제공될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예로는, 초기에 지지-결합된 신톤은 이미 알려진 방법에 따라 뉴클레오시드 3'-산소 즉, 바람직하게는 링커 분자를 통해 고체상 지지체에 적절하게 보호된 뉴클레오시드를 공유 부착시켜 제공된다(예를 들어, Eckstein, supra). 뉴클레오시드 5'-하이드록실, 엑소시클릭 아민기 및 다른 작용기의 보호 방법은 예를 들어, Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d ed, John Wiley & Sons, New York, 1991에서 찾아볼 수 있다. 일반적으로 지지 연결된 뉴클레오시드의 5'-보호기는 희석된 산으로 처리하여 제거되며, 용액 즉, 바람직하게는 무수의 아세토니트릴과 함께 지지체로부터 세척된다(헹궈진다). 포스포디아미디트 및 지지-결합된 신톤의 반응은 아세토니트릴과 같은 용액에서, 바람직하게는 예를 들어, 테트라졸과 같은 전형적인 유기 염기인 활성제가 있는 상태에서 수행된다. 합성된 지지-결합된 아미디트는 포스포릴 보호기가 부착되어 보호된다. 포스포릴 보호기는 올리고뉴클레오티드 합성시 적절하게 사용되는 보호기로서 당업계에 잘 알려져 있다. 대표적인 포스포릴 보호기는 2-시아노에틸(Koster 외의 미국특허 제4,725,677호 및 재공고 제34,069호), 메틸, 4-시아노-2-부테닐 및 디페닐메틸실릴에틸(DPSE)기이다.
하기 구조식을 갖는 지지-결합된 포스파이트를 형성하기 위하여, 포스포릴 보호기는 구조식 HO-R5를 갖는 반응물을 첨가하고 디알킬아미노, 모폴리노 또는 유사 아미노기가 이탈하여 보호되는 포스포릴기에 전형적으로 결합된다:
상기 -OR5기는 테트라졸과 같은 유기 염기인 활성제가 존재하는 상태에서 포스포러스에 적절하게 접촉시킨다. 그 다음, 지지-결합된 포스파이트가 황화되어, n이 1씩 증가하여 지지-결합된 신톤을 형성하기 위해 5'-위치에서 디프로텍트 한다. 바람직한 포스포로티오에이트가 얻어질 때까지 상기 순환 반응을 되풀이한다. 상기 완성된 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트는 일반적으로 암모니움 하이드록시드와 같은 강한 염기와 함께, 고체상 지지체로부터 절단된다. 절단이 이루어지는 동안, 포스포러스 보호기는 고체상 지지체에 결합된 것과 같이 절단된다. 이와 같이, 상기 절단 과정은 보호된 작용기의 디프로텍션(deprotection) 이전 혹은 이후에 이루어질 수 있으며, 포스포로티오에이트가 없는 모든 보호기를 형성시킬 수 있다.
뷰케이지(Beaucage) 시약(예를 들어, Iyer, R.P. 외, J. Chem. Soc. 1990, 112, 1253-1254 및 Iyer, R.P. 외, J. Org. Chem. 1990, 55, 4693-4699); 테트라에틸티우람 다이설파이드(예를 들어, Vu, H., Hirschbein, B.L., Tetrahedron Lett. 1991, 32, 3005-3008); 디벤조일 테트라설파이드(예를 들어, Rao, M.V. 외., Tetrahedron Lett. 1992, 33, 4839-4842); 디(페닐아세틸)다이설파이드(예를 들어, Kamer, P.C.J., Tetrahedron Lett. 1989, 30, 6757-6760); 1,2,4-디티우아졸린-5-원(DtsNH) 및 3-에톡시-1,2,4-디티우아졸린-5-원(EDITH)(Xu 외, Nucleic Acids Research, 1996, 24, 3643-3644 및 Xu 외, Nucleic Acids Research, 1996, 24, 1602-1607); 및 Stec 외의 미국특허 제5,292,875호 및 Stec 외의 미국특허 제5,151,510호에 개시되어 있는 티오포스포로스 화합물, Efimov 외, Nucleic Acids Research, 1995, 23, 4029-4033에서 개시된 설폰산의 다이설파이드, 황, 트리아릴, 트리알킬, 트리아랄킬 혹은 트리알카릴 포스핀과 같은 리간드와 결합한 황을 포함하는 황화 반응물은 포스포로티오에이트 결합을 형성하기 위해 산화하는 동안 사용된다.
본 발명의 문맥상에서, 상기 "올리고뉴클레오티드"는 특정한 염기서열로 형성되는 복수로 연결된 뉴클레오티드 단위를 의미한다. 뉴클레오티드란 뉴클레오시드의 포스포릴 에스테르를 의미한다. "뉴클레오시드"란 뉴클레오시드 염기(즉, 질소를 함유한 헤테로시클릭 염기 혹은 "뉴클레오염기")와 펜토푸라노실 당의 결합을 의미한다.
본 발명의 방법은 자연적 그리고 비자연적으로 생성되는 조성기를 둘 다 갖고 있는 포스포로티오에이트 올리고머를 합성하기 위해 이용된다. 예를 들면, 본 발명은 리보오스 및 데옥시리보오스와 같이 자연적으로 생성된 5탄당 성분, 그리고 올리고뉴클레오티드 유사체에 있어서 치환된 것으로 알려진 다른 당들과 마찬가지로 그것들의 치환된 유도체를 갖고 있는 포스포로티오에이트 올리고머를 합성하는 데에 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위해 이용된다. 상기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 당 성분과 뉴클레오시드 염기는 자연적 혹은 비자연적으로 생성될 수 있다. 비자연적으로 생성된 당 및 뉴클레오시드 염기는 자연적으로 생성된 당(예를 들어, 리보오스 및 데옥시리보오스) 및 뉴클레오시드 염기(예를 들어, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민)와 통상 서로 구조적으로 구별되지만, 기능적으로는 상호 교체가 가능하다. 이와 같이, 비자연적으로 생성된 뉴클레오염기 및 당은 자연적으로 생성된 종의 구조 및/혹은 기능을 모방하고, 표적에 대한 포스포로티오에이트의 결합을 도와주며, 혹은 포스포로티오에이트 올리고머의 특징에 이득이 될 수 있도록 기여를 하는 상기 모든 구조들을 포함한다.
본 발명의 방법은 2'-위치에 부착되는 여러 치환체들을 갖는 포스포로티오에이트 올리고머의 합성을 제공한다. 이러한 것들은 예를 들어, 할로겐, O-알킬, O-알킬아미노, O-알킬알콕시, 보호된 O-알킬아미노, O-알킬아미노알킬, O-알킬 이미다졸 및 m이 1 내지 약 10인 구조식 (O-알킬)m의 폴리에스테르를 포함한다. 상기 폴리에스테르 중에 바람직한 것은 선형 및 환형의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 크라운 에테르와 Ouchi 외, Drug Design and Discovery 1992, 9, 93, Ravasio 외, J. Org. Chem. 1991, 56, 4329, 그리고 Delgardo 외, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9, 249에서 개시된 것과 같은 (PEG)-함유기이다. 또한 당 변형은 Cook, P.D., supra에서 개시하고 있다. 플루오로, O-알킬, O-알킬아미노, O-알킬 이미다졸, O-알킬아미노알킬 및 알킬 아미노 치환은 「2' 및 5' 치환된 피리미딘 뉴클레오티드를 갖는 올리고머 화합물」을 발명의 명칭으로 한 1995. 3. 6 출원된 미국특허출원 제08/398,901호에 기재되어 있으며, 여기서 참고로 인용하였다.
또한 리보실 고리에서 O-치환을 하는 당이 본 발명에서 제공된다. 고리 O에는 S, CH2, CHF 및 CF2가 대표적으로 치환된다(예를 들어, Secrist 외, Abstract 21, Program & Abstracts, Tenth International Roundtable, Nucleosides, Nucleotides and their Biological Applications, Park City, Utah, Sept. 16-20, 1992).
본 발명의 방법에 있어서 바람직하게 이용되는 대표적인 뉴클레오염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 우리딘 및 티민을 포함하며, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 5-할로 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(유사 우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 옥사, 아미노, 티롤, 티오알킬, 하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌류 및 구아닌류, 5-트리플루오로-메틸 및 다른 5-치환된 우라실류와 시토신류, 그리고 7-메틸구아닌과 같이 비자연적 및 자연적으로 생성되는 뉴클레오염기를 포함한다. 또한 자연적 및 비자연적으로 생성되는 뉴클레오염기는 미국특허 제3,687,808호(Merigan 외); Chapter 15 by Sanghvi, Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu, CRC Press, 1993; Englisch 외, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, pp. 613-722(특히, pp. 622-623); Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J.I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, 1990, pp. 858-859; 및 Cook, P.D., Anti-Cancer Drug Design, 1991, 6, pp. 585-607에 개시된 것들을 포함한다. 또한 "뉴클레오시드 염기" 및 "뉴클레오염기"란 대부분의 전통적인 뉴클레오시드 염기가 아닌 뉴클레오시드 염기와 유사한 기능을 하는 것이 확실한 '절대적(universal) 염기'를 포함하는 뉴클레오시드 염기로서 제공될 수 있는 헤테로시클릭 화합물을 포함하는 것이다. 그러한 절대적 염기의 한가지 대표적인 예는 3-니트로피롤이다.
본 발명의 방법은 합성이 이루어지는 동안 여러 가지 작용을 하는 일부분을 보호하기 위해 불안정한(labile) 보호기를 이용한다. 보호기는 여러 가지 다른 형태의 작용기를 보호하기 위해 본 발명의 올리고뉴클레오티드 합성 방법에 이용된다. 일반적으로, 보호기는 특정 반응 상태에서 화학적 작용기를 불활성하게 하며, 분자의 잔여 부분에 실질적 손상을 주지 않고 상기 분자로부터 작용기로부터 부착되거나 제거된다(예를 들어, Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d edition, John Wiley & Sons, New York, 1991). 핵산 케미스트리에 이용되는 대표적인 하이드록실 보호기는 Beaucage 외, Tetrahedron 1992, 48, 2223에 의해 개시된다. 포스포로티오에이트가 합성되는 동안 뉴클레오티드를 보호하기 위해 유용한 대표적 보호기는 염기 불안정 보호기 및 산 불안정 보호기를 포함하고 있다. 염기 불안정 보호기는 헤테로시클릭 뉴클레오염기의 엑소시클릭 아미노기를 보호하는 데에 이용된다. 이러한 보호 형태는 일반적으로 아실화에 의해서 이루어진다. 두가지 통상적으로 사용되는 아실화기는 벤조일클로라이드 및 이소부티릴클로라이드이다. 이러한 보호기는 올리고뉴클레오티드가 합성되는 동안에 이용되는 반응 조건에 안정적이며, 합성의 마지막 단계에서 염기 처리를 하는 동안 대개 같은 비율로 절단된다. 본 발명의 포스포로티오에이트 합성 방법에 있어서 이용되는 두 번째 보호 형태는 합성되는 동안 뉴클레오티드 5' 하이드록실을 보호하는 데 이용되는 산 불안정 보호기이다.
본 발명의 포스포디아미디트의 아미노 부분은 표준 올리고뉴클레오티드 합성에 있어서 포스포아미디트를 위해 직접적으로 이용되는 여러 가지 아민으로부터 선택될 수 있다. 상기의 것은 지방성 및 헤테로알킬 아민을 둘 다 포함한다. 바람직한 아미노기는 디이소프로필아미노이다. 다른 바람직한 아민의 예는 여러 미국특허(주로 M. Caruthers 외)에서 개시하고 있다. 상기 미국특허에는 제4,668,777호, 제4,458,066호, 제4,415,732호 및 제4,500,707호가 포함되며 여기의 모든 것들은 참고로 인용되었다.
본 발명의 여러 가지 바람직한 구체예에 있어서, 상기 포스포디아미디트는 활성제를 이용하여 5' 하이드록실이 친핵성 공격을 하도록 활성화된다. 활성제는 하나의 아미노기를 포스포로디아미디트로 치환하여, 연결되는 뉴클레오티드 사슬의 상기 5' 하이드록실기가 친핵성 공격을 더욱 하기 쉽도록 포스포디아미디트의 포스포러스를 제공하는 것으로 알려져 있다. 상기 연결되는 뉴클레오티드 사슬과 상호작용 없이 친핵성 공격으로 포스포러스를 활성화시킬 수 있는 모든 활성제는 본 발명에 적절하게 이용될 수 있다. 하나의 바람직한 활성제는 테트라졸이다. 여러 가지 상업적으로 입수 가능하며 통상적으로 이용되는 활성제는 티오테트라졸, 니트로테트라졸 및 N,N-디이소프로필아미노하이드로테트라졸리드이다. 다른 바람직한 활성제는 미국특허 제4,725,677호를 비롯하여 위에서 언급한 특허들과, Berner, S., Muhlegger, K., 및 Seliger, H., Nucleic Acids Research 1989, 17:853; Dahl, B.H., Nielsen, J. 및 Dahl, O., Nucleic Acids Research 1987, 15:1729; 그리고 Nielson, J. Marugg, J.E., Van Boom, J.H., Honnens, J., Taagaard, M. 및 Dahl, O., J. Chem. Research 1986, 26에서 개시되어 있으며, 여기에서 참고로 인용되었다.
일반적으로 캡핑(capping) 단계는 지지-결합된 포스파이트의 황화 반응 전 혹은 후에 행하는 것이 바람직하다. 상기 캡핑 단계는 커플링 순환 과정(coupling cycle)에서 반응이 되지 않은 차단 사슬(blocking chain)이 올리고머 사슬을 짧게 만드는 것을 방지하는 측면에서 바람직하다. 캡핑에 이용되는 한가지 대표적인 반응물은 아세틱 안하이드리드이다. 다른 바람직한 캡핑 반응물 및 방법은 미국특허 제4,816,571호에서 개시하고 있다.
여기에서 사용되는 "알킬"은 직선 사슬, 가지 사슬 및 지방족 탄화수소기를 포함하지만, 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 알킬기는 치환이 가능하다. 대표적인 알킬 치환체는 미국특허 제5,212,295호의 12번째 지면, 41 내지 50번째 줄에 개시하고 있다.
여기에서 사용되는 상기 "아랄킬"은 예를 들어, 벤질기와 같은 아릴기를 갖고 있는 알킬기를 나타낸다. 상기 "알카릴"은 예를 들어, 메틸페닐기와 같은 알킬기를 갖고 있는 아릴기를 나타낸다. 그리고 상기 "아릴"기는 페닐, 나프틸, 안트라실, 펜난트릴, 피레닐 및 크실릴에 제한되지 않는 것을 포함하는 방향족 고리 화합물이다.
여기에서 사용되는 상기 O-알킬아미노는 O-알킬-NH2의 구조식을 갖는 기를 나타낸다. 상기 O-알킬알콕시는 -O-알킬-O-알킬의 구조식을 갖는 기를 나타낸다. 상기 O-알킬아미노알킬은 아미노 부분이 하나 이상의 부가적인 알킬기를 갖고 있는 O-알킬아미노기를 의미한다. 상기 O-알킬리미다졸은 O-알킬-이미다졸의 구조식을 갖는 기를 의미한다.
여기에서 사용되는 "헤테로시클로알킬"은 하나 이상의 헤테로원자(즉, 비-탄소 원자)를 갖고 있는 알킬 고리 구조를 의미한다. 바람직한 헤테로시클로알킬기는 예를 들어, 모폴리노기를 포함한다. 여기에서 사용되는 "헤테로시클로알케닐"은 하나 이상의 이중 결합과 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 고리 구조를 의미한다. 바람직한 헤테로시클로알케닐기는 예를 들어, 피롤리디노기를 포함하고 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, R4는 고체상 지지체에 연결되는 링커이다. 고체상 지지체는 Caruthers의 미국특허 제4,415,732호, 제4,458,066호, 제4,500,707호, 제4,668,777호, 제4,973,679호 및 제5,132,418호와 Koster 외의 미국특허 제4,725,677호 및 재공고 제34,069호에서 기재된 고체상 합성 방법에 있어서 고체상으로 제공될 수 있는 치환체이다. 링커는 고체상 합성 기술에 있어서 초기 신톤 분자의 작용기(예를 들어, 하이드록실기)에 고체상 지지체를 연결하는 짧은 분자(short molecule)이며, 이것은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach, Ekstein, F. Ed., IRL Press, N.Y., 1991, Chapter 1, pp. 1-23에서는 바람직한 링커들을 개시하고 있다.
본 발명에 부합하는 고체상 지지체는 예를 들어, 제어된 포아 클래스(CPG), 옥살릴-제어된 포아 글래스(예를 들어, Allul 외, Nucleic Acids Research 1991, 19, 1527), 텐타젤 지지체(아미노폴리에틸렌글리콜 유도 지지체(예를 들어, Wright 외, Tetrahedron Letters 1993, 34, 3373)) 및 포로스(폴리스티렌/디비닐벤젠의 공중합체)를 포함한 고체상 방법에서 당업계에서 일반적으로 알려진 적절하게 이용할 수 있는 것을 포함한다.
본 발명의 여러 바람직한 구체예에서, R1혹은 R4는 하이드록실 보호기일 수 있다. 본 발명의 방법에서는 매우 다양한 하이드록실 보호기가 이용될 수 있다. 바람직하게, 상기 보호기는 산성 상태에서는 제거될 수 있으나 염기성 상태에서는 안정적이다. 일반적으로, 보호기는 특정 반응 상태에서 화학적 작용기들을 불활성하게 하며, 분자의 잔여 부분에 실질적으로 손상을 주지 않고 상기 분자에 그러한 작용기로부터 부착되거나 제거될 수 있다. 대표적인 하이드록실 보호기는 Beaucage 외, Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311 및 Greene and Wuts, supra, Chapter 2에서 개시하고 있다. R2, R3및 R3a를 위해 이용되는 바람직한 보호기는 디메톡시트틀(DMT), 모노메톡시트리틀, 9-페닐크잔텐-9-일(Pixyl) 및 9-(p-메톡시페닐)크잔텐-9-일(Mox)을 포함한다. R2혹은 R3기는 하이드록실이 없는 형태로 제공될 수 있도록 당업계에 잘 알려진 기술로 본 발명의 올리고머 화합물로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 디메톡시트리틀 보호기는 포름산, 디클로로아세트산, 트리클로로아세트산 및 p-톨루엔 설폰산과 같은 양성자성(protic) 산 혹은 브롬화 아연과 같은 레위스(Lewis) 산에 의해 제거될 수 있다(Greene and Wuts, supra).
본 발명의 바람직한 구체예에서, 아미노기는 알킬 혹은 예를 들어, 2'-알콕시기와 같은 다른 기에 부착된다(예를 들어, 상기 R1은 알콕시). 상기 아미노기는 자연적 및 비자연적으로 생성되는 뉴클레오염기에서 일반적으로 존재한다. 본 발명의 올리고머 화합물을 합성하는 동안 상기 아미노기는 보호된 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해서, 바람직한 대표적 아미노 보호기는 Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 7, 2d ed., John Wiley & Sons, New York, 1991에서 개시되어 있다. 일반적으로, 여기에서 사용되는 "뉴클레오염기"와 같은 분자의 일부분과 연관되어 사용되는 "보호된"이라는 용어는 분자의 일부분이 보호기에 의해 보호되는 하나 이상의 작용기를 포함하고 있다는 것을 가리킨다.
본 발명의 방법에 의해 형성되는 포스포로티오에이트는 특이 표적 올리고뉴클레오티드에 바람직하게 잡종화될 수 있을 것이다. 바람직하게, 본 발명의 방법에 의해 형성된 상기 포스포로티오에이트는 약 1 내지 100 단량체 하부단위로 이루어진다. 상기 화합물이 약 10 내지 30 단량체 하부단위로 이루어진다면 더욱 바람직하며, 약 15 내지 30 단량체 하부단위로 이루어진다면 가장 바람직하다.
본 발명의 한가지 측면에 있어서, 본 발명의 상기 화합물은 조절이 요구되는 단백질의 형성 및 활성을 암호화하는 RNA 혹은 DNA를 조절하는 데에 이용된다. 이용된 상기 조성물의 표적 부분은 미리 선별된 RNA 혹은 DNA 부분에 잡종화될 수 있도록 상보성이 있는 것에서 선택된다.
본 발명의 상기 올리고머 화합물은 진단, 치료 및 연구 시약, 그리고 키트에 이용될 수 있다. 상기의 것들은 바람직한 약제학적으로 수용가능한 희석제 혹은 담체를 함유하고 있는 약제학적 조성물에 사용될 수 있다. 또한 상기의 것들은 바람직하지 않은 단백질의 생성이 유발하는 질병을 갖는 유기체를 치료하는 데에 이용될 수 있다. 바람직하지 않은 단백질을 암호화하는 핵산의 가닥과 특이적으로 잡종화할 수 있는 염기서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 상기 유기체에 접촉시킨다. 이러한 형태의 치료는 단세포 원핵 및 진핵 유기체로부터 다세포 진핵 유기체까지 다양한 유기체에서 시도될 수 있다. 유전적, 대사적 혹은 세포적 조절의 중요한 부분인 DNA-RNA 전사 혹은 RNA-단백질 해독을 이용하는 모든 유기체는 본 발명에 따라 치료적 및/혹은 예방적 치료가 가능하다. 표면상으로 다양한 유기체들 즉, 세균, 효모, 원생동물, 조류, 모든 식물 및 온혈 동물을 포함한 모든 고등 동물들도 치료될 수 있다. 또한, 세포 활성에 있어 중요한 부분인 DNA-RNA 전사 및 RNA-단백질 해독이 둘 다 이루어지는, 다세포성 진핵생물의 각각의 세포도 치료될 수 있다. 더 나아가, 진핵생물 세포들의 많은 세포기관(예를 들어, 미토콘드리아 및 엽록체)에서는 전사와 해독 기작이 이루어진다. 이와 같이, 단세포, 세포 집단 혹은 세포기관들은 올리고뉴클레오티드를 치료적 혹은 진단적으로 사용하여 치료될 수 있는 유기체의 범주 안에 포함될 수 있다.
본 발명의 추가적 이익 및 신규의 특징은 하기에 기재된 실시예로서 당업자들에게 명확해질 것이며, 하기에 기재된 실시예는 첨부된 특허청구범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
5'-O-디메톡시트리틀-염기 보호된 뉴클레오시드 3'-O-포스포비스모폴리디트의 제조
상기 화합물은 Uznanski, B. 외, Tetrahedron Letters, 1987, 28, 3401-3404에 개시된 방법에 따라 합성되었다.
실시예 2
5'-O-디메톡시트리틀-염기 보호된 뉴클레오시드 3'-O-포스포비스디에틸아미디트의 제조
상기 화합물은 Yamana, K. 외, Tetrahedron, 1989, 45, 4135-4140에서 개시된 방법에 따라 합성되었다.
실시예 3
T-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기(glass reactor)에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그런 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틀)티미딘 -3'-O-포스포비스모폴리디트 0.2M 용액과 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가한 후, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 3-하이드록시프로피오니트릴 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하여, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약의 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF (1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었다. 상기 수용액은 여과되었고, T-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위해 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 4
C-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 아세토니트릴에 용해되어 있는 N4-벤조일-5'??O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시시티딘-3'-O-포스포비스모폴리디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척한 후 아세토니트릴에 용해되어 있는 3-하이드록시프로피오니트릴 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dC-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 5
dG-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신-3'-O-포스포비스모폴리디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 3-하이드록시프로피오니트릴 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dG-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 6
dA-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신 -3'-O-포스포비스모폴리디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 3-하이드록시프로피오니트릴 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dA-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 7
T-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘-3'-O-포스포비스모폴리디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 2-디페닐메틸실릴에탄올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음, 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF (1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었다. 상기 수용액은 여과되었고, T-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 8
C-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N4-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시시티딘 -3'-O-포스포비스모폴리디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 2-디페닐메틸실릴에탄올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음, 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dC-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 9
dG-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신-3'-O-포스포비스모폴리디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 2-디페닐메틸실릴에탄올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dG-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 10
dA-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신-3'-O-포스포비스모폴리디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 2-디페닐메틸실릴에탄올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dA-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 11
T-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘-3'-O-포스포비스모폴리디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 4-시아노-2-부텐-1-올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었다. 상기 수용액은 여과되었고, T-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 12
C-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N4-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시시티딘 -3'-O-포스포비스모폴리디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 4-시아노-2-부텐-1-올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dC-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 13
dG-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신-3'-O-포스포비스모폴리디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 4-시아노-2-부텐-1-올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dG-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 14
dA-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신-3'-O-포스포비스모폴리디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 4-시아노-2-부텐-1-올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dA-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 15
T-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘-3'-O-포스포비스디에틸 아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 3-하이드록시프로피오니트릴 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/ THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었다. 상기 수용액은 여과되었고, T-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 16
C-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N4-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시시티딘-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 3-하이드록시프로피오니트릴 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dC-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 17
dG-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 3-하이드록시프로피오니트릴 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dG-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 18
dA-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 3-하이드록시프로피오니트릴 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dA-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 19
T-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 2-디페닐메틸실릴에탄올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/ THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었다. 상기 수용액은 여과되었고, T-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 20
C-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N4-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시시티딘-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 2-디페닐메틸실릴에탄올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dC-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 21
dG-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 2-디페닐메틸실릴에탄올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dG-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 22
dA-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 2-디페닐메틸실릴에탄올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dA-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 23
T-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 4-시아노-2-부텐-1-올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/ THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었다. 상기 수용액은 여과되었고, T-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 24
C-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N4-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시시티딘-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 4-시아노-2-부텐-1-올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dC-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 25
dG-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 4-시아노-2-부텐-1-올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dG-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 26
dA-T 포스포로티오에이트 2량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 100 밀리그램(4 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 4-시아노-2-부텐-1-올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하고 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었고 55℃에서 12시간 동안 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, dA-T 포스포로티오에이트 2량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 27
5'-TTTTTTT-3' 포스포로티오에이트 7량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 50 밀리그램(2 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 4-시아노-2-부텐-1-올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 그 다음 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/ THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 순환 전체는 완벽하게 보호된 티미딘 7량체를 제공하기 위하여 5번 이상 반복되었다. 상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 상온에서 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리되었다. 상기 수용액은 여과되었고, TTTTTTT 포스포로티오에이트 7량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
실시예 28
5'-d(GACT)-3' 포스포로티오에이트 4량체의 합성
에스테르 결합을 통해 CPG(제어된 포아 글래스)에 결합된 5'-O-디메톡시트리틀티미딘 50 밀리그램(2 mmole)을 유리 반응기에 넣고, 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)을 첨가하였다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 4-시아노-2-부텐-1-올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 그 다음 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)은 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 첨가되었다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N4-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시시티딘-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M을 첨가하였고, 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 4-시아노-2-부텐-1-올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 그 다음 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)은 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위하여 첨가되었다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다. 그 다음, 무수의 아세토니트릴에 용해되어 있는 N6-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 4-시아노-2-부텐-1-올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 그 다음 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
2% 디클로로아세트산의 디클로로메탄 용액(volume/volume)은 5'-하이드록실기를 디프로텍트 하기 위해 첨가되었다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다. 그 다음, 아세토니트릴에 용해되어 있는 N2-이소부티릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시구아노신-3'-O-포스포비스에틸아미디트 0.2M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 아세토니트릴에 용해되어 있는 4-시아노-2-부텐-1-올 0.8M 용액 및 아세토니트릴에 용해되어 있는 1H-테트라졸 0.4M 용액을 첨가하였고, 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 생성물을 아세토니트릴로 세척하였고, 상기 과정을 한번 이상 반복하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었고, 그 다음 아세토니트릴에 용해되어 있는 뷰케이지 시약 0.05% 용액을 첨가한 후 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이러한 황화 반응 단계는 5분 동안 한번 이상 반복되었다. 상기 지지체는 아세토니트릴로 세척된 후에 아세틱 안하이드리드/루티딘/THF(1:1:8) 용액으로 세척되었으며, 5'-하이드록실기에 어떠한 반응도 일어나지 않도록 캡을 씌우기 위해서 N-메틸 이미다졸/THF를 첨가하였다. 상기 생성물은 아세토니트릴로 세척되었다.
상기 화합물을 함유하고 있는 담체는 상온에서 90분 동안 30% 암모니움 하이드록시드 수용액으로 처리된 후, 24시간 동안 55℃에서 배양되었다. 상기 수용액은 여과되었고, 5'-dG-dA-dC-T-3'의 포스포로티오에이트 4량체를 제공하기 위하여 감소된 압력하에서 농축되었다.
본 명세서에서 기재된 특허, 출원 및 간행물은 참고로 인용되었다.
이 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 많은 변화 및 변형이 본 발명의 취지를 벗어나지 않는 바람직한 구체예가 될 수 있다는 것을 인식할 수 있다. 그러므로 그러한 모든 변형은 본 발명의 범주 안에 포함된다.

Claims (19)

  1. 하기 구조식의 포스포디아미디트(phosphordiamidite)와:
    (상기식에서 R1은 보호기이고; R2및 R3는 디알킬아미노 혹은 모폴리노이며; B는 뉴클레오시드 염기이며; 그리고 R6은 할로겐, O-알킬, O-알킬아미노, O-알킬알콕시, 보호된 O-알킬아미노, O-알킬아미노알킬, O-알킬 이미다졸 혹은 구조식 (O-알킬)m의 폴리에스테르이며, 여기에서 m은 1 내지 10의 수임);
    하기 구조식의 지지-결합된 신톤(synthon)을 반응시켜:
    (상기식에서 R4는 고체상 지지체에 연결되는 링커이며; R5는 포스포릴 보호기이고; 그리고 n은 0 내지 100의 수임);
    하기 구조식의 지지-결합된 포스포아미디트(phosphoramidite)를 형성하고:
    ;
    상기 지지-결합된 포스포아미디트를 보호하고, 그럼으로써 하기 구조식의 지지-결합된 포스파이트를 형성하며:
    ;
    보호된 포스포로티오에이트를 형성하기 위하여 상기 지지-결합된 포스파이트를 황화시켜며; 그리고
    n이 1씩 증가하면서 지지-결합된 신톤을 더 형성하기 위하여 상기 보호된 포스포로티오에이트를 디프로텍트(deprotect) 하는;
    단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 고체상 지지체에서 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지지-결합된 포스포아미디트는 R5가 포스포릴 보호기인 구조식 R5-OH의 알콜과 반응하여 보호되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 R2및 R3이 디이소프로필아미노인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, R2및 R3이 디이소프로필아미노인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, R5가 2-시아노에틸인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, R5가 4-시아노-2-부테닐 혹은 디페닐메틸실릴에틸인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 포스파이트 화합물이 상기 지지-결합된 신톤과 함께 유기 염기가 존재하는 상태에서 반응하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 유기 염기는 테트라졸인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 황화 반응물이 뷰케이지 시약, 테트라에틸티우람 다이설파이드, 디벤조일 테트라설파이드, 펜아세틸 다이설파이드, 1,2,4-디티우아졸린-5-원, 3-에톡시-1,2,4-디티우아졸린-5-원, 설폰산의 다이설파이드, 황, 또는 리간드와 결합된 황인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 황화 반응물이 뷰케이지 시약, 테트라에틸티우람 다이설파이드, 디벤조일 테트라설파이드, 펜아세틸 다이설파이드, 1,2,4-디티우아졸린-5-원 혹은 3-에톡시-1,2,4-디티우아졸린-5-원인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 혹은 우라실인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 n은 10 내지 30 뉴클레오티드 단위인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 n은 15 내지 25 뉴클레오티드 단위인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 하기 구조식을 갖는 것을 특징으로 하는 화합물:
    상기에서
    B는 뉴클레오시드 염기이며;
    R1은 보호기이고;
    R2는 디알킬아미노 혹은 모폴리노이며;
    R4는 고체상 지지체에 연결된 링커이며;
    R5는 포스포릴 보호기이며;
    R6은 할로겐, O-알킬, O-알킬아미노, O-알킬알콕시, 보호된 O-알킬아미노, O-알킬아미노알킬, O-알킬 이미다졸 혹은 구조식 (O-알킬)m의 폴리에스테르이며, 여기에서 m은 1 내지 10의 수이며; 그리고
    n은 1 내지 100의 수임.
  15. 제14항에 있어서, 상기 R2는 디이소프로필아미노 혹은 모폴리노인 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 포스포릴 보호기는 시아노에틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 포스포릴 보호기는 4-시아노-2-부테닐 혹은 디페닐메틸실릴에틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  18. 제14항에 있어서, 상기 n은 1 내지 30인 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 제14항에 있어서, 상기 n은 15 내지 25인 것을 특징으로 하는 화합물.
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