CN102675386B - 一种龙胆苦苷分离提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种龙胆苦苷分离提纯方法，采用硅胶柱层析的方法，其中柱层析硅胶的粒度为200～300目，用量为龙胆苦苷粗提物重量的30倍，洗脱液采用氯仿和乙醇体积比为9∶1混合溶剂，以龙胆苦苷纯品为对照采用薄层层析法跟踪检测，选择性的收集洗脱液，挥干溶剂得到龙胆苦苷纯品。本发明采用硅胶柱层析的方法，其中对柱层析硅胶的粒度、洗脱液、硅胶及柱层析硅胶的用量进行了优化，针对龙胆苦苷的结构特点，使龙胆苦苷能够被大量单独的从硅胶层析柱上洗脱下来，提高了龙胆苦苷的提取量，并且最终得到的龙胆苦苷纯度达到98.3～99.1％。
Description
技术领域
本发明涉及一种龙胆苦苷分离提纯方法，特别是从龙胆苦苷30％的龙胆粗提物中分离高纯度龙胆苦苷的方法。
背景技术
龙胆苦苷结构式
龙胆苦苷属裂环环烯醚萜苷类，有抗炎、镇痛、保肝、利胆等作用，用于治疗风湿性关节痛、结核病潮热、小儿疳热、黄疸性肝炎、小便不利等症，龙胆苦苷已被中国药典2005版作为龙胆HPLC方法含量测定的定量化学指标，同时还是龙胆及其制品指纹图谱的标志性成分。因此高纯度龙胆苦苷用途广泛，需求量大。
目前报道的龙胆苦苷分离提纯方法，主要有两种：一种运用大孔吸附树脂法，该方法分离量较大，但纯度不够高；另一种采用高速逆流色谱仪，该方法上样量小，不适合大量产品制备使用，且仪器较昂贵，使用时受限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种龙胆苦苷分离提纯方法，提高龙胆苦苷的纯度。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种龙胆苦苷分离提纯方法，其步骤如下：
1)柱层析硅胶的预处理：取200～300目柱层析硅胶，加入氯仿、甲醇体积比为9∶1的混合溶剂，搅拌至没有气泡后倒入玻璃层析柱中，沉降，得到硅胶层析柱；
2)将龙胆苦苷粗提物用乙醇溶解，加入3倍粗提物重量的200～300目硅胶，拌匀，挥去溶剂晾干，粉碎过200目筛，加入到含有粗提物30倍重量柱层析硅胶的硅胶层析柱上，采用氯仿、甲醇体积比为9∶1的混合溶剂做洗脱剂洗脱，以龙胆苦苷纯品做对照采用薄层层析法跟踪检测，待龙胆苦苷呈现单一斑点时收集洗脱液，直至洗脱液中再次出现其它斑点时停止收集；
3)将收集的洗脱液挥干溶剂得到纯化的龙胆苦苷。
上述步骤2)中洗脱完毕后采用乙醇冲柱，柱层析硅胶柱可重复使用2次。
本发明采用硅胶柱层析的方法，其中对柱层析硅胶的粒度、洗脱液、硅胶及柱层析硅胶的用量进行了优化，针对龙胆苦苷的结构特点，使龙胆苦苷能够被大量的单独的从硅胶层析柱上洗脱下来，提高了龙胆苦苷的提取量，并且最终得到的龙胆苦苷纯度达到98.3～99.1％，大大提高了龙胆苦苷的纯度。本发明的方法应用范围广、方便快捷、成本低、操作简单、分离量大，适合大规模推广应用。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的龙胆苦苷分离提纯方法进行具体的介绍，其中涉及的硅胶、柱层析硅胶、氯仿、乙醇和龙胆苦苷纯品均为市售产品。其中龙胆苦苷的粗提物采用如下制备：秦艽(Gentianamacrophylla Pal1.)粉碎，用15倍70％乙醇于40℃超声5h，提取两次，提取液减压浓缩后用石油醚脱脂，将除脂后的水提液通过活性炭∶硅藻土(1∶1)的超载柱，先用水洗脱除去水溶性杂质，再用乙醇洗脱，得乙醇洗脱液，回收乙醇，得到龙胆苦苷含量30％的粗提取物。
实施例1
本实施例的龙胆苦苷分离提纯方法采用如下步骤：
1)称取200目柱层析硅胶600g，加入氯仿、甲醇体积比为9∶1的混合溶剂，搅拌至没有气泡后倒入玻璃层析柱中，沉降，得到硅胶层析柱；
2)称取龙胆粗提物20g用少量乙醇溶解，加入60g 200目硅胶拌匀，挥去溶剂，晾干，研碎过200目筛，加到步骤1)的硅胶层析柱上；
3)用氯仿、甲醇体积比为9∶1的混合溶剂做洗脱剂洗脱，龙胆苦苷纯品做对照，薄层层析法跟踪检测，待龙胆苦苷呈现单一斑点时收集洗脱液，一直到洗脱液中再次出现其它斑点时停止收集。收集的洗脱液旋转蒸发、浓缩得龙胆苦苷纯品4.2g。
其中薄层层析法跟踪检测，采用GF254硅胶薄层板，龙胆苦苷纯品做对照，氯仿-甲醇-水(30∶10∶3)混合溶剂做展开剂展开，紫外灯下254nm处观察，显红紫色，确定位置，再用碘显色。
HPLC检测测得龙胆苦苷含量为98.9％。检测条件：色谱柱为Diamond C18(4.60mm×150mm，5μm)，流动相甲醇-水(25∶75)，流速为1mL·min-1，检测波长为270nm，柱温为25℃。
实施例2
本实施例的龙胆苦苷分离提纯方法采用如下步骤：
1)称取250目柱层析硅胶600g，加入氯仿、甲醇体积比为9∶1的混合溶剂，搅拌至没有气泡后倒入玻璃层析柱中，沉降，得到硅胶层析柱；
2)称取龙胆粗提物20g用少量乙醇溶解，加入60g 250目硅胶拌匀，挥去溶剂，晾干，研碎过200目筛，加到步骤1)的硅胶层析柱上；
3)用氯仿、甲醇体积比为9∶1的混合溶剂做洗脱剂洗脱，龙胆苦苷纯品做对照，薄层层析法跟踪检测，待龙胆苦苷呈现单一斑点时收集洗脱液，一直到洗脱液中再次出现其它斑点时停止收集。收集的洗脱液旋转蒸发、浓缩得龙胆苦苷纯品4.18g。
其中薄层层析法跟踪检测，采用GF254硅胶薄层板，龙胆苦苷纯品做对照，氯仿-甲醇-水(30∶10∶3)混合溶剂做展开剂展开，紫外灯下254nm处观察，显红紫色，确定位置，再用碘显色。
HPLC检测测得龙胆苦苷含量为98.3％。检测条件与实施例1相同。
实施例3
本实施例的龙胆苦苷分离提纯方法采用如下步骤：
1)称取280目柱层析硅胶600g，加入氯仿、甲醇体积比为9∶1的混合溶剂，搅拌至没有气泡后倒入玻璃层析柱中，沉降，得到硅胶层析柱；
2)称取龙胆粗提物20g用少量乙醇溶解，加入60g 280目硅胶拌匀，挥去溶剂，晾干，研碎过200目筛，加到步骤1)的硅胶层析柱上；
3)用氯仿、甲醇体积比为9∶1的混合溶剂做洗脱剂洗脱，龙胆苦苷纯品做对照，薄层层析法跟踪检测，待龙胆苦苷呈现单一斑点时收集洗脱液，一直到洗脱液中再次出现其它斑点时停止收集。收集的洗脱液旋转蒸发、浓缩得龙胆苦苷纯品4.10g。
其中薄层层析跟踪检测方法与实施例1相同。
HPLC检测测得龙胆苦苷含量为99.1％。检测条件与实施例1相同。
实施例4
本实施例的龙胆苦苷分离提纯方法采用如下步骤：
1)称取300目柱层析硅胶600g，加入氯仿、甲醇体积比为9∶1的混合溶剂，搅拌至没有气泡后倒入玻璃层析柱中，沉降，得到硅胶层析柱；
2)称取龙胆粗提物20g用少量乙醇溶解，加入60g 300目硅胶拌匀，挥去溶剂，晾干，研碎过200目筛，加到步骤1)的硅胶层析柱上；
3)用氯仿、甲醇体积比为9∶1的混合溶剂做洗脱剂洗脱，龙胆苦苷纯品做对照，薄层层析法跟踪检测，待龙胆苦苷呈现单一斑点时收集洗脱液，一直到洗脱液中再次出现其它斑点时停止收集。收集的洗脱液旋转蒸发、浓缩得龙胆苦苷纯品4.20g；
4)将洗脱后的硅胶层析柱采用乙醇冲洗，可以重复使用2次。
其中薄层层析跟踪检测方法与实施例1相同。
HPLC检测测得龙胆苦苷含量为98.6％。检测条件与实施例1相同。
Claims (2)
1.一种龙胆苦苷分离提纯方法，其特征在于：其步骤如下：
1）柱层析硅胶的预处理：取200～300目柱层析硅胶，加入氯仿、甲醇体积比为9:1的混合溶剂，搅拌至没有气泡后倒入玻璃层析柱中，沉降，得到硅胶层析柱；
2）将龙胆苦苷粗提物用乙醇溶解，加入3倍粗提物重量的200～300目硅胶，拌匀，挥去溶剂晾干，粉碎过200目筛，加入到含有粗提物30倍重量柱层析硅胶的硅胶层析柱上，采用氯仿、甲醇体积比为9：1的混合溶剂做洗脱剂洗脱，以龙胆苦苷纯品做对照采用薄层层析法跟踪检测，待龙胆苦苷呈现单一斑点时收集洗脱液，直至洗脱液中再次出现其它斑点时停止收集；
3）将收集的洗脱液挥干溶剂得到纯化的龙胆苦苷；
所述龙胆苦苷的粗提取物采用如下制备：秦艽粉碎，用15倍70%乙醇于40℃超声5h，提取两次，提取液减压浓缩后用石油醚脱脂，将除脂后的水提液通过活性炭：硅藻土为1:1的超载柱，先用水洗脱除去水溶性杂质，再用乙醇洗脱，得乙醇洗脱液，回收乙醇，得到龙胆苦苷含量30%的粗提取物。
2.根据权利要求1所述的龙胆苦苷分离提纯方法，其特征在于：步骤2）洗脱完毕后采用乙醇冲柱，柱层析硅胶柱可重复使用2次。
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