CN104857008A - 龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了龙胆苦苷（Gentiopicroside，Gent）作为治疗神经病理性疼痛药物的用途。实验结果表明龙胆苦苷在安全剂量范围内使用时，剂量为100mg/kg时呈一定的剂量-药效相关性，可以显著改善小鼠慢性缩窄性损伤模型的疼痛行为、电生理活动的改变，并恢复小鼠损伤后运动及协调能力的下降，说明龙胆苦苷具有治疗神经病理性疼痛、改善其电生理活动及修复受损神经的作用。

Description

龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途

技术领域

本发明涉及龙胆苦苷的应用，特别涉及龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途。

背景技术

疼痛是人类对伤害性感受的知觉，是一种与实际或潜在的组织损伤相关的不愉快的主观感觉和情绪体验,是当今困扰人类健康的最严重的问题之一。疼痛可分为两大类，即生理性疼痛和病理性疼痛。其中病理性疼痛又包括两种，一种是感受性疼痛，又称为炎症性疼痛，直接由伤害性刺激造成，是机体防御机制的关键组成部分，与组织损伤或炎症有关；另一种是神经病理性疼痛，由外周或中枢神经系统损伤所致，与损伤区域外触觉和温觉反应异常有关，包括一系列疼痛综合征，比如复杂的区域疼痛综合症、幻肢痛、癌性疼痛、AIDS痛、三叉神经痛和带状疱疹后神经痛等。其中，神经病理性疼痛(Neuropathic Pain，NP)是由于外周或中枢神经系统原发或继发性病变，损伤，功能障碍或短暂性紊乱引起的疼痛。它属于一种慢性疼痛，临床上主要表现为自发性疼痛、痛觉过敏及痛觉超敏。自发性疼痛是指在没有可见的刺激条件下出现的疼痛；痛觉过敏是指对伤害性刺激产生过强的伤害性反应；痛觉超敏是指对非伤害性刺激产生伤害性反应。常见于自身免疫性疾病(如多发性硬化)、代谢性疾病(如糖尿病性神经病变)、感染(如带状疱疹后神经痛)、血管病(如脑卒中)以及各种损伤、炎症或手术后遗留的神经痛。人群中的发病率为1.5％。神经病理性疼痛病程长且治愈困难，患者在精神上、身心上遭受极大的痛苦，严重影响了患者的生活质量，并带来了沉重的经济负担。由于其病因多样，发病机制复杂而导致发病率高，难治愈已经成为临床医疗最具挑战的难题之一。

分子生物学和电生理技术广泛应用于神经病理性疼痛的基础和临床中，使得其病理机制研究取得显著进展，为临床治疗提供了有力证据。已有大量报道证实，神经病理性疼痛的发生与发展常常伴随着中枢及外周神经系统电生理活动的改变，因此对神经病理性疼痛进行电生理研究具有十分重要的意义。

目前，药物治疗是控制症状的主要手段。常用的药物有三环类抗抑郁药、抗癫痛药、局麻药、抗心律失常药和阿片类药。然而，这些药物往往由于疗效不确切，作用机制不明确，又有不同程度的副作用，从而限制了它们在临床上的广泛应用。因此，研究神经病理性疼痛产生的病因和病理，寻找和开发新型镇痛药，不仅成为疼痛医学研究的热点和难点，而且对于最终解决这一顽症，提高罹患人群的生活质量具有重要的临床意义和社会意义。

龙胆苦苷(Gentiopicroside，Gent)是从中药龙胆中提取的一种环烯醚萜类化合物。目前，这种化合物已被证明能在小鼠中枢神经系统产生抗抑郁、抗惊厥及镇痛作用。研究发现，龙胆苦苷的镇痛作用是针对长期炎症性疼痛，主要通过下调前扣带皮层(ACC)中NMDA受体的GluN2B亚基，而NMDA受体也是调节神经病理性疼痛的关键的谷氨酸受体。然而，龙胆苦苷是否通过影响电生理活动的改变以改善神经病理性疼痛，目前尚未见相关报道。因此，探究龙胆苦苷对神经病理性疼痛的镇痛作用及其对电生理活动的影响具有极高的潜在价值与社会意义。

发明内容

本发明的目的是通过对龙胆苦苷的药理作用研究，提供龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途。

本发明通过以下技术方案来实现发明目的：

本发明提供的龙胆苦苷为治疗神经病理性疼痛药物的用途，所述龙胆苦苷的结构式如式(1)所示：

式(1)

具体地，所述神经病理性疼痛中为慢性期或修复期的神经病理性疼痛。

进一步地，所述龙胆苦苷单次应用剂量为小鼠25～200mg/kg。

优选地，所述龙胆苦苷单次应用剂量为小鼠25mg/kg。

优选地，所述龙胆苦苷单次应用剂量为小鼠50mg/kg。

优选地，所述龙胆苦苷单次应用剂量为小鼠100mg/kg。

优选地，所述龙胆苦苷单次应用剂量为小鼠50mg/kg～100mg/kg。

具体地，所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、粉针剂型或注射剂型。

本发明提供的龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途具有以下有益效果：

(1)龙胆苦苷在安全剂量下能显著改善坐骨神经慢性缩窄性损伤(CCI)小鼠的疼痛行为，使机械缩足反射阈值(PWT)和热缩足反射潜伏期(PWL)上升，而冷刺激抬足次数下降；

(2)龙胆苦苷可以改善神经病理性疼痛小鼠的神经功能，改善其运动及协调能力并恢复坐骨神经功能指数(SFI)；

(3)龙胆苦苷能升高由于神经病理性疼痛引起的的坐骨神经传导速度的下降。

表明龙胆苦苷具有治疗神经病理性疼痛所致外周神经损伤的作用，可用于制备神经病理性疼痛的治疗药物。

附图说明

图1是给药7天后，与模型组相比，反映三种药量的龙胆苦苷对小鼠慢性缩窄性损伤后运动协调影响的在棒时间对比图；

图2是给药7天后，与模型组相比，反映三种药量的龙胆苦苷对小鼠慢性缩窄性损伤后自主活动次数影响的对比图；

图3是给药7天后，与假手术组(sham)、模型组相比，不同药量的龙胆苦苷对慢性缩窄性损伤小鼠损伤侧爪的爪印对比图；

图4是给药7天后，与假手术组(sham)、模型组相比，不同药量的龙胆苦苷对小鼠慢性缩窄性损伤后的坐骨神经动作电位对比图；

图5是与假手术组(sham)、模型组相比，不同用药量的龙胆苦苷对小鼠慢性缩窄性损伤后坐骨神经传导速度影响的对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，龙胆苦苷的结构式如式(1)所示：

式(1)

其中，神经病理性疼痛模型为慢性疼痛模型，龙胆苦苷单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量，龙胆苦苷单次应用剂量为小鼠25mg/kg，药物的剂型为注射剂型。

实施例2

龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，龙胆苦苷的结构式如式(1)所示：

式(1)

其中，神经病理性疼痛模型为慢性疼痛模型，龙胆苦苷单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量，龙胆苦苷单次应用剂量为小鼠50mg/kg，药物的剂型为注射剂型。

实施例3

龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，龙胆苦苷的结构式如式(1)所示：

式(1)

其中，神经病理性疼痛模型为慢性疼痛模型，龙胆苦苷单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量，龙胆苦苷单次应用剂量为小鼠100mg/kg，药物的剂型为粉针剂型。

下面的动物实验进一步说明了上述实施例1-3的效果：

一、实验材料

1.1动物处理

雄性ICR小鼠，体重为18-22g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：NCXK(宁)2013-0005。喂养条件包括标准饲料，自来水，室温保持在(24±2)℃，湿度50-60％，每日光照与黑暗时间各12h。实验前将动物置于实验环境适应3天。

1.2实验药品及仪器

龙胆苦苷(南京景竹生物科技有限公司，CAS号：20831-76-9)，普瑞巴林胶囊(辉瑞制药有限公司，批号：1162011)，液体石蜡，生理盐水，戊巴比妥钠(Sigma-Aldrich公司，批号：20091011)。von Frey纤维丝(美国stoelting)，BL-420F生物实验能系统，PL-200热刺激仪，YSL-4A转棒式疲劳仪，YSL-1A多功能小鼠自主活动仪(成都泰盟科技有限公司)，YP601N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，EL-104精密电子天平(梅特勒-托利多一起(上海)有限公司)，4-0医用铬制羊肠线(上海浦东金环医疗用品有限公司)。手术器械包括手术剪、弯剪、眼科小弯镊、持针器、碘伏、消毒纱布和医用酒精等。

1.3建立CCI小鼠模型

参照Bennett和Xie方法建立坐骨神经慢性缩窄性损伤模型(ChronicConstriction Injury，CCI)，小鼠腹腔注射0.8％的戊巴比妥钠麻醉后，取侧卧位，备皮，用碘伏消毒皮肤，切开皮肤后，顺纹肌钝性分离股二头肌和臀肌，暴露右侧坐骨神经中上段。用4-0医用铬制羊肠线间隔1mm松结扎3处，为预防强度过大，结扎以引起右后肢出现轻微的颤动为宜，从而保护神经外膜的血运。结扎完毕后逐层缝合肌肉层和皮肤。假手术组只暴露右侧坐骨神经，不给予结扎。

1.4分组及给药：

将ICR小鼠随机分为6组：假手术组、模型组、Gent(25、50、100mg/kg三个剂量)组，普瑞巴林组，每组10只。假手术组只暴露右侧坐骨神经，不给予结扎。模型组和药物治疗组进行上述右侧坐骨神经的结扎。假手术组和模型组术后第8天腹腔注射生理盐水；药物治疗组分别给予25、50、100mg/kg的Gent，给药容积为0.1ml/10g，连续给药7天。分别在术前、术后第7天和给药后1、3、5、7天测定各个行为学指标。普瑞巴林组没有提及

二、实验过程

(一)行为学指标观察

1.机械缩足反射阈值(Paw Withdrawal Threshold，PWT)

1.1实验方法：

在安静的环境下，将小鼠置于2mm×2mm的金属网垫上，用有机玻璃盒约束小鼠，待其适应30min后，采用Chaplan的up and down法测定小鼠的机械缩足反射阈值(PWT)。使用不同折力的Von Frey Filaments(vFFs)刺激小鼠的第3和4趾间的皮肤，观察小鼠的缩足反应。当vFFs弯曲至90°时，小鼠仍不抬足，视为无反应。从折力为0.4g开始，如果vFFs不能引起缩足反应，则调高到相邻的大一级vFFs的级数；如果有反应，则调低的vFFs级数，每次间隔10s，当最大折力达到4.0g时，记录压力值，即为机械缩足反射阈值(g)。

1.2实验结果：

表1 龙胆苦苷对CCI小鼠机械缩足反射阈值(PWT)的影响

与假手术组比较，*p<0.05；与模型组比较，^#p<0.05；与模型组比较，^##p<0.01

由表1可知，各组小鼠术前的基础痛阈无明显差异(p>0.05)。与假手术组相比，模型组的PWT显著降低(p<0.05)，说明模型制备成功。与模型组相比，龙胆苦苷(100mg/kg)组给药后1、3、5、7天的PWT显著增高(p<0.01)；龙胆苦苷(50mg/kg)组给药后1、3、5、7天的PWT显著增高(p<0.05)；龙胆苦苷(25mg/kg)组给药后各时间点的PWT无显著性差异(p>0.05)

2.热缩足反射潜伏期(Paw Withdrawal Latency，PWL)的测定

2.1实验方法：

在安静环境下，将小鼠置于3mm厚的玻璃板上，用有机玻璃盒约束小鼠，待其适应30min后，采用Hargreaves法测定小鼠的热缩足反射潜伏期。用热刺激仪以激光束照射小鼠右后肢足底，直到其出现缩足或抬足反应时停止照射。设定12s自动切断照射以防烫伤小鼠足底。每次间隔1min，连续测定5次，去掉最大值和最小值后，取剩下的3个数据的平均值作为热缩足反射潜伏期。

2.2实验结果：

表2 龙胆苦苷对CCI小鼠热缩足反射潜伏期(PWL)的影响

与假手术相比，*p<0.01；与模型组相比，#p<0.05；与模型组相比，^##p<0.01.

由表2可以看出，各组小鼠术前的基础痛阈无明显差异(p>0.05)，与假手术组相比，模型组的PWL显著降低(p<0.05)，说明模型制备成功。与模型组相比，龙胆苦苷(100mg/kg)组给药后1、3、5、7天的PWT显著性增高(p<0.01)；龙胆苦苷(50mg/kg)组给药后1、3、5、7天的PWL显著性增高(p<0.05)；龙胆苦苷(25mg/kg)组给药后各时间点的PWL无显著性差异(P>0.05)。

3.冷缩足反射次数的测定

3.1实验方法：

在安静环境下，将小鼠置于表面温度为(4±1)℃的冷板上，用有机玻璃约束小鼠，待其适应5min后，按照Jasmin法观察小鼠5min，记录小鼠5min内的抬足次数。

3.2实验结果：

表3：龙胆苦苷对冷缩足反射的影响

与假手术相比，^*p<0.01；与模型组相比，^#p<0.05；与模型组相比，^##p<0.01

由表3可知，各组小鼠术前的基础痛阈无明显差异(p>0.05)，与假手术组相比，模型组的冷缩足反射次数显著降低(p<0.05)，说明模型制备成功。与模型组相比，龙胆苦苷(100mg/kg)组给药后第1天的抬足次数显著性增高(p<0.05)，给药后第3、5、7天抬足次数极显著增高(p<0.01)；龙胆苦苷(50mg/kg)组和龙胆苦苷(25mg/kg)组给药后第3、5、7天的冷抬足次数显著性增高(p<0.01)，而给药后第1天并无明显变化(p>0.05)

(二)运动协调及自主活动的观察

1.运动协调

1.1实验方法

各组动物给药7天后，利用YSL-4C转棒式疲劳仪，将各组小鼠放置在转速为40r·min^-1转棒上，每次5只平行实验，记录小鼠在转棒上停留的时间，记录小鼠在转棒上累积停留的时间，如5min不跌落者按5min记。

1.2实验结果

由图1可知，给药7天后，与模型组相比，龙胆苦苷(25mg/kg)、龙胆苦苷(50mg/kg)及龙胆苦苷(100mg/kg)组给药7天后在棒时间并均无明显变化(p>0.05)。

2.自主活动

2.1实验方法

各组动物给药7天后，利用YLS-1A多功能小鼠自主活动仪，将各组小鼠放置在转速为45×45×40cm的黑色有机玻璃盒中，每次5只平行实验，记录小鼠在玻璃盒中的活动次数。

2.2实验结果

由图2可知，给药7天后，与模型组相比，龙胆苦苷(25mg/kg)、龙胆苦苷(50mg/kg)及龙胆苦苷(100mg/kg)组在给药后7天后的自主活动次数均无显著变化(p>0.05)。通过自主活动及运动协调实验结果可知，龙胆苦苷在本实验给药剂量下并未产生镇静催眠作用，即并未对实验动物的中枢神经产生抑制作用。

(三)坐骨神经功能评分

1.坐骨神经功能指数(SFI)

1.1实验方法

自制小鼠行走槽，槽体尺寸长宽高为30cm×5cm×8cm，通道远端放置一个鼠箱，鼠箱单侧开门。行走槽底放置与之等宽和等长的白纸。小鼠双侧后足蘸红色印泥，然后将鼠放置在行走槽近端口，诱使鼠向远端口行走，鼠行走过后白纸便可留下大鼠双侧后足每侧7～8个足印。选取清晰的三个足印并测定以下3个量:(1)足印的长度(Podogram Length,PL)：即为大鼠足印最长的距离，足跟与足尖的距离；(2)足址的宽度(width between the first and fifthtoes，TW):第1趾至笫5趾的距离。(3)中间足趾距离(inter-toes distance,IT)：第2趾至第4趾的距离。测量时精确至mm,每次测量并记录最长的一组足印数据。选小鼠正常侧足(N)和实验侧足(E)两侧足印。将上述3个变量带入公式计算坐骨神经指数(SFI)。

SFl＝-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETW-NTW)/NTW+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8

坐骨神经功能指数(SF1)以SF1＝0即为正常，SFI＝-100即为神经完全损伤(断离)。

1.2实验结果

由图3可知，与假手术组相比，模型组小鼠的术侧爪明显收缩。而龙胆苦苷(100mg/kg)、龙胆苦苷(50mg/kg)和普瑞巴林(10mg/kg)组小鼠术侧爪较模型组明显舒张。龙胆苦苷(25mg/kg)与模型组相比爪印无明显差异。具体结果见表4。

表4：龙胆苦苷对CCI小鼠坐骨神经功能指数(SFI)的影响

SFI＝0，坐骨神经无损伤；SFI＝-100，坐骨神经完全断离。

与假手术相比，*p<0.01；与模型组相比，#p<0.05；与模型组相比，^##p<0.01

由表4可知，各组小鼠术前的SFI无明显差异(p>0.05)，与假手术组相比，模型组的SFI显著降低(p<0.05)，说明模型制备成功。与模型组相比，龙胆苦苷(50mg/kg)组给药后第1、3、5、7天的SFI显著性增高(p<0.05)，；龙胆苦苷(100mg/kg)组和普瑞巴林(10mg/kg)组给药后第1、3、5、7天的SFI显著性增高(p<0.01)；而龙胆苦苷(25mg/kg)给药后各时间点的SFI并无明显变化(p>0.05)

(四)坐骨神经电生理检测

1.坐骨神经传导速度

1.1实验方法

小鼠腹腔注射0.8％的戊巴比妥钠麻醉，俯卧位固定。放入屏蔽橱内，术野脱毛，于坐骨神经的走行切开皮肤，分离股四头肌肉组织至坐骨切迹，显露坐骨神经，细分离双侧坐骨神经，分离过程中注意用温润石蜡油保护坐骨神经，分离动作须轻细，以免损伤神经，须用玻璃分针将坐骨神经轻轻拉起，勿用镊子钳。上至坐骨切迹，下至足部，分离后立即测定，用生理盐水为导电介质，以钩状电极作为刺激电极置于坐骨切迹处，踝部和足底第二趾间分别插入白色记录针电极，一对红色参考电极置于记录电极和刺激电极之间，大约位于腓肠肌处。测试时保持肌体温度在37℃左右。并连接BL-420F生物机能实验系统，选择肌肉神经实验-神经干兴奋传导速度测定。实验参数设定：模式细电压；方式单刺激；延时5.0；波宽0.05ms；强度1.0V；波间隔99。记录近端和远端坐骨神经产生动作电位的潜伏期，测定两记录电极间的距离。神经传导速度＝记录电极之间的距离/动作电位潜伏期之差，重复电刺激三次取平均值。

1.2实验结果

由图4可知，与假手术组相比，模型组小鼠的术侧坐骨神经的动作电位振幅明显下降，而动作电位潜伏期明显增长。与模型组相比，龙胆苦苷(100mg/kg)、龙胆苦苷(50mg/kg)和普瑞巴林(10mg/kg)组小鼠术侧术侧坐骨神经的动作电位振幅明显升高，而动作电位潜伏期明显缩短。龙胆苦苷(25mg/kg)与模型组相比振幅及潜伏期无明显差异。

由图5可知，给药7天后，与假手术组相比，模型组的NCV显著降低(p<0.01)，说明模型制备成功。与模型组相比，龙胆苦苷(100mg/kg)、龙胆苦苷(50mg/kg)组与普瑞巴林(10mg/kg)组在给药7天后NCV显著增高(p<0.01)；龙胆苦苷(25mg/kg)组给药7天后NCV并无明显变化(p>0.05)。此结果表明龙胆苦苷具有修复受损坐骨神经脱髓鞘和坐骨神经纤维的作用。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，其特征在于：所述龙胆苦苷的结构式如式（1）所示：

式（1）。

2.根据权利要求1所述的龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，其特征在于：所述神经病理性疼痛是由慢性缩窄性损伤所诱导的。

3.根据权利要求1所述的龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，其特征在于：所述龙胆苦苷单次应用剂量为小鼠25~100 mg/kg。

4.根据权利要求3所述的龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，其特征在于：所述龙胆苦苷单次应用剂量为小鼠25mg/kg。

5.根据权利要求3所述的龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，其特征在于：所述龙胆苦苷单次应用剂量为小鼠50mg/kg。

6.根据权利要求3所述的龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，其特征在于：所述龙胆苦苷单次应用剂量为小鼠100mg/kg。

7.根据权利要求1所述的龙胆苦苷作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，其特征在于：所述龙胆苦苷单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量。

8.根据权利要求1-7中任一项权利要求所述的龙胆苦苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，其特征在于：所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射剂型或粉针剂型。