JP2002165594A - Ｃ型肝炎ウイルスのｉｒｅｓ及びｎｓ３プロテアーゼを標的とするｒｎａ分子 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルスのｉｒｅｓ及びｎｓ３プロテアーゼを標的とするｒｎａ分子Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 IRES活性とNS3プロテアーゼ活性を共に抑制
可能な機能性RNA分子を提供する。 【解決手段】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３プ
ロテアーゼに対する阻害活性をもつＲＮＡアプタマー配
列と、ＨＣＶのＩＲＥＳ(internal ribosomal entry si
te)に対する切断活性をもつリボザイム配列とを含むキ
メラＲＮＡ分子、このキメラＲＮＡ分子をコードするＤ
ＮＡを含む発現ベクター、あるいは、キメラＲＮＡ分子
又は発現ベクターを含むＣ型肝炎を予防又は治療するた
めの医薬組成物。
可能な機能性RNA分子を提供する。 【解決手段】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３プ
ロテアーゼに対する阻害活性をもつＲＮＡアプタマー配
列と、ＨＣＶのＩＲＥＳ(internal ribosomal entry si
te)に対する切断活性をもつリボザイム配列とを含むキ
メラＲＮＡ分子、このキメラＲＮＡ分子をコードするＤ
ＮＡを含む発現ベクター、あるいは、キメラＲＮＡ分子
又は発現ベクターを含むＣ型肝炎を予防又は治療するた
めの医薬組成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス
のＩＲＥＳ及びＮＳ３プロテアーゼを標的とするＲＮＡ
分子に関する。具体的には、該ＲＮＡ分子は、該ＩＲＥ
Ｓに対する切断活性をもつリボザイム配列と該ＮＳ３プ
ロテアーゼに対する阻害活性をもつＲＮＡアプタマー配
列とを含むキメラ分子である。
のＩＲＥＳ及びＮＳ３プロテアーゼを標的とするＲＮＡ
分子に関する。具体的には、該ＲＮＡ分子は、該ＩＲＥ
Ｓに対する切断活性をもつリボザイム配列と該ＮＳ３プ
ロテアーゼに対する阻害活性をもつＲＮＡアプタマー配
列とを含むキメラ分子である。
【０００２】本発明はまた、該キメラＲＮＡ分子をコー
ドするＤＮＡを含む発現ベクターに関する。本発明はさ
らに、該キメラＲＮＡ分子又は該発現ベクターを含むＣ
型肝炎の予防又は治療用の医薬組成物に関する。
ドするＤＮＡを含む発現ベクターに関する。本発明はさ
らに、該キメラＲＮＡ分子又は該発現ベクターを含むＣ
型肝炎の予防又は治療用の医薬組成物に関する。
【０００３】
【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は非Ａ非Ｂ型
肝炎の病原体で、慢性肝炎の主要原因であるＲＮＡウイ
ルスである（Houghton, M. et al., Hepatology, 14:38
1-388,1991; Matsuura, Y and Miyamura, T., Sem. Vir
ol. 4:297-304, 1993; Cuthbert, J.A., Clin. Microbi
ol. Rev., 7:505-532, 1994）。ＨＣＶ由来の慢性肝炎
の約20%は肝硬変、肝臓癌へと移行するため、重篤な肝
疾患の要因となっており、その感染者および患者は世界
各国において急増している（現在、約１億７千万人）。
現在までのところ、Ｃ型肝炎の治療にはインターフェロ
ンが主に用いられている。しかしながら有効な治療薬が
存在していないため、その開発が急務とされている。
肝炎の病原体で、慢性肝炎の主要原因であるＲＮＡウイ
ルスである（Houghton, M. et al., Hepatology, 14:38
1-388,1991; Matsuura, Y and Miyamura, T., Sem. Vir
ol. 4:297-304, 1993; Cuthbert, J.A., Clin. Microbi
ol. Rev., 7:505-532, 1994）。ＨＣＶ由来の慢性肝炎
の約20%は肝硬変、肝臓癌へと移行するため、重篤な肝
疾患の要因となっており、その感染者および患者は世界
各国において急増している（現在、約１億７千万人）。
現在までのところ、Ｃ型肝炎の治療にはインターフェロ
ンが主に用いられている。しかしながら有効な治療薬が
存在していないため、その開発が急務とされている。
【０００４】ＨＣＶは約9,500ヌクレオチドからなるプ
ラス鎖RNAを遺伝子としてもち、フラビウイルス科に分
類される。ＨＣＶ遺伝子はウイルス特異的であり、かつ
重要な２段階のステップを経て、ＨＣＶ増殖に必要な構
造蛋白質（コア蛋白質；C、外被蛋白質；E1、E2）なら
びに非構造蛋白質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5
B）に変換される（図１）。
ラス鎖RNAを遺伝子としてもち、フラビウイルス科に分
類される。ＨＣＶ遺伝子はウイルス特異的であり、かつ
重要な２段階のステップを経て、ＨＣＶ増殖に必要な構
造蛋白質（コア蛋白質；C、外被蛋白質；E1、E2）なら
びに非構造蛋白質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5
B）に変換される（図１）。
【０００５】第１ステップはＨＣＶ遺伝子から前駆体蛋
白質（約3,000アミノ酸）への翻訳である。この翻訳に
はＨＣＶ遺伝子の５’非翻訳領域に位置するInternal r
ibosomal entry site（IRES；図１、図２）が重要な役
割を果たしている。IRESはリボソームがキャップ構造非
依存的に翻訳を開始するために必須なRNA構造である。
この約350ヌクレオチドから構成されるIRESは、ウイル
ス遺伝子型間において高い相同性をもって保存されてい
る。
白質（約3,000アミノ酸）への翻訳である。この翻訳に
はＨＣＶ遺伝子の５’非翻訳領域に位置するInternal r
ibosomal entry site（IRES；図１、図２）が重要な役
割を果たしている。IRESはリボソームがキャップ構造非
依存的に翻訳を開始するために必須なRNA構造である。
この約350ヌクレオチドから構成されるIRESは、ウイル
ス遺伝子型間において高い相同性をもって保存されてい
る。
【０００６】第２ステップは翻訳された前駆体蛋白質の
プロセシングである（図１）。このプロセシングには、
宿主細胞由来のシグナルペプチダーゼならびにウイルス
由来のプロテアーゼが関与している。非構造蛋白質の一
つであるNS3は、トリプシン様セリンプロテアーゼファ
ミリーに見られる共通した配列を有している。NS3のN末
端側の約１/3にはプロテアーゼドメイン、C末端側の約2
/3にはヘリカーゼドメインがコードされている。NS3の
ヒスチジン1083、アスパラギン酸1107、セリン1165はセ
リンプロテアーゼファミリーの中でキモトリプシン系に
属しているようなNS3プロテアーゼの触媒作用のトリア
ッド（三つ組み）を構成している。NS3領域にコードさ
れているセリンプロテアーゼ（以下、「NS3プロテアー
ゼ」という）の活性は非構造蛋白質間の切断（４箇所；
NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、NS5A/NS5B；図１）
に関与しており、その活性はNS4Aによって促進されるこ
とが報告されている（Hijikata, M. et al., J. Viro
l., 67:4665-4675, 1993b等）。これらの知見からNS3プ
ロテアーゼ活性は、HCV増殖に必須な因子の一つとなっ
ている。このためNS3プロテアーゼ活性阻害剤は、HCV疾
患の治療薬となりうると考えられている。
プロセシングである（図１）。このプロセシングには、
宿主細胞由来のシグナルペプチダーゼならびにウイルス
由来のプロテアーゼが関与している。非構造蛋白質の一
つであるNS3は、トリプシン様セリンプロテアーゼファ
ミリーに見られる共通した配列を有している。NS3のN末
端側の約１/3にはプロテアーゼドメイン、C末端側の約2
/3にはヘリカーゼドメインがコードされている。NS3の
ヒスチジン1083、アスパラギン酸1107、セリン1165はセ
リンプロテアーゼファミリーの中でキモトリプシン系に
属しているようなNS3プロテアーゼの触媒作用のトリア
ッド（三つ組み）を構成している。NS3領域にコードさ
れているセリンプロテアーゼ（以下、「NS3プロテアー
ゼ」という）の活性は非構造蛋白質間の切断（４箇所；
NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、NS5A/NS5B；図１）
に関与しており、その活性はNS4Aによって促進されるこ
とが報告されている（Hijikata, M. et al., J. Viro
l., 67:4665-4675, 1993b等）。これらの知見からNS3プ
ロテアーゼ活性は、HCV増殖に必須な因子の一つとなっ
ている。このためNS3プロテアーゼ活性阻害剤は、HCV疾
患の治療薬となりうると考えられている。
【０００７】本発明者らは先に、NS3プロテアーゼを特
異的に阻害可能なRNAアプタマーを創製することに成功
した（特願平9-305344号参照）。アプタマー(aptamer)
は、アミノ酸のような小分子から蛋白質、さらにはウイ
ルスのような高分子を認識する核酸分子であり、in vit
ro選択法によって得ることができる。
異的に阻害可能なRNAアプタマーを創製することに成功
した（特願平9-305344号参照）。アプタマー(aptamer)
は、アミノ酸のような小分子から蛋白質、さらにはウイ
ルスのような高分子を認識する核酸分子であり、in vit
ro選択法によって得ることができる。
【０００８】しかしながら、上記の第１ステップと第２
ステップを共に抑えることができるならば、第1ステッ
プ（IRSE活性）又は第2ステップ（NS3プロテアーゼ活
性）のみを抑えることよりも格段に、かつ高い信頼性を
もってHCVの増殖を抑える可能性が高まると考えられ
る。
ステップを共に抑えることができるならば、第1ステッ
プ（IRSE活性）又は第2ステップ（NS3プロテアーゼ活
性）のみを抑えることよりも格段に、かつ高い信頼性を
もってHCVの増殖を抑える可能性が高まると考えられ
る。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】したがって本発明の第
1の目的は、IRES活性とNS3プロテアーゼ活性を共に抑制
可能な機能性RNA分子を提供することである。本発明の
第2の目的は、C型肝炎の治療のために、該RNA分子を利
用することである。
1の目的は、IRES活性とNS3プロテアーゼ活性を共に抑制
可能な機能性RNA分子を提供することである。本発明の
第2の目的は、C型肝炎の治療のために、該RNA分子を利
用することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、要約すると以
下のとおりである。
下のとおりである。
【００１１】本発明は、その第1の態様において、Ｃ型
肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３プロテアーゼに対する
阻害活性をもつＲＮＡアプタマー配列と、ＨＣＶのＩＲ
ＥＳ(internal ribosomal entry site)に対する切断活
性をもつリボザイム配列とを含むキメラＲＮＡ分子を提
供する。
肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３プロテアーゼに対する
阻害活性をもつＲＮＡアプタマー配列と、ＨＣＶのＩＲ
ＥＳ(internal ribosomal entry site)に対する切断活
性をもつリボザイム配列とを含むキメラＲＮＡ分子を提
供する。
【００１２】その実施態様において、該ＲＮＡアプタマ
ー配列は、ループ構造を形成する下記の塩基配列： 5’-GAXUGGGAC-3’ （配列中、ＸはＡ又はＵである。）と、下記の塩基配
列： 5’-GGGAGA-3’ 3’-UCCUCU-5’ を有するステム構造とを含む。
ー配列は、ループ構造を形成する下記の塩基配列： 5’-GAXUGGGAC-3’ （配列中、ＸはＡ又はＵである。）と、下記の塩基配
列： 5’-GGGAGA-3’ 3’-UCCUCU-5’ を有するステム構造とを含む。
【００１３】その別の実施態様において、上記ループ構
造を形成する塩基配列は、それに隣接してステム構造を
形成する塩基配列を含み、これによってループ-ステム
構造が形成される。該ループ-ステム構造は例えば、 (i)5’-GAGGGUAGAAUGGGACUACCUUU-3’(配列番号１) (ii)5’-GUGCUCUUAGAAUGGGACUAAGACAC-3’（配列番号
２） (iii)5’-GACACGAUUGGGACGUGUC-3’（配列番号３） からなる群から選択される塩基配列を含むことができ
る。
造を形成する塩基配列は、それに隣接してステム構造を
形成する塩基配列を含み、これによってループ-ステム
構造が形成される。該ループ-ステム構造は例えば、 (i)5’-GAGGGUAGAAUGGGACUACCUUU-3’(配列番号１) (ii)5’-GUGCUCUUAGAAUGGGACUAAGACAC-3’（配列番号
２） (iii)5’-GACACGAUUGGGACGUGUC-3’（配列番号３） からなる群から選択される塩基配列を含むことができ
る。
【００１４】さらに別の実施態様において、上記ＲＮＡ
アプタマー配列中の２つのステム構造の間に、下記の塩
基配列： (i) 5’-CCUC-3’ (ii) 5’-AUUCCGACCAGAAGCUUCGGGAUUU-3’(配列番号
４) (iii) 5’-GGGACCCUUUCCUC-3’（配列番号５） (iv) 5’-AUUCCGACCAGAA-3’（配列番号６） (v) 5’-UAUGGGACCCUUUCCUC-3’（配列番号７） (vi) 5’-AUUCCGACCAGAAGUAC-3’（配列番号８） からなる群から選択されるリンカー又はループ-ステム
構造を形成する配列が介在して含むことができる。
アプタマー配列中の２つのステム構造の間に、下記の塩
基配列： (i) 5’-CCUC-3’ (ii) 5’-AUUCCGACCAGAAGCUUCGGGAUUU-3’(配列番号
４) (iii) 5’-GGGACCCUUUCCUC-3’（配列番号５） (iv) 5’-AUUCCGACCAGAA-3’（配列番号６） (v) 5’-UAUGGGACCCUUUCCUC-3’（配列番号７） (vi) 5’-AUUCCGACCAGAAGUAC-3’（配列番号８） からなる群から選択されるリンカー又はループ-ステム
構造を形成する配列が介在して含むことができる。
【００１５】さらに別の実施態様において、上記ＲＮＡ
アプタマー配列は例えば、下記の塩基配列： (i)5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUUCGGGAUUUGAGGGUAGAAUG
GGACUACCUUUCCUCUCUCCU-3’（配列番号９） (ii)5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGUGCUCUUAGAAUGGGACUAAGA
CACGGGACCCUUUCCUCUCUCCU-3’（配列番号１０） (iii)5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGUACGACACGAUUGGGACGUGU
CUAUGGGACCCUUUCCUCUCUCCU-3’（配列番号１１） からなる群から選択される配列からなる。
アプタマー配列は例えば、下記の塩基配列： (i)5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUUCGGGAUUUGAGGGUAGAAUG
GGACUACCUUUCCUCUCUCCU-3’（配列番号９） (ii)5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGUGCUCUUAGAAUGGGACUAAGA
CACGGGACCCUUUCCUCUCUCCU-3’（配列番号１０） (iii)5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGUACGACACGAUUGGGACGUGU
CUAUGGGACCCUUUCCUCUCUCCU-3’（配列番号１１） からなる群から選択される配列からなる。
【００１６】本発明のさらに別の実施態様において、上
記リボザイム配列は、ハンマーヘッド型である。例えば
リボザイム配列は、ステム構造を形成する下記の二本鎖
配列： 5’-CUGAUGAGUCC-3’ 3’-AAG CAGG-5’ を含む。（ここで、5’-CUGAUGAGUCC-3’は配列番号18
として示される。）さらに別の実施態様において、上記
リボザイム配列のステム構造は、前記ＲＮＡアプタマー
配列中の下記のステム構造部分： 5’-GGGAGA-3’ 3’-UCCUCU-5’ と連結されている。
記リボザイム配列は、ハンマーヘッド型である。例えば
リボザイム配列は、ステム構造を形成する下記の二本鎖
配列： 5’-CUGAUGAGUCC-3’ 3’-AAG CAGG-5’ を含む。（ここで、5’-CUGAUGAGUCC-3’は配列番号18
として示される。）さらに別の実施態様において、上記
リボザイム配列のステム構造は、前記ＲＮＡアプタマー
配列中の下記のステム構造部分： 5’-GGGAGA-3’ 3’-UCCUCU-5’ と連結されている。
【００１７】さらに別の実施態様において、上記リボザ
イム配列は、ＩＲＥＳの塩基配列と相補的な基質結合配
列を含む。基質結合配列は、10〜100塩基以上、通常10
〜50塩基、好ましくは10〜30塩基、さらに好ましくは15
〜20塩基からなる。
イム配列は、ＩＲＥＳの塩基配列と相補的な基質結合配
列を含む。基質結合配列は、10〜100塩基以上、通常10
〜50塩基、好ましくは10〜30塩基、さらに好ましくは15
〜20塩基からなる。
【００１８】さらに別の実施態様において、本発明のキ
メラＲＮＡ分子は、下記の塩基配列： (i) Rz-G9I-IIIb 5’-GGUUGAUCCCUGAUGAGUCCGGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUUCGG
GAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUGGACGAAAGAAA
GGAC-3’（配列番号１２） (ii) Rz-G9II-IIIb 5’-GGUUGAUCCCUGAUGAGUCCGGGAGAAUUCCGACCAGAAGUGCUCU
UAGAAUGGGACUAAGACACGGGACCCUUUCCUCUCUCCUGGACGAAAGAA
AGGAC-3’（配列番号１３） (iii) Rz-G9III-IIIb 5’-GGUUGAUCCCUGAUGAGUCCGGGAGAAUUCCGACCAGAAGUACGAC
ACGAUUGGGACGUGUCUAUGGGACCCUUUCCUCUCUCCUGGACGAAAGAA
AGGAC-3’（配列番号１４） (iv) Rz-G9I-IIId 5’-GGCGACCCCUGAUGAGUCCGGGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUUCGG
GAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUGGACGAAACAC
UACUC-3’（配列番号１５） (v) Rz-G9II-IIId 5’-GGCGACCCCUGAUGAGUCCGGGAGAAUUCCGACCAGAAGUGCUCUU
AGAAUGGGACUAAGACACGGGACCCUUUCCUCUCUCCUGGACGAAACACU
ACUC-3’（配列番号１６） (vi) Rz-G9III-IIId 5’-GGCGACCCCUGAUGAGUCCGGGGAGAAUUCCGACCAGAAGUACGAC
ACGAUUGGGACGUGUCUAUGGGACCCUUUCCUCUCUCCUUGGACGAAACA
CUACUC-3’（配列番号１７） からなる群から選択される配列からなる。
メラＲＮＡ分子は、下記の塩基配列： (i) Rz-G9I-IIIb 5’-GGUUGAUCCCUGAUGAGUCCGGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUUCGG
GAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUGGACGAAAGAAA
GGAC-3’（配列番号１２） (ii) Rz-G9II-IIIb 5’-GGUUGAUCCCUGAUGAGUCCGGGAGAAUUCCGACCAGAAGUGCUCU
UAGAAUGGGACUAAGACACGGGACCCUUUCCUCUCUCCUGGACGAAAGAA
AGGAC-3’（配列番号１３） (iii) Rz-G9III-IIIb 5’-GGUUGAUCCCUGAUGAGUCCGGGAGAAUUCCGACCAGAAGUACGAC
ACGAUUGGGACGUGUCUAUGGGACCCUUUCCUCUCUCCUGGACGAAAGAA
AGGAC-3’（配列番号１４） (iv) Rz-G9I-IIId 5’-GGCGACCCCUGAUGAGUCCGGGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUUCGG
GAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUGGACGAAACAC
UACUC-3’（配列番号１５） (v) Rz-G9II-IIId 5’-GGCGACCCCUGAUGAGUCCGGGAGAAUUCCGACCAGAAGUGCUCUU
AGAAUGGGACUAAGACACGGGACCCUUUCCUCUCUCCUGGACGAAACACU
ACUC-3’（配列番号１６） (vi) Rz-G9III-IIId 5’-GGCGACCCCUGAUGAGUCCGGGGAGAAUUCCGACCAGAAGUACGAC
ACGAUUGGGACGUGUCUAUGGGACCCUUUCCUCUCUCCUUGGACGAAACA
CUACUC-3’（配列番号１７） からなる群から選択される配列からなる。
【００１９】本発明は、第2の態様において、上記のキ
メラＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写因子の制御下
に含む発現ベクターを提供する。その実施態様におい
て、前記転写因子はプロモーターを含む。該プロモータ
ーの例として、ポリメラーゼIIIプロモーター又はβ-ア
クチンプロモーターを挙げることができる。
メラＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写因子の制御下
に含む発現ベクターを提供する。その実施態様におい
て、前記転写因子はプロモーターを含む。該プロモータ
ーの例として、ポリメラーゼIIIプロモーター又はβ-ア
クチンプロモーターを挙げることができる。
【００２０】別の実施態様において、転写因子はさらに
エンハンサーを含むことができる。該エンハンサーの例
はサイトメガロウイルス由来のエンハンサーである。本
発明は、第3の態様において、上記のキメラＲＮＡ分子
を含む、Ｃ型肝炎を予防又は治療するための医薬組成物
を提供する。本発明は、第4の態様において、上記の発
現ベクターを含む、Ｃ型肝炎を予防又は治療するための
医薬組成物を提供する。本明細書中で使用する用語の定
義は以下のとおりである。
エンハンサーを含むことができる。該エンハンサーの例
はサイトメガロウイルス由来のエンハンサーである。本
発明は、第3の態様において、上記のキメラＲＮＡ分子
を含む、Ｃ型肝炎を予防又は治療するための医薬組成物
を提供する。本発明は、第4の態様において、上記の発
現ベクターを含む、Ｃ型肝炎を予防又は治療するための
医薬組成物を提供する。本明細書中で使用する用語の定
義は以下のとおりである。
【００２１】「アプタマー」とは、アミノ酸のような小
分子から蛋白質、さらにはウイルスのような高分子を認
識する核酸分子を意味し、本発明ではＨＣＶ由来のＮＳ
３プロテアーゼタンパク質に直接結合して該プロテアー
ゼの活性を阻害することが可能な機能性ＲＮＡ分子をい
う。阻害作用を有するアプタマーはin vitro選択法に
よって得ることができる。この選択法では、ランダムな
配列をもつＲＮＡ分子のプールから特定のタンパク質に
結合する分子を選択、増幅するサイクルを繰り返すこと
によって、非常に特異的に結合するＲＮＡアプタマーが
得られる。最初はごく僅かしかないそのような分子もＰ
ＣＲ法で増幅され、結合の弱い分子はサイクルを繰り返
すことで淘汰され、最終的に特異的に結合する分子のみ
が残る。
分子から蛋白質、さらにはウイルスのような高分子を認
識する核酸分子を意味し、本発明ではＨＣＶ由来のＮＳ
３プロテアーゼタンパク質に直接結合して該プロテアー
ゼの活性を阻害することが可能な機能性ＲＮＡ分子をい
う。阻害作用を有するアプタマーはin vitro選択法に
よって得ることができる。この選択法では、ランダムな
配列をもつＲＮＡ分子のプールから特定のタンパク質に
結合する分子を選択、増幅するサイクルを繰り返すこと
によって、非常に特異的に結合するＲＮＡアプタマーが
得られる。最初はごく僅かしかないそのような分子もＰ
ＣＲ法で増幅され、結合の弱い分子はサイクルを繰り返
すことで淘汰され、最終的に特異的に結合する分子のみ
が残る。
【００２２】「リボザイム」とは、触媒機能をもつRNA
を指し、詳しくは、任意のRNA鎖を部位特異的に切断す
る触媒RNAをいう。本発明ではこのような特性をもつRNA
はすべて包含される。「IRES」とは、ＨＣＶ遺伝子の
５'非翻訳領域に位置（図1）し、リボソームがキャップ
構造非依存的に翻訳を開始するために必須な約350ヌク
レオチドから構成されるＲＮＡ構造（図2）である。IRE
Sは、ＨＣＶの遺伝子型間において高い相同性をもって
保存されているため、種々のＨＣＶの型（又は株）に依
存することなく、IRES構造の破壊によって蛋白への翻訳
を阻止することが可能となる。
を指し、詳しくは、任意のRNA鎖を部位特異的に切断す
る触媒RNAをいう。本発明ではこのような特性をもつRNA
はすべて包含される。「IRES」とは、ＨＣＶ遺伝子の
５'非翻訳領域に位置（図1）し、リボソームがキャップ
構造非依存的に翻訳を開始するために必須な約350ヌク
レオチドから構成されるＲＮＡ構造（図2）である。IRE
Sは、ＨＣＶの遺伝子型間において高い相同性をもって
保存されているため、種々のＨＣＶの型（又は株）に依
存することなく、IRES構造の破壊によって蛋白への翻訳
を阻止することが可能となる。
【００２３】「ループ構造」とは、一本鎖の核酸による
ループ状の構造をいう。図3CにはＲＮＡアプタマー（G9
-I, G9-II, G9-III）の二次構造が例示されているが、
ステム構造の末端に見られるリング状部分がループ構造
である。「ステム構造」とは、塩基対合により二本鎖を
形成した核酸のステム状の構造をいう。「ループ-ステ
ム構造」とは、一本鎖のＲＮＡがループとステムを形成
した構造をいう。
ループ状の構造をいう。図3CにはＲＮＡアプタマー（G9
-I, G9-II, G9-III）の二次構造が例示されているが、
ステム構造の末端に見られるリング状部分がループ構造
である。「ステム構造」とは、塩基対合により二本鎖を
形成した核酸のステム状の構造をいう。「ループ-ステ
ム構造」とは、一本鎖のＲＮＡがループとステムを形成
した構造をいう。
【００２４】「リンカー」とは、２つのドメイン間を結
合する核酸をいう。「ハンマーヘッド型」とは、ＲＮＡ
を切断する活性をもつ最も小さい触媒ＲＮＡ (Symons,
R. H., Ann. Rev. Biochem., 61: 641-671,1992)であ
り、特定の部位、即ちNUX配列（N及びXはそれぞれA, G,
C又はU、及びA, C又はUである。）の後ろ、効率的な切
断部位としてGUC、GUU、CUUなどのトリプレットの後ろ
でＲＮＡ鎖を切断可能である(Shimayama, T. et al., B
iochemistry 34: 3649-3654, 1995)。したがって、特定
のRNA分子を切断できる人工エンドヌクレアーゼとして
使用するために、30個程度のヌクレオチドからなるRNA
分子を作製できる(Haseloff, J. and Gerlach, W. L.,
Nature 334: 585-591, 1988)。
合する核酸をいう。「ハンマーヘッド型」とは、ＲＮＡ
を切断する活性をもつ最も小さい触媒ＲＮＡ (Symons,
R. H., Ann. Rev. Biochem., 61: 641-671,1992)であ
り、特定の部位、即ちNUX配列（N及びXはそれぞれA, G,
C又はU、及びA, C又はUである。）の後ろ、効率的な切
断部位としてGUC、GUU、CUUなどのトリプレットの後ろ
でＲＮＡ鎖を切断可能である(Shimayama, T. et al., B
iochemistry 34: 3649-3654, 1995)。したがって、特定
のRNA分子を切断できる人工エンドヌクレアーゼとして
使用するために、30個程度のヌクレオチドからなるRNA
分子を作製できる(Haseloff, J. and Gerlach, W. L.,
Nature 334: 585-591, 1988)。
【００２５】[転写因子]とは、ＤＮＡ遺伝情報がＲＮＡ
へ転写される過程で転写を調節する因子をいう。この因
子には、例えばプロモーターやエンハンサーが含まれ
る。プロモーターはTATAボックス、GCリッチ反復配列な
どからなり、ゲノム上のそれらの位置は真核細胞、原核
細胞、ウイルスによって異なる。エンハンサーは真核細
胞、ウイルスに存在し、プロモーターの上流に存在し
て、プロモーターからの転写を著しく促進する働きを有
する。転写因子にはオペレーターも含むことができ、こ
の場合任意の誘導物質によって転写をコントロールする
ことができる。
へ転写される過程で転写を調節する因子をいう。この因
子には、例えばプロモーターやエンハンサーが含まれ
る。プロモーターはTATAボックス、GCリッチ反復配列な
どからなり、ゲノム上のそれらの位置は真核細胞、原核
細胞、ウイルスによって異なる。エンハンサーは真核細
胞、ウイルスに存在し、プロモーターの上流に存在し
て、プロモーターからの転写を著しく促進する働きを有
する。転写因子にはオペレーターも含むことができ、こ
の場合任意の誘導物質によって転写をコントロールする
ことができる。
【００２６】
【発明の実施の形態】本発明をさらに詳細に説明する。
【００２７】ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼに対する阻害
活性をもつＲＮＡアプタマー配列 NS3プロテアーゼの活性阻害剤を得るために、インビト
ロ選択法によってランダムなRNAオリゴヌクレオチドの
ライブラリー（N30；図3A）から、NS3のプロテアーゼ活
性ドメイン（△NS3と称する；アミノ酸番号1027-1218）
に対するRNAアプタマーを作製した（図3ＢのG9-I、G9-I
I、G9-III；Fukuda, K. et al., Eur.J. Biochem., 26
7:3685-3694, 2000）。インビトロ選択法は、標的分子
に対して特異的親和性をもった新規の核酸分子を創製す
る手法としてその有効性が認められている。得られた3
種類のRNAアプタマーの二次構造をMulfold プログラム
によって解析した結果、ループとステムから構成される
構造をもつことが予測された。また共通モチーフ配列
が、ループ構造（-GA(A/U)UGGGAC-）を形成しているこ
とが推測された（図3C；太字の部分）。これらの予測は
RNase限定分解法や、化学修飾法により、この構造の正
しいことを確認した。RNAアプタマーの△NS3に対する解
離定数を解析した結果、３つとも約 10 nMであった。△
NS3およびMBP-NS3（NS3の全アミノ酸配列を含むもの）
のプロテアーゼ活性に対する抑制効果を調べた結果、す
べてのクラスが約90%の阻害活性を示した。さらにp41
（NS4Aの一部の配列を含む合成ペプチドでNS4Aと機能相
補し、NS3のプロテアーゼ活性を促進する。）存在下に
おけるMBP-NS3のプロテアーゼ活性の抑制効果を調べた
ところ、すべてのクラスが約70%の阻害活性を示した。G
9-IアプタマーのΔNS3に対する阻害様式をDixon プロッ
トによって 解析した結果、非競合的な阻害様式を示
し、阻害物質定数は約100 nMであった。これらの結果か
ら、得られた3種類のRNAアプタマーはNS3に対して特異
的親和性を示し、抗HCV剤としてのリード化合物の候補
に成りうることが示唆された。
活性をもつＲＮＡアプタマー配列 NS3プロテアーゼの活性阻害剤を得るために、インビト
ロ選択法によってランダムなRNAオリゴヌクレオチドの
ライブラリー（N30；図3A）から、NS3のプロテアーゼ活
性ドメイン（△NS3と称する；アミノ酸番号1027-1218）
に対するRNAアプタマーを作製した（図3ＢのG9-I、G9-I
I、G9-III；Fukuda, K. et al., Eur.J. Biochem., 26
7:3685-3694, 2000）。インビトロ選択法は、標的分子
に対して特異的親和性をもった新規の核酸分子を創製す
る手法としてその有効性が認められている。得られた3
種類のRNAアプタマーの二次構造をMulfold プログラム
によって解析した結果、ループとステムから構成される
構造をもつことが予測された。また共通モチーフ配列
が、ループ構造（-GA(A/U)UGGGAC-）を形成しているこ
とが推測された（図3C；太字の部分）。これらの予測は
RNase限定分解法や、化学修飾法により、この構造の正
しいことを確認した。RNAアプタマーの△NS3に対する解
離定数を解析した結果、３つとも約 10 nMであった。△
NS3およびMBP-NS3（NS3の全アミノ酸配列を含むもの）
のプロテアーゼ活性に対する抑制効果を調べた結果、す
べてのクラスが約90%の阻害活性を示した。さらにp41
（NS4Aの一部の配列を含む合成ペプチドでNS4Aと機能相
補し、NS3のプロテアーゼ活性を促進する。）存在下に
おけるMBP-NS3のプロテアーゼ活性の抑制効果を調べた
ところ、すべてのクラスが約70%の阻害活性を示した。G
9-IアプタマーのΔNS3に対する阻害様式をDixon プロッ
トによって 解析した結果、非競合的な阻害様式を示
し、阻害物質定数は約100 nMであった。これらの結果か
ら、得られた3種類のRNAアプタマーはNS3に対して特異
的親和性を示し、抗HCV剤としてのリード化合物の候補
に成りうることが示唆された。
【００２８】G9-Iの各ループ、ステム構造の新たな塩基
置換もしくは欠失体を作製し、その機能に及ぼす影響を
調べた結果、共通のモチーフ配列（-GAAUGGGAC-）を含
むStem-loop III 構造が、DNS3のプロテアーゼ阻害活性
に重要であることが明らかになった（図4）。さらにプ
ライマー配列から構成されるStem I も、両活性に関与
していることが判明した（図4）。一方、Stem-loop II
は直接活性には関わっていなかった。しかしながら、St
em IとStem-loop III 間には、全体の活性を有する三次
構造を維持するために、幾つかの二本鎖構造が必要であ
ることが示唆された。
置換もしくは欠失体を作製し、その機能に及ぼす影響を
調べた結果、共通のモチーフ配列（-GAAUGGGAC-）を含
むStem-loop III 構造が、DNS3のプロテアーゼ阻害活性
に重要であることが明らかになった（図4）。さらにプ
ライマー配列から構成されるStem I も、両活性に関与
していることが判明した（図4）。一方、Stem-loop II
は直接活性には関わっていなかった。しかしながら、St
em IとStem-loop III 間には、全体の活性を有する三次
構造を維持するために、幾つかの二本鎖構造が必要であ
ることが示唆された。
【００２９】上記の知見に基づき、本発明で使用可能な
ＲＮＡアプタマー配列のは少なくとも、ループ構造を形
成する下記の塩基配列： 5’-GAXUGGGAC-3’ （配列中、ＸはＡ又はＵである。）と、下記の塩基配
列： 5’-GGGAGA-3’ 3’-UCCUCU-5’ を有するステム構造とを含むことができる。さらに該ル
ープ構造には、その配列に隣接して別のステム構造を形
成する二本鎖の塩基配列が存在し、ループ-ステム構造
を形成する必要がある。ループ-ステム構造の具体例は
配列番号１、２、３に示される塩基配列を有するもので
あるが、ステム部分の配列は例示のものに限定されず変
化可能である。本発明で使用可能なＲＮＡアプタマー配
列においては、上記ループ構造と上記ステム構造（例え
ば図4中ではLoopIII-StemIIIとStemIを指す。）との間
に活性を有する三次構造を維持するためにリンカー又は
二本鎖構造（例えば配列番号４〜８、配列CCUCなど）が
必要である。
ＲＮＡアプタマー配列のは少なくとも、ループ構造を形
成する下記の塩基配列： 5’-GAXUGGGAC-3’ （配列中、ＸはＡ又はＵである。）と、下記の塩基配
列： 5’-GGGAGA-3’ 3’-UCCUCU-5’ を有するステム構造とを含むことができる。さらに該ル
ープ構造には、その配列に隣接して別のステム構造を形
成する二本鎖の塩基配列が存在し、ループ-ステム構造
を形成する必要がある。ループ-ステム構造の具体例は
配列番号１、２、３に示される塩基配列を有するもので
あるが、ステム部分の配列は例示のものに限定されず変
化可能である。本発明で使用可能なＲＮＡアプタマー配
列においては、上記ループ構造と上記ステム構造（例え
ば図4中ではLoopIII-StemIIIとStemIを指す。）との間
に活性を有する三次構造を維持するためにリンカー又は
二本鎖構造（例えば配列番号４〜８、配列CCUCなど）が
必要である。
【００３０】本発明において、好ましいＲＮＡアプタマ
ー配列は配列番号９、10、11に示される配列である（図
3C中、G9-I, G9-II, G9-III参照）。これらの配列の両
末端にリボザイム配列を連結すると本発明のキメラＲＮ
Ａ分子になる。
ー配列は配列番号９、10、11に示される配列である（図
3C中、G9-I, G9-II, G9-III参照）。これらの配列の両
末端にリボザイム配列を連結すると本発明のキメラＲＮ
Ａ分子になる。
【００３１】ＨＣＶのＩＲＥＳに対する切断活性をもつ
リボザイム配列 本発明で使用可能なリボザイムは、HCVのIRESを酵素的
に切断する活性をもつならばその種類を問わない。好適
なリボザイムはハンマーヘッド型リボザイムであり、こ
のリボザイムは例えば下記の二本鎖配列： 5’-CUGAUGAGUCC-3’ 3’-AAG CAGG-5’ を含むステム領域と、基質IRES（図2）が結合するため
の基質結合配列とを含む。あるいは、本発明のリボザイ
ムはヘテロダイメリックのリボザイム（マキシザイムと
もいう）でもよい(T. Kuwabara et al., Mol Cell, 2:6
17-627, 1998)。基質結合配列は、切断可能部位〔NUX配
列（N及びXはそれぞれA, G, C又はU、及びA, C又はUで
ある。）〕を含む基質IRESに相補的な配列からなる。し
たがって、基質IRES配列（図2）中の上記NUX配列を含む
任意の配列がリボザイムのターゲットとなる。基質結合
配列は、10〜100塩基以上、通常15〜50塩基、好ましく
は15〜30塩基、より好ましくは15〜20塩基からなる。
リボザイム配列 本発明で使用可能なリボザイムは、HCVのIRESを酵素的
に切断する活性をもつならばその種類を問わない。好適
なリボザイムはハンマーヘッド型リボザイムであり、こ
のリボザイムは例えば下記の二本鎖配列： 5’-CUGAUGAGUCC-3’ 3’-AAG CAGG-5’ を含むステム領域と、基質IRES（図2）が結合するため
の基質結合配列とを含む。あるいは、本発明のリボザイ
ムはヘテロダイメリックのリボザイム（マキシザイムと
もいう）でもよい(T. Kuwabara et al., Mol Cell, 2:6
17-627, 1998)。基質結合配列は、切断可能部位〔NUX配
列（N及びXはそれぞれA, G, C又はU、及びA, C又はUで
ある。）〕を含む基質IRESに相補的な配列からなる。し
たがって、基質IRES配列（図2）中の上記NUX配列を含む
任意の配列がリボザイムのターゲットとなる。基質結合
配列は、10〜100塩基以上、通常15〜50塩基、好ましく
は15〜30塩基、より好ましくは15〜20塩基からなる。
【００３２】キメラＲＮＡ分子 ＲＮＡアプタマー配列は、例えば図5Ａ、５Ｂに示され
るように、ステム領域に結合される。本発明のキメラ分
子は、例えば配列番号12〜17に示される配列を有する
が、この例の基質結合配列部分はさらに伸長可能であ
る。
るように、ステム領域に結合される。本発明のキメラ分
子は、例えば配列番号12〜17に示される配列を有する
が、この例の基質結合配列部分はさらに伸長可能であ
る。
【００３３】具体的には、△NS3に対して得られたRNAア
プタマー（NS3アプタマーともいう）に新たな機能を付
加させるために、HCV遺伝子の５’非翻訳領域に位置す
るIRESをターゲットとしたハンマーヘッド型リボザイム
とのキメラ体（Rz-G9 アプタマーともいう）が作製され
る（図5A、5B）。IRESのIIIbおよびIIIdドメインのルー
プ領域をハンマーヘッド型リボザイムのターゲット配列
として選択し（図2の矢印）、Rz-G9 アプタマー（Rz-G9
I-IIIb、Rz-G9II-IIIb、Rz-G9III-IIIb、Rz-G9I-IIId、
Rz-G9II-IIId、Rz-G9III-IIId）の構築をPCR法に基づい
て行うことができる（後述の実施例）。
プタマー（NS3アプタマーともいう）に新たな機能を付
加させるために、HCV遺伝子の５’非翻訳領域に位置す
るIRESをターゲットとしたハンマーヘッド型リボザイム
とのキメラ体（Rz-G9 アプタマーともいう）が作製され
る（図5A、5B）。IRESのIIIbおよびIIIdドメインのルー
プ領域をハンマーヘッド型リボザイムのターゲット配列
として選択し（図2の矢印）、Rz-G9 アプタマー（Rz-G9
I-IIIb、Rz-G9II-IIIb、Rz-G9III-IIIb、Rz-G9I-IIId、
Rz-G9II-IIId、Rz-G9III-IIId）の構築をPCR法に基づい
て行うことができる（後述の実施例）。
【００３４】Rz−NS3アプタマー発現ベクター 上記のRz-NS3アプタマー（キメラRNA分子）をコードす
るDNAを作製し、これを転写因子を含むベクターに組み
込むことによって、Rz-NS3アプタマー発現ベクターを得
ることができる。
るDNAを作製し、これを転写因子を含むベクターに組み
込むことによって、Rz-NS3アプタマー発現ベクターを得
ることができる。
【００３５】Rz-NS3アプタマーをコードするDNAは、当
業界で周知の核酸の化学的合成法により、例えばDNA/RN
A合成機を用いて製造することができる。また、合成さ
れたDNAを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術
を利用してか、あるいは該DNAを含むベクターによって
形質転換された培養宿主細胞中での発現を利用して、該
DNAを増幅することができる。PCR技術、形質転換及び発
現技術は例えばJ. Sambrookら（Molecular Cloning A L
aboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, Second edition., 1989）に記載されている。
業界で周知の核酸の化学的合成法により、例えばDNA/RN
A合成機を用いて製造することができる。また、合成さ
れたDNAを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術
を利用してか、あるいは該DNAを含むベクターによって
形質転換された培養宿主細胞中での発現を利用して、該
DNAを増幅することができる。PCR技術、形質転換及び発
現技術は例えばJ. Sambrookら（Molecular Cloning A L
aboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, Second edition., 1989）に記載されている。
【００３６】発現系を構築するためのベクターとして
は、pUC19（宝酒造、京都）、pGREENLANTERN（ライフテ
ックオリエンタル（株）、東京）、pHaMDR (HUMAN GENE
THERAPY 6:905-915 (July 1995))などのプラスミドベ
クター、遺伝子治療用ベクターとしてのアデノウイルス
ベクターやレトロウイルスベクター（例えばモロニーマ
ウス白血病ウイルス等）などを使用できる。
は、pUC19（宝酒造、京都）、pGREENLANTERN（ライフテ
ックオリエンタル（株）、東京）、pHaMDR (HUMAN GENE
THERAPY 6:905-915 (July 1995))などのプラスミドベ
クター、遺伝子治療用ベクターとしてのアデノウイルス
ベクターやレトロウイルスベクター（例えばモロニーマ
ウス白血病ウイルス等）などを使用できる。
【００３７】上記ベクターにおいて、キメラ分子の上流
にはプロモーター配列を含むことができる。プロモータ
ー配列は、該キメラ分子の発現を調節する要素であり、
ウイルスプロモーター（アデノウイルスVA1プロモータ
ー、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス即時
型初期プロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルスプロ
モーターなど）、ファージプロモーター（λPLプロモー
ターなど）、pol IIIプロモーター（ヒトtRNAプロモー
ター（例えばtRNAvalプロモーター）など）、β−アク
チンプロモーターなどが含まれる。pol IIIプロモータ
ー（特にtRNAプロモーター）、β−アクチンプロモータ
ーが好ましく使用できる。さらに、転写因子としてプロ
モーターとエンハンサーの組合せを使用してもよい。エ
ンハンサーとしては哺乳類由来、ウイルス由来のものが
使用できる。後述の実施例では、ニワトリ由来β−アク
チンプロモーターとサイトメガロウイルス由来エンハン
サーの組合せが使用される。
にはプロモーター配列を含むことができる。プロモータ
ー配列は、該キメラ分子の発現を調節する要素であり、
ウイルスプロモーター（アデノウイルスVA1プロモータ
ー、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス即時
型初期プロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルスプロ
モーターなど）、ファージプロモーター（λPLプロモー
ターなど）、pol IIIプロモーター（ヒトtRNAプロモー
ター（例えばtRNAvalプロモーター）など）、β−アク
チンプロモーターなどが含まれる。pol IIIプロモータ
ー（特にtRNAプロモーター）、β−アクチンプロモータ
ーが好ましく使用できる。さらに、転写因子としてプロ
モーターとエンハンサーの組合せを使用してもよい。エ
ンハンサーとしては哺乳類由来、ウイルス由来のものが
使用できる。後述の実施例では、ニワトリ由来β−アク
チンプロモーターとサイトメガロウイルス由来エンハン
サーの組合せが使用される。
【００３８】また本発明のベクターにおいては、キメラ
分子の下流にターミネーター配列をさらに含むことがで
きる。ターミネーターは、転写を終結させる配列であれ
ば、いずれの配列も使用でき、ターミネーター配列とし
てUUUUUが使用できる。ベクターは、必要に応じて抗生
物質耐性遺伝子（例えばAmpr, Neor）、栄養要求性を相
補する遺伝子などの選択マーカー遺伝子若しくはレポー
ター遺伝子を含むことができる。
分子の下流にターミネーター配列をさらに含むことがで
きる。ターミネーターは、転写を終結させる配列であれ
ば、いずれの配列も使用でき、ターミネーター配列とし
てUUUUUが使用できる。ベクターは、必要に応じて抗生
物質耐性遺伝子（例えばAmpr, Neor）、栄養要求性を相
補する遺伝子などの選択マーカー遺伝子若しくはレポー
ター遺伝子を含むことができる。
【００３９】具体的には、Rz-NS3アプタマーの効果をin
vivoで評価するために、in vitro系で高い活性を示し
たG9 IIアプタマーとG9 IIIアプタマーとのキメラ体に
ついて、発現ベクターの構築をPCR法に基づいて試み
た。Rz-NS3アプタマーを導入するベクターとして、強い
転写活性をもつCAGプロモーター（Chicken-actin promo
ter + Cytomegarovirus enhancer）を有するpCAGGS（H.
Niwa et al., Gene, 108:193-200,1991）を選択した。
また、HDVリボザイム（Y-A. Suh et al., Nucleic Acid
s Res. 20:747-753, 1992）によって３’末端がプロセ
シングされ、Rz-NS3アプタマーが単独で転写されるよう
にデザインした。その結果、下記の４種類のpCAG/Rz-G9
aptamer/HDV： (i) pCAG/Rz-G9II-IIIb/HDV (ii) pCAG/Rz-G9III-IIIb/HDV (iii) pCAG/Rz-G9II-IIId/HDV (iv) pCAG/Rz-G9III-IIIb/HDV を構築した。
vivoで評価するために、in vitro系で高い活性を示し
たG9 IIアプタマーとG9 IIIアプタマーとのキメラ体に
ついて、発現ベクターの構築をPCR法に基づいて試み
た。Rz-NS3アプタマーを導入するベクターとして、強い
転写活性をもつCAGプロモーター（Chicken-actin promo
ter + Cytomegarovirus enhancer）を有するpCAGGS（H.
Niwa et al., Gene, 108:193-200,1991）を選択した。
また、HDVリボザイム（Y-A. Suh et al., Nucleic Acid
s Res. 20:747-753, 1992）によって３’末端がプロセ
シングされ、Rz-NS3アプタマーが単独で転写されるよう
にデザインした。その結果、下記の４種類のpCAG/Rz-G9
aptamer/HDV： (i) pCAG/Rz-G9II-IIIb/HDV (ii) pCAG/Rz-G9III-IIIb/HDV (iii) pCAG/Rz-G9II-IIId/HDV (iv) pCAG/Rz-G9III-IIIb/HDV を構築した。
【００４０】Rz-G9 アプタマーによる_NS3のプロテアー
ゼ活性の阻害 構築した６種類のRz-G9 アプタマーによる、ΔNS3のプ
ロテアーゼ活性の阻害効果を検討した。化学合成したNS
5A/NS5Bペプチド（ΔNS3の基質）およびp41ペプチド（N
S3のコファクター）の存在下、ΔNS3（0.8 mM）に対し
て２当量のRz-G9 アプタマー（1.6 mM）を加え、切断反
応を行った。その結果、Rz-G9II-IIIb、Rz-G9III-IIIb
およびRz-G9II-IIId、Rz-G9III-IIIdはG9アプタマー（G
9-I、G9-II、G9-III）と同様に、９０％以上の阻害活性
を示した（図６）。一方、G9-Iアプタマーとのキメラ体
であるRz-G9I-IIIbとRz-G9I-IIIdは約５０％程度の阻害
活性を示した。
ゼ活性の阻害 構築した６種類のRz-G9 アプタマーによる、ΔNS3のプ
ロテアーゼ活性の阻害効果を検討した。化学合成したNS
5A/NS5Bペプチド（ΔNS3の基質）およびp41ペプチド（N
S3のコファクター）の存在下、ΔNS3（0.8 mM）に対し
て２当量のRz-G9 アプタマー（1.6 mM）を加え、切断反
応を行った。その結果、Rz-G9II-IIIb、Rz-G9III-IIIb
およびRz-G9II-IIId、Rz-G9III-IIIdはG9アプタマー（G
9-I、G9-II、G9-III）と同様に、９０％以上の阻害活性
を示した（図６）。一方、G9-Iアプタマーとのキメラ体
であるRz-G9I-IIIbとRz-G9I-IIIdは約５０％程度の阻害
活性を示した。
【００４１】Rz-G9 アプタマーによる基質（IRES、RNA
379mer）の切断活性 構築した６種類のRz-G9 アプタマーによる、ターゲット
IRES（RNA379mer）のリボザイム切断活性を検討し、全
ての系において、ターゲット配列部位IIIb 及びIIId ド
メインでの位置特異的（図２の矢印、図７）切断が起こ
ることを、アガロースゲル電気泳動で確認した。又、酵
素（Rz-G9 アプタマー）過剰下の条件で速度論的解析
（図８）を行い、各々のキネテックパラメーター
（kcat、KM）を比較した。その結果、二次構造モデル
上、基質との結合がより優位と考えられるIIId シリー
ズが、より高い切断活性効率（kcat/KM）を示し二次構
造モデルと活性との相関関係を示唆した。Rz-G9II-IIId
およびRz-G9III-IIIdの切断活性効率の値（kcat/KM）が
１mＭ-1min-1以上を示し、通常のハンマーヘッド型リボ
ザイムに近い値を示している。
379mer）の切断活性 構築した６種類のRz-G9 アプタマーによる、ターゲット
IRES（RNA379mer）のリボザイム切断活性を検討し、全
ての系において、ターゲット配列部位IIIb 及びIIId ド
メインでの位置特異的（図２の矢印、図７）切断が起こ
ることを、アガロースゲル電気泳動で確認した。又、酵
素（Rz-G9 アプタマー）過剰下の条件で速度論的解析
（図８）を行い、各々のキネテックパラメーター
（kcat、KM）を比較した。その結果、二次構造モデル
上、基質との結合がより優位と考えられるIIId シリー
ズが、より高い切断活性効率（kcat/KM）を示し二次構
造モデルと活性との相関関係を示唆した。Rz-G9II-IIId
およびRz-G9III-IIIdの切断活性効率の値（kcat/KM）が
１mＭ-1min-1以上を示し、通常のハンマーヘッド型リボ
ザイムに近い値を示している。
【００４２】培養細胞を用いたRz-G9 aptamerのIRESに
対する切断効果 作製したRz-G9 aptamer発現プラスミドのIRESに対する
切断活性をin vivo（培養細胞を用いた系）で検討する
ため、IRES依存的に翻訳されるGFP発現プラスミドのpCM
V/IRES/nuc/GFPの構築を行った。発現したGFPはその下
流に位置する核移行シグナルの作用によって、核に集積
するようにデザインされている。さらにGFPのIRES依存
的な翻訳を確認するために、HCV IRES 活性に必須なド
メインIIIを欠失させたpCMV/mIRES/nuc/GFPの構築を同
時に行った。それぞれをHepG2細胞にトランスフェクシ
ョンし、蛍光顕微鏡で観察した結果、pCMV/IRES/nuc/GF
Pにおいては細胞の核が緑色に発光していることを確認
した（図８a）。一方、pCMV/mIRES/nuc/GFPにおいて
は、ほとんどの細胞において核の発光が見られなかった
（図８a）。以上の結果から、構築したpCMV/IRES/nuc/G
FPがIRES依存的にGFPを翻訳し、Rz-G9 aptamer発現プラ
スミドを評価する系として有用であることが判明した。
対する切断効果 作製したRz-G9 aptamer発現プラスミドのIRESに対する
切断活性をin vivo（培養細胞を用いた系）で検討する
ため、IRES依存的に翻訳されるGFP発現プラスミドのpCM
V/IRES/nuc/GFPの構築を行った。発現したGFPはその下
流に位置する核移行シグナルの作用によって、核に集積
するようにデザインされている。さらにGFPのIRES依存
的な翻訳を確認するために、HCV IRES 活性に必須なド
メインIIIを欠失させたpCMV/mIRES/nuc/GFPの構築を同
時に行った。それぞれをHepG2細胞にトランスフェクシ
ョンし、蛍光顕微鏡で観察した結果、pCMV/IRES/nuc/GF
Pにおいては細胞の核が緑色に発光していることを確認
した（図８a）。一方、pCMV/mIRES/nuc/GFPにおいて
は、ほとんどの細胞において核の発光が見られなかった
（図８a）。以上の結果から、構築したpCMV/IRES/nuc/G
FPがIRES依存的にGFPを翻訳し、Rz-G9 aptamer発現プラ
スミドを評価する系として有用であることが判明した。
【００４３】次にpCMV/IRES/nuc/GFP（1.0μg/well）と
Rz-G9 aptamer発現プラスミドのpCAG/Rz-G9II-IIIb/HD
V、pCAG/Rz-G9III-IIIb/HDV、pCAG/Rz-G9II-IIId/HDVお
よびpCAG/Rz-G9III-IIId/HDV（1.5μg/well）をトラン
スフェクション試薬（FuGENE）を用いて、HepG2細胞に
コトランスフェクションした。37℃で48-72時間培養
後、蛍光顕微鏡ならびに位相差顕微鏡で細胞を観察し、
Rz-G9 aptamerのIRESに対する切断効果を検討した。そ
の結果、pCAG/Rz-G9III-IIIb/HDVとpCAG/Rz-G9III-IIId
/HDVをコトランスフェクションした実験群において、核
の発光の減少が顕著に観察された（図８b）。
Rz-G9 aptamer発現プラスミドのpCAG/Rz-G9II-IIIb/HD
V、pCAG/Rz-G9III-IIIb/HDV、pCAG/Rz-G9II-IIId/HDVお
よびpCAG/Rz-G9III-IIId/HDV（1.5μg/well）をトラン
スフェクション試薬（FuGENE）を用いて、HepG2細胞に
コトランスフェクションした。37℃で48-72時間培養
後、蛍光顕微鏡ならびに位相差顕微鏡で細胞を観察し、
Rz-G9 aptamerのIRESに対する切断効果を検討した。そ
の結果、pCAG/Rz-G9III-IIIb/HDVとpCAG/Rz-G9III-IIId
/HDVをコトランスフェクションした実験群において、核
の発光の減少が顕著に観察された（図８b）。
【００４４】以上の結果から、細胞内で転写されたRz-G
9III-IIIbとRz-G9III-IIIdがIRESに対して有意に作用
（即ち、ハンマーヘッド型リボザイムによる切断反応）
し、HCV前駆体蛋白質の翻訳を阻害する機能性RNAである
ことが示唆された。
9III-IIIbとRz-G9III-IIIdがIRESに対して有意に作用
（即ち、ハンマーヘッド型リボザイムによる切断反応）
し、HCV前駆体蛋白質の翻訳を阻害する機能性RNAである
ことが示唆された。
【００４５】上記の例示ではHCVのIRESのドメインIIIｂ
とIIIｄの切断を試みたが、IRESは図2に示すようにIIV
のドメインから構成されており、IIIｂ、IIIｄ以外の領
域もターゲットとすることができる。この場合リボザイ
ムの基質結合配列は、そのようなターゲット部位を含む
領域に相補的な配列を含む。
とIIIｄの切断を試みたが、IRESは図2に示すようにIIV
のドメインから構成されており、IIIｂ、IIIｄ以外の領
域もターゲットとすることができる。この場合リボザイ
ムの基質結合配列は、そのようなターゲット部位を含む
領域に相補的な配列を含む。
【００４６】医薬組成物 本発明のキメラRNA分子及び発現ベクターはともにC型肝
炎を予防又は治療するために用いることができる。HCV
に感染した被験者の組織又は細胞（例えば肝臓）に、本
発明のキメラRNA分子又は発現ベクターを導入すること
によって、細胞中のHCVのIRESを切断するか、及び／又
は、HCVのNS3プロテアーゼを阻害しHCVの増殖を阻止す
ることができる。キメラRNA分子又は発現ベクターの導
入は例えば、それらをリポソームに封入し細胞内に取り
込む方法（”Lipidic vector systems for gene transf
er”(1997) R.J. Lee and L. Huang Crit, Rev. Ther.
Drug Carrier Syst. 14:173-206；中西守ら,蛋白質 核
酸 酵素 Vol.44, No.11, 1590-1596 (1999)）、リン酸
カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェク
ション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃によ
る方法などで行うことができる。ベクターを使用する場
合には、ベクターを細胞に上記の方法で導入することが
できる。例えば疾患部位の細胞を一部取り出し、in vit
roで遺伝子導入を行った後、該細胞を再び組織に戻すこ
とも可能であるし、あるいは、疾患部の組織に直接ベク
ターを導入することもできる。ウイルスベクターで感染
させる場合のウイルスタイターは通常約107pfu/ml以上
である。遺伝子治療にウイルスベクターを用いる方法に
ついては、例えば”Viral vectors in gene therapy”
(1997) A.E. Smith, Annu. Rev.Microbiol. 49:807-838
に記載されている。
炎を予防又は治療するために用いることができる。HCV
に感染した被験者の組織又は細胞（例えば肝臓）に、本
発明のキメラRNA分子又は発現ベクターを導入すること
によって、細胞中のHCVのIRESを切断するか、及び／又
は、HCVのNS3プロテアーゼを阻害しHCVの増殖を阻止す
ることができる。キメラRNA分子又は発現ベクターの導
入は例えば、それらをリポソームに封入し細胞内に取り
込む方法（”Lipidic vector systems for gene transf
er”(1997) R.J. Lee and L. Huang Crit, Rev. Ther.
Drug Carrier Syst. 14:173-206；中西守ら,蛋白質 核
酸 酵素 Vol.44, No.11, 1590-1596 (1999)）、リン酸
カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェク
ション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃によ
る方法などで行うことができる。ベクターを使用する場
合には、ベクターを細胞に上記の方法で導入することが
できる。例えば疾患部位の細胞を一部取り出し、in vit
roで遺伝子導入を行った後、該細胞を再び組織に戻すこ
とも可能であるし、あるいは、疾患部の組織に直接ベク
ターを導入することもできる。ウイルスベクターで感染
させる場合のウイルスタイターは通常約107pfu/ml以上
である。遺伝子治療にウイルスベクターを用いる方法に
ついては、例えば”Viral vectors in gene therapy”
(1997) A.E. Smith, Annu. Rev.Microbiol. 49:807-838
に記載されている。
【００４７】これまで、リボザイムのin vivo使用に関
する数多くの研究が行われ、種々の生物での遺伝子発現
の抑制のためにリボザイムを利用することを目的とした
多くの成功実験例〔 Sullenger, B. A. & Cech, T. R.,
Science 262: 1566-1569 (1993); Yu, M., et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 699-703 (1995); Bertr
and, E. et al., RNA 3: 75-88 (1997); Kawasaki, H.,
et al., Nature 393:284-289 (1998); Kuwabara, T.,
et al., Nature Biotechnol. 16: 961-965 (1998); Kuw
abara, T., et al., Mol. Cell 2: 617-627 (1998); Pl
ehn-Dujowich,D. & Altman, S., Proc. Natl. Sci. Aca
d. USA 95: 7327-7332 (1998); Koseki, S., et al.,
J. Virol. 73: 1868-1877 (1999); Tanabe, T. et al.,
Nature406: 473-474 (2000)〕が報告されており、ここ
に開示される手法を本発明にも適用することができる。
する数多くの研究が行われ、種々の生物での遺伝子発現
の抑制のためにリボザイムを利用することを目的とした
多くの成功実験例〔 Sullenger, B. A. & Cech, T. R.,
Science 262: 1566-1569 (1993); Yu, M., et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 699-703 (1995); Bertr
and, E. et al., RNA 3: 75-88 (1997); Kawasaki, H.,
et al., Nature 393:284-289 (1998); Kuwabara, T.,
et al., Nature Biotechnol. 16: 961-965 (1998); Kuw
abara, T., et al., Mol. Cell 2: 617-627 (1998); Pl
ehn-Dujowich,D. & Altman, S., Proc. Natl. Sci. Aca
d. USA 95: 7327-7332 (1998); Koseki, S., et al.,
J. Virol. 73: 1868-1877 (1999); Tanabe, T. et al.,
Nature406: 473-474 (2000)〕が報告されており、ここ
に開示される手法を本発明にも適用することができる。
【００４８】本発明のキメラRNA分子又は発現ベクター
を有効成分として含む医薬組成物は、必要により医薬上
許容される担体（例えば生理食塩水、緩衝液などの希釈
剤）を含むことができる。本発明の医薬組成物は、C型
肝炎の予防又は治療に使用することができる。被験者へ
の投与量、投与方法、投与頻度は、被験者の年齢、体
重、性別、疾病の状態、重篤度、生体の応答性によって
適宜変化させうるし、また、治療の有効性が認められる
まで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間
にわたり投与が継続される。
を有効成分として含む医薬組成物は、必要により医薬上
許容される担体（例えば生理食塩水、緩衝液などの希釈
剤）を含むことができる。本発明の医薬組成物は、C型
肝炎の予防又は治療に使用することができる。被験者へ
の投与量、投与方法、投与頻度は、被験者の年齢、体
重、性別、疾病の状態、重篤度、生体の応答性によって
適宜変化させうるし、また、治療の有効性が認められる
まで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間
にわたり投与が継続される。
【００４９】
【実施例】以下、実施例によって本発明をより具体的に
説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定
されることはないものとする。
説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定
されることはないものとする。
【００５０】〔実施例１〕Rz-G9アプタマー・キメラRNA分子等の構築 ここで使用したΔNS3タンパク質はすでに本発明者が報
告した方法により大腸菌HB101より精製した（Vishunuva
rdhan, D. et al., FEBS Lett., 402:209-212,1997）。
Rz-G9I-IIIb、Rz-G9II-IIIb、Rz-G9III-IIIb（図2；IRE
SのIIIbをターゲットする。）の構築のために、以下2本
の プライマーを用いた。
告した方法により大腸菌HB101より精製した（Vishunuva
rdhan, D. et al., FEBS Lett., 402:209-212,1997）。
Rz-G9I-IIIb、Rz-G9II-IIIb、Rz-G9III-IIIb（図2；IRE
SのIIIbをターゲットする。）の構築のために、以下2本
の プライマーを用いた。
【００５１】 (i) IIIb f-プライマー 5'-AGTAATACGACTCACTATAGGTTGATCCCTGATGAGTCCGGGAGAAT
TCCGACCAGAAG-3' (配列番号19) (ii) IIIb r-プライマー 5'-GTCCTTTCTTTCGTCCAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号2
0） Rz-G9I-IIId、Rz-G9II-IIId、Rz-G9III-IIId（図2；IRE
SのIIIdをターゲットする。）の構築のために、以下2本
の プライマーを用いた。
TCCGACCAGAAG-3' (配列番号19) (ii) IIIb r-プライマー 5'-GTCCTTTCTTTCGTCCAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号2
0） Rz-G9I-IIId、Rz-G9II-IIId、Rz-G9III-IIId（図2；IRE
SのIIIdをターゲットする。）の構築のために、以下2本
の プライマーを用いた。
【００５２】(iii) IIId f-プライマー 5'-AGTAATACGACTCACTATAGGCGACCCCTGATGAGTCCGGGAGAATT
CCGACCAGAAG-3'（配列番号21） (iv) IIId r-プライマー 5'-GAGTAGTGTTTCGTCCAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号2
2）
CCGACCAGAAG-3'（配列番号21） (iv) IIId r-プライマー 5'-GAGTAGTGTTTCGTCCAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号2
2）
【００５３】G9I、G9IIおよびG9IIIをコードしたDNAを
鋳型とし、上記のプライマーを用いてPCRを行った（94
℃, 75 sec -> 45℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイ
クルを5回、次いで94℃, 75 sec -> 65℃, 75 sec -> 7
2℃, 135 secのサイクルを20回）。得られたDNA断片を
精製およびクローン化し、配列の確認を行った（M13 un
iversal primerを用い、ABI PRISM Big Dye Terminator
Cycle Sequencing Reaction Kit を用いた。）。目的
の配列を持ったクローンを鋳型としてPCR断片を獲得
し、これらをRNAに転写して以下の実験に用いた。Rz-G9
アプタマーによるリボザイム切断反応の速度論的解析
に用いる鋳型RNA（379mer）を作製するために、以下の
２本のプライマーを用いた。
鋳型とし、上記のプライマーを用いてPCRを行った（94
℃, 75 sec -> 45℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイ
クルを5回、次いで94℃, 75 sec -> 65℃, 75 sec -> 7
2℃, 135 secのサイクルを20回）。得られたDNA断片を
精製およびクローン化し、配列の確認を行った（M13 un
iversal primerを用い、ABI PRISM Big Dye Terminator
Cycle Sequencing Reaction Kit を用いた。）。目的
の配列を持ったクローンを鋳型としてPCR断片を獲得
し、これらをRNAに転写して以下の実験に用いた。Rz-G9
アプタマーによるリボザイム切断反応の速度論的解析
に用いる鋳型RNA（379mer）を作製するために、以下の
２本のプライマーを用いた。
【００５４】 (i) T7f-プライマー 5'-AGTAATACGACTCACTATA-3'(配列番号23) (ii) 5' UTR r-プライマー 5'-GAGGTTTAGGATTCGTGCT-3'（配列番号24） HCV IRESをコードしたプラスミドDNAを鋳型とし、上記
のプライマーを用いて上記と同様にPCRを行った。得ら
れたDNA断片を、上記と同様に精製およびクローン化
し、配列の確認を行った。目的の配列をもったクローン
を鋳型としてPCR断片を獲得し、RNA（379mer）に転写し
て以下の実験に用いた。
のプライマーを用いて上記と同様にPCRを行った。得ら
れたDNA断片を、上記と同様に精製およびクローン化
し、配列の確認を行った。目的の配列をもったクローン
を鋳型としてPCR断片を獲得し、RNA（379mer）に転写し
て以下の実験に用いた。
【００５５】Rz-G9アプタマーによる△NS3プロテアーゼ
阻害活性の測定 基本的に垣内らにより報告された方法に従う（Kakiuch
i, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 210:1
059-1065, 1995）。ダンシル標識した NS5A／5B境界領
域の 20アミノ酸 Dns-GEAGD DIVPC／SMSYT WTGAL（／が
ΔNS3による切断部位）（86μM）にプレインキュベート
したΔNS3（0.75μM）とRNAアプタマー（3.6μM）の混
液を加え、25℃、1時間反応した。反応混液をHPLCで分
離し、蛍光（励起波長: 310 nm、 発光波長: 510 nm）
測定により、合成基質から産物の生成量を測定した。
阻害活性の測定 基本的に垣内らにより報告された方法に従う（Kakiuch
i, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 210:1
059-1065, 1995）。ダンシル標識した NS5A／5B境界領
域の 20アミノ酸 Dns-GEAGD DIVPC／SMSYT WTGAL（／が
ΔNS3による切断部位）（86μM）にプレインキュベート
したΔNS3（0.75μM）とRNAアプタマー（3.6μM）の混
液を加え、25℃、1時間反応した。反応混液をHPLCで分
離し、蛍光（励起波長: 310 nm、 発光波長: 510 nm）
測定により、合成基質から産物の生成量を測定した。
【００５６】結果を図６に示した。Rz-G9II-IIIb、Rz-G
9III-IIIbおよびRz-G9II-IIId、Rz-G9III-IIIdはG9アプ
タマー（G9-I、G9-II、G9-III）と同様に、９０％以上
の阻害活性を示した。一方、G9-Iアプタマーとのキメラ
体であるRz-G9I-IIIbとRz-G9I-IIIdは約５０％程度の阻
害活性を示した。
9III-IIIbおよびRz-G9II-IIId、Rz-G9III-IIIdはG9アプ
タマー（G9-I、G9-II、G9-III）と同様に、９０％以上
の阻害活性を示した。一方、G9-Iアプタマーとのキメラ
体であるRz-G9I-IIIbとRz-G9I-IIIdは約５０％程度の阻
害活性を示した。
【００５７】Rz-G９アプタマーによる基質（IRES、ＲＮ
Ａ379mer）の切断活性の測定 5'末端を32p標識した基質（0.01 mＭ、50 mM Tris-HCl
（pH 7.4）、10 mM MgCl2）、Rz-G9アプタマー（0.05〜
１ mＭ、50 mM Tris-HCl （pH 7.4）、10 mM MgCl2）
を37℃、10分間プレインキュベートし、混合することに
より反応を開始した。反応液を、目的の時間に一部を取
り出し、等量の反応停止液（50 ｍＭ ＥＤＴＡ、9 Ｍ
尿素、0.1% xylene cyanol、 0.1% bromophenolblu
e）に加えて反応を停止し、タイムコースをおった。各
フラクションは、90℃で2分間変性操作を行った後急冷
し、5％変性ＰＡＧＥにより未反応の基質と切断生成物
を分離し、イメージアナライザーによって放射活性を測
定し、切断生成物の量比を算出した。時間に対する切断
反応物の量比をプロットし、擬一次反応式から見かけの
反応速度定数（kobs）を求め、kobs/E(Rz-G9アプタマー
の濃度)とのプロット（Eadie-Hofstee plot）から、キ
ネテックパラメーター（ｋcat、KM）を求めた（表
１）。その結果、特にRz-G9II-IIIdおよびRz-G9III-III
dの切断活性効率の値（kca t/KM）が１mＭ-1min-1以上を
示し、通常のハンマーヘッド型リボザイムに近い値を示
している。
Ａ379mer）の切断活性の測定 5'末端を32p標識した基質（0.01 mＭ、50 mM Tris-HCl
（pH 7.4）、10 mM MgCl2）、Rz-G9アプタマー（0.05〜
１ mＭ、50 mM Tris-HCl （pH 7.4）、10 mM MgCl2）
を37℃、10分間プレインキュベートし、混合することに
より反応を開始した。反応液を、目的の時間に一部を取
り出し、等量の反応停止液（50 ｍＭ ＥＤＴＡ、9 Ｍ
尿素、0.1% xylene cyanol、 0.1% bromophenolblu
e）に加えて反応を停止し、タイムコースをおった。各
フラクションは、90℃で2分間変性操作を行った後急冷
し、5％変性ＰＡＧＥにより未反応の基質と切断生成物
を分離し、イメージアナライザーによって放射活性を測
定し、切断生成物の量比を算出した。時間に対する切断
反応物の量比をプロットし、擬一次反応式から見かけの
反応速度定数（kobs）を求め、kobs/E(Rz-G9アプタマー
の濃度)とのプロット（Eadie-Hofstee plot）から、キ
ネテックパラメーター（ｋcat、KM）を求めた（表
１）。その結果、特にRz-G9II-IIIdおよびRz-G9III-III
dの切断活性効率の値（kca t/KM）が１mＭ-1min-1以上を
示し、通常のハンマーヘッド型リボザイムに近い値を示
している。
【００５８】
【表１】Rz-G9アプタマーによるリボザイム切断反応の
速度論的解析
速度論的解析
【００５９】pCMV/IRES/nuc/GFPおよびpCMV/mIRES/nuc/
GFPの構築 pCMV/myc/nuc/GFP (Invitrogen) はサイトメガロウイ
ルス由来のプロモーター（Pcmv）を有し、核移行シグナ
ル（nuclear localization signal : NLS）を付加した
Green Fluorescent Protein（GFP）が発現するベクター
である。このベクターを細胞にトランスフェクションす
ると、発現したGFP が核に移行し、その蛍光を蛍光顕微
鏡により観察することができる。Rz-G9 アプタマーの
細胞内におけるIRES 切断活性を評価するために、IRES
依存的にGFP を発現するベクター（pCMV/IRES/nuc/GF
P）の構築をpCMV/myc/nuc/GFP をもとに行った。IRES
（-32〜363）をコードしたプラスミドを鋳型とし、5'-T
AATACGACTCACTATA-3'(T7-promoter primer;配列番号2
5）、5' GAGGTTTAGGATTCGTGCT-3'（5'-UTR primer；配
列番号26）をプライマーとしてPCR（94℃, 75 sec -> 5
5℃, 75 sec -> 72℃->135 secのサイクルを25回）を行
い、得られた断片を以下のようにしてpCMV/myc/nuc/GFP
に挿入した（図９）。なお IRES 配列中（ドメインIV
）に含まれる 342〜363 は、HCVコアタンパクの翻訳領
域であるが、IRESの翻訳開始活性に重要な二次構造形成
にも関わるため、挿入断片に含めた。IRES 依存的にGFP
が翻訳されるように、制限酵素 （Sfi I） でGFP 遺伝
子 の上流にあるコザックシークエンスを切断した（図
９a）。次にDNA Blunting Kit（寶酒造）を用い、3' 突
出末端の切断部位の平滑化（図９b）及び、IRES （-32
〜363）の挿入（図９c）を行った。この反応液をコンピ
テント細胞（JM 109、東洋紡）にトランスフォーメーシ
ョンした後、寒天培地上で培養した。出現したコロニー
からプラスミドDNAを調製した後、シークエンシングを
行い目的配列の確認を行った。
GFPの構築 pCMV/myc/nuc/GFP (Invitrogen) はサイトメガロウイ
ルス由来のプロモーター（Pcmv）を有し、核移行シグナ
ル（nuclear localization signal : NLS）を付加した
Green Fluorescent Protein（GFP）が発現するベクター
である。このベクターを細胞にトランスフェクションす
ると、発現したGFP が核に移行し、その蛍光を蛍光顕微
鏡により観察することができる。Rz-G9 アプタマーの
細胞内におけるIRES 切断活性を評価するために、IRES
依存的にGFP を発現するベクター（pCMV/IRES/nuc/GF
P）の構築をpCMV/myc/nuc/GFP をもとに行った。IRES
（-32〜363）をコードしたプラスミドを鋳型とし、5'-T
AATACGACTCACTATA-3'(T7-promoter primer;配列番号2
5）、5' GAGGTTTAGGATTCGTGCT-3'（5'-UTR primer；配
列番号26）をプライマーとしてPCR（94℃, 75 sec -> 5
5℃, 75 sec -> 72℃->135 secのサイクルを25回）を行
い、得られた断片を以下のようにしてpCMV/myc/nuc/GFP
に挿入した（図９）。なお IRES 配列中（ドメインIV
）に含まれる 342〜363 は、HCVコアタンパクの翻訳領
域であるが、IRESの翻訳開始活性に重要な二次構造形成
にも関わるため、挿入断片に含めた。IRES 依存的にGFP
が翻訳されるように、制限酵素 （Sfi I） でGFP 遺伝
子 の上流にあるコザックシークエンスを切断した（図
９a）。次にDNA Blunting Kit（寶酒造）を用い、3' 突
出末端の切断部位の平滑化（図９b）及び、IRES （-32
〜363）の挿入（図９c）を行った。この反応液をコンピ
テント細胞（JM 109、東洋紡）にトランスフォーメーシ
ョンした後、寒天培地上で培養した。出現したコロニー
からプラスミドDNAを調製した後、シークエンシングを
行い目的配列の確認を行った。
【００６０】ネガティブコントロールとなるベクター
（pCMV/mIRES/nuc/GFP）の構築を行うために、IRES 中
の翻訳開始活性に重要であるドメインIIIa〜d を含むス
テム-ループ構造 (134〜290)を欠失させた断片（mIRE
S）を作製し、これをワイルドタイプ IRES と同様にpCM
V/myc/nuc/GFPに挿入した。mIRES は、以下の1st PCR、
2ndPCR の2段階からなるPCR(いずれも94℃, 75 sec ->
50℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイクルを25回) に
より作製した（図１０）。1st PCR （図１０a）で、T7-
promoter primerとmutagenic primer-r (5' AGCACCCTAT
CAGGCCCCGGGAGGGGGGGT 3')（配列番号27）による断片
（1st PCR-1、-32〜133）および、5'-UTR primer とmut
agenic primer-f（5' ACCCCCCCTCCCGGGGCCTGATAGGGTGCT
3'（配列番号28）による断片（1st PCR-2、291〜363）
を独立に増幅させた（図１０- b）。mutagenic primer
-f、およびmutagenic primer -r は、プライマー配列
（15塩基）に加え、互いに他方のプライマー配列と相補
的な配列（15塩基）を有している。これら1st PCR によ
り得た断片を回収し、等量を混合した。これを熱変成さ
せたのちアニーリングを行うと、ヘテロの2本鎖が形成
される。そのうちの片方は1本鎖DNAの3'末端領域におい
てオーバーラップしており、この3'末端の伸長後、T7-p
romoter primer、5'-UTR primer を用いてこの2本鎖DNA
の増幅を行った（2ndPCR（図１０c））。この結果、ド
メインIIIa〜IIId (134〜290)を欠失させた断片（図１
０d）が得られた。
（pCMV/mIRES/nuc/GFP）の構築を行うために、IRES 中
の翻訳開始活性に重要であるドメインIIIa〜d を含むス
テム-ループ構造 (134〜290)を欠失させた断片（mIRE
S）を作製し、これをワイルドタイプ IRES と同様にpCM
V/myc/nuc/GFPに挿入した。mIRES は、以下の1st PCR、
2ndPCR の2段階からなるPCR(いずれも94℃, 75 sec ->
50℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイクルを25回) に
より作製した（図１０）。1st PCR （図１０a）で、T7-
promoter primerとmutagenic primer-r (5' AGCACCCTAT
CAGGCCCCGGGAGGGGGGGT 3')（配列番号27）による断片
（1st PCR-1、-32〜133）および、5'-UTR primer とmut
agenic primer-f（5' ACCCCCCCTCCCGGGGCCTGATAGGGTGCT
3'（配列番号28）による断片（1st PCR-2、291〜363）
を独立に増幅させた（図１０- b）。mutagenic primer
-f、およびmutagenic primer -r は、プライマー配列
（15塩基）に加え、互いに他方のプライマー配列と相補
的な配列（15塩基）を有している。これら1st PCR によ
り得た断片を回収し、等量を混合した。これを熱変成さ
せたのちアニーリングを行うと、ヘテロの2本鎖が形成
される。そのうちの片方は1本鎖DNAの3'末端領域におい
てオーバーラップしており、この3'末端の伸長後、T7-p
romoter primer、5'-UTR primer を用いてこの2本鎖DNA
の増幅を行った（2ndPCR（図１０c））。この結果、ド
メインIIIa〜IIId (134〜290)を欠失させた断片（図１
０d）が得られた。
【００６１】〔実施例２〕Rz-NS3 アプタマー発現ベクターの構築 Rz-NS3アプタマー（ハンマーヘッド型リボザイムとNS3
アプタマーのキメラ体）の発現ベクターを構築するため
に、CAGプロモーター（Chicken β-actin promoter + C
ytomegarovirus enhancer）を有するpCAGGSを選択し
た。まず最初にHDVリボザイムによって３’末端がプロ
セシングされ、NS3アプタマーが単独で転写されるよう
にデザインしたpCAG/G9 aptamer/HDVを構築した（図１
１）。
アプタマーのキメラ体）の発現ベクターを構築するため
に、CAGプロモーター（Chicken β-actin promoter + C
ytomegarovirus enhancer）を有するpCAGGSを選択し
た。まず最初にHDVリボザイムによって３’末端がプロ
セシングされ、NS3アプタマーが単独で転写されるよう
にデザインしたpCAG/G9 aptamer/HDVを構築した（図１
１）。
【００６２】G9IIおよびG9IIIをコードしたDNAを鋳型と
し、以下のプライマーを用いてPCR-I（94℃, 75 sec ->
45℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイクルを5回、94
℃,75 sec -> 55℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイ
クルを20回）を行った（図１１）。
し、以下のプライマーを用いてPCR-I（94℃, 75 sec ->
45℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイクルを5回、94
℃,75 sec -> 55℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイ
クルを20回）を行った（図１１）。
【００６３】 G9/Xho I-f プライマー 5' CCGCTCGAGGGGAGAATTCCGACCAGA 3'（配列番号29） G9/Kpn I-r プライマー 5' CCATGCCGGCCATCAGGTACCAAGGAGAGAGGAAAG 3'（配列番
号30） HDVリボザイムをコードしたプラスミドDNAを鋳型とし、
以下のプライマーを用いてPCR-II（条件はPCR-Iに同
じ）を行った（図１１）。
号30） HDVリボザイムをコードしたプラスミドDNAを鋳型とし、
以下のプライマーを用いてPCR-II（条件はPCR-Iに同
じ）を行った（図１１）。
【００６４】 HDV/Kpn I-f プライマー 5' CTTTCCTCTCTCCTTGGTACCTGATGGCCGGCATGG 3'（配列番
号31） HDV/Bgl II-r プライマー 5' GGAAGATCTGATCCCATTCGCCATTAC 3'（配列番号32） 得られたそれぞれのDNA断片を精製し、G9/Xho I-f プラ
イマーとHDV/Bgl II-rプライマーの存在下、PCR-IIIを
行った（図１１）。得られたPCR断片を精製し、Xho Iと
Bgl IIで処理した後、pCAGGSのCAGプロモーター下流に
位置するXho I、Bgl IIサイト（図１１）に導入した。
目的の配列を持ったクローンを獲得した。
号31） HDV/Bgl II-r プライマー 5' GGAAGATCTGATCCCATTCGCCATTAC 3'（配列番号32） 得られたそれぞれのDNA断片を精製し、G9/Xho I-f プラ
イマーとHDV/Bgl II-rプライマーの存在下、PCR-IIIを
行った（図１１）。得られたPCR断片を精製し、Xho Iと
Bgl IIで処理した後、pCAGGSのCAGプロモーター下流に
位置するXho I、Bgl IIサイト（図１１）に導入した。
目的の配列を持ったクローンを獲得した。
【００６５】次にRz-G9II-IIIb、Rz-G9III-IIIb、Rz-G9
II-IIId、Rz-G9III-IIIdをコードしたプラスミドDNAを
鋳型とし、以下のプライマーを用いてPCR（94℃, 75 se
c ->50℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイクルを25
回）を行った。
II-IIId、Rz-G9III-IIIdをコードしたプラスミドDNAを
鋳型とし、以下のプライマーを用いてPCR（94℃, 75 se
c ->50℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイクルを25
回）を行った。
【００６６】Rz-G9II-IIIbとRz-G9III-IIIbに対して G9/IIIb-XhoI-f 5' CCGCTCGAGGGTTGATCCCTGATGA 3'（配列番号33） G9/IIIb-KpnI-r 5' TCTGGTACCGTCCTTTCTTTCGTCC 3'（配列番号34） Rz-G9II-IIId、Rz-G9III-IIIdに対して G9/IIId-XhoI-f 5' CCGCTCGAGGGCGACCCCTGATGAG 3'（配列番号35） G9/IIId-KpnI-r 5' TCTGGTACCGAGTAGTGTTTCGTCC 3'（配列番号36） 得られたそれぞれのPCR断片を精製し、Xho IとBgl IIで
処理した後、pCAG/G9aptamer/HDVのXho IおよびBgl II
サイトにに導入した。目的の配列を持ったクローンを獲
得した。
処理した後、pCAG/G9aptamer/HDVのXho IおよびBgl II
サイトにに導入した。目的の配列を持ったクローンを獲
得した。
【００６７】培養細胞を用いたRz-G9 aptamerのIRESに
対する切断効果 HepG2細胞を12-ウェルプレートに1.5 X 105 cells/well
（10％血清を含んだ1mlのDMEM培地中）まいて、37℃で2
4時間培養した（50〜80%コンフルエントになるよう
に）。24時間培養後、GFP発現プラスミドpCMV/IRES/nuc
/GFP（1.0μg/well）とRz-G9 aptamer発現プラスミドpC
AG/Rz-G9II-IIIb/HDV、pCAG/Rz-G9III-IIIb/HDV、pCAG/
Rz-G9II-IIId/HDVおよびpCAG/Rz-G9III-IIId/HDV（1.5
μg/well）をトランスフェクション試薬（FuGENE）を用
いて、HepG2細胞にコトランスフェクションした。更に3
7℃で48〜72時間培養後、蛍光顕微鏡ならびに位相差顕
微鏡で細胞を観察し（核に集積するGFPの緑色の蛍
光）、Rz-G9 aptamerのIRESに対する切断効果を検討し
た。
対する切断効果 HepG2細胞を12-ウェルプレートに1.5 X 105 cells/well
（10％血清を含んだ1mlのDMEM培地中）まいて、37℃で2
4時間培養した（50〜80%コンフルエントになるよう
に）。24時間培養後、GFP発現プラスミドpCMV/IRES/nuc
/GFP（1.0μg/well）とRz-G9 aptamer発現プラスミドpC
AG/Rz-G9II-IIIb/HDV、pCAG/Rz-G9III-IIIb/HDV、pCAG/
Rz-G9II-IIId/HDVおよびpCAG/Rz-G9III-IIId/HDV（1.5
μg/well）をトランスフェクション試薬（FuGENE）を用
いて、HepG2細胞にコトランスフェクションした。更に3
7℃で48〜72時間培養後、蛍光顕微鏡ならびに位相差顕
微鏡で細胞を観察し（核に集積するGFPの緑色の蛍
光）、Rz-G9 aptamerのIRESに対する切断効果を検討し
た。
【００６８】その結果、pCAG/Rz-G9III-IIIb/HDVとpCAG
/Rz-G9III-IIId/HDVをコトランスフェクションした実験
群において、核の発光の減少が顕著に観察された（図８
b）。この実験によって、細胞内で転写されたRz-G9III-
IIIbとRz-G9III-IIIdがIRESに対して有意に作用（ハン
マーヘッド型リボザイムによる切断反応）し、HCV前駆
体蛋白質の翻訳を阻害する機能性RNAであることが示唆
された。
/Rz-G9III-IIId/HDVをコトランスフェクションした実験
群において、核の発光の減少が顕著に観察された（図８
b）。この実験によって、細胞内で転写されたRz-G9III-
IIIbとRz-G9III-IIIdがIRESに対して有意に作用（ハン
マーヘッド型リボザイムによる切断反応）し、HCV前駆
体蛋白質の翻訳を阻害する機能性RNAであることが示唆
された。
【００６９】
【発明の効果】本発明のキメラRNA分子は、HCVのIRESを
切断してその機能を喪失させるリボザイム活性と、HCV
のNS3プロテアーゼ活性を阻害するアプタマー活性とを
併せもつ新規の機能性核酸分子である。リボザイム活性
はHCV遺伝子がリボザイムに結合するのを阻止すること
によって蛋白への翻訳を妨げる働きをし、一方、アプタ
マー活性は、リボザイムで阻止できずにたまたま翻訳さ
れて生じたNS3プロテアーゼを直接阻害することによっ
てHCV蛋白への翻訳後プロセシングを阻止する働きをす
る。即ち本発明のキメラRNA分子は、時間差でHCVの増殖
を阻止する作用を有するため、C型肝炎ウイルスに感染
したが発症していないキャリヤに対する発症予防やC型
肝炎発症後の治療に使用可能であり治療成績の向上が期
待できる。
切断してその機能を喪失させるリボザイム活性と、HCV
のNS3プロテアーゼ活性を阻害するアプタマー活性とを
併せもつ新規の機能性核酸分子である。リボザイム活性
はHCV遺伝子がリボザイムに結合するのを阻止すること
によって蛋白への翻訳を妨げる働きをし、一方、アプタ
マー活性は、リボザイムで阻止できずにたまたま翻訳さ
れて生じたNS3プロテアーゼを直接阻害することによっ
てHCV蛋白への翻訳後プロセシングを阻止する働きをす
る。即ち本発明のキメラRNA分子は、時間差でHCVの増殖
を阻止する作用を有するため、C型肝炎ウイルスに感染
したが発症していないキャリヤに対する発症予防やC型
肝炎発症後の治療に使用可能であり治療成績の向上が期
待できる。
【００７０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Secretary of the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Techn ology,and MITSUBISHI GAS CHEMICAL CO.,INC. <120> RNA Molecules Targeting IRES and NS3 Protease of Hepatit is C Virus <130> 11900385 <140> <141> <160> 36 <170> Windows 95 (MS Word 2000) <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a loop-stem structure capable of existing in RNA aptamer <400> 1 gaggguagaa ugggacuacc uuu 23 <210> 2 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a loop-stem structure capable of existing in RNA aptamer <400> 2 gugcucuuag aaugggacua agacac 26 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a loop-stem structure capable of existing in RNA aptamer <400> 3 gacacgauug ggacguguc 19 <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a loop-stem structure capable of existing in RNA aptamer <400> 4 auuccgacca gaagcuucgg gauuu 25 <210> 5 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a stem structure capable of existing in RNA aptamer <400> 5 gggacccuuu ccuc 14 <210> 6 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a stem structure capable of existing in RNA aptamer <400> 6 auuccgacca gaa 13 <210> 7 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a stem structure capable of existing in RNA aptamer <400> 7 uaugggaccc uuuccuc 17 <210> 8 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a stem structure capable of existing in RNA aptamer <400> 8 auuccgacca gaaguac 17 <210> 9 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: an RNA aptamer <400> 9 gggagaauuc cgaccagaagc uucgggauuu gaggguagaa ugggacuacc uuuccucucu 60 ccu 63 <210> 10 <211> 64 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: an RNA aptamer <400> 10 gggagaauuc cgaccagaagu gcucuuagaa ugggacuaag acacgggacc cuuuccucuc 60 uccu 64 <210> 11 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: an RNA aptamer <400> 11 gggagaauuc cgaccagaagu acgacacgau ugggacgugu cuaugggacc cuuuccucucu 60 ccu 63 <210> 12 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a chimeric RNA molecule <400> 12 gguugauccc ugaugagucc gggagaauuc cgaccagaag cuucgggauu ugaggguaga 60 augggacuac cuuuccucuc uccuggacga aagaaaggac 100 <210> 13 <211> 101 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a chimeric RNA molecule <400> 13 gguugauccc ugaugagucc gggagaauuc cgaccagaag ugcucuuaga augggacuaa 60 gacacgggac ccuuuccucu cuccuggacg aaagaaagga c 101 <210> 14 <211> 101 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a chimeric RNA molecule <400> 14 gguugauccc ugaugagucc gggagaauuc cgaccagaag uacgacacga uugggacgug 60 ucuaugggac ccuuuccucu cuccuggacg aaagaaagga c 101 <210> 15 <211> 101 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a chimeric RNA molecule <400> 15 ggcgaccccu gaugaguccg gggagaauuc cgaccagaag cuucgggauu ugaggguaga 60 augggacuac cuuuccucuc uccuuggacg aaacacuacu c 101 <210> 16 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a chimeric RNA molecule <400> 16 ggcgaccccu gaugaguccg ggagaauucc gaccagaagu gcucuuagaa ugggacuaag 60 acacgggacc cuuuccucuc uccuggacga aacacuacuc 100 <210> 17 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: a chimeric RNA molecule <400> 17 ggcgaccccu gaugaguccg gggagaauuc cgaccagaag uacgacacga uugggacgug 60 ucuaugggac ccuuuccucu cuccuuggac gaaacacuac uc 102 <210> 18 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: part of a stem of ribozyme <400> 18 cugaugaguc c 11 <210> 19 <211> 59 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: IIIb f-primer <400> 19 agtaatacga ctcactatag gttgatccct gatgagtccg ggagaattcc gaccagaag 59 <210> 20 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: IIIb r-primer <400> 20 gtcctttctt tcgtccagga gagaggaaag g 31 <210> 21 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: IIId f-primer <400> 21 agtaatacga ctcactatag gcgacccctg atgagtccgg gagaattccg accagaag 58 <210> 22 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: IIId r-primer <400> 22 gagtagtgtt tcgtccagga gagaggaaag g 31 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: T7 f-primer <400> 23 agtaatacga ctcactata 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: 5'UTR r-primer <400> 24 gaggtttagg attcgtgct 19 <210> 25 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: T7-promoter primer <400> 25 taatacgact cactata 17 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: 5'-UTR primer <400> 26 gaggtttagg attcgtgct 19 <210> 27 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: mutagenic primer-r <400> 27 agcaccctat caggccccgg gagggggggt 30 <210> 28 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: mutagenic primer-f <400> 28 accccccctc ccggggcctg atagggtgct 30 <210> 29 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: G9/Xho I-r primer <400> 29 ccgctcgagg ggagaattcc gaccaga 27 <210> 30 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: G9/Kpn I-r primer <400> 30 ccatgccggc catcaggtac caaggagaga ggaaag 36 <210> 31 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: HDV/Kpn I-f primer <400> 31 ctttcctctc tccttggtac ctgatggccg gcatgg 36 <210> 32 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: HDV/Bgl II-r primer <400> 32 ggaagatctg atcccattcg ccattac 27 <210> 33 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: G9/IIIb-XhoI-f primer <400> 33 ccgctcgagg gttgatccct gatga 25 <210> 34 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: G9/IIIb-KpnI-r primer <400> 34 tctggtaccg tcctttcttt cgtcc 25 <210> 35 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: G9/IIId-XhoI-f primer <400> 35 ccgctcgagg gcgacccctg atgag 25 <210> 36 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: G9/IIId-KpnI-r primer <400> 36 tctggtaccg agtagtgttt cgtcc 25
【００７１】
【配列表フリーテキスト】 配列番号１− 人工配列の説明：RNAアプタマー中に存在可能な ループ-ステム構造。 配列番号２− 人工配列の説明：RNAアプタマー中に存在可能な ループ-ステム構造。 配列番号３− 人工配列の説明：RNAアプタマー中に存在可能な ループ-ステム構造。 配列番号４− 人工配列の説明：RNAアプタマー中に存在可能な ループ-ステム構造。
【００７２】 配列番号５− 人工配列の説明：RNAアプタマー中に存在可能な ステム構造。 配列番号６− 人工配列の説明：RNAアプタマー中に存在可能な ステム構造。 配列番号７− 人工配列の説明：RNAアプタマー中に存在可能な ステム構造。 配列番号８− 人工配列の説明：RNAアプタマー中に存在可能な ステム構造。
【００７３】 配列番号９− 人工配列の説明：RNAアプタマー。 配列番号10− 人工配列の説明：RNAアプタマー。 配列番号11− 人工配列の説明：RNAアプタマー。 配列番号12− 人工配列の説明：キメラRNA分子。
【００７４】 配列番号13− 人工配列の説明：キメラRNA分子。 配列番号14− 人工配列の説明：キメラRNA分子。 配列番号15− 人工配列の説明：キメラRNA分子。 配列番号16− 人工配列の説明：キメラRNA分子。
【００７５】 配列番号17− 人工配列の説明：キメラRNA分子。 配列番号18− 人工配列の説明：リボザイムのステムの一部。 配列番号19− 人工配列の説明：IIIb fプライマー。 配列番号20− 人工配列の説明：IIIb rプライマー。
【００７６】 配列番号21− 人工配列の説明：IIId fプライマー。 配列番号22− 人工配列の説明：IIId rプライマー。 配列番号23− 人工配列の説明：T7 f-プライマー。 配列番号24− 人工配列の説明：5’UTR r-プライマー。
【００７７】 配列番号25− 人工配列の説明：T7-プロモータープライマー。 配列番号26− 人工配列の説明：5’-UTRプライマー。 配列番号27− 人工配列の説明：変異誘発性プライマー-ｒ。 配列番号28− 人工配列の説明：変異誘発性プライマー-ｆ。
【００７８】 配列番号29− 人工配列の説明：G9/Xho I-rプライマー。 配列番号30− 人工配列の説明：G9/Kpn I-rプライマー。 配列番号31− 人工配列の説明：HDV/Kpn I-fプライマー。 配列番号32− 人工配列の説明：HDV/Bgl II-rプライマー。
【００７９】 配列番号33− 人工配列の説明：G9/IIIb-XhoI-fプライマー。 配列番号34− 人工配列の説明：G9/IIIb-KpnI-rプライマー。 配列番号35− 人工配列の説明：G9/IIId-XhoI-fプライマー。 配列番号36− 人工配列の説明：G9/IIId-KpnI-rプライマー。
【図1】HCV遺伝子の翻訳およびプロセシング。
【図2】HCV遺伝子の５’非翻訳領域に位置するIRESの二
次構造。IIIbおよびIIIdドメインの矢印はRz-G9 アプタ
マーによる切断部位を示す。 AUG（白抜きの部分）がコ
ア蛋白質の開始コドンに相当する。
次構造。IIIbおよびIIIdドメインの矢印はRz-G9 アプタ
マーによる切断部位を示す。 AUG（白抜きの部分）がコ
ア蛋白質の開始コドンに相当する。
【図3】図3A； in vitro selection 法に用いたRNAプー
ル（N 30）の配列。図3B; 獲得したNS3に対するRNAアプ
タマー（G9-I、G9-II、G9-III）の配列。四角の中の配
列は共通モチーフ配列（-GA(A/U)UGGGAC-）を示す。図3
C；G9-I、G9-IIおよびG9-IIIのMulfold プログラムに
よって解析された二次構造。太字は共通モチーフ配列を
示す。バー（-）は塩基対の形成を示し、黒丸（●）は
ワブル塩基対の形成を示す。
ル（N 30）の配列。図3B; 獲得したNS3に対するRNAアプ
タマー（G9-I、G9-II、G9-III）の配列。四角の中の配
列は共通モチーフ配列（-GA(A/U)UGGGAC-）を示す。図3
C；G9-I、G9-IIおよびG9-IIIのMulfold プログラムに
よって解析された二次構造。太字は共通モチーフ配列を
示す。バー（-）は塩基対の形成を示し、黒丸（●）は
ワブル塩基対の形成を示す。
【図4】G9-Iアプタマーの活性に重要な領域（灰色の部
分）。太字は共通モチーフ配列を示す。バー（-）は塩
基対の形成を示し、黒丸（●）はワブル塩基対の形成を
示す。
分）。太字は共通モチーフ配列を示す。バー（-）は塩
基対の形成を示し、黒丸（●）はワブル塩基対の形成を
示す。
【図5】図５A；IRESのIIIbドメインをターゲットとした
３種類のRz-G9 アプタマー（Rz-G9I-IIIb、Rz-G9II-III
b、Rz-G9III-IIIb）。図5 B；IRESのIIIdドメインをタ
ーゲットとした３種類のRz-G9 アプタマー（Rz-G9I-III
d、Rz-G9II-IIId、Rz-G9III-IIId）。 斜体の部分はハ
ンマーヘッド型リボザイムのターゲット認識（又は基質
結合）配列を示す。 白抜きの部分はハンマーヘッド型
リボザイムの活性領域を示す。 普通の字体の部分はア
プタマーの構造を示す。
３種類のRz-G9 アプタマー（Rz-G9I-IIIb、Rz-G9II-III
b、Rz-G9III-IIIb）。図5 B；IRESのIIIdドメインをタ
ーゲットとした３種類のRz-G9 アプタマー（Rz-G9I-III
d、Rz-G9II-IIId、Rz-G9III-IIId）。 斜体の部分はハ
ンマーヘッド型リボザイムのターゲット認識（又は基質
結合）配列を示す。 白抜きの部分はハンマーヘッド型
リボザイムの活性領域を示す。 普通の字体の部分はア
プタマーの構造を示す。
【図６】Rz-G9 アプタマーによる△NS3のプロテアーゼ
活性阻害効果。
活性阻害効果。
【図７】Rz-G9 アプタマーによるIRESの切断を示すアガ
ロースゲル電気泳動図。
ロースゲル電気泳動図。
【図８】蛍光顕微鏡ならびに位相差顕微鏡によるHepG2
細胞の様子。a；pCMV/IRES/nuc/GFP（上図；蛍光＋位相
差（左）、蛍光（右））およびpCMV/mIRES/nuc/GFP（下
図；蛍光＋位相差）。b；pCAG/Rz-G9III-IIIb/HDV（上
図；蛍光＋位相差）およびpCAG/Rz-G9III-IIId/HDV（下
図；蛍光＋位相差）。
細胞の様子。a；pCMV/IRES/nuc/GFP（上図；蛍光＋位相
差（左）、蛍光（右））およびpCMV/mIRES/nuc/GFP（下
図；蛍光＋位相差）。b；pCAG/Rz-G9III-IIIb/HDV（上
図；蛍光＋位相差）およびpCAG/Rz-G9III-IIId/HDV（下
図；蛍光＋位相差）。
【図９】pCMV/IRES/nuc/GFPおよびpCMV/mIRES/nuc/GFP
の構築；IRES またはIRES mutantのベクター pCMV/myc/
nuc/GFP への挿入。
の構築；IRES またはIRES mutantのベクター pCMV/myc/
nuc/GFP への挿入。
【図１０】IRES mutant の作製。
【図１１】Rz-NS3アプタマーをコードするDNAの構築。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 9/99 9/99 Ａ６１Ｋ 35/76 // Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 福田 宏太郎 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 西川 富美子 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 浦上 貞治 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三 菱瓦斯化学株式会社本社内 (72)発明者 舩路 浩平 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三 菱瓦斯化学株式会社本社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA07 BA80 CA11 EA02 HA20 4B050 CC04 DD20 LL01 4C084 AA13 NA14 ZA752 ZB332 ZC202 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA75 ZB33 ZC20 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA75 ZB33
Claims (19)
- 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３プ
ロテアーゼに対する阻害活性をもつＲＮＡアプタマー配
列と、ＨＣＶのＩＲＥＳ(internal ribosomal entry si
te)に対する切断活性をもつリボザイム配列とを含むキ
メラＲＮＡ分子。 - 【請求項２】 前記ＲＮＡアプタマー配列が、ループ構
造を形成する下記の塩基配列： 5’-GAXUGGGAC-3’ （配列中、ＸはＡ又はＵである。）と、下記の塩基配
列： 5’-GGGAGA-3’ 3’-UCCUCU-5’ を有するステム構造とを含むことを特徴とする、請求項
１に記載のキメラＲＮＡ分子。 - 【請求項３】 前記ループ構造を形成する塩基配列が、
それに隣接してステム構造を形成する塩基配列を含み、
これによってループ-ステム構造を形成していることを
特徴とする、請求項２に記載のキメラRNA分子。 - 【請求項４】 前記ループ-ステム構造が、 (i)5’-GAGGGUAGAAUGGGACUACCUUU-3’(配列番号１) (ii)5’-GUGCUCUUAGAAUGGGACUAAGACAC-3’（配列番号
２） (iii)5’-GACACGAUUGGGACGUGUC-3’（配列番号３） からなる群から選択される塩基配列を含むことを特徴と
する、請求項３に記載のキメラＲＮＡ分子。 - 【請求項５】 前記ＲＮＡアプタマー配列中の２つのス
テム構造の間に、下記の塩基配列： (i) 5’-CCUC-3’ (ii) 5’-AUUCCGACCAGAAGCUUCGGGAUUU-3’(配列番号
４) (iii) 5’-GGGACCCUUUCCUC-3’（配列番号５） (iv) 5’-AUUCCGACCAGAA-3’（配列番号６） (v) 5’-UAUGGGACCCUUUCCUC-3’（配列番号７） (vi) 5’-AUUCCGACCAGAAGUAC-3’（配列番号８） からなる群から選択されるリンカー又はループ-ステム
構造を形成する配列が介在して含むことを特徴とする、
請求項２〜４のいずれか一項に記載のキメラＲＮＡ分
子。 - 【請求項６】 前記ＲＮＡアプタマー配列が、下記の塩
基配列： (i)5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUUCGGGAUUUGAGGGUAGAAUG
GGACUACCUUUCCUCUCUCCU-3’（配列番号９） (ii)5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGUGCUCUUAGAAUGGGACUAAGA
CACGGGACCCUUUCCUCUCUCCU-3’（配列番号１０） (iii)5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGUACGACACGAUUGGGACGUGU
CUAUGGGACCCUUUCCUCUCUCCU-3’（配列番号１１） からなる群から選択される配列からなることを特徴とす
る、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラＲＮＡ
分子。 - 【請求項７】 前記リボザイム配列が、ハンマーヘッド
型であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラＲ
ＮＡ分子。 - 【請求項８】 前記リボザイム配列が、ステム構造を形
成する下記の塩基配列： 5’-CUGAUGAGUCC-3’ 3’-AAG CAGG-5’ を含むことを特徴とする、請求項７に記載のキメラＲＮ
Ａ分子。 - 【請求項９】 前記リボザイム配列のステム構造が、前
記ＲＮＡアプタマー配列中の下記のステム構造部分： 5’-GGGAGA-3’ 3’-UCCUCU-5’ と連結されていることを特徴とする、請求項８に記載の
キメラＲＮＡ分子。 - 【請求項１０】 前記リボザイム配列が、ＩＲＥＳの塩
基配列と相補的な基質結合配列を含むことを特徴とす
る、請求項１、７〜９のいずれか一項に記載のキメラＲ
ＮＡ分子。 - 【請求項１１】 前記基質結合配列が10〜30塩基、好ま
しくは15〜20塩基からなることを特徴とする、請求項１
０に記載のキメラＲＮＡ分子。 - 【請求項１２】 前記キメラＲＮＡ分子が、下記の塩基
配列： (i) Rz-G9I-IIIb 5’-GGUUGAUCCCUGAUGAGUCCGGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUUCGG
GAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUGGACGAAAGAAA
GGAC-3’（配列番号１２） (ii) Rz-G9II-IIIb 5’-GGUUGAUCCCUGAUGAGUCCGGGAGAAUUCCGACCAGAAGUGCUCU
UAGAAUGGGACUAAGACACGGGACCCUUUCCUCUCUCCUGGACGAAAGAA
AGGAC-3’（配列番号１３） (iii) Rz-G9III-IIIb 5’-GGUUGAUCCCUGAUGAGUCCGGGAGAAUUCCGACCAGAAGUACGAC
ACGAUUGGGACGUGUCUAUGGGACCCUUUCCUCUCUCCUGGACGAAAGAA
AGGAC-3’（配列番号１４） (iv) Rz-G9I-IIId 5’-GGCGACCCCUGAUGAGUCCGGGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUUCGG
GAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUUGGACGAAACAC
UACUC-3’（配列番号１５） (v) Rz-G9II-IIId 5’-GGCGACCCCUGAUGAGUCCGGGAGAAUUCCGACCAGAAGUGCUCUU
AGAAUGGGACUAAGACACGGGACCCUUUCCUCUCUCCUGGACGAAACACU
ACUC-3’（配列番号１６） (vi) Rz-G9III-IIId 5’-GGCGACCCCUGAUGAGUCCGGGGAGAAUUCCGACCAGAAGUACGAC
ACGAUUGGGACGUGUCUAUGGGACCCUUUCCUCUCUCCUUGGACGAAACA
CUACUC-3’（配列番号１７） からなる群から選択される配列からなることを特徴とす
る、請求項１に記載のキメラＲＮＡ分子。 - 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか一項に記載
のキメラＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写因子の制
御下に含む発現ベクター。 - 【請求項１４】 前記転写因子がプロモーターを含むこ
とを特徴とする、請求項１３に記載の発現ベクター。 - 【請求項１５】 前記転写因子がエンハンサーをさらに
含むことを特徴とする、請求項１４に記載の発現ベクタ
ー。 - 【請求項１６】 前記プロモーターが、ポリメラーゼII
Iプロモーター又はβ-アクチンプロモーターであること
を特徴とする、請求項１４に記載の発現ベクター。 - 【請求項１７】 前記エンハンサーがサイトメガロウイ
ルス由来のものであることを特徴とする、請求項１５に
記載の発現ベクター。 - 【請求項１８】 請求項1〜１２のいずれか一項に記載
のキメラＲＮＡ分子を含む、Ｃ型肝炎を予防又は治療す
るための医薬組成物。 - 【請求項１９】 請求項１３〜１７のいずれか一項に記
載の発現ベクターを含む、Ｃ型肝炎を予防又は治療する
ための医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000363124A JP2002165594A (ja) | 2000-11-29 | 2000-11-29 | Ｃ型肝炎ウイルスのｉｒｅｓ及びｎｓ３プロテアーゼを標的とするｒｎａ分子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000363124A JP2002165594A (ja) | 2000-11-29 | 2000-11-29 | Ｃ型肝炎ウイルスのｉｒｅｓ及びｎｓ３プロテアーゼを標的とするｒｎａ分子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002165594A true JP2002165594A (ja) | 2002-06-11 |
Family
ID=18834282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000363124A Pending JP2002165594A (ja) | 2000-11-29 | 2000-11-29 | Ｃ型肝炎ウイルスのｉｒｅｓ及びｎｓ３プロテアーゼを標的とするｒｎａ分子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002165594A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100490699B1 (ko) * | 2002-10-05 | 2005-05-19 | 제노프라 주식회사 | 씨형 간염 바이러스의 아이알이에스 발현 세포에서만 선택적으로 유전자 활성을 유도하는 트랜스-스플라이싱 리보자임 |
| WO2005097991A1 (es) * | 2004-03-25 | 2005-10-20 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Secuencia de rna, construcción de rna y dna, y composición farmacéutica inhibidoras de la proliferación del virus causante de la hepatitis tipo c (vhc), y sus aplicaciones |
| EP4219516A2 (en) | 2012-07-13 | 2023-08-02 | Wave Life Sciences Ltd. | Chiral control |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11137252A (ja) * | 1997-11-07 | 1999-05-25 | Agency Of Ind Science & Technol | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子 |
-
2000
- 2000-11-29 JP JP2000363124A patent/JP2002165594A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11137252A (ja) * | 1997-11-07 | 1999-05-25 | Agency Of Ind Science & Technol | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100490699B1 (ko) * | 2002-10-05 | 2005-05-19 | 제노프라 주식회사 | 씨형 간염 바이러스의 아이알이에스 발현 세포에서만 선택적으로 유전자 활성을 유도하는 트랜스-스플라이싱 리보자임 |
| WO2005097991A1 (es) * | 2004-03-25 | 2005-10-20 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Secuencia de rna, construcción de rna y dna, y composición farmacéutica inhibidoras de la proliferación del virus causante de la hepatitis tipo c (vhc), y sus aplicaciones |
| ES2270656A1 (es) * | 2004-03-25 | 2007-04-01 | Consejo Sup. Investig. Cientificas | Secuencia de rna, construccion de rna y dna, y composicion farmaceutica inhibidoras de la proliferacion del virus causante de la hepatitis tipo c (vhc), y sus aplicaciones. |
| EP4219516A2 (en) | 2012-07-13 | 2023-08-02 | Wave Life Sciences Ltd. | Chiral control |
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