JPH11137252A - Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子Info
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- JPH11137252A JPH11137252A JP9305344A JP30534497A JPH11137252A JP H11137252 A JPH11137252 A JP H11137252A JP 9305344 A JP9305344 A JP 9305344A JP 30534497 A JP30534497 A JP 30534497A JP H11137252 A JPH11137252 A JP H11137252A
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- hepatitis
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- protease
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｃ型肝炎ウイルスのNS3プロテアーゼを阻害
する活性の高い物質を提供する。 【解決手段】 Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼ
を阻害することができ、下記の塩基配列(I)を含むＲＮ
Ａ分子。 5'-GAXUGGGAC-3' (I) （配列番号１） （配列中、XはAまたはUである）上記のＲＮＡ分子を含
む医薬組成物および上記のＲＮＡ分子を用いてＣ型肝炎
ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害する方法。
する活性の高い物質を提供する。 【解決手段】 Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼ
を阻害することができ、下記の塩基配列(I)を含むＲＮ
Ａ分子。 5'-GAXUGGGAC-3' (I) （配列番号１） （配列中、XはAまたはUである）上記のＲＮＡ分子を含
む医薬組成物および上記のＲＮＡ分子を用いてＣ型肝炎
ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス
のＮＳ３プロテアーゼを阻害するＲＮＡ分子に関する。
のＮＳ３プロテアーゼを阻害するＲＮＡ分子に関する。
【０００２】
【従来の技術】C型肝炎ウイルス（HCV）は、非Ａ非B型
肝炎のメジャーな病原体（Houghton etal., 1991; Mats
uura et al., 1993; Cuthbert, 1994）で、その構造は
１本のおよそ9500ヌクレオチドのRNAゲノムを持ったウ
イルスである（Choo et al., 1989a; Choo et al., 199
1b）。約3000アミノ酸のpolyproteinが、このゲノムか
ら（図２Ａ）NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-
NS5B-COOHの順序で翻訳される（Matsuura et al., 199
3; Grakoui et al., 1993a; Pizzi et al., 1994;Hijik
ata et al., 1991a; Lin et al., 1994）。コアタンパ
ク質（C）、外被タンパク質（E1、E2）そしてそれ以外
のNSタンパク質がある。このpolyproteinは、宿主とウ
ィルスのプロテアーゼの協同作業によって、少くとも10
個のウィルスタンパク質に分断される。
肝炎のメジャーな病原体（Houghton etal., 1991; Mats
uura et al., 1993; Cuthbert, 1994）で、その構造は
１本のおよそ9500ヌクレオチドのRNAゲノムを持ったウ
イルスである（Choo et al., 1989a; Choo et al., 199
1b）。約3000アミノ酸のpolyproteinが、このゲノムか
ら（図２Ａ）NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-
NS5B-COOHの順序で翻訳される（Matsuura et al., 199
3; Grakoui et al., 1993a; Pizzi et al., 1994;Hijik
ata et al., 1991a; Lin et al., 1994）。コアタンパ
ク質（C）、外被タンパク質（E1、E2）そしてそれ以外
のNSタンパク質がある。このpolyproteinは、宿主とウ
ィルスのプロテアーゼの協同作業によって、少くとも10
個のウィルスタンパク質に分断される。
【０００３】今までの研究から、小包体の中に局在する
宿主のシグナルペプチダーゼが構造上の部位（C/E1、E1
/E2、E2/p7とp7/NS2）でpolyproteinを切断することが
わかっている（Cuthbert, 1994; Mizushima et al., 19
94a; Mizushima et al., 1994b）。一方、NS3タンパク
質は、NS部分の4箇所（3/4A、4A/4B、4B/5Aと5A/5B）で
切断を行う（Hijikata et al., 1993b; Grakoui et a
l., 1993b; Tomei et al., 1993; Manabe et al., 199
4）。NS2/3 サイトでの切断は、NS2部位を取り囲むHCV
にコードされたもう一つのメタロプロテアーゼによって
行われる（ Grakoui et al., 1993a; Hijikata et al.,
1993b）。
宿主のシグナルペプチダーゼが構造上の部位（C/E1、E1
/E2、E2/p7とp7/NS2）でpolyproteinを切断することが
わかっている（Cuthbert, 1994; Mizushima et al., 19
94a; Mizushima et al., 1994b）。一方、NS3タンパク
質は、NS部分の4箇所（3/4A、4A/4B、4B/5Aと5A/5B）で
切断を行う（Hijikata et al., 1993b; Grakoui et a
l., 1993b; Tomei et al., 1993; Manabe et al., 199
4）。NS2/3 サイトでの切断は、NS2部位を取り囲むHCV
にコードされたもう一つのメタロプロテアーゼによって
行われる（ Grakoui et al., 1993a; Hijikata et al.,
1993b）。
【０００４】実際には、NS3のNターミナルの180アミノ
酸残基が、プロテアーゼドメインで、トリプシン様セリ
ンプロテアーゼファミリーに共通のシーケンスを含む。
すなわち、NS3のヒスチジン1083、アスパラギン酸110
7、セリン1165は、セリンプロテアーゼファミリーの中
でキモトリプシン系に属しているようなNS3プロテアー
ゼの触媒作用の catalytic triadを構成する。ごく最近
明らかにされたこのプロテアーゼドメインの立体構造か
らも（Love et al, 1997, Kim et al 1997）、トリプシ
ン様セリンプロテアーゼに共通の構造が確認された。
酸残基が、プロテアーゼドメインで、トリプシン様セリ
ンプロテアーゼファミリーに共通のシーケンスを含む。
すなわち、NS3のヒスチジン1083、アスパラギン酸110
7、セリン1165は、セリンプロテアーゼファミリーの中
でキモトリプシン系に属しているようなNS3プロテアー
ゼの触媒作用の catalytic triadを構成する。ごく最近
明らかにされたこのプロテアーゼドメインの立体構造か
らも（Love et al, 1997, Kim et al 1997）、トリプシ
ン様セリンプロテアーゼに共通の構造が確認された。
【０００５】一方、NS3 のC末には全く別のヘリカーゼ
のドメインがある（Kim et al., 1995）。このタンパク
質の作用については全くわかっていない。またNS4Aペプ
チドは特にNS4B/5Aサイトでの切断効率を高めるNS3プロ
テアーゼのcofactorかeffectorであることが示された
が、どのようにして切断効率を上げるのかは、今のとこ
ろ不明である。このようにNS3領域にコードされている
セリンプロテアーゼ（以下、「NS3プロテアーゼ」と記
す) はHCVの増殖に必須の酵素でかつHCVの亜種の中で非
常に保存されており、NS3の抗体が、HCV診断の中で使わ
れている。これらの特性から、NS3プロテアーゼは、現
在、治療薬や診断薬の開発の中で一番の標的とされてい
るが、特にNS3プロテアーゼの阻害剤として今までに効
果の有る物は見つかっていない。
のドメインがある（Kim et al., 1995）。このタンパク
質の作用については全くわかっていない。またNS4Aペプ
チドは特にNS4B/5Aサイトでの切断効率を高めるNS3プロ
テアーゼのcofactorかeffectorであることが示された
が、どのようにして切断効率を上げるのかは、今のとこ
ろ不明である。このようにNS3領域にコードされている
セリンプロテアーゼ（以下、「NS3プロテアーゼ」と記
す) はHCVの増殖に必須の酵素でかつHCVの亜種の中で非
常に保存されており、NS3の抗体が、HCV診断の中で使わ
れている。これらの特性から、NS3プロテアーゼは、現
在、治療薬や診断薬の開発の中で一番の標的とされてい
るが、特にNS3プロテアーゼの阻害剤として今までに効
果の有る物は見つかっていない。
【０００６】我々は大腸菌から高活性のNS3プロテアー
ゼ領域（以下、「△NS3」または「△NS3タンパク質」と
記す、図２Ｂ）の簡単で高収率な精製系をすでに報告し
ている（Vishunuvardhanら。 1997）。発現プラスミドp
HisB△NS3は、N末に6ヶのHis-tagを付加した、192アミ
ノ酸（アミノ酸残基1027-1218）のNS3タンパク質をコー
ドし、6つのHis-tagを利用することで、ワンステップの
クロマトグラフィーで精製されるようになっている。精
製した△NS3は、今までに大腸菌で発現した他のNS3プロ
テアーゼと比較すると、最も高い活性を示した。このこ
とは HCV polyproteinの1027-1218がプロテアーゼ領域
であることを示している。更に我々は、生体内の状況を
反映するHCV polyproteinのアミノ酸シーケンス2203-25
06において、△NS3の能力をテストした結果、合成ペプ
チド基質5A/Bを用いた時と同じく、△NS3はNS5A/B結合
を切断することができた（Vishunuvardhanら。 199
7）。このように精製した△NS3プロテアーゼは小さい分
子サイズで、NS3プロテアーゼの完全な触媒作用の機能
を表わし、精製の平易さと高い収量を考えると、プロテ
アーゼ阻害剤の開発ならびに構造機能相関を解明するの
に理想的な標的タンパク質と考える。
ゼ領域（以下、「△NS3」または「△NS3タンパク質」と
記す、図２Ｂ）の簡単で高収率な精製系をすでに報告し
ている（Vishunuvardhanら。 1997）。発現プラスミドp
HisB△NS3は、N末に6ヶのHis-tagを付加した、192アミ
ノ酸（アミノ酸残基1027-1218）のNS3タンパク質をコー
ドし、6つのHis-tagを利用することで、ワンステップの
クロマトグラフィーで精製されるようになっている。精
製した△NS3は、今までに大腸菌で発現した他のNS3プロ
テアーゼと比較すると、最も高い活性を示した。このこ
とは HCV polyproteinの1027-1218がプロテアーゼ領域
であることを示している。更に我々は、生体内の状況を
反映するHCV polyproteinのアミノ酸シーケンス2203-25
06において、△NS3の能力をテストした結果、合成ペプ
チド基質5A/Bを用いた時と同じく、△NS3はNS5A/B結合
を切断することができた（Vishunuvardhanら。 199
7）。このように精製した△NS3プロテアーゼは小さい分
子サイズで、NS3プロテアーゼの完全な触媒作用の機能
を表わし、精製の平易さと高い収量を考えると、プロテ
アーゼ阻害剤の開発ならびに構造機能相関を解明するの
に理想的な標的タンパク質と考える。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、NS3プロテ
アーゼを阻害する活性の高い物質を提供することを目的
とする。
アーゼを阻害する活性の高い物質を提供することを目的
とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、インビト
ロ選択法を用いて、△NS3タンパク質に特異的に結合す
る高い親和性を持つRNAアプタマーを創製することに成
功し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明
は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害する
ことができ、下記の塩基配列(I)を含むＲＮＡ分子を提
供する。 5'-GAXUGGGAC-3' (I) （配列番号１） （配列中、XはAまたはUである）上記の塩基配列(I)はル
ープ構造を形成するとよい。また、ループ構造を形成す
る塩基配列(I)に隣接してステム構造を形成する塩基配
列が存在するとよい。
ロ選択法を用いて、△NS3タンパク質に特異的に結合す
る高い親和性を持つRNAアプタマーを創製することに成
功し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明
は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害する
ことができ、下記の塩基配列(I)を含むＲＮＡ分子を提
供する。 5'-GAXUGGGAC-3' (I) （配列番号１） （配列中、XはAまたはUである）上記の塩基配列(I)はル
ープ構造を形成するとよい。また、ループ構造を形成す
る塩基配列(I)に隣接してステム構造を形成する塩基配
列が存在するとよい。
【０００９】ここで、「ループ構造」とは、一本鎖の核
酸によるループ状の構造をいい、「ステム構造」とは、
塩基対により二本鎖を形成した核酸のステム状の構造を
いう。このようなループ構造を形成する塩基配列(I)に
隣接してステム構造を形成する塩基配列が存在するＲＮ
Ａ分子としては、下記の塩基配列(II)、塩基配列(III)
または塩基配列(IV)を含むものを挙げることができる。 5'-CUUCGGGAUUUGAGGGUA GAAUGGGAC UA-3' (II) (配列番号２） 5'-UGCUCUUA GAAUGGGAC UAAGACACGGGAC-3' (III) (配列番号３） 5'-UACGACAC GAUUGGGAC GUGUCUAUGGGAC-3' (IV) (配列番号４）
酸によるループ状の構造をいい、「ステム構造」とは、
塩基対により二本鎖を形成した核酸のステム状の構造を
いう。このようなループ構造を形成する塩基配列(I)に
隣接してステム構造を形成する塩基配列が存在するＲＮ
Ａ分子としては、下記の塩基配列(II)、塩基配列(III)
または塩基配列(IV)を含むものを挙げることができる。 5'-CUUCGGGAUUUGAGGGUA GAAUGGGAC UA-3' (II) (配列番号２） 5'-UGCUCUUA GAAUGGGAC UAAGACACGGGAC-3' (III) (配列番号３） 5'-UACGACAC GAUUGGGAC GUGUCUAUGGGAC-3' (IV) (配列番号４）
【００１０】上記の塩基配列(II)、塩基配列(III)また
は塩基配列(IV)を含むＲＮＡ分子は、さらに、下記の塩
基配列(V)を5'末端側に、下記の塩基配列(VI)の5'末端
から少なくとも１３個の連続する塩基の配列を3'末端側
に有しているとよい。 5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAG-3' (V) (配列番号５） 5'-CCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3' (VI) (配列番号６）
は塩基配列(IV)を含むＲＮＡ分子は、さらに、下記の塩
基配列(V)を5'末端側に、下記の塩基配列(VI)の5'末端
から少なくとも１３個の連続する塩基の配列を3'末端側
に有しているとよい。 5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAG-3' (V) (配列番号５） 5'-CCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3' (VI) (配列番号６）
【００１１】また、本発明は、上記のＲＮＡ分子を含む
医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、Ｃ型肝炎
ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができ、
Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス薬として用いるこ
とができる。この医薬組成物を用いて、Ｃ型肝炎を診断
したり、Ｃ型肝炎を予防および／または治療することが
できる。さらに、本発明は、上記のＲＮＡ分子を用いて
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害する方法
を提供する。かかる方法においては、Ｃ型肝炎ウイルス
に感染した細胞に上記のＲＮＡ分子を導入するとよい。
医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、Ｃ型肝炎
ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができ、
Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス薬として用いるこ
とができる。この医薬組成物を用いて、Ｃ型肝炎を診断
したり、Ｃ型肝炎を予防および／または治療することが
できる。さらに、本発明は、上記のＲＮＡ分子を用いて
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害する方法
を提供する。かかる方法においては、Ｃ型肝炎ウイルス
に感染した細胞に上記のＲＮＡ分子を導入するとよい。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
我々は、△NS3タンパク質に特異的に結合する高い親和
性を持つRNAアプタマーを創製するためにインビトロ選
択法（図１）を使った。図１に示すように、ランダムな
配列を持つRNA分子のプールから特定のタンパク質に結
合する分子（RNAアプタマー）を選択、増幅するサイク
ルを繰り返すことで、非常に特異的に結合するRNAアプ
タマーが得られた。最初はごく僅かしかないそのような
分子もPCR法で増幅され（条件により変異導入も可
能）、結合の弱い分子はサイクルを繰り返すことで淘汰
され、最終的に特異的に結合する分子のみが残るのであ
る。このようにして得られたRNAアプタマーとΔNS3 と
の結合活性および結合定数は、以下のようにして測定す
ることができる。
我々は、△NS3タンパク質に特異的に結合する高い親和
性を持つRNAアプタマーを創製するためにインビトロ選
択法（図１）を使った。図１に示すように、ランダムな
配列を持つRNA分子のプールから特定のタンパク質に結
合する分子（RNAアプタマー）を選択、増幅するサイク
ルを繰り返すことで、非常に特異的に結合するRNAアプ
タマーが得られた。最初はごく僅かしかないそのような
分子もPCR法で増幅され（条件により変異導入も可
能）、結合の弱い分子はサイクルを繰り返すことで淘汰
され、最終的に特異的に結合する分子のみが残るのであ
る。このようにして得られたRNAアプタマーとΔNS3 と
の結合活性および結合定数は、以下のようにして測定す
ることができる。
【００１３】各サイクルのRNAならびにクローン化後のR
NAを32P標識する。RNA／ΔNS3／tRNA＝1／1／10（0.1
μM／0.1 μM／1 μM）の条件で混ぜた後、ニトロセル
ロース膜でろ過する。結合活性はΔNS3と混ぜた RNA量
に対して、膜上に残った複合体を形成した RNA量の割合
で表わす。結合定数は32P標識した適当な濃度の（例え
ば、0.3μM）RNAの存在下、ΔNS3の濃度を適当な範囲で
（例えば、0.15μM−1.5μM）変化させて、結合活性を
測定し、最大結合活性の１／２の活性を示すΔNS3の濃
度で表す。
NAを32P標識する。RNA／ΔNS3／tRNA＝1／1／10（0.1
μM／0.1 μM／1 μM）の条件で混ぜた後、ニトロセル
ロース膜でろ過する。結合活性はΔNS3と混ぜた RNA量
に対して、膜上に残った複合体を形成した RNA量の割合
で表わす。結合定数は32P標識した適当な濃度の（例え
ば、0.3μM）RNAの存在下、ΔNS3の濃度を適当な範囲で
（例えば、0.15μM−1.5μM）変化させて、結合活性を
測定し、最大結合活性の１／２の活性を示すΔNS3の濃
度で表す。
【００１４】また、RNAアプタマーのΔNS3 プロテアー
ゼに対する阻害活性は、基本的に垣内らにより報告され
た方法に従って測定することができる。すなわち、ΔNS
3 プロテアーゼを、RNAアプタマー又はtRNAの存在下に
プレインキュベートし、これを基質（例えば、化学合成
したNS5A/5B junctionペプチド）に添加して反応を行
い、反応混合液中の基質分解産物の生成量を測定する。
ゼに対する阻害活性は、基本的に垣内らにより報告され
た方法に従って測定することができる。すなわち、ΔNS
3 プロテアーゼを、RNAアプタマー又はtRNAの存在下に
プレインキュベートし、これを基質（例えば、化学合成
したNS5A/5B junctionペプチド）に添加して反応を行
い、反応混合液中の基質分解産物の生成量を測定する。
【００１５】HCVを含む細胞に本発明のRNAを導入するこ
とにより、該細胞中のHCVのNS3プロテアーゼを阻害する
ことができる。例えば、本発明のRNAをリポソームに封
入し、これを生体に投与して、HCVを含む細胞内に取り
込ませることにより、HCVのNS3プロテアーゼを阻害する
ことができる。このような方法については、"Lipidicve
ctor systems for gene transfer"(1997) R. J. Lee a
nd L. Huang Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst 14,
173-206.に記載されている。また、本発明のRNAをコー
ドするDNAをウイルスなどのベクターに組み込んで、HCV
を含む細胞内に導入し、該細胞内でこのベクターを発現
させ、本発明のRNAを産生させることにより、HCVのNS3
プロテアーゼを阻害することもできる。このような方法
については、"Viral vectors in gene therapy"(1997)
A. E. Smith Annu. Rev. Microbiol 49, 807-838. に
記載されている。これらの方法の詳細およびこれらの方
法に用いられる材料は、遺伝子治療の分野で知られてお
り、それらを本発明においても用いることができる。
とにより、該細胞中のHCVのNS3プロテアーゼを阻害する
ことができる。例えば、本発明のRNAをリポソームに封
入し、これを生体に投与して、HCVを含む細胞内に取り
込ませることにより、HCVのNS3プロテアーゼを阻害する
ことができる。このような方法については、"Lipidicve
ctor systems for gene transfer"(1997) R. J. Lee a
nd L. Huang Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst 14,
173-206.に記載されている。また、本発明のRNAをコー
ドするDNAをウイルスなどのベクターに組み込んで、HCV
を含む細胞内に導入し、該細胞内でこのベクターを発現
させ、本発明のRNAを産生させることにより、HCVのNS3
プロテアーゼを阻害することもできる。このような方法
については、"Viral vectors in gene therapy"(1997)
A. E. Smith Annu. Rev. Microbiol 49, 807-838. に
記載されている。これらの方法の詳細およびこれらの方
法に用いられる材料は、遺伝子治療の分野で知られてお
り、それらを本発明においても用いることができる。
【００１６】HCVのNS3プロテアーゼを阻害することによ
り、Ｃ型肝炎を予防および／または治療することができ
る。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性による
が、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態
の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、
投与方法、頻度で行えばよい。また、本発明のRNAを用
いて、Ｃ型肝炎を診断することができる。本発明のRNA
を抗体の代わりに利用することができる。本発明のRNA
を蛍光などで標識しておき、HCVに感染している細胞の
抽出液又は細胞をつぶした物と混ぜ、ニトロセルロース
膜で濾過する。HCVが細胞内に存在すれば、膜上にトラ
ップされ、検出できる。
り、Ｃ型肝炎を予防および／または治療することができ
る。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性による
が、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態
の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、
投与方法、頻度で行えばよい。また、本発明のRNAを用
いて、Ｃ型肝炎を診断することができる。本発明のRNA
を抗体の代わりに利用することができる。本発明のRNA
を蛍光などで標識しておき、HCVに感染している細胞の
抽出液又は細胞をつぶした物と混ぜ、ニトロセルロース
膜で濾過する。HCVが細胞内に存在すれば、膜上にトラ
ップされ、検出できる。
【００１７】
【実施例】以下、実施例によって本発明をより具体的に
説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定さ
れることはない。 〔実施例１〕RNAアプタマーの創製 1-1 タンパク質、核酸 ここで使用するΔNS3タンパク質は、すでに我々が報告
した方法により大腸菌HB101より精製した（Vishunuvard
hanら、1997）。インビトロ選択法に用いた N30のRNAプ
ールは、5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAG-[N30]-CCUUUCCUCUCU
CCUUCCUCUUCU-3'(図３Aの配列、配列番号７）を持つ。
配列番号７に示したRNA配列に対応する鋳型DNAをDNA自
動合成機で合成した後、当量のプライマー２ 5'AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG3'（配列番号８）を加えPC
Rにより2本鎖DNAとした。 更にプライマー１ 5'AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCAGAAG3'（配列
番号９）を加え、PCRにより2本鎖を増幅する。これを鋳
型とし試験管内転写反応により、N30 RNAプールを作っ
た。
説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定さ
れることはない。 〔実施例１〕RNAアプタマーの創製 1-1 タンパク質、核酸 ここで使用するΔNS3タンパク質は、すでに我々が報告
した方法により大腸菌HB101より精製した（Vishunuvard
hanら、1997）。インビトロ選択法に用いた N30のRNAプ
ールは、5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAG-[N30]-CCUUUCCUCUCU
CCUUCCUCUUCU-3'(図３Aの配列、配列番号７）を持つ。
配列番号７に示したRNA配列に対応する鋳型DNAをDNA自
動合成機で合成した後、当量のプライマー２ 5'AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG3'（配列番号８）を加えPC
Rにより2本鎖DNAとした。 更にプライマー１ 5'AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCAGAAG3'（配列
番号９）を加え、PCRにより2本鎖を増幅する。これを鋳
型とし試験管内転写反応により、N30 RNAプールを作っ
た。
【００１８】1-2 インビトロ選択法 約1015分子の配列を持つ N30 RNAプール（1 n mol）と
ΔNS3タンパク質（0.25n mol）を 50mM Tris-HCl (pH7.
7), 30mM NaCl, 5mM CaCl2, 10mM DTT（結合バッファ
ー）中、室温で１時間保温した。この混液をポップトッ
プホルダーに固定したニトロセルロース膜でろ過し、上
記バッファーで洗浄した。フィルター上に残ったΔNS3
に結合したRNAは 200μlの溶離液（0.4M酢酸ソーダ、5m
M EDTA、 7M尿素 (PH5.5)）につけ90℃、5分間加温し、
膜及びΔNS3から遊離させ、エタノール沈殿により回収
した。回収したRNAからAMV逆転写酵素により cDNAを合
成し、さらに PCRにより増幅した。これを鋳型に試験管
内転写反応により再度 RNAプールとし、次のインビトロ
選択のサイクルに用いた。
ΔNS3タンパク質（0.25n mol）を 50mM Tris-HCl (pH7.
7), 30mM NaCl, 5mM CaCl2, 10mM DTT（結合バッファ
ー）中、室温で１時間保温した。この混液をポップトッ
プホルダーに固定したニトロセルロース膜でろ過し、上
記バッファーで洗浄した。フィルター上に残ったΔNS3
に結合したRNAは 200μlの溶離液（0.4M酢酸ソーダ、5m
M EDTA、 7M尿素 (PH5.5)）につけ90℃、5分間加温し、
膜及びΔNS3から遊離させ、エタノール沈殿により回収
した。回収したRNAからAMV逆転写酵素により cDNAを合
成し、さらに PCRにより増幅した。これを鋳型に試験管
内転写反応により再度 RNAプールとし、次のインビトロ
選択のサイクルに用いた。
【００１９】このサイクルを 11回繰り返した。各RNAプ
ールの結合活性を測定した後、サイクル9後の cDNAをTA
クローニングベクターに挿入し、クローン化した。45個
のクローンを選び、各クローンからアルカリ法でプラス
ミドを回収し、DNAシーケンスを決めた。各選択サイク
ルで使用したRNAとタンパク質の量比ならびにプールの
結合活性を表１に示す。
ールの結合活性を測定した後、サイクル9後の cDNAをTA
クローニングベクターに挿入し、クローン化した。45個
のクローンを選び、各クローンからアルカリ法でプラス
ミドを回収し、DNAシーケンスを決めた。各選択サイク
ルで使用したRNAとタンパク質の量比ならびにプールの
結合活性を表１に示す。
【００２０】
【表１】 45個のクローンをシーケンスした結果、主に3つのシー
ケンスファミリー、G9-I（21個）、G9-II（5個）、G9-I
II（4個）があった（図３B）。それらはいずれも、5'-G
AXUGGGAC-3'（X=A or U）（配列番号１）のコンセンサ
ス配列を持ち、しかも二次構造をみると、コンセンサス
配列はループ構造を形成していることがわかった（図４
に太字で示した配列）。また、残りのN30由来の配列は
それ自身であるいはプライマー部分（図４にイタリック
体で示した配列）とともにステム構造を形成し、全体に
ステムに富んだ二次構造をとることが推測された。図４
の矢印は、ΔNS3との結合活性を有するアプタマーの3'
末端の境界を指している。また、図４の−は塩基対の形
成を示し、●はワブル塩基対の形成を示す。このコンセ
ンサス配列を持つアプタマーはシーケンスを調べた全ク
ローンのうち、80%を占めていた。
ケンスファミリー、G9-I（21個）、G9-II（5個）、G9-I
II（4個）があった（図３B）。それらはいずれも、5'-G
AXUGGGAC-3'（X=A or U）（配列番号１）のコンセンサ
ス配列を持ち、しかも二次構造をみると、コンセンサス
配列はループ構造を形成していることがわかった（図４
に太字で示した配列）。また、残りのN30由来の配列は
それ自身であるいはプライマー部分（図４にイタリック
体で示した配列）とともにステム構造を形成し、全体に
ステムに富んだ二次構造をとることが推測された。図４
の矢印は、ΔNS3との結合活性を有するアプタマーの3'
末端の境界を指している。また、図４の−は塩基対の形
成を示し、●はワブル塩基対の形成を示す。このコンセ
ンサス配列を持つアプタマーはシーケンスを調べた全ク
ローンのうち、80%を占めていた。
【００２１】〔実施例２〕NS3プロテアーゼに対するアプタマーの性質 2-1 アプタマーの結合活性ならびに結合定数の測定 各サイクルのRNAならびにクローン化後のRNAを32P標識
した。RNA／ΔNS3／tRNA＝1／1／10（0.1 μM／0.1 μM
／1 μM）の条件で混ぜ、以下はインビトロ選択法での
操作と同様に、ニトロセルロース膜でろ過した。結合活
性はΔNS3と混ぜた RNA量に対して、膜上に残った複合
体を形成した RNA量の割合で表わす。結合定数は32P標
識したRNA（0.3μM）の存在下、ΔNS3を0.15μM−1.5μ
Mまで変化させ、結合活性を測定した。G9-I、G9-II、G9
-IIIの３種類のアプタマーの△NS3タンパク質に対する
結合活性は20%前後であった（表２）。
した。RNA／ΔNS3／tRNA＝1／1／10（0.1 μM／0.1 μM
／1 μM）の条件で混ぜ、以下はインビトロ選択法での
操作と同様に、ニトロセルロース膜でろ過した。結合活
性はΔNS3と混ぜた RNA量に対して、膜上に残った複合
体を形成した RNA量の割合で表わす。結合定数は32P標
識したRNA（0.3μM）の存在下、ΔNS3を0.15μM−1.5μ
Mまで変化させ、結合活性を測定した。G9-I、G9-II、G9
-IIIの３種類のアプタマーの△NS3タンパク質に対する
結合活性は20%前後であった（表２）。
【００２２】
【表２】 表２中、ΔNS3-G9*とは、インビトロ選択におけるサイ
クル9後のRNAプールある。また結合定数はいずれも600
nMであった（図５）。これらの結果はコンセンサス配列
が△NS3タンパク質との結合に強く関与していることを
示している。
クル9後のRNAプールある。また結合定数はいずれも600
nMであった（図５）。これらの結果はコンセンサス配列
が△NS3タンパク質との結合に強く関与していることを
示している。
【００２３】2-2 RNAアプタマーの構造解析 RNAアプタマーの3'側の必要領域を明らかにするため、
5'末端を標識したRNAアプタマーを 50mM 炭酸ナトリウ
ム（PH 9.2）バッファー中、2.5μgのキャリアーtRNA存
在下、92℃、4.5分加温し、アルカリによる部分分解反
応を行った。この反応液をΔNS3と混ぜ、ニトロセルロ
ース膜でろ過し、膜上の複合体から結合したRNAを回収
し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。
マーカーとして、ΔNS3を加えないRNAのアルカリ部分分
解物ならびにRNase T1、U2、Aによる限定分解物を同時
に泳動した。なお、ΔNS3を添加しない場合は、上記の
方法でアルカリ部分分解後、そのまま変性ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で分離した。3'必要領域の分析結
果、いずれも3'末端から11Ntsまで取り除いても△NS3タ
ンパク質に対する結合活性は失われないことがわかった
（図６）。図６において、−は△NS3タンパク質の不存
在を、＋は△NS3タンパク質の存在を示し、Ａ、Ｔ１お
よびＵ２は、それぞれ、RNase T1、U2、Aを示す。
5'末端を標識したRNAアプタマーを 50mM 炭酸ナトリウ
ム（PH 9.2）バッファー中、2.5μgのキャリアーtRNA存
在下、92℃、4.5分加温し、アルカリによる部分分解反
応を行った。この反応液をΔNS3と混ぜ、ニトロセルロ
ース膜でろ過し、膜上の複合体から結合したRNAを回収
し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。
マーカーとして、ΔNS3を加えないRNAのアルカリ部分分
解物ならびにRNase T1、U2、Aによる限定分解物を同時
に泳動した。なお、ΔNS3を添加しない場合は、上記の
方法でアルカリ部分分解後、そのまま変性ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で分離した。3'必要領域の分析結
果、いずれも3'末端から11Ntsまで取り除いても△NS3タ
ンパク質に対する結合活性は失われないことがわかった
（図６）。図６において、−は△NS3タンパク質の不存
在を、＋は△NS3タンパク質の存在を示し、Ａ、Ｔ１お
よびＵ２は、それぞれ、RNase T1、U2、Aを示す。
【００２４】2-3 ΔNS3プロテアーゼ阻害活性の測定 基本的に垣内らにより報告された方法に従った（Kakiuc
hiら、1995）。ダンシル標識した NS5A／5B境界領域の
20アミノ酸 Dns - GEAGD DIVPC／SMSYT WTGAL（／がΔN
S3による切断部位）（配列番号１０）（86μM）にプレ
インキュベートしたΔNS3（0.75μM）とRNAアプタマー
（3.6μM）の混液を加え、25℃、1時間反応させた。反
応混液をHPLCで分離し、蛍光（excitation: 310 nm、51
0 nm: emission:）測定により、合成基質から産物の生
成量を測定した。その結果いずれのアプタマーも90%以
上の阻害が観察された（図７）。
hiら、1995）。ダンシル標識した NS5A／5B境界領域の
20アミノ酸 Dns - GEAGD DIVPC／SMSYT WTGAL（／がΔN
S3による切断部位）（配列番号１０）（86μM）にプレ
インキュベートしたΔNS3（0.75μM）とRNAアプタマー
（3.6μM）の混液を加え、25℃、1時間反応させた。反
応混液をHPLCで分離し、蛍光（excitation: 310 nm、51
0 nm: emission:）測定により、合成基質から産物の生
成量を測定した。その結果いずれのアプタマーも90%以
上の阻害が観察された（図７）。
【００２５】NS3タンパク質がHCVの増殖に不可欠なこと
から、セリンプロテアーゼの一般的阻害剤がいくつか
(例えば、トシルリシルクロロメチルケトン(TLCK)など)
、プロテアーゼ活性の阻害剤としてテストされた (Lin
ら、1992) 。その結果、これらの阻害剤は、mM濃度で
必要であったが、我々のアプタマーは、μM以下の濃度
で90%以上の阻害が観察されることから、活性の高い阻
害剤であることがわかった。
から、セリンプロテアーゼの一般的阻害剤がいくつか
(例えば、トシルリシルクロロメチルケトン(TLCK)など)
、プロテアーゼ活性の阻害剤としてテストされた (Lin
ら、1992) 。その結果、これらの阻害剤は、mM濃度で
必要であったが、我々のアプタマーは、μM以下の濃度
で90%以上の阻害が観察されることから、活性の高い阻
害剤であることがわかった。
【００２６】引用文献 Choo, Q.-L., Kuo, G., Weiner, A.J., Overby, L.R.,
Bradley, D.W. and Houghton, M. (1989a) Science 24
4, 359-362 Choo, Q.-L., Richman, K., Han, J.H., berger, K., L
ee, C., Dong, C., Gallegos, C., Coit, D., Medina-S
elby, A., Barr, P., Weiner, A.J., Bradley, D.W., K
uo, G. and Houghton, M. (1991b) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88, 2451-2455 Cuthbert, J.A. (1994) Clin. Microbiol. Rev. 7, 505
-532 Grakoui, A., Wychowski, C., Lin, C., Feinstone, S.
M. and Rice, C.M. (1993a) J. Virol. 67, 1385-1395 Grakoui, A., McCourt, D.W., Wychowski, C., Feinsto
ne, S.M. and Rice, C.M. (1993b) J. Virol. 67, 2832
-2843 Hijikata, M., Kato, N., Ootsuyama, Y., Nakagawa,
M. and Shimotohno, K. (1991a) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 88, 5547-5551 Hijikata, M., Mizushima, T., Akagi, S., Mori, S.,
Kakiuchi, N., Kto, N.,Tanaka, T., Kimura, K. and S
himotohno, K. (1993b) J. Virol. 67, 4665-4675 Houghton, M., Weiner, A., Han, J., Kuo, G. and Cho
o, Q.-L. (1991) Hepatology, 14, 381-388 Kakiuchi, N., Higikata, M., Komoda, Y., Tanji, Y.,
Hirowatari, Y. and Shimotohno, K. (1995) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 210, 1059-1065 Kim, D.W., Gwack, Y., Han, J.H. and Choe, J. (199
5) Biochem. Biophys. Res. Commun. 215, 160-166 Kim, J.L., Morgenstern, K.A., Lin, C., Fox, T., Dw
yer, M.D., Landro, J.A., Chambers, S.P., markland,
W., Lepre, C.A., O'Malley, E.T., Harbeson,S.L., R
ice, C.M., Murcko, M.A., Caron, P.R. and Thomson,
J.A. (1996) Cell 87, 343-355. Lin, C., Lindenbach, B.D., Pragai, B., McCourt, D.
W. and Rice, C.M. (1994) J. Virol. 68, 5063-5073 Love, R.A., Parge, H.E., Wickersham, J.A., Hostoms
ky, Z., Habuka, N., Moomaw, E.W., Adachi, T. and H
ostomska, Z. (1996) Cell 87, 331-34. Manabe, S., Fuke, I., Tanishita, O., Kaji, C., Gom
i, Y., Yoshida, S., Mori, C., Takamizawa, A., Yash
ida, I. and Okayama, H. (1994) Virology. 198, 636-
644 Matsuura, Y. and Miyamuar, T. (1993) Sem. Virol.
4, 297-304 Miller, R.H. and Purcell, R.H. (1990) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87, 2057-2061 Mizushima, H., Hijikata, M., Tanji, Y., Kimura, K.
and Shimotohno, K. (1994a) J. Virol. 68, 2731-273
4 Mizushima, H., Hijikata, M., Asabe, S.-I., Hirota,
M., Kimura, K. and Shimotohno, K. (1994b) J. Viro
l. 68, 6215-6222 Pizzi, E., Tramontano, A., Tomei, L., Lamonica,
N., Failla, C., Sardana,M., Wood, T. and DeFrances
co, R. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,888-89
2 Tomei, L., Failla, C., Santolini, E., DeFrancesco,
R. and LaMonica, N. (1993) J. Virol. 67, 4017-402
6 Vishinuvardhan, D., Kakiuchi, N., Urvil, P. T., Sh
imotohno, K., Kumar, P. K. R. and Nishikawa, S. (1
997) FEBS Lett. 402, 209-212. Lin, C. and Rice, C.M. (1995) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 92, 7622-7626
Bradley, D.W. and Houghton, M. (1989a) Science 24
4, 359-362 Choo, Q.-L., Richman, K., Han, J.H., berger, K., L
ee, C., Dong, C., Gallegos, C., Coit, D., Medina-S
elby, A., Barr, P., Weiner, A.J., Bradley, D.W., K
uo, G. and Houghton, M. (1991b) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88, 2451-2455 Cuthbert, J.A. (1994) Clin. Microbiol. Rev. 7, 505
-532 Grakoui, A., Wychowski, C., Lin, C., Feinstone, S.
M. and Rice, C.M. (1993a) J. Virol. 67, 1385-1395 Grakoui, A., McCourt, D.W., Wychowski, C., Feinsto
ne, S.M. and Rice, C.M. (1993b) J. Virol. 67, 2832
-2843 Hijikata, M., Kato, N., Ootsuyama, Y., Nakagawa,
M. and Shimotohno, K. (1991a) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 88, 5547-5551 Hijikata, M., Mizushima, T., Akagi, S., Mori, S.,
Kakiuchi, N., Kto, N.,Tanaka, T., Kimura, K. and S
himotohno, K. (1993b) J. Virol. 67, 4665-4675 Houghton, M., Weiner, A., Han, J., Kuo, G. and Cho
o, Q.-L. (1991) Hepatology, 14, 381-388 Kakiuchi, N., Higikata, M., Komoda, Y., Tanji, Y.,
Hirowatari, Y. and Shimotohno, K. (1995) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 210, 1059-1065 Kim, D.W., Gwack, Y., Han, J.H. and Choe, J. (199
5) Biochem. Biophys. Res. Commun. 215, 160-166 Kim, J.L., Morgenstern, K.A., Lin, C., Fox, T., Dw
yer, M.D., Landro, J.A., Chambers, S.P., markland,
W., Lepre, C.A., O'Malley, E.T., Harbeson,S.L., R
ice, C.M., Murcko, M.A., Caron, P.R. and Thomson,
J.A. (1996) Cell 87, 343-355. Lin, C., Lindenbach, B.D., Pragai, B., McCourt, D.
W. and Rice, C.M. (1994) J. Virol. 68, 5063-5073 Love, R.A., Parge, H.E., Wickersham, J.A., Hostoms
ky, Z., Habuka, N., Moomaw, E.W., Adachi, T. and H
ostomska, Z. (1996) Cell 87, 331-34. Manabe, S., Fuke, I., Tanishita, O., Kaji, C., Gom
i, Y., Yoshida, S., Mori, C., Takamizawa, A., Yash
ida, I. and Okayama, H. (1994) Virology. 198, 636-
644 Matsuura, Y. and Miyamuar, T. (1993) Sem. Virol.
4, 297-304 Miller, R.H. and Purcell, R.H. (1990) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87, 2057-2061 Mizushima, H., Hijikata, M., Tanji, Y., Kimura, K.
and Shimotohno, K. (1994a) J. Virol. 68, 2731-273
4 Mizushima, H., Hijikata, M., Asabe, S.-I., Hirota,
M., Kimura, K. and Shimotohno, K. (1994b) J. Viro
l. 68, 6215-6222 Pizzi, E., Tramontano, A., Tomei, L., Lamonica,
N., Failla, C., Sardana,M., Wood, T. and DeFrances
co, R. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,888-89
2 Tomei, L., Failla, C., Santolini, E., DeFrancesco,
R. and LaMonica, N. (1993) J. Virol. 67, 4017-402
6 Vishinuvardhan, D., Kakiuchi, N., Urvil, P. T., Sh
imotohno, K., Kumar, P. K. R. and Nishikawa, S. (1
997) FEBS Lett. 402, 209-212. Lin, C. and Rice, C.M. (1995) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 92, 7622-7626
【００２７】
【発明の効果】本発明のRNAアプタマーにより、Ｃ型肝
炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができ
る。従って、本発明のRNAアプタマーを医薬に利用する
ことができる。
炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができ
る。従って、本発明のRNAアプタマーを医薬に利用する
ことができる。
【００２８】
配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＲＮＡ 配列： ＧＡＷＵＧＧＧＡＣ
９
９
【００２９】配列番号：２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成RNA 配列： CUUCGGGAUU UGAGGGUAGA AUGGGACUA 29
【００３０】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成RNA 配列： UGCUCUUAGA AUGGGACUAA GACACGGGAC 30
【００３１】配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成RNA 配列： ＵＡＣＧＡＣＡＣＧＡ ＵＵＧＧＧＡＣＧＵＧ ＵＣＵＡＵＧＧＧＡＣ
３０
３０
【００３２】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成RNA 配列： GGGAGAAUUC CGACCAGAAG 20
【００３３】配列番号：６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成RNA 配列： CCUUUCCUCU CUCCUUCCUC UUCU 24
【００３４】配列番号：７ 配列の長さ：７４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成RNA 配列の特徴 特徴を表す記号：unsure 存在一：20..50 配列： GGGAGAAUUC CGACCAGAAG NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN CCUUUCCUCU 60 CUCCUUCCUC UUCU 74
【００３５】配列番号：８ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGAAGAGGAA GGAGAGAGGA AAGG 24
【００３６】配列番号：９ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGTAATACGA CTCACTATAG GGAGAATTCC GACCAGAAG 39
【００３７】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Gly Glu Ala Gly Asp Asp Ile Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp 1 5 10 15 Thr Gly Ala Leu 20
【図１】RNAアプタマー創製の概念図が示されている。
【図２】HCV polyproteinの構造の概念図（Ａ）（矢印
は NS3プロテアーゼによる切断箇所を示す。）およびNS
3 プロテアーゼドメイン（ΔNS3）の模式図（Ｂ）が示
されている。
は NS3プロテアーゼによる切断箇所を示す。）およびNS
3 プロテアーゼドメイン（ΔNS3）の模式図（Ｂ）が示
されている。
【図３】N30のRNAプールのシーケンス（Ａ）および単離
したアプタマーのシーケンス（Ｂ）が示されている。
したアプタマーのシーケンス（Ｂ）が示されている。
【図４】アプタマーの二次構造が示されている。太字は
コンセンサス配列、イタリックはプライマー結合配列、
矢印はΔNS3との結合活性を有するRNAアプタマーの３’
末端の境界を示す。
コンセンサス配列、イタリックはプライマー結合配列、
矢印はΔNS3との結合活性を有するRNAアプタマーの３’
末端の境界を示す。
【図５】結合定数を求める図である。
【図６】アプタマーの３’境界領域の分析結果を示す。
【図７】アプタマーによるΔNS3プロテアーゼの阻害活
性を示す。
性を示す。
Claims (14)
- 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼ
を阻害することができ、下記の塩基配列(I)を含むＲＮ
Ａ分子。 5'-GAXUGGGAC-3' (I) （配列番号１） （配列中、XはAまたはUである） - 【請求項２】 塩基配列(I)がループ構造を形成する請
求項１記載のＲＮＡ分子。 - 【請求項３】 ループ構造を形成する塩基配列(I)に隣
接してステム構造を形成する塩基配列をさらに含む請求
項２記載のＲＮＡ分子。 - 【請求項４】 下記の塩基配列(II)を含む請求項３記載
のＲＮＡ分子。 5'-CUUCGGGAUUUGAGGGUA GAAUGGGAC UA-3' (II) (配列番号２） - 【請求項５】 下記の塩基配列(III)を含む請求項３記
載のＲＮＡ分子。 5'-UGCUCUUA GAAUGGGAC UAAGACACGGGAC-3' (III) (配列番号３） - 【請求項６】 下記の塩基配列(IV)を含む請求項３記載
のＲＮＡ分子。 5'-UACGACAC GAUUGGGAC GUGUCUAUGGGAC-3' (IV) (配列番号４） - 【請求項７】 さらに、下記の塩基配列(V)を5'末端側
に、下記の塩基配列(VI)の5'末端から少なくとも１３個
の連続する塩基の配列を3'末端側に有している請求項４
〜７のいずれかに記載のＲＮＡ分子。 5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAG-3' (V) (配列番号５） 5'-CCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3' (VI) (配列番号６） - 【請求項８】 請求項１記載のＲＮＡ分子を含む医薬組
成物。 - 【請求項９】 Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼ
を阻害するための請求項８記載の医薬組成物。 - 【請求項１０】 Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス
薬として用いられる請求項８記載の医薬組成物。 - 【請求項１１】 Ｃ型肝炎を診断するための請求項８記
載の医薬組成物。 - 【請求項１２】 Ｃ型肝炎を予防および／または治療す
るための請求項８記載の医薬組成物。 - 【請求項１３】 請求項１記載のＲＮＡ分子を用いてＣ
型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害する方法。 - 【請求項１４】 Ｃ型肝炎ウイルスに感染した細胞に請
求項１記載のＲＮＡ分子を導入することを含む請求項１
３記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30534497A JP3612551B2 (ja) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30534497A JP3612551B2 (ja) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002165594A (ja) * | 2000-11-29 | 2002-06-11 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Ｃ型肝炎ウイルスのｉｒｅｓ及びｎｓ３プロテアーゼを標的とするｒｎａ分子 |
| JP2002345475A (ja) * | 2001-05-25 | 2002-12-03 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新規機能性核酸 |
| US7119072B2 (en) | 2002-01-30 | 2006-10-10 | Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. | Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus |
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