JP2002345475A - Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新規機能性核酸 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新規機能性核酸Info
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- JP2002345475A JP2002345475A JP2001156957A JP2001156957A JP2002345475A JP 2002345475 A JP2002345475 A JP 2002345475A JP 2001156957 A JP2001156957 A JP 2001156957A JP 2001156957 A JP2001156957 A JP 2001156957A JP 2002345475 A JP2002345475 A JP 2002345475A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼおよ
びヘリカーゼを標的とする新規機能性核酸を得ること。 【解決手段】 下記の塩基配列(1)を有し、ＨＣＶのＮ
Ｓ３プロテアーゼおよび／またはＮＳ３ヘリカーゼを阻
害することができるＲＮＡ分子。 5'-Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｘ−Ｂ-3' (1) （配列中、Ａは5'-GGGAGA-3'であり、ＸおよびＹは互い
に相補的な塩基数が３〜９個の塩基配列であり、Ｎは塩
基数が３〜７個の塩基配列であり、Ｂは5'-UUGAGGGUAGA
AUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCU-3'であるが、但し、Ｎ、Ｘ
およびＹの塩基配列の塩基数の合計は２２個以下であ
る。）
びヘリカーゼを標的とする新規機能性核酸を得ること。 【解決手段】 下記の塩基配列(1)を有し、ＨＣＶのＮ
Ｓ３プロテアーゼおよび／またはＮＳ３ヘリカーゼを阻
害することができるＲＮＡ分子。 5'-Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｘ−Ｂ-3' (1) （配列中、Ａは5'-GGGAGA-3'であり、ＸおよびＹは互い
に相補的な塩基数が３〜９個の塩基配列であり、Ｎは塩
基数が３〜７個の塩基配列であり、Ｂは5'-UUGAGGGUAGA
AUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCU-3'であるが、但し、Ｎ、Ｘ
およびＹの塩基配列の塩基数の合計は２２個以下であ
る。）
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス
のＮＳ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新
規機能性核酸、該核酸をコードするＤＮＡを含む発現ベ
クター、および前記核酸または発現ベクターを含む医薬
組成物に関する。
のＮＳ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新
規機能性核酸、該核酸をコードするＤＮＡを含む発現ベ
クター、および前記核酸または発現ベクターを含む医薬
組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は非Ａ非Ｂ型
肝炎の病原体で、慢性肝炎の主要原因であるＲＮＡウイ
ルスである。ＨＣＶ由来の慢性肝炎の約20%は肝硬変、
肝臓癌へと移行するため、重篤な肝疾患の要因となって
おり、その感染者および患者は世界各国において急増し
ている。現在までのところ、Ｃ型肝炎の治療にはインタ
ーフェロンが主に用いられている。しかしながら有効な
治療薬が存在していないため、その開発が急務とされて
いる。
肝炎の病原体で、慢性肝炎の主要原因であるＲＮＡウイ
ルスである。ＨＣＶ由来の慢性肝炎の約20%は肝硬変、
肝臓癌へと移行するため、重篤な肝疾患の要因となって
おり、その感染者および患者は世界各国において急増し
ている。現在までのところ、Ｃ型肝炎の治療にはインタ
ーフェロンが主に用いられている。しかしながら有効な
治療薬が存在していないため、その開発が急務とされて
いる。
【０００３】ＨＣＶは約9,600ヌクレオチドからなるプ
ラス鎖RNAを遺伝子としてもち、フラビウイルス科に分
類される。ＨＣＶ遺伝子はまず、3,010アミノ酸からな
る前駆蛋白質に変換され、この前駆蛋白質がプロセシン
グをうけて、ＨＣＶ増殖に必要な構造蛋白質（コア蛋白
質；C、外被蛋白質；E1、E2）ならびに非構造蛋白質（N
S2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）に変換される。
ラス鎖RNAを遺伝子としてもち、フラビウイルス科に分
類される。ＨＣＶ遺伝子はまず、3,010アミノ酸からな
る前駆蛋白質に変換され、この前駆蛋白質がプロセシン
グをうけて、ＨＣＶ増殖に必要な構造蛋白質（コア蛋白
質；C、外被蛋白質；E1、E2）ならびに非構造蛋白質（N
S2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）に変換される。
【０００４】非構造蛋白質の一つであるNS3の、N末端側
の約1/3にコードされているセリンプロテアーゼ（以
下、「NS3プロテアーゼ」という）は非構造蛋白質間の
切断（４箇所；NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、NS5A
/NS5B）に関与している。この蛋白質のプロセシング
は、ウイルスの増殖に必要なステップである。また、NS
4Aはコファクターとして、すべての切断部位においてNS
3プロテアーゼのはたらきを促進している。立体構造解
析により、NS3プロテアーゼは、2つのβバレルを有する
トリプシン様の構造を持っていることが明らかとなって
いる。さらにNS4Aとの複合体の構造解析の結果、NS4Aは
NS3プロテアーゼの活性中心であるN末端側のβバレル
に、必須な因子として結合していることが報告されてい
る。
の約1/3にコードされているセリンプロテアーゼ（以
下、「NS3プロテアーゼ」という）は非構造蛋白質間の
切断（４箇所；NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、NS5A
/NS5B）に関与している。この蛋白質のプロセシング
は、ウイルスの増殖に必要なステップである。また、NS
4Aはコファクターとして、すべての切断部位においてNS
3プロテアーゼのはたらきを促進している。立体構造解
析により、NS3プロテアーゼは、2つのβバレルを有する
トリプシン様の構造を持っていることが明らかとなって
いる。さらにNS4Aとの複合体の構造解析の結果、NS4Aは
NS3プロテアーゼの活性中心であるN末端側のβバレル
に、必須な因子として結合していることが報告されてい
る。
【０００５】これに対し、NS3のC末端側の約2/3にはヘ
リカーゼドメイン（以下、「NS3ヘリカーゼ」という）
がコードされている。NS3ヘリカーゼは、ヌクレオチド
三リン酸に依存して、DNAあるいはRNAの二本鎖をほどく
はたらきをする。この酵素は、フラビウイルスファミリ
ーに属するすべての種において見い出されており、ウイ
ルスゲノムの複製に重要なはたらきをしていると考えら
れている。また、NS3ヘリカーゼは、Poly(U)配列によく
結合することが報告されており、この配列はHCVRNAの3'
末端にも存在している。また、構造解析により、NS3ヘ
リカーゼは3つのドメイン（ドメインI、II、III）から
なり、それらが割れ目により隔てられた構造をとってい
ることが明らかにされている。また、デオキシウリジン
のオクタマー（dU8）との複合体の構造解析の結果、dU8
がこの割れ目に結合することが報告されており、この部
分が基質の結合部位と考えられる。
リカーゼドメイン（以下、「NS3ヘリカーゼ」という）
がコードされている。NS3ヘリカーゼは、ヌクレオチド
三リン酸に依存して、DNAあるいはRNAの二本鎖をほどく
はたらきをする。この酵素は、フラビウイルスファミリ
ーに属するすべての種において見い出されており、ウイ
ルスゲノムの複製に重要なはたらきをしていると考えら
れている。また、NS3ヘリカーゼは、Poly(U)配列によく
結合することが報告されており、この配列はHCVRNAの3'
末端にも存在している。また、構造解析により、NS3ヘ
リカーゼは3つのドメイン（ドメインI、II、III）から
なり、それらが割れ目により隔てられた構造をとってい
ることが明らかにされている。また、デオキシウリジン
のオクタマー（dU8）との複合体の構造解析の結果、dU8
がこの割れ目に結合することが報告されており、この部
分が基質の結合部位と考えられる。
【０００６】以上のことから、NS3はHCVの増殖に重要な
酵素であると考えられる。そのため、NS3プロテアーゼ
やNS3ヘリカーゼの活性を阻害できるようなものは、強
力な抗HCV薬となりうる。すでに本発明者らは、in vitr
o selection法によって、NS3プロテアーゼに対するアプ
タマーを得ており、それらはG9-I、G9-II、G9-IIIの3種
である（図１）。また、これらは共通配列（5'-GA(A/U)
UGGGAC-3'）を持っており、これがループ構造を形成し
ているものと思われる（図１）。さらに本発明者らは、
これらのアプタマーがin vitroにおいて、ΔNS3プロテ
アーゼに対して特異的に、かつ高い親和性でもって結合
し（Kd約10nM）、さらにMBP-NS3（アミノ酸985-1647、1
10 kDa）のプロテアーゼ活性を約90%阻害することを明
らかにしている（特開平11-137252号）。
酵素であると考えられる。そのため、NS3プロテアーゼ
やNS3ヘリカーゼの活性を阻害できるようなものは、強
力な抗HCV薬となりうる。すでに本発明者らは、in vitr
o selection法によって、NS3プロテアーゼに対するアプ
タマーを得ており、それらはG9-I、G9-II、G9-IIIの3種
である（図１）。また、これらは共通配列（5'-GA(A/U)
UGGGAC-3'）を持っており、これがループ構造を形成し
ているものと思われる（図１）。さらに本発明者らは、
これらのアプタマーがin vitroにおいて、ΔNS3プロテ
アーゼに対して特異的に、かつ高い親和性でもって結合
し（Kd約10nM）、さらにMBP-NS3（アミノ酸985-1647、1
10 kDa）のプロテアーゼ活性を約90%阻害することを明
らかにしている（特開平11-137252号）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、G9-Iアプタ
マーの種々の領域に変異を導入した各種変異体を作成
し、その機能を解析することにより、Ｃ型肝炎ウイルス
のＮＳ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新
規機能性核酸を得ることを目的とする。
マーの種々の領域に変異を導入した各種変異体を作成
し、その機能を解析することにより、Ｃ型肝炎ウイルス
のＮＳ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新
規機能性核酸を得ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】今回、G9-Iの変異体を数
種類作成し、その機能を解析したところ、ステムIとス
テム-ループIII構造が、ΔNS3のプロテアーゼ活性を阻
害するために必要であることが明らかとなった。この領
域には、共通配列（5'-GA(A/U)UGGGAC-3'）が含まれて
いる。
種類作成し、その機能を解析したところ、ステムIとス
テム-ループIII構造が、ΔNS3のプロテアーゼ活性を阻
害するために必要であることが明らかとなった。この領
域には、共通配列（5'-GA(A/U)UGGGAC-3'）が含まれて
いる。
【０００９】本発明者らは、さらにG9アプタマーの機能
構造を解析するために、ステムII領域における変異体を
作成し、その機能構造相関を調べた。その結果、G9-Iと
同等にNS3プロテアーゼを阻害できる最小のアプタマー
（ΔNEO-III）を得ることに成功した。そして、最終的
にΔNEO-IIIに14U配列を付加させ、新たなRNA分子であ
るNEO-III-14Uを構築した結果、HCVのNS3プロテアーゼ
とNS3ヘリカーゼの両方を阻害することに成功した。本
発明は、上記の知見に基づき、完成されたものである。
構造を解析するために、ステムII領域における変異体を
作成し、その機能構造相関を調べた。その結果、G9-Iと
同等にNS3プロテアーゼを阻害できる最小のアプタマー
（ΔNEO-III）を得ることに成功した。そして、最終的
にΔNEO-IIIに14U配列を付加させ、新たなRNA分子であ
るNEO-III-14Uを構築した結果、HCVのNS3プロテアーゼ
とNS3ヘリカーゼの両方を阻害することに成功した。本
発明は、上記の知見に基づき、完成されたものである。
【００１０】すなわち、本発明は、下記の塩基配列(1)
を有し、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼおよび／またはＮ
Ｓ３ヘリカーゼを阻害することができるＲＮＡ分子を提
供する。 5'-Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｘ−Ｂ-3' (1) （配列中、Ａは5'-GGGAGA-3'であり、ＸおよびＹは互い
に相補的な塩基数が３〜９個の塩基配列であり、Ｎは塩
基数が３〜７個の塩基配列であり、Ｂは5'-UUGAGGGUAGA
AUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCU-3'であるが、但し、Ｎ、Ｘ
およびＹの塩基配列の塩基数の合計は２２個以下であ
る。） 本発明のＲＮＡ分子は、下記の二次構造(I)をとること
ができる。
を有し、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼおよび／またはＮ
Ｓ３ヘリカーゼを阻害することができるＲＮＡ分子を提
供する。 5'-Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｘ−Ｂ-3' (1) （配列中、Ａは5'-GGGAGA-3'であり、ＸおよびＹは互い
に相補的な塩基数が３〜９個の塩基配列であり、Ｎは塩
基数が３〜７個の塩基配列であり、Ｂは5'-UUGAGGGUAGA
AUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCU-3'であるが、但し、Ｎ、Ｘ
およびＹの塩基配列の塩基数の合計は２２個以下であ
る。） 本発明のＲＮＡ分子は、下記の二次構造(I)をとること
ができる。
【００１１】
【化２】 （二次構造中、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニ
ン、Uはウラシルであり、iは３〜９のいずれかの整数で
あり、jは３〜７のいずれかの整数であるが、但し、２i
＋j≦２２であり、ｎ1〜ｎjは、それぞれ独立に、いず
れかの核酸塩基であり、ｘ1〜ｘiおよびｙ1〜ｙiは、そ
れぞれ独立に、いずれかの核酸塩基であるが、但し、ｘ
kとｙk(ｋ＝1〜i)は互いに相補的な塩基であり、核酸塩
基間をつなぐ実線は相補的塩基対の形成を示し、核酸塩
基間の黒丸はワブル塩基対の形成を示す。） ＲＮＡ分子の二次構造は、一般の遺伝情報処理ソフトウ
ェア(Mulfoldプログラム（Zuker, M. (1989) Computer
prediction of RNA structure, Methods Enzymol. 180,
202-287.）など）に塩基配列を入力して予測すること
ができ、このような方法で、あるＲＮＡ分子が二次構造
(I)をとることが予測された場合に、そのＲＮＡ分子は
二次構造(I)をとることができるものとする。あるいは
また、ＲＮＡ分子の二次構造は、RNA分解酵素による限
定分解法、化学試薬による修飾法、修飾ヌクレオチド導
入と限定分解を組み合わせた修飾干渉法のような実験的
な手法で確認してもよい。
ン、Uはウラシルであり、iは３〜９のいずれかの整数で
あり、jは３〜７のいずれかの整数であるが、但し、２i
＋j≦２２であり、ｎ1〜ｎjは、それぞれ独立に、いず
れかの核酸塩基であり、ｘ1〜ｘiおよびｙ1〜ｙiは、そ
れぞれ独立に、いずれかの核酸塩基であるが、但し、ｘ
kとｙk(ｋ＝1〜i)は互いに相補的な塩基であり、核酸塩
基間をつなぐ実線は相補的塩基対の形成を示し、核酸塩
基間の黒丸はワブル塩基対の形成を示す。） ＲＮＡ分子の二次構造は、一般の遺伝情報処理ソフトウ
ェア(Mulfoldプログラム（Zuker, M. (1989) Computer
prediction of RNA structure, Methods Enzymol. 180,
202-287.）など）に塩基配列を入力して予測すること
ができ、このような方法で、あるＲＮＡ分子が二次構造
(I)をとることが予測された場合に、そのＲＮＡ分子は
二次構造(I)をとることができるものとする。あるいは
また、ＲＮＡ分子の二次構造は、RNA分解酵素による限
定分解法、化学試薬による修飾法、修飾ヌクレオチド導
入と限定分解を組み合わせた修飾干渉法のような実験的
な手法で確認してもよい。
【００１２】上記の塩基配列（１）のＮは塩基数が３〜
７個の塩基配列であるが、好ましくは、塩基数が4〜7個
の塩基配列である。塩基配列（１）のＸおよびＹは互い
に相補的な塩基数が３〜９個の塩基配列であるが、好ま
しくは、互いに相補的な塩基数が3〜9個の塩基配列であ
る。Ｎ、ＸおよびＹの塩基配列の塩基数の合計は２２個
以下であるが、好ましくは、10〜13個である。
７個の塩基配列であるが、好ましくは、塩基数が4〜7個
の塩基配列である。塩基配列（１）のＸおよびＹは互い
に相補的な塩基数が３〜９個の塩基配列であるが、好ま
しくは、互いに相補的な塩基数が3〜9個の塩基配列であ
る。Ｎ、ＸおよびＹの塩基配列の塩基数の合計は２２個
以下であるが、好ましくは、10〜13個である。
【００１３】上記の二次構造(I)のｎ1ｎ2・・・ｎjは塩
基数が３〜７個の塩基配列であるが、好ましくは、塩基
数が4〜7個の塩基配列である。二次構造(I)のｘ1ｘ2・
・・ｘiおよびy1y2・・・yiは互いに相補的な塩基数が
３〜９個の塩基配列であるが、好ましくは、互いに相補
的な塩基数が3〜9個の塩基配列である。２ｉ＋ｊは２２
以下であるが、好ましくは、10〜13である。
基数が３〜７個の塩基配列であるが、好ましくは、塩基
数が4〜7個の塩基配列である。二次構造(I)のｘ1ｘ2・
・・ｘiおよびy1y2・・・yiは互いに相補的な塩基数が
３〜９個の塩基配列であるが、好ましくは、互いに相補
的な塩基数が3〜9個の塩基配列である。２ｉ＋ｊは２２
以下であるが、好ましくは、10〜13である。
【００１４】塩基配列（１）および二次構造(I)の３'末
端のUの後に、さらに少なくとも14個のU（Uはウラシル
である。）を有してもよい。
端のUの後に、さらに少なくとも14個のU（Uはウラシル
である。）を有してもよい。
【００１５】塩基配列（１）および二次構造(I)の３'末
端のUの後に、さらに１個のU（Uはウラシルである。）
を有してもよい。
端のUの後に、さらに１個のU（Uはウラシルである。）
を有してもよい。
【００１６】塩基配列（１）および二次構造(I)の３'末
端のUの後に、さらに5'-UCCUCUUCU-3'（配列中、Uはウ
ラシルであり、Cはシトシンである。）の塩基配列を有
してもよい。
端のUの後に、さらに5'-UCCUCUUCU-3'（配列中、Uはウ
ラシルであり、Cはシトシンである。）の塩基配列を有
してもよい。
【００１７】本発明のＲＮＡ分子の例としては、下記の
(i)〜(vii)のいずれかの塩基配列を有するものが挙げら
れる。 (i) ΔLoopII 5'-GGGAGAAUUCCGAGCUUCGGGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUU
UCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号４） (ii) ΔStemII 5'-GGGAGAACCGACCAGAAGCUUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACC
UUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号５） (iii) NEO-I 5'-GGGAGAACCGAGCUUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCU
CUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号６） (iv) NEO-III 5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUC
UCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号７） (v) NEO-II 5'-GGGAGAACCGGCUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCU
CUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号８） (vi) ΔNEO-III 5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUC
UCCUU-3'（配列番号９） (vii) NEO-III-14U 5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUC
UCCUUUUUUUUUUUUUUU-3'（配列番号１０） また、本発明は、上記のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ
を転写因子の制御下に含む発現ベクターを提供する。
(i)〜(vii)のいずれかの塩基配列を有するものが挙げら
れる。 (i) ΔLoopII 5'-GGGAGAAUUCCGAGCUUCGGGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUU
UCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号４） (ii) ΔStemII 5'-GGGAGAACCGACCAGAAGCUUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACC
UUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号５） (iii) NEO-I 5'-GGGAGAACCGAGCUUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCU
CUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号６） (iv) NEO-III 5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUC
UCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号７） (v) NEO-II 5'-GGGAGAACCGGCUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCU
CUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号８） (vi) ΔNEO-III 5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUC
UCCUU-3'（配列番号９） (vii) NEO-III-14U 5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUC
UCCUUUUUUUUUUUUUUU-3'（配列番号１０） また、本発明は、上記のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ
を転写因子の制御下に含む発現ベクターを提供する。
【００１８】さらに、本発明は、上記のＲＮＡ分子また
は上記の発現ベクターを有効成分として含む、医薬組成
物を提供する。
は上記の発現ベクターを有効成分として含む、医薬組成
物を提供する。
【００１９】本発明の医薬組成物は、ＨＣＶのＮＳ３プ
ロテアーゼおよび／またはＮＳ３ヘリカーゼを阻害する
ために使用することができる。
ロテアーゼおよび／またはＮＳ３ヘリカーゼを阻害する
ために使用することができる。
【００２０】本発明の医薬組成物は、Ｃ型肝炎を予防お
よび／または治療するために使用することができる。
よび／または治療するために使用することができる。
【００２１】本発明は、上記のＲＮＡ分子を有効成分と
して含み、Ｃ型肝炎を診断するための医薬組成物も提供
する。
して含み、Ｃ型肝炎を診断するための医薬組成物も提供
する。
【００２２】本明細書において、「相補的な塩基配列」
とは、互いに塩基対を形成しうるような核酸の塩基配列
をいう。塩基対として、ＲＮＡでは、アデニン(A)とウ
ラシル(U)との対合、グアニン(G)とシトシン(C)との対
合を例示することができ、また、GとUのワブル塩基対も
含まれる。
とは、互いに塩基対を形成しうるような核酸の塩基配列
をいう。塩基対として、ＲＮＡでは、アデニン(A)とウ
ラシル(U)との対合、グアニン(G)とシトシン(C)との対
合を例示することができ、また、GとUのワブル塩基対も
含まれる。
【００２３】「アプタマー」とは、アミノ酸のような小
分子から蛋白質、さらにはウイルスのような高分子を認
識する核酸分子を意味する。
分子から蛋白質、さらにはウイルスのような高分子を認
識する核酸分子を意味する。
【００２４】「ステム構造」とは、塩基対合により二本
鎖を形成した核酸のステム状の構造をいう。
鎖を形成した核酸のステム状の構造をいう。
【００２５】「ループ構造」とは、一本鎖の核酸による
ループ状の構造をいう。例えば、図１にはRNAアプタマ
ーG9-I、G9-IIおよびG9-IIIの二次構造が示されている
が、ステム構造の末端に見られるリング状部分がループ
構造である。
ループ状の構造をいう。例えば、図１にはRNAアプタマ
ーG9-I、G9-IIおよびG9-IIIの二次構造が示されている
が、ステム構造の末端に見られるリング状部分がループ
構造である。
【００２６】「ループ−ステム構造」とは、一本鎖のRN
Aがループとステムを形成した構造をいう。
Aがループとステムを形成した構造をいう。
【００２７】「転写因子」とは、DNA遺伝情報がRNAへ転
写される過程で転写を調節する因子をいう。この因子に
は、例えば、プロモーターやエンハンサーが含まれる。
プロモーターはTATAボックス、GCリッチ反復配列などか
らなり、ゲノム上のそれらの位置は真核細胞、原核細
胞、ウイルスによって異なる。エンハンサーは真核細
胞、ウイルスに存在し、プロモーターの上流に存在し
て、プロモーターからの転写を著しく促進する働きを有
する。転写因子にはオペレーターも含むことができ、こ
の場合、任意の誘導物質によって転写をコントロールす
ることができる。
写される過程で転写を調節する因子をいう。この因子に
は、例えば、プロモーターやエンハンサーが含まれる。
プロモーターはTATAボックス、GCリッチ反復配列などか
らなり、ゲノム上のそれらの位置は真核細胞、原核細
胞、ウイルスによって異なる。エンハンサーは真核細
胞、ウイルスに存在し、プロモーターの上流に存在し
て、プロモーターからの転写を著しく促進する働きを有
する。転写因子にはオペレーターも含むことができ、こ
の場合、任意の誘導物質によって転写をコントロールす
ることができる。
【００２８】
【発明の実施の形態】本発明を詳細に説明する。
【００２９】Full-NS3導入ベクターの構築 まず、NS3を完全にカバーする領域である、HCV前駆蛋白
質のアミノ酸1027〜1657番をコードするcDNA断片を、pM
AN34NSH（Kakiuchi,N. ら (1995) Bacterial expressio
n and analysis of cleavage activity of HCV serine
proteinase using recombinant and synthetic substra
te, Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 1059-106
5.）を鋳型としてPCR法により得た。次にこの断片をベ
クターpGEMEX-1(Promega)に挿入した。以上のようにし
て得られたpT7Full-NS3からは、ヒスチジン６残基が付
加した完全長NS3が得られ、以下に説明するアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより精製することができる。
質のアミノ酸1027〜1657番をコードするcDNA断片を、pM
AN34NSH（Kakiuchi,N. ら (1995) Bacterial expressio
n and analysis of cleavage activity of HCV serine
proteinase using recombinant and synthetic substra
te, Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 1059-106
5.）を鋳型としてPCR法により得た。次にこの断片をベ
クターpGEMEX-1(Promega)に挿入した。以上のようにし
て得られたpT7Full-NS3からは、ヒスチジン６残基が付
加した完全長NS3が得られ、以下に説明するアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００３０】蛋白質の発現と精製 NS3プロテアーゼ（ΔNS3; アミノ酸 1027-1218、25 kD
a）とマルトース結合性蛋白質を付加させた完全長NS3
（MBP-NS3; アミノ酸 985-1647、110 kDa）はすでに報
告されている方法（Kakiuchi, N.ら (1995) Biochem. B
iophys. Res. Commun. 210, 1059-1065.）で大腸菌HB10
1内で発現させ、精製した。NS3プロテアーゼの基質とし
て用いた、NS5A-5B切断部位を含む17アミノ酸からなる
ペプチド（S1; Dns GEAGDDIVPC*SMSYTWT Dns：ダンシ
ル残基、*：切断部位）およびNS4Aペプチド（P41; アミ
ノ酸 1673-1692）も、すでに報告されている方法（Kak
iuchi, N.ら (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun.
210, 1059-1065.）で精製した。pT7Full-NS3をBL21(DE
3)に導入したのち、100 μg/mlのアンピシリンを含むL-
ブロース培地中で、600 nmでの吸光度が0.5に達するま
で30℃で培養し、さらにその時点から8時間培養した。F
ull-NS3はT7 RNA polymeraseプロモーターにより発現を
調節されている。つぎに培養した大腸菌を遠心（6000回
転、15分）し、ペレットをバッファーA[20 mM Tris-HCl
(pH7.6)、0.5 M NaCl、5 mMイミダゾール]で懸濁し、
さらにマイクロチップ-ホーンを用いてソニケーション
（0℃、30秒、10回、インターバルを各回ごとに2分）し
た。この菌体溶液を遠心（12000回転、30分、4℃）し、
上清をバッファーAで平衡化させたNi-NTAカラムにロー
ドした。カラムをバッファーAで洗浄し、5 mMから1 Mの
イミダゾールを含むバッファーAで溶出を行った。各フ
ラクション中のFull-NS3は10% SDS-PAGEを行った後、ク
マシーブリリアントブルー染色により確認した。つぎに
Full-NS3を含んだフラクションをTNEバッファー[10 mM
Tris-HCl (pH7.6)、50 mM NaCl、1 mM EDTA] で透析
し、これをTNEバッファーで平衡化させたポリ(U)-セフ
ァロース4Bカラムにロードし、TNEバッファーで洗浄し
た。溶出は、溶出バッファー[10 mM Tris-HCl(pH7.6)、
1 M NaCl、1 mM EDTA]によって行い、先に述べた方法
で、Full-NS3を含んだフラクションを選別し、TNEバッ
ファーで透析した。さらにこれをAmiconCentriprep-10
を用いて濃縮し、等量のグリセロールを加え、これを以
下の実験に用いた。得られたFull-NS3は純度99%以上の
高純度なものである。
a）とマルトース結合性蛋白質を付加させた完全長NS3
（MBP-NS3; アミノ酸 985-1647、110 kDa）はすでに報
告されている方法（Kakiuchi, N.ら (1995) Biochem. B
iophys. Res. Commun. 210, 1059-1065.）で大腸菌HB10
1内で発現させ、精製した。NS3プロテアーゼの基質とし
て用いた、NS5A-5B切断部位を含む17アミノ酸からなる
ペプチド（S1; Dns GEAGDDIVPC*SMSYTWT Dns：ダンシ
ル残基、*：切断部位）およびNS4Aペプチド（P41; アミ
ノ酸 1673-1692）も、すでに報告されている方法（Kak
iuchi, N.ら (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun.
210, 1059-1065.）で精製した。pT7Full-NS3をBL21(DE
3)に導入したのち、100 μg/mlのアンピシリンを含むL-
ブロース培地中で、600 nmでの吸光度が0.5に達するま
で30℃で培養し、さらにその時点から8時間培養した。F
ull-NS3はT7 RNA polymeraseプロモーターにより発現を
調節されている。つぎに培養した大腸菌を遠心（6000回
転、15分）し、ペレットをバッファーA[20 mM Tris-HCl
(pH7.6)、0.5 M NaCl、5 mMイミダゾール]で懸濁し、
さらにマイクロチップ-ホーンを用いてソニケーション
（0℃、30秒、10回、インターバルを各回ごとに2分）し
た。この菌体溶液を遠心（12000回転、30分、4℃）し、
上清をバッファーAで平衡化させたNi-NTAカラムにロー
ドした。カラムをバッファーAで洗浄し、5 mMから1 Mの
イミダゾールを含むバッファーAで溶出を行った。各フ
ラクション中のFull-NS3は10% SDS-PAGEを行った後、ク
マシーブリリアントブルー染色により確認した。つぎに
Full-NS3を含んだフラクションをTNEバッファー[10 mM
Tris-HCl (pH7.6)、50 mM NaCl、1 mM EDTA] で透析
し、これをTNEバッファーで平衡化させたポリ(U)-セフ
ァロース4Bカラムにロードし、TNEバッファーで洗浄し
た。溶出は、溶出バッファー[10 mM Tris-HCl(pH7.6)、
1 M NaCl、1 mM EDTA]によって行い、先に述べた方法
で、Full-NS3を含んだフラクションを選別し、TNEバッ
ファーで透析した。さらにこれをAmiconCentriprep-10
を用いて濃縮し、等量のグリセロールを加え、これを以
下の実験に用いた。得られたFull-NS3は純度99%以上の
高純度なものである。
【００３１】フィルターバインディングアッセイによる
平衡解離定数の決定 機能性RNA（ΔNEO-III、NEO-III-14U）の平衡解離定数
（Kd）は、32Pでラベルした一定量のRNAに対し、0.1か
ら700 nMのFull-NS3を結合させて算出した。RNAとFull-
NS3を含んだバインディングバッファー[50 mM Tris-HCl
(pH7.8)、30 mMNaCl、5 mM CaCl2、10 mM DTT]をニト
ロセルロース膜に通過させ、膜をバインディングバッフ
ァーで1回洗浄した。ニトロセルロース膜の放射活性を
もとに、スキャッチャードプロットを行い、解離平衡定
数を決定した。
平衡解離定数の決定 機能性RNA（ΔNEO-III、NEO-III-14U）の平衡解離定数
（Kd）は、32Pでラベルした一定量のRNAに対し、0.1か
ら700 nMのFull-NS3を結合させて算出した。RNAとFull-
NS3を含んだバインディングバッファー[50 mM Tris-HCl
(pH7.8)、30 mMNaCl、5 mM CaCl2、10 mM DTT]をニト
ロセルロース膜に通過させ、膜をバインディングバッフ
ァーで1回洗浄した。ニトロセルロース膜の放射活性を
もとに、スキャッチャードプロットを行い、解離平衡定
数を決定した。
【００３２】プロテアーゼ活性の測定 まず、RNAとΔNS3とP41をバッファー[50 mM Tris-HCl
(pH7.8)、30 mM NaCl、5 mM CaCl2、10 mM DTT]中で、2
5℃で15分プレインキュベーションした。つぎに、基質
であるS1を加え、25℃で、40分（ΔNS3）または80分 (F
ull-NS3)インキュベートし、最終濃度0.25 Nとなるよう
にNaOH溶液を加えて反応を停止させた。この反応溶液を
アセトニトリルの濃度勾配を用いた、逆相クロマトグラ
フィーカラムにロードした。切断された基質の蛍光シグ
ナルにより、プロテアーゼ活性を算出した。
(pH7.8)、30 mM NaCl、5 mM CaCl2、10 mM DTT]中で、2
5℃で15分プレインキュベーションした。つぎに、基質
であるS1を加え、25℃で、40分（ΔNS3）または80分 (F
ull-NS3)インキュベートし、最終濃度0.25 Nとなるよう
にNaOH溶液を加えて反応を停止させた。この反応溶液を
アセトニトリルの濃度勾配を用いた、逆相クロマトグラ
フィーカラムにロードした。切断された基質の蛍光シグ
ナルにより、プロテアーゼ活性を算出した。
【００３３】Full-NS3のヘリカーゼ活性の測定 ヘリカーゼ活性を測定する際にもちいる基質は、バクテ
リオファージM13mp181本鎖DNAと、T4ポリヌクレオチド
キナーゼを用いて5'末端を[γ-32P]ATPでラベルした30
塩基からなる相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリン
グさせることで得た。アニーリングは20 mM Tris-HCl
(pH7.8)、0.5 M NaCl、1 mM EDTAの溶液中で、94℃で3
分変性させ、その後緩やかに25℃にすることで行った。
さらに、Microcon Centrifugal Filter Device YM-50
(MILLIPORE) をもちいたゲルフィルトレーションにより
精製し、これをヘリカーゼ活性の測定に使用した。Full
-NS3 1.8 μMをRNAインヒビターとともに、反応液[25 m
M MOPS-NaOH (pH7.0)、2.5 mM DTT、100 μg/ml BSA
（ウシ血清アルブミン）、3 mM MgCl2、3 mMATP]中で、
室温で20分プレインキュベーションした。このあと2.6
fmolの基質を加え、37℃で30分インキュベーションし
た。反応の停止は、停止溶液[0.1 M Tris-HCl (pH7.6、
20 mM EDTA、0.5% SDS、0.1% Nonidet P-40、0.1% brom
ophenolblue、 0.1% xylene cyanol、25% glycerol)を
加えることで行った。このようにして得られた反応液を
0.5xTris-borate-EDTAを含む8% PAGEを行い、BAS2000で
基質の2重鎖がほどかれている様子を解析することによ
りヘリカーゼ活性を算出した。
リオファージM13mp181本鎖DNAと、T4ポリヌクレオチド
キナーゼを用いて5'末端を[γ-32P]ATPでラベルした30
塩基からなる相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリン
グさせることで得た。アニーリングは20 mM Tris-HCl
(pH7.8)、0.5 M NaCl、1 mM EDTAの溶液中で、94℃で3
分変性させ、その後緩やかに25℃にすることで行った。
さらに、Microcon Centrifugal Filter Device YM-50
(MILLIPORE) をもちいたゲルフィルトレーションにより
精製し、これをヘリカーゼ活性の測定に使用した。Full
-NS3 1.8 μMをRNAインヒビターとともに、反応液[25 m
M MOPS-NaOH (pH7.0)、2.5 mM DTT、100 μg/ml BSA
（ウシ血清アルブミン）、3 mM MgCl2、3 mMATP]中で、
室温で20分プレインキュベーションした。このあと2.6
fmolの基質を加え、37℃で30分インキュベーションし
た。反応の停止は、停止溶液[0.1 M Tris-HCl (pH7.6、
20 mM EDTA、0.5% SDS、0.1% Nonidet P-40、0.1% brom
ophenolblue、 0.1% xylene cyanol、25% glycerol)を
加えることで行った。このようにして得られた反応液を
0.5xTris-borate-EDTAを含む8% PAGEを行い、BAS2000で
基質の2重鎖がほどかれている様子を解析することによ
りヘリカーゼ活性を算出した。
【００３４】G9-I RNAの作製 G9-I、およびΔNEO-III-14Uの変異体は、ミュータジェ
ニックプライマーを用いたPCRにより、増幅し、シーク
エンシングを行うことにより配列を確認した。
ニックプライマーを用いたPCRにより、増幅し、シーク
エンシングを行うことにより配列を確認した。
【００３５】G9-Iアプタマーのステム-ループ領域の変
異体の解析 G9-I、G9-II、G9-III（G9アプタマー）の二次構造は、M
ulfoldプログラムにより推測し、G9アプタマーのステム
IとループIIIが共通であることがわかった（図1）。こ
れまでに本発明者らは、ステムIとステム-ループIIIがN
S3プロテアーゼ活性の阻害に必須であることを明らかに
している。また、これらの領域中には、ループIIIにお
ける共通配列（5'-GA(A/U)UGGGAC-3'）を含んでいた
（図1、2）。ステムIIの2つの2重鎖を欠失させたΔSI
I、およびループIIの大半を削除したΔLIIはG9-Iと同等
にNS3プロテアーゼに対する阻害活性を持っていた（図
2）。このことは、ステム-ループIIがNS3プロテアーゼ
に対する阻害に関しては、必須でないことを示唆してい
る。しかしながら、ステム-ループIIIがステムIと直接
連結しているdRIIは、G9-Iに比べて45%の阻害活性しか
保持していなかった。本発明者らはG9-Iをもとに、G9-I
の阻害活性を維持するために最低限必要な共通構造を明
らかにするため、さらに3つの変異体（dRII-Δ7A、dRII
-Δ7A8U、dRII-Δ7A8U9U；図3）を作製し、その機能を
解析した。これらのNS3プロテアーゼ阻害活性はdRIIと
同様、G9-Iに比べて弱い阻害活性を示した（図4A）。こ
の結果より、G9-Iと同等のNS3プロテアーゼ阻害活性を
持つ変異体は、ステム-ループIIのスペーサー配列の長
さを変化させても得られないことが示された。さらにス
テム-ループIIの機能について解析するために、この領
域に変異を加えたものを作製した。まず、ΔSIIとΔLII
のG9-Iから削除した部分の両方を削除した変異体である
NEO-Iを作製した（図2）。さらにNEO-IのステムIIの2本
鎖部を1つずつ欠失させたものであるNEO-IIとNEO-IIIを
作製した（図2）。これら3種の変異体のNS3プロテアー
ゼ阻害活性をしらべたところ、すべてが95％阻害し、G9
-Iと同等の機能を維持していることがわかった（図4
B）。以上の結果から、G9-Iの機能維持には、ステムII
の領域にいくつかの2重鎖構造が配列非依存的に必要で
あることが示された。すでに本発明者らは、G9アプタマ
ーの3'末端の11ヌクレオチドは、ΔNS3の結合には関与
していないことを明らかにしている。そこで、今回得た
NEO-IIIの3'端の1本鎖部を削除してΔNEO-IIIとし（図
2）、その阻害活性を調べた。その結果、G9-Iと同等に
ΔNS3のプロテアーゼ活性を阻害することがわかった
（図4A）。こうして、G9アプタマーと同等の機能をもつ
最小のアプタマーが得られた。
異体の解析 G9-I、G9-II、G9-III（G9アプタマー）の二次構造は、M
ulfoldプログラムにより推測し、G9アプタマーのステム
IとループIIIが共通であることがわかった（図1）。こ
れまでに本発明者らは、ステムIとステム-ループIIIがN
S3プロテアーゼ活性の阻害に必須であることを明らかに
している。また、これらの領域中には、ループIIIにお
ける共通配列（5'-GA(A/U)UGGGAC-3'）を含んでいた
（図1、2）。ステムIIの2つの2重鎖を欠失させたΔSI
I、およびループIIの大半を削除したΔLIIはG9-Iと同等
にNS3プロテアーゼに対する阻害活性を持っていた（図
2）。このことは、ステム-ループIIがNS3プロテアーゼ
に対する阻害に関しては、必須でないことを示唆してい
る。しかしながら、ステム-ループIIIがステムIと直接
連結しているdRIIは、G9-Iに比べて45%の阻害活性しか
保持していなかった。本発明者らはG9-Iをもとに、G9-I
の阻害活性を維持するために最低限必要な共通構造を明
らかにするため、さらに3つの変異体（dRII-Δ7A、dRII
-Δ7A8U、dRII-Δ7A8U9U；図3）を作製し、その機能を
解析した。これらのNS3プロテアーゼ阻害活性はdRIIと
同様、G9-Iに比べて弱い阻害活性を示した（図4A）。こ
の結果より、G9-Iと同等のNS3プロテアーゼ阻害活性を
持つ変異体は、ステム-ループIIのスペーサー配列の長
さを変化させても得られないことが示された。さらにス
テム-ループIIの機能について解析するために、この領
域に変異を加えたものを作製した。まず、ΔSIIとΔLII
のG9-Iから削除した部分の両方を削除した変異体である
NEO-Iを作製した（図2）。さらにNEO-IのステムIIの2本
鎖部を1つずつ欠失させたものであるNEO-IIとNEO-IIIを
作製した（図2）。これら3種の変異体のNS3プロテアー
ゼ阻害活性をしらべたところ、すべてが95％阻害し、G9
-Iと同等の機能を維持していることがわかった（図4
B）。以上の結果から、G9-Iの機能維持には、ステムII
の領域にいくつかの2重鎖構造が配列非依存的に必要で
あることが示された。すでに本発明者らは、G9アプタマ
ーの3'末端の11ヌクレオチドは、ΔNS3の結合には関与
していないことを明らかにしている。そこで、今回得た
NEO-IIIの3'端の1本鎖部を削除してΔNEO-IIIとし（図
2）、その阻害活性を調べた。その結果、G9-Iと同等に
ΔNS3のプロテアーゼ活性を阻害することがわかった
（図4A）。こうして、G9アプタマーと同等の機能をもつ
最小のアプタマーが得られた。
【００３６】NEO-III-14Uの構築とそのターゲットへの
結合性 これまでアプタマーのターゲットとして用いてきたFull
-NS3は、NS2のC末端側の一部を有し、NS3のC末端側の一
部を欠いているものであった。最近になって、NS3ヘリ
カーゼドメインの最後尾のβ鎖が、プロテアーゼドメイ
ンの活性部位と接しており、重要なはたらきをしている
可能性があることが報告されたため、より生理的条件に
近づけるためには完全なFull-NS3を用いる必要性が示唆
された。そのため、本発明者らは今回完全長Full-NS3を
精製し、用いた。NS3ヘリカーゼは、3個のドメインから
なり、1本鎖のオリゴヌクレオチドが、ドメインI、II
と、ドメインIIIのあいだの割れ目に結合することが報
告されている。中でもホモリボポリマー、特にPoly(U)
配列がよく結合し、しかもヘリカーゼ活性を阻害するこ
とが報告されている。そこで本発明者らは、HCVのNS3プ
ロテアーゼとNS3ヘリカーゼの両方を阻害することを目
的としてΔNEO-IIIの3'端に14U配列を付加させたNEO-II
I-14Uを構築した。NEO-III-14Uに付加した(U)14配列の
効果を調べるため、ΔNEO-IIIとNEO-III-14UのFull-NS3
に対する結合を比較し、Kd値を算出した（図5）。その
結果、NEO-III-14U（マル；約10 nM）がG9-I（シカク；
約90 nM）とΔNEO-III（ヒシガタ；約90 nM）に比べ
て、9倍もFull-NS3に対する親和性が高いことが明らか
となった。よって、NEO-III-14Uの(U)14配列は、Full-N
Sに対する親和性を高めるはたらきをすることが示され
た。
結合性 これまでアプタマーのターゲットとして用いてきたFull
-NS3は、NS2のC末端側の一部を有し、NS3のC末端側の一
部を欠いているものであった。最近になって、NS3ヘリ
カーゼドメインの最後尾のβ鎖が、プロテアーゼドメイ
ンの活性部位と接しており、重要なはたらきをしている
可能性があることが報告されたため、より生理的条件に
近づけるためには完全なFull-NS3を用いる必要性が示唆
された。そのため、本発明者らは今回完全長Full-NS3を
精製し、用いた。NS3ヘリカーゼは、3個のドメインから
なり、1本鎖のオリゴヌクレオチドが、ドメインI、II
と、ドメインIIIのあいだの割れ目に結合することが報
告されている。中でもホモリボポリマー、特にPoly(U)
配列がよく結合し、しかもヘリカーゼ活性を阻害するこ
とが報告されている。そこで本発明者らは、HCVのNS3プ
ロテアーゼとNS3ヘリカーゼの両方を阻害することを目
的としてΔNEO-IIIの3'端に14U配列を付加させたNEO-II
I-14Uを構築した。NEO-III-14Uに付加した(U)14配列の
効果を調べるため、ΔNEO-IIIとNEO-III-14UのFull-NS3
に対する結合を比較し、Kd値を算出した（図5）。その
結果、NEO-III-14U（マル；約10 nM）がG9-I（シカク；
約90 nM）とΔNEO-III（ヒシガタ；約90 nM）に比べ
て、9倍もFull-NS3に対する親和性が高いことが明らか
となった。よって、NEO-III-14Uの(U)14配列は、Full-N
Sに対する親和性を高めるはたらきをすることが示され
た。
【００３７】NEO-III-14UのFull-NS3プロテアーゼ活性
阻害効果 NEO-III-14Uに付加した(U)14配列の、Full-NS3プロテア
ーゼ阻害における効果をしらべるため、ΔNEO-IIIとNEO
-III-14UのFull-NS3プロテアーゼに対する阻害活性を測
定した（図6）。その結果、NEO-III-14U（マル）がΔNE
O-III（ヒシガタ）よりもFull-NS3プロテアーゼ活性を
阻害し、Full-NS3の2倍のモル量で約80%阻害することが
わかった。また、poly(U)20存在下における同様の反応
を解析した結果、Full-NS3プロテアーゼ活性に対する影
響は見られなかった（サンカク）。さらにヘリカーゼ活
性が、NEO-III-14Uのプロテアーゼ活性阻害効果に対し
て、負の調節を行うという可能性を否定するために、AT
PおよびMg2+の存在下というヘリカーゼが活性化する条
件で、NEO-III-14UのFull-NS3プロテアーゼ阻害活性を
測定した（シカク）。その結果、NEO-III-14Uは高いプ
ロテアーゼ阻害活性を保持していた。以上のことから、
今回新たに作製したNEO-III-14Uは、in vitroにおいてF
ull-NS3プロテアーゼを強力に阻害するものであること
が示された。
阻害効果 NEO-III-14Uに付加した(U)14配列の、Full-NS3プロテア
ーゼ阻害における効果をしらべるため、ΔNEO-IIIとNEO
-III-14UのFull-NS3プロテアーゼに対する阻害活性を測
定した（図6）。その結果、NEO-III-14U（マル）がΔNE
O-III（ヒシガタ）よりもFull-NS3プロテアーゼ活性を
阻害し、Full-NS3の2倍のモル量で約80%阻害することが
わかった。また、poly(U)20存在下における同様の反応
を解析した結果、Full-NS3プロテアーゼ活性に対する影
響は見られなかった（サンカク）。さらにヘリカーゼ活
性が、NEO-III-14Uのプロテアーゼ活性阻害効果に対し
て、負の調節を行うという可能性を否定するために、AT
PおよびMg2+の存在下というヘリカーゼが活性化する条
件で、NEO-III-14UのFull-NS3プロテアーゼ阻害活性を
測定した（シカク）。その結果、NEO-III-14Uは高いプ
ロテアーゼ阻害活性を保持していた。以上のことから、
今回新たに作製したNEO-III-14Uは、in vitroにおいてF
ull-NS3プロテアーゼを強力に阻害するものであること
が示された。
【００３８】NEO-III-14UによるFull-NS3ヘリカーゼ活
性阻害効果 バクテリオファージM13mp 18 1本鎖DNAと、5'末端を[γ
-32P]ATPでラベルした30塩基の相補的なオリゴヌクレオ
チドをアニーリングさせることで得た基質をもちいて、
Full-NS3のヘリカーゼ活性を測定した。その結果、基質
濃度2.6 fmolに対して、Full-NS3の濃度100 nMでほぼ完
全に基質は1本鎖となることがわかった（図7A；レーン
2）。つぎにpoly(U)20のFull-NS3ヘリカーゼ活性阻害効
果をしらべたところ、poly(U)20がFull-NS3に対して2,0
00倍量で、Full-NS3ヘリカーゼ活性を50%阻害すること
がわかった（図7A；レーン7）。さらに、NEO-III-14Uの
(U)14配列の、Full-NS3ヘリカーゼ活性阻害における効
果をしらべるため、ΔNEO-IIIとNEO-III-14UのFull-NS3
ヘリカーゼに対する阻害活性を測定した（図7B）。その
結果、NEO-III-14UをFull-NS3の20〜50倍量加えること
で、ヘリカーゼ活性をほぼ完全に抑制した（図7B；レー
ン13、14）。これに対してΔNEO-IIIは、NEO-III-14Uと
同量を加えても低い阻害効果しかなかった（図7B；レー
ン6、7）。これらの結果から、NEO-III-14Uは、NS3プロ
テアーゼ活性とNS3ヘリカーゼ活性の両方を阻害し、強
力にHCVの増殖を抑制できるものと期待できる。
性阻害効果 バクテリオファージM13mp 18 1本鎖DNAと、5'末端を[γ
-32P]ATPでラベルした30塩基の相補的なオリゴヌクレオ
チドをアニーリングさせることで得た基質をもちいて、
Full-NS3のヘリカーゼ活性を測定した。その結果、基質
濃度2.6 fmolに対して、Full-NS3の濃度100 nMでほぼ完
全に基質は1本鎖となることがわかった（図7A；レーン
2）。つぎにpoly(U)20のFull-NS3ヘリカーゼ活性阻害効
果をしらべたところ、poly(U)20がFull-NS3に対して2,0
00倍量で、Full-NS3ヘリカーゼ活性を50%阻害すること
がわかった（図7A；レーン7）。さらに、NEO-III-14Uの
(U)14配列の、Full-NS3ヘリカーゼ活性阻害における効
果をしらべるため、ΔNEO-IIIとNEO-III-14UのFull-NS3
ヘリカーゼに対する阻害活性を測定した（図7B）。その
結果、NEO-III-14UをFull-NS3の20〜50倍量加えること
で、ヘリカーゼ活性をほぼ完全に抑制した（図7B；レー
ン13、14）。これに対してΔNEO-IIIは、NEO-III-14Uと
同量を加えても低い阻害効果しかなかった（図7B；レー
ン6、7）。これらの結果から、NEO-III-14Uは、NS3プロ
テアーゼ活性とNS3ヘリカーゼ活性の両方を阻害し、強
力にHCVの増殖を抑制できるものと期待できる。
【００３９】NEO-III-14Uによる、Full-NS3とHCV RNAの
3'末端のプラスおよびマイナス鎖との結合の阻害 Full-NS3のヘリカーゼドメインは、HCV RNAの3'末端の
プラス鎖およびマイナス鎖と特異的に強く結合すること
が報告されている。NS3ヘリカーゼは、HCVゲノムの複製
にかかわっていると思われていることから、この結合
は、ヘリカーゼがHCVの2重鎖をほどくにあたって、重要
なステップとなっていることが考えられる。よってこの
ステップを阻害すればHCVの増殖を抑えることができる
と思われる。そこでNEO-III-14Uによる、Full-NS3とHCV
RNAの3'末端のプラス鎖およびマイナス鎖との結合の阻
害を調べた（図8）。Full-NS3のヘリカーゼドメイン
は、HCV RNAの3'末端のプラス鎖およびマイナス鎖と特
異的に強く結合することが報告されている。NS3ヘリカ
ーゼは、HCVゲノムの複製に関わっていると考えられて
いることから、この結合は、NS3ヘリカーゼがHCVゲノム
の2重鎖をほどくにあたって、重要なステップとなって
いることが考えられる。よってこのステップを阻害すれ
ばHCVの増殖を抑えることができると思われる。そこでN
EO-III-14Uによる、Full-NS3とHCV RNAの3'末端のプラ
ス鎖およびマイナス鎖との結合の阻害能を調べた（図8
A、8B）。まずプローブとして、32p-ラベルしたプラス
鎖におけるvariable region-poly(U/C) stretch-3'X re
gion (164ヌクレオチド；3'(+) UTRプローブ)とプラス
鎖の1-127に対して相補的な3'(-) UTRプローブを調整し
た。NEO-III-14U（図 8A.3'(+) UTRに対して5, 25, 50
and 100 μM、 図8B. 3'(-) UTRに対して10, 50,100 an
d 200 μM)を含む反応液（Full-NS3；3'(+) UTRに対し
て0.2 μM、3'(-)UTRに対して0.4 μM）を、室温で30分
間プレインキュベーションした。次に3'(+) UTRプロー
ブ（図 8A. 2.0 μM）もしくは3'(-) UTRプローブ（図
8B. 4.0 μM）をそれぞれの反応液に加えて、30℃で15
分間インキュベーションした。反応液をニトロセルロー
ス膜に通過させ、結合活性を解析した。その結果、3'
(+) UTRおよび3'(-) UTRに対するFull-NS3の結合は、NE
O-III-14Uの濃度上昇とともに阻害された。特に3'(+) U
TRにおいては、プローブに対して50当量過剰のNEO-III-
14Uを加えると約１５％に抑制された。
3'末端のプラスおよびマイナス鎖との結合の阻害 Full-NS3のヘリカーゼドメインは、HCV RNAの3'末端の
プラス鎖およびマイナス鎖と特異的に強く結合すること
が報告されている。NS3ヘリカーゼは、HCVゲノムの複製
にかかわっていると思われていることから、この結合
は、ヘリカーゼがHCVの2重鎖をほどくにあたって、重要
なステップとなっていることが考えられる。よってこの
ステップを阻害すればHCVの増殖を抑えることができる
と思われる。そこでNEO-III-14Uによる、Full-NS3とHCV
RNAの3'末端のプラス鎖およびマイナス鎖との結合の阻
害を調べた（図8）。Full-NS3のヘリカーゼドメイン
は、HCV RNAの3'末端のプラス鎖およびマイナス鎖と特
異的に強く結合することが報告されている。NS3ヘリカ
ーゼは、HCVゲノムの複製に関わっていると考えられて
いることから、この結合は、NS3ヘリカーゼがHCVゲノム
の2重鎖をほどくにあたって、重要なステップとなって
いることが考えられる。よってこのステップを阻害すれ
ばHCVの増殖を抑えることができると思われる。そこでN
EO-III-14Uによる、Full-NS3とHCV RNAの3'末端のプラ
ス鎖およびマイナス鎖との結合の阻害能を調べた（図8
A、8B）。まずプローブとして、32p-ラベルしたプラス
鎖におけるvariable region-poly(U/C) stretch-3'X re
gion (164ヌクレオチド；3'(+) UTRプローブ)とプラス
鎖の1-127に対して相補的な3'(-) UTRプローブを調整し
た。NEO-III-14U（図 8A.3'(+) UTRに対して5, 25, 50
and 100 μM、 図8B. 3'(-) UTRに対して10, 50,100 an
d 200 μM)を含む反応液（Full-NS3；3'(+) UTRに対し
て0.2 μM、3'(-)UTRに対して0.4 μM）を、室温で30分
間プレインキュベーションした。次に3'(+) UTRプロー
ブ（図 8A. 2.0 μM）もしくは3'(-) UTRプローブ（図
8B. 4.0 μM）をそれぞれの反応液に加えて、30℃で15
分間インキュベーションした。反応液をニトロセルロー
ス膜に通過させ、結合活性を解析した。その結果、3'
(+) UTRおよび3'(-) UTRに対するFull-NS3の結合は、NE
O-III-14Uの濃度上昇とともに阻害された。特に3'(+) U
TRにおいては、プローブに対して50当量過剰のNEO-III-
14Uを加えると約１５％に抑制された。
【００４０】アプタマー発現ベクター 上記のG9-I変異体アプタマーをコードするDNAを作製
し、これを転写因子を含むベクターに組み込むことによ
って、G9-I変異体アプタマー発現ベクターを得ることが
できる。G9-I変異体アプタマーをコードするDNAは、当
業界で周知の核酸の化学的合成法により、例えば、DNA/
RNA合成機を用いて製造することができる。また、合成
したDNAを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR)技術
を利用して、あるいは、該DNAを含むベクターによって
形質転換された培養宿主細胞中での発現を利用して、該
DNAを増幅することができる。PCR技術、形質転換および
発現技術は、例えば、J. Sambrookら(Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, Second edition, 1989)に記載されている。
発現系を構築するためのベクターとしては、pUCI9（宝
酒造、京都）、pGREENLANTERN（ライフテックオリエン
タル（株）、東京）、pHaMDR(HUMAN GENE THERAPY 6:90
5-915 (July 1995))などのプラスミドベクター、遺伝子
治療用ベクターとしてのアデノウイルスベクターやレト
ロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウ
イルス等）などを使用できる。上記ベクターにおいて、
G9-I変異体アプタマーをコードするDNAの上流にはプロ
モーター配列を含むことができる。プロモーター配列
は、G9-I変異体アプタマーの発現を調節する要素であ
り、ウイルスプロモーター（アデノウイルスVA1プロモ
ーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス
即時型初期プロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス
プロモーターなど）、ファージプロモーター（λPLプロ
モーターなど）、pol IIIプロモーター（ヒトtRNAプロ
モーター（例えば、tRNAvalプロモーター）など）、β
−アクチンプロモーターなどが含まれる。pol IIIプロ
モーター（特に、tRNAプロモーター）、β−アクチンプ
ロモーターが好ましく使用できる。さらに、転写因子と
してプロモーターとエンハンサーの組み合わせを使用し
てもよい。エンハンサーとしては哺乳類由来、ウイルス
由来のものが使用できる。また、本発明のベクターにお
いては、G9-I変異体アプタマーをコードするDNAの下流
にターミネーター配列をさらに含むことができる。ター
ミネーターは、転写を終結させる配列であれば、いずれ
の配列も使用でき、ターミネーター配列としてUUUUUを
使用できる。ベクターは、必要に応じて、抗生物質耐性
遺伝子（例えば、Ampr,、Neor)、栄養要求性を相補する
遺伝子などの選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝
子を含むことができる。
し、これを転写因子を含むベクターに組み込むことによ
って、G9-I変異体アプタマー発現ベクターを得ることが
できる。G9-I変異体アプタマーをコードするDNAは、当
業界で周知の核酸の化学的合成法により、例えば、DNA/
RNA合成機を用いて製造することができる。また、合成
したDNAを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR)技術
を利用して、あるいは、該DNAを含むベクターによって
形質転換された培養宿主細胞中での発現を利用して、該
DNAを増幅することができる。PCR技術、形質転換および
発現技術は、例えば、J. Sambrookら(Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, Second edition, 1989)に記載されている。
発現系を構築するためのベクターとしては、pUCI9（宝
酒造、京都）、pGREENLANTERN（ライフテックオリエン
タル（株）、東京）、pHaMDR(HUMAN GENE THERAPY 6:90
5-915 (July 1995))などのプラスミドベクター、遺伝子
治療用ベクターとしてのアデノウイルスベクターやレト
ロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウ
イルス等）などを使用できる。上記ベクターにおいて、
G9-I変異体アプタマーをコードするDNAの上流にはプロ
モーター配列を含むことができる。プロモーター配列
は、G9-I変異体アプタマーの発現を調節する要素であ
り、ウイルスプロモーター（アデノウイルスVA1プロモ
ーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス
即時型初期プロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス
プロモーターなど）、ファージプロモーター（λPLプロ
モーターなど）、pol IIIプロモーター（ヒトtRNAプロ
モーター（例えば、tRNAvalプロモーター）など）、β
−アクチンプロモーターなどが含まれる。pol IIIプロ
モーター（特に、tRNAプロモーター）、β−アクチンプ
ロモーターが好ましく使用できる。さらに、転写因子と
してプロモーターとエンハンサーの組み合わせを使用し
てもよい。エンハンサーとしては哺乳類由来、ウイルス
由来のものが使用できる。また、本発明のベクターにお
いては、G9-I変異体アプタマーをコードするDNAの下流
にターミネーター配列をさらに含むことができる。ター
ミネーターは、転写を終結させる配列であれば、いずれ
の配列も使用でき、ターミネーター配列としてUUUUUを
使用できる。ベクターは、必要に応じて、抗生物質耐性
遺伝子（例えば、Ampr,、Neor)、栄養要求性を相補する
遺伝子などの選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝
子を含むことができる。
【００４１】医薬組成物 本発明のアプタマーおよび発現ベクターは、ＨＣＶのＮ
Ｓ３プロテアーゼおよび／またはＮＳ３ヘリカーゼを阻
害するために用いることができ、具体的には、Ｃ型肝炎
を予防および／または治療するために用いることができ
る。HCVに感染した被験者の組織または細胞（例えば、
肝臓）に、本発明のアプタマーまたは発現ベクターを導
入することによって、細胞中のHCVのＮＳ３プロテアー
ゼおよび／またはヘリカーゼを阻害し、HCVの増殖を阻
止することができる。アプタマーまたは発現ベクターの
導入は、例えば、それらをリポソームに封入し、細胞内
に取り込む方法（"Lipidic vector systems for gene t
ransfer"(1997) R.J. Lee and L. Huang Crit. Rev. Th
er. Drug Carrier Syst 14, 173-206；中西守ら、蛋白
質 核酸 酵素 Vol.44, No.11, 1590-1596 (1999))、
リン酸カルシムム法、エレクトロポレーション法、リポ
フェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子
銃による方法などで行うことができる。ベクターを細胞
に導入する場合には、例えば、疾患部位の細胞を一部取
り出し、in vitroで遺伝子導入を行った後、該細胞を再
び組織に戻すことも可能であるし、あるいは、疾患部の
組織に直接ベクターを導入することもできる。ウイルス
ベクターで感染させる場合のウイルスタイターは通常約
１０７pfu/ml以上である。遺伝子治療にウイルスベクタ
ーを用いる方法については、例えば、"Viral vectors i
n gene therapy" (1997) A.E. Smith, Annu. Rev. Micr
obiol. 49:807-838に記載されている。本発明のアプタ
マーまたは発現ベクターを有効成分として含む医薬組成
物は、必要により、医薬上許容される担体（例えば、生
理食塩水、緩衝液などの希釈剤）を含むことができる。
投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、
治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽
減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与
方法、頻度で行えばよい。また、本発明のアプタマーを
用いて、Ｃ型肝炎を診断することができる。本発明のア
プタマーを抗体の代わりに利用することができる。本発
明のアプタマーを蛍光などで標識しておき、HCVに感染
している細胞の抽出液又は細胞をつぶした物と混ぜ、ニ
トロセルロース膜で濾過する。HCVが細胞内に存在すれ
ば、膜上にトラップされ、検出できる。
Ｓ３プロテアーゼおよび／またはＮＳ３ヘリカーゼを阻
害するために用いることができ、具体的には、Ｃ型肝炎
を予防および／または治療するために用いることができ
る。HCVに感染した被験者の組織または細胞（例えば、
肝臓）に、本発明のアプタマーまたは発現ベクターを導
入することによって、細胞中のHCVのＮＳ３プロテアー
ゼおよび／またはヘリカーゼを阻害し、HCVの増殖を阻
止することができる。アプタマーまたは発現ベクターの
導入は、例えば、それらをリポソームに封入し、細胞内
に取り込む方法（"Lipidic vector systems for gene t
ransfer"(1997) R.J. Lee and L. Huang Crit. Rev. Th
er. Drug Carrier Syst 14, 173-206；中西守ら、蛋白
質 核酸 酵素 Vol.44, No.11, 1590-1596 (1999))、
リン酸カルシムム法、エレクトロポレーション法、リポ
フェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子
銃による方法などで行うことができる。ベクターを細胞
に導入する場合には、例えば、疾患部位の細胞を一部取
り出し、in vitroで遺伝子導入を行った後、該細胞を再
び組織に戻すことも可能であるし、あるいは、疾患部の
組織に直接ベクターを導入することもできる。ウイルス
ベクターで感染させる場合のウイルスタイターは通常約
１０７pfu/ml以上である。遺伝子治療にウイルスベクタ
ーを用いる方法については、例えば、"Viral vectors i
n gene therapy" (1997) A.E. Smith, Annu. Rev. Micr
obiol. 49:807-838に記載されている。本発明のアプタ
マーまたは発現ベクターを有効成分として含む医薬組成
物は、必要により、医薬上許容される担体（例えば、生
理食塩水、緩衝液などの希釈剤）を含むことができる。
投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、
治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽
減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与
方法、頻度で行えばよい。また、本発明のアプタマーを
用いて、Ｃ型肝炎を診断することができる。本発明のア
プタマーを抗体の代わりに利用することができる。本発
明のアプタマーを蛍光などで標識しておき、HCVに感染
している細胞の抽出液又は細胞をつぶした物と混ぜ、ニ
トロセルロース膜で濾過する。HCVが細胞内に存在すれ
ば、膜上にトラップされ、検出できる。
【００４２】
【実施例】以下、本発明を実施例によって具体的に説明
する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するため
のものであって、本発明の範囲を限定するものではな
い。
する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するため
のものであって、本発明の範囲を限定するものではな
い。
【００４３】［実施例１］ G9-I変異体アプタマーの作
製 変異体アプタマーは後記の各鋳型DNAを用い、試験管内
転写法により調製した。試験管内転写は、鋳型DNA（2.5
μg）を40 mM Tris-HCl(pH 7.5)、4.0 mM スペルミジ
ン、10 mM DTT、15 mM MgCl2、 0.05% Triton X-100、
7.5 mM づつの４種類のNTPの存在下、T7RNAポリメラー
ゼ（0.08 μg/μl）に加え、全量20 μlで37℃で３時間
反応した。反応後、７M尿素−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により単離精製した。 (i)ΔloopII ΔloopII forwardプライマー、5'-AGTAATACGACTCACTATA
GGGAGAATTCCGAGCTTCGGGATTTGAGGG-3'（配列番号１５）
とreverseプライマー、 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-
3'（配列番号１６）を用いた。G-9IをコードしたDNAを
鋳型とし、上記のプライマーを用いてPCRを行った（94
℃, 75 sec -> 45℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイ
クルを5回、次いで94℃, 75 sec -> 65℃, 75 sec -> 7
2℃, 135 secのサイクルを20回）。得られたDNA断片を
精製およびクローン化し、配列の確認を行った（M13 un
iversal primerを用い、ABI PRISM Big Dye Terminator
Cycle Sequencing Reaction Kit を用いた）。目的の
配列を持ったクローンを鋳型としてPCR断片を獲得し、
これらを試験管内転写によりRNAに転写して以下の実験
に用いた。 (ii)ΔstemII ΔstemII forwardプライマー、5'-AGTAATACGACTCACTATA
GGGAGAACCGACCAGAAGCTCTGGTTTGAGGG-3'（配列番号１
７） と reverseプライマー、5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGA
AAGG-3'（配列番号１６）を用い、上記 (i) と同様の操
作にて変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転
写して以下の実験に用いた。 (iii)NEO-I 合成NEO-I template DNA、5'- GGGAGAACCGAGCTTCGGTTTG
AGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3'（配列
番号１８）とNEO-I forwardプライマー、5'-AGTAATACGA
CTCACTATAGGGAGAACCGAGCTTCGG-3'（配列番号１９）とre
verseプライマー、5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'
（配列番号１６）を用い、PCRを行った（94℃, 75 sec
-> 45℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイクルを6回、
次いで94℃, 75 sec -> 65℃, 75 sec -> 72℃, 135 se
cのサイクルを12回）。得られたDNA断片を精製およびク
ローン化し、配列の確認を行った（M13 universal prim
erを用い、ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Seque
ncing Reaction Kitを用いた）。目的の配列を持ったク
ローンを鋳型としてPCR断片を獲得し、これらをRNAに転
写して以下の実験に用いた。 (iv)NEO-III 合成NEO-III template DNA、5'- GGGAGAACCAGCTGGTTTGA
GGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3'（配列
番号２０）とNEO-III forwardプライマー、5'-AGTAATAC
GACTCACTATAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3'（配列番号２１）
とreverseプライマー、 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-
3'（配列番号１６）を用い、上記(iii) と同様の操作に
て変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写し
て以下の実験に用いた。 (v)NEO-II 合成NEO-II template DNA、5'- GGGAGAACCGGCTCGGTTTGA
GGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT 3'（配列
番号２２）とNEO-II forwardプライマー、5'-AGTAATACG
ACTCACTATAGGGAGAACCGGCTCGGTT-3'（配列番号２３） と
reverseプライマー、 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'
（配列番号１６）を用い、上記 (iv) と同様の操作にて
変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して
以下の実験に用いた。 (vi)ΔNEO-III 合成NEO-III template DNA、5'- GGGAGAACCAGCTGGTTTGA
GGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCT-3'（配列番号２４）
とNEO-III forwardプライマー、5'-AGTAATACGACTCACTA
TAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3'（配列番号２１）とΔNEO-III
reverseプライマー、 5'-AGGAGAGAGGAAAGGTAGTCC-3'
（配列番号２２）を用い、上記(iii) と同様の操作にて
変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して
以下の実験に用いた。 (vii)NEO-III-14U 合成NEO-III-14U template DNA、5'- GGGAGAACCAGCTGGT
TTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTTTTTTTTTTTTT-
3'（配列番号２５）とNEO-III forwardプライマー、5'-
AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3'（配列番号
２１） とΔNEO-III-14U reverseプライマー、 5'- AAA
AAAAAAAAAAAGGAGAGAGGAAAGG -3'（配列番号２６）を用
い、上記(iii) と同様の操作にて変異アプタマー遺伝子
を作成し次いで、RNAに転写して以下の実験に用いた。
製 変異体アプタマーは後記の各鋳型DNAを用い、試験管内
転写法により調製した。試験管内転写は、鋳型DNA（2.5
μg）を40 mM Tris-HCl(pH 7.5)、4.0 mM スペルミジ
ン、10 mM DTT、15 mM MgCl2、 0.05% Triton X-100、
7.5 mM づつの４種類のNTPの存在下、T7RNAポリメラー
ゼ（0.08 μg/μl）に加え、全量20 μlで37℃で３時間
反応した。反応後、７M尿素−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により単離精製した。 (i)ΔloopII ΔloopII forwardプライマー、5'-AGTAATACGACTCACTATA
GGGAGAATTCCGAGCTTCGGGATTTGAGGG-3'（配列番号１５）
とreverseプライマー、 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-
3'（配列番号１６）を用いた。G-9IをコードしたDNAを
鋳型とし、上記のプライマーを用いてPCRを行った（94
℃, 75 sec -> 45℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイ
クルを5回、次いで94℃, 75 sec -> 65℃, 75 sec -> 7
2℃, 135 secのサイクルを20回）。得られたDNA断片を
精製およびクローン化し、配列の確認を行った（M13 un
iversal primerを用い、ABI PRISM Big Dye Terminator
Cycle Sequencing Reaction Kit を用いた）。目的の
配列を持ったクローンを鋳型としてPCR断片を獲得し、
これらを試験管内転写によりRNAに転写して以下の実験
に用いた。 (ii)ΔstemII ΔstemII forwardプライマー、5'-AGTAATACGACTCACTATA
GGGAGAACCGACCAGAAGCTCTGGTTTGAGGG-3'（配列番号１
７） と reverseプライマー、5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGA
AAGG-3'（配列番号１６）を用い、上記 (i) と同様の操
作にて変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転
写して以下の実験に用いた。 (iii)NEO-I 合成NEO-I template DNA、5'- GGGAGAACCGAGCTTCGGTTTG
AGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3'（配列
番号１８）とNEO-I forwardプライマー、5'-AGTAATACGA
CTCACTATAGGGAGAACCGAGCTTCGG-3'（配列番号１９）とre
verseプライマー、5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'
（配列番号１６）を用い、PCRを行った（94℃, 75 sec
-> 45℃, 75 sec -> 72℃-> 135 secのサイクルを6回、
次いで94℃, 75 sec -> 65℃, 75 sec -> 72℃, 135 se
cのサイクルを12回）。得られたDNA断片を精製およびク
ローン化し、配列の確認を行った（M13 universal prim
erを用い、ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Seque
ncing Reaction Kitを用いた）。目的の配列を持ったク
ローンを鋳型としてPCR断片を獲得し、これらをRNAに転
写して以下の実験に用いた。 (iv)NEO-III 合成NEO-III template DNA、5'- GGGAGAACCAGCTGGTTTGA
GGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3'（配列
番号２０）とNEO-III forwardプライマー、5'-AGTAATAC
GACTCACTATAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3'（配列番号２１）
とreverseプライマー、 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-
3'（配列番号１６）を用い、上記(iii) と同様の操作に
て変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写し
て以下の実験に用いた。 (v)NEO-II 合成NEO-II template DNA、5'- GGGAGAACCGGCTCGGTTTGA
GGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT 3'（配列
番号２２）とNEO-II forwardプライマー、5'-AGTAATACG
ACTCACTATAGGGAGAACCGGCTCGGTT-3'（配列番号２３） と
reverseプライマー、 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'
（配列番号１６）を用い、上記 (iv) と同様の操作にて
変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して
以下の実験に用いた。 (vi)ΔNEO-III 合成NEO-III template DNA、5'- GGGAGAACCAGCTGGTTTGA
GGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCT-3'（配列番号２４）
とNEO-III forwardプライマー、5'-AGTAATACGACTCACTA
TAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3'（配列番号２１）とΔNEO-III
reverseプライマー、 5'-AGGAGAGAGGAAAGGTAGTCC-3'
（配列番号２２）を用い、上記(iii) と同様の操作にて
変異アプタマー遺伝子を作成し次いで、RNAに転写して
以下の実験に用いた。 (vii)NEO-III-14U 合成NEO-III-14U template DNA、5'- GGGAGAACCAGCTGGT
TTGAGGGTAGAATGGGACTACCTTTCCTCTCTCCTTTTTTTTTTTTTT-
3'（配列番号２５）とNEO-III forwardプライマー、5'-
AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCAGCTGGTTT-3'（配列番号
２１） とΔNEO-III-14U reverseプライマー、 5'- AAA
AAAAAAAAAAAGGAGAGAGGAAAGG -3'（配列番号２６）を用
い、上記(iii) と同様の操作にて変異アプタマー遺伝子
を作成し次いで、RNAに転写して以下の実験に用いた。
【００４４】［実施例２］ G9-I変異体アプタマーのFu
ll-NS3に対する結合性の測定 機能性RNA（ΔNEO-III、NEO-III-14U）の平衡解離定数
（Kd）は、32Pでラベルした一定量のRNAに対し、0.1か
ら700 nMのFull-NS3を結合させて算出した。RNAとFull-
NS3を含んだバインディングバッファー[50 mM Tris-HCl
(pH7.8)、30 mMNaCl、5 mM CaCl2、10 mM DTT]をニト
ロセルロース膜に通過させ、膜をバインディングバッフ
ァーで1回洗浄した。ニトロセルロース膜の放射活性を
もとに、スキャッチャードプロットを行い、解離平衡定
数を決定した。
ll-NS3に対する結合性の測定 機能性RNA（ΔNEO-III、NEO-III-14U）の平衡解離定数
（Kd）は、32Pでラベルした一定量のRNAに対し、0.1か
ら700 nMのFull-NS3を結合させて算出した。RNAとFull-
NS3を含んだバインディングバッファー[50 mM Tris-HCl
(pH7.8)、30 mMNaCl、5 mM CaCl2、10 mM DTT]をニト
ロセルロース膜に通過させ、膜をバインディングバッフ
ァーで1回洗浄した。ニトロセルロース膜の放射活性を
もとに、スキャッチャードプロットを行い、解離平衡定
数を決定した。
【００４５】［実施例３］ G9-I変異体アプタマーのFu
ll-NS3プロテアーゼ活性阻害効果の測定 まず、RNAアプタマーとFull-NS3プロテアーゼとP41をバ
ッファー[50 mM Tris-HCl (pH7.8)、30 mM NaCl、5 mM
CaCl2、10 mM DTT]中で、25℃で15分プレインキュベー
ションした。つぎに、基質であるS1（最終濃度49.8 μ
M）を加え、全量15 μlとし、25℃で、80分インキュベ
ートした。反応は最終濃度0.25 NとなるようにNaOH溶液
を加えて停止させた。この反応溶液を逆相HPLC（TSKgel
ODS-120T;4 ml）にロードし、50 mM酢酸アンモニウム
バッファー（pH 6.5）を含むアセトニトリルの濃度勾配
を用い、溶出、分析した。切断された基質の蛍光シグナ
ルにより、プロテアーゼ活性を算出した。
ll-NS3プロテアーゼ活性阻害効果の測定 まず、RNAアプタマーとFull-NS3プロテアーゼとP41をバ
ッファー[50 mM Tris-HCl (pH7.8)、30 mM NaCl、5 mM
CaCl2、10 mM DTT]中で、25℃で15分プレインキュベー
ションした。つぎに、基質であるS1（最終濃度49.8 μ
M）を加え、全量15 μlとし、25℃で、80分インキュベ
ートした。反応は最終濃度0.25 NとなるようにNaOH溶液
を加えて停止させた。この反応溶液を逆相HPLC（TSKgel
ODS-120T;4 ml）にロードし、50 mM酢酸アンモニウム
バッファー（pH 6.5）を含むアセトニトリルの濃度勾配
を用い、溶出、分析した。切断された基質の蛍光シグナ
ルにより、プロテアーゼ活性を算出した。
【００４６】［実施例４］ G9-I変異体アプタマーのFu
ll-NS3ヘリカーゼ活性阻害効果の測定 ヘリカーゼ活性を測定する際にもちいる基質は、バクテ
リオファージM13mp181本鎖DNAと、T4ポリヌクレオチド
キナーゼを用いて5'末端を[γ-32P]ATPでラベルした30
塩基からなる相補的なオリゴヌクレオチド5'-AGGTCGACT
CTAGAGGATCCCCGGGTACCG-3'（配列番号２７）をアニーリ
ングさせることで得た。アニーリングは20 mM Tris-HCl
(pH7.8)、0.5 M NaCl、1 mM EDTAの溶液中で、94℃で3
分変性させ、その後緩やかに25℃にすることで行った。
さらに、Microcon Centrifugal Filter Device YM-50
(MILLIPORE) をもちいたゲルフィルトレーションにより
精製し、これをヘリカーゼ活性の測定に使用した。Full
-NS3 1.8 μMをRNAインヒビターとともに、反応液[25 m
M MOPS-NaOH (pH7.0)、2.5 mM DTT、100 μg/ml BSA
（ウシ血清アルブミン）、3 mM MgCl2、3 mMATP]中（全
量20μl）で、室温で20分プレインキュベーションし
た。このあと2.6fmolの基質を加え、37℃で30分インキ
ュベーションした。反応の停止は、停止溶液[0.1 M Tri
s-HCl (pH7.6、20 mM EDTA、0.5% SDS、0.1% Nonidet P
-40、0.1% bromophenol blue、 0.1% xylene cyanol、2
5% glycerol)を加えることで行った。このようにして得
られた反応液を0.5xTris-borate-EDTAを含む8% PAGEを
行い、BAS2000（富士フィルム）で基質の2重鎖がほどか
れている様子を解析することによりヘリカーゼ活性を算
出した。
ll-NS3ヘリカーゼ活性阻害効果の測定 ヘリカーゼ活性を測定する際にもちいる基質は、バクテ
リオファージM13mp181本鎖DNAと、T4ポリヌクレオチド
キナーゼを用いて5'末端を[γ-32P]ATPでラベルした30
塩基からなる相補的なオリゴヌクレオチド5'-AGGTCGACT
CTAGAGGATCCCCGGGTACCG-3'（配列番号２７）をアニーリ
ングさせることで得た。アニーリングは20 mM Tris-HCl
(pH7.8)、0.5 M NaCl、1 mM EDTAの溶液中で、94℃で3
分変性させ、その後緩やかに25℃にすることで行った。
さらに、Microcon Centrifugal Filter Device YM-50
(MILLIPORE) をもちいたゲルフィルトレーションにより
精製し、これをヘリカーゼ活性の測定に使用した。Full
-NS3 1.8 μMをRNAインヒビターとともに、反応液[25 m
M MOPS-NaOH (pH7.0)、2.5 mM DTT、100 μg/ml BSA
（ウシ血清アルブミン）、3 mM MgCl2、3 mMATP]中（全
量20μl）で、室温で20分プレインキュベーションし
た。このあと2.6fmolの基質を加え、37℃で30分インキ
ュベーションした。反応の停止は、停止溶液[0.1 M Tri
s-HCl (pH7.6、20 mM EDTA、0.5% SDS、0.1% Nonidet P
-40、0.1% bromophenol blue、 0.1% xylene cyanol、2
5% glycerol)を加えることで行った。このようにして得
られた反応液を0.5xTris-borate-EDTAを含む8% PAGEを
行い、BAS2000（富士フィルム）で基質の2重鎖がほどか
れている様子を解析することによりヘリカーゼ活性を算
出した。
【００４７】［実施例５］ G9-I変異体アプタマーによ
る、Full-NS3とHCV RNAの3'末端のプラスおよびマイナ
ス鎖との結合の阻害効果の測定 まずプローブ作製を以下の手順で行った。3'(+) UTRプ
ローブの作製のために、プラス鎖のvariable region-po
ly U/C stretch-98 nucleotide X region (164ヌクレオ
チド) に相当するcDNAを、プラスミドp5'IL-3'Xを鋳型
として5'-AGTAATACGACTCACTATAGGAACGGGGAGCTAAACACTCC
-3'（配列番号２８）と5'-ACATGATCTGCAGAGAGGCC-3'
（配列番号２９）のプライマーを用いて増幅した。3'
(-) UTRプローブの作製ために、HCV ゲノムの5'UTR (1-
127) に相当するcDNAを、プラスミドp5'IL-3'X由来の配
列を鋳型として、 5'-TGTAATACGACTCACTATAGGGAGGGGGGG
TCCTGGAGG-3'（配列番号３０）と5'-GCCAGCCCCCGATTGGG
GG-3'（配列番号３１）のプライマーを用いて増幅し
た。プライマー配列中の下線は、T７RNA プロモーター
配列を意味する。得られた二つのDNA断片を鋳型とし
て、α-32p-CTP (Amersham)の存在下、T7 Ampliscribe
kit (Epicentre Technologies)を用いて転写反応を行っ
た。得られたそれぞれの断片を回収し、以下の実験操作
に用いた。NEO-III-14U（図 8A. 3'(+) UTRに対して5,
25, 50 and 100 μM、 図8B. 3'(-) UTRに対して10, 5
0, 100 and 200 μM)を含む反応液（5 mM HEPES (pH 7.
9),20 mM DTT, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 0.5% glycero
l, 2 mM ATP、15 μg E. coli tRNAそしてFull-NS3；3'
(+) UTRに対して0.2 μM、3'(-) UTRに対して0.4 μM）
を室温で30分間プレインキュベーションした。次に3'
(+) UTRプローブ（図 8A. 2.0 μM）もしくは3'(-) UTR
プローブ（図 8B. 4.0 μM）をそれぞれの反応液に加え
て（全量25 μl）、30℃で15分間インキュベーションし
た。反応液をニトロセルロース膜に通過させ、結合活性
をBAS2000によって解析した。
る、Full-NS3とHCV RNAの3'末端のプラスおよびマイナ
ス鎖との結合の阻害効果の測定 まずプローブ作製を以下の手順で行った。3'(+) UTRプ
ローブの作製のために、プラス鎖のvariable region-po
ly U/C stretch-98 nucleotide X region (164ヌクレオ
チド) に相当するcDNAを、プラスミドp5'IL-3'Xを鋳型
として5'-AGTAATACGACTCACTATAGGAACGGGGAGCTAAACACTCC
-3'（配列番号２８）と5'-ACATGATCTGCAGAGAGGCC-3'
（配列番号２９）のプライマーを用いて増幅した。3'
(-) UTRプローブの作製ために、HCV ゲノムの5'UTR (1-
127) に相当するcDNAを、プラスミドp5'IL-3'X由来の配
列を鋳型として、 5'-TGTAATACGACTCACTATAGGGAGGGGGGG
TCCTGGAGG-3'（配列番号３０）と5'-GCCAGCCCCCGATTGGG
GG-3'（配列番号３１）のプライマーを用いて増幅し
た。プライマー配列中の下線は、T７RNA プロモーター
配列を意味する。得られた二つのDNA断片を鋳型とし
て、α-32p-CTP (Amersham)の存在下、T7 Ampliscribe
kit (Epicentre Technologies)を用いて転写反応を行っ
た。得られたそれぞれの断片を回収し、以下の実験操作
に用いた。NEO-III-14U（図 8A. 3'(+) UTRに対して5,
25, 50 and 100 μM、 図8B. 3'(-) UTRに対して10, 5
0, 100 and 200 μM)を含む反応液（5 mM HEPES (pH 7.
9),20 mM DTT, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 0.5% glycero
l, 2 mM ATP、15 μg E. coli tRNAそしてFull-NS3；3'
(+) UTRに対して0.2 μM、3'(-) UTRに対して0.4 μM）
を室温で30分間プレインキュベーションした。次に3'
(+) UTRプローブ（図 8A. 2.0 μM）もしくは3'(-) UTR
プローブ（図 8B. 4.0 μM）をそれぞれの反応液に加え
て（全量25 μl）、30℃で15分間インキュベーションし
た。反応液をニトロセルロース膜に通過させ、結合活性
をBAS2000によって解析した。
【００４８】
【発明の効果】本発明により、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ
３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新規機能
性核酸が提供された。本発明の新規機能性核酸は、Ｃ型
肝炎の診断、予防および／または治療に有効である。
３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新規機能
性核酸が提供された。本発明の新規機能性核酸は、Ｃ型
肝炎の診断、予防および／または治療に有効である。
【００４９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. <120> NEW FUNCTIONAL NUCLEIC ACIDS TARGETING NS3 PROTEASE AND HELICASE OF HEPATITIS C VIRUS <130> P01-039 <140> <141> <160> 31 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 1 gggagaauuc cgaccagaag cuucgggauu ugaggguaga augggacuac cuuuccucuc 60 uccuuccucu ucu 73 <210> 2 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 2 gggagaauuc cgaccagaag ugcucuuaga augggacuaa gacacgggac ccuuuccucu 60 cuccuuccuc uucu 74 <210> 3 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 3 gggagaauuc cgaccagaag uacgacacga uugggacgug ucuaugggac ccuuuccucu 60 cuccuuccuc uucu 74 <210> 4 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 4 gggagaauuc cgagcuucgg gauuugaggg uagaauggga cuaccuuucc ucucuccuuc 60 cucuucu 67 <210> 5 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 5 gggagaaccg accagaagcu ucgguuugag gguagaaugg gacuaccuuu ccucucuccu 60 uccucuucu 69 <210> 6 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 6 gggagaaccg agcuucgguu ugaggguaga augggacuac cuuuccucuc uccuuccucu 60 ucu 63 <210> 7 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 7 gggagaacca gcugguuuga ggguagaaug ggacuaccuu uccucucucc uuccucuucu 60 <210> 8 <211> 61 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 8 gggagaaccg gcucgguuug aggguagaau gggacuaccu uuccucucuc cuuccucuuc 60 u 61 <210> 9 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 9 gggagaacca gcugguuuga ggguagaaug ggacuaccuu uccucucucc uu 52 <210> 10 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 10 gggagaacca gcugguuuga ggguagaaug ggacuaccuu uccucucucc uuuuuuuuuu 60 uuuuu 65 <210> 11 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 11 gggagaauuu gaggguagaa ugggacuacc uuuccucucu ccu 43 <210> 12 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 12 gggagauuug aggguagaau gggacuaccu uuccccucuc cu 42 <210> 13 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 13 gggagauuga ggguagaaug ggacuaccuu uccccucucc u 41 <210> 14 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RNA <400> 14 gggagaugag gguagaaugg gacuaccuuu ccccucuccu 40 <210> 15 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 15 agtaatacga ctcactatag ggagaattcc gagcttcggg atttgaggg 49 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 16 agaagaggaa ggagagagga aagg 24 <210> 17 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 17 agtaatacga ctcactatag ggagaaccga ccagaagctc tggtttgagg g 51 <210> 18 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 18 gggagaaccg agcttcggtt tgagggtaga atgggactac ctttcctctc tccttcctct 60 tct 63 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 19 agtaatacga ctcactatag ggagaaccga gcttcgg 37 <210> 20 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 20 gggagaacca gctggtttga gggtagaatg ggactacctt tcctctctcc ttcctcttct 60 <210> 21 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 21 agtaatacga ctcactatag ggagaaccag ctggttt 37 <210> 22 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 22 gggagaaccg gctcggtttg agggtagaat gggactacct ttcctctctc cttcctcttc 60 t 61 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 23 agtaatacga ctcactatag ggagaaccgg ctcggtt 37 <210> 24 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 24 gggagaacca gctggtttga gggtagaatg ggactacctt tcctctctcc t 51 <210> 25 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 25 gggagaacca gctggtttga gggtagaatg ggactacctt tcctctctcc tttttttttt 60 tttt 64 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 26 aaaaaaaaaa aaaaggagag aggaaagg 28 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 27 aggtcgactc tagaggatcc ccgggtaccg 30 <210> 28 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 28 agtaatacga ctcactatag gaacggggag ctaaacactc c 41 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 29 acatgatctg cagagaggcc 20 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 30 tgtaatacga ctcactatag ggaggggggg tcctggagg 39 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 31 gccagccccc gattggggg 19
【００５０】
【配列番号１】配列番号１は、G9-Iの塩基配列を示す。
【００５１】
【配列番号２】配列番号２は、G9-IIの塩基配列を示
す。
す。
【００５２】
【配列番号３】配列番号３は、G9-IIIの塩基配列を示
す。
す。
【００５３】
【配列番号４】配列番号４は、ΔLoopIIの塩基配列を示
す。
す。
【００５４】
【配列番号５】配列番号５は、ΔStemIIの塩基配列を示
す。
す。
【００５５】
【配列番号６】配列番号６は、NEO-Iの塩基配列を示
す。
す。
【００５６】
【配列番号７】配列番号７は、NEO-IIIの塩基配列を示
す。
す。
【００５７】
【配列番号８】配列番号８は、NEO-IIの塩基配列を示
す。
す。
【００５８】
【配列番号９】配列番号９は、ΔNEO-IIIの塩基配列を
示す。
示す。
【００５９】
【配列番号１０】配列番号１０は、NEO-III-14Uの塩基
配列を示す。
配列を示す。
【００６０】
【配列番号１１】配列番号１１は、dRIIの塩基配列を示
す。
す。
【００６１】
【配列番号１２】配列番号１２は、dRII-Δ7Aの塩基配
列を示す。
列を示す。
【００６２】
【配列番号１３】配列番号１３は、dRII-Δ7A8Uの塩基
配列を示す。
配列を示す。
【００６３】
【配列番号１４】配列番号１４は、dRII-Δ7A8U9Uの塩
基配列を示す。
基配列を示す。
【００６４】
【配列番号１５】配列番号１５は、ΔloopII forwardプ
ライマーの塩基配列を示す。
ライマーの塩基配列を示す。
【００６５】
【配列番号１６】配列番号１６は、reverseプライマー
の塩基配列を示す。
の塩基配列を示す。
【００６６】
【配列番号１７】配列番号１７は、ΔstemII forwardプ
ライマーの塩基配列を示す。
ライマーの塩基配列を示す。
【００６７】
【配列番号１８】配列番号１８は、NEO-Iを合成するた
めの鋳型DNAの塩基配列を示す。
めの鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００６８】
【配列番号１９】配列番号１９は、NEO-I forwardプラ
イマーの塩基配列を示す。
イマーの塩基配列を示す。
【００６９】
【配列番号２０】配列番号２０は、NEO-IIIを合成する
ための鋳型DNAの塩基配列を示す。
ための鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００７０】
【配列番号２１】配列番号２１は、NEO-III forwardプ
ライマーの塩基配列を示す。
ライマーの塩基配列を示す。
【００７１】
【配列番号２２】配列番号２２は、NEO-IIを合成するた
めの鋳型DNAの塩基配列を示す。
めの鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００７２】
【配列番号２３】配列番号２３は、NEO-II forwardプラ
イマーの塩基配列を示す。
イマーの塩基配列を示す。
【００７３】
【配列番号２４】配列番号２４は、NEO-IIIを合成する
ための鋳型DNAの塩基配列を示す。
ための鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００７４】
【配列番号２５】配列番号２５は、NEO-III-14Uを合成
するための鋳型DNAの塩基配列を示す。
するための鋳型DNAの塩基配列を示す。
【００７５】
【配列番号２６】配列番号２６は、ΔNEO-III-14U reve
rseプライマーの塩基配列を示す。
rseプライマーの塩基配列を示す。
【００７６】
【配列番号２７】配列番号２７は、ヘリカーゼ活性を測
定する際に用いた基質の塩基配列を示す。
定する際に用いた基質の塩基配列を示す。
【００７７】
【配列番号２８】配列番号２８は、3'(+) UTRプローブ
の作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
の作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７８】
【配列番号２９】配列番号２９は、3'(+) UTRプローブ
の作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
の作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７９】
【配列番号３０】配列番号３０は、3'(-) UTRプローブ
の作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
の作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００８０】
【配列番号３１】配列番号３１は、3'(-) UTRプローブ
の作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
の作製のために用いたプライマーの塩基配列を示す。
【図１】G9-I、G9-IIおよびG9-IIIアプタマーの二次構
造を示す。
造を示す。
【図２】G9-Iアプタマーの変異体の二次構造を示す。
【図３】G9-Iアプタマーの変異体の二次構造を示す。
【図４】G9-I変異体のプロテアーゼ活性阻害効果を示
す。
す。
【図５】Full-NS3に対するRNAリガンドの結合曲線を示
す。
す。
【図６】NEO-III-14Uのプロテアーゼ活性阻害効果を示
す。
す。
【図７】NEO-III-14Uのヘリカーゼ活性阻害効果を示
す。
す。
【図８】G9-I変異体アプタマーによる、Full-NS3とHCV
RNAの3'末端のプラスおよびマイナス鎖との結合の阻害
効果を示す。
RNAの3'末端のプラスおよびマイナス鎖との結合の阻害
効果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 31/14 31/14 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｑ 1/06 Ｃ１２Ｑ 1/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 福田 宏太郎 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所つくばセンター内 (72)発明者 舩路 浩平 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三 菱瓦斯化学株式会社本社内 (72)発明者 浦上 貞治 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三 菱瓦斯化学株式会社本社内 (72)発明者 関矢 聡 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所つくばセンター内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA19 BA80 CA02 CA09 CA11 CA20 DA03 FA01 GA11 HA11 HA17 HA20 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ08 QQ10 QR35 QR38 QR56 QS32 QX02 4C084 AA13 NA14 ZA751 ZB331 ZC202 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA75 ZB33 ZC20 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA75 ZB33 ZC20
Claims (11)
- 【請求項１】 下記の塩基配列(1)を有し、ＨＣＶのＮ
Ｓ３プロテアーゼおよび／またはＮＳ３ヘリカーゼを阻
害することができるＲＮＡ分子。 5'-Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｘ−Ｂ-3' (1) （配列中、Ａは5'-GGGAGA-3'であり、ＸおよびＹは互い
に相補的な塩基数が３〜９個の塩基配列であり、Ｎは塩
基数が３〜７個の塩基配列であり、Ｂは5'-UUGAGGGUAGA
AUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCU-3'であるが、但し、Ｎ、Ｘ
およびＹの塩基配列の塩基数の合計は２２個以下であ
る。） - 【請求項２】 下記の二次構造(I)をとることができる
請求項１記載のＲＮＡ分子。 【化１】 （二次構造中、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニ
ン、Uはウラシルであり、iは３〜９のいずれかの整数で
あり、jは３〜７のいずれかの整数であるが、但し、２i
＋j≦２２であり、ｎ1〜ｎjは、それぞれ独立に、いず
れかの核酸塩基であり、ｘ1〜ｘiおよびｙ1〜ｙiは、そ
れぞれ独立に、いずれかの核酸塩基であるが、但し、ｘ
kとｙk(ｋ＝1〜i)は互いに相補的な塩基であり、核酸塩
基間をつなぐ実線は相補的塩基対の形成を示し、核酸塩
基間の黒丸はワブル塩基対の形成を示す。） - 【請求項３】 塩基配列(1)または二次構造(I)の３'末
端のUの後に、さらに少なくとも14個のU（Uはウラシル
である。）を有する請求項１または２記載のＲＮＡ分
子。 - 【請求項４】 塩基配列(1)または二次構造(I)の３'末
端のUの後に、さらに１個のU（Uはウラシルである。）
を有する請求項１または２記載のＲＮＡ分子。 - 【請求項５】 塩基配列(1)または二次構造(I)の３'末
端のUの後に、さらに5'-UCCUCUUCU-3'（配列中、Uはウ
ラシルであり、Cはシトシンである。）の塩基配列を有
する請求項１または２記載のＲＮＡ分子。 - 【請求項６】 下記の(i)〜(vii)のいずれかの塩基配列
を有する請求項１または２記載のＲＮＡ分子。 (i) ΔLoopII 5'-GGGAGAAUUCCGAGCUUCGGGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUU
UCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号４） (ii) ΔStemII 5'-GGGAGAACCGACCAGAAGCUUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACC
UUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号５） (iii) NEO-I 5'-GGGAGAACCGAGCUUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCU
CUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号６） (iv) NEO-III 5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUC
UCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号７） (v) NEO-II 5'-GGGAGAACCGGCUCGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCU
CUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号８） (vi) ΔNEO-III 5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUC
UCCUU-3'（配列番号９） (vii) NEO-III-14U 5'-GGGAGAACCAGCUGGUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUC
UCCUUUUUUUUUUUUUUU-3'（配列番号１０） - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載のＲＮＡ
分子をコードするＤＮＡを転写因子の制御下に含む発現
ベクター。 - 【請求項８】 請求項１〜６のいずれかに記載のＲＮＡ
分子または請求項７記載の発現ベクターを有効成分とし
て含む、医薬組成物。 - 【請求項９】 ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼおよび／ま
たはＮＳ３ヘリカーゼを阻害するための請求項８記載の
医薬組成物。 - 【請求項１０】 Ｃ型肝炎を予防および／または治療す
るための請求項８記載の医薬組成物。 - 【請求項１１】 請求項１〜６のいずれかに記載のＲＮ
Ａ分子を有効成分として含み、Ｃ型肝炎を診断するため
の請求項８記載の医薬組成物。
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|---|---|---|---|
| JP2001156957A JP4779089B2 (ja) | 2001-05-25 | 2001-05-25 | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新規機能性核酸 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001156957A JP4779089B2 (ja) | 2001-05-25 | 2001-05-25 | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新規機能性核酸 |
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|---|---|
| JP2002345475A true JP2002345475A (ja) | 2002-12-03 |
| JP4779089B2 JP4779089B2 (ja) | 2011-09-21 |
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ID=19000891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001156957A Expired - Lifetime JP4779089B2 (ja) | 2001-05-25 | 2001-05-25 | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新規機能性核酸 |
Country Status (1)
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11137252A (ja) * | 1997-11-07 | 1999-05-25 | Agency Of Ind Science & Technol | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子 |
| JP2000508521A (ja) * | 1996-01-23 | 2000-07-11 | バイロファーマ・インコーポレイテッド | Ｒｎａウイルス阻害剤の同定方法 |
-
2001
- 2001-05-25 JP JP2001156957A patent/JP4779089B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000508521A (ja) * | 1996-01-23 | 2000-07-11 | バイロファーマ・インコーポレイテッド | Ｒｎａウイルス阻害剤の同定方法 |
| JPH11137252A (ja) * | 1997-11-07 | 1999-05-25 | Agency Of Ind Science & Technol | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子 |
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|---|---|
| JP4779089B2 (ja) | 2011-09-21 |
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