KR20090015118A - Ｒｅｇ１ 항응고계의 투여 - Google Patents

Abstract

숙주에서 혈액 응고를 조절하는 앱타머 및 해독제계의 개선된 투여 방법은 원하는 약역학 반응을 제공하도록 상기 계의 성분의 중량으로 조정되거나 체질량 지수로 조정되는 투여에 기초하여 제공된다. 또한, 앱타머의 활성을 원하는 정도로 역전시키는 방법은 해독제 용량이 앱타머 용량만 대한 이의 관계에만 기초한다.

Description

ＲＥＧ１ 항응고계의 투여 {ADMINISTRATION OF THE REG1 ANTICOAGULATION SYSTEM}

관련 출원의 상호 참조:

본 출원은 이들의 개시가 전체로서 본 명세서에 포함되는 모두 "REG1 항응고 계의 투여"란 명칭의 2006년 5월 26일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/808,987호, 2006년 9월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/847,809호, 및 2006년 11월 10일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/865,352호에 대한 우선권을 주장한다.

숙주의 혈액 응고를 조절하는 앱타머 및 해독제계의 개선된 투여 방법은 체중으로 조정되거나 체질량 지수로 조정되는 계의 성분의 투여에 기초하여 주어진다.

급성 질환 치료용 항응고 요법

급성 허혈성 심장 질환의 병리생물학에 있어서의 혈전증의 중심적인 역할을 고려하면, 항응고주사제는 급성 관상동맥 증후군, 예컨대 불안정 협심증, 및 심근 경색증을나타내는 환자 및 관상동맥 혈관 재생술을 받는 환자에 대한 의학적 치료의 토대가 되어왔다 (Harrington et al., 2004; Popma et al., 2004). 시판용 항응고제로는 미분획 헤파린 (UFH), 저분자량 헤파린 (LMWH), 및 트롬빈 직접 저해제 (DTI), 예컨대 재조합 히루딘, 비발리루딘, 및 아르가트로반을 들 수 있다. 항응고제 용도 및 항혈전제 연속 개발에 대한 현재 패러다임은 허혈성 이벤트의 위험성 감소를 의미하는 효능과, 출혈 위험성을 최소화하는 안전성 사이의 균형을 확보하는 것이다 (Harrington et al., 2004). 각 시판용 약제는 플라시보에 관한 증가된 출혈 위험성을 지니고 있다.

항응고제 및 항혈전제와 관련된 주요 유해 사례는 출혈로, 이는 영구적 장애 및 사망의 원인이 될 수 있다 (Ebbesen et al., 2001; Levine et al., 2004). 일반적으로, 심장혈관 임상의는 약물이 급성 관상동맥 증후군 또는 관상동맥 혈관 재생술의 허혈성 합병증을 감소시킬 수 있는 경우에는, 기꺼이 증가된 출혈 위험성과 교환해왔다. 그러나, 최근의 데이터에 의하면, 출혈 사례, 특히 수혈을 요하는 출혈 사례는 ACS에 걸린 환자의 치료 성과 및 치료비에 큰 영향을 미치는 것으로 제시되어 있다. 선택적 관상동맥 우회로 이식 (CABG) 술을 받는 환자에 있어서의 수혈 비율은 30 내지 60%의 범위이고, 이러한 환자에 있어서의 수혈은 증가된 조기, 중기 및 장기 사망률과 관련되어 있다 (Bracey et al., 1999; Engoren et al., 2002; Hebert et al., 1999). 출혈은 또한 경피 관상동맥 중재술 (PCI)과 관련된 가장 흔한 비용이 많이 드는 합병증으로, 환자의 5 내지 10%는 $8000 내지 $12,000의 증분 비용으로 수혈이 이루어진다 (Moscucci, 2002). 또한, ACS에 대한 치료를 받는 환자에 있어서의 다량의 출혈 빈도가 5% 내지 10%의 범위 (CABG를 받는 환자를 제외하고)로 마찬가지로 높고, 출혈 및 수혈은 독립적으로 상당히 증가된 조기 사망률과 관련되어 있다 (Moscucci et al., 2003; Rao et al., 2004). 따라서, 신규한 항혈전제의 연속 개발에도 불구하고, 보다 안전한 항응고제에 대하여 상당한 임상적 필요성이 존재한다.

약물 활성의 급속한 회복은 역전시키는 수단으로서 주입 종료와 함께 불용융성 약제로서의 약물의 제형에 의해 수동적으로, 또는 약물의 활성을 중화시킬 수 있는 제 2 약제, 해독제의 투여를 통해 능동적으로 달성될 수 있다.

급성 허혈성 심장 질환에 걸린 입원 환자에 관해서는, 이상적인 항응고제는 정맥 또는 피하 주사에 의해 전달가능하고, 빈번한 모니터링을 요하지 않도록 즉시 효과적이고, 용이하게 투여되며, 즉시 예상가능하게 가역적일 것이다.

문제에 대처하는 현재의 해결책

UFH는 현재 사용이 승인된 유일한 해독제 가역성 항응고제이다. 그러나, UFH는 상당한 제약이 따른다. 첫째로, 헤파린은 이의 사용 예측가능성이 문제가 되는 복잡한 약물동태를 갖고 있다 (Granger et al., 1996). 둘째로, 이의 해독제, 프로타민의 용량 예측가능성이 문제가 되며, 이의 사용과 관련된 심각한 부작용이 있다 (Carr and Silverman, 1999; Welsby et al., 2005). 최종적으로, 헤파린은 혈소판 감소증 (HIT) 및 혈전증을 동반하는 혈소판 감소증 (HITT)을 유발할 수 있다 (Warkentin, 2005; Warkentin and Greinacher, 2004).

이러한 제약에도 불구하고, 헤파린은 주로 "가역적"이기 때문에, 입원 환자에 있어서 가장 통상적으로 사용되는 항응고제로 남는다. 차세대 항응고제, 예컨대 LMWH는 UFH 투여 예측가능성을 개선시킨 것으로, 이의 일상적인 사용의 일부로서 실험실에 준한 모니터링을 요하지 않는다. HIT 및 HITT는 UFH와 비교하여, LMWH에 의해서는 보다 적게 관찰되나, 이러한 위험성을 제거시키지는 못했다. 세가지의 시판용 DTI 중 두가지, 레피루딘 및 아르가트로반은 특히 HIT가 발병되거나 HIT 병력이 있는 환자에 있어서의 사용에 승인되어 있다. 비발리루딘은 PCI 시의 항응고제로서의 사용이 승인되어 있으므로, HIT를 앓는 환자에 있어서의 매력적인 UFH의 대체수단을 제공한다. 그러나, 외과적 또는 경피 관상동맥 혈관 재생술을 받는 환자에 있어서의 이들의 사용에 대하여 특별한 위험성을 나타내는 LMWH, DTI의 항응고 효과를 역전시키는 직접적이고 분명한 해독제는 없다 (Jones et al., 2002). LMWH 또는 DTI로 치료된 환자에 있어서의 출혈은 응고 인자를 포함하여, 혈액 제제를 투여함으로써 처리된다.

혈액 응고 및 FIX

세포에 기초한 응고 모델 (도 1)은 생리적 응고가 생체 내에서 어떻게 일어나는지를 추정하는 가장 명확한 설명을 제공한다 (Hoffman et al., 1995; Kjalke et al., 1998; Monroe et al., 1996).

이러한 모델에 따르면, 응고 촉진 반응은 3개의 별개의 단계, 즉 개시, 증폭 및 전파로 일어난다. 응고 개시는 조직 인자를 갖는 세포, 예컨대 활성화 단구, 대식세포, 및 내피세포에서 일어난다. 조직 인자와 복합체를 형성하는 응고 인자 VIIa는 응고 인자 IX (FIX) 및 X (FX)의 활성화를 촉진시켜, 프로트롬빈으로부터 소량의 트롬빈을 발생시킨다. 증폭 단계 (프라이밍 (priming) 단계로도 명명됨)에서, 개시 단계에서 소량의 트롬빈은 응고 인자 V, VIII, 및 XI를 활성화시키고, 또한 혈소판을 활성화시키며, 응고 촉진 반응이 일어나는 표면을 공급한다. 생체내 에서, 증폭 단계시에 발생된 소량의 트롬빈은 내인성 트롬빈 저해제로 불리우는 세르핀, 예컨대 항트롬빈 III, α-2-마크로글로불린 및 헤파린 보조 인자 II의 존재로 인해, 피브리노겐을 피브린으로 전환시키기에 충분하지 않다. 응고 촉진 반응의 최종 단계, 전파는 배타적으로 활성화된 혈소판의 표면에서 일어난다. 전파 시에, 충분량의 FIXa는 FIX의 FXIa로 촉진되는 활성화에 의해 발생된다. FIXa는 이의 필수 보조 인자 FVIIIa와 복합체를 형성하며, FX를 활성화한다. 이어서, FXa는 이의 필수 보조 인자 FVa와 복합체를 형성한다. FXa-FVa 복합체는 프로트롬빈을 활성화시키며, 이는 트롬빈 생성 및 피브린 침착의 "버스트 (burst)"를 유도한다. 최종 결과는 안정한 혈병의 형성이다.

이러한 모델에 기초하여, FIXa는 응고에서 두가지 역할을 한다. 개시 단계에서, FIXa는 FX의 FXa로의 활성화 및 후속 프로트롬빈 활성화를 통해 소량의 트롬빈을 생성시키는데 있어서 중요한 역할을 한다. 그러나, 이러한 FIXa의 역할은 FX의 FXa로의 조직 인자 FVIIa로 촉진되는 전환을 적어도 부분적으로 과잉되게 한다. 더욱 중요한 FIXa의 역할은 전파 단계에서 일어나며, FVIIIa/FIXa 효소 복합체는 활성화된 혈소판 표면에서의 FXa 생성에 대한 유일한 촉매로서 작용한다. 따라서, FIX에서의 유전적 결손 (즉, 혈우병 B) 또는 FIX/IXa의 약리학적 저해로 인한 FIXa 활성 감소는 응고에 대하여 여러 가지 영향을 부여하는 것으로 예기된다. 첫째, FIXa 활성 저해 또는 손실은 응고 개시를 부분적으로 저하시킨다. 둘째, FIXa 활성 저해 또는 손실은 응고 전파 단계에 큰 영향을 미치며, 그 결과 트롬빈 생성이 상당히 감소되거나 제거된다. 최종적으로, 전파 단계 시의 트롬빈 생성 한계는 혈 소판 및 업스트림 응고 인자, 예컨대 인자 V, VIII 및 XI의 활성화를 감소시킴으로써 응고의 피드백 증폭을 적어도 부분적으로 저해시킬 것이다.

종래의 FIXa 저해제의 동물 및 인간 평가

FIX 활성 저해제, 예컨대 활성 부위로 불활성화된 인자 IXa (FIXai) 또는 FIX에 대한 모노클로널 항체 (예를 들면, 항체 BC2)는 동맥 혈전증 및 발작의 각종 동물 모델을 포함하여, 다수의 동물 모델에서 강력한 항응고제 및 항혈전제 활성을 나타내었다 (Benedict et al., 1991; Choudhri et al., 1999; Feuerstein et al., 1999; Spanier et al., 1998a; Spanier et al., 1997; Spanier et al., 1998b; Toomey et al., 2000). 일반적으로, 이러한 연구에 따르면, FIXa 저해제는 동물에 있어서 미분획 헤파린보다 출혈 위험성에 대한 항혈전제 활성의 비율이 더 높은 것으로 나타났다. 그러나, 이러한 연구에 있어서, 유효량보다 조금 더 높은 용량에서는, 이러한 약제로 처리된 동물은 헤파린과 동일한 출혈 프로파일을 나타내었다. 적절히 컨트롤된 동물 연구에 있어서의 이러한 경험은 임상 세팅에서, FIXa 저해제의 활성을 제어하는 능력이 이의 안전성을 향상시키고 이의 의학적 사용을 촉진시키는 것을 시사한다. 또한, FIXai는 합성 패치 혈관 수복의 래빗 모델 및 심폐 바이패스를 이용한 CABG의 개 및 비인간 영장류 모델을 포함하여, 항응고 요법을 요하는 다수의 동물 외과 수술 모델에 있어서의 헤파린 대체물로서 안전하고 유용한 것으로 밝혀졌다 (Spanier et al., 1998a; Spanier et al., 1997; Spanier et al., 1998b). FIXai는 또한 온정적인 케어 기준 (compassionate care basis)으로 콜롬비아 의과대학 (Columbia College of Physicians and Surgeons)의 의사에 의해 심 폐 바이패스를 요하는 다수의 중증 환자 및 다른 체외 순환로의 세팅, 예컨대 체외 막형 산소화에서 성공적으로 사용되어 왔다 (Spanier et al., 1998a). 따라서, FIXa는 관상동맥 혈관 재생술의 항응고 요법 (CABG 및 PCI), 및 급성 관상동맥 증후군에 걸린 환자에 있어서의 혈전증의 치료 및 예방에 대한 유효 타겟이다.

앱타머 약물 개발, 약물-해독제 쌍, 및 REG1

조절된 항응고를 부여하는 하나의 해결책으로는 특히 주요 항응고제에 결합하여 중화시킬 수 있는 제 2 약제와 병용하여, 비교적 저 용량으로 임상적으로 적절한 활성을 달성할 수 있는 ∼12 시간 이상의 중간 내지 장기간 작용을 갖는 항응고제를 사용하는 것이다. 이러한 "약물-해독제" 병용제는 약물의 항응고 활성의 예측가능한 안전한 중화 및 역전을 확보할 수 있다 (Rusconi et al., 2004, Nat Biotechnol. 22(11):1423-8; Rusconi et al., 2002, Nature 419(6902):90-4).

본 발명자들은 REG1, 앱타머계 항응고계의 개발에 대한 약물-해독제 기술을 적용하였다 (도 2 참조). 앱타머는 모노클로널 항체와 같이, 타겟 단백질에 대하여 고 친화성 및 특이성으로 결합하는 1본쇄 핵산이다 (Nimjee et al., 2005). 그러나, 앱타머가 타겟 단백질에 결합하여 이를 억제하기 위해서는, 앱타머는 특정한 구상 삼차 구조를 채택해야 한다. 이러한 구상 삼차 구조의 형성은 적절한 이차 구조를 채택하도록 앱타머를 필요로 한다 (즉, 정확한 염기쌍 및 비염기쌍 영역).

도 2의 카툰에 도시된 바와 같이, 일부의 앱타머에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 도입으로, 앱타머 구조를 변화시키므로, 이의 타겟 단백질에 더 이상 결합할 수 없어서, 앱타머 약물의 생리학적 활성을 효과적으로 역전시키거나 중화시킬 수 있다 (Rusconi et al., 2004, Nat Biotechnol. 22(11):1423-8; Rusconi et al., 2002, Nature 419(6902):90-4).

RB006 (P-L-guggaCUaUaCCgCgUaaUgCuGcCUccacT (여기서, P = mPEG2-NHS 에스테르 MW 40 kDa; L = C6 NH₂ 링커; G = 2-OH G; g = 2'-O-Me G; C = 2-F C; c = 2'-O-Me C; U = 2-F U; u = 2'-O-Me U; a = 2-O-Me A; 및 T = 역위 2'-H T (서열 번호 1); 도 2 참조), REG1의 약물 성분은 고 친화성 및 특이성을 갖는 응고 인자 IXa와 결합하는 직접 FIXa 저해제이다 (Rusconi et al., 2004, Nat Biotechnol. 22(11): 1423-8; Rusconi et al., 2002, Nature 419(6902):90-4; WO05/106042 (Duke University)도 참조). RB006는 FVIIIa/FIXa로 촉진되는 FX의 FXa로의 전환을 블로킹함으로써, 항응고 효과를 이끌어낸다. RB006는 길이가 31개의 뉴클레오티드로 된 변형 RNA 앱타머이며, 2'-플루오로 및 2'-O-메틸 당 함유 잔기의 존재에 의해 엔도뉴클레아제 분해에 대하여 적절히 안정화되고, 3'역위 데옥시티미딘 캡에 의해 엑소뉴클레아제 분해에 대하여 안정화된다. 앱타머의 핵산 부분은 40 킬로돌턴 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 담체에 컨쥬게이트되어, 이의 혈중 반감기를 상승시킨다. 일시 정맥 주사 후에, 마우스에 있어서의 RB006의 반감기는 약 8 시간이고, 원숭이에 있어서의 반감기는 약 12 시간이다. 이로써, RB006는 정맥 주사보다는 오히려 1회 일시 주사로서 주어져서, 수시간에 걸쳐서 항응고 상태를 유지할 수 있다.

도 2에 도시된 바와 같이, RB007 (cgcgguauaguccac (여기서, g = 2'-0-Me G; c = 2'-O-Me C; u = 2'-O-Me U; 및 a = 2'-O-Me A (서열 번호 2)이다; 도 2 참조), REG1의 해독 성분은 RB006에 효과적으로 결합하여, 이의 항 FIXa 활성을 중화시킬 수 있는 RB006의 부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드이다. RB007은 REG1의 약물 성분의 부분에 상보적인 15개의 뉴클레오티드로 된 2'-O-메틸 RNA 올리고뉴클레오티드이다. 2'-O-메틸 변형은 해독제에 내성을 나타내는 적당한 뉴클레아제를 부여하며, RB006를 찾아 결합할 수 있도록 충분한 생체 내에서의 안정성을 제공하나, 생체내에서의 지속성 연장을 지지하지 못한다.

REG1 의 비임상 개발

본 발명자들은 FIXa에 대한 RB006 앱타머의 특이성 및 앱타머에 대한 해독제 RB007의 친화성을 입증하는 약리학 데이터를 개발하였다. 비임상 약리학 연구 결과는 하기와 같이 요약될 수 있다: REG1 약물 성분 (RB006 및/또는 관련 전구체 화합물)은 (1) 시험관 내에서의 응고 인자 X 활성화를 효과적으로 저해할 수 있고; (2) 인간 및 다른 동물종의 혈장에 있어서의 시험관 내에서의 혈장 응고 시간을 연장할 수 있으며; (3) 일시 정맥내 투여에 의해 전신적으로 항응고할 수 있고; (4) 동물 동맥 손상 혈전증 모델에 있어서의 혈전 형성을 예방할 수 있으며; (5) 동물 심폐 바이패스 모델에서 헤파린을 교체할 수 있고, (6) REG1 해독 성분에 의한 중화 후 30분 이내에 동물에서 효과적으로 재투여될 수 있다.

현재까지의 비임상 약리학 연구에 의하면, REG1 해독 성분 (REG1 약물 성분의 전구체에 특이적인 RB007 및/또는 해독제)이 (1) 인간 및 다른 동물종의 혈장에 있어서의 시험관 내에서의 REG1 약물 성분 (RB006)의 항응고 활성을 신속하게 내구적으로 중화할 수 있고; (2) 이러한 약제로 전신적으로 항응고된 동물에 있어서의 일시 정맥내 투여에 의해 생체 내에서의 REG1 약물 성분의 항응고 활성을 신속하게 내구적으로 중화할 수 있으며; (3) REG1 약물 성분의 초치료 용량 (supratherapeutic dose) 및 외과 수술에 의한 외상의 혼합으로 유도된 출혈을 예방할 수 있고; (4) 심폐 바이패스에 의해 동물에서의 REG1 약물 성분의 항응고 활성을 중화할 수 있다. 또한, 해독제는 일시 정맥내 투여에 의해 인간 혈장 또는 동물에서 시험관 내에서의 항응고 활성 또는 다른 생리학적 활성을 나타내지 않았다.

앱타머-해독제계의 예측가능하고 반복가능한 효과를 나타낼 수 있는 확실한 방법을 제공할 필요성이 있다.

본 발명자들은 앱타머, 특히 앱타머 항응고제의 체중으로 조정된 용량 및 중요하게는 체질량 지수로 조정된 용량과, 이의 약역학 반응 사이의 명확한 관계를 알아냈다. 또한, 놀랍게도 앱타머의 활성을 원하는 레벨로 억제하기 위해서는 앱타머에 대한 해독제의 용량이 부가적 기준에 의거하는 것이 아니라, 다만 숙주에 주어진 앱타머의 양에 기초하여 조정되어야 할 필요가 있음을 알아냈다. 이러한 새로운 발견은 임상 용도에 대한 예측가능하고 반복가능한 투여 방식을 부여할 수 있는 특정한 투여 방식을 지지한다.

일실시형태에 있어서, 본 발명은 1) 숙주의 체질량 지수 (BMI)를 측정하고; 2) 원하는 약역학 반응을 확인하며; 3) 약역학 반응에 대한 BMI 당 용량의 비교에 기초하여, 원하는 약역학 반응을 달성하도록 앱타머 항응고제의 용량을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는 개선된 앱타머 항응고제계의 투여 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 앱타머의 해독제가 이어서 숙주에게 투여되고, 해독제의 용량이 원하는 앱타머 활성 감소를 위해 조정된 사전에 투여된 앱타머의 용량과의 비율에 기초하여 주어진다. 경우에 따라서는, 이러한 해독제 용량은 앱타머의 투여 후의 시간에 기초하여 조정된다. 경우에 따라서는, 앱타머에 대한 해독제의 비는 앱타머가 24 시간 보다 전에 투여된 경우, 절반으로 된다.

특정한 실시형태에 있어서, 최대 레벨의 항응고 효과가 요구된다. 이러한 경우에는, 앱타머는 4 mg/BMI 이상의 레벨로 제공될 수 있다. 다른 경우에서는, 약 75%의 최대 항응고 레벨이 요구된다. 이러한 경우에는, 약 0.75.0-1.5 mg/BMI의 용량이 숙주에게 주어진다. 다른 경우에서는, 최대 50%의 항응고 레벨이 요구된다. 이러한 경우에는, 약 0.25 내지 0.5 mg/BMI의 용량이 주어진다.

특정한 일반적인 실시형태에 있어서는, 사용된 항응고제 용량은 0.1 내지 10 mg/BMI이다. 다른 실시형태에 있어서는, 용량은 0.2 내지 8 mg/BMI, 또는 0.2 내지 6 mg/BMI, 0.2 내지 5 mg/BMI, 0.2 내지 4 mg/BMI, 0.2 내지 3 mg/BMI, 0.2 내지 2 mg/BMI, 또는 0.2 내지 1 mg/BMI이다. 일부의 실시형태에 있어서는, 항응고제의 용량은 약 0.1 mg/BMI, 약 0.2 mg/BMI, 약 0.5 mg/BMI, 약 0.75 mg/BMI, 약 1 mg/BMI, 약 2 mg/BMI, 약 3 mg/BMI, 약 4 mg/BMI, 약 5 mg/BMI, 약 6 mg/BMI, 약 7 mg/BMI, 약 8 mg/BMI, 약 9 mg/BMI, 또는 약 10 mg/BMI이다.

다른 실시형태에 있어서는, 본 발명은 1) 숙주의 체중을 측정하고; 2) 원하는 약역학 반응을 확인하며; 3) 약역학 반응에 대한 숙주 체중 킬로그램 당 용량의 비교에 기초하여, 원하는 약역학 반응을 달성하도록 앱타머 항응고제의 용량을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는 개선된 앱타머 항응고제계의 투여 방법을 제공한다. 특정한 실시형태에 있어서, 앱타머의 해독제가 이어서 숙주에게 투여되고, 해독제의 용량이 원하는 앱타머 활성 감소를 위해 조정된 사전에 투여된 앱타머의 용량과의 비율에 기초하여 주어진다. 경우에 따라서는, 이러한 해독제 용량은 앱타머의 투여 후의 시간에 기초하여 조정된다. 경우에 따라서는, 앱타머에 대한 해독제의 비는 앱타머가 24 시간 보다 전에 투여된 경우, 두배로 된다.

특정한 실시형태에 있어서, 최대 레벨의 항응고 효과가 요구된다. 이러한 경우에는, 앱타머는 1.4 mg/kg 이상의 레벨로 제공될 수 있다. 다른 경우에서는, 최대 약 75%의 항응고 레벨이 요구된다. 이러한 경우에는, 0.5 내지 0.75 mg/kg의 용량이 숙주에게 주어진다. 다른 경우에서는, 최대 약 50%의 항응고 레벨이 요구된다. 이러한 경우에는 약 0.2 내지 0.4 mg/kg의 용량이 주어진다.

특정한 일반적인 실시형태에 있어서, 사용된 용량은 0.1 내지 2 mg/kg, 0.1 내지 1.8 mg/kg, 0.1 내지 1.6 mg/kg, 0.1 내지 1.5 mg/kg, 0.1 내지 1.4 mg/kg, 0.1 내지 1.3 mg/kg, 0.1 내지 1.2 mg/kg, 0.1 내지 1.1 mg/kg, 0.1 내지 1.0 mg/kg, 0.1 내지 0.9 mg/kg, 0.1 내지 0.8 mg/kg, 0.1 내지 0.7 mg/kg, 0.1 내지 0.6 mg/kg, 0.1 내지 0.5 mg/kg, 0.1 내지 0.4 mg/kg, 0.1 내지 0.3 mg/kg, 또는 0.1 내지 0.2 mg/kg이다. 다른 실시형태에 있어서는, 용량은 1 내지 20 mg/kg, 1 내지 18 mg/kg, 1 내지 15 mg/kg, 2 내지 15 mg/kg, 3 내지 15 mg/kg, 4 내지 15 mg/kg, 5 내지 20 mg/kg, 5 내지 15 mg/kg, 또는 1 내지 10 mg/kg, 또는 5 내지 10 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg이다. 주요 실시형태에 있어서, 앱타머 항응고제계는 REG1계로, 앱타머 항응고제 및 올리고뉴클레오티드 해독제를 포함한다. 특정한 비한정적인 실시형태에 있어서, 앱타머는 RB006 (서열 번호 1)이고, 해독제는 RB007 (서열 번호 2)이다. 일실시형태에 있어서, 약역학 반응은 응고 분석, 예컨대 aPTT (혈장 또는 전혈) 또는 활성응고시간 (ACT)에서 측정되며, 절대값, 퍼센트 효과, 퍼센트 변화, 시간 가중 평균 또는 한정된 시간에 대한 농도 곡선하 면적으로서 기록될 수 있다.

약역학 반응 레벨은 특정 용도에 요구된 레벨일 수 있다. 예를 들면, 경우에 따라서는, 환자가 혈전 사례의 위험성이 낮은 경우, 저 레벨의 반응이 요구될 수 있다. 특정한 경우에는, 항응고제, 특히 앱타머의 포화량을 FIXa, 예컨대 RB006에 사용하여, 응고 인자 억제, 특히 FIX 또는 FIXa 억제를 최대화하는 것이 바람직하지 않을 수 있다. 다른 경우에서는, 환자가 혈전 사례의 위험성이 높거나 혈전 발현을 갖는 경우, 고 레벨의 반응이 요구될 수 있다. 이러한 경우에는, 항응고제, 특히 앱타머의 포화량을 FIXa, 예컨대 RB006에 사용하여, 응고 인자 억제, 특히 FIX 또는 FIXa 억제를 최대화하는 것이 바람직할 수 있다.

일실시형태에 있어서, 항응고제 앱타머, 예컨대 RB006는 정맥내 볼루스 전달 (IV bolus delivery)로 주어진다. 다른 실시형태에 있어서는, 항응고제 앱타머는 피하 주사로 주어진다. 다른 실시형태에 있어서는, 앱타머의 정맥내 또는 피하 일시 전달 후에, 해독제가 주입된다.

본 명세서에 기재된 절차에 의해, 항응고제 및 해독제가 단계적으로 전달되어, 두 화합물 또는 두 화합물 중 하나를 원하는 레벨의 타겟 저해 및 저해 해제로 적정할 수 있다.

앱타머에 대한 해독제의 비율은 앱타머의 원하는 저해 레벨에 기초하여 조정된다. 해독제 용량은 앱타머 용량에만 상관관계가 있고, 게다가 숙주에 관한 인자에 기초하여 조정될 필요는 없다. 일실시형태에 있어서, 해독제에 대한 앱타머의 비율은 1:1이다. 다른 실시형태에 있어서는, 해독제에 대한 앱타머의 비율은 1:1 초과, 예컨대 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 이상이다. 이러한 비율은 또한 해독제/앱타머 비율에 기초하여 계산될 수 있으며, 예를 들면, 약 1:1 미만, 예컨대 0.9:1 또는 약 0.9:1, 0.8:1 또는 약 0.8:1, 0.7:1 또는 약 0.7:1, 0.6:1 또는 약 0.6:1, 0.5:1 또는 약 0.5:1, 0.45:1 또는 약 0.45:1, 0.4:1 또는 약 0.4:1, 0.35:1 또는 약 0.35:1, 0.3:1 또는 약 0.3:1, 0.25:1 또는 약 0.25:1, 0.2:1 또는 약 0.2:1, 0.15:1 또는 약 0.15:1, 0.1:1 또는 약 0.1:1 또는 0.1:1 미만, 예컨대 약 0.005:1 이하이다. 일부의 실시형태에 있어서는, 상기 비율은 0.5:1 내지 0.1:1, 0.5:1 내지 0.2:1, 또는 0.5:1 내지 0.3:1이다. 다른 실시형태에 있어서는, 상기 비율은 1:1 내지 5:1, 1:1 내지 10:1, 또는 1:1 내지 20:1이다.

일부의 실시형태에 있어서는, 다만 앱타머 활성의 부분적인 역전이 일어난다. 예를 들면, 일부의 실시형태에 있어서는, 앱타머 활성은 90%, 또는 90% 미만, 예컨대 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10% 이하로 역전된다. 앱타머에 대한 해독제의 비율은 중량을 중량에 비교하거나 몰 기준으로 계산될 수 있다.

본 발명의 특정한 실시형태에 있어서, 투여계가 적용되는 숙주 또는 대상은 인간이다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주는 항응고 요법을 필요로 하는 인간이다. 특정한 실시형태에 있어서, 숙주는 혈관 수술, 예컨대 CABG 수술을 받는 인간 환자이다.

본 발명자들은 앱타머, 특히 앱타머 항응고제의 체중으로 조정된 용량 및 중요하게는 체질량 지수로 조정된 용량과, 이의 약역학 반응 사이의 명확한 관계를 알아냈다. 또한, 놀랍게도 앱타머의 활성을 원하는 레벨로 억제하기 위해서는 앱타머에 대한 해독제의 용량이 부가적 기준에 의거하는 것이 아니라, 다만 숙주에 주어진 앱타머의 양에 기초하여 조정되어야 할 필요가 있음을 알아냈다. 이러한 새로운 발견은 임상 용도에 대한 예측가능하고 반복가능한 투여 방식을 부여할 수 있는 특정한 투여 방식을 지지한다.

앱타머의 개발

핵산 앱타머는 SELEX로 불리우는 시험관증폭선택법 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)을 이용하여 분리된다. 이 방법에 의해, 타겟 분자에 대한 고도의 특이적 결합을 갖는 핵산 분자를 시험관 내에서 발생시킬수 있다는 것이다. SELEX 법은 예를 들면, 미국 특허 제7,087,735호, 미국 특허 제5,475,096호 및 미국 특허 제5,270,163호 (WO 91/19813도 참조)에 기재되어 있다.

SELEX 법은 실질적으로 원하는 결합 친화성 및 선택성의 기준을 달성하도록 동일한 통상적인 선발법을 이용한 후보 올리고뉴클레오티드의 혼합물의 선택, 및 결합, 분배 및 증폭의 단계적 반복을 포함한다. 핵산의 혼합물, 예컨대 랜덤화 시퀀스의 세그먼트를 포함하는 혼합물을 출발물질로 하여, SELEX 법은 혼합물을 결합에 유리한 조건하에서 타겟과 접촉시키는 단계, 타겟 분자에 특이적으로 결합된 핵산으로부터 비결합 핵산을 분배하는 단계, 핵산-타겟 복합체를 분리하는 단계, 핵산-타겟 복합체로부터 분리된 핵산을 증폭하여, 리간드가 풍부한 핵산 혼합물을 얻는 단계, 그 다음에 타겟 분자에 대한 고 특이성, 고 친화성 앱타머를 얻는데 요구되는 만큼의 많은 사이클을 통해 결합, 분배, 분리 및 증폭하는 단계를 반복하는 것을 포함한다.

기본적인 SELEX 법은 다수의 특정한 목적을 달성하도록 변형되어 왔다. 예를 들면, 미국 특허 제5,707,796호는 특수한 구조 특성을 갖는 핵산 분자, 예컨대 벤트 DNA를 선택하기 위해 겔 전기이동과 관련하여 SELEX를 사용하는 것에 대하여 기재하고 있다. 미국 특허 제5,763,177호는 결합가능한 광반응기를 포함하는 앱타머를 선택하고/하거나 타겟 분자에 광가교하고/하거나 타겟 분자를 광불활성화하기 위한 SELEX에 기초한 방법을 기재하고 있다. 미국 특허 제5,580,737호는 카운터-SELEX로 불리우는 밀접한 관련이 있는 분자를 식별할 수 있는 고 특이적 앱타머를 동정하는 방법을 기재하고 있다. 미국 특허 제5,567,588호 및 제5,861,254호는 타겟 분자에 대하여 고 친화성 및 저 친화성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 매우 효과적으로 분배할 수 있는 SELEX에 기초한 방법을 기재하고 있다. 미국 특허 제5,496,938호는 SELEX 프로세스가 행해진 후에 개선된 앱타머를 얻는 방법을 개시하고 있다. 미국 특허 제5,705,337호는 리간드를 이의 타겟에 공유 결합하는 방법을 기재하고 있다.

용액 중에서의 소 펩티드에 대한 앱타머를 동정하는 실현가능성은 미국 특허 제5,648,214호에서 입증되었다. 타겟 분자의 특이적 부위에 타겟된 앱타머를 제조하도록 리간드와 함께 친화 용출을 이용하는 능력은 특정한 렉틴에 결합하는 고 친화성 앱타머의 제조에 관한 미국 특허 제5,780,228호에 예시되어 있다. 세포 종류 그룹을 포함하는 특정한 조직에 대한 앱타머를 제조하는 방법은 미국 특허 제6,127,119호에 기재되어 있다. 송아지 장 포스파타제에 대한 특정한 변형 고 친화성 리간드의 제조는 미국 특허 제6,673,553호에 기재되어 있다. 미국 특허 제6,716,580호는 로봇 매니퓰레이터의 사용을 포함하는 앱타머를 동정하는 자동 공정을 기재하고 있다. 이의 가장 기본적인 형태에 있어서, SELEX 법은 하기 일련의 단계에 의해 규정될 수 있다:

1) 서열이 다른 핵산의 후보 혼합물이 제조된다. 후보 혼합물은 일반적으로 고정 서열 영역 (즉, 후보 혼합물의 각 멤버는 동일한 위치의 동일한 서열을 포함한다) 및 랜덤화 서열 영역을 포함한다. 고정 서열 영역은 (a) 후술하는 증폭 단계를 돕거나, (b) 타겟에 결합하도록 알려진 서열을 모사하거나, (c) 후보 혼합물 중의 주어진 구조 배열의 핵산 농도를 증가시키도록 선택된다. 랜덤화 서열은 완전히 램덤화되거나 (즉, 임의의 위치에서 염기를 발견할 확률은 4분의 1이다), 다만 부분적으로 랜덤화될 수 있다 (예를 들면, 임의의 위치에서의 염기를 발견할 확률은 0 내지 100 퍼센트 사이의 레벨일 수 있다).

2) 후보 혼합물은 타겟과 후보 혼합물 멤버 사이의 결합에 유리한 조건하에서 선택된 타겟과 접촉된다. 이러한 경우에는, 타겟과 후보 혼합물의 핵산 사이의 상호작용은 타겟과 타겟에 대하여 최대 친화성을 갖는 핵산 사이에 핵산-타겟 쌍을 형성하는 것으로서 여겨질 수 있다.

3) 타겟에 대하여 최고 친화성을 갖는 핵산은 타겟에 대하여 보다 덜 친화성을 갖는 핵산으로부터 분배된다. 최고 친화성 핵산에 대응하는 다만 극소수의 서열 (및 아마도 단 하나의 핵산 분자)이 후보 혼합물에 존재하기 때문에, 통상 후보 혼합물 중의 상당량의 핵산 (약 5 내지 50%)이 분배 시에 보유되도록 분배 기준을 설정하는 것이 바람직하다.

4) 그 다음에, 타겟에 대하여 비교적 높은 친화성을 갖는 것으로서 분배 시에 선택된 핵산은 증폭되어, 타겟에 대하여 비교적 높은 친화성을 갖는 핵산이 풍부한 새로운 후보 혼합물을 생성시킨다.

5) 상술한 분배 및 증폭 단계를 반복함으로써, 새로이 생성된 후보 혼합물은 점점 더 약해지는 결합 서열을 포함하며, 타겟에 대한 핵산의 평균 친화도는 통상 증가할 것이다. 극단적으로, SELEX 법은 타겟 분자에 대하여 최고 친화성을 갖는 원래의 후보 혼합물로부터 핵산을 나타내는 하나 또는 소수의 특이적인 핵산을 포함하는 후보 혼합물을 산출할 것이다.

화학적 변형

핵산의 치료상 사용에서 부닥치는 하나의 문제는 원하는 효과가 보이기 전에, 포스포디에스테르 형태의 올리고뉴클레오티드가 세포내 및 세포외 효소, 예컨대 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의해 체액 중에서 빠르게 분해될 수 있다는 것이다. 앱타머의 특정한 화학적 변형은 앱타머의 생체내에서의 안정성을 증대시키거나, 앱타머의 전달을 향상시키거나 조절하도록 이뤄질 수 있다.

앱타머의 변형은 전체로서 앱타머 염기 또는 앱타머에 대한 부가 전하, 분극률, 소수성, 수소 결합, 정전기 상호작용, 및 유연성을 포함하는 다른 화학기를 제공하는 것을 포함하나, 이것에 한정되지 않는다. 이러한 변형은 2'-위치 당 변형, 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 푸린 변형, 한외 아민에서의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-요오도-우라실의 치환; 골격 변형, 포스포로티오에이트 또는 인산알킬 변형, 메틸화, 이상 여기 짝짓기 결합, 예컨대 이소베이스 (isobases) 이소시티딘 및 이소구아니딘 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 변형은 또한 3' 및 5' 변형, 예컨대 캐핑을 포함할 수 있다.

SELEX 법은 리간드에 대한 개선된 특성, 예컨대 개선된 생체내에서의 안정성 또는 개선된 전달 특성을 부여하는 변형 뉴클레오티드를 포함하는 고 친화성 앱타머의 동정을 포함한다. 이러한 변형의 예로는 리보오스 및/또는 포스페이트 및/또는 염기 위치에서의 화학적 치환을 포함한다. 변형 뉴클레오티드를 포함하는 SELEX로 동정된 앱타머는 미국 특허 제5,660,985호에 기재되어 있으며, 이 공보는 피리미딘의 5- 및 2'-위치에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기재하고 있다. 미국 특허 제5,580,737호는 2'-아미노 (2'-NH₂), 2'-플루오로 (2'-F), 및/또는 2'-O-메틸 (2'-OMe)로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 특정한 앱타머를 기재하고 있다. 미국 특허 제5,756,703호는 각종 2'-변형 피리미딘을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기재하고 있다.

SELEX 법은 미국 특허 제5,637,459호 및 제5,683,867호에 기재된 선택된 올리고뉴클레오티드를 다른 선택된 올리고뉴클레오티드 및 비올리고뉴클레오티드 기능 단위와 결합하는 것을 포함한다. 미국 특허 제5,637,459호는 2'-아미노 (2'-NH₂), 2'-플루오로 (2'-F), 및/또는 2'-O-메틸 (2'-OMe)로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 고 특이성 앱타머를 기재하고 있다. SELEX 법은 또한 미국 특허 제6,011,020호에 기재된 진단 또는 치료 복합체 중에서 선택된 앱타머를 친유성 또는 비면역원성, 고분자량 화합물과 혼합하는 것을 포함한다.

앱타머가 SELEX 법에 의해 유도되는 경우에는, 변형은 프리- 또는 포스트-SELEX 변형일 수 있다. 프리-SELEX 변형은 이의 타겟에 대한 특이성 및 개선된 생체내에서의 안정성을 갖는 앱타머를 산출할 수 있다. 2'-OH 앱타머에 행해진 포스트-SELEX 변형은 앱타머의 결합능에 악영향을 미치지 않고서 개선된 생체내에서의 안정성을 가져올 수 있다. 일실시형태에 있어서, 앱타머의 변형은 분자의 3' 말단에서의 3'-3' 역위 포스포디에스테르 결합 및 일부 또는 전체의 뉴클레오티드의 2' 플루오로 (2'-F) 및/또는 T 아미노 (2'-NH₂), 및/또는 2' O 메틸 (2'-OMe) 변형을 포함한다.

일실시형태에 있어서, 앱타머 또는 이의 레귤레이터는 친유성 화합물, 예컨대 콜레스테롤, 디알킬글리세롤, 디아실글리세롤, 또는 비면역원성, 고분자량 화합물 또는 폴리머, 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG)에 공유결합될 수 있다. 이러한 경우에는, 앱타머 또는 모듈레이터의 약물속도론적 특성이 향상될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 앱타머 또는 모듈레이터는 리포솜 내에서 캡슐화될 수 있다. 친유성 화합물 또는 비면역원성, 고분자량 화합물은 앱타머 또는 모듈레이터(들)와의 비공유 상호작용을 통해 공유결합되거나 공유결합으로 관련될 수 있다. 공유결합이 이용되는 실시형태에 있어서, 친유성 화합물 또는 비면역원성, 고분자량 화합물은 앱타머 또는 모듈레이터의 여러 위치, 예컨대 염기 상의 환외 아미노기, 피리미딘 뉴클레오티드의 5-위치, 푸린 뉴클레오티드의 8-위치, 포스페이트의 하이드록실기, 또는 5' 또는 3' 말단에서의 하이드록실기 또는 다른 기에 공유결합될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 공유결합은 5' 또는 3' 하이드록실기이다. 복합체의 다른 성분에 대한 올리고뉴클레오티드 모듈레이터의 결합은 직접 또는 링커 또는 스페이서를 이용하여 이뤄질 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 염기 부분, 당 부분, 또는 포스페이트 골격에서 변형되어, 예를 들면, 분자 안정성, 하이브리드화 등을 향상시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 다른 부가된 기를 포함할 수 있다. 이 때문에, 올리고뉴클레오티드는 다른 분자, 예를 들면, 펩티드, 하이브리드화로 트리거된 가교제, 수송제, 하이브리드화로 트리거된 분열제 등에 컨쥬게이트될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시하이드록시메틸) 우라실, 5-카복시메틸아미노메틸 티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실쿼오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-이네틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2α-티오우라실, β-D-만노실쿼오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-이네틸티오-N&이소펜테닐아데닌, 우라실 옥시아세트산, 와이부톡소신, 슈도우라실, 쿼오신, 2-티오사이토신, 5-메틸 티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산메틸 에스테르, 우라실 옥시아세트산 (v), 5-메틸 티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-카복시프로필) 및 2,6-디아미노푸린을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 변형 염기 부분을 포함할 수 있다.

본 발명의 앱타머 또는 모듈레이터는 또한 아라비노스, 2-플루오로아라비노스, 자일로스, 및 헥소스를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 변형 당 부분을 포함할 수 있다. 앱타머 또는 모듈레이터는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르, 및 포름아세탈 또는 이의 유사체를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 변형 포스페이트 골격을 포함할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 당해 기술분야에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기 (예를 들면, Biosearch, Applied Biosystems 제)를 이용하여 합성될 수 있다.

모듈레이터

본 발명의 모듈레이터는 올리고뉴클레오티드, 소분자, 펩티드, 올리고당, 예를 들면 아미노글리코사이드, 또는 앱타머, 또는 키메라 또는 이들의 융합 또는 가교 산물에 결합하거나, 아니면 이들의 활성을 조절할 수 있는 다른 분자일 수 있다.

일실시형태에 있어서, 모듈레이터는 적어도 일부의 앱타머에 상보적인 올리고뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 모듈레이터는 앱타머를 표적으로 하는 리보자임 또는 DNA자임일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 모듈레이터는 적어도 일부의 앱타머에 상보적이거나 이것과 하이브리드화하는 서열을 포함하는 펩티드 핵산 (PNA), 모르폴리노 핵산 (MNA), 로크된 핵산 (LNA) 또는 슈도사이클릭 올리고핵산염기 (PCO)일 수 있다.

앱타머는 적절한 안정한 이차 구조의 형성에 의존하는 활성 삼차 구조를 갖는다. 따라서, 본 발명의 상보적 올리고뉴클레오티드 모듈레이터와 앱타머 사이의 2본쇄 (duplex) 생성 메카니즘이 2개의 짧은 선형 올리고리보뉴클레오티드 사이의 그것과 동일하는 한, 이러한 산물의 상호작용 및 생성 반응속도는 분자내 앱타머 구조에 의해 영향을 받는다. 핵형성 속도는 최종 안정한 2본쇄의 형성에 중요하며, 이러한 단계의 속도는 앱타머에 존재하는 1본쇄 루프 및/또는 1본쇄 3' 또는 5' 테일에 올리고뉴클레오티드 모듈레이터를 타겟함으로써 크게 향상된다. 일어나는 분자간 2본쇄의 형성에 관해서는, 분자간 2본쇄의 생성 자유 에너지는 타겟된 앱타머 내의 현존하는 분자내 2본쇄의 형성에 관해 유리해야 한다.

모듈레이터는 고도의 특이성 및 원하는 친화성을 갖는 특정한 앱타머를 결합하도록 디자인될 수 있다. 모듈레이터는 또한 결합시에, 앱타머의 구조가 대체로 활성형으로 변형되도록 디자인될 수 있다. 예를 들면, 모듈레이터는 타겟된 앱타머에 결합시에, 앱타머가 이의 타겟 분자에게 더 이상 결합할 수 없거나 이의 타겟 분자에 덜 친화성을 갖고서 결합하도록 앱타머의 3차원 구조가 변경되도록 디자인될 수 있다.

또는, 모듈레이터는 결합 시에, 이의 타겟 분자에 대한 앱타머의 친화성이 향상되도록 앱타머의 3차원 구조가 변화되도록 디자인될 수 있다. 즉, 모듈레이터는 결합 시에, 앱타머가 이의 타겟 분자에 결합할 수 있도록 구조 모티프가 앱타머에 형성되도록 디자인될 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 모듈레이터 자체는 앱타머이다. 이러한 실시형태에 있어서, 앱타머는 처음에 생성되어, 원하는 치료 타겟에 결합한다. 제 2 단계에서, 제 1 앱타머에 결합하는 제 2 앱타머는 본 명세서에 기재된 SELEX 법또는 다른 방법을 이용하여 생성되어, 치료 앱타머와 타겟 사이의 상호작용을 조절한다. 일실시형태에 있어서, 제 2 앱타머는 제 1 앱타머의 효과를 불활성화시킨다.

다른 실시형태에 있어서, 타겟에 결합하는 앱타머는 PNA, MNA, LNA 또는 PCO일 수 있고, 모듈레이터는 앱타머이다. 또는, 타겟에 결합하는 앱타머는 PNA, MNA, LNA 또는 PCO이고, 모듈레이터는 PNA이다. 또는, 타겟에 결합하는 앱타머는 PNA, MNA, LNA 또는 PCO이고, 모듈레이터는 MNA이다. 또는, 타겟에 결합하는 앱타머는 PNA, MNA, LNA 또는 PCO이고, 모듈레이터는 LNA이다. 또는, 타겟에 결합하는 앱타머는 PNA, MNA, LNA 또는 PCO이고, 모듈레이터는 PCO이다. 이들은 어느 것이나 경우에 따라 자연발생적인 입체 화학 또는 비자연발생적인 입체 화학 또는 혼합 형태로 사용될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 실시형태에 있어서, 앱타머는 D 형태이고, 다른 실시형태에 있어서, 앱타머는 L 형태이다.

일실시형태에 있어서, 본 발명의 모듈레이터는 적어도 일부의 타겟된 앱타머 서열에 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들면, 모듈레이터 올리고뉴클레오티드는 타겟된 앱타머의 6 내지 25개의 뉴클레오티드, 전형적으로는 8 내지 20개의 뉴클레오티드, 보다 전형적으로는 10 내지 15개의 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 유리하게는, 모듈레이터 올리고뉴클레오티드는 앱타머의 6 내지 25개의 연속 뉴클레오티드, 또는 8 내지 또는 20개 또는 10 내지 15개의 연속 뉴클레오티드에 상보적이다. 모듈레이터 올리고뉴클레오티드의 길이는 타겟된 앱타머 및 요구된 효과를 고려하여 최적화될 수 있다. 전형적으로, 모듈레이터 올리고뉴클레오티드는 길이가 5 내지 80개의 뉴클레오티드, 보다 전형적으로는 10 내지 30개, 가장 전형적으로는 15 내지 20개의 뉴클레오티드 (예를 들면, 15 내지 17개)이다. 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 D 또는 L 입체 화학, 또는 이의 혼합 형태로 지니는 뉴클레오티드로 형성될 수 있다. 자연발생적인 뉴클레오시드는 D 형태로 되어 있다.

타겟된 앱타머에 대한 올리고뉴클레오티드 결합의 최적 부위를 결정하도록 다양한 전략이 사용될 수 있다. 상보적 올리고뉴클레오티드가 앱타머 주위에 "워킹"하는 경험적 전략이 사용될 수 있다. 워킹 실험은 연속적으로 행해지는 2개의 실험을 포함한다. 각각의 후보 혼합물 멤버가 대상으로 하는 올리고뉴클레오티드 모듈레이터에 해당하는 고정된 핵산-영역을 갖는 새로운 후보 혼합물이 제조될 수 있다. 후보 혼합물의 각 멤버는 또한 서열의 랜덤화 영역을 포함한다. 이 방법에 따르면, "확대" 앱타머로서 명명되는 것을 동정할 수 있으며, 앱타머의 하나 이상의 결합 도메인에 결합할 수 있는 영역을 포함한다. 이러한 접근법에 따르면, 앱타머의 약 5개의 뉴클레오티드로 스태거되는 길이가 약 15개의 뉴클레오티드로 된 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드 (예를 들면, 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드)가 사용될 수 있다 (예를 들면, 앱타머의 뉴클레오티드 1 내지 15개, 6 내지 20개, 11 내지 25개 등에 상보적인 올리고뉴클레오티드). 경험적 전략은 하이브리드화의 효율에 대한 앱타머의 삼차 구조의 영향을 예측하기가 어려울 수 있기 때문에 특히 효과적일 수 있다. 후술되는 실시예에 기재된 분석은 특히 앱타머의 완전한 결합을 달성하는데 요구되는 몰 과잉량의 올리고뉴클레오티드에 중점을 두고서, 특정 앱타머에 하이브리드화하는 상이한 올리고뉴클레오티드의 능력을 평가하는데 사용될 수 있다. 앱타머의 이의 타겟 분자로부터의 해리 속도 또는 앱타머와 이의 타겟 분자와의 결합 속도를 증가시키는 상이한 올리고뉴클레오티드 모듈레이터의 능력은 또한 예를 들면, BIACORE 분석을 이용하는 표준 속도론 연구를 행하여 측정될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 모듈레이터는 5 내지 50배의 몰 과잉량의 올리고뉴클레오티드가 원하는 방법으로 앱타머와 이의 타겟 분자 사이의 상호작용을 변경하는데 요구되도록 선택될 수 있다.

또는, 타겟된 앱타머는 올리고뉴클레오티드 모듈레이터와의 결합을 향상시키기 위해 1본쇄 테일 (3' 또는 5')을 포함하도록 변형될 수 있다. 적절한 테일은 1 내지 20개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 10개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 3 내지 5개의 뉴클레오티드 (예를 들면, 변형 뉴클레오티드, 예컨대 2'-O-메틸 서열)를 포함할 수 있다. 테일된 앱타머는 1본쇄 테일의 부가가 앱타머의 활성 구조를 붕괴시키지 않는다는 것을 입증하도록 결합 및 생물학적 검증에서 테스트될 수 있다 (예를 들면, 후술하는 실시예에 기재된 바와 같이). 테일 서열과 함께 예를 들면, 1, 3 또는 5개의 염기 쌍을 형성할 수 있는 일련의 올리고뉴클레오티드 (예를 들면, 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드)가 디자인되어, 테일된 앱타머 단독과 결합하는 이의 능력, 및 앱타머의 이의 타겟 분자로부터의 해리 속도 또는 앱타머의 이의 타겟 분자와의 결합 속도를 증가시키는 이의 능력이 테스트될 수 있다. 스크램블 서열 컨트롤은 효과가 2본쇄 형성으로 인한 효과 및 비특이성 효과가 아닌 것을 입증하도록 사용될 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드 모듈레이터는 적어도 일부의 앱타머에 상보적인 서열을 포함한다. 그러나, 절대 상보성이 요구되지 않는다. 본 명세서에서 명명되는 "적어도 일부의 앱타머에 상보적인" 서열로은 앱타머와 하이브리드화할 수 있도록 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미한다. 하이브리드화하는 능력은 상보성 정도 및 안티센스 핵산 길이에 의존할 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드를 더욱 하이브리드화할수록, 염기가 타겟 앱타머와 더욱 미스매치하고, 안정한 2본쇄를 포함할 수 있으며, 이를 형성한다 (또는 경우에 따라서는 3본쇄 (triplex)). 당업자는 표준 절차를 이용하여, 미스매치의 허용도를 확인하여, 하이브리드화된 복합체의 융점을 측정할 수 있다. 특정한 측면에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 5개 또는 적어도 10개의 뉴클레오티드, 적어도 15 또는 17개의 뉴클레오티드, 적어도 25개의 뉴클레오티드 또는 적어도 50개의 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 또는 1본쇄로 된 이의 키메라 혼합물 또는 유도체 또는 변형체일 수 있다.

일실시형태에 있어서, 모듈레이터는 리보자임 또는 DNA자임이다. 각각 상이한 타입의 특이성을 나타내는 적어도 다섯 부류의 리보자임이 있다. 예를 들면, 그룹 I 인트론은 사이즈가 약 300 내지 >1000개의 뉴클레오티드이고, 절단 부위의 5'에 직접 타겟 서열의 U를 필요로 하며, 절단 부위의 5' 사이드에 4 내지 6개의 뉴클레오티드를 결합한다. 사이즈가 약 290 내지 400개의 뉴클레오티드인 RNaseP RNA (M1 RNA)인 또 하나의 부류가 있다. 제 3 예로는 사이즈가 약 30 내지 40개의 뉴클레오티드인 해머헤드형 리보자임이 있다. 이들은 절단 부위의 5'에 직접 타겟 서열 UH를 요하며, 절단 부위의 양측부에 변수의 뉴클레오티드를 결합한다. 제 4 부류는 사이즈가 약 50개의 뉴클레오티드인 헤어핀형 리보자임이다. 이는 절단 부위의 3'에 직접 타겟 서열 GUC를 요하며, 절단 부위의 5' 사이드에 4개의 뉴클레오티드를, 절단 부위의 3' 사이드에 변수의 뉴클레오티드를 결합시킨다. 제 5 그룹은 크기가 약 60개의 뉴클레오티드인 델타 간염 바이러스 (HDV) 리보자임이다.

다른 부류의 촉매 분자는 "DNA자임"으로 불리운다. DNA자임은 1본쇄로, RNA 및 DNA를 절단한다. DNA자임에 대한 일반적인 모델이 제안되어 있으며, "10-23" 모델로서 알려져 있다. "10-23" 모델을 따르는 DNA자임은 15개의 데옥시리보뉴클레오티드의 촉매 도메인을 가지며, 각각 7 내지 9개의 데옥시리보뉴클레오티드로 된 2개의 기질 인식 도메인이 측면에 배치되어 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드 모듈레이터의 핵산염기는 핵산염기간 결합, 예를 들면, 펩티딜 결합 (펩티드 핵산 (PNA)의 경우에서와 같이; Nielsen et al. (1991) Science 254, 1497 및 미국 특허 제5,539,082호) 및 모르폴리노 결합 (Qin et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10, 11 (2000); Summerton, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 187 (1997); Summerton et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 63 (1997); Taylor et al., J Biol Chem. 271, 17445 (1996); Partridge et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6, 169 (1996))을 통해, 또는 다른 천연 또는 변형 결합에 의해 연결될 수 있다. 올리고핵산염기는 또한 로크된 핵산 (LNA)일 수 있다 (Nielsen et al., J Biomol Struct Dyn 17, 175 (1999); Petersen et al., J Mol Recognit 13, 44 (2000); Nielsen et al., Bioconjug Chem 11, 228 (2000)).

PNA는 올리고뉴클레오티드와 유사하나, 조성이 다른 화합물이다. PNA에서, 올리고뉴클레오티드의 데옥시리보오스 골격은 펩티드 골격으로 치환된다. 펩티드 골격의 각 서브유닛은 자연발생적인 또는 비자연발생적인 핵산염기에 결합된다. PNA는 종종 N-(2-아미노에틸)글리신 단위로 구성되는 아키랄 폴리아미드 골격을 갖고 있다. 푸린 또는 피리미딘 염기는 메틸렌 카보닐 링커 (1-3)를 통해 각 단위에 결합되어, 상보적 핵산을 타겟한다. PNA는 왓슨-크릭 염기 짝짓기 규칙에 따라 평행 또는 역평행 배향으로 상보적 RNA 또는 DNA에 결합한다. PNA 올리고머의 비전하 특성은 천연 호모듀플렉스와 비교하여, 하이브리드 PNA/DNA(RNA) 2본쇄의 안정성을 향상시킨다.

모르폴리노 핵산은 각각 6원 모르폴린환에 결합되는 4개의 유전적 염기 (아데닌, 사이토신, 구아닌, 및 티민) 중 1개를 포함하는 모르폴리노 서브 유닛으로 어셈블되기 때문에 그와 같이 불리운다. 이러한 4개의 서브유닛 타입의 18개 내지 25개의 서브 유닛은 비이온성 포스포로디아미데이트 서브유닛간 결합에 의해 특정 순서로 결합되어, 모르폴리노 올리고를 얻는다. 비이온성 결합에 의해 결합되는 이의 6원 모르폴린 골격 부분을 갖는 이러한 모르폴리노 올리고는 RNA, DNA, 및 이온 결합에 의해 결합되는 5원 리보오스 또는 데옥시리보오스 골격 부분을 갖는 이들의 유사체보다 실질적으로 안티센스 특성이 더욱 우수하다 (wwwgene- tools.com/Morphol-inos/body_morpholinos.HTML 참조).

LNA는 본 발명의 모듈레이터에 대한 프라임 후보가 되게 하는 다수의 특성을 갖는 DNA 유사체의 부류이다. LNA 모노머는 RNA-모노머와 구조적으로 유사한 이환식 화합물이다. LNA는 수용성인 DNA 및 RNA의 대부분의 화학적 성질을 공유하며, 겔 전기영동, 에탄올 침전 등에 의해 분리될 수 있다 (Tetrahedron, 54, 3607-3630 (1998)). 그러나, DNA 또는 RNA 올리고에로의 LNA 모노머의 도입에 의해, 상보적 DNA 또는 RNA를 갖는 2본쇄의 고온 안정성을 가져오며, 동시에 왓슨-크릭 염기 짝짓기 규칙을 따른다. 3' 위치 LNA(들)를 포함하는 프라이머가 효소 연장 반응, 예를 들면, PCR 반응에 대한 기질인 것의 발견과 함께, LNA 올리고머와 함께 형성된 이러한 2본쇄의 고온 안정성은 본 출원서에 기재된 시험관 내에서의 분석에서 변형 핵산의 검출 특이성을 크게 증가시킨다. 각각의 대립 유전자의 증폭 과정은 매우 특징적이고 (교차반응은 육안으로 관찰되지 않는다), 다수의 반응은 동일한 용기에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6,316,198호를 참조한다.

슈도사이클릭 올리고핵산염기 (PCO)는 또한 본 발명의 모듈레이터로서 사용될 수 있다 (미국 특허 제6,383,752호). PCO는 이들의 3'-3' 또는 5'-5' 말단을 통해 결합되는 2개의 올리고뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. PCO의 세그먼트 중 하나 ("기능 세그먼트")는 다수의 작용기 (예를 들면, 타겟 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 갖고 있다. 또 하나의 세그먼트 ("보호 세그먼트")는 기능 세그먼트의 3'- 또는 5 '-말단 (기능 세그먼트에 결합되어 있는 말단에 의존하는)에 상보적이다. 기능 세그먼트와 보호 세그먼트 세그먼트 사이의 상보성의 결과로서, PCO는 타겟 핵산 (예를 들면, RNA)의 부재하에 분자내 슈도사이클릭 구조를 형성한다. PCO는 3'-3' 또는 5'-5' 결합의 존재 및 분자내 슈도사이클릭 구조의 형성 때문에 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 훨씬 안정하다. 마우스에 있어서의 약물동태학적, 조직 분포, 및 안정성 연구에 따르면, PCO가 일반적으로 PS-올리고뉴클레오티드와 유사한 약물동태학적 및 조직 분포 프로파일보다 생체내에서 안정성이 더 높으나, 선택된 조직으로부터 빠르게 제거된다는 것을 제시하고 있다. 형광단 및 소광 분자가 본 발명의 PCO에 적절하게 결합되는 경우에는, 분자는 선형 구조인 경우, 형광을 발할 것이나, 형광성은 환상 구조에서 억제된다.

앱타머의 펩티드계 모듈레이터는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유사체에 대한 모듈레이터의 대체 분자 부류를 나타낸다. 이러한 부류의 모듈레이터는 충분한 활성을 갖는 타겟 앱타머의 올리고뉴클레오티드 모듈레이터가 타겟과 올리고뉴클레오티드 모듈레이터 사이의 핵형성을 향상시키는 충분한 1본쇄 영역의 결핍으로 인해 분리될 수 없는 경우에, 특히 유용한 것으로 입증된다. 또한, 펩티드 모듈레이터는 올리고뉴클레오티드 모듈레이터와는 상이한 생체이용률 및 약물동태를 제공한다.

아미노글리코사이드와 유사한 올리고당은 핵산에 결합할 수 있고, 앱타머의 활성을 조절하는데 사용될 수 있다. 앱타머와 타겟 사이에 삽입하거나, 아니면 앱타머와 타켓 사이의 결합을 방해하거나 변화시키는 소분자는 또한 치료 레귤레이터로서 사용될 수 있다. 이러한 소분자는 소분자의 유무에 관계없이 앱타머와 타겟 사이의 결합 변화량을 측정하는 분석에서 후보를 스크리닝하거나, 소분자의 유무에 관계없이 타겟에 대한 앱타머의 생물학적 효과 차이를 측정하는 생체 내 또는 시험관 내에서의 분석을 이용함으로써 확인될 수 있다. 일단 소분자가 원하는 효과를 나타내는 것으로 확인되면, 원하는 조절 작용에 대한 화학 구조를 최적화하는데, 기법, 예컨대 조합 방법이 사용될 수 있다.

표준 결합 분석은 본 발명의 모듈레이터를 확인하여 선택하는데 사용될 수 있다. 비한정적인 예는 겔 시프트 분석 및 BIACORE 분석이다. 즉, 테스트 모듈레이터는 테스트 조건 또는 전형적인 생리적 조건하에서 타겟할 앱타머와 접촉하여, 테스트 모듈레이터가 실제로 앱타머와 결합하는지의 여부에 관하여 측정할 수 있다. 그 다음에, 앱타머와 결합하는 것으로 밝혀진 테스트 모듈레이터는 적절한 생물학적 검증 (앱타머 및 이의 타겟 분자에 따라 변화할 것이며, 예를 들면 응고 테스트)에서 분석되어, 테스트 모듈레이터가 이의 타겟 분자에 대한 앱타머로 인한 생물학적 효과에 영향을 미칠 수 있는지를 측정할 수 있다.

겔 시프트 분석은 결합능을 평가하는데 사용되는 기법이다. 예를 들면, 테스트 시퀀스를 포함하는 DNA 단편은 처음에 테스트 단백질 또는 추정 결합 단백질을 포함하는 혼합물로 인큐베이트한 다음에, 전기영동에 의해 겔에서 분리된다. DNA 단편이 단백질에 의해 결합되어 있는 경우에는, 사이즈가 크므로, 이의 이동이 유리 단편의 이동에 대하여 지연될 것이다. 예를 들면, 전기영동 겔 이동도 시프트 분석에 관한 한가지 방법은 (a) 적절한 조건하에서 혼합물 중에서 핵산 결합 단백질을, dsDNA, ssDNA, 및 RNA로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 분자 프로브를 포함하는 비방사성 또는 방사성 표지 핵산 분자와 접촉시켜, 복합체를 형성함에 있어서 단백질과 프로브 사이의 특정한 결합 상호작용을 향상시키고; (b) 혼합물을 전기영동시키며; (c) 정압 블롯 트랜스퍼 또는 캐필러리 트랜스퍼를 이용하여, 복합체를 양전하를 띤 나일론인 막에 이동시키고; (d) 복합체 중의 비방사성 또는 방사성 표지를 검출함으로써, 막에 결합된 복합체를 검출할 수 있다.

Biacore 기술은 센서 칩 표면 상의 결합 사례를 측정하여, 표면에 결합된 반응체 (interactant)가 분석 특이성을 측정한다. 상호작용 특이성을 측정하는 것은 상이한 분자가 고정화 반응체에 결합할 수 있는지의 여부를 단순히 분석하는 것을 포함한다. 결합에 의해, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 신호에 급격한 변화가 일어나므로, 상호작용이 일어나는지의 여부가 바로 명백해진다. SPR에 기초한 바이오센서는 표면에 근접한 생체분자의 질량 농도를 측정함으로써 상호작용을 모니터한다. 표면은 상호작용 파트너 중 하나를 결합시킴으로써 특이성을 나타내게 된다. 다른 파트너(들)를 포함하는 샘플은 표면을 유동하며: 샘플의 분자가 표면에 부착된 반응체에 결합하는 경우에는, 국소 농도 변화 및 SPR 반응이 측정된다. 상기 반응은 표면에 결합하는 분자의 질량에 정비례한다.

SPR은 상이한 굴절률의 2개의 매질 간의 계면에서의 전도막으로부터 특정한 조건하에서 광반사가 일어나는 경우에 발생한다. Biacore 기술에 있어서, 매질은 샘플 및 센서 칩의 글래스이고, 전도막은 칩 표면 상의 금으로 된 얇은 층이다. SPR로 인해, 특정한 반사각에서의 반사광 강도가 감소된다. 이 각은 반사광의 반대측의 표면에 근접한 굴절률에 따라 변화한다. 샘플 중의 분자가 센서 표면에 결합하는 경우에는, 표면에서의 농도, 따라서 굴절률은 변화하고, SPR 반응은 검출된다. 상호작용 과정 중에 시간에 대한 반응을 플롯함으로써, 상호작용 진행의 정량적 측정을 얻는다. Biacore 기술은 최소 반사광 강도 각을 측정한다. 광은 샘플에 의해 흡수되지 않으며, 대신에 광에너지는 골드 필름에서 SPR을 통해 분산된다. SPR 반응값은 공명 단위 (RU)로 나타낸다. 하나의 RU는 최소 강도 각에서의 0.0001°의 변화를 나타낸다. 대부분의 단백질에 관해서는, 이는 센서 표면에서 약 1 pg/㎟의 농도 변화에 대략적으로 상당한다. RU와 표면 농도 사이의 정확한 변환 계수는 센서 표면의 특성 및 농도 변화의 원인이 되는 분자의 특성에 따라 변화한다.

타겟과의 상호작용이 변화하는 방법으로, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유사체, 펩티드, 폴리펩티드, 올리고당 또는 소분자가 앱타머에 결합할 수 있는지를 결정할 수 있는 다수의 다른 분석이 있다. 예를 들면, 전기영동 이동도 시프트 분석 (EMSAs), 적정 열량 측정법, 섬광 근접 측정법, 분석 초원심을 이용한 침강 평형법 (예를 들면, www.cores.utah.edu/interaction 참조), 형광 편광 분석, 형광 이방성 측정법, 형광 강도 측정법, 형광 공명 에너지 이동 (FRET) 분석, 니트로셀룰로스 필터 결합 분석, ELISAs, ELONAs (예를 들면, 미국 특허 제5,789,163호 참조), RIAs, 또는 평형 투석 분석은 앱타머에 결합하는 약제의 능력을 평가하는데 사용될 수 있다. 약제와 앱타머 사이의 상호작용이 직접 측정되는 직접 분석이 행해질수 있거나, 앱타머를 이의 타겟으로부터 치환하는 약제의 능력을 평가하는데 경합 또는 전위 분석이 행해질 수 있다 (예를 들면, Green, Bell and Janjic, Biotechniques 30(5), 2001, p 1094 및 미국 특허 제6,306,598호 참조). 일단 후보 조절제가 확인되면, 이의 타겟에 대한 앱타머의 활성을 조절하는 이의 능력은 생물학적 검증에서 확인될 수 있다. 또는, 약제가 앱타머와 이의 타겟과의 상호작용을 조절할 수 있는 것으로 확인되면, 이러한 결합 분석은 약제가 앱타머와 직접 상호작용하는 것을 입증하는데 사용될 수 있으며, 이러한 상호작용의 친화력을 측정할 수 있다.

다른 실시형태에 있어서는, 질량 분석법은 앱타머에 결합하는 레귤레이터, 레귤레이터와 앱타머 사이의 상호작용의 부위(들), 및 앱타머에 대한 약제의 상대 결합 친화성을 확인하는데 사용될 수 있다 (예를 들면, 미국 특허 제6,329,146호 (Crooke et al.) 참조). 이러한 질량 스펙트럼 법은 또한 앱타머의 모듈레이터로서 사용될 수 있는 선택된 타겟 앱타머에 결합하는 개별 화합물에 관하여, 화학 혼합물 또는 라이브러리, 특히 조합 라이브러리를 스크린하는데 사용될 수 있다. 또한, 질량 스펙트럼 기술은 예를 들면, 화합물의 조합 라이브러리에 대하여, 다수의 타겟 앱타머를 동시에 스크린하는데 사용될 수 있다. 또한, 질량 스펙트럼 기술은 다수의 분자종, 특히 "소" 분자와 타겟 앱타머의 분자 상호작용 부위 사이의 상호작용을 확인하는데 사용될 수 있다.

앱타머와 타겟 사이의 상호작용을 변화시키는데 있어서의 레귤레이터의 유효성을 평가하는 생체 내 또는 시험관 내에서의 분석은 치료할 질환에 대하여 특이적이다. 공지되어 있는 생물학적 특성에 대한 표준 분석이 충분하고, 사용될 수 있다. 생물학적 검정법의 예로는 특정한 용도에 대하여 특정한 앱타머를 기재하는 본 출원서에 인용된 특허공보에 나타나 있다.

본 발명은 또한 앱타머의 모듈레이터를 확인하는 방법을 제공한다. 모듈레이터는 일반적으로 결합 분석, 분자 모델링, 또는 생물학적 기능의 변형을 측정하는 생체 내 또는 시험관 내에서의 분석을 통해 동정될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 핵산에 대한 모듈레이터의 결합은 겔 시프트 분석에 의해 측정된다. 다른 실시형태에 있어서는, 앱타머에 대한 모듈레이터의 결합은 Biacore 분석에 의해 측정된다.

일실시형태에 있어서, 모듈레이터는 1.0 마이크로몰 (μM) 미만, 바람직하게는 0.1 μM 미만, 더욱 바람직하게는 0.01 μM의 모듈레이터 농도에서 용액 중의 앱타머에 실질적으로 결합하는 능력을 갖는다 "실질적으로"란 타겟 생물 활성의 적어도 50% 감소가 타겟의 존재하에서의 변형에 의해 관찰되는 것을 의미하며, 50% 감소는 본 명세서에서 IC₅₀ 값으로서 명명된다.

약제학적 조성물

본 발명의 앱타머 또는 모듈레이터는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 조성물의 명확한 특성은 적어도 부분적으로 안정화 변형을 포함한 앱타머 및/또는 모듈레이터의 특성, 및 투여 경로에 따라 다를 것이다. 일반적으로, 앱타머 또는 모듈레이터는 필요에 따라, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 경구 또는 국소 투여된다.

본 발명의 앱타머 또는 모듈레이터를 포함하는 약제학적으로 유용한 조성물은 공지된 방법에 따라, 예컨대 약제학적으로 허용가능한 담체의 혼합에 의해 제형화될 수 있다. 이러한 담체 및 제형화 방법의 예로는 문헌 [참조: Remington's Pharmaceutical Sciences]에서 찾아낼 수 있다. 효과적인 투여에 적합한 약제학적으로 허용가능한 조성물을 생성하기 위해, 이러한 조성물은 유효량의 앱타머 또는 모듈레이터를 함유할 것이다. 이러한 조성물은 하나 이상의 화합물의 혼합물을 함유할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 화합물은 활성 성분을 형성할 수 있고, 전형적으로 의도된 투여 형태, 즉, 경구 정제, 캡슐, 엘릭시르, 시럽, 좌약, 겔 등에 관하여 적절히 선택된 적절한 약제학적 희석제, 부형제 또는 담체 (본 명세서에서 한데 뭉뚱그려 "담체" 물질로 명명됨)와의 혼합물로 투여되며, 통상적인 약무에 일치한다.

정제 또는 캡슐 형태의 경구 투여에 관해서는, 활성 약물 성분은 경구용 비독성 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체, 예컨대 에탄올, 글리세롤, 물 등과 배합될 수 있다. 또한, 필요에 따라, 적절한 결합제, 윤활제, 붕괴제 및 착색제는 혼합물에 혼입될 수 있다. 적절한 결합제로는 전분, 젤라틴, 천연당, 예컨대 글루코스 또는 베타-락토스, 옥수수 감미료, 천연 및 합성 검, 예컨대 아카시아, 트래거캔스 또는 알긴산나트륨, 카복시메틸셀룰로스, 폴리에틸렌글리콜, 왁스 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 제형에 사용되는 윤활제로는 올레인산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 붕괴제로는 전분, 메틸 셀룰로스, 한천, 벤토나이트, 크산탄 검 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

액체 형태에 관해서는, 활성 약물 성분은 적절히 풍미를 낸 현탁화제 또는 분산제, 예컨대 합성 및 천연 검, 예를 들면, 트래거캔스, 아카시아, 메틸-셀룰로스 등에서 배합될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 분산제로는 글리세린 등을 들 수 있다. 비경구 투여에 관해서는, 멸균 현탁액 및 용액이 요구된다. 통상 적절한 방부제를 함유하는 등장성 제제는 정맥내 투여가 요구되는 경우에 사용된다.

활성 약물 성분을 함유하는 국소용 제제는 당업계에 공지된 각종 담체 물질, 예를 들면, 알콜, 알로에 베라 겔, 알라토닌, 글리세린, 비타민 A 및 E 오일, 광유, PPG2 미리스틸 프로피오네이트 등과 혼합되어, 예를 들면, 알콜 용액, 국소용 클렌저, 클렌징 크림, 스킨 겔, 스킨 로션, 및 크림 또는 겔 제제의 샴푸를 형성할 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 리포솜 전달 시스템, 예컨대 작은 단층 소포, 큰 단층 소포 및 다층 소포의 형태로 투여될 수 있다. 리포솜은 각종 인지질, 예컨대 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린으로 형성될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 타겟가능한 약물 담체로서의 수용성 폴리머과 결합될 수 있다. 이러한 폴리머로는 폴리비닐-피롤리돈, 피란 코폴리머, 폴리하이드록시프로필메타크릴-아미드페놀, 폴리하이드록시-에틸아스파르트아미드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥사이드폴리리신을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 약물 방출 제어를 달성하는데 유용한 생분해성 폴리머 부류, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리락트산, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리하이드록시부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디하이드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 하이드로겔의 가교 또는 양친매성 블록 코폴리머에 결합될 수 있다 (바람직하게는 공유 결합을 통해). 콜레스테롤 및 유사 분자는 앱타머에 결합되어, 생체이용률을 증가시키고 연장할 수 있다.

화합물은 직접 투여될 수 있다 (예를 들면, 단독 또는 리포솜 제제 중에서 또는 담체와 복합체를 형성함 (예를 들면, PEG)) (예를 들면, 미국 특허 제6,147,204호, 미국 특허 제6,011,020호 참조). 일실시형태에 있어서, 다수의 모듈레이터는 단일 PEG 분자와 결합될 수 있다. 모듈레이터는 동일하거나 상이한 앱타머에 결합될 수 있다. 동일한 앱타머에 대하여 다수의 모듈레이터가 존재하는 실시형태에 있어서는, 앱타머와의 다중 결합 상화작용으로 인해 친화성이 증가된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 다수의 PEG 분자는 서로 결합될 수 있다. 이러한 실시형태에 있어서, 동일한 앱타머 또는 상이한 앱타머의 하나 이상의 모듈레이터는 각 PEG 분자와 결합될 수 있다. 이 때문에, 또한 이의 타겟에 대한 각 모듈레이터의 친화성이 증가된다.

친유성 화합물 및 비면역원성 고분자량 화합물은 본 발명의 모듈레이터와 함께 본 발명에 사용하기 위해 제형화될 수 있으며, 현재 당업계에 공지되거나 그 후에 개발되는 각종 기술에 의해 제조될 수 있다. 전형적으로, 이들은 인지질, 예를 들면, 디스테아로일 포스파티딜콜린으로 제조되고, 다른 물질, 예컨대 중성 지질, 예를 들면, 콜레스테롤을 포함할 수 있으며, 또한 표면 개질제, 예컨대 양전하를 띤 (예를 들면, 스테릴아민 또는 콜레스테롤의 아미노만노스 또는 아미노만니톨 유도체) 또는 음전하를 띤 (예를 들면, 디아세틸 포스페이트, 포스파티딜 글리세롤) 화합물을 포함할 수 있다. 다중막 리포솜은 통상적인 기술에 의해, 즉 적절한 용매 중에 지질을 용해시켜 적절한 컨테이너 또는 용기의 내벽에 선택된 지질을 침착시킨 다음에, 용매를 증발시켜 용기의 내벽에 박막을 남기거나 분문 건조에 의해 형성될 수 있다. 그 다음에, 수상을 소용돌이치면서 용기에 가해, MLV를 형성시킨다. 그 다음에, UV는 MLV의 균질화, 초음파 처리 또는 압출 (필터를 통해)에 의해 형성될 수 있다. 또한, UV는 세제 제거 기술에 의해 형성될 수 있다. 본 발명의 특정한 실시형태에 있어서, 복합체는 리포솜의 표면과 결합된 타겟 앱타머을 갖는 리포솜 및 캡슐화된 치료약 또는 진단약을 포함한다. 프리폼된 리포솜은 변형되어, 앱타머와 결합할 수 있다. 예를 들면, 양이온성 리포솜은 정전기 상호작용을 통해 핵산과 결합한다. 또는, 친유성 화합물, 예컨대 콜레스테롤에 결합된 핵산은 프리폼된 리포솜에 가해져서, 콜레스테롤이 리포솜막과 결합하게 된다. 또는, 핵산은 리포솜의 형성 시에 리포솜과 결합할 수 있다.

투여 방법

포유동물 숙주에 대한 본 발명의 바람직한 물질 투여 방법은 비경구, 정맥내, 피내, 관절내, 활액낭내, 수막강내, 동맥내, 심장내, 근육내, 피하, 안와내, 관절낭내, 척수강내, 흉골내, 국소, 경피 (transdermal) 패치, 직장, 질내 또는 요도 좌제, 복막, 경피 (percutaneous), 비내 분무, 외과적 이식, 내과 수술 페인트, 주입 펌프 또는 카테터를 통해서이다. 일실시형태에 있어서, 약제 및 담체는 서방형 제제, 예컨대 임플란트, 볼루스, 미립자, 마이크로스피어, 나노입자 또는 나노스피어로 투여된다. 약물학적 제제에 대한 표준 정보에 관해서는, 문헌 [참조: Ansel, et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Sixth Edition, Williams & Wilkins (1995)]을 참조한다.

본 발명의 앱타머 또는 모듈레이터는 주사 또는 장시간에 걸친 주입에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 치료할 조직이 전형적으로 전신 투여에 의해 체내에 접근되므로, 대부분 치료 조성물의 정맥내 투여에 의해 치료될 수 있지만, 타겟된 조직이 타겟 분자를 포함할 가능성이 있는 다른 조직 및 전달 기술이 주어진다. 따라서, 본 발명의 앱타머 및 모듈레이터는 전형적으로 경구적으로, 혈관 조직에 국소적으로, 정맥내로, 복강내로, 근육내로, 피하로, 강내로, 경피적으로 투여되어, 연동 기술에 의해 전달될 수 있다. 상술한 바와 같이, 약제학적 조성물은 각종 경로에 의해, 예컨대 경구적으로, 혈관 조직에 국소적으로, 정맥내로, 복강내로, 근육내로, 피하로, 강내로, 경피적으로 개체에 주어져서, 연동 기술에 의해 전달될 수 있다. 혈관 조직에 대한 국소성 투여에 관한 대표적 비한정적인 접근법은 (1) 예를 들면, 제거되거나 바이패스된 손상 또는 병든 혈관 조직 세그먼트 대신에 코팅되거나 함침된 혈관을 이식함으로써, 생체 내에서의 전달을 위해 혈관 조직을 핵산 리간드를 포함하는 겔로 코팅하거나 함침하고; (2) 전달을 요하는 용기로 카테터를 통해 전달하며; (3) 핵산 리간드 조성물을 환자에게 이식할 혈관으로 펌프하는 것을 포함한다. 또는, 핵산 리간드는 마이크로인젝션 또는 리포솜 캡슐화에의해 세포로 도입될 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 핵산 리간드는 1일 1회 용량으로 투여될 수 있거나, 전체 1일 투여량은 다수회로 분할하여 투여될 수 있다. 그 후에, 모듈레이터는 모듈레이터의 투여에 의해 핵산 리간드의 효과를 변화시키도록 적절한 수단에 의해 주어진다.

본 발명의 모듈레이터 폴리펩티드를 포함하는 치료 조성물은 예를 들면, 단위 용량의 주입에 의해서와 같이, 통상 정맥내로 투여된다. 본 발명의 치료 조성물에 관하여 사용되는 경우의 용어 "단위 용량"은 대상에 대한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며, 각 단위는 필요한 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 관련하여 원하는 치료 효과를 산출하도록 계산된 소정량의 활성 물질을 포함한다.

조성물은 제형에 적합한 방법으로 본 명세서에 기재된 치료적 유효량으로 투여된다. 적절한 투여 계획은 가변적이나, 초기 투여에 이어서, 연속 주입 또는 다른 투여에 의해 1 시간 이상의 간격으로 반복 투여하는 것이 특징이다. 또는, 혈액 중의 농도를 생체 내에서의 요법에 지정된 범위로 유지하기에 충분한 지속 정맥 주사가 고찰된다.

본 명세서에 사용된 용어 "약제학적으로 허용가능한," "생리적으로 허용되는", 및 조성물, 담체, 희석제 및 시약을 나타내는 이의 문법상의 변화는 서로 바꿀 수 있으며, 물질이 실질적으로 중독성 부작용이 없거나 중독성 부작용을 쇠약하게 하도록 투여될 수 있는 것을 나타낸다

본 발명의 모듈레이터를 포함하는 약제학적으로 유용한 조성물은 공지된 방법에 따라, 예컨대 약제학적으로 허용가능한 담체의 혼합에 의해 제형화될 수 있다. 이러한 담체 및 제형화 방법은 문헌 [참조: Remington's Pharmaceutical Sciences]에서 찾아볼 수 있다. 효과적인 투여에 적합한 약제학적으로 허용가능한 조성물을 형성하기 위해, 이러한 조성물은 유효량의 앱타머를 함유할 것이다. ㅇ이러한 조성물은 하나 이상의 모듈레이터의 혼합물을 함유할 수 있다.

도 1은 세포에 기초한 응고 모델을 나타낸다. TF - 조직 인자; vWF - 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 인자; II - 프로트롬빈; IIa - 트롬빈; Va, VIIa, VIIIa, IXa, Xa, XIa - 응고 인자 V, VII, VIII, IX, X 및 XI의 활성형.

도 2는 REG1 항응고계를 나타낸다. 상기 계는 FIXa 저해제 RB006 및 이의 대응 해독제 RB007로 구성된다. 해독제에 의한 약물의 인지는 도시된 바와 같이, 왓슨-크릭 염기 짝짓기를 통해서이다. RB006는 2'-플루오로 잔기 (대문자) 2'-O-메틸 잔기 (소문자) 및 단일 2'-하이드록실 잔기 (밑줄)로 구성되는 변형 RNA 앱타머이다. RB006는 6-카본 아미노 링커 (L)를 통해 40 KDa 폴리에틸렌글리콜 담체 (P)에 컨쥬게이트되어 있으며, 3' 말단 (idT)의 역위 데옥시티미딘에 의해 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호된다. RB007 (해독제)은 2'-O-메틸 변형 RNA 올리고뉴클레오티드이다.

도 3은 RB006가 정상 혼주 (pooled) 인간 혈장의 APTT에 있어서의 농도 의존성 증가를 나타내는 시험관 내에서의 RB006 APTT 용량 반응 곡선 그래프이다. "평균 Sec"는 평균 APTT이다. 데이터는 4개의 파라미터로 된 로지스틱 방정식에 일치하며, 곡선의 IC50을 측정할 수 있다.

도 4는 개인의 혈장에 있어서의 RB006 항응고 효과의 그래프이다. RB006의 항응고 활성을 4명, 즉 2명의 여자 및 2명의 남자에게서 측정하였다. 혈장 샘플을George King Biomedical (Overland Park, KS)로부터 얻었다. 개인을 선별하여, 응고 인자 레벨에 대하여 정상인 것으로 확인하였다. M/55는 도너가 55세의 남자임을 나타내고; F/49은 도너가 49세의 여자임을 나타낸다. 사용된 APTT 시약은 MDA 플레이틀린 (Platelin) L (Biomeriux)으로, 도 3에 나타낸 연구에 사용된 APTT 시약보다 FIX 레벨에 대하여 비교적 더 민감하다.

도 5는 해독제 RB007의 약물 중화 활성을 나타내는 그래프이다. 앱타머 RB006에 대한 해독제 RB007의 낮은 몰 과잉량은 10분 이내에 RB006의 항응고 활성 을 완전히 중화시킨다. 도시된 테이터는 3개의 단독 측정값의 평균 ± SEM이다. 몰 비는 앱타머 및 해독제 (AD)에 대한 올리고뉴클레오티드의 몰에 기초한다.

도 6는 이전의 약물 투여량의 해독제 중화 후의 앱타머 RB006의 재투여 그래프이다. 피그에게 앱타머 RB006 2.5 mg/kg을 투여하고, 15 분 후에 RB007 해독제 (n = 2) 3 mg/kg로 처리하여, 이러한 초기 투여량을 중화시켰다. 그 다음에, 해독제 RB007 투여 30분 후 (초기 앱타머 투여 45분 후)에, 피그에게 앱타머 RB006 2.5 mg/kg을 재투여하였다. 응고 시간 변화를 전혈에서 (A) ACT (O) 분석으로 측정하거나; (B) 혈장에서 APTT (O) 응고 분석으로 측정하였다. 도시된 테이터는 평균 ± 각 동물의 중복 측정 범위이다. A 및 B의 굵은 선은 테이터 점을 통한 단순한 2점간의 선이다.

도 7은 사이노몰거스 (Cynomolgus) 원숭이 및 인간의 혈장에 있어서의 시험관 내에서의 APTT 용량 반응 곡선의 RB006의 그래프이다. RB006는 인간 혈장에서 관찰된 것과 매우 유사한 원숭이 혈장에 있어서의 APTT의 용량 의존적 연장을 유도한다. 원숭이 (REG1-TOX001 및 REG1-TOX003)에게 행해진 비임상 독성 시험에서 혈장 샘플을 분석하는데 사용된 동일한 브랜드의 APTT 시약, APTT-LS를 사용하여, 실험을 행하였다. 따라서, 이들 데이터는 섹션 8.4에 나타낸 REG1-TOX001 및 REG1-TOX003로부터 APTT 결과를 해석하기 위한 기준으로서 사용된다. 제조업자 (Pacific Hemostasis, Middletown, VA)에 의하면, 이 시약은 < 1% FIX 레벨을 포함하는 인간 혈장 샘플에서는 ∼87.3 초간, ∼20% 정상 FIX 활성을 포함하는 샘플에서는 36.1 초간, 및 100% FIX 활성을 포함하는 샘플에서는 27.5 초간의 APTT를 산 출한다. 시트르산 혼주 사이노몰거스 원숭이 혈장은 Charles River Laboratories, Sierra Division에 의해 제공되었다.

도 8은 RB006 투여에 의한 원숭이의 전신 항응고 그래프이다. 원숭이의 항응고 레벨을 APTT로 모니터링하였다. 15 mg/kg로 처리된 동물에 관해서는, RB006는 평균 ± SEM로 나타낸다. 5 및 30-mg/kg 용량 레벨에서의 동물에 관해서는, 데이터는 평균 ± 범위이고, 이들 각 용량 레벨에서는 다만 2마리의 동물이 있다.

도 9은 RB006를 사용한 원숭이의 전신 항응고 및 해독제 RB007를 사용한 해제의 그래프이다. 원숭이의 항응고 레벨을 APTT로 모니터링하였다. RB006 투여 후 t=3에 RB007을 투여하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 나타낸다.

도 10은 인간의 RB006의 약역학적 활성 그래프이다.

도 11은 RB007에 의한 인간의 RB006의 생리학적 활성 중화 그래프이다.

도 11은 RB007 투여 및 비투여에 의한 RB006의 약역학적 활성을 비교하는 그래프이다.

도 12는 RB006 60 mg로 처리한 후 3시간에서의 RB007 및 플라시보로 처리된 대상에 있어서의 RB007 대 플라시보의 약역학 반응을 비교하는 그래프이다.

도 13은 RB006을 투여한 모든 대상에 대한 0 내지 3시간에 걸친 베이스라인에 대한 보다 상세한 APTT의 상대적 증가의 분석을 나타낸다.

도 14는 RB006 용량 레벨 (15, 30, 60 또는 90 mg)로 만들어진 각 대상에 대한 AUC_{0 -3} 그래프이다. 상대적 효과가 3 시간에 걸쳐서 측정되기 때문에, "3"의 값 은 RB006에 대한 반응이 없음을 나타내고, 6의 값은 베이스라인에 대하여 평균 2배 증가를 나타낸다.

도 15은 RB006 용량 레벨의 함수로서의 중량으로 조정된 RB006의 용량 그래프이다.

도 16은 "중량으로 조정된" RB006의 용량과 비교한 AUC_{O -3} 그래프이다.

도 17은 RB006 용량 레벨의 함수로서의 RB006로 처리된 대상의 BMI로 조정된 용량 그래프이다.

도 18은 RB006 대 BMI로 조정된 용량에 대한 AUC_{O -3} 그래프이다.

도 19은 상이한 용량의 RB006 (15, 30, 60 및 90 mg)에서의 APTT를 나타내는 %FIX 활성에 관하여 베이스라인과 비교한 APTT 그래프이다.

도 20은 관상동맥 질환을 앓는 환자에게 정맥내 투여된 RB006 앱타머 및 RB007 해독제의 4개의 용량을 이용하여 비교한 APTT 반응 그래프이다.

도 21은 모든 치료군에서의 1일, 3일 및 5일에서 RB006 (0.75 mg/kg) 투여 후의 시간 가중 APTT를 나타내는 그래프이다. 그룹 1: 대상에게 1일, 3일, 및 5일째에 단회 용량의 앱타머 (0.75 mg/kg RB006)를 투여한 다음에, 1 시간 후에 해독제의 고정 용량 (1.5 mg/kg RB007)을 투여함; 그룹 2 및 3: 대상에게 1일, 3일, 및 5일째에 단회 용량의 앱타머 RB006 (0.75 mg/kg)를 투여한 다음에, 1 시간 후에 단회 용량의 RB007을 변화시켜 투여하였다.

도 23은 RB006와 비교한 여러 비율에서의 RB006 (0.75 mg/kg) 및 RB007으로 투여된 그룹에서의 시간에 대한 평균 APTT 그래프이다.

도 24는 RB006와 비교한 경우에 있어서의 1 시간에 RB007을 리스트된 비율로 투여한 후에 RB006 투여의 시간 가중 APTT의 회복률을 나타내는 그래프이다.

응고 테스트 방법

응고의 표준 측정은 혈장 및 전혈에 있어서의 플라스마 베이스 프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 분석, 및 전혈 베이스 (whole blood-based) 활성응고시간 (ACT) 분석을 포함한다. 이들 각각의 분석에서 응고를 개시하는데 사용되는 활성화제가 상이하지만, 이들은 분석 종말점으로서의 혈전 형성의 공통 특징을 공유한다. 중요하게는, 이러한 시험관 내에서의 분석에 있어서, 저 레벨의 트롬빈, ∼10 내지 30 nM은 종말점에 이르기에 충분한 피브린을 생성하기에 충분하다. 이러한 레벨의 트롬빈은 다만 3 내지 5% 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 나타내며, 응고 반응의 개시 단계 시에 생성되는 트롬빈의 양과 일치한다 (Butenas et al., 2003; Mann et al., 2003). 따라서, 이들 분석은 주로 응고 반응의 개시 단계에 대하여 리포트하고 있으며, 주로 응고의 전파 단계에 포함된 응고 인자의 결핍 또는 이의 억제의 영향에 관해서는 충분히 반영되어 있지 않다.

표준 혈전 베이스 (clot-based) 분석이 FIX/IXa 활성을 나타내는 방법은 혈우병 A (FVIII 결핍) 또는 B (FIX 결핍)을 앓는 개체에 있어서의 응고 이상 측정을 검출하거나 검출하지 않는 이들의 능력에 의해 예시된다. 혈우병의 특징은 혈우병 을 앓는 개체가 이상 APTT을 가지지만, 정상 PT를 갖기 때문에, 분리된 APTT의 연장을 갖는다는 것이다 (Bolton-Maggs and Pasi, 2003). 세포에 기초한 응고 모델은 FVIII 또는 FIX이 결핍된 개체가 정상 PT를 레지스터하는 이유에 관한 패러독스를 설명한다. PT 분석은 11 내지 15 초에 혈전을 형성시키기에 충분한 초생리학적 레벨의 조직 인자로 개시된다. 따라서, 반응을 신속하게 개시하는데 사용되는 고 레벨의 조직 인자-FVIIa 복합체는 FVIII 또는 FIX의 부재하에서도 혈전 종말점에 이르도록 충분한 트롬빈을 산출하기에 충분한 양으로 FXa를 산출한다. 따라서, 이러한 분석에서 응고 개시에 있어서의 FIX의 역할이 마스크되거나 바이패스되기 때문에, FIX/FIXa 활성의 더욱 격심한 억제가 PT 분석에 영향을 미치지 않는 것으로 예기된다. 따라서, FIXa의 약리학적 저해제, 예컨대 안티-FIXa 앱타머 RB006는 PT값을 연장하지 않는 것으로 예측된다.

혈장 또는 전혈 APTT 분석은 ∼28 내지 35초에 혈전을 형성하기에 충분한 양의 하전 미립자, 예컨대 셀라이트 또는 카올린, 인지질 표면, 및 칼슘으로 개시된다. 혈우병 B (및 A)을 앓는 개체는 이상 APTT 값을 레지스터하나; 분석이 주로 응고의 개시 단계에 대하여 리포트하기 때문에, 이들 개체에 있어서의 APTT의 연장 크기는 제한된다 (즉, 제한된 값을 산출). APTT가 FIX 이외에도 다른 응고 인자에도 의존하기 때문에, 개체의 혈우병 B 중증도와 이들의 APTT값 사이에는 밀접한 상관관계가 존재하지 않는다. 따라서, FIXa의 약리학적 억제가 APTT 분석에서 어떻게 레지스터되는지를 예측하는 것을 해석하기 위한 양호한 프레임워크는 혈장 FIX 분석이다. 혈장 FIX 분석은 APTT를 행하기 전에, 테스트 혈장이 완충액에 희석되 어, FIX 결핍 혈장과 혼합되는 표준 APTT 방법의 변형이므로, 테스트 혈장의 FIX 레벨은 응고 시간의 일차 결정 인자이다. 이러한 분석은 전형적으로 혈우병 B의 중증도를 측정하거나 (즉, FIX 레벨 측정) FIX의 확득된 저해제를 진단하는데 사용된다. FIX 분석 결과는 테스트 샘플의 응고 시간을 FIX 레벨 표준 곡선과 비교함으로써 해석되며, 이는 FIX 결핍 혈장과 혼합하기 전에 완충액 중에서의 정상 혈장의 연속 희석으로 준비된다. 표 1은 정상 인간 혈장으로 행해진 전형적인 FIX 레벨 표준 곡선을 나타낸다 [주: 이러한 분석에서의 절대 APTT 시간은 시약 의존성을 나타낸다.]. 표 1에서 관찰되는 바와 같이, 25% 정상 (즉, 75% 감소) FIX 레벨에서, APTT 응고 시간은 베이스라인 보다 1.4 배 이상 증가된다. ∼3% 정상 (즉, 97% 감소) FIX 레벨에서, APTT 응고 시간은 베이스라인 보다 2 배 이상 증가되고, <1% 정상 (즉, >99% 감소) FIX 레벨에서는 APTT 응고 시간은 베이스라인에 관하여 2.5 배 증가된다. 혈우병 B (즉, ∼50% 정상 FIX 레벨)의 담체는 정상 APTT 값을 나타내며 (Bolton-Maggs and Pasi, 2003), 이는 FIX 레벨 표준 곡선의 데이터와 일치한다. 전체적으로 보면, 이러한 관찰로부터, 상당한 비율의 FIX 활성이 APTT가 연장되기 전에 억제되어야 한다는 것을 알 수 있다.

ACT 분석이 검사 중에 항응고를 모니터하기 위해 주로 수술실 및 카테터 검사실에서 사용되기 때문에, 혈우병을 앓는 개체가 전형적으로 이러한 검사를 행하기 전에 인자 보충 요법 (또는 유사 요법)으로 치료됨에 따라, ACT가 감소된 FIX/FIXa 활성에 의해 어떻게 영향을 받는지에 관한 데이터는 거의 존재하지 않는다. 그러나, ACT가 하전 미립자로 개시되는 응고 종말점 분석이기 때문에, ACT 분석에서의 FIXa의 약리학적 억제 효과는 APTT 분석에서 관찰된 것을 반영할 것 같다. 즉, 실질적인 FIXa 억제도에 이를 때까지 (>50%), ACT의 연장이 관찰되지 않을 것으로 예상된다. 따라서, APTT 분석과 유사하게, ACT 연장 크기는 미분획 헤파린으로 관찰된 연장과 비교하여, 낮을 것으로 예상된다. 최종적으로, 이 분석은 FIXa 억제에 응하여 만족시킬 것으로 예상된다. APTT 및 ACT 반응에 있어서의 이러한 유사성은 비임상 독성 시험에서 다양한 용량의 RB006로 처리된 원숭이에게서 입증되었다.

응고 측정에 대한 REG1 항응고계의 효과

이전의 데이터는 항 FIXa 앱타머가 시험관 내에서나 동물에게 정맥내 투여를 행해도 PT를 연장하지 않는 것을 보여준다 (Rusconi et al., 2004, Nat Biotechnol. 22(11): 1423-8; Rusconi et al., 2002, Nature 419(6902):90-4; Dyke, 2006, Circulation. 114(23):2490-7). 도 3에 도시된 바와 같이, RB006는 시험관 내에서의 혼주 정상 인간 혈장 중의 APTT의 용량 의존적인 증가를 이끌어낸다. 이 데이터는 RB006 APTT 용량 반응 곡선이 0과 30-50 ㎍/mL 사이에서 가장 민감하며, 그 후에 정체 상태에 이른다. APTT 용량 반응 곡선의 상승기 및 정체 상태를 포함하는 이러한 특징은 RB006 또는 이전의 항 FIX 앱타머가 교차 반응성을 나타내는 인간, 돼지, 마우스 및 원숭이를 포함하는 모든 종의 혈장에서 일관된다 (Rusconi et al., 2004, Nat Biotechnol. 22(11): 1423-8). 항 FIXa 앱타머를 이용한 시험관 내에서의 혈장의 처리에 응하여 달성된 최대 APTT는 사용된 APTT 시약 및 종에 의존한다. 중요하게는, 그러나, 이러한 최대 APTT는 FIXa 활성의 완전 저해 또는 거의 완전한 저해에 일치한다. 이는 항 FIXa 앱타머에 응한 최대 APTT가 <1% 정상 FIX 레벨 (그러나, 모든 다른 응고 인자 레벨에서 정상)을 포함하는 인간 혈장의 APTT 및 FIX-녹아웃 마우스의 혈장의 APTT에 해당하는 사실에 의해 명시된다 (Rusconi et al., 2004, Nat Biotechnol. 22(11):1423-8). 따라서, RB006에 응한 APTT의 정체 상태는 앱타머에 의한 FIX/FIXa 억제 포화를 반영할 것 같다.

또한, 도 3의 데이터와 표 1의 혈장 FIX 분석 표준 곡선과 비교함으로써, RB006의 효능에 대한 통찰력을 가지게 된다. APTT는 ∼5 ㎍/mL의 RB006 농도에서 RB006에 응하여 ∼1.4 배 증가하며, 이는 이러한 RB006의 농도가 ∼75% 혈장 FIX 활성을 억제하는데 충분하다는 것을 나타낸다. 또한 혈장 FIX 분석에 따르면, 혈장 FIX의 거의 95% 억제 (APTT가 2.0 배 증가)가 10 내지 15 ㎍/mL의 RB006 농도에서 달성된다.

개체의 혈장에서의 APTT의 RB006 농도 의존적인 연장을 측정함으로써, RB006의 항응고 효과의 개체차를 평가하기 위해 시험관 내에서의 연구를 행하였다. 혼주 정상 인간 혈장 대 개체의 혈장의 시험관 내에서의 RB006 APTT 용량 반응 곡선의 비교는 도 4에 도시된다.

도 4에 도시된 바와 같이, APTT의 RB006 농도 의존성 증가는 각 개체의 혈장에서와 매우 유사하다. 또한, 개체의 혈장에서의 APTT의 RB006 농도 의존성 증가는 혼주 정상 인간 혈장의 그것과 매우 유사하다 (풀당 20 도너). RB006는 또한 ACT 분석에서 측정된 응고 시간을 연장한다 (Rusconi et al., 2004, Nat Biotechnol. 22(11): 1423-8). 그러나, RB006 농도의 함수로서의 ACT 변화의 해석은 이러한 분석이 새로운 전혈을 필요로 하기 때문에, ACT를 이용한 시험관 내에서의 용량 반응 연구를 행하는 어려움으로 인해 현시점에서 제한되어 있으며, 시간 의존적이다.

해독제 RB007에 의한 RB006의 항응고 활성의 중화는 APTT 분석을 이용하여 시험관 내에서 측정되었다. 도 5에 도시된 바와 같이, RB007의 농도가 혼주 인간 혈장의 고정 농도의 RB006에 비례하여 증가함에 따라, APTT 값 변화량은 베이스라인 레벨로 복귀되는데, 이는 RB007의 항응고 활성의 완전 중화를 나타낸다. 인간 혈장의 시험관 내에서의 완전 RB006 중화에 요구된 RB007의 최소 몰 과잉량은 약 3 배 내지 4 배 (즉, 앱타머의 올리고뉴클레오티드 부분에 대한 해독제의 몰 비)이다. 이는 RB006-RB007 듀플렉스 (T_m, ∼90℃)의 측정된 열역학적 안정성과 일치한다.

도 5에 나타낸 데이터는 또한 비임상 안전성 약리학 및 독성 시험 및 임상 시험에 사용된 약물 RB006에 대한 해독제 RB007의 용량비의 선택에 관한 기준이 된다. 인간 혈장의 시험관 내에서의 RB006의 완전 중화를 달성하는데 필요한 RB006에 대한 RB007의 최소 몰 과잉량은 3 배 내지 4 배이다. RB007 (5,269 Da, 나트륨 염)과 RB006 (∼50,964 Da, 나트륨 염) 사이의 분자량 차이를 고려하면, 이는 0.5:1 해독제:약물의 중량 대 중량비로 변화한다. 이것이 시험관 내에서의 결과이므로, 어느 한 성분의 약물동태가 생체 내에서의 약물 중화에 어떻게 영향을 미치는 가를 예측하지 못하기 때문에, 해독제:약물의 0.5:1 중량비는 약물을 효과적으로 중화하는 것으로 예상되는 해독제의 최소비를 반영한다. 따라서, 2:1 해독제:약물의 중량 대 중량비, 시험관 내에서의 최소 유효량 비의 작은 배수 (multiple)는 비임상 및 임상 시험에 대한 개시 용량으로서 선택되었다.

요약하면, 항 FIXa 앱타머 RB006는 시험관 내에서의 FIXa 활성의 완전 또는 거의 완전한 저해를 할 수 있는 강력한 응고 FIXa의 저해제이다. RB006의 항응고 활성은 RB007에 의해 앱타머 활성을 중화할 수 있기 때문에, APTT 및 ACT 분석으로 효과적으로 모니터될 수 있다. 시험관 내에서의 연구로부터, FIX 저해율 대 APTT 변화량 사이의 관계는 RB006에 관하여 잘 정의되어 있다. 앱타머 활성의 완전 저해를 달성하기에 충분한 해독제 대 앱타머의 적절한 몰 비도 시험관 내에서의 연구로부터 정의되었으며, REG1 항응고계에 선택된 해독제:앱타머의 2:1 mg/kg 용량비를 산출하였다.

비임상 약리학, 약물 동태, 및 독성

REG1 항응고계 및 이의 개별 약물 및 해독 성분 (또는 각각 RB002 및 RB004로 명명되는 덜 강력한 약물 및 해독제의 프로토타입)의 생리학적 활성을 시험관 내에서 임상적으로 관련된 동물 모델에서 입증하였다.

항 FIXa 앱타머의 항응고 활성은 돼지의 전신성 항응고제 연구 (Rusconi et al., 2004, Nat Biotechnol. 22(11): 1423-8), 양 심폐 바이패스 모델, 및 사이노몰거스 원숭이의 안전성 약리학 연구에서 평가되었다. 항 FIXa 앱타머의 항혈전 작용도 마우스 동맥 손상 모델 (Rusconi et al., 2004, Nat Biotechnol. 22(11): 1423-8)에서 입증되었다. 해독제의 약물 중화 활성은 인간 혈장의 시험관 내에서 (Rusconi et al., 2002, Nature 419(6902): 90-4), 돼지 전신 항응고 모델, 외과 수술에 의한 외상의 마우스 모델 (즉, 고도로 항응고처리된 동물의 꼬리 절단) (Rusconi et al., 2004, Nat Biotechnol. 22(11):1423-8), 양 심폐 바이패스 모델, 및 사이노몰거스 원숭이의 안전성 약리학 연구에서 입증되었다. 또한, 이전의 약물 용량의 해독제 중화 직후에 재투여되는 약물의 능력은 돼지 전신 항응고 연구에서 입증되었다.

REG1 항응고계의 약물동태의 특성화는 혈장 샘플의 앱타머, 해독제 및 앱타 머/해독제 복합체의 레벨을 정량화하는 신규 방법에 의지하는 생물 분석 전략을 필요로 하였다. 이들 방법은 생체 내에서의 독성 시험에서 수집한 샘플에 적용되며, 원숭이 및 마우스의 단회 및 반복 투여의 조건하에서 모든 3개의 분자적 실체의 약물 동태를 측정할 수 있다.

REG1 항응고계의 철저한 안전성 평가를 행하였다. 일차 독성 시험을 초기 임상 시험에서 생성물의 사용 목적을 시뮬레이션하는 투여 조건하에서 원숭이 및 마우스에서 행하였다 (즉, 해독제 투여 3 시간 후에 행하진 앱타머의 연속 투여). 각 성분의 작은 임상 배수 대 큰 임상 배수를 임상 용도에 의도된 동일한 용량비로 테스트하고, 두가지 종에 대하여 앱타머 및 해독제의 효과를 분리하여 테스트하였다. 양쪽의 원숭이 연구에 있어서, 초기 임상 시험에서 의도된 투여를 모방하는 스케쥴에 따라 앱타머, 해독제 또는 양 피험물질의 단회 투여가 행해진 다수의 치료군이 있었다. 또한, 14일간의 마우스 연구 및 단회 및 반복 투여의 원숭이 독성 연구에서, 2주간에 걸쳐서 반복 투여가 행해진 그룹을 포함하였다 (마우스에 대해서는 14회 투여, 원숭이에 대해서는 2주간 동안 하루 걸러 투여된 것으로, 7회 투여). 특수 종말점은 약역학 반응, REG1 성분에로의 노출, 및 올리고뉴클레오티드 부류의 효과를 평가하도록 독성 시험에 포함되었다. 코어 독성 시험은 원숭이의 안전성 약리학 평가 (전파 원격 측정법을 이용), 일련의 유전 독성 분석, 및 혈액 적합성 연구로 보충되었다.

돼지의 항응고제 및 약물 중화 활성 연구

앱타머의 초기 용량의 해독제 RB007 중화 후에 재투여된 앱타머 RB006의 능 력은 돼지의 전신 항응고 모델에서 평가되었다. 이러한 연구에 있어서, 약물의 제 2 용량을 해독제 투여 30분 후에 투여하였다. 해독제 투여와 앱타머의 재투여 사이의 30 분간의 시기는 제 1 앱타머 용량의 항응고 활성의 중화에 대하여 명백하게 실험으로 증명할 수 있도록 선택되었다. 도 6에 도시된 바와 같이, 피크 항응고 활성, 및 앱타머의 제 2 용량의 피크 항응고 활성에 대한 시간은 초기 앱타머 용량에 의한 것과 실질적으로 동일한데, 이는 제 1 앱타머 용량의 해독제 중화 후의 앱타머 재투여는 가능하다는 것을 입증한다. 이러한 데이터는 마우스 및 원숭이에서 관찰된 RB007의 약물 동태와 일치하며, 이는 RB007이 매우 짧은 혈장 중 반감기 (즉, 몇분간)를 갖고, 본 연구에서 사용된 것보다 실질적으로 더 높은 용량으로도 감지할 수 있는 혈장 농도를 축적하지 않는다는 것을 나타낸다. 해독제의 반감기를 고려하면, 앱타머가 해독제 투여 후 30분보다 더 짧은 시간 간격으로 효과적으로 재투여될 수 있다.

양의 심폐 바이패스 중의 관상동맥 바이패스 그라프트 ( CABG )에 있어서의 REG1 항응고계의 유효성

REG1은 급성 관상동맥 증후군을 앓고 있는 인간을 포함한 환자에 사용되는 해독제 가역성 항응고제 및 항응고 요법 또는 혈전증 치료를 위한 해독제 가역성 약제를 사용하는 것이 유리한 다른 징후에 대한 항응고제로서, 관상동맥 혈관 재생술 [관상동맥 바이패스 그라프트 (CABG) 및 경피 관동맥 인터벤션 (PCI)]의 해독제 가역성 항응고제로서 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 연구는 심폐 바이패스 (CPB)로 CABG 수술을 받은 동물에서의 CPB 회로의 개방성을 유지하고, 이 모델에서 RB006를 중화하는데 필요한 REG1의 해독 성분, RB007의 대응하는 용량을 규정하는데 필요한 REG1의 항응고 성분, RB006의 용량 범위를 규정하기 위한 것이다.

RB006 (항응고제)를 관상동맥 바이패스 수술의 개시시에 10 마리의 양에게 정맥내로 투여하였다. 수술의 종료 시에, RB006의 효과를 역전시키도록 RB007 (RB006 중화제)를 정맥내로 투여하였다. 28±3일 후에, 모든 동물을 안락사시켰다.

좌우 신장, 간, 폐, 및 뇌전체의 대표 샘플을 수집하였다. 혈액의 제거 및 관류압이 최소 6 시간 동안 10% 중성 완충 포르말린 (NBF)으로 ∼100 mmHg으로 고정될 때까지, 심장을 락트산을 가한 링거액 또는 생리식염수로 플러싱하였다. 완전 고정시에, 심장을 10% NBF에 두었다. 해부 시에 수집한 대표 조직 샘플을 10% NBF로 고정시켜 침지시켰다.

심장을 약 1 cm 마다 횡방향으로 잘라서 (한 덩어리의 빵 형태로), 이상을 조사하였다. 각각의 심장에서 10개의 잘라낸 부분을 수집하여, 파라핀으로 처리하였다. 10개 중 3개의 잘라낸 부분은 LCX 문합, 대동맥 문합, 및 미드-그라프트 (mid-graft)를 포함하였다. 남아있는 7개의 잘라낸 부분은우심방벽, 좌심방벽, 심방 중격, 우실자유벽, 좌실자유벽, 심실 중격, 및 정점 (apex)을 포함하였다. 심근 조직을 포함하는 모든 파라핀 블록을 2회 절단하였는데, 한 번은 헤마토실린-에오신 (H&E)으로 염색하고, 한 번은 Masson's Verhoeff Elastin (MVE)으로 염색하였다. 신장, 간, 폐, 및 뇌의 샘플을 파라핀에 끼우고, 다음과 같이 절단하였다: 각각의 신장으로부터의 하나의 잘라낸 부분, 간으로부터의 하나의 잘라낸 부분, 폐로 부터의 하나의 잘라낸 부분, 및 뇌조직의 4개의 샘플 각각으로부터의 하나의 잘라낸 부분으로, 전체가 8개의 잘라낸 부분을 포함하였다. 모드 얻어진 슬라이드를 H&E로 염색하였다.

이러한 연구에 관한 거시적 관찰 및 조직학적 상관 관계는 대부분의 병변이 외과적 처리 (예를 들면, 부착) 또는 안락사 (예를 들면, 기관 및 기관지의 거품)와 관련이 있는 것을 나타낸다. 부착은 이러한 처리 타입의 통상적인 후유증으로, 본 연구에서 지나치게 고려되지 않았다.

한 동물의 대동맥 문합에는 최소한도로 부착된 작은 혈전이 존재하였다. 혈전은 이식 조직으로의 혈류를 방해하지 않는 것으로 나타났다. 이러한 관찰에 대한 특정한 미시적 상관 관계가 없었다. 문합 부위에서의 현미경적 소견은 양 그룹에서의 다른 대상 동물과 타입 및 크기에서 유사하였다. 단 하나의 예외로서, 대상 동물에서의 관상동맥 바이패스 부분 내에 혈전증 또는 폐색의 거시적 증거가 없었다. 우발적인 혈전 형성은 이러한 모델에서 보기 드문 일이 아니기 때문에, RB006 투여와의 관련성은 의심스럽게 여겨진다.

사이노몰거스 원숭이의 REG1 항응고계의 약역학적 활성

사이노몰거스 원숭이의 혈장에서의 RB006의 시험관 내에서의 항응고 활성은 APTT 분석에서 응고까지의 시간의 농도 의존적 연장에 의해 반영된다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, RB006 APTT 용량 반응 곡선은 다른 종에서 알 수 있듯이 0내지 50 ㎍/mL에서 가장 민감하며, 그 후에 정체 상태에 이른다. 원숭이 및 인간 용량 반응 곡선은 반응 범위가 인간에서 더 큰 것을 제외하고는 유사하다. 인간 혈장에서, 약 200 ㎍/mL 이하에서는 APTT의 농도 의존적 연장이 존재하지만, 원숭이 혈장에서는 농도반응 곡선은 약 50 ㎍/mL에서 정체 상태에 이른다. 인간 혈장 곡선의 정체 상태는 <1% 혈장 FIX 활성을 포함하는 인간 혈장에 관찰되는 것에 상당하는 APTT 값에서 일어나며, 타겟, FIXa의 포화로 인한 것 같다. 혈장 FIX 분석은 원숭이 혈장의 RB006 APTT 용량 반응 곡선의 해석을 돕도록 행해졌다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 원숭이 혈장의 APTT는 FIX 레벨에 민감하다. 그러나, FIX 레벨의 감소에 대한 반응 크기는 적당하다. FIX 레벨의 75% 감소는 APTT가 1.4배 증가되며, FIX 레벨의 >95% 감소는 APTT가 배가되고, 혈장 FIX 레벨의 99.9% 감소는 APTT가 2.5 배가된다.

도 7의 데이타와 표 2에 나타낸 데이터의 비교는 ∼6 ㎍/mL RB006가 원숭이 의 혈장 FIX 활성을 약 90% 저해하는데 필요하고 (즉, 이 농도는 APTT가 1.6 배 증가된다), 혈장 FIX 활성의 >95% 억제는 10 내지 12 ㎍/mL의 RB006 농도에서 일어난다. 시험관 내에서의 RB006 원숭이 APTT 용량 반응 곡선은 베이스라인에 대하여 약 2.5배 증가에서 정체 상태에 이르며 (베이스라인 ∼24 초간, 최대 APTT ∼60 초간), <0.1% 정상 FIX 레벨에서 원숭이 혈장 FIX 분석에서 관찰된 APTT의 증가 크기와 일치한다 (표 2 참조). 따라서, RB006 APTT 용량 반응 곡선의 정체 상태는 아마도 원숭이 혈장의 타겟의 포화를 나타낼 것이다 (즉, FIX 활성의 완전 저해). 결론적으로, % FIX 저해율 대 원숭이 혈장의 시험관 내에서의 혈장 RB006 농도는 통상 인간 혈장의 시험관 내에서 관찰된 것과 유사하며, 중요한 차이점은 베이스라인과 최대 APTT 사이의 RB006 농도 범위가 인간에서 더 크고, 용량 반응 증가가 원숭이 혈장에서보다 인간 혈장에서 더욱 점진적이다.

사이노몰거스 원숭이의 RB006 및 RB007 의 생체내에서의 활성

RB006 및 RB006/RB007 복합체의 항응고성과 이들 화합물의 혈장 레벨 사이의 관계는 원숭이 안전성 약리학 연구 REG1-TOX001에서 평가되었다. 요컨대, 12 마리의 원숭이를 3개의 치료군으로 배정하였다. 그룹 1은 항 FIXa 앱타머 RB006를 수용하고, 그룹 2는 RB006의 해독제, RB007을 수용하며, 그룹 3는 REG1 항응고계, 즉, RB006에 이어서 RB007로 처리하였다 (3시간 후에). 용량을 피험물질의 2개의 양을 통해 단계적으로 증가시켰는데, 연구 4일째에 제 1 투여를 행하고 13일째에 제 2 투여를 행하였다. RB006의 용량 반응을 더욱 잘 이해하기 위해, 그룹 1 (RB006, 앱타머 단독)로 배정된 4 마리의 원숭이를 13일째에 2개의 그룹으로 세분 하였는데, 2 마리의 동물은 저 용량을 수용하고 (그룹 1a, 5 mg/kg RB006), 2 마리의 동물은 고 용량을 수용하였다e (그룹 1b, 30 mg/kg RB006).

도 8에 도시된 바와 같이, RB006를 5 내지 30 mg/kg 범위의 용량으로 투여한 바, 원숭이의 큰 항응고 레벨을 얻었다. 각 용량 레벨에서의 평균 APTT는 RB006 투여 후에 0.25 내지 24 시간에 60초를 초과하였고, 이는 원숭이의 <0.1% 정상 혈장 FIX 레벨에 상당한다. RB006 투여에 따른 APTT의 용량 의존적인 증가가 있다.

그러나, 용량 반응은 RB006 혈장 레벨이 RB006 투여 후 6 시간 시점까지, 시험관 내에서의 APTT 용량 반응 곡선이 정체 상태 (∼40 내지 50 ㎍/mL; 표 3 및 도 7 참조)에 접근하는 농도를 초과한다는 사실로 인해 즉시 명백해지지 않는다. RB006 투여 후 6 시간을 초과하는 시점에서는, RB006 농도가 이러한 레벨 이하로 감소되기 때문에, 용량 반응은 더욱 명백해진다. APTT는 5 및 15 mg/kg 용량의 RB006를 수용한 원숭이의 베이스라인으로 복귀될 때까지 행해졌다. 평균 APTT는 5-mg/kg 용량 레벨에서 120 시간에 베이스라인으로 복귀되고, 15-mg/kg 용량 레벨에서 192 시간에 베이스라인으로 복귀되었는데, 이는 원숭이의 RB006에 관한 시험관 내에서의 APTT 용량 반응 곡선 (도 7) 및 약 12 시간의 관찰된 반감기 (표 3 참조)와 일치한다. 전혈 활성응고시간 (ACT) 데이터는 APTT 데이터를 반영하였다 (데이터 도시되지 않음).

듀얼 올리고 하이브리드화 ELISA 분석을 이용하여, RB006 투여 후 처음 24 시간에 대한 여러 시점에서 독성 동태 데이터를 수집하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, RB006 농도는 투여 용량의 함수로서 증가되고, RB006의 반감기는 12 시간 범 위에 있었다. 도 8에 나타낸 데이터와 일치하는 것으로, RB006의 혈장 레벨 (표 3)과 도 7에 도시된 시험관 내에서의 용량 반응 곡선의 비교는 동물이 모든 용량 레벨에서 RB006 투여 후 처음 24 시간을 통해 완전히 항응고되는 것을 나타내었다. 이들 용량 레벨은 제시된 임상 범위 이상이다. 그룹 1a 동물의 투여 후 24 시간 후의 평균 RB006 농도와 이들 동물의 평균 APTT는 양호하게 일치한다. 24 시간에서의 5 mg/kg RB006로 처리된 동물의 평균 RB006 농도는 15.9 ㎍/mL이고, 평균 APTT는 61.1 초이었다. 이는 원숭이의 시험관 내에서의 RB006 용량 반응 곡선에 의거한 예측된 결과에 비교하여, 매우 유리하다 (도 7 참조). 따라서, 이러한 연구는 RB006로 처리된 원숭이의 항응고 레벨을 모니터하는 APTT의 유용성을 확인하며, 데이터는 초기 임상 연구에서 RB006를 수용한 인간의 항응고 상태를 모니터하기 위한 APTT의 용도를 지지한다.

해독제 RB007 만으로 처리된 그룹 2 동물에 있어서, 평균 APTT 및 ACT는 테스트된 용량 레벨 (30 및 60 mg/kg)의 RB007 투여에 의해 영향을 받지 않았다. 듀얼 올리고 하이브리드화 ELISA 분석을 이용하여, RB007 투여 후 처음 24 시간에 대한 여러 시점에서 독성 동태 데이터를 수집하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 낮으나 측정가능한 레벨의 해독제가 4일째에 30 mg/kg 또는 13일째에 60 mg/kg의 주입 후 0.25 시간에 RB007을 수용한 동물의 혈장에 존재하였다. 이러한 레벨은 극도로 변하기 쉬우나, 통상 용량 의존적이었다. 해독제의 투여 후 레벨은 정맥내 주사 후의 앱타머의 농도 (그룹 1)와 비교하여 매우 낮았다. 따라서, 해독제가 단독 투여되는 경우에는 매우 낮은 혈장 중 반감기를 갖는 것은 분명하며, 주로 주사 15분 후에 순환으로부터 명백하다.

RB006에 이어서, 3 시간 후에 RB007로 처리된 동물의 APTT 데이터 (그룹 3)는 도 9에 도시되어 있다. RB006 만으로 처리된 동물의 데이터와 일치하고, 이들 용량 레벨에서의 RB006의 투여는 큰 항응고 레벨을 산출하며, 이는 투여 후 0.25 및 3 시간 후의 평균 APTT는 실질적으로 두 용량 레벨에서의 완전 FIX 저해와 일치하였다. RB007의 연속 투여는 원숭이의 RB006의 항응고 효과를 신속하게 완전히 중화시키며, 테스트된 두 RB006/RB007 용량 레벨에서의 RB007 투여 후 15 분 이내에 (취해진 제 1 시점) 베이스라인으로 복귀하는 평균 APTT를 나타내었다. 30/60 mg/kg RB006/RB007로 처리된 그룹 3 동물에 있어서, APTT는 RB006 투여 후 5일간 추적되었다. 이러한 기간에 걸쳐서 수집된 APTT 데이터는 RB006의 항응고 효과가 지속적으로 중화되었으며, 120 시간 또는 원숭이에 있어서의 RB006의 약 10 시간의 반감기에 대한 리바운드 항응고에 대한 증거는 없음을 나타낸다 (도 9). 해독제 RB007에 의한 RB006의 항응고 활성의 중화 지속성은 이러한 약물-해독제 복합체의 관찰된 열역학적 안정성에 완전히 일치한다.

그룹 3 동물에서의 RB006 투여 후 24 시간 동안 독성 동태 데이터를 수집하였다 (표 5). 그룹 3 동물에 관해서는, 유리 RB006 (즉, RB007에 의해 결합되어 있지 않은 RB006) 및 복합체형 RB006 (즉, RB007에 의해 결합되어 있는 RB006) 혈장 농도를 측정하였다. 도 9에 나타낸 APTT 데이터와 일치하며, 투여 후 0.25 및 3 시간에서의 RB006의 평균 혈장 농도는 꽤 높았다. RB007 투여 15 분 이내에, 유리 RB006의 평균 농도는 사용된 분석의 정량 하한값 (LLOQ) 이하의 레벨로 5,000배 내지 10,000배 감소하였다. 유리 RB006 레벨의 감소와 동시에, 복합체형 RB006의 평균 혈장 농도는 각각 15/30 및 30/60 mg/kg 용량 레벨에서 분석의 LLOQ 이하로부터 ∼125 내지 220 ㎍/mL로 증가하였는데, 이는 유리 RB006 농도의 급속한 감소가 RB006에 대한 RB007의 결합으로 인한 것임을 나타낸다. 유리 RB006의 농도는 RB007 투여 후 3 시간 동안은 분석의 LLOQ 이하로 남았는데, 이는 APTT 결과와 일치한다. RB007 투여 후 21 시간에 (RB006 투여 후 24 시간에), 매우 낮은 레벨의 RB006가 여러 동물에서 검출가능하였다 (다만 0.17 ㎍/mL 이하의 평균). 그러나, 이러한 레벨의 RB006는 너무 낮아서 측정가능한 항응고 효과를 나타내지 못하는데, 이는 REG1 항응고계로 처리된 동물에 있어서 24 시간 이상에서 APTT 연장이 없는 것과 일치한다.

원숭이의 비임상 약리학 연구의 개요

제시된 연구는 RB006가 약물을 초 임상 용량 (supra-clinical dose)으로 단회 일시 정맥 주사 후 24 시간 이상 실질적으로 FIX 활성의 완전 저해를 달성할 수 있는 원숭이에 있어서의 강력한 항응고제임을 입증한다. 원숭이에 있어서의 RB006의 항응고 활성의 시험관 내에서의 연구와, 이러한 안전성 약리학 연구의 APTT 및 독성 동태 데이터의 비교로부터, 혈장 RB006 농도에 대한 APTT의 예측된 연장과 관찰된 연장은 양호하게 일치함이 입증된다. 따라서, APTT 분석은 RB006 투여로 유도되는 항응고를 모니터하는 유용한 도구로서 사용될 것이다. 시험관 내에서의 인간 RB006-APTT 용량 반응 곡선과 원숭이 RB006-APTT 용량 반응 곡선 사이의 유사성은 이러한 원숭이 연구 (REG1-TOX001) 및 원숭이에 행해진 큰 통상적인 독성 연구 (REG1-TOX003)로부터 유도된 데이터가 RB006의 투여에 대한 인간 반응을 예측하는데 유용한 가이드로서 사용되는 것을 제시한다. 최종적으로, REG1-TOX001로부터의 APTT 및 독성 동태 데이터는 RB007이 RB006에 대한 매우 효과적인 해독제임을 입증한다. RB006로 처리된 동물에 있어서의 RB007의 일시 정맥내 투여 후 15분 이내에, 평균 APTT 시간이 RB006 처리 전 레벨로 복귀되어, 전체 모니터링 기간 (120 시간 이하)에 이러한 베이스라인 레벨로 남아 있었다. RB007에 의한 RB006 항응고 활성의 관찰된 중화는 완전히 독성 동태 데이터로 지지되었으며, RB006-RB007 복합체의 측정된 열역학적 안정성과 일치한다. 독성 동태 연구에 따르면, 복합체형 RB006의 농도가 상당히 증가됨과 동시에 유리 RB006 레벨이 RB007 투여 후 15분 이내에 분석의 LLOQ 이하로 감소되고, 독성 동태 분석 기간 (RB006 투여 후 24 시간) 동안에 유리 RB006 레벨의 증가는 감지될 수 없었다. 따라서, 원숭이 연구에서 얻어진 데이터는 REG1 항응고계가 앱타머의 단회 정맥내 주사로부터의 안정하고 지속적인 모니터가능한 항응고에 이어서, 해독제의 정맥내 일시 주사 시에 앱타머 활성 의 지속적인 중화의 달성에 관하여 의도한 바와 같이 작용한다는 것을 입증하였다. 이러한 REG1 항응고계의 성능은 의도된 임상 용량 범위 (즉, 독성 시험에 적절한 용량)의 저 배수 내지 고 배수로 달성되나, 동물에 대한 부작용 없이 달성되었다.

REGl 독성 동태

생물학적 분석법을 개발하여, 원숭이 및 마우스의 혈장 중의 유리 앱타머 (RB006), 유리 해독제 (RB007) 및 앱타머/해독제 (RB006/RB007) 복합체의 농도의 정량화를 행할 수 있는 것을 확인하였다. 이러한 방법은 원숭이에 있어서의 안전성 약리학 연구 (Study No. REG1-TOX001), 마우스에 있어서의 14일간의 연구 (Study No. REG1-TOX002), 및 원숭이에 있어서의 단회/반복 투여 연구 (Study No. REG1-TOX003)로부터 수집된 샘플의 분석에 적용하였다. 모든 세가지 연구에 있어서, 분리된 동물 그룹은 앱타머 만을 수용하거나, 해독제 만을 수용하거나, 또는 앱타머를 수용한 후 3일 후에 해독제를 수용하는 것을 포함하였다. 각 처리 조건의 다수회 투여 레벨을 모든 연구에서 테스트하여, 이들 연구 중 두가지 (마우스에 있어서의 14일간의 연구 및 원숭이에 있어서의 단회/반복 투여 연구)도 피험물질의 반복 투여를 사용하였다. 이들 연구에서 테스트된 앱타머의 용량 레벨은 원숭이에 있어서는 0.25 내지 45 mg/kg, 마우스에 있어서는 2.5 내지 22.5 mg/kg의 범위이었다. 테스트된 해독제의 용량은 앱타머의 용량의 2배 (즉, 원숭이에 있어서는 90 mg/kg 이하, 마우스에 있어서는 45 mg/kg)이었다. 이 비율은 임상 시험에서의 사용에 의도된 것과 유사하다.

모든 세가지 연구에 관해서는, 독성 동태 결과는 REG1 항응고계의 하기 특성 의 입증에 관해서는 유사하였다:

· 정맥내 주사 후의 앱타머의 혈장 농도는 넓은 용량 범위에 대하여 용량에 비례하며, 동물간 차이가 낮았다. 원숭이 또는 마우스에서 성별차가 뚜렷하지 않았다.

· 혈장의 앱타머의 클리어런스는 비교적 더디고 (즉, 추정된 반감기는 원숭에 있어서는 적어도 12 시간이고, 마우스에 있어서는 ∼8 시간이었다). 이러한 더딘 클리어런스는 앱타머의 페길레이티드 구조에 기초하여 예측되고, 다른 페길레이티드 올리고뉴클레오티드의 약물 동태에 대한 문헌 보고와 일치한다. 이의 고 인자 IX 저해 능력과 함께 앱타머의 최소 클리어런스는 약역학적 마커, 즉, 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 및 활성응고시간의 측정에 기초하여, 6시간에 걸친 비교적 안정한 정도의 항응고를 제공하였다. 이러한 프로파일은 REG1 항응고계의 앱타머 성분의 바람직한 특성이다.

· 해독제 단독의 정맥내 주사 (앱타머를 사용한 전처리가 없음)에 의해서는, 제 1 샘플링 시간 후의 주사 시에도 (10 내지 15분) 혈장 중의 레벨이 매우 낮았다. 이러한 초기에 측정된 해독제 레벨은 해독제 용량 레벨이 2배 만큼 높은 사실에도 불구하고, 앱타머 보다 낮은 자릿수이었다 (즉,앱타머 만을 수용한 그룹의 앱타머 레벨과 비교하여). 총체적으로, 해독제에 대한 데이터는 단독으로 수용되는 경우에는 혈장 중의 반감기가 매우 짧다는 것을 나타낸다. 원숭이에게 비교적 높은 용량 레벨 (30 mg/kg)로 하루 걸러서 7회 (14일간) 투여한 경우에는 혈장에 해독제가 축적되지 않았다

· 앱타머 수용 후 3일 후에 해독제를 수용한 그룹에 관해서는 (즉, 완전 REG1 항응고계), 유리 앱타머의 농도는 해독제 투여 후 수분 이내에 정량 한계값 이하 또는 약간 위로 급격하게 감소되었는데 (고도로 민감한 하이브리드화 타입 분석을 이용하여), 이는 해독제에 의한 순환 앱타머의 완전 결합을 나타낸다. 해독제 단독 처리로 보여진 바와 같이, 이들 조건하에서는 유리 해독제의 레벨이 매우 낮았다. 해독제에 의한 앱타머의 결합은 사실상 앱타머 활성의 완전 중화와 관련되어 있으며 (즉, 응고 파라미터의 정규화), 이는 의도된 REG1 항응고계의 성능과 일치한다.

· 유리 앱타머의 제거와 동시에, 앱타머/해독제 복합체는 해독제에 의한 앱타머의 완전 결합과 일치하는 레벨에서 혈장에서 검출되었다. 복합체는 복합체 내의 폴리에틸렌글리콜 부분의 존재로부터 예측되는 바와 같이 (앱타머로부터 유도되는), 유리 앱타머 보다 약간 빠른 속도이나 (즉, 앱타머 만으로 처리된 그룹의 앱타머 클리어런스의 속도와 비교하여), 유리 해독제 보다 훨씬 더 낮은 속도로 혈장으로부터 제거되었다. 혈장으로부터의 앱타머/해독제 복합체의 광범위한 제거는 해독제 투여 후 21 시간 이내에 명백하였다. 2주간 동안에 하루 걸러 원숭이에게 앱타머 및 해독제 (REG1 응고계)를 반복 투여하였더니, 혈액 중에 복합체나 유리 앱타머가 축적되지 않고, 앱타머 약물 동태 변화도 없으며 (즉, 해독제 투여 이전의 기간 동안), 앱타머에 의한 누적 항응고 증거가 없었다.

· 마우스와 원숭이의 약물 동태 사이의 유일한 차이점은 원숭이에 있어서의 적당히 더 긴 앱타머의 반감기이었다 (마우스에 있어서의 ∼8 시간에 비해, 적어도 12 시간).

인간의 REG1의 임상 용도

개별 환자 또는 환자 집단에 사용하는 항응고 방법을 선택하는데 있어서, 임상의는 각종 약리학적 전략의 특성을 비교 검토한다. 항응고의 주요 부작용이 출혈 (즉, 과장된 약리)로서, 급성 질환 치료 표시에 관해서는 이상적인 항응고제가 1) 정맥내 또는 피하로 전달가능하고, 2) 즉시 치료하며, 3) 빈번하게 관찰할 필요가 없도록 용이하게 투여되고, 가장 중요하게는 4) 즉시 예상가능한 가역성을 나타냄을 유념한다. REG1 항응고계는 이러한 효과적이고, 안전하며, 빠르게 가역적인 항응고제에 관한 채워지지 않은 의학적 필요성에 따라 개발되어 왔다.

REG1은 이러한 치료를 필요로 하는 인간 및 다른 동물에 대한 다수의 임상 증상에 사용될 수 있다. 예를 들면, REG1은 해독제 가역성 항응고제로서 동맥 질환 및 폐색과 관련된 관상동맥 및 말초 혈관 재생술에 사용될 수 있다. 특히, REG1은 관상동맥 혈관 재생술 (관상동맥 바이패스 그라프트 (CABG) 및 경피 관동맥 인터벤션 (PCI))의 해독제 가역성 항응고제로서, 급성 관상동맥 증후군을 앓고 있는 환자에 해독제 가역성 항응고제로서, 항응고 또는 혈전증 치료용 해독제-가역성 약제를 사용하는 것이 유리한 다른 증상용 항응고제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법이 사용될 수 있는 질환 및 수술로는 장골, 경동맥, 상완, 대동맥, 신장, 장간막, 대퇴골, 오금, 경골, 및 복막 혈관과 관련된 것을 포함한 말초 혈관 이식술; 심부 정맥 혈전증의 예방; 정형 외과 수술 후 또는 암 환자의 폐색전증의 예방; 심방 세동의 예방; 혈전성 뇌졸중의 예방; 및 혈액 투석 및 체외 막형 산소화 를 포함하나 이들에 한정되지 않는 혈액 체외 순환을 요하는 증상을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법이 사용될 수 있는 가능한 질환 및 수술의 추가 예로는 심폐 바이패스에서 심장내 수술을 받은 환자; 심장내 혈전 형성 또는 말초 색전을 앓고 있는 환자; 및 다른 과응고 상태에 있는 환자를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법은 또한 움직일 수 없는 환자에 대한 DVT 및 폐색전의 예방 및 정맥내 유치 카테터 및 동맥 또는 정맥 라인에서의 효능 유지에 유용할 수 있다.

REG1의 항응고 성분, RB006의 용량 범위는 증상에 의존할 것이다. 예를 들면, RB006 용량은 인간에 있어서는 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg일 수 있다. 특정한 증상에 있어서는, 용량 범위는 약 0.5 mg/kg 내지 약 9 mg/kg, 약 0.75 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 7 mg/kg, 약 1.5 mg/kg 내지 약 6.0 mg/kg, 약 2.0 mg/kg 내지 약 5.0 mg/kg, 약 2.5 mg/kg 내지 약 4.0 mg/kg일 것이다. 특정한 증상에 있어서는, 약물 성분은 수술 개방성을 유지하도록 투여될 것이다. 특정한 증상에 있어서는, RB006는 해독제를 중화하는 연속 투여를 행하지 않고서 단독으로 투여될 것이다.

RB006를 중화하거나 부분적으로 중화하는 REG1의 해독 성분, RB007의 대응 용량은 투여된 RB006의 양에 의존한다. 해독제 용량은 해독제:약물 중량비 (해독제 mg : 약물 mg)로 약 0.1:1 내지 약 20:1, 약 0.25:1 내지 약 15:1, 약 0.5:1 내지 약 12:1, 약 0.75:1 내지 약 10:1, 약 1:1 내지 약 9:1, 약 1.5:1 내지 약 8:1, 약 2:1 내지 약 7.5:1, 약 2.5:1 내지 약 6:1, 약 3:1 내지 약 5:1의 범위일 수 있 다.

이의 안전한 임상 응용에서 신뢰도를 촉진하는 REG1 항응고계의 가장 중요한 특성은 용량 의존적 방법으로 앱타머의 생리학적 활성을 예상할 수 있게 역전시키는 확립된 해독제의 능력이다.

인간에 있어서의 REG1 항응고계의 평가

본 연구는 처음으로 REG1 항응고계를 인간에서 평가하였다. REG1 항응고계의 단회 정맥내 (IV) 용량 점증 연구를 건강한 인간의 지원자에서 행하였다. 본 연구의 대상을 네 가지 상이한 용량 레벨 중 하나로 3개의 치료군 중 하나의 물품 또는 플라시보에 무작위로 할당하였다. 각 용량 레벨의 각 치료군에 있어서, REG1 또는 플라시보를 수용한 대상과 함께, 대상을 7:1의 처리 대 플라시보로 램덤화하였다. 염화나트륨 주입 0.9% USP를 모든 플라시보 주입에 대하여 사용하였다. 대상을 각 용량 레벨로 REG1 또는 플라시보를 수용하도록 랜덤화하였다.

본 연구에 등록된 대상의 위험을 최소화하고 대상의 안전성을 최대화하기 위해, 3개의 치료군을 하기 순서로 나타내었다:

치료군 1: 플라시보 약물에 이어서, 활성 RB007 해독 성분

OR 플라시보 약물에 이어서, 플라시보 해독제

치료군 2: 활성 RB006 약물에 이어서, 활성 RB007 성분

OR 플라시보 약물에 이어서, 플라시보 해독제

치료군 3: 활성 RB006 약물에 이어서, 플라시보 해독제

OR 플라시보 약물에 이어서, 플라시보 해독제

치료군 1을 REG1 항응고계의 해독 성분 (RB007)에 대하여 평가하였다. 이 치료군의 각 대상에게 0 시간 (즉. 제 1 볼루스 주사가 투여된 시간). 3 시간 후에, 대상에게 활성 해독 성분 (RB007)의 정맥내 주사를 행하고, 하나의 대상에게는 플라시보를 투여하였다.

치료군 2를 REG1 항응고계의 활성 약물 성분 (RB006)에 이어서, REG1 항응고계의 활성 해독 성분 (RB007)에 대하여 평가하였다. 이 치료군의 대상에게 0 시간에 활성 약물 성분 (RB006)의 주입을 행하고, 한 대상에게는 플라시보를 주입하였다. 3 시간 후에, 활성 약물 성분을 수용한 대상에게 활성 해독 성분 (RB007)의 주입을 행하고, 약물 성분 대신에 플라시보를 수용한 한 대상에게는 해독제 대신에 플라시보를 주입하였다

치료군 3를 REG1 항응고계의 활성 약물 성분 (RB006)에 대하여 평가하였다. 이 치료군의 대상에게 0 시간에 활성 약물 (RB006)의 주입을 행하고, 한 대상에게는 해독제 대신에 플라시보를 주입하였다. 3 시간 후에, 플라시보를 수용한 모든 대상에게 해독제 대신에 플라시보를 주입하였다.

활성 연구 약물 성분 (RB006)을 4개의 용량 레벨로 투여하였다: (1) 저 용량 (15 mg RB006); (2) 저 중간 용량 (30 mg RB006); (3) 고 중간 용량 (60 mg RB006); 및 (4) 고 용량 (90 mg RB006). 개시 용량 및 연속 증대를 혼주 정상 인간 혈장에서의 RB006에 대한 시험관 내에서의 APTT 용량 반응 곡선의 3개의 중요한 측면을 규정하는 타겟 최대 혈장 농도에 대하여 선택하였다: APTT가 시험관 내에서의 용량 반응 곡선에서 RB006가 증가하기 시작하는 최대 혈장 농도를 타겟하는 저 용량 (~4 ㎍/mL); 시험관 내에서의 RB006 APTT 용량 반응 곡선에서의 IC50를 브래킷하는 최대 혈장 농도를 타겟하는 2개의 중간 용량 (~8 내지 16 ㎍/mL); 및 시험관 내에서의 RB006 APTT 용량 반응 곡선이 정체 상태로 되기 시작하는 혈장 농도를 타겟하는 고 용량 (∼25 ㎍/mL).

활성 연구 해독 성분 (RB007)을 mg/kg 기준으로 약물 (RB006) 용량 레벨의 2배에 상당하는 4개의 대응 용량 레벨로 투여하였다: (1) 저 용량 (30 mg RB007); (2) 저 중간 용량 (60 mg RB007); (3) 고 중간 용량 (120 mg RB007); 및 (4) 고 용량 (180 mg RB007). 표 6는 이러한 단계 1A에 관한 각 치료군의 용량을 개요적으로 나타낸다.

연구 약물 성분 (RB006), 연구 해독 성분 (RB007), 및 이들의 플라시보를 1 분간에 걸쳐서 각각 주입하였다. REG1 연구 약물 성분 또는 플라시보를 0 시간에 주입하고, 해독 성분 또는 플라시보를 3 시간에 주입하였다

REG1을 건강한 지원자에 대하여 평가하여, 안전성 프로파일을 결정하고, REG1 항응고계의 PK 및 PD 반응을 기재하였다. 본 연구는 처음으로 앱타머 및 앱타머의 올리고뉴클레오티드 해독제를 이용하는 항응고계를 인간에게 투여하였다. 그 결과, 약물의 일시 정맥 주사 후의 APTT의 용량 반응을 나타내고, 해독제 일시 정맥 주사 후에 신속하게 지속적으로 베이스라인 APTT로 복귀된다. ACT 후, APTT로서의 유사한 패턴이 이어졌다. PT는 베이스라인과 비교하여 변하지 않은 채로 존재하였다.

대상에게 0 시간에 정맥내 볼루스 주사로서 RB006 또는 0.9% 생리식염수를 투여하여, 치료의 항응고 효과를 혈장 APTT의 측정에 의해 시간에 대하여 평가하였 다 (도 10). 각 치료군에 관한 APTT 값은 상대 APTT의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 상대 APTT는 대상에 대한 RB006 투여전 베이스라인 APTT 값으로 나눈 소정 샘플 시간에서의 개별 대상에 대한 APTT 값이다. 값 1은 RB006에 대한 무반응을 나타내고, 값 >1은 항응고 효과를 나타낸다. RB006의 용량이 15 mg에서 60 mg로 증가됨에 따라, 상대 APTT 값의 뚜렷한 용량 반응이 관찰된다. 30 mg RB006로 처리된 대상에서 관찰된 최대 상대 APTT로 붕괴하는데 60 mg RB006로 처리된 대상에 관한 평균 상대 APTT에 요구된 시간이기 때문에, APTT 분석에 의해 평가된 RB006의 약역학적 활성의 반감기는 적어도 12 내지 18 시간인 것으로 나타난다.

대상에게 0 시간에 정맥내 볼루스 주사로서 RB006 또는 0.9% 생리식염수 (플라시보)를 투여한 다음에, RB006 투여 후 3시간 후에 정맥내 볼루스 주사로서 RB007 또는 플라시보를 투여하였다. RB006 처리의 항응고 효과를 혈장 APTT의 측정에 의해 장기간에 걸쳐 평가하였다 (도 11). 각 치료군에 관한 APTT 값은 상대 APTT의 평균 ± SEM이다. 상대 APTT는 개별 대상에 관한 RB006 투여전 베이스라인 APTT 값으로 나눈 소정 샘플 시간에서의 개별 대상에 대한 APTT 값이다. RB006의 용량이 15 mg에서 90 mg로 증가됨에 따라, 상대 APTT 값의 뚜렷한 용량 반응이 관찰된다. RB007 투여에 의해, RB007 투여 후에 상대 APTT의 베이스라인 값으로의 복귀로부터 알 수 있는 바와 같이, RB006의 생리학적 활성의 완전한 급격한 (5분 이내) 지속적인 중화를 행하였다.

상기 도 10 및 11에 기재된 처리. 플라시보에 대한, 60 mg RB006로 처리한 후에, RB007로 처리한 대상의 약역학 반응의 비교에 의해, RB007의 급격하고 지속 적인 중화 활성이 입증된다 (도 12). RB007의 투여 및 미투여에 대한 3 시간 내지 24 시간의 APTT 반응 곡선하 면적의 비교에 의해 시각화되는 바와 같이, RB007의 투여로, 항응고를 촉진하도록 대상의 노출을 효과적으로 제거한다,

얻어진 영장류의 보체 활성화를 나타내지 않는 일시 정맥 주사에 REG1 응고계를 투여하는 능력은 다른 타입의 올리고뉴클레오티드 분자의 이러한 볼루스 주사로 이전에 관찰된 투여와 함께, 보체 활성화, 그리하여 독성의 결합이 주어진다면, 놀랄만 하다. 예를 들면, 문헌 [Galbraith et al. (1994) "Complement Activation and hemodynamic changes following intraveneous administration of phosphorothioate oligonucleotides in the monkey," Antisense Research and Development 4:201-206; and Levin, A. A., Monteith, D. K., Leeds, J. M., Nicklin, P. L., Geary, R. S., Butler, M., Templin, M. V., and Henry, S. P. (1998)]. Toxicity of oligonucleotide therapeutic agents, In Handbook of Experimental Pharmacology, G. V. R. e. a. Born, ed. (Berlin: Springer-Verlag), pp. 169-215]을 참조한다.

투여 파라미터의 전략 분석

도 13는 RB006를 수용한 모든 대상에 관한 0 내지 3 시간의 베이스라인에 대한 APTT의 상대적 증가의 상세한 분석을 나타낸다. 원숭이 시험의 테이터와 일치하게도, APTT의 레벨은 수시간에 걸쳐서 최대 및 정체 상태에 이른다. 처리 후 처음 3 시간 동안에 측정된 베이스라인과 비교하여, 상대 APTT 곡선하 면적을 평가함으로써, 데이터를 분석하였다. 도 19은 RB006 반응이 % FIX 저해에 어떻게 관련되 어 있는지를 나타낸다. 이 데이터는 >99% FIX 활성이 항응고제를 사용하여, 억제될 수 있음을 나타낸다.

도 14는 RB006 용량 레벨 (15, 30, 60 또는 90 mg)에 의해 편성된 각 대상에 대한 AUC_{O -3}를 나타낸다. 상대 효과가 3 시간에 걸쳐서 측정되기 때문에, "3"의 값은 무반응을 나타내며, 6의 값은 베이스라인에 대하여 평균 2배 증가됨을 나타낸다.

도 15은 RB006 용량 레벨의 함수로서의 RB006의 중량으로 조정된 용량을 나타낸다. 도 16는 RB006 (AUC_{O -3})의 약역학적 효과와 RB006의 "중량으로 조정된" 용량 사이의 관계를 나타낸다. 중량으로 조정된 용량은 0.2 mg/kg 내지 1.6 mg/kg의 범위이며, AUC_{O -3}의 범위는 약 3 내지 10 단위이다. 그래프는 반응과 중량으로 조정된 용량 사이에는 명백한 관계가 있으며, 피험자간 변동이 꽤 낮음을 보여준다.

도 20 및 도 21에 도시된 바와 같이, RB006 용량 레벨에 대한 등록된 대상의 체질량 지수 (BMI) 사이에는 명백한 관계가 존재한다. 19 내지 25의 BMI는 정상이고, 25 내지 30은 과체중이며, >30은 비만이다. 본 연구의 대상은 약 16의 BMI 내지 35 이상의 BMI의 범위이었다. 체질량 지수 (BMI)는 개인의 체중 및 신장으로부터 계산된 수치이다. BMI는 사람에 대한 비만도의 신뢰성있는 지표이다. BMI는 체지방을 직접 측정하지 않으나, 연구에 따르면, BMI가 체지방의 직접 측정, 예컨대 수중 계량 및 이중 에너지 X선 흡수법 (DXA)과 상호 관계가 있다. BMI는 체지방의 직접 측정에 대한 대안으로서 고려될 수 있다. BMI는 성민 및 아이에 대하여 동일한 방법으로 계산된다. 하기식에 의거하여 계산된다:

도 17은 RB006 용량 레벨의 함수로서의 RB006로 처리된 대상의 BMI로 조정된 용량을 나타낸다. 도 18은 RB006 대 BMI로 조정된 용량에 대한 AUC_{O -3} 사이의 관계를 나타낸다. 용량은 0.5 mg/BMI 내지 약 4.5 mg/BMI의 범위이었다. AUC_{O -3}의 범위는 약 3 내지 10 단위이었다. 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, 약역학적 파라미터와 BMI로 조정된 용량 사이에는 명백한 관계기 존재한다. 상기 관계는 저 변동과 함께, 중량으로 조정된 용량 관계보다 훨씬 더 두드러진다. 상대 AUC_{O -3}에 대한 BMI의 관계는 약물이 지방 또는 관련 조직에 대해서가 아니라, 주로 중심 신체 컴파트먼트에 분포할 것 같다는 것을 나타낸다. 이러한 분포는 비경구 투여용 항응고제로서 REG1계의 사용에 대한 추가적 지지를 제공한다.

안정한 CAD 를 이용한 환자에 있어서의 REG1 계의 평가

아스피린 및/또는 클로피도그렐을 복용한 안정한 관상동맥 질환에 걸린 50명의 환자에 대하여 연구를 행하였다. 환자를 RB006 및 RB007의 4개의 용량 레벨을 통해 3개의 그룹 중 하나 (RB006 단독, RB006에 이어서 RB007, 또는 플라시보 단독)로 랜덤화하였다.

베이스라인 특성은 61세의 평균 연령 (사분위 범위 (IQR) 56-68), 20% 여성, 80% 사전 경피 관상동맥 중재술, 및 34% 사전 관상동맥 바이패스 이식술을 포함하였다. 저, 저 중간, 고 중간 및 고 용량의 RB006의 단회 정맥내 (IV) 볼루스 후 10분 후의 중앙 aPTT는 29.2초 (IQR 28.1-29.8), 34.6초 (IQR 30.9-40.0), 46.9초 (IQR 40.3-51.1) 및 52.2초 (IQR 46.3-58.6), p<0.0001, (aPTT 정상 범위 27-40초)이었다. RB007는 7일까지는 반동적인 상승없이, aPTT를 1분의 중앙값 이내의 정상 하한값 보다 <10% 이상 역전시켰다 (IQR 1-2) (도 1). 환자의 38%에 대하여 이중 항혈소판 요법을 사용했음에도 불구하고, 대량 출혈 또는 다른 심각한 유해 사례가 없었다.

도 20는 플라시보와 비교한 4개의 앱타머/해독제 용량에서의 APTT 반응의 비교 결과를 나타낸다. 그룹 1 "저 용량"을 정맥내 볼루스로 0 시간에 15 mg RB006를 투여하고, 3 시간 후에 30 mg RB007 해독제를 투여하였다. 그룹 2 "저 중간 용량"을 정맥내 볼루스로 0 시간에 30 mg RB006를 투여하고, 3 시간 후에 60 mg RB007 해독제를 투여하였다. 그룹 3 "고 중간 용량"을 정맥내 볼루스로 0 시간에 50 mg RB006를 투여하고, 3 시간 후에 100 mg RB007 해독제를 투여하였다. 그룹 4 "고 용량"을 정맥내 볼루스로 0 시간에 75 mg RB006를 투여하고, 3 시간 후에 150 mg RB007 해독제를 투여하였다. 50 및 75 mg/kg RB006에서, aPTT의 강한 상승이 보이는데, 2× 앱타머 농도에서는 RB007의 투여시에 완전 역전되었다.

REG1 계의 반복 투여

건강 상태가 일반적으로 양호한 38명의 환자에 대하여 연구를 행하였다. 3개의 치료군으로 식별되었다: 그룹 1, 1일, 3일, 5일째에 앱타머 (0.75 mg/kg RB006)로 단회 투여 후 1 시간 후에 고정 용량의 해독제 (1.5 mg/kg RB007)를 투여한 대상; 및 그룹 2 및 3, 1일, 3일, 5일째에 앱타머 RB006 (0.75 mg/kg)의 단회 투여 후 1 시간 후에 RB007의 단회 투여를 변화시킨 대상. 그룹 2 및 3의 대상에서의 RB007에 대한 용량 적정을 하기 표 A에 나타낸다.

RB006의 용량 (0.75 mg/kg)을 RB006에 대한 체중으로 조정된 반응에 의거하여 선택하였다. 평균하여, 이러한 RB006의 중량으로 조정된 용량은 대상의 APTT를 2배로 상승시켰다. RB006 앱타머, 해독제 및 이들 각각의 플라시보는 각각 1분간에 걸친 주입으로서 주어졌다. 도 21은 상이한 해독제의 처리를 통해 1일, 3일 5 일째에 RB006 (0.75 mg/kg) 투여 후의 시간 가중 APTT를 나타낸다.

도 22는 각각의 그룹에서 RB006 투여의 APTT에 대한 퍼센트 효과를 나타낸다. APTT의 약 270 % 증가는 모든 세 그룹에서 0.75 mg/kg 앱타머 투여 후에 나타나나, 3개의 치료군에 대해서는 크게 다르지 않았다.

도 23은 RB006 투여와 비교한, RB006 (0.75 mg/kg) 및 다양한 비율의 RB007를 투여한 그룹의 평균 APTT를 나타낸다. RB006를 0 시간에 투여하고, 1 시간 후에 RB007를 기재된 비율로 투여하였다. 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, RB007은 앱타머에 대한 해독제의 항응고 용량을 역전시켰다. 또한, 도 23에서 알 수 있는 바와 같이, 테스트된 각 비율에서의 RB007의 역전 효과는 이 화합물에 대하여 예기되는 바와 같이, 시간에 대한 RB006 약역학적 활성이 점차적으로 감소됨과 동시에, 시간에 대하여 비교적 안정하였다.

도 24는 RB006 투여와 비교한, RB006 (0.75 mg/kg) 및 다양한 비율의 RB007를 투여한 그룹의 시간 가중 APTT의 회복률을 나타낸다. RB006를 0 시간에 투여하고, RB007을 1 시간 후에 기재된 비율로 투여하였다. 테스트된 최저 비율, 0.125:1에서, RB007은 RB006의 효과를 약 40%로 역전시켰다. 0.2:1에서, RB007은 RB006의 효과를 약 50%로 역전시켰다. 0.3:1에서, RB007은 RB006의 효과를 약 75%로 역전시켰다. 0.5:1에서, RB007은 RB006의 효과를 약 85%로 역전시켰다. 1:1 또는 2:1의 고 비율에서, RB007은 RB006의 효과를 효과적으로 완전히 역전시켰다.

Claims (30)

1. a. 숙주의 체질량 지수 (BMI)를 측정하고;

   b. 원하는 약역학 반응을 확인하며;

   c. 약역학 반응에 대한 BMI 당 용량의 비교에 기초하여, 원하는 약역학 반응을 달성하도록 앱타머의 용량을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는 앱타머의 투여 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 해독제의 용량이 사전에 투여된 앱타머의 기지의 용량에 기초하고, 해독제:앱타머 비가 원하는 앱타머 활성 감소에 기초하여, 해독제:앱타머의 용량을 숙주에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 원하는 약역학 반응은 최대 레벨의 항응고인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 앱타머는 4 mg/BMI 이상의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 원하는 약역학 반응은 최대 약 75%의 항응고 레벨인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 앱타머는 약 3.0 내지 4.0 mg/BMI의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 원하는 약역학 반응은 최대 약 50%의 항응고 레벨인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 앱타머는 약 2.0 내지 3.0 mg/BMI의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 항응고제의 용량은 0.1 내지 10 mg/BMI인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 항응고제의 용량은 약 5 mg/BMI인 것을 특징으로 하는 방법.
11. a. 숙주의 체중을 kg으로 측정하고;

    b. 원하는 약역학 반응을 확인하며;

    c. 약역학 반응에 대한 kg 당 용량의 비교에 기초하여, 원하는 약역학 반응을 달성하도록 앱타머의 용량을 숙주에게 투여하고;

    d. 해독제의 용량이 앱타머와의 비율에만 기초하여 주어지는, 해독제:앱타머의 용량을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는 앱타머의 투여 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 해독제의 용량이 사전에 투여된 앱타머의 기지의 용량에 기초하고, 해독제:앱타머 비가 원하는 앱타머 활성 감소에 기초하여, 해독제:앱타머의 용량을 숙주에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 11 항에 있어서, 원하는 약역학 반응은 최대 레벨의 항응고인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 항응고제의 용량은 약 1.4 mg/kg 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 11 항에 있어서, 원하는 약역학 반응은 최대 약 75%의 항응고 레벨인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 항응고제의 용량은 약 1.0 mg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 11 항에 있어서, 원하는 약역학 반응은 최대 약 50%의 항응고 레벨인 것 을 특징으로 하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 항응고제의 용량은 약 0.6 내지 0.8 mg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 11 항에 있어서, 항응고제의 용량은 0.1 내지 2 mg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 11 항에 있어서, 항응고제의 용량은 5 내지 10 mg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 1 항 또는 제 11 항에 있어서, 해독제는 올리고뉴클레오티드 해독제인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 1 항 또는 제 11 항에 있어서, 앱타머는 서열번호 1을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 1 항 또는 제 11 항에 있어서, 약역학 반응은 응고 분석에서 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 1 항 또는 제 11 항에 있어서, 앱타머는 정맥내 볼루스 전달로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 1 항 또는 제 11 항에 있어서, 앱타머는 피하 주사로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 2 항 또는 제 12 항에 있어서, 앱타머 및 해독제는 1:1의 비율로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 2 항 또는 제 12 항에 있어서, 앱타머 및 해독제는 적어도 2:1의 비율로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 2 항 또는 제 12 항에 있어서, 앱타머 및 해독제는 0.5:1 이하의 비율로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 2 항 또는 제 12 항에 있어서, 앱타머 활성은 90% 미만으로 역전되는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 2 항 또는 제 12 항에 있어서, 앱타머 활성은 약 50%로 역전되는 것을 특징으로 하는 방법.

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