CN101453891A - Reg1抗凝系统的给药 - Google Patents

Abstract

提供了一种给药适体和解毒剂系统来控制宿主血凝固的改进方法来达到所需药物动力学反应，其基于该系统成分的体重调节或体重指数调节的给药剂量。另外，提供了一种将适体活性逆转至所需程度的方法，其中解毒剂剂量仅基于其与适体剂量的关系。

Description

REG1抗凝系统的给药

对相关申请的交叉引用

本申请要求名称都为“REG1抗凝系统的给药”的申请日为2006年5月26日的美国临时申请号60/808,987；申请日为2006年9月27日的美国临时申请号60/847,809和申请日为2006年11月10日的美国临时申请号60/865,352的优先权，将其全部公开在此引入作为参考。

发明领域

提供一种给药适体和解毒剂系统来控制宿主中的血凝固的改进方法，其基于该系统组分的体重调节或体重指数调节的剂量给药。

发明背景

紧急医护抗凝作用

鉴于可注射的抗凝血剂在急性缺血性心脏病病理学中对血栓症的中心作用，可注射抗凝血剂已经成为具有急性冠脉综合症例如不稳定的心绞痛和心肌梗死的病人以及进行冠状血管再生术的那些病人的药物治疗的基础(Harrington等人，2004；Popma等人，2004)。当前可采用的抗凝血剂包括普通肝素(UFH)、低分子量肝素(LMWH)、以及直接的凝血酶抑制剂(DTI)例如重组的水蛭素、比伐芦定和阿加曲班。用于抗凝血剂用途和连续的抗血栓形成药物开发这两者的本范例是要在意味着降低局部缺血事件风险的功效和意味着将出血风险减至最小的安全性之间建立一种平衡(Harrington等人，2004)。每种可利用的药剂都带有相对于安慰剂相比出血风险增加。

与抗凝血剂和抗血栓形成药物相关的主要不利事件是出血，其可引起终生残疾和死亡(Ebbesen等人2001；Levine等人，2004)。通常，当药物可降低急性冠脉综合症或冠状血管再生术的局部出血并发症时，心血管临床医生一直愿意去卖掉出血的风险。但是，新近的数据提示出血事件，特别是需要输血的那些出血事件对ACS病人治疗的结果和花费有重要影响。进行择期冠状动脉旁路移植(CABG)手术的患者输血率为30-60％，并且在这些患者中输血与短期、中期、长期死亡率增加相关联(Bracey等人，1999；Engoren等人，2002；Hebert等人，1999)。出血也是与经皮冠状动脉介入(PCI)相关的最频繁发生和费用大的并发症，5-10％的患者进行输血，费用增加$8000-＄12,000(Moscucci，2002)。另外，进行ACS治疗的患者大出血的频率也是高的，范围从5％至10％(不包括进行CABG的患者)，出血和输血独立地与短期死亡率的显著增加相关联(Moscucci等人，2003；Rao等人，2004)。因此，尽管有新抗血栓药被持续地开发出来，但对于更安全的抗凝血剂仍存在巨大的临床需要。

达到药物活性的迅速逆转可被动地通过将药物配制成半衰期短的可灌注的药剂，采用灌注终止作为逆转方式来达到；或主动地通过给药中和该药物的活性的第二种药剂—解毒剂来达到。

对于患有急性缺血性心脏病的住院治疗的患者，理想的抗凝血剂是通过静脉或皮下注射可输送的、立即生效的、易于给药，以致不需要频繁地监测并且是立即和可预测地逆转。

解决该问题的现有方法

UFH是当前被认可使用的唯一解毒剂可逆的抗凝血剂。但是UFH具有重要的局限性。首先，肝素具有复杂的药物动力学使其用途的可预测性受到挑战(Granger等人，1996)。其次，其解毒剂鱼精蛋白的剂量可预测性正在受到挑战，并且其使用伴有严重的副作用(Carr andSilverman，1999；Welsby等人，2005)。最后，肝素可引起血小板减少症(HIT)和伴有血栓形成的血小板减少症(HITT)(Warkentin，2005；Warkentin and Greinacher，2004)。

尽管有这些限制，肝素仍然是最通常用于住院就医病人的抗凝血剂，主要因为它是“可逆的”。更新一代的抗凝血剂，例如LMWHs对UFH给药剂量的可预测性已经有改进，并且不需要基于实验室的监测作为其日常使用的一部分。相对于UFH而言，采用LMWHs不太频繁地观察到HIT和HITT，但是他们并没有消除这种风险。市售的DTIs、来匹卢定和阿加曲班这三种中的两种被特别批准用于已经出现或具有HIT病史的患者。比伐芦定被批准在PCI期间用作抗凝血剂，并因此为HIT患者提供了对于UFH的有吸引力的可替代选择。然而，没有直接和清晰的解毒剂来逆转LMWHs和DTIs的抗凝血剂作用，DTIs在进行外科手术或经皮冠状血管再生术的病人中使用呈现出特别的风险(Jones等人，2002)。在用LMWH′s或DTI′s治疗的病人中出血是通过给药包括凝固因子在内的血制品来控制的。

血凝固和FIX

迄今为止，血凝固的细胞模型(图1)为生理学血凝固如何在体内发生提供了最清晰的解释(Hoffman等人，1995；Kjalke等人，1998；，Monroe等人，1996)。

根据这种模型，促凝血反应在引发、扩增和繁殖三个不同阶段中发生。血凝固的引发发生在带有组织因子的细胞例如活性单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞之上。与组织因子形成复合物的凝血因子VIIa催化凝血因子IX(FIX)和X(FX)的活化，FIX和FX又依次由凝血酶原产生了少量凝血酶。在扩增期(也称为引导期)中，在引发阶段中产生的少量凝血酶使凝血因子V、VIII和XI活化并且也使血小板活化，血小板提供了于其上发生进一步的促凝血反应的表面。在体内，在扩增期期间产生的少量凝血酶不足以使纤维蛋白原转变成血纤蛋白，这是由于存在被称为丝氨酸蛋白酶抑制剂的内源性凝血酶抑制剂，例如抗凝血酶III、α-2-巨球蛋白和肝素辅因子II。促凝血反应的最后阶段繁殖仅发生在活化的血小板表面上。在繁殖期间，由于FIXa催化的对FIX的活化作用产生了大量的FIXa，FXIa与其所需的辅因子FVIIIa形成复合物，后者使FX活化。随后，FXa与其所需的辅因子形成复合物。FXa-FVa复合物使凝血酶原活化，这导致凝血酶产生的“爆发”以及血纤维蛋白沉积，最终结果是形成了稳定的血凝块。

根据这种模型，FIXa在血凝固中起两种作用。在引发阶段，FIXa在通过使FX活化成Fxa而产生少量凝血酶以及后来的凝血酶原活化中起重要作用。然而，就FX被组织因子FVIIa催化转化成FXa而言，FIXa的这种作用至少是部分多余的。在繁殖阶段，FIXa的作用更关键，其中FVIIIa/FIXa酶复合物用作在活化血小板表面上产生Fxa的唯一催化剂。因此可预期或者是由于FIX遗传缺陷(即血友病B)，或者是由于FIX/IXa的药理学抑制而致的FIXa活性降低对于血凝固具有几种作用：第一，FIXa活性的抑制或损失将部分地抑制血凝固的引发。第二，FIXa活性的抑制或损失将对血凝固的繁殖阶段产生极深的影响，导致凝血酶产量显著降低或消除。最后，通过减小血小板和上游凝血因子例如因子V、VIII和XI活化作用，在繁殖阶段期间限制凝血酶产生将至少部分地减弱血凝固的反馈放大。

先前对FIXa抑制剂的动物和人的评估

FIX活性的抑制剂，例如活性部位灭活的因子Ixa(FIXai)或抗FIX的单克隆抗体(例如抗体BC2)在多个动物模型包括动脉血栓形成和中风的各种动物模型中已经表现出有效的抗凝血和抗血栓形成活性(Benedict等人，1991；Choudhri等人，1999；Feuerstein等人，1999；Spanier等人，1998a；Spanier等人，1997；Spanier等人，1998b；Toomey等人，2000)。通常，这些研究已经表明在动物中FIXa抑制剂的抗血栓形成活性与出血风险的比率比普通肝素高。然而，在这些研究中，在稍高于有效剂量的剂量下，用这些药剂治疗的动物所显示的出血曲线与肝素没有差别。这种控制良好的动物研究方面的经验暗示在临床应用中，控制FIXa抑制剂活性的能力将增强其安全性并促进其医疗用途。另外已经表明，在需要抗凝血剂治疗的许多动物外科模型(包括合成的贴的血管修补的兔模型以及带有心肺旁路CABG的犬和非人灵长类动物模型)中作为肝素替代物，FIXa是安全和有效的(Spanier等人，1998a；Spanier等人，1997；Spanier等人，1998b)。根据陪护，FIXai也已经由哥伦比亚内外科医师学院的内科医生成功地用于需要心肺转流并且其它体外回路硬化如体外膜氧化(Spanier等人，1998a)的几种病危患者。因此，FIXa是用于冠状血管再生术(CABG和PCI两者)中抗凝血剂治疗以及急性冠脉综合症患者的血栓症的治疗和预防的有效标靶。

适体药物开发，药物-解毒剂对及REG1

一种提供可控的抗凝作用的方法是利用在相对较低剂量下可达到临床适当活性的、具有12小时及更长的中长期作用延续时间的抗凝血剂与能够特异性地结合到该第一抗凝血剂并中和该第一抗凝血剂的第二药剂的组合。这种“药物-解毒剂”组合能够确保该药物抗凝活性的可预测的和安全的中和和逆转(Rusconi等人，2004，Nat Biotechnol.22(11)：1423-8；Rusconi等人，2002，Nature 419(6902)：90-4)。

申请人已经将该药物-解毒剂技术应用到REG1、基于适体的抗凝系统的发现中(见图2)。适体是以高亲和力和特异性结合到标靶蛋白质的单链核酸(Nimjee等人，2005)，很像单克隆抗体。然而，为了使适体结合到标靶蛋白质上并抑制其，该适体必须采取特异的球状三级结构。形成这种球状三级结构需要适体采取适当的二级结构(即正确的碱基配对和非碱基配对区)。

如图2中的卡通形式所示，将与部分适体互补的寡核苷酸引入可改变适体的结构以使其能不再结合到其标靶蛋白质，并因此有效地逆转或中和该适体药物的药理学活性(Rusconi等人，2004，Nat Biotechnol.22(11)：1423-8；Rusconi等人，2002，Nature 419(6902)：90-4)。

RB006(P-L-guggaCUaUaCCgCgUaaUgCuGcCUccacT，其中P＝mPEG2-NHS酯MW 40 kDa；L＝C6 NH₂接头；G＝2-OH G；g＝2′-O-Me G；C＝2-F C；c＝2′-O-Me C；U＝2-F U；u＝2′-O-Me U；a＝2-O-Me A；以及T＝转化的2′-H T(SEQ ID NO 1)；见图2)，REG1的药物成分是以高亲和力和特异性与凝血因子IXa结合的直接FIXa抑制剂(Rusconi等人，2004，Nat Biotechnol.22(11)：1423-8；Rusconi等人，2002，Nature 419(6902)：90-4；也可参见杜克大学的WO05/106042)。RB006引出了通过阻断FVIIIa/FI Xa催化的FX向FXa的转化而致的抗凝血效果。RB006是修饰的RNA适体，31个核苷酸长，由于存在含2′-氟基和2′-O-甲基糖残基，它是中度稳定化的抗内切核酸酶降解的，并且通过3′反向脱氧胸苷帽，它是稳定化的抗外切核酸酶降解的。该适体的核酸部分被轭合到40千道尔顿的聚乙二醇(PEG)载体上以增强其血液半衰期。在静脉内团注之后，在小鼠中RB006的半衰期约为8小时，而在猴子中约为12小时。这样，可以以团注，而不是以静脉灌注的形式来给予RB006，以在几个小时里保持抗凝血状态。

如图2中所示，RB007(cgcgguauaguccac，其中g＝2′-0-Me G；c＝2′-O-Me C；u＝2′-O-Me U；以及a＝2′-O-Me A(SEQ ID NO 2)；见图2)，REG1的解毒剂成分是与RB006的部分互补的寡核苷酸，其可有效地结合到RB006并由此中和其抗FIXa活性。RB007是2′-O-甲基RNA寡核苷酸，15个核苷酸长，其与REG1的药物成分部分互补。2′-O-甲基修饰赋予所述的解毒剂以适度的抗核酸酶性，这提供了充分的体内稳定性以使其能够寻求并结合RB006，但不支持延长的体内持续性。

REG1的非临床研发

申请人已经发展了药理学数据，证明RB006适体对FIXa的特异性以及抗体RB007对适体的亲和力。非临床药理学研究的结果可以被总结如下：REG1的药物成分(RB006和/或相关的前体化合物)可(1)在体外有效地抑制凝血因子X的活化；(2)延长人或其它动物物种中的体外血浆的血浆凝固时间；(3)在静脉内团注给药之后，全身性地抗动物凝血；(4)在动物动脉损伤血栓形成模型中防止血栓形成；(5)在动物心肺分流术模型中取代肝素；以及(6)被REG1解毒剂成分中和之后在30分钟内有效地在动物中再给药。

迄今为止的非临床药理学研究已经显示REG1的抗体成分(RB007和/或REG1药物成分前体的特异性抗体)能够(1)在体外迅速持久地中和人或其它动物种类的血浆中REG1药物成分(RB006)的抗凝血活性；(2)在静脉内团注给药之后，在采用该药剂进行全身性抗凝血处理的动物中，在体内迅速而持久地中和体内REG1药物成分的抗凝血活性；(3)防止由超治疗剂量的REG1药物成分与手术创伤的结合引起的出血；以及(4)在心肺分流术之后在动物中中和REG1药物成分的抗凝血活性。此外，在静脉内团注给药之后，在体外在人血浆中或在动物中该抗体没有表现出任何抗凝血或其它药理学活性。

仍然需要提供一种允许可预测的并且可重复的适体-解毒剂系统效果的可靠的给药方法。

发明概述

已经发现在适体，特别是适体抗凝血剂的体重调节的剂量以及更重要地，体重指数调节的剂量及其药物动力学反应两者之间有清晰的关系。此外，令人惊讶地发现适体的解毒剂的剂量仅仅需要根据提供给宿主的适体数量而不用根据任何其它标准而被调节以抑制适体的活性达到所需的水平。这种新认识为特定的给药方式提供了支持，该特定的给药方式允许针对临床用途使用可预测并且可重复的给药方案。

在一种实施方式中，本发明提供了一种改进的适体抗凝血系统的给药方法，包括：1)测量宿主的体重指数(BMI)；2)表征所需的药物动力学反应；以及3)根据每个BMI的剂量与药物动力学反应的比较，将一定剂量的适体抗凝血剂给药到宿主以达到所需的药物动力学反应。在某些实施方式中，随后将该适体的解毒剂给药到宿主，其中对于所需的适体活性减小量，根据一种比率和先前给予的调节的适体剂量来提供解毒剂剂量。在某些情形中，根据给药适体后的时间来调节解毒剂剂量。在某些情形中，如果已经在多于24小时之前给药适体，则将解毒剂与适体的比例减半。

在某些实施方式中，需要最大水平的抗凝血效果。在这些情形中，可以以4mg/BMI或更大的水平提供适体。在其它情形中，需要约75％的最大凝血水平。在那些情形中，供给宿主的剂量约为0.75.0-1.5mg/BMI。在其它情形中，需要约50％的最大凝血水平，在这些情形中，供给的剂量约为0.25-0.5mg/BMI。

在某些一般性的实施方式中，采用的抗凝血剂的剂量为0.1-10mg/BMI。在另一实施方式中，所述剂量为0.2-8mg/BMI，或0.2-6mg/BMI，0.2-5mg/BMI，0.2-4mg/BMI，0.2-3mg/BMI，0.2-2mg/BMI或0.2-1mg/BMI。在某些实施方式中，抗凝血剂的剂量为约1mg/BMI，或约2mg/BMI，或约5mg/BMI，或约.75mg/BMI，或约1mg/BMI，或约2mg/BMI，或约3mg/BMI，或约4mg/BMI，或约5mg/BMI，或约6mg/BMI，或约7mg/BMI，或约8mg/BMI，或约9mg/BMI，或约10mg/BMI。

在另一实施方式中，本发明提供了一种改进的适体抗凝血系统的给药方法，该方法包括：1)测量宿主的体重；2)表征所需的药物动力学反应；以及3)根据每千克宿主体重的剂量与药物动力学反应的比较，将一定剂量的适体抗凝血剂给药到宿主以达到所需的药物动力学反应。在某些实施方式中，随后将该适体的解毒剂给药到宿主，其中对于所需的适体活性减小量，根据一种比率和先前给予调节的适体剂量来提供解毒剂剂量。在某些情形中，根据给药适体后的时间来调节该解毒剂剂量。在某些情形中，如果已经在多于24小时之前给药适体，则将解毒剂与适体的比例加一倍。

在某些实施方式中，需要最高水平的抗凝血效果。在这些情形中，可提供1.4mg/kg或更大的适体量。在其它情形中，需要约75％的最大凝血水平。在那些情形中，供给宿主的剂量约为0.5-0.75mg/kg。在其它情形中，需要约50％的最大凝血水平，在这些情形中，提供给约为0.2-.0.4mg/kg的剂量。

在某些一般性的实施方式中，采用的剂量为0.1-2mg/kg，0.1-1.8mg/kg，0.1-1.6mg/kg，0.1-1.5mg/kg，0.1-1.4mg/kg，0.1-1.3mg/kg，0.1-1.2mg/kg，0.1-1.1mg/kg，0.1-1.0mg/kg，0.1-0.9mg/kg，0.1-0.8mg/kg，0.1-0.7mg/kg，0.1-0.6mg/kg，0.1-0.5mg/kg，0.1-0.4mg/kg，0.1-0.3mg/kg，或者0.1-0.2mg/kg.。在其它实施方式中，剂量为1-20mg/kg，1-18mg/kg，1-15mg/kg，2-15mg/kg，3-15mg/kg，4-15mg/kg，5-20mg/kg，5-15mg/kg，或者1-10mg/kg，或者5-10mg/kg，或为约1mg/kg，约2mg/kg，约3mg/kg，约4mg/kg，约5mg/kg，约6mg/kg，约7mg/kg，约8mg/kg，约9mg/kg，或约为10mg/kg.。在原则性的实施方式中，适体抗凝血系统是REG1系统，其包括适体抗凝血剂和寡核苷酸解毒剂。在某些非限制性实施方式中，适体是RB006(SEQ ID NO 1)并且解毒剂是RB007(SEQ ID NO 2)。在一种实施方式中，测量药物动力学反应，例如aPTT(血浆或全血)或活化的凝固时间(ACT)，并且可记录为绝对值、效果百分比、变化百分比、时间加权的平均值或在定义的时间段上的曲线下的面积。

对于特定的应用，药物动力学反应水平可以处于任何所需的水平。例如，在某些情况下，当患者处于低的发生血栓事件的风险中时，可能需要低水平的反应。在特定的情形中，可能不需要采用饱和量的抗凝血剂，特别是FIXa的适体如RB006来使凝血因子抑制以及特别是FIX或FIXa抑制最大化。在其它情形中，当患者处于高的发生血栓事件的风险中或血栓形成正在发生时，可能需要高水平的反应。在这种情形中，采用饱和量的抗凝血剂，特别是FIXa的适体如RB006来使凝血因子抑制以及特别是FIX或FIXa抑制最大化可能是理想的。

在一种实施方式中，以静脉内团输来提供抗凝血剂适体如RB006。在另一实施方式中，通过皮下注射来提供抗凝血剂适体。在另一实施方式中，在静脉内或皮下团输适体之后，注射解毒剂。

在此所述的程序允许分步递送抗凝血剂和解毒剂两者以允许将两种化合物中任一种或两者的滴度达到所需的目标抑制和逆转的水平。

根据所需的该适体抑制水平来调节解毒剂与适体的比率。发现解毒剂剂量仅需要与适体的剂量相关，并且不必根据与宿主相关的因素另外调节。在一种实施方式中，适体与解毒剂的比率是1:1。在其它实施方式中，适体与解毒剂的比率大于1:1，例如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或更大。也可根据解毒剂与适体的比率来计算这些比率，例如其可小于约1:1如0.9:1或约0.9:1、0.8:1或约0.8:1、0.7:1或约0.7:1、0.6:1或约0.6:1、0.5:1或约0.5:1、0.45:1或约0.45:1、0.4:1或约0.4:1、0.35:1或约0.35:1、0.3:1或约0.3:1、0.25:1或约0.25:1、0.2:1或约0.2:1、0.15:1或约0.15:1、0.1:1或约0.1:1或小于0.1:1例如约为0.005:1或更小。在某些实施方式中，该比率为0.5:1至0.1:1，或0.5:1-0.2:1，或0.5:1-0.3:1。在其它实施方式中，该比率为1:1-5:1或1:1-10:1或1:1-20:1。

在某些实施方式中，仅发生适体活性的部分逆转。例如，在一些实施方式中，适体活性逆转90％或小于90％，例如约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或更少。可通过将重量与重量比较或以摩尔为基准来计算解毒剂与适体的比率

在本发明的特定实施方式中，剂量给药系统被应用的宿主或主体是人。在具体的实施方式中，宿主是需要抗凝血治疗的人。在某些实施方式中，宿主是进行血管手术例如CABG手术的病人。

附图的简要说明

图1描述了基于细胞的血凝固模型。TF-组织因子；vWF-血管性血友病因子；II-凝血酶原；Ha-凝血酶；凝血因子V、VII、VIII、IX、X和XI的Va、VIIa、VIIIa、IXa、Xa、XIa活化形式。

图2描述了REG1抗凝血系统。该系统由FXIa抑制剂RB006及其配对的解毒剂RB007构成。解毒剂对药物的识别是通过如所示的沃森-克里克碱基配对来进行的。RB006是修饰的RNA适体，其由2′-氟残基(大写体)2′-O-甲基残基(小写体)以及单个的2′-羟基残基(下划线)构成。RB006经由6-碳氨基接头(L)与40-Kda聚乙二醇载体(P)轭合，并且被3′端上的反向脱氧胸苷(idT)保护以防被核酸外切酶降解。RB007(解毒剂)是2′-O-甲基修饰的RNA寡核苷酸。

图3是体外的RB006 APTT剂量反应曲线图，其表明RB006引起了正常汇合的人血浆的APTT的浓度依赖性的增加。“平均秒”是平均APTT。将数据拟合到四参数逻辑方程，允许确定该曲线的IC50。

图4是在来自个体的血浆中RB006抗凝血效果的图。在4个人(两个女人，两个男人)中测量了RB006的抗凝血活性。血浆样品是从GeorgeKing Biomedical(Overland Park，KS)得到的。个体被甄别过并被证实就凝血因子水平而言是正常的。M/55意味着供血者是男人，年龄55岁；F/49意味着供血者是女人，年龄49岁。所采用的APTT试剂是MDAPlatelin L(Biomeriux)，与图3中所示该研究中所采用的APTT试剂相比，它对FIX水平相对更敏感。

图5是显示解毒剂RB007的药物中和活性的图。解毒剂RB007对适体RB006的低摩尔过量在10分钟内完全中和了RB006的抗凝血活性。所示数据是来自三个独立测量值的平均值±SEM。摩尔比基于适体和解毒剂(AD)的寡核苷酸的摩尔数。

图6是在解毒剂中和先前的药物剂量之后再剂量给药适体RB006的图。将2.5mg/kg适体RB006给药到猪，15分钟后用3mg/kg RB007解毒剂(n＝2)处理以中和该初始剂量，然后在给药解毒剂RB007之后30分钟(初始适体剂量给药后45分钟)，将2.5mg/kg适体RB006再给药到猪。在全血中在(A)ACT(O)测定中；或B)在血浆中测定APTT(O)凝固来测量血凝固时间的变化。所示数据是来自每个动物的双份测量值的平均值±范围。在(A和B)中粗线是通过数据点的一条点到点的线。

图7是在来自猕猴和人的血浆中RB006的体外APTT剂量反应曲线图。RB006引起来自猴的血浆中的APTT的剂量依赖性延长，其非常类似于在人血浆中所观察到的情况。采用与在猴子中进行的在非临床毒性研究中用来分析血浆药品所采用的相同商标的APTT试剂、APTT-LS(REG1-TOX001和REG1-TOX003)进行实验。因此，这些数据用作解释在8.4部分中所示的来自REG1-TOX001和REG1-TOX003的APTT结果的基础。根据制造商(Pacific Hemostasis，Middletown，VA)，该试剂在FIX含量<1％的人血浆样品中产生～87.3秒的APTT；在含～20％正常FIX活性的样品中为36.1秒；以及在含100％正常FIX活性的样品中为27.5秒。枸橼酸钠猕猴血浆是由Charles River Laboratories，SierraDivision.提供的。

图8是经给药RB006后猴子的全身抗凝血作用图。利用APTT来监测猴子的抗凝血水平。对于采用15mg/kg处理的动物，将RB006数据显示为平均值±SEM。对于5和30-mg/kg剂量水平的动物，将数据显示为平均值±范围，因为在每个这些剂量水平下仅有两个动物。

图9是采用RB006对猴子进行全身抗凝血作用和用RB007进行逆转的图。利用APTT来监测猴子中的抗凝血水平。在给药RB006后的t＝3小时时给药RB007。显示的数据为平均值±SEM。

图10是在人中RB006的药物动力学活性的图。

图11是利用RB007中和人中的RB006药理活性的图。

图11是比较有和没有给药RB007时的RB006药物动力学活性的图。

图12是比较在用RB007处理后在3小时时用60mg RB006处理与用安慰剂处理的受试者中药物动力学反应的图。

图13显示对于接受了RB006的所有受试者，对从0至3小时在基线上的APTT的相对增长的更详细分析。

图14是通过RB006剂量水平(15、30、60或90mg)组织的各受试者的AUC0-3图。因为在3小时内测量了相对效果，值“3”表示对RB006没有反应；值6表示在基线上平均增加2倍，等。

图15是体重调节的RB006剂量作为RB006剂量水平的函数的图。

图16是与RB006“体重调节”剂量比较的UC0-3的图。

图17是用RB006处理的受试者的BMI调节剂量作为RB006剂量水平的函数的图。

图18是RB006的UC0-3与BMI调节的剂量的关系图。

图19是相对于％FIX活性的与基线相比的APTT图，其显示在不同的RB006剂量(15、30、60和90mg)下的APTT。

图20是在患有冠状动脉病的患者中使用4剂静脉内给药的RB006适体和RB007解毒剂比较的APTT反应图。

图21是显示在全部治疗组中在第1、3和5天给药RB006(0.75mg/kg)后的时间加权的APTT的图。第1组受试者在第1、3和5天接受单次剂量适体(0.75mg/kg RB006)，接着在一小时后接受固定剂量的解毒剂(1.5mg/kgRB007)；第2和3组受试者在第1、3和5天接受单次剂量适体(0.75mg/kg RB006)，接着在一小时后给药不同的RB007单次剂量。

图23是给药RB006(0.75mg/kg)和与RB006比率不同的RB007的组中的平均APTT对时间的图。

图24是显示与RB006相比时以所列比率在给药RB007后一小时给药RB006而得的时间加权的APTT恢复百分比。

详细说明

已经发现在适体、特别是适体抗凝血剂的体重调节的剂量以及更为重要地，体重指数调节的剂量及其药物动力学反应两者之间有清晰的关系。此外，令人惊讶地发现适体的解毒剂的剂量仅需要根据供给宿主的适体量而不用根据任何其它标准而被调节以抑制适体的活性达到所需水平。这种新认识为特定的给药方式提供了支持，该特定的给药方式允许针对临床用途的可预测的并且可重复的给药方案。

适体改进

利用被称为SELEX的指数富集的配体系统进化方法来分离核酸适体。该方法允许在体外发展高度特异性地结合到靶分子的核酸分子。例如在美国专利号7,087,735、美国专利号5,475,096和美国专利号5,270,163(还参见WO 91/19813)中描述了SELEX方法。

SELEX方法涉及从候选寡核苷酸混合物中选择和采用相同的常规选择方案分步反复结合、分开和扩增，以实际上达到亲和力和选择性的任何所需标准。从核酸的混合物(例如包括随机序列的片段的混合物)开始，SELEX方法包括以下步骤：在有利于结合的条件下使该混合物与靶接触，将未结合的核酸与已经特异性地结合到靶分子的那些分开，使核酸-靶复合物解离，将从核酸-靶复合物中分离出来的核酸扩增以产生富含配体的核酸的混合物，然后重复以下步骤：结合、分开、解离和扩增，通过与所需循环一样多的循环来产生靶分子的高特异性、高亲和力适体。

已经改进了基本的SELEX方法来达到许多具体目的。例如美国专利号5,707,796描述了采用SELEX与凝胶电泳结合来选择具有特定结构特征的核酸分子，例如弯曲的DNA。美国专利号5,763,177描述了一种基于SELEX的方法，该方法用于选择含有光反应性基团的适体，该光反应性基团能够结合到和/或光致交联到和/或光灭活靶分子。美国专利号5,580,737描述了一种用于确定高特异性适体的方法，该高特异性适体能够在密切相关的分子之间进行区分，被称为反向SELEX。美国专利号5,567,588和5,861,254描述了基于SELEX的方法，其可在对靶分子具有高和低的亲和力的寡核苷酸之间完成高效率的分开。美国专利号5,496,938，描述了在已经实施SELEX方法之后得到改进适体的方法，美国专利5,705,337描述了使配基共价键合到其靶的方法。

美国专利号5,648,214证明了识别适体与溶液中的小肽的可行性。在美国专利号5,780,228中举例说明采用配基使用亲和洗脱来产生靶向靶分子上的特定位置的适体的能力，该专利涉及与某些外源凝集素结合的高亲和力适体的生产。在美国专利号6,127,119中描述了制备某些组织的适体的方法，这些组织包括细胞类型组。在美国专利号6,673,553中描述了牛小肠磷酸酶的某些高亲和力改进配基的制备。美国专利号6,716,580描述了表征适体的自动化方法，其包括采用机械手操作员。

在SELEX方法的最基本方式中，SELEX方法可以被以下的系列步骤定义：

1)制备不同序列的核酸的候选混合物。该候选混合物通常包括固定序列区(即候选混合物各成分在相同位置包含相同的序列)和随机序列区。选择固定的序列区：(a)有助于下述的扩增步骤，(b)模拟已知序列以结合到靶，或者(c)提高候选混合物中给定的核酸结构排列的浓度。随机序列可以是完全随机化的(即在任意位置发现碱基的概率为四分之一)或者仅部分随机化(例如在任意位置发现碱基的概率可选择为0-100％之间的任意水平)。

2)使候选混合物与所选靶在有利于靶与候选混合物成分之间结合的条件下进行接触。在这些情况下，靶与候选混合物的核酸之间的相互作用可被认为是在靶和对该靶具有最强亲和力的那些核酸之间形成了核酸-靶对。

3)将对该靶具有最高亲和力的核酸与对该靶具有较小亲和力的那些核酸分开。因为仅极其小数量的对应于最高亲和力的核酸的序列(并且可能仅一个核酸分子)存在于候选混合物中，所以通常理想的是设定分开标准，使得候选混合物中显著量的核酸(约为5-50％)在分开期间被保留。

4)然后，将在分开期间作为对靶具有比较高亲和力的被选择的那些核酸扩增以产生新的候选混合物，其富含对靶具有比较高亲和力的核酸。

5)通过重复以上分开和扩增步骤，新形成的候选混合物含有少而又少的弱结合序列，并且核酸对靶的平均亲和度将普遍增加。取其极端，SELEX方法将产生含有一种或少量的独特核酸的候选混合物，该独特核酸代表了来自对靶分子具有最高亲和力的初始候选混合物的那些核酸。

化学修饰

在核酸的治疗性使用中遇到的一个问题是在所需效果显示之前，以其磷酸二酯形式存在的寡核苷酸可能在体液中被细胞内和细胞外的酶例如核酸内切酶和核酸外切酶迅速地降解。可以对适体进行某些化学修饰来增大该适体的体内稳定性或增强或介导适体的递送。

适体的修饰包括(但不限于)提供其它化学基团的那些修饰，该化学基团将附加电荷、极化性、疏水性、氢键、静电相互作用和立体易变性引入适体碱基或作为一个整体的适体。这种修饰包括(但不限于)2′-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺修饰、4-硫尿核苷取代、5-溴或5-碘尿嘧啶取代；主链修饰、硫代磷酸酯或烷基磷酸酯修饰、甲基化、不寻常的碱基配对组合，例如异碱、异胞苷和异胍等。修饰也可包括3′和5′修饰，例如加帽。

SELEX方法包括鉴定含有修饰核苷酸的高亲和力适体，该修饰的核苷酸赋予配基以改进的特性，例如改进的体内稳定性或改进的递送特性。这类修饰的例子包括在核糖和/或磷酸酯和/或碱位置处的化学取代。SELEX鉴定的含有修饰的核苷酸的适体被描述在美国专利号5,660,985中，该专利描述了含有在嘧啶的5-和2′-位化学修饰了的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美国专利号5,580,737描述了含有一种或多种核苷酸的特异性适体，该核苷酸被2′-氨基(2′-NH₂)、2′-氟(2′-F)和/或2′-O-甲基(2′-OMe)修饰。美国专利号5,756,703描述了含有各种2′-修饰的嘧啶的寡核苷酸。

SELEX方法包括将所选择的寡核苷酸与美国专利号5,637,459和5,683,867中所述的其它所选择的寡核苷酸和非寡核苷酸功能单元相组合。美国专利号5,637,459描述了含有一种或多种核苷酸的高特异性适体，该核苷酸被2′-氨基(2′-NH₂)、2′-氟(2′-F)和/或2′-O-甲基(2′-OMe)修饰。SELEX方法进一步包括将所选适体与亲脂性或非免疫原性高分子量化合物在诊断或治疗复合物中相组合，如美国专利号6,011,020中所述。

当通过SELEX方法衍生适体时，修饰可以是SELEX前或后的修饰。SELEX前的修饰可产生对其靶具有特异性并具有体内稳定性两者的适体。对2′-OH适体进行的SELEX后的修饰可导致体内稳定性改进而对适体的结合能力没有不利影响。在一种实施方式中，适体修饰包括在该分子3′端的3′-3′反向磷酸二酯键以及一些或全部核苷酸的2′-氟(2′-F)和/或2′-氨基(2′-NH₂)和/或2′-O-甲基(2′-OMe)修饰。

在一种实施方式中，适体或其调节剂可以被共价连接到亲脂性化合物例如胆固醇、二烷基甘油、二酰基甘油或非免疫原性的高分子量化合物或聚合物例如聚乙二醇(PEG)。在这些例子中，能够提高适体或调节剂的药物动力学性能。在还有的其它实施方式中，适体或调节剂可以被包在质脂体内。亲脂性化合物或非免疫原性高分子量化合物可以与适体或调节剂共价键合或通过非共价相互作用缔合。在采用共价连接的实施方式中，亲脂性化合物或非免疫原性高分子量化合物可以被共价连接到适体或调节剂的各种位置，例如碱基上的环外氨基、嘧啶核苷酸的5-位、嘌呤核苷酸的8-位、磷酸酯的羟基或5′或3′终端羟基或其它基团。在一种实施方式中，共价连接是连接到5′或3′羟基。寡核苷酸调节剂与复合物的其它组分的连接可直接进行或利用接头或间隔区进行。

例如，可在碱基部分、糖部分或磷酸酯主链上对本发明寡核苷酸进行修饰，以改进分子稳定性、杂化等。寡核苷酸可包括其它附加基团。为此目的，可将寡核苷酸轭合到另一分子，例如肽、杂交引发的交联剂、转移剂、杂交引发的裂解剂等等。寡核苷酸可以包括选自下组的至少一种修饰的碱基部分，该组包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖Q核苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2α-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷(queosine)、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶羟乙酸、wybutoxosine？、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2--硫胞嘧啶、5-甲基硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯、尿嘧啶羟乙酸(v)、5-甲基硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧丙基)和2，6-二氨基嘌呤。

本发明的适体和调节剂也可包括选自下组的至少一种修饰的糖部分，该组包括但不限于：阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木糖和己糖。适体和调节剂可包括选自下组的至少一种修饰的磷酸酯主链，该组包括但不限于：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯和甲缩醛(formacetal)或其类似物。

可通过本领域已知的标准方法来合成任何本发明的寡核苷酸，例如通过采用DNA自动合成仪(例如市售的如Biosearch，AppliedBiosystems)。

调节剂

本发明的调节剂可以是寡核苷酸、小分子、肽、寡糖，例如氨基苷类、或能够结合到适体或者以别的方式调节适体活性的其它分子，或者这些中任何一种的嵌合体或融合或连接产物。

在一种实施方式中，调节剂是与适体的至少一部分互补的寡核苷酸。在另一实施方式中，调节剂可以是靶向适体的核酶或DNA酶。在此外的实施方式中，调节剂可以是肽核酸(PNA)、吗啉基核酸(MNA)、锁闭的核酸(LNA)或假环状寡核碱基(PCO)，其包括与适体的至少一部分互补或杂交的序列。

适体具有活性的三级结构，其取决于适当的稳定二级结构的形成。因此，虽然在本发明的互补寡核苷酸调节剂和适体之间的双螺旋形成机理与两个短的线性寡核糖核苷酸之间的相同，但是设计这种相互作用的规则和这种产物的形成动力学两方面都是受分子内适体结构影响的。成核速率对于最终形成稳定的双螺旋是重要的，并且通过使寡核苷酸调节剂靶向存在于适体中的单链环和/或单链的3′或5′尾部，该步骤的速度被极大地提高。为了发生分子间双螺旋的形成，形成分子间双螺旋的自由能必须有利于已有分子内双螺旋在靶向的适体内形成。

调节剂可被设计成使其以高度特异性和所需水平的亲和力结合特定的适体。调节剂也可被设计成这样，在结合后，适体结构被修饰为活性更大或更小的形式。例如，调节剂可被设计成这样，在结合到靶向的适体之后，该适体的三维结构改变以致该适体不再能够结合到其靶分子或以较小亲和力结合到其靶分子。

可替代地，调节剂可被设计成这样，使得在结合后，适体的三维结构被改变以致该适体对于其靶分子的亲和力增强。即调节剂可被设计成这样，在结合后，在适体中产生了一种结构基序以使该适体可结合到其靶分子。

在本发明的一种备选的实施方式中，调节剂其自身是一种适体。在该实施方式中，首先产生适体，该适体结合到所需的治疗靶，第二步，利用在此所述的SELEX方法或其它方法产生结合到第一适体的第二适体，并且调节治疗适体和靶之间的相互作用。在一种实施方式中，第二适体使第一适体的作用钝化。

在其它可供选择的实施方式中，结合到靶的适体可以是PNA、MNA、LNA或PCO，而调节剂是一种适体。备选地，结合到靶的适体是PNA、MNA、LNA或PCO，而调节剂是PNA。备选地，结合到靶的适体是PNA、MNA、LNA或PCO，而调节剂是MNA。备选地，结合到靶的适体是PNA、MNA、LNA或PCO，而调节剂是LNA。备选地，结合到靶的适体是PNA、MNA、LNA或PCO，而调节剂是PCO。在天然存在的立体化学结构或非天然存在的立体化学结构或其混合物中，可随意采用这些之中的任一种。例如，在一种优选实施方式中，适体呈D构型，而在另一实施方式中，适体呈L构型。

在一种实施方式中，本发明调节剂是一种寡核苷酸，其包括与靶向的适体序列的至少一部分互补的序列。例如，调节剂寡核苷酸可包括与靶向适体的6-25个核苷酸，典型为8-20个核苷酸，更典型为10-15个核苷酸互补的序列。有利地，调节剂寡核苷酸与适体的6-25个、或8-20个、或10-15个连续的核苷酸互补。考虑到靶向适体及寻求的效果，可以将调节剂寡核苷酸的长度优化。典型地，调节剂寡核苷酸是5-80个核苷酸长，更典型为10-30个核苷酸，最典型为15-20个核苷酸(例如15-17个)。寡核苷酸可被制备成具有带有D或L立体化学构型或其混合物的核苷酸。天然存在的核苷酸呈D构型。

可采用各种策略来确定寡核苷酸结合到靶向适体的最佳位点。可采用经验性策略，其中互补寡核苷酸是“步行”在适体周围。步行实验可涉及顺序进行的两个实验。可制得一种新候选混合物，其中该候选混合物的每种成分具有对应于有关寡核苷酸调节剂的固定核酸区。该候选混合物的每种成分还包括随机序列区。根据这种方法，有可能鉴定何谓“延长的”适体，其包含可结合到多于一个适体结合区的区域。根据该方法，可采用约为15个核苷酸长的2′-O-甲基寡核苷酸(例如2′-O-甲基寡核苷酸)，它在适体上(例如与适体的核苷酸1-15、6-20、11-25，等互补的寡核苷酸适体)交错约5个核苷酸。经验性策略可以是特别有效的，因为难于预知适体的三级结构对于杂交效力的影响。后续的实施例中所述分析可用于估定不同寡核苷酸与特定适体杂交的能力，特别强调在达到适体完全结合必需的寡核苷酸过量摩尔数。通过进行标准动力学研究，利用例如BIACORE分析，也可测定不同寡核苷酸调节剂提高适体与其靶分子分离速率或适体与其靶分子缔合速率的能力。可对寡核苷酸调节剂进行选择，以使按照所需方式改进适体及其靶分子之间相互作用需要5-50倍摩尔过量或更少的寡核苷酸。

备选地，为了促进与寡核苷酸调节剂的缔合，可改进靶向适体以使其包括单链尾部(3′或5′)。合适的尾部可包括1-20个核苷酸，优选1-10个核苷酸、更优选1-5个核苷酸，以及最优选3-5个核苷酸(例如修饰核苷酸如2′-O-甲基序列)。可在结合和生物测定中测试有尾的适体(例如随后实施例中所述)以证实加入单链尾部没有破坏适体的活性结构。可以设计出能够形成例如，具有尾部序列的1、3或5碱基对的一系列寡核苷酸(例如2′-O-甲基寡核苷酸)并测试其与尾部适体单独缔合的能力以及提高适体与其靶分子解离速率或适体与其靶分子缔合速率的能力。可使用杂乱的序列对照以证实效果是由于双螺旋形成而不是非特异性效果所致。

本发明的寡核苷酸调节剂包括与适体的至少一部分互补的序列。然而，完全互补不是必需的。在此提及的“与适体的至少一部分互补的”序列是指一种具有充分的互补性而能够与适体杂交的序列。杂交能力可以取决于互补程度和反义核酸的长度两者。通常，杂交的寡核苷酸越大，其可含有的与靶适体配错的碱基就越多，并且还形成稳定的双螺旋(根据具体情况或为三螺旋)。通过使用标准操作程序来测定杂交复合物的熔点，本领域技术人员可确定可容许的配错程度。在具体的方面，寡核苷酸可以是至少5个或至少10个核苷酸，至少15个或至少17个核苷酸，至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。本发明的寡核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合体混合物或其衍生物或其变型，是单链的。

在一种实施方式中，调节剂是核酶或DNA酶。至少有5种核酶，其中各自显示出不同类型的特异性。例如，第I组内含子的大小为约300->1000核苷酸并且需要U直接在靶序列中5′分裂位点并且在分裂位点的5′-侧结合4-6个核苷酸。另一种类是RNA酶P RNA(M1 RNA)，其大小约为290-400个核苷酸。第三个实例是锤头核酶，其大小约为30-40个核苷酸。它们需要靶序列UH直接在5′分裂位置并且在分裂位置两侧上结合可变数目的核苷酸。第四种类是发夹核酶，其大小约为50个核苷酸。它们需要靶序列GUC直接在3′分裂位置并且在分裂位置5′-侧上结合4个目核苷酸以及可变数目结合到分裂位置3′-侧。第五种类是丁型肝炎病毒(HDV)核酶，其大小约为60个核苷酸。

另一类催化分子被称为“DNA酶”。DNA酶是单链的，并且切割RNA和DNA两者。已经提出了DNA酶的一种一般模型，并且该模型被称为“10-23”型，符合“10-23”模型的DNA酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，其两侧面是两个各自具有7-9个脱氧核糖核苷酸的底物识别结构域。

本发明的寡核苷酸调节剂的核碱基可通过核碱基之间的键例如肽基键(如肽核酸(PNAs)的情形，Nielsen等人(1991)Science 254，1497和U.S.Pat.No.5,539,082)和吗啉键(Qin等人，Antisense Nucleic AcidDrug Dev.10，11(2000)；Summerton，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7，187(1997)；Summerton等人，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7，63(1997)；Taylor等人，J Biol Chem.271，17445(1996)；Partridge等人，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.6，169(1996))或通过任何其它天然或修饰键来连接。低聚核碱基也可以是锁闭的核酸(LNAs)。Nielsen等人，J Biomol Struct Dyn 17，175(1999)；Petersen等人，J MoI Recognit 13，44(2000)；Nielsen等人，Bioconjug Chem 11，228(2000)。

PNAs是类似于寡核苷酸的化合物，但组成不同。在PNAs中，寡核苷酸的脱氧核糖主链被肽主链取代。肽主链的每个亚基连接到天然存在或非天然存在的核碱基上。PNA通常具有由N-(2-氨乙基)氨基乙酸单元组成的非手性聚酰胺主链。嘌呤或嘧啶碱基经由亚甲基羰基接头(1-3)连接到各单元以靶向互补核酸。遵循沃森-克里克碱基配对规则，PNA以平行或反平行取向结合到互补RNA或DNA。与天然同质双链相比，PNA低聚物的不带电性质提高了杂交PNA/DNA双螺旋的稳定性。

吗啉核酸如此命名是因为它们由吗啉亚基装配而成，其各自包括连接到六元吗啉环的四个遗传碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)之一。18-25个这四种亚基类型的亚基通过非离子性的二氨基磷酸酯亚基之间的键以特定顺序结合来提供吗啉低聚物。这些吗啉低聚物，其六元吗啉主链部分通过非离子键连接，与通过非离子键连接的具有五元核糖或脱氧核糖主链部分的RNA、DNA及其类似物相比，提供了实质上更好的反义性能(参见wwwgene-tools.com/Morphol-inos/bodymorpholinos.HTML).。

LNA是具有某些特征使其成为用于本发明调节剂的主要候选者的一类DNA类似物。LNA单体是在结构上类似于RNA单体的双环化合物。LNA共享DNA和RNA的大部分化学性能，它是水溶性的，能够通过凝胶电泳、乙醇沉淀等来分离(Tetrahedron，54，3607-3630(1998))。然而，将LNA单体引入DNA或RNA低聚物中导致具有互补DNA或RNA的双螺旋热稳定性高，而同时遵从沃森-克里克碱基配对规则。与LNA低聚物一起形成的双螺旋的这种高热稳定性，发现含有3’位LNA的引物是用于酶扩展(例如聚合酶链反应)的底物，被用于本发明以显著地增加本申请所述体外分析中的不同核酸检测的特异性。单个的等位基因的扩增方法存在极大差别(不可见交联反应)并且在同一容器中可发生几个反应。例如参见美国专利号6,316,198。

假环状低聚核碱基(PCOs)也可用作本发明中的调节剂(参见美国专利号6,383,752)。PCOs含有两种寡核苷酸片段，它们通过其3′-3′或5′-5′端连接。PCO的片段之一(“功能性片段”)具有一些官能度(例如与靶mRNA互补的反义寡核苷酸)。另一片段(“保护性片段”)与功能性片段的3′-或5′-末端互补(取决于端部，通过该端部连附到功能性片段)。由于功能性片段和保护性片段之间的互补性，PCOs在没有靶核酸的条件下形成分子内假环状结构(例如RNA)。PCOs比常规的反义寡核苷酸更稳定，因为存在3′-3′或5′-5′键并且形成了分子内假环状结构。在小鼠中的药物动力学、组织分布和稳定性研究提示：通常PCOs的体内稳定性高于PS-寡核苷酸并且药物动力学和组织分布轮廓与其相类似，但是从所选组织中迅速除去。当荧光团和猝灭分子适当地连接到本发明PCOs时，该分子处于线性构型时将发荧光，但是该荧光在处于环状构型时猝灭。

适体的基于肽的调节剂代表了寡核苷酸或其类似物的另一可供选择的调节剂的分子类型。当靶适体的充分活性的寡核苷酸调节剂由于缺乏足够的单链区来促进该靶和寡核苷酸调节剂之间的成核作用而不能被分离时，这类调节剂被证实是特别有效的。另外，与寡核苷酸调节剂相比，肽调节剂提供了不同的生物利用度和药物动力学。

寡糖，象氨基糖苷类，可结合到核酸并且可用于调节适体的活性。插入适体和靶之间或者以别的方式破坏或改变适体和靶之间结合的小分子也可用作治疗调节剂。鉴别这种类小分子可通过在一种测量在有和没有小分子时适体和靶之间的结合变化的分析中筛选，或通过采用测量在有和没有小分子时适体对靶的生物学作用差异的体内或体外分析来鉴别。一旦确定小分子表现出所需效果，可采用例如组合方法的技术来优化化学结构以达到所需的调节效果。

可采用标准的结合测定来鉴别和选择本发明的调节剂。非限制性例子是凝胶位移检测和BIACORE检测。即测试调节剂可与待靶向的适体在测试条件或典型生理学条件下接触，并且对测试调节剂事实上是否与该适体结合进行测定。然后在适当的生物鉴定(其将随着适体及其靶分子的变化而变化，例如凝固实验)中可对被发现与适体结合的测试调节剂进行分析来确定测试调节剂是否能够影响由适体引起的对其靶分子的生物学效果。

凝胶位移检测是一种用于评估结合能力的技术。例如，首先将含有测试序列的DNA片段与测试蛋白质或含假定结合蛋白质的混合物一起培养，然后通过电泳在凝胶上分离。如果DNA片段与蛋白质结合，则其尺寸将更大并因此相对于自由片段的移动的其迁移将被延迟。例如，一种电泳凝胶迁移率位移实验方法可以是：(a)在稳定的条件下使结合蛋白质的核酸与含有分子探针的非放射性或放射性标记核酸分子在混合物中接触，来促进蛋白质和探针在形成复合物时它们之间的特异性的结合相互作用，其中所述探针选自dsDNA、ssDNA和RNA；(b)使该混合物电泳；(c)利用正压印迹转移或毛细管转移使该复合物转移到膜，其中该膜是带正电荷的尼龙，以及(d)通过检测该复合物中的非放射性或放射性标记来检测结合到该膜的复合物。

Biacore技术可测量传感器芯片表面上的结合情况，使得与该表面附连的相互作用物测定了该检测的特异性。测试相互作用的特异性包括简单地分析不同分子是否能够结合到固定的反应物。结合立即使表面等离子共振(SPR)信号发生变化，所以是否发生相互作用是立即显而易见的。基于SPR的生物传感器，通过测量靠近表面的生物分子质量浓度来监测相互作用。通过附连配偶体之一而使该表面成为特异性的。当来自样品的分子与附连到该表面的反应物结合时，含有其它配偶体的样品在该表面上流动，测得了局部浓度变化和SPR响应。该反应与结合到该表面上的分子质量成正比。

当光在一定条件下从导电膜反射时产生SPR，该导电膜在两种折射率不同的介质之间的界面上。在Biacore技术中，该介质是样品和传感器芯片的玻璃，而导电膜是芯片表面上的薄金层。SPR引起特定反射角度的反射光强度减小。该角度随靠近反射光对面上的表面的折射率而变化。当样品中的分子结合到传感器表面时，该表面上的浓度变化并因此折射率变化，从而检测到了SPR响应。绘制相互作用期间反应对时间的图提供了相互作用进度的定量测量。Biacore技术可测量反射光强度最小时的角度。该样品没有吸收该光，而是光能量通过金膜中的SPR消散。SPR响应值用共振单位(RU)表示。一个RU代表最小强度的角度变化0.0001°。对于大部分蛋白质，这约略相当于传感器表面上浓度变化约为1pg/mm²。RU和表面浓度之间的精确换算因子取决于该传感器表面的性能和引起浓度变化的分子性质。

还有许多其它检测方法可测定寡核苷酸或其类似物、肽、多肽、寡糖或小分子是否能够以改进了与靶的相互作用的方式结合到适体。例如，电泳迁移率变化检测(EMSAs)、滴定量热法、闪烁亲近测定法、采用分析超速离心的沉降平衡分析法(参见例如www.cores.utah.edu/interaction)、荧光偏振分析、荧光各向异性分析、荧光强度分析、荧光共振能量转移(FRET)分析、硝化纤维过滤器结合分析、ELISAs、ELONAs(参见例如美国专利号5,789,163)、RIAs或平衡渗析分析可用于评估试剂结合到适体的能力。可进行直接测定(其中直接测定试剂与适体之间的相互作用)，或者可进行竞争测定或其中试剂能够将适体从其靶中置换出的置换分析(例如参见Green，Bell and Janjic，Biotechniques 30(5)，2001，p1094和美国专利号6,306,598)。一旦确定了候选调节剂，就可在生物测定中证实其调节适体对于其靶的活性的能力。备选地，如果一种试剂被确定可调节一种适体与其靶的相互作用，就可采用这种结合分析来证实该试剂与该适体是直接相互作用的，并且可测量所述相互作用的亲和力。

在另一实施方式中，可采用质谱法来鉴定结合到一种适体的调节剂、该调节剂和该适体之间相互作用的位置、以及试剂对于该适体的相对结合亲和力(例如参见Crook等人的美国专利号6,329,146)。这种质谱法也可用于检测化学混合物或库、特别是组合库中是否有结合到所选靶适体的个别化合物，其可用作该适体的调节剂。此外，质谱技术可用于筛选多靶适体，其同时对着例如化合物组合库。而且，质谱技术可用于鉴别多种分子种类之间的相互作用，特别是靶适体上的“小”分子和分子相互作用位置。

评估调节剂在改进适体和靶之间相互作用方面的效力的体内或体外分析对于待治疗的病症是特异性的。大量生物性质标准测定是众所周知并且是可采用的。本申请引用的专利中提供了生物学测定例子，其描述了用于特定应用的某些适体。

本发明还提供了用来表征适体的调节剂的方法。通过结合分析、制作分子模型或测量生物学功能改进的体内或体外分析通常可表征调节剂。在一种实施方式中，调节剂与核酸的结合是通过凝胶移动检测来测定的。在另一实施方式中，调节剂与适体的结合是通过Biacore检测来测定的。

在一种实施方式中，调节剂能够实质上结合溶液中的适体的调节剂的浓度小于1(1.0)微摩尔(uM)、优选小于0.1uM、更优选小于0.01uM.。“实质上”是指通过在具有靶的条件下的调节所观察到的靶生物活性降低至少50％，并且50％降低在此被称为IC50值。

药用组合物

本发明的适体或调节剂可被配制成药用组合物，其可包括可药用载体、稀释剂或赋形剂。该组合物的精确性质将至少部分地取决于该适体和/或调节剂的性质，包括任何稳定化改进以及给药途径。通常，该适体或调节剂被酌情以IV、IM、IP、SC、口服或局部给药。

可根据已知方法配制包括本发明适体或调节剂的可药用组合物，例如通过可药用载体的混合。在Remington′s Pharmaceutical Sciences中可找到这种载体的例子及其配制方法。为了形成适用于有效给药的可药用组合物，这种组合物将含有有效量的适体或调节剂。这种组合物可含有多于一种化合物的混合物。

在本发明的方法中，该化合物可形成活性成分，并且通常以与适当的药用稀释剂、赋形剂或载体的混合物形式(在此共同称为“载体”材料)一起给药，针对计划给药方式，即口服片剂、胶囊、酏剂、糖浆、栓剂、凝胶等适当选择稀释剂、赋形剂或载体，并且与传统的制药实践一致。

对于口服给药片剂或胶囊形式，可将活性药物成分与口服无毒的可药用惰性载体例如乙醇、甘油、水等混合。此外，当想要或必需时，适当的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂也可被混入该混合物中。适当的粘合剂包括(没有限制)淀粉、凝胶、天然糖例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然或合成树胶如阿拉伯树胶、黄芪胶或藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。用于这些剂型的润滑剂包括(没有限制)油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括(没有限制)淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等等。

对于液体形式，活性药物成分可与适当调味的悬浮剂或分散剂例如合成或天然树胶，如黄芪胶、阿拉伯树胶、甲基纤维素等混合。可采用的其它分散剂包括甘油等。对于肠胃外给药，无菌悬浮液和溶液是理想的。当想要静脉内给药时，采用通常含有适当防腐剂的等渗制剂。

含有活性药物成分的局部制剂可与本领域众所周知的各种载体材料例如醇、库拉索芦荟胶、尿囊素、甘油、维生素A和E油、矿物油、PPG2丙酸肉豆蔻酯等混合以形成例如醇溶液、局部清洁剂、清洁膏、皮肤凝胶、皮肤洗剂以及膏或凝胶配方的洗发剂。

也可将本发明的化合物以脂质体输送系统形式给药，例如以单层小质脂体、单层大质脂体和多层质脂体形式给药。可由各种磷脂例如胆固醇、硬脂酰胺或卵磷脂来形成脂质体。

本发明化合物也可与作为可标靶药物载体的可溶性聚合物结合。该聚合物可包括聚乙烯基吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基甲基丙烯酰基-对氨基苯酚、聚羟基-乙基天冬酰胺苯酚或被棕榈酰残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸。此外，本发明化合物可以被偶联到(优选通过共价键)可用于达到药物控制释放的一类可生物降解的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯以及水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。胆固醇及类似的分子可被连接到适体以增大和延长生物利用度。

可直接给药该化合物(例如单独或以脂质体制剂或与载体复合(例如PEG))(参见例如美国专利号6,147,204、美国专利号6,011,020)。在一种实施方式中，可以使多个调节剂与单个PEG分子缔合，该调节剂可用于相同或不同的适体。在其中对同一个适体有多种调节剂的实施方式中，由于与该适体的多重结合相互作用而增大了亲和力。在又一实施方式中，多个PEG分子可以被彼此连接。在这种实施方式中，用于相同适体或不同适体的一种或多种调节剂可与各个PEG分子缔合。这也导致了各调节剂对其靶的亲和力增大。

亲脂性化合物和非免疫原性高分子量化合物，利用它可配制成本发明调节剂来用于本发明，可以通过本领域目前已知或后来发展的任何各种方法来制备。典型地，它们是由磷脂例如二硬脂酰基磷脂酰胆碱来制备，并且可包括其它材料例如中性脂质如胆固醇、以及还有表面修饰剂如带正电荷(例如甾基胺或氨基甘露糖或胆固醇的氨基甘露糖醇衍生物)或带负电荷(例如二乙酰基磷酸酯、磷脂酰基甘油)的化合物。可通过传统方法形成多层脂质体，即通过将所选择的脂质溶解于适当溶剂中，然后蒸发该溶剂在容器里面留下薄膜，或者通过喷雾干燥来在适当容器或管内壁上沉积该脂质。然后在漩涡或涡流运动下将一种水相加入容器中，其导致MLVs的形成。然后可通过MLVs的均化、超声波降解或挤出(通过过滤器)形成UVs。在某些本发明的实施方式中，复合物包括含有靶与脂质体表面缔合的适体的脂质体和胶囊包着的治疗或诊断剂。可改进预形成的脂质体以与适体相缔合。例如阳离子脂质体通过静电相互作用与核酸相缔合。备选地，附连到亲脂性化合物上的核酸例如胆固醇可被加入预形成的脂质体中，由此胆固醇变得与脂质体膜缔合。备选地，在配制脂质体期间可以使核酸与脂质体缔合。

给药方法

本发明材料给药到哺乳动物宿主的优选方式是肠胃外、静脉内、皮内、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心脏内、肌内、皮下、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、局部、透皮贴剂、经直肠、阴道或尿道栓剂、腹膜、经皮、鼻喷雾、外科植入、内部外科涂剂、输液泵或经导管的方式。在一种实施方式中，以缓释制剂给药试剂和载体例如灌输、大丸剂、微粒、微球体、纳米颗粒、或毫微球。关于治疗剂型的标准信息，参见Ansel，等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Sixth Edition，Williams & Wilkins(1995)。

可通过注射或随时间逐步输入来以非肠道方式给药本发明的适体或调节剂。虽然通过体内全身给药通常可进入待治疗的组织，并因此最经常是通过静脉内给药治疗组合物来治疗，但是仍然提供了其它组织和输送技术，其中有可能所述的靶向组织含有靶分子。因此，本发明的适体和调节剂通常被口服、局部给药到血管组织、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、经眼，并且能够通过蠕动技术输送。如上所述，将药用组合物供给个体可通过各种途径如口服、局部给药到血管组织、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、经眼，并且能够通过蠕动方法输送。局部给药到血管组织的非限制性的典型方法包括(1)用含有核酸配基的凝胶涂覆或浸渍血管组织以在体内输送，例如通过植入涂覆或浸渍过的血管代替被除去或旁通的损伤或有病的血管组织段；(2)经导管输送到其中需要输送的血管；(3)将核酸配基组合物泵送到待植入病人的血管中。备选地，通过显微注射或脂质体封装可将核酸配基引入细胞。有利地，本发明的核酸配基可以是每日一次剂量给药，或每日全部剂量分几剂给药。其后，以任何适当方式提供调节剂来通过给药该调节剂而改变核酸配基的作用。

例如通过注射单位剂量，可按常规静脉内给药含有本发明的多肽调节剂的治疗组合物。当关于本发明治疗组合物使用术语“单位剂量”时，是指适合作为单剂量用于受治疗者的完全离散单位，每个单位含有计算出的预定量活性材料，以与所需稀释剂即载体或赋形剂联合产生所需治疗效果。

以与给药药剂相容的方式给药组合物，并且以在此所述的治疗有效量给药。合适的给药方式是可变的，但是典型地是在初始给药后接着以一小时或更多小时的时间间隔继续注射或以其它方式重复剂量给药。备选地，预期的连续静脉内注入足以将在血液中的浓度保持在体内治疗的指定范围内。

在此使用的术语“药学上可接受的”、“生理学上容许的”及其文法变化，当它们是指组合物、载体、稀释剂和试剂时，可互换使用，并且表示该材料能够在没有相当大毒副作用或使毒副作用衰弱下给药。

可药用组合物包括根据已知方法例如通过可药用载体的混合能够配制的本发明调节剂。在Remington′s Pharmaceutical Sciences中可找到这类载体和配制方法的例子。为了形成适用于有效给药的可药用组合物，该组合物将含有有效量的适体。该组合物可含有多于一种调节剂的混合物。

实施例

测试血凝固的措施

血凝固的标准测量包括基于血浆的凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶原激酶时间(APTT)测定，两者都是在血浆和全血中，以及基于全血的活化凝固时间(ACT)进行测定。虽然在这些测定的各个中用于引发血凝固的活化剂不同，但它们共有的特征是凝块形成作为测定终点。重要的是，在这些体外测定中，低水平的凝血酶～10-30nM就足以产生足够的纤维蛋白来达到终点。该凝血酶水平代表仅3-5％的从凝血酶原到凝血酶的转化率，并且与凝固反应的开始阶段期间产生的凝血酶量一致(Butenas等人，2003；Mann等人，2003)。因此，这些测定大体上报告了凝固反应的初始阶段，而没有充分反映在凝固的增长阶段主要涉及的凝血因子的缺乏或受到的抑制的影响。

举例说明了其中标准凝固测定反映FIX/IXa活性的方式，这些测定能够在具有严重血友病A(FVIII缺乏)或B(FIX缺乏)的个体中发现或未发现异常凝固测量值。血友病的特点是APTT的分离延长，因为患血友病的个体具有异常APTTs，而不是正常PTs(Bolton-Maggs and Pasi，2003)。血凝固细胞模型说明了关于为什么缺乏FVIII或FIX的个体记录了正常的PTs的奇异现象。PT测定以超生理水平的组织因子开始，足以在11-15秒产生凝块。因此，甚至在没有FVIII或FIX的条件下，用于迅速引发反应的高水平组织因子FVIIa复合物产生的Fxa量足以产生足够的凝血酶以达到凝结终点。因此，甚至不期望深度抑制FIX/FIXa活性来影响PT测定，因为在该测定中，在血凝固开始时FIX的作用被掩盖了或被忽视了。因此，不期望FIXa的药理学抑制剂例如抗FIXa适体FIXa延长PT值。

血浆或全血APTT测定两者都是以带电的颗粒例如硅藻土或高岭土、磷脂表面和足量的钙开始，以在28-35秒产生凝块。虽然患血友病B(和A)的个体记录了异常的APTT值，但是在这些个体中APTT的延长的幅度是有限的(即产生有限值)，因为该测定大体上报告了血凝固的开始阶段。个体的血友病B严重性及其APTT值之间不是紧密相关的，因为APTT取决于除FIX之外的其它凝血因子。因此，用于解释FIXa的药理学抑制如何被期望在APTT测定中记录的更好框架是血浆FIX分析。血浆FIX分析是标准APTT方法的一种变化，其中在进行APTT之前，将测试血浆在缓冲剂中稀释并且与缺少FIX的血浆一起混合，使得在测试血浆中FIX水平是凝固时间的主要决定因素。该分析通常用于确定血友病B的严重性(即测定FIX水平)或用来诊断获得的FIX抑制剂。通过将测试样品的凝固时间与FIX水平标准曲线进行比较来说明FIX分析的结果，其是在与FIX不足血浆混合之前通过在缓冲剂中连续稀释正常血浆来制备的。表1示出了利用正常的人血浆完成的典型FIX水平标准曲线[注：该分析中的绝对APTT时间是由试剂决定的。如表1中所观察到的，FIX水平是正常值的25％(即降低75％)时，APTT凝固时间在基线上增加1.4倍，而当FIX水平是正常值的～3％(即降低97％)时，APTT凝固时间在基线上增加2倍，而当FIX水平<正常值的1％(即降低>99％)时，APTT凝固时间相对于基线增加了2.5倍。血友病B的载体(即正常FIX水平的～50％)显示出正常的APTT值(Bolton-Maggs andPasi，2003)，这与根据FIX水平标准曲线而得的数据一致。合起来看，这些观测显示显著百分比的FIX活性在APTT将被延长之前必须被抑制。

因为主要是在手术室和导管室中采用ACT测定来监测操作期间的抗凝作用，所以关于ACT如何受到降低的FIX/FIXa活性的影响存在很少的数据，因为患血友病的个体通常是在进行这种操作之前被用因子替代治疗(或类似治疗)进行治疗。然而，由于ACT是以带电颗粒开始的凝固终点测定，所以在ACT测定中FIXa的药理学抑制效果很可能反映出在APTT测定中观察到的那些。即，预期在直到达到实质程度的FIXa抑制水平(>50％)之前不会观察到ACT的延长。因此，类似于APTT测定，与采用未分级的肝素所观察到的延长相比，ACT延长量很可能是中度的。最后，响应FIXa抑制，该测定很可能达到饱和。在非临床毒性研究中，在用各种剂量RB006处理的猴子中证明了APTT和ACT响应的这种相似性。

REG1抗凝系统对血凝固测量值的影响

前述数据显示：在体外或者在静脉内给药到动物之后，抗FIXa适体没有延长PT(Rusconi等人，2004，Nat Biotechnol.22(11)：1423-8；Rusconi等人，2002，Nature 419(6902)：90-4；Dyke，2006，Circulation.114(23)：2490-7)。如图3所示，RB006在体外在汇合的正常人血浆中引起依赖性的APTT增加。该数据指示，RB006 APTT剂量-反应曲线在0和30-50μg/mL之间最敏感，然后开始达到平台。包括APTT剂量-反应曲线的上升期和平台期的这些特征在来自其中RB006或初始抗FIX适体表现出交联反应性的所有种类的血浆中是一致的，该所有种类包括人、猪、鼠和猴子(Rusconi等人，2004，Nat Biotechnol.22(11)：1423-8)。响应体外用抗FIXa适体处理血浆中达到的APTT最大值取决于所采用的APTT试剂和种类。然而重要的是，该APTT最大值与FIXa活性的完全抑制或接近完全抑制相一致。这被以下事实所证明，即响应抗FIXa适体的APTT最大值等价于在含有<1％正常FIX含量(但其它所有凝固因子水平正常)的人血浆中APTT并且等价于在FIX-敲除小鼠的血浆中APTT(Rusconi等人，2004，Nat Biotechnol.22(11)：1423-8)。因此，响应RB006的APTT的平台或许反映了由于FIX/FIXa抑制被适体所饱和。

另外，将图3中的数据与表1中血浆FIX分析标准曲线进行比较提供了可深入了解RB006的效力。在～5μg/mL的RB006浓度下响应RB006的APTT增加～1.4倍，指示RB006的这个浓度足以抑制～75％血浆FIX活性。此外，根据血浆FIX分析，在10-15μg/mL的RB006浓度下达到几乎95％的血浆FIX抑制(APTT增加2倍)。

通过测量来自个体血浆中依赖于RB006浓度的APTT的延长，已经进行了体外研究来评估RB006的抗凝血剂效果的个体变异性。在汇合的正常人血浆中对来自个体血浆的体外RB006 APTT剂量-响应曲线的比较示于图4中。

如图4中所示，依赖于RB006浓度的APTT增加非常类似于来自每一个体的血浆中的情况。此外，依赖于RB006浓度的个体血浆APTT增加非常类似于汇合的正常人血浆(每个汇合20个供体)。如ACT分析中所测得的，RB006还延长了凝固时间(Rusconi等人，2004，NatBiotechnol.22(11)：1423-8)。然而，在这个时候，对作为RB006浓度的函数的ACT变化的解释说明是有限的，这是由于难于进行关于ACT的体外剂量-响应研究所致，因为该分析需要新鲜的全血，并且是时间敏感性的。

已经利用APTT分析在体外测量了RB006抗凝活性被解毒剂RB007的中和。如图5所示，相对于在汇合的人血浆中RB006的固定浓度，RB007浓度增加了。APTT值变化恢复到基线水平，指示RB007抗凝活性被完全中和。体外人血浆中全部RB006中和所需的最小过量RB007摩尔数约为3-4倍(即抗体相对于适体寡核苷酸部分的摩尔比)。这与测得的RB006-RB007双螺旋稳定性是一致的(Tm为～90℃).。

图5中所示的数据也用作用于选择非临床安全药理学和毒性研究及临床实验中采用的解毒剂RB007相对于药物RB006的剂量比的基础。达到体外人血浆中RB006全部中和必需的相对于RB006的最小过量RB007摩尔数为3-4倍。如果得到RB007(5,269Da，钠盐)与RB006(-50，964 Da，钠盐)之间的分子量差异，就将此转换成0.5:1解毒剂:药物的重量对重量比。因为这是一个体外结果并因此不能预知任一成分的药物动力学将如何影响体内的药物中和，解毒剂:药物的0.5:1的重量比反映出可预期解毒剂的最小比率来有效中和该药物。因此，解毒剂:药物的重量对重量比为2:1，小倍数的体外最低有效剂量被选择为非临床和临床研究的开始剂量。

总之，抗FIXa适体RB006是一种能够完全或接近完全抑制FIXa体外活性的凝固FIXa的有效抑制剂。利用APTT和ACT分析可有效地监测RB006的抗凝活性，正如适体活性能被被RB007中和一样。由体外研究可得，关于RB006已经很好地确定了FIX抑制百分比与APTT变化之间的关系。由体外研究已经定义了足以达到适体活性完全抑制的解毒剂与适体的适当摩尔比，该研究得到了被选择用于REG1抗凝系统的0.5:1的解毒剂:适体剂量比。

非临床药理学、药物分布和毒性

REG1抗凝系统及其个别药物和解毒剂组分的药理学活性(或效力较小的药物和解毒剂的原型，分别被称为RB002和RB004)在体外和临床相关动物模型中得到了证明。

在猪全身抗凝研究(Rusconi等人，2004，Nat Biotechnol.22(11)：1423-8)、羊心肺旁路模型和猕猴安全药理学研究中评估了抗FIXa适体的抗凝活性。还在小鼠动脉损害模型中证明了抗FIXa适体的抗血栓活性(Rusconi等人，2004，Nat Biotechnol.22(11)：1423-8)。在体外人血浆(Rusconi等人，2002，Nature419(6902)：90-4)、猪全身抗凝模型、小鼠手术创伤模型(即高度抗凝血的动物的尾部横切)(Rusconi等人，2004，NatBiotechnol.22(11)：1423-8)、羊心肺旁路模型和猕猴安全药理学研究中证明了解毒剂的药物中和活性。另外，在猪全身抗凝研究中证明了解毒剂中和先前的药物剂量后不久将要被再给药的药物能力。

REG1抗凝系统的药物动力学表征需要依赖于新方法论的生物分析策略来确定血浆样品中适体、解毒剂和适体/解毒剂复合物的量。将这些方法应用于从体内毒性研究中收集的样品，其容许在单次或重复给药到猴子和小鼠的条件下测定全部三种分子实体的药物动力学。

进行REG1抗凝系统的彻底的安全性评估，在初始临床实验中模拟该产品目的用途的给药条件下(即连续给药适体3小时，接着给药解毒剂)，在猴子和小鼠中进行主要毒性研究。在与目的临床用途相同的剂量比下测试从小至大多个临床用的各成分，并且分别测试两个种类的适体和解毒剂的效果。在两者的猴子研究中，根据模拟初期临床实验中预计给药的计划中有许多治疗组接受单次剂量适体、解毒剂或两种测试物。而且，在14天小鼠研究和在单次和重复给药的猴子毒性研究中，包括在两周期间给药重复的剂量的组(给小鼠14个每日剂量，而给猴子7个剂量，每隔一天一次持续两周)。在毒性研究中包括了特定的终点来评估对于REG1组分的药物动力学反应和寡核苷酸的分类效果。用在猴子中的安全药理学评估(采用生物遥测学)、一组遗传毒性测试和血液相容性研究来补充核心的毒性研究。

在猪中的抗凝活性和药物中和效能的研究

在猪全身抗凝血模型中评估在解毒剂RB007中和初始剂量适体后再给药适体RB006的能力。在这些研究中，在给药解毒剂后30分钟给药第二剂药物。选择给药解毒剂和再给药适体之间的30分钟窗口以使首次适体剂量的抗凝活性中和作用能够清楚地进行实验证明。如图6中所示，达到第二剂适体抗凝活性峰的抗凝活性峰值和时间基本上与初始适体剂量相同，证明解毒剂中和适体的首次剂量后再给药适体是可行的。这些数据与在小鼠和猴子两者中所观察到的RB007药物动力学一致，其指示RB007具有非常短的血浆半衰期(即几分钟)，并且甚至在明显高于该研究所采用的剂量下，也没有积聚成可察觉的血浆浓度。考虑到解毒剂的半衰期，或许能够在给药解毒剂后有效地以短于30分钟的时间间隔再给药该适体。

在羊心肺分流术和冠状动脉旁路移植(CABG)中REG1抗凝系统的 效力

在冠状血管再生术[冠状动脉分流术移植(CABG)和经皮心脏介入(PCI)]中，REG1可用作解毒剂可逆的抗凝血剂，作为解毒剂可逆的抗凝血剂用于患者，包括患急性冠脉综合症的人，并且作为用于其它征兆的抗凝血剂，其中使用解毒剂可逆的抗凝血剂用于抗凝血或抗血栓形成治疗是有利的。在此所述的研究试图定义在进行具有CPB的CABG手术的动物中保持心肺旁路(CPB)回路开放所必需的REG1抗凝成分RB006的剂量范围，并且试图定义在该模型中中和RB006所需REG1解毒剂成分RB007的相应剂量。

在冠状动脉分流手术开始时将RB006(抗凝血剂)静脉内给药到10只羊，在手术结束时，静脉内供给RB007(RB006中和剂)以逆转RB006的效果。在28±3天后，将所有动物安乐死。

收集左右肾、肝、肺及全脑的典型样品。用乳酸化的林格氏溶液或生理盐水冲洗心脏直至清除了血液并且在10％中性缓冲的福尔马林(NBF)下将压力灌流固定在～100mmHg持续6小时。完全固定后，将心脏置于10％NBF中。用10％NBF浸渍固定在验尸期间收集的典型组织样品。

以大约每个1cm将心脏横切(土司面包型)并且检查其异常性。从每个心脏收集10个切片并且在石蜡中加工。10片中的3片包括LCX融合、大动脉融合和中间移植。剩下的7片包括右心房壁、左心房壁、心房间隔膜、右心室游离壁、左心室游离壁、心室间隔膜和尖端。将含有心肌组织的所有石蜡块切片两次，一次用于用苏木精或曙红(H&E)着色，并且一次用于用Masson′s Verhoeff Elastin(MVE)着色。将肾、肝、肺及脑样品插入石蜡中并且如下切片：从每个肾切一片，从每个肝切一片，从每个肺切一片，以及从四个脑组织样品中的每个切一片，总共8个切片。将所得全部载物片用H&E着色。

关于该研究的宏观观察和组织学关系指示大部分损伤要么涉及手术操作(例如粘连)，要么涉及安乐死(例如在气管和支气管中的泡沫)。粘连是这类手术操作的普通后遗症并且在该研究中不认为是过多的。

在一种动物的大动脉融合处有少量、最小限度依附的血栓。该血栓似乎没有阻塞血液流入移植物。对于该观测没有特定的微观相关物。在融合位置的微观发现在类型和幅度方面与两组中的其它研究动物相类似。有一种例外，在任何研究动物中的冠状动脉旁路的任何部分内都没有血栓症或闭塞的目视迹象。偶然的血栓形成在该模型中不是罕见的，因此，与RB006给药的关系被认为是值得怀疑的。

在猕猴中REG1抗凝系统的药物动力学活性

在APTT分析中随浓度而定的凝固时间延长反映了在猕猴血浆中RB006的体外抗凝活性。如图7中可见，RB006 APTT剂量-响应曲线在0和50μg/mL之间是最敏感的，然后是平台，如关于其它种类已经看到的。猴子和人剂量-响应曲线是类似的，除了在人中响应范围更大。在人血浆中，在达到约200μg/mL之前有依赖于浓度的APTT延长，而在猴子血浆中，浓度-响应曲线在大约50μg/mL时达到平台。人血浆曲线的平台出现在APTT值等价于含有<1％血浆FIX活性的人血浆中观察到的值处，并且很可能是由于将靶FIXa饱和所致。进行血浆FIX分析以有助于解释猴子血浆中的RB006 APTT剂量-响应曲线。如表2中所示，猴子血浆中的APTT对FIX水平敏感。然而对于FIX水平降低的响应值是适度的。FIX水平降低75％导致APTT增加14倍，FIX水平降低>95％导致APTT加倍，而血浆FIX水平降低99.9％导致APTT增加2.5倍。

将图7中的数据与表2中的陈列数据进行比较指示，抑制猴子血浆约90％的FIX活性需要～6μg/mL RB006(即，该浓度产生APTT增加1.6倍)，而>95％的血浆FIX活性抑制发生在RB006浓度为10-12μg/mL时。体外RB006猴子APTT剂量-响应曲线的平台是在基线上增加约2.5倍时(基线～24秒，APTT最大值～60秒)，其与猴子血浆FIX分析中在<0.1％正常FIX水平时所观察到的APTT增加值一致(参见表2)。因此，RB006 APTT剂量-响应曲线中平台可能代表猴子血浆中靶被饱和(即FIX活性被完全抑制)。最后，体外猴子血浆中FIX抑制％与血浆RB006浓度的关系曲线通常类似于在体外人血浆中所观察到的，主要差异是：在基线和APTT最大值之间的RB006浓度范围在人中更大，而剂量响应增加在人血浆中比在猴子血浆中更平缓。

猕猴中RB006和RB007体内活性

在猴子安全药理学研究REG1-TOX001中评估了RB006和RB006/RB007复合物的抗凝血性能与这些化合物血浆含量之间的关系，简要地，将12只猴子分配到三个治疗组。组1接受抗FIXa适体RB006，组2接受RB006的解毒剂RB007，以及组3用REG1抗凝系统处理，即RB006后接着RB007(3小时之后)。在两种数量的测试品中逐步增加剂量，第一剂发生在研究的第4天，而第二剂发生在第13天。为了更好地理解RB006剂量-响应，将分配到第1组的4只猴子(RB006，单独适体)在第13天再细分成两组，让两个动物接受低剂量(组1a，5mg/kgRB006)，而让两个动物接受高剂量(组1b，30mg/kg RB006)。

如图8中所示，以范围为5-30mg/kg的剂量给药RB006导致猴子中抗凝水平极深。在给药RB006后自0.25-24小时在每个剂量水平下的平均APTT超过60秒，其等价于在猴子中<0.1％正常血浆的FIX水平。响应于给药RB006有依赖于剂量的APTT增加。

然而，剂量-响应不是立即显而易见的，这是由于事实上在给药RB006后6小时时间点以内，RB006血浆水平超过体外APTT剂量-响应曲线达到平台时的浓度(～40-50μg/mL；参见表3和图7)。在给药RB006超过6小时后的时间，RB006浓度降至该水平以下，剂量-响应更加明显。紧接着APTT直至其回到猴子接受5和15mg/kg剂量RB006时的基线。在5mg/kg剂量水平时平均APTT经120小时回到基线，而在15mg/kg剂量水平时经192小时，这与体外APTT剂量-响应曲线(图7)和在猴子中观察到的RB006半衰期约为12小时(参见表3)相一致。APTT数据(未示出)反映了全血活性凝固时间(ACT)的数据。

利用双寡杂交ELISA分析，在给药RB006后第一个24小时内的几个时间点收集毒性动力学数据。如表3所示，RB006浓度增加作为给药剂量的函数，并且RB006的半衰期在12小时范围内。与图8中所示数据一致，RB006血浆水平(表3)与图7中所示体外剂量-响应曲线的比较指示在所有剂量水平给药RB006后第一个24小时内动物抗凝血程度极深。这些剂量水平很好地在建议的临床范围之上。在组1a动物中在给药后24小时的RB006平均浓度和这些动物的平均APTT之间具有极好的对应性。在24小时用5mg/kg RB006处理的动物的RB006平均浓度为15.9μg/mL，而平均APTT为61.1秒。根据猴子体外RB006剂量-响应曲线，这很有利地与预期结果相当(参见图7)。因此，该研究确认了APTT可用于在用RB006处理的猴子中监测抗凝血水平，并且该数据支持采用APTT监测初期临床研究中接受RB006的人的抗凝血状态。

在仅用解毒剂RB007处理的组2动物中，平均APTT和ACT不受在任一测试的剂量水平(30和60mg/kg)下给药RB007的影响。利用双寡杂交ELISA分析，在给药RB007后第一个24小时内的几个时间点收集毒性动力学数据。如表4所示，低但可测量的解毒剂量存在于在第4天注射30mg/kg或第13天注射60mg/kg后0.25小时接受RB007的动物血浆中。这些量可变性极大，但通常是依赖于剂量的。与静脉内注射后适体浓度(组1)相比，解毒剂的后给药水平非常低。因此，显而易见的是，当单独给药时，解毒剂在血浆中具有非常短的半衰期，并且在注射后15分钟内大体上被从循环中清除掉。

来自用RB006处理，接着用RB007处理3小时后的动物(组3)的APTT数据示于图9中。与来自仅用RB006处理的动物的数据一致，以这些剂量水平给药RB006产生极高的抗凝血水平，在给药后0.25和3小时的平均APTT′s与在两种剂量水平基本上完全的FIX抑制相一致。后来RB007的给药迅速并完全地中和了猴子中RB006的抗凝效果，在RB006/RB007两者的测试剂量水平上，平均APTT在给药RB007(所取第一时间点)后15分钟内回到基线。在用30/60mg/kg RB006/RB007处理的组3动物中，在RB006给药5天后，跟着给药APTT。在该时间期限内收集的APTT数据表明RB006抗凝效果被持久地中和，在120小时内没有抗凝作用回弹的迹象，或在猴子中约为10个RB006的半衰期(图9)。解毒剂RB007对RB006抗凝活性的中和作用的持久性与所观察到的该药物-解毒剂复合物的热力学稳定性完全一致。

在组3动物中给药RB006后24小时收集毒性动力学数据(表5)。对于组3动物，测量游离RB006(即未被RB007结合的RB006)和复合RB006(即被RB007结合的RB006)血浆浓度两者。与图9中所示APTT数据一致，在给药后0.25和3小时的RB006平均血浆浓度是十分高的。在给药RB007 15分钟内，游离RB006平均浓度下降5,000-10,000倍，达到低于所采用的该分析定量的下限(LLOQ)的水平。在15/30和30/60mg/kg剂量水平下，伴随游离RB006含量下降，复合RB006的平均血浆浓度在从该分析LLOQ以下分别增加到～125-220μg/mL，指示由于RB007与RB006结合而游离RB006浓度迅速下降。在RB007给药后3小时，游离RB006浓度保持在该分析LLOQ以下，这与APTT结果相一致。在给药RB007后21小时(给药RB006后24小时)，在几个动物中可发现非常少量RB006(仅平均0.17μg/mL或更少)。然而这些RB006量太少而不能产生可测量的抗凝效果，这与在用REG1抗凝系统处理的动物中在24小时和更久没有APTT延长相一致。

在猴子中非临床药理学研究概述

所列的研究证明了RB006是猴子的有效抗凝血剂，在以超临床剂量静脉内团注后24小时或更长的时间能够达到基本上完全抑制FIX活性持续。比较猴子体外RB006抗凝活性研究与由安全药理学研究所得的APTT和毒性动力学数据证明了预期和观察到的APTT延长与血浆RB006浓度关系曲线之间的良好对应性。因此，APTT分析将被用作监测由给药RB006引起的抗凝作用的有利工具。人和猴子体外RB006-APTT剂量-响应曲线之间的相似性启示由该猴子研究(REG1-TOXOO1)以及在猴子中进行的全身大毒性研究(REG1-TOX003)所得数据将用作预测人对给药RB006的响应的有益指导。最后，来自REG1-TOXOO1的APTT和毒性动力学数据证明RB007是非常有效的RB006解毒剂。在RB006治疗动物的静脉内团注给药RB007后15分钟内，平均APTT时间回到RB006前治疗水平并且保持在该基线水平持续整个监测期(120小时以内)。所观察到的RB007对RB006抗凝活性的中和作用可得到毒性动力学数据的充分支持，并且与测得的RB006-RB007复合物热力学稳定性相一致。毒性动力学研究证明游离RB006水平在给药RB007后的15分钟内降低到该分析的LLOQ以下，伴发复合RB006浓度显著增加，并且对于毒性动力学分析持续时间(给药RB006后24小时)没有可评估的游离RB006水平增加。因此，猴子研究所得数据证明：关于由静脉内团注适体、接着在静脉内团注解毒剂下迅速、完全和持久地中和适体活性而达到稳定、持久和可监测的抗凝作用，REG1抗凝系统的表现如预计的那样。REG1抗凝系统的这种性能可在由低到高的多种预计的临床剂量范围下达到(即用于毒性研究的适当剂量)，但对动物没有不利影响。

REG1毒性动力学

人们改进了生物分析方法并证实其能够量化猴子和小鼠血浆中的游离适体(RB006)、游离解毒剂(RB007)和适体/解毒剂(RB006/RB007)复合物的浓度。将这些方法应用于分析从猴子安全药理学研究(研究号REG1-TOX001)、14天小鼠研究(研究号REG1-TOX002)以及猴子的单次/重复剂量研究(研究号REG1-TOX003)中收集的样品。对于全部三种研究，包括单独接受适体、或单独接受解毒剂、或接受适体3小时后接受解毒剂的分别的动物组。所有研究中在多种剂量水平的各治疗条件下进行测试，并且这些研究中的两种(14天小鼠研究和猴子的单次/重复剂量研究)也采用重复给药测试物。在这些研究中测试的适体的剂量水平范围是对于猴子为0.25-45mg/kg以及对于小鼠为2.5-22.5mg/kg。测试解毒剂的剂量是那些适体的两倍(即猴子90mg/kg以内，而小鼠45mg/kg以内)。该比率类似于打算用于临床实验的比率。

对于全部三种研究，关于证明REG1抗凝系统的以下性能，毒性动力学结果是相似的：

-在静脉内注射后，适体血浆浓度在宽剂量范围内是与剂量成比例的，具有适度的动物间变化，在猴子或小鼠中没有明显的性别差异。

-从血浆清除适体比较慢(即估计半衰期对于猴子至少为12小时，而对于小鼠为8小时)。这种缓慢清除可根据适体的聚乙二醇化结构而预期，并且与关于其它聚乙二醇化的寡核苷酸的药物动力学的文献记录相一致。根据测量药效标记，即活化部分凝血激酶时间和活化凝血时间，适体的最小清除率结合其高IX因子抑制效力在6小时期间提供了相对稳定的抗凝血程度。该特性是REG1抗凝系统的适体组分的理想性能。

-静脉内团注解毒剂(没有用适体在先治疗)在血浆中产生非常低的水平，甚至是在注射后第一取样时间(10-15分钟)时。在这些早期时间测量的解毒剂水平是低于适体的那些测量值的数量等级(即与已经单独接受了适体的那些组中适体水平相比)，尽管事实上解毒剂剂量水平是两倍高。总起来说，解毒剂数据指示，当单独提供时，其在血浆中具有非常短的半衰期。当以比较高剂量水平(30mg/kg)每隔一天给猴子给药7剂(14天)时，没有出现解毒剂在血浆中积聚。

-对于接受适体3小时后接着接受解毒剂的组(即完全的REG1抗凝系统)，游离适体浓度在给药解毒剂后数分钟内急剧降低至低于或稍高于定量限度(采用敏感度高的杂交型分析)，指示循环的适体被解毒剂完全结合。如用解毒剂单独处理所见的，在这些条件下具有非常低水平的游离解毒剂。适体与解毒剂的结合产生事实上适体活性完全被中和(即凝固参数的正常化)，与REG1抗凝系统的预计性能相一致。

-与除去游离适体同时，检测到适体/解毒剂复合物在血浆中的水平与适体和解毒剂完全结合相一致。以稍快于游离适体的速率从血浆中除去该复合物(即，通过与仅用适体处理的组中的适体清除速率进行比较)，但是比游离解毒剂的速率低得多，如由该复合物(得自适体)内存在聚乙二醇部分可预期的那样。显而易见的是在给药解毒剂后21小时内从血浆中广泛除去了适体/解毒剂复合物。在将适体和解毒剂(REG1抗凝系统)两周每天重复给药到猴子时，在血液中没有该复合物积聚或游离的适体积聚，适体药物动力学没有变化(即在给药解毒剂之前的时期)，并且没有由适体产生的累积抗凝血作用迹象。

-在小鼠和猴子药物动力学之间仅有的差异是在猴子中适体半衰期略长(至少12小时，与在小鼠中8小时相比)。

人的REG1临床使用

在选择哪种抗凝方法用于个体病人或病人群体方面，临床医生权衡了各种药理学策略的特征。记住抗凝作用的主要不利效果是出血(即药理学过度)，对于紧急医护指示，理想的抗凝血剂是1)静脉内或皮下可输送的；2)立即治疗的；3)易于给药以致不需要频繁监测，并且最重要的是4)立即并且可预测地逆转。为了回应这种未满足的医疗需求即需要有效、安全并且可迅速逆转的抗凝血剂，已经改进了REG1抗凝系统。

在需要这种处理的处理人及其它动物的许多临床应用中可采用REG1。例如，在与动脉疾病和闭塞有关的冠状和外周血管再生术中，REG1可用作解毒剂可逆的抗凝血剂。特别是在冠状血管再生术(冠状动脉旁路移植(CABG)和经皮心脏介入(PCI))中，REG1可用作解毒剂可逆的抗凝血剂，作为用于急性冠脉综合症患者的解毒剂可逆的抗凝血剂，以及作为用于其它征兆的抗凝血剂，在这些征兆中采用解毒剂可逆剂有利于抗凝血或抗血栓形成治疗。本发明方法可用于的病症和手术包括但不限于外周血管移植术，其包括与回肠、颈动脉、臂、大动脉、肾、肠系膜、股动脉、腿弯部、胫骨、和腹膜脉管相关联的那些，预防深度静脉血栓、预防矫形手术后或癌症患者中的肺栓塞、预防心房纤维性颤动、预防血栓形成中风；以及需要血液体外循环的指征，其包括(但不限于)血液透析和体外膜式产氧。本发明方法可用于的潜在病症和手术的另外例子包括(但不限于)进行心内心肺旁路手术的患者；具有心内血块形成或外周栓塞的患者；以及处于其它凝固性过高状态的患者。本发明方法也可用于预防不能动的病人的DVT和肺栓塞以及可用于保持留置静脉内导管和动脉或静脉管道的效能。

REG1的抗凝血成分RB006的剂量范围将取决于征兆。例如，RB006剂量可以是在人中为约0.1mg/kg-约10mg/kg。在某些征兆中，剂量范围可以是约.5mg/kg-约9mg/kg、约.75mg/kg-约8mg/kg、约1mg/kg-约7mg/kg、约1.5mg/kg-约6.0mg/kg、约2.0mg/kg-约5.0mg/kg、约2.5mg/kg-约4.0mg/kg.。在某些征兆中，以保持手术开放所需的剂量来给药药物成分。在某些征兆中，单独给药RB006，没有随后给药中和解毒剂。

中和或部分中和RB006所需的REG1解毒剂成分RB007的相应剂量范围取决于RB006的给药量。以解毒剂:药物重量比(解毒剂毫克数:药物毫克数)，解毒剂剂量范围可以是约0.1:1-约20:1、约.25:1-约15:1、约.5:1-约12:1、约.75-约10:1、约1:1-约9:1、约1.5:1-约8:1、约2:1-约7.5:1、约2.5:1-约6:1、约3:1-约5:1.。

对其临床应用安全有信心的REG1抗凝系统的最重要性能是解毒剂以依赖于剂量的方式可预测地逆转适体的药理学活性的早已确立的能力。

对人的REG1抗凝系统的评估

该研究是首次对人进行REG1抗凝系统评估。在健康人志愿者中进行REG1抗凝系统的单次静脉内(IV)剂量-梯度研究。在该研究中，受治疗者被随机地分配到三条线路之一、为4个不同剂量水平之一的被研究物或安慰剂。在每条线路的每个剂量水平，受治疗者被随机安排为7:1的治疗对安慰剂，受治疗者接受REG1或安慰剂。全部安慰剂注射采用0.9％USP氯化钠注射液。随机安排受治疗者来接受每一剂量水平的REG1或安慰剂。

为了使参与该研究的受治疗者风险减至最小并且使其安全性最大化，以如下顺序指定三条线路：

线路1：安慰剂药物紧接着活性RB007解毒剂成分

或安慰剂药物紧接着安慰剂解毒剂；

线路2：活性RB006药物紧接着活性RB007成分

或安慰剂药物紧接着安慰剂解毒剂；线路3：活性RB006药物紧接着安慰剂解毒剂

或安慰剂药物紧接着安慰剂解毒剂。；

线路1评估REG1抗凝系统的解毒剂成分(RB007)。该线路中每个受治疗者在0时间(即首次团注给药的时间)接受安慰剂注射，3小时以后，该受治疗者接受静脉内注射活性解毒剂成分(RB007)，同时一个受治疗者接受安慰剂。

线路2评估REG1抗凝系统的活性药物成分(RB006)紧接着REG1抗凝系统的活性解毒剂成分(RB007)的组合。该线路中的受治疗者在0时间接受活性药物成分(RB006)注射，并且一个接受安慰剂。3小时以后，接受活性药物成分的受治疗者接受注射活性解毒剂成分(RB007)，同时接受安慰剂代替药物成分的一个受治疗者接受安慰剂代替解毒剂。

线路3评估REG1抗凝系统的活性药物成分(RB006)。该线路中的受治疗者在0时间接受活性药物成分(RB006)注射，并且一个接受安慰剂代替解毒剂。3小时以后，全部受治疗者接受安慰剂代替解毒剂。

在4个剂量水平上给药活性研究药物成分(RB006)：(1)低剂量(15mg RB006)；(2)中低剂量(30mg RB006)；(3)中高剂量(60mgRB006)；以及(4)高剂量(90mg RB006)。选择开始剂量和随后的增加达到最大血浆浓度目标，其定义了在汇合的正常人血浆中RB006体外APTT剂量响应曲线的三(3)个关键方面：在RB006体外剂量响应曲线中APTT开始上升时达到最大血浆浓度目标的低剂量(～4μg/mL)；二(2)个在RB006体外APTT剂量响应曲线中支持IC50达到血浆浓度目标的中剂量(～8-16μg/mL)；以及在体外RB006 APTT剂量响应曲线开始稳定时达到血浆浓度目标的高剂量(～25μg/mL)。

在等价于两倍药物(RB006)剂量水平(基于mg/kg)的四(4)个相应剂量水平下给药活性研究解毒剂成分(RB007)：(1)低剂量(30mgRB007)；(2)中低剂量(60mg RB007)；(3)中高剂量(120mg RB007)；以及(4)高剂量(180mg RB007)。

表6略述了用于1A这个阶段研究的每一线路中的剂量。

在一(1)分钟期间注射来提供各研究药物成分(RB006)、研究解毒剂成分(RB007)、及其各自安慰剂。在0时间提供REG1研究药物成分或安慰剂并且在三(3)小时后提供解毒剂成分或安慰剂。

在健康志愿者中评估REG1以测定安全性曲线并描述REG1抗凝系统的PK和PD响应。该研究是首次将利用适体和适体的低解毒剂核苷酸的抗凝系统给药到人。结果指示在静脉内团注药物之后可见APTT剂量响应曲线，在静脉内团注解毒剂之后迅速持久地回到APTT基线。ACT遵循与APTT类似的图形。与基线相比PT仍然没有变化。

在零时间以静脉内团注射将RB006或0.9％生理盐水给药到受治疗者，通过超时测量血浆APTT来评估该治疗的抗凝血效果(图10)。每个治疗组的APTT值被表示为相对APTT的平均值±SEM。相对APTT是单个受试者在给定取样时间的APTT值除以给药RB006前受治疗者的APTT基线值。值1指示对于RB006没有响应，而值>1指示一种抗凝血效果。当RB006剂量从15mg逐步上升到60mg时，在相对APTT值中可观察到清楚的剂量-响应。通过APTT分析评定的RB006药效活性半衰期似乎至少为12-18小时，因为这是用60mg RB006治疗的受治疗者的平均相对APTT衰减到在用30mg RB006治疗的受试者中所观察到的最大相对APTT所需要的时间。

在零时间以静脉内团注方式将RB006或0.9％生理盐水(安慰剂)给药到受治疗者，然后在给药RB006后3小时以静脉内团注方式将RB007或安慰剂给药到受治疗者，通过超时测量血浆APTT来评估RB006治疗的抗凝血效果(图11)。每个治疗组的APTT值被表示为相对APTT的平均值±SEM。相对APTT是个别受试者在给定取样时间的APTT值除以给药RB006前受治疗者APTT的基线值。当RB006剂量从15mg逐步上升到90mg时，在相对APT T值中可观察到清楚的剂量-响应。给药RB007导致RB006药理学活性被完全、迅速(5分钟内)且持久地中和，如给药RB007后相对APTT回到基线值所证明的。

如以上图10和11所述的治疗。在用60mg RB006治疗后接着在3小时用RB007与用安慰剂治疗的受试者中进行药效响应比较证明了RB007的迅速且持久的中和效能(图12)。给药RB007有效地消除了受试者受到进一步的抗凝血作用，如比较给药RB007和没有给药RB007下在3和24小时之间的APTT响应曲线下面积所看到的。

在灵长类中能够以静脉内团注来给药REG1抗凝系统结果没有产生补体激活是令人惊讶的，这是考虑到补体激活和由此的毒性的相关性，它是先前用这种团注来给药其它类型寡核苷酸分子所观察到的。参见例如Galbraith等人(1994)＂猴子静脉内注射给药磷硫酰寡核苷酸后的补体激活和血液动力学变化(Complement activation and hemodynamicchanges following intravenous administration of phosphorothioateoligonucleotides in the monkey)＂Antisense Research and Development4：201-206；and Levin，A.A.，Monteith，D.K.，Leeds，J.M.，Nicklin，P.L.，Geary，R.S.，Butler，M.，Templin，M.V.，and Henry，S.P.(1998)。寡核苷酸治疗剂的毒性，(在实验药理学手册中)In Handbook of ExperimentalPharmacology，G.V.R.e.a.Born，ed.(Berlin：Springer-Verlag)，pp.169-215。

定量给药参数的策略分析

图13示出了对于接受RB006的所有受治疗者APTT从0至3小时在基准上的相对增长。与来自猴子实验的数据一致，APTT水平达到最大值和稳定水平持续几小时。通过评估相对APTT曲线下的面积与治疗后第一个3小时测得的基线相比来分析该数据。图19示出了RB006响应与％FIX抑制相关性如何。该数据显示利用抗凝血剂以分步的方式可抑制>99％FIX活性。

图14示出了由RB006剂量水平(15，30，60或90mg)组织的各受治疗者的AUC0-3。因为相对效果是在3小时内测量的，所以值“3”表示没有响应，值6表示在基线上平均增加两倍等。

图15示出了作为RB006剂量水平的函数的RB006体重调节的剂量。图16描述了RB006药效(AUC0-3)和RB006“体重调节的”剂量之间的关系。该体重调节的剂量范围为0.2mg/kg-1.6mg/kg，AUC 0-3范围约为3-10个单位。该图显示在响应和体重调节的剂量之间具有清晰的关系，对于抗凝血剂在受治疗者之间变化性相当低。

如图20和21中所见，在参与的受治疗者体重指数(BMI)与RB006剂量水平之间具有清晰的关系。BMI为19-25是正常，25-30是超重，以及>30肥胖。在该研究中受治疗者的范围从BMI约为16到BMI超过35。体重指数(BMI)是由人的体重和身高计算出的数。BMI是人身体肥胖度的可靠指标。BMI没有直接测量身体脂肪，但是研究已经显示BMI与身体脂肪的直接测量值相关，例如水下称重和双能X-线吸收法(DXA)。BMI可被认为是直接测量身体脂肪的替代选择，用同样的方法计算成人和儿童两者的BMI。该计算是根据如下公式。：

图17显示了用RB006处理受试者的BMI调节的剂量作为RB006剂量水平的函数。图18描述了RB006的AUC 0-3和体重调节的剂量之间的关系。剂量范围为0.5mg/BMI-约4.5mg/BMI.，AUC 0-3范围在约3-10个单位之间。如由该图可见的，药物动力学参数和BMI调节剂量之间具有清晰的关系，该关系甚至比体重调节的剂量关系更显著，变化性更低。BMI与相对AUC0-3的关系指示该药物可能主要分布在中央身体隔室，而不在脂肪或相关组织。该分布为REG1系统用作肠胃外给药的抗凝血剂提供了另外的支持。

在具有稳定的CAD患者中评估REG1系统

对服用阿司匹林和/或氯吡格雷的50个稳定性冠状动脉病患者进行研究。将患者随机地分到三组(单独的RB006、RB006紧接着RB007或单独的安慰剂)之一跨越4个RB006和RB007剂量水平。

基线特征包括61岁中年(四分位数间距(IQR)56-68)，20％女性，80％先前经皮冠状动脉介入治疗，以及34％先前冠状动脉傍路移植术。静脉内团注低、中低、中高、高剂量RB006之后10分钟aPTT中值为29.2秒(IQR 28.1-29.8)、34.6秒(IQR 30.9-40.0)、46.9秒(IQR 40.3-51.1)和52.2秒(IQR 46.3-58.6)，p<0.0001，(aPTT正常范围为27-40秒)。在中值1分钟内RB007使aPTT逆转至正常值上限之上<10％(IQR1-2)(图1)，7天以内没有回弹增加。尽管在38％的受试者中使用双重抗血小板治疗，但是没有大出血或其它严重的不利结果。

图20显示出了四种适体/解毒剂剂量与安慰剂的APTT响应比较的结果。组1“低剂量”是在0时间给药15mg RB006和在3小时静脉内团注RB007解毒剂30mg。组2“中低剂量”是在0时间给药30mg RB006和在3小时静脉内团注RB007解毒剂60mg。组3“中高剂量”是在0时间给药50mg RB006和在3小时静脉内团注RB007解毒剂100mg。组4“高剂量”是在0时间给药75mg RB006和在3小时静脉内团注RB007解毒剂150mg。在50和75mg/kg RB006两者中，可见aPTT强劲上升，其在2倍适体浓度的RB007给药下完全逆转。

REG1系统的重复给药

对38个通常健康良好的病人进行研究。确定三个治疗组：组1，其中受治疗者在第1、3和5天接受单次剂量的适体(0.75mg/kg RB006)，1小时后紧接着接受固定剂量的解毒剂(1.5mg/kg RB007)，而组2和3，其中受治疗者在第1、3和5天接受单次剂量的适体RB006(0.75mg/kg)，1小时后紧接着给药可变单次剂量的解毒剂RB007。组2和3受试者的RB007滴定剂量被示于下表A中。

表A.组2和3解毒剂(RB007)与药物(RB006)的剂量比率

¹第5天测试的解毒剂：药物比为0.1:1和1:1，并且是基于第1和3天产生的aPTT结果。

²解毒剂的剂量为0.075mg/kg-0.75mg/kg。

根据对RB006的体重调节响应来选择RB006剂量(0.75mg/kg)。平均起来，该RB006体重调节的剂量使受治疗者的APTT提高2倍。在一(1)分钟的时期内以注射供给每人RB006适体、解毒剂及其各自的安慰剂。图21示出了在第1、3和5天给药RB006(0.75mg/kg)后经不同的解毒剂治疗的时间加权的APTT。

图22示出了对于在各组中给药RB006的APTT效果％。在全部3组中给药75mg/kg适体后可见APTT增加约270％并且经过三个治疗日没有明显的不同。

图23示出了与RB006相比，在以各种不同比率给药RB006(0.75mg/kg)和RB007的组中的平均APTT。在0时间给药RB006，而在1小时时以列出的比率给药RB007。如图中可见，RB007逆转了适体解毒剂的抗凝血剂量。此外，如图23中可见，在各个测试的比率下RB007的逆转作用在时间上是比较稳定的，如同对该化合物的预期，RB006的药效活性随时间逐渐降低。

图24示出了与RB006相比，在以各种不同比率给药RB006(0.75mg/kg)和为各RB007的组中的时间加权的APTT恢复％。在0时间给药RB006，而在1小时时以列出的比率给药RB007。在测试的最低比率0.125:1下，RB007逆转了大约40％的RB006效果。在0.2:1下，RB007逆转了大约50％的RB006效果。在0.3:1下，RB007逆转了大约75％的RB006效果。在0.5:1下，RB007逆转了大约85％的RB006效果。而在更高比率1:1或2:1下，RB007有效地完全逆转了RB006效果。

Claims (30)

1.一种给药适体的方法，该方法包括：

a.测量宿主的体重指数(BMI)；

b.表征所需的药物动力学反应；以及

c.根据每个BMI的剂量与药物动力学反应的比较，将一定剂量的适体给药到宿主以达到所需的药物动力学反应。

2.权利要求1所述的方法，该方法还包括将一定剂量的所述适体的解毒剂给药到宿主，其中所述解毒剂的剂量基于已知的预先给药的适体剂量，并且所述解毒剂：适体比率基于所需的适体活性减小量。

3.权利要求1所述的方法，其中所需的药物动力学反应是最大抗凝水平。

4.权利要求3所述的方法，其中所述适体的给药剂量为4mg/BMI或更大。

5.权利要求1所述的方法，其中所需的药物动力学反应为约75％最大抗凝水平。

6.权利要求5.所述的方法，其中所述适体的给药剂量约为3.0-4.0mg/BMI。

7.权利要求1所述的方法，其中所需的药物动力学反应为约50％最大抗凝水平。

8.权利要求7所述的方法，其中所述适体的给药剂量为约2.0-3.0mg/BMI。

9.权利要求1所述的方法，其中所述抗凝血剂的剂量为0.1-10mg/BMI。

10.权利要求1所述的方法，其中所述抗凝血剂的剂量约为5mg/BMI。

11.一种给药适体的方法，该方法包括：

a.测量宿主的以kg表示的体重；

b.表征所需的药物动力学反应；

c.根据每千克剂量与药物动力学反应的比较，将一定剂量的适体给药到所述宿主以达到所需的药物动力学反应；以及

d.将一定剂量的所述适体解毒剂给药到所述宿主，其中仅根据解毒剂与适体的比例来提供解毒剂的剂量。

12.权利要求11所述的方法，该方法还包括将一定剂量的所述适体的解毒剂给药到宿主，其中所述解毒剂的剂量基于已知的预先给药的适体剂量，并且所述解毒剂：适体比率基于所需的适体活性减小量。

13.权利要求11所述的方法，其中所需的药物动力学反应是最大抗凝水平。

14.权利要求13所述的方法，其中所述抗凝血剂的剂量为约1.4mg/kg或更大。

15.权利要求11所述的方法，其中所需的药物动力学反应为约75％最大抗凝水平。

16.权利要求15所述的方法，其中所述抗凝血剂的剂量约为1.0mg/kg。

17.权利要求11所述的方法，其中所需的药物动力学反应为约50％最大抗凝水平。

18.权利要求17所述的方法，其中所述抗凝血剂的剂量约为.6-.8mg/kg。

19.权利要求11所述的方法，其中所述抗凝血剂的剂量为0.1-2mg/kg.。

20.权利要求11所述的方法，其中所述抗凝血剂的剂量为5-10mg/kg.。

21.权利要求1或11所述的方法，其中所述解毒剂是寡核苷酸解毒剂。

22.权利要求1或11所述的方法，其中所述适体包括SEQ ID NO 1。

23.权利要求1或11所述的方法，其中所述药物动力学反应是在血凝固分析中测得的。

24.权利要求1或11所述的方法，其中所述适体是以静脉内团递来给药的。

25.权利要求1或11所述的方法，其中所述适体是以皮下注射来给药的。

26.权利要求2或12所述的方法，其中所述适体和解毒剂的给药比率为1:1。

27.权利要求2或12所述的方法，其中所述适体和解毒剂的给药比率为至少2:1。

28.权利要求2或12所述的方法，其中所述适体和解毒剂的给药比率为0.5:1或更小。

29.权利要求2或12所述的方法，其中适体活性被逆转少于90％。

30.权利要求2或12所述的方法，其中适体活性被逆转约50％。

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