CN1662663B - 抑制纤溶酶原激活物抑制剂-1的dna酶 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种特异性切割编码PAI-1的mRNA的DNAzyme和核酶。本发明还提供一种特异性抑制编码PAI-1的mRNA翻译的反义寡核苷酸。本发明还提供各种抑制PAI-1表达的方法和由这些方法治疗疾病的方法。最后,本发明提供了含配制好的DNAzyme,核酶,反义寡核苷酸或其他PAI-1表达抑制剂为活性组分的药物组合物。
Description
本申请要求于2002年4月23日提交的美国系列号为10/128,706,的优先权,其内容通过参考结合于本申请中。
在本申请中,各种出版物通过阿拉伯数字在括号中被参考。关于这些参考文献的详细出处位于说明书末尾部分,权利要求书之前。为了对本发明所涉及的领域进行更充分的描述,这些出版物的全部内容均通过参考结合于本申请。
背景技术
在心肌梗塞发生之后,并发的心肌坏死会刺激一种创伤愈合反应,其特征在于炎性细胞迁移到受感染的心肌部位,细胞外基质降解以及新血管的生成。这些组分的每一种都显示需要通过纤溶酶活化潜在的金属蛋白酶,通过由表达在渗透性骨髓源性细胞的表面的尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)活化,纤溶酶衍生自纤溶酶原(1-3)。最近,已经提示细胞表面u-PA的作用可能促进细胞迁移所必需的隐藏的细胞附着位点暴露(4)。这似乎涉及u-PA和天然状态下与玻连蛋白复合的纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)之间直接相互作用(4,5)。PAI-1与蛋白酶,例如u-PA,的反应产生一个快速的构象变化,使其与玻连蛋白解离,并增加其与低密度脂蛋白受体之间的亲和性(6),从而导致它的清除和降解。从玻连蛋白PAI-1暴露了玻连蛋白上与其另一个配体,整合素αVβ3结合所必需的表位(4,7)。由于细胞表面的整合素αVβ3和组织玻连蛋白之间的相互作用已经显示对于血管发生的发育是非常重要的(4,8,9),我们推测在心肌梗塞发生之后,PAI-1蛋白的过量表达会由骨髓衍生的成血管细胞抑制最适新血管生成,而且抑制PAI-1的表达将促进新血管生成。
为了开发一种具有临床应用价值的抑制PAI-1表达的方法,我们对各种抑制特异mRNA活性的可能策略进行了检验。
反义寡核苷酸与它们的mRNA中的互补靶位点杂交,通过空间位阻抑制核糖体的运动,或通过启动内源RNAse H的切割,来阻断翻译成蛋白质(10)。虽然目前通过硫代磷酸酯键合的方法得到的构建体对血清降解具有更强的抗性,但是由于对非靶向RNA的“无关切割”所产生的非特异性生物学效应仍是一个需要解决的问题(11)。
核酶是天然存在的含催化位点的RNA分子,因此它们是比反义寡核苷酸更有效的试剂。但是,由于核酶对化学和酶学降解具有敏感性,以及有限的靶位点特异性,使得核酶的广泛应用受到了限制(12)。
已经描述了新一代的催化性核酸含有DNA分子,并且对特异的RNA序列具有催化活性(13-16)。这类DNA酶表现出比锤头型核酶更强的催化效率,产生比RNA的自发切割速率高出大约一千万倍的速率,并且具有更强的底物特异性,这类DNA酶对化学和酶学降解具有更强的抗性,合成所需费用也相当便宜。
发明概述
本发明提供一种特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性核酸,从5’到3’方向包含:
(a)定义至少4个核苷酸的第一结合结构域的连续核苷酸;
(b)定义与第一个结合结构域的3’末端相连,并能够在预定的磷酸二酯键处对编码PAI-1的mRNA进行切割的催化结构域的连续核苷酸;和
(c)定义与催化结构域的3’末端相连,至少4个核苷酸的第二结合结构域的连续核苷酸。
其中每个结合结构域的核苷酸序列都与PAI-1编码mRNA的核苷酸序列互补,和其中催化核酸与编码PAI-1的mRNA杂交并且进行特异性切割。
本发明进一步提供一种包含配制好的催化性核酸和药用载体的药用组合物。
本发明进一步提供一种特异性抑制PAI-1在另外表达PAI-1的细胞中表达的方法,该方法包含将细胞与配制好的催化性核酸相接触,从而特异性地抑制PAI-1在细胞内的表达。
本发明进一步提供一种特异性抑制PAI-1在受试者细胞内表达的方法,包括对受试者给药对于特异抑制PAI-1在受试者细胞内表达有效量的配制好的催化性核酸。
本发明进一步提供一种特异性抑制PAI-1在受试者细胞内表达的方法,包括对受试者给药对于特异抑制PAI-1在受试者细胞内表达有效量的配制好的药物组合物。
本发明进一步提供一种治疗受试者心血管疾病的方法,所述疾病包括在受试者中的心肌细胞的凋亡,该方法包括对受试者给药对于抑制在受试者中的心肌细胞凋亡有效量的配制好的药物组合物以治疗心血管疾病。
本发明进一步提供一种治疗受试者纤维化疾病的方法,所述纤维化疾病包括纤维发生,所述方法包括对受试者给药对于抑制受试者中纤维发生的有效量的配制好的药物组合物以治疗纤维化疾病。
本发明进一步提供一种可以在高严谨条件下与编码PAI-1的mRNA杂交,长度为8到40个核苷酸的包含连续核苷酸的寡核苷酸。本发明进一步提供配制好的寡核苷酸,其中人源的PAI-1编码mRNA包含连续核苷酸,其序列为SEQ ID NO:5。
本发明进一步提供一种治疗受试者的方法,包括对受试者给药对于抑制PAI-1在受试者中表达的有效量的配制好的寡核苷酸以治疗受试者。
本发明进一步提供一种治疗受试者心血管疾病的方法,所述心血管疾病包括在受试者中的心肌细胞的凋亡,所述方法包括对受试者给药对于抑制在受试者中的心肌细胞凋亡的有效量的配制好的寡核苷酸以治疗心血管疾病。
本发明进一步提供一种治疗受试者纤维化疾病的方法,所述纤维化疾病包括在受试者中纤维发生,所述方法包括对受试者给药对于抑制受试者的纤维发生有效量的配制好的寡核苷酸以治疗纤维化疾病。
附图简述
图1(A)-(D):(A)此图显示的是三个DNA酶,分别命名为E1(SEQID NO:2),E2(SEQ ID NO:4)和E3(SEQ ID NO:3),它们都含有相同的15个核苷酸的催化结构域(SEQ ID NO:1),催化结构域侧接两个8个核苷酸(E1和E2)或9个核苷酸(E3)的臂,这些臂与人源的(E1和E3)或者鼠源的(E2)PAI-1mRNA互补。此图还显示对照的DNA酶E0(SEQ ID NO:7),寡核苷酸S1(SEQ ID NO:8),寡核苷酸转录物(SEQID NO:9)和寡核苷酸S2(SEQ ID NO:10)。(B)此图显示21个碱基寡核苷酸S1(SEQ ID NO:8)当与E1在10∶1底物:酶过量培养时,在2分钟内被切割的情况,最大切割发生2小时,所述S1合成自人源PAI-1mRNA,5’末端标记32P的。(C)此图显示E1也能够以时间和浓度依赖的方式对更大的用32P进行标记的通过体外转录制备的人源PAI-1mRNA片段进行切割。(D)此图显示DNA酶切割的序列特异性质:对照DNA酶E0,其含有与E1和E3同样的催化结构域,但打乱(scramble)侧臂序列,导致人源PAI-1mRNA转录物的未切割。
图2(A)-(D):(A)此图显示DNA酶E2以剂量和时间依赖的方式对23个碱基的合成自大鼠PAI-1mRNA的寡核苷酸S2进行切割。(B)此图显示E2还以剂量依赖的方式切割大鼠PAI-1mRNA转录物2-4小时,以产生156核苷酸切割产物。(C)此图显示大鼠S2PAI-1mRNA转录物(SEQ IDNO:10)与可以被E3切割的人源mRNA PAI-1转录物(SEQ ID NO:9)之间只有一个核苷酸的差异。
图3(A)-(D):(A)此图显示细胞mRNA反转录后的RT-PCR产物的光密度分析结果:在培养的大鼠内皮中,相对于E0打乱的DNA,E2对TGF-β所诱导的稳态mRNA水平产生52%的抑制作用。
(B)此图显示用E2DNA酶转染的内皮细胞对TGF-β介导的PAI-1蛋白诱导的作用。如通过蛋白质印迹所检测,用打乱的DNA酶转染的内皮细胞证实在细胞质PAI-1E0蛋白中增加约50%。相反,当用PAI-1DNA酶E2进行转染时,这种效应几乎完全消失。(C)此图显示当细胞在含有20%血清的培养基中培养6个小时,DNA酶几乎完全被降解,但是当细胞在含有2%血清的培养基中培养时,DNA酶在24小时内保持完整。(D)此图显示与打乱的DNA酶E0转染相比,用E1或E3DNA酶转染和在2%血清中培养12个小时的HUVEC在TGF-β依赖的PAI-1活性方面减少20%和28%(二者p<0.01)。
图4(A)-(C):(A)此图显示在注射E2两周后,梗塞的大鼠心脏中的PAI-1的表达发生了显著性改变,在梗塞周围区域中巨噬细胞的PAI-1表达水平减少了71%(p<0.01)。(B)和(C)显示注射E2和成血管细胞会增加CD31阳性毛细管数目。
图5(A)-(C):(A)此图显示E2对梗塞周围区域中的心肌细胞凋亡的抑制作用。(B)此图显示用E2处理和用E2和成血管细胞处理后,左心室的射血分数(LVEF)的恢复百分比。
图6:此图显示编码人源纤溶酶原激活物抑制剂-1蛋白的DNA序列(SEQ ID NO:5)。
图7:此图显示编码大鼠纤溶酶原激活物抑制剂-1蛋白的DNA序列(SEQ ID NO:15)。
图8:此图显示人源纤溶酶原激活物抑制剂-1蛋白的氨基酸序列(SEQID NO:6)。
图9:此图显示大鼠纤溶酶原激活物抑制剂-1蛋白的氨基酸序列(SEQID NO:16)。
图10:此图显示人源PAI-1mRNA上可能的催化性脱氧核糖核酸5’-AT-3’切割位点(以相应的DNA表示,SEQ ID NO:5)。粗体部分表明蛋白的编码区域,大写字母表明共有序列切割位点。
图11:此图显示人源PAI-1mRNA上可能的催化性脱氧核糖核酸的5’-AC-3’切割位点(以相应的DNA表示,SEQ ID NO:5)。粗体部分表明蛋白的编码区域,大写字母表明共有序列切割位点。
图12:此图显示人源PAI-1mRNA编码区域上的可能的催化性锤头型核糖核酸的切割位点(以相应的DNA表示,SEQ ID NO:17)。大写字母”T”表示切割位点。
图13:此图显示在气囊血管成形术损伤后,PAI-1催化性DNA酶(E2)阻止大鼠颈动脉新内膜的形成。
图14:此图显示在气囊血管成形术损伤后,PAI-1催化性DNA酶(E2)降低大鼠新内膜的形成。
图15:此图显示在气囊血管成形术损伤后,PAI-1催化性DNA酶(E2)阻止新内膜形成过程中平滑肌细胞的增殖。
图16:此图显示在气囊血管成形术损伤后,PAI-1催化性DNA酶(E2)阻止新内膜形成过程中平滑肌细胞的增殖。
详细描述
如此处所用,除非另外提及,下述每个术语具有如下的定义。
“给药”是指本领域普通技术人员已知的各种方法和递送系统的任何一种。例如,给药可通过移入、跨粘膜、经皮和皮下、口服、胃肠外、局部、通过心脏注射,通过吸入,通过导管例如逆行输尿管导管,通过动脉内注射,通过斯坦特印模来进行。
“催化”是指一种试剂具有催化剂的功能,即一种试剂可以增加化学反应速度,而其本身没有永久的结构上的改变。
“共有序列”是指一段长度至少是两个残基的核苷酸序列,其间发生催化性核酸切割。例如,对于催化性脱氧核糖核酸来说,共有序列是嘌呤:嘧啶,如“A:U”和“G:U”。
“纤溶酶原激活物抑制剂-1蛋白”是指当来源于人的时候,由鉴定为SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码且具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的蛋白质,以及当来源于大鼠的时候,由鉴定为SEQ ID NO:15的核苷酸序列编码且具有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的蛋白质,和其任一个的任何变体,无论是人工或天然存在。变体包括,不限于同源物,翻译后修饰物,突变体和多态型。
“纤溶酶原激活物的抑制剂-1mRNA”是指包含编码纤溶酶原激活物抑制剂-1蛋白的mRNA分子。纤溶酶原激活物抑制剂-1mRNA包括,不限于蛋白质编码序列以及5’和3’非蛋白质编码序列。
“杂交”是指基于序列互补一条单链的核酸分子与另一核酸分子的退火。核酸之间杂交的倾向性依赖于它们环境的温度和离子强度,核酸的长度和互补程度。这些参数对杂交的作用在本领域内是众所周知的(见38)。
“抑制”是指减慢,停止或其他形式的阻止。
“严谨条件”或是”严谨度”是指由核酸,盐和温度所定义的杂交条件。这些条件在本领域内是众所周知的,是可以改变的。包含或低或高严谨度的众多同等条件依赖于许多因素:如序列的长度和性质(DNA,RNA,碱基的组成),靶的性质(DNA,RNA,碱基组成),周围环境(在溶液里或被固定在固体基质上),盐或者其他组分的浓度(例如:甲酰胺,硫酸葡聚糖和/或聚乙二醇)和反应温度(其变化范围从比探针的解链温度大约低5℃到比解链温度大约低20℃至25℃)。一个或多个因素的变化会导致或高或低的不同于上述条件但具有等同效果的条件。就像本领域的技术人员所理解的那样,为了鉴定或检测相同的或相关的多核苷酸序列,可以改变杂交的严谨度。
“核酸”包括任何的核酸,包括,不限于DNA,RNA,寡核苷酸或者多聚核苷酸,以及它们的类似物或衍生物。形成核酸的核苷酸可以是核苷酸的类似物或衍生物。核酸可以结合非核苷酸。
“核苷酸”包括,不限于核苷酸和其类似物或衍生物。例如,核苷酸可包括A,C,G,T和U碱基,以及其衍生物。这些碱基的衍生物在本领域是众所周知的,并在PCR系统,试剂和耗材(Perkin Elmer Catalogue1996-1997,Roche Molecular System,Inc.,Branchburg,New Jersey,USA)中例证。
“药用载体”是指对于本领域技术人员已知各种载体的任何一种。
“特异性切割”是指当涉及一种配制好的催化性脱氧核糖核酸分子对于靶mRNA分子作用时,其意味着切割靶mRNA分子而不切割另一mRNA分子,所述另一mRNA分子缺乏互补于催化性脱氧核糖核酸分子的两个结合结构域中的任何一个序列。
“受试者”是指任何动物,如人,灵长类动物,鼠,大鼠,豚鼠或兔。
术语“DNA酶”,“DNAzyme”和“催化性脱氧核糖核酸”是同义词。
“载体”包括,不限于可用于将一段特定的核酸序列稳定地引入到一个生物的基因组中的核酸分子。
本发明提供一种特异切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性核酸,从5’到3’方向包含:
(a)定义至少4个核苷酸的第一结合结构域的连续核苷酸;
(b)定义与第一个结合结构域的3’末端相连,并能够在预定的磷酸二酯键处对编码PAI-1的mRNA进行切割的催化结构域的连续核苷酸;和
(c)定义与催化结构域的3’末端相连、至少4个核苷酸的第二个结合结构域的连续核苷酸。
其中每个结合结构域的核苷酸序列与PAI-1编码mRNA中的核苷酸序列互补,其中催化核酸与编码PAI-1的mRNA杂交和特异性切割。
在不同实施方案中,催化性脱氧核糖核酸分子能够在5’-A(或G)和U(T)-3’(或C)的连接处,即在嘌呤:嘧啶共有序列处切割编码PAI-1的mRNA。在另一个的实施方案中,催化性脱氧核糖核酸分子可以在mRNA内的任何一个5’-AU-3’;5’-AC-3’;5’-GU-3’;或5’-GC-3’位点连接处切割PAI-1mRNA。
为了靶向人源的编码PAI-1的mRNA,可基于mRNA序列中的共有序列切割位点5’-嘌呤:嘧啶-3’设计催化性核酸(Genbank登录号:M16006)(36)。特别优选根据RNA折叠软件如RNAdraw2.1的位于mRNA开环上的潜在切割位点作为靶目标(22)。以DNA为基础的催化性核酸可利用基于编码PAI-1的mRNA序列(如SEQ ID NO:5所示DNA)的两个序列特异性臂与催化核心(SEQ ID NO:1)相连的结构。(23)和(24)详细地显示了关于催化性DNA结构的另外的实例。为了验证催化性脱氧核糖核酸的效率,可以将商品化的鼠脑polyA-RNA(Ambion)作为体外切割反应的模板。
催化性核酸分子可以其中的每一个和任何一个共有序列处切割PAI-1编码mRNA。由于催化性核糖核酸和脱氧核糖核酸的共有序列是已知的,和编码PAI-1的mRNA序列是已知的,因此普通的技术人员可基于直接的说明容易构建针对编码PAI-1的mRNA共有序列的任一个的催化性核糖核酸或脱氧核糖核酸。在本发明的优选实施方案中,催化性脱氧核糖核酸包含10-23结构。DNA酶可以在264个人源PAI-1的mRNA的编码区域中的切割位点对PAI-1mRNA进行切割,其中包括51个5’-AT-3’(-AU-)位点,76个-AC-位点,53个-GT-(-GU-)位点和84个-GC-位点。图10和图11分别是编码PAI-1的mRNA的相应DNA上的AT和AC切割位点。
以AT位点为例,切割位点包括SEQ ID NO:5的核苷酸76、82、152、159、254、277、316、328、333、340、344、355、374、391、399、410、415、433、449、472、543、547、550、554、583、586、644、717、745、748、773、794、800、811、847、853、866、901、919、939、1027、1036、1120、1125、1168、1183、1198、1201、1204、1261和1273。
催化性核糖核酸的例子包括发夹和锤头型核酶。在本发明的优选实施方案中,催化性核糖核酸在锤头(25)或发夹基序中形成(26,27,28),但也可以在丁型肝炎病毒(29),I型内含子(35),RNaseP RNA(与一个RNA引导序列相联)(30,31)或者脉孢霉属VS RNA(32,33,34)基序中形成。锤头型核酶可以切割任何的mRNA5’-NUH-3’三联体,其中U是保守的,N是任何一个核苷酸,H可以是C,U,A,但不能是G。例如人源的编码PAI-1的mRNA的编码区域中有151个可被锤头型核酶切割的位点。参见图12。
用催化性核酸切割编码PAI-1的mRNA干扰编码PAI-1的mRNA一个或多个正常功能。被干扰的mRNA的功能包括所有生命功能,如将RNA移位到蛋白质翻译位点,从RNA翻译成蛋白质,剪接RNA以产生一个或多个mRNA,和RNA可能具有的催化活性。
在一个实施方案中,第一结合结构域的核苷酸包含至少一个脱氧核糖核苷酸。在另一个实施方案中,第二结合结构域的核苷酸包含至少一个脱氧核糖核苷酸。在一个实施方案中,第一结合结构域的核苷酸包含至少一个脱氧核糖核苷酸衍生物。在另一个实施方案中,第二结合结构域的核苷酸包含至少一个脱氧核糖核苷酸衍生物。在一个实施方案中,第一结合结构域的核苷酸包含至少一个核糖核苷酸。在另一个实施方案中,第二结合结构域的核苷酸包含至少一个核糖核苷酸。在一个实施方案中,第一结合结构域的核苷酸包含至少一个核糖核苷酸衍生物。在另一个实施方案中,第二结合结构域的核苷酸包含至少一个核糖核苷酸衍生物。在一个实施方案中,第一结合结构域中的核苷酸包含至少一个修饰碱基。在另一个实施方案中,第二结合结构域的核苷酸包含至少一个修饰碱基。
核苷酸可以包括其他碱基,如可以使用肌苷,脱氧肌苷和次黄嘌呤。此外,也可以使用异嘌呤(isoteric purine)2’脱氧呋喃糖苷类似物,2’脱氧烟云杯伞素或者2’脱氧黄苷,或者其他嘌呤或嘧啶的类似物。通过对这些碱基和碱基类似物的仔细筛选,可以对寡核苷酸的杂交性质进行精细调整。例如可以使用肌苷减少杂交特异性,而可以使用二氨基嘌呤增加杂交特异性。
腺嘌呤和鸟嘌呤可以在N3、N7、N9、C2、C4、C5、C6或C8位置进行修饰,并且仍然可以保持它们形成氢键的能力。胞嘧啶,胸腺嘧啶和尿嘧啶可以在N1、C2、C4、C5或C6位置进行修饰,并且仍然可以保持它们形成氢键的能力。与天然存在的碱基相比,有些碱基类似物具有不同的氢键性质。例如:2-氨基-2’dA与T形成3个氢键(3),而不是通常的2个氢键(2)。已显示增加双螺旋稳定性的碱基类似物的例子包括,但不限于:5-氟-2’-dU,5-溴-2’-dU,5-甲基-2’-dC,5-丙炔基-2’-dC,5-丙炔基-2’-dU,2-氨基-2’-dA,7-脱氮鸟苷,7-脱氮腺苷和N2-咪唑丙基(imidazoylpropyl)-2’-dG。
可以通过修饰和/或取代糖部分来生成核苷酸类似物。核苷酸的糖部分也可以通过增加一个或多个取代物进行修饰。例如,一个或多个糖部分可以包含下面一个或多个取代物:氨基、烷氨基、芳烷基、杂烷基、杂环烷基、氨基烷氨基、O、H、烷基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCN、O-、烷基、S-烷基、SOMe、SO2Me、ONO2、NH-烷基、OCH2CH=CH2、OCH2CCH、OCCHO、烯丙基、O-烯丙基、NO2、N3和NH2。例如,糖的2’位置可以被修饰以包含下列基团之一:H、OH、OCN、O-烷基、F、CN、CF3、烯丙基、O-烯丙基、OCF3、S-烷基、SOMe、SO2Me、ONO2、NO2、N3、NH2、NH-烷基、或者OCH=CH2、OCCH,其中,烷基可以是直链的、支链的、饱和的或不饱和的。此外,核苷酸可以具有一个或多个它的被修饰和/或取代以成为核糖或己糖(即葡萄糖,半乳糖)糖,或者具有一个或多个异头糖。核苷酸可以具有一个或多个L-糖。
指导制备这些修饰碱基/核苷/核苷酸的代表性美国专利包括,但不限于美国专利号6,248,878和6,251,666,其通过参考结合于此。
可以修饰糖以含有一个或多个连接其他化学物如荧光标记的连接物。在一个实施方案中,糖与一个或多个氨基烷氧基连接物相连。在另一个实施方案中,糖含有一个或多个烷氨基连接物。氨基烷氧基和烷氨基连接物可以通过其氨基基团与生物素,胆酸,荧光素或者其他化学部分连接。
核苷酸类似物或衍生物可以连接侧链基团。侧链基团可以用于不同的目的,包括:但不限于增加细胞对分子的吸收能力,加强靶核酸的降解和提高杂交的亲和性。侧链基团可以连接到催化性核酸的结合结构域。侧链基团的实例包括但不限于:吖啶衍生物(即2-甲氧基-6-氯-9-氨基吖啶);交联物如补骨脂素衍生物,叠氮苯甲酰甲基,二氨基吖啶和叠氮二氨基吖啶;人工核酸内切酶;金属复合物如EDTA-Fe(II);邻菲咯啉-Cu(I)和卟啉-Fe(II);烷基化部分;核酸酶如氨基-1-己醇葡萄球菌核酸酶和碱性磷酸酶;末端转移酶;抗体酶;胆甾醇部分;亲脂性载体;肽偶联物;长链醇;磷酸酯;氨基;巯基基团;放射性标记物,非放射性标记物如染料;和聚赖氨酸或其他多胺。在一个实施例中,核酸包含一个与碳水化合物,硫酸化碳水化合物或糖相偶联的寡核苷酸。偶联可以被认为是通过把它们共价连接到选择杂交的寡核苷酸而将特异性引入到其他非特异性DNA结合分子的一种手段。催化性核酸的结合结构域可具有一个或多个它们的被修饰或被取代为核糖,葡萄糖,蔗糖或半乳糖,或者任何其他糖的糖。另一方面,它们可以有一个或多个在其2’位置上即2’烯丙基或2’-氧-烯丙基被取代或者被修饰的糖。一个2’-氧-烯丙基糖的实例是2’-氧-甲基核糖核苷酸。此外,结合结构域的核苷酸可具有一个或多个它们的被取代或修饰以形成á异头物糖的糖。
催化性核酸结合结构域可以包括非核苷酸置换。非核苷酸置换包括无碱基(abasic)核苷酸,多醚,多胺,聚酰胺,肽,碳水化合物,脂或多碳氢化合物。这里的术语“无碱基”或“无碱基核苷酸”包括缺少碱基或在1’位置上有其他的化学基团取代了碱基的糖部分。
在一个实施方案中,第一个结合结构域的核苷酸含有至少一个修饰的核苷间键。在另一个实施方案中,第二结合结构域的核苷酸含有至少一个修饰的核苷间键。在另外的实施方案中,修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。核酸可以含有修饰的化学键。例如在催化性核酸的核苷酸之间的化学键可以包含硫代磷酸酯键。核酸可以包括核苷酸,其具有可通过用类似物如-NH,-CH2或-S取代一个或两个桥氧原子被修饰的部分。也可以使用其他本领域所知的氧类似物。硫代磷酸酯键可以是在空间上有规则的或随机的。
在一个实施方案中,编码PAI-1的mRNA编码人源PAI-1。在另外的实施方案中,人源编码PAI-1的mRNA具有如SEQ ID NO:5所示的序列。
本发明提供一种包含配制好的催化性核酸和药用载体的药用组合物。关于它们最普遍相关的递送系统,下面通过举例的方式列出了药用载体。
经皮肤递送系统包括,例如水性和非水性凝胶、乳膏、多重乳剂、微乳、脂质体、油膏、水性或非水性溶液、洗剂、气雾剂、烃类基质和粉剂,和可含有赋形剂如:增溶剂、渗入增强剂(如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸),和亲水聚合物(如聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮),在一个实施方案中,药用载体是脂质体或是透皮增强剂。用于本发明中的脂质体的例子包括:(1)Cellfectin,由阳离子脂质N,NI,NII,NIII-四甲基-N,NI,NII,NIII-四棕榈基-精胺和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1∶1.5(M/M)脂质体制剂(GIBCO BRL);(2)Cytofectin GSV,阳离子脂质和DOPE的2∶1(M/M)脂质体制剂(Glen Research);(3)DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰基氧基)-N,N,N-三甲基-铵甲基硫酸酯](Boehringer Manheim);和(4)Lipofectamine,聚阳离子脂质DOSPA和中性脂质DOPE的3∶1(M/M)脂质体制剂(GIBCO BRL)。
透粘膜递送系统包括贴剂,片剂,栓剂,阴道栓剂,凝胶,乳膏,和可以含有赋形剂如:增溶剂,增强剂(如丙二醇,胆汁盐和氨基酸),和其他载体(如聚乙二醇,脂肪酸酯及衍生物和亲水性聚合物如羟基丙基甲基纤维素和透明质酸)。
可注射的药物递送系统包括溶液,混悬液,凝胶,微球体和聚合可注射剂,和可含有赋形剂如:改变溶解性的试剂(如乙醇,丙二醇和蔗糖)和聚合物(如聚辛内酯(polycaprylactones)和PLGA’s)。可植入系统包括棍和盘,可含有赋形剂如PLGA和聚辛内酯。
口服运送系统包括片剂和胶囊。这些可以含有赋形剂如粘合剂(如羟基丙基甲基纤维素,聚乙烯吡咯烷酮及其他纤维素物质和淀粉),稀释剂(如乳糖和其他糖,淀粉,磷酸二钙和纤维素物质),崩解剂(如淀粉聚合物和纤维素物质)和润滑剂(如硬脂酸盐和滑石)。
本发明提供一种特异性抑制PAI-1在另外表达PAI-1的细胞内表达的方法,,其包括将细胞与配制好的催化性核酸相接触,从而特异性地抑制PAI-1在细胞内的表达。
本发明提供一种特异性抑制受试者细胞内PAI-1表达的方法,其包括对受试者给药在受试者细胞内特异性抑制PAI-1表达的有效量的配制好的催化性核酸。
本发明提供一种特异性抑制受试者细胞内PAI-1表达的方法,其包括对受试者给药在受试者细胞内特异性抑制PAI-1表达的有效量的配制好的的药物组合物。
本发明提供一种治疗受试者的心血管疾病的方法,所述疾病涉及受试者中的心肌细胞凋亡,所述方法包括对受试者给药抑制受试者中的心肌细胞凋亡的有效量的配制好的药物组合物从而治疗心血管疾病。
在一个实施方案中,心血管疾病是充血性心力衰竭。在另一个实施方案中,心血管疾病是心肌梗死。在另一个实施方案中,心血管疾病是绞痛。在另一个实施方案中,心血管疾病是心肌缺血。在另一个实施方案中,心血管疾病是指心肌病。
本发明提供一种治疗受试者心血管疾病的方法,所述心血管疾病涉及受试者中新内膜形成,所述方法包括对受试者给药抑制受试者中新内膜形成的有效量的配制好的药物组合物以治疗受试者中的心血管疾病。心血管疾病可以是医原性的,心血管疾病可以是再狭窄。在一个实施方案中,新内膜的形成来自于对受试者所做的气囊血管成形术。在一个实施方案中,新生内膜的形成来自于对受试者所做的斯坦特印模移植。
本发明提供一种治疗受试者纤维化疾病的方法,所述纤维化疾病涉及纤维发生,所述方法包括对受试者给药抑制受试者中纤维发生的有效量的配制好的药物组合物以治疗纤维化疾病。在不同的实施方案中,纤维化疾病是肾病,肝病,肺病,皮肤病或眼病。在另外的实施方案中,皮肤纤维化疾病是硬皮病或银屑病(psorasis)。
“有效量”是指至少足以治疗,减轻,回复或者另外抑制给定疾病状态的剂量。在纤维化疾病中,有效剂量是指足以减轻,回复或者另外抑制纤维发生的剂量。在心血管疾病中,有效剂量是指足以减轻,回复或者另外抑制心肌细胞凋亡的剂量。在新内膜形成中,有效剂量是指足以减轻,回复或者另外抑制新内膜形成的剂量。
基于动物数据使用常规的计算方法可以确定配制好的药物组合物的有效量。在一个实施方案中,有效量包含每千克体重约为10ng到约100μg的配制好的核酸分子。在另一个实施方案中,有效量是每千克体重约为100ng到约10μg的核酸分子。在另外的实施方案中,有效量包含每千克体重约为1μg到约5μg的核酸分子。在另一个实施方案中,有效量包含每千克体重约为10μg到约100μg的核酸分子。在优选实施方案中,有效量包含每千克体重约为100μg到500μg的核酸分子。在另一个实施方案中,有效量包含每千克体重约为500μg到1000μg的核酸分子。在另一个实施方案中,有效量包含每千克体重约为1mg到2mg的核酸分子。
本发明的化合物可以被混合,包埋,结合或者另外与其他分子,分子结构,或是化合物混合物联合使用,例如为了有助于摄入,分布和/或吸收,采取脂质体,受体靶向分子,口服的,直肠的,局部的或者其他制剂。指导制备这种有助于摄入,分布和/或吸收的制剂的具有代表性的美国专利包括,但不限于:美国专利号5,108,921;5,354,844;5,416,016;5,459,127;5,521,291;5,543,158;5,547,932;5,583,020;5,591,721;4,426,330;4,534,899;5,013,556;5,108,921;5,213,804;5,227,170;5,264,221;5,356,633;5,395,619;5,416,016;5,417,978;5,462,854;5,469,854;5,512,295;5,527,528;5,534,259;5,543,152;5,556,948;5,580,575和5,595,756,它们每个通过参考结合于此。
优选对患有心血管疾病或纤维化疾病的哺乳动物给药天然形式或悬浮在载体介质中的催化性核酸,根据有效治疗哺乳动物以减小心血管疾病或纤维化疾病的有害作用的治疗时间表和剂量来使用。靶向编码PAI-1的mRNA的核酸序列的不同部位的一个或多个不同的催化性核酸,或反义寡核苷酸,或其类似物可以以单一剂量或不同剂量和以依赖于期望治疗的不同剂量和时间一起使用。可以以使核酸先进入血液再进入细胞的方式或备选地,以一种方式,通过电穿孔、或直接注射到心脏中、或者通过导管引入到肾组织中以便将催化性核酸直接导入细胞或细胞群如心肌细胞来对哺乳动物给药催化性核酸。对于这种治疗方案确定最佳剂量和治疗时间表是在本领域技术人员的技术范围之内。
对需要抑制PAI-1的表达(或者抑制纤维生成)的人患者每天或每隔一天给药有效量的催化性核酸1-8次或更多次。剂量依赖于所要治疗的心血管疾病或纤维化疾病症状的严重性和反应性,其治疗时间可以从几天到几个月,或者一直到实现治愈或者症状得以减轻。给药的实际有效量或剂量要考虑患者的大小和体重,治疗的性质是否是预防,治疗的实质,患者的年龄、体重、健康状况和性别,给药途径和其他因素。
药物组合物可以含有合适的促进将催化性核酸加工成可药用的制剂的赋形剂和辅助剂。优选地,制剂,特别是可通过口服给药的那些和可用于优先给药类型的那些,如片剂、糖衣丸和胶囊,和可直肠给药的制剂,如栓剂,以及适合胃肠外或口服给药的溶液,和可口含(bucally)或舌下给药的组合物,其包括包埋化合物,含有约0.1重量%-约99重量%的活性成分,和赋形剂。
以本领域众所周知的方式制备本发明的药物制剂。例如,可以采用常规的混合,粒化,制备糖衣丸,溶解或冻干方法来制备药物制剂。所采取的方法最终依赖于所用活性成分的物理性质。
特别地,合适的赋形剂是填料,如糖,包括乳糖和蔗糖、甘露醇或山梨醇,纤维素制剂和/或磷酸钙、如磷酸三钙或磷酸氢钙以及粘合剂如淀粉、糊剂,使用例如包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果必要,可以添加崩解剂,如上述淀粉以及羧甲基淀粉、交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或褐藻酸或其盐,如褐藻酸钠。辅助成分是流动调节试剂和润滑剂,如硅土、滑石、硬脂酸或其盐、如硬脂酸镁或硬脂酸钙、和/或聚乙二醇。如果需要,可对糖丸的核心提供合适的包衣以抵抗胃液。为了这一目的,可以使用浓缩的糖溶液,其可选择性的含有阿拉伯树胶,滑石,聚乙烯吡咯烷酮,聚乙二醇,和/或二氧化钛,漆溶液,及合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了产生对胃液抗性的包衣,使用合适的纤维素制剂,如乙酰基纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯的溶液。例如,为了鉴别或表征不同的活性化合物剂量组合,可向糖衣丸包衣的片剂中可以加入染料和颜料。其他用于口服的药物制剂包括由明胶制备的适合插入式(push-fit)胶囊,以及由明胶和增塑剂,如甘油或山梨醇所制备的软密封胶囊。适合插入式胶囊可含有颗粒形式的活性化合物,其可以和填料如乳糖,粘合剂如淀粉,和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁,和选择性稳定剂混合。在软胶囊中,活性化合物优选地溶解于或悬浮于合适的液体中,如脂肪油,液体石蜡,或者液体聚乙二醇。此外,可加入稳定剂。
例如,可用于直肠的可能的药物制剂包括由活性化合物和栓剂基质的组合组成的栓剂。例如,合适的栓剂基质是天然的或合成的甘油三酯,烷述烃,聚乙二醇或高级烷醇。此外,也可以使用由活性化合物和基质组合组成的明胶直肠胶囊。可能的基质材料包括,例如液态甘油三酯,聚乙二醇或烷属烃。
合适的胃肠外给药制剂包括水溶性或水分散形式的活性化合物的水溶液。此外,也可以给药活性化合物的混悬液如合适的油性注射混悬液。合适的亲水性溶剂或载体包括脂肪油,如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射混悬液可以含有增加混悬液粘度的物质,包括如羧甲基纤维素钠,山梨醇和/或葡聚糖。选择性地,混悬液也可包括稳定剂。
另外,本发明的催化性核酸也可以包埋在脂质体或免疫脂质体中给药,其是药物组合物,其中活性成分以分散或是各种形式包含在由与脂性层粘附的水性同心层组成的微粒中。在将寡核苷酸靶向肝细胞时,脂质体是尤其活跃的。根据其溶解性,活性成分可以存在在水层和脂层中,或者处于所谓脂质体混悬液(liposomic suspension)中。疏水层一般但不是专门地含有磷脂,如卵磷脂和鞘磷脂,固醇类,如胆固醇,或多或少的离子型表面活性剂,如三十二烷基磷酸酯,硬脂胺或磷脂酸,和/或其他疏水性质的物质。脂质体的直径一般在约15nm到约5μm之间。
本发明还提供一种包含一段在高度严谨的条件下与编码PAI-1的mRNA杂交的连续核苷酸的寡核苷酸,连续核苷酸序列长度在8-40个核苷酸之间。在不同的实施方案中,寡核苷酸长度在40-80个核苷酸之间。
在优选实施方案中,反义寡核苷酸与编码PAI-1的mRNA的杂交会对编码PAI-1的mRNA的一个或多个功能产生干扰。被干扰的mRNA的功能包括所有生命的功能,如将RNA移位到蛋白质翻译位点,从RNA翻译成蛋白质,RNA的剪接以产生一个或多个mRNA,及RNA所具有的催化活性。例如在给定的严谨条件下,人源PAI-1的反义寡核苷酸可以特异性地与人源PAI-1mRNA分子上的靶目标进行杂交,从而抑制其翻译成PAI-1蛋白。
被干扰的mRNA的功能包括所有生命的功能,如将RNA移位到蛋白质翻译位点,从RNA翻译成蛋白质,RNA的剪接以产生一个或多个mRNA,及RNA所具有的催化活性。在给定的严谨条件下,PAI-1反义寡核苷酸特异性地与编码PAI-1的mRNA分子上的靶目标进行杂交,从而抑制其翻译成PAI-1。
与本发明相一致,本领域的普通技术人员会理解信使RNA不但包括通过三联体遗传密码子编码蛋白质的信息,还包括相关的核苷酸,其构成了被本领域的人称之为5’非翻译区,3’非翻译区,5’帽子区域和内含子/外显子连接区的核苷酸的区域。因此,可以根据本发明制备催化核酸或反义寡核苷酸,其全部或部分地靶向这些相关核苷酸及信息核苷酸上。例如,反义寡核苷酸可以因此特异性地与转录起始位点区域,翻译起始密码子区域,5’帽子区域和内含子/外显子连接区,编码区,翻译中止密码子区域或5’非翻译区或3’非翻译区内的序列进行杂交。相似地,催化性核酸可以特异性地切割转录起始位点区域,翻译起始密码子区域,5’帽子区域,内含子/外显子连接区,编码区,翻译中止密码子区域或5’非翻译区和3’非翻译区内的序列。如本领域所知,典型的翻译起始密码子是5’-AUG(在转录的mRNA分子上;在相应的DNA分子上是5’-ATG)。少数基因的翻译起始密码子的RNA序列是5’-GUG,5’-UUG或5’-CUG和5’-AUA,5’-ACG,5’-CUG,已经显示在体内有作用。因此,虽然在真核细胞中每个翻译事件中的起始氨基酸典型地都是蛋氨酸,但是术语”翻译起始密码子”可包括许多密码子序列。本领域还已知的是真核基因可以有两个或多个备选的翻译起始密码子,在一个特定的细胞类型或组织中,或在特殊的条件下,任何一个起始密码子都可能优先被用于翻译起始。在本发明的上下文中,“翻译起始密码子”是指在体内启动转录自编码PAI-1的基因的mRNA的翻译的一个或多个密码子,而不管该密码子的序列。本领域还已知的是一个基因的翻译中止密码子可具有以下三个序列之一,即5’-UAA,5’-UAG和5’-UGA(相应的DNA序列分别是5’-TAA,5’-TAG和5’-TGA)。术语”翻译起始密码子区”是指从翻译起始密码子以任一的方向(即5’或3’)包含约25-约50连续核苷酸的部分这种mRNA或基因。该区域是优选的靶向区域。同样,术语”翻译终止密码子区”是指从翻译终止密码子以任一的方向(即5’或3’)包含约25-约50连续核苷酸的部分这种mRNA或基因。该区域也是一个优选的靶向区域。开放阅读框或”编码区”在本领域中已知是指翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域,它也是可被有效靶向的区域。其他优选的靶向区域包括5’非翻译区(5’UTR),在本领域中已知是指从翻译起始密码子沿5’方向的mRNA部分,因此包括5’帽子位点和mRNA的翻译起始密码子之间的核苷酸,或者基因上的相应核苷酸,3’非翻译区(3’UTR)在本领域中已知是指从翻译终止密码子沿3’方向的mRNA部分,因此包括翻译终止密码子和mRNA3’末端之间的核苷酸,或者基因上的相应核苷酸。mRNA剪接位点也可能是优选的靶向区域,并且在疾病中包含异常剪接或在疾病中包含特定mRNA剪接产物过量表达的情形中,是特别有用的。由于重排或缺失造成的异常融合连接区也可以作为优选的靶目标。
一旦已经鉴定了一个或多个靶位点,就可以选择与靶目标充分互补的反义寡核苷酸,即充分杂交和具有足够的特异性,以提供对分子功能的期望的破坏。在本发明的上下文中,“杂交”是指通常在相对的核酸链或者一个核酸链的两个区域的互补碱基之间的氢键合,也已知为沃森-克里克碱基配对。鸟嘌呤和胞嘧啶是互补碱基的实例,已知在它们之间形成三个氢键。腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的碱基的实例,在它们之间形成两个氢键。术语“特异性杂交”和“互补”用来表明足够程度的互补性,从而使DNA或RNA靶分子和反义寡核苷酸之间形成稳定的特异性的结合。同样的,一旦已经鉴定了PAI-1的mRNA分子上的切割靶位点,如对于DNA酶来说的任何一个嘌呤:嘧啶共有序列,就能够合成出催化性核酸。基于多态性或突变的PAI-1的mRNA序列,可如上所述同样地制备目的在于破坏PAI-1的多态性和突变体的催化性核酸和反义寡核苷酸。
对于选择哪个特定的靶向特定编码蛋白质的mRNA的反义寡核苷酸序列将在给定的靶mRNA序列内形成最稳定的DNA:RNA杂合体的方法在本领域是已知的,并且在美国专利专利号6,183,966中举例说明,其通过参考结合于此。
在一个实施方案中,在配制好的寡核苷酸中至少一个核苷酸之间的键含有一个硫代磷酸酯键。与标准的脱氧核糖核酸相比较,以硫代磷酸酯骨架合成的反义寡核苷酸分子已表明对于核酸外切酶损伤具有特别的抗性,因此优选地使用它们。可在Applied Biosystems(Foster City,CA)model 380B DNA合成仪上,使用标准的方法合成PAI-1mRNA的硫代磷酸酯反义寡核苷酸。例如,可以使用二硫化四乙基秋兰姆/乙腈进行硫化。从受控多孔玻璃支持物上切割下来后,可在60℃氨水中保温8小时对寡脱氧核苷酸碱解(base deblock),然后用反相HPLC进行纯化[0.1M三乙基铵碳酸氢盐/乙腈;PRP-1支持物]。寡聚体可以在3%醋酸中去三苯甲基化,用2%高氯酸锂/丙酮沉淀,溶解在无菌水中,然后作为钠盐从1M NaCl/乙醇重沉淀。通过紫外光度计测定全长物质的浓度。本领域已知的用于这种合成的任何其他方法可另外或备选使用。众所周知的是用相似的技术制备寡核苷酸诸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
优选的修饰的寡核苷酸骨架包括,例如硫代磷酸酯,手性硫代磷酸酯,二硫代磷酸酯,磷酸三酯,氨基烷基磷酸三酯,甲基和其他烷基磷酸酯,包括3’-亚烷基-磷酸酯,5’-亚烷基-磷酸酯和手性磷酸酯,次膦酸酯(phosphinates),氨基磷酸酯,包括3’-氨基-氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯,硫羰氨基磷酸酯,硫羰烷基磷酸酯,硫羰烷基磷酸三酯,硒基磷酸酯和硼烷基-磷酸酯(borano-phosphates),它们都有正常的3’-5’键,这些的2’-5’连接类似物,和具有反向极性的那些,其中一个或多个核苷酸之间的键合为3’-3’,5’-5’或2’-2’键。优选的具有反向极性的寡核苷酸在多数的3’核苷酸间的连接处含有一个3’-3’连接,即是一个倒转的核苷残基,它可以是无碱基的(核碱基丢失或其被羟基取代)。也包括各种盐,混合盐和自由酸的形式。指导制备上述含磷连接的代表性的美国专利包括,但不限于美国专利号3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5,399,676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361;5,194,599;5,565,555;5,527,899;5,721,218;5,672,697和5,625,050,其每一个通过参考结合于此。
在一个实施方案中,配制好的寡核苷酸的核苷酸含有至少一个脱氧核糖核苷酸。在另一个实施方案中,核苷酸含有至少一个核糖核苷酸。这种脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸可以如上所述进行修饰或衍生。
在一个实施方案中,编码PAI-1的mRNA编码人源PAI-1。在另外的实施方案中,人源编码PAI-1的mRNA包含连续核苷酸,序列如SEQ IDNO:5所示。
本发明进一步提供治疗受试者的方法,其包括对受试者给药抑制PAI-1在受试者体内的表达的有效量的配制好的寡核苷酸,以由此治疗受试者。
本发明进一步提供一种治疗受试者心血管疾病的方法,所述心血管疾病涉及受试者中的心肌细胞凋亡,所述方法包括对受试者给药抑制受试者的心肌细胞的凋亡的有效量的配制好的寡核苷酸,以由此治疗心血管疾病。
本发明进一步提供一种治疗受试者纤维化疾病的方法,所述纤维化疾病涉及受试者纤维发生,所述方法包括对受试者给药抑制受试者的纤维发生的有效量的配制好的寡核苷酸,以由此治疗纤维化疾病。
本发明进一步提供一种治疗受试者心血管疾病的方法,所述心血管疾病涉及受试者新内膜形成,所述方法包括对受试者给药抑制受试者的新内膜形成的有效量的配制好的药物组合物,以由此治疗受试者的心血管疾病。心血管疾病可以是医原性的,心血管疾病可以是再狭窄。在一个实施方案中,新内膜形成来自于对受试者所做的气囊血管成形术。在一个实施方案中,新内膜形成来自于对受试者所做的斯坦特印模移植。
反义寡核苷酸可通过静脉内注射,静脉滴注,皮下、腹膜或肌内注射,口服或直肠给药。已研究过特定反义寡核苷酸的人的药代动力学。参见(37),其全部内容结合于此作为参考。
本发明进一步提供一种治疗受试者血管疾病的方法,其中所述疾病通过减少凝血酶或血纤蛋白的产生来治疗,所述方法包括给药有效抑制PAI-1表达的PAI-1表达抑制剂,从而通过减少凝血酶或血纤蛋白的产生以由此治疗受试者血管疾病。
本发明进一步提供一种治疗受试者血管疾病的方法,其中血管疾病通过抑制PAI-1表达来治疗,所述方法包括对受试者给药有效抑制受试者中PAI-1表达的PAI-1表达抑制剂,由此治疗受试者的血管疾病。
本发明进一步提供一种治疗受试者肝病的方法,其中肝病通过抑制PAI-1表达来治疗,所述方法包括对受试者给药有效抑制受试者中PAI-1表达的PAI-1表达抑制剂,以由此治疗受试者的肝病。在一个实施方案中,疾病是急性爆发型肝衰竭。在一个实施方案中,抑制PAI-1表达可以增强如来自毒性休克或病毒肝炎损伤后的肝细胞的再生。
本发明提供即用的方法,其中PAI-1表达抑制剂是反义寡核苷酸,抗体,催化性核酸,小分子,或RNAi。本发明提供即用的方法,其中疾病是局部缺血性疾病。在不同实施方案中,疾病是外周动脉疾病,或脑血管疾病。
本发明进一步提供一种诱导受试者心脏组织中新血管生成的方法,包括对受试者给药抑制PAI-1在心脏中表达的有效量的PAI-1表达抑制剂,以诱导受试者心脏组织中新血管的生成。在一个实施方案中,受试者是心血管疾病患者。在另外的实施方案中,疾病是心肌梗塞,绞痛,充血性心力衰竭,外周动脉疾病或心肌缺氧。
本发明进一步提供一种诱导受试者组织中新血管生成的方法,包括对受试者给药抑制PAI-1在受试者组织中表达的有效量的PAI-1表达抑制剂,以诱导受试者组织中新血管的生成。在一个实施方案中,受试者是局部缺血性疾病患者。在另外的实施方案中,疾病是肾局部缺血性疾病,脑血管疾病,中风,或肝病。
本发明进一步提供一种包括PAI-1表达抑制剂和药用载体的药物组合物。在不同的实施方案中,PAI-1表达抑制剂是催化性核酸,寡核苷酸,单克隆抗体,小分子,或RNAi(RNA干扰在美国专利号6,506,599中有详细叙述,其中的内容结合于此作为参考)。
本发明进一步提供一种治疗受试者心血管疾病的方法,其中所述疾病通过提高受试者的心肌功能来治疗,所述方法包括对受试者给药抑制提高受试者心肌功能的有效量的配制好的药物组合物,从而治疗受试者的心血管疾病。在一个实施方案中,即用的方法另外包括对受试者给药药物组合物之前,同时或之后对受试者给药一种试剂。在另外的实施方案中,试剂是内皮祖细胞,骨髓细胞,心肌祖细胞,胚胎干细胞或者脐血干细胞(cord blood stem cell)。在其他实施方案中,试剂是G-CSF、GM-CSF、SDF-1、IL-8、SCF、VEGF、FGF、或者GRO家族的趋化因子。。
本发明进一步提供一种抑制受试者心脏中平滑肌细胞增殖的方法,包括对受试者给药抑制受试者心脏中平滑肌细胞增殖的有效量的配制好的药物组合物。
本发明进一步提供一种抑制受试者心脏中凝血酶和血纤蛋白沉积的方法,包括对受试者给药抑制受试者心脏中凝血酶和血纤蛋白沉积的有效量的配制好的药物组合物。
本发明进一步提供即用的方法,另外包括对受试者给药内皮祖细胞,骨髓细胞,心肌祖细胞,胚胎干细胞或者脐血干细胞。本发明进一步提供即用的方法,其中可以通过斯坦特印模,支架,静脉,口服,通过吸入,皮下,通过直接肌肉注射或者通过基因载体方式对给药药物组合物。
本发明进一步提供一种抑制受试者组织中凝血酶和血纤蛋白沉积的方法,包括对受试者给药抑制受试者组织中凝血酶和血纤蛋白沉积的有效量的配制好的药物组合物。
本发明进一步提供即用的方法,其中受试者是深度静脉血栓,肺栓塞,肾病,冠状梗塞,转移,炎症,弥散性血管内凝结,动脉硬化症,类风湿性关节炎,肾小球性肾炎,全身性红斑狼疮,自免疫神经病,肉芽肿病或同种异体移植排斥患者。
本发明进一步提供一种治疗受试者败血性休克的方法,包括对受试者给药治疗受试者败血性休克的有效量的配制好的药物组合物。
本发明另外提供治疗血栓形成性疾病、血栓形成性紊乱或止血性紊乱患者的方法,其中所述疾病或紊乱与PAI-1表达升高有关,所述方法包括对受试者给药降低受试者PAI-1表达的有效量的配制好的药物组合物,由此治疗所述疾病。
本发明另外提供即用方法,其中所述疾病或紊乱是深度静脉血栓,肺栓塞,肾病,冠状梗塞,转移,炎症,弥散性血管内凝结,动脉硬化症,类风湿性关节炎,肾小球性肾炎,全身性红斑狼疮,自免疫神经病,肉芽肿病或同种异体移植排斥深度。在一个实施方案中,即用的方法进一步包括对受试者给药溶解血栓剂或溶解血栓剂的激活剂。在不同的实施方案中,溶解血栓剂的激活剂是组织纤溶酶原激活物,尿激酶,链激酶或尿激酶原。
在即用的方法的实施方案中,方法进一步包括对受试者给药抗凝剂。在不同的实施方案中,抗凝剂是肝素,华法林,乙酰水杨酸,茴茚二酮,苯茚二酮或羟基香豆素。
本发明进一步提供一种制备配制好的药物组合物的方法,包括将治疗有效量的PAI-1表达抑制剂与药用载体混合在一起。
本发明提供所有针对受试者是哺乳动物的即用的方法,在优选实施方案中,哺乳动物是人。
在本发明中,对于每个配制好的核酸分子,寡核苷酸,PAI-1表达抑制剂,小分子,药物组合物和方法来说,预见了受试者,药用载体,剂量,细胞类型,给药方式和靶核酸序列的各种实施方案。
通过参考以下的试验细节可以更好地理解本发明,但是那些本领域的技术人员很容易懂得这些特定的试验细节仅仅举例说明本发明,其后的权利要求更全面地描述了本发明。
实验结果
靶向人源和大鼠PAI-1mRNA的DNA酶的构建
我们设计了三个DNA酶,以特异性地靶向在人源和大鼠PAI-1信使RNA的翻译起始位点AUG上或附近处的嘧啶:嘌呤结合处,该区域在种间是保守的,具有相对较低的自由能(17)。如图1a所示,三个DNA酶分别命名为E1(SEQ ID NO:2),E2(SEQ ID NO:4)和E3(SEQ ID NO:3),含有相同的15个核苷酸的催化结构域(SEQ ID NO:1),其侧接两个8个核苷酸(E1,E2)或9个核苷酸(E3)的臂,这些臂与人源的(E1,E3)或者大鼠的(E2)PAI-1mRNA互补。为了产生对照DNA酶E0(SEQID NO:7),在不改变催化结构域的前提下,E2的两个侧臂中的核苷酸序列被打乱(图1a)。每个分子的3’末端都有一个对3’到5’核酸外切酶消化有抗性的具有反向的3’-3’连接的胸腺嘧啶的帽子结构。
E1和E3DNA酶对人源PAI-1mRNA的特异性切割。
如图1b所示,合成自人源PAI-1mRNA且在5’末端标记32P的21个碱基的寡核苷酸S1(SEQ ID NO:8)当与E1在10∶1底物:酶过量培养时,在2分钟内被切割,最大切割存在2小时。10个核苷酸的切割产物与在5’末端标记32P的片段大小是一致。如图1c所示,E1也能够以时间和浓度依赖的方式切割通过体外转录制备的更大的用32P标记的人源PAI-1mRNA片段。520个核苷酸的转录物在2-4小时被最大程度地切割,并得到所期望的320和200个核苷酸。使用E3也得到了同样的剂量依赖性结果,当使用最高浓度20μM时,发生对人源PAI-1mRNA转录物的最大切割。图1d显示DNA酶切割的序列特异性性质,其中对照DNA酶E0含有与E1和E3同样的催化结构域,但侧臂的序列被打乱,结果使得E0不能够对人源PAI-1mRNA转录物进行切割。当在将转录物与E1,而不是E0一起温育前,将转录物在72℃预热10分钟会提高切割。
E2DNA酶对大鼠PAI-1mRNA的特异性切割。
图2可见DNA酶反应特异性的进一步证据。图2a显示DNA酶E2能够以剂量和时间依赖的方式对合成自大鼠PAI-1mRNA序列的23个碱基的寡核苷酸S2进行切割。图2b显示E2也能够以剂量依赖的方式对大鼠PAI-1mRNA转录物切割2-4小时,以得到156个核苷酸的切割产物。相反,被打乱的对照DNA酶E0和E3都不能对大鼠PAI-1mRNA转录产物进行切割。图2c,因为大鼠PAI-1mRNA转录产物(SEQ ID NO:10)与可以被E3切割的人源PAI-1mRNA转录产物(SEQ ID NO:9)之间只有一个核苷酸的差异,这些结果表明这些DNA酶对靶目标具有精细的特异性。
DNA酶抑止内源PAI-1mRNA和蛋白的诱导
为了确定DNA酶对内源PAI-1产生的作用,使来源于人和大鼠的内皮单层细胞长到汇合,然后用种属特异性的DNA酶或打乱的对照进行转染。转染的细胞再用TGF-β活化8小时以最大程度诱导PAI-1的表达。对细胞的mRNA进行逆转录后对RT-PCR产物的光密度法显示,相对于E0打乱的DNA,E2对培养的大鼠内皮细胞中TGF-β可诱导的稳态mRNA水平抑制52%,图3a。组成型PAI-1mRNA的水平不受DNA酶转染的影响。图3b显示的是经过E2DNA酶转染的内皮细胞对TGF-β介导的PAI-1蛋白诱导的作用。通过蛋白印迹检测发现,用打乱DNA酶转染的内皮细胞使细胞质中的PAI-1蛋白升高约50%。与此相反,当用PAI-1DNA酶E2进行转染时,这种作用几乎完全消失。
DNA酶对血清依赖性降解的抗性
由于在3’末端正确方向具有胸腺嘧啶的DNA酶在24小时内被血清(浓度为1-5%)中的因子显著降解(14),因此我们研究了3’末端反向的胸腺嘧啶对PAI-1DNA酶血清依赖性溶核降解的保护作用。DNA酶E1用32P标记,并与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)单层温育3-24小时,所述内皮细胞在含有生理浓度(2%)或超过生理浓度(20%)的血清的培养基中进行培养。如图3c所示,虽然当细胞在含有20%的血清培养基中培养6个小时会使DNA酶几乎完全降解,但是当细胞培养在含有2%的血清培养基中时,DNA酶在24小时内没有发生变化。如图3d所示,与用打乱的DNAE0进行转染相比较,经过E1或E3DNA酶转染并在含有2%的血清培养基中培养12个小时的HUVEC证实了在TGF-β依赖性PAI-1的活性方面减少20%和28%(均为p<0.01)。合起来,这些结果指示在3’末端反向的胸腺嘧啶可保护PAI-1DNA酶免受体内可能会遇到的生理血清浓度下的溶核降解作用,结果能够抑制细胞PAI-1活性。
E2的心脏内注射降低巨噬细胞PAI-1的表达。
我们对当心肌梗塞时,将E2注射到心脏内是否可抑制大鼠心脏内PAI-1的表达进行了研究。当将左前降枝(LAD)动脉结扎和诱导心肌梗塞两周后,免疫组织化学研究表明,在梗塞区和梗塞周围处的大鼠CD68阳性巨噬细胞内的PAI-1表达显著发生。当少量的血管内皮细胞染色呈阳性时,在远离梗塞的肌细胞或间质细胞中没有检测到PAI-1的表达。我们的结论是在梗塞的大鼠心脏中PAI-1蛋白的主要来源是通过过滤巨噬细胞和吞噬细胞产生的。注射E2两周后,在梗塞的大鼠心脏中,PAI-1的表达有了显著改变,在梗塞周围处由巨噬细胞产生的PAI-1的表达减少了71%(p<0.01),图4a。在该位点抑制PAI-1的表达是高度特异性的,这是因为注射E2之后,梗塞区中心的巨噬细胞中的PAI-1的表达保持不受影响,并且注射打乱的DNA酶E0时不会减少梗塞周围区域PAI-1的表达。
E2的心脏内注射导致梗塞周围区域新血管生成。
如图4b所示,与PAI-1表达减少平行的是,两周后,在注射过E2的大鼠心脏证实梗塞周围区域的大内腔的毛细血管的数量显著增加(大于6个核)。与注射E0打乱的DNA酶相比较,单独注射E2可使梗塞周围区域的大内腔的毛细血管的数量显著增加,更令人激动的是,当E2和通过静脉内递送的成人骨髓源性CD34+CD117+(CD34+CD117bright)成血管细胞一起使用时,使大内腔的毛细血管的数量再增加62%。用人源抗-CD31mAb检测发现,尽管很多新生成的血管是大鼠来源的(血管生成(angiogenesis)),但显著数量的是人源的(血管发生(vasculogenesis))。与E0对照酶相比较,当E2存在时,在梗塞区和梗塞周围区的游离的、分散的、间隙的人成血管细胞的数目减少了5.2倍,图4c。相反,与E0相比较,注射E2后梗塞周围区的大内腔的毛细血管的数量(大于6个核)增加14倍。我们的结论是通过抑制梗塞周围区的PAI-1的表达,E2能够使人成血管细胞更有效地在心脏组织中迁移,合生,及参与新血管的形成。
E2保护梗塞周围区域的心肌细胞避免凋亡。
我们以前表明骨髓源性的内皮祖细胞所诱导产生的梗塞周围区域新血管生成可以保护邻近的活心肌细胞避免凋亡。因为单独血管内注射E2可使梗塞的大鼠心脏的该部位进行新血管生成,我们研究了注射E2对心肌细胞凋亡的作用。在将LAD结扎的时候注射E2,可使梗塞周围区域的心肌细胞凋亡减少70%(p<0.01),图5a。当注射打乱的对照DNA酶E0时没有观察到该现象。使心肌细胞避免凋亡的保护水平类似于用人成血管细胞静脉内灌输观察到的水平。
肾纤维化
肾素-血管紧张素系统(RAS)在进行性肾病中已经被详尽地研究过,表明除了在血液动力学和盐/水动态平衡方面以外的多重作用。现在已认识到RAS可能通过类型1(AT1)和类型4(AT4)受体与纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的诱导相关,因此促进血栓和纤维化(39)。因此纤溶酶原激活物抑制剂-1是肾纤维生成疾病的合适的靶目标。肾纤维化的损伤过程包括几个机制,其中抑制细胞外基质(ECM)降解可能起重要作用。有两个相关联的蛋白质水解系统参与基质降解:纤溶酶原激活系统和基质金属蛋白酶系统。PAI-1作为纤溶酶原激活的主要抑制剂,调节纤维蛋白溶解作用及纤溶酶介导的基质金属蛋白酶激活。PAI-1也是ECM的一个组分,在其中它与玻连蛋白相结合。PAI-1在正常人的肾脏中是不表达的,但是在各种形式的肾病中,PAI-1被强烈地诱导表达,从而导致肾纤维化和最终肾衰竭。凝血酶,血管紧张素II和转化生长因子-β在体外和体内有效激动增加PAI-1的合成。几个实验和临床研究支持PAI-1在慢性肾小球性肾炎,肾糖尿病,病灶性节段性肾小球硬化和其他纤维化肾病中的肾纤维化过程中具有一定的作用(40)。
晚期肾脏疾病(ESRD)的发生率和流行率正在不断地攀升,构成了公众健康的巨大负担。这种逐步上升的流行率表明需要有更新的治疗干预和策略对现有治疗手段进行补充。虽然许多证据已确切地表明血管紧张素II介导进行性肾病,但最近的证据也暗示醛固酮在进行性肾病中成为一个重要的致病因素。最近,几个实验证据表明,选择性地阻断醛固酮,独立于阻断肾素-血管紧张素,减少了易感性自发性高血压中风大鼠(SHRSP)模型中的蛋白尿和肾硬化和和亚整体肾切除大鼠模型(即残留肾)中的蛋白尿和肾小球硬化。尽管使用血管紧张素II受体阻断剂和血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂所造成的药理学阻断减少蛋白尿和肾硬化/肾小球硬化,但选择性醛固酮再灌注恢复这些异常现象的发生,尽管肾素-血管紧张素阻断仍在继续。醛固酮可以通过几种机制促进纤维化的发生:包括纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的表达和随后的由于转化生长因子β1(TGF-β1)和活性氧类(ROS)刺激所造成的血管ribrinolysis改变(41)。因此期望PAI-1是用于治疗性干扰肾纤维化的合适的靶目标。
进行性肾病特征在于诱导纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1),这表明损害肾纤溶酶级联活性可能对肾纤维化起作用。用敲除PAI-1的小鼠研究表明,表现出对输尿管梗阻纤维化作用的抗性对于肾纤维化反应中PAI-1建立了重要的纤维产生作用。结果表明PAI-1的一个重要的促纤维化功能就是在召集包括肌纤维细胞和巨噬细胞在内的纤维化诱导细胞过程中起重要作用(42)。
肝纤维化
在慢性肝损伤过程中,转化生长因子β(TGF-β)在由来源于肝星形细胞(HSC)的肌纤维细胞样细胞刺激肝纤维生成过程中具有重要作用。在急性肝损伤中,来源于HSC的TGF-β增加了纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)和α2(I)前胶原(COLIA2)转录物。由于在HSC中观察到Smad2的高水平磷酸化及TGF-β诱导PAI-1的转录,所以在肝损伤中的HSCs和原代培养的HSCs中的Smad2可以被自体分泌机制所激活(43)。
在硬化的肝中,增加的PAI-1与uPA,uPAR和tPA一起与基质降解的整体抑制相关。在肝纤维化中,肝星形细胞是重要的PAI-1来源。在大鼠的肝纤维生成中,肝星形细胞的作用是增加纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物的抑制剂的表达量(44)。因此,期望PAI-1是用于治疗性干扰肝纤维化的合适的靶目标。
肺纤维化
先天性肺纤维化(IPF)病人支气管肺泡灌洗术(BAL)的上清液中的PAI-1水平显著高于正常受试者。在先天性肺纤维化的肺中,前凝血剂和抗纤维蛋白溶解的活性增高。因此,期望PAI-1是用于治疗性干扰肺纤维化的合适的靶目标。
此外,通过上述机制,通过逆转认为由于缺血发生的纤维化症状可以治疗眼睛的白内障。
再狭窄
在患有下述疾病的患者中PAI-1水平会显著性升高:心肌梗塞,尤其再患有糖尿病,外周动脉疾病,尤其再患有糖尿病,和气囊血管成形术和/或斯坦特印模移植和再狭窄。升高的PAI-1水平减少活化的蛋白c的水平,这将导致增加凝血酶的生成以及纤维和凝块的形成。凝血酶诱导平滑肌细胞的迁移和增殖,这是气囊血管成形术或斯坦特印模移植后再狭窄的标志。
我们因此提出一个理论,用PAI-1DNA酶对气囊血管成形术的部位进行局部给药将会增加内源性活化的蛋白c的量,减少凝血酶的生成,降低纤维的沉积,降低平滑肌细胞的迁移和增殖,防止气囊血管成形术或斯坦特印模移植后再狭窄。
首先我们在结合颈内动脉灌输PAI-1DNA酶,打乱的DNA酶或盐水进行气囊血管成形术后,14天测量了新内膜形成。如图13和14所示,通过测定面积和血管内腔被侵占的比例发现,PAI-1DNA酶显著地抑制新内膜的形成。与由接受打乱的DNA酶或盐水的动物相比,接受局部灌入PAI-1DNA酶的动物的新内膜形成的减少程度超过了50%(两者p<0.05)。接受盐水的气囊血管成形术处理的动物14天后的颈内动脉的平均腔面积是0.178+/-0.067um2,而最初的平均面积是0.281+/-0.082um2,那些经过打乱的DNA酶处理的动物的平均腔面积是0.129+/-0.051um2,而最初的平均面积是0.247+/-0.058um2,那些经过PAI-1DNA酶处理的动物的平均腔面积是0.231+/-0.028um2,而最初的平均面积是0.292+/-0.025um2。因此在经过气囊血管成形术后接受打乱的DNA酶或盐水处理的动物有新内膜的形成,它们的动脉平均内腔被侵占了42+5%和43+10%,而接受PAI-1DNA酶处理的动物表明所形成的新内膜只侵占了22+5%动脉内腔(p<0.05)。在气囊血管成形术后,三组(盐水,打乱的DNA酶,PAI-1DNA酶)的平均面积没有显著性差异(0.281+0.082um2对0.247+0.058um2对0.292+0.025um2)。
接下来,我们研究了伴随PAI-1DNA酶给药,新内膜形成的减少是否来自于平滑肌细胞增殖的降低。如图15和16所示,通过对结蛋白和Ki67抗原的双免疫染色发现,PAI-1DNA酶显著地抑制平滑肌细胞的增殖。与那些接受打乱的DNA酶或盐水的动物相比,接受局部PAI-1DNA酶注入的动物的新内膜平滑肌细胞增生的减少程度超过了60%(两者p<0.05)。而在接受气囊血管成形术后的接受打乱的DNA酶或盐水的动物证实在新内膜中分别80+12和89+20个正在复制的平滑肌细胞/高倍视野,那些接受PAI-1DNA酶的动物在新内膜中仅有35+6个正在复制的平滑肌细胞/高倍视野(p<0.05)。
PAI-1和蛋白C的抑制
蛋白C是一种丝氨酸蛋白酶,是天然存在的抗凝剂。在凝血级联反应中,它通过使因子Va和VIIIa失活阻碍凝血酶产物生成的能力,从而在止血调控中发挥作用。败血症被认为是对感染的全身性炎性反应,它与许多宿主防御机制的激活相关,这些机制包括细胞因子网络,白细胞和补体和凝集/纤维蛋白溶解作用系统[Mesters,等.,Blood 88:881-886,1996]。在各种器官内的微血管系统中,弥散性血管内凝集[DIC]和纤维蛋白的广泛沉积是败血症/败血性休克的早期症状。DIC在多器官衰竭综合征的发展过程中是一个重要的中介,并导致败血性休克患者进行较差的预诊[Fourrier,等.,Chest 101:816-623,1992]。活化的蛋白C能够以纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的方式,发挥原纤维蛋白溶解因子的功能。玻连蛋白是一种大量存在的血浆和血小板糖蛋白,它已被认为可以作为辅因子,显著地提高活化的蛋白C(APC)与PAI-1的反应能力。玻连蛋白增强APC与PAI-1的反应活性大约300倍,揭示PAI-1是所报道的APC最有效的抑制剂。
因此,一种抑制PAI-1的方法将能提高APC活性,并且诱导纤溶酶原激活水平的增加,从而导致纤维溶解作用级联反应的上调。
材料与方法
DNA酶和RNA底物:含有3’-3’反向胸腺嘧啶的DNA酶是通过整合DNA技术(CoralvilleIA)合成的,并用无RNA酶活性的IE-HPLC或RP-HPLC进行纯化。与靶DNA酶序列相对应的短RNA底物是用化学方法合成的,然后用无RNA酶PAGE进行纯化,还由DNA模板体外转录获得。
体外转录:从所培养的HUVEC细胞的总RNA中通过RT-PCR方法扩增人源的PAI-1cDNA,所使用的引物为:5’CCAAGAGCGCTGTCAAGAAGAC3’(正向引物;SEQ ID NO:11)和5’TCACCGTCTGCTTTGGAGACCT3’(反向引物;SEQ ID NO:12)(位置25-10600,J.Biol.Chem,1988,263(19):9143)。PCR产物长度为1598个碱基。PAI-1cDNA被克隆到pGEM-T载体上(Promega),以获得质粒构建体pGEM-hPAI。对cDNA序列用自动测序仪进行验证。含有32P标记的核苷酸的人源PAI-1RNA转录产物是通过体外转录方式制备的(SP6聚合酶,Promega)。20ml反应体系中由4μl 5xbuffer,2μl DTT,1μl Rnasin抑制剂,4μl NTP混合物(1μl A,G,C和1μl H2O),100μM UTP,2μl模板(0.3μl/μl),a-32P-UTP(10μci/μl)和1μl SP6聚合酶(20u/μl)。在32℃下反应1小时。在Chromaspin-200柱(Clontech,Palo Alto,CA)上离心,将没有结合上去的标记和短核苷酸(<350个碱基)与放射性标记的物质分离。
切割反应:用T4多核苷酸激酶对所合成的RNA底物进行32P末端标记。切割反应体系包括60mMTris-HCl(pH7.5),10mMMgCl2,150mMNaCl,0.5μM32P标记的RNA寡聚物,0.05-5μMDNA酶。当对体外转录产物进行切割时,反应体系包括1%的PAI-I转录产物,25mMTris-HCl(pH7.5),5mM MgCl2,100mM NaCl和0.2-20μM DNA酶。反应在37℃进行,然后将等分试样转移到含有90%甲酰胺,20mM EDTA和上样染料的管中“淬灭”。用TBE-尿变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离样品(体外转录产物用5%的胶,合成的RNA用15%的胶),在-80℃下放射性自显影检测。
血清中的DNA酶稳定性:用T4多核苷酸激酶对DNA酶进行放射性标记。标记反应体系(20μl体积)由下述物质组成:1μl20μM DNA酶,2μl10x激酶缓冲液,1μl T4PNK(10u/μl),10μl H2O和6μl32P-ATP(3000uCi/mmol,10uCi/μl)。37℃反应30分钟。HUVEC在含有2%或20%FCS的培养基(Clonetic)中培养,加入终浓度为100nM的放射性标记的寡聚物。在0,3,6,12,24小时的不同时间点将混合物的等分试样取走,用酚/氯仿淬灭,冻存备用。每个实验结束时,所有的样品用酚抽提,用15%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行分析,用放射性自显影检测。
培养条件和DNA酶转染:原代HUVEC内皮细胞来自于Clonetic(USA),在含有2%FCS,100ug/ml链霉素和100IU/ml青霉素的培养基中于37℃,5%CO2的湿润气氛中培养。在实验中所用的HUVEC是第六到第八代细胞。为了DNA酶转染,将大鼠内皮细胞(EC)收获,接种到6孔平板上的每一个孔中(约1x105个细胞/孔)。当细胞近乎汇聚时(70~80%),用1ml HEPES缓冲液(pH7.4)将分汇合(70~80%)细胞洗两次,然后用0.5ml含有1μM的测试分子(E2或E0)和20μg/ml阳离子脂质(DOTAP)的不含血清的培养基转染细胞。温育3小时后,将0.5ml的2%血清培养基加入到每个孔中。3小时后向一半的孔加入终浓度为1.8ng/ml的TGF-β。转染的细胞连续培养8小时,然后用Trizol试剂(LifeTechnologies)裂解,分离得到RNA(用于RT-PCR)和蛋白(用于蛋白印迹)。
RT-PCR:使用1mlTrizol试剂,从6孔平板的每个孔中分离得到总RNA,溶解在20μl被DEPC处理过的H2O中。将2μl样品用于反转录,反应体系为20μl然后4μl产物用作扩增PAI-1或人GAPDH的模板,PCR体系为50μl(5μl10xbuffer,1μl dNTP,0.25μl Taq聚合酶,1μl正向和反向引物,38μl H2O,2μl32P-dCTP(3000ci/mmol,10uci/μl))。反应条件是95℃2分钟(预变性),95℃0.5分钟,58℃1分钟,72℃2分钟,35次循环,72℃10分钟。人GAPDH 被用作内参比(正向引物:5’TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTG3’SEQ ID NO:13;反向引物:5’CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC3’SEQ ID NO:14)。其PCR产物是452个碱基。
蛋白印迹:将作为对照的细胞和DNA酶处理过的细胞收获,用PBS洗涤,然后将细胞沉淀重悬在裂解液中进行裂解。使用10%聚丙烯酰胺分离胶使用minigels(Bio-Rad)对等量的蛋白(15μg/泳道)进行SDS凝胶电泳分离。电泳后,通过电转移将蛋白转移到硝酸纤维素膜上(Protran,Schleicler&Schuell),在室温下,用含有5%(W/V)BSA的TBS-T缓冲液(0.1M Tris-base(pH7.5),0.15M NaCl和0.1%Tween-20)进行封闭,封闭时间至少1小时。随后用羊抗PAI的IgG多克隆抗体(Santa Cruz biotech)对膜进行免疫印迹,然后借助ECL-system(Amersham),用辣根过氧化物酶偶联的抗山羊IgG(Sigma)进行显色。
纤溶酶活性测定(PAI-1功能分析):在干扰后的不同时间,收集合适的培养基和细胞裂解物。细胞用PBS洗涤两次,在400ml 0.5%Triton X-100中进行裂解,以用于测定纤溶酶。合适的培养基、Triton细胞裂解物和纤溶酶底物Val-Leu-Lys-pNA(S2251,Kabivitru,Stockholm Sweden)室温下在96孔微滴平板上(终体积为200μl)一起温育60分钟。对410nm的光吸收值进行读数测量纤溶酶的活性,并根据纤溶酶(Sigma)标准回归线计算。
动物,外科手术步骤,人源细胞的注入和细胞迁移到组织的定量分析:本研究所使用的Rowett(rnu/rnu),无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley,Indianapolis,Indiana)是经过”哥伦比亚大学研究所动物安全和使用委员会(Columbia University Institute for Animal Care and Use Committee)”认可的。麻醉后进行左胸廓切开手术,打开心包膜,将左前降枝(LAD)动脉结扎。在进行外科手术时,对一组大鼠进行三次心脏内的E2DNA酶注射,对另一组小鼠进行三次心脏内的打乱的E0对照注射,对第三组小鼠进行三次心脏内的盐水注射。在对新生血管生成的研究中,将2.0x106个来源于经过G-CSF活动化的单个供体的人细胞重新构建成2.0x105个免疫纯的CD34+CD117+细胞,并在LAD结扎48小时后注入到大鼠的尾部静脉中。每一组包括6-10只大鼠。
毛细血管密度定量:为了对毛细血管密度和毛细血管种属来源进行定量分析,用抗因子VIII、大鼠或人CD31(全部Serotec,UK)及大鼠或人MHCI类(Accurate Chemicals,CT)的单克隆抗体对另外的部分进行染色。利用免疫过氧化物酶技术进行染色,所使用的是抗生物素蛋白/生物素封闭试剂盒,能被大鼠吸收的生物素化的抗鼠IgG和过氧化物酶-偶联物(AllVector Laboratories,Burlingame,CA)。在梗塞两周后,对用抗因子VIII的单克隆抗体标记的部分进行毛细血管密度测定,并与没有损伤的心肌的毛细血管密度进行比较。数值表示为每HPF(600x)的因子VIII阳性细胞的数量。
通过石蜡组织切片的DNA末端标记测定肌细胞凋亡:为了在单细胞水平上对凋亡进行原位测定,我们使用由脱氧核苷酸转移酶(TdT)(BoehringerMannheim,Mannheim,Germany)介导的DNA末端标记的TUNEL方法。在注射盐水或CD34+人细胞两周后,从LAD结扎的大鼠获得大鼠心肌组织切片,同时获得健康大鼠的心肌组织切片作为阴性对照。简要地讲,使用二甲苯将组织中的石蜡除去,然后逐渐用乙醇稀释并用磷酸缓冲的盐水(PBS)洗两次,从而使组织重新水合。然后37℃下用蛋白酶K(10μg/ml,溶于Tris/HCl中)对组织切片消化处理30分钟。然后用PBS将载玻片洗3次,与50μl的TUNEL反应混合物(TdT和荧光素标记的dUTP)放在一起,在潮湿的气氛中37℃温育60分钟。对于阴性对照,反应混合物中不含有TdT。切片用PBS洗涤3次后,与荧光素偶联的碱性磷酸酶(AP)(BoehringerMannheim,Mannheim,Germany)特异性抗体一起温育30分钟。TUNEL染色通过可以将具有DNA片段化的核染成蓝色的底物系统(BCIP/NBTsubstrate systemDAKO,Carpinteria,CA)进行显色。将样品在PBS中暴露3分钟,以终止反应。为了测定心肌细胞中染成蓝色的凋亡的核的比例,用结蛋白特异性单克隆抗体对组织进行复染。通过使用含3%过氧化氢酶PBS溶液将内源的过氧化物酶封闭15分钟,然后用20%山羊血清溶液进行洗涤。抗结蛋白抗体(Sigma,Saint Louis,Missouri)在40℃温育过夜(1∶100)。经过3次洗涤后,切片用抗兔IgG进行处理,然后用生物素偶联的二抗处理30分钟(Sigma,Saint Louis,Missouri)。然后加入抗生物素蛋白/生物素复合物(Vector Laboratories,Burlingame,CA)继续处理30分钟,然后在DAB溶液混合物(Sigma,Saint Louis,Missouri)中暴露5分钟,肌细胞呈现棕色。在放大倍数为40倍的显微镜下对组织切片进行观察,最少在8个高倍视野中至少有100个细胞。通过凋亡指数测定凋亡肌细胞的百分比;而凋亡指数是通过将染色结果阳性的肌细胞核的数量除以肌细胞核的总数再乘以100而计算的。组织边缘被染色的细胞不计算在内。凋亡指数小于等于1,则认为没有发生凋亡。
心肌功能分析:通过高频线性阵列传感器(SONOS 5500,Hewlett Packard,Andover,MA)进行超声心动图研究。得到了乳头中间(mid-papillary)和顶点水平上的2维图像。用双平面面积-长度方法得到舒张末期(EDV)和收缩末期(ESV)的左心室容积大小,左心室的射血分数的百分比可以从[(EDV-ESV)/EDV]x100计算得出。利用超声波流动探头(TransonicSystems Inc.,Ithaca,NY)测定心输出量(CO),将计算得到的每份体重的心输出量值作为心脏指数。所有的超声心动图研究都是由对治疗不知情的观察者完成的(ST)。
气囊血管成形术和颈动脉损伤的大鼠模型:用氯胺酮(90mg/kg腹膜内)和赛拉嗪(10mg/kg腹膜内)对雄性Sprague-Dawley大鼠(体重350-400g,Sprague-Dawley Harlan,Indianapolis,IN)进行麻醉,通过外部动脉将一个2F栓子切除术气囊导管(Baxter Health Care)插入到左颈总动脉处。将气囊充气膨胀,使颈总动脉扩大,然后将气囊抽回到外部动脉。这一过程重复3次,然后将导管移走。左颈总动脉受到气囊损伤后,通过临时结扎将损伤的末端部分分离。将PAI-1或打乱的对照DNA酶融入到末端损伤部分,室温温育5分钟。温育后将套管移走,恢复向颈总动脉内的血液流动。气囊损伤两周后麻醉大鼠,将左右颈动脉移出,包埋在石蜡中。将每个动脉分成三段,分别包埋在石蜡中。从每一段切下来的横断面环(5μm)用苏木精和曙红进行染色。在40倍的显微镜下对载玻片进行拍照。用NIHImage1.60软件包对空腔,新内膜和血管中层面积进行测量。面积的测量是通过对空腔的周长(空腔面积[LA],Um2)、新内膜的周长(内膜面积[IA],Um2)和外弹性层(血管面积[VA],Um2)的测定得到的。所得到的内膜面积与破裂长度的比值(IA/FL)用来对损伤程度进行修正。测量是由对治疗不知情的观察者完成的。
新内膜形成的形态分析:将每段颈动脉上的相隔约3mm的两个切片用Masson′s Trichrome法染色,利用计算机辅助测面法测定内膜和中膜的面积,对每段颈动脉的两个切片的内膜和中膜平均面积进行测定。对于14天的动脉样品,通过计算两个切片中的每个切片在4个高倍视野中的细胞核数目测量内膜细胞密度。然后计算得出动脉的平均密度,通过将内膜面积与细胞密度相乘得到内膜细胞数目。测量是由对治疗不知情的观察者完成的。
平滑肌细胞增殖的测定:通过对气囊血管成形术和用PAI-1DNA酶或打乱的对照DNA酶处理14天后获得的大鼠颈动脉组织切片双重染色,确定动脉平滑肌细胞的DNA合成和细胞周期。对来自未经历气囊血管成形术的动物和来自于实验动物未处理的动脉检测对照颈动脉样品。简要地说,在0.1M EDTA缓冲液微波处理石蜡包埋的切片,用1∶3000比例稀释的抗大鼠Ki67的第一单克隆抗体(由Giorgio Catoretti惠赠,Columbia University)或者1∶300比例稀释抗人Ki67的第一单克隆抗体(Dako,CA)染色切片,并且在4℃温育过夜。洗涤后,将切片与1∶200比例稀释的碱性磷酸酶偶联的种特异性二抗(Vector Laboratories Burlingame,CA)温育30分钟,使用BCIP/NBT底物试剂盒(Dako,CA)使染色呈阳性的细胞核显蓝色。然后将切片和抗结蛋白的单克隆抗体(Accurate Chemicals,CT)一起在4℃温育过夜,使用上述的抗生物素蛋白/生物素系统,可以使染色阳性的细胞呈现棕色。将经过颈动脉内膜和中膜中的细胞周期的平滑肌细胞发展计算为结蛋白阳性的细胞/高倍视野中共表达Ki67的比例。
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Claims (35)
1.一种特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述催化性脱氧核糖核酸从5’到3’方向包含:
(a)确定至少4个核苷酸的第一结合结构域的连续脱氧核糖核苷酸;
(b)确定与所述第一结合结构域的3’末端相连、并能够在预定的磷酸二酯键处切割编码PAI-1的mRNA的催化结构域的序列为SEQID NO:1的连续脱氧核糖核苷酸;和
(c)确定与催化结构域的3’末端相连的至少4个核苷酸的第二结合结构域的连续脱氧核糖核苷酸,
其中所述第一和第二结合结构域的每一个中的核苷酸序列与所述编码PAI-1的mRNA的核糖核苷酸序列在待切割的预定的磷酸二酯键的相对侧互补,并且其中所述催化性核酸与所述编码PAI-1的mRNA在嘌呤:嘧啶共有序列的预定的磷酸二酯键处杂交并进行特异性切割。
2.权利要求1中的催化性脱氧核糖核酸,包含修饰的碱基。
3.权利要求1中的催化性脱氧核糖核酸,包含修饰的核苷间键。
4.权利要求3中的催化性脱氧核糖核酸,其中修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。
5.权利要求1中的催化性脱氧核糖核酸,其中所述催化性脱氧核糖核酸包含SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列。
6.一种药物组合物,其包含权利要求1中的催化性脱氧核糖核酸和药用载体。
7.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于特异性抑制PAI-1在细胞内的表达。
8.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于特异性抑制PAI-1在受试者细胞内的表达。
9.权利要求7的应用,其中所述药物为适于通过斯坦特印模,支架,静脉内,口服,通过吸入,皮下,通过直接肌肉注射或者通过基因载体方式进行给药的形式。
10.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于治疗受试者心血管疾病的方法中,所述疾病涉及在受试者中心肌细胞凋亡。
11.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于治疗受试者心血管疾病,所述疾病涉及在受试者中新内膜形成。
12.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于治疗受试者纤维化疾病,所述疾病涉及在受试者中纤维发生。
13.权利要求12中的应用,其中所述纤维化疾病是肾病,肝病,肺病和眼病。
14.权利要求11中的应用,其中受试者已经历气囊血管成形术。
15.权利要求11中的应用,其中受试者已经历斯坦特印模移植。
16.权利要求11中的应用,其中心血管疾病是再狭窄。
17.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于治疗受试者血管疾病,其中所述疾病通过减少凝血酶或血纤蛋白产生来得以治疗。
18.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于治疗受试者血管疾病,其中血管疾病通过抑制PAI-1的表达来得以治疗。
19.权利要求10,11,13,17或18中任一项的应用,其中催化性核酸为适于通过斯坦特印模,支架,静脉内,口服,通过吸入,皮下,通过直接肌肉注射或者通过基因载体方式进行给药的形式。
20.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于诱导受试者心脏组织新血管形成的方法中。
21.权利要求20中的应用,其中受试者是心血管疾病患者。
22.权利要求21中的应用,其中心血管疾病是心肌梗塞,绞痛,充血性心力衰竭,外周动脉疾病或心肌缺氧。
23.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于诱导受试者组织新血管生成。
24.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于治疗受试者心血管疾病的方法中,其中所述疾病通过提高受试者的心肌功能来得以治疗。
25.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于抑制受试者组织中平滑肌细胞增殖。
26.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于抑制受试者心脏中凝血酶和血纤蛋白沉积。
27.权利要求20,23,24,25或26任一项中的应用,其中所述药物为适于通过斯坦特印模,支架,静脉内,口服,通过吸入,皮下,通过直接肌肉注射或者通过基因载体方式进行给药的形式。
28.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于抑制受试者组织中凝血酶和血纤蛋白沉积的方法中。
29.权利要求28中的应用,其中所述受试者患有肾病或肾小球性肾炎。
30.权利要求1所述的特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA的催化性脱氧核糖核酸在制备药物中的应用,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5,所述药物用于治疗受试者败血性休克的方法中。
31.权利要求28或30的应用,其中所述药物为适于通过斯坦特印模,支架,静脉内,口服,通过吸入,皮下,通过直接肌肉注射或者通过基因载体方式进行给药的形式。
32.权利要求8-31任一项的应用,其中所述催化性脱氧核糖核酸包含SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列。
33.权利要求8-18,20-26,28-30任一项中的应用,其中所述受试者是哺乳动物。
34.权利要求33中的应用,其中所述哺乳动物是人。
35.制备药物组合物的方法,其包含混合治疗有效量的催化性脱氧核糖核酸和药用载体,所述催化性脱氧核糖核酸特异性切割编码纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的mRNA并包含SEQ ID NO:2,SEQID NO:3或SEQ ID NO:4的序列,其中mRNA序列为SEQ ID NO:5。
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