EA026309B1 - Нуклеиново-кислотные модуляторы clec-2 - Google Patents

Нуклеиново-кислотные модуляторы clec-2 Download PDF

Info

Publication number
EA026309B1
EA026309B1 EA201390173A EA201390173A EA026309B1 EA 026309 B1 EA026309 B1 EA 026309B1 EA 201390173 A EA201390173 A EA 201390173A EA 201390173 A EA201390173 A EA 201390173A EA 026309 B1 EA026309 B1 EA 026309B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cec
ligand
nucleic acid
modulator
sequence
Prior art date
Application number
EA201390173A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201390173A1 (ru
Inventor
Джулиана М. ЛЭЙЗЕР
Санджой К. Маханти
Сэмьюэл К. Вольфф
Кэтрин К. Редик
Кристофер П. РАСКОНИ
Original Assignee
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НоваМедика"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НоваМедика" filed Critical ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НоваМедика"
Publication of EA201390173A1 publication Critical patent/EA201390173A1/ru
Publication of EA026309B1 publication Critical patent/EA026309B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Обеспечены лиганды, которые связываются с CLEC-2 и регулируют функцию CLEC-2. Нуклеиново-кислотные лиганды CLEC-2, описанные здесь, способны ингибировать CLEC-2-опосредованную агрегацию тромбоцитов и могут также обеспечивать применение в регуляции CLEC-2-опосредуемых процессов, таких как образование тромбов, метастазирование опухолей, лимфоангиогенез, диссеминация ВИЧ, воспалительная реакция, продуцирование цитокинов и фагоцитоз. Здесь описаны также модуляторные молекулы, которые могут обращать активность лиганда CLEC-2 как in vitro, так и in vivo и ex vivo.

Description

Данное изобретение относится, в общем, к фармакологической системе, содержащей нуклеиновокислотный лиганд, который связывается с белком СЬЕС-2 и регулирует активность белка СЬЕС-2. Эти нуклеиново-кислотные лиганды являются также активно обратимыми с использованием модулятора, который ингибирует активность этого нуклеиново-кислотного лиганда для нейтрализации его фармакологического действия и посредством этого разрушения функции СЬЕС-2. Кроме того, это изобретение относится к композиции, содержащей нуклеиново-кислотный лиганд и/или модулятор, а также к способам применения этих агентов и композиций в лечении СЬЕС-2-опосредуемых нарушений.
Уровень техники
Лектин-подобный рецептор 2 С-типа (СЬЕС-2) был недавно идентифицирован с использованием подхода биоинформатики и был признан в качестве рецептора тромбоцитов (О'Са11адЪап, С.А., Сштеп! Ορίηίοη οί РЪаттасо1оду, 2009; 9:90-95). СЬЕС-2 является трансмембранным белком типа 2 с внеклеточным лектин-подобным доменом С-типа и коротким цитоплазматическим доменом, содержащим единственный Ъет1ТАМ (иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина) УХХЬ мотив. Фосфорилирование тирозин 7 в этом цитоплазматическом мотиве запускается связыванием лиганда после активации Бтд-киназ, которое, в свою очередь, фосфорилирует ряд находящихся ниже по ходу процесса передающих сигнал белков, в том числе РЬСу2. Имеются два известных природно-встречающихся белка, способных взаимодействовать с СЬЕС-2 и опосредовать его физиологические функции трансдукции сигнала; этот эндогенный белок подопланин и белок родоцитин яда змеи, оба из которых запускают активацию тромбоцитов, включающую в себя сильную стимуляцию как агрегации, так и секреции. Ιηοικ-διιζιιίί е! а1., совместно с Ка!о сообщали, что профиль индуцированной подопланином агрегации тромбоцитов является очень сходным с профилем индуцированной родоцитином агрегации, и идентифицировали СЬЕС-2 как рецептор для подопланина (Ιηοικ-διιζιιίί. К.О. е! а1., ί. ТЪготЪ. Наеток!. 2011; 9 (кирр1 1): 4455). Они также обнаружили, что индуцируемая родоцитином агрегация тромбоцитов является высоко зависимой от генерирования ТхА2 и полимеризации актина в сравнении с агрегацией тромбоцитов, индуцируемой СКР (1поие, е! а1. ВюсЪет. ВюрЪук. Кек. Соттип. 1999; 256: 114-120). Как родоцитин, так и подопланин взаимодействуют непосредственно с СЬЕС-2 при микромолярных аффинностях (Ка!о, Υ. е! а1., Сапсег δει, 2008; 99:54-61; Οζί·ι.1<ί„ Υ, е! а1., ί. ТЪгот. Неток!, 2008; 7.191-194). Было показано, что СЬЕС-2 связывается с опухолевыми клетками через подопланин, и результаты из исследований на мышах указывают на то, что передача сигнала СЬЕС-2 может стимулировать метастазирование опухолей (Уа!коп, А. А., е! а1., ВюсЪеткЪу, 2009; 48: 10988-10996).
Предполагалось также, что СЬЕС-2 участвует в нормальном гемостазе и тромбозе ш νίνο (Бра1!оп, ЕС., ί. ТЪтот. Неток!, 2009; 7:1192-1199; Уа!коп, А.А., е! а1., ВюсЪеткЪу, 2009; 48:10988-10996) в распространении образования тромбов. Подвергание действию белков субэндотелиального внеклеточного матрикса после разрушения стенок сосудов запускает активацию и агрегацию тромбоцитов. Недавно было показано на мышах, что лечение анти-СЬЕС-2-антителом уменьшает белок из циркулирующих тромбоцитов в течение нескольких дней. СЬЕС-2-недостаточные мыши обнаруживали тяжелые дефекты образования агрегации тромбоцитов ех νίνο и ш νίνο (Мау, Р., е! а1., В1ооб, 2009; 114:3464-3472). Образование тромбов в условиях протекания ех νίνο и ш νίνο является тяжело нарушенным, когда мыши являются недостаточными в отношении СЬЕС-2. СЬЕС-2-недостаточные мыши проявляют умеренное увеличение времени кровотечения в сравнении с мышами, обработанными агентами, которые ингибируют αΙ№β3, или мышами, которые ингибируют СР1Ъа (Мау, Р., е! а1., В1ооб, 2009; 114:3464-3472; Кишскт, Т., В1ооб, 2009; 114:3364-3365).
Было также обнаружено, что СЬЕС-2 опосредует присоединение вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) к тромбоцитам. Связывание рецепторов СЬЕС-2 на тромбоцитах с ВИЧ-1 может позволить как избегание деструкции тромбоцитов, так и использование этих тромбоцитов для облегчения их трансмиссии (СЪа1рап, С. е! а1., ί. νίτο1. 2006; 80 (18): 8951-8960). Предполагается, что передача сигнала СЬЕС-2 участвует также в регуляции воспалительной реакции в миелоидных дендритных клетках (Моигао-Ба, Ό. е! а1., 2011 Еиг. 1. 1ттип. 41:3040-3053).
Таким образом, существует необходимость в терапевтических агентах и способах для лечения СЬЕС-2-опосредуемых нарушений.
Сущность изобретения
Здесь описаны нуклеиново-кислотные лиганды, которые специфически ингибируют СЬЕС-2, способы идентификации и/или характеристики этих лигандов и терапии для использования этих лигандов.
В одном аспекте обеспечен лиганд СЬЕС-2 или его фармацевтически приемлемая соль, где этот лиганд содержит выделенную последовательность нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления по меньшей мере один нуклеотид является рибонуклеотидом. В другом варианте осуществления по меньшей мере один нуклеотид является 2'-фтор-2'-дезоксипиримидиннуклеотидом. Еще в одном вариан- 1 026309 те осуществления эта выделенная последовательность нуклеиновой кислоты лиганда СЬЕС-2 содержит смесь рибонуклеотидов и 2'-фтор-2'-дезоксипиримидиннуклеотидов.
В одном варианте осуществления этот лиганд СЬЕС-2 содержит вторичную структуру, содержащую по меньшей мере один стебель и по меньшей мере одну петлю.
В одном варианте осуществления этот лиганд СЬЕС-2 содержит в направлении 5'-3': первый стебель, который имеет длину 5-10 пар нуклеотидов (п.н.); первую трехнуклеотидную петлю, которая содержит последовательность 5'-ОЫС-3'; второй стебель, который имеет длину 4 п.н., где указанный второй стебель содержит пару неодназначного спаривания в основании второго стебля; и вторую петлю, содержащую нуклеотидную последовательность 5'-ΥυΥΝΝΚΥυ-3'.
В одном варианте осуществления этот нуклеиново-кислотный лиганд имеет длину от приблизительно 20 до приблизительно 100 нуклеотидов (нт). В другом варианте осуществления этот лиганд имеет длину от приблизительно 30 до приблизительно 40 или от приблизительно 30 до приблизительно 35 нт. В другом варианте осуществления этот нуклеиново-кислотный лиганд СЬЕС-2 имеет длину приблизительно 30 нт, 31 нт, 32 нт, 33 нт, 34 нт или 35 нт.
В одном варианте осуществления лиганд СЬЕС-2 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:4-93, или ее фармацевтически приемлемой соли.
В одном варианте осуществления этот лиганд связывается с белком СЬЕС-2 или его фрагментом. В другом варианте осуществления этот лиганд связывается с растворимым доменом СЬЕС-2. Еще в одном варианте осуществления этот лиганд связывается с внеклеточным доменом СЬЕС-2. Еще в одном варианте осуществления этот лиганд связывается с доменом О1и58-Рго230 СЬЕС-2. В одном варианте осуществления этот лиганд специфически связывается с белком СЬЕС-2 (8ЕЦ ГО N0:1). В другом варианте осуществления этот лиганд специфически связывается с внеклеточным доменом СЬЕС-2 (8ЕЦ ГО N0:2).
В одном варианте осуществления этот лиганд состоит из нуклеотидов, в которых один или несколько из этих нуклеотидов являются модифицированными. В другом варианте осуществления модификации нуклеотидов являются стабилизирующими модификациями. Еще в одном варианте осуществления эти модификации увеличивают стабильность этого лиганда ίη νίίτο и/или ίη νίνο. Еще в одном варианте осуществления эти модификации увеличивают биодоступность этого лиганда ίη νίνο.
В одном варианте осуществления этот лиганд содержит инвертированный тимин на его 3'-конце.
В одном варианте осуществления этот лиганд имеет константу диссоциации (Кб) в отношении СЬЕС-2 приблизительно 20 наномолярную (нМ) или менее.
В одном варианте осуществления этот лиганд имеет константу диссоциации в отношении СЬЕС-2, которая больше чем 0, но меньше чем приблизительно 100 микромолей (мкМ), меньше чем приблизительно 1 мкм, меньше чем приблизительно 500 наномолей (нМ), меньше чем приблизительно 100 нМ, меньше чем приблизительно 50 нМ, меньше чем приблизительно 1 нМ, меньше чем приблизительно 500 пикомолей (пМ), меньше чем приблизительно 300 пМ, меньше чем приблизительно 250 пМ или меньше чем приблизительно 200 пМ. В одном варианте осуществления этот лиганд имеет константу диссоциации в отношении СЬЕС-2, которая находится в диапазонах от приблизительно 0,1 до 10 нМ или от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нМ.
В одном варианте осуществления лиганд СЬЕС-2 связывается с вариантом СЬЕС-2 и уменьшает или увеличивает функцию варианта СЬЕС-2, где этот вариант СЬЕС-2 по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен аминокислотной последовательности СЬЕС-2 (8ЕЦ ГО N0:1) или 8ЕЦ ГО N0:2).
В одном варианте осуществления связывание лиганда СЬЕС-2 с СЬЕС-2 стабилизирует активную конформацию СЬЕС-2. В другом варианте осуществления связывание лиганда СЬЕС-2 с СЬЕС-2 стабилизирует неактивную конформацию СЬЕС-2.
В одном варианте осуществления один или несколько нуклеотидов этого лиганда содержат модифицированный сахар и/или модифицированное основание. В другом варианте осуществления эти модификации являются 2'-стабилизирующими модификациями. Еще в одном варианте осуществления эти 2'стабилизирующие модификации являются 2'-фтор-модификациями на сахарном кольце нуклеотида.
В одном варианте осуществления этот нуклеиново-кислотный лиганд для СЬЕС-2 является обратимым, где этот лиганд СЬЕС-2, связанный с СЬЕС-2, может становиться несвязанным. В другом варианте осуществления этот лиганд СЬЕС-2, связанный с СЬЕС-2, становится не связанным с СЬЕС-2 в присутствии модулятора лиганда СЬЕС-2.
В одном аспекте обеспечен модулятор, который связывает лиганд СЬЕС-2, где этот модулятор обращает, частично или полностью, активность лиганда СЬЕС-2.
В одном варианте осуществления этот модулятор содержит выделенную последовательность нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления этот модулятор содержит ДНКпоследовательность, РНК-последовательность, полипептидную последовательность или любую их комбинации. В одном варианте осуществления этот модулятор является нуклеиново-кислотным модулятором, содержащим дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, 2'-0-метил-2'-дезоксинуклеотиды или
- 2 026309 смесь дезоксирибонуклеотидов и рибонуклеотидов и 2'-О-метил-2'-дезоксинуклеотидов. В другом варианте осуществления этот нуклеиново-кислотный модулятор содержит по меньшей мере один модифицированный дезоксирибонуклеотид и/или по меньшей мере один модифицированный рибонуклеотид.
В одном варианте осуществления этот модулятор содержит олигонуклеотид, который является комплемпентарным по меньшей мере части нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2. В другом варианте осуществления этот модулятор состоит из олигонуклеотида, который является комплементарным по меньшей мере части нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2. В другом варианте осуществления этот модулятор содержит олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере части петли в лиганде СЬЕС-2.
Еще в одном варианте осуществления этот модулятор содержит олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере части стебля в лиганде СЬЕС-2. Еще в одном варианте осуществления этот модулятор содержит олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере части стебля в лиганде СЬЕС-2 и по меньшей мере части петли в лиганде СЬЕС-2.
В одном варианте осуществления этот модулятор содержит последовательность, которая более чем на 80%, 85%, 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из ЗЕО ГО N0:60, ЗЕО ГО N0:61, ЗЕО ГО N0:62, ЗЕО ГО N0:63, ЗЕО ГО N0:64 и ЗЕО ГО N0:65. В другом варианте осуществления этот модулятор содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕО ГО N0:60, ЗЕО ГО N0:61, ЗЕО ГО N0:62, ЗЕО ГО N0:63, ЗЕС) ГО N0:64 и ЗЕС) ГО N0:65.
В одном варианте осуществления этот модулятор нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 выбран из группы, состоящей из рибозима, ДНК-зима, пептиднуклеиновой кислоты (РЫЛ), морфолинонуклеиновой кислоты (МИЛ) и закрытой нуклеиновой кислоты (НИЛ).
В одном варианте осуществления этот модулятор нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 содержит нуклеиновую кислоту, которая является комплементарной по меньшей мере части нуклеиновокислотного лиганда СЬЕС-2. В другом варианте осуществления этот модулятор выбран из группы, состоящей из рибозима, ДНК-зима, пептиднуклеиновой кислоты (РНА). морфолинонуклеиновой кислоты (МКА) и закрытой нуклеиновой кислоты (^NА), где этот модулятор специфически связывается или взаимодействует по меньшей мере с частью нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2.
В одном варианте осуществления этот модулятор выбран из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, связывающей белок или пептид, малой молекулы, олигосахарида, нуклеиновой кислоты, связывающей липид, полимера, наночастицы и микросферы, где этот модулятор связывается или взаимодействует по меньшей мере с частью нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2.
В одном варианте осуществления этот модулятор содержит выделенную последовательность нуклеиновой кислоты, где эта последовательность имеет длину приблизительно 10 нт приблизительно 30 нт, приблизительно 10 нт-приблизительно 25 нт, приблизительно 10 нт-приблизительно 20 нт, приблизительно 10 нт-приблизительно 15 нт или приблизительно 15 нт приблизительно 20 нт. В другом варианте осуществления этот модулятор содержит выделенную последовательность нуклеиновой кислоты, где эта последовательность имеет длину приблизительно 10 нт, 11 нт, 12 нт, 13 нт, 14 нт, 15 нт, 16 нт, 17 нт, 18 нт, 19 нт или 20 нт.
В одном варианте осуществления один или несколько нуклеотидов нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 и/или нуклеиново-кислотного модулятора являются модифицированными. В другом варианте осуществления один или несколько нуклеотидов содержат модификацию в 2'-гидроксильном положении. В другом варианте осуществления эта модификация, присутствующая в лиганде СЬЕС-2, выбрана из группы, состоящей из 2'-фтор. В другом варианте осуществления одним или несколькими нуклеотидами лиганда СЬЕС-2 является 2'-фтор-2'-дезоксицитидин или 2'-фтор-2'-дезоксиуридин. Еще в одном варианте осуществления этими одним или несколькими нуклеотидами модулятора являются 2'-Ометилцитозин, 2'-О-метилуридин, 2'-О-метиладенозин, 2'-О-метилгуанозин или 2'-О-метилцитимидин. Еще в одном варианте осуществления этими одним или несколькими нуклеотидами являются 2'фторцитидин, 2'-фторуридин, 2'-фтораденозин или 2'-фторгуанозин.
В одном варианте осуществления эта модификация одного или нескольких нуклеотидов нуклеиново-кислотного модулятора СЬЕС-2 содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из 5фторурацила, 5-фторцитозина, 5-бромурацила, 5-бромцитозина, 5-хлорурацила, 5-хлорцитозина, 5иодурацила, 5-иодцитозина, 5-метилцитозина, 5-метилурацила, гипоксантина, ксантина, 4-ацетилцитозина, 5-(карбоксигидроксиметил)урацила, 5-карбоксиметиламинометилтиоуридина, 5-карбоксиметиламинометилурацила, дигидроурацила, бета-О-галактозилквеозина, инозина, N6-изопентениладенина, 1-метилгуанина, 1-метилинозина, 2,2-диметилгуанина, 2-метиладенина, 2-метилгуанина, 3-метилцитозина, 6-метилцитозина, Ж-аденина, 7-метилгуанина, 5-метиламинометилурацила, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацила, бетаГО-маннозилквеозина, 5'-метоксикарбоксиметилурацила, 5-метоксиурацила, 5-метоксицитозина, 2-метилтио-Ж-изопентениладенина, урацилоксиуксусной кислоты (ν), бутоксозина, псевдоурацила, квеозина, 2-тиоцитозина, 5-метилтиоурацила, 2-тиоурацила, 4-тиоурацила, 5-метилурацила, метилового эфира урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацилоксиуксусной кислоты (ν), 5- 3 026309 метилтиоурацила, 3-(3-амино-3-И-карбоксипропил)уридина (асрЗИ) и 2,6-диаминопурина.
В одном варианте осуществления этот модулятор содержит по меньшей мере одну модифицированную сахарную часть.
В одном варианте осуществления связывание этого модулятора с лигандом СЬЕС-2 создает суицидное положение в лиганде СЬЕС-2, разрушая посредством этого вторичную структуру этого лиганда СЬЕС-2 и приводя к усиленной деструкции этого нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 нуклеазами.
В одном варианте осуществления связывание этого модулятора с комплексом лиганд СЬЕС-2СЬЕС-2 уменьшает или элиминирует связывание лиганда СЬЕС-2 с СЬЕС-2.
В другом аспекте обеспечен способ модуляции активности лиганда СЬЕС-2.
В одном варианте осуществления этот нуклеиново-кислотный лиганд специфически связывает СЬЕС-2 и ингибирует СЬЕС-2-опосредуемые нарушения. В одном варианте осуществления этот лиганд ингибирует способность СЬЕС-2 опосредовать агрегацию тромбоцитов. В одном варианте осуществления этот лиганд ингибирует способность СЬЕС-2 опосредовать активацию и секрецию тромбоцитов. В одном варианте осуществления этот лиганд ингибирует способность СЬЕС-2 распространять образование тромбов. В одном варианте осуществления этот лиганд ингибирует способность СЬЕС-2 взаимодействовать с эндогенным белком подопланином. В одном варианте осуществления этот лиганд ингибирует способность СЬЕС-2 взаимодействовать с опухолевыми клетками. В одном варианте осуществления этот лиганд ингибирует способность СЬЕС-2 связывать опухолевые клетки через подопланин и аттрагировать тромбоциты к участкам опухоли. В одном варианте осуществления этот лиганд ингибирует способность СЬЕС-2 взаимодействовать с опухолевыми клетками, ингибируя посредством этого метастазирование. В одном варианте осуществления этот лиганд ингибирует способность СЬЕС-2 взаимодействовать с опухолевыми клетками, уменьшая посредством этого способность опухолевых клеток высвобождать факторы роста. В одном варианте осуществления этот лиганд ингибирует способность СЬЕС-2 взаимодействовать с Вирусом Иммунодефицита Человека (ВИЧ). В одном варианте осуществления этот лиганд ингибирует способность СЬЕС-2 облегчать распространение (диссеминацию) ВИЧ. В одном варианте осуществления этот лиганд ингибирует способность опосредуемой передачей сигнала СЬЕС-2 воспалительной реакции, продуцирования цитокинов, взаимодействия тромбоцит-моноцит и адгезии тромбоцитов.
В одном варианте осуществления обеспечен способ модуляции активности нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 введением модулятора лиганда СЬЕС-2 хозяину, которому был введен нуклеиновокислотный лиганд СЬЕС-2. В одном варианте осуществления этот модулятор может быть олигонуклеотидным модулятором или его производным, и в некоторых вариантах осуществления, он является комплементарным части нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2.
В дополнительном аспекте обеспечен способ регуляции функции СЬЕС-2 с использованием лиганда СЬЕС-2.
В одном варианте осуществления способ регуляции функции СЬЕС-2 предусматривает введение хозяину терапевтически эффективного количества лиганда СЬЕС-2. В другом варианте осуществления этот способ дополнительно предусматривает введение модулятора лиганда СЬЕС-2 хозяину, которому ранее был введен лиганд СЬЕС-2.
В другом аспекте обеспечен способ лечения или облегчения СЬЕС-2-опосредованного заболевания или нарушения.
В одном варианте осуществления этот способ предусматривает введение хозяину, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества лиганда СЬЕС-2, который связывается с СЬЕС-2. В одном варианте осуществления этот хозяин диагностирован как имеющий опосредуемой тромбоцитами нарушение.
В одном варианте осуществления это заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из сердечно-сосудистых нарушений, церебрально-васкулярных нарушений, нарушений периферических сосудов, острого коронарного синдрома, связанных с диабетом нарушений и рака.
В одном варианте осуществления этим церебрально-васкулярным нарушением является тромбоз, тромбоэмболия или приступ транзиторной ишемии (ΤΙΑ). В другом варианте осуществления острый коронарный синдром обусловлен коронарным тромбозом, нестабильной стенокардией или инфарктом миокарда. Еще в одном варианте осуществления связанным с диабетом нарушением является диабетическая ретинопатия, диабетическая васкулопатия, атеросклероз, ишемический инсульт, заболевание периферических сосудов, острое повреждение почки или хроническая почечная недостаточность. В одном варианте осуществления рак выбран из рака легкого, рака молочной железы, рака предстательной железы, тестикулярного рака, рака поджелудочной железы, рака головного мозга, рака костей и рака печени.
В одном варианте осуществления этот лиганд СЬЕС-2 вводят парентеральным введением, внутривенным введением, внутрикожной доставкой, интраартикулярной доставкой, внутрисуставной доставкой, внутриоболочечной, внутрианртериальной доставкой, интракардиальной доставкой, внутримышечной доставкой, подкожной доставкой, интраорбитальной доставкой, интракапсулярной доставкой, интраспинальной доставкой, внутригрудинной доставкой, местной доставкой, доставкой с использованием трансдермального пластыря, ректальной доставкой, трансбуккальной доставкой, доставкой через влагалищный или уретральный суппозиторий, внутрибрюшинной доставкой, чрескожной доставкой, достав- 4 026309 кой через назальный спрей, доставкой через хирургический имплантат, доставкой с использованием хирургической кисточки для внутренних органов, доставкой через инфузионный насос или доставкой через катетер.
В другом аспекте обеспечен способ лечения хозяина, нуждающегося в этом, введением лиганда СЬЕС-2, где этот лиганд СЬЕС-2 регулирует функцию тромбоцитов.
В одном варианте осуществления вводят терапевтически эффективную дозу СЬЕС-2.
В одном варианте осуществления эта терапевтически эффективная доза уменьшает или ингибирует адгезию и/или агрегацию и/или секрецию тромбоцитов.
В одном аспекте обеспечена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество нуклеиново-кислотного лиганда, который связывает СЬЕС-2.
В одном аспекте обеспечена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество модулятора, где этот модулятор обращает активность нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2, который связывает СЬЕС-2.
В одном варианте осуществления эта фармацевтическая композиция содержит лиганд СЬЕС-2 и фармацевтически приемлемые эксципиенты. В другом варианте осуществления эта фармацевтическая композиция является жидкостью, подходящей для внутривенной инъекции. Еще в одном варианте осуществления эта фармацевтическая композиция является жидкостью или дисперсией для подкожного введения.
В одном аспекте, обеспечен набор, содержащий терапевтически эффективное количество нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 и/или модулятора, который регулирует активность нуклеиновокислотного лиганда СЬЕС-2.
В одном варианте осуществления этот набор содержит лиганд СЬЕС-2. В другом варианте осуществления этот набор содержит модулятор лиганда СЬЕС-2. Еще в одном варианте осуществления этот набор содержит как лиганд СЬЕС-2, так и модулятор для лиганда СЬЕС-2.
Способы, фармацевтические композиции и применения нуклеиново-кислотных лигандов, описанные здесь, также обеспечены в качестве модулируемых терапевтических веществ для применения в нарушениях или схемах лечения, требующих антитромбоцитарной или антитромботической терапий. В некоторых вариантах осуществления, этим лечением является хирургическое вмешательство, включающее в себя чрескожные введения. Эти способы могут включать в себя введение нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 хозяину, нуждающемуся в этом, где этот хозяин страдает, или находится при риске этого страдания, от окклюзионного тромботического заболевания или нарушения коронарной, церебральной или периферической сосудистой системы. Дополнительно, обеспечены фармацевтические композиции, в которых нуклеиново-кислотный лиганд или его модулятор находятся в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Композиции, содержащие этот модулятор, могут быть сконструированы для введения хозяину, которому вводили нуклеиново-кислотный лиганд, для возможности модуляции активности этого лиганда и, следовательно, регуляции коагуляционного состояния хозяина при риске кровотечения.
В одном аспекте, обеспечен способ определения, активирует или ингибирует лиганд СЬЕС-2 функцию СЬЕС-2. В одном варианте осуществления функцией СЬЕС-2 является СЬЕС-2-зависимая или СЬЕС-2-опосредованная агрегация тромбоцитов. В другом варианте осуществления обеспечен способ определения, активирует ли лиганд СЬЕС-2 СЬЕС-2-зависимую агрегацию тромбоцитов. Еще в одном варианте осуществления этот способ выполняют ίη νίΐτο.
В одном варианте осуществления этот способ предусматривает:
(a) смешивание лиганда СЬЕС-2 с пробой крови для приготовления обработанной пробы крови;
(b) контактирование этой обработанной пробы крови с вспомогательной молекулой (молекулойфасилитатором);
(c) измерение образования агрегатов тромбоцитов после этого контактирования; и (6) сравнение степени образования агрегатов тромбоцитов, детектируемого в стадии (с), со степенью образования агрегатов тромбоцитов, полученной с контрольной пробой крови без использования лиганда СЬЕС-2 для связывания СЬЕС-2 и ингибирования его взаимодействия с вспомогательной молекулой (молекулой-фасилитатором).
В одном варианте осуществления эта вспомогательная молекула (молекула-фасилитатор) иммобилизована на твердом носителе.
В одном варианте осуществления этой вспомогательной молекулой (молекулой-фасилитатором) является активатор СЬЕС-2. В другом варианте осуществления этой вспомогательной молекулой (молекулой-фасилитатором) является родоцитин. Еще в одном варианте осуществления этой вспомогательной молекулой (молекулой-фасилитатором) является подопланин.
В одном варианте осуществления при использовании в комбинации с активатором СЬЕС-2, этой вспомогательной молекулой (молекулой-фасилитатором) является растворимый коллаген. В другом варианте осуществления этим растворимым коллагеном является коллаген типа I, II или III. Еще в одном варианте осуществления этот способ дополнительно предусматривает добавление активатора СЬЕС-2 в пробу крови. Еще в одном варианте осуществления этим активатором СЬЕС-2 является родоцитин.
- 5 026309
В одном варианте осуществления этой пробой крови является цельная кровь. В другом варианте осуществления этой пробой крови является обогащенная тромбоцитами плазма (РКР). Еще в одном варианте осуществления этой пробой крови являются промытые тромбоциты.
В одном варианте осуществления лигандом СЬЕС-2 является нуклеиново-кислотный лиганд (содержащий нуклеиновую кислоту лиганд). В другом варианте осуществления этот нуклеиново-кислотный лиганд СЬЕС-2 включает в себя §ЕО ГО N0:8 или §ЕЦ ГО N0:9 или последовательность, произведенную из §ЕО ГО N0:8 или §ЕО ГО N0:9.
Описание фигур
Фиг. 1 является диаграммой процесса селекции (отбора) нуклеиново-кислотного лиганда §ЕЬЕХ.
Фиг. 2 показывает условия для Раундов 1-10 селекции §е12.
Фиг. 3 показывает обогащение связывания селекции лиганда СЬЕС-2.
Фиг. 4 показывает кривые связывания отобранных нуклеиново-кислотных лигандов СЬЕС-2.
Фиг. 5 иллюстрирует предсказанные вторичные структуры §2-20 Т10 и КВ 587.
Фиг. 6 показывает конкретные условия для дегенеративной селекции.
Фиг. 7 иллюстрирует консервацию последовательности дегенеративной селекции §2-20.
Фиг. 8 показывает районы, комплементарные между лигандом СЬЕС-2 и модуляторами.
Фиг. 9А-В показывают графики индуцированной родоцитином агрегации \УР тромбоцитов в присутствии лиганда СЬЕС-2.
Фиг. 10А-С показывают диаграммы индуцированной родоцитином агрегации тромбоцитов в присутствии лигандов СЬЕС-2 или в присутствии модуляторов лигандов СЬЕС-2.
Фиг. 11А-В показывают диаграммы индуцированной родоцитином экспрессии Р-селектина человека.
Фиг. 12А-В показывают результаты анализов адгезии тромбоцитов на основе протекания ίη νίίτο.
Подробное описание
Нуклеиново-кислотные лиганды (состоящие из нуклеиновых кислот лиганды), также называемые аптамерами, являются не встречающимися в природе, одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, которые принимают специфическую трехмерную форму, которая позволяет связывание с желаемой молекулой-мишенью. Что касается лигандов, которые связываются с пептидами и белками, ассоциация лиганда с его белком-мишенью может приводить к ингибированию функции этого белка, подобно тому, как связывание моноклонального антитела с его белком-мишенью может приводить к ингибированию функции этого белка. Одним уникальным признаком нуклеиново-кислотных лигандов является способность генерировать активные регуляторные агенты к ним в форме комплементарных олигонуклеотидов, которые гибридизуются с этим лигандом спариванием оснований Уотсона-Крика. Эти активные регуляторные агенты фундаментально изменяют активную структуру лигандов и, следовательно, нейтрализуют их фармакологическую активность. Данное изобретение обеспечивает соединения, композиции и способы, которые включают в себя нуклеиново-кислотные лиганды к СЬЕС-2 для опосредования биологической функции и взаимодействия СЬЕС-2. Дополнительно обеспечены модуляторы, которые могут регулировать активность этих нуклеиново-кислотных лигандов СЬЕС-2.
Определения
В данном контексте будут применяться следующие определения, если не указано иное.
Термин приблизительно, при использовании здесь для ссылки на измеряемую величину, такую как величина массы, времени, дозы и т.д., предназначен для включения вариаций ±20% или ± 10%, ± 5%, ± 1% или ± 0,1% от указанной величины, и как таковые, такие вариации пригодны для выполнения описанного способа.
Нуклеиново-кислотный лиганд, который может также называться здесь лигандом или аптамером, является нуклеиновой кислотой, которая может образовывать третичную структуру и которая взаимодействует с молекулой-мишенью, нуклеиново-кислотный лиганд СЬЕС-2 или лиганд СЬЕС-2 или анти-СЬЕС-2-лиганд или нуклеиново-кислотный лиганд СЬЕС-2 обозначает лиганд или аптамер, который специфически связывается с СЬЕС-2 или его фрагментом. Этот фрагмент СЬЕС-2 может быть растворимым фрагментом, таким как внеклеточный домен (ЕСЭ) или его фрагмент. Альтернативно, лиганд СЬЕС-2 связывает молекулу СЬЕС-2, которая экспрессируется на поверхности клетки или обнаруживается ассоциированной с тромбоцитом. Белок СЬЕС-2 может быть эндогенно экспрессируемым на клетке или экспрессирован посредством рекомбинантных способов. Эти термины относятся к олигонуклеотидам, имеющим районы специфического связывания, которые способны образовывать комплексы с рассматриваемой молекулой-мишенью в физиологическом окружении. Аффинность связывания лиганда с молекулой-мишенью определяется в терминах константы диссоциации (Кб) взаимодействия между этим лигандом и молекулой-мишенью. Обычно, Кб этого лиганда в отношении этого лиганда находится между приблизительно 0,1 нМ и приблизительно 100 нМ. Специфичность этого связывания определяется в терминах сравнительной константы диссоциации этого лиганда в отношении мишени в сравнении с константой диссоциации в отношении этого лиганда и других материалов в этом окружении или вообще неродственных молекул. Обычно, Кб для этого лиганда относительно этой мишени будет в 10-раз, 50- 6 026309 раз, 100-раз или 200-раз меньшей, чем Κά относительно неродственного материала или сопутствующего материала в данном окружении.
В применении здесь, в контексте гомологичных районов, по существу гомологичная последовательность является последовательностью, которая образует одну и ту же вторичную структуру спариванием Уотсона-Крика в конкретной молекуле. В некоторых вариантах осуществления, последовательности являются по существу гомологичными, если они имеют по меньшей мере 80%, 85% или большую идентичность последовательности, такую как приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности относительно указанного лиганда. Для большей ясности, такие по существу гомологичные последовательности могут быть также описаны как последовательности, имеющие по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичность последовательности относительно конкретной последовательности, или эта последовательность может быть приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной конкретной последовательности лиганда. В контексте нуклеиново-кислотного лиганда указанной длины, такой как 50 или менее нуклеотидов, гомологичная последовательность может быть обнаружена в любом районе, который делает возможным связывание Уотсона-Крика с образованием одной и той же вторичной структуры, независимо от идентичности последовательности в этом конкретном районе.
Список Последовательностей, поданный с этой заявкой, обеспечивает только первичные последовательности (обеспечивает последовательность нуклеотидов без конкретных модификаций). Понятно, что каждая из последовательностей в этом описании и в представленном Списке Последовательностей может иметь любую комбинацию модификаций, как описано здесь. Последовательности, имеющие модификации, описанные в табл. 1-4, ассоциированы, каждая, с конкретным названием клона или названием, которое обеспечивает определенное описание последовательности нуклеиновой кислоты с ее конкретно определенными модификациями.
Пара лиганд-модулятор или лиганд-модуляторная пара означает включение указанного лиганда в молекулу-мишень, и лиганд-модулятор, который изменяет вторичную и/или третичную структуру этого лиганда таким образом, что взаимодействие этого лиганда с его мишенью модулируется. Этот модулятор может быть олигонуклеотидом, комплементарным части этого лиганда. Этот модулятор может изменять конформацию этого лиганда для уменьшения способности связывания этого лиганда на 10100%, 20-100%, 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, или на любой процент в диапазоне между 10% и 100% при физиологических условиях ίη νίΐτο, ех νίνο или ίη νίνο.
Модулятор, антидот, регулятор или регуляторный агент относятся к любому фармацевтически приемлемому агенту, который может связывать лиганд или аптамер, как описано здесь, и модифицировать взаимодействие между этим лигандом и его молекулой-мишенью (например, модификацией структуры этого лиганда) желаемым образом.
Модулирование обозначает в данном контексте ослабление, увеличение или некоторое другое измеримое изменение активности.
Хозяином называют млекопитающее, и этот термин включает в себя человека и остальных млекопитающих. Примеры хозяина включают в себя, но не ограничиваются ими, мышей, крыс, хомячков, морских свинок, свиней, кроликов, кошек, собак, коз, лошадей, овец, коров и людей.
Фармацевтически приемлемые означает в данном контексте материалы, одобренные регулирующим агенством Федерального правительства или правительства штата, или перечисленные в Фармакопее США или других общепризнанных фармакопеях материалы, для применения в людях.
Фармацевтически эффективной дозой является доза, требуемая для предотвращения, ингибирования появления или лечения (ослабления симптома до некоторой степени) состояния заболевания. Эта фармацевтически эффективная доза зависит от типа заболевания, используемой композиции, способа введения, типа подвергаемого лечению млекопитающего, физических характеристик конкретного рассматриваемого млекопитающего, сопутствующего медикаментозного лечения и других факторов, которые будут известны квалифицированным в данной области специалистам. Обычно, вводят количество между 0,1 мг/кг и 100 мг/кг массы тела в день в зависимости от эффективности нуклеиново-кислотного лиганда и модулятора.
Термин стабилизированная молекула нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая менее легко деградируется ίη νίνο (например, посредством экзонуклеазы или эндонуклеазы) в сравнении с нестабилизированной молекулой нуклеиновой кислоты. Стабилизация может быть функцией длины и/или вторичной структуры и/или включения химических замен в сахарной или фосфатной частей олигонуклеотидного скелета. Стабилизация может быть получена регуляцией, например, вторичной структуры, которая может стабилизировать молекулу. Например, если З'-конец молекулы нуклеиновой кислоты комплементарен району слева, эта часть может укладываться обратно и образовывать структуру стебель-петля, которая стабилизирует эту молекулу.
Термины аффинность связывания и активность связывания относятся к тенденции молекулы лиганда связываться или не связываться с мишенью. Энергетика указанных взаимодействий является важной в активности связывания и в аффинности связывания, так как она определяет необходимые концентрации взаимодействующих партнеров, скорости, при которых эти партнеры способны ассоции- 7 026309 роваться, и относительные концентрации связанных и свободных молекул в растворе. Эта энергетика может характеризоваться, среди прочих путей, определением константы диссоциации, КД.
Лечение или обработка означает в данном контексте любое лечение заболевания в млекопитающем, в том числе: (а) защиту против этого заболевания, т.е. недопущение развития клинических симптомов; (Ь) ингибирование этого заболевания, т.е. задержку, устранение, уменьшение или супрессию развития клинических симптомов; и/или (с) облегчение этого заболевания, т.е. вызывание регресса клинических симптомов. Квалифицированным в данной области специалистам будет понятно, что в медицине человека не всегда можно отличить предотвращение и супрессию, поскольку эти первичные индуктивные событие или события могут быть неизвестными, латентными, или пациент еще не диагностирован хорошо после появления этого события или этих событий. Таким образом, в данном контексте термин профилактика предназначен для использования в качестве элемента лечения и включает в себя как предотвращение, так и супрессию, как определено здесь. Предполагается, что термин защита, в данном контексте включает в себя профилактику.
Термин эффективное количество обозначает дозу, достаточную для обеспечения лечения для подлежащего лечению нарушения или патологического состояния. Она будет варьироваться в зависимости от пациента, заболевания и проводимого лечения.
Термин вариант нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 включает в себя в данном контексте варианты, которые выполняют по существу ту же самую функцию, что и нуклеиново-кислотный лиганд СЬЕС-2, и содержат, по существу, ту же самую структуру.
СЬЕС-2
СЬЕС-2 является трансмембранным белком, экспрессируемым на поверхности клеток печени и нескольких гемопоэтических клеток, включающих в себя моноциты, дендритные клетки, нормальные клетки-киллеры (ΝΚ-клетки) и гранулоциты. Из гемопоэтических клеток и лакунарных эндотелиальных клеток печени белок СЬЕС-2 специфически экспрессируется в тромбоцитах и мегакариоцитарных клетках (Окнрап с1 а1., 2006; 1 νίτοί, 80:8951-8960). Было показано, что СЬЕС-2 опосредует активацию тромбоцитов через 8гс- и 8ук-киназу.
Первоначально были идентифицированы только экзогенные лиганды для СЬЕС-2. Они включали в себя змеиный яд, родоцитин (аггретин) и ВИЧ-1, оба из которых, как было показано, активируют тромбоциты и посредством этого активирует агрегацию тромбоцитов. СЬЕС-2-недостаточность ассоциирована с увеличенными периодами кровотечения и защитой от образования окклюзивного артериального тромба (Мау с1 а1., 2009, В1ооД, 114:34 64-3472). Мау с1 а1. показали также, что лечение анти-СЬЕС-2антителом мышей приводит к полной и высокоспецифической потере СЬЕС-2 в циркулирующих тромбоцитах в течение нескольких дней, сопровождающейся тяжелыми дефектами в агрегации тромбоцитов.
Одним эндогенным лигандом СЬЕС-2,идентифицированным недавно О/аО с1 а1. (2010; 1. ТЬгош Наето8., 7:191-194), является подопланин. Подопланин является сиалогликопротеином, предположительно участвующим в индуцируемой опухолями агрегации тромбоцитов и метастазировании опухоли. Подопланин является высокоэкспрессируемым в лимфатическом эндотелии и в подоцитах почки. Экспрессия подопланина не детектируется в эндотелии сосудов. Взаимодействие подопланина с СЬЕС-2 является важным для разделения крови и лимфатических сосудов во время развития. Исследования показали, что как подопланин-, так и СЬЕС-2-недостаточные мыши обнаруживают фенотип кровотечения и атипичные сосудистые связи (БсЬасЬт V., е1 а1., 2003, ЕМВО, 1. 22:3546-3556; διιζιιΐά-ΐηοικ К. е1 а1., 2010, 1. Βίο1. СЬеш, 285:24494-24507). Исследования предполагают, что СЬЕС-2 может играть роль в метастазировании гемопоэтических опухолей, так как этот рецептор опосредует индуцированную опухолевыми клетками активацию тромбоцитов, процесс, о котором известно, что он значимо стимулирует распространение опухолевых клеток (Нопп е1 а1., 1992, Сапсег Ме1а81а818 Кеу, 11:325-351; №е8\уапФ е1 а1., Сапсег Ке8, 1999, 59:1295-1300).
Аминокислотная последовательность полноразмерного белка СЬЕС-2 (ОеиВапк Ассеззюп Ио. ААР3 777) представлена ниже
СЬЕС-2 (81Т) ГО N0:1)
МОСЕТСУХТЬ ΝΙΚΤΚΚΡΑΒΙ ЭТСЙА3351М КУМАЙТЫЛЬ СУСЖ^’йЪ'УА ЬОТИЗУКОНК 61 УЬОПЕКЕЦКТ СТЬОСЦАККР СрууУКЗеЕЬ КОТРКОЯКОЗ РСОТМКЯУУО ОЗСУСРРКНЫ
121 ЬТИББВКОТС ТПМИАТ’ШК! ЦИКИТУВУТК ΑΚΤΗ£, 1ККУС ЬВКОКЗНВУН КМЕПСЩ/ТВЕ 181 НМРЕРЦЕОЯК СНМЫСАУРИН СКМНРТРСЕИ КНУЬМСЕККА СИТКУООЬР
Внеклеточный домен (ЕСИ) СЬЕС-2 включает в себя приблизительно аминокислоты 58-229 и представлен ниже
СЬЕС-2 (О1п58-Рго229) (81Т) ГО N0:2)
5 8 61 ΪΟΟΏΞΝΕΝΚΤ аТЬОСЬАЕЕК СйУУУКСЬ’ЕТ КОТЕКОНКСЗ РСОТНЖУУС
121. ЬТОЕЕ5К£УС ΤΏΜΝΑΊΊΧΚΪ ΟίΐκΜίνΕΥίκ Ι,5ΚςΚ3ΝΕ\Α-ί К Е ОС 3 V Σ £ϊ Е
3.81. ММГЕЕЬЕОСЕ СКИНРТРСЕЫ КНУЕМСЕККА СМТКТООЪР
Внеклеточный домен (ЕСИ) СЬЕС-2, слитый с Ν-концевой меткой Н1810 (8ЕО ГО N0:3), который
- 8 026309 используется для селекции (отбора) описанных здесь нуклеиново-кислотных лигандов, включает в себя аминокислоты 58-229 и представлен ниже ннннннннннокмуьоцаяЕМктстцрогАхкрсоууткйеЕькетркснксарсотиикуусц.ясуоррннмьте
ЕЕЗК0УСТиТ'а<1А''П.7:К1'Ь'Ж!>?.1:,7ЕУ1КАКТН1.1Р.;«СЬ5Е2КЗ?5Е;‘,'Икмн;цс31/1Ёг:ЦМг'Ег'1-;ЕПСКеЬЛ'й1еАУ5,Л ΝΟΚΜΕ РТ?С ΕΚΚΗϊΔϊ·ΐα’:ΪΡ.ΚΑ.ΟΙάΓΓΚνΓίΟΤ, Р
Развитие нуклеиново-кислотных лигандов СЬЕС-2
Нуклеиново-кислотные лиганды, которые специфически связывают белок СЬЕС-2, идентифицировали с использованием способа 8ЕЬЕХ. Лиганды, которые первоначально получали посредством 8ЕЬЕХ, затем полностью характеризовали для понимания свойств лигандов СЬЕС-2. Такая характеристика включала в себя секвенирование, сопоставление последовательностей для определения консервативных последовательностей, предсказание (прогнозирование) вторичной структуры и укорочения и анализ мутаций для идентификации районов лигандов, наиболее критических для желаемой функции специфического связывания и ингибирования СЬЕС-2.
8ЕЬЕХ обозначает Системную Эволюцию лигандов посредством Экспоненциального Обогащения. Этот способ делает возможной эволюцию ίη νίΐτο молекул нуклеиновых кислот с высокоспецифическим связыванием молекул-мишеней. Этот 8ЕЬЕХ-способ описан, например, в патентах США с номерами 5475096 и 5270163 (см. также АО 91/19813).
В его наиболее базовой форме этот способ 8ЕЬЕХ может быть определен следующими сериями стадий:
1) готовят кандидатную смесь нуклеиновых кислот с различающейся последовательностью. Эта кандидатная смесь обычно включает в себя районы фиксированных последовательностей (т.е., каждый из членов этой кандидатной смеси содержит одни и те же последовательности в одном и том же местоположении) и районы рандомизированных последовательностей. Эти фиксированные районы последовательностей отбирают либо: (а) для содействия в стадиях амплификации, описанных ниже, (Ь) для имитации последовательности, о которой известно, что она связывается с мишенью, или (с) для увеличения концентрации конкретной структурной аранжировки нуклеиновых кислот в этой кандидатной смеси. Эти рандомизированные последовательности могут быть полностью рандомизированными (т.е. вероятность нахождения основания в любом положении равна одному к четырем) или только частично рандомизированными (например, вероятность нахождения основания в любом местоположении может быть выбрана на любом уровне между 0 и 100%).
2) Эту кандидатную смесь контактируют с выбранной мишенью при условиях, благоприятных для связывания между мишенью и членами кандидатной смеси. При этих условиях, взаимодействие между мишенью и нуклеиновыми кислотами этой кандидатной смеси могут рассматриваться как образование комплексов нуклеиновая кислота-мишень между этой мишенью и нуклеиновыми кислотами, имеющими наиболее сильную аффинность в отношении этой мишени.
3) Эти нуклеиновые кислоты с наивысшей аффинностью в отношении мишени, отделяют от нуклеиновых кислот с меньшей аффинностью в отношении этой мишени. Поскольку только крайне малое число последовательностей (и, возможно, только одна молекула нуклеиновой кислоты), соответствующих нуклеиновым кислотам с наивысшей аффинностью, существуют в этой кандидатной смеси, желательно обычно установить критерии разделения таким образом, что значительное число нуклеиновых кислот в кандидатной смеси (приблизительно 5-50%) сохраняются во время разделения.
4) Нуклеиновые кислоты, отобранные во время разделения как имеющие относительно более высокую аффинность в отношении мишени, амплифицируют затем для создания новой кандидатной смеси, которая обогащена нуклеиновыми кислотами, имеющими относительно более высокую аффинность в отношении этой мишени.
5) В результате повторения стадий разделения и амплификации, описанных выше, новообразованная кандидатная смесь содержит менее и менее слабо связывающих последовательностей, и средняя степень аффинности этих нуклеиновых кислот в отношении мишени будет обычно увеличиваться. Способ 8ЕЬЕХ дает кандидатную смесь, содержащую одну или малое число уникальных нуклеиновых кислот, представляющих те последовательности нуклеиновых кислот из исходной кандидатной смеси, которые укладываются в специфическую вторичную и третичную структуру, делающую возможной взаимодействие наивысшей аффинности с молекулой-мишенью.
Нуклеиново-кислотные лиганды, специфические в отношении СЬЕС-2, могут быть генерированы выполнением 8ЕЬЕХ против коротких пептидов, которые представляют внеклеточный домен этой молекулы, с использованием способов 8ЕЬЕХ, как описано, например, в патенте США № 7087735. Альтернативно, нуклеиново-кислотные лиганды, специфические в отношении СЬЕС-2, могут быть выделены выполнением 8ЕЬЕХ на интактных тромбоцитах, мембранных фракциях тромбоцитов, обогащенных в отношении этого белка, на очищенном СЬЕС-2 или на клеточных линиях, специфически сверхэкспрессирующих рецептор СЬЕС-2, с использованием способов 8ЕЬЕХ, описанных, например, в патенте США № 6730482.
Дополнительно, способ 8ЕЬЕХ может быть направлен на выделение специфических нуклеиново- 9 026309 кислотных лигандов СЬЕС-2 с использованием конкурентных схем элюции аффинности, таких как схемы, описанные в патенте США № 5780228.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиново-кислотный лиганд СЬЕС-2 связывается с рецептором СЬЕС-2 при физиологических условиях. Физиологическими условиями обычно называют уровень солей и рН раствора. Ιη νίίτο, физиологические условия обычно копируются в буфере, включающем в себя 150 мМ ИаС1, 2 мМ СаС12, 20 мМ НЕРЕ8, при рН приблизительно 7,4. В некоторых вариантах осуществления, используют нативные, обычно неактивированные тромбоциты, описанные выше, для скрининга популяции нуклеиново-кислотных лигандов и обеспечивают обогащенную популяцию, которая содержит лиганды, направленные на белки, обнаруживаемые на тромбоцитах. Затем эту обогащенную популяцию используют либо против стабильной клеточной линии, сверхэкспрессирующей желаемый рецептор СЬЕС-2, либо против клеточной линии, которая была транзиторно трансфицирована этим белком. Вторичный скрининг может выполняться либо с использованием модифицированной процедуры §ЕЬЕХ на выделенных рецепторах из этих клеток или на целых клетках, либо посредством конкурентных исследований лиганда или идентификации действий на внутриклеточных путях передачи сигнала.
Лиганды могут быть также подвергнуты скринингу на ингибирование агрегации тромбоцитов в анализах функции тромбоцитов, таких как Агрегометрия коэффициента пропускания света, выполняемая в богатой тромбоцитами плазме или препаратах промытых тромбоцитов, или Импеданс Агрегометрия, выполняемая в обогащенной тромбоцитами плазме или цельной крови или промытых тромбоцитах с активацией тромбоцитов родоцитином с последующим окрашиванием маркерами активации тромбоцитов и агрегации, включающими в себя анти-СИ62Р (Р-Селектин), анти-РАС1 (активированный СРПЫНа) или анти-фибриноген. Специфичность конкретного нуклеиново-кислотного лиганда в отношении СЬЕС-2 может дополнительно распознаваться по способности этого лиганда блокировать события внутриклеточной передачи сигнала, запускаемые известными агонистами данного рецептора. Специфичность конкретного нуклеиново-кислотного лиганда в отношении СЬЕС-2 может дополнительно распознаваться по отсутствию действия на агрегацию тромбоцитов при агрегации, запускаемой агонистом, который активирует рецептор, другой чем СЬЕС-2.
Лиганд, описанный здесь, состоит из последовательности выделенной нуклеиновой кислоты, которая может быть ДНК или РНК и которая может быть синтезирована с использованием модифицированных рибо- или дезоксирибонуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления, описанных здесь, эта последовательность нуклеиновых кислот записана в виде РНК-последовательности. Подобным образом, в некоторых вариантах осуществления, описанных здесь, в которых нуклеиново-кислотный лиганд первоначально идентифицирован в виде ДНК-молекулы, эта последовательность нуклеиновокислотного лиганда записана в виде ДНК-молекулы. Понятно, что последовательность нуклеотидов, представленная в форме текста как ДНК-последовательность, неотъемлемо обеспечивает описание соответствующей РНК-последовательности, в которой тимины (Т) в этой ДНК-последовательности заменены уридинами (И) с получением соответствующей РНК-последовательности нуклеотидов. Подобным образом, понятно, что последовательность нуклеотидов, представленная в форме текста как РНКпоследовательность, неотъемлемо обеспечивает описание соответствующей ДНК-последовательности, в которой уридины (И) в этой РНК-последовательности заменены тиминами (Т) с получением соответствующей ДНК-последовательности.
Аффинность связывания лигандов в отношении мишени может быть определена в виде Кй. Величина этой константы диссоциации может быть определена непосредственно при помощи хорошо известных способов, таких как способы связывания радиолиганда, описанные в примере 1.
В некоторых вариантах осуществления Кй связывания этого лиганда с СЬЕС-2 может находиться в диапазоне от приблизительно 1 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 10 пМ до приблизительно 50 нМ или от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 20 нМ. В других вариантах осуществления, Кй связывания лиганда с СЬЕС-2 является по меньшей мере в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз или 10 раз меньшей, чем Кй связывания этого лиганда с неродственным белком или другим сопутствующим материалом в окружающей среде. Этим неродственным белком мог бы быть также белок, имеющий мотив, родственный мотивам, присутствующим в СЬЕС-2, таким как другой рецептор активации или адгезии тромбоцитов.
Как будет обсуждаться более подробно ниже, активность связывания этого лиганда, полученная и идентифицированная при помощи способа 8ЕЬЕХ, может быть дополнительно модифицирована или усилена с использованием большого разнообразия способов генной инженерии.
В некоторых вариантах осуществления этот лиганд взаимодействует с внеклеточным доменом СЬЕС-2. Этот лиганд может препятствовать связыванию эндогенных лигандов с рецептором СЬЕС-2. В некоторых вариантах осуществления, этот лиганд может ингибировать внутриклеточную передачу сигнала через рецептор СЬЕС-2. Этот лиганд может также стабилизировать или разрушать конформацию этого рецептора, например, димерную конформацию, так что этот рецептор имеет уменьшенную способность взаимодействовать с эндогенным лигандом, таким как подопланин. В некоторых вариантах осуществления этот лиганд может влиять на агрегацию тромбоцитов и/или активацию и/или адгезию тромбоцитов и/или секрецию тромбоцитов.
- 10 026309
Описанные здесь нуклеиново-кислотные лиганды могут функционировать в качестве активно обратимых агентов. Они являются агентами или фармацевтически активными молекулами, которые, после введения пациенту, могут непосредственно регулироваться введением второго агента. Как описано более подробно ниже, этот второй агент, называемый здесь модулятором, может выключать или регулировать фармакологическую активность этого лиганда. В результате, фармакологическая активность этого лиганда может обращаться другими средствами, чем, например, клиренс лекарственного средства.
Описанные здесь лиганды СЬЕС-2 являются предпочтительно нуклеиново-кислотными лигандами СЬЕС-2, которые специфически связывают внеклеточный домен (ЕСЭ) (аминокислотные остатки О1п58Рго230; §ЕЦ ГО N0:2). Лиганды СЬЕС-2 отбирали с использованием способа §ЕЬЕХ, описанного более подробно ниже и в примере 1, затем модифицированы для увеличения стабильности, аффинности в отношении СЬЕС-2 и/или способности регулировать активность СЬЕС-2.
Лиганды, выделенные в соответствии с описанными здесь способами, представлены ниже в табл. 12, приведенных здесь в примере 2.
Как описано здесь, аптамеры, которые связывают СЬЕС-2, выделяли и секвенировали, как описано в примерах 1-2, что привело к идентификации 20 уникальных последовательностей. Один клон, §2-20, идентифицировали как ингибитор высокой аффинности СЬЕС-2-зависимой агрегации тромбоцитов. Этот клон характеризовали дополнительно генерированием укороченных и/или мутированных версий §ЕЬЕХотобранной последовательности, как описано в примерах 3-5. Анализ вторичной структуры клона §2-20 (§ЕЦ ГО N0:8 или §ЕЦ ГО N0:9), использующий программу, доступную в шГо16-сервере (шГоМ.ЪюшГо.гркеби), предсказал консенсусную структуру, в которой лиганд (аптамер) имеет первый стебель с длиной 6 п.н., но данные показывают, что длина этого первого стебля может находиться в диапазоне от 5 до 10 п.н. и сохранять высокую аффинность в отношении СЬЕС-2. Таким образом, этот первый стебель аптамера может находиться в диапазоне от приблизительно 3 п.н. до приблизительно 15 п.н. или от приблизительно 4 п.н. до приблизительно 12 п.н., или от приблизительно 5 п.н. до приблизительно 10 п. н..
Представляется, что этот первый стебель имеет длину приблизительно 3 п.н., 4 п.н., 5 п.н., 6 п.н., 7 п.н., 8 п.н., 9 п.н., 10 п.н., 11 п.н., 12 п.н., 13 п.н., 14 п.н. или 15 п.н. Предсказано также, что структура лиганда СЬЕС-2 имеет первую петлю, имеющую последовательность 5'-ОАС-3', хотя анализ мутаций показал толерантность мутаций во втором положении структуры этой первой петли. Таким образом, представляется, что эта первая петля лиганда СЬЕС-2 содержит консенсусную последовательность 5'СЖ.'-3'. в которой N может быть А, Т, С, О или и. 3' (справа) от этой первой петли находится второй стебель, имеющий длину приблизительно 4 п.н. с неодназначной парой нуклеотидов у основания этого стебля, хотя эта длина может варьироваться от приблизительно 3 п.н. до 7 п.н. или от 4 п.н. до приблизительно 6 п. н. 3' (справа) от этого второго стебля находится вторая структура петли с последовательностью 5'-СИСАиАии-3'. Анализ мутаций показал, что предпочтительной консенсусной последовательностью петли 2 может быть 5'-ΥυΥNNК.Υυ'-3', где Υ обозначает пиримидин, К обозначает пурин и N обозначает А, О, С, Т или и. Примерами укороченных лигандов СЬЕС-2, произведенных из §2-20, являются §2-20 Т10 (§1Т) ГО N0:22) и КВ587 (§1Т) ГО N0:24).
Определение консенсусной структуры облегчает конструирование лигандов для идентификации одного или нескольких нуклеотидов, которые могут увеличивать или уменьшать структуру и функцию лиганда. Это позволяет один или несколько раз эффективно идентифицировать и тестировать нуклеотидные добавления, делеции и замены для конкретных структур стебля и петли.
Знание консенсусной (канонической) вторичной структуры позволяет также избегать модификаций, которые могут быть вредными для структуры и функции лиганда. Например, некоторые модификации могут быть консервативными в этой консенсусной вторичной структуре, такие как 2'-фтор в районе стебля или петли. В этих случаях, удаление 2'-фтора из этих стебля или петли лиганда может приводить к потере активности.
В одном варианте осуществления этот лиганд является молекулой нуклеиновой кислоты, отобранной при помощи способа §ЕЬЕХ, и включает в себя укороченные и по существу гомологичные последовательности таких молекул. В применении здесь, в контексте гомологичных районов, по существу, гомологичная последовательность является последовательностью, которая образует ту же самую вторичную структуру спариванием оснований Уотсона-Крика в конкретной молекуле. В другом варианте осуществления лиганд, выбранный с использованием способа §ЕЬЕХ, отбирают из группы, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной или является идентичной §ЕЦ ГО N0:5-59, или последовательности, выбранной из группы, состоящей из §ЕЦ ГО N0:9-14, 16-22, 24, 33, 37, 38, 42, 44-48 и 55-57. Еще в одном варианте осуществления этот лиганд является лигандом, который имеет константу диссоциации менее приблизительно 10 нМ или менее приблизительно 5 нМ при измерении ίη νίΐτο в физиологических условиях.
Лиганды СЬЕС-2, описанные здесь, могут быть молекулами нуклеиновых кислот, которые содержат последовательность, которая отличается от последовательности §2-20 наличием в ней делеции в одном или нескольких положениях нуклеотидов в §ЕЦ ГО N0:7, §ЕЦ ГО N0:8 или §ЕЦ ГО N0:9. Лиганд
- 11 026309
СЬЕС-2 может быть получен введением любой комбинации одной или нескольких делеций в ЗЕЦ ГО N0:7, ЗЕЦ ГО N0:8 или ЗЕЦ ГО N0:9.
Лиганд СЬЕС-2, описываемый здесь, может содержать последовательность, генерированную укорочением (делецией) одного или нескольких нуклеотидов из 5'-конца и/или З'-конца ЗЕЦ ГО N0:7, ЗЕО ГО N0:8 или ЗЕО ГО N0:9. Например, лиганд СЬЕС-2 может быть последовательностью, генерированной делецией первых (5') 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов ЗЕЦ ГО N0:7, ЗЕО ГО N0:8 или ЗЕЦ ГО N0:9. В альтернативном варианте осуществления последние (3') 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов делетированы из ЗЕЦ ГО N0:7, ЗЕЦ ГО N0:8 или ЗЕЦ ГО N0:9. Еще в одном варианте осуществления нуклеотиды в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80, или любая их комбинация делетированы из последовательности ЗЕЦ ГО N0:7, ЗЕЦ ГО N0:8 или ЗЕЦ ГО N0:9. В другом варианте осуществления эта комбинация делетированных последовательностей состоит из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов.
В одном предпочтительном варианте осуществления этот лиганд СЬЕС-2 содержит последовательность, которая является по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичной ЗЕЦ ГО N0:24. В этом варианте осуществления лиганд СЬЕС-2 имеет длину в диапазоне от приблизительно 20 п.н. до 40 п.н., 25 п.н.-30 п.н. или приблизительно 27 п.н.-33 п.н. Этот лиганд СЬЕС-2 имеет вторичную структуру, содержащую первый стебель, первую петлю, содержащую 5'-ОКС-3' (где N обозначает О, А, Т, С или и), второй стебель и вторую петлю, содержащую 5'-СиСАиАии-3' или 5'-УиУННК.Уи-3' (где Υ обозначает пиримидин, К обозначает пурин и N обозначает А, О, С, Т или и). В контексте нуклеиново-кислотного лиганда ЗЕЦ ГО N0:24, гомологичная последовательность может быть обнаружена в любом районе, что позволяет посредством спаривания оснований Уотсона-Крика образовывать одну и ту же вторичную структуру, независимо от идентичности последовательности в этом конкретном районе.
Лиганд СЬЕС-2, описанный здесь, функционирует для ингибирования активности молекулы СЬЕС2 ίη νίΐΓΟ и/или ίη νίνο. Другими словами, добавление лиганда СЬЕС-2 может уменьшать активность СЬЕС-2 в указанном анализе, сконструированном для измерения активности СЬЕС-2. Например, лиганд СЬЕС-2 ингибирует функцию СЬЕС-2. Лиганд СЬЕС-2 может функционировать ингибированием СЬЕС2-зависимых функций тромбоцитов ίη νίΐτο и/или ίη νίνο.
Модуляторы нуклеиново-кислотных лигандов СЬЕС-2
В некоторых вариантах осуществления нуклеиново-кислотные лиганды к СЬЕС-2 являются обратимыми. В одном аспекте обеспечен способ модуляции активности лиганда к СЬЕС-2 введением модулятора лиганда к СЬЕС-2 хозяину, которому был введен нуклеиново-кислотный лиганд.
Модуляторы могут включать в себя любой фармацевтически приемлемый агент, который может связываться с нуклеиново-кислотным лигандом и модифицировать взаимодействие между этим лигандом и его молекулой-мишенью (например, модификацией структуры этого нуклеиново-кислотного лиганда) желаемым образом, или который деградирует, метаболизирует, расщепляет или иным образом химически изменяет нуклеиново-кислотный лиганд, для модификации его биологического действия.
Модуляторы нуклеиновых кислот лигандов СЬЕС-2, описанные здесь, сконструированы на основе стандартных правил спаривания оснований Уотсона-Крика (см. пример 6). Синтезируют модуляторные олигонуклеотиды варьирующей длины, чтобы иметь последовательности, комплементарные лиганду СЬЕС-2, который, как было показано, ингибирует функцию СЬЕС-2. Затем каждый из этих синтезированных модуляторных олигонуклеотидов тестируют на его способность связываться с лигандом СЬЕС-2, например, посредством анализа смещения подвижности в геле. Затем важно тестировать, способны или не способны модуляторы, которые связывают лиганд СЬЕС-2, также обращать активность лиганда СЬЕС-2. Как описано более подробно ниже и в Разделе Примеров, активность обращения конкретного модулятора может быть тестирована с использованием анализов, которые оценивают антитромбоцитарную активность лигандов СЬЕС-2. Анализы, выполняемые для идентификации лигандов СЬЕС-2, которые ингибируют СЬЕС-2-опосредуемую агрегацию тромбоцитов, выполняли также в присутствии модуляторов, которые, как было показано, связываются с лигандом СЬЕС-2. Модуляторы могут добавляться к смеси для анализа до, вместе или после добавления лиганда СЬЕС-2. Активность обращения модулятора может быть продемонстрирована, например, исследованиями агрегации промытых тромбоцитов, анализами индуцированной родоцитином или подопланином агрегации тромбоцитов в цельной крови, богатой тромбоцитами плазме или в препаратах промытых тромбоцитов, анализами проточной цитометрии, выполняемыми с родоцитином или подопланином, для оценивания экспрессии Р-селектина в присутствии лиганда СЬЕС-2, и ίη νίΐτο анализами адгезии тромбоцитов на основе протекания.
В одном предпочтительном варианте осуществления модулятором нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 является последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере частично комплементарна последовательности нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2. Как показано на фиг. 8 (и см. табл. 4), модуляторы лиганда СЬЕС-2 КВ587 конструировали для гибридизации с разными районами КВ587. КВ581, который комплементарен 16 основаниям 3' первичной последовательности КВ587, был эффективен в уменьшении связывания КВ587 с СЬЕС-2, как определено нейтрализацией ингибиторной
- 12 026309 активности лиганда СЬЕС-2 в анализах агрегации тромбоцитов и как определено анализами смещения подвижности в геле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, здесь обеспечен модулятор, который комплементарен району лиганда СЬЕС-2 или способен гибридизоваться с тем же самым районом лиганда СЬЕС-2. Вследствие этого, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2, включающим в себя петлю 2, стебель 2 и стебель 1, или его частью. В качестве одного конкретного примера, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом, соответствующим основаниям в положениях приблизительно 14-31 или 14-26 или 1631 или 18-31 или 21-31 или 16-26 или 16-29 лиганда СЬЕС-2 КВ587 (5>ЕО ГО N0:24). Кроме того, специфическое взаимодействие этого модулятора с лигандом СЬЕС-2 приводит к уменьшению связывания лиганда СЬЕС-2 с полипептидом СЬЕС-2. Кроме того, этот модулятор может ингибировать или обращать функцию белка-мишени СЬЕС-2 посредством лиганда СЬЕС-2.
В одном предпочтительном варианте осуществления этот модулятор нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 является нуклеиновой кислотой, которая является по меньшей мере частично комплементарной последовательности нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2. Как показано на фиг. 8 (и см. табл. 4), модуляторы лиганда КВ587 СЬЕС-2 сконструированы для гибридизации с различными районами КВ587. КВ582, который является комплементарным внутренним 16 основаниям первичной последовательности КВ587, был эффективным в уменьшении связывания КВ587 с СЬЕС-2, как определено нейтрализацией ингибиторной активности лиганда СЬЕС-2 в анализах агрегации тромбоцитов и как определено анализами смещения подвижности в геле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, здесь обеспечен модулятор, который комплементарен району лиганда СЬЕС-2 или способен гибридизоваться с тем же самым районом лиганда СЬЕС-2. Вследствие этого, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2, включающим в себя петлю 2, стебель 2 и часть стебля 1, или его частью. В качестве одного конкретного примера, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом, соответствующим основаниям в положениях приблизительно 14-31 или 14-29 или 14-27 или 16-29 или 16-27 или 19-29 или 21-31 или 21-29 лиганда СЬЕС-2 КВ587 (5>Е0 ГО N0:24). Кроме того, специфическое взаимодействие этого модулятора с лигандом СЬЕС2 приводит к уменьшению связывания лиганда СЬЕС-2 с полипептидом СЬЕС-2. Кроме того, этот модулятор может ингибировать или обращать функцию белка-мишени СЬЕС-2 посредством лиганда СЬЕС-2.
В одном предпочтительном варианте осуществления этот модулятор нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 является нуклеиновой кислотой, которая является по меньшей мере частично комплементарной последовательности нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2. Как показано на фиг. 8 (и см. табл. 4), модуляторы лиганда КВ587 СЬЕС-2 сконструированы для гибридизации с различными районами КВ587. КВ583, который является комплементарным внутренним 15 основаниям первичной последовательности КВ587, был эффективным в уменьшении связывания КВ587 с СЬЕС-2, как определено нейтрализацией ингибиторной активности лиганда СЬЕС-2 в анализах агрегации тромбоцитов и как определено анализами смещения подвижности в геле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления здесь обеспечен модулятор, который комплементарен району лиганда СЬЕС-2 или способен гибридизоваться с тем же самым районом лиганда СЬЕС-2. Вследствие этого, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2, включающим в себя петлю 1, стебель 2 и петлю 2, или его частью. В качестве одного конкретного примера модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом, соответствующим основаниям в положениях приблизительно 7-21 или 9-21 или 9-17 или 7-19 или 7-17 или 7-14 лиганда КВ587 СЬЕС-2 (5>Е0 ГО N0:24) лиганда КВ587 СЬЕС-2 (5>Е0 ГО N0:24). Кроме того, специфическое взаимодействие этого модулятора с лигандом СЬЕС-2 приводит к уменьшению связывания лиганда СЬЕС-2 с полипептидом СЬЕС-2. Кроме того, этот модулятор может ингибировать или обращать функцию белка-мишени СЬЕС-2 посредством лиганда СЬЕС-2.
В одном предпочтительном варианте осуществления этот модулятор нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 является нуклеиновой кислотой, которая является по меньшей мере частично комплементарной последовательности нуклеиново-кислотного лиганда КВ587 СЬЕС-2. Как показано на фиг. 8 (и см. табл. 4), модуляторы лиганда КВ587 СЬЕС-2 сконструированы для гибридизации с различными районами КВ587. КВ584, который является комплементарным внутренним 16 основаниям первичной последовательности КВ587, был эффективным в уменьшении связывания КВ587 с СЬЕС-2, как определено нейтрализацией ингибиторной активности лиганда СЬЕС-2 в анализах агрегации тромбоцитов и как определено анализами смещения подвижности в геле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, здесь обеспечен модулятор, который комплементарен или способен гибридизоваться с тем же самым районом лиганда СЬЕС-2. Вследствие этого, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2, включающим в себя часть стебля 1, петлю 1, стебель 2 и часть петли 2, или его частью. В качестве одного конкретного примера, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом, соответствующим основаниям в положениях приблизительно 1-21 или 1-19 или 1-14 или 4-14 или 4-19 или 4-21 или 6-21 или 6-14 лиганда СЬЕС-2 КВ587 (5>Е0 ГО N0:24). Кроме того, специфическое взаимодействие этого модулятора с лигандом СЬЕС-2 приводит к уменьшению связывания лиганда СЬЕС-2 с полипептидом СЬЕС-2. Кроме того, этот модулятор может
- 13 026309 ингибировать или обращать функцию белка-мишени СЬЕС-2 посредством лиганда СЬЕС-2.
В одном предпочтительном варианте осуществления этот модулятор нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 является нуклеиновой кислотой, которая является по меньшей мере частично комплементарной последовательности нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2. Как показано на фиг. 8 (и см. табл. 4), модуляторы лиганда КВ587 СЬЕС-2 сконструированы для гибридизации с различными районами КВ587. КВ585, который является комплементарным 18 основаниям 5' первичной последовательности РВ587, был эффективным в уменьшении связывания КВ587 с СЬЕС-2, как определено нейтрализацией ингибиторной активности лиганда СЬЕС-2 в анализах агрегации тромбоцитов и как определено анализами смещения подвижности в геле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, здесь обеспечен модулятор, который комплементарен или способен гибридизоваться с тем же самым районом лиганда СЬЕС-2. Вследствие этого, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2, включающим в себя стебель 1, петлю 1, стебель 2 и часть петли 2, или его частью. В качестве одного конкретного примера, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом, соответствующим основаниям в положениях приблизительно 1-21 или 1-18 или 116 или 1-14 или 4-21 или 4-18 или 4-14 или 6-14 или 6-18 или 6-21 лиганда СЬЕС-2 КВ587 (8ЕЦ ГО N0:24). Кроме того, специфическое взаимодействие этого модулятора с лигандом СЬЕС-2 приводит к уменьшению связывания лиганда СЬЕС-2 с полипептидом СЬЕС-2. Кроме того, этот модулятор может ингибировать или обращать функцию белка-мишени СЬЕС-2 посредством лиганда СЬЕС-2.
В одном предпочтительном варианте осуществления этот модулятор нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 является нуклеиновой кислотой, которая является по меньшей мере частично комплементарной последовательности нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2. Как показано на фиг. 8 (и см. табл. 4), модуляторы лиганда КВ587 СЬЕС-2 сконструированы для гибридизации с различными районами КВ587. КВ586, который является комплементарным 13 основаниям 5' первичной последовательности КВ587, был эффективным в уменьшении связывания КВ587 с СЬЕС-2, как определено нейтрализацией ингибиторной активности лиганда СЬЕС-2 в анализах агрегации тромбоцитов и как определено анализами смещения подвижности в геле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, здесь обеспечен модулятор, который комплементарен району лиганда СЬЕС-2 или способен гибридизоваться с тем же самым районом лиганда СЬЕС-2. Вследствие этого, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2, включающим в себя стебель 1, петлю 1 и стебель 2, или его частью. В качестве одного конкретного примера, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом, соответствующим основаниям в положениях приблизительно 1-13 или 1-10 или 6-13 лиганда СЬЕС-2 КВ587 (8ЕЦ ГО N0:24). Кроме того, специфическое взаимодействие этого модулятора с лигандом СЬЕС-2 приводит к уменьшению связывания лиганда СЬЕС-2 с полипептидом СЬЕС-2. Кроме того, этот модулятор может ингибировать или обращать функцию белка-мишени СЬЕС-2 посредством лиганда СЬЕС-2.
Альтернативные примеры модуляторов включают в себя: олигонуклеотиды, или их аналоги, которые являются комплементарными по меньшей мере части последовательности нуклеиново-кислотного лиганда (в том числе рибозимы или ДНК-зимы). Другие примеры включают в себя пептиднуклеиновые кислоты (ΡΝΑ), морфолинонуклеиновые кислоты (ΜΝΑ) или закрытые нуклеиновые кислоты (ΕΝΑ); связывающие нуклеиновую кислоту белки или пептиды; олигосахариды; малые молекулы; или связывающие нуклеиновую кислоту полимеры, липиды, наночастицы или модуляторы на основе микросфер.
Модуляторы могут быть сконструированы таким образом, что они могут связывать конкретный лиганд с высокой степенью специфичности и желаемой степенью аффинности.
Модуляторы могут быть также сконструированы таким образом, что, после связывания, структура этого лиганда является модифицированной либо в более, либо в менее активную форму. Например, модулятор может быть сконструирован таким образом, что после связывания с нуклеиново-кислотным лигандом-мишенью вторичная и/или третичная структура этого лиганда является измененной, посредством чего этот лиганд не может более связываться с его молекулой-мишенью или связывается с его молекулой-мишенью с меньшей аффинностью. Альтернативно, модулятор может быть сконструирован таким образом, что, после связывания, трехмерная структура этого лиганда изменяется таким образом, что аффинность этого лиганда в отношении его молекулы-мишени повышается. То есть модулятор может быть сконструирован таким образом, что, после связывания, некоторый структурный мотив модифицируется таким образом, что аффинность этого лиганда увеличивается. В другом варианте осуществления пара лиганд/модулятор сконструирована таким образом, что связывание этого модулятора с молекулой нуклеиново-кислотного лиганда, которая не может связываться с представляющей интерес мишенью, может приводить к продуцированию структурного мотива в этом лиганде, который посредством этого позволяет лиганду связываться с его молекулой-мишенью.
Модуляторы могут быть также сконструированы для неспецифического связывания с конкретным нуклеиново-кислотным лигандом или набором нуклеиново-кислотных лигандов с достаточной аффинностью для образования комплекса. Такие модуляторы могут быть в основном ассоциированы с нуклеиновыми кислотами посредством заряд-зарядных взаимодействий. Такие модуляторы могут также одновременно связывать более одного нуклеиново-кислотного лиганда. Модулятор может быть сконструирован
- 14 026309 таким образом, что, после связывания с одним или несколькими нуклеиново-кислотными лигандами, структура нуклеиново-кислотного лиганда не является значимо измененной относительно ее активной формы, а, скорее, этот модулятор маскирует или стерически предотвращает ассоциацию этого нуклеиново-кислотного лиганда с его молекулой-мишенью.
Нуклеотидные модуляторы могут иметь любую длину, что делает возможным эффективное связывание с молекулой-лигандом. Например, олигонуклеотидные модуляторы могут находиться в диапазоне длин от приблизительно 10 нуклеотидов (нт) до приблизительно 30 нт, от приблизительно 10 нт до приблизительно 20 нт или от приблизительно 15 нт. Эти нуклеотидные модуляторы могут иметь длину 8 нт, 9 нт, 10 нт, 11 нт, 12 нт, 13 нт, 14 нт, 15 нт, 16 нт, 17 нт, 18 нт, 19 нт, 20 нт, 21 нт, 22 нт, 23 нт, 24 нт, 25 нт, 26 нт, 27 нт, 28 нт, 29 нт или 30 нт. Специалист с обычной квалификацией в данной области может также представить себе нуклеотидные модуляторы, имеющие длины, большие 30 нт.
Нуклеиново-кислотный лиганд, описанный здесь, имеет активную третичную структуру, на которую может влиять образование подходящей стабильной вторичной структуры. Таким образом, хотя механизм образования дуплекса между комплементарным олигонуклеотидным модулятором и нуклеиновокислотным лигандом сходен с образованием дуплекса между двумя короткими линейными олигорибонуклеотидами, как правила конструирования таких взаимодействий, так и кинетика образования такого продукта могут находиться под влиянием межмолекулярной структуры лиганда.
Стадия нуклеации первоначального образования пар нуклеотидов между нуклеиново-кислотным лигандом и олигонуклеотидным модулятором играет важную роль в образовании конечного стабильного дуплекса, и скорость этой стадии в сильной степени повышается нацеливанием олигонуклеотидного модулятора на одноцепочечные петли и/или одноцепочечные 3'- или 5'-хвосты, присутствующие в нуклеиново-кислотном лиганде. Для появления оптимального образования межмолекулярного дуплекса, эта свободная энергия является идеально благоприятной для образования межмолекулярного дуплекса относительно образования существующих внутримолекулярных дуплексов в нуклеиново-кислотном лигандемишени.
Описанные здесь модуляторы являются обычно олигонуклеотидами, которые содержат последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеиново-кислотноголиганда-мишени. Например, модуляторный олигонуклеотид может содержать последовательность, комплементарную приблизительно 6 нт (нуклеотидам)-25 нт, 8 нт 20 нт или 10 нт-15 нт лиганда-мишени. Длина этого модуляторного олигонуклеотида может быть легко оптимизирована с использованием способов, описанных здесь и известных лицам с обычной квалификацией в данной области, с учетом лиганда-мишени и желаемого эффекта. Этот олигонуклеотид может быть произведен с нуклеотидами, несущими Ό- или Ь-стереохимию или их смеси. Природно-встречающиеся нуклеозиды имеют Ό-конфигурацию.
Хотя эти олигонуклеотидные модуляторы включают в себя последовательность, комплементарную по меньшей мере части нуклеиново-кислотного лиганда, абсолютная комплементарность не требуется. Последовательность, комплементарная по меньшей мере части нуклеиново-кислотного лиганда, на которую здесь делается ссылка, является последовательностью, имеющей достаточную комплементарность, чтобы иметь способность гибридизоваться с нуклеиново-кислотным лигандом. Эта способность гибридизоваться может зависеть как от степени комплементарности, так и длины этой нуклеиновой кислоты. Обычно, чем больше гибридизующийся олигонуклеотид, тем больше ошибочных спариваний оснований с лигандом-мишенью он может содержать и все еще образовывать стабильный дуплекс (или триплекс в случае его наличия). Специалист с квалификацией в данной области может получить приемлемую степень ошибочных спариваний с использованием стандартных процедур для определения точки плавления гибридизованного комплекса. Эти олигонуклеотиды могут быть одноцепочечными ДНК или РНК или химерными смесями или их производными или модифицированными версиями.
Модуляторы могут включать в себя модификации как в нуклеиново-кислотном скелете, так и в структуре индивидуальных нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления модулятор является нуклеиновой кислотой, комплементарной по меньшей мере одному району петли в этом лиганде. В других вариантах осуществления модулятор является нуклеиновой кислотой, комплементарной по меньшей мере одному району стебля в этом лиганде. В других вариантах осуществления этот модулятор является нуклеиновой кислотой, комплементарной по меньшей мере одному району петли и одному району соседнего стебля. В некоторых вариантах осуществления модулятор является олигонуклеотидом, имеющим по меньшей мере одну последовательность, которая гибридизуется при физиологических условиях с частью этого лиганда. В зависимости от желаемой функции модулятора этот модулятор может быть сконструирован для разрушения или стабилизации вторичной и/или третичной структуры нуклеиново-кислотного лиганда.
В некоторых вариантах осуществления модулятор сконструирован для связывания с суицидным положением на этом лиганде и тем самым разрушает последовательность этого лиганда. Одним суицидным положением является одноцепочечная часть лиганда, чувствительная к ферментативному расщеплению. В одном примерном варианте осуществления это суицидное положение становится одноцепочечным и лабильным после связывания этого модулятора с лигандом, и может усиливать расщепление
- 15 026309 этого лиганда ферментами в кровотоке, такими как эндонуклеазы крови, или эндонуклеазы печени. В некоторых вариантах осуществления, этот модулятор связывается с лигандом, после чего этот лиганд не может более взаимодействовать с его мишенью.
В некоторых вариантах осуществления последовательность модулятора содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, например, 2'-О-метил- и 2'-фтор-модификацию, которая может включать в себя 2'-О-метилцитозин, 2'-О-метилуридин, 2'-О-метиладенозин, 2'-О-метилгуанозин, 2'фторцидин или 2'-фторуридин.
Различные стратегии могут быть использованы для определения оптимального сайта в нуклеиновокислотном лиганде для связывания олигонуклеотидным модулятором. Может быть использована эмпирическая стратегия, в которой комплементарные олигонуклеотиды блуждают вокруг нуклеиновокислотного лиганда. В соответствии с этим подходом, могут быть использованы олигонуклеотиды (например, 2'-О-метил- или 2'-фторолигонуклеотиды с длиной приблизительно 15 нуклеотидов, которые ступенчато с различием приблизительно 5 нуклеотидов находятся на этом лиганде (например, олигонуклеотиды, комплементарные 1-15, 6-20, 11-25 и т.д. лигандам). Эмпирическая стратегия может быть особенно эффективной, так как действие третичной структуры нуклеиново-кислотного лиганда на эффективность гибридизации является трудно предсказуемым.
Такие анализы, как анализы, описанные в примере 6 и 8, могут быть использованы для оценивания способности различных олигонуклеотидов гибридизоваться со специфическим нуклеиново-кислотным лигандом, с особым вниманием в отношении молярного избытка олигонуклеотида, требуемого для достижения полного связывания нуклеиново-кислотного лиганда. Способность различных олигонуклеотидных модуляторов увеличивать скорость диссоциации нуклеиново-кислотного лиганда из его молекулымишени, или ассоциации с его молекулой-мишенью может быть также определена проведением стандартных кинетических исследований с использованием, например, анализов, ШАСОКЕ. Олигонуклеотидные модуляторы могут быть выбраны таким образом, что необходим 5-50-кратный молярный избыток олигонуклеотида, или менее, для модификации желаемым образом взаимодействия между этим лигандом и его молекулой-мишенью.
Альтернативно, этот нацеленный нуклеиново-кислотный лиганд может быть модифицирован таким образом, что он включает в себя одноцепочечный хвост (3' или 5') для усиления ассоциации с олигонуклеотидным модулятором. Подходящие хвосты могут содержать 1-20 нуклеотидов, 1-10 нуклеотидов, 1-5 нуклеотидов или 3-5 нуклеотидов. Хвосты могут быть также модифицированы (например, 2'О-метил- и 2'-фтормодификацией которая может включать в себя, 2'-О-метилцитозин, 2'-О-метилуридин, 2'-О-метиладенозин, 2'-О-метилгуанозин, 2'-фторцитидин или 2'-фторуридин). Имеющие хвосты лиганды могут быть тестированы в анализах связывания и биоанализах (например, как описано в примерах, приведенных ниже) для подтверждения, что добавление одноцепочечного хвоста не разрушает активную структуру нуклеиново-кислотного лиганда. Ряд олигонуклеотидов (например, 2'-О-метилолигонуклеотидов), которые могут образовать, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пар оснований с последовательностью хвоста, могут быть сконструированы и тестированы на их способность ассоциироваться только с одним имеющим хвост лигандом, а также на их способность увеличивать скорость диссоциации этого лиганда из молекулы-мишени или ассоциации этого лиганда с его молекулой-мишенью. Контроли смешанных последовательностей могут быть использованы для подтверждения, что эффекты были обусловлены образованием дуплекса и не являются неспецифическими эффектами.
В другом варианте осуществления этим модулятором является рибозим или ДНК-зим. Ферментативные нуклеиновые кислоты действуют сначала связыванием с РНК- или ДНК-мишенью. Такое связывание осуществляется через мишень-связывающую часть ферментативной нуклеиновой кислоты, которая удерживается в тесной связи с ферментативной частью молекулы, которая действует, расщепляя РНК-мишень. Таким образом, эта ферментативная нуклеиновая кислота сначала распознает и затем связывает РНК- или ДНК-мишень через комплементарное спаривание оснований и после связывания с правильным сайтом действует ферментативно для разрезания РНК-мишени, тем самым позволяя инактивацию РНК-лигандов. Имеются по меньшей мере пять классов рибозимов, каждый из которых проявляет различный тип специфичности. Например, Интроны группы I имеют размер приблизительно 300->1000 нуклеотидов и требуют присутствия и в последовательности-мишени сразу слева (5') от сайта расщепления и связывает 4-6 нуклеотидов в 5'-стороне (слева) от этого сайта расщепления. Другим классом является РНК РНКазы Р (РНК М1), которые имеют размер приблизительно 290-400 нуклеотидов. Третьим классом являются Наттегкеаб РФо/утек (МолотоголовыеРибозимы), которые имеют размер приблизительно 30-40 нуклеотидов. Они требуют последовательности-мишени ИН (где Н не является С) непосредственно слева (5') от сайта расщепления и связывают варьирующееся количество нуклеотидов на обеих сторонах от сайта расщепления. Четвертым классом являются На1грш РФо/утек (Шпилечные Рибозимы), которые имеют размер приблизительно 50 нуклеотидов. Они требуют последовательностьмишень СиС непосредственно справа (3') от сайта расщепления и связывают 4 нуклеотида на 5'-стороне (слева) от этого сайта расщепления и варьирующееся количество на 3'-стороне от этого сайта расщепления. Пятой группой является НераООк ИеИа Уник (НИУ) РФо/утек (Рибозимы вируса гепатита дельта) которые имеют размер приблизительно 60 нуклеотидов. ДНК-зимы являются одноцепочечными и рас- 16 026309 щепляют как РНК, так и ДНК. Была предложена общая модель для ДНК-зима, и она известна как модель 10-23. ДНК-зимы согласно модели 10-23 имеют каталитический домен из 15 дезоксирибонуклеотидов, фланкированный двумя доменами распознавания субстрата из семи-девяти дезоксирибонуклеотидов, каждый.
В другом варианте осуществления модулятор сам является нуклеиново-кислотным лигандом. В этом варианте осуществления генерируют первый лиганд, который связывается с желаемой терапевтической мишенью. Во второй стадии, второй лиганд, который связывается с первым лигандом, генерируют с использованием способа 8ЕЬЕХ, описанного здесь, или другого способа и модулируют взаимодействие между терапевтическим лигандом и мишенью. В одном варианте осуществления этот второй лиганд дезактивирует эффект первого лиганда.
В другом примерном варианте осуществления этим модулятором является модулятор на основе ΡΝΑ (ПНК), ΜΝΑ (МНК), ΕΝΑ (ЗНК) или РСО. Нуклеооснования этих олигонуклеотидных модуляторов могут быть соединены через связи между нуклеооснованиями, например, пептидильными связями (как в случае пептиднуклеиновых кислот (ΡΝΑ); №екеп е! а1. (1991) §с1еисе 254, 1497 и υ.δ. Ра1. Νο. 5539082) морфолино-связями (Οίη е! а1., ЛШкепхе №с1ею Лай Эгид Эеу. 10, 11 (2000); Зиштейоп, ЛШкепхе Νυс1е1с Α^ Эгид Эеу. 7, 187 (1997); Зиштейоп е! а1., Αηί^δеηδе №с1ею Α^ Эгид Эеу. 7, 63 (1997); Тау1ог е! а1., 1 Βίο1 СБет. 271, 17445 (1996); РагШйде е! а1., Αη!^δеηδе ШсШс Α^ Эгид Эеу. 6, 169 (1996)), или любой другой природной или модифицированной связью. Этими олигонуклеооснованиями могут быть также закрытые нуклеиновые кислоты (ΣΝΑδ). №екеп е! а1., 1 Вюто1 81гис! Эуп 17, 175 (1999); Ре!егвеп е! а1., 1 Μο1 Кесодт! 13, 44 (2000); №екеп е! а1., Вюсопщд СБет 11, 228 (2000).
ΡΝΑ (ПНК) являются соединениями, которые являются аналогами олигонуклеотидов, но различаются в их составе. В ПНК, дезоксирибозный скелет молекулы олигонуклеотида заменен пептидным скелетом. Каждая субъединица этого пептидного скелета присоединена к природно-встречающемуся или не встречающемуся в природе нуклеооснованию. ПНК часто имеет ахиральный полиамидный скелет молекулы, состоящий из ^(2-аминоэтил)глициновых звеньев. Пуриновые или пиримидиновые основания связаны с каждым звеном через метиленкарбонильный линкер (1-3) для нацеливания на комплементарную нуклеиновую кислоту. ПНК связывается с комплементарной РНК или ДНК в параллельной или антипараллельной ориентации в соответствии с правилами спаривания оснований Уотсона-Крика. Этот незаряженный характер ΡΝΑ-олигомеров усиливает стабильность гибридных дуплексов ПНК/ДНК(РНК) в сравнении с природными гомодуплексами.
Морфолинонуклеиновые кислоты названы так, поскольку они собраны из морфолино-субъединиц, каждая из которых содержит одно из четырех генетических оснований (аденозин, цитозин, гуанин и тимин), связанных с 6-членным морфолиновым кольцом. Субъединицы этих четырех типов субъединиц соединены в специфическом порядке неионными фосфордиамидатными межсубъединичными связями с образованием морфолино-олиго.
ΕΝΑ (ЗНК) является классом ДНК-аналогов, которые имеют некоторые признаки, которые делают их превосходными кандидатами для модуляторов. Мономеры ΕΝΑ (ЗНК) являются бициклическими соединениями, структурно сходными с РНК-мономерами. ΕΝΑ (ЗНК) имеет большинство химических свойств ДНК и РНК, она является водорастворимой, может разделяться гель-электрофорезом, осаждается этанолом и т.д. (Те!гаБейгоп, 54, 3607-3630 (1998)). Однако, введение мономеров ΕΝΑ либо в ДНК-, либо в РНК-олиго приводит к высокой тепловой стабильности дуплексов с комплементарной ДНК или РНК, хотя, в то же самое время, подчиняющихся правилам спаривания оснований Уотсона-Крика.
Псевдоциклические олигонуклеооснования (РСО) могут быть также использованы в качестве модулятора (см. Патент США № 6383752). РСО содержат два олигонуклеотидных сегмента, соединенных через их 3'-3' или 5'-5'-концы. Один из сегментов (функциональный сегмент) РСО имеет некоторую функциональность (например, комплементарность относительно РНК-мишени). Другой сегмент (защитный сегмент) является комплементарным 3'- или 5'-концевой стороне этого функционального сегмента (в зависимости от конца, посредством которого он соединен с функциональным сегментом). В результате комплементарности между функциональным и защитным сегментами, РСО образует внутримолекулярные псевдоциклические структуры в отсутствие нуклеиновых кислот-мишеней (например, РНК). РСО являются более стабильными, чем общепринятые олигонуклеотиды вследствие присутствия связей 3'-3' или 5'-5' и образования внутримолекулярных псевдоциклических структур. Исследования фармакокинетики, тканевого распределения и стабильности в мышах предполагают, что РСО имеют более высокую стабильность ш у1уо, чем эти характеристики Ρδ-олигонуклеотидов в целом, и фармакинетику и профили тканевого распределения, сходные с этими характеристиками Ρδ-олигонуклеотидов в целом, но быструю элиминацию из выбранных тканей. При подходящем связывании молекул флуорофора и гасителя с РСО данного изобретения эта молекула будет флуоресцировать, когда она находится в линейной конфигурации, но эта флуоресценция гасится в циклической конформации. Этот признак может быть использован для скрининга РСО в качестве потенциальных модуляторов.
В другом примерном варианте осуществления эти модуляторы являются модуляторами на основе пептидов. Модуляторы на основе пептидов нуклеиново-кислотных лигандов представляют альтернативный молекулярный класс модуляторов относительно олигонуклеотидов или их аналогов. Этот класс мо- 17 026309 дуляторов особенно применим, если достаточно активные олигонуклеотидные модуляторы нуклеиновокислотного лиганда-мишени не могут быть выделены вследствие отсутствия достаточного количества одноцепочечных районов для усиления нуклеации между этой мишенью и олигонуклеотидным модулятором. Кроме того, пептидные модуляторы обеспечивают другую биодоступность и фармакокинетику, чем олигонуклеотидные модуляторы. В одном примерном варианте осуществления этим модулятором является протамин (Опеу еΐ а1., 2009, Ναΐ Мей. 15:1224-1228). Протамины растворимы в воде, не коагулируются нагреванием и содержат аргинин, аланин и серин (большинство содержат также пролин и валин и многие содержат глицин и изолейцин). Модуляторы включают в себя также варианты протамина (см., например, Аакейе1й еΐ а1, 1. §ит§. Ке8. 63:280 (1196)) и модифицированные формы протамина, в том числе описанные в публикации США № 20040121443. Другие модуляторы включают в себя фрагменты протамина, такие как фрагменты протамина, описанные в патенте США № 6624141 и публикации США № Νο. 20050101532. Модуляторы включают в себя также, в основном, пептиды, которые модулирует активность гепарина, другие глюкозаминогликаны или протеогликаны (см., например, патент США № 5919761). В одном примерном варианте осуществления модуляторы являются пептидами, которые содержат катионные ΝΗ-группы, позволяющие стабилизировать заряд-зарядные взаимодействия, такие как поли-Ь-лизин и поли-Ь-орнитин.
Доступны некоторые стратегии для выделения пептидов, способных связываться с нуклеиновокислотным лигандом-мишенью и модулировать активность нуклеиново-кислотного лиганда-мишени. Например, были описаны комбинаторные библиотеки кодируемых пептидов на гранулах, и было продемонстрировано, что они содержат пептиды, способные связывать вирусные РНК-последовательности и разрушать взаимодействие между вирусной РНК и вирусном регуляторным белком, который специфически связывает указанную РНК (Н^апд еΐ а1. Ргос. Ν;·ι11. Асай. δοί И8А, 1999, 96:12997). С использованием таких библиотек модуляторы нуклеиново-кислотных лигандов могут быть выделены присоединением метки к нуклеиново-кислотному лиганду-мишени и инкубированием вместе этой меченой мишени и иммобилизованной на гранулах пептидной библиотеки в условиях, при которых связывание между некоторыми членами этой библиотек и нуклеиновой кислотой является предпочтительным. Связывание нуклеиново-кислотного лиганда со специфическим пептидом на этой грануле заставляет эту гранулу быть окрашенной указанной меткой на нуклеиново-кислотном лиганде и, следовательно, облегчать идентификацию пептидов, способных связывать мишень, простым выделением этой гранулы. Прямое взаимодействие между пептидами, выделенными такими способами скрининга, и нуклеиново-кислотным лигандом-мишенью может быть подтверждено и определено количественно с использованием любого числа анализов связывания, описанных для идентификации модуляторов нуклеиново-кислотных лигандов. Способность указанных пептидов модулировать нуклеиново-кислотный лиганд-мишень может быть подтверждена подходящими биоанализами.
В некоторых вариантах осуществления, модулятором является белок. Например, в некоторых вариантах осуществления, нуклеиново-кислотный лиганд связан с молекулой биотина. В этих случаях, стрептавидин или авидин вводят для связывания с этим лигандом и обращения эффектов этого лиганда (см. δ;·ινί еΐ а1. 1 ТЬ^οтЬο5^5 апй Ηаетο5ίа5^5, 6: 1697-1706). Авидин является тетрамерным белком, продуцируемым в яйцеводах птиц, пресмыкающихся и земноводных, который отлагается в белках их яиц. Стрептавидин является тетрамерным белком, очищенным из бактерии БйерЮтусек ηνίάίηίί. Этот тетрамерный белок содержит четыре идентичные субъединицы (гомотетрамер), каждая из которых может связываться с биотином (витамином В7, витамином Н) с высокой степенью аффинности и специфичности. Белковый модулятор нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 может быть растворимой частью домена СЬЕС-2, который связан нуклеиново-кислотным лигандом СЬЕС-2. Например, ЕС.И или его фрагмент полипептида СЬЕС-2 может конкурировать с нуклеиново-кислотным лигандом СЬЕС-2 за связывание с клеточносвязанным или нативным СЬЕС-2 для обращения связывания нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 с нативной молекулой СЬЕС-2.
В одном дополнительном варианте осуществления модуляторы являются модуляторами на основе олигосахарида.
Олигосахариды могут взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами. Например, антибиотические аминогликозиды являются продуктами видов БйерЮтусек и взаимодействуют с разнообразным множеством молекул РНК, таких как различные рибозимы, РНК-компоненты рибосом и последовательности ТАК и ККЕ ВИЧ-1. Таким образом, олигосахариды могут связываться с нуклеиновыми кислотами и могут быть использованы для модуляции активности нуклеиново-кислотных лигандов.
В другом варианте осуществления модулятор является модулятором на основе малой молекулы. Малая молекула, которая интеркалируется между лигандом и мишенью или иным образом разрушает или модифицирует связывание между этим лигандом и мишенью, может быть также использована в качестве терапевтического регулятора. Такие малые молекулы могут быть идентифицированы скринингом кандидатов в анализе, который измеряет изменения связывания между лигандом и мишенью с малой молекулой и без малой молекулы, или с использованием анализа ίη νίνο или ίη νίΐτο, который измеряет различие в биологическом действии этого лиганда в отношении этой мишени с малой молекулой или без малой молекулы. После идентификации малой молекулы, которая проявляет желаемое действие, могут
- 18 026309 быть использованы способы, такие как комбинаторные подходы для оптимизации этой химической структуры для желаемого регуляторного действия.
Еще в одном примерном варианте осуществления этот модулятор является связывающим нуклеиновую кислоту полимером, липидом, наночастицей или микросферами. В дополнительных неограничивающих примерах, этот модулятор может быть выбран из группы, состоящей из: 1,2-диолеоил-5пглицеро-3-этилфосфохолина (ЕЭ0РС); дилауроилэтилфосфатидилхолина (ЕПЬРС); ЕЭЕРС/Е00РС: содержащих пиридиний поверхностно-активных веществ; диолеоилфосфатидилэтаноламина (Э0РЕ); (±)N-(3 -аминопропил)-N,N-диметил-2,3-бис(додецилокси)-1-пропанаминийбромида (ОАР-ОЬЫЕ) плюс нейтрального ко-липида диолеоилфосфатидилэтаноламина (Э0РЕ) (0ΑΡ-ΌΕΚΙΒ/Ό0ΡΒ); диметил-Н-[2-(сперминкарбоксамидо)этил]-2,3-бис(диолеилокси-1-пропаниминийпентагидрохлорида (Э0ЗРА); дилауроилэтилфосфатидилхолина (ЕЭТРС); этилдимиристоилфосфатидилхолина (ЕЭМРС); (±)-N,N,N-триметил-2,3-бис(ζ-октадец-9-енлилокси)-1 -пропанаминийхлорида (Ό0ΤΑΡ); (±)-Н-2-(2гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропанаминийбромида (ОМР1Е);
триметил-2,3-бис^-октадец-9-енилокси)-1-пропанаминийхлорида (Ό0ΤΜΑ); 5-карбоксиспермилглициндиоктадециламида (Э0СЗ); дипальмитоилфосфатидилэтаноламин-5-карбоксиспермиламида (ЭРРЕЗ); 1,3-диолеоилокси-2-(6-карбоксиспермил)пропиламида (00ЗРЕР); тетраметилтетрапальмитоилспермина (ТМТРЗ); тетраметилтетраолеилспермина (ΤΜΤ03); тетраметилтетралаурилспермина (ТМТЬЗ); тетраметилтетрамиристилспермина (ΤΜΤΜ3); тетраметилдиолеилспермина (ΤΜΌ03); дифитаноилфосфатидилэтаноламина (ЭРЬРЕ) и (±)-N-(3-аминопропил)-N,N-диметил-2,3-бис(додецилокси)-1-пропанаминийбромида (САР-ЭЬК1Е); спирта; акрилового или метакрилового полимера; №\\'котс дендримера; полипропилена; диметилдиоктадециламмонийбромида (ЭАБ); цетилтриметиламмонийбромида (СТАВ); альбумина; обработанного кислотой желатина; полилизина; полиорнитина; полиаргинина; ДЕАЕцеллюлозы; ДЕАЕ-декстрана и поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилата и полипропиламина (РОРАМ).
В одном варианте осуществления этот модулятор выбран из хитозана и производных хитозана. Производные хитозана включают в себя водорастворимые наночастицы хитозана (такие как описанные в патенте США № 6475995; Заявке на патент США № 2006/0013885; ЫтреапсЕоЬ с1 а1., (2006) ЕГПсасу апб ΤοχίαίΙν оГ АтрЬоЮпст В-С1Шо5ап №торагПс1с5; Шгеизап ИпАегеЬу 1оигпа1 14(2):27-34). Вследствие поликатионного характера хитозанового полимера (по существу, очень большого полиаминного полимера, состоящего из повторяющихся мономеров глюкозамина), хитозан может быть использован для агрегации и/или инкапсулирования лигандов в полиэлектролитный комплекс ίη νί\Ό после инъекции в хозяина. Это основано частично на взаимодействиях первичных аминов, обнаруживаемых на хитозане, и фосфодиэфирного скелета этого лиганда.
В других вариантах осуществления модулятор выбран из группы, состоящей из 1,5-диметил-1,5диазаундекаметиленполиметобромида; блок-сополимеров полиоксиэтилена/полиоксипропилена; поли-Ьлизина; полиамидоамина (РАМАМ); β-циклодекстринсодержащего поликатиона (СЭР); β-циклодекстринсодержащего поликатиона (имидазолсодержащего варианта) (СЭР-1т); полифосфорамидатного полимера (8 кДа, 30 кДА) (РРА-ЭРА 8 к, РРА-ЭРА 30 к); полибрена; спермина; ΡΒО-блок-Ρ^^-дендримеров; полиэтиленимина (РЕ1); маннозы-РЕ1; трансферина-РЕЕ линейного-РЕ1 (1РЕ1); желатина; метакрилата/метакриламида; поли(бета-аминоэфиров); полиэлектролитных комплексов (РЕС); поли(виниламина) (РУА); коллагена; полипропиленимина (РР1); полиаллиламина; поливинилпиридина; аминоацеталированного поли(винила).
В некоторых вариантах осуществления, первичные амины на хитозановом полимере могут быть существенно модифицированы для изменения водорастворимости и состояния заряда. Производные хитозана включают в себя триметилхитозанхлорид (ТМС), который может быть синтезирован при различных степенях кватернизации; монокарбоксиметилированный хитозан (МСС), который является полиамфолитическим полимером; сшитое производное глутаральдегида (СЗСА); тиолированный хитозан (Ьее, е1 а1. (2007) РЬагт. Ке5. 24: 157-67); гликольхитозан (ОС), производное хитозана, конъюгированное с этиленгликолем (Ьее, е1 а1. (2007) Ιηΐ ί РЬагт.); [N-(2-карбоксибензил)хитозан (СВСЗ) (Ьт, е1 а1. (2007) СагЬоЬубг Ке5. 342(1): 87-95); бета-циклодекстринхитозановый полимер (Уеп1ег, е1 а1. (2006) Ιηΐ ΐ РЬагт. 313(1-2):36-42); О-карбоксиметилхитозан; N,О-карбоксиметилхитозан; или хитозан, химически модифицированный введением ксантатной группы на его скелет.
В одном варианте осуществления пустые хитозановые наночастицы генерируют и используют в качестве модуляторов.
Могут быть использованы хитозан или производные хитозана с диапазоном молекулярной массы 10000 Да - >1000000 Да. В некоторых вариантах осуществления хитозан имеет молекулярную массу 500000 Да или менее. В некоторых вариантах осуществления хитозан имеет молекулярную массу 100000 Да или менее. В некоторых вариантах осуществления хитозан имеет молекулярную массу 10000-90000, 10000-80000, 20000-700000, 30000-70000, приблизительно 30000, приблизительно 40000, приблизительно 50000 или приблизительно 60000 Да.
В некоторых вариантах осуществления используют полимеры хитозана, содержащие различные степени деацетилирования первичных аминов. В этих вариантах осуществления различные степени де- 19 026309 ацетилирования изменяют состояние заряда этого полимера и тем самым свойства связывания этого полимера. После контакта этой хитозановой частицы с лигандами в хозяине, лиганды могут связываться с поверхностью наночастицы и становиться захваченными на этой наночастице или входят в эту наночастицу и становятся инкапсулированными посредством ионных взаимодействий.
В другом варианте осуществления этот модулятор является микросферой полифосфатного полимера. В некоторых вариантах осуществления, этот модулятор является производным такой микросферы, такой как поли(сополимер Ь-лактида и этилфосфита) или Р(ЬАЕО-Е0Р) и другие, описанные в патенте США № 6548302. Такие полимеры могут быть получены таким образом, что они содержат различные функциональные группы в виде части полимерного скелета макромолекулы. В одном примере, эти полимеры могут содержать кватернизованные амины с положительным зарядом при физиологическом рН, так что они могут образовывать комплекс с одной или несколькими нуклеиновыми кислотами или инкапсулировать одну или несколько нуклеиновых кислот после контакта. В некоторых вариантах осуществления, эти полимеры не содержат положительных зарядов.
В некоторых вариантах осуществления, модулятор является катионной молекулой. В некоторых вариантах осуществления, этот лиганд образует структуру квартета гуанина (О-квартет или Оквадруплекс). Эти структуры связаны катионными молекулами. В некоторых вариантах осуществления, эти молекулы являются образующими хелаты металлов молекулами. В некоторых вариантах осуществления этим модулятором является порфирин. В некоторых вариантах осуществления, этим соединением является ТМРуР4. См. 1оасЫт1, еί а1. ίΑΤ’δ 2007, 129, 3036-3037 и Того, еί а1. Αηαΐνΐίοαΐ ВюсНепп^гу 2008, Аид 1, 379 (1) 8-15.
Модуляторы могут быть идентифицированы обычно посредством анализов связывания, молекулярного моделирования или анализов ίη νίνο или ίη νίίτο, которые измеряют модификацию биологической функции. В одном варианте осуществления связывание модулятора с нуклеиновой кислотой определяют анализом смещения в геле. В другом варианте осуществления связывание модулятора с нуклеиновокислотным лигандом определяют с использованием анализа В1АС0КЕ.
Для идентификации и селекции (отбора) модуляторов могут быть использованы стандартные анализы связывания. Неограничивающими примерами являются анализы смещения в геле и В1АС0КЕанализы. То есть, тест-модуляторы могут быть контактированы с нуклеиново-кислотными лигандами, чтобы они служили мишенями при условиях тестирования или при типичных физиологических условиях, и выполняют определение, связывается ли этот тест-модулятор действительно с этим лигандом. Затем тест-модуляторы, которые, как было обнаружено, связывают нуклеиново-кислотный лиганд, анализируют в подходящем биоанализе (который будет варьироваться в зависимости от этого лиганда и его молекулы-мишени, например, тесты коагуляции) для определения может ли этот тест-модулятор влиять на биологический эффект, вызываемый этим лигандом на его молекуле-мишени.
Анализ смещения в геле является хорошо известным способом, используемым для оценивания связывающей способности. Например, нуклеиново-кислотный лиганд к СЬЕС-2 сначала инкубируют с белком СЬЕС-2 или его фрагментом, или смесью, содержащей белок СЬЕС-2 или фрагмент, и затем разделяют на геле при помощи электрофореза. После связывания этого лиганда с данным белком этот комплекс будет большим по размеру и, следовательно, его миграция будет замедляться относительно миграции свободного лиганда, который может быть нанесен на контрольную дорожку в геле в отсутствие белка СЬЕС-2. Этот лиганд может быть меченым, например, радиоактивной или нерадиоактивной частью молекулы для возможности детектирования комплекса лиганд-СЬЕС-2 в геле. При использовании анализа смещения в геле для скрининга на лиганды, имеющие СЬЕС-2-связывающую активность, этот комплекс может быть затем экстрагирован из этого геля и выделенный лиганд может быть анализирован для идентификации лигандов, имеющих желаемую активность связывания СЬЕС-2.
Анализы смещения в геле могут быть также использованы для скрининга модуляторов на связывание нуклеиново-кислотных лигандов с СЬЕС-2, так как ассоциация этого модулятора с нуклеиновокислотным лигандом замедляет подвижность этого нуклеиново-кислотного лиганда относительно подвижности свободного лиганда (см., например, Κιΐί^οηί еί а1., 2002, №1иге. 41: 90-94).
Дополнительно, модуляторы могут быть добавлены к такому формату анализа и подвергнуты скринингу на их способность блокировать ассоциацию нуклеиново-кислотного лиганда с СЬЕС-2. Например, смесь СЬЕС-2-лиганд может быть инкубирована в присутствии увеличенных количеств потенциального модулятора. Модулятор с желаемой активностью будет специфически уменьшать образование комплекса СЬЕС-2-лиганд при детектировании анализом смещения в геле.
Технология В1АС0КЕ известна квалифицированному в данной области специалисту как надежный и ценный инструмент для идентификации и анализа макромолярных взаимодействий, в том числе взаимодействий полипептид-нуклеиновая кислота. Таким образом, можно использовать эту технологию для скрининга на нуклеиново-кислотные аптамеры или лиганды или идентификации нуклеиново-кислотных аптамеров или лигандов, которые специфически связывают белок СЬЕС-2 или его фрагмент. Технология В1АС0КЕ измеряет события связывания на поверхности сенсорного чипа, так что взаимодействующий агент, присоединенный к этой поверхности, определяет специфичность этого анализа. Другими словами, белок или фрагмент СЬЕС-2 мог бы быть присоединен к поверхности сенсорного чипа, например, через
- 20 026309 гистидиновую метку. Затем эти связанные белки СЬЕС-2 подвергают действию раствора, содержащего потенциальные молекулы лиганда. Связывание нуклеиново-кислотного лиганда с белком СЬЕС-2 дает немедленное изменение в сигнале резонанса поверхностных плазмонов (§РК). Этот сигнал прямо пропорционален массе молекул, которые связываются с этой поверхностью.
Как описано для анализа смещения в геле, В1ЛСОКЕ мог бы быть использован для идентификации или анализа модуляторов лигандов СЬЕС-2. Опять, реакционная смесь, действию которой подвергают связанный с чипом белок СЬЕС-2, может содержать как известный лиганд СЬЕС-2, так и увеличивающиеся количества модулятора, и эффекты определяют стандартным анализом В1ЛСОКЕ полученного взаимодействия между СЬЕС-2 и его лигандом.
Имеются ряд других анализов, которые могут определять, может ли олигонуклеотид или его аналог, пептид, полипептид, олигосахарид или малая молекула связываться с лигандом таким образом, что взаимодействие с этой мишенью модифицируется. Например, анализы смещения электрофоретической подвижности (ЕМ8Л), титрационная калориметрия, анализы сцинтилляционной близости, седиментационные равновесные анализы с использованием аналитического ультрацентрифугирования (см., например, \у\у\у.согс5.и1а11.сйи/т1сгас1юп). флуоресцентные анализы поляризации, флуоресцентные анализы анизотропии, анализы интенсивности флуоресценции, флуоресцентные резонансные анализы переноса энергии (РКЕТ), анализы связывания на нитроцеллюлозном фильтре, ЕЫ§Л, ЕЬОЫЛ (см., например, патент США № 5789163), ΚΙΆ или анализы равновесного диализа могут быть использованы для оценивания способности агента связываться с нуклеиново-кислотным лигандом. Могут выполняться прямые анализы, в которых взаимодействие между агентом и нуклеиново-кислотным лигандом определяют непосредственно, или конкурентные или вытеснительные анализы, в которых может определяться способность агента вытеснять этот лиганд из его мишени (например, см. Огееп, Ве11 апй .Таирс, ВюЮсйшсщех 30(5), 2001, р. 1094 и патент США № 6306598). После идентифицирования кандидатного модулирующего агента, его способность модулировать активность нуклеиново-кислотного лиганда в отношении его мишени может подтверждаться в биоанализе. Альтернативно, если идентифицирован агент, который может модулировать взаимодействие лиганда с его мишенью, такие анализы связывания могут быть использованы для подтверждения того, что этот агент взаимодействует непосредственно с этим лигандом и может измерять аффинность указанного взаимодействия.
В другом варианте осуществления может быть использована масс-спектрометрия для идентификации модулятора, который связывается с нуклеиново-кислотным лигандом, сайта (сайтов) взаимодействия между этим модулятором и нуклеиново-кислотным лигандом и относительной аффинности агентов в отношении этого лиганда (см., например, патент США № 6329146). Такие масс-спектральные способы могут быть также использованы для скрининга химических смесей или библиотек, особенно комбинаторных библиотек, на индивидуальные соединения, которые связываются с выбранным лигандоммишенью, которые могут быть использованы в качестве модуляторов этого лиганда. Кроме того, массспектральные способы могут быть использованы для скрининга множественных нуклеиново-кислотных лигандов-мишеней одновременно против, например, комбинаторной библиотеки соединений. Кроме того, масс-спектральные способы могут быть использованы для идентификации взаимодействия между множеством молекулярных частиц, в частности, малых молекул, и молекулярного сайта взаимодействия на лиганде-мишени.
В другом варианте осуществления анализы ίη νίνο или ίη νίίτο, которые оценивают эффективность модулятора в модификации взаимодействия между нуклеиново-кислотным лигандом и мишенью, которые являются специфическими для подлежащего лечению нарушения, могут быть использованы для идентификации модулятора, который связывается с нуклеиново-кислотным лигандом.
Имеются обширные стандартные анализы для биологических свойств, которые хорошо известны и могут быть использованы. Примеры биологических анализов обеспечены в патентах, цитируемых в этой заявке, которые описывают некоторые нуклеиново-кислотные лиганды для конкретных применений.
В одном варианте осуществления этот модулятор имеет способность значимо связываться с нуклеиново-кислотным лигандом в растворе при концентрациях модулятора, меньших чем десять (10,0) мкМ, один (1,0) мкМ, предпочтительно меньшей чем 0,1 мкМ, предпочтительно меньшей чем 0,01 мкМ. Под термином значимо имеется в виду, что наблюдается по меньшей мере 50%-ное уменьшение биологической активности-мишени посредством модуляции в присутствии этой мишени, и при 50%-ном уменьшении эту величину называют здесь величиной 1С50.
Оптимизация лигандов и модуляторов
Для того чтобы лиганд был пригоден для применения в качестве терапевтического агента, этот лиганд является предпочтительно недорогим для синтеза, безопасным для применения в хозяине и стабильным ίη νίνο. РНК дикого типа и ДНК-олигонуклеотиды обычно являются нестабильными ίη νίνο вследствие их чувствительности к деградации нуклеазами. Устойчивость к деградации нуклеазами может быть в сильной степени увеличена включением модифицирующих групп в 2'-положении.
2'-Фтор или аминогруппы могут быть включены в пулы олигонуклеотидов, из которых затем отбирают лиганды. В данном описании 2'-фторпиримидины используют в реакции транскрипции ίη νίίτο для генерирования исходного пула олигонуклеотидов для отбора лигандов (см. пример 1).
- 21 026309
После исходной идентификации лигандов (с использованием, например, 8ЕЬЕХ) и модуляторов (например, с конструированием на основе комплементарности последовательностей) эти лиганды и модуляторы могут быть модифицированы или сконструированы для улучшения их желаемой структуры, функции и/или стабильности различными способами. Они включают в себя, но не ограничиваются ими, замену конкретных сахарных остатков, изменение состава и размера конкретных районов и/или структур в этом лиганде и конструирование (дизайн) лигандов, которые могут более эффективно регулироваться модулятором.
Конструирование (дизайн) и оптимизация нуклеиново-кислотного лиганда включает в себя принятие во внимание вторичной структуры этот лиганда, а также взаимосвязи между этой вторичной структурой лиганда и контролем модулятора. В отличие от общепринятых способов модификации нуклеиновых кислот, конструирование этих лигандов к белку СЬЕС-2 может включать в себя рассмотрение действия изменений в отношении этого лиганда на дизайн потенциальных модуляторов. Если лиганд модифицирован посредством, например, укорочения, соответствующий модулятор должен быть сконструирован для контроля укороченного лиганда.
Вторичная структура лигандов, идентифицированных при помощи способа 8ЕЬЕХ, может быть предсказана различными способами, известными квалифицированным в данной области специалистам. Например, каждая последовательность может быть анализирована с использованием программы, такой как Μίοΐά (т&И.Ъюш&.гркеби; см. также 2икег, 2003, ЖсГОс Аабк Кек. 31:3406-3415 и МаШс\У5. е1 а1., 1999, ί. Μο1. Βίο1. 288:911-940). Таким образом, сравнительный анализ последовательностей различных отобранных последовательностей может быть использован для сопоставления этих последовательностей на основе консервативных консенсусных вторичных структурных элементов для достижения предсказанной вторичной консенсусной структуры для лигандов СЬЕС-2.
СЬЕС-2 нуклеиновые лиганды
СЬЕС-2, описанные здесь, могут быть модифицированы варьированием всей длины лиганда, а также длин структур стебля и петли. Например, могут быть генерированы укорочения лиганда, в которых часть 5'- и/или 3'-конца укорочений делетирована из лиганда, отобранного в способе ЗЕЬЕХ. Для определения степени укорочений, которые переносятся лигандом, одним используемым способом может быть тепловой отжиг олигонуклеотида (например, ДНК-олигонуклеотида), комплементарного 5'- или 3'концевому району этого лиганда, затем сравнение связывания этого лиганда с подвергнутым отжигу олигонуклеотидом и без подвергнутого отжигу олигонуклеотида. Если не наблюдается значимое различие связывания между лигандом с отожженным олигонуклеотидом и лигандом без отожженного олигонуклеотида, это позволяет предполагать, что отожженная часть лиганда является несущественной для связывания этого лиганда с белком-мишенью. Этот способ может выполняться с использованием олигонуклеотидов, которые отжигаются до различных длин 5'- или 3'-концов этого лиганда с определением 5'и 3'-связей, которые обеспечивают полностью функциональный лиганд.
В другом варианте осуществления это конструирование включает в себя уменьшение размера лиганда. В другом варианте осуществления размер модулятора изменен относительно размера этого лиганда. Еще в одном варианте осуществления нитки гуанинов уменьшены до менее чем четырех гуанинов, или менее чем трех гуанинов, или менее чем двух гуанинов или до отсутствия гуанинов. Однако, совместное действие этих изменений должно решать проблему создания лиганда, который обеспечивает адекватную активность, но легко нейтрализоваться этим модулятором.
Для нацеливания модулятора, улучшенный лиганд может быть также модифицирован таким образом, что он включает в себя одноцепочечный хвост (3' или 5') для стимуляции ассоциации с олигонуклеотидным модулятором. Подходящие хвосты могут содержать 1 нт-20 нт, предпочтительно 1 нт-10 нт, 1 нт-5 нт или 3 нт-5 нт, где этим нуклеотидом в каждом положении в этом хвосте могут быть А, С, О, Т или и. Вполне понятно, что такие хвосты могут включать в себя модифицированные нуклеотиды, как описано более подробно ниже.
Имеющие хвосты лиганды могут быть тестированы в анализах связывания и биоанализах (например, как описано ниже) для подтверждения, что добавление одноцепочечного хвоста не разрушает активную структуру этого лиганда. Ряд олигонуклеотидов (например, 2'-О-метилолигонуклеотидов), которые могут образовывать, например, 1, 3 или 5 п.н. с последовательностью хвоста, могут быть сконструированы и тестированы на их способность ассоциироваться с одним лигандом с хвостом, а также на их способность увеличивать скорость диссоциации этого лиганда или скорость ассоциации этого лиганда с их молекулой-мишенью. Контроли перемешанных последовательностей могут быть использованы для подтверждения, что эти эффекты обусловлены образованием дуплексов и не являются неспецифическими эффектами.
Лиганды СЬЕС-2 могут быть также сконструированы таким образом, что они имеют суицидное положение, которое делает возможной эффективную регуляцию спаренных модуляторов. После связывания лиганда с этим модулятором это суицидное положение становится одноцепочечным и лабильным, облегчающим посредством этого расщепление этого лиганда ферментами, природно представленными в крови, такими как эндонуклеазы крови или эндонуклеазы печени. Это обеспечивает способ для эффективной и безотлагательной элиминации активного лиганда из кровотока.
- 22 026309
Химические модификации
Одной проблемой, встречающейся в терапевтическом применении нуклеиновых кислот, является то, что олигонуклеотиды в их фосфодиэфирной форме могут деградироваться в биологических жидкостях внутриклеточными и внеклеточными ферментами, такими как эндонуклеазы и экзонуклеазы, до манифестации полного действия. Некоторые химические модификации нуклеиново-кислотного лиганда могут увеличивать ίη νίνο стабильность нуклеиново-кислотного лиганда или усиливать или опосредовать доставку этого нуклеиново-кислотного лиганда. Дополнительно, некоторые химические модификации могут увеличивать аффинность этого нуклеиново-кислотного лиганда в отношении его мишени, стабилизацией или стимулированием образования требуемых структурных элементов в нуклеиновокислотном лиганде или обеспечением дополнительных молекулярных взаимодействий с молекулоймишенью.
Модификации этих лигандов могут включать в себя, но не ограничиваются ими, модификации, которые обеспечивают химические группы, которые включают в себя, но не ограничиваются ими, химические группы, которые обеспечивают дополнительный заряд, способность к поляризации, гидрофобность, образование водородных связей, электростатические взаимодействия и функциональность в отношении оснований нуклеиново-кислотного лиганда или в отношении этого лиганда в целом. Модификации могут находиться в части основания, сахарной части или фосфатном скелете, например, для улучшения таких свойств, как стабильность молекулы и аффинность в отношении предполагаемой мишени. Такие модификации включают в себя, но не ограничиваются ими, сахарные модификации в 2'-положении, пиримидиновые модификации в 5'-положении, пуриновые модификации в 8-положении, модификации при экзоциклических аминах, замену 4-тиоуридина, замену 5-бром- или 5-иодурацила, модификации скелета молекулы, фосфоротиоатные или алкилфосфатные модификации, метилирования, необычные комбинации спаривания оснований, такие как изооснования изоцитидин и изогуанин и т.п. Модификации могут также включать в себя 3'- и 5'-модификации, такие как кэппирование.
Способ §ЕЬЕХ включает в себя идентификацию высокоаффинных нуклеиново-кислотных лигандов, содержащих модифицированные нуклеотиды, придающие улучшенные характеристики на этом лиганде, такие как улучшенная стабильность ίη νίνο или улучшенные характеристики доставки. Примеры таких модификаций включают в себя химические замены в положениях рибозы и/или фосфата и/или положениях оснований. Идентифицированные с использованием §ЕЬЕХ нуклеиново-кислотные лиганды, содержащие модифицированные нуклеотиды, описаны в патенте США № 5660985, который описывает олигонуклеотиды, содержащие нуклеотидные производные, химически модифицированные в 5'- и 2'положениях пиримидинов. Патент США № 5580737 описывает специфические нуклеиново-кислотные лиганды, содержащие один или несколько нуклеотидов, модифицированных 2'-амино (2'-ИН2), 2'-фтором (2'-Р) и/или 2'-0-метилом (2'-ОМе).
Способ §ЕЬЕХ включает в себя объединение отобранных олигонуклеотидов с другими отобранными олигонуклеотидами и не-олигонуклеотидными функциональными звеньями, описанными в патентах США с номерами 5637459 и 5683867. Патент США № 5637459 описывает высокоспецифические нуклеиново-кислотные лиганды, содержащие один или несколько нуклеотидов, модифицированных 2'-амино (2'-ИН2), 2'-фтором (2'-Р) и/или 2'-0-метилом (2'-ОМе). Способ §ЕЬЕХ дополнительно включает в себя объединение отобранных нуклеиново-кислотных лигандов с липофильными или Не-иммуногенными соединениями, соединениями с высокой молекулярной массой в диагностическом или терапевтическом комплексе, как описано в патенте США № 6011020.
При получении нуклеиново-кислотных лигандов по способу §ЕЬЕХ, эти модификации могут быть пре- или пост-§ЕЬЕХ-модификациями. Пре-§ЕЬЕХ модификации могут давать лиганды, имеющие как специфичность в отношении в отношении их мишени, так и увеличенную стабильность ίη νίνο. Пост§ЕЬЕХ модификации, произведенные для 2'-гидроксил-(2'-ОН)-нуклеиново-кислотных лигандов, могут приводить к улучшенной стабильности ίη νίνο без вредного действия на способность связывания нуклеиново-кислотных лигандов. В одном варианте осуществления модификации этого лиганда включают в себя 3'-3'-инвертированную фосфодиэфирную связь на 3'-конце этой молекулы и 2'-фтор-(2'-Р), 2'-амино (2'-ИН2), 2'-дезокси- и/или 2'-0-метил(2'-ОМе) модификацию некоторых или всех из этих нуклеотидов.
Описанные здесь лиганды исходно генерировали посредством §ЕЬЕХ с использованием библиотек транскриптов, в которых остатки С и и были 2'-фторзамещенными и остатки А и О были 2'-ОН.
В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновые кислоты, образующие этот лиганд, включают в себя модифицированные сахара и/или модифицированные основания. В некоторых вариантах осуществления эти модификации включают в себя стабилизирующие модификации, такие как 2'-стабилизирующие модификации. В одном варианте осуществления 2'-стабилизирующие модификации могут включать в себя 2'-фтор-модификации на сахарном кольце.
В одном варианте осуществления это конструирование включает в себя уменьшение содержания 2'гидроксила этого лиганда или этого модулятора или обоих. В другом варианте осуществления это конструирование включает в себя 2'-0-метил-содержание этого лиганда или этого модулятора или обоих.
В фармацевтических композициях эти лиганды могут быть обеспечены в формах, таких как формы соли, которые улучшают растворимость или биодоступность. Подходящие соли включают в себя неорга- 23 026309 нические катионы, такие как натрий и калий.
Любой из олигонуклеотидов этого описания может быть синтезирован стандартными способами, известными в данной области, например, с использованием автоматизированного ДНК-синтезатора (такого как коммерчески доступные ДНК-синтезаторы, доступные, например, из ВюкеагсЪ, АррНей Вюкук!етк).
Лиганды и модуляторы описываются здесь с использованием сокращений, легко понимаемых квалифицированными специалистами, и иллюстрируются следующим образом: гА обозначает 2'ОН А или аденозин; А обозначает 2'-дезокси А или 2'-дезоксиаденозин; тА обозначает 2'-О-метил А или 2'метокси-2'-дезоксиаденин; гО обозначает 2'-ОН О или гуанозин; О обозначает 2'-дезокси О или 2'дезоксигуанозин; тО обозначает 2'-О-метил О или ог 2'-метокси-2'-дезоксигуанозин; £С обозначает 2'-фтор С или 2'-фтор-2'-дезоксицитидин; тС обозначает 2'-О-метил С или метокси-2'-дезоксицитидин; ίϋ обозначает 2'-фтор и или 2'-фторуридин; ти обозначает 2'-О-метил и или 2'-метоксиуридин; и ГТ обозначает инвертированный 2'Н Т.
Связывание с носителем
Описанные здесь лиганды могут также включать в себя модификации, которые улучшают биодоступность или стабильность. Такие модификации могут включать в себя конъюгацию с молекулой носителя, которая может включать в себя, но не ограничивается ими, гидрофильную или гидрофобную часть молекулы.
Способы для лечения СЬЕС-2-опосредованных нарушений
В одном варианте осуществления обеспечен способ для лечения СЬЕС-2-опосредованного нарушения, предусматривающий введение хозяину, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества лиганда или его фармацевтически приемлемой соли, как описано здесь.
СЬЕС-2 был впервые идентифицирован как медиатор агрегации тромбоцитов (в отношении обзора, см. Б^икЫпоие е! а1, 2011, 1. ТЪготЪ Наеток!ак1к, 9 (81):44-55). Затем было показано, что СЬЕС-2 участвует в образовании и стабилизации образовании тромбов. Таким образом, лиганды СЬЕС-2, которые способны ингибировать функцию или активность СЬЕС-2, могут быть использованы для терапевтического воздействия на различные опосредованные тромбоцитами нарушения. В одном варианте осуществления это СЬЕС-2-опосредованное нарушение включает в себя сосудистое нарушение. В другом варианте осуществления это сосудистое нарушение выбрано из группы, состоящей из острых коронарных синдромов, тромбоза, тромбоэмболии, тромбоцитопении, заболевания периферических сосудов и транзиторного ишемического приступа. Описанные здесь композиции применимы также для лечения цереброваскулярного нарушения, включающего в себя, но не ограничивающегося ими, транзиторный ишемический приступ, ишемический инсульт и эмболию.
В одном варианте осуществления СЬЕС-2-опосредованным нарушением является связанное с диабетом нарушение. В одном варианте осуществления связанное с диабетом нарушение выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетической васкулопатии, атеросклероза, ишемического инсульта заболевания периферических сосудов, острого почечного повреждения и хронической почечной недостаточности.
В одном варианте осуществления это СЬЕС-2-опосредованное нарушение включает в себя опосредуемое тромбоцитами воспалительное нарушение. В другом варианте осуществления это опосредуемое тромбоцитами воспалительное нарушение выбрано из группы, состоящей из артрита, ревматоидного артрита, псориатического артрита, реактивного артрита, воспалительного заболевания пищеварительного тракта, анкилозирующего спондилита и склеродермии.
В одном варианте осуществления этим СЬЕС-2-опосредованным нарушением является рак. Уже давно предполагалось, что тромбоциты участвуют в метастазировании и/или прогрессировании рака (ИакЪ е! а1., 202, Ьапсе! Опсо1, 3:425-430). Агрегаты тромбоцитов, окружающие опухолевые клетки, могут защищать их от напряжения сдвига и ИК-клеток в крови, облегчая посредством этого образование очагов опухолевых клеток. Кроме того, со времени открытия подопланина в качестве эндогенного лиганда СЬЕС-2, экспериментальные данные позволяли предположить, что СЬЕС-2/подопланин может быть жизнеспособной мишенью для антиметастатических лекарственных средств. Например, блокирующее анти-подопланин-антитело значимо ингибировало количество метастатических легочных узелков, состоящих из опухолевых клеток, экспрессирующих подопланин (Ка!о е! а1., 2008, Сапсег 8с1, 99:54-61).
Описанные здесь лиганды СЬЕС-2, которые, как показано, ингибируют СЬЕС-2-опосредованную агрегацию тромбоцитов, имеют терапевтическое применение в лечении и ингибировании метастазирования опухолей. В одном варианте осуществления рак выбран из группы, состоящей из рака легкого, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичек, рака поджелудочной железы, рака головного мозга, рака костей и рака печени. Однако, понятно, что лиганды СЬЕС-2, описанные здесь, могут быть применимы в лечении или ингибировании любого рака, который метастазирует или, согласно мнению квалифицированного специалиста, имеет вероятность метастазирования.
В другом варианте осуществления лиганд СЬЕС-2 ингибирует инициацию активации тромбоцитов. В других вариантах осуществления, этот лиганд СЬЕС-2 ингибирует активацию тромбоцитов и провоспалительную реакцию полученных тромбоцитов. В других вариантах осуществления лиганд СЬЕС-2
- 24 026309 ингибирует адгезию тромбоцитов. В других вариантах осуществления лиганд СЬЕС-2 ингибирует агрегацию тромбоцитов. Еще в одном дополнительном варианте осуществления этот лиганд СЬЕС-2 ингибирует генерирование тромбина.
В некоторых вариантах осуществления обеспечен способ лечения или предотвращения образования сосудистого события, в частности, тромботического или тромбоэмболического события, предусматривающий введение нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2, описанного здесь, хозяину, нуждающемуся в этом.
В одном варианте осуществления нуклеиново-кислотный лиганд СЬЕС-2 обеспечивается в течение продолжительного периода времени. В этом случае, модулятор лиганда СЬЕС-2 может быть использован только в чрезвычайных ситуациях, например, если лечение приводит к кровотечению, в том числе внутричерепному или желудочно-кишечному кровотечению. В другом варианте осуществления этот модулятор вводят при необходимости неотложной хирургии для пациентов, которые получали лечение нуклеиново-кислотным лигандом СЬЕС-2. В другом варианте осуществления этот модулятор вводят для контроля концентрации нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 и тем самым продолжительности и интенсивности лечения. В другом варианте осуществления нуклеиново-кислотный лиганд СЬЕС-2 обеспечен в качестве тромбоцитарного анестетика во время процедуры искусственного (экстрапульмонарного) кровообращения. В другом варианте осуществления нуклеиново-кислотный лиганд СЬЕС-2 вводят для обеспечения периода перехода от пероральных антитромбоцитарных лекарственных средств или перехода к пероральным антитромбоцитарным лекарственным средствам, и этот модулятор используют для обращения нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2, как только устанавливаются терапевтические уровни перорального антитромбоцитарного агента.
Описанные здесь способы могут быть использованы в комбинации с другой терапией.
В одном варианте осуществления хозяина готовят к подверганию хирургическому вмешательству, или он подвергается хирургическому вмешательству, или он был подготовлен к хирургическому вмешательству, которое подвергает его риску окклюзионного тромботического события. В других вариантах осуществления этот хозяин получает сосуд-трансплантат для выполнения гемодиализа, который находится при риске закупорки вследствие взаимодействий между этим сосудом и тромбоцитами.
В одном варианте осуществления эта терапия включает в себя лечение хозяина терапевтически эффективным количеством противоракового или антитромбатического агента.
В одном варианте осуществления эта терапия включает в себя лечение хозяина терапевтически эффективным количеством анти-ВИЧ-агента, выбранного из группы, состоящей из антивирусных агентов ВИЧ, иммуномодуляторов и противоинфекционных агентов.
Введение и фармацевтическая композиция
Нуклеиново-кислотные лиганды СЬЕС-2 или модуляторы лиганда СЬЕС-2, описанные здесь, могут быть приготовлены в виде фармацевтических композиций, которые могут включать в себя, но не ограничиваются ими, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент. Точная природа этой композиции будет зависеть, по меньшей мере частично, от природы этого лиганда и/или модулятора, в том числе любых стабилизирующих модификаций, и способа введения. Композиции, содержащие этот модулятор, могут быть сконструированы для введения хозяину, который получал нуклеиновокислотный лиганд СЬЕС-2, для возможности модуляции активности этого лиганда, и, следовательно, регуляции антитромбоцитарной активности вводимого нуклеиново-кислотнного лиганда СЬЕС-2.
Это конструирование и приготовление фармацевтических или фармакологических композиций будет известно квалифицированным в данной области специалистам в свете данного описания. Обычно, такие композиции могут быть приготовлены в виде инъекционно вводимых препаратов, либо в виде растворов, либо в виде суспензий; твердых форм, подходящих для растворения или для суспендирования в жидкости перед инъекцией; в виде таблеток или других твердых веществ для перорального введения; в виде капсул с пролонгированным действием, в виде жидкостей для перорального введения; в виде эликсиров, сиропов, суппозиториев, гелей или любой другой формы, используемой в данной области, в том числе глазных капель, кремов, лосьонов, мазей, ингаляционных средств и т.п. Применение стерильных препаратов, таких как промывки на основе солей, хирургами, врачами или работниками медикосанитарной службы для лечения конкретной зоны в операционном поле может быть также особенно полезным. Композиции могут быть также приготовлены для доставки через микроустройства, микрочастицы или губки. Композиции могут быть также нанесены на имплантированные медицинские устройства, такие как стенты, для локальной доставки.
Фармацевтически применимые композиции, содержащие нуклеиново-кислотный лиганд СЬЕС-2 или модулятор лиганда СЬЕС-2, могут быть приготовлены по меньшей мере частично примешиванием фармацевтически активного носителя. Примеры таких носителей и способов приготовления могут быть найдены в ЬепипдЮп: ТНс §аепсе апй Ргасйсе о£ Ркагтасу, 201И οόίΐίοη (Ырршсой ХУППапъ & ^ίΙΚίηδ. 2000) и Лп5е1 е1 а1., Рйагтасеийса1 Эокаде Рогтк апй Эгид ЭеПуегу 8у81ет8, 61Ι1 Ей. (МеФа, Ра.: ХУППапъ & ХУПкпк 1995).
Подходящие фармацевтические эксципиенты включают в себя стабилизаторы, антиоксиданты, корректирующие осмоляльность агенты, буферы и корректирующие рН агенты, в том числе, но не только,
- 25 026309 забуференный фосфатом солевой раствор (ЗФР). Подходящие добавки включают в себя физиологически биосовместимые буферы (например, гидрохлорид трометамина), добавления хелатных соединений (таких как, например, ЕЭТА, ΌΤΡΑ или ΌΤΡΑ-бисамид) или кальций-хелатных комплексов (например, кальций ΌΤΡΑ, СаЯаЭТРА-бисамид), или, необязательно, добавления солей кальция или натрия (например, хлорида натрия, хлорида кальция, глюконата кальция или лактата кальция). Фармацевтические композиции могут быть упакованы для применения в жидкой форме или могут быть лиофилизированы.
Для образования фармацевтически приемлемой композиции, подходящей для эффективного введения, такие композиции будут содержать эффективное количество нуклеиново-кислотного лиганда или модулятора. Такие композиции могут содержать добавки более чем одного соединения. Эти композиции обычно содержат приблизительно 0,1 мас.%, приблизительно 50 мас.%, приблизительно 1 мас.%, приблизительно 25 мас.%, или приблизительно 5 мас.%, приблизительно 20 мас.% активного агента (лиганда или модулятора).
Здесь обеспечены фармацевтические композиции для парентерального введения, в том числе для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций или инфузий. Для парентерального введения желательными являются асептические суспензии и растворы. Когда желательной является внутривенное введение, используют изотонические препараты, которые обычно содержат подходящие консерванты. Эти фармацевтические композиции могут быть стерилизованы и/или содержат адъюванты, такие как консервирующие, стабилизирующие, увлажняющие или эмульгирующие агенты, усилители растворения, соли для регуляции осмотического давления и/или буферов. Жидкие, особенно инъецируемые композиции могут быть, например, приготовлены растворением, диспергированием и т.д. Активное соединение растворяют в фармацевтически чистом растворителе или смешивают с фармацевтически чистым растворителем, таким как, например, вода, забуференная вода, солевой раствор, 0,4%-ный солевой раствор, 0,3%-ный глицин, гиалуроновая кислота, водная декстроза, глицерин, этанол и т.п., для образования посредством этого инъецируемого раствора или суспензии.
Дополнительно, могут быть приготовлены твердые формы для растворения в жидкости перед инъекцией.
Для облегчения растворения агента в водной среде, в качестве увлажняющего агента может быть добавлено поверхностно-активное вещество. Поверхностно-активные вещества включают в себя аниогенные детергенты вещества, такие как лаурилсульфат натрия, сульфосукцинат диоктилнатрия и сульфонат диоктилнатрия. Могут быть использованы катионогенные детергенты, и они могут включать в себя хлорид бензалкония или хлорид бензетония. Неионогенные детергенты, которые могли бы быть включены в препарат в качестве поверхностно-активных веществ, включают в себя, но не ограничиваются ими, лауромакрогол 400, полиоксил 40-стеарат, полиоксиэтилированное гидрогенизированное касторовое масло 10, 50 и 60, моностеарат глицерина, полисорбат 20, 40, 60, 65 и 80, эфир сахарозы и жирной кислоты, метилцелюлозу, карбоксиметилцелюлозу и любой из плюрониковых детергентов, такой как Плюроник Р68 и/или Плюроник Р127 (например, см. З1гаррс с1 а1. Еиг. ί. οί РЬагш. ВюрЬагт., 2005, 61:126-133). Поверхностно-активные вещества могли бы присутствовать в этом препарате белка или производного, либо отдельно, либо в виде смеси в различных соотношениях.
Для перорального введения в форме таблетки или капсулы активный компонент лекарственного средства может объединяться с пероральным, нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и т. п. Кроме того, когда это желательно или необходимо, подходящие связывающие агенты, смазывающие вещества, дезинтегрирующие агенты и красящие агенты могут быть также включены в эту смесь. Подходящие связывающие агенты включают в себя, без ограничения, крахмал, желатин, природные сахара, такие как глюкоза или бета-лактоза, сахаристое вещество из кукурузы, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, трагакант или альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлозу, полиэтиленглиноль, воски и т. п. Смазывающие вещества, используемые в этих лекарственных формах, включают в себя, без ограничения, олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т. п. Дезинтеграторы включают в себя, без ограничения, крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую камедь и т.п.
Для жидких форм, используемых в пероральном введении, активный компонент лекарственного средства может быть объединен с подходящим образом ароматизированными суспендирующими или диспергирующими агентами, такими как синтетические и природные камеди, трагакант, аравийская камедь, метилцеллюлоза и т. п. Другие диспергирующие агенты, которые могут быть использованы, включают в себя глицерин и т. п.
Локальные препараты, содержащие активный компонент лекарственного средства, могут быть смешаны с различными материалами-носителями, хорошо известными в данной области, такими как, например, спирты, гель ;·ι1οο усга, аллантоин, глицерин, витаминизированные А- и Е-масла, минеральное масло, РРО2 миристилэфиропропионат, и т.п., для образования, например, спиртовых растворов, локальных детергентов, очищающих кремов, кожных гелей, кожных лосьонов и шампуней в препаратах в виде кремов или гелей.
Эти лиганды могут также вводиться в форме липосомных систем доставки, таких как малые однослойные пузырьки, большие однослойные пузырьки и многослойные пузырьки. Липосомы могут быть
- 26 026309 образованы из различных фосфолипидов, таких как холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины. Активные агенты, вводимые непосредственно (например, отдельно) или в липосомном препарате, описаны, например, в патенте США № 6147204.
Этот лиганд может быть также связан с растворимыми полимерами в качестве способных к нацеливанию носителей лекарственных средств. Такие полимеры могут включать в себя поливинилпирролидон, сополимер пирана, полигидроксипропилметакрил-амид-фенол, полигидрокси-этиласпартамидфенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный пальмитоильными остатками. Кроме того, эти лиганды могут быть связаны (предпочтительно через ковалентную связь) с классом биодеградируемых полимеров, применимых в достижении контролируемого высвобождения лекарственного средства, например, полиэтиленгликолем (РЕО), полимолочной кислотой, полиэпсилон капролактоном, полиоксазолинами, полигидроксимасляной кислотой, полиортоэфирами, полиацеталями, полигидро-пиранами, полицианоакрилатами и сшитыми или амфипатическими блоксополимерами гидрогелей. Холестерин и сходные молекулы могут быть связаны с нуклеиново-кислотными лигандами для увеличения и пролонгирования биодоступности.
Липофильные соединения и неиммуногенные высокомолекулярные соединения, с которыми модуляторы этого изобретения могут быть приготовлены для использования, могут быть получены любым из различных способов, известных в настоящее время в данной области, или затем разработаны далее. Обычно их готовят из фосфолипида, например, дистеароилфосфатидилхолина, и они могут включать в себя другие материалы, такие как нейтральные липиды, например, холестерин, а также модификаторами поверхности, такими как положительно заряженные (например, содержащие стериламин или аминоманнозу или аминоманнит производные холестерина) или отрицательно заряженные (например, диацетилфосфат, фосфатидилглицерин) соединения. Многослойные липосомы могут быть приготовлены общепринятым способом, т.е. помещением выбранного липида на внутреннюю стенку подходящего контейнера или сосуда растворением этого липида в подходящем растворителе, и затем упариванием этого растворителя с оставлением тонкой пленки внутри этого сосуда, или распылительной сушкой. Затем в этот сосуд добавляют водную фазу с применением вихревого движения или вортекса, которое приводит к образованию многослойных липосомных пузырьков (МЬУ). Однослойные липосомные пузырьки (ИУ) могут быть затем приготовлены гомогенизацией, обработкой ультразвуком или экструзией (через фильтры) МЬУ. Кроме того, ИУ могут быть образованы способами удаления детергентов. В некоторых вариантах этого описания, этот комплекс содержит липосому с нацеливающим нуклеиново-кислотным лигандом (лигандами), ассоциированными с поверхностью этой липосомы, и инкапсулированным терапевтическим или диагностическим агентом. Предварительно отформованные липосомы могут быть модифицированы для ассоциации с нуклеиново-кислотными лигандами. Например, катионная липосома ассоциируется через электростатические взаимодействия с нуклеиновой кислотой. Альтернативно, нуклеиновая кислота, присоединенная к липофильному соединению, такому как холестерин, может быть добавлена к предварительно сформованным липосомам, посредством чего этот холестерин становится ассоциированным с этой липосомной мембраной. Альтернативно, нуклеиновая кислота может быть ассоциирована с этой липосомой во время формования этой липосомы.
В другом варианте осуществления стент или медицинское устройство может быть покрыто препаратом, содержащим лиганд СЬЕС-2, или модулятор лиганда СЬЕС-2, в соответствии со способами, известными квалифицированным в данной области специалистам.
Рассматриваются также терапевтические наборы. Эти наборы содержат реагенты, активные агенты и материалы, которые могут потребоваться для применения на практике описанных выше способов. Эти наборы будут в основном содержать, в подходящих контейнерах, фармацевтически приемлемый препарат лиганда СЬЕС-2 и/или модулятора лиганда СЬЕС-2. Если этот набор содержит как лиганд СЬЕС-2, так и модулятор СЬЕС-2, этот модулятор СЬЕС-2, в некоторых вариантах осуществления, является модулятором, который связывает лиганд СЬЕС-2 в этом наборе. Этот набор может иметь единственный контейнер, и/или он может иметь разные контейнеры для каждого соединения.
Способы введения
Способы введения лигандов СЬЕС-2 и/или модуляторов лигандов СЬЕС-2 данного изобретения хозяину включают в себя, но не ограничиваются ими, парентеральное (инъекцией или постепенной инфузией на протяжении времени), внутривенное, интрадермальное, интраартикулярное, внутрисуставное, внутриоболочечное, внутриартериальное, интракардиальное, внутримышечное, подкожное, интраорбитальное, интракапсулярное, интраспинальное, внутригрудинное, локальное введение, введение с использованием трансдермального пластыря, ректальное, трансбуккальное, с использованием влагалищного или уретрального суппозитория, внутрибрюшинное, чрескожное, с использованием назального спрея, с использованием хирургического имплантата, с использованием хирургической кисточки для внутренних органов, с использованием инфузионного насоса или через катетер. В одном варианте осуществления этот агент и носитель вводят в препарате медленного высвобождения, таком как имплантат, болюс, микрочастица, микросфера, наночастица или наносфера. В одном варианте осуществления нуклеиновокислотный лиганд СЬЕС-2 доставляется посредством подкожной инъекции или депонирования, включающего в себя подкожную инфузию (например, с использованием осмотического насоса).
- 27 026309
В одном варианте осуществления нуклеиново-кислотный лиганд СЬЕС-2 доставляется посредством подкожного введения и модулятор доставляется подкожным или внутривенным введением.
Терапевтические композиции, содержащие лиганды и модуляторы данного изобретения, могут вводиться внутривенно, например, инъекцией унифицированной (стандартной) дозы. Термин унифицированная (стандартная) доза при применении в ссылке на терапевтическую композицию относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократной дозы для хозяина, причем каждая единица содержит заданное количество активного материала, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в ассоциации с требуемым разбавителем; т.е. носителем или наполнителем.
Дополнительно, один подход в отношении парентерального введения использует имплантацию систем медленного высвобождения или пролонгированного высвобождения, которое гарантирует, что поддерживается постоянный уровень дозы.
Обеспечено также локальное введение, например, в интерстиций пораженного сустава. Локальное введение может достигаться инъекцией, например, из шприца или другого изделия, включающего в себя инъекционное устройство, такое как игла. Скорость введения из шприца может регулироваться давлением на протяжении желаемого периода времени для распределения содержимого этого шприца. В другом примере, локальное введение может достигаться инфузией, которая может быть облегчена использованием насоса или другого сходного устройства.
Обеспечены также репрезентативные, неограничивающие подходы для локального введения в ткань сосудов, и они включают в себя (1) покрытие или импрегнацию ткани сосудов крови гелем, содержащим нуклеиново-кислотный лиганд, для доставки ίη νίνο, например, имлантацией этого покрытого или импрегнированного сосуда вместо поврежденного или больного сегмента ткани сосуда, который был удален или обойден; (2) доставку через катетер к сосуду, в котором желательна доставка; (3) подачу насосом композиции в сосуд, который подлежит имплантации в пациента.
Альтернативно, эти соединения могут вводиться в клетки микроинъекцией или липосомным инкапсулированием.
Обеспечено также введение лигандов СЬЕС-2 в субъект покрытием медицинских устройств, таких как стенты, фармацевтическими композициями, содержащими этот лиганд. Способы покрытия для получения подходящего высвобождения и введения этого лиганда известны специалисту с обычной квалификацией в данной области.
Оптимальные схемы для введения доз для описанных здесь композиций могут быть легко установлены квалифицированным в данной области специалистом и могут варьироватся в зависимости от модулятора, пациента и желаемого эффекта. Это эффективное количество может варьироваться в соответствии с различными факторами, такими как состояние, масса, пол, возраст индивидуума и количество вводимого нуклеиново-кислотного лиганда. Другие факторы включают в себя способ введения.
Фармацевтически эффективная доза зависит от типа заболевания, используемой композиции, способа введения и типа получающего лечение млекопитающего, физических характеристик конкретного рассматриваемого млекопитающего, одновременного медикаментозного лечения и других факторов, которые будут известны квалифицированным в этой области медицины специалистам. Обычно, эти композиции будут вводиться в дозах, корректированных в отношении массы тела, например, в дозах, находящихся в диапазоне от приблизительно 1 мкг/кг массы тела до приблизительно 100 мг/кг массы тела. Более часто, эти дозы будут находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг, и более часто от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, или приблизительно от 1,0 до приблизительно 5,0 мг/кг, или приблизительно от 1,0 мг/кг, приблизительно 2,0 мг/кг, приблизительно 3,0 мг/кг, приблизительно 4,0 мг/кг, приблизительно 5,0 мг/кг, приблизительно 6,0 мг/кг, приблизительно 7,0 мг/кг, приблизительно 8,0 мг/кг, приблизительно 9,0 мг/кг или приблизительно 10,0 мг/кг. Обычно, эта доза сначала обеспечивает концентрацию лекарственного средства в плазме приблизительно 0,002 мкг/мл-приблизительно 2000 мкг/мл лекарственного средства, более часто от приблизительно 2,0 мкг/мл до приблизительно 400 мкг/мл и более часто от приблизительно 10 мкг/мл до 200 мкг/мл или приблизительно 20 мкг/мл-приблизительно 100 мкг/мл лекарственного средства, приблизительно 20 мкг/мл, приблизительно 40 мкг/мл, приблизительно 60 мкг/мл, приблизительно 80 мкг/мл, приблизительно 100 мкг/мл, приблизительно 120 мкг/мл, приблизительно 140 мкг/мл, приблизительно 160 мкг/мл, приблизительно 180 мкг/мл или приблизительно 200 мкг/мл.
При введении модулятора в хозяина, которому уже вводили этот лиганд, отношение модулятора к лиганду может корректироваться на основе желаемого уровня ингибирования этого лиганда. Доза модулятора может быть рассчитана на основе корреляции с дозой лиганда. В одном варианте осуществления это отношение (масса к массе) дозы модулятора к дозе лиганда равно 1:1. В других вариантах осуществления, этот отношение модулятора к лиганду является более высоким, чем 1:1, таким как 2:1 или приблизительно 2:1, 3:1 или приблизительно 3:1, 4:1 или приблизительно 4:1, 5:1 или приблизительно 5:1, 6:1 или приблизительно 6:1, 7:1 или приблизительно 7:1, 8:1 или приблизительно 8:1, 9:1 или приблизительно 9:1, 10:1 или приблизительно 10:1 или более. В других вариантах осуществления это отношение (масса к массе) дозы модулятора к дозе лиганда равно менее чем 1:1, например, 0,9:1 или приблизительно 0,9:1, 0,8:1 или приблизительно 0,8:1, 0,7:1 или приблизительно 0,7:1, 0,6:1 или приблизительно 0,6:1,
- 28 026309
0,5:1 или приблизительно 0,5:1, 0,45:1 или приблизительно 0,45:1, 0,4:1 или приблизительно 0,4:1, 0,35:1 или приблизительно 0,35:1, 0,3:1 или приблизительно 0,3:1, 0,25:1 или приблизительно 0,25: 1, 0,2:1 или приблизительно 0,2:1, 0,15:1 или приблизительно 0,15:1, 0,1:1 или приблизительно 0,1:1 или менее чем 0,1:1, например, приблизительно 0,005:1 или менее. В некоторых вариантах осуществления это отношение доз (масса к массе) находится между 0,5:1 и 0,1:1 или между 0,5:1 и 0,2:1, или между 0,5:1 и 0,3:1. В других вариантах осуществления, это отношение доз (масса к массе) находится между 1:1 и 5:1, или между 1:1 и 10:1 или между 1:1 и 20:1.
Эти лиганды могут вводиться внутривенно в единственной суточной дозе, каждый второй день, или вся суточная доза может вводиться в виде нескольких разделенных доз. Введение лиганда и/или модулятора может обеспечиваться один раз в день (ц.6.), два раза в день (Ьл.6.), три раза в день (ΐ.ί.ά.) или более часто в случае необходимости. После этого этот модулятор обеспечивают любым подходящим способом для изменения действия нуклеиново-кислотного лиганда введением этого модулятора. Нуклеиновокислотные лиганды могут вводиться подкожно два раза в неделю, один раз в неделю, каждые две недели или один раз в месяц. В некоторых вариантах осуществления эти лиганды или модуляторы вводят менее часто, чем один раз в день. Например, введение лиганда может проводиться каждый второй день, каждый третий день, каждый четвертый день, один раз в неделю или один раз в месяц.
В одном варианте осуществления может быть желательным совместное введение или последовательное введение. Для комбинаторного лечения с использованием более чем одного активного агента, где эти активные агенты находятся в отдельных препаратах доз, эти активные агенты могут вводиться одновременно, или они могут вводиться в ступенчато расположенных точках времени.
Эти композиции вводят способом, совместимым с этими препаратами доз, и в терапевтически эффективном количестве. Вводимое количество зависит от подлежащего лечению хозяина, способности системы этого хозяина использовать этот активный ингредиент и степени желаемого терапевтического действия. Точные количества активного ингредиента, необходимые для введения, зависят от решения практикующего врача и являются конкретными для каждого индивидуума. Однако подходящие диапазоны доз для системного введения описаны здесь и зависят от способа введения. Подходящие схемы введения являются также вариабельными, но определяются начальным введением с последующими повторяемыми дозами при одном или нескольких часовых интервалах посредством последующей инъекции или другого введения. Альтернативно, обеспечена непрерывная внутривенная инфузия, достаточная для поддержания концентраций в крови в диапазонах, указанных для терапий ίη νίνο.
В некоторых вариантах осуществления композиции этого описания изобретения могут дополнительно содержать другой терапевтический агент. При использовании второго агента, этот второй агент может вводиться либо в отдельной лекарственной формы, либо в виде части единой лекарственной формы с этими соединениями или композициями. Хотя одно или несколько соединений этого изобретения могут быть использованы в применении монотерапии для лечения нарушения, заболевания или симптома, они могут быть также использованы в комбинированной терапии, в которой применение соединения или композиции (терапевтическиого агента) является объединенным с применением одного или нескольких других терапевтических агентов для лечения тех же самых и/или других типов нарушений, симптомов и заболеваний. Комбинированная терапия включает в себя введение двух или нескольких терапевтических агентов одновременно или последовательно. Эти агенты могут быть введены в любом порядке. Альтернативно, множественные терапевтические агенты могут быть объединены в единую композицию, которая может вводиться пациенту.
Способы характеристики лигандов СЬЕС-2 и модуляторов лигандов СЬЕС-2
В одном аспекте, данное описание изобретения обеспечивает способы для характеристики лигандов СЬЕС-2, которые могут функционировать в качестве активаторов или ингибиторов СЬЕС-2. Такие способы оценивают активность СЬЕС-2 в виде СЬЕС-2-опосредованной агрегации СЬЕС-2. В одном варианте осуществления эти анализы выполняют ίη νίΐτο или ίη νίνο с использованием анализов адгезии тромбоцитов на основе кровотока цельной крови.
Различные исследования предполагают, что, хотя СЬЕС-2 может не требоваться для начального прикрепления к покрытым коллагеном поверхностям, СЬЕС-2 может требоваться для стабилизации агрегатов тромбоцитов и роста тромбов. Роль СЬЕС-2 в тромбозе была исследована, например, с использованием СЬЕС-2-химер в мышах. Эти исследования предполагают, что СЬЕС-2 участвует в стабилизации тромбов как ίη νίΐτο, так и ίη νίνο (δπζυ&-ΐηοπ^ К. е1 а1., 2010, ΐ. Βίο1. СЬет. 285, 24494-24507). Эта роль рецептора СЬЕС-2 в стабилизации агрегатов тромбоцитов ίη νίΐτο была также недавно продемонстрирована с использованием анализа перфузии крови, где лишенные СЬЕС-2 тромбоциты были способны прикрепляться нормально к покрытой коллагеном поверхности, но последующее образование стабильных агрегатов тромбоцитов сильно нарушалось при средних-высоких коэффициентах сдвига (Мау, Р. Е1 а1., 2009 Β1οο6, 114:3464-3472). В результате таких исследований, была выдвинута гипотеза, что СЬЕС-2 может способствовать росту тромба отбиранием функции СРУ в тромбоцитах, рекрутированных к растущему тромбу, которые не будут получать контакта с коллагеном (№5\\цп61. В. е1 а1., 2011, ΐ. ТЬгот. Наетο8ΐ, 9, 8ирр1 1:92-104). Другими словами, хотя прикрепление тромбоцитов к покрытой коллагеном поверхности и начальное образование тромба зависит от СРУЕ дальнейшая агрегация тромбоцитов, т.е.
- 29 026309 образование тромба, требует СЬЕС-2.
Адгезию тромбоцитов при проточных условиях на покрытых коллагеном поверхностях, использовали рутинным образом для исследования ίη νίΐτο и ίη νίνο роста и стабильности тромбов. Эти проточные эксперименты выполняли, например, с использованием прибора, такого как ВюЫих (Πιιχίοη Ьюкаенсек, δοιιΐΐι δηη Типикто, СА), который обеспечивает возможность подражания физиологическому потоку сдвига (сдвиговому течению) в модели ίη νίΐτο, с предоставлением также высокопроизводительного формата луночного планшета.
Спустя немного времени было обнаружено, что анализы адгезии тромбоцитов ίη νίΐτο на основе протекания с использованием цельной крови могли бы быть использованы для идентификации активаторов или ингибиторов СЬЕС-2-опосредованного образования агрегатов тромбоцитов. В одном варианте осуществления поверхность, которая подвергается сдвиговому протеканию цельной крови покрывают родоцитином, который, как известно, эффективно стимулирует СЬЕС-2-зависимое образование агрегатов тромбоцитов. Как подробно описано в примере 10 (фиг. 12А), применение покрытой родоцитином поверхности поддерживает накапливание активированных тромбоцитов в тромбах в условиях протекания в цельной крови. Этот способ анализа выполняли затем в присутствии предположительных ингибиторов или активаторов СЬЕС-2-зависимого образования агрегатов тромбоцитов. Например, пробу цельной крови инкубируют с соединением, о котором известно, что он связывает СЬЕС-2 (например, с любым из описанных здесь лигандов СЬЕС-2). Затем может быть сделано сравнение образования агрегатов тромбоцитов в присутствии и в отсутствие этого лиганда СЬЕС-2. Одним ингибитором СЬЕС-2-зависимого образования агрегатов тромбоцитов является лиганд СЬЕС-2, который уменьшает уровень образования агрегатов тромбоцитов по меньшей мере на 50%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% в сравнении с уровнем образования агрегатов тромбоцитов в отсутствие лиганда СЬЕС-2.
Этот анализ может быть также использован для идентификации модуляторов лиганда СЬЕС-2. Опять, как описано в примере 10, проба цельной крови может быть инкубирована в присутствии лиганда СЬЕС-2 в дополнительном присутствии или в отсутствие модулятора лиганда СЬЕС-2. Соединение, которое является функциональным модулятором лиганда СЬЕС-2, будет обращать активность этого лиганда СЬЕС-2. Например, если лиганд СЬЕС-2 уменьшил уровень образования агрегатов тромбоцитов, добавление функционального модулятора лиганда СЬЕС-2 будет приводить к увеличению образования агрегатов тромбоцитов относительно уровня, наблюдаемого в присутствии только лиганда СЬЕС-2.
Во втором протоколе, применимом для характеристики функции лиганда СЬЕС-2, выполняют анализы адгезии тромбоцитов на основе протекания ίη νίΐτο с использованием цельной крови, где эту цельную кровь подвергают действию поверхности, покрытой растворимым коллагеном типа I (коллагеном I). Например, Пример 10 (фиг. 12В) показывает анализы, выполненные с использованием ВЮРЬИХ, в которых лунки были покрыты растворимым коллагеном I хвоста крысы. В этом протоколе, пробу цельной крови инкубируют с родоцитином перед протеканием мимо покрытой растворимым коллагеном I поверхности. Присутствие родоцитина в пробе, приводило к образованию более крупных агрегатов тромбоцитов в сравнении с агрегатами тромбоцитов, образованными после протекания крови, лишенной родоцитина. Для тестирования способности лиганда СЬЕС-2 активировать или ингибировать СЬЕС-2опосредованное образование агрегатов тромбоцитов, пробу цельной крови инкубируют с лигандом СЬЕС-2 перед стадией протекания крови. Инкубирование с лигандом СЬЕС-2 может выполняться до или после инкубирования с родоцитином. Альтернативно, лиганд СЬЕС-2 и родоцитин добавляют одновременно с пробой крови. Как описано выше, затем может проводиться образование агрегатов тромбоцитов в присутствии и в отсутствие лиганда СЬЕС-2. Ингибитор СЬЕС-2-зависимого образования тромбоцитов является лигандом СЬЕС-2, который уменьшает уровень образования агрегатов тромбоцитов по меньшей мере на 50%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% в сравнении с уровнем образования агрегатов тромбоцитов в отсутствие лиганда СЬЕС-2. Далее, модулятор лиганда СЬЕС-2 может быть охарактеризован в отношении его способности обращать действия лиганда СЬЕС-2 на СЬЕС-2-опосредованное образование агрегатов тромбоцитов, как описано выше. Соединение, которое является функциональным модулятором лиганда СЬЕС-2, будет обращать активность лиганда СЬЕС-2. Например, если лиганд СЬЕС-2 уменьшил уровень агрегации тромбоцитов, добавление функционального модулятора лиганда СЬЕС-2 будет приводить к увеличению образования агрегатов тромбоцитов относительно уровня, наблюдаемого в присутствии только лиганда СЬЕС-2.
Понятно, что эти способы анализов для характеристики функциональной активности лигандов СЬЕС-2 и модуляторов лигандов СЬЕС-2 не ограничиваются использованием с пробами цельной крови. В некоторых вариантах осуществления, проба крови может включать в себя один или несколько природных компонентов крови. Эта проба крови может, в некоторых вариантах осуществления, включать в себя один или несколько искусственных компонентов крови. Альтернативно, проба крови, используемая в этом проточном анализе, является пробой, которая содержит цельную кровь или обогащенную тромбоцитами плазму или промытые тромбоциты.
Функциональная активность лигандов СЬЕС-2 и модуляторов может быть тестирована с использованием различных клеточных линий, например, эндотелиальных клеток, дендритных клеток, лейкоцитов, моноцитов, нейтрофилов, макрофагов, лимфоидных клеток, иммунных клеток, т.е. природных Т-клеток- 30 026309 киллеров, В-клеток. Различные функциональные анализы, включающие в себя взаимодействия тромбоцит-тромбоцит, взаимодействия тромбоцит-моноцит, взаимодействия тромбоцит-лейкоцит, передачу сигнала кальция, анализы адгезии клеток, анализы секреции, ЬР§-индуцированные анализы воспалении, анализы миграции клеток, §ук- и §гк-анализы фосфорилирования, анализы ЕЫ§Л для связывания лигандов, анализы занятия рецепторов на основе проточной цитометрии или анализы с использованием диагностических маркеров. Реагенты и синтетические эквиваленты модулятора рецептора СЬЕС-2, которые могут быть тестированы с аптамерными лигандами, являются сшитыми антителами, рецепторами СЬЕС2 исследований гомофильного взаимодействия, ингибиторами и активаторами малых молекул, пептидами, белками, моноклональными антителами, липопротеинами, липидированными пептидами и т.д.
Следующие примеры обеспечены для иллюстрации некоторых аспектов описания данного изобретения. Эти примеры не рассматриваются как ограничивающие каким-либо образом объем этого описания.
Примеры
Пример 1. Идентификация нуклеиново-кислотных лигандов к СЬЕС-2
Способ §ЕЬЕХ использовали для получения лигандов, которые связывают СЬЕС-2, как описано и иллюстрировано на фиг. 1.
Библиотеки кандидатных ДНК генерировали тепловым отжигом и быстрым охлаждением 1 нмоль олиго ДНК-матрицы и 1,5 нмоль олиго 5'-ДНК-праймера. Последовательностями олиго ДНК-матрицы 8е12 для конструирования кандидатной смеси являются: 5'- ТСТСССЛТСС ТСЛСССЛСТС
СТСТС(Ы40)ССССЛ ТССТССТССС ТА-3' (8ЕЦ ГО N0:4) (N40 представляет 40 смежных нуклеотидов, синтезированных с эквимолярными количествами А, Т, С и С), олиго 5'-праймера и олиго 3'-праймера, являются соответственно 5'-СССССААТТС ТААТАССАСТ САСТАТАССС АССАССАТСС СС-3' (последовательность Т7-промотора указана жирным шрифтом), и 5'-ТСТСССАТСС ТСАСССАСТС СТСТС-3'. Эти реакции заполняли Еxο-К1еηο№, останавливали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 2 мМ и экстрагировали РС1 [фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1)] и затем смесью хлороформ: изоамиловый спирт (24:1). Этот экстракт обессоливали, концентрировали и невключенные нуклеотиды удаляли с использованием колонки Λιηχοη 10 δρίη. ДНК-матрицы использовали в реакции транскрипции для генерирования 2'-фторпиримидиновой исходной библиотеки. Условиями транскрипции ίη νίίτο были 40 мМ Трис-НС1 рН 8,0, 4% РЕС-800, 12 мМ М§С12, 1 мМ спермидин, 0,002% Тритон, 5 мМ ДТТ, 1 мМ гСТР, 1 мМ гАТР, 3 мМ 2'Р-СТР, 3 мМ 2'Р-иТР, 8 мкг/мл неорганической пирофосфатазы, 0,5 мкМ ДНК-библиотеки и Т7-полимераза. Смеси для транскрипции инкубировали в течение ночи при 37°С, обрабатывали ДНКазой, дважды экстрагировали смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), концентрировали с использованием колонки Аш/топ 10 δρίη и очищали в геле на 12% денатурирующем геле электрофореза в ПААГ. РНК элюировали из геля и буфер заменяли и концентрировали с ТЕпромывками в колонке А^^п 10 δρίη.
Селекцию (отбор) СЬЕС-2 начинали с комплексной библиотекой из ~1014 различных 2фторпиримидиновых РНК-последовательностей. Этот комплексный пул РНК предварительно очищали против биотин-РЕС6-Н186 пептида, иммобилизованного на магнитных стрептавидиновых гранулах. Эту предварительно очищенную РНК связывали с очищенным рекомбинантным меченом на Ν-конце Ηίδ10 белком СЬЕС-2 (8ЕЦ ГО N0:3). Очищенный меченый гистидином белок СЬЕС-2 получали из Κ&Ό δуδίетδ (Μίη^αρο1ίδ, ΜΝ), ί’αΙα1ο§ Νο. 1718-СЬ-050, и включали остатки С1п58-Рго229.
Селекция лиганда СЬЕС-2 выполняли в буфере для связывания Р. Буфер для связывания Р стоит из 20 мМ НЕРЕ8 рН 7,4, 150 мМ №С1, 2 мМ СаС12 и 0,01% БСА. Начиная в раунде 3, 0,0024% тРНК дрожжей включали в раундах реакций связывания. Комплексы Белок-РНК распределяли на диске 25 мм нитроцеллюлозы с промыванием. Связанную РНК экстрагировали из нитроцеллюлозного диска инкубацией в РС1 (25:24:1). Добавляли воду и эту водную фазу экстрагировали с последующей экстракцией смесью хлороформ: изоамиловый спирт. Полученную связанную РНК осаждали этанолом. Одну четверть этой осажденной РНК отжигали до 3'-праймера и обратно транскрибировали с использованием АМУ КТ. Использовали полную КТ-реакцию в ПЦР с 5'- и 3'-праймерами и стандартными условиями ПЦР для генерирования ДНК-матрицы для следующего раунда генерирования РНК. Конкретные условия для каждого раунда селекции показаны на фиг. 2.
Обогащение библиотек лигандов в отношении СЬЕС-2 подвергали мониторингу в прямых исследованиях связывания с использованием пулов РНК радиоактивно меченых лигандов из соответствующих раундов и растворимого СЬЕС-2. Исследования связывания выполняли с Р32 меченой на конце РНК, добавляемой к серийным разведениям СЬЕС-2 в буфере для связывания Р. Для приготовления радиоактивно меченых РНК для исследований связывания, сто пикомолей РНК дефосфорилировали Бактериальной Щелочной Фосфатазой при 50°С в течение 1 ч. Эту реакцию экстрагировали смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1) и осаждали этанолом. Три пмоль дефосфорилированной РНК метили на конце с использованием Полинуклеотидкиназы Т4 с добавленным буфером и 20 мкКи у-32Р-АТФ и затем очищали с использованием спин-колонки Вютай МюгоВю δρίη Р-30. Меченую на конце РНК разбавляли до конечной концентрации 2000 имп/мкл и денатурировали нагреванием при 65°С в течение 5 мин. Разведения РНК и СЬЕС-2 уравновешивали при 37°С перед использованием. РНК (5 мкл) добавля- 31 026309 ли к варьирующимся концентрациям СЬЕС-2 (15 мкл) при 37°С и инкубировали вместе в течение 5-15 мин. Затем эту комплексную смесь КNΑ/С^ЕС-2-белок наносили на нитроцеллюлозную мембрану Ргоίΐ3η ВА85, нанесенную в виде слоя на мембрану Оеиебсгееи Р1из \ν1οη, в 96-луночной вакуумной распределительной системе с промыванием. Эту мембрану экспонировали с использованием фосфоресцирующего экрана, сканировали и количественно обрабатывали с использованием М^есЫаг ΙΧηπηι^ §1οΐ'ΐιι 840 РЬοзрЬο^^таβе^. Связанную фракцию рассчитывали делением количества импульсов на нитроцеллюлозе на общее количество импульсов и коррекцией в отношении фона. Обогащение связывания селекции СЕЕС-2 показано на фиг. 3.
Пример 2. Секвенирование и идентификация нуклеиново-кислотных лигандов СЕЕС-2
Конечные ПЦР-продукты, представляющие анти-СЕЕС-2-обогащенные библиотеки лигандов из Раунда 10 экспериментов §Р1,РХ, описанных в примере 1, расщепляли ΙφοΚΙ и ВатН1, очищали с использованием набора для очистки и направленно клонировали в линеаризованный вектор риС1. Бактериальные колонии высевали штрихом для получения отдельных клонов и ночные культуры (5 мкл) инокулировали из этих отдельных колоний. Плазмидную ДНК готовили из отдельных колоний с использованием наборов ΙηνίΐΐΌβίΛΐ РигеНик С)шск Р1азт1б Минргер и секвенировали с использованием праймера вектора. В целом секвенировали 42 колонии с 20, представляющими уникальные последовательности. Каждую из этих уникальных последовательностей оценивали в отношении СЕЕС-2-аффинности (в соответствии со способами в примере 1) и способности ингибировать индуцированную родоцитином СЕЕС2-зависимую агрегацию тромбоцитов (в соответствии со способами в примере 8). После анализа полученных данных для 20 клонов, идентифицировали лиганд §2-20 как высокоаффинный ингибитор СЕЕС2-зависимой агрегации и характеризовали более полно, как описано подробно ниже.
Последовательности случайного района ДНК, соответствующего РНК случайного района, полноразмерной ДНК, полноразмерной РНК и полноразмерной РНК с модификациями в отношении аптамера §2-20 показаны в табл. 1. Полноразмерными называют последовательности, происходящие как из способа §ЕЕЕХ, содержащие последовательности, произведенные как из случайной части библиотек лигандов, используемых в способе §ЕЕЕХ, так и последовательности из фиксированных частей последовательности, фланкирующих этот случайный район.
Таблица 1. Последовательности для лиганда §2-20 СЕЕС-2
Название клона Последовательность 1П ΝΟ:
днк- последовательность случайного района 82-20 АСТССССТСАТАТТСССССССАТСТТАСТАССТСССТГАТ 5
РНК- последовательность случайного района 32-20 АсиссосисАЦАиисссссссАисицАсиАСсисссциАи 6
Полноразмерная ДНКпоследовательность 52-20 СССАССАССАТСССОАСТССССТСАТАТТСССССССАТСТТАСТАССТСОСТТАТ САСАССАСТСССТСАССАТСССАСА 7
Полноразмерная РНКпоследовательность 52-20 СССАССАССАЦСЗСССАСиСОССЦСАЦАТОСССССОСАиСииАСЦАССЦСССЦЦАи САСАССАсиессисАСОАисссзАОА 8
Полноразмерная РНКпоследовательность 52-20 с модификациями гСгСгСгА:гСгСгА£СгСгА£ЦгС£СгСгСгА£С£игСгСгС£С£Ц£СгА£игА£ Ц£Ц£С£С£Сге£СгС£СгА£и£С£и£игА£С£игА£С£С£и£СгСгС£Ц£ОгА£Ц £СгАгСгА£СгСгА£С£и£СгС£С£ЦгСгАгСгСгА£и£С£СгСгАгСгА 9
§ЕР ΙΌ N0: относятся к немодифицированным версиям лигандов, описанных в столбце, озаглавленном Модифицированная последовательность, последовательности перечисляются в 5'-3'направлении γΟ-2'Κ16ο О; γΑ-2'Κ16ο А; £С-2'-фтор С; £Ц-2'-фтор и
Аффинность анти-СЕЕС-2-лиганда в отношении СЕЕС-2 определяли прямыми исследованиями связывания радиоактивно меченой РНК лиганда и растворимого СЕЕС-2, как описано выше в примере 1. Аффинность анти-СЕЕС-2 лиганда, §2-20, в отношении СЕЕС-2 была высокой, с Кб ~1,4 нМ.
Пример 3. Зондирование укорочения последовательности анти-СЕЕС-2-лиганда
Скрининг §2-20 на потенциальную вторичную структуру проводили с использованием т&1бсервера (т&М.Ъют&.грЁеби). Описание этих способов можно найти на сайте сервера, а также в М. /пкег (2003) М&1б \хеЪ зегхег Юг иисклс ас1б ίοΜΐηβ аиб ЬуЪ^^б^ζаί^οη р^еб^сί^οη. кисклс Ас1бз Кез. 31 (13), 3406-15 и Ώ.Η. Мабтеуз, еί а1. (1999) Еxраηбеб §е^иеηсе ^ереηбеηсе ο£ ТЬе^тοбуηат^с Ра^атеίе^з 1тртхез Р^б^^ ο£ КNΑ §есοηба^у §йисШге I. Μο1. Вю1. 288, 911-940. Генерировали ряд укороченных соединений для анти-СЕЕС-2-лиганда §2-20 (табл. 2) и определяли их аффинность в отношении СЕЕС-2 (табл. 2). За исключением КВ587, все укороченные соединения транскрибировали ΐη νίίτο из ДНКматриц. КВ587 синтезировали на ДНК/РНК-синтезаторе Мегтабе 12 с 1бТ, предварительно загруженным СРО. Данные связывания для полноразмерного аптамера §2-20, укороченного §2-20 Т10, и КВ587 показаны на фиг. 4.
- 32 026309
Таблица 2. Укорочения §2-20
Название клона Ρ Н К-п оследовательность ка (нМ) ЗВ<2 1Е> ΝΟ!
82-20 гСхСгСгАгСгагА£СхСгА£игС£СхОгОгА£С£игСгСгС£С£и£СгА£игА£и£и£С £с£СхО£СгС£СгА£и£С£и£ихА£С£ихА£С£С£и£СхСхО£и£игА£Ц£СгАгСгА£С гСгА£С £ Ь'£СгС£С £ игСгЛгЗГ(ЗгА£а£С£СгСгАгСгА 1.4 10
52-20 Т1 гСгСгСгАгСгСГА£СгОгА£игО£СгЙ.гСгА£С£игСгСгС£С£и£СгА£игА£и£Ц£С £С£СгС£СгЗ£СгА£Ц£С£и£игА£С£игА£С£С£и£СгСгС£и£игА£и 4.6 11
£2-20 Т2 гСг<ЗгОгАгСгОгА£СгСгА£игС£СгСгСгА£С£игСгСгС£С£и£СгА£игА£О£и£С £С£СгО£Сге£СгА£и£С£и£игА£С£ЦгА£С£С£и£С 2.8 12
32-20 ТЗ гСгСгСгАгОгСгА£СгСгА£игЗ£СгОгегА£С£игСгОгО£С£и£СгА£игА£и£и£С £С£СгС£СгО£СГА£и£С£и£игА£С£НгА 2.2 13
82-20 Т4 гСгСгСгАгСгСгА£СгСгА£игЗ£СгСгСгА£С£игС-гСгО£С£и£СгА£игА£Ц£У£С £С£СгО£СгО£СгА£и£С 1.4 14
82-20 Т5 гег(ЗгвгАгСгСгА£СгСгА£игО£СгСг<ЗгА£С£ЦгСгСгС£С£и£СгА£игА£а£и£С ЕСЕСхО аеай 15
32-20 Тб гОгбгСгА-............-гСгА£игО£СгСгСгА£С£игСгСгС£С£и£СгА£игА£Ц£и£С £С£СгС£СгС£СгА£и£С 1 16
32-20 Тб ехх 8Ьр гбгагагА--------гСгА£иге£СгС1ЛЗгА£С£игСгСгС£С£и£СгА£игА£и£Ц£С £С£СгС£Сгй£СгА£и£С£и£С 3.9 17
32-20 Тб ехЫОЬр гСгОхСхА--------гегА£ЦгЗ£СгЗгСгА£С£игОх-Сха£С£и£СгА£игА£и£и£С £С£СгО£СгС£СгА£и£С£и£С£С£С 4.6 18
32-20 Т7 хЦгСгОхА--------гОгА--гС£СгСгСгЛ£СЕих£1гСгС£С£и£СгА£игА£и£и£С £С£СгС£СгС£С--£и£С 3 19
32-20 ТЗ гСгОгОгА--------гОгА£и--£СгагСгА£С£игСгСгС£С£и£СгА£игА£и£и£С £С£СхО£СгО.....гА£Ц£С 1.6 20
32-20 Т9 х-СгСгСх-А------------гСх-А£иге—гСгОгА£С£ихСгСгС£С£Ст£Сг?Л:игА£и£и£С £С£СгС£С--£СгА£и£С 18.7 21
52-20 Т10 гСгОгСгА....................£игО£СхагСгА£С£№С!гСгС£С£и£СгА£игА£и£и£С £с£СгС£СгО£СгА£и£С 2.2 22
32-20 Т11 гСпЗхСхА........- -......-........£ихС£СгЗг5гА£С£СгСг(ЗхС£С£и£СгА£ихА£и£и£С £С £СгС£ СхС£СГАЕЦЕС 66 23
КВ 587 ----гСгА----------------£игб£Сг0гСгА£С£игСгСгС£С£и£СгА£игА£и£и£С £С£СгО£Сг<3£СгА£и£СЧат 2.9 24
§НС) II) N0: относится к немодифицированным версиям лигандов, описанных в столбце, озаглавленном Модифицированная последовательность, последовательности перечисляются в 5'-3'направлении γΟ-2'ΚΛο О; γΆ-2'ΚΛο А; ГС-2'-фтор С; Ги-2'-фтор и.
Вторичная структура укороченных §2-20 Т10 и КВ587 представлена в фиг. 5. Предсказанные границы 5'- и 3'-концов являются достаточными для образования стебля 1 и функциональных анти-СЬЕС-2лигандов. Если 3'-часть стебля 1 удалена, как в §2-20 Т5, связывание с СЬЕС-2 уничтожается. Данные связывания для §2-20 Т7 и §2-20 Т8 указывают на то, что стебель 1 может иметь длину 5 п.н. и все еще сохранять сравнимую аффинность связывания. Удлинение стебля 1, с 6 п.н. до 8-10 п.н., как показано с §2-20 Т6 ех!;8 и §2-20 Т6 ехП0, также связывало СЬЕС-2 с высокой аффинностью. Таким образом, стебель 1 может иметь длину 5-10 п.н. со сравнимыми аффинностями связывания.
Стебель 2 является стеблем из 4 п.н., предпочтительно с парой нуклеотидов неоднозначного спаривания в нижней части. §2-20 Т10 имеет единственную замену, изменяющую пару нуклеотидов нижней части стебля 2 из Ц-О в С-О. Эта замена хорошо переносится, как продемонстрировано значимым (приблизительно 30-кратным) увеличением Кб.
Пример 4. Мутационное зондирование последовательности анти-СЬЕС-2-лиганда
Генерировали ряд мутантных соединений для укорочений §2-20, содержащих нуклеотидные мутации в районах петли, и определяли их аффинность связывания в отношении СЬЕС-2 (табл. 3). За исключением КВ588, все мутантные укорочения транскрибировались ίη νίΐΐΌ из ДНК-матриц. КВ5887 синтезировали на ДНК/РНК-синтезаторе Мегтабе 12 с Ϊ6Τ, предварительно загруженным СРО.
Таблица 3. Мутации §2-20
Название клона Ρ Н К-последовател ьность ка (нМ) 8Е0 Χϋ ΝΟ:
32-20 Ми XI хОгбхОхА---- гСхА£ОгС£СгС£С£О£С£игСхСхС£С£и£СхА£ОгА£и£о£с£С£СгС£СгС£СгА£и£С >60 25
32-20 Ми г 2 х-СгСгСх’А........- г«гА£ЦгС£СгСгСгА£С £ОгСхСгбгСГА£СгА£ОкА£и£и£С£С£СхС£СгС£СгА£О£С >60 26
32-20 МиХЗ гСгОгС г А---- гегА£игО£СгСх-ОгА£С£их(ЗгСгО€С£иг<3£и£ихА£и£и£С£С£СхС£СхС£СгА£и£С >60 27
32-20 Мих 4 гбгОгОгА---- гегА£ихе£СгОхСгА£С£игОгСгС£С£и£СгАхА£и£и£и£С£С£СхС£Сх!3£СгА£и£С >60 28
32-20 Мих 5 гСгСх-СгА---- гСгА£ихС£СгОгСгА£С£игСгСгСГС£и£СгА£игАгАгА£С£С£СгС£СгО£СгА£и£С >50 29
32-20 МиХ 6 ХСгбгСгА........ г6гА£игС£Сг<ЗхСхАгО£ихСгСхС£С£и£СгА£игА£и£и£С£С£СгС£СгО£СхА£и£С >50 30
32-20 МиХ 7 хСгЗгОгА---- х6гА£их6ГСгС£СхА£С£игСгСге£С£О£СхА£игА£и£и£С£С£Сге£СгС£СхА£и£С >50 31
КН 533 гСхА£игО£СгС£СгА£С£игСх(Зге£с£и£СгА£игА£и£и£С£С£СгО£СгС£СгА£и £С1с1т >60 32
32-20 МиХ 8 гСгСх-СгА------ гСгА£игС£СгОхС£и£С£игСхСгС€С£и£СгА£игА£иГи£С£С£СхО£СгС£СгА£и£С 3.5 3 3
32-20 Т10 гСгОгОгА------ £игС£СхОгСгА£С£ЦгОгСгСгС£и£СхА£игА£и£и£С£СГСхС£СхС£СгА£иГС >50 34
- 33 026309
Ии£9
82-20 ИО ми сю гСгОгСгА------- £игС£СгСгСгАГС£игСгСгС£СгА£СгА£игА£и£и£С£С£С13£СгО£СгА£и£С >60 35
32-2 0 ТЮ МиС11 гЗгСхСгА------ £игЗ£СгОхОгА£С£ихОхвгС£с£игЗхА£игА£и£3£С£С£СгЗ£Сг5£СгА£и£С >60 26
32-20 ТЮ Ми£12 гЗхЗгЗгА-------- £игО£СгСгОгА£С£игСгСгО£С£О£С£и£игА£и£и£С£С£СгС£СгС£СгА£и£С 2.4 3?
32-20 Т10 Ми £13 гЗхОхСгА---------- £и1’С£СгСх'СгА£С£0х'0гСгС£С£и£СгАгАх'А£и£.и£С£С£СгЗ£СгС£СгА£и£С 2.4 38
32-20 ТЮ МиС14 гЗгОгЗг А- — £игО£схСх-охАГс£игегс-гс;£с£и£сгА£и£и£и£и£с£с£сгс£сгс£сх-А£и£с >60 39
32-20 Т10 МиС15 хвхОгЗгА........... £игЗ£С'гЗг0гА£С£ОгО.гЗх:О£С£и£СгА£игА1А£Ц£С£С£СгЗ£СгС£СгА£и£С 30 40
32-20 ИО МиС16 хВгЗгСгА------- £0гЗ£СгС1ГвхА£С£иг0гвгЗ£С£и£СхА£0хА£игА£С£С£Сх0£СхЗ£СгА£и£С >60 **
32-20 тю МиС17 х’ОгЗгСх'А------ £игЗ£Сг0гвгА£С£игВгЗгЗ£П£и£СгА£игА£и£и£С£с£сгЗ£СгЗ£СгА£и£С >3.8 42
82-20 ТЮ Ми 1:18 хСхЗхЗхА............ £игв£СгВгвгА£С£игВгВгВ£С£С£СгА£игА£и£и£С£С£СгВ£СхЗ£СхА£и£С 51.7 43
82-2 0 ТЮ МиС19 1-СгСгагА------- £ихО£Сг<.5гСгА£с£игСгЕгС£С£У£игЛ1:игА£1!£и£С£С£СгС£СгС£СгА£и£С 5.7 44
62-2.0 ТЮ МиЬ2 0 ιΌχΌχΟχΆ·----- £ОгО£СгвгЗгА£С£игЗгСгС£С£а£СгС£ОгА£О£и£С£С£СгО£СгО£СгА£а£с 1.2 45
52-20 ТЮ Ми 1:21 гВгЗгСгА----- £игЗ£СгЗгЗгА£С£игЗгвгЗ£С£и£СгА£Сх-А£и£и£С£С£Сгв£Сга£СгА£и£С 1.7 46
82-20 ТЮ Ми 1:2 2 ГвХСХОГА------------ £ихО£СхвгвгА£С£ОгЗгвхв£С£и£СгА£ихв£и£и£С£С£СжЗ£СгО£СгА£и£С 5.6 47
22-20 ТЮ МиС2 3 гвгСгЗгА------------- £игС£СгСгСгА£С£игОх-ег(3£С1:и£СгА£игА£С£С1£С£С£СгЗ£С.гЗ£Сх-А£и£с 6.7 48
82-20 ТЮ Миг. 2 4 гСгЗх'ЗгА------ £П«5£СгвгегАГС£игбгегв£С£и£СхА£игА£и£С£С£С£СгО£СгС£СгА£и£С >60 49
32-20 тю МиС2 5 гСгСгСгА------ £игО£СгагАгА£С£и1бгС1в£С£и£СгА£игА£и£и£С£С£СгС£СгС£СхА£13£С >60 50
82-2 0 ИО Ми 1.26 х'ОгСгЗгА----------- £игС£Сх-СхСхА£и£игСгОхС£С£и£СгА£игА£и£и£С£С£Сг«£СгС£СгА£и£С >60 51
22-20 ТЮ Ми Г. 2 7 ГЗгЗгОХА--------- Г0гЗ£Сг0г0гА£С£иг0г0х0£С£О£СХА£и£С£и£0£С£С£Сгв£СгС£СгА£и£С >60 52
32-20 ТЮ Ми£28 гЗгвгЗхА------£и.гО£СгСгСгА£С£игОгЗгС£С£и£С- £игА£и£и£С£С£СгЗ£СгЗ£СгА£П£С >60 53
32-20 ТЮ МиО 2 9 гСхЗгОхА-.....- --£ихС£СгОгОгА£С£игОгЗгО£С£и£СгА£и- £и£и£С£С£СгВ£СгС£СгА£и£С >60 54
52-20 Т4 МиСЗО х'йгЗгСгЛгСгСгА£Сх-ЗгА£их-С£СгСгЗ£и£С£их-СгСгС£С£и£СгА£игА£и£и£С£С £ СгО£СгС£СгА£и£С 6.3 55
82-20 Т4 МиС31 гагвгСгАгОгахА£СгвгА£игЗ£СгЗгЗгЗ£С£ОгСхОгв£С£О£СгА£ОгА£и£Й£С£С £СгВ£СгЗ£.СхА£и£С 4.3 56
82-20 Т4 Ми £32 хСгвг0гАгвгвгА£СгвгА£иг0£СгвгвгЛ£С£игЗгЗгв£СГи£СгАгЗгА£3£и£С£С £СхЗ£СгО£СгА£и£С 12.4 57
82-20 Т4 МиСЗЗ гОгОхОгА------ ' £ихС£СхО£игА£С£ЗгОгОхЗ£С£и£СхА£игА£О£а£С£С£СхО£Сх<3£СгА£и£С >60 58
32-20 Т4 МиС37 гОхЗхОхА------£ихО£СгЗгОгА£С£игвх«гО£С£и£Сг А- - х-А£и£О£С£С£СгЗ£СхО£СгА£и£С >60 59
8НС) ΙΌ N0: относится к немодифицированным версиям лигандов, описанных в столбце, озаглавленном Модифицированная последовательность, последовательности перечисляются в 5'-3'-направлении γΟ-2'ΚΛο О; γΑ-2'ΚΛο А; £С-2'-фтор С; ги-2'-фтор υ
Эта вторичная структура укороченной последовательности 82-20 (фиг. 5) показывает, что имеются две структуры петли, где петля 1 является 5'-ОАС-3' и петля 2 является 5'-СиСАиАии-3'. Посредством мутационного анализа удалось получить более тщательное определение структур петель.
В основании 1 петли 1 замена либо А (мутант 25), С (мутант 7), либо υ (мутант 33) не были хорошо переносимыми. Мутант 7, по существу, не имел специфического связывания с белком СЬЕС-2, и его химически синтезированную версию (КВ588) использовали в качестве отрицательного контроля в дальнейших исследованиях. Второе основание петли 1 легко воспринимало замену либо О (мутант 31), либо υ (мутант 8), что позволяет предполагать, что это положение способно переносить либо пурины, либо пиримидины. Данные связывания двойного мутанта (мутанта 1) согласуются с данными моносайтовых мутантов. Третье основание петли 1, предпочтительно является С. Замена С на другой пиримидин υ (мутант 26) не была хорошо переносимой, и не была заменой О (мутант 6). На основании этих данных, петля 1 может быть описана как имеющая консенсусную последовательность 5-СКС-3', где 'Ή представляет
- 34 026309 любое из оснований (Α, С, С, Т или и).
Петля 2 является петлей из 8 оснований с последовательностью 5'-θυθΑυΑυυ-3'. Анализ мутантов позволяет предполагать, что пиримидин является предпочтительным для основания 1. Замена υ (мутант 17) хорошо переносилась, но наблюдали слабую потерю аффинности. Замена основания 1 на С (мутант 9) не переносилась хорошо. υ является предпочтительным во втором основании петли 2, и замена либо А (мутант 10), либо С (мутант 18) не переносилась хорошо. Пиримидин является предпочтительным в третьем основании петли 2 (мутант 19) и замена на пурин (мутант 11) не переносилась хорошо. Основание 4 петли 2 могло переносить пурин (мутант 20) или пиримидин (мутант 12). Хотя это положение может выносить либо пурин, либо пиримидин, делеция этого основания не переносилась хорошо (мутант 28). Кроме того, замена на С (мутант 32) также переносилась. Хотя это положение могло легко переносить замены, делеция этого положения не переносилась хорошо (мутант 37). Пурин является предпочтительным в основании 6 петли 2. Замена этого пурина (мутант 22) переносилась, но пиримидиновые замены (как мутант 14, так и мутант 27) переносились. Пиримидин является предпочтительным в основании 7 петли 2 (мутант 23). Замена на А (мутант 15) в основании 7 приводит к увеличению Кй. Хотя связывание мутанта 15 (Кй ~30 нМ) является значительно лучшим, чем многих из других генерированных конструктов мутантов, пурин в этом положении является менее желательным, чем пиримидин. υ является предпочтительным в основании 8 петли 2. Замена этого υ либо на С (мутант 24), либо А (мутант 16) не переносились хорошо.
На основании этих данных, предпочтительная консенсусная последовательность петли 2 может быть представлена следующим образом: 5'-ΥυΥΝΝΚΥυ-3', где Υ представляет пиримидин, К представляет пурин и Ν представляет любой из этих четырех оснований.
Пример 5. Вырожденный 8ЕЬЕХ
Для идентификации ключевых нуклеотидов в последовательности лиганда СЬЕС-2 82-20 выполняли вырожденный 8ЕЬЕХ. Исходным матричным олиго для вырожденного 8ЕЬЕХ была последовательность 82-20 с вырожденностью, введенной конструированием в район Ν40. Синтез этого вырожденного матричного олиго 82-20 был основан на 60% исходных оснований и 13,3% каждого из оставшихся трех оснований на протяжении последовательности случайного района 82-20. Введением вырожденной версии последовательности 82-20 в селективное давление 8ЕЬЕХ, можно определить, какие замены нуклеотидов являются предпочтительными для связывания с СЬЕС-2. Исходный пул вырожденных РНК 82-20 имел сравнимое связывание с наивным пулом 8е1 2 для СЬЕС-2. После четырех раундов отбора, аффинность связывания пула РНК раунда 4 из вырожденного отбора был сравним с РНК раунда 10 из первоначального отбора.
Конкретные условия для вырожденного отбора 82-20 показаны на фиг. 6. Сорок три аптамера из раунда 3 и сорок шесть аптапмеров из раунда 4 клонировали и секвенировали, как описано в примере 2.
Исходный вырожденный пул конструировали с 60% консервативностью исходной последовательности. Посредством анализа коэффициентов частоты замен в отдельных положениях, можно определить, какие основания легко переносят замену. Частота каждого нуклеотида в отдельных положениях для последовательностей как раунда 3, так и раунда 4 для случайного района иллюстрирована на фиг. 7. Первые 24 нуклеотида в случайном районе этих последовательностей являются высоко консервативными. Положения оснований 25-40 содержат значимо меньшую консервативность, в сравнении с фоном 60%, согласно конструированию. Эти данные согласуются с данными укорочений, показывая минимальный незаменимый район, необходимый для связывания с СЬЕС-2.
Этот вырожденный анализ отбора выявил также стебель 1, который мог бы выносить неоднозначные пары оснований, а также некоторые минимальные несвязанные основания, с предположением, что структура этого стебля остается интактной. В соответствии с данными укорочения, стебель 2 был высококонсервативным в вырожденном отборе, с парой оснований υ-С в нижней части, предпочитаемой со 100%-ной частотой.
Для петли 1, первое основание (С) в этой петле произведено из 5'-фиксированного района и в результате в этом положении не наблюдались мутации. В основании 2 (А) петли 1, по-видимому, нет предпочтения в отношении А, но наблюдали другие замены, и репрезентация А в этом положении, повидимому, уменьшается по мере прогрессирования от раунда 3 до раунда 4. В соответствии с мутационными данными, С в третьем основании в петле 1 был консервативным в 100% этих последовательностей как из раунда 3, так из раунда 4. Для петли 2, сходные наблюдения получали при сравнении результатов этого вырожденного отбора с данными мутаций в примере 3.
В общем и целом, часть случайного района, участвующего в связывании с СЬЕС-2 (основания 1-24 случайного района), совмещалась в высокой степени с исходной последовательностью 82-20. Остальные основания этого случайного района (основания 25-40), которые не являются необходимыми в минимальной структуре, были гораздо более дивергентными.
Пример 6. Регуляторные агенты для последовательности анти-СЬЕС-2-лиганда
Лиганды кодируют информацию, необходимую для конструирования модуляторов нуклеиновых кислот, или регуляторных агентов для них, на основе правил спаривания комплементарных оснований Уотсона-Крика. Эффективность конкретного регуляторного агента зависит от нескольких факторов,
- 35 026309 включающих в себя доступность района-мишени этого лиганда для нуклеации регуляторным агентом, а также отсутствие внутренней вторичной структуры или ограниченная внутренняя вторичная структура в этом регуляторном агенте, которая требовала бы денатурации перед образованием полного дуплекса с этим лигандом. Для определения районов анти-СЬЕС-2-лигандов, которые могли бы быть предпочтительными районами для ассоциации с нуклеиново-кислотными модуляторами, ряд регуляторных агентов (см. табл. 4 и фиг. 8) были сконструированы для КВ587.
Для тестирования эффективности всех шести регуляторных агентов (КВ581-586) использовали анализ смещения (сдвига) в геле. В этом анализе, КВ587 метили на конце у-Р32-АТФ и добавляли в следовых количествах к немеченому КВ587 и затем инкубировали либо с буфером, либо с различными молярными отношениями одного из шести регуляторных агентов. Более конкретно, молярную концентрацию немеченого КВ587 поддерживали постоянно при 1 мкМ, тогда как диапазон регуляторного агента (8 мкМ0,25 мкМ) добавляли в реакционную смесь, приводя к диапазону молярных отношений 1:8-1:0,25 КВ587 к регуляторному агенту. Реакции инкубировали в течение 15 мин при 37°С, наносили на гель, содержащий 16% нативный полиакриламид/0,5хТВЕ/2 мМ СаС12 и подвергали электрофорезу в течение 3 ч при 10 В. Затем этот гель снимали, заворачивали в 8агап-обертку, экспонировали с использованием экрана формирователя сигналов изображения фосфора в течение 1 ч в светонепроницаемой кассете и сканировали при помощи §!огт 840. Полученный скан показывал нативное положение одного КВ587, и КВ587 плюс варьирующих молярных количеств регуляторного агента, смещенных кверху вследствие гибридизации этого лиганда с регуляторнвм агентом. Результаты минимального молярного отношения регуляторного агента, необходимого для разрушения нативной укладки КВ587, показаны в табл. 4. Эта вторичная структура анти-СЬЕС-2-лиганда способна эффективно модулироваться с использованием регуляторных агентов.
Таблица 4. Регуляторные агенты
Названне клона РНК-последовательность Мини- мальное молярное отношение ЗЕО ГО МО:
КВ581 гаСтАтЬ'тОтСтСтСтОтОтОтАтАтигаАтитО 2:1 60
К.В582 титСтСтОтаСтОтСйпОтАтАтитАтитСтАтО 1:1 61
КВ583 тАтАтитЛтиитОтАтОтСтСтСтАтСтитС 2:1 62
КВ584 титАтитОтАтОтСтСтСтАтОтитСтСгаСтС 2:1 63
КВ585 тАтигаОтАтОтСтСтСтАтОтитСтСтОтСапАтитС 2:1 64
К.В586 тСтСтСтАтСтитСтСтОтСтЛтигаС 8:1 65
ЗЕЦ Ιϋ ΝΟ: относятся к немодифицированным версиям лигандов, описанных в столбце, озаглавленном Модифицированная последовательность, последовательности перечисляются в 5'-3'направлении тЦ=2'-О-метилуридин; тА=2'-О-метиладенозин; тО=2'-О-метилгуанозин; тС=2'-Ометилцитозин
Пример 7. Способы оценивания антитромбоцитарной активности анти-СЬЕС-2-лигандов
Приготовление промытых тромбоцитов (УР) и исследования агрегации
Промытые тромбоциты человека готовили в основном, как описано Мик1агй е! а1. (1972; Вг.1Наета!о1 22, 193-204). Вкратце, кровь человека собирали в виде одной шестой объема буфера кислота/цитрат/декстроза (АСЭ) (85 мМ цитрат натрия, 65 мМ лимонная кислота и 110 мМ глюкоза), помещали в водяную баню при 37°С и выдерживали в течение 30 мин, затем центрифугировали при 250хд в течение 16 мин при комнатной температуре. Богатую тромбоцитами плазму удаляли и центрифугировали при 2200хд в течение 13 мин при комнатной температуре, затем ресуспендировали в 40 мл НЕРЕ8забуференного раствора Тироде (136,5 мМ ИаС1, 2,68 мМ КС1, 1 мМ МдС12, 2 мМ СаС12, 12 мМ ИаНСО3, 0,43 мМ ИаН2РО4, 5,5 мМ глюкоза, 5 мМ НЕРЕ8 рН 7,4, 0,35% бычий сывороточный альбумин), содержащего 10 Е/мл гепарин и 5 мкМ (конечная концентрация) простагландин 12 (РО12). Эту суспензию тромбоцитов инкубировали в водяной бане 37°С в течение 10 мин, добавляли 5 мкМ (конечная концентрация) РО12 и эту смесь центрифугировали при 1900хд в течение 8 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 40 мл забуференного НЕРЕ8 раствора Тироде, содержащего 5 мкМ (конечная концентрация) РО12, и затем инкубировали в течение 10 мин в водяной бане 37°С и центрифугировали при 1900хд в течение 8 мин. Этот осадок ресуспендировали при плотности 3х108 тромбоцитов/мл в забуференном НЕРЕ8 растворе Тироде, содержащем 0,1 Е/мл апиразы картофеля, и инкубировали в водяной бане 37°С перед использованием в исследованиях агрегометрии.
Индуцированную родоцитином (Аддгейп; покупаемый из РгапкРш! ишуегкйу Нокрйа1) агрегацию УР тромбоцитов, определяли измерением трансмиссии света через 0,5 мл суспензии перемешиваемых (1200 об/мин) промытых тромбоцитов (425 мкл промытых тромбоцитов, 25 мкл фибриногена, 25 мкл ингибиторов или контролей и 25 мкл родоцитина) в люмиагрегометре при 37°С (СЪгопо-Ьод Согр. Науег!о^п, РА). Фон этого прибора устанавливали с использованием 0,5 мл забуференным Нерек раствора Тироде. Перед измерениями агрегации, суспензию тромбоцитов дополняли 1 мг/мл фибриногена (конечная концентрация). Агрегацию тромбоцитов инициировали добавлением указанных концентраций родоцитина (для получения процентной агрегации между 70-90%) и трансмиссию света непрерывно регистри- 36 026309 ровали в течение по меньшей мере 6 мин. Для скрининга анти-СЬЕС-2-лигандов или контролей на способность блокировать индуцированную родоцитином агрегации тромбоцитов, анти-СЬЕС-2-лиганды добавляли к суспензии тромбоцитов при разведении для получения желаемой конечной концентрации и инкубировали в течение 3 мин перед добавлением родоцитина и эту реакцию регистрировали в течение 4-6 мин после добавления родоцитина.
Эффективность родоцитина определяли для каждого донора из максимальной степени процентной агрегации, полученной из кривой доза-ответ с использованием серийных разведений родоцитина из диапазона приблизительно 3-60 нМ в буфере 20 мМ Трис рН 8,0, 50 мМ ЫаС1, для определения подходящей действующей концентрации. Способность анти-СЬЕС-2-лигандов ингибировать индуцированную родоцитином агрегацию тромбоцитов тестировали в препаратах АР, как описано выше, с использованием широкого диапазона концентраций анти-СЬЕС-2-лиганда. Фиг. 9А и 9В показывает графики индуцированной АР агрегации СЬЕС-2 лигандов. 82-20 (след 2 и след 6; 1 и 0,5 мкМ); КБ587 (след 1 и след 5; 1 мкМ и 0,5 мкМ); КБ588 (след 3 и след 7; 1 и 0,5 мкМ); и Контроли (след 4 и след 8; 20 нМ родоцитин). Положение спустя 6 мин после добавления родоцитина отмечено на следе толстой направленной вниз стрелкой. Как показано на фиг. 9А и 9В, аптамеры 82-20 и КБ587 были полностью эффективными в ингибировании индуцированной родоцитином агрегации АР в присутствии приблизительно 20-30 нМ агониста родоцитина.
Пример 8. Способы для оценивания антитромботической активности анти-СЬЕС-2-лигандов полноразмерного клона 82-20 и укороченного КБ587 в анализах индуцируемой родоцитином агрегации тромбоцитов
Промытые тромбоциты человека готовили в основном, как описано выше. Эффективность родоцитина определяли для каждого донора из максимальной степени процентной агрегации, полученной из кривой доза-ответ с использованием серийных разведений родоцитина из приблизительно 3-60 нМ, для определения подходящей действующей концентрации, как описано в примере 7. Способность антиСЬЕС-2-лигандов ингибировать индуцированную родоцитином агрегацию тромбоцитов тестировали в препаратах АР, как описано выше. Данные из анализа доза-ответ 82-20 и РБ587 представлены на фиг. 10А и 10В. Фиг. 10А является диаграммой индуцированной родоцитином агрегации тромбоцитов, выраженной в виде процента от контроля для варьирующихся концентраций клона 82-20 нуклеиновокислотного лиганда СЬЕС-2 в промытых тромбоцитах человека. Фиг. 10В является диаграммой индуцированной родоцитином агрегации тромбоцитов, выраженной в виде процентов от контроля для варьирующихся концентраций клона 82-20 нуклеиново-кислотных лигандов СЬЕС-2 РБ587 и неактивного мутанта КБ588 в промытых тромбоцитах человека. Наблюдали по существу полное ингибирование агрегации в присутствии 0,5 мкМ 82-20 или КБ587 в течение 6 мин после добавления родоцитина.
Анализы родоцитин-индуцированной агрегации тромбоцитов человека для тестирования нуклеиново-кислотных модуляторов нуклеиново-кислотных лигандов СЬЕС-2 в АР.
Промытые тромбоциты человека (АР) готовили в основном, как описано ранее. При тестировании широкого диапазона концентраций ингибиторов нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 получают величину 1С95-100. Эти величины 1С95-100 представляют концентрацию ингибитора, необходимую для ингибирования на приблизительно 95-100% агрегации, вызываемой конкретной концентрацией рассматриваемых агонистов. При тестировании модуляторов на их способность обращения антитромботической активности, тромбоциты инкубируют в течение 3 мин с 2-4 мкМ аптамеров СЬЕС-2 (1С95_1оо) или буфером-?, с последующим добавлением различных молярных концентраций модуляторов (4:1; 2:1; 1:1 модуляторы:аптамеры) в течение 10 мин перед добавлением родоцитина и эту реакцию регистрируют в течение 6 мин. Фиг. 10С показывает диаграммы индуцированной родоцитином агрегации тромбоцитов, выраженной в виде процента от контроля для варьирующихся концентраций одного нуклеиновокислотного лиганда РБ587 или в комбинации с модуляторами лиганда СЬЕС-2 КБ581, КБ582, КБ583, РБ584, КБ585 и КБ586 в промытых тромбоцитах человека.
Пример 9. Анализ функции активации тромбоцитов с использованием проточной цитометрии (РСелектин; экспрессия СЭ62-Р) с родоцитином (Аггретином)
Исследования с использованием проточной цитометрии
Проточную цитометрию с использованием Р-селектин-специфического антитела выполняли для оценивания способности аптамеров СЬЕС-2 ингибировать индуцированную родоцитином экспрессию Рселектина человека. Экспрессия Р-селектина на поверхности тромбоцитов является маркером активации тромбоцитов. Суспензию промытых тромбоцитов человека (плотность 3х 108 клеток/мл) разводили до 1/10 в буфере Тироде и хранили при 37°С. 5 мкл каждого соединения в буфере-Р (Пул 8ЕЬ2, 82-20, 82-20 Т4, 82-20 Т5, 82-20 Т6; 20 мкМ исходный раствор КБ587 и КБ588) добавляли в пробирки для анализа на 5 мл. Немедленно, добавляли 50 мкл разведенных тромбоцитов и осторожно смешивали. Эти пробирки инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин. 2,5 мкл родоцитина (3,331 мкМ исходный раствор готовили в буфере 20 мМ Трис, 50 мМ ЫаС1, рН 8,0) добавляли в каждую пробирку, перемешивали и инкубировали в течение еще 5 мин. Эти пробирки переносили на лед и охлаждали в течение мин. 20 мкл антитела СИ62Р-РЕ (ВссЮп ΩίοΚίηδοη; Са1#550561) добавляли в каждую пробирку и инкубировали в течение 20 мин на льду. Эти суспензии тромбоцитов в каждой пробирке дополнительно разводили
- 37 026309
0,6 мл охлажденного на льду ЗФР и анализировали в РАСЗ-СаИЪиг.
Детектирование экспрессии ί'Ό62 с использованием РАСЗ-СаНЪиг
Два отдельных дот-плота (один 1ο§ ЗЗС νδ РЗС и 1ο§ РЗС νδ РЬ2-Н) и гистограмму создавали на зоне обзора. Тромбоциты идентифицировали с использованием дот-плота ЗЗС νδ РЗС (прибор корректировали для правильного обзора). Создавали один представляющий интерес район 1 (К1) вокруг этих тромбоцитов (во избежание подсчета остатков клеток как тромбоцитов). Тромбоциты в районе 1 (К1) наблюдали на дот-плоте РЗС νδ РЬ2-Н (с коррекцией РЬ2 с использованием контроля). Тромбоциты наблюдали также на построенных в виде гистограммы величинах νδ РЬ2-Н. Квадрантный статистический маркер устанавливали на дот-плоте РЗС νδ РЬ2-Н с использованием контрольной пробирки и определяли статистические параметры (контроль; неокрашенные тромбоциты). Все эти пробы, начиная с находящегося в покое контроля (плюс антитело), собирали. Результаты строили в виде % от контроля (150 нМ активация родоцитина; нижний правый квадрант, обработанный как общая 100% активация) с использованием ОгарНРай Ρπδΐη.
РАСЗ-анализ, описанный выше, использовали для тестирования способности аптамеров З2-20, КВ587 и 3 укорочений З2-20, ингибировать индуцированную родоцитином экспрессию Р-селектина в ^Р. Полученные данные иллюстрированы на фиг. 11А и 11В, которые обеспечивают диаграммы индуцированной родоцитином экспрессии Р-селектина человека с использованием проточной цитометрии с Р-селектин-РЕ-антителом. Активность выражена в виде процента от контроля для 2 мкМ клона З2-29 и укорочений нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 в промытых тромбоцитах человека (фиг. 11 А) или 2 мкМ нуклеиново-кислотного лиганда СЬЕС-2 КВ587 и неактивного мутанта КВ588 в промытых тромбоцитах человека (фиг. 11В).
Лиганды СЬЕС-2 З2-20, КВ587, З2-20-Т4 и З2-20-Т6, каждый, были способны значимо уменьшать индуцированную родоцитином экспрессию Р-селектина на поверхности \УР человека, тогда как укорочения З2-20-Т5 и КВ588, которые не связывают СЬЕС-2, не обнаруживали ингибиторной активности, демонстрируя корреляцию между аффинностью лигандов в отношении СЬЕС-2 и ингибированием активности СЬЕС-2.
Пример 10. Ιη νίίτο анализ адгезии тромбоцитов на основе протекания в цельной крови на активность аптамера СЬЕС-2 с использованием Вюйих™ 200 (Р1ихюп В^οδс^еηсеδ, 1пс.)
Лиганды СЬЕС-2 характеризовали в отношении их способности ингибировать опосредованную СЬЕС-2 агрегацию тромбоцитов с использованием ίη νίίτο анализа адгезии тромбоцитов на основе протекания в присутствии цельной крови.
Приготовление цельной крови для эксперимента с перфузией и протеканием
Кровь брали из здорового волонтера в антикоагулянт РРАС (0,3 мМ) в шприцы на 60 мл с использованием иглы 19О х 3/4 дюйма. Эту кровь немедленно метили флуоресцентно 4 мкМ Са1сеш-АМ (Ιηνί(годен Р/Ы С3100 МР) в течение 1 ч при 37°С (Са1сеш-АМ добавляли к крови очень осторожно перевертыванием пробирки несколько раз для перемешивания и эту кровь использовали в пределах 3,5 ч вытягивания). При выполнении этого эксперимента с покрытыми фибриллярным коллагеном или родоцитином лунками, этот эксперимент начинали сразу же с использованием установок протекания цельной крови 5 дин/см2 при 37°С с использованием программы ВюЛих™. При выполнении этого эксперимента с покрытой коллагеном хвоста крысы поверхностью, цельную кровь активировали 165 нМ родоцитином в течение 2 мин и затем этот эксперимент начинали немедленно с использованием установок протекания цельной крови 5 дин/см2 при 37°С с использованием программы Вюйих™. Эти данные (флуоресцентных изображений агрегатов тромбоцитов) собирали с использованием инвертированного микроскопа с временными интервалами флуоресценции (Ζβίδδ 200М АхюхеП Μκτοδ^ρβ, присоединенного к камере устройства Ахюсат СЬа^§ей-Сοиρ1ей Эеу1се и программе Αx^ον^δ^οη) в течение каждых 6 секунд для общей продолжительности 6-10 мин. Для тестирования тест-изделий (аптамера СЬЕС-2 КВ587 и неактивного контрольного лиганда КВ588) 200 мкл меченой крови инкубировали с указанными концентрациями аптамеров (или буфера-Р; в объеме 10 мкл) в течение 3-5 мин при комнатной температуре перед добавлением во входную лунку. Форматированные изображения файла тегированных изображений (формата ΤίΓΓ) использовали для расчета интенсивности флуоресценции с использованием программы ВюЛих Μοη^·!^™ и затем эту таблицу результатов экспортировали в ΜκτοδοΓΐ ехсе1 и строили с использованием ОгарНрай РШт (фиг. 12А и 12В).
Эксперименты с покрытой родоцитином поверхностью
Родоцитин эффективно стимулирует зависимую от СЬЕС-2 агрегацию тромбоцитов (пример 7; фиг. 9 и 10). Авторы анализировали образование агрегатов тромбоцитов на покрытой родоцитином поверхности для исследования аптамеров СЬЕС-2 в условиях протекания. Для этих экспериментов протекания рутинным образом использовали 48-луночные планшеты ВюЛих (Р/М 900-0017). Для покрытия родоцитином, эти планшеты примировали буфером 20 мМ Трис рН 8,0, 50 мМ №С1 в течение 5 мин при 5 дин/см2 и затем 50 мкг/мл разведенного родоцитина перфузировали из выходной лунки в течение 10 мин при 5 дин/см2. Покрытые коллагеном планшеты использовали в качестве контролей. Для покрытия коллагеном эти планшеты примировали 0,02 М уксусной кислотой в течение 5 мин при 5 дин/см2 и затем 25
- 38 026309 мкг/мл разведенного фибриллярного коллагена (СЬгопо-Ьод Ρ/Ν 385) в 0,02 М уксусной кислоте перфузировали из выходной лунки в течение 10 мин при 5 дин/см2. Протекание останавливали и этот планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Белки покрытия промывали ЗФР при 5 дин/см2 в течение 10 мин. Планшет блокировали полным заполнением входной лунки (1 мл) 5% м/о БСА/ЗФР и перфузировали в канал при 5 дин/см2 в течение 15 мин. Протекание останавливали и этот планшет инкубировали в течение дополнительных 10 мин при комнатной температуре. Избыток ЗФР/БСА удаляли из всех лунок и этот планшет хранили при комнатной температуре для использования в тот же самый день или хранили при 4 в ЗФР/БСА до двух дней.
Фиг. 12А показывает статические видеоизображения с флуоресцентными конечными точками действий лигандов СЬЕС-2 на накапливание тромбоцитов на покрытой родоцитином поверхности, подвергнутой действию протекающей цельной крови (А=покрытие родоцитина 50 мкг/мл; В=контрольное покрытие 25 мкг/мл фибриллярного коллагена; С-Р покрытые 50 мкг/мл родоцитина, С=3 мкМ КВ58 7; Ό=3 мкм КВ588; Е=4 мкМ РВ588; и Р=4 мкМ РВ587). График О показывает измерение данных поверхностей прикрепленных тромбоцитов, рассчитанных с использованием программы Р1ихюп МоШаде™. Эти данные выражены в виде процентной максимальной реакции неактивного мутанта КВ588 на покрытой родоцитином поверхности. Как показано на фиг. 12А, родоцитин, поддерживал накапливание активированных тромбоцитов в агрегатах тромбоцитов при условиях протекания в цельной крови. КВ587, но не неактивный мутантный контрольный КВ588, специфически блокировал эту активность (фиг. 12А, сравните панели С с Ό и Р с Е).
Эксперименты с покрытой растворимым коллагеном-Ι хвоста крысы поверхноствю:
Авторы также анализировали способность активированных родоцитином (СЬЕС-2-специфическим агонистом) образовывать большие агрегаты тромбоцитов на покрытой коллагеном хвоста крысы поверхности в сравнении с неактивированными тромбоцитами при протекании. Затем авторы анализировали возможную функцию СЬЕС-2 в этом процессе с использованием РВ587. Для этого анализа, планшеты покрывали 100 мкг/мл растворимого Коллагена I хвоста крысы (1пуЬгодеп; Са!#Л10483-01), как описано выше. Эти планшеты примировали 0,02 М уксусной кислотой в течение 5 мин при 5 дин/см2 и затем 25 мкг/мл разведенного фибриллярного коллагена (СЬгопо-Ьод Ρ/Ν 385) или 100 мкг/мл растворимого Коллагена хвоста крысы в 0,02 М уксусной кислоте перфузировали из выходной лунки в течение 10 мин при 5 дин/см2. Протекание останавливали и этот планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Белки покрытия промывали ЗФР при 5 дин/см2 в течение 10 мин. Планшет блокировали полным заполнением входной лунки (1 мл) 5% м/о БСА/ЗФР и перфузировали в этот канал при 5 дин/см2 в течение 15 мин. Протекание останавливали и этот планшет инкубировали в течение дополнительных 10 мин при комнатной температуре. Избыток ЗФР/БСА удаляли из всех лунок и этот планшет хранили при комнатной температуре для использования в тот же самый день или хранили при 4°С в ЗФР/БСА до двух дней.
Фиг. 12В показывает статические видеоизображения с флуоресцентными конечными точками действий лигандов СЬЕС-2 на накапливание тромбоцитов на покрытой растворимым коллагеном хвоста крысы поверхности, подвергнутой действию протекающей цельной крови в присутствии и в отсутствие обработки агонистом родоцитина (А=25 мкг/мл фибриллярного коллагена; В=100 мкг/мл фибриллярного коллагена; С=100 мкг/мл коллагена хвоста крысы плюс обработка 165 нМ родоцитином; Ό=100 мкг/мл коллагена хвоста крысы плюс буфер Р; Е=100 мкг/мл коллагена хвоста крысы плюс 3 мкМ РВ587 плюс обработка 165 нМ родоцитином); Р=100 мкг/мл коллагена хвоста крысы плюс 3 мкМ РВ588 плюс обработка 165 нМ родоцитином). График О показывает измерение данных поверхностей прикрепленных тромбоцитов, рассчитанных с использованием программы Р1ихюп МоШаде™. Эти данные выражены в виде процента от максимальной реакции неактивного мутанта РВ588 на покрытой коллагеном хвоста крысы поверхности в присутствии родоцитина. Как показано на фиг. 12В присутствие агониста родоцитина значимо увеличивало размер агрегатов тромбоцитов, прикрепленных к покрытой коллагеном хвоста крысы поверхности в сравнении с необработанной цельной кровью. При предварительном инкубировании цельной крови КВ587, с последующей активацией родоцитином, размер агрегатов тромбоцитов уменьшался опять до агрегатов фона, наблюдаемых с растворимым коллагеном из хвоста крысы в отсутствие родоцитина (фиг. 12В - изображения В, Ό, Е и график О). Неактивный мутантный контроль, КВ588, не оказывал действия на размер агрегатов тромбоцитов (панель Р фиг. 12В).
- 39 026309
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Ьау2ег, ДиНапа М.
МаНапСу, Зап^оу К.
Ио1££, Затие1 С.
КеДиск, СаСНегипе С.
Кизсопи, СНгизСорНег Р.
<120> НУКЛЕИНОВОКИСЛОТНЫЕ МОДУЛЯТОРЫ СЬЕС-2 <130> 10815-8013.4000 <140> ЫоС уе£ аззидпеД <141> ЕНеД НегемиСН <150> ИЗ 61/393,191 <151> 2010-10-14
<160> 68
<170> РаСепС1п
<210> 1
<211> 227
<212> БЕЛОК
<213> Ното зар.
<400> 1
МеС С1п 1 Азр С1и
Рго А1а Ьеи 11е 20
МеС А1а Ьеи 11е 35
Уа1 А1а 50 Ьеи С1у
С1и Азп 65 С1и Азп
С1п Туг Уа1 Уа1
Ьуз Суз Зег Рго 100
Туг С1у РНе РНе 115
Суз ТНг 130 Азр МеС
Уа1 С1и 145 Туг 11е
Зег Агд С1п Ьуз
11е Зег С1и Азп
уегзтоп 3.5
епз
Азр 5 С1у Туг 11е
Зег Уа1 С1у Зег
Ьеи Ьеи 11е Ьеи 40
11е Тгр Зег 55 Уа1
Агд ТНг 70 С1у ТНг
Ьуз 85 С1п Зег С1и
Суз Азр ТНг Азп
Агд Низ Азп Ьеи 120
Азп А1а ТНг 135 Ьеи
Ьуз А1а 150 Агд ТНг
Зег 165 Азп С1и Уа1
МеС РНе С1и РНе
ТНг Ьеи 10 Азп 11е
А1а 25 Зег Зег Зег
Суз Уа1 С1у МеС
МеС С1п Агд Азп 60
Ьеи С1п С1п 75 Ьеи
Ьеи Ьуз 90 С1у ТНг
Тгр 105 Агд Туг Туг
ТНг Тгр С1и С1и
Ьеи Ьуз 11е Азр 140
Низ Ьеи 11е 155 Агд
Тгр Ьуз 170 Тгр С1и
Ьеи С1и Азр С1у
Ьуз ТНг Агд 15 Ьуз
Тгр Тгр 30 Агд Уа1
Уа1 45 Уа1 С1у Ьеи
Туг Ьеи С1п Азр
А1а Ьуз Агд Суз 80
РНе Ьуз С1у 95 Низ
С1у Азр 110 Зег Суз
Зег 125 Ьуз С1п Туг
Азп Агд Азп 11е
Тгр Уа1 С1у Ьеи 160
Азр С1у Зег 175 Уа1
Ьуз С1у Азп МеС
- 40 026309
180
185
190
Азп Ьуз С1п 225 Суз НЬз 210 Ьеи А1а 195 Туг Рго Туг Ьеи РЬе МеЬ НЬз Суз Азп С1и 215 С1у 200 Агд Ьуз Ьуз МеЬ А1а НЬз С1у Рго МеЬ 220 ТЬг 205 ТЬг Суз Ьуз
<210> 2
<211> 170
<212> БЕЛОК
<213> Ното зартепз
<400> 2
С1п Агд Азп Туг Ьеи С1п Азр С1и Азп С1и Азп Агд ТЬг С1у
1 5 10
С1п С1п Ьеи А1а Ьуз Агд Суз С1п Туг Уа1 Уа1 Ьуз С1п 5ег
20 25 30
Ьуз С1у ТЬг РЬе Ьуз С1у НЬз Ьуз Суз 5ег Рго Суз Азр ТЬг
35 40 45
Агд Туг Туг С1у Азр 5ег Суз Туг С1у РЬе РЬе Агд НЬз Азп
50 55 60
Тгр С1и С1и 5ег Ьуз С1п Туг Суз ТЬг Азр МеЬ Азп А1а ТЬг
65 70 75
Ьуз 11е Азр Азп Агд Азп 11е Уа1 С1и Туг 11е Ьуз А1а Агд
85 90
Ьеи 11е Агд Тгр Уа1 С1у Ьеи 5ег Агд С1п Ьуз 5ег Азп С1и
100 105 110
Ьуз Тгр С1и Азр С1у 5ег Уа1 11е 5ег С1и Азп МеЬ РЬе С1и
115 120 125
С1и Азр С1у Ьуз С1у Азп МеЬ Азп Суз А1а Туг РЬе НЬз Азп
130 135 140
МеЬ НЬз Рго ТЬг Суз С1и Азп Ьуз НЬз Туг Ьеи МеЬ Суз С1и
145 150 155
А1а С1у МеЬ ТЬг Ьуз Уа1 Азр С1п Ьеи Рго
165 170
С1и
Уа1
Азп
Азр <210> 3 <211> 180 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> НЬз-меченый СЬЕС-2 <400> 3
ТЬг
С1и
Азп
Ьеи
Ьеи
ТЬг
Уа1
РЬе
С1у
Агд
Ьеи
Ьеи
Тгр
ТЬг
Ьеи
ΗΪ3
Тгр
Ьеи
Ьуз
Ьуз
160
- 41 026309
Нгз 1 Нгз Нгз Нгз Нгз 5 Нгз Нгз Нгз Нгз Нгз 10 С1п Агд Азп Туг Ьеи 15 С1п
Азр С1и Азп С1и 20 Азп Агд ТЬг С1у ТЬг 25 Ьеи С1п С1п Ьеи А1а 30 Ьуз Агд
Суз С1п Туг 35 Уа1 Уа1 Ьуз С1п 5ег 40 С1и Ьеи Ьуз С1у ТЬг 45 РЬе Ьуз С1у
Нгз Ьуз 50 Суз 5ег Рго Суз Азр 55 ТЬг Азп Тгр Агд Туг 60 Туг С1у Азр 5ег
Суз 65 Туг С1у РЬе РЬе Агд 70 Нгз Азп Ьеи ТЬг Тгр 75 С1и С1и 5ег Ьуз С1п 80
Туг Суз ТЬг Азр Ме£ 85 Азп А1а ТЬг Ьеи Ьеи 90 Ьуз 11е Азр Азп Агд 95 Азп
11е Уа1 С1и Туг 100 11е Ьуз А1а Агд ТЬг 105 Нгз Ьеи 11е Агд Тгр 110 Уа1 С1у
Ьеи 5ег Агд 115 С1п Ьуз 5ег Азп С1и 120 Уа1 Тгр Ьуз Тгр С1и 125 Азр С1у 5ег
Уа1 11е 130 5ег С1и Азп Ме£ РЬе 135 С1и РЬе Ьеи С1и Азр 140 С1у Ьуз С1у Азп
Ме£ 145 Азп Суз А1а Туг РЬе 150 Нгз Азп С1у Ьуз Ме£ 155 Нгз Рго ТЬг Суз С1и 160
Азп Ьуз Нгз Туг Ьеи 165 Ме£ Суз С1и Агд Ьуз 170 А1а С1у Ме£ ТЬг Ьуз 175 Уа1
Азр С1п Ьеи Рго 180 <210> 4 <211> 82 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигомер <220>
<221> Ш15с £еа£иге <222> (26)..(65) <223> η представляет собой а, с, д, или £ <400> 4 £с£сдда£сс £садсдад£с д£с£дппппп пппппппппп пппппппппп ηηηηηηηηηη пппппссдса £сд£сс£ссс £а <210> 5 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 42 026309 <220>
<223> Синтетический олигомер <400> 5 ас'Ьдддс'Ьса ЬаЬЬсссдсд саЬсЬЬасЬа ссЬсддЬЬаЬ <210> 6 <211> 40 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигомер <400> 6 асидддсиса иаиисссдсд саисииасиа ссисддииаи <210> 7 <211> 80 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигомер <400> 7 дддаддасда ЬдсддасЬдд дсЬсаЬаЬЬс ссдсдсаЬсЬ ЬасЬассЬсд дЬЬаЬсадас дасЬсдсЬда ддаЬссдада <210> 8 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигомер <400> 8 дддаддасда идсддасидд дсисаиаиис ссдсдсаиси иасиассисд дииаисадас дасисдсида ддаиссдада <210> 9 <211> 80 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> Ш15с ЬеаЬиге <222> (1).7(3) <223> д=2' РгЬо С <220>
<221> Ш15с ЬеаЬиге
- 43 026309
(4). . а=2' • (4) ПЬо А
Ш13С (5)7 д=2' £еа£иге 7(6) ПЬо С
Ш13С (7)7 а=2' £еа£иге 77) ПЬо А
Ш13С £еа£иге
(8)..(8)
С = 2' Пиого С
Ш13С (9)7 д=2' £еа£иге /(9) ПЬо С
Ш13С (10)/ а=2' £еа£иге /.(10) ПЬо А
Ш13С (11)/ и= 2 1 £еа£иге /.(11) ' Пиого и
Ш13С (12)/ д=2' £еа£иге /.(12) ПЬо С
Ш13С £еа£иге
(13)..(13)
С = 2' Пиого С
Ш13С (14)/ д=2' £еа£иге /.(15) ПЬо С
Ш13С (16)/ а=2' £еа£иге /.(16) ПЬо А
Ш13С £еа£иге
(17)..(17)
С = 2' Пиого С
Ш15С £еа£иге (19)7.(21) д=2' ПЬо С
- 44 026309 шазс £еа£иге (22)..(22)
С = 2' Пиого С шизс £еа£иге (23)7.(23) и= 2' Пиого и
Ш1зс £еа£иге (24)7.(24)
С = 2' Пиого С
Ш1зс £еа£иге (25)7.(25) а=2' ПЬо А
Ш1зс £еа£иге (26)7.(26) и= 2' Пиого и
Ш1зс £еа£иге (27)..(27) а=2' ПЬо А
Ш1зс £еа£иге (28)..(29) и= 2' Пиого и ш1зс £еа£иге (30)..(32)
С = 2' Пиого С ш1зс £еа£иге (33)..(33) д=2' ПЬо С ш1зс £еа£иге (34)..(34)
С = 2' Пиого С ш1зс £еа£иге (36)..(36)
С = 2' Пиого С ш1зс £еа£иге (37)..(37) а=2' ПЬо А ш1зс £еа£иге (38)..(38)
- 45 026309
<223> и= 2' Пиого и
<220>
<221> шЧзс £еа£иге
<222> (39)..(39)
<223> С = 2' Пиого С
<220>
<221> тЧзс £еа£иге
<222> (42)7.(42)
<223> а=2' ПЬо А
<220>
<221> тЧзс £еа£иге
<222> (43)7.(43)
<223> С = 2' Пиого С
<220>
<221> тЧзс £еа£иге
<222> (44)7.(44)
<223> и= 2' Пиого и
<220>
<221> тЧзс £еа£иге
<222> (45)7.(45)
<223> а=2' ПЬо А
<220>
<221> тЧзс £еа£иге
<222> (46)..(47)
<223> С = 2' Пиого С
<220>
<221> тЧзс £еа£иге
<222> (48)..(48)
<223> и= 2' Пиого и
<220>
<221> тЧзс £еа£иге
<222> (49)..(49)
<223> С = 2' Пиого С
<220>
<221> тЧзс £еа£иге
<222> (50)..(51)
<223> д=2' ПЬо С
<220>
<221> тЧзс £еа£иге
<222> (52)..(53)
<223> и= 2' Пиого и
<220>
<221> тЧзс £еа£иге
<222> (54)..(54)
<223> а=2' ПЬо А
<220>
<221> тЧзс £еа£иге
<222> (55)..(55)
<223> <220> и= 2' Пиого и
- 46 026309 шгзс ЬеаЬиге (56)..(56)
С = 2' Пиого С шгзс ЬеаЬиге (57)7.(57) а=2' КгЬо А
Ш1зс ЬеаЬиге (58)7.(58) д=2' КгЬо С
Ш1зс ЬеаЬиге (59)7.(59) а=2' КгЬо А
Ш1зс ЬеаЬиге (60)..(60)
С = 2' Пиого С
Ш1зс ЬеаЬиге (61)..(61) д=2' ПЬо С
Ш1зс ЬеаЬиге (62)..(62) а=2' ПЬо А ш1зс ЬеаЬиге (63)..(63)
С = 2' Пиого С ш1зс ЬеаЬиге (64)..(64) и= 2' Пиого и ш1зс ЬеаЬиге (65)..(65)
С = 2' Пиого С ш1зс ЬеаЬиге (66)..(66) д=2' ПЬо С ш1зс ЬеаЬиге (67)..(67)
С = 2' Пиого С ш1зс ЬеаЬиге (68)..(68) и= 2' Пиого и
- 47 026309 <220>
<221> Ш15С £еа£иге
<222> (69)..(69)
<223> д=2' РтЬо С
<220>
<221> Ш15С £еа£иге
<222> (70)7.(70)
<223> а=2' РтЬо А
<220>
<221> Ш15С £еа£иге
<222> (71)7.(72)
<223> д=2' РтЬо С
<220>
<221> Ш15С £еа£иге
<222> (73)7.(73)
<223> а=2' РтЬо А
<220>
<221> Ш15С £еа£иге
<222> (74)7.(74)
<223> и= 2' Ииого и
<220>
<221> Ш15С £еа£иге
<222> (75)..(76)
<223> С = 2' Пиого С
<220>
<221> Ш15С £еа£иге
<222> (77)..(77)
<223> д=2' РтЬо С
<220>
<221> Ш15С £еа£иге
<222> (78)..(78)
<223> а=2' РтЬо А
<220>
<221> Ш15С £еа£иге
<222> (79)..(79)
<223> д=2' РтЬо С
<220>
<221> Ш15С £еа£иге
<222> (80)..(80)
<223> а=2' РтЬо А
<400> 9
дддаддаеда идсддасидд дсисаиаиис ссдсдсаиси иасиассисд дииаисадас 60
дасисдсида ддаиссдада 80
<210> 10
<211> 80
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность <220>
- 48 026309 <223> Синтетический олигомер <400> 10 дддаддасда идсддасидд дсисаиаиис ссдсдсаиси иасиассисд дииаисадас 60 дасисдсида ддаиссдада 80
<210> <211> <212> <213> 11 55 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 11
дддаддасда идсддасидд дсисаиаиис ссдсдсаиси иасиассисд дииаи 55
<210> <211> <212> <213> 12 49 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 12
дддаддасда идсддасидд дсисаиаиис ссдсдсаиси иасиассис 49
<210> <211> <212> <213> 13 45 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 13
дддаддасда идсддасидд дсисаиаиис ссдсдсаиси иасиа 45
<210> <211> <212> <213> 14 39 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 14
дддаддасда идсддасидд дсисаиаиис ссдсдсаис 39
<210> <211> <212> <213> 15 33 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
- 49 026309 <400> 15 дддаддасда идсддасидд дсисаиаиис ссд 33
<210> <211> <212> <213> 16 35 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 16
дддадаидсд дасидддсис аиаиисссдс дсаис 35
<210> <211> <212> <213> 17 37 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 17
дддадаидсд дасидддсис аиаиисссдс дсаисис 37
<210> <211> <212> <213> 18 39 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 18
дддадаидсд дасидддсис аиаиисссдс дсаисиссс 39
<210> <211> <212> <213> 19 33 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 19
дддададсдд асидддсиса иаиисссдсд сис 33
<210> <211> <212> <213> 20 33 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 20
дддадаисдд асидддсиса иаиисссдсд аис 33
- 50 026309 <210> 21 <211> 33 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтетический олигомер <400> 21 дддадаиддд асидддсиса иаиисссдсс аис <210> 22 <211> 33 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтетический олигомер <400> 22 дддаидсдда сидддсисаи аиисссдсдс аис <210> 23 <211> 33 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтетический олигомер <400> 23 дддаидсдда ссдддсисаи аиисссдсдс аис <210> 24 <211> 31 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтетический олигомер <400> 24 даидсддаси дддсисаиаи исссдсдсаи с <210> 25 <211> 35 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтетический олигомер <400> 25 дддадаидсд сисидддсис аиаиисссдс дсаис <210> 26
- 51 026309
<211> <212> <213> 35 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 26
дддадаидсд дасиддддас аиаиисссдс дсаис 35
<210> <211> <212> <213> 27 35 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 27
дддадаидсд дасидддсид ииаиисссдс дсаис 35
<210> <211> <212> <213> 28 35 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 28
дддадаидсд дасидддсис ааииисссдс дсаис 35
<210> <211> <212> <213> 29 35 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 29
дддадаидсд дасидддсис аиааасссдс дсаис 35
<210> <211> <212> <213> 30 35 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 30
дддадаидсд дадидддсис аиаиисссдс дсаис 35
<210> <211> <212> <213> 31 35 РНК Искусственная последовательность
- 52 026309 <220>
<223>
Синтетический олигомер <400> 31 дддадаидСд СаСидддСиС аиаииСССдС дСаиС <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
РНК
Искусственная последовательность
Синтетический олигомер <400> 32 даидСдСаСи дддСиСаиаи иСССдСдСаи с <210> 33 <211> 35 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтетический олигомер <400> 33 дддадаидсд дисидддсис аиаиисссдс дсаис <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
РНК
Искусственная последовательность
Синтетический олигомер <400> 34 дддаидсдда сиддддисаи аиисссдсдс аис <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
РНК
Искусственная последовательность
Синтетический олигомер <400> 35 дддаидсдда сидддсасаи аиисссдсдс аис <210> 36 <211> 33 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигомер
- 53 026309 <400> 36 дддаидсдда сидддсидаи аиисссдсдс аис <210> 37 <211> 33 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигомер <400> 37 дддаидсдда сидддсисии аиисссдсдс аис <210> 38 <211> 33 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтетический олигомер <400> 38 дддаидсдда сидддсисаа аиисссдсдс аис <210> 39 <211> 33 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтетический олигомер <400> 39 дддаидсдда сидддсисаи ииисссдсдс аис <210> 40 <211> 33 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтетический олигомер <400> 40 дддаидсдда сидддсисаи ааисссдсдс аис
<210> <211> <212> <213> 41 33 РНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 41
- 54 026309 дддаидсдда сидддсисаи аиасссдсдс аис 33
<210> <211> <212> <213> 42 33 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 42
дддаидсдда сидддиисаи аиисссдсдс аис 33
<210> <211> <212> <213> 43 33 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 43
дддаидсдда сидддсссаи аиисссдсдс аис 33
<210> <211> <212> <213> 44 33 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 44
дддаидсдда сидддсииаи аиисссдсдс аис 33
<210> <211> <212> <213> 45 33 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 45
дддаидсдда сидддсисди аиисссдсдс аис 33
<210> <211> <212> <213> 46 33 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 46
дддаидсдда сидддсисас аиисссдсдс аис 33
- 55 026309 <210> 47 <211> 33 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтетический олигомер <400> 47 дддаидсдда сидддсисаи диисссдсдс аис <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
РНК
Искусственная последовательность
Синтетический олигомер <400> 48 дддаидсдда сидддсисаи асисссдсдс аис <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
РНК
Искусственная последовательность
Синтетический олигомер <400> 49 дддаидсдда сидддсисаи аиссссдсдс аис <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
РНК
Искусственная последовательность
Синтетический олигомер <400> 50 дддаидсдаа сидддсисаи аиисссдсдс аис <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
РНК
Искусственная последовательность
Синтетический олигомер <400> 51 дддаидсдда иидддсисаи аиисссдсдс аис
<210> 52
<211> 33
<212> РНК
- 56 026309
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 52
дддаидсдда сидддсисаи сиисссдсдс аис 33
<210> <211> <212> <213> 53 32 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 53
дддаидсдда сидддсисиа иисссдсдса ис 32
<210> <211> <212> <213> 54 32 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 54
дддаидсдда сидддсисаи иисссдсдса ис 32
<210> <211> <212> <213> 55 39 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 55
дддаддасда идсддисидд дсисаиаиис ссдсдсаис 39
<210> <211> <212> <213> 56 39 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический олигомер
<400> 56
дддаддасда идсдддсидд дсисаиаиис ссдсдсаис 39
<210> <211> <212> <213> 57 39 РНК Искусственная последовательность
<220>
- 57 026309
<223> Синтетический олигомер
<400> 57
дддаддасда идсддасидд дсисадаиис ссдсдсаис
<210> 58
<211> 33
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 58
дддаидсдиа сидддсисаи . аиисссдсдс аис
<210> 59
<211> 32
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 59
дддаидсдда сидддсисаа иисссдсдса ис
<210> 60
<211> 16
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 60 даидсдсддд ааиаид
<210> <211> <212> <213> 61 16 РНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 61 идсдсдддаа иаидад
<210> <211> <212> <213> 62 15 РНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 62
- 58 026309 ааиаидадсс садис
<210> 63
<211> 16
<212> РНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетический
<400> 63
иаидадссса диссдс
<210> 64
<211> 18
<212> РНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетический
<400> 64
аидадсссад иссдсаис
<210> 65
<211> 13
<212> РНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетический
<400> 65
сссадиссдс аис
<210> 66
<211> 74
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетический
<400> 66
дддддааЕЕс ЕааЕасдасЕ
ддаддасдаЕ дсдд
<210> 67
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетический
<400> 67
последовательность олигомер последовательность олигомер последовательность олигомер последовательность олигомер сасЕаЕаддд аддасдаЕдс последовательность олигомер
ЕсЕсддаЕсс ЕсадсдадЕс дЕсЕд ддЕааЕасда сЕсасЕаЕад
- 59 026309 <210> 68 <211> 32 <212> РНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигомер <220>
<223> КВ587 <220>
<221> шгзс £еа£иге <222> (1),?4),(6),(7),(11),(12),(13),(25),(27) <223> С представляет собой 2'г1Ьо С <220>
<221> шгзс £еа£иге <222> (2),(8),(17),(19),(29) <223> А представляет собой 2'г1Ьо А <220>
<221> Ш1зс £еа£иге <222> (5),(9),(14),(16),(22),(23),(24),(26),(28),(31) <223> С представляет собой 2'-£1иого С <220>
<221> Ш1зс £еа£иге <222> (3),(10),(15),(7),(18),(20),(21),(30) <223> и представляет собой 2'-£1иого и <220>
<221> Ш1зс £еа£иге <222> (32) <223> η представляет собой инвертированный деокситимидин <400> 68 даидсддаси дддсисаиаи исссдсдсаи сп 32

Claims (20)

1. Нуклеиново-кислотный лиганд, который связывает СЬЕС-2, где указанный лиганд содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из ЗЕЦ ГО N0:7, ЗЕЦ ГО N0:8, ЗЕЦ ГО N0:9 и ЗЕЦ ГО N0:24, и где указанная последовательность нуклеиновой кислоты образует по меньшей мере одну структуру стебля и по меньшей мере одну структуру петли, или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Лиганд по п.1, где этот лиганд содержит в 5'-3'-направлении первый стебель, длина которого составляет 5-10 пар оснований;
первую трехнуклеотидную петлю, которая содержит последовательность 5'-ОКС-3';
второй стебель, длина которого составляет 4 пары оснований, где указанный второй стебель содержит пару неоднозначного спаривания в основании второго стебля; и вторую петлю, содержащую нуклеотидную последовательность 5'-ΥυΥNNКΥυ-3'.
3. Лиганд по любому из предшествующих пунктов, где указанный лиганд связывает СЬЕС-2 с константой диссоциации в диапазоне от приблизительно 0,1 до 10 нМ.
4. Фармацевтическая композиция для лечения СЬЕС-2-опосредованных нарушений, содержащая лиганд СЬЕС-2 по любому из предыдущих пунктов или его фармацевтически приемлемую соль.
5. Модулятор, который связывается специфически с лигандом СЬЕС-2, содержащий последова- 60 026309 тельность, которая более чем на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из ЗН() ГО N0:60, ЗЕО ГО N0:61, ЗЕО ГО N0:62, ЗЕО ГО N0:63, ЗЕО ГО N0:64 и ЗЕО ГО N0:65, где указанный модулятор содержит вторую последовательность нуклеиновой кислоты и где указанный лиганд
СЬЕС-2 содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты.
6. Способ лечения СЪЕС^-опосредованного нарушения, предусматривающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества лиганда по любому из пп.1-5 или его фармацевтически приемлемой соли.
7. Способ по п.6, где СЪЕС^-опосредованным нарушением является опосредованное тромбоцитами нарушение.
8. Способ по п.6 или 7, где опосредованное тромбоцитами нарушение выбрано из группы, состоящей из сосудистого нарушения, сердечно-сосудистого нарушения, нарушения периферических сосудов, церебрально-васкулярного нарушения, опосредованного тромбоцитами воспалительного нарушения, связанного с диабетом нарушения, рака и ВИЧ-инфекции.
9. Способ по п.8, где сосудистое нарушение выбрано из группы, состоящей из острого коронарного синдрома, тромбоза, тромбоэмболии, тромбоцитопении, заболевания периферических сосудов и транзиторного ишемического приступа.
10. Способ по п.8, где церебрально-васкулярное нарушение выбрано из группы, состоящей из транзиторного ишемического приступа, ишемического инсульта и эмболии.
11. Способ по п.8, где опосредованное тромбоцитами воспалительное нарушение выбрано из группы, состоящей из артрита, ревматоидного артрита, псориатического артрита, реактивного артрита, воспалительного заболевания пищеварительного тракта, анкилозирующего спондилита и склеродермии.
12. Способ по п.8, где рак выбран из группы, состоящей из рака легкого, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака головного мозга, рака костей и рака печени.
13. Способ по п.8, где связанное с диабетом нарушение выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетической васкулопатии, атеросклероза, ишемического инсульта, заболевания периферических сосудов, острого повреждения почки и хронической почечной недостаточности.
14. Способ определения способности лиганда СЬЕС-2 активировать или ингибировать СЬЕС-2опосредованную агрегацию тромбоцитов, предусматривающий:
(a) смешивание лиганда СЬЕС-2 с пробой крови, (b) приведение смеси со стадии (а) в контакт с иммобилизованной на твердом носителе вспомогательной молекулой, (c) измерение уровня образования агрегации тромбоцитов, (й) сравнение степени образования агрегации тромбоцитов со стадии (с) со степенью их агрегации в контрольной пробе крови, в которой лиганд СЬЕС-2 отсутствует.
15. Способ по п.14, где вспомогательная молекула представляет собой активатор СЬЕС-2.
16. Способ по п.14 или 15, где вспомогательная молекула представляет собой растворимый коллаген типа Ι, ΙΙ или ΙΙΙ, где способ дополнительно предусматривает добавление родоцитина к пробе крови.
17. Способ по пп.14, 15 или 16, дополнительно предусматривающий смешивание обработанной пробы крови с модуляторной молекулой перед стадией (Ь), где указанная модуляторная молекула способна связывать указанную регуляторную молекулу лиганда.
18. Набор, содержащий лиганд СЬЕС-2 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
19. Набор по п.18, дополнительно содержащий модулятор, который специфически связывает лиганд СЬЕС-2.
20. Набор по п.18, содержащий модулятор, который специфически связывается с лигандом СЬЕС-2.
- 61 026309
Фиг. 2
Фиг. 3
Связывание 32-20 РЬ, 32-20 Т10 и КВ587 С СЬЕС-2
0.00001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1
СЬЕС-2 (мкМ)
82-20 ГЬ 82-20 ТЮ I КВ587 Односаитовое связывание (гипербола) Односаитовое связывание (гипербола) Односайтовое ί связывание ί (гипербола) ] Величины наилучшей' 1 подгонки Величины наилучшей подгонки Величины наилучшей I подгонки з Вмакс 0,8500 Вмакс 0.7823 Вмакс 0.8215 Κά 0.001340 КО 0.002159 Κά 0.002892
Фиг. 4
Фиг. 5А
- 62 026309
Фиг. 5В
Раунд [С1 ЕС*2] мкМ [РНК]мкМ РНКЬелок РНК нмоль тРНК 1 1 8 8 2 0 2 0.2 2 10 1 0 3 0.08 0.8 10 1 .0024% 4 0.08 0.72 12 1 .0024%
Фиг. 6
Последовательности Раунда 3
А С и <5 ; О 6 С и с А и А и и С С с е с е С А и С 15 2% 0% 0% 0% 0% 2% 12% 0% 5% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 87% 8% 4% 2% 2% А Ж, 0% 2% 0% \2<& 0% 2% 0% 0% 71% 2% 81% 0% 0% 0% 0% 2% 0% 0% 4% 0% 85% 14% 2% С 2% §00^ 0% 0% 0% 0% 9% 10% 0% 12% 4% 100% ва% 0% 0% 88% 0% 14% 82% и 7% 0% 58% 0% 2% 2% 2% 2% В% 78% 0% 0% 0% 0% 0% 2% 9% 72% 2% 78% 4%
У У А С А с υ г < и ! А υ 4 9%» 10 .· % 4 ίζ 4 ζ ? 0 п° ч’ «2% Тг О7 о ь «/ 4 г ( 31 ζ 4/ 10 59 7 а/я 71 , 73 7 ?ϊ ζ£Ρ 87 73 2Σί% 70 о А 10/ 00 /5 9 51.. 8в> 1 л 0 814 1-3 . ζ «с? 59 2 7 В/ а/.
Фиг. 7А
Последовательности Раунда 4
А С и 0 й 0 с и с А и А υ и с с с 0 С 0 € Α 0 С с 7% 0% 0% 0% с% 0% 11% 4% 4% ΰ% 0% 0% 0% 0% 98% 0% 98% 0% 0% 4% 117« !Й4Ь 10δ% А 87% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 07с 78% 2% 98% ΰ% 0% ΰ% 0% 0% 0% 0% 2% 0% 94% 4% 0% С 4% \т с>% 0% 0% 0% 93% а% 86% 7% 7% 0% 0% 0% 108% ιοο% 100% 2% 1007 0% 33% 4% '22% 85% и 2% 0% №&% 0% ΰ% 0% 2% 4% 0% 87% 0% ίδδΜ ϋ% ΰ% с% 0% 0% 2% 7% 2% 70% 4%
ίί | и Α Ц™ Λ г ί и С. С о 1 1 и ίη.\ « < 1 1 4 <- ? 7° »г>, 74% 1 - 4 4 4 5? * г 56 ρ / У 4% ί •5 < % ! и ί /О €7 у /? 8β·«|τβ' И г< Р ·> I 17 53%(61 . 47 λ к I ’ 87 ί 4 81 47 | 7 76
Фиг. 7В
- 63 026309
Фиг. 8
А υ V АО © №581 □ №582 Δ №583 О №584 V №585 №588
- 64 026309
Фиг. 10А
Агрегация 'Л/Р человека Родоцитин 8-30 15-18 нМ
Фиг. 10В
Фиг. 10С
Индуцированные родоцитином 'Л/Р человека Экспрессия Р-селектина с использованием антитела
СО62Р-РЕ (2 мкМ РНК)
Фиг. 11А
- 65 026309
Индуцированные родоцитином ТУР человека Экспрессия Р-селектина с использованием антитела
СО62Р-РЕ (2 мкМ РНК)
Контроль РВ588 №587
Фиг. 11В
Фиг. 12А
Фиг. 12В
EA201390173A 2010-10-14 2011-10-14 Нуклеиново-кислотные модуляторы clec-2 EA026309B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39319110P 2010-10-14 2010-10-14
PCT/US2011/056422 WO2012051571A2 (en) 2010-10-14 2011-10-14 Nucleic acid modulators of clec-2

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201390173A1 EA201390173A1 (ru) 2013-09-30
EA026309B1 true EA026309B1 (ru) 2017-03-31

Family

ID=45755491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390173A EA026309B1 (ru) 2010-10-14 2011-10-14 Нуклеиново-кислотные модуляторы clec-2

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20120095085A1 (ru)
EP (1) EP2627769A2 (ru)
JP (1) JP2013545443A (ru)
KR (1) KR20130122632A (ru)
CN (1) CN103476932A (ru)
AU (1) AU2011315903B8 (ru)
CA (1) CA2814076A1 (ru)
EA (1) EA026309B1 (ru)
IL (1) IL225645A0 (ru)
RU (1) RU2013108809A (ru)
SG (1) SG189856A1 (ru)
WO (1) WO2012051571A2 (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2895184A4 (en) * 2012-09-12 2016-09-07 Oklahoma Med Res Found MODULATION OF PLATELET ACTIVATION WITH PODOPLANIN MEDIATION
CN105112554B (zh) * 2015-09-28 2019-03-01 北京泱深生物信息技术有限公司 Clec1b基因在胆管癌诊断和治疗中的应用
AU2017278022B2 (en) * 2016-03-30 2023-07-06 Synovo Gmbh Detecting microbial infection in wounds
JP6961884B2 (ja) * 2016-05-09 2021-11-05 国立大学法人山梨大学 機能抑制型の遺伝子組換えロドサイチン変異体
WO2018046876A1 (en) * 2016-09-06 2018-03-15 The University Of Birmingham Treatment of chronic inflammatory disease
CN108478783B (zh) * 2018-03-30 2021-03-23 苏州大学 Clec-2在制备治疗颅脑损伤药物中的应用
US20200208110A1 (en) 2018-11-30 2020-07-02 Cellphire, Inc. PLATELETS LOADED WITH mRNA
EP3886879A4 (en) 2018-11-30 2022-12-07 Cellphire Inc. PLATES AS DELIVERY AGENTS
WO2020191069A1 (en) * 2019-03-18 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Modulation of type 2 immunity by targeting clec-2 signaling
AU2020267368B2 (en) 2019-05-03 2023-05-04 Cellphire, Inc. Materials and methods for producing blood products
US11701388B2 (en) 2019-08-16 2023-07-18 Cellphire, Inc. Thrombosomes as an antiplatelet agent reversal agent
WO2021158645A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 Cellphire, Inc. Methods of treating congenital hemophilia with anti-fibrinolytic loaded platelets

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006115295A1 (en) * 2005-04-25 2006-11-02 University Of Yamanashi Compositions and methods for treating hemostasis disorders associated with clec-2 signal transduction
WO2008121354A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-09 Duke University A method of modulating the activity of a nucleic acid molecule
WO2008134445A2 (en) * 2007-04-25 2008-11-06 University Of Yamanashi Platelet activation receptor clec-2: compositions and uses thereof
WO2010149664A1 (en) * 2009-06-22 2010-12-29 Csl Behring Gmbh Clec-2 is an essential platelet activating receptor in hemostasis and thrombosis

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
ES2259800T3 (es) 1990-06-11 2006-10-16 Gilead Sciences, Inc. Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico.
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5683867A (en) 1990-06-11 1997-11-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5789163A (en) 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Enzyme linked oligonucleotide assays (ELONAS)
US6011020A (en) 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5780228A (en) 1990-06-11 1998-07-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands to lectins
US6147204A (en) 1990-06-11 2000-11-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5919761A (en) 1992-08-14 1999-07-06 The Board Of Regents Of The University Of Michigan Peptides for heparin and low molecular weight heparin anticoagulation reversal
US6306598B1 (en) 1992-11-13 2001-10-23 Regents Of The University Of California Nucleic acid-coupled colorimetric analyte detectors
US6682886B1 (en) 1994-04-28 2004-01-27 Gilead Sciences, Inc. Bivalent binding molecules of 7 transmembrane G protein-coupled receptors
US6699843B2 (en) * 1995-06-07 2004-03-02 Gilead Sciences, Inc. Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to PDGF
US6475995B1 (en) 1998-01-16 2002-11-05 The Johns Hopkins University Oral delivery of nucleic acid vaccines by particulate complexes
US6428956B1 (en) 1998-03-02 2002-08-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometric methods for biomolecular screening
AU4697099A (en) 1998-06-18 2000-01-05 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Polymers for delivery of nucleic acids
US6624141B1 (en) 1999-03-17 2003-09-23 The Regents Of The University Of Michigan Protamine fragment compositions and methods of use
US6383752B1 (en) 1999-03-31 2002-05-07 Hybridon, Inc. Pseudo-cyclic oligonucleobases
US6376190B1 (en) 2000-09-22 2002-04-23 Somalogic, Inc. Modified SELEX processes without purified protein
US20040121443A1 (en) 2001-03-08 2004-06-24 Carr Francis J. Modified protamine with reduced immunogenicity
KR100578382B1 (ko) 2004-07-16 2006-05-11 나재운 항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자 및 그 제조방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006115295A1 (en) * 2005-04-25 2006-11-02 University Of Yamanashi Compositions and methods for treating hemostasis disorders associated with clec-2 signal transduction
WO2008121354A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-09 Duke University A method of modulating the activity of a nucleic acid molecule
WO2008134445A2 (en) * 2007-04-25 2008-11-06 University Of Yamanashi Platelet activation receptor clec-2: compositions and uses thereof
WO2010149664A1 (en) * 2009-06-22 2010-12-29 Csl Behring Gmbh Clec-2 is an essential platelet activating receptor in hemostasis and thrombosis

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEKSANDRA A. WATSON, CHARITA M. CHRISTOU, JOHN R. JAMES, ANGHARAD E. FENTON-MAY, GERALD E. MONCAYO, ANITA R. MISTRY, SIMON J. DAV: "The Platelet Receptor CLEC-2 Is Active as a Dimer", BIOCHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 48, no. 46, 24 November 2009 (2009-11-24), pages 10988 - 10996, XP055024220, ISSN: 00062960, DOI: 10.1021/bi901427d *
F. MAY, I. HAGEDORN, I. PLEINES, M. BENDER, T. VOGTLE, J. EBLE, M. ELVERS, B. NIESWANDT: "CLEC-2 is an essential platelet-activating receptor in hemostasis and thrombosis", BLOOD, vol. 114, no. 16, 15 October 2009 (2009-10-15), pages 3464 - 3472, XP055023466, ISSN: 00064971, DOI: 10.1182/blood-2009-05-222273 *
GOPINATH, S.C.B.: "Anti-coagulant aptamers", THROMBOSIS RESEARCH, TARRYTOWN, NY, US, vol. 122, no. 6, 1 January 2008 (2008-01-01), US, pages 838 - 847, XP025466375, ISSN: 0049-3848, DOI: 10.1016/j.thromres.2007.10.022 *
K. SUZUKI-INOUE, O. INOUE, G. DING, S. NISHIMURA, K. HOKAMURA, K. ETO, H. KASHIWAGI, Y. TOMIYAMA, Y. YATOMI, K. UMEMURA, Y. SHIN, : "Essential in Vivo Roles of the C-type Lectin Receptor CLEC-2: EMBRYONIC/NEONATAL LETHALITY OF CLEC-2-DEFICIENT MICE BY BLOOD/LYMPHATIC MISCONNECTIONS AND IMPAIRED THROMBUS FORMATION OF CLEC-2-DEFICIENT PLATELETS", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 285, no. 32, 6 August 2010 (2010-08-06), pages 24494 - 24507, XP055023464, ISSN: 00219258, DOI: 10.1074/jbc.M110.130575 *
KATO Y, KANEKO M K, KUNITA A, ITO H, KAMEYAMA A, OGASAWARA S, MATSUURA N, HASEGAWA Y, SUZUKI-INOUE K, INOUE O, OZAKI Y, NARIMATSU : "Molecular analysis of the pathophysiological binding of the platelet aggregation-inducing factor podoplanin to the C-type lectin-like receptor CLEC-2", CANCER SCIENCE, JAPANESE CANCER ASSOCIATION, TOKYO, JP, vol. 99, no. 1, 1 January 2008 (2008-01-01), JP, pages 54 - 61, XP002550988, ISSN: 1347-9032, DOI: 10.1111/j.1349-7006.2007.00634.x *
KATSUE SUZUKI-INOUE, ET AL.: "Involvement of the Snake Toxin Receptor CLEC-2, in Podoplanin-mediated Platelet Activation, by Cancer Cells", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, US, vol. 282, no. 36, 6 July 2007 (2007-07-06), US, pages 25993 - 26001, XP009105651, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/jbc.M702327200 *
O'CALLAGHAN, C.A.: "Thrombomodulation via CLEC-2 targeting", CURRENT OPINION IN PHARMACOLOGY, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS,, NL, vol. 9, no. 2, 1 April 2009 (2009-04-01), NL, pages 90 - 95, XP026194179, ISSN: 1471-4892, DOI: 10.1016/j.coph.2008.11.001 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2814076A1 (en) 2012-04-19
KR20130122632A (ko) 2013-11-07
EP2627769A2 (en) 2013-08-21
AU2011315903B2 (en) 2015-07-16
WO2012051571A3 (en) 2012-06-14
AU2011315903B8 (en) 2015-07-30
WO2012051571A2 (en) 2012-04-19
RU2013108809A (ru) 2014-09-10
JP2013545443A (ja) 2013-12-26
SG189856A1 (en) 2013-06-28
EA201390173A1 (ru) 2013-09-30
IL225645A0 (en) 2013-06-27
US20120095085A1 (en) 2012-04-19
CN103476932A (zh) 2013-12-25
AU2011315903A1 (en) 2013-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA026309B1 (ru) Нуклеиново-кислотные модуляторы clec-2
EP2070939B1 (en) Modulators of pharmacological agents
RU2571660C2 (ru) Модуляторы гликопротеина vi, представляющие собой нуклеиновую кислоту
US6699843B2 (en) Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to PDGF
WO2014066142A1 (en) Nucleic acid regulation of growth arrest-specific protein 6 (gas6)
DK2613789T3 (en) SDF-1-binding nucleic acids and their use in cancer treatment
WO2001087351A1 (en) Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to pdgf
CN1662663B (zh) 抑制纤溶酶原激活物抑制剂-1的dna酶
CA2743828C (en) Fas/fasl or other death receptor targeted methods and compositions for killing tumor cells
US8889646B2 (en) Nucleic acid modulators of glycoprotein VI
US8889645B2 (en) Nucleic acid modulators of glycoprotein VI
US20230146246A1 (en) Method of Modulating the Number and the Distribution of Tumor-Infiltrating Leukocytes in Tumors
WO2014066084A1 (en) Nucleic acid modulators of alpha2beta1

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU