CN103476932A - Clec-2的核酸调节剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了能结合CLEC-2并调节CLEC-2功能的配体。本发明所述的核酸CLEC-2配体能够抑制CLEC-2介导的血小板聚集，并且还可以用于调节CLEC-2介导的过程，例如血栓形成、肿瘤转移、淋巴管新生、HIV传播、炎症反应、细胞因子产生和吞噬作用。本发明还公开了调节剂分子，其能够在体外、体内和离体逆转CLEC-2配体的活性。

Description

CLEC-2的核酸调节剂

相关申请交叉引用

本申请要求于2010年10月14日提交的美国临时专利申请61/393,191号的权益，在此通过引用将其全文并入本文。

技术领域

本发明通常涉及包含核酸配体的药理体系，所述核酸配体能结合CLEC-2蛋白并调节CLEC-2蛋白的活性。使用抑制核酸配体的活性来中和其药理效应，从而恢复CLEC-2功能的调节剂，这些核酸配体还是活性可逆的。本发明还涉及包含核酸配体和/或调节剂的组合物以及使用这些药剂和组合物治疗CLEC-2介导的疾病的方法。

背景

最近使用生物信息学方法鉴定了C型凝集素样受体2(CLEC-2)，其被认为是血小板受体(O’Callaghan,C.A.,Current Opinion of Pharmacology,2009;9:90-95.)。CLEC-2是2型跨膜蛋白，其具有细胞外C型凝集素样结构域和含有单个hemlTAM(基于免疫受体酪氨酸的活化基序)YXXL基序的短胞质结构域。在Src激酶活化后，胞质YXXL基序中酪氨酸7的磷酸化通过配体结合引发，这依次磷酸化一系列下游信号蛋白，包括PLCγ2。有两种已知的能够与CLEC-2相互作用并调节其生理信号转导功能的天然存在的蛋白：内源性蛋白平足蛋白(podoplanin)和蛇毒液蛋白蛇毒蛋白(rhodocytin)，二者均能引发血小板活化，包括有效地刺激聚集和分泌。Inoue-Suzuki等人与Kato合作报道了平足蛋白诱导血小板聚集的概况与蛇毒蛋白诱导血小板聚集的概况非常相似，并且鉴定CLEC-2为平足蛋白的受体(Inoue-Suzuki,K.O.et.al.,J.Thromb.Haemost.2011;9(suppl1):44-55)。他们还表明，与CRP诱导的血小板聚集相比，蛇毒蛋白诱导的血小板聚集高度依赖TxA2产生和肌动蛋白聚合(Inoue,.et.al.Biochem.Biophys.Res.Commun.1999;256:114-120)。蛇毒蛋白和平足蛋白二者均以微摩尔亲和力与CLEC-2直接相互作用(Kato,Y.et.al.,CancerSci,2008;99:54-61;Ozaki,Y,et.al.,J.Throm.Hemost,2008;7.191-194)。已证明CLEC-2通过平足蛋白结合于肿瘤细胞，并且来自小鼠研究的结果表明CLEC-2信号转导可以促进肿瘤转移(Watson,A.A.,et al.,Biochemistry,2009;48:10988-10996)。

在扩大血栓形成中，CLEC-2还参与体内正常的止血作用和血栓形成(Spalton,J.C.,J.Throm.Hemost,2009;7:1192-1199;Watson,A.A.,et al.,Biochemistry,2009;48:10988-10996)。血管壁损伤时，内皮下细胞外基质蛋白的暴露引发血小板活化和聚集。最近在小鼠中已证明，抗CLEC-2抗体治疗能持续几天降低来自循环血小板的蛋白。CLEC-2缺陷型小鼠在离体和体内显示出重度血小板聚集物形成缺陷(May,F.,et al.,Blood,2009;114:3464-3472)。当小鼠缺陷CLEC-2时，在离体和体内流动条件下的血栓形成是严重缺陷的。与用抑制αIIbβ3的试剂或抑制GP1bα的试剂处理的小鼠相比，CLEC-2缺陷型小鼠表现出血时间适度增加(May,F.,et al.,Blood,2009;114:3464-3472;Kunicki,T.,Blood,2009;114:3364-3365)。

还发现CLEC-2能介导1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)结合于血小板。血小板上CLEC-2受体与HIV-1的结合可以允许HIV-1避免被血小板破坏，以及使用血小板促进HIV-1的传播(Chaipan,C.et al.,J.Virol.2006;80(18):8951-8960)。CLEC-2受体信号转导还参与调节髓样树突状细胞中的炎症反应(Mourao-Sa,D.et.al.,2011Eur.J.Immun.41:3040-3053)。

因此，存在对用于治疗CLEC-2介导的疾病的治疗剂和方法的需要。

概述

本文描述了能特异抑制CLEC-2的核酸配体，用于鉴定和/或表征这些配体的方法以及使用这些配体的治疗。

在一个方面，提供了CLEC-2配体或其药学可接受的盐，其中配体包含分离的核酸序列。在一个实施方案中，至少一个核苷酸是核糖核苷酸。在另一个实施方案中，至少一个核苷酸是2’-氟-2’脱氧嘧啶核苷酸。在另一个实施方案中，CLEC-2配体的分离的核酸序列包含核糖核苷酸和2’-氟-2’脱氧嘧啶核苷酸的混合物。

在一个实施方案中，CLEC-2配体包含含有至少一个茎和至少一个环的二级结构。

在一个实施方案中，在5’至3’方向，CLEC-2配体包含第一茎，长度是5-10个碱基对；第一三核苷酸环，其包含序列5’-GNC-3’；第二茎，长度是4bp，其中所述第二茎在第二茎底部包含摆动配对；以及第二环，其包含核苷酸序列5’-YUYNNRYU-3’。

在一个实施方案中，CLEC-2核酸配体长度为大约20至大约100个核苷酸(nt)。在另一个实施方案中，配体长度为大约30至大约90、大约30至大约40或大约30至大约35个核苷酸。在另一个实施方案中，CLEC-2核酸配体长度为大约30nt、31nt、32nt、33nt、34nt或35nt。

在一个实施方案中，CLEC-2配体包含核酸序列或其药学可接受的盐，所述核酸序列与选自SEQ ID NOs:4-93的序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致。

在一个实施方案中，配体能结合于CLEC-2蛋白或其片段。在另一个实施方案中，配体能结合于CLEC-2的可溶结构域。在另一个实施方案中，配体能结合于CLEC-2的细胞外结构域。在另一个实施方案中，配体能结合于CLEC-2的Gln58-Pro230结构域。在一个实施方案中，配体能特异性地结合于CLEC-2蛋白(SEQ ID NO:l)。在另一个实施方案中，配体能特异性地结合于CLEC-2的细胞外结构域(SEQ ID NO:2)。

在一个实施方案中，配体由核苷酸组成，其中一个或多个核苷酸被修饰。在另一个实施方案中，核苷酸修饰是稳定的修饰。在另一个实施方案中，在体外和/或体内，修饰增加配体的稳定性。在另一个实施方案中，在体内，修饰增加配体的生物利用度。

在一个实施方案中，配体在其3’末端包含反向的胸腺嘧啶。

在一个实施方案中，配体对于CLEC-2的解离常数(“Kd”)为大约20纳摩尔(nM)或更低。

在一个实施方案中，配体对于CLEC-2的解离常数大于0，但小于大约100微摩尔(μΜ)、小于大约1μΜ、小于大约500纳摩尔(nM)、小于大约100nM、小于大约50nM、小于大约1nM、小于大约500皮摩尔(pM)、小于大约300pM、小于大约250pM或小于大约200pM。在一个实施方案中，配体对于CLEC-2的解离常数范围为大约0.1至10nM或大约0.5至大约5nM。

在一个实施方案中，CLEC-2配体结合于CLEC-2变体，并且减少或抑制CLEC-2变体的功能，其中CLEC-2变体与CLEC-2氨基酸序列(SEQID NO:l或SEQ lD NO:2)至少80%、85%、90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。

在一个实施方案中，CLEC-2配体与CLEC-2结合稳定了CLEC-2的活性构象。在另一个实施方案中，CLEC-2配体与CLEC-2结合稳定了CLEC-2的失活构象。

在一个实施方案中，配体的一个或多个核苷酸包含修饰的糖和/或修饰的碱基。在另一个实施方案中，修饰是2’稳定修饰。在另一个实施方案中，2’稳定修饰是在核苷酸糖环上的2’-氟修饰。

在一个实施方案中，CLEC-2的核酸配体是可逆的，其中结合于CLEC-2的CLEC-2配体能够变成非结合的。在另一个实施方案中，在CLEC-2配体调节剂存在时结合于CLEC-2的CLEC-2配体变成与CLEC-2非结合。

在一方面，提供了能结合CLEC-2配体的调节剂，其中调节剂部分或完全逆转CLEC-2配体的活性。

在一个实施方案中，调节剂包含分离的核酸序列。在另一个实施方案中，调节剂包含DNA序列、RNA序列、多肽序列或它们的任意组合。在一个实施方案中，调节剂是核酸调节剂，所述核酸调节剂包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、2’-O-甲基-2’脱氧核苷酸或脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和2’-O-甲基-2’脱氧核苷酸的混合物。在另一个实施方案中，核酸调节剂包含至少一个修饰的脱氧核糖核苷酸和/或至少一个修饰的核糖核苷酸。

在一个实施方案中，调节剂包含与CLEC-2核酸配体的至少一部分互补的寡核苷酸。在另一个实施方案中，调节剂由与CLEC-2核酸配体的至少一部分互补的寡核苷酸组成。在另一个实施方案中，调节剂包含与CLEC-2配体的环的至少一部分互补的寡核苷酸序列。在另一个实施方案中，调节剂包含与CLEC-2配体的茎的至少一部分互补的寡核苷酸序列。在另一个实施方案中，调节剂包含与CLEC-2配体的茎的至少一部分互补的和与CLEC-2配体的环的至少一部分互补的寡核苷酸序列。

在一个实施方案中，调节剂包含与选自SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65的序列超过80%、85%、90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。在另一个实施方案中，调节剂包含选自SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65的序列。

在一个实施方案中，CLEC-2核酸配体的调节剂选自核酶、脱氧核酶、肽核酸(PNA)、吗啉基核酸(MNA)和锁核酸(LNA)。

在一个实施方案中，CLEC-2核酸配体的调节剂包含与CLEC-2核酸配体的至少一部分互补的核酸。在另一个实施方案中，调节剂选自核酶、脱氧核酶、肽核酸(PNA)、吗啉基核酸(MNA)和锁核酸(LNA)，其中调节剂能与CLEC-2核酸配体的至少一部分特异性地结合或相互作用。

在一个实施方案中，调节剂选自结合蛋白或肽的核酸、小分子、寡糖、结合脂质的核酸、聚合物、纳米颗粒和微球体，其中调节剂能与CLEC-2核酸配体的至少一部分结合或相互作用。

在一个实施方案中，调节剂包含分离的核酸序列，其中序列长度是大约10nt至大约30nt、大约10nt至大约25nt、大约10nt至大约20nt、大约10nt至大约15nt或大约15nt至大约20nt。在另一个实施方案中，调节剂包含分离的核酸序列，其中序列长度是大约10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt或20nt。

在一个实施方案中，修饰CLEC-2核酸配体和/或核酸调节剂序列的一个或多个核苷酸。在另一个实施方案中，一个或多个核苷酸包含在2’羟基位置的修饰。在另一个实施方案中，存在于CLEC-2配体中的修饰选自2’-氟。在另一个实施方案中，CLEC-2配体的一个或多个核苷酸是2’-氟-2’脱氧胞苷或2’-氟-2’脱氧尿苷。在另一个实施方案中，调节剂的一个或多个核苷酸是2’-O-甲基胞嘧啶、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基腺苷、2’-O-甲基鸟苷或2’-O-甲基胸苷。在另一个实施方案中，一个或多个核苷酸是2’氟胞苷、2’氟尿苷、2’氟腺苷或2’-氟鸟苷。

在一个实施方案中，CLEC-2核酸调节剂的一个或多个核苷酸的修饰包含选自以下的修饰：5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基胺甲基硫尿核苷、5-羧基甲基胺甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、6-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶羟乙酸(v)、布他沙明(butoxosine)、假尿嘧啶、Q苷、2-巯基胞嘧啶、5-甲基硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶羟乙酸(v)、5-甲基硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧丙基)尿苷(acp3U)和2,6-二氨基嘌呤。

在一个实施方案中，调节剂包含至少一个修饰的糖部分。

在一个实施方案中，调节剂与CLEC-2配体结合暴露CLEC-2配体内的自杀位置，从而破坏CLEC-2配体的二级结构，并且导致核酸酶对核酸CLEC-2配体的破坏增强。

在一个实施方案中，调节剂与CLEC-2配体-CLEC-2复合物的结合降低或消除CLEC-2配体与CLEC-2的结合。

在另一方面，提供了调节CLEC-2配体活性的方法。

在一个实施方案中，核酸配体能特异性地结合CLEC-2，并抑制CLEC-2介导的疾病。在一个实施方案中，配体抑制CLEC-2介导血小板聚集的能力。在一个实施方案中，配体抑制CLEC-2介导血小板活化和分泌的能力。在一个实施方案中，配体抑制CLEC-2扩散血栓形成的能力。在一个实施方案中，配体抑制CLEC-2与内源性蛋白平足蛋白相互作用的能力。在一个实施方案中，配体抑制CLEC-2与肿瘤细胞相互作用的能力。在一个实施方案中，配体抑制CLEC-2通过平足蛋白结合肿瘤细胞和吸引血小板至肿瘤位置的能力。在一个实施方案中，配体抑制CLEC-2与肿瘤细胞相互作用的能力，从而抑制转移。在一个实施方案中，配体抑制CLEC-2与肿瘤细胞相互作用的能力，从而降低肿瘤细胞释放生长因子的能力。在一个实施方案中，配体抑制CLEC-2与人免疫缺陷病毒(HIV)相互作用的能力。在一个实施方案中，配体抑制CLEC-2促进HIV传播的能力。在一个实施方案中，配体抑制CLEC-2信号介导的炎症反应、细胞因子产生、血小板-单核细胞相互作用和血小板粘附的能力。

在一个实施方案中，提供了通过给予宿主CLEC-2配体的调节剂来调节CLEC-2核酸配体活性的方法，该宿主已给予核酸CLEC-2配体。在一个实施方案中，调节剂可以是寡核苷酸调节剂或其衍生物，在某些实施方案中，调节剂与核酸CLEC-2配体的一部分互补。

在另一方面，提供了使用CLEC-2配体调节CLEC-2功能的方法。

在一个实施方案中，调节CLEC-2功能的方法包括给予宿主治疗有效量的CLEC-2配体。在另一个实施方案中，方法还包括给予宿主CLEC-2配体的调节剂，所述宿主之前已给予CLEC-2配体。

在另一方面，提供了治疗或改善CLEC-2介导的疾病或病症的方法。

在一个实施方案中，方法包括给予有需要的宿主治疗有效剂量的能与CLEC-2结合的CLEC-2配体。在一个实施方案中，宿主被诊断有血小板介导的疾病。

在一个实施方案中，血小板介导的疾病或病症选自心血管疾病、脑血管疾病、周围血管疾病、急性冠脉综合征、糖尿病相关疾病和癌症。

在一个实施方案中，脑血管疾病是血栓症、血栓栓塞或短暂性脑缺血发作(TIA)。在另一个实施方案中，急性冠脉综合征是由于冠状动脉血栓形成、不稳定的心绞痛或心肌梗死。在另一个实施方案中，糖尿病相关疾病是糖尿病性视网膜病变、糖尿病血管病变、动脉粥样硬化、缺血性卒中、周围血管疾病、急性肾损伤或慢性肾衰竭。在一个实施方案中，癌症选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、胰腺癌、脑癌、骨癌和肝癌。

在一个实施方案中，通过以下给予CLEC-2配体：肠胃外给药、静脉注射、皮内递送、关节内递送、滑膜内递送、鞘内递送、动脉内递送、心内递送、肌肉递送、皮下递送、眼眶内递送、囊内递送、脊柱内递送、胸骨内递送、局部递送、透皮贴剂递送、直肠递送、口腔递送、通过阴道或尿道栓塞递送、腹膜递送、经皮递送、通过鼻喷雾递送、通过手术植入递送、手术涂布递送、通过输注泵递送或通过导管递送。

在另一方面，提供了通过给予CLEC-2配体治疗有需要的宿主的方法，其中CLEC-2配体调节血小板功能。

在一个实施方案中，给予治疗有效剂量的CLEC-2。

在一个实施方案中，治疗有效剂量降低或抑制血小板粘附和/或聚集和/或分泌。

在一方面，提供了药物组合物，其包含治疗有效量的能结合CLEC-2的核酸配体。

在一方面，提供了包含治疗有效量的调节剂的药物组合物，其中调节剂逆转能结合CLEC-2的核酸CLEC-2配体的活性。

在一个实施方案中，药物组合物包含CLEC-2配体和药学可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，药物组合物是适于静脉注射的液体。在另一个实施方案中，药物组合物是适于皮下注射的液体或分散剂。

在一方面，提供了试剂盒，其包含治疗有效量的CLEC-2核酸配体和/或调节CLEC-2核酸配体活性的调节剂。

在一个实施方案中，试剂盒包含CLEC-2配体。在另一个实施方案中，试剂盒包含CLEC-2配体的调节剂。在另一个实施方案中，试剂盒包含CLEC-2配体和CLEC-2配体的调节剂。

还将本文所述的方法、药物组合物和核酸配体的用途提供为在需要抗血小板或抗血栓治疗的疾病或治疗方案中使用的可调整的疗法。在某些实施方案中，治疗是手术介入，包括经皮介入。方法可以包括给予有需要的宿主CLEC-2的核酸配体，其中宿主患有或有风险患有冠状动脉、脑或外周血管系统的闭塞性血栓疾病或病症。此外，提供了药物组合物，在药物组合物中核酸配体或其调节剂与药学可接受的载体联合。可以设计用于给予宿主(其已被给予核酸配体)的含有调节剂的组合物，来允许调节配体的活性，并因此调节有大出血风险宿主的凝固状态。

在一方面，提供了用于确定CLEC-2配体是激活还是抑制CLEC-2功能的方法。在一个实施方案中，CLEC-2的功能是CLEC-2依赖的或CLEC-2介导的血小板聚集。在另一个实施方案中，提供了用于确定CLEC-2配体是否激活CLEC-依赖的血小板聚集的方法。在另一个实施方案中，在体外进行所述方法。

在一个实施方案中，方法包括

(a)将CLEC-2配体与血液样品混合来制备处理的血液样品；

(b)将处理的血液样品与促进剂分子接触；

(c)测量接触后的血小板聚集物的形成；以及

(d)将在步骤(c)中检测的血小板聚集物形成的程度与用对照血液样品获得的血小板聚集物形成的程度进行比较，所述对照血液样品没有用于结合CLEC-2并抑制其与促进剂分子的相互作用的CLEC-2配体。

在一个实施方案中，促进剂分子固定于固体支持物。

在一个实施方案中，促进剂分子是CLEC-2活化剂。在另一个实施方案中，促进剂分子是蛇毒蛋白。在另一个实施方案中，促进剂分子是平足蛋白。

在一个实施方案中，当与CLEC-2活化剂联合使用时，促进剂分子是可溶性胶原蛋白。在另一个实施方案中，可溶性胶原蛋白是I、II或III型胶原蛋白。在另一个实施方案中，方法还包括向血液样品加入CLEC-2活化剂。在另一个实施方案中，CLEC-2活化剂是蛇毒蛋白。

在一个实施方案中，血液样品是全血。在另一个实施方案中，血液样品是血小板富集的血浆(PRP)。在另一个实施方案中，血液样品是洗涤血小板。

在一个实施方案中，CLEC-2配体是核酸CLEC-2配体。在另一个实施方案中，核酸CLEC-2配体包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9衍生的序列。

附图说明

图1是SELEX核酸配体筛选方法的图表。

图2显示了1-10轮Sel2筛选的条件。

图3显示了CLEC-2配体筛选结合的富集。

图4显示了筛选CLEC-2核酸配体的结合曲线。

图5说明了S2-20T10和RB587预测的二级结构。

图6显示了简并筛选的具体条件。

图7说明了S2-20简并筛选序列的保守性。

图8显示了CLEC-2配体和调节剂间的互补区域。

图9A-B显示了蛇毒蛋白诱导的CLEC-2配体WP血小板聚集的图。

图10A-C显示了在CLEC-2配体存在或在CLEC-配体和CLEC-2配体调节剂存在时蛇毒蛋白诱导的血小板聚集的图。

图11A-B显示了蛇毒蛋白诱导的人P-选择素表达的图。

图12A-B显示了体外基于流动的血小板粘附试验的结果。

详细说明

核酸配体，也被称为“适体”，是非天然存在的单链核酸，其采用能够结合理想的靶分子的特定的三维形状。对于能够结合肽和蛋白的配体，配体与其靶蛋白结合可以导致蛋白功能的抑制，这与单克隆抗体与其靶蛋白结合可以导致蛋白功能的抑制非常像。核酸配体独有的特征是使活性控制剂与它们产生通过沃森-克里克碱基配对与配体杂交的互补寡核苷酸形式的能力。这些活性控制剂从根本上改变了配体的活性结构，从而中和它们的药物活性。本发明提供了化合物、组合物和方法，其包含用于介导CLEC-2的生物学功能和相互作用的CLEC-2核酸配体。还提供了能够调节CLEC-2核酸配体活性的调节剂。

定义

如本文所使用的，将应用以下定义除非另有所指。

本文所使用的术语“大约”，当结合可测量的值，例如重量、时间、剂量等时，是指包括特定值±20%或±10%、±5%、±1%或±0.1%的变化，因为这些变化适于进行本公开的方法。

“核酸配体”，在本文也可以被称为“配体”或“适体”，是能够形成三级结构并能与靶分子相互作用的核酸。“CLEC-2核酸配体”或“CLEC-2配体”或“抗-CLEC-2配体”或“核酸CLEC-2配体”是指能特异性地结合CLEC-2或其片段的配体或适体。CLEC-2片段可以是可溶性片段，例如细胞外结构域(ECD)或其片段。可选地，CLEC-2配体能结合在细胞表面表达的或发现与血小板有关的CLEC-2分子。CLEC-2蛋白可以是在细胞上内源性表达的或通过重组方法表达的。该术语指具有特定结合区域的寡核苷酸，该区域在生理环境下能够与预期的靶分子形成复合物。配体和靶分子结合的亲和力根据配体和靶分子间相互作用的解离常数(Kd)来限定。通常地，配体与其靶分子的Kd为大约0.1nM至大约100nM。与配体和环境中的其它物质或通常不相关的分子的解离常数相比，结合的特异性根据配体与靶标的相对解离常数来限定。通常地，配体与靶标的Kd将比与不相关的物质或环境中附随物质的Kd低10倍、50倍、100倍或200倍。

如本文所使用的，在同源区域的背景下，“基本上同源的”序列是在特定分子内通过沃森-克里克碱基配对形成相同的二级结构的序列。在某些实施方案中，如果序列与指定的配体分享至少80%、85%或更高的序列一致性，例如大约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，则序列是“基本上同源的”。为了清楚，这些“基本上同源的”序列还可以被描述为与特定序列“具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性”的序列，或者序列可以与特定的配体序列大约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在指定长度(例如50或更少的核苷酸)的核酸配体的背景下，能够在允许沃森-克里克结合形成相同的二级结构的任何区域内发现同源序列，而与特定区域内的序列一致性无关。

本申请提交的序列表仅提供了主要的序列(提供了不含特定修饰的核苷酸序列)。应理解的是，在所提交的本说明书和序列表中提供的每一个序列都可以具有本文所述的任意修饰组合。如表1-4中所述的具有修饰的序列的每一个与特定的“克隆名称”或“名称”关联，所述名称提供了具有特别确定的修饰的核酸序列的确定的描述。

“配体调节剂对(Ligand modulator pair)”或“配体调节剂对(ligandmodulator pair)”表示包括靶分子指定的配体和配体调节剂，所述配体调节剂能改变配体的二级和/或三级结构以便调节配体与其靶分子的相互作用。调节剂可以是与配体的一部分部分互补的寡核苷酸。在体外、离体或体内的生理条件下，调节剂能够改变配体的构象，从而使得配体的靶标结合能力降低10%至100%、20%至100%、25%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%或范围为10%至100%内的任意百分比。

“调节剂”、“解毒剂”、“调节物”或“控制剂”是指任何能够结合本文所述的配体或适体，并以理想的方式修饰配体及其靶分子(例如，通过修饰配体的结构)间相互作用的试剂。

本文所用的“调节”表示活性减少、增加或一些其它可测量的变化。

“宿主”是指哺乳动物，并且包括人和非人哺乳动物。宿主的例子包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、兔、猫、狗、山羊、马、绵羊、牛和人类。

本文所用的“药学可接受的”，表示由联邦或州政府的管理机构批准的，或美国药典或其它普遍公认的药典中所列举的供人使用的。

药物有效剂量是预防、抑制发生或治疗(将症状减轻至一定程度)疾病状态所需要的剂量。药物有效剂量依赖于疾病的类型、使用的组合物、给药途径、被治疗的哺乳动物类型、所关注的具体哺乳动物的身体特征、同时进行的药物治疗以及在医疗领域技术人员所认识到的其它因素。通常地，根据核酸配体和调节剂的效力每天给予量为0.1mg/kg至100mg/kg体重的活性成分。

“稳定的核酸分子”是指与不稳定的核酸分子相比在体内不易被降解(例如，通过核酸外切酶或核酸内切酶)的核酸分子。稳定性可以是长度和/或二级结构和/或寡核苷酸骨架的糖或磷酸部分内含有的化学替代物的功能。例如，稳定性可以通过控制能够稳定分子的二级结构来获得。例如，如果核酸分子3’末端与上游区域互补，则这部分能够对叠起来，并形成稳定分子的“茎环”结构。

术语“结合亲和力”和“结合活性”本意是指配体分子结合或不结合靶标的趋势。所述相互作用的热力学在“结合活性”和“结合亲和力”中非常重要，因为它们确定了相互作用伴侣的必要浓度、这些伴侣能够结合的速率和结合和溶液中结合分子和游离分子的相对浓度。除此之外，热力学可以通过测定解离常数Kd来表征。

本文使用的“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”是指在哺乳动物中任何疾病的治疗，包括：(a)防御疾病，即，使临床症状不再发展；(b)抑制疾病，即，阻止、改善、降低或抑制临床症状的发展；和/或(c)缓解疾病，即，使临床症状消退。本领域技术人员应理解，在人用药物中，并不是总能够区分“预防”和“抑制”，因为最终诱导的事件可能是未知的，潜在的，或患者没有被查明直至远在事件发生之后。因此，本文所用的作为“治疗”的要素的术语“预防”意图包括如本文定义的“预防”和“抑制”。如本文所使用的，术语“保护”意欲包括“预防”。

术语“有效量”是指足以为被治疗的疾病或疾病状态提供治疗的剂量。其将根据患者、疾病和所实施的治疗而不同。

如本文所用的CLEC-2核酸配体“变体”包括这样的变体，变体与CLEC-2核酸配体执基本相同的功能，并且包含基本相同的结构。

CLEC-2

CLEC-2是在肝细胞和几种造血细胞的表面表达的跨膜蛋白，所述造血细胞包括单核细胞、树突状细胞、NK细胞和粒细胞。在造血细胞和肝窦内皮细胞中，CLEC-2蛋白在血小板和巨核细胞中特异性表达(Chaipanet al.,2006;J Virol,80:8951-8960)。已经证明CLEC-2通过Src和Syk激酶介导血小板活化。

最初，仅鉴定了CLEC-2的外源配体。这些配体包括蛇毒即蛇毒蛋白(aggretin)和HIV-1，两者均都已被证明能够活化血小板，从而活化血小板聚集。CLEC-2缺陷与出血次数增多和防御闭塞性动脉血栓形成有关(May et al.,2009,Blood,114:3464-3472)。May等人还证明了抗CLEC-2抗体治疗小鼠导致在循环的血小板中CLEC-2完全且高特异性地丢失几天，伴随血小板聚集的严重缺陷。

最近被Ozaki等人鉴定(2010;J.Throm Haemos.,7:191-194)的内源性CLEC-2配体是平足蛋白。平足蛋白是唾液酸糖蛋白，与肿瘤诱导的血小板聚集和肿瘤转移有关。平足蛋白在淋巴内皮和肾足细胞中大量表达。在血管内皮中没有检测到平足蛋白的表达。平足蛋白与CLEC-2的相互作用对于在发育过程中血液和淋巴管的分离非常重要。研究表明，平足蛋白和CLEC-2缺陷型小鼠表现出出血表型和非典型性血管连接(Schacht,V.,et.al.,2003,EMBO,J.22:3546-3556;Suzuki-Inoue K.et al.,2010,J.Biol.Chem,285:24494-24507)。研究表明CLEC-2可以在血液肿瘤转移中发挥作用，因为受体介导肿瘤细胞诱导的血小板活化，这是已知显著促进肿瘤细胞扩散的过程(Honn et al.,1992,Cancer Metastasis Rev,11:325-351;Nieswandt et al.,Cancer Res,1999,59:1295-1300)。

以下展示了全长CLEC-2蛋白(GenBank Accession No.AAF36777)的氨基酸序列：

CLEC-2(SEQ ID NO:1)

  1 MQDEDGYITL NIKTRKPALI SVGSASSSWW RVMALILLIL CVGMVVGLVA LGIWSVMQRN

 61 YLQDENENRT GTLQQLAKRF CQYVVKQSEL KGTFKGHKCS PCDTNWRYYG DSCYGFFRHN

121 LTWEESKQYC TDMNATLLKI DNRNIVEYIK ARTHLIRWVG LSRQKSNEVW KWEDGSVISE

181 NMFEFLEDGK GNMNCAYFHN GKMHPFTCEN KHYLMCERKA GMTKVDQLP

CLEC-2的细胞外结构域(ECD)大约包含氨基酸58-229，并在以下呈现：

CLEC-2(Gln58-Pro229)(SEQ ID NO:2)

 58                                                               QRN

 61 YLQDENENRT GTLQQLAKRF CQYVVKQSEL KGTFKGHKCS PCDTNWRYYG DSCYGFFRHN

121 LTWEESKQYC TDMNATLLKI DNRNIVEYIK ARTHLIRWVG LSRQKSNEVW KWEDGSVISE

181 NMFEFLEDGK GNMNCAYFHN GKMHPFTCEN KHYLMCERKA GMTKVDQLP

CLEC-2的细胞外结构域(ECD)与N末端His10标签融合(SEQ ID NO:3)，其包含氨基酸58-229，并在以下呈现，所述His10标签用于筛选本文所述的核酸配体：

HHHHHHHHHHQRNYLQDENENRTGTLQQLAKRFCQYVVKQSELKGTFKGHKCSPCDTNWRYYGDSCYGFFRHNLTW

EESKQYCTDMNATLLKIDNRNIVEYIKARTHLIRWVGLSRQKSNEVWKWEDGSVISENMFEFLEDGKGNMNCAYFH

NGKMHPFTCENKHYLMCERKAGMTKVDQLP

CLEC-2核酸配体的开发

使用SELEX方法鉴定特异性结合CLEC-2蛋白的核酸配体。最初通过SELEX获得的配体随后被完全表征，从而了解CLEC-2配体的特性。这些包括测序、序列对比以确定保守序列、二级结构预测和截短及突变分析以鉴定对特异性结合和抑制CLEC-2的理想功能最关键的配体区域。

SELEX是指通过指数富集的配体的系统演化。该方法允许能高特异性结合靶分子的核酸分子的体外演化。例如，在美国专利5,475,096号和5,270,163号(还参见WO 91/19813)中描述了SELEX方法。

在其最基础的形式中，SELEX方法可以通过以下的一系列步骤定义：

1)制备不同序列的核酸的候选混合物。候选混合物通常包括固定序列的区域(即，候选混合物的每一个成员在相同的位置包含相同的序列)和随机序列的区域。选择固定序列的区域：(a)协助以下所述的扩增步骤，(b)模拟已知能结合靶标的序列，或(c)在候选混合物中提高给定结构排布的核酸的浓度。随机序列可以是完全随机的(即，在任何位置发现某一碱基的概率是四分之一)或仅部分随机的(例如，在在任何位置发现某一碱基的概率可以在0至100%的任何水平上进行选择)。

2)在适合靶标和候选混合物成员之间结合的条件下，将候选混合物与选择的靶标接触。在这些环境下，靶标和候选混合物的核酸之间的相互作用可以被认为在靶标和对靶标具有最强亲和力的那些核酸之间形成核酸-靶分子复合物。

3)从对靶标具有较低亲和力的那些核酸中区分出对靶标具有最高亲和力的核酸。因为只有极少数量的与最高亲和力核酸对应的序列(可能只有一种核酸分子)存在于候选混合物，通常理想的是设定分离标准，使得在候选混合物中大量的核酸(大约5至50%)在分离过程中被保留。

4)然后扩增在分离过程中选择的与靶标具有相对更高亲和力的那些核酸，以产生在对靶标具有相对更高亲和力的核酸中富集的新的候选混合物。

5)通过重复以上分离和扩增步骤，新形成的候选混合物包含越来越少的弱结合序列，并且核酸对靶标的亲和力的平均程度通常将提高。SELEX方法产生包含一种或少量独特的核酸的候选混合物，该核酸代表了来自初始候选混合物的那些核酸序列，其折叠成能够与靶分子以最高亲和力相互作用的特定的二级和三级结构。

通过使用如美国专利第7,087,735号所述的SELEX方法，针对代表分子的细胞外结构域的小肽进行SELEX，可以产生CLEC-2特异的核酸配体。可选择地，通过使用如美国专利第6,730,482号所述的SELEX方法，在完整的血小板、富集蛋白的血小板膜成分、纯化的CLEC-2或特异性过表达CLEC-2受体的细胞系上进行SELEX，可以分离CLEC-2特异的核酸配体。

此外，使用竞争性亲和洗脱方案，SELEX方法可以用于分离特异性的CLEC-2核酸配体，例如在美国专利第5,780,228号中所描述的。

在某些实施方案中，在生理条件下CLEC-2核酸配体能结合CLEC-2受体。生理条件通常涉及溶液的盐和pH水平。在体外，生理条件通常在大约为7.4的pH下，在包含150mM NaCl、2mM CaCl₂、20mM HEPES的缓冲液中复制。在某些实施方案中，如上所述使用天然的通常未活化的血小板筛选核酸配体群体，并提供富集的群体，该群体包含针对血小板上所见的蛋白的配体。然后针对过表达理想的CLEC-2受体的稳定细胞系或瞬时转染蛋白的细胞系使用富集的群体。通过配体竞争研究或通过鉴定在细胞内信号通路上的效应，在型这些细胞分离的受体或全部细胞上使用修饰的SELEX程序，可以完成二级筛选。

还可以在血小板功能测试中，筛选抑制血小板聚集的配体，例如在富含血小板的血浆或洗涤血小板制剂中进行光比浊血小板聚集实验；或在全血中进行阻抗法血小板聚集试验；或在富含血小板的血浆、全血或洗涤血小板中通过用蛇毒蛋白活化血小板，随后用血小板活化和聚集的标志物染色来进行FACS，所述标志物包括抗-CD62P(P-选择素)、抗-PAC1(活化的GPIIbIIIa)或抗-纤维蛋白原。还可以通过配体阻断由给定受体的已知活化剂所触发的细胞内信号转导事件的能力，区分给定核酸配体对CLEC-2的特异性活化剂。还可以当通过活化受体而不是CLEC-2的活化剂触发聚集时，不存在对血小板聚集效应来区分给定核酸配体对CLEC-2的特异性活化剂。

本文所述的配体由分离的核酸序列组成，核酸序列可以是DNA或RNA，并且可以使用修饰的核糖核酸或脱氧核糖核酸合成。在本文所述的某些实施方案中，以RNA序列书写核酸序列。同样地，在本文所述的某些实施方案中，其中核酸配体最初被鉴定为DNA分子，以DNA序列书写核酸序列。应理解在文本形式中以DNA序列呈现的核苷酸序列内在地提供了对应RNA序列的描述，其中DNA序列中的胸腺嘧啶(T’s)用尿苷(U’s)取代以得到相应的RNA核苷酸序列。同样地，应理解在文本形式中以RNA序列呈现的序列内在地提供了对应DNA序列的描述，其中RNA序列中的尿苷(U’s)用胸腺嘧啶(T’s)取代以得到相应的DNA序列。

配体对靶标的结合亲和力可以结合Kd进行限定。该解离常数的值可以通过众所周知的方法直接测定，例如通过实施例1中所述的放射性配体结合法。

在一些实施方案中，配体结合CLEC-2的Kd范围可以为大约1nM至大约100nM、大约10nM至大约50nM或大约0.1nM至大约20nM。在其它的实施方案中，配体结合CLEC-2的Kd小于配体结合不相关蛋白或环境中其它附随物质的Kd的至少2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。不相关蛋白还可以是具有与CLEC-2中存在的基序相关的基序蛋白，诸如另一种血小板活化或粘附受体。

如同以下将更详细讨论的，还可以使用多种基因改造方法修饰或提高通过SELEX方法获得和鉴定的配体的结合活性。

在一些实施方案中，配体能与CLEC-2的细胞外结构域相互作用。配体能够干扰内源性配体与CLEC-2受体的结合。在某些实施方案中，配体能够通过CLEC-2受体抑制细胞内的信号转导。配体还能够稳定或破坏受体的构象，例如二聚体构象，使得受体与内源性配体如平足蛋白相互作用的能力降低，内源性配体。在某些实施方案中，配体能够影响血小板聚集和/或活化和/或血小板粘附和/或血小板分泌。

本文所述的核酸配体可以作为活性可逆的试剂发挥功能。在给予患者之后，这些可逆试剂是能够通过给予第二试剂直接控制受控的试剂或药物活性分子，。如以下更详细的描述，在本文称为调节剂的第二试剂能够关闭或调整配体的药物活性。因此，配体的药物活性能够通过例如药物清除以外的方法逆转。

本文公开的CLEC-2配体优选是能够特异性地结合CLEC-2细胞外结构域(ECD)(氨基酸残基Gln58-Pro230；SEQ ID NO:2)的核酸配体。CLEC-2配体利用以下和实施例1中更详细描述的SELEX方法筛选，然后经修饰以增加稳定性、对CLEC-2的亲和力和/或调节CLEC-2活性的能力。

根据本文所述方法分离的配体在以下提供在本文实施例2中出现的表1-2中。

如本文所述，如实施例1-2所述，分离并测序能结合CLEC-2的适体，导致鉴定出20个独特的序列。鉴定一个克隆，S2-20，为CLEC-2依赖的血小板聚集高亲和力抑制剂。如在实施例3-5中所述，通过产生截短和/或突变版本的SELEX筛选的序列进一步表征该克隆。使用在mfold服务器(mfold.bioinfo.rpi.edu)上获得的软件，克隆S2-20(SEQ ID NO:8或SEQID NO:9)的二级结构分析预测出了共有结构，其中CLEC-2配体(适体)具有长度大约6bp的第一茎，但数据表明，该第一茎的长度范围为5至10bp，并保持对CLEC-2的高亲和力。因而，适体的第一茎范围为大约3bp至大约15bp，或大约4bp至大约12bp、或大约5bp至大约10bp。可预见，第一茎可以具有大约为3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、11bp、12bp、13bp、14bp或15bp的长度。还预测CLEC-2配体结构具有序列为5’-GAG-3’的第一环，尽管突变分析显示在第一环结构的第二位置中的突变耐受。因此，可预见，CLEC-2配体的第一环包含5’-GNC-3’共有序列，其中N可以是A、T、C、G或U。3’至第一环是长度大约为4bp的第二茎，在茎的底部，含有摆动碱基对，但该长度可以从大约3bp至7bp或4bp至大约6bp变化。3’至第二茎是含有序列5’-CUCAUAUU-3’的第二环结构。突变分析显示优选的环2共有序列可以是5’-YUYNNRYU’-3’，其中Y是嘧啶，R是嘌呤，N是A、G、C、T或U。在来自S2-20的截短的CLEC-2配体中、S2-20T10(SEQ ID NO:22)和RB587(SEQ ID NO:24)是这些配体的例子。

共有结构的确定促进配体的基因改造，从而鉴定可以提高或降低配体的结构和功能的一个或多个核苷酸。其允许有效地鉴定和测试对茎环结构特异的核苷酸增加、缺失和取代。

对共有二级结构的了解还允许避免可能对配体的结构和功能有害的修饰。例如，某些修饰在共有二级结构内可能是保守的，例如茎或环区的2’-氟。在这些事例中，从配体茎或环中除去2’-氟可能导致活性丧失。

在一个实施方案中，配体是使用SELEX方法筛选的核酸分子，并且包括其截短体和基本上同源的序列。如本文所使用的，在同源区域的背景下，“基本上同源的”序列是通过特定分子内沃森-克里克碱基配对形成相同二级结构的序列。在另一个实施方案中，使用SELEX方法筛选的配体选自这样的核酸序列，其包含与SEQ ID NOs:5-59至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致，或SEQ ID NOs:5-59一致的核酸序列，或包含与选自SEQ ID NOs:9-14、16-22、24、33、37、38、42、44-48和55-57的序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或与选自SEQ ID NOs:9-14、16-22、24、33、37、38、42、44-48和55-57的序列一致的核酸序列。在另一个实施方案中，如在体外生理条件下测定的，配体的解离常数小于大约10nM或小于大约5nM。

本文所述的CLEC-2配体可以是核酸分子，其包含的序列通过在SEQID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9内的一个或多个核苷酸位置具有缺失而与S2-20序列不同。可以通过引入SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9内一个或多个缺失的组合来产生CLEC-2配体。

本文涉及的CLEC-2配体可以包含通过从SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的5’和/或3’末端截短(缺失)一个或多个核苷酸产生的序列。例如，CLEC-2配体可以是通过缺失SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的前5’)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸产生的序列。在可选择的实施方案中，从SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中缺失最后(3’)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸。在另一个实施方案中，从序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中缺失位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80处的核苷酸，或以上的任意组合。在另一个实施方案中，缺失的序列组合由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸组成。

在优选的实施方案中，CLEC-2配体包含与SEQ ID NO:24至少80%、85%、90%或95%一致的序列。在该实施方案中，CLEC-2配体长度范围为大约20bp至40bp、25bp至30bp或大约27bp至33bp。该CLEC-2配体具有包含第一茎、第一环、第二茎和第二环的二级结构，所述第一茎包含5’-GNC-3’(其中N是G，A，T，C或U)，所述第二环包含5’-CUCAUAUU-3’或5’-YUYNNRYU’-3’(其中Y是嘧啶、R是嘌呤，且N是A、G、C、T或U)的第二环。在核酸配体SEQ ID NO:24的背景下，同源序列可以在允许允许沃森-克里克结合形成相同的二级结构的任意区域中找到，与指定区域内额序列一致性无关。

本文所述的CLEC-2配体具有在体外和/或体内抑制CLEC-2分子活性的功能。换句话说，CLEC-2配体的添加可以在设计测定CLEC-2活性的指定试验中降低CLEC-2活性。例如，CLEC-2配体抑制CLEC-2功能。CLEC-2配体可以通过在体外和/或在体内抑制CLEC-2依赖的血小板功能而发挥功能。

CLEC-2核酸配体的调节剂

在一些实施方案中，核酸配体对CLEC-2是可逆的。在一方面，本文提供了通过给予宿主CLEC-2配体的调节剂来调节配体对CLEC-2的活性的方法，所述宿主已经给予了核酸配体。

调节剂可以包括能够结合核酸配体，并且以理想的方式修饰配体及其靶分子(例如，通过修饰核酸配体的结构)间的相互作用，或降解、代谢、切割或以其它方式化学改变核酸配体以修饰其生物学效应的任何药学可接受的试剂。

根据标准互补的沃森-克里克碱基配对规则设计本文所述的CLEC-2配体的核酸调节剂(见实施例6)。合成不同长度的调节性寡核苷酸，其序列与已证明抑制CLEC-2功能的CLEC-2配体互补。然后测定每一合成的调节寡核苷酸结合CLEC-2配体的能力，例如，通过凝胶阻滞实验。然后重要的是测定结合CLEC-2配体的调节剂是否还能够逆转CLEC-2配体的活性调节剂。如以下和实施例部分中更详细描述的，可以使用评估CLEC-2配体的抗血小板活性的试验测定给定调节剂的可逆活性。还在已被证实能够结合CLEC-2配体的调节剂的存在下进行试验，进行该试验以鉴定CLEC-2抑制CLEC-2介导的血小板聚集的配体。可以在添加CLEC-2配体之前、同时或之后向试验混合物中添加调节剂。可以利用以下证实调节剂的可逆活性：例如在全血、富含血小板的血浆或在洗涤血小板制剂中的洗涤血小板聚集研究、蛇毒蛋白或平足蛋白诱导的血小板聚集试验，用蛇毒蛋白或平足蛋白进行的流式细胞术测定以评价在存在CLEC-2配体的情况下的P-选择素的表达，以及基于在体外流动的血小板粘附试验。

在优选的实施方案中，CLEC-2核酸配体的调节剂是与CLEC-2核酸配体序列至少部分互补的核酸序列。如图8所示(并参见表4)，设计CLEC-2配体RB587的调节剂以便与RB587不同的区域杂交。如在血小板聚集试验中通过对CLEC-2配体抑制活性的中和所测定的以及通过凝胶阻滞实验所测定的，与RB587一级序列的3’16个碱基互补的RB581有效地降低RB587与CLEC-2的结合。因而，在一些实施方案中，本文提供了调节剂，其与CLEC-2配体的相同区域互补或能够与CLEC-2配体的相同区域杂交。因此，本文所述的调节剂能够与CLEC-2核酸配体包含环2、茎2和茎1，或以上的一部分的区域杂交。作为一个具体的例子，本文所述的调节剂能够与CLEC-2配体RB587(SEQ ID NO:24)对应于大约14-31或14-26或16-31或18-31或21-31或16-26或16-29位置处的碱基的区域杂交。而且，调节剂与CLEC-2配体的特定的相互作用导致CLEC-2配体与CLEC-2多肽的结合降低。而且，调节剂可以通过CLEC-2配体抑制或逆转CLEC-2靶蛋白功能的抑制。

在优选的实施方案中，CLEC-2核酸配体的调节剂是与CLEC-2核酸配体序列至少部分互补的核酸序列。如图8所示(并参见表4)，设计CLEC-2配体RB587的调节剂以便与RB587不同的区域杂交。如在血小板聚集试验中通过对CLEC-2配体抑制活性的中和所测定的以及通过凝胶阻滞实验所测定的，与RB587一级序列的内部16个碱基互补的RB582有效地降低RB587与CLEC-2的结合。因而，在一些实施方案中，本文提供了调节剂，其与CLEC-2配体的相同区域互补或能够与CLEC-2配体的相同区域杂交。因此，本文所述的调节剂能够与CLEC-2核酸配体包含环2、茎2和茎1的一部分，或以上的一部分的区域杂交。作为一个具体的例子，本文所述的调节剂能够与CLEC-2配体RB587(SEQ ID NO:24)对应于大约14-31或14-29或14-27或16-29或16-27或19-29或21-29位置处的碱基的区域杂交。而且，调节剂与CLEC-2配体的特定的相互作用导致CLEC-2配体与CLEC-2多肽的结合降低。而且，调节剂可以通过CLEC-2配体抑制或逆转CLEC-2靶蛋白功能的抑制。

凝胶阻滞在优选的实施方案中，CLEC-2核酸配体的调节剂是与CLEC-2核酸配体序列至少部分互补的核酸序列。如图8所示(并参见表4)，设计CLEC-2配体RB587的调节剂以便与RB587不同的区域杂交。如在血小板聚集试验中通过对CLEC-2配体抑制活性的中和所测定的以及通过凝胶阻滞实验所测定的，与RB587一级序列的内部15个碱基互补的RB583有效地降低RB587与CLEC-2的结合。因而，在一些实施方案中，本文提供了调节剂，其与CLEC-2配体的相同区域互补或能够与CLEC-2配体的相同区域杂交。因此，本文所述的调节剂能够与CLEC-2核酸配体包含环1、茎2和环2，或以上的一部分的区域杂交。作为一个具体的例子，本文所述的调节剂能够与CLEC-2配体RB587(SEQ ID NO:24)对应于大约7-21或9-21或9-17或7-19或7-17或7-14位置处的碱基的区域杂交。而且，调节剂与CLEC-2配体的特定的相互作用导致CLEC-2配体与CLEC-2多肽的结合降低。而且，调节剂可以通过CLEC-2配体抑制或逆转CLEC-2靶蛋白功能的抑制。

凝胶阻滞在优选的实施方案中，CLEC-2核酸配体的调节剂是与CLEC-2核酸配体序列至少部分互补的核酸序列。如图8所示(并参见表4)，设计CLEC-2配体RB587的调节剂以便与RB587不同的区域杂交。如在血小板聚集试验中通过对CLEC-2配体抑制活性的中和所测定的以及通过凝胶阻滞实验所测定的，与RB587一级序列的内部16个碱基互补的RB584有效地降低RB587与CLEC-2的结合。因而，在一些实施方案中，本文提供了调节剂，其与CLEC-2配体的相同区域互补或能够与CLEC-2配体的相同区域杂交。因此，本文所述的调节剂能够与CLEC-2核酸配体包含茎1的一部分、环1、茎2和环2的一部分，或以上的一部分的区域杂交。作为一个具体的例子，本文所述的调节剂能够与CLEC-2配体RB587(SEQ ID NO:24)对应于大约1-21或1-19或1-14或4-14或4-19或4-21或6-21或6-14位置处的碱基的区域杂交。而且，调节剂与CLEC-2配体的特定的相互作用导致CLEC-2配体与CLEC-2多肽的结合降低。而且，调节剂可以通过CLEC-2配体抑制或逆转CLEC-2靶蛋白功能的抑制。

凝胶阻滞在优选的实施方案中，CLEC-2核酸配体的调节剂是与CLEC-2核酸配体序列至少部分互补的核酸序列。如图8所示(并参见表4)，设计CLEC-2配体RB587的调节剂以便与RB587不同的区域杂交。如在血小板聚集试验中通过对CLEC-2配体抑制活性的中和所测定的以及通过凝胶阻滞实验所测定的，与RB587一级序列的5’18个碱基互补的RB585有效地降低RB587与CLEC-2的结合。因而，在一些实施方案中，本文提供了调节剂，其与CLEC-2配体的相同区域互补或能够与CLEC-2配体的相同区域杂交。因此，本文所述的调节剂能够与CLEC-2核酸配体包含茎1、环1、茎2、环2的一部分，或以上的一部分的区域杂交。作为一个具体的例子，本文所述的调节剂能够与CLEC-2配体RB587(SEQ ID NO:24)对应于大约1-21或1-18或1-16或1-14或4-21或4-18或4-14或6-14或6-18或6-21位置处的碱基的区域杂交。而且，调节剂与CLEC-2配体的特定的相互作用导致CLEC-2配体与CLEC-2多肽的结合降低。而且，调节剂可以通过CLEC-2配体抑制或逆转CLEC-2靶蛋白功能的抑制。

凝胶阻滞在优选的实施方案中，CLEC-2核酸配体的调节剂是与CLEC-2核酸配体序列至少部分互补的核酸序列。如图8所示(并参见表4)，设计CLEC-2配体RB587的调节剂以便与RB587不同的区域杂交。如在血小板聚集试验中通过对CLEC-2配体抑制活性的中和所测定的以及通过凝胶阻滞实验所测定的，与RB587一级序列的5’13个碱基互补的RB586有效地降低RB587与CLEC-2的结合。因而，在一些实施方案中，本文提供了调节剂，其与CLEC-2配体的相同区域互补或能够与CLEC-2配体的相同区域杂交。因此，本文所述的调节剂能够与CLEC-2核酸配体包含茎1、环1和茎2，或以上的一部分的区域杂交。作为一个具体的例子，本文所述的调节剂能够与CLEC-2配体RB587(SEQ ID NO:24)对应于大约1-13或1-10或6-13位置处的碱基的区域杂交。而且，调节剂与CLEC-2配体的特定的相互作用导致CLEC-2配体与CLEC-2多肽的结合降低。而且，调节剂可以通过CLEC-2配体抑制或逆转CLEC-2靶蛋白功能的抑制。

凝胶阻滞调节剂可选择的例子包括：与核酸配体序列(包括核酶或脱氧核酶)的至少一部分互补的寡核苷酸或其类似物。其它例子包括肽核酸(PNA)、吗啉基核酸(MNA)或锁核酸(LNA)；核酸结合的蛋白或肽；寡糖；小分子；或核酸结合的聚合物、脂质、纳米颗粒或基于微球体的调节剂。

可以设计调节剂，以便以高程度的特异性和理想的亲和力程度结合特定的核酸配体。还可以设计调节剂，以便当结合时，配体的结构被修饰成更强或更弱的活性形式。例如，可以设计调节剂，使得当结合所靶向的核酸配体时，改变该配体的二级和/或三级结构，有此配体能够不再结合其靶分子或以更低的亲和力结合其靶分子。可选地，可以设计调节剂，以便当结合时，改变配体的三维结构，使得配体对其靶分子的亲和力提高。也就是说，可以设计调节剂，以便当结合时，修饰结构基序，使得配体的亲和力提高。在另一个实施方案中，设计配体/调节剂对，使得调节剂与核酸配体分子(其不能结合目的靶标)的结合能够导致配体内结构基序的产生，所述结构基序有此允许配体结合其靶分子。

还可以设计调节剂，使之以足以形成复合物的亲和力非特异性地结合特定的核酸配体或核酸配体组。这些调节剂通常可通过电荷-电荷相互作用与核酸结合。这些调节剂还可以同时结合多于一种核酸配体。可以设计调节剂，以便当结合一种或多种核酸配体时，核酸配体的结构没有从其活性形式显著改变，而是，调节剂掩饰或空间上阻止了核酸配体与其靶分子的结合。

核苷酸调节剂可以是允许有效地结合配体分子的任意长度。例如，寡核苷酸调节剂长度范围可以为大约10个核苷酸(nt)至大约30nt，大约10nt至大约20nt或大约15nt。核苷酸调节剂长度可以是8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt或30nt。本领域的普通技术人员还可以设想长度大于30nt的核苷酸调节剂。

本文所述的核酸配体具有活性三级结构，该结构可以通过形成适当稳定的二级结构受到影响。因此，尽管互补的寡核苷酸调节剂和核酸配体间双螺旋形成的机制与两个短的线性寡核糖核苷酸间双螺旋的形成类似，但是设计这些相互作用和这些产物形成的动力学的规则可以受到分子内配体结构的影响。

核酸配体和寡核苷酸调节剂之间初始碱基对形成的成核速率在最终形成稳定的双螺旋中发挥了重要作用，并且通过将寡核苷酸调节剂靶向核酸配体中存在的单链环和/或单链3’或5’末端大幅提高该步骤的速率。为了发生分子间双螺旋的最优形成，理想的是相对于所靶向的核酸配体内已有的分子内双螺旋的形成，自由能有利于形成分子间双螺旋。

本文所述的调节剂通常是包含与所靶向的核酸配体序列的至少一部分互补的序列的寡核苷酸。例如，调节寡核苷酸可以包含与所靶向的配体的大约6nt(核苷酸)至25nt、8nt至20nt或10nt至15nt互补的序列。考虑所靶向的配体和寻求的效果，使用本文所述的和本领域技术人员熟知的技术，可以容易地优化调节寡核苷酸的长度。可以使用含D或L立体化学，或其混合物的核苷酸制备寡核苷酸。天然存在的核苷是D构型。

尽管寡核苷酸调节剂包含与核酸配体的至少一部分互补的序列，但是不需要绝对互补。“与核酸配体的至少一部分互补的”序列在本文中称为具有足以能够与核酸配体杂交的互补性的序列。杂交的能力可以依赖于互补的程度和核酸的长度。通常地，杂交的寡核苷酸越长，其可以含有与靶配体的碱基错配越多，并且仍能够形成稳定的双螺旋(或可以是三螺旋)。本领域技术人员通过使用测定杂交复合物的熔点的标准程序能够确定错配的耐受程度。寡核苷酸可以是单链DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰版本。

调节剂可以在核酸骨架和单个核酸结构中包含修饰。在某些实施方案中，调节剂是与配体中的至少一个环区域互补的核酸。在其它的实施方案中，调节剂是与配体中的至少一个茎区域互补的核酸。在其它的实施方案中，调节剂是与至少一个环区域和一个邻近的茎区域互补的核酸。在一些实施方案中，调节剂是具有一段这样的序列的寡核苷酸，该序列在生理条件下能与配体的一部分杂交。依据期望的调节剂功能，可以设计调节剂以破坏或稳定核酸配体的二级和/或三级结构。

在一些实施方案中，调节剂被设计成能结合配体的“自杀位置”，从而破坏配体的序列。自杀位置是配体的对酶敏感的单链部分。在一个示例性的实施方案中，自杀位置在调节剂与配体结合后变成单链且不稳定，并能够通过循环中的酶如血液或肝脏的核酸内切酶提高配体的切割。在某些实施方案中，在调节剂结合于配体之后，配体可不再与其靶标相互作用。

在一些实施方案中，调节剂序列包含至少一个修饰的核苷酸。例如，2’-O-甲基和2’-氟修饰，其可以包含2’-O-甲基胞嘧啶、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基腺嘌呤、2’-O-甲基鸟苷、2’氟胞苷或2’氟尿苷。

可以使用不同的策略测定寡核苷酸调节剂所结合的核酸配体内的最适位点。可以使用实验策略，其中互补的寡核苷酸在核酸配体周围“步行”。按照该方法，可以使用长度大约为15核苷酸的寡核苷酸(例如，2’-O-甲基或2’-氟寡核苷酸)，所述寡核苷酸在配体上错开大约5个核苷酸(例如，与配体的1-15、6-20、11-25等互补的寡核苷酸)。实验策略可以是特别有效的，因为核酸配体三级结构对杂交效率的影响是难以预测的。

测定如在实施例6和8中所述的那些测定，可以用于评估不同寡核苷酸杂交特定核酸配体的能力，特别强调需要摩尔过量的寡核苷酸以实现核酸配体的完全结合。还可以通过利用例如BIACORE测定进行标准的动力学研究，，来测定不同寡核苷酸调节剂增加核酸配体从其靶分子解离或配体与其靶分子结合的的速率的能力。可以选择寡核苷酸调节剂使得需要5-50倍摩尔过量的或更少的寡核苷酸，以便以以期望的方式来修饰配体及其靶分子间的相互作用。

可选地，可以修饰所靶向的核酸配体使之包含单链尾(3’或5’)，以便促进与寡核苷酸调节剂的结合。合适的尾可以包含1至20个核苷酸、1至10个核苷酸、1至5个核苷酸或3至5个核苷酸。还可以修饰尾(例如2’-O-甲基和2’-氟修饰，其可以包括2’-O-甲基胞嘧啶、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基腺嘌呤、2’-O-甲基鸟苷、2’氟胞苷或2’氟尿苷)。可以在结合和生物测定(例如，如在以下的实施例中所述的)中测试加尾配体，来验证添加单链尾不会破坏核酸配体的活性结构。可以设计一系列能够与尾序列形成例如1、2、3、4或5个碱基对的寡核苷酸(例如，2’-O-甲基寡核苷酸)，并检测它们与单独的加尾配体结合的能力以及其增加配体从其靶分子解离或配体与其靶分子结合的速率的能力。可以使用混乱序列对照以验证效应是由于双螺旋的形成，而不是非特异性效应。

在另一个实施方案中，调节剂是核酶或脱氧核酶。酶性核酸首先通过结合于靶RNA或DNA起作用。这些结合通过酶性核酸的靶标结合部分发生，所述靶标结合部分十分接近分子的起到切割靶RNA作用的酶促部分。因而，酶性核酸首先识别靶RNA或DNA，然后通过互补碱基配对结合靶RNA或DNA，一旦结合到正确的位点，发挥酶促切割靶RNA的作用，从而允许RNA配体失活。有至少5类核酶，每一类都显示了不同类型的特异性。例如，I组内含子的大小为大约300至＞1000个核苷酸，并且需要靶序列在切割位点的5’正好为U，并在切割位点的5’侧结合4-6个核苷酸。另一类是RNaseP RNA(M1RNA)，其大小为大约290至400个核苷酸。第三类是锤头状核酶(Hammerhead Ribozyme)，其大小为大约30至40个核苷酸。它们需要在切割位点的5’正好为靶序列UH(其中H不是G)，并在切割位点的两侧结合数目可变的核苷酸。第四类是发夹核酶，其大小为大约50个核苷酸。它们需要靶序列GUC正好在切割位点的3’，并结合切割位点5’侧的4个核苷酸和切割位点3’侧数目可变的核苷酸。第五类是丁型肝炎病毒(HDV)核酶，其大小为大约60个核苷酸。脱氧核酶是单链的，并切割RNA和DNA二者。已经提出了脱氧核酶的一般模型，被称为“10-23”模型。“10-23”模型的脱氧核酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，侧翼的每一个为7至9个脱氧核糖核苷酸的两个底物识别结构域。

在另一个实施方案中，调节剂本身是核酸配体。在该实施方案中，产生能结合期望的治疗靶标的第一配体。在第二步，能结合第一配体的第二配体使用本文所述的SELEX方法或另一种方法产生，并介导治疗配体和靶标间的相互作用。在一个实施方案中，第二配体使第一配体的效应失活。

在另一个示例性的实施方案中，调节剂是基于PNA、MNA、LNA或PCO的调节剂。寡核苷酸调节剂的核苷碱基可以通过核苷碱基间连接来连接，例如，肽连接(如肽核酸(PNAs)的例子；Nielsen et al.(1991)Science254,1497和美国专利第5,539,082号)以及吗啉基连接(Qin et al.,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.10,11(2000)、Summerton,AntisenseNucleic Acid Drug Dev.7,187(1997)、Summerton et al.,Antisense NucleicAcid Drug Dev.7,63(1997)、Taylor et al.,J Biol Chem.271,17445(1996)、Partridge et al.,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.6,169(1996))，或通过任何其它天然的或修饰的连接。寡核苷碱基还可以是锁核酸(LNAs)。Nielsenet al.,J Biomol Struct Dyn17,175(1999)、Petersen et al.,J Mol Recognit13,44(2000)、Nielsen et al.,Bioconjug Chem11,228(2000)。

PNA是与寡核苷酸类似但在组成上不同的化合物。在PNA中，寡核苷酸的脱氧核糖骨架用肽骨架替代。肽骨架的每一个亚单元与天然存在的或非天然存在的核苷碱基相连。PNA通常具有由N-(2-氨乙基)甘氨酸单元组成的非手性聚酰胺骨架。通过靶向互补核酸的亚甲基羰基连接剂(1-3)，嘌呤或嘧啶碱基被连接至每一单元。PNA按照沃森-克里克碱基配对规则以平行或反平行方向结合互补的RNA或DNA。与天然的同聚双螺旋相比，PNA寡聚物不带电的性质提高了杂交PNA/DNA(RNA)双螺旋的稳定性。

这样命名吗啉基核酸，是因为它们从吗啉基亚单元组装，每一个亚单元都包含与6元吗啉环连接的四个遗传碱基中的一个(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)。通过非离子的磷二酰胺亚单元间连接产生吗啉基寡核苷酸，将这些四种亚单元类型的亚单元以特定的顺序的连接起来。

LNA是一类DNA类似物，其具有使其成为调节剂的主要候选物的一些特性。LNA单体是与RNA单体结构类似的双环化合物。LNA与DNA和RNA分享大多数化学特性，LNA是水溶性的，能够通过凝胶电泳、乙醇沉淀等分离(Tetrahedron,54,3607-3630(1998))。然而，向DNA或RNA寡核苷酸引入LNA单体导致与互补DNA或RNA的双螺旋具有高热稳定性，同时遵从沃森-克里克碱基配对规则。

还可以使用假环寡核苷碱基(PCO)作为调节剂(见美国专利第6,383,752号)。PCO包含两个寡核苷酸片段，其通过它们的3’-3’或5’-5’末端连接。PCO的一个片段(“功能片段”)具有一些功能(例如，与靶RNA互补)。另一个片段(“保护片段”)与功能片段的3’-或5’-末端互补(依赖于与功能片段连接的末端)。由于功能片段和保护片段间的互补性，PCO在无靶核酸(例如RNA)的情况下形成分子内假环结构。因为存在3’-3’或5’-5’链接和形成分子内假环结构，PCO比传统的寡核苷酸更稳定。在小鼠中的药物代谢动力学、组织分布和稳定性研究表明PCO比那些通常的PS-寡核苷酸具有更高的体内稳定性，且药物代谢动力学、组织分布概况与PS-寡核苷酸类似，但从选择的组织中快速清除。当荧光基团和猝灭分子与本文公开的PCO适当连接时，在分子是线性构型时分子将发荧光，但在环形构型时荧光被淬灭。该特性可以用于筛选PCO作为潜在的调节剂。

在另一个示例性的实施方案中，调节剂是基于肽的调节剂。核酸配体的基于肽的调节剂代表了寡核苷酸或其类似物的可选择的分子类型的调节剂。如果由于缺乏足够的单链区域来促进靶标和寡核苷酸调节剂之间的成核，而不能分离靶核酸配体的足够活性的寡核苷酸调节剂，则该类调节剂是特别有用的。此外，与寡核苷酸调节剂相比，肽调节剂提供不同的生物利用度和药物代谢动力学。在一个示例性的实施方案中，调节剂是鱼精蛋白(Oney et al.,2009,Nat.Med.15:1224-1228)。鱼精蛋白在水中是可溶的，不会通过加热凝固，并且包含精氨酸、丙氨酸和丝氨酸(大多数还包含脯氨酸和缬氨酸，许多包含甘氨酸和异亮氨酸)。调节剂还包括鱼精蛋白的变体(见例如，Wakefield et al,J.Surg.Res.63:280(196))和修饰形式的鱼精蛋白，其包括如美国公开第20040121443号中所述的鱼精蛋白。其它调节剂包含鱼精蛋白片段，例如在美国专利第6,624,141号和美国公公开第20050101532号中所述的鱼精蛋白片段。通常地，调节剂还包括调节肝素活性的肽，其它的糖胺聚糖或蛋白聚糖(见例如，美国专利第5,919,761号)。在一个示例性的实施方案中，调节剂是包含阳离子-NH基团的肽，其允许稳定电荷-电荷相互作用，例如多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸。

可用几个策略开分离能够结合靶核酸配体从而调节靶核酸配体活性的肽。例如，已经描述了固定于珠子的编码肽的组合文库，已证明其包含能够结合病毒RNA序列，并破坏病毒RNA和病毒调节蛋白间的相互作用的肽，所述病毒调节蛋白特异性地结合所述RNA(Hwang et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA,1999,96:12997)。使用这些文库，通过以下可以分离核酸配体的调节剂：将标记物添加至靶核酸配体，并在这样的条件下共同孵育标记的靶标和珠子固定的肽文库，该条件支持文库的一些成员与核酸的结合。核酸配体与指定珠子上特定肽的结合导致珠子被核酸配体上的标记物“显色”，因此通过简单分离珠子就能够鉴定能够结合靶标的肽。可以使用所述的用于鉴定核酸配体调节剂的任意数量的结合试验，来确认和定量通过这些筛选方法分离的肽和靶核酸配体间的直接相互作用。通过适当的生物试验，能够确认所述肽调节靶核酸配体活性的能力。

在一些实施方案中，调节剂是蛋白质。例如，在某些实施方案中，核酸配体连接于生物素分子。在这些例子中，给予链霉亲和素或抗生物素蛋白来结合并逆转配体的效应(见Savi et.Al.J Thrombosis andHaemostasis,6:1697-1706)。抗生物素蛋白是鸟类、爬行类动物和两栖动物的输卵管中产生四聚体蛋白，其贮存于它们的卵白中。链霉亲和素是从细菌阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)中纯化的四聚体蛋白。四聚体蛋白包含四个相同的亚基(同源四聚体)，每一个亚基都能够以高度的亲和力和特异性结合生物素(维生素B7、维生素H)。CLEC-2核酸配体的蛋白调节剂可以是CLEC-2核酸配体所连接的CLEC-2结构域的可溶性部分。例如，CLEC-2多肽的ECD或其片段可以与CLEC-2核酸配体竞争结合细胞连接的或天然的CLEC-2，从而逆转CLEC-2核酸配体与天然CLEC-2分子的结合。

在另一个实施方案中，调节剂是基于寡糖的调节剂。寡糖能够与核酸相互作用。例如，氨基糖甙类抗生素是链霉菌的产物，与多种RNA分子阵列特异地相互作用，例如多种核酶、核糖体的RNA组分和HIV-1的TAR和RRE序列。因而，寡糖能够结合核酸并且可以用于调节核酸配体的活性。

在另一个实施方案中，调节剂是基于小分子的调节剂。还可以使用小分子作为治疗的调节剂，所述小分子能够插入配体和靶标之间或以其它方式破坏或修饰配体和靶标间的结合。可以通过以下鉴定这样的小分子：在存在或不存在小分子的情况下，在测量配体和靶标间结合变化的试验中筛选候选者，或在存在或不存在小分子的情况下，通过使用测量配体对靶标的生物效应差异的体内或体外试验。一旦鉴定了表现出期望效应的小分子，则可以使用诸如组合方法的技术，来优化化学结构，用于期望的调节效应。

在另一示例性的实施方案中，调节剂是核酸结合的聚合物、脂质、纳米颗粒或微球体。在其它非限制性的例子中，调节剂可以选自1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EDOPC)、二月桂酰乙基磷酸卵磷脂(EDLPC)、EDLPC/EDOPC、吡啶盐表面活性剂、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、(±)-N-(3-氨丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)-1-溴化丙铵(GAP-DLRIE)加中性的糖脂二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(GAP-DLRIE/DOPE)、(±)-N,N-二甲基-N-[2-(精胺甲酰胺基)乙基]-2,3-双(二油烯基氧基-l-丙铵盐酸盐(propaniminium petahydrochloride)(DOSPA)、二月桂酰乙基磷酸卵磷脂(EDLPC)、乙基二肉豆蔻酰磷酸卵磷脂(EDMPC)、(±)-N,N,N-三甲基-2,3-双(z-十八-9烯-酰氧基)-1-氯化丙铵(DOTAP)、(±)-N-2-(2-羟基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(四癸氧基)-l-溴化丙铵(DMRIE)、(±)-N,N,N-三甲基-2,3-双(z-十八-9-烯氧基)-l-氯化丙铵(DOTMA)、5-羧基精胺酰甘氨酸-二(十八烷基)-酰胺(DOGS)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺酰胺(DPPES)、1,3二油氧基-2-(6-羧基精胺基)-丙基-酰胺(DOSPER)、四甲基四棕榈酰精胺(TMTPS)、(四甲基四油基精胺(TMTOS)、四甲基四月桂基精胺(TMTLS)、四甲基四肉豆蔻基精胺(TMTMS)、四甲基二油基精胺(TMDOS)、二植烷酰磷脂酰-乙醇胺(DPhPE)和(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧)-1-溴化丙铵(GAP-DLRIE)。

乙醇、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、Newkome树状聚合物、聚苯、二甲基双十八烷基溴化铵(DAB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、白蛋白、酸处理的明胶、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸、多聚精氨酸、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖和聚(N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)和聚丙胺(POPAM)。

在一个实施方案中，调节剂选自壳聚糖和壳聚糖衍生物。壳聚糖衍生物包括水溶性壳聚糖纳米颗粒(例如在美国专利第6,475,995号；美国专利申请第2006/0013885号；Limpeanchob et al,(2006)Efficacy and Toxicityof Amphotericin B-Chitosan Nanoparticles;Nareusan University Journal14(2):27-34中描述的)。考虑壳聚糖聚合物的聚阳离子性质(本质上是由重复的葡糖胺单体组成的非常大的多胺聚合物)，壳聚糖在注入宿主之后可以用于将配体聚集和/或封装入体内的聚电解质复合物。在某种程度上，这是基于壳聚糖上所见的伯胺和配体的磷酸二酯骨架的相互作用。

在其它的实施方案中，调节剂选自1,5-二甲基-1,5-二氮杂十一亚甲基聚甲溴化物、聚氧乙烯/聚氧化丙烯嵌段共聚物、聚-L-赖氨酸、聚酰胺胺(PAMAM)、包含β-环糊精的聚阳离子(CDP)、包含β-环糊精聚阳离子(包含咪唑的变体)(CDP-Im)、聚氨基磷酸酯聚合物(8kDa，30kDa)(PPA-DPA8k、PPA-DPA30k)、聚凝胺、精胺、PEG-嵌段-PLL-树状聚合物、聚乙烯亚胺(PEI)、甘露糖-PEI、转铁蛋白-PEI、线性-PEI(lPEI)、明胶、异丁烯酸盐/异丁烯酰胺、聚(β-氨基酯)、聚电解质复合物(PEC)、聚(乙烯胺)(PVA)、胶原蛋白、聚丙烯亚胺(PPI)、聚丙烯胺、聚乙烯吡啶、氨基乙缩醛化的聚(乙烯基

在某些实施方案中，可以大幅度地修饰壳聚糖聚合物上的伯胺以改变水溶性和电荷状态。壳聚糖衍生物包括三甲基壳聚糖盐酸盐(TMC)，其可以以不同程度的季铵化作用合成；单羧甲基化壳聚糖(MCC)，其是多聚两性聚合物；戊二醛交联的衍生物(CSGA)；硫醇盐壳聚糖(Lee,et al.(2007)Pharm.Res.24:157-67)；乙二醇壳聚糖(GC)，一种与乙二醇偶联的壳聚糖衍生物(Lee,et al.(2007)Int J Pharm.)；N-(2-羧苄基)壳聚糖(CBCS)(Lin,et al.(2007)Carbohydr Res.342(1):87-95)；β-环糊精-壳聚糖聚合物(Venter,et al.(2006)Int J Pharm.313(l-2):36-42)；O-羧甲基壳聚糖；Ν,Ο-羧甲基壳聚糖；或通过向其骨架上引入黄酸盐基团而化学修饰的壳聚糖。

在一个实施方案中，产生空的壳聚糖纳米颗粒，并用作调节剂。可以使用分子量范围为10,000Da至＞1,000,000Da的壳聚糖或壳聚糖衍生物。在某些实施方案中，壳聚糖是500,000Da或更小。在某些实施方案中，壳聚糖是100,000Da或更小。在一些实施方案中，化合物为10,000至100,000Da、10,000至90,000Da、10,000至80,000Da、20,000至70,000Da、30,000至70,000Da、大约30,000、大约40,000、大约50,000或大约60,000Da。

在一些实施方案中，使用包含不同程度的去乙酰化伯胺的壳聚糖聚合物。在这些实施方案中，不同程度的去乙酰作用改变了聚合物的电荷状态以及因而的聚合物的结合特性。在壳聚糖纳米颗粒与宿主中的配体接触之后，配体可以结合纳米颗粒，并被纳米颗粒表面捕获，或进入纳米颗粒，并通过离子相互作用封装。

在另一个实施方案中，调节剂是多聚磷酸聚合物微球体。在某些实施方案中，调节剂是这些微球体的衍生物，例如聚(L-丙交酯-co-乙基-亚磷酸盐)或P(LAEG-EOP)等，如美国专利第6,548,302号中所述的。可以产生这样的聚合物，使之包含多种官能团作为聚合物骨架的一部分。在一个例子中，聚合物可以包含在生理pH下具有正电荷的季胺，使得当接触时，它们能够复合或封装一种或多种核酸。在某些实施方案中，聚合物不包含正电荷。

在某些实施方案中，调节剂是阳离子分子。在某些实施方案中，配体形成鸟嘌呤四聚体(G-四聚体或G-四螺旋)结构。这些结构被阳离子分子结合。在某些实施方案中，分子是金属螯合分子。在一些实施方案中，调节剂是卟啉。在一些实施方案中，化合物是TMPyP4。见Joachimi,et.al.JACS2007,129,3036-3037和Toro,et.al.Analytical Biochemistry2008,Aug1,379(I)8-15。

通常可以通过结合试验、分子建模或测量生物功能改变的体内或体外试验鉴定调节剂。在一个实施方案中，通过凝胶阻滞试验测定调节剂与核酸的结合。在另一个实施方案中，通过BIACORE试验测定调节剂与核酸配体的结合。

可以使用标准的结合试验来鉴定和选择调节剂。非限制性例子是凝胶阻滞试验和BIACORE试验。也就是说，可以在测试条件或典型的生理条件下，将测试调节剂与所靶向的核酸配体接触，并作出测试调节剂实际上是否结合配体的决定。然后可以在合适的生物试验(依据配体及其靶分子而不同，例如凝结试验)中分析发现能够结合核酸配体的测试调节剂，来确定测试调节剂是否能够影响其靶分子上的配体所引起的生物效应。

凝胶阻滞试验是众所周知的用于评估结合能力的技术。例如，首先将CLEC-2的核酸配体与CLEC-2蛋白或其片段或包含CLEC-2蛋白或其片段的混合物孵育，然后通过电泳在凝胶上分离。当配体结合蛋白时，复合物的尺寸将更大，并且其迁移因而相对于游离配体的迁移将延迟，所述游离配体可以在不存在CLEC-2蛋白的情况下施加到凝胶的对照泳道中。例如，可以通过放射性或非放射性部分标记配体，从而允许在凝胶中检测配体CLEC-2复合物。当使用凝胶阻滞试验筛选具有CLEC-2结合活性的配体时，则可以从凝胶中提取复合物，并分析分离的配体来鉴定具有期望的CLEC-2结合活性的配体。

还可以使用凝胶阻滞试验筛选核酸配体与CLEC-2结合的调节剂，因为相对于游离配体的迁移率，调节剂与核酸配体的结合调节剂延迟核酸配体的迁移率(见，例如，Rusconi et al.,2002,Nature,41:90-94.)。

此外，可以向这样的试验形式中添加调节剂，并筛选它们阻止CLEC-2核酸配体与CLEC-2结合的能力。例如，可以在存在量渐增的调节剂的情况下，孵育CLEC-2-配体复合物。如通过凝胶阻滞试验所检测的，具有理想活性的调节剂将特异性地降低CLEC-2-配体复合物的形成。

本领域技术人员熟知BIACORE技术是可靠且有价值的用于鉴定和分析大分子的相互作用(包括多肽-核酸相互作用)的工具。因此，可以使用该项技术来筛选或鉴定能够特异性结合CLEC-2蛋白或其片段的核酸适体或配体。BIACORE技术测量传感器芯片表面上的结合事件，使得连接于表面上的相互作用物能够决定分析的特异性。换句话说，CLEC-2蛋白或片段可以例如，通过组氨酸标签连接于传感器芯片表面。然后将结合的CLEC-2蛋白暴露于含有潜在配体分子的溶液。核酸配体与CLEC-2蛋白结合立即产生了表面等离子共振(SPR)信号的改变。信号与结合于表面的分子的质量直接成比例。

如凝胶阻滞试验所述的，可以使用BIACORE鉴定或分析CLEC-2配体的调节剂。再次，芯片结合的CLEC-2蛋白所暴露的反应混合物可以包含已知的具有渐增量调节剂的CLEC-2配体，以及通过CLEC-2和其配体间产生的相互作用的标准BIACORE分析确定的效应。

有许多其它试验能够测定寡核苷酸或其类似物、肽、多肽、寡糖或小分子是否能够以使得与靶标的相互作用被修饰的方式结合配体。例如，可以使用以下来评价试剂结合核酸配体的能力：电泳迁移率实验(EMSA)、滴定量热法、亲近闪烁实验、使用分析超速离心的沉降平衡实验(例如参见www.cores.utah.edu/interaction)、荧光偏振实验、荧光各向异性实验、荧光强度实验、荧光共振能量转移(FRET)实验、硝酸纤维素过滤器结合实验、ELISA、ELONA(见例如，美国专利第5,789,163号)、RIA或平衡透析实验。可以进行其中直接测定试剂和核酸配体间的相互作用的直接测定，或可以进行其中测定试剂从其靶标置换配体能力的竞争或置换测定(例如，见Green,Bell and Janjic,Biotechniques30(5),2001,p1094和美国专利第6,306,598号)。一旦鉴定了调节试剂的候选者，则可以在生物试验中确认候选者调节核酸配体对其靶标的活性的能力。可选地，如果鉴定试剂能够调节配体与其靶标的相互作用，则可以使用这些结合试验来证实试剂与配体的直接相互作用，并可以测量所述相互作用的亲和力。

在另一个实施方案中，可以使用质谱鉴定能够结合核酸配体的调节剂、调节剂和核酸配体间相互作用的位点以及试剂对配体的相对结合亲和力(见例如美国专利第6,329,146号)。还可以使用这些质谱方法筛选化学混合物或文库、特别是组合文库，筛选能够结合选择的靶配体并可以用作配体调节剂的个体化合物。此外，可以使用质谱技术针对例如化合物的组合文库同时筛选多个靶核酸配体。而且，可以使用质谱技术鉴定多种分子间的相互作用，尤其是“小”分子和靶配体上的分子相互作用位点。

在另一个实施方案中，评价调节剂修饰核酸配体和靶标间相互作用效力的体内或体外试验可用于鉴定能够结合核酸配体的调节剂，所述相互作用对于待治疗的疾病是特异的。有多种众所周知和可以使用的生物特性的标准试验。在本申请引用的专利中提供了生物试验的例子，其中描述了特定应用的某些核酸配体。

在一个实施方案中，调节剂具有以小于10.0微摩尔(μΜ)、1微摩尔(μΜ)，优选小于0.1μΜ、及更优选小于0.01μΜ的调节剂浓度大幅度地结合溶液中的核酸配体的能力。“大幅度地”是指在存在靶标的情况下通过调节所观察到的靶标生物活性降低至少50%，并且50%降低在本文中被称为IC₅₀值。

优化配体和调节剂

为了使配体适用于治疗，配体优选能廉价地合成、在宿主中安全使用并且在体内是稳定的。野生型RNA和DNA寡核苷酸在体内通常是不稳定的，因为它们易于被核酸酶降解。通过在2’位置并入修饰的基团能够大大增加对核酸酶降解的抗性。

可以将2’-氟或氨基并入寡核苷酸库，配体随后从该库中选择。在本公开中，在体外转录反应中使用2’-氟嘧啶产生用于配体选择的初始寡核苷酸库(见实施例1)。

在对配体(通过例如，SELEX)和调节剂(例如，基于序列互补性设计)进行初始鉴定之后，可以通过多种方法对配体和调节剂进行修饰或基因改造，以提高它们期望的结构、功能和/或稳定性。这些包括但不限于取代特定的糖残基、改变配体中特定区域和/或结构的组成和大小以及设计能够被调节剂更有效地调节的配体。

核酸配体的设计和优化涉及了解配体的二级结构以及二级结构和调节剂控制间的联系。与修饰核酸的传统方法不同，设计CLEC-2蛋白的配体可以包括考虑配体改变对潜在调节剂设计的影响。如果通过截短修饰配体，例如，则应该设计相应的调节剂来控制截短的配体。

可以通过本领域技术人员已知的多种方法预测通过SELEX方法所鉴定的配体的二级结构。例如，使用软件程序如Mfold(mfold.bioinfo.rpi.edu；还可见Zuker,2003,Nucleic Acids Res.31:3406-3415和Mathews,et al.,1999,J.Mol.Biol.288:911-940)可以分析每一个序列。接下来，多条选择序列的比较序列分析可以用于基于保守的共有二级结构元件来对比序列，从而获得CLEC-2配体的预测二级共有结构。

可以通过改变总的配体长度及茎和环结构的长度来修饰本文公开的CLEC-2核酸配体。例如，可以产生配体截短物，其中从SELEX方法选择的配体中删除配体的5’和/或3’末端的一部分。为了测定配体所耐受的截短的程度，所用的一种方法可以是加热退火与配体的5’或3’末端区域互补的寡核苷酸(例如DNA寡核苷酸)，然后比较有和没有退火寡核苷酸的情况下配体的结合。如果没有在有退火寡核苷酸的配体和没有退火寡核苷酸的配体间观察到明显的结合差异，这表明配体的退火部分对于配体与靶蛋白的结合是不必要的。可以使用与配体的不同长度的5’或3’末端退火的寡核苷酸进行该方法，以确定完整功能配体的5’和3’边界。

在另一个实施方案中，设计包括减小配体的尺寸。在另一个实施方案中，相对于配体的尺寸改变调节剂的尺寸。在另一个实施方案中，将一连串的鸟嘌呤减少至小于四个鸟嘌呤、或小于三个鸟嘌呤、或小于两个鸟嘌呤或无鸟嘌呤。然而，这些改变的联合效应必须满足产生这样的配体的挑战，该配体能提供足够的活性，但易于被调节剂中和。

为了调节剂能命中目标，还可以修饰改进的配体以包含单链尾(3’或5’)，以便促进与寡核苷酸调节剂的结合。合适的尾可以包含1nt至20nt、优选1nt至10nt、1nt至5nt或3nt至5nt，其中尾内每个位置的核苷酸可以是A、C、G、T或U。应当容易理解，这些尾可以包含如以下详细描述的修饰的核苷酸。

可以在结合和生物试验(例如，如下所述)中测试含尾的配体，以证实单链尾的添加不会破坏配体的活性结构。可以设计一系列寡核苷酸(例如，2’-O-甲基寡核苷酸)，并检测它们与单独的含尾配体结合的能力以及它们增加配体从其靶分子解离或配体与其靶分子结合的速率的能力，所述一系列寡核苷酸能与尾序列形成，例如，1、3或5个碱基对。可以使用混乱序列对照证实效应是由于双螺旋的形成，不是非特异性效应。

还可以设计CLEC-2配体使之具有自杀位置，该位置允许被配对调节剂更有效地调节。在调节剂与配体结合后，自杀位置变成单链的并且不稳定，从而使得配体易于被血液中天然存在的酶(例如血液或肝脏的核酸内切酶)切割。这提供了从循环中有效地、大幅度地立即清除活性配体的方式。

化学修饰

在核酸的治疗用途中遇到的一个问题是在全部效应显现前，磷酸二酯形式的寡核苷酸在体液中可以被细胞内和细胞外的酶如核酸内切酶和核酸外切酶降解。核酸配体的某些化学修饰能够增强核酸配体的体内稳定性或提高或介导核酸配体的递送。此外，通过稳定或促进核酸配体内需要的结构元件的形成，或通过提供与靶分子其它的分子相互作用，某些化学修饰能够增加核酸配体对其靶标的亲和力。

配体的修饰可以包括但不限于提供这样的化学基团的修饰，该化学基团并入额外的电荷、极化性、疏水性、氢键、静电相互作用和对核酸配体碱基或作为整体的配体的官能性。修饰可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架处进行，例如，以改善诸如分子的稳定性和对预期靶标的亲和力的性质。这类修饰包括但不限于2’-位糖修饰、5-位嘧啶修饰，8-位嘌呤修饰、对环外胺的修饰、取代4-硫代尿苷、取代5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶、骨架修饰、硫代磷酸或烷基磷酸修饰、甲基化、不常见的碱基配对组合如异碱基异胞苷和异鸟嘌呤等。修饰还可以包括3’和5’修饰，例如加帽。

SELEX方法包括鉴定高亲和力的核酸配体，该核酸配体包含赋予配体改善特性(例如提高的体内稳定性或改善的递送特性)的修饰的核苷酸。这些修饰的例子包括在核糖和/或磷酸和/或碱基位置的化学取代。在美国专利第5,660,985号中描述了含有修饰核苷酸的SELEX鉴定的核酸配体，该专利中描述了在嘧啶的5-和2’-位置含有化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美国专利第5,580,737号描述了特定的核酸配体，其包含用2’-氨基(2’-NH2)、2’-氟(2’-F)和/或2’-O-甲基(2’-OMe)修饰的一个或多个核苷酸。

如美国专利第5,637,459号和第5,683,867号中所述的，SELEX方法包括将选择的寡核苷酸与其它选择的寡核苷酸和非寡核苷酸功能单元结合。美国专利第5,637,459号描述了高度特异的核酸配体，其包含用2’-氨基(2’-NH₂)、2’-氟(2’-F)和/或2’-O-甲基(2’-OMe)修饰的一个或多个核苷酸。如美国专利第6,011,020号中所述的，SELEX方法还包括将选择的核酸配体与诊断或治疗复合物中亲脂的或非免疫原性的、高分子量化合物结合。

如果核酸配体通过SELEX方法衍生，则修饰可以是SELEX之前或之后修饰。SELEX之前修饰可以产生对其靶标具有特异性和体内稳定性提高的配体。对2’-羟基(2’-OH)核酸配体进行SELEX之后修饰可导致体内稳定性提高，没有不利地影响核酸配体的结合能力。在一个实施方案中，配体的修饰包括在分子3’末端的3’-3’反向磷酸二酯连接和一些或全部核苷酸的2’氟(2’-F)、2’氨基(2’-NH2)、2’脱氧和/或2’-O-甲基(2’-OMe)修饰。

本文所述的配体最初使用转录文库通过SELEX产生，在转录文库中C和U残基是2’-氟取代的，且A和G残基是2’-OH取代。

在某些实施方案中，组成配体的核酸包含修饰的糖和/或修饰的碱基。在某些实施方案中，修饰包括稳定修饰，例如2’-稳定修饰。在一个实施方案中，2’-稳定修饰可包含在糖环上的2’-氟修饰。

在一个实施方案中，设计包括降低配体或调节剂或二者的2’-羟基含量。在另一个实施方案中，设计包括降低配体或调节剂或二者的2’-氟含量。在另一个实施方案中，设计包括降低配体或调节剂或二者的2’-O-甲基含量。

在药物组合物中，配体可以以诸如提高可溶性或生物利用度的盐形式的形式提供。适合的盐包含无机阳离子，例如钠和钾。

可以通过本领域已知的标准方法合成本公开的任意寡核苷酸，例如通过使用自动化DNA合成仪(例如，可从Biosearch Applied Biosystems商购的)。

配体和调节剂在本文利用技术人员易于理解的缩写进行描述并注释如下：“rA”是2’OΗA或腺苷；“A”是2’-脱氧A或2’-脱氧腺苷；“mA”是2’-O-甲基A或2’-甲氧基-2’-脱氧腺嘌呤；“rG”是2’-OH G或鸟苷；“G”是2’-脱氧G或2’-脱氧鸟苷；“mG”是2’-O-甲基G或2’-甲氧基-2’脱氧鸟苷；“fC”是2’-氟C或2’-氟-2’脱氧胞苷；“mC”是2’-O-甲基C或甲氧基-2’-脱氧胞苷；“fU”是2’-氟U或2’-氟-尿苷；“mU”是2’-O-甲基U或2’-甲氧基-尿苷；和“iT”是反向2’HT。

与载体偶联

本文所述的配体还可以包含能够提高生物利用度或稳定性的修饰。这类修饰可以包括与载体分子缀合，所述载体分子可以包括但不限于亲水部分或疏水部分。

治疗CLEC-2介导的疾病的方法

在一个实施方案中，提供了用于治疗CLEC-2介导的疾病的方法，包括给予有需要的宿主治疗有效量的本文所述的配体或其药学可接受的盐。

CLEC-2首先被鉴定为血小板聚集的调节剂(综述，见Suzuki-Inoue etal,2011,J.Thromb Haemostasis,9(Sl):44-55)。接下来，已证明CLEC-2与血栓形成和稳定有关。因此，能够抑制CLEC-2功能或活性的CLEC-2配体可用于多种血小板介导的疾病的治疗干预。在一个实施方案中，CLEC-2介导的疾病包括血管疾病。在另一个实施方案中，血管疾病选自急性冠脉综合征、血栓症、血栓栓塞、血小板减少症、周围血管疾病和短暂性脑缺血发作。本文所述的组合物还用于治疗脑血管疾病，其包括但不限于短暂性脑缺血发作、缺血性卒中和栓塞。

在一个实施方案中，CLEC-2介导的疾病是糖尿病相关疾病。在一个实施方案中，糖尿病相关疾病选自糖尿病性视网膜病变、糖尿病血管病变、动脉粥样硬化、缺血性卒中、周围血管疾病、急性肾损伤和慢性肾衰竭。

在一个实施方案中，CLEC-2介导的疾病包括血小板介导的炎症性疾病。在另一个实施方案中，血小板介导的炎症性疾病选自关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、炎症性肠病、强直性脊柱炎和硬皮病。

在一个实施方案中，CLEC-2介导的疾病是癌。长期以来已表明，血小板参与癌症转移和/或进程(Nash et al.,202,Lancet Oncol,3:425-430)。肿瘤细胞周围的血小板聚集物可以保护它们远离血液中的切应力和NK细胞，进而促进肿瘤细胞巢的形成。而且，由于发现平足蛋白作为内源性CLEC-2配体，实验数据表明CLEC-2/平足蛋白可以是抗转移药物的活靶标。例如，抗-平足蛋白封闭抗体显著抑制转移性肺节结的数目，该节结由表达平足蛋白的肿瘤细胞组成(Kato et al.,2008,Cancer Sci,99:54-61)。

本文所述的CLEC-2配体在肿瘤转移的治疗和抑制中具有治疗应用，已证明CLEC-2配体抑制CLEC-2-介导的血小板聚集。在一个实施方案中，癌选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、胰腺癌、脑癌、骨癌和肝癌。然而，应理解本文所述的CLEC-2配体可以用于治疗或抑制已经转移或技术人员认为可能转移的任何癌症。

在一个实施方案中，CLEC-2配体抑制血小板活化的起始。在其它的实施方案中，CLEC-2配体抑制血小板活化以及因而的血小板促炎症反应。在其它的实施方案中，CLEC-2配体抑制血小板粘附。在其它的实施方案中，CLEC-2配体抑制血小板聚集。在另一实施方案中，CLEC-2配体抑制凝血酶生成。

在某些实施方案中，提供了治疗或预防血管事件，尤其是血栓或血栓栓塞事件形成的方法，其包括给予有需要的宿主本文所述的CLEC-2核酸配体。

在一个实施方案中，提供CLEC-2核酸配体，持续延长的时间段。在这个例子中，CLEC-2配体调节剂可以仅用于紧急情况下，例如，如果治疗导致出血，包含颅内或胃肠出血。在另一个实施方案中，当已接受CLEC-2核酸配体治疗的患者需要紧急手术时，给予调节剂。在另一个实施方案中，给予调节剂以控制CLEC-2核酸配体的浓度以及因而的治疗持续时间和强度。在另一个实施方案中，在心肺分流术中，提供CLEC-2核酸配体作为血小板麻醉剂。在另一个实施方案中，给予CLEC-2核酸配体，以提供口服抗血小板药物的过度期，并且一旦确定了口服抗血小板药剂的治疗水平，则使用调节剂逆转CLEC-2核酸配体。

本文所述的方法可以与另一种疗法联合使用。

在一个实施方案中，宿主准备经历或正在经历手术干预，或已经经历手术干预，所述干预使宿主处于闭塞性血栓事件的风险中。在其它的实施方案中，宿主已接受使之能够进行血液透析的血管移植，所述宿主处于由于血管和血小板间的相互作用而引起闭塞的风险中

在一个实施方案中，疗法包括用治疗有效量的抗癌剂或抗血栓形成剂治疗宿主。

在一个实施方案中，疗法包括用治疗有效量的抗-HIV剂治疗宿主，所述抗-HIV剂选自HIV抗病毒剂、免疫调节剂和抗感染剂。

给药和药物组合物

本文教导的CLEC-2核酸配体或CLEC-2配体调节剂可被配制成药物组合物，所述药物组合物可以包含但不限于药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。组合物的精确性质将至少部分依赖于配体和/或调节剂的性质(包括任何稳定修饰)和给药途径。可以将包含调节剂的组合物设计成用于给予已接受CLEC-2核酸配体的宿主，从而允许调节配体的活性，并因此调节所给予的CLEC-2核酸配体的抗血小板活性。

鉴于本公开，药物或药理组合物的设计和制备是本领域技术人员已知的。通常地，这类组合物可被制备成血管注射剂，以液体溶液或悬浮液形式；注射前适于溶解或悬浮于液体中的固体形式；片剂或用于口服给药的其它固体；作为延时释放胶囊；作为口服给药的液体；作为酏剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂或本领域中使用的任何其它形式，包括滴眼剂、乳剂、洗剂、软膏、吸入剂等。在手术场地由外科医生、内科医生或卫生保健人员处理特定区域所用的无菌制剂也可以是非常有用的，例如基于盐的洗涤物。组合物还可以被配制成用于通过微装置、微板或海绵递送。组合物还可以包被于植入的医疗设备，例如支架，用于局部递送。

可以至少部分通过混合药学可接受的载体来配制药学有用的包含CLEC-2核酸配体或CLEC-2配体调节剂的组合物。这类载体和配制方法的实例可以参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第20版(Lippincott Williams&Wilkins,2000)和Ansel et al，PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems，第6版(Media,Pa.:Williams&Wilkins,1995)。

合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲液和pH调节剂，包括但不限于磷酸缓冲盐。合适的添加剂包括在生理上生物兼容的缓冲液(例如，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、添加螯合剂(例如，EDTA、DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合复合物(例如钙DTPA，CaNaDTPA-双酰胺)或任选地，添加钙或钠盐(例如，氯化钠、氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)。药物组合物可以包装成以液体形式使用，或可以是冻干的。

为了形成适于有效给药的药学可接受的组合物，这类组合物将包含有效量的核酸配体或调节剂。这类组合物可以包含多于一种化合物的混合物。组合物通常包含大于0.1%重量百分比(wt%)至大约50wt%、大约1wt%至大约25wt%、或大约5wt%至大约20wt%的活性试剂(配体或调节剂)。

本文提供了用于肠胃外给药的药物组合物，包括皮下、肌肉或静脉注射和输注。对于肠胃外给药，要求无菌的悬液和溶液。当要求静脉给药时，使用通常包含合适的防腐剂的等渗制剂。药物组合物可以被灭菌和/或包含佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液助溶剂、调节渗透压的盐和/或缓冲液。例如，通过溶解、分散等可以制备液体、特别是可注射的组合物。活性化合物溶解在药学上的纯溶剂中或与药学上的纯溶剂混合，例如，水、缓冲的水、盐溶液、0.4%盐溶液、0.3%甘氨酸、透明质酸、葡萄糖水、甘油、乙醇等，从而形成可注射的溶液或悬液。此外，可以配制在注射前适于溶解于液体中的固体形式。

为了帮助试剂溶解入水环境，可以添加表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可以包括阴离子型去污剂，例如十二烷基硫酸钠、二辛基琥珀酸磺酸钠和十六烷基磺酸钠。可以使用阳离子型去污剂，并包括苯扎氯胺或苄索氯铵。可以包括在制剂中的作为表面活性剂的非离子型去污剂包括但不限于，聚桂醇400、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯20、40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和任何共聚物去污剂，例如Pluronic F68和/或Pluronic F127(例如，见Strappe et al.Eur.J.of Pharm.Biopharm.,2005,61:126-133)。表面活性剂可以单独或作为不同比例的混合物存在于蛋白或衍生物制剂中。

对于以片剂或胶囊形式的口服给药，活性药物成分可以与口服的、无毒的药学可接受的惰性载体联合，例如乙醇、甘油、水等。而且，当需要或必要时，还可以将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂合并入混合物。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、明胶、诸如葡萄糖或β乳糖的天然糖、玉米甜味剂、天然和合成的树胶如阿拉伯树胶、黄芪胶或海藻酸钠、羟甲基纤维素钠、聚乙二醇、蜡等。在这些剂量形式中使用的润滑剂包括但不限于油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，醋酸钠，氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉，甲基纤维素，琼脂，膨润土，黄原胶等。

对于口服给药中使用的液体形式，活性药物成分可以并入合适味道的悬浮剂或分散剂中，例如合成和天然树胶，例如，黄芪胶、阿拉伯树胶、甲基纤维素等。可以使用的其它分散试剂包括甘油等。

包含活性药物成分的局部制剂可以与本领域众所周知的多种载体物质混合，例如，乙醇、芦荟凝胶、尿囊素、甘油，维生素A和维生素E油、矿物油、PPG2肉豆蔻基醚丙酸酯等，从而形成例如酒精溶液、局部清洁剂、清洁霜、皮肤凝胶、护肤液和洗头膏或凝胶制剂。

还可以以脂质体递送系统的形式给予配体，例如小单室囊泡、大单室囊泡和多室囊泡。脂质体可以从多种磷脂形成，例如胆固醇、硬脂酰胺或磷酸卵磷脂。例如，在美国专利第6,147,204号中描述了直接(例如单独)给予的或在脂质体制剂中的活性试剂。

配体还可以与作为可被命中的药物载体的可溶性聚合物偶联。这类聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基甲基丙烯酰-酰胺-苯酚、聚羟基-乙基天冬酰胺苯酚或棕榈酰残基取代的聚氧化乙烯多聚赖氨酸。此外，配体可以与一类在实现药物受控释放中有用的可生物降解的聚合物偶联(优选通过共价连接)，例如，聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、聚ε-己内酯、聚噁唑啉、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶交联的或两亲嵌段共聚物。胆固醇和相似的小分子可以被连接至核酸配体，来增加和延长生物利用度。

可以通过本领域目前已知的或随后开发的多种技术种的任何一种，制备亲脂性化合物和非免疫原性高分子化合物，利用这些化合物可以配制用于使用的本文公开的调节剂。通常地，它们从磷脂如二硬脂酰卵磷脂中制备，并可以包括其它物质例如中性脂质，例如，胆固醇，并且还包括表面修饰剂例如带正电荷的(例如，硬脂酰胺或氨基甘露糖或胆固醇的氨基甘露醇衍生物)或负电荷的(例如，二乙酰磷酸、磷脂酰甘油)化合物。可以通过传统的技术形成多层脂质体，即，通过将选择的脂质溶解于合适的溶剂中，然后蒸发溶剂而在管的内侧留下薄膜或通过喷雾干燥，来将所述脂质沉积在合适容器或管的内壁上。然后将水相加入具有旋转或涡旋运动的容器，这导致形成多层脂质体小囊泡(MLV)。然后通过均匀化、超声或挤压(通过过滤器)MLV可以形成单层脂质体小囊泡(UV)。此外，通过去污剂去除技术能够形成UV。在本公开的某些实施方案中，复合物包含这样的脂质体，该脂质体具有与脂质体的表面结合的靶核酸配体和封装的治疗剂或诊断剂。可以修饰预形成的脂质体与核酸配体结合。例如，阳离子脂质体通过静电相互作用与核酸结合。可选地，可以向预形成的脂质体添加附着于亲脂性化合物(例如胆固醇)的核酸，由此胆固醇与脂质体膜结合。可选地，核酸可以在脂质体形成过程中与脂质体结合。

在另一个实施方案中，根据本领域技术人员已知的方法，可以用包含CLEC-2配体或CLEC-2配体调节剂的制剂包被支架或医疗设备。

还考虑治疗试剂盒。试剂盒包含反应物、活性试剂和实施以上方法可能需要的物质。试剂盒通常在合适的容器装置中包含CLEC-2配体和/或CLEC-2配体调节剂的药学可接受的制剂。如果试剂盒既包含CLEC-2配体又包含CLEC-2调节剂，则在一些实施方案中，CLEC-2调节剂是能与试剂盒中的CLEC-2配体结合的调节剂。试剂盒可以具有单个容器装置，和/或其对于每一种化合物可以具有不同的容器装置。

给药方法

将本公开的CLEC-2配体和/或CLEC-2配体调节剂给予宿主的方式包括但不限于，肠胃外的(通过注射或随时间逐步输注)、静脉的、皮内的、关节内的、滑膜内的、鞘内的、动脉内的、心内的、肌肉的、皮下的、眼眶内的、囊内的、脊柱内的、胸骨内的、局部的、透皮贴剂、经直肠的、口腔的、阴道或尿道栓剂、腹膜的、经皮的、鼻喷雾、手术植入、体内手术涂布、输注泵或通过导管。在一个实施方案中，以缓释制剂(例如移植物、大丸剂、微粒、微球体、纳米颗粒或纳米球)给予试剂和载体。在一个实施方案中，通过皮下注射或沉积包括皮下输注(例如通过渗透泵)递送CLEC-2核酸配体。

在一个实施方案中，通过皮下给药递送CLEC-2核酸配体，并且通过皮下或静脉给药递送调节剂。

包含本文公开的配体和调节剂的治疗组合物可以静脉给药(例如通过注射单位剂量)。术语“单位剂量”，当结合治疗组合物使用时，是指适于作为宿主的单一剂量的物理分离的单位，每一个单位包含经计算结合所需的稀释剂(即载体或赋形剂)产生希望的治疗效果的预定量的活性物质。

此外，胃肠外给药的一种方法采用缓释或持久释放系统的植入，这确保维持恒定水平的剂量。

还提供了例如对受累关节的间隙的局部给药。通过注射能够实现局部给药，例如从注射器或包含注射装置例如针的其它制品。可以通过在期望的时间段内，分配注射器内含物的控制的压力，来控制注射器的给药速率。在另一个例子中，可以通过输注实现局部给药，通过使用泵或其它类似的装置可以方便输注。

还提供了对血管组织局部给药的有代表性的、非限制性的方法，其包括(1)用含有核酸配体的凝胶包被或灌注血管组织，用于体内递送，例如，通过植入包被或灌注的血管来替代已被移除或被忽略的受损或患病的血管组织区段；(2)通过导管向需要递送的血管递送；(3)将组合物泵入待植入患者的血管中。可选地，通过显微注射或通过脂质体封装可以将化合物导入细胞。

还提供了通过用包含配体的药物组合物包被医疗设备如支架来给予受试者CLEC-2配体。用于包被从而允许适当的释放并给予配体的方法是本领域技术人员已知的。

本领域技术人员能够容易地建立本文所述组合物的最佳剂量方案，并能够根据调节剂、患者和寻求的效果而不同。有效量可以根据多种因素，例如个人的疾病状况、体重、性别、年龄和所给予的核酸配体的量而不同。其它因素包括给药方式。

药物有效剂量依赖于疾病类型、使用的组合物、给予途径、被治疗的哺乳动物类型、所考虑的特定哺乳动物的身体特征、同时存在的药物治疗和医药领域技术人员认识到的其它因素。通常地，以体重调整的剂量给予组合物，例如，剂量范围为大约1μg/kg体重至大约100mg/kg体重。更通常地，剂量范围为大约0.1mg/kg至大约20mg/kg，更通常地为大约0.5mg/kg至大约10mg/kg、或大约1.0至大约5.0mg/kg、或大约1.0mg/kg、大约2.0mg/kg、大约3.0mg/kg、大约4.0mg/kg、大约5.0mg/kg、大约6.0mg/kg、大约7.0mg/kg、大约8.0mg/kg、大约9.0mg/kg或大约10.0mg/kg。通常地，剂量初始提供的药物血浆浓度为大约0.002μg/ml至大约2000μg/ml药物，更通常地为大约2.0μg/ml至大约400μg/ml，更通常地为大约10μg/ml至200μg/ml、或大约20μg/ml至大约100μg/ml药物、大约20μg/ml、大约40μg/ml、大约60μg/ml、大约80μg/ml、大约100μg/ml、大约120μg/ml、大约140μg/ml、大约160μg/ml、大约180μg/ml或大约200μg/ml。

当向已被给予配体的宿主给予调节剂时，可以根据期望的配体抑制水平调节调节剂与配体的比例。可以根据与配体剂量的相互关系计算调节剂的剂量。在一个实施方案中，调节剂与配体的重量比重量的剂量比是1:1。在其它的实施方案中，调节剂与配体的比大于1:1，例如2:1或大约2:1、3:1或大约3:1、4:1或大约4:1、5:1或大约5:1、6:1或大约6:1、7:1或大约7:1、8:1或大约8:1、9:1或大约9:1、10:1或大约10:1或更高。在其它的实施方案中，调节剂与配体的重量比重量的剂量比小于大约1:1，例如0.9:1或大约0.9:1、0.8:1或大约0.8:1、0.7:1或大约0.7:1、0.6:1或大约0.6:1、0.5:1或大约0.5:1、0.45:1或大约0.45:1、0.4:1或大约0.4:1、0.35:1或大约0.35:1、0.3:1或大约0.3:1、0.25:1或大约0.25:1、0.2:1或大约0.2:1、0.15:1或大约0.15:1、0.1:1或大约0.1:1或小于0.1:1，例如大约0.005:1或更低。在一些实施方案中，重量比重量的剂量比是0.5:1至0.1:1、或0.5:1至0.2:1、或0.5:1至0.3:1。在其它的实施方案中，重量比重量的剂量比是1:1至5:1、或1:1至10:1、或1:1至20:1。

可以以单一日剂量、每两天剂量静脉给予配体，或可以以几个分开的剂量给予总日剂量。可以每天一次(q.d.)、每天两次(b.i.d.)、每天三次(t.i.d.)或按需要更频繁地提供配体和/或调节剂给药。此后，通过任何合适的方式提供调节剂，来通过给予调节剂改变核酸配体的效用。可以每周两次、每周、每两周或每月皮下给予核酸配体。在一些实施方案中，通常小于每天一次给予配体或调节剂。例如，可以每两天、每三天、每四天、每周或每月进行配体给药。

在一个实施方案中，共同给予或相继给予其它试剂可以是可取的。对于用多于一种活性试剂的组合治疗，如果活性试剂在单独的剂量制剂中，则可以同时给予活性试剂，或可以在分别交错的时间给予每一种试剂。

以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效量给予组合物。待给予的量取决于待治疗的宿主、宿主身体利用活性成分的能力和期望治疗效果的程度。需要给予的活性成分的准确量取决于医师的判断，并且对于每一个体是特定的。然而，全身应用的合适的剂量范围如本文公开，且取决于给药途径。合适的给药方案还是可变的，但是特征是通过初始给药，

随后在一个或多个小时间隔通过随后的注射或其它给药的重复剂量。可选地，提供了在足以将血液中的浓度维持在体内治疗指定的范围内的连续静脉输注。

在某些实施方案中，本公开的组合物还可以包含另一种治疗剂。当使用第二试剂时，第二试剂可以作为单独的剂量形式，或作为具有化合物或组合物的单一剂量形式的一部分给予。尽管一种或多种本发明的化合物可用于单一疗法治疗病症、疾病或症状的应用中，但是它们还可以用于联合疗法中，在联合疗法中使用本发明的化合物或组合物(治疗剂)与使用一种或多种其它治疗剂联合，用于治疗相同和/或其它类型的病症、症状和疾病。联合疗法包括同时或相继地给予两种或更多种治疗剂。可以以任意顺序给予试剂。可选地，多种治疗剂可以被并入可被给予患者的单一组合物中。

表征CLEC-2配体和CLEC-2配体调节剂的方法

在一方面，本公开提供了用于表征CLEC-2配体的方法，所述CLEC-2配体可以作为CLEC-2的活化剂或抑制剂起作用。这类方法根据CLEC-2介导的血小板聚集来评估CLEC-2活性。在一个实施方案中，使用基于全血流动的血小板粘附试验在体外或离体进行试验。

多个研究表明，尽管CLEC-2可能不是对包被胶原蛋白的表面的初始血小板附着所需的，但是CLEC-2可能是稳定血小板聚集和血栓生长所需的。已经研究了CLEC-2在血栓形成中的作用，例如，在小鼠中使用CLEC-2嵌合体。这些研究表明CLEC-2与体外和体内的血栓稳定有关(Suzuki-Inoue,K.et al.,2010,J.Biol.Chem.285,24494-24507)。最近还使用全血灌注试验证明了CLEC-2受体在体外血小板聚集稳定中的作用，其中CLEC-2耗尽的血小板能够正常地附着于包被胶原蛋白的表面，但随后稳定的血小板聚集物的形成在中等至高剪切速率下被强烈地削弱了(May,F.et.al.,2009Blood,114:3464-3472)。通过这些研究，据推测CLEC-2可以通过“接管”血小板中GPVI的功能而有助于血栓生长，所述血小板被招募至将不与胶原蛋白接触的生长的血栓(Neswandt,B.et.al.,2011,J.Throm.Haemost,9,suppl1:92-104)。换句话说，尽管血小板附着于包被胶原蛋白的表面和初始血栓形成依赖于GPVI，但血小板的进一步聚集即形成血栓需要CLEC-2。

在流动条件下血小板在包被胶原蛋白的表面的粘附已被常规地用于研究体外和体内血栓的生长和稳定性。例如，使用仪器如BioFlux^TM(Fluxion Biosciences,South San Francisco,CA))进行了这些流动实验，这提供了在体外模型中效仿生理剪切流的能力，同时还提供了高通量孔板形式。

目前已发现，利用全血的基于体外流动的血小板试验可以用于鉴定CLEC-2介导的血小板聚集物形成的活化剂或抑制剂。在一个实施方案中，进行全血剪切流的表面用蛇毒蛋白包被，所述蛇毒蛋白已知可有效地刺激CLEC-2依赖的血小板聚集物的形成。如在实施例10(图12A)中详细描述的，在全血流动条件下，使用蛇毒蛋白包被的表面支持血栓中活化血小板的积累。然后在存在CLEC-2依赖的血小板聚集物形成的推定抑制剂或活化剂的情况下进行该试验方法。例如，将全血样品与已知结合CLEC-2的化合物(例如，本文所述的任何一种CLEC-2配体)孵育。然后可以在CLEC-2配体存在和不存在的情况下，对血小板聚集物的形成进行比较。CLEC-2依赖的血小板聚集物形成的抑制剂是这样的CLEC-2配体，与在不存在CLEC-2配体时血小板聚集物形成的水平相比，该CLEC-2配体将血小板聚集物形成的水平降低至少50%、75%、80%、85%、90%或95%。

还可以使用该试验来鉴定CLEC-2配体的调节剂。再一次，如在实施例10中所述的，可以在CLEC-2配体存在时，将全血样品进一步在存在或不存在CLEC-2配体的调节剂的情况下进行孵育。是CLEC-2配体的功能调节剂的化合物将逆转CLEC-2配体的活性。例如，如果CLEC-2配体已经降低血小板聚集物形成的水平，相对于在只有CLEC-2配体存在时所观察到的水平，添加CLEC-2配体的功能调节剂将导致血小板聚集物形成的增加。

在用于表征CLEC-2配体功能的第二方案中，进行利用全血的基于体外流体的血小板粘附试验，其中将全血暴露于涂有I型可溶性胶原蛋白(胶原蛋白I)的表面。例如，实施例10(图12B)，显示了使用BIOFLUX进行的试验，在试验中用可溶性大鼠鼠尾胶原蛋白蛋白I包被孔。在该方案中，在流过可溶性胶原蛋白I包被的表面前将全血样品与蛇毒蛋白孵育。与缺少蛇毒蛋白的血液流体时所形成的血小板聚集物相比，在样品中蛇毒蛋白的存在导致在可溶性胶原蛋白I包被的表面形成较大的血小板聚集物。为了测试CLEC-2配体活化或抑制CLEC-2介导的血小板聚集物形成的能力，在血液流动步骤前将全血样品与CLEC-2配体孵育。在与蛇毒蛋白孵育之前或之后，可以进行与CLEC-2配体的孵育。可选地，将CLEC-2配体和蛇毒蛋白同时加入血液样品。如上文，然后可以在CLEC-2配体存在和不存在的情况下，对血小板聚集物的形成进行比较。CLEC-2依赖的血小板聚集物形成的抑制剂是这样的CLEC-2配体，与在不存在CLEC-2配体时血小板聚集物形成的水平相比，该CLEC-2配体将血小板聚集物形成的水平降低至少50%、75%、80%、85%、90%或95%。此外，如以上描述，可以表征CLEC-2配体的调节剂逆转CLEC-2配体对于CLEC-2介导的血小板聚集物形成的效应的能力。是CLEC-2配体的功能调节剂的化合物将逆转CLEC-2配体的活性。例如，如果CLEC-2配体已经降低血小板聚集物的水平，相对于在只有CLEC-2配体存在时所观察到的水平，添加CLEC-2配体的功能调节剂将导致血小板聚集物形成的增加。

应当理解，这些表征CLEC-2配体和CLEC-2配体调节剂的功能活性的试验方法不限于在全血样品中使用。在某些实施方案中，血液样品可以包含一种或多种天然的血液成分。在某些实施方案中，血液样品可以包含一种或多种人工血液成分。可选地，在流动试验中使用的血液样品是包含全血或富含血小板的血浆或洗涤血小板的样本。

可以使用多种细胞系测试CLEC-2配体和调节剂的功能活性，例如，内皮细胞、树突状细胞、粒性白细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、免疫细胞即自然杀伤T细胞、B细胞。多种功能试验包括血小板-血小板相互作用、血小板-单核细胞相互作用、血小板白细胞相互作用、钙信号、细胞粘附试验、分泌试验、LPS诱导的炎症试验、细胞迁移试验、Syk和Srk磷酸化试验、配体结合的ELISA试验、基于流式细胞术的受体占用试验或诊断标志物试验。可以用适体配体测试的CLEC-2受体调节剂的试剂和合成的等同物，其是交联的抗体、CLEC-2受体嗜同种相互作用研究、小分子抑制剂和活化剂、肽、蛋白质、单克隆抗体、脂蛋白、脂化肽等。

提供以下实施例来阐明本公开的某些方面。这些实施例不应以任何方式被认为是限制本公开的范围。

实施例

实施例1:CLEC-2核酸配体的鉴定

使用SELEX方法获得图1中描述和说明的能够结合CLEC-2的配体。

通过加热退火和瞬间冷却1nmole模板DNA寡核苷酸和1.5nmole5’DNA引物寡核苷酸产生候选DNA文库。用于设计候选混合物的Sel2DNA模板寡核苷酸的序列是：5’-TCTCGGATCC TCAGCGAGTCGTCTG(N40)CCGCA TCGTCCTCCC TA-3’(SEQ ID NO:4)(N40代表用等摩尔量A、T、G和C合成的40个连续的核苷酸)，5’引物寡核苷酸和3’引物寡核苷酸分别是5’-GGGGGAATTC TAATACGACTCACTATAGGG AGGACGATGC GG-3’(T7启动子序列是黑体的)和5’-TCTCGGATCC TCAGCGAGTC GTCTG-3’。反应充满Exo-Klenow，通过加入终浓度为2mM的EDTA停止反应，并用PCI[苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)]，然后用氯仿：异戊醇(24:1)提取。提取物用Amicon10离心柱脱盐、浓缩并去除未包含的核苷酸。在转录反应中利用DNA模板产生2’-氟嘧啶起始文库。体外转录条件是40mM Tris-HCl pH8.0、4%PEG-800、12mM MgCl₂，1mM亚精胺、0.002%Triton、5mM DTT、1mMrGTP、1mM rATP、3mM2’F-CTP、3mM2’F-UTP、8μg/mL无机焦磷酸酶、0.5μΜDNA文库和Y639F突变的T7聚合酶。转录在37°C过夜孵育，DNase处理，氯仿：异戊醇(24:1)提取两次、用Amicon10离心柱浓缩，并在12%变性PAGE凝胶上进行凝胶纯化。RNA从凝胶中洗脱，更换缓冲液、用TE(10mM Tris pH7.5、0.1mM EDTA)清洗在Amicon10离心柱中浓缩。

用～10¹⁴不同的2’-氟嘧啶RNA序列的复合文库起始CLEC-2筛选。复合RNA库针对生物素-PEG6-His6肽进行预纯化，并固定于链霉亲和素磁珠。将预纯化的RNA结合于纯化的带重组N末端His10标签的CLEC-2蛋白(SEQ ID NO:3)。纯化的带组氨酸标签的CLEC-2蛋白从R&DSystems(Minneapolis，MN)获得，目录号1718-CL-050，并包含Gln58-Pro229残基。

在结合缓冲液“F”中进行CLEC-2配体筛选。结合缓冲液F由20mMHEPES pH7.4、150mM NaCl、2mM CaCl₂和0.01%BSA组成。从第三轮开始，0.0024%酵母tRNA包括在该轮结合反应中。在25mm硝酸纤维素圆盘上用洗涤分离蛋白质-RNA复合物。在PCI(25：24：1)中孵育，从硝酸纤维素圆盘中提取结合的RNA。加入水，提取水相，然后用氯仿：异戊醇(24:1)提取。用乙醇沉淀得到的结合RNA。将沉淀RNA的四分之一与3’引物加热退火，并使用AMV RT逆转录。用5’和3’引物以及产生用于下一轮RNA产生的DNA模板的标准PCR条件，在PCR中使用全部的RT反应。在图2中显示了每一轮筛选的具体条件。

利用来自各轮SELEX的同位素标记的配体RNA库和可溶性CLEC-2在直接结合研究中监视CLEC-2配体文库的富集。用添加至结合缓冲液F中的一系列CLEC-2稀释液的痕量P³²末端标记的RNA进行结合研究。为了制备用于结合研究的同位素标记RNA，用细菌碱性磷酸酶在50°C使100皮摩尔RNA去磷酸化，持续1h。反应用苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)提取，氯仿：异戊醇(24:1)提取，并用乙醇沉淀。3皮摩尔去磷酸化的RNA用提供了缓冲液的T4聚核苷酸激酶和20μCiγ-Ρ³²-ΑΤΡ对进行末端标记，接下来用Biorad MicroBio Spin P-30离心柱纯化。稀释末端标记的RNA至终浓度2000cpm/μL，并在65°C加热变性5分钟。使用前在37°C平衡RNA和CLEC-2稀释液。在37°C将RNA(5μL)加入不同浓度的CLEC-2(15μL)，并且共同孵育5至15min。然后在具有清洗的96孔真空多支管系统中，将复合的RNA/CLEC-2蛋白混合物加载至ProtranBA85硝酸纤维素膜上，并在上覆盖Genescreen Plus尼龙膜。将膜暴露于磷屏成像仪屏、扫描并用Molecular Dynamics Storm840磷屏成像仪屏定量。通过将硝酸纤维素上的计数除以总计数并调整背景来计算分数结合。在图3中显示了CLEC-2筛选结合的富集。

实施例2：CLEC-2核酸配体的测序和鉴定

最终的PCR产物用EcoRl和BamHl消化，使用纯化试剂盒纯化，并并定向克隆进入线性化的pUC1载体，所述最终的PCR产物代表来自实施例1中所述的第10轮SELEX实验的抗CLEC-2富集的配体文库。将细菌集落划线获得单克隆，并接种来自单集落的5mL过夜培养物。使用Invitrogen Purelink Quick Plasmid Miniprep试剂盒从单集落中制备质粒DNA，并利用载体引物测序。共测序42个克隆，其中20个代表了独特的序列。评价这些独特序列中的每一个相对于CLEC-2的亲和力(根据实施例1中的方法)和抑制蛇毒蛋白诱导的CLEC-2依赖的血小板聚集(根据实施例8中的方法)的能力。分析20个克隆所得的结果之后，鉴定配体S2-20为CLEC-2依赖的聚集的高亲和力抑制剂，并如以下详细描述进行了更全面地表征。

在表1中显示了适体S2-20的DNA随机区域、对应的RNA随机区域、全长DNA、全长RNA和具有修饰的全长RNA的序列。全长是指从SELEX方法获得的序列，包含来源于SELEX方法中使用的配体文库的随机部分的序列以及来自随机区域侧翼的固定序列部分的序列。

表1：CLEC-2配体S2-20的序列

SEQ ID NOs是指在标题为“修饰的序列”的栏中描述的未修饰版本的配体，以5’-3’方向列出了序列。

rG=2’核糖G、rA=2’核糖A、fC=2’氟C、fU=2’氟U

如在上述实施例1中所述，使用同位素标记的痕量配体RNA和可溶性CLEC-2，通过直接结合研究测定抗CLEC-2配体对CLEC-2的亲和力。抗CLEC-2配体(S2-20)对CLEC-2的亲和力较高，Kd为大约1.4nM。

实施例3：抗CLEC-2配体序列的截短探测

利用mfold服务器(mfold.bioinfo.rpi.edu)实施S2-20可能的二级结构筛选。在服务器网址以及M.Zuker(2003)“Mfold web server for nucleicacid folding and hybridization prediction.”Nucleic Acids Res.31(13),3406-15和D.H.Mathews,et al.(1999)“Expanded Sequence Dependence ofThermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA SecondaryStructure”J.Mol.Biol.288,911-940中找到了这些方法的描述。产生一系列抗CLEC-2配体S2-20的截短化合物(表2)，并测定了它们与CLEC-2的亲和力(表2)。除RB587之外，在体外从DNA模板转录所有的截短物。在具有idT预载的CPG的Mermade12DNA/RNA合成仪中合成RB587。在图4中显示了S2-20全长适体、S2-20T10截短物和RB587的结合数据。

表2：S2-20截短

SEQ ID NOs是指在标题为“修饰的序列”的栏中描述的未修饰版本的配体，以5’-3’方向列出了序列。

rG=2’核糖G、rA=2’核糖A、fC=2’氟C、fU=2’氟U

在图5中呈现了截短物S2-20T10和RB587的二级结构。预测的5’和3’末端的界限足以形成茎1和有功能的抗CLEC-2配体。如果去除茎1的3’部分，如在S2-20T5中，与CLEC-2的结合被消除。S2-20T7和S2-20T8的结合数据表明，茎1长度可以是5个碱基对，并仍然保持相当的亲和力。如用S2-20T6ext8和S2-20T6ext10所证明的，使茎1延长6个碱基对至8-10个碱基对仍以高亲和力结合CLEC-2。因而，茎1的长度可以是具有相当的亲和力的5-10个碱基对。

茎2是优选在底部具有摆动碱基对的4个碱基对的茎。S2-20T1l具有单一的取代，使茎2底部碱基对从U-G变成C-G。如显著增加Kd(大约30倍)所证明的，该取代并没有被很好地耐受。

实施例4：抗CLEC-2配体序列突变探测

产生S2-20截短物的一系列突变化合物，并测定了它们与CLEC-2的亲和力(表3)，所述突变化合物在环区域内包含核苷酸突变。除RB588之外，在体外从DNA模板中转录全部突变的截短物。在具有idT预载的CPG的Mermade12DNA/RNA合成仪中合成RB588。

表3：S2-20突变

SEQ ID NOs是指在标题为“修饰的序列”的栏中描述的未修饰版本的配体，以5’-3’方向列出了序列。

rG=2’核糖G、rA=2’核糖A、fC=2’氟C、fU=2’氟U

截短的S2-20序列的二级结构(图5)表明有2个环结构，其中环1是5’-GAC-3’，环2是5’-CUCAUAUU-3’。通过进行突变分析，环结构更严格的界定能够确定。

在环1的碱基1中，取代为A(mut25),C(mut7)或U(mut33)不能很好地耐受。Mut7基本上对CLEC-2蛋白没有特异性结合，并且在进一步研究中使用化学合成的版本(RB588)作为阴性对照。环1的第二碱基容易接受取代为G(mut31)或U(mut8)，这表明这个位置能够耐受嘌呤或嘧啶。双突变(mut1)结合数据与单点突变数据一致。环1的第三碱基优选为C。将C取代为其它嘧啶U(mut26)或G(mut6)都不能很好地耐受。考虑到这些数据，可以描述环1具有共有序列5’-GNC-3’，其中“N”代表4个碱基(A、G、C、T或U)中的任意一个。

环2是序列为5’-CUCAUAUU-3’的8个碱基的环。突变分析表明嘧啶是第一碱基优选的。取代为U(mut17)能被很好地耐受，但观察到亲和力略微降低。碱基1取代为G(mut9)不能被很好地耐受。U是环2的第二碱基优选的，因为取代为A(mut10)或C(mut18)都不能被很好地耐受。嘧啶是环3的第三碱基优选的(mut19)，并且取代为嘌呤(mut11)不能被很好地耐受。环2碱基4可以耐受嘌呤(mut20)或嘧啶(mut12)取代。尽管这个位置能够耐受嘌呤或嘧啶，但不耐受碱基缺失(mut28)。碱基5可以耐受取代为A(mut13)或C(mut21)，并具有相当的结合亲和力。此外，还耐受取代为G(mut32)。尽管这个位置能够易于耐受取代，但删除这个位置不能被耐受(mut37)。嘌呤是环2碱基6优选的。耐受嘌呤取代(mut22)，但不耐受两种嘧啶取代(mut14和mut27)。嘧啶是环2碱基7优选的(mut23)。在碱基7取代为A(mut15)导致Kd增加。尽管突变体15(Kd～30nM)的结合显著优于所产生的其它多种突变构建体，但与嘌呤相比，在这个位置更需要嘧啶。U是环2碱基8优选的。将该U取代为C(mut24)或A(mut16)都不能被很好地耐受。

根据该数据，优选的环2共有序列可以书写如下：5’-Y U Y N N R YU-3’，其中“Y”代表嘧啶，“R”代表嘌呤，“N”代表四个碱基的任意一个。

实施例5：简并SELEX

为了鉴定S2-20CLEC-2配体序列内的关键核苷酸，进行简并SELEX。简并SELEX的起始模板寡核苷酸是具有通过N40区域中的设计所引入的简并性的S2-20序列。S2-20简并模板寡核苷酸的合成是60%原始碱基和整个S2-20随机区域序列中剩余的3个碱基的每一个的13.3%。通过向SELEX选择压力中引入S2-20序列的简并版本，能够确定哪个核苷酸取代对于结合CLEC-2是优选的。S2-20简并RNA起始库具有与天然Sel2库对CLEC-2相当的结合。在4轮筛选之后，来自简并筛选第4轮RNA库的结合亲和力与来自最初筛选第10轮RNA的亲和力相当。在图6中显示了简并S2-20筛选的具体条件。对来自第3轮的43个和第4轮的46个适体进行克隆，并如在实施例2中所述进行测序。

用60%保守的初始序列设计起始简并库。通过在单个位置分析取代频率，能够确定哪个碱基易于耐受取代。在图7中说明了随机区域的第3轮和第4轮序列的单个位置处每一个核苷酸的频率。序列随机区域中的前24个核苷酸是高度保守的。与设计的60%的基线相比，碱基位置25-40明显含有较低的保守性。这些数据与截短数据一致，这表明结合CLEC-2所需的最小的必需区域。

简并筛选分析还显示茎1可以耐受摆动碱基配对以及一些极少的假定茎结构保持完整的未配对碱基。与截短数据一致，茎2在简并筛选中是高度保守的，在茎底部的U-G碱基对具有100%的频率。

对于环1，在环中的第1碱基(G)来自5’固定的区域，并且因此在该位置未见到突变。在环1的碱基2(A)，确实出现对A的偏爱性，但观察到其它取代，并且当从第3轮至第4轮进行SELEX时，该位置A的出现似乎在降低。与突变数据一致，环1中的第3碱基的C在来自第3轮和第4轮的序列中是100%保守的。对于环2，当将简并筛选结果与实施例3中的突变数据比较时，发现了类似的观察结果。

总之，参与结合CLEC-2的随机区域的一部分(随机区域碱基1-24)，高度聚集于原始S2-20序列。在最小结构中不是必要的随机区域的剩余碱基(碱基25-40)更加分散。

实施例6：抗CLEC-2配体序列的控制剂

基于互补的沃森-克里克碱基配对原则，配体编码设计核酸调节剂或控制剂所需的信息。给定控制剂的效力依赖于数种因素，包括配体的靶区域对控制剂成核的可达性以及在控制剂内不存在或存在有限的内部二级结构，在与配体的形成全双螺旋之前，所述二级结构需要变性。为了限定抗CLEC-2配体对于与核酸调节剂结合是优选区域的区域，为RB587设计了一系列控制剂(见表4和图8)。

为了测试全部6种控制剂(RB581-586)的效力，使用了凝胶阻滞试验。在该试验中，RB587用γ-Ρ³²-ΑΤΡ末端标记，并加入痕量的未标记RB587，然后与缓冲液或不同摩尔比的6种控制剂中的一种孵育。更具体地，未标记RB587的摩尔浓度保持恒量1μΜ，而向反应中加入一定范围的控制剂(8μΜ至0.25μΜ)，这导致RB587与控制剂的摩尔比范围为1:8至1:0.25。反应在37°C孵育15min，加载至16%非变性聚丙烯酰胺/0.5xTBE/2mM CaCl₂凝胶上，并且以10W运行3h。然后取出凝胶，在保鲜膜中包裹，在不漏光的暗盒中暴露于磷屏成像仪屏1h，并用Storm840扫描。所得到的扫描表明只有RB587的天然位置和RB587加不同摩尔量的控制剂由于配体和控制剂杂交而向上迁移。在表4中显示了破坏RB587天然折叠所需的控制剂最小摩尔比的结果。抗CLEC-2配体RB587的二级结构能够通过使用控制剂被有效地调节。

表4：控制剂

SEQ ID NOs是指在标题为“修饰的序列”的栏中描述的未修饰版本的配体，以5’-3’方向列出了序列。

mU=2’-O-甲基尿苷、mA=2’-O-甲基腺苷、2’-O-甲基鸟苷、mC=2’-O-甲基胞嘧啶

实施例7：评估抗CLEC-2配体抗血小板活性的方法

洗涤血小板制剂(WP)和聚集研究：

基本上如Mustard et al.(1972;Br.J.Haematol22,193-204)所述制备人的洗涤血小板。简述之，收集人血液至六分之一体积的枸木缘酸钠葡萄糖(ACD)缓冲液(85mM柠檬酸钠、65mM柠檬酸和110mM葡萄糖)中，放置于37°C水浴30min，然后在室温下以250g离心16min。移出富含血小板的血浆，在室温下于2200g离心13min，然后在40mL含有10U/mL肝素和5μΜ(终浓度)前列腺素I2(PGI2)的HEPES缓冲的蒂罗德溶液(136.5mM NaCl、2.68mM KCl、1mM MgCl₂、2mM CaCl₂、12mMNaHCO₃、0.43mM NaH₂PO₄、5.5mM葡萄糖、5mM HEPES pH7.4、0.35%牛血清白蛋白)中重悬。在37°C水浴中孵育血小板悬液10min，加入5μΜ(终浓度)PGI2，并将混合物在1900g离心8min。将所得的沉淀在40mL含有5μΜ(终浓度)PGI2的HEPES缓冲的蒂罗德溶液中重悬，然后在37°C水浴中孵育10min，并在1900g离心8min。将沉淀以3x10⁸血小板/mL的密度重悬于含有0.1U/mL马铃薯腺苷三磷酸双磷酸酶的HEPES缓冲的蒂罗德溶液中，并在集合度测定研究使用前在37°C水浴中孵育2h。

通过生物发光凝集测定仪(Chrono-Log Corp.Havertown,PA)在37°C测量0.5ml搅动的(1200rpm)洗涤血小板悬液(425μl洗涤血小板、25μl纤维蛋白原、25μl抑制剂或对照和25μl蛇毒蛋白)的光透射，测定蛇毒蛋白(Aggretin；购自Frankfurt University Hospital)诱导的WP血小板聚集。使用0.5ml HEPES缓冲的蒂罗德溶液设定仪器基线。在聚集测量前，血小板悬液添加终浓度为1mg/ml的纤维蛋白原。通过加入指定浓度的蛇毒蛋白(产生70-90%的聚集百分比)起始血小板聚集，连续记录光透射至少6min。为了筛选抗CLEC-2配体或能够阻止蛇毒蛋白诱导的血小板聚集的对照，将抗CLEC-2配体以产生期望终浓度的稀释度加入血小板悬液，并在加入蛇毒蛋白前孵育3min，加入蛇毒蛋白后记录反应4-6min。

测定来自最大程度聚集百分比的每一个供体的蛇毒蛋白的效力以确定合适的激发浓度，所述最大程度聚集百分比从利用一系列稀释度的蛇毒蛋白(在20mM Tris pH8.0，50mM NaCl缓冲液中范围为大约3-60nM)的剂量反应曲线获得。使用宽范围的抗CLEC-2配体浓度，在如上所述的WP制剂中测试抗CLEC-2配体抑制蛇毒蛋白诱导的血小板聚集的能力。图9A和9B显示了CLEC-2配体对于蛇毒蛋白诱导的WP血小板聚集的图。S2-20(轨迹2和轨迹6；1μΜ和0.5μΜ)；RB587(轨迹1和轨迹5；1μΜ和0.5μΜ)；RB588(轨迹3和轨迹7；1μΜ和0.5μΜ)；和对照(轨迹4和轨迹8；20nM蛇毒蛋白)。通过密集的向下指的箭头在轨迹上标记加入蛇毒蛋白6分钟后的位置。如图9A和9B所示，在大约20-30nM蛇毒蛋白活化剂存在时，S2-20和RB587适体在抑制蛇毒蛋白诱导的WP聚集中完全有效。

实施例8：在蛇毒蛋白诱导的血小板聚集试验中评估抗CLEC-2配体S2-20全长克隆和RB587截短物的抗血小板活性的方法

基本上如上所述制备人洗涤血小板。如在实施例7中所述，测定来自最大程度聚集百分比的每一个供体的蛇毒蛋白的效力以确定合适的激发浓度，所述最大程度聚集百分比从利用一系列稀释度的蛇毒蛋白(大约3-60nM)的剂量反应曲线获得。。在如上所述的WP制剂中测试抗CLEC-2配体抑制蛇毒蛋白诱导的血小板聚集的能力。在图10A和10B中呈现了来自S2-20和RB587剂量反应分析的数据。图10A是蛇毒蛋白诱导的血小板聚集的图，表示为在人的洗过的血小板中不同浓度CLEC-2核酸配体S2-20克隆与对照的百分比。图10B是蛇毒蛋白诱导的血小板聚集的图，表示为在人洗涤血小板中不同浓度CLEC-2核酸配体RB587和非活性的突变体RB588与对照的百分比。观察到添加蛇毒蛋白6分钟之后，在存在0.5μM S2-20或RB587的情况下基本上完全抑制了聚集。

用于核酸调节剂在WP中测试CLEC-2核酸配体的蛇毒蛋白诱导的血小板聚集试验：

如之前所述制备人的洗过的血小板(WP)。当测试宽范围浓度的CLEC-2核酸配体抑制剂时，获得IC_95-100值。IC_95-100值代表了由给定浓度的激发活化剂所引发的抑制聚集大约95-100%所需的抑制剂浓度活化剂。当测试调节剂对抗血小板活性的可逆性时，将血小板与2-4μΜCLEC-2适体(IC_95-100)或缓冲液F孵育3min，随后在加入蛇毒蛋白之前加入不同摩尔浓度的调节剂(4：1；2：1；1：1调节剂：适体)持续10min，记录反应6分钟。图10C显示蛇毒蛋白诱导的血小板聚集的图，表示为在人洗涤血小板中不同浓度的单独的CLEC-2核酸配体或与CLEC-2配体调节剂RB581、RB582、RB583、RB584、RB585和RB586联合与对照的百分比。

实施例9：利用流式细胞术用蛇毒蛋白(Aggretin)的血小板活化功能分析(P-选择素；CD62-P表达)

流式细胞术研究：

使用P-选择素特异性抗体，进行流式细胞术来评估CLEC-2适体抑制蛇毒蛋白诱导的人P-选择素表达的能力。血小板表面的P-选择素表达是血小板活化的标志物。在蒂罗德缓冲液中以1/10稀释人洗涤血小板悬液(密度为3x10⁸细胞/mL)，并保持在37°C。在5mL试管中加入5μl在缓冲液F中的每一种测试化合物(SEL2库、S2-20、S2-20T4、S2-20T5、S2-20T6、RB587和RB58820μΜ原液)。立即，加入50μL稀释的血小板并轻轻混匀。在室温下孵育试管3min。向每管加入2.5μL蛇毒蛋白(在20mM Tris、50mM NaCl缓冲液，pH8.0中配制的3.331μΜ原液)，混匀并再孵育5min。将试管转移至冰上，并冷却1分钟。向每管加入20μLCD62P-PE抗体(Becton Dickinson；Cat#550561)，并在冰上孵育20min。用0.6mL冰预冷的PBS进一步稀释每管中的血小板悬液，并在FACS-Calibur中分析。

使用FACS-Calibur检测CD62的表达：

在流动观察区域创建两个分开的散点图(一个log SSC对FSC和logFSC对FL2-H)和一个柱状图。使用SSC对FSC的散点图(为了适合观察而调整仪器)鉴定血小板。围绕血小板创建感兴趣的区域1(Rl)(这是为了避免将碎片计数为血小板)。在散点图FSC对FL2-H(使用对照调整FL2)上观察区域1(Rl)中的血小板。还在以计数对FL2-H而绘制的柱状图上观察血小板。使用对照管在FSC对FL2-H散点图上设置象限统计标记，并确定统计参数(对照；未染色的血小板)。收集以静止对照(加抗体)起始的所有样品。使用GraphPad Prism，将数据绘制成对照(150nM蛇毒蛋白活化；右下象限作为共100%活化)的%。

使用上述FACS分析，来检测适体S2-20、RB587和S2-20的3个截短物在WP中抑制蛇毒蛋白诱导的P-选择素表达的能力。在图11A和11B中说明了所得的数据，其提供了利用流式细胞术和P-选择素-PE抗体的蛇毒蛋白诱导的人P-选择素表达的图。活性表示为在人洗涤血小板中2μΜCLEC-2核酸配体S2-20克隆和截短物(图11A)或在人洗涤血小板中2μΜCLEC-2核酸配体RB587和失活突变体RB588(图11B)对对照的百分比。

每一种CLEC-2配体S2-20、RB587、S2-20-T4和S2-20-T6都能够显著降低人WP表面上蛇毒蛋白诱导的P-选择素表达，而不能结合CLEC-2的截短物S2-20-T5和RB588未显示出抑制活性，这证明配体对CLEC-2的亲和力和抑制CLEC-2活性之间的关联。

实施例10：使用Bioflux^TM200(Fluxion Biosciences,Inc.)在用于CLEC-2适体活性的全血中的基于体外流动的血小板粘附试验

在全血存在时，使用基于体外流动的血小板粘附试验表征CLEC-2配体抑制CLEC-2介导的血小板聚集的能力。

用于灌注和流动实验的全血制剂：

使用19G x3/4”注射针头从健康志愿者中抽取血液至含有PPACK(0.3mM)抗凝血剂的60mL注射器中。立即用4μΜCalcein-AM(Invitrogen P/N C3100MP)在37°C荧光标记血液1hr(通过颠倒试管几次混匀而将Calcein-AM轻轻加入血液，并且在抽血3.5h内使用血液)。当用包被纤维状胶原蛋白或蛇毒蛋白的孔进行实验时，通过向进口孔加入200μL标记的血液起始实验，并在37°C使用Bioflux^TM软件，使用5dyn/cm²全血流动设置立即开始灌注。当用大鼠鼠尾胶原蛋白包被的表面进行实验时，用165nM蛇毒蛋白活化全血2分钟，然后通过向进口孔加入200μL标记的活化血液起始实验，并在37°C使用Bioflux^TM软件，使用5dyn/cm²全血流动设置立即开始灌注。使用时间推移倒置荧光显微镜(附有Axiocam电荷耦合器件照相机和Axiovision软件的Zeiss200MAxiovert显微镜)，每6秒收集数据(血小板聚集的荧光图像)，总共持续6-10分钟。为了检测测试物(CLEC-2适体RB587和失活的对照配体RB588)，在加入进口孔前，在RT下将200μL标记的血液与指定浓度的适体(或缓冲液F；以10μL体积)孵育3-5分钟。使用标记图像文件(tiff)格式的图像，来利用Bioflux Montage^TM软件计算荧光强度，然后将数据表导入Microsoft excel，并使用Graphpad Prism(图12A和图12B)作图。

利用包被蛇毒蛋白的表面的实验：

蛇毒蛋白有效地刺激CLEC-2依赖的血小板聚集(实施例7；图9和10)。为了研究流动条件下CLEC-2适体的活性，我们在包被蛇毒蛋白的表面上分析了血小板聚集物的形成。对于流动实验，常规使用Bioflux48孔板(P/N900-0017)。为了用蛇毒蛋白包被，用20mM Tris pH8.0、50mMNaCl缓冲液以5dyn/cm²预处理板5min，然后从进口孔以5dyn/cm²灌注50μg/ml稀释的蛇毒蛋白10min。使用包被纤维状胶原蛋白的板作为对照。为了胶原蛋白包被，用0.02M乙酸以5dyn/cm²预处理板5min，然后从进口孔以5dyn/cm²灌注在0.02M乙酸中的25μg/ml稀释的纤维状胶原蛋白(Chrono-Log P/N385)10min。停止流动，并在室温下孵育板1h。用PBS以5dyn/cm²清洗包被的蛋白10min。通过用5%w/v BSA/PBS(1ml)完全充满进口孔来封闭板，并以5dyn/cm²灌注通道15min。停止流动，并在室温下再孵育板10min。从全部孔中除去过量的PBS BSA，并在室温下保持板，当日使用，或在PBS BSA中4°C保存长达两天。

图12A显示了CLEC-2配体对包被蛇毒蛋白的表面上的血小板聚集的影响的视频静止荧光终点图像，所述包被蛇毒蛋白的表面暴露于流动的全血(A=50μg/mL蛇毒蛋白包被的；B=25μg/mL纤维状胶原蛋白包被的对照；C至F为用50mL蛇毒蛋白包被的，C=3μΜRB587；D=3μΜRB588；Ε=4μΜRB588；和F=4μΜRB587)。图G显示了通过FluxionMontage^TM软件计算的粘附血小板的表面覆盖数据的测量结果。数据表示为在蛇毒蛋白包被的表面上失活突变体RB588的百分比最大响应。如图12A中所示，在全血流动条件下，蛇毒蛋白支持血小板聚集中活化的血小板的积累。RB587，而不是失活的突变体对照RB588，特异性地阻断该活性(图12A，比较图C至D和F至E)。

用可溶性大鼠鼠尾I型胶原蛋白包被的表面的实验：

我们还分析了在流动条件下与未活化的血小板相比，蛇毒蛋白(CLEC-2特异性活化剂)活化的血小板在包被大鼠鼠尾胶原蛋白的表面形成更大的血小板聚集的能力。我们然后在该方法中使用RB587分析了CLEC-2可能的功能。对于该试验，如上所述，用100μg/mL可溶性大鼠鼠尾I型胶原蛋白(Invitrogen；Cat#A10483-01)包被板。用0.02M乙酸以5dyn/cm²预处理板5min，然后从进口孔以5dyn/cm²灌注在0.02M乙酸中的25μg/ml稀释的纤维状胶原蛋白(Chrono-Log P/N385)或100μg/mL可溶性大鼠鼠尾胶原蛋白10min。停止流动，并在室温下孵育板1h。以5dyn/cm²用PBS清洗包被的蛋白10min。通过用5%w/v BSA/PBS(1ml)完全充满进口孔来封闭板，并以5dyn/cm²灌注通道15min。停止流动，并在室温下再孵育板10分钟。从所有孔中移除过量的PBS BSA，在室温下保持板，当日使用，或在PBS BSA中4°C保存长达两天。

图12B显示了CLEC-2配体对包被大鼠鼠尾可溶性胶原蛋白的表面上的血小板聚集的影响的视频静止荧光终点图像，所述包被大鼠鼠尾可溶性胶原蛋白的表面在存在或不存在蛇毒蛋白活化剂处理的条件下暴露于流动的全血(A=25μg/mL纤维状胶原蛋白；B=100μg/mL大鼠鼠尾胶原蛋白；C=100μg/mL大鼠鼠尾胶原蛋白加165nM蛇毒蛋白处理；D=100μg/mL大鼠鼠尾胶原蛋白加缓冲液F；E=100μg/mL大鼠鼠尾胶原蛋白加3μM RB587加165nM蛇毒蛋白处理；F=100μg/mL大鼠鼠尾胶原蛋白加3μΜRB588加165nM蛇毒蛋白处理)。图G显示了通过FluxionMontage^TM软件计算的粘附血小板覆盖数据的测量结果。数据表示为在蛇毒蛋白存在时，在包被大鼠鼠尾胶原蛋白的表面上失活突变体RB588的百分比最大响应。如图12B中所示，与未处理的全血相比，蛇毒蛋白活化剂的存在显著增加附着于包被大鼠鼠尾胶原蛋白表面的血小板聚集尺寸。当全血与RB587预孵育随后通过蛇毒蛋白活化时，血小板聚集尺寸降低至在不存在蛇毒蛋白时用可溶性大鼠鼠尾胶原蛋白可见的基线聚集(图12B-图B、D、E和图G)。失活的突变体对照RB588，对于血小板聚集尺寸无影响(图12B的图F)。

Claims (22)

1.能结合CLEC-2的核酸配体，或者其药学可接受的盐，其中所述配体包含核酸序列，并且其中所述核酸序列形成至少一个茎结构和至少一个环结构。

2.如权利要求1所述的配体，其中所述配体在5’至3’方向包含：

第一茎，其长度是5-10个碱基对；

第一三核苷酸环，其包含序列5’-GNC-3’；

第二茎，其长度是4个碱基对，其中所述第二茎在所述第二茎底部包含摆动配对；以及

第二环，其包含核苷酸序列5’-YUYNNRYU-3’。

3.如权利要求1所述的配体，其中所述核酸序列包含与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少80%一致的序列。

4.如权利要求1所述的配体，其中所述核酸序列包含与SEQ ID NO:24至少80%一致的序列。

5.如前述权利要求中任一项所述的配体，其中所述配体能以范围为大约0.1nM至10nM的解离常数结合CLEC-2。

6.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的配体或其药学可接受的盐。

7.调节剂，其能特异性地结合CLEC-2配体，

其中所述调节剂包含第二核酸序列；并且

其中所述CLEC-2配体包含第一核酸序列。

8.用于治疗CLEC-2介导的疾病的方法，所述方法包括给予有需要的宿主治疗有效量的权利要求1至6中任一项所述的配体或其药学可接受的盐。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述CLEC-2介导的疾病是血小板介导的疾病。

10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述血小板介导的疾病选自血管疾病、心血管疾病、周围血管疾病、脑血管疾病、血小板介导的炎症性疾病、糖尿病相关疾病、癌症和HIV感染。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述血管疾病选自急性冠脉综合征、血栓症、血栓栓塞、血小板减少症、周围血管疾病和短暂性脑缺血发作。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述脑血管疾病选自短暂性脑缺血发作、缺血性卒中和栓塞。

13.如权利要求10所述的方法，其中所述血小板介导的炎症性疾病选自关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、炎症性肠病、强直性脊柱炎和硬皮病。

14.如权利要求10所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、胰腺癌、脑癌、骨癌和肝癌。

15.如权利要求10所述的方法，其中所述糖尿病相关疾病选自糖尿病性视网膜病变、糖尿病血管病变、动脉粥样硬化、缺血性卒中、周围血管疾病、急性肾损伤和慢性肾衰竭。

16.用于确定CLEC-2配体是激活还是抑制CLEC-2依赖的血小板聚集物形成的方法，其包括

(a)将CLEC-2配体与血液样品混合来制备处理的血液样品；

(b)将所述处理的血液样品与促进剂分子接触，其中所述促进剂分子被固定于固体支持物上；

(c)测量接触后的血小板聚集物的形成；以及

(d)将在步骤(c)中检测的血小板聚集物形成的程度与用对照血液样品获得的血小板聚集的程度进行比较，所述对照血液样品没有用于接触所述促进剂分子的CLEC-2配体。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述促进剂分子是CLEC-2活化剂。

18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述促进剂分子是I、II或III型可溶性胶原蛋白，并且其中所述方法还包括向所述血液样品加入蛇毒蛋白。

19.如权利要求16、17或18所述的方法，其还包括在步骤(b)之前将所述处理的血液样品与调节剂分子混合，其中所述调节剂分子能够结合所述调节的配体分子。

20.试剂盒，其包含CLEC-2配体和药用赋形剂。

21.如权利要求20所述试剂盒，其还包含能特异性地结合所述CLEC-2配体的调节剂。

22.试剂盒，其包含能特异性地结合CLEC-2配体的调节剂。

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