CN102459599A - 糖蛋白vi的核酸调节剂 - Google Patents

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Abstract

本发明一般而言涉及调节血小板生物学的药理学系统，所述系统基于可与血小板糖蛋白GPVI结合并调整其活性以调节血小板功能的核酸配体。使用调节剂，这些核酸配体也是活性可逆的，所述调节剂抑制所述核酸配体的活性以中和该药理作用并因此恢复GPVI功能，包括胶原结合、血小板粘附、胶原诱导的血小板激活和胶原诱导的血小板聚集。本发明还涉及包含所述核酸配体的组合物、包含所述配体和调节剂的组合物，产生所述核酸配体及其调节剂的方法，并涉及在药物治疗和诊断过程中使用这些试剂和组合物的方法。

Description

糖蛋白VI的核酸调节剂
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年6月3日申请的美国临时专利申请号61/183,847和于2010年2月3日申请的美国临时专利申请号61/300,951的优先权，其内容通过引用全部结合到本文中。
技术领域
本发明一般而言涉及抗血小板药理学系统，所述系统包含与血小板特异性蛋白糖蛋白VI(GPVI)结合并调节其活性的核酸配体。使用抑制所述核酸配体的活性以中和其药理作用并因此恢复GPVI功能的调节剂，这些核酸配体也是活性可逆的。本发明还涉及包含核酸配体和/或调节剂的组合物以及使用这些试剂和组合物治疗血小板介导的疾病和病症的方法。
背景
血小板是小的无核血细胞，其在正常条件下相当静止，但通过粘附、激活、聚集和血栓形成而立即响应血管损伤。血小板的主要功能是在组织创伤和内皮下基质暴露后阻止血液损失。众所周知的是，血管破坏可将胞外基质组分暴露给血液，尤其是冯维勒布兰德因子(vonWillebrand factor，VWF)、胶原、纤连蛋白、血小板反应蛋白和层粘连蛋白。血小板与这些暴露分子之间的相互作用导致血小板细胞的激活。
尽管早就知道血小板在止血和血栓形成中具有主要作用，但是也逐渐认识到血小板可能在各种各样的其它病症(例如炎症、肿瘤生长和转移、以及免疫宿主防御)中也起到重要作用。因此，血小板受体蛋白是用于调节血小板功能以作为治疗或预防血小板介导病症的方法的引人关注的靶标。
糖蛋白VI(GPVI)是特别引人关注的靶标，因为它是在血小板上特异性表达的跨膜蛋白。具有胞外暴露的细胞特异性分子同时提供对治疗部分的可接近性和最小(如果有的话)有害副作用的潜力，因为表达概况有限。
糖蛋白VI (GPVI)是主要的血小板信号转导胶原受体，显示在产生介导血小板激活的胞内信号中起作用(Watson等，Platelets，2000，11：252-258)。GPVI是Ig超家族的62-65 kDa糖蛋白，由含有胶原结合结构域的2个Ig C2环组成，其代表潜在的药物靶点。该蛋白在体内被极高度糖基化和唾液酸化，并且在外Ig-C2-样结构域上发现单一糖基化位点。作为免疫球蛋白超家族成员，GPVI与天然杀伤受体有关。其信号转导可间接通过FcR的γ-链或直接通过GPVI胞质结构域来介导。FcRγ-链含有基于免疫受体酪氨酸的激活模体，并协同非酪氨酸激酶SYK和衔接子LAT和LCP2导致磷脂酶C2和相关胞内信号转导途径的激活(Lankhof等，Thromb Haemost，1996，75：950-958)。
已经知道GPVI在血块形成相关的生理及临床事件中的重要性并得到GPVI水平与急性冠状动脉综合征(ACS)和中风事件发作的流行病学相关的支持(Bigalke等，American Heart Journal，2008，156：193-200；Bigalke等，European Journal of Neurology，2009，101：911-915)，以及在GPVI缺陷小鼠中证明的血栓形成抗性的支持(Denis等，Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular Biology，2007，27：728-739)。此外，Gawaz等人已经证明放射性标记的GPVI可用于小鼠血管性损害的闪烁成像，因为它与损伤区特异性结合，这表明在这些部位的胶原被暴露(Thromb Haemost.，2005，93：910-913)。Penz等人(FASEB J.2005，19：898-909)已经证明患有颈动脉狭窄的患者的人粥样斑块含有能够激活血小板的胶原I型和III型结构。此外，对GPVI的阻断或GPVI的不存在能够预防血栓形成，而对α2β1的阻断则几乎无效。同样，用抗胶原的抗体阻断胶原或用胶原酶降解胶原也可预防血栓形成。
新近，已经知道GPVI在血小板功能障碍和异常胶原表达相关病症中起到更广泛作用。这部分地因为以下事实：血小板在例如血栓形成的情况下在血管损伤后的粘附中，以及在各种各样的炎性介质和细胞因子的释放中都起作用。此外，在血小板与血管损伤部位反应之后，随后的血小板激活导致细胞因子和其它调节分子的释放。因此，尽管可能看起来血小板异常激活相关病症是多样的，但这些病症都与其对血小板功能的依赖性相关。因此，抑制或预防血小板激活可提供有价值的治疗效果。
血小板介导的病症包括血管病以及高危糖尿病相关的各种病症。已证明由血小板介导的炎性病症包括炎性关节炎疹和硬皮病。早就知道炎症和白细胞活性在炎性关节病中的作用。新近，已经鉴定了发炎关节的滑液中存在血小板(Boilard等，Science，2010，327：580-583)。此外，已经证明在罹患炎性关节炎患者的关节液中的血小板微粒是促炎的，通过IL-1引发滑液成纤维细胞的细胞因子应答。药理和遗传方法都证明GPVI在关节炎中的这种血小板促炎特性中起到关键作用。
已证明与血小板表面上GPVI表达相关的其它病症包括实验性肿瘤转移(Jain等，J.Thromb Haemostasis，2009，7：1713-1717)、糖尿病(Cabeza等，2004，53：2117-2121)和丙肝病毒感染(Zahn等，Diabetes，2004，53：2117-2121)。
尽管已经证明GPVI在血小板功能和相关生理疾病中的扩大作用，但发现和开发该受体的拮抗剂的工作仍是有限的。抗血小板疗法的强度及持续时间的活性控制或调节可提供显著临床益处。因此，本领域仍然需要经设计用于特异性靶向GPVI蛋白并调节其功能的调节剂。
发明概述
本文描述涉及与糖蛋白VI(GPVI)特异性结合的核酸配体的组合物，使用与糖蛋白VI(GPVI)特异性结合的核酸配体及其调节剂的方法和治疗。
一方面，提供GPVI配体，其中所述配体包含分离的核酸序列。在另一个实施方案中，至少一个核苷酸是核糖核苷酸。在另一个实施方案中，至少一个核苷酸是脱氧核糖核酸。在再一个实施方案中，分离的核酸序列GPVI配体包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。
在一个实施方案中，核酸GPVI配体包含二级结构，其包含1、2或3个茎和1、2、3或4个环。
在一个实施方案中，GPVI配体包含二级结构，其中所述二级结构在5’-3’方向上包含第1茎区、第1环区、第2茎区、第2环区、第3环区、第3茎区和第4环区。在另一个实施方案中，GPVI配体在5’-3’方向上基本上由第1茎区、第1环区、第2茎区、第2环区、第3环区、第3茎区和第4环区组成。
在一个实施方案中，将核酸GPVI配体二级结构设计为在5’-3’方向上的第1茎、第1环、与第2环和与第3环连接的第2茎、与第3环和与第4环连接的第3茎、和第4环。在一个实施方案中，第2茎与第1、第2和第3环连接。
在一个实施方案中，核酸GPVI配体的第4环包含由UAA组成的第1共有序列。在另一个实施方案中，第4环包含由(G/A)UAA组成的序列。
在一个实施方案中，第3茎包含由G-C碱基对后接C-G碱基对组成的序列。
在一个实施方案中，核酸GPVI配体包含GC(G/A)UAAGC。在另一个实施方案中，核酸配体的第3茎和第4环包含GC(G/A)UAAGC。在又一个实施方案中，核酸配体的第3茎和第4环包含选自GCAUAAGC和GCGUAAGC的序列。
在一个实施方案中，第3环包含序列YD，其中Y是嘧啶，D不是胞嘧啶。在另一个实施方案中，第3环包含序列YU、YG或YA。在再一个实施方案中，第3环包含序列UU、UG、UA、CU、CG或CA。在另一个实施方案中，第3环由序列YD组成。
在一个实施方案中，第1环包含序列GAC。
在一个实施方案中，分离的核酸GPVI配体序列的长度为约20个核苷酸(nt)至约50nt，约20nt至约45nt，约20nt至约40nt，约20nt至约35nt，约20nt至约30nt，或约30nt至约35nt。
在一个实施方案中，GPVI配体包含选自SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：15的分离的核酸序列。在另一个实施方案中，GPVI配体包含选自SEQ ID NO：28至SEQ ID NO：33的分离的核酸序列。在再一个实施方案中，GPVI配体包含选自EF-1-RNA、EF-2-RNA、EF-3-RNA、E2-6-RNA、EF-22-RNA和EF-31-RNA的分离的RNA核酸序列。在另一个实施方案中，GPVI配体包含选自EF-1-修饰的、EF-2-修饰的、EF-3-修饰的、E2-6-修饰的、EF-22-修饰的和EF-31-修饰的分离的RNA核酸序列。在另一个实施方案中，GPVI配体包含这样的分离的核酸序列：其与选自SEQ ID NO：28至SEQ ID NO：33的序列具有至少80％同一性。
在一个实施方案中，GPVI配体选自RB424、RB426、RB427、RB428、RB429、RB430、RB445、RB446、RB447、RB431、RB432、RB433、RB434、RB435、RB436、RB439、RB440、RB441、RB442、RB443和RB444。
在一个实施方案中，GPVI配体选自RB448、RB452、RB453、RB455、RB460、RB462、RB466、RB478、RB480、RB488、EB490、RB491、RB492、RB493、RB495、RB496、RB497、RB498、RB499、RB500、RB502、RB503、RB504、RB505、RB506、RB507、RB508、RB517、RB518、RB519、RB520、RB521、RB522、RB523、RB524、RB525、RB526、RB527、RB528、RB531、RB532、RB533、RB534、RB535、RB536、RB537、RB538、RB540、RB541、RB542、RB546、RB547、RB548、RB549、RB550、RB551、RB552、RB553、RB554、RB555、RB556、RB560、RB561、RB566、RB567、RB569、RB570、RB571。
在一个实施方案中，GPVI配体的分离的核酸序列包含一个或多个核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的混合物。
在一个实施方案中，分离的核酸GPVI配体序列的一个或多个核苷酸是经修饰的。在另一个实施方案中，一个或多个核苷酸包含在2’羟基位置上的修饰。在另一个实施方案中，修饰选自2’-O-甲基和2’-氟代。在又一个实施方案中，一个或多个核苷酸是2’-O-甲基胞嘧啶、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基腺苷或2’-O-甲基鸟苷。在再一个实施方案中，一个或多个核苷酸是2’氟胞苷或2’氟尿苷。
在一个实施方案中，包含修饰的一个或多个核苷酸选自5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤(xantine)、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基-O-甲基硫代尿苷、5-羧基甲基氨基-O-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、6-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基-O-甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-O-甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶氧乙酸(v)、butoxosine、假尿嘧啶、辫苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶氧乙酸(v)、5-甲基硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧基丙基)尿苷、(acp3U)和2，6-二氨基嘌呤。
在一个实施方案中，GPVI配体包含至少一个经修饰的糖部分。
在一个实施方案中，GPVI配体包含至少一个经修饰的磷酸主链。
在一个实施方案中，分离的核酸GPVI配体序列在其3’端包含反向胸腺嘧啶。
在一个实施方案中，核酸GPVI配体包含间隔基(spacer)。在另一个实施方案中，间隔基是二醇间隔基。在另一个实施方案中，核酸GPVI配体的第2环包含二醇间隔基。在又一个实施方案中，核酸GPVI配体的第2环由二醇间隔基组成。在再一个实施方案中，二醇间隔基由9-O-二甲氧基三苯甲基-三甘醇，1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺的掺入提供。在又一个实施方案中，二醇间隔基连接在分离的核苷酸GPVI配体序列的第一内部核苷酸的3’端并连接在分离的核苷酸GPVI配体序列的与第1内部核苷酸相邻的第2内部核苷酸的5’端。
在一个实施方案中，核酸GPVI配体包含脂族氨基接头。在另一个实施方案中，脂族氨基接头连接在分离的核酸GPVI配体序列的5’端。在又一个实施方案中，脂族氨基接头连接在分离的核酸GPVI配体序列的3’端。在再一个实施方案中，脂族氨基接头通过6-(三氟乙酰氨基)己醇(2-氰基乙基-N，N-二异丙基)亚磷酰胺的掺入提供。
在一个实施方案中，分离的核酸GPVI配体与至少一个亲水性部分连接。在另一个实施方案中，至少一个亲水性部分是聚亚烷基二醇。
在一个实施方案中，GPVI配体包含与分离的核酸序列的5’端和/或3’端连接的聚亚烷基部分。在另一个实施方案中，聚亚烷基部分通过接头而连接。在又一个实施方案中，接头是脂族氨基接头。
在一个实施方案中，使用六碳氨基接头，将GPVI配体与40KD聚乙二醇(PEG)部分连接。在另一个实施方案中，六碳氨基接头是通过酰胺连接而与PEG部分连接。在又一个实施方案中，PEG部分是与一个或多个氨基酸例如赖氨酸连接的2个20 KD的PEG部分，其通过酰胺键与六碳氨基接头连接。
在一个实施方案中，第1核酸GPVI配体包含硫代磷酸酯键。
在一个实施方案中，核酸GPVI配体与GPVI(SEQ ID NO：1)特异性结合。在另一个实施方案中，核酸GPVI配体与GPVI的胞外结构域(SEQ ID NO：2)特异性结合。
在一个实施方案中，GPVI配体的解离常数为约20纳摩尔浓度(nM)或更小。
在一个实施方案中，GPVI配体的解离常数范围为约400皮摩尔浓度(pM)至约10nM。
在一个实施方案中，GPVI配体的解离常数范围为约100pM至约10nM。
在一个实施方案中，核酸GPVI配体抑制GPVI与胶原结合。在另一个实施方案中，核酸GPVI配体通过GPVI抑制胞内信号转导。在另一个实施方案中，使用GPVI配体通过GPVI对胞内信号转导的抑制包括减少肌醇三磷酸的产生或抑制胞内钙水平的波动。
在一个实施方案中，核酸GPVI配体抑制GPVI与胶原相关肽(CRP)和/或与convulxin结合。
在一个实施方案中，核酸GPVI配体抑制GPVI与胶原和CRP二者结合。
在一个实施方案中，核酸GPVI配体抑制GPVI与胶原结合，但不抑制GPVI与CRP结合。在另一个实施方案中，核酸GPVI配体抑制GPVI与胶原和CRP二者结合，但不抑制GPVI与convulxin结合。
在一个实施方案中，核酸GPVI配体与GPVI的结合使GPVI的活性构象稳定。在另一个实施方案中，核酸GPVI配体与GPVI的结合使GPVI的失活构象稳定。在又一个实施方案中，核酸GPVI配体与GPVI的结合抑制GPVI与FcRγ亚基间的相互作用。
在另一个实施方案中，GPVI配体与GPVI的结合导致GPVI活性受抑制或降低。在又一个实施方案中，GPVI配体与GPVI的结合导致GPVI不能与FcRγ-链相互作用或与FcRγ-链相互作用能力下降。在再一个实施方案中，GPVI配体与血小板表面上表达的GPVI的结合导致血小板粘附受抑制或降低。在再一个实施方案中，GPVI配体与血小板表面上表达的GPVI的结合导致血小板激活受抑制或降低。在再一个实施方案中，GPVI配体与血小板表面上表达的GPVI的结合导致血小板聚集受抑制或降低。
在一个实施方案中，GPVI配体与多种GPVI结合并降低或抑制其功能，其中所述GPVI变体与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在一个实施方案中，GPVI配体对GPVI的解离常数(“Kd”)小于约100微摩尔浓度(μM)、小于约1μM、小于约500纳摩尔浓度(nM)、小于约100nM、小于约50nM、小于约1nM、小于约500皮摩尔浓度(pM)、小于约300pM、小于约250pM或小于约200pM。
第二方面，提供GPVI配体的调节剂，其中所述调节剂部分地或完全地逆转GPVI配体的活性。
在一个实施方案中，调节剂包含分离的核酸序列。在另一个实施方案中，调节剂包括DNA序列、RNA序列、多肽序列或其任何组合。
在一个实施方案中，GPVI核酸配体调节剂选自核酶、DNA酶、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸(MNA)和锁定核酸(LNA)。
在一个实施方案中，GPVI核酸配体调节剂选自核酶、DNA酶、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸(MNA)和锁定核酸(LNA)，其中所述调节剂与至少部分的GPVI核酸配体特异性结合或与之相互作用。
在一个实施方案中，调节剂选自核酸结合蛋白或肽、小分子、寡糖、核酸结合脂质、聚合物、纳米粒和微球体，其中所述调节剂与至少部分的GPVI核酸配体结合或与之相互作用。
在一个实施方案中，调节剂是包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的混合物的核酸调节剂。在另一个实施方案中，核酸调节剂包含至少一个经修饰的脱氧核糖核苷酸和/或至少一个经修饰的核糖核苷酸。
在一个实施方案中，调节剂是与至少部分的GPVI核酸配体互补的寡核苷酸。在另一个实施方案中，调节剂是与GPVI配体中的至少部分的环互补的寡核苷酸。在另一个实施方案中，调节剂是与核酸GPVI配体的至少第1环、第2茎和第2环互补的寡核苷酸。在另一个实施方案中，调节剂是与GPVI配体的第3环、第3茎、第4环和第1茎互补的寡核苷酸。
在一个实施方案中，调节剂包含分离的核酸序列，其中所述序列的长度为约10nt至约30nt、约10nt至约25nt、约10nt至约20nt、约10nt至约15nt或约15nt至约20nt。
在一个实施方案中，核酸调节剂序列的一个或多个核苷酸是经修饰的。在另一个实施方案中，一个或多个核苷酸包含在2’羟基位置上的修饰。在另一个实施方案中，修饰选自2’-O-甲基和2’-氟代。在又一个实施方案中，一个或多个核苷酸是2’-O-甲基胞嘧啶、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基腺苷、2’-O-甲基鸟苷或2’-O-甲基胸苷。在再一个实施方案中，一个或多个核苷酸是2’氟胞苷、2’氟尿苷、2’氟腺苷或2’-氟鸟苷。
在一个实施方案中，核酸调节剂的一个或多个核苷酸的修饰包括选自以下的修饰：5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基-O-甲基硫代尿苷、5-羧基甲基氨基-O-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、6-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基-O-甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-O-甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶氧乙酸(v)、butoxosine、假尿嘧啶、辫苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶氧乙酸(v)、5-甲基硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧基丙基)尿苷(acp3U)和2，6-二氨基嘌呤。
在一个实施方案中，调节剂包含至少一个经修饰的糖部分。
在一个实施方案中，调节剂包含至少一个经修饰的磷酸主链。
在一个实施方案中，调节剂包含在生理条件下与GPVI配体的第4环杂交的寡核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸调节剂包含序列3’-AUU-5’。
在一个实施方案中，调节剂包含在生理条件下与GPVI配体的第1环杂交的寡核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸调节剂包含序列3’CUG-5’。
在一个实施方案中，调节剂包含选自SEQ ID NO：74-88的序列。在另一个实施方案中，调节剂选自RB416、RB417、RB418、RB419、RB420、RB421、RB422、RB423、RB513、RB514、RB515、RB516、RB543、RB544和RB545。
在一个实施方案中，调节剂破坏核酸GPVI配体的二级结构。在另一个实施方案中，调节剂使GPVI配体的二级结构稳定。
在一个实施方案中，调节剂破坏核酸GPVI配体的三级结构。在另一个实施方案中，调节剂使GPVI配体的二级结构稳定。
在一个实施方案中，调节剂与GPVI配体的结合，暴露了GPVI配体内的自杀位置(suicide position)，因而破坏了GPVI配体的二级结构并导致核酸GPVI配体被核酸酶的破坏增加。
在一个实施方案中，调节剂与GPVI配体-GPVI复合物的结合，降低或消除了GPVI配体与GPVI的结合。
另一方面，提供调节GPVI配体活性的方法。
在一个实施方案中，提供调节核酸配体对GPVI的活性的方法，即通过将GPVI配体调节剂给予已被给予核酸GPVI配体的宿主。在一个实施方案中，调节剂可以是寡核苷酸调节剂或其衍生物，而在某些实施方案中，调节剂与部分的核酸GPVI配体互补。
又一方面，提供了使用GPVI配体来调节GPVI功能的方法。
在一个实施方案中，用于调节GPVI功能的方法包括给予宿主治疗有效量的GPVI配体。在另一个实施方案中，所述方法还包括将GPVI配体调节剂给予宿主。
另一方面，提供治疗或改善血小板介导的疾病或病症的方法。
在一个实施方案中，所述方法包括给予有需要的宿主治疗有效剂量的与GPVI结合的GPVI配体。在另一个实施方案中，所述宿主是经诊断患有高危糖尿病。在再一个实施方案中，所述宿主是经诊断患有转移高危癌症。
在一个实施方案中，血小板介导的疾病或病症选自脑血管疾病、急性冠状动脉综合征、糖尿病相关疾病、自身免疫炎性疾病和癌症。
在一个实施方案中，所述脑血管疾病是血栓形成、血栓栓塞或短暂性缺血发作(TIA)。在另一个实施方案中，急性冠状动脉综合征是因为冠状动脉血栓形成、不稳定型心绞痛或心肌梗死。在再一个实施方案中，糖尿病相关疾病是糖尿病性视网膜病、糖尿病性血管病、动脉粥样硬化、缺血性发作、外周血管病、急性肾损伤或慢性肾衰竭。在另一个实施方案中，自身免疫炎性疾病是硬皮病、类风湿性关节炎或选自银屑病性关节炎、反应性关节炎、炎性肠病和强直性脊柱炎的炎性自身免疫病。在一个实施方案中，癌症选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、骨癌和肝癌。
在一个实施方案中，给予GPVI配体是通过：胃肠外给予、静脉内注射、皮内递送、关节内递送、滑液内递送、鞘内、动脉内递送、心内递送、肌内递送、皮下递送、眼眶内递送、囊内递送、脊柱内递送、胸骨内递送、局部递送、透皮糊剂递送、直肠递送、借助阴道或尿道栓剂递送、腹膜递送、经皮递送、借助鼻腔喷雾递送、借助手术植入递送、借助内用外科涂剂(internal surgical paint)递送、借助输注泵递送或借助导管递送。
另一方面，提供通过给予GPVI配体治疗有需要的宿主的方法，其中GPVI配体调节血小板功能。
在一个实施方案中，给予治疗有效剂量的GPVI。
在一个实施方案中，治疗有效剂量降低或抑制血小板粘附和/或聚集。
一方面，提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的与GPVI结合的核酸GPVI配体。
一方面，提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的调节剂，其中调节剂调节与GPVI结合的核酸GPVI配体的活性。
在一个实施方案中，药物组合物包含GPVI配体和药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，药物组合物是适于静脉内注射的液体。在又一个实施方案中，药物组合物是适于皮下注射的液体或分散体。
一方面，提供一种药盒，其包含治疗有效量的GPVI核酸配体和/或调节GPVI核酸配体的活性的调节剂。
附图简述
图1是SELEX核酸配体选择方法图。
图2显示用于进行SELEX循环以鉴定针对GPVI的核酸配体的选择条件。
图3显示富含针对GPVI的核酸配体的痕量32P末端标记的文库的结合曲线。
图4A-B显示在“E/F”选择系列中在10轮选择后的各克隆和在“E2”选择系列中在10轮选择后的各克隆的经鉴定的第一随机区(primary random region)衍生序列。
图5显示在选择过程中鉴定的序列的GPVI结合所需的最小预测基本序列(primary sequence)和预测保守二级结构。“L”是指环，“S”是指茎区。
图6是EF-3 GPVI配体与GPVI的结合图，将3’引物退火到EF-3从而在蛋白相互作用期间掩蔽EF-3的3’固定区或不退火。
图7是比较GPVI的截短配体与原始GPVI配体EF-2和EF-3的结合曲线图。
图8显示若干截短的EF-3和EF-31 GPVI配体截短变体的序列和预测二级结构。
图9显示截短序列EF-3 T2和EF-2 T2 GPVI配体的预测二级结构和失活点突变的位置。
图10显示GPVI核酸配体变体的GPVI结合测定结果。
图11显示不同GPVI核酸配体的预测二级结构和糖取代。
图12显示GPVI核酸配体变体的GPVI结合测定结果。
图13A-B显示六甘醇间隔基亚磷酰胺和间隔基亚磷酰胺掺入到核酸序列的两个核苷酸之间。
图14A-B显示可通过接头与GPVI配体缀合的PEG部分和缀合部分的构型。
图15是比较EF-2和EF-3的GPVI配体截短变体与含有失活点突变的变体的胶原诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。
图16是不同浓度的选择GPVI核酸配体的胶原诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。
图17显示不同浓度的选择GPVI核酸配体的CRP诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。
图18显示不同浓度的选择GPVI核酸配体的胶原诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。
图19显示不同浓度的选择GPVI核酸配体的CRP诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。
图20显示在富含血小板的血浆中，不同浓度的GPVI配体RB571下的胶原和CRP诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。
图21是GPVI核酸配体在暴露给流动的全血的胶原包被表面上对血小板积累的影响的图，以失活对照配体的最大响应％来表示。
图22显示表明GPVI配体RB571对GPVI的结合特异性与血小板受体P2Y1、P2Y12和PAR-1相比较的图。
图23显示表明GPVI配体RB571对GPVI的结合特异性与血小板受体GP1bα-vWF相互作用或血小板血栓烷A2受体相比较的图。
图24显示截短序列GPVI配体EF2-T2和EF3-T2的预测二级结构以及配体与GPVI配体调节剂RB416-423之间的互补性区域。
图25显示GPVI配体EF2-T2单用或与不同浓度的不同GPVI配体调节剂联用的胶原诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。
图26显示GPVI配体EF3-T2单用或与不同浓度的不同GPVI配体调节剂联用的胶原诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。
图27显示GPVI配体RB490单用或与不同浓度的不同GPVI配体调节剂联用的胶原诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。
图28显示表明用GPVI配体调节剂RB515对GPVI核酸配体RB490的抗GPVI活性的逆转持久性的图。
图29显示GPVI配体RB571的预测二级结构及其与GPVI配体调节剂RB515的预测相互作用。
图30显示GPVI配体RB571单用或与不同浓度的GPVI配体调节剂RB515联用的胶原诱导的和CRP诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。
图31显示在富含血小板的血浆中，GPVI配体RB571单用或与GPVI配体调节剂RB515联用的胶原诱导的和CRP诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。
发明详述
本发明提供与血小板膜糖蛋白VI(GPVI)结合的核酸配体的药物组合物、配体调节剂和将其用于治疗血小板介导的疾病和病症的方法。还提供包含GPVI核酸配体和/或GPVI配体调节剂的药物制剂。
A.定义
本文所用的术语“约”当用于可测值例如重量、时间、剂量等的量时，是指包括指定量的±20％或±10％、±5％、±1％或±0.1％的变异，因为这样的变异适于进行所公开的方法。
“核酸配体”在本文中也称为“配体”或“适配体”，是可形成三级结构的核酸，这可允许它与靶分子相互作用。“GPVI核酸配体”或“GPVI配体”或“抗GPVI配体”或“核酸GPVI配体”是指与GPVI特异性结合的配体或适配体。这些术语是指具有在生理环境中能与预期靶分子形成复合物的特异性结合区的寡核苷酸。配体与靶分子结合的亲和力是根据配体与靶分子间相互作用的解离常数(Kd)来定义的。通常，配体对其靶标的Kd介于约1nM至约100nM之间。结合特异性按照配体对靶标的比较解离常数相对于配体与环境中的其它材料或对普通的无关分子的解离常数来定义。通常，配体对靶标的Kd与对环境中的无关材料或伴随材料的Kd相比减小10倍、50倍、100倍或200倍。
“配体调节剂对”或“配体调节剂对”是指包括靶分子的指定配体和能改变配体的二级和/或三级结构而使配体与其靶标间的相互作用被调节的配体调节剂。调节剂可以是与部分的配体互补的寡核苷酸。在生理条件下调节剂可改变配体构象，以使配体的靶结合能力降低10％至100％、20％至100％、25％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或10％至100％范围内的任何百分率。
“调节剂(mudulator)”、“解毒剂(antidote)”、“调节剂(regulator)”或“控制剂(control agent)”是指可与本文所述的配体或适配体结合并以所需方式改变该配体与其靶分子间相互作用(例如通过改变配体结构)的任何药学上可接受的物质。
本文所用的术语“调节”是指活性降低、增加或某些其它可测量的变化。
本文所用的术语“药学上可接受的”是指经联邦或州政府管理部门批准的或列于美国药典或其它公知的药典中用于人类的。
药物有效剂量是预防、抑制发病或治疗疾病状态(在某种程度上减轻症状)所需的剂量。药物有效剂量取决于疾病类型、所用组合物、给药途径、所治疗哺乳动物的类型、所考虑的指定哺乳动物身体特点、同时使用的药物和药学领域技术人员将会了解的其它因素。通常，按照核酸配体和调节剂的效能给予0.1mg/kg至100mg/kg体重/天的活性成分的量。
“稳定的核酸分子”是指与未稳定的核酸分子相比，在体内更不容易降解(例如通过外切核酸酶或内切核酸酶)的核酸分子。稳定可由长度和/或二级结构和/或寡核苷酸主链的磷酸部分的糖中所含化学取代决定。可通过控制例如可使分子稳定的二级结构而达到稳定。例如，如果核酸分子的3′端与上游区互补，该部分就可以向回折叠并形成可使分子稳定的“茎环”结构。
术语“结合亲和力”和“结合活性”是指配体分子与靶标结合与否的趋势。所述相互作用的能量学在“结合活性”和“结合亲和力”中是重要的，因为它们限定了相互作用伴侣的必要浓度、这些伴侣能缔合的速率、以及溶液中结合分子和游离分子的相对浓度。能量学可尤其通过测定解离常数Kd表征。
本文所用的术语“治疗”是指对哺乳动物疾病的任何治疗，包括：(a)针对疾病的保护作用，也就是说，使临床症状不发展；(b)抑制疾病，也就是说，终止、改善、减少或抑制临床症状的发展；和/或(c)减轻疾病，也就是说，使临床症状消退。本领域技术人员将会理解在人用药物中，并非总能区分“预防”和“抑制”，因为直到事件发生良久之后，最终诱导的事件也可能是未知的、潜伏的，或患者不可查明。因此，本文所用的术语“预防”旨在作为“治疗”的要素，包括“预防”和“抑制”，如本文所定义。本文所用的术语“保护”是指包括“预防”。
术语“有效量”是指足以对待治疗病症或疾病状态提供治疗的剂量。这会因患者、疾病和待进行的治疗而异。
本文所用的术语GPVI核酸配体“变体”包括能行使与GPVI核酸配体基本相同功能并包含基本相同结构的变体。
B.糖蛋白VI
糖蛋白VI(GPVI)在血小板细胞表面上特异性表达。大量研究表明，胶原介导的GPVI的激活在血小板粘附和聚集中起到关键作用。因此，GPVI是令人日益关注的用于治疗血小板和胶原介导的疾病的治疗靶标。
因为生理止血与病理血栓形成间的边界非常窄，所以对于胶原介导的GPVI激活而言能够提供对血小板活性的良好控制是必要的。因此，本文也提供能够调节或调整所公开的GPVI配体的活性的调节剂成分。
GPVI是长度为339个氨基酸残基的糖蛋白(GenBank检索号Q9HCN6；在本文中公开为SEQ ID NO：1)。氨基酸残基1-20代表信号序列，其被切割而产生具有319个氨基酸的成熟蛋白。GPVI具有2个胞外免疫球蛋白结构域、粘蛋白样核心、短肽接头序列、跨膜结构域和与Fyn和Lyn Src家族激酶结合的短胞质尾。也可将GPVI与FcRγ-链组成型地复合，允许装配和激活Syk并启动与免疫受体所用的途径具有许多相似性的下游信号转导途径的激活。在人类染色体19上的白细胞受体簇(LRC)中发现编码GPVI的基因。没有GPVI或FcR γ-链的小鼠具有明显受损的针对胶原的血小板响应并降低血栓形成。另外，新的单克隆抗人GPVI抗体的Fab片段OM4在大鼠血栓形成模型中体内抑制血栓形成，在用GP IIb/IIIa抗体时可见出血时间没有延长。
已经知道GPVI胞外结构域(SEQ ID NO：2)与胶原I-IV型特异性结合(Jung等，Platelets，2008，19：32-42)。此外，已知胶原I-IV型支持血小板激活、聚集和粘附，而非纤维状胶原VI、VII和VIII型则仅导致微弱粘附，却不导致血小板聚集。因此，进行研究以鉴定与GPVI胞外结构域结合的GPVI配体，以产生可用于治疗血小板介导的病症或疾病的药物制剂。
C.针对GPVI的核酸配体的开发
使用SELEX方法，鉴定与GPVI蛋白特异性结合的核酸配体。再对最初通过SELEX获得的配体进行充分表征，以了解GPVI配体的特性。这样的表征包括测序、测定保守序列的序列比对、二级结构预测、以及鉴定对特异性结合和抑制GPVI所需功能最重要的配体区的截短和突变分析。在鉴定最佳配体序列和二级结构之后，进行修饰以优化配体，用于药物用途。这些修饰的实例包括PEG化、在核酸配体内使用间隔基以及对核酸配体的糖和磷酸部分的所选修饰。进行结合测定，以监测所用不同修饰所导致的配体功能。
SELEX是指通过指数富集的配体系统进化。该方法允许与靶分子高度特异性结合的核酸分子的体外进化。该SELEX方法描述于例如美国专利号7,087,735、5,475,096和5,270,163(亦见WO 91/19813)。
SELEX方法包括从候选寡核苷酸混合物中选择并且使用同样的通用选择方案，逐步重复结合、区分和扩增，从而真正达到任何所需的结合亲和力和选择性的标准。从核酸混合物例如包含随机化序列区段的混合物开始，SELEX方法包括以下步骤：在利于结合的条件下使混合物与靶标接触，将已与靶分子特异性结合的那些核酸与未结合核酸区分开，使核酸靶标复合物解离，将从核酸靶标复合物中解离出的核酸扩增以得到配体富集的核酸混合物，再通过所需要的多轮循环重复结合、区分、解离和扩增的步骤以便得到对靶分子具有高特异性、高亲和力的配体。
已经对基本SELEX方法进行改良，以达到各种特定目的。例如，美国专利号5,707,796描述了使用SELEX以及凝胶电泳，以选择具有特定结构特征的核酸分子，例如弯曲DNA。美国专利号5,763,177描述了基于SELEX的方法，用于选择含有光反应性基团并能与靶分子结合和/或与之光交联和/或将其光激活的配体。美国专利号5,580,737描述了鉴定能区分密切相关分子的高度特异性配体的方法，称为反向SELEX(Counter-SELEX)。美国专利号5,567,588和5,861,254描述了基于SELEX的方法，所述方法实现了对靶分子具有高亲和力和低亲和力的寡核苷酸的高效区分。美国专利号5,496,938描述了在进行SELEX方法之后获得改善的配体的方法。美国专利号5,705,337描述了使配体与其靶标共价交联的方法。
美国专利号5,648,214证明了在溶液中鉴定针对小肽的核酸配体的可行性。美国专利号5,780,228举例说明了使用配体亲和洗脱而产生靶向靶分子上的特定位点的配体的能力，其涉及结合某些凝集素的高亲和力配体的产生。制备针对某些组织(其包括多类细胞类型)的核酸配体的方法描述于美国专利号6,127,119。针对小牛肠磷酸酶的某些经修饰的高亲和力配体的制备描述于美国专利号6,673,553。美国专利号6,716,580描述了鉴定核酸配体的自动化方法，其包括使用机器人操作器。
按照其最基本形式，SELEX方法可定义为以下一系列步骤：
1)制备不同序列的候选核酸混合物。候选混合物通常包含固定序列区(即候选混合物的每个成员在相同位置中含有相同序列)和随机序列区。选择固定序列区是为了：(a)有助于下述扩增步骤，(b)模拟已知与靶标结合的序列，或(c)在候选混合物中提高核酸的给定结构排列的浓度。随机序列可以是完全随机(即在任何位置找到碱基的概率是1/4)或仅部分随机(例如在任何位置找到碱基的概率可选择在介于0至100％之间的任何水平)。
2)在利于靶标与候选混合物成员结合的条件下，使候选混合物与所选靶标接触。在这些情况下，靶标与候选混合物核酸间的相互作用可视为在靶标与对靶标具有最强亲和力的那些核酸之间形成核酸-靶标复合物。
3)将对靶标具有最高亲和力的核酸与对靶标具有较低亲和力的那些核酸区分开。因为仅有对应于最高亲和力核酸的极少量序列(且可能仅一分子核酸)存在于候选混合物中，所以通常需要设定区分标准，使得在区分期间在候选混合物中保留显著量的核酸(大约5-50％)。
4)再对区分期间所选的对靶标具有相对高亲和力的那些核酸进行扩增，以产生新的候选混合物，其中富集了对靶标具有相对高亲和力的核酸。
5)通过重复以上区分和扩增步骤，新形成的候选混合物含有越来越少的弱结合序列，核酸对靶标的亲和力的平均程度通常将会上升。直到最后，SELEX方法将会从原始候选混合物中得到含有代表那些核酸序列的一个或少量独特核酸(其折叠成使能与靶分子具有最高亲和力相互作用的特定的二级和三级结构)的候选混合物。
SELEX可用于产生二价结合，其具有对蛋白(包括受体)的两个或更多表位具有亲和力的两个或更多结合结构域。具体地讲，在一个实施方案中，所述方法可用于选择对GPVI受体的两个或更多区具有亲和力的核酸配体。例如，在某些实施方案中，配体可与C2区的至少两个部分结合。在某些实施方案中，配体通过破坏二聚体构象或使其稳定而影响GPVI受体的二聚化。在这些实施方案中，可将调节剂设计为与核酸配体所能结合的仅一个表位结合、与不止一个表位结合或与所有表位都结合。调节剂可以例如干扰与仅一个表位(例如受体的C2-1或C2-2区)的结合。
可使用例如美国专利号7,087,735所述的SELEX方法，通过针对代表分子的胞外结构域的短肽进行SELEX，而产生对GPVI具有特异性的核酸配体。备选地，使用例如美国专利号6,730,482所述的SELEX方法，可通过在完整血小板上、在富集所述蛋白的血小板膜部分上、在纯化的GPVI上或在特异性过量表达GPVI受体的细胞系上进行SELEX，分离对GPVI具有特异性的核酸配体。
另外，可使用竞争亲和洗脱方案，例如美国专利号5,780,228所描述的那些，将SELEX方法用于分离特异性GPVI核酸配体。例如，为了分离对GPVI具有特异性的核酸配体，可通过加入足量的GPVI活化剂或结合剂(例如胶原、convulxin或CRP或相关化合物)，而进行与该蛋白结合的配体的洗脱。
GPVI受体可以是用于SELEX方法的重组表达的和纯化的蛋白。在某些实施方案中，GPVI核酸配体在生理条件下与GPVI受体结合。生理条件通常涉及溶液的盐和pH水平。在体外，生理条件通常可在包含150mM NaCl、2mM CaCl2、20mM HEPES，pH约7.4的缓冲液中再现。在某些实施方案中，如上所述地使用天然的、通常是未激活的血小板，以筛选核酸配体群体并提供富含有针对血小板上存在的蛋白质的配体的集群体。再针对过量表达所需GPVI受体的稳定细胞系，或已经用该蛋白瞬时转染的细胞系，来使用富集群体。二次筛选可如下完成：通过使用改良SELEX方法，对于来自这些细胞的分离的受体或对于完整细胞，通过配体竞争研究或通过鉴定对胞内信号转导途径的作用。
在某些实施方案中，可使用固定化蛋白来鉴定针对特异性GPVI靶标的核酸配体。在某些这样的实施方案中，可将纯化蛋白通过化学接头与固体基质连接。在其它实施方案中，可使用去垢剂例如阴离子型去垢剂(例如胆酸盐)来提取过量表达特定蛋白的细胞的膜，以分离与固定化人工膜偶联的蛋白和混合物的某部分。通常，认为可通过除去去垢剂而完成重新组织，在其间脂质和蛋白重新组织并与通常在支持基质(例如珠)上的固定化人工膜的烃链形成层。
可通过筛选核酸配体抑制特定激动剂诱导的血小板功能和/或由GPVI诱发的胞内信号转导事件的能力，鉴定由这些SELEX方法所分离的对GPVI具有特异性的核酸配体(其也具有所需的功能活性)。因为所需核酸配体不仅是结合伴侣，而且是受体信号转导的抑制剂，所以可以通过评价配体对血小板活性的作用而鉴定具有所需功能的配体。这可包括表征配体对已知由GPVI调节的不同信号途径的作用。例如，GPVI信号转导可导致GPVI蛋白簇集，并导致激酶激活而开始激活磷脂酶Cγ2的事件的局部信号链，释放使得Ca2+水平升高和蛋白激酶C激活的第二信使1，4，5-肌醇三磷酸和二酰甘油。可使用本领域普通技术人员众所周知的方法测定任何这样的第二信使系统或信号。
另外，可在这些系统中测定在GPVI核酸配体存在或不存在时的GPVI的胶原结合。
也可在血小板功能测定(例如在富含血小板的血浆和洗涤血小板制剂中进行的透光聚集度测定(Light Transmittance Aggregometry)或在全血中进行的阻抗聚集度测定(Impedance Aggregometry))中筛选配体对血小板聚集的抑制。另外，也可在静态条件或在流动的全血中筛选配体对血小板与胶原包被的表面的相互作用的抑制。GPVI的给定核酸配体的特异性可进一步通过配体阻断由给定受体的已知激动剂所触发的胞内信号转导事件的能力区别。例如，GPVI核酸配体抑制剂可望阻断由例如蛇C型凝集素convulxin、胶原或胶原相关肽(CRP)所触发的信号转导。GPVI的给定核酸配体的特异性还进一步通过在聚集由激活并非GPVI的受体的激动剂所触发时不存在对血小板聚集的作用来区别。
任何上述方法的应用，单独或联用，都将得到多种对GPVI具有特异性的核酸配体。一旦鉴定了具有所需抑制特性的核酸配体之后，可按照下文所述鉴定该配体的调节剂。
D.GPVI的核酸配体
本文所公开的GPVI配体优选是核酸配体，例如配体。使用在下文和实施例1中更详细描述的SELEX方法，筛选与GPVI胞外结构域(ECD)(氨基酸残基Gln21-Lys267；SEQ ID NO：2)特异性结合的GPVI配体，然后将其修饰以增加稳定性、对GPVI的亲和力和/或调节GPVI活性的能力。
本发明的GPVI核酸配体由分离的核酸序列组成，所述序列可以是DNA或RNA，并且其可以用修饰的核糖核酸或脱氧核糖核酸合成。如本文所述，如果使用RNA的碱基结构，所述结构在碱基序列中将包含尿苷(U)来替代胸苷(T)。在本文所述的某些实施方案中，核酸序列被写为RNA序列。同样，在本文所述的某些实施方案中，其中核酸配体最初被鉴定为DNA分子，核酸序列被写为DNA序列。可以理解，作为DNA序列以文本形式呈现的核苷酸序列固有地提供相应RNA序列的描述，其中DNA序列内的胸腺嘧啶(T)被尿苷(U)替换，以得到相应的核苷酸RNA序列。同样，可以理解，作为RNA序列以文本形式呈现的序列固有地提供相应DNA序列的描述，其中RNA序列内的尿苷(U)被胸腺嘧啶(T)替换，以得到相应的DNA序列。
对通过SELEX方法获取的若干GPVI核酸配体进行测序并对其序列进行比对。图4所示的序列比对导致对通过筛选过程而富集的6个独特序列的鉴定。称为“A”至“F”的6个序列的比对表明UAA序列的存在。此外，该完全保守序列包含在以下序列之中：(G/A)UAA。通过各侧与GC相接的(G/A)UAA序列产生保守GC(G/A)UAAGC序列。
然后对独特的GPVI配体进行二级结构预测分析。二级结构有助于配体的功能特性。正如技术人员所充分理解的，可根据茎和环结构描述二级结构，因为它们在分子中存在于5’-3’方向上。根据以下实施例2所示的二级结构预测，GPVI ECD配体具有包含3茎和4环的二级结构。5’-3’构型包括第1茎(茎1或S1)、第1环(环1或L1)、与第2和第3环(环3或L3)相连的第2茎(茎2或S2)、第3环、第3茎(茎3或S3)和第4环(环4或L4)(参见图8A-8C)。在某些实施方案中，第2茎与第1、第2和第3环连接，而第3茎与第3和第4环连接。在一个实施方案中，第3茎在5’-3’方向上邻近第1茎。序列GC(G/A)UAAGC构成茎3(GC碱基对)和环4((G/A)UAA)。序列GAC构成环1。
由SELEX所鉴定的GPVI配体的突变分析显示，UA、UU或UG的环3序列支持配体与GPVI的高亲和力结合。因此，在某些实施方案中，GPVI核酸配体的环3包含序列5’-YD-3’，其中Y代表嘧啶，D代表U、G或A。
在某些实施方案中，使用技术人员已知的方法，可用间隔基取代GPVI核酸配体的环2。间隔基可以是提供类似于环2结构的非核苷酸间隔基，使得当环2被间隔基取代时，GPVI配体维持其结构和功能。通过将(9-O-二甲氧基三苯甲基-三甘醇，1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(参见图13A-13B)掺入到GPVI核酸配体中而达到用六甘醇间隔基对环2进行取代，结果对GPVI的亲和力无损失。因此，本领域普通技术人员将会理解，可以用各种市售的非核苷酸间隔基取代环2。所述间隔基的实例包括但不限于通过将以下化合物掺入到GPVI核酸配体中而得到的那些：5’-O-二甲氧基三苯甲基-1’2’二脱氧核糖-3’-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺；18-O-二甲氧基三苯甲基六甘醇，1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺；和12-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)十二烷基-1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
GPVI配体在调节GPVI功能或治疗血小板介导的疾病中的功效主要取决于配体以足够的亲和力与GPVI蛋白结合的能力。因此，在通过SELEX方法得到GPVI配体之后，对每种配体测序，然后可表征其对靶分子的结合。本文的配体与靶标(GPVI)的结合亲和力可用Kd来定义。该解离常数值可通过众所周知的方法例如实施例1所述的放射性配体结合方法来直接测定。然而，已经观察到对于某些小寡核苷酸而言，直接测定Kd有时很困难，并且可导致错误的高结果。在这样的情况下，对于已知与靶标或候选物结合的物质而言，可进行靶分子或其它候选物质的竞争结合测定。在理想条件下发生50％抑制的浓度值(Ki)就等于Kd。然而，决不能是Ki小于Kd。因此，备选地，对Ki的测定设定了Kd值的最大值。在技术难题阻碍了对Kd进行精确测定的情况下，可合宜地替换为对Ki的测定，以提供Kd的上限。Ki值也可用于证实本发明的配体与靶标结合。在表征GPVI配体结合特性时，可用已知的GPVI结合分子(例如胶原、CRP(胶原相关肽)或convulxin(Cvx))的竞争结合或功能测定来分析特异性。
在某些实施方案中，配体与GPVI结合的Kd范围可为约1nM至约100nM，约10nM至约50nM或约20nM至约0.1nM。在其它实施方案中，配体与GPVI结合的Kd比配体与环境中的无关蛋白或其它伴随材料结合的Kd小至少2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。无关蛋白也可以是具有与GPVI中存在的模体相关的模体的蛋白，例如另一Ig超家族成员或包含胶原结合结构域的另一种蛋白或另一种血小板激活或粘附受体。
正如下文将要详述的那样，可使用各种各样的工程方法，对经SELEX方法而获取并鉴定的配体的结合活性进行进一步修饰或增强。
在某些实施方案中，配体与GPVI的胞外结构域相互作用。配体可干扰GPVI受体与胶原结合。在某些实施方案中，配体可通过GPVI受体而抑制胞内信号转导，包括降低肌醇三磷酸的产生或降低胞内钙水平的波动。配体也可稳定或破坏受体构象，例如二聚体构象，使得受体与胶原或FcRγ相互作用的能力降低。配体可通过胶原或其它GPVI激动剂而影响血小板激活。配体也可影响血小板对胶原或胶原相关肽的粘附。配体可影响由胶原或其它GPVI激动剂诱导的血小板聚集。
本文所述的核酸配体可起到活性可逆试剂的作用。它们是这样的试剂或药学活性分子：其在给予患者之后可通过给予第二种试剂而受到直接控制。正如下文详述的那样，第二种试剂，在本文中称为调节剂，可关闭或微调配体的药理活性。结果，可通过并非例如药物清除的方式而逆转配体的药理活性。
E.调节剂
在某些实施方案中，GPVI的核酸配体是可逆的。一方面，本发明通过将GPVI配体的调节剂给予已被给予核酸配体的宿主而提供调节GPVI的核酸配体的活性的方法。
本发明的调节剂包括可以所需方式与核酸配体结合并改变该配体与其靶分子间相互作用(例如通过改变核酸配体的结构)的任何药学上可接受的试剂，或降解、代谢、切割或以其它方式化学改变核酸配体以改变其生物学作用的任何药学上可接受的试剂。本发明调节剂的实例包括：与至少部分的核酸配体序列互补的寡核苷酸或其类似物(包括核酶或DNA酶)。其它实例包括肽核酸(PNA)、吗啉代核酸(MNA)或锁定核酸(LNA)；核酸结合蛋白或肽；寡糖；小分子；或基于核酸结合聚合物、脂质、纳米粒或微球体的调节剂。
调节剂可经设计，使其以高度特异性和所需亲和力程度与特定核酸配体结合。调节剂也可经设计，使得一旦结合后，配体结构被改变为更高或更低活性形式。例如，调节剂可经设计，使得一旦与靶核酸配体结合后，该配体的二级和/或三级结构发生改变，从而配体不再与其靶分子结合或以较低亲和力与其靶分子结合。备选地，调节剂可经设计，使得一旦结合后，配体的三维结构发生改变，以增强配体与其靶分子的亲和力。也就是说，调节剂可经设计，使得一旦结合后，结构模体被修饰，使配体亲和力增加。在另一个实施方案中，配体/调节剂对经设计，使调节剂与不能与目标靶标结合的核酸配体分子的结合可导致在配体内产生结构模体，从而允许配体与其靶分子结合。
调节剂也可经设计，使其以足够亲和力与特定核酸配体或核酸配体组非特异性结合而形成复合物。这样的调节剂通常可通过电荷-电荷相互作用与核酸缔合。这样的调节剂也可同时与不止一个核酸配体结合。调节剂可经设计，使得一旦与一种或多种核酸配体结合后，核酸配体的结构并未与其活性形式有显著改变，但是，调节剂掩蔽或在空间上阻止了核酸配体与其靶分子的缔合。
核苷酸调节剂可以是允许与配体分子有效结合的任何长度。例如，寡核苷酸调节的长度范围可为约10个核苷酸(nt)至约30nt、约10nt至约20nt、或约15nt。核苷酸调节剂的长度可以是8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25n25、26nt、27nt、28nt、29nt或30nt。本领域普通技术人员也可设想长度大于30nt的核苷酸调节剂。
本文所述的核酸配体具有活性三级结构，其可受合适的稳定二级结构的形成的影响。因此，尽管互补的本发明寡核苷酸调节剂与核酸配体间双链体的形成机制类似于两个短的线状寡核糖核苷酸间的双链体的形成，但是分子内配体结构可同时影响到设计这样的相互作用的规则和所述产物形成的动力学。
核酸配体与寡核苷酸调节剂间最初碱基对形成的成核率在最终稳定双链体形成中起到重要作用，并且通过将寡核苷酸调节剂靶向到核酸配体中存在的单链环和/或单链3′或5′尾极大地提高该步骤的速率。对于分子间双链体最佳形成的发生，相对于靶向核酸配体内现有的分子内双链体的形成，自由能理想地有利于分子间双链体的形成。
本发明在本文所述的调节剂通常是包含与至少部分的靶向核酸配体序列互补的序列的寡核苷酸。例如，调节剂寡核苷酸可包含与靶向配体的约6nt至25nt、8nt至20nt或10nt至15nt互补的序列。使用本文所述的和本领域普通技术人员已知的技术，考虑到靶向配体和所寻求的效果，可以容易地优化调节剂寡核苷酸的长度。可以用携带D或L立体化学的核苷酸或其混合物制备寡核苷酸。天然存在的核苷呈D构型。
尽管本发明的寡核苷酸调节剂包含与至少部分的核酸配体互补的序列，但绝对互补性并非必需的。“与至少部分的核酸配体互补的”序列在本文中是指具有足够互补性以能与核酸配体杂交的序列。杂交能力可取决于核酸的互补性程度和长度。通常，杂交的寡核苷酸越大，其可含有的与靶配体错配的碱基就约多并且仍能形成稳定的双链体(或三链体，视情况而定)。本领域技术人员可通过使用测定杂交复合物熔点的标准程序来确定错配的可容忍程度。本发明的寡核苷酸可以是单链DNA或RNA或嵌合混合物或其衍生物或修饰形式。
调节剂在核酸主链和单个核酸结构中都可包含修饰。在某些实施方案中，调节剂是与配体中的至少一个环区互补的核酸。在某些实施方案中，调节剂是至少具有在生理条件下与二维结构中的第4环杂交的序列的寡核苷酸，并且尤其是包含序列3’-AUU-5’的寡核苷酸。在其它实施方案中，调节剂是在生理条件下与配体二级结构中的第1环杂交的寡核苷酸，并且尤其是至少包含序列3’-CUG-5’的寡核苷酸。根据调节剂的所需功能，可设计调节剂以破坏或稳定核酸配体的二级和/或三级结构。
在某些实施方案中，调节剂经设计与配体上的“自杀位置”结合并因此破坏配体序列。自杀位置是对酶促切割敏感的配体的单链部分。在一个示例性的实施方案中，一旦调节剂与配体结合后，自杀位置就变为单链并且不稳定，并且可增强由循环例如血液中的酶或肝脏内切核酸酶对配体的切割。在某些实施方案中，调节剂与配体结合，然后配体就不再与其靶标相互作用。
在一个示例性的实施方案中，调节剂包含选自SEQ ID NO：74-88的核酸序列。
在某些实施方案中，调节剂序列包含至少一个经修饰的核苷酸。例如，2’-O-甲基和2’-氟代修饰，其可包含2’-O-甲基胞嘧啶、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基腺苷、2’-O-甲基鸟苷、2’氟胞苷或2’氟尿苷。
可使用不同策略以测定核酸配体内寡核苷酸调节剂所结合的最佳位点。可使用一个经验性的策略，其中互补寡核苷酸在核酸配体周围“步查(walk)”。依照该方法，可使用长度约15个核苷酸的寡核苷酸(例如2′-O-甲基或2’-氟寡核苷酸)，其错开配体上的约5个核苷酸(例如与配体的1-15、6-20、11-25等互补的寡核苷酸)。经验性的策略特别有效，因为核酸配体三级结构对杂交效率的影响可能难以预测。
在以下实施例中描述的测定可用于评价不同寡核苷酸与特异性核酸配体杂交的能力，尤其强调要达到与核酸配体完全结合，需要寡核苷酸摩尔过量。也可通过进行标准动力学研究，使用例如BIACORE测定，来确定不同寡核苷酸调节剂提高核酸配体与其靶分子的解离速率或配体与其靶分子的缔合速率的能力。可选择寡核苷酸调节剂，使得需要5-50倍摩尔过量的寡核苷酸或更少，以便以所需方式修饰配体与其靶分子间的相互作用。
备选地，靶向核酸配体可经修饰，使其包含单链尾(3′或5′)，以促进与寡核苷酸调节剂的缔合。合适的尾可包含1-20个核苷酸、1-10个核苷酸、1-5个核苷酸或3-5个核苷酸。尾也可经修饰(例如2’-O-甲基和2’-氟代修饰，其可包含2’-O-甲基胞嘧啶、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基腺苷、2’-O-甲基鸟苷、2’氟胞苷或2’氟尿苷)。可在结合和生物测定(例如以下实施例所述)中测试加尾配体，以证实单链尾的加入未破坏核酸配体的活性结构。可设计出可与尾序列形成例如1、2、3、4或5碱基对的一系列寡核苷酸(例如2′-O-甲基寡核苷酸)并测试它们单独与加尾配体缔合的能力，以及它们提高配体与其靶分子的解离速率或配体与其靶分子的缔合速率的能力。可使用错义序列(scrambledsequence)对照以证实作用是因为双链体形成而不是非特异性作用。
在另一个实施方案中，调节剂是核酶或DNA酶。酶核酸通过首先与靶RNA或DNA结合而起作用。这样的结合是通过酶核酸的靶结合部分而发生的，所述部分与可起到切割靶RNA的作用的分子的酶部分紧密接近。因此，酶核酸通过互补碱基配对先识别再结合靶RNA或DNA，而且一旦结合正确位点后，起到酶促作用，以切割靶RNA，因而允许RNA配体失活。有至少5类核酶，其各自显示不同类型的特异性。例如，I组内含子的大小是约300至＞1000个核苷酸并且在紧接切割位点的5′的靶序列中需要U并且在切割位点的5′侧与4-6个核苷酸结合。另一类是RNaseP RNA(M1 RNA)，其大小为约290-400个核苷酸。第3类是锤头核酶，其大小为约30-40个核苷酸。它们在紧接切割位点的5′需要靶序列UH(其中H不是G)并且在切割位点两侧与不同数量的核苷酸结合。第4类是发夹核酶，其大小为约50个核苷酸。它们在紧接切割位点的3′需要靶序列GUC并在切割位点的5′侧与4个核苷酸结合并且在切割位点的3′-侧与不同数量结合。第5组是丁型肝炎病毒(HDV)核酶，其大小为约60个核苷酸。DNA酶是单链的并且切割RNA和DNA二者。已经提出了DNA酶的一般模型，其被称为“10-23”模型。遵循“10-23”模型的DNA酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，其侧翼连接各自具有7-9个脱氧核糖核苷酸的两个底物识别结构域。
在另一个实施方案中，调节剂本身是核酸配体。在该实施方案中，产生与所需治疗靶标结合的第1配体。在第2步骤中，使用本文所述的SELEX方法或另一方法，产生与第1配体结合的第2配体，并且其调节治疗性配体与靶标间的相互作用。在一个实施方案中，第2配体使第1配体的作用失效。
在另一个示例性的实施方案中，调节剂是基于PNA、MNA、LNA或PCO的调节剂。本发明寡核苷酸调节剂的核酸碱基(Nucleobase)可通过核酸碱基间键而连接，所述键例如肽键(例如在肽核酸(PNA)的情况下；Nielsen等(1991)Science 254，1497和美国专利号5,539,082)和吗啉代键(Qin等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.10，11(2000)；Summerton，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7，187(1997)；Summerton等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7，63(1997)；Taylor等，J BiolChem.271，17445(1996)；Partridge等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.6，169(1996))，或通过任何其他天然的或经修饰的键。寡核苷酸碱基(oligonucleobase)还可以是锁定核酸(LNA)。Nielsen等，J Biomol StructDyn 17，175(1999)；Petersen等，J Mol Recognit 13，44(2000)；Nielsen等，Bioconjug Chem 11，228(2000)。
PNA是类似于寡核苷酸、但组成不同的化合物。在PNA中，寡核苷酸的脱氧核糖主链被肽主链取代。肽主链的各亚基与天然存在的或非天然存在的核酸碱基连接。PNA通常具有由N-(2-氨基乙基)甘氨酸单位组成的非手性聚酰胺主链。嘌呤碱基或嘧啶碱基通过亚甲基羰基接头(1-3)与各单位连接，以靶向互补核酸。PNA按照Watson-Crick碱基配对原则以平行或反向平行方向与互补RNA或DNA结合。与天然同型双链体相比，PNA寡聚体不带电荷的特性增强了杂合PNA/DNA(RNA)双链体的稳定性。
吗啉代核酸如此命名，是因为它们从吗啉代亚基装配而来，其各自含有与6元吗啉环连接的4种遗传碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)中的一个。这4种亚基类型的18-25个亚基通过非离子型磷酸二酰胺(phosphorodiamidate)的亚基间键以特定顺序相连，得到吗啉代寡聚物。
LNA是一类DNA类似物，其具有可使其成为本发明调节剂的首要候选者的某些特性。LNA单体是结构类似于RNA单体的双环化合物。LNA与DNA和RNA共享大部分化学性能，它是水溶性的，可以经凝胶电泳分离、乙醇沉淀等(Tetrahedron，54，3607-3630(1998))。然而，将LNA单体引入DNA或RNA寡聚物中，导致具有互补DNA或RNA的双链体具有高的热稳定性，同时又服从Watson-Crick碱基配对原则。
假环状寡核苷酸碱基(PCO)也可用作本发明的调节剂(参见美国专利号6,383,752)。PCO含有通过其3′-3′或5′-5′端连接的2个寡核苷酸区段。PCO的区段之一(“功能性区段”)具有某些功能性(例如与靶RNA互补)。另一区段(“保护性区段”)与功能性区段的3′-或5′-末端互补(取决于通过其与功能性区段连接的末端)。由于功能性区段与保护性区段间的互补性，在靶核酸(例如RNA)不存在时，PCO构成分子内假环状结构。PCO比常规寡核苷酸更稳定，因为存在3′-3′或5′-5′键并形成分子内假环状结构。在小鼠中进行的药物动力学、组织分布和稳定性研究表明，PCO与PS-寡核苷酸相比一般具有更高的体内稳定性，以及类似的药物动力学和组织分布特征，但从所选组织中快速消除。当荧光团和猝灭剂分子与本发明的PCO适当连接时，如果所述分子呈线状构型则会发荧光，但呈环状构象时荧光就会被猝灭。该特性可用于筛选PCO作为潜在调节剂。
在另一个示例性的实施方案中，调节剂是基于肽的调节剂。基于肽的核酸配体调节剂代表了寡核苷酸或其类似物的调节剂的一类备选分子。如果靶核酸配体的足够活性的寡核苷酸调节剂因缺乏足够的单链区而不能促进靶标与寡核苷酸调节剂间成核，因而无法分离，那么这类调节剂就特别有用。另外，与寡核苷酸调节剂相比，肽调节剂提供不同的生物利用度和药物动力学。在一个示例性的实施方案中，调节剂是鱼精蛋白(Oney等，2009，Nat.Med.15：1224-1228)。鱼精蛋白是水溶性的，受热不凝结，并且含有精氨酸、丙氨酸和丝氨酸(大部分还含脯氨酸和缬氨酸而且许多含甘氨酸和异亮氨酸)。调节剂也包括鱼精蛋白变体(参见例如Wakefield等，J.Surg.Res.63：280(1996))和鱼精蛋白的修饰形式，包括美国公开号20040121443中描述的那些。其它调节剂包括鱼精蛋白片段，例如美国专利号6,624,141和美国公开号20050101532中描述的那些。调节剂通常也包括调节肝素活性的肽、其它糖胺聚糖或蛋白聚糖(参见例如美国专利号5,919,761)。在一个示例性的实施方案中，调节剂是含有阳离子-NH基团并能稳定电荷-电荷相互作用的肽，例如聚-L-赖氨酸和聚-L-鸟氨酸。
可使用若干策略以分离能结合并因此调节靶核酸配体活性的肽。例如，已经描述了固定在珠上的编码肽组合文库，并已证明其中含有能结合病毒RNA序列并破坏病毒RNA与病毒调节蛋白间相互作用的肽，所述病毒调节蛋白与所述RNA特异性结合(Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，1999，96：12997)。使用这样的文库，核酸配体调节剂可如下分离：通过给靶核酸配体挂上标记并在有利于文库的某些成员与核酸结合的条件下将带标记的靶标与固定在珠上的肽文库一起温育。核酸配体与给定珠上的特异性肽结合，使该珠通过核酸配体上的标记而“着色”，因此使能够通过简单的珠分离而鉴定出能与靶标结合的肽。使用描述用于鉴定核酸配体调节剂的多种结合测定，可以证实经这类筛选方法所分离出的肽与靶核酸配体之间的直接相互作用并对其进行定量测定。可通过合适的生物测定，证实所述肽调节靶核酸配体活性的能力。
在一个另外的实施方案中，调节剂是基于寡糖的调节剂。寡糖可与核酸相互作用。例如，氨基糖苷类抗生素是链霉菌(Streptomyces)的产物并与多种RNA分子(例如各种核酶、核糖体的RNA组分以及HIV-1的TAR和RRE序列)特异性相互作用。因此寡糖可与核酸结合并可用于调节核酸配体活性。
在另一个实施方案中，调节剂是基于小分子的调节剂。插入配体与靶标之间或者以其它方式破坏或改变配体与靶标之间结合的小分子也可用作治疗调节剂。通过在有或无小分子时在测定配体与靶标之间结合改变的测定中筛选候选者，或者通过使用测定在有或无小分子时配体对靶标的生物学作用的差异的体内或体外测定，就可以鉴定这样的小分子。一旦鉴定了表现出所需作用的小分子后，组合方法等技术就可用于优化用于所需调节作用的化学结构。
在再一个示例性的实施方案中，调节剂是核酸结合聚合物、脂质、纳米粒或微球体。在再一些非限制性实例中，调节剂可选自：1，2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EDOPC)；二月桂酰乙基磷脂酰胆碱(EDLPC)；EDLPC/EDOPC；吡啶鎓表面活性剂；二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)；(±)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十二烷氧基)-1-丙基溴化铵(GAP-DLRIE)加中性辅脂二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(GAP-DLRIE/DOPE)；(±)-N，N-二甲基-N-[2-(精胺甲酰胺基)乙基]-2，3-二(二油酰氧基-1-propaniminium petahydrochloride(DOSPA)；二月桂酰乙基磷脂酰胆碱(EDLPC)；乙基二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(EDMPC)；(±)-N，N，N-三甲基-2，3-二(z-十八-9-烯-酰氧基(oyloxy))-1-丙基氯化铵(DOTAP)；(±)-N-2-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十四烷氧基)-1-丙基溴化铵(DMRIE)；(±)-N，N，N-三甲基-2，3-二(z-十八-9-烯氧基)-1-丙基氯化铵(DOTMA)；5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基-酰胺(DOGS)；二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基酰胺(DPPES)；1，3二油酰氧基-2-(6-羧基精胺基)-丙基-酰胺基(DOSPER)；四甲基四棕榈酰基精胺(TMTPS)；(四甲基四油酰基精胺(TMTOS)；四甲基四月桂基精胺(TMTLS)；四甲基四肉豆蔻基精胺(TMTMS)；四甲基二油基精胺(TMDOS)；二植烷酰基磷脂酰-乙醇胺(DPhPE)；和(±)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十二烷氧基)-1-丙基溴化铵(GAP-DLRIE)。
在其它实施方案中，调节剂选自：脱乙酰壳多糖；脱乙酰壳多糖衍生物；1，5-二甲基-1，5-二氮杂十一亚甲基聚甲溴化物；聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物；聚-L-赖氨酸；聚酰胺基胺(PAMAM)；含β-环糊精的聚阳离子(CDP)；含β-环糊精的聚阳离子(含咪唑的变体)(CDP-Im)；聚氨基磷酸酯聚合物(8kDa，30kDa)(PPA-DPA 8k，PPA-DPA 30k)；聚凝胺(polybrene)；精胺；PEG-嵌段-PLL-树状聚合物；聚乙烯亚胺(PEI)；甘露糖-PEI；转铁蛋白-PEI；线状(linera)-PEI(lPEI)；明胶；甲基丙烯酸/甲基丙烯酰胺；聚(β-氨基酯)；聚电解质复合物(PEC)；聚(乙烯胺)(PVA)；胶原；聚丙烯亚胺(PPI)；聚丙烯胺；聚乙烯吡啶；氨基缩醛化聚(乙烯醇)；丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物；Newkome树状聚合物；聚亚苯基；二甲基双十八烷基溴化铵(DAB)；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；白蛋白；经酸处理的明胶；聚赖氨酸；聚鸟氨酸；聚精氨酸；DEAE-纤维素；DEAE-葡聚糖；和聚(N，N-二甲氨基乙基甲基丙烯酸)；和聚丙胺(POPAM)。
在一个实施方案中，调节剂选自脱乙酰壳多糖和脱乙酰壳多糖衍生物。脱乙酰壳多糖衍生物包括水溶性脱乙酰壳多糖纳米粒(例如以下文献所述：美国专利号6,475,995；美国专利申请号2006/0013885；Limpeanchob等(2006)Efficacy and Toxicity of Amphotericin B-ChitosanNanoparticles；Nareusan University Journal 14(2)：27-34)。给定脱乙酰壳多糖聚合物(本质上是由重复葡糖胺单体组成的非常大的聚胺聚合物)的聚阳离子特性，脱乙酰壳多糖可用于在注入宿主之后在体内将配体聚集和/或包入聚电解质复合物中。这部分是基于脱乙酰壳多糖上存在的伯胺与配体的磷酸二酯主链的相互作用。
在某些实施方案中，脱乙酰壳多糖聚合物上的伯胺可被充分修饰，以改变水溶性和电荷状态。脱乙酰壳多糖衍生物包括三甲基脱乙酰壳多糖氯化物(TMC)，其可在不同季铵化程度下合成；一羧基甲基化脱乙酰壳多糖(MCC)，其是聚两性电解质聚合物；戊二醛交联的衍生物(CSGA)；硫醇化脱乙酰壳多糖(Lee等(2007)Pharm.Res.24：157-67)；二醇脱乙酰壳多糖(GC)，一种与乙二醇缀合的脱乙酰壳多糖衍生物(Lee等(2007)Int J Pharm.)；[N-(2-羧基苄基)脱乙酰壳多糖(CBCS)(Lin等(2007)Carbohydr Res.342(1)：87-95)；β-环糊精-脱乙酰壳多糖聚合物(Venter，等(2006)Int J Pharm.313(1-2)：36-42)；O-羧基甲基脱乙酰壳多糖；N，O-羧基甲基脱乙酰壳多糖；或通过将黄原酸酯基引到其主链上而进行化学修饰的脱乙酰壳多糖。
在一个实施方案中，产生空的脱乙酰壳多糖纳米粒并用作调节剂。可使用分子量范围为10,000Da至＞1,000,000Da的脱乙酰壳多糖或脱乙酰壳多糖衍生物。在某些实施方案中，脱乙酰壳多糖是500,000Da或更小。在某些实施方案中，脱乙酰壳多糖是100,000Da或更小。在某些实施方案中，所述化合物介于10,000和100,000Da之间、介于10,000和90,000之间、介于10,000和80,000之间、介于20,000和70,0000之间、介于30,000和70,000之间、约30,000、约40,000、约50,000或约60,000Da。
在某些实施方案中，使用含有不同程度脱乙酰化伯胺的脱乙酰壳多糖聚合物。在这些实施方案中，不同脱乙酰化程度改变了聚合物的电荷状态并因此改变聚合物的结合性能。一旦脱乙酰壳多糖纳米粒与宿主中的配体接触之后，配体可与纳米粒表面结合并被捕获在其上，或进入纳米粒并因离子相互作用而被包入。
在另一个实施方案中，调节剂是聚磷酸聚合物微球体。在某些实施方案中，调节剂是这样的微球体的衍生物，例如聚(L-丙交酯-共-亚磷酸乙酯)或P(LAEG-EOP)等，如美国专利号6,548,302所述。可制备这样的聚合物，使其含有各种各样的官能团作为聚合物主链的组成部分。在一个实例中，聚合物可含有在生理pH下带正电荷的季胺，使得它们在与一个或多个核酸接触后可与之复合或将其包入。在某些实施方案中，聚合物不含正电荷。
本发明也提供鉴定核酸GPVI配体调节剂的方法。通常可通过结合测定、分子建模或者测定生物学功能改变的体内或体外测定来鉴定调节剂。在一个实施方案中，通过凝胶迁移测定(gel shift assay)来测定调节剂与核酸的结合。在另一个实施方案中，通过BIACORE测定来测定调节剂与核酸配体的结合。
标准结合测定可用于鉴定和选择本发明的调节剂。非限制性实例是凝胶迁移测定和BIACORE测定。也就是说，可在试验条件或典型生理条件下使试验调节剂与待靶向的核酸配体接触，并确定试验调节剂是否真的与配体结合。再在合适生物测定(其因配体及其靶分子的不同而异，例如凝结试验)中分析被发现与核酸配体结合的试验调节剂，以确定试验调节剂是否能影响配体对其靶分子所引起的生物学作用。
凝胶迁移测定是众所周知的用于评价结合能力的技术。例如，先将含有试验序列的DNA片段与试验蛋白或含有推定结合蛋白的混合物一起温育，再通过凝胶电泳在凝胶上分离。如果DNA片段与蛋白结合，它的尺寸就会比较大，因此其迁移就比游离片段更迟缓。例如，电泳凝胶迁移率迁移测定的一个方法可以是：(a)在合适条件下在混合物中使核酸结合蛋白与包含分子探针的非放射性或放射性标记的核酸分子接触，以促进正形成复合物中的蛋白与核酸间的特异性结合相互作用，其中所述探针选自dsDNA、ssDNA和RNA；(b)将混合物电泳；和(c)通过检测复合物中的非放射性或放射性标记而检测与膜结合的复合物。
BIACORE技术测量传感器芯片表面上的结合事件，使得与表面连接的相互作用物确定分析特异性。测试相互作用的特异性包括简单分析不同分子是否可与固定化的相互作用物结合。结合使表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)信号立即发生变化，使得相互作用是否发生直接显而易见。基于SPR的生物传感器通过测定接近表面的生物分子的质量浓度而监测相互作用。通过连接相互作用伴侣之一使表面具特异性。含有其它伴侣的样品流过表面：当来自样品的分子与连接在表面上的相互作用物结合时，局部浓度变化并测得SPR响应。该响应与同表面结合的分子质量直接成比例。
当光在某些条件下在不同折射率的两种介质的界面上从传导膜反射时，产生SPR。在BIACORE技术中，介质是样品和传感器芯片的玻璃，而传导膜是芯片表面上的金薄层。SPR在特定反射角引起反射光强度降低。该角度随接近反射光相对侧表面的折射率不同而变化。当样品中的分子与传感器表面结合时，表面处的浓度改变和因此折射率改变，并检测SPR响应。将响应针对相互作用过程期间的时间来作图，提供对相互作用过程的定量度量。BIACORE技术测定最小反射光强度的角度。光不被样品吸收：而是光能通过金膜中的SPR而耗散。SPR响应值用共振单位(RU)来表示。1 RU代表强度最小角度的0.0001°的变化，对于大部分蛋白质，这大致等于在传感器表面上的约1pg/mm2的浓度改变。RU与表面浓度间的准确转换因子取决于传感器表面性能和造成浓度改变的分子的特性。
有许多其它测定可测定寡核苷酸或其类似物、肽、多肽、寡糖或小分子是否能与配体结合，其结合方式使得改变与靶标的相互作用。例如，电泳迁移率迁移测定(EMSA)、滴定量热术、闪烁亲近测定、使用分析用超速离心的沉降平衡测定(参见例如www.cores.utah.edu/interaction)、荧光偏振测定、荧光各向异性测定、荧光强度测定、荧光共振能量转移(FRET)测定、硝基纤维素滤膜结合测定、ELISA、ELONA(参见例如美国专利号5,789,163)、RIA或平衡透析测定都可用于评价试剂与核酸配体结合的能力。可以进行直接测定，其中直接测定试剂与核酸配体间的相互作用；或者可以进行竞争测定或置换测定，其中测定试剂将配体从其靶标置换的能力(例如参见Green，Bell和Janjic，Biotechniques 30(5)，2001，第1094页和美国专利号6,306,598)。一旦鉴定候选调节剂后，就可在生物测定中证实其调节核酸配体对其靶标的活性的能力。备选地，如果试剂被鉴定为可调节配体与其靶标的相互作用，那么这样的结合测定可用于证实该试剂与配体直接相互作用并可测定所述相互作用的亲和力。
在另一个实施方案中，质谱可用于鉴定与核酸配体结合的调节剂、调节剂与核酸配体间相互作用位点和试剂对配体的相对结合亲和力(参见例如美国专利号6,329,146)。这样的质谱方法也可用于筛选化学混合物或文库，尤其是组合文库，用于筛选出与所选靶配体结合的各个化合物，其可用作配体调节剂。此外，质谱技术可用于针对例如化合物的组合文库同时筛选多个靶核酸配体。此外，质谱技术可用于鉴定多个分子物类(尤其是“小”分子)与靶配体上分子相互作用位点间的相互作用。
评价调节剂在改变核酸配体与靶标间相互作用中的有效性的体内或体外测定对于待治疗的疾病是特异性的。有许多标准测定用于生物学特性，所述测定是众所周知的并可使用。生物学测定的实例在本申请中所引用的专利中提供，其描述了某些核酸配体用于特定应用。
在某些实施方案中，调节剂是小分子。例如，在某些实施方案中，核酸配体与生物素分子连接。在这样的情况下，给予链霉抗生物素或抗生物素蛋白，以结合和逆转配体的作用(参见Savi等.J Thrombosisand Haemostasis，6：1697-1706)。抗生物素蛋白是鸟类、爬行类和两栖类输卵管中产生的四聚体蛋白，其沉积在它们的卵白中。链霉抗生物素是从细菌阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)中纯化的四聚体蛋白。该四聚体蛋白含有4个相同的亚基(同型四聚体)，其各自可以高度亲和力和特异性与生物素(维生素B7、维生素H)结合。
在某些实施方案中，调节剂是阳离子型分子。在某些实施方案中，配体形成鸟嘌呤四联体(quartet)(G-四联体或G-四链结构(quadruplex))结构。这些结构为阳离子型分子所结合。在某些实施方案中，所述分子是金属螯合分子。在某些实施方案中，调节剂是卟啉。在某些实施方案中，化合物是TMPyP4。参见Joachimi等.JACS 2007，129，3036-3037和Toro等.Analytical Biochemistry 2008，8月1日，379(1)8-15。
在一个实施方案中，在小于10.0微摩尔浓度(uM)、1.0微摩尔浓度(uM)、优选小于0.1uM和更优选小于0.01uM的调节剂浓度下，调节剂在溶液中具有与核酸配体充分结合的能力。“充分”是指在靶标存在下通过调节而观察到靶生物活性至少降低50％，并且降低50％在本文中称为IC50值。
F.优化配体和调节剂
为了使配体适合用作治疗药，优选配体合成便宜，在宿主中使用安全并且在体内稳定。野生型RNA和DNA寡核苷酸在体内通常都不稳定，因为它们对核酸酶的降解敏感。通过在2′-位掺入修饰基团可极大地提高对核酸酶降解的抗性。
可将2’-氟代或氨基基团掺入到寡核苷酸池中，随后从中选择配体。在本说明书中，在体外转录反应中使用2’-氟嘧啶以产生最初的寡核苷酸池，用于配体选择(参见实施例1)。然而，选自在各嘌呤位置上含有2’-羟基糖的这类文库的所得配体，虽然因此在体内比类似RNA或DNA配体更稳定，但是需要另外优化。因此，随后经各种方式对用本文所述方法鉴定的配体进行修饰，以获取功能和稳定性增强且用于大规模制备工艺的可行性增加的配体。
在最初鉴定配体(通过例如SELEX)和调节剂(例如根据序列互补性设计)之后，可经各种方式对配体和调节剂进行修饰或工程改造，以改进它们的所需结构、功能和/或稳定性。这些包括但不限于取代特定糖残基，改变配体中特定区域和/或结构的组成和大小，并且设计可被调节剂更有效调节的配体。
核酸配体的设计和优化包括评价配体的二级结构以及二级结构与调节剂控制之间的关系。与修饰核酸的常规方法不同，设计针对GPVI蛋白的配体可包括考虑改变配体对潜在调节剂设计的影响。如果配体通过例如截短而被修饰，那么相应调节剂应当设计为控制截短的配体。
可通过本领域普通技术人员已知的各种方法，对通过SELEX方法鉴定的配体二级结构进行预测。例如，可用以下软件程序来分析各序列：例如Mfold(mfold.bioinfo.rpi.edu；另见Zuker，2003，Nucleic AcidsRes.31：3406-3415和Mathews等，1999，J. Mol.Biol.288：911-940)。随后，可使用不同所选序列的比较序列分析，根据保守共有二级结构元件比对序列，以达到预测GPVI配体的二级共有结构(参见实施例2)。例如上述分析允许设计并测试通过SELEX获得的序列变体，以产生功能和稳定性增强的配体。
可通过改变配体总长度以及茎和环结构的长度，修饰本发明的GPVI核酸配体。例如，可产生配体截短，其中在SELEX方法中所选的配体的5’和/或3’端的部分缺失。为了测定配体所能耐受的截短程度，所用的一个方法可以是加热退火与配体5’或3’端区域互补的寡核苷酸(例如DNA寡核苷酸)，然后比较有或无退火寡核苷酸的配体的结合。如果有或无退火寡核苷酸的配体之间未观察到显著的结合差异，那么这表明配体的退火部分并非配体与靶蛋白结合所必需的。可使用与不同长度的配体5’或3’端退火的寡核苷酸来进行该方法，以测定提供完整功能性配体的5’和3’边界。
在另一个实施方案中，设计包括降低配体大小。在另一个实施方案中，与配体大小相关地改变调节剂的大小。在又一个实施方案中，将鸟嘌呤串减少至小于4个鸟嘌呤，或小于3个鸟嘌呤，或小于2个鸟嘌呤或无鸟嘌呤。然而，这些改变的联合效果必需满足产生配体的挑战，所述配体提供足够的活性但又容易被调节剂所中和。
对于调节剂的靶向，也可修饰改进的配体，使其包含单链尾(3′或5′)，以促进与寡核苷酸调节剂的缔合。合适的尾可包含1nt至20nt，优选1nt至10nt、1nt至5nt或3nt至5nt。容易理解，这样的尾可包含经修饰的核苷酸，如下文将会更详细描述的那样。
可在结合和生物测定(例如下文所述)中测试加尾配体，以证实单链尾的加入未破坏配体的活性结构。可设计出可与尾序列形成例如1、3或5碱基对的一系列寡核苷酸(例如2′-O-甲基寡核苷酸)，并测试它们单独与加尾配体缔合的能力，以及它们提高配体与其靶分子的解离速率或缔合速率的能力。可使用错义序列对照以证实作用是因为双链体形成而不是非特异性作用。
对共有结构的测定也有助于配体的工程改造，以鉴定可增强或降低配体结构和功能的一个或多个核苷酸。例如，可更有效地鉴定和测试特定茎和环结构的核苷酸添加、缺失和取代(参见实施例3)。
对共有二级结构的知识也使我们能够避免可能对配体结构和功能不利的修饰。例如，某些修饰在共有二级结构内可能是保守的，例如茎或环区内的2’-氟代。在这些情况下，从配体的茎或环中除去2′-氟代可导致活性丧失。
在某些实施方案中，配体是选自表1-7的核酸分子，包括其截短的和基本同源的序列。如本文所用，就同源区而言，“基本同源的”序列是通过Watson-Crick碱基配对在特定分子内形成相同二级结构的序列。在某些实施方案中，如果序列与指定配体共享至少80％、85％或更高序列同一性，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性时，则序列是“基本同源的”。就指定长度(例如50个或更少核苷酸)的核酸配体而言，在允许Watson-Crick结合而形成相同二级结构的任何区域内可找到同源序列，无论该指定区域内序列同一性如何。
配体也可经设计而具有自杀位置，其允许配对的调节剂更有效的调节。一旦调节剂与配体结合，自杀位置就变为单链并且不稳定，因此利于由天然存在于血液中的酶(例如血液或肝脏的内切核酸酶)对配体的切割。这提供了从循环中有效且基本上是立即消除活性配体的方式。
化学修饰
在核酸的治疗用途中遇到的一个问题是，呈其磷酸二酯形式的寡核苷酸在表现所需作用之前，在体液中可被胞内和胞外酶(例如内切核酸酶和外切核酸酶)快速降解。核酸配体的某些化学修饰可提高核酸配体的体内稳定性或者增强或介导核酸配体的递送。另外，某些化学修饰可通过稳定或促进核酸配体内所需结构元件的形成或者提供与靶分子的另外的分子相互作用而增强核酸配体对其靶标的亲和力。
配体的修饰可包括但不限于提供化学基团的修饰，其向核酸配体碱基或向作为整体的配体掺入额外电荷、极化率、疏水性、氢键、静电相互作用和官能度。这样的修饰包括但不限于2′-位的糖修饰、5-位的嘧啶修饰、8-位的嘌呤修饰、在环外胺上的修饰、4-硫代尿苷的取代、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶的取代、主链修饰、硫代磷酸酯或烷基磷酸酯修饰、甲基化、不常见的碱基配对组合(例如异碱基(isobase)异胞苷(isocytidine)和异胍(isoguanidine))等。修饰也可包括3′修饰和5′修饰，例如加帽。
SELEX方法包括鉴定含有修饰核苷酸的高亲和力核酸配体，修饰核苷酸赋予配体改进的特性，例如改进的体内稳定性或改进的递送特性。这类修饰的实例包括在核糖和/或磷酸和/或碱基位置上的化学取代。经SELEX鉴定的含有经修饰核苷酸的核酸配体描述于美国专利号5,660,985，其描述了含有在嘧啶的5-位和2′-位上进行化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美国专利号5,580,737描述了含有经2′-氨基(2′-NH2)、2′-氟代(2′-F)和/或2′-O-甲基(2′-OMe)修饰的一个或多个核苷酸的特异性核酸配体。美国专利号5,756,703描述了含有不同2′-修饰嘧啶的寡核苷酸。
SELEX方法包括将所选寡核苷酸与其它所选寡核苷酸和非寡核苷酸功能性单元组合起来，如美国专利号5,637,459和5,683,867所述。美国专利号5,637,459描述了含有经2′-氨基(2′-NH2)、2′-氟代(2′-F)和/或2′-O-甲基(2′-OMe)修饰的一个或多个核苷酸的高度特异性核酸配体。SELEX方法还包括将所选核酸配体与亲脂性或非免疫原性的高分子量化合物组合在诊断用或治疗用复合物中，如美国专利号6,011,020所述。
如果核酸配体经SELEX方法得到，那么修饰可以是SELEX前或后的修饰。SELEX前修饰可得到对其靶标具有特异性且具有改进的体内稳定性的配体。对2′-羟基(2’-OH)核酸配体进行的SELEX后修饰可导致改进的体内稳定性，而不有害地影响核酸配体的结合能力。在一个实施方案中，配体的修饰包括在分子的3′端的3′-3′反向磷酸二酯键，以及某些或所有核苷酸的2′氟代(2′-F)、2′氨基(2′-NH2)、2’脱氧和/或2′O甲基(2′-OMe)修饰。
本文所述的配体首先通过SELEX使用转录物文库而产生，所述文库中C残基和U残基是2’-氟取代的，而A残基和G残基是2’-OH取代的。尽管这样的修饰产生适于筛选的配体分子，但是高2’羟基含量却使它们并不适于作为药物开发候选者，这是因为以下事实：这些位置对体内核酸酶降解非常敏感，限制了胃肠外给予之后所能达到的最大浓度以及它们的循环半衰期。因此，一旦例如通过SELEX方法鉴定了功能性序列后，就可通过评价取代对配体结构、功能和稳定性的影响来测试单个残基对这些取代的耐受性。
在某些实施方案中，组成配体的核酸包含经修饰的糖和/或经修饰的碱基。在某些实施方案中，修饰包括稳定化修饰，例如2’-稳定化修饰。在一个实施方案中，2’-稳定化修饰可包括在糖环上的2’-氟代、2’脱氧或2’-O-甲基修饰。
在一个实施方案中，设计包括降低配体或调节剂或这两者的2′-羟基含量。在另一个实施方案中，设计包括降低配体或调节剂或这两者的2’-氟含量。在另一个实施方案中，设计包括提高配体或调节剂或这两者的2’-O-甲基含量。
寡核苷酸可包含至少一个经修饰的碱基部分，其选自包括但不限于以下的碱基部分：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲氨基甲基硫代尿苷、5-羧基甲氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2α-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N&异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶氧乙酸、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶氧乙酸(v)、5-甲基硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧基丙基)和2，6-二氨基嘌呤。
本文所述的配体和调节剂的寡核苷酸可包含经修饰的糖基，例如，一个或多个羟基被卤素、脂族基团置换或官能化为醚或胺。在一个实施方案中，呋喃糖残基的2′-位被O-甲基、O-烷基、O-烯丙基、S-烷基、S-烯丙基或卤基中的任何一个取代。在另一个实施方案中，本发明的核酸配体或调节剂可包含至少一个选自包括但不限于以下的经修饰的糖部分：阿拉伯糖、2-氟代阿拉伯糖、木酮糖、己糖、2′-氟代核糖、2′-O-甲基核糖、2′-O-甲氧基乙基核糖、2′-O-丙基核糖、2′-O-甲巯基乙基核糖、2′-O-二乙氨基氧乙基核糖、2′-O-(3-氨基丙基)核糖、2′-O-(二甲氨基丙基)核糖、2′-O-(甲基乙酰氨基)核糖和2′-O-(二甲氨基乙氧基乙基)核糖。
配体或调节剂可包含至少一个选自包括但不限于以下的经修饰的磷酸主链：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、膦酸甲酯、烷基磷酸三酯和甲缩醛(formacetal)或其类似物。
还可通过用更稳定的环结构取代一个或多个核酸环结构，进一步稳定包含茎和环结构的配体分子，用于治疗用途。例如，对于本文所述的GPVI配体，发现用六甘醇间隔基取代环2，导致具有类似亲和力的GPVI配体和具有核苷酸基环的抗GPVI配体。图13A显示在合成中使用的用于六甘醇接头的起始亚磷酰胺。图13B显示当掺入到核酸配体的两个核苷酸之间时的六甘醇间隔基。
在药物组合物中可提供配体，其形式例如改进溶解度或生物利用度的盐形式。
本发明的任何寡核苷酸都可通过本领域已知的标准方法来合成，例如通过使用自动化DNA合成仪(例如可购自例如Biosearch，AppliedBiosystems)。
配体和修饰剂(modifier)在本文中用技术人员容易理解并记录如下的缩略语来描述：“rA”是2′OH A或腺苷；“A”是2’-脱氧A或2’-脱氧腺苷；“mA”是2′-O-甲基A或2’-甲氧基-2’-脱氧腺嘌呤；“rG”是2′-OH G或鸟苷；“G”是2’-脱氧G或2’-脱氧鸟苷；“mG”是2′-O-甲基G或2’-甲氧基-2’脱氧鸟苷；“fC”是2′-氟C或2’-氟-2’脱氧胞苷；“mC”是2′-O-甲基C或甲氧基-2’-脱氧胞苷；“fU”是2′-氟U或2’-氟-尿苷；“mU”是2′-O-甲基U或2’-甲氧基-尿苷；“iT”是反向2′H T，(C6L)是己基氨基接头；(6GLY)是六甘醇间隔基；(PEG40KGL2-NOF)是大约40kDa的支化PEG(SUNBRIGHTTM产品号GL2-400GS2)，(6FAM)是6-羧基荧光素；(s)是两个核苷酸间的硫代磷酸酯键。
与载体偶联
GPVI配体也可包含改进生物利用度或稳定性的修饰。这样的修饰可包括与可包含但不限于亲水性部分或疏水性部分的载体分子缀合。一个实例是与核酸序列缀合的聚乙二醇分子。与例如下文所述的聚合物缀合，可限制血浆区室的分布并增加循环半衰期。
糖修饰，如上所述，可确保稳定性，但它们却不能保证核酸配体为治疗活性的足够药物动力学。在健康个体中，配体在IV注射的数分钟内就被从血浆中清除掉，可能是通过肾排泄。通过将配体与较大的大分子例如聚乙二醇(PEG)缀合，实现在注射后将完整配体保留在血液中达数小时至数日。通过将配体包埋在脂质体中，也可降低配体的血浆清除率。
因此，在一个实施方案中，可将GPVI核酸配体或GPVI配体调节剂与非免疫原性的高分子量化合物例如聚乙二醇(PEG)或其它水溶性药学上可接受的聚合物共价结合或以其它方式连接，所述聚合物包括但不限于聚氨基胺(PAMAM)；多糖例如葡聚糖；或聚噁唑啉(POZ)。GPVI核酸配体或GPVI配体调节剂可通过共价键与高分子量化合物缔合。当使用共价连接时，高分子量化合物可共价连接在配体或调节剂的多种位置上。在某些实施方案中，配体或调节剂可包入脂质体内部，用于给予有需要的宿主。
在一个实施方案中，将配体或调节剂与聚乙二醇(PEG)连接。可将聚乙二醇(PEG)与生物活性化合物缀合，作为“惰性”载体以潜在地(1)延长化合物在循环中的半衰期，(2)改变化合物的分布概况和/或(3)伪装化合物，从而降低其免疫原性潜力并保护其免遭酶促降解。
可将配体或调节剂通过共价键与PEG分子连接。例如，可通过马来酰亚胺或乙烯基砜官能团将寡核苷酸配体或调节剂与5′-巯基连接。
通常，活化PEG和其它活化的水溶性聚合物用适于与治疗药上的所需位点偶联的合适活化基团来活化。将这些聚合物与活性剂缀合的代表性聚合物试剂和方法是本领域已知的，并进一步描述于例如Zalipsky，S.等，″Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols)forModification of Polypeptides″载于Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications，J.M.Harris，Plenus Press，New York(1992)；和Zalipsky，Advanced Drug Reviews，1995，16：157-182。这样的试剂也有市售。
例如，在一个用于制备酰胺连接的缀合物的方法中，使带有活化酯(例如NHS酯，例如mPEG-琥珀酰亚胺基-α-甲基丁酸酯)的水溶性聚合物与活性剂的胺基反应，由此得到活性剂与水溶性聚合物之间的酰胺键。能与活性氨基反应的另外的官能团包括例如N-羟基琥珀酰亚胺基酯、对硝基苯基碳酸酯、琥珀酰亚胺基碳酸酯、醛、缩醛、N-酮-哌啶酮、马来酰亚胺、羰基咪唑、氮杂内酯类、环状酰亚胺硫酮、异氰酸酯、异硫氰酸酯、三氟代乙烷磺酰氯(tresyl chloride)和卤素甲酸酯等。
在一个实施方案中，可将多个GPVI配体或GPVI配体调节剂与一个PEG分子缔合。配体和调节剂可以是相同或不同的序列和修饰。在还一个实施方案中，可将多个PEG分子彼此连接。在该实施方案中，可将针对相同GPVI蛋白靶序列或不同GPVI蛋白序列靶标的一个或多个GPVI配体或GPVI配体调节剂与每个PEG分子缔合。在将对相同靶标具有特异性的多个配体或调节剂与PEG连接的实施方案中，有可能使相同靶标彼此紧密接近，以产生相同靶标之间的特异性相互作用。在将对不同靶标具有特异性的多个配体或调节剂与PEG连接时，有可能使不同靶标彼此紧密接近，以产生靶标间的特异性相互作用。
尽管用于亲水性部分(例如PEG分子)缀合的各种接头和方法是本领域技术人员众所周知的，但是以下仍提供了若干实施方案。在一个实施方案中，氨基接头，例如图14所示的C6己基氨基接头，即6-(三氟乙酰氨基)己醇(2-氰基乙基-N，N-二异丙基)亚磷酰胺，可用于将己基氨基接头添加到合成寡核苷酸的5’端。以下描述了可用于将接头添加到合成寡核苷酸上的其它接头亚磷酰胺：
以下结构的TFA-氨基C4CED亚磷酰胺(可得自ChemGenes，目录号CLP-1453)：
Figure BPA00001505315800481
以下结构的5’-氨基修饰剂C3TFA(可得自Glen Research目录号10-1923-90)：
Figure BPA00001505315800482
5’-氨基-修饰剂C3-TFA
以下结构的5’-氨基修饰剂5(可得自Glen Research，目录号10-1905-90)：
Figure BPA00001505315800491
5’-氨基修饰剂5，
以下结构的5’-氨基修饰剂C12(可得自Glen Research，目录号10-1912-90)：
Figure BPA00001505315800492
5’-氨基-修饰剂C12，
以下结构的5’巯基-修饰剂C6(可得自Glen Research，目录号10-1926-90)：
5’-巯基修饰的接头用于例如PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺和PEG-邻吡啶基-二硫化物。
PEG的大小范围可为5-200KD，通常用于药物制剂的PEG范围为10-60KD。可制备至多约30KD的直链PEG。对于大于30KD的PEG，可将多个PEG连接在一起(多臂或“支化”PEG)以制备所需大小的PEG。具有支化“mPEG2”连接(两个mPEG通过氨基酸连接)的化合物的通用合成描述于Monfardini等，Bioconjugate Chem.1995，6：62-69。对于“支化”PEG，即包含不止一个与共同反应性基团连接的PEG或mPEG的化合物，PEG或mPEG可通过氨基酸(例如赖氨酸)连接在一起或者它们可通过例如甘油连接。对于每个mPEG为约10、约20或约30KD的支化PEG而言，总质量为约20、约40或约60KD，并且化合物按其总质量提及(即40kD mPEG2是两个连接的20kD mPEG)。可用作制备PEG化的化合物的试剂的40KD总分子量PEG，包含例如以下结构的[N2-(一甲氧基20K聚乙二醇氨基甲酰基)-N6-(一甲氧基20K聚乙二醇氨基甲酰基)]赖氨酸N-羟基琥珀酰亚胺：
Figure BPA00001505315800501
可用于制备稳定化的本发明化合物的另外的PEG试剂包括以下通式的其它支化PEG N-羟基琥珀酰亚胺(mPEG-NHS)：
Figure BPA00001505315800502
Figure BPA00001505315800503
总分子量为40KD或60KD(其中每个mPEG为约20或约30KD)。如上所述，支化PEG可通过任何合适试剂例如氨基酸而连接，在某些实施方案中，通过赖氨酸残基或甘油残基而连接。
它们也可包含以下通式的非支化mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)：
Figure BPA00001505315800511
其中mPEG为约20KD或约30KD。在一个具体的实施方案中，活性酯是-O-CH2CH2-CO2-NHS。
试剂也可包括通过甘油连接的支化PEG，例如SunbrightTM系列(来自NOF Corporation，Japan)。这些试剂的具体非限制性实例是：
Figure BPA00001505315800512
(SUNBRIGHTGL2-400GS2)；
Figure BPA00001505315800513
(SUNBRIGHT GL2-400HS)；和
Figure BPA00001505315800514
(SUNBRIGHT GL2-400TS)。
试剂也可包含以下通式的非支化琥珀酰亚胺基α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)：
Figure BPA00001505315800521
其中mPEG介于10和30KD之间。在一个亚实施方案中，活性酯是-O-CH2CH2CH(CH3)-CO2-NHS。该结构的化合物由Nektar Therapeutics售卖，目录号2M4K0R01。
PEG试剂也可包括硝基苯基碳酸酯连接的PEG，例如以下结构：
Figure BPA00001505315800522
该结构的化合物是市售的，例如来自Sunbio，Inc.。可将包含硝基苯基碳酸酯的化合物与含有接头的伯胺缀合。在该反应中，O-硝基苯基作为离去基团，留下结构[mPEG]n-NH-CO-NH-接头-配体。
如上所述的具有可用于巯基修饰接头的巯基反应基团的PEG，包括以下通用结构的化合物：
Figure BPA00001505315800523
其中mPEG为约10、约20或约30KD。另外，该结构可以是支化的，例如其中每个mPEG为约10、约20或约30KD并且总质量为约20、约40或约60KD。如上所述的具有可用于巯基修饰接头的巯基反应基团的支化PEG，包括这样的化合物：其中支化PEG的总分子量为约40或60KD(其中每个mPEG为20或30KD)。PEG试剂也可以是以下结构：
Figure BPA00001505315800531
PEG-马来酰亚胺使靶化合物的巯基PEG化，其中马来酰亚胺环的双键断开以与巯基连接。反应速率是pH依赖性的，并且在一个实施方案中，是在介于pH6和10之间、或介于pH7和9之间、或约pH8进行。
在一个实施方案中，多个GPVI配体调节剂可与一个PEG分子缔合。调节剂可以是针对相同或不同的GPVI核酸配体。在有多个调节剂针对相同配体的实施方案中，因与配体有多重结合相互作用，所以亲和力增加。在还一个实施方案中，多个PEG分子可彼此连接。在该实施方案中，针对相同核酸配体或不同配体的一个或多个调节剂可与每个PEG分子缔合。这也导致各调节剂与其靶标的亲和力增加。
在一个实施方案中，核酸配体或其调节剂可与亲脂性化合物(例如胆固醇、二烷基甘油或二酰基甘油)共价连接。亲脂性化合物或非免疫原性的高分子量化合物可与配体或调节剂共价键合或通过非共价相互作用缔合。配体或寡核苷酸调节剂与亲脂性或非免疫原性的高分子量化合物可直接连接或者使用接头或间隔基连接。
在使用直接共价连接的实施方案中，亲脂性化合物或非免疫原性高分子量化合物可共价结合在配体或调节剂的各种位置上，例如连接在碱基上的环外氨基、嘧啶核苷酸的5-位、嘌呤核苷酸的8-位、磷酸的羟基或者5′端或3′端的羟基或其它基团。
在配体或调节剂通过接头或间隔基与亲脂性或非免疫原性的高分子量化合物连接的实施方案中，可使用例如六碳氨基接头将亲脂性化合物或非免疫原性高分子量化合物与配体或调节剂连接。
在另一个实施方案中，接头与核酸序列间可包含一个或多个磷酸基团。
将配体或调节剂与亲脂性化合物或非免疫原性高分子量化合物连接的另外的合适接头和间隔基描述于美国专利号7,531,524，其通过引用结合到本文中。
可在例如碱基部分、糖部分或磷酸主链上对本发明的寡核苷酸进行修饰，以改进性能，例如分子的稳定性和对预期靶标的亲和力。
G.治疗血小板介导的病症的方法
血小板含有2种生理上重要的胶原受体：GPVI和整联蛋白α2β1。这其中，响应胶原的血小板激活通过GPVI介导。由胶原与GPVI相互作用所导致的血小板激活，导致致密和α-颗粒内容物从血小板中释放。颗粒组分包括多种血小板激动剂以及促炎细胞因子、生长因子、粘附分子和其它蛋白，包括：ATP、GTP、ADP、GDP、多磷酸、CD63、LAMP2、5-羟色胺、血小板因子4、β-血小板球蛋白、MIP-1α、RANTES、MCP-3、CCL17、CXCL1、CXCL5、IL-8、BFGF、EGF、HGF、胰岛素样生长因子1、TGF-β、VEGF-A、VEGF-C、PDGF、P-选择蛋白、vWF、血小板反应蛋白、血纤蛋白原、整联蛋白αIIβ3和αvβ3、纤连蛋白、白蛋白、α1-胰蛋白酶、Gas6、富含组氨酸的糖蛋白、高分子量激肽原和淀粉样蛋白β-蛋白前体。因此，通过GPVI与胶原的相互作用的血小板激活局部创造了能刺激附近的多种细胞类型的促炎环境。
GPVI与胶原的相互作用也是血小板粘附到患病或受损的血管壁上所需要的。最终，由胶原导致的GPVI激活触发血小板聚集。由胶原导致的GPVI激活在当血管破坏暴露出血管胶原时的止血中起到重要作用，因而导致血小板栓塞的形成。尽管已经充分理解血小板在血栓形成中的作用并且该作用通常是由GPVI与胶原I和III型相互作用所介导，所述胶原I和III型存在于内皮下基质中并且在动脉粥样硬化斑块中富集，但是更多新近数据表明血小板一旦激活后的促炎反应可成为多种疾病状态加上血栓性疾病的原因，所述疾病状态包括动脉粥样硬化、糖尿病性血管病、类风湿性关节炎和硬皮病。例如，当GPVI的表达异常高时，或者当血小板暴露给处于病理生理水平的胶原时，或者当血小板暴露给异常分布的胶原时，GPVI与胶原的相互作用可导致疾病状态。因此，本文提供使用治疗有效量的GPVI配体治疗血小板介导的疾病或病症的方法。这些GPVI配体可通过与血小板结合并抑制其激活而发挥作用。
为了理解抗GPVI治疗可产生疗效的疾病，仅需要理解GPVI对体内存在的不同胶原类型的特异性，因为胶原对血小板的激活需要胶原能够与GPVI相互作用。有29种不同类型的胶原。这其中有9种已经鉴定在血管系统中表达，包括I、III、IV、V、VI、VIII、XII、XIII和XIV型。另外，这其中有7种是纤维状的并能装配成稳定的三螺旋和更高级的纤维状结构，包括I、II、III、IV、V、XI、XXIV和XXVII型(Nieswandt等，Blood，2003，102：449-461；Herr等，J.Biol.Chem，2009，284：19781-19785)。已经证明原纤维形成胶原(I、II、III和IV型)支持血小板激活、聚集和粘附，而非纤维状胶原(VI、VII和VIII型)仅诱导微弱粘附，却不导致血小板聚集。因此，胶原I-IV型可与GPVI相互作用以特异性激活血小板。另外，已经证明GPVI与胶原I-IV型特异性结合(Jung等，Platelets，2008；19：32-42)。因此，胶原I-IV型高表达的疾病，或者血小板的这些胶原类型发生异常定位或呈递的疾病，可用GPVI配体来治疗。
已经充分理解胶原和胶原相关肽的GPVI结合的结构要求(参见实施例6；另见Smethurst等，J.Biol.Chem.，2007，282：1296-1304；Smethurst等，Blood，2004，103：903-911；Horii等，Blood，2008：936-942)。GPVI在胶原原纤维内的一个主要识别位点是三肽序列GPO。另外，GPVI中的胶原结合沟间隔大约5.5nM。因此，预期含有GPO重复序列并形成能以约5.5nm单位间距显示GPO重复序列以使它们能结合GPVI二聚体的纤维状结构的其它胶原类型，通过GPVI激活血小板，导致可用GPVI配体来治疗疾病。
GPVI通常在血小板上以低至中等水平表达，通常受体数量为约1200/血小板。然而，GPVI表达水平增加可使血小板对胶原过度反应，并因此使个体易患疾病，或直接引起由血小板-胶原相互作用所介导的疾病状态。GPVI的过量表达已知与血栓性血管病的发作相关，所述血管病包括短暂性缺血发作(TIA)和急性冠状动脉综合征(Bigalke等，Thromb.Res.，2010：125：e184-189；Bigalke等，Int.J.Cardiol.，2009年1月11日电子版；Bigalke等，Clin.Res.Cardiol.，2010，99：227-233)。因此，用GPVI配体对脑血管事件(例如TIA和中风)的治疗，或对急性冠状动脉综合征的治疗，可得到疗效。
共同的分子机制是血小板在止血和炎症反应中的作用基础。例如，在血管内皮损伤存在时，例如在糖尿病和在动脉粥样硬化血栓性血管病中，有高水平的GPVI血小板激活。这导致细胞因子的释放以及白细胞的激活、定位和成熟。在动脉粥样硬化性血管病存在下，该过程的产生和持续存在也导致血小板粘附到内皮表面、斑块不稳定并导致进一步的血管损伤。这样的事件组合可导致血管中缺血。因此，阻止或降低血小板不良激活的治疗药(例如GPVI配体)可用于治疗已知与例如上调GPVI在血小板上的表达或通过增加向胶原的暴露而增加血小板激活相关的各种各样的疾病。
糖尿病与增强的胶原介导的血小板激活相关，并且在患有糖尿病的个体中GPVI表达比未患病个体明显更高(Cabeza等，Diabetes，2004，53：2117-2121)。在糖尿病中的高GPVI表达明显促进了糖尿病相关的血栓性缺血并发症，从而抗GPVI治疗在治疗糖尿病相关的血栓性缺血疾病中可得到疗效。GPVI的激活明显增强了CD40L的表面表达。CD40L是参与血栓形成和动脉粥样硬化的强效血小板衍生细胞因子。此外，CD40L在GPVI激活的血小板中过量表达，增强了CD62P、αvβ3、细胞间粘附分子1的内皮表面表达，并增强单核细胞趋化蛋白1的分泌。这些结果表明，胶原受体GPVI的功能在2型糖尿病中被改变并在糖尿病性动脉粥样硬化血栓性并发症和局部血管病中起到重要作用。
因此，GPVI配体可用于治疗通常与糖尿病相关的各种各样的血小板介导的病症。在一个实施方案中，提供了治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括给予GPVI配体。用GPVI配体治疗高危糖尿病患者，可降低或预防这些患者中的糖尿病相关疾病。这些病症包括但不限于糖尿病性视网膜病、糖尿病性血管病、动脉粥样硬化、缺血性发作和慢性肾衰竭。用GPVI配体治疗糖尿病，也可在这些患者中降低或抑制微血栓的形成。
还提供治疗患有血小板介导的炎性病症例如类风湿性关节炎(RA)或其它炎性关节炎病症的患者的方法。近期研究已经证明，患有RA和其它形式的炎性关节炎的人在他们的关节液中血小板微粒水平升高(Boilard等，Science，2010，327：580-583)。血小板微粒是促炎的并能引发周围细胞(例如滑液成纤维细胞)的炎性反应。例如，胶原IV型与GPVI的结合导致释放IL-1和IL-8。
小鼠中的机械论研究使促炎血小板状态与GPVI激活关联。在敲除小鼠模型中GPVI不存在，阻止了滑膜和胞外基质中促炎细胞的募集并因此阻止了白细胞的募集和成熟。
关节炎症导致关节胞外基质中血小板与胶原的相互作用，通过邻近细胞的GPVI介导的血小板激活而导致炎症扩张并表现出可被GPVI配体治疗的RA/炎性关节炎病症。因此，GPVI配体可提供在改善、降低或预防炎性疾病中的治疗用途，所述疾病例如RA或其它炎性关节炎疹，包括但不限于痛风、银屑病性关节炎、反应性关节炎、病毒性或病毒感染后关节炎和脊柱关节炎。
GPVI配体也可用于治疗患有硬皮病或系统性硬化症的患者。硬皮病似乎是作为在肌肉和关节中产生肿胀(炎症)的自身免疫应答而发生的，与胶原的过度产生相关。微血管损伤是涉及系统性硬化症或硬皮病的一个重要的致病过程。在暴露的内皮下基质中，血小板I和III型胶原受体(GPVI)与其各自配体相互作用，其作为在系统性硬化症患者中的进行性微血管损伤的结果，导致血小板激活和聚集以及释放促炎介质，其促进血管损伤和炎症(Chiang等，Thrombosis，2006，117：299-306)。在系统性硬化症中，血管损伤的特点在于小动脉—毛细血管血管周炎并伴有单核细胞浸润，其导致动脉内膜增殖以及微动脉和毛细血管闭塞并伴有内皮细胞和基膜的磨损。内皮细胞或基膜或这两者的损伤的复发模式是系统性硬化症的特点。另外，这些事件受到身体组织中胶原的过量产生和积累的驱动，导致全身组织广泛硬化和瘢痕化。因此，使用GPVI配体可提供对疾病(例如胶原水平升高和血小板介导的微血管损伤相关的硬皮病或系统性硬化症)的治疗性缓解。本文提供通过给予治疗有效量的GPVI配体而治疗硬皮病患者的方法。
本文所公开的GPVI配体也可用于治疗经诊断患有癌症的患者。近期研究表明GPVI介导肿瘤转移(参见例如Jain等，J.Thromb.Haemostasis，2009，7：1713-1717)。使用体内实验性转移测定，Jain等人证明GPVI敲除小鼠的肿瘤转移比野生型对照小鼠表现出显著减少。因此，在一个实施方案中，提供用于抑制、减少或预防经诊断患有原发性癌肿瘤的患者中的转移的方法，其中给予患者治疗有效量的GPVI配体。
也提供本文所述的GPVI核酸配体的方法、药物组合物和用途，作为用于疾病的可调节的抗血小板药或需要抗血小板治疗的治疗方案。在某些实施方案中，治疗是手术干预。方法可包括将GPVI核酸配体给予有需要的宿主，其中宿主患有冠状动脉、脑或外周血管系统的闭塞性血栓疾病或病症或者处于患这些疾病或病症的风险中。
在一个实施方案中，GPVI配体抑制血小板激活的起始。在其它实施方案中，GPVI配体抑制血小板激活和随之产生的血小板促炎反应。在其它实施方案中，GPVI配体抑制血小板粘附。在其它实施方案中，GPVI配体抑制血小板聚集。在还一个实施方案中，GPVI配体抑制凝血酶的产生。
在一个实施方案中，宿主患有冠状动脉、脑或外周血管系统的闭塞性血栓疾病或病症或者处于患这些疾病或病症的风险中。在某些其它实施方案中，宿主准备接受或正在接受手术干预，或者已经接受手术干预，所述手术干预使患者处于闭塞性血栓事件的风险中。在其它实施方案中，宿主已经接受血管移植，使其能够进行血液透析，其因血管与血小板间的相互作用而处于闭塞的风险中。
在某些实施方案中，提供治疗或预防血管事件的形成、尤其是血栓事件或血栓栓塞事件(thromboembolitic event)的方法，所述方法包括将本发明的GPVI核酸配体给予有需要的宿主。
在一个实施方案中，在延长的时间期间内提供GPVI核酸配体。在这种情况下，GPVI配体调节剂仅可用于紧急情况，例如如果治疗导致出血，包括颅内或胃肠道出血。在另一个实施方案中，当已经接受GPVI核酸配体治疗的患者需要紧急手术时，给予调节剂。在另一个实施方案中，给予调节剂以控制GPVI核酸配体的浓度并因此控制治疗持续时间和强度。在另一个实施方案中，在心肺分流术期间，提供GPVI核酸配体作为血小板麻醉剂。在另一个实施方案中，给予GPVI核酸配体，以提供停止或开始口服抗血小板药物的过渡期，并且，一旦建立起口服抗血小板药的治疗水平，调节剂就用于逆转GPVI核酸配体。
H.药物组合物
本文教导的GPVI核酸配体或GPVI配体调节剂可配制成药物组合物，其可包含但不限于药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。组合物的准确性质将(至少部分)取决于配体和/或调节剂的性质，包括任何稳定化修饰和给药途径。含有调节剂的组合物可经设计用于给予已接受GPVI核酸配体的宿主，以允许调节配体活性，并因此调节所给予的GPVI核酸配体的抗血小板活性。
本领域技术人员根据本说明书将会知道药物组合物或药理学组合物的设计和制备。通常，这类组合物可制备成下列形式：注射用的液体溶液剂或混悬剂；适于在注射之前溶于或悬浮于液体中的固体形式；口服给药用的片剂或其它固体；定时释放胶囊剂；口服给药用的液体剂；酏剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂或本领域所用的任何其它形式，包括滴眼剂、乳膏剂、洗剂、软膏剂、吸入剂等。无菌制剂(例如基于盐水的洗剂)被外科医生、内科医生或健康护理工作者用于在手术区处理特定区域的用途也可以是特别有用的。也可将组合物配制成用于通过微装置、微粒或海绵递送。
包含本发明GPVI核酸配体或GPVI配体调节剂的药学上有用的组合物可至少部分地通过混合药学上可接受的载体来配制。这类载体和配制方法的实例可参见Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第20版(Lippincott Williams&Wilkins，2000)和Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第6版(Media，Pa.：Williams&Wilkins，1995)。
合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲剂和pH调节剂。合适的添加剂包括生理上生物相容性缓冲剂(例如氨丁三醇、盐酸)，螯合剂添加物(例如EDTA、DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合物添加物(例如钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)，或者任选的钙盐或钠盐添加物(例如氯化钠、氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)。本发明的药物组合物可包装成以液体形式使用，或可冻干。
为了形成适于有效给予的药学上可接受的组合物，这类组合物含有有效量的核酸配体或调节剂。这类组合物可含有不止一种化合物的混合物。组合物通常含有约0.1％重量百分比(wt％)至约50wt％、约1wt％至约25wt％、或约5wt％至约20wt％的活性剂(配体或调节剂)。
本文提供了用于胃肠外注射给药(包括皮下、肌内或静脉内注射和输注)的药物组合物。对于胃肠外给药，需要无菌混悬剂和溶液剂。当需要静脉内给予时，使用通常含合适防腐剂的等渗制剂。药物组合物可被灭菌和/或含有辅料，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂(solution promoter)、用于调节渗透压的盐类和/或缓冲剂。液体(尤其注射用组合物)可例如通过溶解、分散等制备。将活性化合物溶于药学纯的溶剂(例如水、缓冲水、盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇等)中或与之混合，由此形成注射用溶液剂或混悬剂。另外，可配制适于在注射之前溶于液体中的固体形式。
为了帮助将试剂分散到含水环境中，可加入表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可包括阴离子型去垢剂，例如月桂基硫酸钠、磺基丁二酸二辛酯钠和磺酸二辛酯钠。可使用阳离子型去垢剂，其可包括苯扎氯铵或卞索氯铵。可包含在制剂中作为表面活性剂的非离子型去垢剂包括但不限于聚桂醇400、聚乙二醇酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯20、40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和任何pluronic去垢剂例如Pluronic F68和/或Pluronic F127(例如参见Strappe等，Eur.J.ofPharm.Biopharm.，2005，61：126-133)。表面活性剂可存在于蛋白或衍生物的制剂中，可单独存在或以不同比例的混合物形式存在。
对于片剂或胶囊剂形式的口服给药，可将活性药物成分与口服的无毒药学上可接受的惰性载体(例如乙醇、甘油、水等)混合。此外，如果需要或必要的话，也可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入到混合物中。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、明胶、天然糖类例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然及合成胶例如阿拉伯胶、西黄蓍胶或藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。这些剂型所用的润滑剂包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄原胶等。
对于口服给药中使用的液体形式，可将活性药物成分与适当矫味的悬浮剂或分散剂混合，所述悬浮剂或分散剂例如合成及天然胶，例如西黄蓍胶、阿拉伯胶、甲基纤维素等。其它可使用的分散剂包括甘油等。
可将含有活性药物成分的局部制剂与本领域众所周知的各种载体材料(例如醇类、芦荟凝胶、尿囊素、甘油、维生素A和E油、矿物油、PPG2肉豆蔻基醚丙酸酯等)混合，以形成例如含醇溶液剂、局部清洁剂、清洁用乳膏剂、皮肤凝胶剂、皮肤洗剂以及乳剂或凝胶制剂的洗发剂。
本发明的化合物也可以脂质体递送系统(例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡)形式给予。脂质体可由各种各样的磷脂(例如胆固醇、十八烷基胺或磷脂酰胆碱)形成。直接给予(例如单独)或以脂质体制剂给予的活性剂描述于例如美国专利号6,147,204。
也可将本发明的化合物与可溶性聚合物偶联，作为可寻靶的药物载体(targetable drug carrier)。这样的聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺酚、聚羟基乙基aspartamide酚或被棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。此外，可将本发明的化合物与一类可用于达到药物控制释放的生物可降解聚合物偶联(优选通过共价键)，所述聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、聚ε己内酯、聚噁唑啉、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛类、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸类和水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。可将胆固醇和类似分子与核酸配体连接，以增加和延伸生物利用度。
可通过本领域目前已知或随后开发的多种技术中的任一种，制备可与本发明调节剂一起配制用于本发明的亲脂性化合物和非免疫原性高分子量化合物。通常，它们制备自磷脂，例如二硬脂酰磷脂酰胆碱，并且可包含其它材料，例如中性脂(例如胆固醇)，以及表面修饰剂，例如带正电荷(例如十八烷胺或氨基甘露糖或胆固醇的氨基甘露醇衍生物)或负电荷(例如二乙酰基磷酸、磷脂酰甘油)的化合物。多层脂质体可通过常规技术形成，也就是说，通过使所选脂质沉积在合适容器或器皿的内壁(通过将所选脂质溶于合适溶剂中，再蒸发溶剂并在器皿内壁留下薄层)或通过喷雾干燥。再在旋转或涡旋运动条件下将含水相加入到器皿中，导致MLV的形成。然后可通过对MLV进行匀浆、超声处理或挤出(通过滤器)形成UV。另外，可通过去垢剂去除技术形成UV。在本发明的某些实施方案中，复合物包括这样的脂质体：其中靶向核酸配体缔合在脂质体表面并具有包入的治疗剂或诊断剂。预先形成的脂质体可经修饰以与核酸配体缔合。例如，阳离子型脂质体通过静电相互作用与核酸缔合。或者，可将与亲脂性化合物例如胆固醇连接的核酸加入到预先形成的脂质体中，从而使胆固醇与脂质体膜缔合。或者，可在脂质体配制期间将核酸与脂质体缔合。
在另一个实施方案中，可按照技术人员已知的方法，用包含GPVI配体或GPVI配体调节剂的制剂来包被支架或医疗器械。
也涵盖了治疗用药盒。药盒包含实施以上方法所需的试剂、活性剂和材料。药盒通常在合适容器设备中含有药学上可接受的GPVI配体和/或GPVI配体调节剂的制剂。药盒可具有单个容器设备，和/或可具有用于每种化合物或每种反应混合物或步骤的不同容器设备。
I.给予方法
将本发明GPVI配体和/或GPVI配体调节剂给予宿主的方式包括但不限于胃肠外(通过注射或随时间逐渐输注)、静脉内、皮内、关节内、滑液内、鞘内、动脉内、心内、肌内、皮下、眼眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、局部、透皮贴剂、经直肠、阴道或尿道栓剂、腹膜、经皮、鼻腔喷雾、手术植入、内用外科涂剂、输注泵递或经导管。在一个实施方案中，试剂和载体可以缓释制剂给予，例如植入物、大丸剂、微粒、微球体、纳米粒或纳米球。在一个实施方案中，GPVI核酸配体是通过皮下注射或沉积(包括皮下输注(例如通过渗透泵))递送。
在一个实施方案中，GPVI核酸配体是通过皮下给药而递送，调节剂是通过皮下或静脉内给药而递送。
包含本发明配体和调节剂的治疗组合物可静脉内给予，例如通过单位剂量注射。术语“单位剂量”当用于本发明的治疗组合物时，是指适于作为单位剂量用于宿主的物理上分开的单位，每一单位含有经计算能产生所需疗效的预定量的活性材料以及所需的稀释剂；即载体或溶媒。
另外，用于胃肠外给药的一个方法使用缓释或持续释放系统的植入，其确保维持恒定水平的剂量。
也提供局部给药，例如给予患病关节的间质。局部给药可通过注射而完成，例如用注射器或者含有注射装置(例如针头)的其它制品。可通过在分配注射器内容物的所需时间期间内的控制压力来控制注射器的给药速率。在另一个实例中，局部给药可通过输注完成，可通过使用泵或其它类似装置利于输注。
也提供了用于局部给予至血管组织的代表性非限制性方法，包括(1)用包含核酸配体的凝胶剂包被或浸渍血管组织，用于体内递送，例如通过植入经包被或浸渍的血管来替代被除去或分流的损伤或患病的血管组织区段；(2)通过导管向需要递送的血管进行递送；(3)将组合物泵入准备植入患者的血管中。或者，可通过显微注射或通过脂质体包封将化合物导入细胞中。
还提供的是，通过用含有配体的药物组合物包被医疗器械例如支架，将GPVI配体给予受试者。允许配体适当释放和给予的包被方法方法是本领域普通技术人员已知的。
本领域技术人员可以容易地确定本文所述组合物的最佳给药方案，所述方案可因调节剂、患者和所寻求的效果的不同而异。有效量可因各种因素的不同而异，所述因素例如个体病况、体重、性别、年龄和所给予的核酸配体量。其它因素包括给药方式。
通常，将以针对体重调节的剂量给予组合物，例如剂量范围为约1μg/kg体重至约100mg/kg体重。更通常，剂量范围为约0.1mg/kg至约20mg/kg，更通常为约0.5mg/kg至约10mg/kg、或约1.0至约5.0mg/kg、或约1.0mg/kg、约2.0mg/kg、约3.0mg/kg、约4.0mg/kg、约5.0mg/kg、约6.0mg/kg、约7.0mg/kg、约8.0mg/kg、约9.0mg/kg或约10.0mg/kg。通常，剂量最初提供的血浆药物浓度为约0.002μg/ml至约2000μg/ml药物，更通常是约2.0μg/ml至约400μg/ml，更通常是约10μg/ml至200μg/ml，或约20μg/ml至约100μg/ml药物，约20μg/ml、约40μg/ml、约60μg/ml、约80μg/ml、约100μg/ml、约120μg/ml、约140μg/ml、约160μg/ml、约180μg/ml或约200μg/ml。
当将调节剂给予已被给予配体的宿主时，可根据所需配体抑制水平来调整调节剂与配体的比例。可根据与配体剂量的相关性来计算调节剂剂量。在一个实施方案中，调节剂与配体的重量∶重量的剂量比为1∶1。在其它实施方案中，调节剂与配体的比率为大于1∶1，例如2∶1或约2∶1、3∶1或约3∶1、4∶1或约4∶1、5∶1或约5∶1、6∶1或约6∶1、7∶1或约7∶1、8∶1或约8∶1、9∶1或约9∶1、10∶1或约10∶1或更高。在其它实施方案中，调节剂与配体的剂量比为小于约1∶1，例如0.9∶1或约0.9∶1、0.8∶1或约0.8∶1、0.7∶1或约0.7∶1、0.6∶1或约0.6∶1、0.5∶1或约0.5∶1、0.45∶1或约0.45∶1、0.4∶1或约0.4∶1、0.35∶1或约0.35∶1、0.3∶1或约0.3∶1、0.25∶1或约0.25∶1、0.2∶1或约0.2∶1、0.15∶1或约0.15∶1、0.1∶1或约0.1∶1或小于0.1∶1例如约0.005∶1或更低。在某些实施方案中，所述比率介于0.5∶1和0.1∶1之间，或介于0.5∶1和0.2∶1之间，或介于0.5∶1和0.3∶1之间。在其它实施方案中，所述比率介于1∶1和5∶1之间，或介于1∶1和10∶1之间，或介于1∶1和20∶1之间。
本发明的GPVI核酸配体可以每天一次剂量、两天一次剂量经静脉内给予，或总的日用量可以若干分次剂量来给予。配体和/或调节剂的给予可提供每天1次(q.d.)、每天2次(b.i.d.)、每天3次(t.i.d.)或视需要提供更多次。然后，通过任何合适方式提供调节剂以通过给予调节剂来改变核酸配体的作用。本发明的核酸配体可皮下给予，每周2次，每周1次，每两周1次或每月1次。在某些实施方案中，配体或调节剂的给予次数不比每天1次频繁。例如，可每2天、每3天、每4天、每周或每月1次地进行配体给予。
在一个实施方案中，可能需要联合给予或序贯给予其它药物。对于用不止一种活性剂的联合治疗，当活性剂是分开的剂量制剂时，可以同时给予活性剂，或者它们可以彼此错开的时间分别给予。
按照与剂量制剂相容的方式，并以治疗有效量给予组合物。待给予的量取决于待治疗的宿主、宿主系统利用活性成分的能力、以及所需疗效的程度。需要给予的活性成分的准确量取决于执业医师的判断并且是因人而异。然而，用于系统性应用的合适剂量范围是本文公开的并且取决于给药途径。合适给药方案也是可变的，但通常是初次给予后通过随后注射或其它给予一个或多个小时间隔的重复剂量。或者，提供足以维持体内治疗指定范围内的血液浓度的连续静脉内输注。
实施例
实施例1：GPVI的核酸配体的鉴定
SELEX方法用于获取与所述GPVI胞外结构域结合的配体，并图示于下图1。
通过加热退火和快速冷却1纳摩尔模板DNA oligo和1.5纳摩尔5’DNA引物oligo，产生起始候选DNA文库。用于设计候选混合物的DNA模板oligo的序列是：5’-TCTCGGATCC TCAGCGAGTCGTCTG(N40)CCGCA TCGTCCTCCC TA-3’(SEQ ID NO：4)(N40代表用等摩尔量的A、T、G和C合成的40个连续核苷酸)，5’引物oligo和3’引物oligo分别为，5’-GGGGGAATTC TAATACGACT  CACTATAGGG AGGACGATGC GG-3’(SEQ ID NO：5)(T7启动子序列有下划线)，和5’-TCTCGGATCC TCAGCGAGTC GTCTG-3’(SEQID NO：6)。以Exo-Klenow加入反应，通过加入终浓度2mM的EDTA终止，并用PCI(酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1))和随后氯仿∶异戊醇(24∶1)提取。将提取物用Amicon 10离心柱脱盐、浓缩并除去未掺入的核苷酸。将DNA模板用于转录反应，以产生2’-氟嘧啶起始文库。体外转录条件是40mM Tris-HCl pH 8.0、4％PEG-800、12mM MgCl2、1mM亚精胺、0.002％Triton、5mM DTT、1mM rGTP、1mM rATP、3mM 2’F-CTP、3mM 2’F-UTP、8μg/mL无机焦磷酸酶、0.5μM DNA文库和Y639F突变体T7聚合酶。将转录物在37℃温育过夜，经DNA酶处理，氯仿∶异戊醇(24∶1)提取2次，用Amicon 10离心柱浓缩，然后在12％变性PAGE凝胶上进行凝胶纯化。从凝胶上将RNA洗脱下来，然后在Amicon 10离心柱上更换缓冲液并用TE (10mM Tris pH 7.5、0.1mMEDTA)洗涤液浓缩。
用约1014个不同2’-氟嘧啶RNA序列的复杂文库开始GPVI选择。将复杂RNA池针对固定在链霉抗生物素珠上的生物素-PEG6-His6肽预先清除。将预先清除的RNA与纯化的带有C端His6标签的GPVI蛋白的重组胞外结构域(SEQ ID NO：3)结合。纯化的带组氨酸标签的GPVI胞外结构域蛋白得自R&D Systems(Minneapolis，MN)，目录号3627-GP，并且包含残基Gln21-Lys267。
在结合缓冲液“E”中进行起始的GPVI配体选择，在随后的几轮中增加对结合缓冲液“F”的严格性。结合缓冲液E由以下成分组成：20mM HEPES pH 7.4、50mM NaCl、2mM CaCl2和0.01％BSA。结合缓冲液F由以下成分组成：20mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、2mMCaCl2和0.01％BSA。将蛋白-RNA复合物在25mm硝基纤维素盘上区分并洗涤。利用在PCI(25∶24∶1)中温育，将已结合RNA从硝基纤维素盘上提取出来。加入Tris-EDTA缓冲液并提取水相，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)提取。所得的已结合RNA经乙醇沉淀。将四分之一的沉淀RNA加热退火到3’引物并用AMV RT进行逆转录。将全部RT反应物用于PCR，使用5’和3’引物和标准PCR条件，以产生DNA模板用于下一轮RNA产生。每轮选择的具体条件见图2。6轮之后，将选择分为两支，称为“E2”和“EF”。E2选择具有在结合缓冲液E中进行的1-8轮，在结合缓冲液F中进行的9-10轮。EF选择具有在结合缓冲液E中进行的1-6轮，和在结合缓冲液F中进行的7-10轮。
在直接结合研究中使用来自各轮SELEX的放射性标记的配体RNA和可溶性GPVI监测GPVI的配体文库的富集。将痕量P32末端标记的RNA加入到在结合缓冲液F中系列稀释的GPVI中，进行结合研究。为了制备放射性标记的RNA用于结合研究，在50℃用细菌碱性磷酸酶使100皮摩尔RNA脱磷酸1小时。将反应用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取，用氯仿∶异戊醇(24∶1)提取，并经乙醇沉淀。用T4多核苷酸激酶以及所供应的缓冲液和20μCi γ-P32-ATP对3pmole脱磷酸RNA进行末端标记，然后用Biorad MicroBio Spin P-30离心柱纯化。将末端标记的RNA稀释到终浓度为2000cpm/μL并在65℃加热变性5分钟。使用前，将RNA和GPVI稀释液在37℃平衡。在37℃将RNA(5μL)加入到不同浓度的GPVI(15μL)中并一起温育5-15分钟。然后在带洗涤的96孔真空管汇系统中，将已复合的RNA/GPVI蛋白混合物上样到Protean BA85硝基纤维素膜上，覆盖在Genescreen Plus尼龙膜上。使用Molecular Dynamics Storm 840 Phosphorimager，将膜暴露给phosphorimager屏，扫描并定量测定。通过用硝基纤维素上的计数除以总计数并对背景进行调整后求出结合分数。将来自SELEX的10E2轮和10EF轮的富集配体文库的结合结果与从未接触GPVI的起始配体文库进行比较，见图3。
实施例2：GPVI核酸配体的结构家族的测序和鉴定
将代表来自实施例1所述SELEX实验的第10轮的抗GPVI富集配体文库的PCR终产物，用EcoR1和BamH1消化，用纯化试剂盒进行净化，然后定向克隆到线状化pUC19载体中。将细菌菌落划线，以得到单个克隆，再用来自单菌落的5mL过夜培养物接种。使用QiagenPlasmid Mini Prep试剂盒，从单菌落制备质粒DNA。使用载体引物，对来自每个SELEX实验的40个质粒进行测序。源自随机区的DNA序列见图4。对这些序列的分析，鉴定出6个独特序列，其在图4中记为“A”到“F”。全长配体克隆的相应独特DNA序列见下表1，而代表随机区的序列提供于表2。
表1：通过SELEX鉴定的全长DNA配体
Figure BPA00001505315800681
Figure BPA00001505315800691
表2：A-F的随机区
Figure BPA00001505315800692
这些独特配体作为全长RNA的代表见表3，并且作为表明SELEX实验所用的2’-氟嘧啶核苷酸的掺入位点的RNA序列的代表示于表4(f表示2’-氟嘧啶修饰，r表示未经修饰的核糖核苷酸)。全长是指得自SELEX方法的序列，包含源自用于SELEX方法的配体文库的随机部分以及随机区两侧的固定序列部分二者的序列。
表3：全长RNA序列
Figure BPA00001505315800693
Figure BPA00001505315800701
表4：带修饰的全长RNA序列
Figure BPA00001505315800702
Figure BPA00001505315800711
*SEQ ID NO是指在“经修饰的序列”一栏中描述的配体的未经修饰的形式。
rG＝2’核糖G；rA＝2’核糖A；fC＝2’-氟C；fU＝2’-氟U
对这6个序列的进一步检查，鉴定出每个克隆都共享的保守基本序列，由(A/G)UAA)组成，其每侧均侧接有序列GC(例如GC(A/G)UAAGC)，表明这6个独特序列是相关家族的成员。
使用mfold服务器(mfold.bioinfo.rpi.edu)针对潜在二级结构进行序列筛选。对这些方法的描述见该服务器站点以及M.Zuker(2003)“Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.”Nucleic Acids Res.31(13)，3406-15和D.H.Mathews等(1999)“ExpandedSequence Dependence of Thermodynamic Parameters ImprovesPrediction of RNA Secondary Structure”J.Mol.Biol.288，911-940。随后，使用独特序列的比较序列分析，根据保守的共有二级结构元件来比对序列，以达到预测抗GPVI配体的二级结构(参见图5和图8)。
抗GPVI配体共享共有的二级结构，其由3茎(S1-S3)和4环(L1-L4)组成，在环4内具有保守的(A/G)UAA序列，并且侧翼GC序列形成包含茎3的配对区。对抗GPVI配体家族的共有二级结构的解析，鉴定了另外的保守结构元件，如图5所示。环1的大小和序列是保守的，环1是由序列GAC的3个核苷酸组成。环3的大小和序列也是保守的，环3是由2个核苷酸组成，大多数是由序列UU或UG组成，但是CA也存在于家族的一个成员中。茎1是由4-5碱基对组成，而茎2的长度更长，通常由7-8碱基对组成。环2在大小上更多变，长度范围为4-7个核苷酸。
按照以上实施例1所述的结合方法学，通过直接结合研究，使用放射性标记的痕量配体RNA和可溶性GPVI，测定各抗GPVI配体对GPVI的亲和力。抗GPVI配体对GPVI的亲和力高，范围为约11nM至约50nM的Kd，对GPVI的亲和力的等级潜力为EF-2≈EF-3≈E2-6≈EF-22≈EF-31＞＞EF-1。引人关注的是，在环3中含有序列CA的配体EF-1表现出对GPVI的亲和力最低，这与环3的UU或UG序列对高亲和力GPVI结合的重要性是一致的。
实施例3：抗GPVI配体结构的截短和突变探查
图5所示的抗GPVI配体的保守二级结构允许关于形成该结构并与GPVI高亲和力结合所需的最小序列的可靠预测。初始实验旨在限定为维持配体具有所需结构和功能的5’和3’边界序列要求。
图5所示的共有二级结构表明源自配体文库的3’固定区的配体区域对于GPVI结合可能不是必要的。通过将互补DNA 3’引物加热退火到以上鉴定的P32末端标记的RNA上，平衡并进行结合研究(如以上实施例1所述)，测试3’固定区衍生序列对与GPVI相互作用的重要性。结果见图6。有无退火引物时的配体结合是类似的，表明该区对于GPVI蛋白的结合并非必要，正如通过图5所示的共有结构所预测的那样。
制备了若干抗GPVI配体的截短化合物，并测定了它们对GPVI的亲和力；所述化合物含有通过图5所示的共有结构所预测的茎1的5’和3’所需序列边界(表5)。“RB ID”是独特标志，是指在“经修饰的序列”一栏所记录的具有特定修饰的序列的配体。“SEQ ID NO：”是指无修饰的相应核酸序列(DNA和/或RNA)。
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Figure BPA00001505315800751
Figure BPA00001505315800761
若干代表性截短的结合数据见图7。与通过图5所限定的二级结构所预测的共有5’和3’边界一致，EF-1 T1、EF2 T2、EF-3 T2、E2-6 T1、EF-22 T1和EF-31 T2与GPVI结合的Kd与各自的全长原始配体的相当，证明预测的5’和3’端边界足以形成茎1和功能性抗GPVI配体(参见表5)。
图5所示的共有结构表明，茎2可含有比形成稳定茎结构所需的更多碱基对。此外，源自起始配体文库的5’固定区的环1的大小和序列的保守性，连同茎2的大小和环2的长度或序列保守性的缺乏，表明茎2和环2可能在某种程度上具有间隔功能，以适当地呈现环1。根据这些知识，可以降低茎2的大小，而保留与GPVI的高亲和力结合。因此，制备另外的截短以测定与GPVI高亲和力结合所需的茎2的最小尺寸(参见图8A、B、C的二级结构示意图，以及表5的序列标志)。EF-3 T4和T5、以及EF-31 T5、T6和T7与GPVI结合的Kd与各自的全长亲代配体的相当，证明长度短至4碱基对的茎2对于与GPVI的高亲和力结合是足够的。这些结果与茎2和环2在适当呈现环1的GAC序列中的作用是完全一致的。另外，在茎2基部的第2位缺失A-U碱基对的截短EF-3 T3和EF-31 T4，与各自的全长原始配体相比都表现出降低的结合。对这些截短的茎2组成的检查与以上列出的未表现出GPVI亲和力降低的截短的茎2组成进行的比较，揭示出截短EF-3 T3和EF-31 T4在茎2内的该位置上独特地具有U-G，而不是原始序列中存在的G-C碱基对或A-U碱基对。这表明嘌呤-嘧啶对在茎2基部的第2碱基对上可能是高亲和力GPVI结合所需要的，这是图5所示的抗GPVI配体共有二级结构中的保守特征。
图5所示的抗GPVI配体共有二级结构显示了在环1、3和4内的基本序列保守性，以及在环2的大小或序列含量中的不保守性。在这些环内构建突变和取代，以评价这些环序列中所观察到的保守性或其缺失的功能重要性(参见上表5；下划线部分表示突变的残基)。
使在EF-2 T2或EF-3 T2的环3内存在的保守UU突变为AA(EF-2T2mut3和EF-3 T2mut3，参见图9的二级结构示意图)，导致完全丧失与GPVI的可检测结合，这与通过图5所示的共有二级结构所预测的环3的UU或UG序列的重要性是一致的。还使位于EF-3 T2的环3内的保守UU突变为UA(EF-3 T2mut6)和AU(EF-3 T2mut7)。与抗GPVI配体共有结构一致，环3的第1个U突变为A，导致丧失与GPVI的可检测结合，而环3的第2个U突变为A则导致对GPVI的亲和力轻微下降。因此，环3的UA序列，与UU或UG相同，支持抗GPVI配体与GPVI的高亲和力结合，并且与所观察到的环3作为5’-YD-3’的保守性是一致的，其中Y代表嘧啶，U最好是环3中的嘧啶，而D代表U或G或A(而非C)。
使EF-3 T2的环4内的保守GUAA和EF-2 T2的环4内的保守AUAA分别突变为GUUU(EF-3 T2mut4)和AUUU(EF-2 T2mut4)，以及突变为GUGG(EF-3 T2mut5)和AUGG(EF-2 T2mut5)(参见图9的二级结构示意图)。这两组取代都导致完全丧失可检测的GPVI结合，这与通过图5所示的共有二级结构所预测的环4的AUAA或GUAA序列对GPVI结合的重要性是一致的。为了进一步证实环3和环4内的保守序列的重要性，将EF-3 T2的环3变为在EF-22、E2-6和EF-31序列中存在的UG(EF-3 T2mut8)，导致对GPVI的亲和力无显著变化，这与图5所示的抗GPVI配体的保守结构是一致的。另外，将EF-3 T2的环4转变为在EF-2、EF-22、E2-6和EF-31中存在的AUAA(EF-3 T2mut9)，导致对GPVI的亲和力无显著变化，这与图5所示的抗GPVI配体的保守结构是一致的。最后，同时将EF-3 T2环3转变为UG并将环4转变为AUAA(EF-3 T2mut10)，如在EF-22、E2-6和EF-31中所发现的那样，导致对GPVI的亲和力无显著变化，这与图5所示的抗GPVI配体的保守结构是一致的。
制备在环1中具有单点突变的合成抗GPVI配体(RB470-RB472，参见下表6)，将环1序列分别转变为CAC、GUC和GAG。每个取代都导致完全丧失可检测的GPVI结合，这与通过图5所示的共有二级结构所预测的环1的GAC序列对GPVI结合的重要性是一致的。
环2在长度或序列组成上表现出无明显保守性，但却可作为间隔基在分离的配体中起作用，使得能够在源自用于SELEX的配体文库的5’固定序列的GAC序列的环1内呈现(presentation)。这预测环2的核苷酸组成对于与GPVI的高亲和力结合并非必需。与该预测一致，EF-31 T7(RB466)的环2被六甘醇间隔基取代(参见图13A-B)，导致对GPVI的亲和力与原始配体(RB448)相比并无损失。RB 466的结合数据见图10。
实施例4：抗GPVI配体的2’糖修饰和磷酸二酯主链的进一步截短和优化
对于体外筛选，分离自2’-氟嘧啶/2’-羟基嘌呤文库的配体表现出足够的核酸酶稳定性。然而，高2’-羟基含量使它们并不适于药物开发候选，因为这些位置对于体内核酸酶降解可能非常敏感，限制了在胃肠外给予之后所能达到的最大浓度以及它们的循环半衰期。因此，我们寻求通过以下方式来优化抗GPVI配体：通过用2’-O-甲基核苷酸取代2’-羟基核苷酸，或用2’-脱氧核苷酸取代2’-羟基核苷酸而使主链进一步稳定，并视需要通过硫代磷酸酯取代来修饰配体主链，以保留对GPVI的亲和力，同时增强核酸酶稳定性。另外也进行了2’-O-甲基核苷酸对2’-氟代核苷酸的取代，以进一步提高稳定性，降低制造成本，并降低在制造工艺期间在加热含2’-氟尿苷的寡核苷酸过程中可能产生的潜在杂质水平。最后，还尝试对5’末端和3’末端“加帽”(其可防止外切核酸酶对寡核苷酸的降解)，以进一步增强体内稳定性。抗GPVI配体中的最小所需序列的保守性相当高，一般而言，它们对GPVI的亲和力相似。配体EF-31 T7代表具有高GPVI亲和力和缩短长度的环2的最小抗GPVI配体，因此被选择作为原始分子，用于进一步优化抗GPVI配体的核酸酶稳定性和GPVI结合。
通过从装载有反向脱氧胸苷的CPG支持物合成配体，完成对EF-31 T7的3’端加帽，在配体3’端产生3’-3’键(RB448)。该修饰被良好耐受，因此用于对该配体进行的所有合成产生的修饰。RB448(SEQID NO：62)具有以下序列：rGrGrGrArGrGrAfCrGrGfCrGfCfUrArAfCrGfCfCfUrGrGfCrAfUrArArGfCfCfUfCfCfCiT，其中“r”代表核糖核酸，“f”代表2’-氟代核苷酸，“iT”代表反向脱氧胸苷。
在茎1、2和3内合成2’O甲基核苷酸对2’羟基和2’氟代核苷酸的最初取代，并在实施例1所述的直接结合测定中测试与GPVI的结合。结合测定的结果见下表6。在茎1内用2’-O-甲基取代大多数(RB452)或所有(RB453)的2’-羟基，被良好耐受，茎1的所有2’-O-甲基组成都导致对GPVI亲和力与原始化合物(RB448)相比增加，这与抗GPVI配体的保守二级结构是一致的。在茎2的上面2对碱基对内用2’-O-甲基取代2’-羟基(RB455)也被良好耐受，这与保守的二级结构和截短数据是一致的，表明在茎2的上面部分中碱基对修饰的若干组合可存在于抗GPVI配体中并支持与GPVI的高亲和力结合。最后，在茎3中用2’-O-甲基G-C碱基对取代2’-羟基-2’-氟G-C碱基对(RB462)导致对GPVI的亲和力显著增加。该取代预期增加茎3的稳定性，并与抗GPVI配体的共有二级结构一致，其中预测茎3是短的2碱基对的茎。
接着合成由RB453、RB455、RB462和RB466内的取代组成的复合分子(RB490)并在直接结合测定中测试与GPVI的结合(参见图10)。与含有各组取代的组成的亲和力一致，RB490与GPVI结合的亲和力明显比起始的原始化合物更大，对GPVI的Kd为约4-5nM，相比之下RB448的Kd为约14-15nM。随后，RB490作为原始化合物用于进一步优化抗GPVI配体。应当注意的是，尽管在分子的第一残基(G在1位)上的2’-O-甲基取代被良好耐受，但该修饰极大降低了用P32对这些合成物进行5’末端标记的效率，因此该残基保留为2’-羟基，用于评价经测试有助于直接结合研究的大部分其它修饰。表明其中讨论的关键复合合成物的糖修饰的二级结构示意图可参见图11A-D。
因为茎2的5’一半是源自用于SELEX研究的配体文库的5’固定区，所以对于该茎底部2对碱基对中取代2’-羟基核苷酸或2’-氟代核苷酸的耐受性的可能性，茎序列的序列组成作为指导可能不如源自配体文库随机区的序列可靠。因此，合成单个2’-O-甲基对2’-羟基和2’-氟代的取代，用于茎2基部的两个G-C碱基对(RB497、498、499和500)。对于茎2末端位置上的G-C碱基对中的G，2’-O-甲基对2’-羟基的取代被良好耐受(RB497)，但对于该碱基对的C，2’-O-甲基对2’氟代的取代(RB498)却不被良好耐受。2’-O-甲基对2’-羟基和对2’-氟代糖的取代，对于茎2第2位中的G-C碱基对的G和C二者(RB499和RB500)而言都被良好耐受，但是注意到对于G的2’-O-甲基取代(RB499)，亲和力有中度下降。
抗GPVI配体的若干共有二级结构预测表明茎1可短至4碱基对。与共有二级结构一致，茎1内G-C碱基对之一的缺失被良好耐受(RB507)，与原始合成物RB490相比亲和力无损失。
茎3内第1个G-C碱基对的修饰为含2’-O-甲基糖的碱基对(RB462)，导致与在该位置上具有2’-羟基-2’-氟G-C碱基对的合成物相比亲和力增加。相反，在茎3内的C-G碱基对中糖的2’-O-甲基取代，导致可检测的GPVI亲和力损失(RB463)。因此，为了进一步研究茎3的最佳糖修饰模式，对于茎3的C-G碱基对，用2’-O-甲基对2’-氟代糖和2’-羟基糖分别进行单独取代(RB501和RB502)。在该C-G碱基对的G中2’-O-甲基对2’-羟基糖的取代被良好耐受，对GPVI的亲和力无明显损失(RB502)，而在该C-G碱基对的C中2’-O-甲基取代2’-氟代，则导致可检测的GPVI亲和力的损失(RB501)，表明在RB463中的这种取代是用该化合物所观察到的GPVI结合损失的原因。总之，茎2的优选糖修饰模式是与抗GPVI配体共有结构一致的，并且表明在茎3的该C-G碱基对中C的存在，在糖修饰、茎形成和基本序列水平上是保守的。
环4序列在抗GPVI配体中是高度保守的，因此对于在环4的这些位置中的每一个上的糖，作出单个的2’-O-甲基取代(RB503、RB504、RB505和RB506)。在这些位置中的每一个上2’-O-甲基取代都被良好耐受，在环4内的每个A上用2’-O-甲基取代2’-羟基糖，得到对GPVI的亲和力与原始合成物RB490相当的合成物(RB503、RB505和RB506)，而在环4内的U上用2’-O-甲基取代2’-氟代糖(RB504)则导致GPVI亲和力中度损失。虽然如此，因为2’-氟代糖修饰提供明显的核酸酶抗性，所以将该环内的U维持为2’-氟代核苷酸。
突变分析(参见实施例3，RB470、RB471和RB472)证明环1中的GAC序列对与GPVI高亲和力结合的重要性。因此，合成环1内每个位置上的糖的单个2’-O-甲基和2’-脱氧取代，以测定环1核苷酸的优选糖修饰模式(RB491、RB492、RB493、RB494、RB495和RB496)。在环1内的G中用2’-O-甲基取代2’-羟基被良好耐受(RB491)，其对GPVI的亲和力与原始合成物RB490的相当，然后未测试该位置上的2’-脱氧取代(RB494)。在环2内的A上用2’-脱氧取代2’-羟基(RB495)与在该位置上2’-O-甲基取代(RB492)相比被更好地耐受，其对GPVI的亲和力与原始化合物RB490的大致相当。在环2的C中用2’-O-甲基糖或2’-脱氧糖替代2’-氟代糖，导致GPVI亲和力中度损失，因此未作进一步研究。与环1内单独的糖取代一致，具有由2’-O-甲基G、2’-脱氧A和2’-氟C组成的环1的合成物(RB519)与GPVI结合的亲和力比具有由2’-O-甲基G、2’-O-甲基A和2’-氟C组成的环1的合成物(RB518)高。
合成由在RB491、RB502、RB503、RB505和RB506内的取代组成的复合分子(RB520)以及由在RB491、RB502、RB503、RB505、RB506和RB507内的取代所组成的复合分子(RB521)，以证实在单个合成物内这些取代的每一个的掺入都被良好耐受。正如单个取代所预期的那样，RB520和RB521(与RB520相同的糖取代模式，但具有4碱基对的茎1)与GPVI结合的Kd类似于RB490与GPVI结合的Kd(大约6nM比RB490的4-5nM)。同样，由这些取代组成、但在茎2的第2个G-C碱基对上具有2’-氟代的合成物(RB524)也以高亲和力与GPVI结合。
RB524在分子中心核内含有4个残余的2’羟基残基(由茎1顶部、环1、茎2基部、环3、茎3和环4限定)。为了测定在高度修饰RB524合成物情况下剩余2’-羟基残基的最佳糖取代模式，在RB524背景中合成先前被独立研究的单个、成对的和多个糖取代。将环1序列的2’-O-甲基G、2’-脱氧A和2’-氟C，以及茎2末端G-C碱基对的G上的2’-脱氧取代包含到RB524背景中(RB526)，得到保留与GPVI的高亲和力结合、但仅有2个剩余的2’-羟基的合成物。随后，正如茎1长度的先前分析所预测的那样，在RB526情况中G-C碱基对的缺失(RB537)，得到保持高亲和力GPVI结合的合成物。在537背景中，在环3的G上用2’-O-甲基取代2’-羟基糖(RB538)也得到保持高亲和力GPVI结合的合成物。最后，用2’-脱氧取代在RB538茎2内的第2个G-C碱基对的G上剩余的单个2’-羟基(RB540)被良好耐受，得到在糖的2’位上全取代的合成物，其对GPVI的Kd大约为15nM。
功能研究(参见实施例6)表明在对GPVI的亲和力与胶原或CRP诱导的血小板聚集的抑制之间具有良好相关性。另外，抗GPVI配体阻断CRP诱导的血小板聚集的能力表明，配体可与胶原结合结构域的一个区域结合，所述区域与GPVI上的CRP结合位点重叠或临近。GPVI上的胶原结合位点具有净的正电荷和大的带正电荷表面。因此，在RB540中，在由环1和茎2内的2’-脱氧取代组成的区域中进行硫代磷酸酯取代，因为硫代磷酸酯取代提高了寡核苷酸的净电负性，并因此可导致配体对GPVI的亲和力升高。另外，在含有2’-脱氧糖的残基的情况下，硫代磷酸酯取代可提供额外保护，使其免遭核酸酶的降解。在RB540背景中，使单个硫代磷酸酯取代在环1的A和C，以及茎2末端2碱基对的G的侧面(RB546、RB547、RB548、RB549、RB550)。在茎2基部的两个G(RB549)或在茎2的3’与第2个G (RB550)之间的单个硫代磷酸酯取代增强配体对GPVI的亲和力。将两种的这些硫代磷酸酯取代都包含到复合抗GPVI配体中(RB566)，进一步增强配体对GPVI的亲和力，导致配体对GPVI的亲和力与RB490相比略有增强，对GPVI的Kd大约为2-4nM，而与RB540相比亲和力极大增强(参见图12)。
除了核酸酶稳定化程度之外，胃肠外给予之后的配体分布和半衰期也受其分子量的极大影响。将配体与高分子量载体例如高分子量聚乙二醇(PEG)缀合，限制了配体向主要血浆区室的分布，导致每剂量单位更高的Cmax，并且极大地限制了配体的肾脏过滤，因此极大地增强了配体的体内效能和循环半衰期。假定可给予控制剂以精细调节抗GPVI配体的效能和半衰期(参见实施例8)，将抗GPVI配体与高分子量载体缀合，以提供最大潜在半衰期，以及主要限制于血浆区室的分布。可通过将PEG与配体上的独特位点缀合完成配体的PEG化，该位点通过在合成期间将位点特异性接头掺入到配体中而加入。因此，评价加入接头和将PEG与RB540、RB549和RB566缀合的影响。这些相应配体的含有5’己基氨基接头的合成物(RB542、RB560和RB567)与GPVI结合的亲和力与不含接头的原始合成物相当。应当注意的是，对于或含5’接头或含5’接头和PEG的合成物而言，配体1位的G上的糖是2’-O-甲基。另外，因为将接头掺入到配体5’端防止了P32对5’端的标记，所以通过针对关联的放射性标记的原始配体的竞争性结合，基本使用实施例1所概述的方法，研究接头和PEG修饰的配体的亲和力。与不含接头或含仅接头的原始合成物(例如用于RB571的RB566)相比，将支化40KDa PEG与各含有接头的配体缀合(RB569、RB570、RB571)，导致GPVI亲和力下降大约1.2-1.7倍。因此，由与40KDa PEG缀合的RB566合成物(在1位具有2’-O-甲基G)组成的RB571表现出对GPVI的Kd大约为5nM。
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实施例5：评价抗GPVI配体的抗血小板活性、活性特异性以及活性调节的方法
A.在PRP和WP中进行的胶原诱导的血小板聚集(CIPA)测定
1.富含血小板的血浆制品(PRP)和聚集研究：
自收集在60ml注射器中的新鲜全血制备人富含血小板的血浆(PRP)，用0.3mM PPACK盐水(9∶1血∶抗凝剂盐水混合物；Biomol目录号PI1117)作为抗凝剂。在50ml锥形管中将血在低速离心(250xg)下离心16分钟。用10ml血清学移液管将经离心而与血细胞分离的富含血小板的血浆移出，再通过在2200xg高速离心10分钟，从剩余血中制备贫含血小板的血浆(PPP)。移出PPP并保存，用作透光聚集度测定(LTA)的空白。
用450μLPRP(加25μL盐水)，在37℃(以1200rpm搅拌)在Chrono-Log(Havertown，PA)lumi-聚集度测量仪(aggregometer)中对PRP中的血小板聚集监测6分钟。用25μL胶原作为激动剂开始聚集。500μL贫含血小板的血浆(PPP)在聚集度测量仪中用作基线。为了筛选抗GPVI配体阻断CIPA的能力，在37℃，在聚集度测量仪小室中，将450μL PRP与25μL含抗GPVI配体的溶液(其浓度可得到所需终浓度)一起温育3分钟，并在加入激动剂胶原之前以1200rpm持续搅拌。通过加入指定浓度的胶原(Equine Tendon Collagen Fibril Type-1；Chronolog，目录号385)开始血小板聚集，得到的聚集百分比为70-90％，并持续记录透光达4-6分钟。
2.洗涤的血小板制品(WP)和聚集研究：
基本按照Mustard等(1972；Br.J.Haematol 22，193-204)所述，制备洗涤的人血小板。简而言之，将人血采集到1/6体积的酸/柠檬酸盐/右旋糖(ACD)缓冲液(85mM柠檬酸钠、65mM柠檬酸和110mM葡萄糖)中，在37℃水浴中放置30分钟，然后在室温下于250xg离心16分钟。移出富含血小板的血浆，并在室温下于2200xg离心13分钟，再重悬于含有10U/mL肝素和5μM(终浓度)前列腺素I2(PGI2)的40mL HEPES-缓冲的Tyrode氏溶液(136.5mM NaCl、2.68mM KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2、12mM NaHCO3、0.43mM NaH2PO4、5.5mM葡萄糖、5mM HEPES pH 7.4、0.35％牛血清白蛋白)中。在37℃水浴中将血小板悬液温育10分钟，加入5μM(终浓度)PGI2并将混合物于1900xg离心8分钟。将所得沉淀物重悬于含有5μM(终浓度)PGI2的40mL HEPES缓冲的Tyrode氏溶液中，然后在37℃水浴中温育10分钟，于1900xg离心8分钟。将所得沉淀物重悬于含有0.1U/mL马铃薯腺苷三磷酸双磷酸酶的HEPES缓冲的Tyrode氏溶液中，密度为3x 108血小板/mL，然后在37℃水浴中温育1小时，然后用于聚集度测定研究。
通过在37℃lumi-聚集度测量仪(Chrono-Log Corp.Havertown，PA)中测量通过0.5ml搅拌(1200rpm)洗涤的血小板悬液(425μL洗涤的血小板、25μL血纤蛋白原、25μL抑制剂或对照和25μL胶原)的透光，测定胶原诱导的WP血小板聚集。用0.5ml Hepes缓冲的Tyrode氏溶液设置仪器基线。在聚集测定之前，向血小板悬液中补充1mg/ml血纤蛋白原。通过加入指定浓度的胶原(Equine Tendon Collagen FibrilType-1；Chronolog，目录号385)开始血小板聚集，以得到聚集百分比为70-90％，并持续记录透光至少6分钟。为了筛选抗GPVI配体或对照(不同的配体突变体)阻断CIPA的能力，将抗GPVI配体加入到血小板悬液中(其浓度可得到所需终浓度)一起温育3分钟后加入胶原，在加入胶原之后记录响应达4-6分钟。
根据得自剂量响应曲线的最大百分比聚集程度，使用盐水中的2X系列稀释的4μg/ml胶原，测定每种供体的胶原效能，并测定攻击浓度。在如上所述的WP和PRP制品中测定抗GPVI配体抑制CIPA的能力，使用宽范围的抗GPVI配体浓度(2μM-7.8nM)。
B.在WP和PRP中进行的CRP诱导的血小板聚集(CRPIPA)测定
交联的胶原相关肽CRP-XL[(GPO)10]是GPVI的选择性强效激动剂(Farndale等，J.Thromb Haemost 2004；2：561-573；Smethurst PA等，J.Biol.Chem 2007；282：1296-1304)，它可用于在PRP和WP聚集测定中通过GPVI受体而特异性触发血小板聚集。
根据得自剂量响应曲线的最大百分比聚集程度，使用盐水中的2X系列稀释的400ng/ml CRP-XL，测定每种供体的CRP-XL效能，并测定攻击浓度。在如上所述的WP和PRP制品中测定抗GPVI配体抑制CRPIPA的能力，使用宽范围的抗GPVI配体浓度(2μM-7.8nM)。
C.胶原或CRP诱导的血小板聚集的百分比降低和IC50测定
将给定攻击胶原或CRP浓度的最大血小板聚集程度设定为100％，求出抗GPVI配体所实现的胶原或CRP所诱导的血小板聚集的百分比降低，并用GraphPad Prism作图。
在测试宽范围的抗GPVI配体浓度(通常为1nM至1μM浓度)时，也得到IC50值。IC50值代表抑制50％的由给定浓度的胶原或CRP所引发的聚集所需的配体浓度。
D.使用BiofluxTM 200(Fluxion Biosciences，Inc.，)在全血中进行的抗GPVI配体活性的体外基于流动的血小板粘附测定
1.制备有胶原包被的试验板：
对于流动实验，常规使用Bioflux 48孔板(P/N 0009-0013)。将各板先以5dyn/cm2用0.02M乙酸预先准备(prime)5分钟，再以5dyn/cm2从进口孔灌注0.02M乙酸中的25μg/ml稀释的纤维状胶原(Chrono-Log P/N385)10分钟。终止流动并将板在室温下温育1小时。以5dyn/cm2用PBS洗涤胶原10分钟。再通过用PBS+5％BSA w/v完全填充出口孔(1ml)并以5dyn/cm2将溶液灌注到通道中达15分钟，将胶原包被板封闭。终止流动并将板在室温下再温育10分钟。从所有孔除去过量PBS+BSA，并将板保持在室温下用于当天使用，或保持在4℃的PBS+BSA中(至多2周)。
2.用于灌注和流动实验的全血制品：
使用193/4”规格针头，从健康志愿者抽血到60mL注射器的PPACK(0.3mM)/CTI(60μg/ml)抗凝剂中。在37℃将血液立即用4μM钙黄绿素-AM(Invitrogen P/N C3100 MP)进行荧光标记1小时(通过将管子翻转几次而混合，将钙黄绿素-AM非常轻柔地加入血液中，血液在抽血3.5小时内使用)。在37℃，使用BiofluxTM软件，使用20dyn/cm2全血流动设置，通过将200μL带标记的血加入到出口孔上方并立即开始灌注而开始实验。使用时间延迟的荧光倒置显微镜(连接AxiocamCharged-Coupled Device相机和Axiovision软件的Zeiss 200M AxiovertMicroscope)，每6秒钟采集数据(血小板聚集的荧光图像)，总共持续期间6分钟。对于试验物(抗GPVI配体、对照配体或对照抗体)，将200μL带标记的血液与指定浓度的配体(或缓冲液F；在10μL体积中)一起在室温下温育4分钟，然后加入到出口孔。使用Bioflux MontageTM软件将标签图像文件(tiff)格式的图像用于计算荧光强度，然后将数据输出到Microsoft excel并用Graphpad Prism作图。针对在对照室被荧光血小板聚集所闭塞时在对照室所观察到的荧光信号(定义为最大血小板响应)，将数据标准化，所述闭塞通常在当抗GPVI配体不存在时发生在3-4分钟之间。
E.用于评价抗GPVI配体对GPVI的特异性的ADP诱导的血小板聚集(AIPA)测定、TRAP诱导的血小板聚集(TIPA)、花生四烯酸诱导的血小板聚集(AAIPA)测定和瑞斯托菌素诱导的血小板聚集(RIPA)测定
通过评价抗GPVI配体对由激动剂诱导的血小板聚集的作用，测定抗GPVI配体对GPVI的特异性，所述激动剂的功能通过其它充分表征的血小板受体介导。对于这些研究，视需要使用人PRP和WP制品以评价不同激动剂的活性。将ADP用作P2Y12受体和P2Y1受体的特异性激动剂，将TRAP用作PAR-1激动剂，将花生四烯酸用作血栓烷A2(TXA2)受体的激动剂，将瑞斯托菌素用作vWF-GP1bα相互作用的激动剂。根据得自相应激动剂的剂量响应曲线的最大百分比聚集程度，测定每种激动剂(ADP、TRAP、花生四烯酸和瑞斯托菌素)的效能，并测定各种相应的激动剂对靶标EC70-90％的攻击浓度。
1.通过WP中的AIPA和TIPA进行的抗GPVI核酸配体的特异性测定。
为了评价抗GPVI配体与P2Y12和P2Y1的潜在相互作用，通常使用5μM ADP的攻击浓度以刺激血小板聚集，并且为了评价它们与PAR-1的潜在相互作用，通常使用2.5μM TFLLRN(TRAP)的攻击浓度以刺激血小板聚集(每次实验的具体攻击激动剂浓度是根据每种供体的激动剂剂量响应曲线确定)。ADP和TRAP所诱导的血小板聚集在WP制品中进行测定，如上所述。每种受体的特异性抑制剂用作阳性对照，以证明靶受体的抑制在测定中可检测。SCH79797(TocrisBiosciences)用作PAR-1拮抗作用的阳性对照，而INS50589(InspirePharmaceuticals)用作P2Y12拮抗作用的阳性对照。
2.通过在PRP中进行的RIPA测定GPVI核酸配体的特异性：
为了评价抗GPVI配体与vWF或GP1bα的潜在相互作用，使用攻击浓度为1.0-2.0mg/mL的瑞斯托菌素(Sigma，目录号R7752)以刺激血小板聚集(每次实验的具体攻击激动剂浓度是根据每种供体的激动剂剂量响应曲线而定)。瑞斯托菌素诱导的血小板聚集是在如上所述的PRP制品中测定。针对GP1bα的HIP1抗体(或同种型IgG对照，Axxora Bio；25μg/ml终浓度)用作阳性对照，以证明靶受体GP1bα的抑制在测定中是可检测的。
3.通过PRP中的AAIPA进行GPVI核酸配体的特异性测定：
为了评价抗GPVI配体与TXA2受体的潜在相互作用，使用攻击浓度为0.25-0.5mg/ml的花生四烯酸(Helena Biosciences；目录号5364)以刺激血小板聚集(每次实验的具体攻击激动剂浓度是根据每种供体的激动剂剂量响应曲线而定)。花生四烯酸诱导的血小板聚集是在如上所述的PRP制品中测定。
F.胶原和CRP所诱导的血小板聚集测定，用于测试在WP和PRP中的抗GPVI配体的核酸调节剂：
胶原和CRP诱导的血小板聚集是在如上所述的WP和PRP制品中进行。为了评价核酸调节剂逆转抗GPVI配体对血小板聚集的抑制的能力，在抗GPVI配体的IC95-100测试它们的浓度(抑制95-100％的由给定浓度的攻击激动剂所引发的聚集所需的配体浓度)。如上所述地进行血小板聚集研究，除了以下之外：在血小板制品与抗GPVI配体的最初温育之后，加入不同量的调节剂，靶向摩尔过量的调节剂与配体的范围为8∶1至0.5∶1，并一起温育10分钟，然后加入激动剂。
G.在WP中由核酸调节剂逆转抗GPVI配体的持久性研究：
为了评价核酸调节剂对抗GPVI活性的逆转的持久性，在37℃将RB490(终浓度0.25μM)和RB515(终浓度0.75μM)加入到总体积4ml WP悬液中(按照上述用于评价核酸调节剂的加入顺序和时间)，在指定时间点(0、0.16、0.5、1、1.5、2、2.5、3和3.5小时)移出450μL等分试样的WP悬液混合物，并进行胶原诱导的血小板聚集。为了证明在该温育期间WP悬液的活性、RB490的活性、以及RB515干扰的缺乏，在3.5小时期间内进行分别单独温育，其中将单独缓冲液、单独RB490或单独RB515加入WP悬液中，并测定胶原诱导的血小板聚集。
实施例6：抗GPVI配体对胶原和CRP所诱导的血小板功能的抑制
GPVI专有地表达在血小板上，是主要的血小板胶原受体。GPVI是稳定的血小板粘附所必需的，而且GPVI与胶原的相互作用是血小板的最强效激活剂之一，触发血小板整联蛋白α2β1和αIIbβ3的内外激活以及血小板颗粒内容物的分泌(其继而激活附近的循环血小板)。在人类中，GPVI缺陷导致缺乏响应胶原的血小板激活，而在体外导致缺乏响应胶原血小板聚集。GPVI胞外结构域的预测结构包括两个Ig样结构域，其包含胶原结合结构域(CBD)及之后的重度O-糖基化茎。通常在LRC受体中，GPVI与FcRγ-链共同受体缔合。GPVI信号转导是间接通过FcR的γ-链和直接通过GPVI胞质结构域而介导。纤维状胶原的四级结构是GPVI激活所需，并且胶原介导的激活可通过交联的胶原相关肽(CRP-XL)重现，所述肽是由序列(GPO)n的三肽重复组成，其中G为甘氨酸，P为脯氨酸，O为羟脯氨酸。
已经解析了由残基Q1-T183组成的GPVI的CBD的晶体结构(Horii等，Blood 108；2006，第936-942页)。结构数据以及诱变数据提供了对胶原与GPVI间、以及CRP-XL与GPVI间的分子相互作用的详细解释。这样的研究也有助于对GPVI激活机制的理解。CBD结构域由呈90°分开定向的两个Ig样结构域C2-1和C2-2组成(其中C2-1是N-端，C2-2是C-端)。GPVI CBD在晶体结构中形成二聚体，其中各CBD的C2-2结构域相互作用而形成背靠背的二聚体。CRP和胶原部分地各结合在C2-1上的浅沟内。该沟对LRC受体中的GPVI是独特的，与其它LRC受体相比，是由GPVI中的11个残基缺失产生。该结合沟的底面是由若干疏水性残基(L53、F54、P56、L62和Y66以及K41的脂族部分)，与外围附近的若干极性(S43、S44、Q48、Q50和S61)和碱性(K41、R46、K59和R166)残基形成。直接参与胶原或CRP结合的残基落入两簇中。第1区是由C2-1表面上的碱性残基组成，包括K41、K59、R60和R166。参与CRP或胶原结合的第2簇残基位于C2-1的远端，并且包含L36(参与胶原结合，但不参与CRP结合)，并且V34和N-聚糖与N72连接，其参与胶原和CRP结合。与突变分析一致，CRP向GPVI的CBD的计算停靠显示CRP结合沟位于第1簇碱性残基内，与K41和R166直接相互作用，并且在K59和R60的侧链的键合距离内。
每个GPVI二聚体含有2个胶原结合沟，一个在相应CBD的各C2-1亚基内。天然胶原纤维是由间隔1.3-1.4nm的平行CRP样三螺旋的假六边形阵列组成，是在可溶性CRP肽晶体结构中保守的排列。GPVI二聚体内的胶原结合沟基本平行并间隔大约5.5nm(胶原纤维中介于n与n+4螺旋之间的距离)。结合沟与胶原螺旋的几何相容性将允许GPVI二聚体同时与胶原纤维内的2条螺旋结合，并且同样与CRP-XL结合。因此，CRP-XL肽的几何学模拟天然胶原，并且使得利用CRP-XL作为GPVI的CBD的离散探针成为可能。
为了初始评价抗GPVI配体阻断GPVI功能的能力，在WP制品中评价配体EF-2 T2和EF-3 T2(参见图9)阻断胶原诱导的血小板激活的能力，如实施例5所述。作为用于配体对胶原诱导的血小板聚集的任何潜在非特异性作用的对照，在初始筛选中包括非GPVI结合的突变配体EF-2 T2 M3-M5和EF-3 T2 M3-M5(参见图9)作为特异性对照。如图15所示，EF-2 T2和EF-3 T2有效阻断胶原诱导的血小板聚集，而无活性突变对照配体却无作用。
随后，在WP制品中在胶原诱导的血小板聚集中评价优化的抗GPVI配体RB490、RB540、RB549和RB566的活性(图16)。优化的配体各有效阻断胶原诱导的血小板聚集。抗GPVI配体的相对效能与它们各自对GPVI的亲和力是一致的，其中RB540(对GPVI的Kd为约15nM)的IC50为约44nM，RB549(对GPVI的Kd为约6-7nM)的IC50为约25nM，RB490(对GPVI的Kd为约4-5nM)的IC50为约23nM，RB566(对GPVI的Kd为约2-3nM)的IC50为约20nM。
为了进一步探查抗GPVI配体阻断GPVI功能的潜在机制，在WP制品中评价配体RB490、RB549和RB566阻断CRP-XL诱导的血小板聚集的能力(图17)，如实施例5所述。与它们阻断胶原诱导的血小板聚集一致，RB490、RB549和RB566以剂量依赖性方式阻断CRP诱导的血小板聚集。当与胶原一起时，配体的相对效能与它们各自对GPVI的亲和力一致，其中RB566、RB490和RB549的IC50分别为38nM、79nM和98nM。毫不奇怪，抗GPVI配体的IC50在CRP诱导的血小板聚集中更高，因为在这些测定中所用的CRP-XL是比胶原更强效的血小板激动剂。总之，这些数据与抗GPVI配体在GPVI的胶原结合沟处或附近结合GPVI的作用机制是一致的，因此阻断胶原或CRP-XL与血小板表面上的GPVI的缔合。
在WP制品中在胶原和CRP所诱导的血小板聚集中也将PEG化配体RB570、RB569和RB571的抗GPVI活性与RB490进行比较(图18-19)。如上所述，PEG化配体对胶原和CRP所诱导的血小板聚集表现出类似的剂量依赖性抑制。将PEG加入到配体中，中度影响了它们相对于RB490在胶原诱导的血小板聚集中的活性，但不影响在CRP诱导的血小板聚集中的活性。在WP制品中，RB571在阻断CRP诱导的聚集中表现出最大效能，其IC50为约33nM。同样，在PRP中，RB571对胶原和CRP所诱导的血小板聚集表现出强效抑制(参见图20；详见实施例5)。
在高剪切力下，在全血中也评价了响应GPVI与胶原包被表面的相互作用时的抗GPVI配体阻断血小板粘附、激活和聚集的能力。如实施例5所述。该测定方式反映出GPVI体内功能的许多特性，包括在流动全血中GPVI与表面结合的纤维状胶原的缔合，以及重现由GPVI-胶原相互作用所介导的3个关键性功能，即血小板粘附、激活和聚集。与失活配体对照RB471相比，RB566和RB571极大地降低了血小板粘附、激活和聚集(图21)(在该测定中的血小板响应在RB471和缓冲液对照之间是类似的)。
因此，在静态条件下和在流动全血中的分离的血小板测定中，抗GPVI配体阻断GPVI功能，影响了GPVI介导的血小板粘附、激活和聚集。另外，与抗GPVI配体在GPVI的胶原结合位点处或附近结合的机制一致，它们对胶原和CRP所诱导的血小板聚集都表现出剂量依赖性抑制，相对效能与它们各自对GPVI的亲和力一致。
实施例7：抗GPVI配体对GPVI的特异性
GPVI是若干血小板受体之一，通过其关联配体对其激活而刺激血小板激活和聚集。其它这样的受体包括血栓烷A2受体(TXA2)、ADP受体P2Y12和P2Y1、凝血酶受体PAR-1和GP1bα，其是通过胶原结合的冯维勒布兰德因子(vWF)激活。为了测定抗GPVI配体与GPVI结合并阻断血小板功能的特异性，在ADP、TRAP(PAR-1激动剂)、花生四烯酸(TXA2激动剂)和瑞斯托菌素(vWF-GP1bα相互作用激动剂)所诱导的血小板聚集测定中，评价抗GPVI配体RB571的作用，如实施例5所述。如图22和图23所示，RB571在WP制品中对ADP或TRAP所诱导的血小板聚集无作用，或在PRP制品中对瑞斯托菌素或花生四烯酸所诱导的血小板聚集无作用。因此，正如根据它们对GPVI的高亲和力和通过SELEX的分离所预期的那样，抗GPVI配体对GPVI具有特异性。
实施例8：抗GPVI配体的核酸调节剂
配体基于互补Watson-Crick碱基配对法则编码设计其核酸调节剂或控制剂所需的信息。给定控制剂的有效性取决于若干因素，包括配体靶向区对于控制剂成核的可接近性，以及控制剂中内部二级结构的不存在或受限制，其需要在与配体形成完整双链体之前变性。为了限定抗GPVI配体的区域(其将是与核酸调节剂缔合的优选区)，设计出一系列控制剂(参见表7和图24)，用于EF-2 T2和EF-3 T2。
表7：GPVI配体调节剂
Figure BPA00001505315800991
Figure BPA00001505315801001
SEQ ID NO.137-151对应于“经修饰的序列”一栏中描述的调节剂的未经修饰的形式。
在血小板聚集测定中，评价了控制剂RB416-RB419对EF-2 T2和RB420-423对EF-3 T2的逆转活性，如实施例5所述。如图25和图26所示，控制剂能相对GPVI配体低摩尔过量在10分钟内逆转抗GPVI配体功能。对于抗GPVI配体上的控制剂互补区，观察到经设计用于EF-2 T2和EF-3 T2的控制剂之间效能一致。RB418和RB422与由茎2的3’侧、环3、茎3的5’侧和环4组成的抗GPVI配体相似区缔合，表现出最大效力。预期这些控制剂对于任何所述抗GPVI配体都表现出相似的效能特性，所述控制剂与所述抗GPVI配体可形成完全互补双链体。
针对RB490设计出一组类似的潜在控制剂(参见表7)。如图27所示，这些核酸调节剂逆转RB490抗GPVI活性的效能与优选配对区(如对EF-2T和EF-3T的控制剂所定义)一致，其中RB515表现出最大效能。调节剂的关键特性是，一旦与配体复合后，调节剂：配体复合物就不解离，并且配体活性保持持久逆转。为了评价RB515对RB490的逆转持久性，我们在胶原诱导的血小板聚集中测定了RB490的抗GPVI活性逆转的持久性，如实施例5所述。RB515持久逆转RB490活性达3.5小时(图28)，在此期间WP制品在响应胶原时维持全部聚集活性。值得注意的是，RB490在RB515不存在时持续完全抑制胶原诱导的血小板聚集超过3.5小时温育期间过程。RB515对RB490抗GPVI活性的逆转活性的持久性类似于用控制剂RB007在人血浆中体外逆转抗FIXa配体RB006的抗凝剂活性所测的持久性，该配体：控制剂对已证明在人以及其它物种中持久的体内逆转。
RB571和RB490在与RB515互补的区域内共享相同的碱基序列，因此RB515是RB571的潜在控制剂(参见图29)。因此，在WP制品和PRP制品中，在胶原和CRP所诱导的血小板激活中评价RB515对RB571的逆转活性。在两种基质中，在响应两种激动剂时，RB515以低摩尔过量有效逆转RB571的抗GPVI活性(图30和31)。RB515对RB571活性的完全逆转所需的摩尔过量少于RB007在体外对RB006的完全逆转所需(2∶1或更低的摩尔比，相比之下RB007对RB006的逆转为4∶1)，表明RB515在人和其它物种中体内对RB571的逆转具有高的成功可能性。
Figure IPA00001505315200011
Figure IPA00001505315200021
Figure IPA00001505315200031
Figure IPA00001505315200051
Figure IPA00001505315200061
Figure IPA00001505315200071
Figure IPA00001505315200081
Figure IPA00001505315200091
Figure IPA00001505315200101
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Figure IPA00001505315200131
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Figure IPA00001505315200171
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Figure IPA00001505315200211
Figure IPA00001505315200221
Figure IPA00001505315200241
Figure IPA00001505315200251
Figure IPA00001505315200261
Figure IPA00001505315200281
Figure IPA00001505315200291
Figure IPA00001505315200301
Figure IPA00001505315200321
Figure IPA00001505315200331
Figure IPA00001505315200341
Figure IPA00001505315200351
Figure IPA00001505315200361
Figure IPA00001505315200371
Figure IPA00001505315200381
Figure IPA00001505315200391
Figure IPA00001505315200401
Figure IPA00001505315200411
Figure IPA00001505315200421

Claims (28)

1.一种包含第1分离的核酸序列的GPVI配体，其中所述GPVI配体与糖蛋白VI(GPVI)结合，且所述GPVI配体包含二级结构，所述二级结构在5’-3’方向上包含第1茎、第1环、第2茎、第2环、第3环、第3茎和第4环；并且其中所述第4环包含UAA。
2.权利要求1的GPVI配体，其中所述第2环被间隔基取代。
3.前述权利要求中任一项的GPVI配体，其中所述第1核酸包含至少一个经修饰的核苷酸。
4.前述权利要求中任一项的GPVI配体，所述配体与载体缀合。
5.前述权利要求中任一项的GPVI配体，其中所述载体是亲水性部分。
6.前述权利要求中任一项的GPVI配体，其中所述亲水性部分是聚乙二醇(PEG)分子。
7.前述权利要求中任一项的GPVI配体，所述配体包含经修饰的磷酸主链。
8.权利要求1的GPVI配体，所述配体包含SEQ ID NO：69，其
中间隔基掺入到SEQ ID NO：69的11位的2’O-甲基G与12位的2’O-
甲基C之间。
9.权利要求8的GPVI配体，所述配体包含经修饰的磷酸主链。
10.权利要求8或9的GPVI配体，所述配体还包含聚乙二醇部分。
11.权利要求8-10中任一项的GPVI配体，其中所述GPVI配体选自RB569、RB570和RB571。
12.包含前述权利要求中任一项的GPVI配体的药物组合物。
13.一种与GPVI配体特异性结合的调节剂，
其中所述调节剂包含第2核酸序列；和
其中所述GPVI配体与糖蛋白VI(GPVI)结合；和
其中所述GPVI配体包含包含二级结构的第1核酸序列，所述二级结构在5’-3’方向上包含第1茎、第1环、第2茎、第2环、第3环、第3茎和第4环；并且其中所述第4环包含UAA。
14.权利要求13的调节剂，其中所述第2核酸序列由约10nt至约50nt组成。
15.包含权利要求13或14的调节剂的药物组合物。
16.包含SEQ ID NO：84的调节剂。
17.权利要求16的调节剂，其中所述调节剂是RB515。
18.包含权利要求13-17中任一项的调节剂的药物组合物。
19.治疗有效量的GPVI配体在治疗血小板介导的病症中的用途，所述用途包括给予有需要的宿主治疗有效量的GPVI配体。
20.权利要求19的用途，其中所述血小板介导的病症选自血管病症、脑血管疾病、血小板介导的炎性病症、糖尿病相关疾病或癌症。
21.权利要求20的用途，其中所述血管病症选自急性冠状动脉综合征、血栓形成、血栓栓塞、外周血管病和短暂性缺血发作。
22.权利要求20的方法，其中所述脑血管疾病选自短暂性缺血发作、缺血性发作和栓塞。
23.权利要求20的用途，其中所述血小板介导的炎性病症选自关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、炎性肠病、强直性脊柱炎和硬皮病。
24.权利要求20的用途，其中所述糖尿病相关疾病选自糖尿病性视网膜病、糖尿病性血管病、动脉粥样硬化、缺血性发作、外周血管病、急性肾损伤和慢性肾衰竭。
25.权利要求20的用途，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、骨癌和肝癌。
26.GPVI配体在调节有需要的宿主中的血小板功能的用途，所述用途包括将有效量的所述GPVI配体给予所述宿主。
27.权利要求26的用途，其中所述宿主正在接受心脏介入。
28.权利要求19-27中任一项的用途，所述用途还包括将调节剂给予所述宿主，其中所述调节剂与所述GPVI配体特异性结合。
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