BRPI0618907A2

BRPI0618907A2 - c0nstructo de expressão de dna, método de produção de vetores, kit para produção de vetores e para produção de constructo de expressão

Info

Publication number: BRPI0618907A2
Application number: BRPI0618907-5A
Authority: BR
Inventors: Matthias Schroff; Detlef Oswlad
Original assignee: Mologen Ag
Priority date: 2005-11-25
Filing date: 2006-11-22
Publication date: 2012-04-17
Also published as: RU2008125849A; US9012620B2; CN101313067A; DK1951870T3; US20080311630A1; WO2007059760A1; JP5186381B2; EP1951870A1; RU2410431C2; DE112006003704A5; JP2009521210A; CA2627443A1; ES2421314T3; CN101313067B; EP1951870B1; AU2006317222B2; HK1125407A1; CA2627443C; AU2006317222A1

Abstract

CONSTRUCTO DE EXPRESSãO DE DNA, MéTODO DE PRODUçãO DE VETORES, KIT PARA PRODUçãO DE VETORES E PARA PRODUçãO DE CONSTRUCTO DE EXPRESSãO. A presente invenção refere-se a constructos de expressões e métodos apropriados para sua produção, para depois de sua transfecção em células eucarióticas, inibir de maneira objetiva a formação de proteínas definidas nestas células através da interferência do RNA. Os métodos para a produção desses vetores não contêm passos de PCR, consistem num procedimento de três passos em um recipiente de reação e podem ser desenvolvidos num espaço de poucas horas. Ainda, os constructos de expressão de DNA que são apropriados para a intencionada inibição da expressão genética por meio da interferência do RNA, são o objeto da invenção que trara de constructos de expressões e que também são apropriados para a inibição múltipla de expressões de genes.

Description

CONSTRUCTO DE EXPRESSÃO DE DNA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE VETORES, KIT PARA PRODUÇÃO DE VETORES E PARA PRODUÇÃO DE

CONSTRUCTO DE EXPRESSÃO

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos para a produção de vetores que são apropriados, depois de sua transfecção para células eucarióticas, para objetivamente inibir a formação de uma ou mais proteínas através da interferência de RNA assim como por vetores da mesma espécie.

Uma possibilidade de inibição de expressão genética, recentemente provada, consiste na produção de moléculas de RNA de filamento duplo. Com este RNA de filamento duplo (dsRNA) é possível desligar de maneira objetiva e altamente eficaz e mais rapidamente do que com qualquer outro método, genes isolados, sem interferir na produção de proteína dos genes vizinhos. O princípio básico é denominado Interferência de RNA, abreviado RNAi. A seqüência causadora dsRNA como siRNA (small interference RNA).

O siRNA não impede a leitura do gene, mas aciona um mecanismo de célula próprio, que inibe a formação da proteína correspondente ao mRNA lido pelo gene (post-trancriptional gene silencing).

O intencionado catabolismo de mRNA é desencadeado através de moléculas siRNA curtas com comprimento de base de RNA de 19-23, que se encontram homólogas ao mRNA alvo, cuja transformação em proteína deverá ser impedida. As moléculas de siRNA se compõem junto com endorreibonucleases especiais num complexo protéico próprio de células com a denominação "RISC" (RNA-induced silencing complexes). Na construção desses complexos os dois filamentos de RNA se desassociam através do que se formam os assim chamados RISC ativados, que contêm respectivamente um filamento simples da molécula siRNA. RISC ativados que possuem o filamento anti-sentido, que se encontram complementariamente ao mRNA alvo, ligam a esses e aos endorribonucleases do complexo protéico do RNA agora providencia o catobolismo do mRNA em seqüência específica.

O siRNA pode ser criado experimentalmente ou ser introduzido através de infiltração. Por um lado isso se sucede através de moléculas siRNA produzidas sinteticamente que podem ser administradas tanto in-vitro como in-vivo.

Este método, porém possui limitações técnicas. Além da instabilidade geral do siRNA sintético no médio como também na célula, a inibição é possível a princípio apenas momentaneamente por meio de siRNA sintético e muitas células (por exemplo, células neuronais) podem ser transfectadas apenas ineficientemente. Estudos que se baseiam na transfecção de siRNA sintético são portanto por via de regra limitados tanto em matéria de tempo de 1 a 5 dias como também especificamente ao tipo de célula. No mais, há a desvantagem do custo alto de produção e a demora na produção.

Por outro lado o siRNA pode ser criado na célula através de vetores. Trata-se aqui de vetores virais ou de vetores baseados em plasmídeo, que conduzem à formação de seqüências de siRNA através de expressão somente dentro da célula. As vantagens em relação à transfecção com siRNA sintético encontram-se na transcrição da seqüência de siRNA correspondente mais estável e como for o caso mais regulada.

No entanto, os vetores baseados em plasmídeo mostram ao lado de uma eficiência de transfecção baixa um processo de produção dispendioso. Assim, torna-se necessário selecionar clones estáveis. Neste processo muitas vezes demorado, que pode durar semanas ou até meses, aparecem com freqüência inúmeras dificuldades potenciais, inerentes a experimentos de clonagem. Para o exame do produto são necessárias seqüências que também se mostram trabalhosas e dispendiosas.

Ademais, os vetores baseados em plasmídeo possuem genes resistentes a antibióticos necessários para sua seleção. Por este motivo estes tipos de vetores não são apropriados para o uso em organismos vivos. A possível recombinação com o aparecimento abundante de bactérias no organismo, abriga o risco do aparecimento crescente de bactérias resistentes a antibióticos. A propagação das resistências a antibióticos é um problema grave e não sustentável.

Visto que vetores virais são aptos para a transfecção eficiente e especifica, eles apresentam uma vantagem em relação a moléculas siRNA sintéticas como também a vetores baseados em plasmideo.

Para a utilização terapêutica, no entanto, estes tipos de vetores são apropriados somente com restrições. Também aqui a recombinação de seqüências virais com virus de ocorrências naturais apresenta um risco inerente de segurança, visto que a produção de novos virus híbridos e patogênicos deve ser temida. Além do mais, a sua produção também é dispendiosa.

Visto que a inibição de expressão em si de apenas um produto geneticamente modificado, com a utilização de sistemas de expressão, está ligada com um número grande de complicações, entende-se quase que por si, que o desligamento simultâneo da expressão de vários produtos geneticamente modificados em uma célula ou num tecido se torna mais complexo e mais difícil de ser atingido.

Um dos problemas principais da inibição de expressão genética através da interferência de RNA, no caso da utilização de várias construções independentes, há uma pequena probabilidade de uma célula ser transfectada por apenas um constructo. Esta pequena probabilidade se potencializa negativamente com o número de constructos utilizados. Muitas vezes, no entanto para inserções terapêuticas genéticas será necessária uma inibição simultânea e controlada da expressão genética.

Existe um número grande de métodos que possibilitam a co-transcrição de vários RNAs em uma célula. O método mais simples é a co-transcrição de dois constructos de expressão independentes (na seqüência também: vetores) . Outro método consiste na transfecção com um vetor, que carrega dois cassetes de expressão independentes. Constructos deste tipo também podem ser utilizados para a produção de siRNAs. Nas duas possibilidades há, no entanto, o perigo de as transcrições se diferenciarem significativamente em relação ao seu número, processamento, meia-vida e efetividade translacional e na quantidade da proteína experimentada.

Por esta razão a utilização desses sistemas de expressão também levariam a uma transcrição fortemente diferenciada de siRNA, através do que no final se obteria uma inibição irregular dos respectivos genes.

A construção de RNAs di- e policistrônicos apresenta mais uma possibilidade de co-expressão de gene através da utilização de elementos IRES (Internai Ribosome Entry Site). Estes possibilitam a iniciação da translação através de ribossomos independentemente da estrutura mRNA cap através de elementos de seqüência. Os elementos IRES foram descobertos pela primeira vez no mRNA do picornavirus (Pelletier und Sonenberg, 1988, Nature 334: 320-325, Jang et al., 1988, Journal Virology 62:2636-2643).

Para a construção de vetores bicistrônicos são utilizados com mais freqüência os elementos IRES do poliovirus e do EMCV (Virus Encephalomyocarditis)(Dirks et al., 1993, Gene 128:247-249). Um ponto negativo é que sua eficácia varia fortemente dependendo da linha de célula utilizada (Borman et at. , 1997, Nucleic Acids Res. 25:925-932).

A maioria dos cassetes de expressão bicistrônicos disponíveis são constituídos por um marcador selecionável ou por um gene repórter que estão dispostos no terceiro lado do elemento IRES e de um MCS (Multiple Cloning Site) para a inserção do gene desejado(Dirks et al., 1993, Gene 128:247- 249). Do mesmo modo são conhecidos sistemas de expressão tri- e policistrônicos com a utilização de elementos IRES (Zitvogel et at., 1994, Hum Gene Ther 5: 1493-1506, Fussenegger et al., 1998a, Nature Biotechnol. 16: 468-472, Mielke et al., 2000, Gene 254. 1-8).

Para a utilização terapêutica, no entanto, os elementos virais IRES são apropriados apenas com restrições. A recombinação de seqüências virais com virus de ocorrências naturais aqui também representa um risco de segurança inerente, visto que a produção de novos vírus híbridos patogênicos deve ser temida.

Vetores multicistrônicos também podem ser construídos através da associação de unidades de transcrição sem elementos IRES. Por um lado, os genes desejados podem ser clonados em um vetor plasmídeo através de diferentes MCS, e por outro lado podem ser conectados cassetes de expressão isolados de plasmídeo através de ligantes de DNA a vetores lineares multiciscrônicos (Tsang et al., 1997, Bio Techniques 22:68) .

Análises das taxas de expressão de genes lineares conectados mostram, no entanto, uma influência fortemente negativa sobre a transcrição de cassetes de expressão disponibilizados dessa forma. (Esperet et al., 2000, J Biol Chem 275: 25831-25839).

Vetores de plasmídeo para a expressão de genes múltiplos diferenciam-se dos vetores de plasmídeo comuns pelo número de unidades de transcrição clonada. Para tal podem ser utilizados promotores, respectivamente seqüências poli (A) de mesma ou diferente origem para as unidades de transcrição.

A desvantagem que surge com a utilização de promotores diferentes consiste na diferença de força dos promotores possibilitando assim que as taxas de expressão de cada gene variem, ao passo que a inserção de promotores iguais pode levar ao desenvolvimento de estruturas secundárias do DNA, que podem ter como conseqüência uma perda de função dos promotores.

É comum para todos os vetores mencionados de múltipla expressão genética que eles se baseiam, ou em plasmídeos, ou em vetores virais. Ao lado de todas as insuficiências descritas sobre os presentes vetores com codificações múltiplas elas ainda apresentam as desvantagens deste tipo de vetores. As desvantagens de vetores virais, às quais se somam a instabilidade da atenuada estirpe de vacinas, e as insuficiências de vetores de DNA de plasmideo, e a conseqüente propagação de genes resistentes a antibióticos (descrito em detalhes no EP 0 941 318 BI) devido a sua utilização, são suficientemente conhecidas.

Desejáveis seriam, portanto, sistemas de expressão para siRNA, que também estão em condições de inibição simultânea de expressão genética de vários genes. O maior problema talvez para a solução desta questão represente uma ligação (ligante) das seqüências para a produção dos siRNAS, a qual garante uma transcrição suficiente para a inibição da expressão genética dessas seqüências.

Um método para a associação de fragmentos de DNA por meio de elementos de ligação de DNA é conhecido pela literatura. Seeman descreve seqüências de DNA para a pesquisa com ramificações que ocorrem naturalmente, assim chamadas Holliday-Junctions, que são postuladas como formas especiais topológicas de B-DNA sob estresse de torção. (Seeman: 1982, J Theor Biol 99: 237-247; Annu. Ver. Biophys. Biomol. Struct. 1998. 27:225-248). A utilização destas estruturas estava até aqui limitada a partes curtas de oligonucleotideos na análise das formas de estruturas de DNA.

Da DE 100 48 417 Al é conhecida uma ligação polifuncional que descreve a conjugação de dois grupos funcionais reativos por meio de um ligante. Como substâncias biológicas, que também podem de tal modo ser acopladas, são mencionados também ácidos nucléicos, os exemplos, no entanto, mostram apenas as utilizações da invenção para a conjugação de peptidios. WO 01/87348 A2 descreve outra inserção de vários genes com uma infiltração eficiente de expressão em células. Os ácidos nucléicos devem ser combinados através de ligações co-valentes em estruturas supramoleculares chamadas de dendrimeros.

Outra possibilidade para produzir vetores para siRNA, está disponível em http://www.ambion.com. . Esse processo evita as acima mencionadas desvantagens. No entanto, este processo de produção também é demorado e devido a uma série de passos necessários de multiplicação de seqüências em questão por meio de PCR (reação em cadeia com polimerase) está cheio de erros. A possibilidade de produção de mutações tanto indesejadas como imperceptíveis, e que ainda são potencializadas pelo processo de PCR, é muito grande. Assim se mostram necessários aqui também os controles de seqüenciação que prolongam o processo de produção e contribuem para os custos mais altos.

Partindo desta posição da técnica, é dever da invenção disponibilizar um método apropriado para a síntese in-vitro ou in-vivo de uma ou várias seqüências definidas de siRNa, os constructos de expressão produzidos por meio destes, assim como um kit para a execução da síntese.

Esta tarefa será resolvida através do que vem a seguir.

De acordo com a invenção está previsto um constructo de expressão que consiste numa primeira estrutura de grampo de cabelo de terminação de DNA na qual um filamento simples de desoxirribonucleotídeo é dobrado de tal forma para uma área de filamento duplo que está presente em uma extremidade com um excesso coesivo e na extremidade oposta os filamentos simples que formam o filamento duplo são interligados por um loop de filamento simples a uma segunda estrutura de grampo de cabelo de terminação que está construída analogicamente à primeira estrutura de grampo de cabelo de terminação e a uma estrutura de DNA em forma de T com três braços de DNA de filamento duplo, os quais estão unidos pela Holliday- Junctions, em que pelo menos um braço contém as seqüências a serem transcritas e os filamentos simples deste braço de DNA de filamento duplo naquela extremidade que está em posição oposta à junção com os outros braços, unidos por um Ioop de DNA de filamento simples, e os outros dois braços apresentam terminações coesivas, em que um braço apresenta uma seqüência de terminação apropriada e o outro braço apresenta uma seqüência promotora apropriada.

Os componentes mencionados apresentam os elementos essenciais de constructo segundo a invenção. A invenção também abrange constructos de expressão, como estes componentes mostram, em que, no entanto, estes provêem de outras combinações de estruturas de DNA.

Segundo a invenção está prevista adiante um constructo de expressão para a inibição especifica da expressão genética por meio de interferência de RNA, a qual apresenta uma primeira estrutura de grampo de cabelo de terminação, na qual um filamento simples de desoxirribonucleotideo é dobrado para uma área de filamento duplo de tal forma que este apresente uma extremidade com um excesso coesivo e na extremidade oposta os filamentos simples formadores do filamento duplo estão unidos por um Ioop de filamento simples, adiante uma segunda estrutura de grampo de cabelo de terminação que está construída analogicamente à primeira estrutura de grampo de cabelo de terminação e cujas áreas de filamento duplo e de filamento simples são compostas pela seqüência a ser transcrita assim como por uma seqüência promotora apropriada e por uma seqüência apropriada de terminação complementar reversa, que se encontram num filamento duplo de DNA entre as duas estruturas de grampo de cabelo de terminação descritas acima.

Um constructo de expressão assim apresenta apenas uma cópia de filamento duplo do siRNA a ser produzido. A produção de um siRNA na presença de apenas uma cópia é possível com este constructo, visto que as seqüências a serem transcritas pelo RNA polimerase serão lidas e transcritas por cima do Ioop de filamento simples. Isto não seria possível com plasmídeo de filamento duplo.

Para as duas estruturas de expressão segundo a invenção está previsto que várias estruturas lineares ou em forma de T estejam ligadas respectivamente a uma extremidade através de um ligante por meio do Holliday-Junctions. Neste caso está previsto que as seqüências a serem transcritas façam a codificação dos genes idênticos ou diferentes.

Sob ligante deve ser entendido oligonucleotídeos para a junção de cassetes de expressão de DNA. Um ligante de acordo com a invenção é composto de dois ou mais filamentos, como deve ser ilustrado no exemplo de ligante a seguir, formado por três oligonicletideos, que estão ligados com três cassetes de expressão sobre filamentos A, B, e C interligados entre si: A extremidade 5' de A possui uma seqüência complementar à extremidade 3' de B e forma um filamento duplo, enquanto a extremidade 3' de A faz um par com a extremidade 5' de C , e finalmente a extremidade 5' de B faz um par com a extremidade 3' de C. Este tipo de junção de filamentos duplos de DNA também é chamado de Holliday- Junction (F.W. Stahl: Genetics. 1994 Oct;138 (2) :241-6), que oferecem a vantagem de componentes de ocorrência natural serem empregados exclusivamente para a junção dos cassetes de expressão, o que pode mostrar-se especialmente vantajoso na aplicação da invenção com fins medicinais com causas toxicológicas.

As seqüências de oligodesoxinucletideos empregadas nas ramificações de DNA são selecionadas de forma que na hibridização das quintas terminações do oligonucleotideo (como exemplo) é produzida para cada uma, uma extremidade excedente e coesiva com quatro bases. As seqüências das terminações coesivas podem se distinguir de cada braço de uma ramificação, mas não precisam. As estruturas em forma de T ou lineares do DNA apresentam um excesso complementar à extremidade coesiva. Por meio disto a intencionada ligação dos cassetes de expressão torna-se possível para cada "braço" das ramificações.

Estes tipos de constructos de expressão de acordo com a invenção são apropriados para inibições múltiplas específicas de expressão genética de diferentes genes. Com base na construção de estruturas idênticas em forma de T, que contêm respectivamente as seqüências necessárias para a produção de siRNAs, os diferentes siRNAs são produzidos com a mesma força. O número de genes, cuja expressão de proteína é inibida, depende do número de estruturas em forma de T que estão ligados entre si pelo ligante. Vantajosamente são escolhidas em forma alternativa de execução, de acordo com o constructo de expressão da invenção, as terminações coesivas de cada componente para a intencionada junção com outros componentes distinta e especificamente. Através disso torna-se possível a montagem do constructo de expressão desejado.

Um constructo de expressão de DNA que contém seqüências para a produção de um ou mais siRNAs, pode transfectar objetivamente as células.

Deve ser entendido como transfecção a introdução de seqüências de ácido nucléico na célula mediante métodos biológicos, químicos ou físicos, com cujo resultado se chega a uma expressão permanente ou passageira através dessas transcrições de RNA codificadas em seqüências com eficácia catalítica na célula transfectada.

Os constructos de expressão segundo a invenção apresentam numa formação continuada com ligação covalente de um ou mais peptídeos, proteínas, hidratos de carbono, anticorpos ou esteróides.

Outro objeto da presente invenção são métodos de produção para constructos de expressão que depois de sua transfecção em células eucarióticas inibem objetivamente a formação de proteínas definidas.

Para constructos de expressão lineares está previsto um método, iniciando no passo

a) do procedimento com a mistura de um filamento duplo de DNA, que possui uma base de comprimento 19-23, uma cópia singular de uma seqüência genética ou sua seqüência complementar reversa como também um sinal de terminação para RNA polimerase que está finalizado numa extremidade através de um Ioop de seqüência e uma base de 8-12 de comprimento o qual é escolhido de maneira que as bases localizadas no lado oposto de modo algum fiquem de maneira complementar umas às outras e os filamentos simples de DNA ladeados a um filamento duplo de DNA estão ligados entre si, que apresenta na outra extremidade um filamento simples de DNA com uma saliência curta, com um oligodesoxinucleotideo em forma de grampo de cabelo o qual apresenta na extremidade saliências curtas das extremidades de filamentos simples de DNA no passo b) do procedimento e no passo c) do procedimento um promotor com extremidades salientes curtas de filamentos simples de DNA, em que a extremidade 5' de filamento simples do promotor pode se unir ao oligodesoxinucleotideo ou ao filamento duplo com base de 10 até 100 de comprimento e a extremidade 3' de filamento simples do promotor está complementária à quinta terminação de filamento simples do filamento duplo de DNA descrito em a) e na ligação dos fragmentos acrescentados de DNA do passo d) do procedimento como também a separação finalizadora de misturas dos vetores produzidos no último passo e) do procedimento.

O método para produção de constructos de expressão lineares da invenção é opcionalmente constituído de tal forma, que antes da inclusão do oligodesoxinucleotideo do passo c) do procedimento é acrescentado um filamento duplo de DNA com uma base de 10 a 1000 de comprimento (= n) de uma seqüência não codificadora com extremidades com saliências curtas de DNA de filamento simples, em que a extremidade 3' de filamento simples poderá se unir à extremidade 5' de filamento simples e a extremidade 5' de filamento simples fica complementária à extremidade 3' de filamentos simples do oligodesoxinucleotideo.

Para a produção de constructos de expressão em forma de T que inibem, depois da transfecção em células eucarióticas, a formação de proteínas definidas objetivamente através da interferência de RNA, está previsto um método que inicia no passo a) do procedimento com a mistura de um filamento duplo de DNA em forma de Τ, o qual contém uma cópia singular de uma seqüência genética em direção 5'-3' com base de 19-23 de comprimento, como também um sinal de terminação para RNA polimerase é finalizado por meio de loop de seqüência com uma base de 8-12 de comprimento, o qual é escolhido de tal forma que as bases opostas de maneira alguma fiquem complementárias umas às outras e as áreas ladeadas com filamentos duplos sejam ligadas assim por dois filamentos simples de DNA e apresenta na outra extremidade dois filamentos simples de DNA com saliências curtas, e um oligodesoxinucleotideo cuja seqüência está complementária aos dois filamentos simples de DNA com saliências curtas e forma duas extremidades salientes de DNA de filamento simples, no passo b) do procedimento com um oligodesoxinucleotideo em forma de Τ, o qual apresenta na extremidade saliências curtas de extremidades de DNA de filamento simples e no passo c) do procedimento mais um oligodesoxinucleotido em forma de Τ, o qual apresenta na extremidade saliências curtas de extremidades de DNA de filamento simples, complementário ao DNA de filamento duplo em forma de T de a) e no passo d) do procedimento um Promotor com extremidades salientes curtas de DNA de filamento simples, em que a extremidade 5' de filamento simples do promotor poderá se unir com o oligodesoxinucleotideo em forma de grampo de cabelo de b) e a extremidade 3' de filamento simples do promotor está complementária à extremidade 5' de filamento simples do filamento duplo de DNA em' forma de T, seguido de ligação de fragmentos acrescentados de DNA do passo e) do procedimento, em que o constructo também pode ser produzido sem o filamento duplo de DNA com base de 10 a 1000 de comprimento como também a separação finalizadora de misturas dos vetores produzidos no último passo f).

Este método de produção apresenta, de acordo com a invenção, segundo o passo c) do procedimento um acréscimo de um filamento duplo de DNA com uma base de 10 a 1000 (= n) de comprimento de uma seqüência não codificadora com extremidades salientes curtas de DNA de filamento simples, em que a extremidade 3' de filamento simples poderá se unir à extremidade 5' de filamento simples e a extremidade 5' está complementária à extremidade 3' de filamento simples do oligodesoxinucleotideo em forma de T do passo b) do procedimento é acrescentado e/ou o acréscimo de um filamento duplo de DNA com uma base de 10 a 1000 de comprimento (= n) de uma seqüência não codificadora com extremidades salientes curtas de DNA com filamento simples, em que a extremidade 5' de filamento simples poderá se unir à extremidade 3' de filamento simples de filamento duplo de DNA em forma de T e a extremidade 3' de filamento simples encontra-se complementária à extremidade 5' de filamento simples do oligodesoxinucleotideo em forma de grampo do passo c) do procedimento.

Numa execução favorecida está previsto um método no qual o promotor é parte de um plasmideo ampliável através de bactérias, o qual é recortado antes da mistura dos componentes com uma endonuclease de restrição, que reconhece um ponto de interseção ladeada ao promotor sobre o plasmideo, o qual não existe na molécula a ser produzida.

Basicamente são previstos como promotores todos os promotores que nas células-alvo, logo, nas células em que deverá ser inibida a expressão genética forem operáveis.

Estes promotores são preferencialmente de origem humana, desde que as células ou os tecidos humanos sejam transfeccionados com os constructos de expressão de acordo com a invenção. No entanto, eles também podem, por exemplo, provir de origem viral, bacteriana ou parasitária ou de outras espécies que não da espécie-alvo. Nela estão previstas especialmente, mas não exclusivamente o promotor humano U6, o promotor humano Hl, o promotor murino U6, o promotor CMV e o promotor 7SK.

Adiante, é previsto de acordo com a invenção, que no caso da utilização de um promotor como parte de um plasmideo ampliável através de bactérias, o passo de ligação ocorrerá na presença de endoclease de restrição, com a qual o promotor foi recortado do plasmideo.

Numa execução realiza-se, antes da separação de misturas final, uma absorção da mistura de reação por meio de uma exonuclease especifica, exclusivamente para a extremidade 3' ou extremidade 5' de DNA.

Nos métodos de acordo com a invenção o filamento duplo de DNA que é acrescentado à mistura no inicio, pode resultar do annealing de um oligodesoxinucleotideo autocomplementário parcial ou de dois oligodesoxinucleotideos complementares. 0 annealing também poderá ocorrer somente na mistura de reação, assim que no inicio do procedimento de acordo com a invenção são acrescentados simplesmente oligodesoxinucleotideos complementares de filamento simples.

A seqüência dos oligodesxinucleotideos é organizada numa execução favorecida, assim que os grampos de cabelo dela resultantes apresentam em seu campo de filamentos duplos a seqüência de reconhecimento de uma endonuclease de restrição.

A separação de mistura final que ocorre por meio dos vetores produzidos pelo método de acordo com a invenção ocorre preferivelmente através de cromatografia ou através de gelectroforese.

Se o promotor for introduzido no método de produção de acordo com a invenção como parte de um plasmideo ampliável através de bactérias, então, trata-se, na endonuclease de restrição com a qual o promotor pode ser recortado do plasmideo, de uma enzima do grupo da classe II de endonuclease de restrição, de preferência do grupo BbsI, BbvI, BbvII, BpiI; BpII, BsaI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, Eaml1041, EarI, Eco31I, Esp3I, FokI, HgaI, SfaNI ou seus isosquizômeros.

Outro objeto da presente invenção é um kit para a realização dos métodos de acordo com a invenção contendo no mínimo um promotor, oligodesoxinucleotideos em forma de grampo de cabelo e enzimas. Nas enzimas trata-se de ligases, endonucleases de restrição, sexonucleases de restrição, quinases e polimerases ou combinações delas selecionadas, em forma de uma mistura de enzimas. Adicionalmente, o kit poderá conter de acordo com a execução, meios para a realização das reações enzimáticas como também meios para a separação de misturas dos vetores produzidos. O promotor poderá estar no kit como parte de um plasmideo, do qual poderá ser recortado através de uma endonuclease de restrição apropriada. A seguir é fornecido um kit que permite a síntese dos múltiplos constructos de expressão de RNAi, que contêm a descrita estrutura em forma de T. Além dos componentes do kit já mencionados ainda há uma estrutura em forma de T na qual pode ser inserida a seqüência desejada no braço de filamento duplo com a seqüência a ser transcrita.

De acordo com a invenção, os constructos de expressão são apropriados para a desejada inibição de expressão genética por meio de interferência de RNA, desde que seja utilizado um ligante com Holliday-Junctinos, para a inibição da expressão genética de vários genes. Com base na montagem especial dos constructos, de acordo com a invenção, são lidas as seqüências a serem transcritas para a formação do siRNA na mesma medida através do RNA polimerase.

O número de genes que são inibidos após a transfecção, de acordo com a invenção, através de um constructo múltiplo de inibição, depende do número de braços com filamentos duplos mostrados pelo ligante.

Em relação à presente invenção não se deve associar quimicamente a co-transfecção de dois vetores separados, nem o método descrito na DE 100 48 417 Al, as seqüências de genes que codificam, junto com os necessários elementos de comando (promotor, sinal poli (A)), uma posição resultante da técnica. Na co-transfecção, no entanto, do mesmo modo vetores diferentes são colocados juntos num espaço estreito através de lipofecção e a célula infiltrada, mas o princípio básico desse método é outro. Além disso, aparecem de modo desvantajoso através da conjugação química descrita de constructos de expressão, estruturas com um peso molecular nitidamente maior, as quais conhecidamente são infiltradas nas células com mais dificuldade. O mesmo refere-se ao método descrito no WO 01/87348 A2 da montagem de um dendrímero contendo ácidos nucléicos. Ademais, este método para a montagem de dendrímeros é um processo de produção de vários níveis e mais dispendioso.

Outro objeto da presente invenção é um medicamento, preferivelmente uma vacina, que contém constructos de expressão de acordo com a invenção. Este tipo de medicamento pode ser administrado local e sistematicamente em pessoas e em animais, e é apropriado para o tratamento de infecções, como por exemplo, infecções com virus de herpes, virus de papiloma ou lentivirus, para o tratamento de distúrbios metabólicos, como por exemplo, a doença de Parkinson ou fibrose cistica, para o tratamento de doenças cardiovasculares, para o tratamento de doenças cancerígenas, como por exemplo, carcinomas, melanomas ou sarcomas, para o tratamento de outras doenças, como por exemplo, a degeneração macular condicionada à idade, e para o tratamento de inflamações, ferimentos, intervenções cirúrgicas que atingem, por exemplo, a coluna, o cérebro ou outros órgãos.

Outras medidas vantajosas estão descritas a seguir; a invenção é descrita com mais detalhes mediante exemplos de execução e as figuras subseqüentes; elas mostram:

Fig. 1 Componentes dos vetores lineares siRNA

Fig. 2 Componentes dos vetores siRNA em forma de T

Fig. 3 Componentes dos vetores Di-siRNA em forma de T

Fig. 4 Componentes dos vetores siRNA triplos em forma de T

Fig. 5 Apresentação detalhada do loop de seqüência alvo dos constructos em forma de T

Figuras 6/7 Resultados de experimentos com a comparação do vetor de expressão siRNA em forma de T (T- SÍRNA-CDC2) com o RNA sintético (CDC2-RNA) que possuem as mesmas seqüências alvo.

Fig. 1: Mostra os componentes dos vetores lineares siRNA

A: Seqüência siRNA a ser introduzida no procedimento que se encontra homologamente ao mRNA alvo. A seqüência compreende uma área de sentido e uma área de anti-sentido (alvo), um loop de seqüência com base de 8-12 de comprimento 35 e uma seqüência de terminação complementar reversa. A seqüência siRNA pode ser constituída de fragmentos ODN individuais que efetua o annealing com a ajuda do Enzymmix, que devem ser ligados ou fosforilados, como for o caso, ela também pode ser apresentada como um fragmento ODN completo.

A seguir os componentes que são ligados ao fragmento ODN através da enzima ligase. Trata-se aqui da seqüência de promotor com os respectivos excessos complementares e do oligodinucleotideo em forma de grampo de cabelo, cujo excesso novamente complementar e único faz com que, a partir das 4 bases respectivas, surja um vetor linear covalente fechado, constituído por promotor, seqüência-alvo e seqüência de terminação e fechado nas extremidades em forma de grampo de cabelo.

Entre o promotor e o oligonucleotídeo finalizador pode ser adicionado um filamento duplo de DNA com base de 10 a 1000 (= n) de comprimento de uma seqüência que não codifica com extremidades salientes curtas de DNA de filamento simples.

B: Produto final pronto para transfecção.

Fig. 2: mostra os componentes dos vetores siRNA em forma de T

A: Seqüência siRNA a ser introduzida no procedimento que se encontra homologamente ao mRNA alvo. A seqüência compreende uma área de sentido e uma área de anti-sentido (alvo) , um Ioop de seqüência com base de 8-12 de comprimento e uma seqüência de terminação. A seqüência siRNA pode ser constituída de fragmentos ODN individuais que efetua o annealing com a ajuda do Enzymmix, que devem ser ligados ou fosforilados, como for o caso, ela também pode ser apresentada como um fragmento ODN completo.

B/C: A seguir os componentes que são ligados ao fragmento ODN através da enzima ligase. Trata-se aqui da seqüência de promotor com os respectivos excessos complementares e do oligodinucleotideo em forma de grampo de cabelo, cujo excesso novamente complementar e único faz com que, a partir das 4 bases respectivas, surja um vetor linear covalente fechado, constituído por promotor, Ioop de sentido ou loop anti-sentido e por seqüência de terminação e fechado nas extremidades em forma de grampo de cabelo.

Entre o promotor e o oligonucleotideo finalizador, como também entre a seqüência de terminação e o oligonucleotideo finalizador pode ser adicionado um filamento duplo de DNA com bases de 10 a 1000 (= n) de comprimento de uma seqüência que não codifica com extremidades salientes curtas de DNA de filamento simples.

D: Produto final pronto para transfecção.

Fig. 3: Mostra os componentes dos vetores Multi-siRNA em forma de T (constructo. Di)

A/B/C/D: Seqüências siRNAs a serem introduzidas no procedimento que se encontram homologamente ao mRNA alvo. As duas seqüências compreendem uma área de sentido ou área de anti-sentido (alvo A, alvo Β), um loop de seqüência com base de 8-12 de comprimento e uma seqüência de terminação. As seqüências siRNAs podem ser constituídas de fragmentos ODN individuais que efetuam o annealing com a ajuda do Enzymmix, que devem ser ligados ou fosforilados, como for o caso, elas também podem ser apresentadas como fragmentos ODN completos.

A seguir os componentes que são ligados ao fragmento ODN através da enzima ligase. Trata-se aqui da seqüência de promotor com os respectivos excessos complementares, de um ligante de filamento duplo de DNA e de oligodinucleotídeos em forma de grampo de cabelo, cujos excessos novamente complementares e únicos fazem com que, a partir das 4 bases respectivas, surja um vetor linear covalente fechado, constituído por promotor, Ioop de sentido ou Ioop de anti- sentido e por seqüência de terminação e fechado nas extremidades em forma de grampo de cabelo.

Entre o promotor e o oligonucleotideo finalizador, entre a seqüência de terminação e o oligonucleotideo finalizador como também respectivamente entre o ligante e o promotor pode ser adicionado um filamento duplo de DNA com base de 10 a 1000 (= n) de comprimento de uma seqüência que não codifica com extremidades salientes curtas de DNA de filamento simples.

Ε: Produto final pronto para transfecção.

Fig. 4: Mostra os componentes dos vetores Multi-siRNA em forma de T (constructo Tri)

A/B/C/D/E: Seqüências siRNAs a serem introduzidas no procedimento que se encontram homologamente ao mRNA alvo. As três seqüências compreendem uma área de sentido ou área de anti-sentido (alvo A, alvo Β) , um Ioop de seqüência com base de 8-12 de comprimento e uma seqüência de terminação. As seqüências siRNAs podem ser constituídas de fragmentos ODN individuais que efetuam o annealing com a ajuda do Enzymmix, que devem ser ligados ou fosforilados, como for o caso, elas também podem ser apresentadas como fragmentos ODN completos. A seguir os componentes que são ligados ao fragmento ODN através da enzima ligase. Trata-se aqui da seqüência de promotor com os respectivos excessos complementares, de um ligante de filamento duplo de DNA e de oligodinucleotídeos em forma de grampo de cabelo, cujos excessos novamente complementares e únicos fazem com que, a partir das 4 bases respectivas, surja um vetor linear covalente fechado, constituído por promotor, Ioop de sentido ou Ioop de anti- sentido e por seqüência de terminação e fechado nas extremidades em forma de grampo de cabelo.

Entre o promotor e o oligonucleotídeo finalizador, entre a seqüência de terminação e o oligonucleotídeo finalizador, como também respectivamente entre o ligante e o promotor pode ser adicionado um filamento duplo de DNA com base de 10 a 1000 (= n) de comprimento de uma seqüência que não codifica com extremidades salientes curtas de DNA de filamento simples.

F: Produto final pronto para transfecção.

Fig. 5: Mostra uma apresentação detalhada do Ioop de seqüência alvo dos constructos em forma de T

Fig. 6: Mostra resultados de um experimento em que o vetor de expressão siRNA em forma de T (T-SÍRNA-CDC2) da invenção é comparado com o RNA sintético (CDC2-RNA) que possui as mesmas seqüências alvo.

CDC2 mRNA foi definido por meio de PCR quantitativa em tempo real após transfecção de células HELA. Foram introduzidos: com o método da invenção, o vetor siRNA em forma de T que possui uma seqüência-alvo CDC2, RNA sintético da mesma seqüência CDC2 e células não tratadas. Os valores representam valores médios que foram calculados a partir de reiteradas estipulações. Nas células não tratadas como esperado, não foi observada a supressão do CDC2 mRNA. Em contrapartida as células tratadas com o vetor siRNA em forma de T, como também com o RNA sintético mostraram uma quantidade significativamente pequena de CDC2 mRNA. Quantidade esta que foi reduzida em 96,7% em comparação ao controle positivo (células não tratadas).

Fig. 7: Mostra resultados de um experimento em que o vetor de expressão siRNA em forma de T (T-SÍRNA-CDC2) da invenção é comparado com o RNA sintético (CDC2-RNA) que possui as mesmas seqüências alvo.

Proteína CDC2 foi definida por meio de Western blot após transfecção de células HELA. Foram introduzidos: com o método da invenção, o vetor siRNA em forma de T que possui uma seqüência-alvo CDC2, RNA sintético da mesma seqüência CDC2 e células não tratadas. Como padrão interno foi utilizado B- Tubilin. Nas células não tratadas (banda 4) como esperado, não foi observada a supressão do CDC2 mRNA. Em contrapartida as células tratadas com o constructo siRNA em forma de T (banda 2), como também com o RNA sintético (banda 3) mostraram uma quantidade significativamente pequena de proteína CDC2.

A supressão da expressão genética através de constructos de SiRNA em forma de T, que foram produzidos com um "kit de vetor de expressão siRN" mediante utilização do método da invenção, é comparável aos efeitos das transfecções de RNA sintético. A supressão da expressão genética encontra-se em ambas as áreas de transfecção entre 94-96%.

Exemplo 1: Produção do vetor siRNA em forma de T para a supressão da expressão CDC2

O vetor codificador do CDC2 para o siRNA foi obtido da seguinte forma:

Os dois fragmentos de ODN para o CDC2 foram aquecidos a 90°C por 3 minutos e destemperados através de resfriamento lento. Assim, obteve-se a seguinte seqüência codificadora para o CDC2:

sEQ.id 1: Xggggtcagctcgttactctctc

Com isso as 19 bases formam o filamento de sentido, as 4 bases seguintes (sublinhadas) o inicio da seqüência de loop.

A fosforilização seguiu na seqüência através de PNKinase. Para se obter 10 microgramas do produto final foram introduzidos 3,9 microgramas de CDC2. Depois da adição de 5,2 microgramas de promotor Hl(Seq. ID 2) como do quinto oligodesocinucleotideo fosforilado em forma de grampo de cabelo (Seq. ID 3 e 4):

Seq. ID 2:

ΑΤΜ'ΤTGCAT GTCGCTATGT GTTCTGGGAA ATCACCATAA ACGTGAAATG TCTTTGGfeTT TGGGAATCfT ATAAGTTCTGT &TGAGAGCAC AGMiAGGG

Seq. ID 3:

-PH-GGG AAA GCT TAG TTT TCT AAG CTT-3 (1,3 micrograma) e

Seq. ID 4:

5'PN-GfT GGA ATT CAG 'TTT TCT GAA TTC-3'- (χ 3 micrograma) cada fragmento foi ligado com o auxilio da enzima ligase T4- DNA. A mistura resultante em ácido nucléico foi tratada com a enzima T7-DNA-polimerase. O produto final, o vetor experimentador siRNALuc foi separado da mistura através de cromatografia ácida e o posto preparado para a transfecção. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Kologen AG Constructos de DNA para a inibição específica da <120> expressão genética por meio de interferência do RNA

<130> XI 1165-06

<150> RP 05029727.8

<151> 2005-11-25

<160> 4

<170> Patentln varsion 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificiál

<220> <223> oligodesoxinucleotideo sintético

<220>

<221> misc feature

<223> As primeiras 19 bases são CDC2 de sentido, as 4 últimas bases são o início do loop

<400> 1

tggggtcagc tcgttaçtc ctc 23

<210> 2

<211> 99

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<223> Promotor de gene humano para Hl RNA

<4DO> 2

atatttgcac gtcgccatgt gttctgggaa gttacgttaa tcgcgtaatg tctttggatt 60

tgggaatcctt ataagttccg tatgagagca cagataggg 99 <table>table see original document page 24</column></row><table>

Claims

1. Constructo de expressão de DNA, para inibição específica da expressão genética por meio de interferência do RNA, caracterizado pelos seguintes componentes: a) uma primeira estrutura de grampo de cabelo de terminação de DNA, na qual um filamento simples de desoxirribonucleotídeo é dobrado para a área de um filamento duplo de tal maneira que se apresenta uma saliência coesiva numa extremidade e na extremidade oposta um Ioop de filamento simples, b) uma segunda estrutura de grampo de cabelo de terminação que é montada analogicamente à primeira estrutura de grampo de cabelo de terminação, c) pelo menos uma estrutura de DNA em forma de T com três braços de DNA de filamento duplo, os quais estão unidos por Holliday-Junctions, em que: i. um braço possui as seqüências a serem transcritas e o filamento simples deste braço de filamento duplo de DNA na extremidade que está em oposição à junção com os outros braços, estão interligados através de um Ioop de DNA de filamento simples, e ii. os outros dois braços apresentam extremidades coesivas, em que um braço apresenta uma seqüência de terminação e o outro braço apresenta uma seqüência promotora apropriada.

2. Constructo de expressão de DNA, para inibição específica da expressão genética por meio de interferência do RNA, caracterizado pelos seguintes componentes: a) uma primeira estrutura de grampo de cabelo de terminação de DNA, na qual um filamento simples de desoxirribonucleotídeo é dobrado para a área de um filamento duplo de tal maneira que se apresenta uma saliência coesiva numa extremidade e na extremidade oposta os filamentos simples formadores dos filamentos duplos interligados entre si através de um Ioop de filamento simples, b) uma segunda estrutura de grampo de cabelo de terminação que é montada analogicamente à primeira estrutura de grampo de cabelo de terminação e cujas áreas de filamento duplo e filamento simples são consistidas pela seqüência a ser transcrita, c) uma seqüência promotora apropriada e uma seqüência de terminação complementar reversa apropriada que se encontram num filamento duplo de DNA entre as duas estruturas de grampo de cabelo de terminação descritas em a) e b).

3. Constructo de expressão de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que várias estruturas de DNA em forma de T são unidas respectivamente numa extremidade através de um ligante por meio da Holliday- Junction.

4. Constructo de expressão de DNA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que várias estruturas de DNA em forma de T são unidas respectivamente numa extremidade através de um ligante por meio da Holliday- Junction.

5. Constructo de expressão de DNA, de acordo com pelo menos uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as extremidades coesivas de componentes individuais para a intencionada junção com outros componentes são selecionadas especifica e diferenciadamente.

6. Constructo de expressão de DNA, para a intencionada inibição de expressão de um ou mais genes, como definido em pelo menos uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as seqüências a serem transcritas fazem a codificação de genes idênticos ou diferenciados.

7. Constructo de expressão de DNA, para a intencionada inibição de expressão de um ou mais genes, como definido em pelo menos uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteção contra o catabolismo de exonuclease é conseguida através de uma área curta de filamento simples de três a oito desoxinucleotideos a qual interliga os dois filamentos do filamento duplo linear.

8. Constructo de expressão de DNA, para a intencionada inibição de expressão de um ou mais genes, como definido em pelo menos uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que isto está interligado na área curta de filamento simples com um ou mais peptideos, proteínas, hidratos de carbono, anticorpos ou esteróides covalentes.

9. Método de produção de vetores, que após sua transfecção inibe objetivamente a formação de proteínas definidas nas células ' eucarióticas, caracterizado pelos seguintes passos: a) mistura de um filamento duplo de DNA que contém uma cópia singular de seqüência genética com uma base de 19-23 de comprimento ou sua seqüência complementar reversa como também um sinal de terminação para RNA polimerase e que é fechado numa extremidade por um Ioop de seqüência com base de 8-12 de comprimento, o qual é selecionado assim que as bases opostas de modo algum sejam complementárias entre si e os filamentos simples de DNA ladeados se interliguem em um filamento duplo de DNA que apresenta na outra extremidade um filamento simples de DNA saliente curto, com b) um oligodesoxinucletídeo que apresenta na extremidade extremidades salientes curtas de DNA com filamento simples, e c) um promotor com extremidades salientes curtas de DNA com filamento simples, em que a extremidade 5' de filamento simples do promotor poderá se unir com o oligodesoxinucletídeo em forma de grampo de cabelo ou o filamento duplo com base de 10 a 1000 de comprimento e a extremidade 3' de filamento simples do promotor se encontra complementariamente à extremidade 5' do filamento duplo de DNA descrito e a), e d) ligação de fragmentos de DNA, e) assim como separação de mistura finalizadora dos vetores produzidos.

10. Método de produção, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o passo b) do procedimento é acrescentado um filamento duplo de DNA com uma base de 10 a -1000 de comprimento (= η) de uma seqüência não codificadora com extremidades salientes curtas de DNA com filamento simples, em que a extremidade 3' de filamento simples poderá se unir à extremidade 5' de filamento simples do promotor e a extremidade 5' de filamento simples encontra-se complementária à extremidade 3' de filamento simples do oligodesoxinucleotido em forma de grampo de cabelo.

11. Método de produção de vetores, que após sua transfecção em células eucarióticas inibe a formação de proteína definida por meio da interferência do RNA, caracterizado pelos seguintes passos: a) mistura de um filamento duplo de DNA em forma de T, a qual contém uma cópia singular de uma seqüência genética em direção 5'-3 com base de 19-23 de comprimento, como também um sinal de terminação para RNA polimerase é finalizado por meio de Ioop de seqüência com uma base de 8-12 de comprimento, o qual é selecionado de tal forma que as bases opostas de maneira alguma fiquem complementárias umas às outras e as áreas ladeadas com filamentos duplos sejam ligadas assim por dois filamentos simples de DNA e apresenta na outra extremidade dois filamentos simples de DNA com saliências curtas, e um oligodesoxinucleotídeo cuja seqüência está complementária aos dois filamentos simples de DNA com saliências curtas e forma duas extremidades salientes de DNA de filamento simples, com um b) um oligodesoxinucleotídeo em forma de Τ, o qual apresenta na extremidade saliências curtas de extremidades de DNA de filamento simples, e c) em outro um oligodesoxinucleotido em forma de grampo de cabelo, o qual apresenta na extremidade saliências curtas de DNA de filamento simples complementárias ao filamento duplo de DNA em forma de T de a), e d) um promotor com extremidades salientes curtas de filamentos simples de DNA, em que a extremidade 5' de filamento simples do promotor pode se unir ao oligodesoxinucleotídeo de b) e a extremidade 3' de filamento simples do promotor está complementária à extremidade 5' de filamento simples do filamento duplo de DNA em forma de T, e e) ligação de fragmentos de DNA, f) assim como separação de mistura finalizadora dos vetores produzidos.

12. Método de produção, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o passo c) do procedimento é um acréscimo de um filamento duplo de DNA com uma base de 10 a 1000 (= n) de comprimento de uma seqüência não codificadora com extremidades salientes curtas de DNA de filamento simples, em que a extremidade 3' de filamento simples poderá se unir à extremidade 5' de filamento simples do promotor e a extremidade 5' está complementária à extremidade 3' de filamento simples do oligodesoxinucleotido em forma de grampo de cabelo do passo b) do procedimento é acrescentado e/ou o acréscimo de um filamento duplo de DNA com uma base de 10 a 1000 de comprimento (= n) de uma seqüência não codificadora com extremidades salientes curtas de DNA com filamento simples, em que a extremidade 5' de filamento simples poderá se unir à extremidade 3' de filamento simples do filamento duplo de DNA em forma de T e a extremidade 3' de filamento simples encontra-se complementária à extremidade 5' de filamento simples do oligodesoxinucleotido em forma de grampo do passo c).

13. Método de produção, de acordo com pelo menos uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que antes do inicio do procedimento oligodesoxinucletideos parcialmente complementários entre si são hibridizados numa molécula de ligação (Iigante) em que a hibridização acontece de maneira tão incompleta que duas ou mais áreas de filamentos duplos com extremidades coesivas com seqüência de base igual ou diferenciada são interligadas pela Holliday- Junctions e pelo desenvolvimento dos passos de procedimento apresentados.

14. Método de produção, de acordo com pelo menos uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que o promotor é parte de um plasmideo ampliável através de bactérias, o qual é recortado antes da mistura dos componentes com uma endonuclease de restrição, que reconhece um ponto de interseção ladeada ao promotor sobre o plasmideo, o qual não existe no constructo de expressão a ser produzido.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que ocorre o respectivo passo de ligação com a presença da endonuclease de restrição, com a qual o promotor foi recortado do plasmideo.

16. Método de produção, de acordo com pelo menos uma das reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que ocorre antes da separação de misturas final, uma absorção da mistura de reação por meio de uma exonuclease especifica, exclusivamente para a extremidade 3' ou 5' de DNA.

17. Método de produção, de acordo com pelo menos uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que na endonuclease de restrição se trata de uma enzima do grupo da classe II de endonuclease de restrição, de preferência do grupo BbsI, BbvI, BbvII, BpiI; BpII, BsaI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, Eamll04I, EarI, Eco31I, Esp3I, FokI, HgaI, SfaNI ou seus isosquizômeros.

18. Método de produção, de acordo com pelo menos uma das reivindicações 9 a 17, caracterizado pelo fato de que é acrescentado um filamento duplo de DNA na mistura dos componentes o qual resulta do annealing parcial de um oligodesoxinucleotideo autocomplementar parcial ou de pelo menos dois oligodesoxinucleotideos.

19. Método de produção, de acordo com pelo menos uma das reivindicações 9 a 18, caracterizado pelo fato de que os oligodesoxinucleotideos com forma de grampo de cabelo apresentam em sua área de filamento duplo a seqüência de reconhecimento para uma endonuclease de restriação.

20. Método de produção, de acordo com pelo menos uma das reivindicações 9 a 19, caracterizado pelo fato de que a separação de misturas ocorre através de cromotografia e/ou através de gelectroforese.

21. Kit para produção de vetores, que são apropriados, após sua transfecção em células eucarióticas, caracterizado pelo fato de que a formação de proteínas definidas é inibida objetivamente através da interferência do RNA, segundo pelo menos um dos métodos como definido nas reivindicações de 9 a 20, contendo pelo menos um promotor, oligodesoxinucleotídeos e enzimas.

22. Kit para produção de constructo de expressão, como definido em uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de conter pelo menos oligodesoxinucleotídeos apropriados para a formação de estruturas de grampo de cabelo de terminação, oligodesoxinucleotídeos apropriados para a formação de um ligante, estruturas de DNA em forma de T nas quais poderão ser inseridas as seqüências a serem transcritas, como também enzimas e meios para a realização dos passos de ligação, de corte, de degradação de DNA e separação de mistura.