CN101313067B

CN101313067B - 以rna干扰特异性抑制基因表达的dna构建体

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Publication number: CN101313067B
Application number: CN200680043264.9A
Authority: CN
Inventors: M·施罗夫; D·奥斯拉德
Original assignee: Mologen AG
Current assignee: Mologen AG
Priority date: 2005-11-25
Filing date: 2006-11-22
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2026-11-22
Also published as: CN101313067A; RU2008125849A; US20080311630A1; ES2421314T3; EP1951870B1; JP2009521210A; CA2627443C; DE112006003704A5; WO2007059760A1; JP5186381B2; HK1125407A1; RU2410431C2; BRPI0618907A2; US9012620B2; AU2006317222B2; DK1951870T3; EP1951870A1; AU2006317222A1; CA2627443A1

Abstract

本发明涉及表达构建体及其合成方法，在它们转染进入真核细胞后，在这些细胞内适合以RNA干扰以靶向方式抑制指定蛋白质的形成。在一个反应容器中，制备这种载体的不包含PCR步骤的方法是3步法并且可在几小时内完成。此外，本发明涉及适合以RNA干扰靶向抑制基因表达的DNA表达构建体，其中这些表达构建体也适合于多基因表达抑制。

Description

以RNA干扰特异性抑制基因表达的DNA构建体

描述

本发明涉及制备载体的方法以及这些载体，在所述载体转染进入真核细胞之后，其适合于通过RNA干扰以靶向方式抑制一或几种蛋白质的形成。

近来，一种抑制基因表达的可能性是基于合成双链RNA分子。使用这种双链RNA(dsRNA)与任何其他方法相比，各个基因可被非常有效地和更快速地以靶向方式关闭，而无需破坏邻近基因的蛋白质形成。其基本原理被命名为RNA干扰，缩写为RNAi。产生该现象的dsRNA序列被命名为siRNA(小干扰RNA)。

SiRNA不能防止基因被读出但是可以打开细胞机制，该机制防止从基因读出的mRNA分子产生并因此阻止相应蛋白质的形成(转录后基因沉默)。

由19至23个RNA碱基长的短siRNA分子触发mRNA的这种靶向降解，该siRNA与转录为被抑制的蛋白质的靶mRNA同源。siRNA分子组合特异性内切核糖核酸酶形成一个细胞的RNA蛋白复合体，称为“RISC”(RNA诱导的沉默复合体)。当这些复合体形成，RNA双链解离，导致每个均含有单链siRNA分子的所谓的活化的RISC。含有与靶mRNA互补的反义链的活化RISC与靶mRNA结合，RNA-蛋白质复合体的内切核糖核酸酶确保序列特异性降解mRNA。

采用实验方法在细胞内产生siRNA或者从外部将其转入。通过体外或体内给予合成制备的siRNA分子来完成这些实验。

但是，该方法具有技术限制。合成的siRNA在培养基和细胞内通常不稳定，原则上，使用合成的siRNA的抑制作用可能只是暂时的，许多细胞(例如神经细胞)可被非常无效率地转染。因此基于合成siRNA转染的研究限制在时间上(从1到5天)和细胞类型上。此外，高生产成本和长时间生产也是不利因素。

其他方法是在细胞内通过载体产生siRNA。它们是病毒载体或基于质粒的载体，其一旦进入到细胞内就可表达形成siRNA序列。与转染合成siRNA比较，其优势在于更稳定和更可调控相应siRNA序列的转录。

但是，基于质粒的载体不仅表现出低转染效率，而且具有一个精细的生产过程。因此需要选择稳定的克隆。通常这个过程冗长并需要花费数周甚至数月，并且频繁出现克隆实验固有的大量潜在的困难。用于检测产物的测序程序也是费力和昂贵的。

此外，基于质粒的载体含有选择所必需的抗生素抗性基因。因此，这个载体不适合应用于活的生物体。与无处不在的细菌可能的重组导致在有机体内出现对抗生素具有抗性的细菌的风险增加。抗生素抗性的传播是一严重问题，这一途径是不可靠的。

因为病毒载体能够有效和靶向转染，与合成siRNA分子和基于质粒的载体比较，它们具有一定的优势。

但是，对于治疗应用仅能有条件的使用这样的病毒载体。在此，病毒序列与天然存在病毒的重组表现出一个固有的安全风险，因此必须小心不要创造一个新的致病性杂种病毒。另外，它们的制备也是精细和昂贵的。

甚至使用表达系统抑制仅仅一个基因产物的表达也与大量复杂情况相关，在细胞或组织内同时关闭几个基因产物的表达是更加复杂而因此更难实现这几乎是公认的。

当使用几个独立的构建体时，通过RNA干扰多重抑制基因表达的一个主要问题是细胞仅将被一个构建体转染的可能性低。这个低可能性随使用的构建体数而呈指数的降低。但是，对于遗传治疗的某些方法，需要一个可控的和同时的基因表达抑制。

存在的大量方法能在细胞内共转录几个RNA分子。最简单的方法是共转染2个独立的表达构建体(以下也称为载体)。另一个方法由转染携带2个独立表达盒的载体组成。这样的构建体也可被用于合成siRNA分子。

但是，这2种可能性具有风险，即转录物在数量、加工、半衰期和翻译效率显著不同以及在蛋白质表达量也显著不同，结果是其应用的特征是无效性和低重复性。因此，这种表达系统的使用也会导致不同程度的siRNA转录，将最终产生相关基因的不平衡抑制。

使用IRES(内部核糖体进入位点)元件构建双顺反子和多顺反子RNA分子代表另一种共表达几个基因的可能性。它们允许通过序列元件由核糖体起始翻译，而与mRNA帽子结构无关。IRES元件最早在小RNA病毒的mRNA中被发现(Pelletier and Sonenberg，1988，Nature 334：320-325，Jang etal.，1988，Journal Virology 62：2636-2643)。

构建双顺反子载体时，最常使用脊髓灰质炎病毒和EMCV(脑心肌炎病毒)的IRES元件(Dirks et al.，1993，Gene 128：247-249)。不幸的是，它们的效率很大程度依赖于使用的细胞系而变化较大(Borman et al.，1997，Nucleic Acids Res.25：925-932)。

大多数可使用的双顺反子表达盒由排列在IRES元件3’侧的可选择标记物或报道基因和插入所需基因的MCS(多克隆位点)组成(Dirks et al.，1993，Gene 128：247-249)。使用IRES元件的三顺反子和多顺反子表达系统也是已知的(Zitvogel et al.，1994，Hum Gene Ther 5：1493-1506，Fusseneggeret al.，1998a，Nature Biotechnol.16：468-472，Mielke et al.，2000，Gene 254.1-8)。

但是，对于治疗应用仅能有条件的使用病毒IRES元件。在此，病毒序列与天然存在病毒的重组表现出一个固有的安全风险，因此必须小心不要创造一个新的致病性杂种病毒。

通过连接无IRES元件的转录单元也可构建多顺反子载体。一方面，通过不同MCS插入质粒载体可以克隆所需基因，另一方面，通过DNA接头连接从质粒分离的表达盒形成线性多顺反子载体(Tsang et al.，1997，BioTechniques 22：68)。

但是，线性顺式连接基因表达率的研究显示对这种方式排列的表达盒转录存在较强的负面影响(Esperet et al.，2000，J Biol Chem 275：25831-25839)。

表达多基因的质粒载体在克隆的转录单位数量上不同于常规质粒载体。在本文中，相同或不同来源的启动子或poly(A)序列可被用于转录单位。

使用不同启动子时出现的不利因素是由于启动子的强度不同而因此各个基因的表达率改变，而使用相同启动子可导致DNA二级结构的形成，其结果是可能导致启动子功能丧失。

所有提及的多基因表达载体共同的是它们是基于质粒或病毒载体。除了所有目前多编码载体所描述的缺陷以外，另外它们表现出这类载体的不利因素。病毒载体的不利因素(包括减毒疫苗株的不稳定性)和质粒DNA载体的缺陷(例如伴随使用过程中抗生素抗性基因的传播(在EP 0 941 318B1中详细描述))充分已知。

因此，需要siRNA表达系统也能够同时抑制几个基因的基因表达。或许解决这个问题的最大难题是连接序列以产生siRNA分子的接头，其确保在每种情况中充分的转录以抑制这些序列的基因表达。

从文献已知一个使用DNA连接元件连接DNA片段的方法。Seeman描述了用于研究天然分枝连接(Verzweigungen)的DNA序列，称为霍利迪连结体，假定为B-DNA在扭曲应力下的特异性拓扑形式(Seeman：1982，JTheor Biol 99：237-247；Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.1998.27：225-248)。目前，这些结构的应用局限于研究DNA结构形式的短寡核苷酸片段。

从DE 10048417A1已知一个多功能连接，其描述两个反应性功能基团通过接头的接合(Koniugation)。作为可以这种方式偶联的生物学物质也提及了核酸，但是实施例只显示了本发明关于肽接合的应用。WO 01/87348A2描述转运几个基因进入细胞进行有效表达的另一个方法。共价键连接核酸形成称为树状聚体的超分子结构。

在http://www.ambion.com显示制备siRNA载体的另一种可能性。这个过程避免了上述提及的不利因素。但是，这个制备过程太耗时并且由于对于相关序列通过PCR(聚合酶链反应)需采取许多必须的扩增步骤而容易导致错误发生。该方法通过PCR过程扩增存在很高的产生非所需和不引人注意的突变体的可能性。所以，在此检测对照序列是必须的，该检测导致制备过程延长和成本增加。

考虑到现有技术状态，本发明的任务是提供一个体外和体内合成一或多种指定siRNA序列的方法，因此制备的表达构建体和完成合成的试剂盒。

这个任务通过独立要求的特征实现。

因此，本发明揭示了一种表达构建体，其包含第一个末端DNA发夹环、第二个末端发夹环和T形DNA结构，其中所述第一个末端DNA发夹环中单链脱氧核糖核苷酸向后折叠形成一个双链区域以至后者呈现出一个粘性突出末端，在相对末端，形成双链的单链通过单链环相互连接，所述第二个末端发夹环与第一个末端发夹环类似构建，所述T形DNA结构具有三个通过霍利迪连结体连接的双链DNA臂，其中至少一个臂含有待转录序列，在与其他臂相对连接的末端，这个双链DNA臂的单链通过单链DNA环相互连接，并且其他两个臂呈现粘性末端，其中一个臂呈现出适合的末端序列和另一个臂呈现合适的启动子序列。

所提及的成分是本发明构建体的必需部分。本发明也包括具有这些成分的表达构建体，但是所述成分来自DNA结构的其他组合。

此外，本发明揭示了一个以RNA干扰靶向抑制基因表达的表达构建体，该构建体呈现第一末端DNA发夹环，其中单链脱氧核糖核苷酸向后折叠形成双链区域以便后者呈现出一个粘性突出末端，在相对末端形成双链的单链通过一个单链环相互连接，此外该构建体还呈现第二末端发夹形环，其与第一末端发夹环类似构建且其双链和单链区由待转录序列和适合的启动子序列和在DNA双链中位于上述两个末端发夹环之间的适合的反向互补终止序列组成。

这样一个表达构建体仅仅显示待合成siRNA一个双链拷贝。使用这个构建体可以制备仅有一个拷贝存在的siRNA，因为待转录序列被RNA聚合酶经过单链环读出并转录。这对于双链质粒是不可能的。

本发明的两个表达构建体设计为在每种情况下几个T形或线性DNA结构均在末端通过霍利迪连结体以接头连接。本文中，它设计为待转录序列编码相同或不同基因。

接头是连接DNA表达盒的寡核苷酸。本发明的接头由两或多条链组成，如下的接头实施例所述，由与在相互连接的A、B和C链上的三个表达盒相连接的三个寡核苷酸形成：A的5’末端具有与B的3’末端互补的序列并形成双链，而A的3’末端与C的5’末端配对，最终B的5’末端和C的3’末端配对。DNA双链的这类连接也称为霍利迪连结体(F.W.Stahl：Genetics.1994 Oct；138(2)：241-6)，它的优点在于仅天然成分用于连接表达盒在本发明被用于医学目的时由于毒理学的原因被证明是特别有利的。

选择用于分支DNA连接的寡脱氧核苷酸序列以至在每种情况中在寡核苷酸5’末端杂交(例如)可以产生一个4个碱基长的突出粘端。分支连接体每一个臂的粘性末端序列可以不同，但是并不是必须的。T形或线性DNA结构呈现与粘性末端互补的突出端。这可以靶向连接表达盒与分支连接体的各个臂。

本发明的这种表达构建体适合于靶向、多重抑制不同基因的基因表达。由于构建在每种情况中含有产生siRNA分子所需序列的T形结构是相同的，因此相同数量的不同siRNA分子被合成。抑制其蛋白质表达的基因数依赖于由接头连接的T形结构数。

在本发明表达构建体的另一个实施方案中，特异性和独特性选择用于和其他成分靶向连接的各个成分的粘性末端是有利的。这允许靶向构建所需的表达构建体。

含有合成一或多种siRNA分子的序列的DNA表达构建体可以靶向方式转染细胞。

转染是使用生物学、化学或物理学方法将核酸序列导入细胞，其结果是在转染细胞内这些序列编码的催化性RNA转录本的持续或瞬时表达。

更进一步地，本发明表达构建体呈现一或几种共价连接肽、蛋白质、糖类、抗体或者类固醇。

本发明也涉及表达构建体的制备方法，该构建体转染进入真核细胞后通过RNA干扰以靶向方式抑制所需蛋白质的形成。

用于线性表达构建体的一个方法包括开始于方法步骤a)混合DNA双链、b)发夹形寡脱氧核苷酸和c)启动子，所述DNA双链含有基因序列或其反向互补序列的19至23碱基长的单一拷贝和RNA聚合酶的终止信号并且在一端末端由8到12碱基长的序列闭合，选择其以便相对碱基从不相互互补并且侧翼DNA单链共同连接形成DNA双链，其在另一末端呈现一短突出DNA单链，所述发夹形寡脱氧核苷酸在末端呈现一单链DNA的短突出末端，所述启动子具有单链DNA的短突出端，其中所述启动子的单链5’末端可与发夹形寡脱氧核苷酸或10到1000碱基长的双链配对，并且所述启动子的单链3’末端与a)中所述DNA双链的单链5’末端互补，在方法步骤d)中进行随后的DNA片段连接，在最后的方法步骤e)中进行合成载体的最终纯化。

可随意设计本发明方法以合成线性表达构建体以至在方法步骤c)中加入发夹形寡脱氧核苷酸之前先加入具有单链DNA的短突出末端的10到1000(＝n)碱基长的非编码序列的DNA双链，其中单链3’末端可与启动子的单链5’末端配对，单链5’末端与发夹形寡脱氧核苷酸的单链3’末端互补。

对于合成转染进入真核细胞后通过RNA干扰以靶向方式抑制指定蛋白质形成的T形表达构建体，一种方法包括开始于方法步骤a)混合T形DNA双链和寡脱氧核苷酸，所述T形DNA双链含有5’到3’方向的基因序列的19到23碱基长的单一拷贝和RNA聚合酶终止信号并且在一端末端由8到12个碱基长的序列闭合，选择其以便相对碱基从不相互互补和侧翼双链区域因此由2个DNA单链相互连接，且在另一末端呈现出2个短突出DNA单链，所述寡脱氧核苷酸的序列与所述2个短突出DNA单链互补并形成单链DNA的2个短突出末端，在方法步骤b)中与在末端呈现单链DNA的短突出末端的发夹形寡脱氧核苷酸混合，方法步骤c)中与另一个发夹形寡脱氧核苷酸混合，所述另一个发夹形寡脱氧核苷酸在末端呈现与a)中的T形DNA双链互补的单链DNA的短突出末端，方法步骤d)中与具有单链DNA的短突出末端的启动子混合，其中所述启动子的单链5’末端可与b)的发夹形寡脱氧核苷酸配对，启动子的单链3’末端与T形DNA双链的单链5’末端互补，在方法步骤e)中进行随后的DNA片段连接，其中无需10到1000碱基长的DNA双链也可合成构建体，在最后方法步骤f)中进行合成载体的最终纯化。

依据本发明，这个制备方法包括在方法步骤c)后加入具有单链DNA的短突出末端的10到1000碱基(＝n)长的非编码序列的DNA双链，其中单链3’末端可与启动子的单链5’末端配对，并加入互补于步骤b)的发夹形寡脱氧核苷酸的单链3’末端的单链5’末端和/或加入具有单链DNA的短突出末端的10到1000碱基(＝n)长的非编码序列的DNA双链，其中单链5’末端可与T形DNA双链的单链3’末端配对并且单链3’末端与方法步骤c)的发夹形寡脱氧核苷酸的单链5’末端互补。

在优选的实施方案中，包括一种方法，其中启动子是细菌扩增质粒(bakteriell amplifizierbaren Plasmides)的一部分，在混合成分之前使用可识别质粒上启动子侧翼的切割位点的限制性核酸内切酶将其切割，该切割位点在合成的分子上是不存在的。

原则上，所述启动子可以是在靶细胞即基因表达被抑制的细胞内可操作的任何启动子。如果用本发明的表达构建体转染人类细胞或组织，这些启动子优选是人来源的。但是，它们也可以是例如病毒、细菌或寄生虫来源的或靶物种以外的其他物种来源。所述启动子特别是也不限于人U6启动子、人H1启动子、鼠U6启动子、CMV启动子和7SK启动子。

此外，依据本发明，如果启动子被用作细菌扩增质粒的一部分，在将启动子从质粒切除的限制性核酸内切酶存在时进行连接步骤。

在一个实施方案中，在最终的纯化步骤之前，使用特异于3’DNA末端或5’DNA末端的核酸外切酶进行反应混合物的消化。

依据本发明的方法，在混合开始时加入的DNA双链可产生自部分自身互补的寡脱氧核苷酸或2个互补寡脱氧核苷酸的退火。反应混合物自身也可发生退火，所以在依据本发明的方法开始时，仅加入单链互补寡脱氧核苷酸。

在一个优选的实施方案中，选择寡脱氧核苷酸序列以至生成的发夹在其双链区域存在限制性核酸内切酶的识别序列。

使用本发明方法合成的载体的最终纯化优选采用色谱或凝胶电泳方法进行。

如果启动子在本发明的制备方法中用作细菌扩增质粒的一部分，将启动子从质粒切割的限制性核酸内切酶是II类限制性核酸内切酶组中之一，优选是选自BbsI、BbvI、BbvII、BpiI；BplI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、Eam1104I、EarI、Eco31I、Esp3I、FokI、HgaI、SfaNI或它们的同切点酶的酶。

本发明还涉及实施本发明方法的试剂盒，其含有至少一个启动子、发夹形寡脱氧核苷酸和酶。所述酶是连接酶，限制性核酸内切酶，限制性核酸外切酶，激酶和聚合酶或选择的酶混合物形式的组合。另外，根据实施方案，所述试剂盒也可含有进行酶反应的手段和纯化制备的载体的手段。所述启动子也可包含在试剂盒中作为质粒的一部分，使用适合的限制性核酸内切酶可将其从质粒切割。

此外，设计一个可以合成多个RNAi表达构建体的试剂盒，其含有所述T形结构。除了已经提及的成分之外，所述试剂盒还含有一个T形结构，在其具有待转录序列的双链臂中可插入所需序列。

如果使用具有霍利迪连结体的接头，本发明用以通过RNA干扰靶向抑制基因表达的表达构建体适合于抑制超过一个基因的表达。由于本发明构建体的特殊结构，形成siRNA的待转录序列被RNA聚合酶以相同程度读出。

转染本发明的多抑制构建体后，被抑制基因的数量依赖于呈现出接头的双链臂的数目。

根据本发明，共转染两个独立的载体或者DE 100 48 417 A1中描述的用于化学连接编码的基因序列和必须控制元件(启动子，poly(A)信号)的方法均不是最接近现有技术。在使用脂质体的共转染中，不同的载体也同样产生相互之间的空间上接近并转运进入细胞，但是本方法的根本原理是不同的。此外，不幸地，描述的表达构建体的化学接合产生更大分子量的结构，已知其更难于转运进入细胞。同样的问题也出现在WO 01/87348 A2描述的构建含有核酸的树枝聚体的方法中。此外，描述的构建树状聚体的方法是多步且复杂的制备过程。

本发明也涉及含有本发明表达构建体之一的药物，优选疫苗。这类药物可被局部和全身地应用于人类和动物，并适于治疗感染例如疱疹病毒感染、乳头瘤病毒感染和慢病毒感染，治疗新陈代谢紊乱例如Parkinson’s病和囊性纤维化，治疗心血管疾病，治疗癌症例如癌、黑色素瘤和肉瘤，治疗其他疾病例如年龄相关性黄斑变性，和炎症、外伤或手术过程后的治疗，例如可影响脊髓、脑和其他器官。

在其他从属权利要求中描述了更多有利特征；使用实施方案的实施例和如下图片更详细描述本发明，它们显示如下：

Fig.1线性siRNA载体的成分

Fig.2T形siRNA载体的成分

Fig.3T形双siRNA载体的成分

Fig.4T形三siRNA载体的成分

Fig.5详细表示T形构建体的靶序列环

Fig.6/7本发明T形siRNA表达载体(T-siRNA-CDC2)与含有相同靶序列的合成RNA(CDC2-RNA)相比较的实验结果

Fig.1：显示线性siRNA载体的成分

A：在本法中使用的siRNA序列与靶mRNA同源。所述序列由一条有义或反义区(靶区)、8到12碱基长的序列环和反向互补终止序列组成。siRNA序列由必须借助酶混合物被退火、连接和合适时磷酸化的各个ODN片段组成，它也可以完整的ODN片段存在。

此外，所述成分通过连接酶与ODN片段连接。这些成分是具有相应互补突出端的启动子序列和发夹形寡二核苷酸，该发夹形寡二核苷酸在每种情况中4个碱基的自身互补和独特突出端导致共价闭合线性载体的产生，其由启动子、靶序列和终止序列组成并具有闭合的发夹形末端。

在启动子和末端寡核苷酸之间，可以使用具有单链DNA的短突出末端的10到1000碱基(＝n)长的非编码序列的DNA双链。

B：用于转染的终产物

Fig.2：显示T形siRNA载体的成分

A：方法中使用的SiRNA序列与靶mRNA同源。序列由有义或反义区(靶区)、8到12碱基长的序列环和终止序列组成。siRNA序列由必须借助酶混合物被退火、连接和合适时磷酸化的各个ODN片段组成；它也可以完整的ODN片段存在。

B/C：此外，所述成分通过连接酶与ODN片段连接。这些成分是具有相应互补突出端的启动子序列和发夹形寡二核苷酸，所述发夹形寡二核苷酸在每种情况中的4个碱基的自身互补和独特的突出端导致共价闭合载体的产生，其由启动子、有义环或反义环和终止序列组成并且具有闭合发夹形末端。

在启动子和末端寡核苷酸之间，以及在终止序列和末端寡核苷酸之间，可以使用具有单链DNA的短突出末端的10到1000碱基(＝n)长的非编码序列的DNA双链。

D：用于转染的终产物

Fig.3：显示T形多siRNA载体(双构建体)的成分

A/B/C/D：方法中使用的SiRNA序列与靶mRNA同源。这两个序列由有义或反义区(靶A，靶B)、8到12碱基长的序列环和终止序列组成。siRNA序列由必须借助酶混合物被退火、连接和合适时磷酸化的各个ODN片段组成；它们也可以完整的ODN片段存在。此外，所述成分通过连接酶与ODN片段连接。这些成分是具有相应互补突出端的启动子序列，DNA双链接头和发夹形寡二核苷酸，在每种情况中所述发夹形寡二核苷酸的4个碱基的自身互补和独特的突出端导致共价闭合载体的产生，其由启动子、有义环或反义环和终止序列组成并且具有闭合发夹形末端。

在启动子和末端寡核苷酸之间，在终止序列和末端寡核苷酸之间，以及在接头和启动子之间的每种情况中，可以使用具有单链DNA的短突出末端的10到1000碱基(＝n)长的非编码序列的DNA双链。

E：用于转染的终产物

Fig.4：显示T形多siRNA载体(三构建体)的成分

A/B/C/D/E：方法中使用的SiRNA序列与靶mRNA同源。这三个序列由有义或反义区(靶A，靶B)、8到12碱基长的序列环和终止序列组成。siRNA序列由必须借助酶混合物被退火、连接和合适时磷酸化的各个ODN片段组成；它们也可以完整的ODN片段存在。此外，所述成分通过连接酶与ODN片段连接。这些成分是具有相应互补突出端的启动子序列，DNA双链接头和发夹形寡二核苷酸，在每种情况中所述发夹形寡二核苷酸的4个碱基的自身互补和独特的突出端导致共价闭合载体的产生，其由启动子、有义环或反义环和终止序列组成并且具有闭合发夹形末端。

在启动子和末端寡核苷酸之间，在终止序列和末端寡核苷酸之间，在接头和启动子之间的每种情况中，可以使用具有单链DNA的短突出末端的10到1000碱基(＝n)长的非编码序列的DNA双链。

F：用于转染的终产物

Fig.5：显示T形构建体靶序列环的详细描述

Fig.6：显示本发明T形siRNA表达载体(T-siRNA-CDC2)与含有相同靶序列的合成RNA(CDC2-RNA)相比较的实验结果

HeLa细胞转染后采用定量实时PCR检测CDC2mRNA。使用以下材料：本发明方法制备的含有CDC2靶序列的T形siRNA载体；相同CDC2靶序列的合成RNA；和未处理细胞。数值为多个测定值计算的平均值。正如预料，未处理细胞未观察到CDC2mRNA的抑制。作为对照，使用T形siRNA载体和合成RNA处理的细胞证明显著少量的CDC2mRNA。与阳性对照(未处理细胞)比较，这减少直至96.7％。

Fig.7：显示本发明T形siRNA表达载体(T-siRNA-CDC2)与含有相同靶序列的合成RNA(CDC2-RNA)相比较的实验结果。

HeLa细胞转染后经Western印迹检测CDC2蛋白质。使用以下材料：本发明方法制备的含有CDC2靶序列的T形siRNA载体；同样CDC2靶序列的合成RNA；和未处理细胞。使用β-微管蛋白作为内标。正如预料，未处理细胞(泳道4)未观察到CDC2mRNA的抑制。作为对照，使用T形siRNA构建体(泳道2)和合成RNA(泳道3)处理的细胞证明显著少量的CDC2蛋白质。

依据本发明方法用“siRNA表达载体试剂盒”制备的T形siRNA构建体对基因表达的抑制与合成RNA转染的作用是可比较的。在两个转染实验中，基因表达的抑制作用在94和96％之间。

实施例1：抑制CDC2表达的T形siRNA载体的制备

编码CDC2的siRNA载体如下获得：

两个CDC2的ODN片段在90℃加热3分钟并逐渐冷却退火。按此方法获得编码CDC2的序列：

Seq.ID 1：TGGGGTCAGCTCGTTACTCTCTC

19个碱基来自有义链，而随后的4个碱基(下划线)来自环序列的开始。

随后PN激酶的磷酸化作用。使用3.9μg CDC2获得10μg终产物。随后加入5.2μg H1启动子(seq.ID 2)和5’磷酸化发夹形寡脱氧核苷酸(seq.ID 3和4)：

Seq.ID 2：ATATTTGCAT GTCGCTATGT GTTCTGGGAA ATCACCATAA

ACGTGAAATG TCTTTGGATT TGGGAATCTT ATAAGTTCTGT

ATGAGAGCAC AGATAGGG

Seq.ID 3：5′-PH-GGG AAA GCT TAG TTT TCT AAG CTT-3′(1.3μg)及

Seq.ID 4：5′-PH-GTT GGAATT CAG TTT TCT GAA TTC-3′(1.3μg)，

T4DNA连接酶帮助各个片段连接。T7DNA聚合酶处理生成的核酸混合物。终产物表达siRNALuc的载体通过柱层析纯化并备用于转染。

序列表

<110>莫洛根股份公司

<120>以RNA干扰特异性抑制基因表达的DNA构建体

<130>XI 1165-06

<150>EP 05025727.8

<151>2005-11-25

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthetic deoxyoligonucleotide

<220>

<221>misc_feature

<223>first 19 bases are sense CDC2，last 4 bases are beginning of loop

<400>1

tggggtcagc tcgttactct ctc 23

<210>2

<211>99

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<223>Promotor of Human Gene for H1RNA

<400>2

atatttgcat gtcgctatgt gttctgggaa atcaccataa acgtgaaatg tctttggatt 60

tgggaatctt ataagttctg tatgagagca cagataggg 99

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthetic deoxyoligonucleotide

<220>

<221>misc_feature

<223>5-prime phosphorylated loop-oligodeoxynecleotide

<400>3

gggaaagctt agttttctaa gctt 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthetic deoxyoligonucleotide

<220>

<221>misc_feature

<223>5-prime phosphorylated loop-oligodeoxynucleotide

<400>4

gttggaattc agttttctga attc 24

Claims

1.通过RNA干扰靶向抑制基因表达的DNA表达构建体，其由以下成分组成：

a)第一末端DNA发夹环，其中脱氧核糖核苷酸的一条单链向后折叠形成双链区以致后者在一个末端具有粘性突出端而在相对末端具有单链环；

b)与第一末端发夹环相似地构建第二末端发夹环；

c)具有通过霍利迪连结体相互连接的三个双链DNA臂的至少一个T形DNA结构，其中

i.一条臂含有待转录序列并且这个DNA双链臂的单链在与其他臂连接相对的末端通过单链DNA环相互连接；

ii.其他2个臂呈现粘性末端，其中一条臂呈现适合的终止序列而另一臂呈现适合的启动子序列。

2.权利要求1的DNA表达构建体，其中几个T形DNA结构均在一个末端由接头通过霍利迪连结体连接。

3.权利要求1或2的DNA表达构建体，其中特异性和独特性地选择用于与其他成分靶向连接的各个成分的粘性末端。

4.权利要求1或2的靶向抑制基因表达的DNA表达构建体，其中待转录的序列编码相同或不同基因。

5.权利要求1或2的靶向抑制基因表达的DNA表达构建体，其中对核酸外切酶降解的保护通过共价彼此连接线性双链的两条链的3到8个脱氧核苷酸的短单链区完成。

6.权利要求1或2的靶向抑制基因表达的DNA表达构建体，其中所述DNA表达构建体在短单链区内与一或几个肽、蛋白质、糖类、抗体或类固醇共价连接。

7.一种载体的合成方法，所述载体在转染进入真核细胞后通过RNA干扰以靶向方式抑制指定蛋白质的形成，所述方法特征在于以下方法步骤：

a)混合权利要求1c）的T形DNA双链和寡脱氧核苷酸，所述T形DNA双链含有19到23碱基长的5’到3’方向的单拷贝基因序列和RNA聚合酶的终止信号，并且其在一个末端通过8到12碱基长度的序列环闭合，选择其以至相对碱基从不相互互补并且侧翼双链区由2个DNA单链相互连接，在另一末端呈现两个短突出DNA单链，所述寡脱氧核苷酸的序列与2个短突出DNA单链互补并形成单链DNA的两个短突出末端，和

b)发夹形寡脱氧核苷酸，其在末端呈现单链DNA的短突出末端，和

c)另一个发夹形寡脱氧核苷酸，其在末端呈现与a)的T形DNA双链互补的单链DNA的短突出末端，和

d)具有单链DNA的短突出末端的启动子，其中所述启动子的单链5’末端可与b)的发夹形寡脱氧核苷酸配对，并且所述启动子的单链3’末端与T形DNA双链的单链5’末端互补，和

e)随后连接DNA片段，及

f)最终纯化合成载体。

8.权利要求7的合成方法，其中在方法步骤c）之后加入具有单链DNA的短突出末端的10到1000碱基长的非编码序列的DNA双链，其中单链3’末端可与启动子单链5’末端配对并且单链5’末端互补于方法步骤b）的发夹形寡脱氧核苷酸的单链3’末端和/或加入具有单链DNA的短突出末端的10到1000碱基长的非编码序列的DNA双链，其中单链5’末端可与T形DNA双链的单链3’末端配对并且单链3’末端与方法步骤c）的发夹形寡脱氧核苷酸的单链5’末端互补。

9.权利要求7-8任一项的合成方法，其中在方法开始之前，部分互补的单链寡脱氧核苷酸杂交形成接头分子，其中所述杂交是不完全的以至具有相同或不同碱基序列的粘性末端的2个或多个双链区通过霍利迪连结体相互连接并随后进行所示的方法步骤。

10.权利要求7的方法，其中所述启动子是细菌扩增质粒的一部分，在混合各种成分之前质粒被识别质粒上启动子侧翼切割位点的限制性核酸内切酶切割，该切割位点不存在于被合成的表达构建体中。

11.权利要求10的方法，其中在从质粒剪接启动子的限制性核酸内切酶存在时进行各连接步骤。

12.权利要求10的方法，其中在最终纯化步骤之前，使用特异于3’或5’DNA末端的核酸外切酶消化反应混合物。

13.权利要求10的方法，其中限制性核酸内切酶是II类限制性核酸内切酶之一。

14.权利要求13的方法，其中限制性核酸内切酶是选自BbsI、BbvI、BbvII、BpiI;BplI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、Eam1104I、EarI、Eco31I、Esp3I、FokI、HgaI、SfaNI或它们的同切点酶的酶。

15.权利要求7的方法，其中在混合成分时加入产生于部分自身互补的寡脱氧核苷酸或至少2条寡脱氧核苷酸的部分退火的DNA双链。

16.权利要求7的方法，其中发夹形寡脱氧核苷酸在其双链区呈现限制性核酸内切酶的识别序列。

17.权利要求7的方法，其中通过层析和/或使用凝胶电泳进行纯化。

18.用于由权利要求7-17任一项的方法合成载体的试剂盒，所述载体在其转染进入真核细胞后适合于在这些细胞内通过RNA干扰以靶向方式抑制指定蛋白质的形成，所述试剂盒含有至少一个启动子、发夹形寡脱氧核苷酸和酶。

19.用于合成权利要求1-2任一项的表达构建体的试剂盒，其至少含有适合形成末端发夹环的寡脱氧核苷酸、适合形成接头的寡脱氧核苷酸、其中可插入待转录序列的T形DNA结构和酶以及进行连接、剪接、DNA降解和纯化步骤的手段。